血管新生阻害剤及びその利用
【課題】新規な血管新生阻害剤を提供する。
【解決手段】ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、血管新生阻害剤とする。
【解決手段】ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、血管新生阻害剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害剤及びその利用に関し、詳しくは、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖を含有する血管新生阻害剤及び該阻害剤を含む血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においては様々な生理的条件下で血管新生が生じているが、ガンの成長や転移に際し、ガン細胞が自身の栄養補給のために血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を誘導して血管新生を生じさせていると考えられている。このため、腫瘍血管新生を阻害してガン細胞の発育や転移を抑制する方法が注目されてきており、血管新生を阻害する薬剤も開示されている（特許文献１）。
【０００３】
一方、藻類由来の酸性多糖としては、フコダイン、ラムナン硫酸、硫酸ガラクタン等が知られており、例えば、硫酸化多糖であるフコダインには、抗がん活性、抗凝血活性などが知られている。また、同じく硫酸化多糖であるラムナン硫酸においては、抗凝血活性が知られている（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００３−９６０７８
【特許文献２】特開昭６３−２３５３０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ラムナン硫酸の血管新生阻害作用については報告されていない。そこで、本発明は、血管新生を阻害することのできる新規な血管新生阻害剤及び該阻害剤を用いた薬剤組成物及び食品組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、緑藻植物のアオサ藻綱に属するヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎ
ｉｔｉｄｕｍ ）やヒロハノヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ）のラムナン硫酸を含有する抽出画分が血管新生阻害作用を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００６】
本発明の一つの形態によれば、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、血管新生阻害剤が提供される。この形態においては、前記硫酸化多糖は、以下の特徴を有することができる。
（ａ）構成多糖の全質量において、ラムノース含量が５０質量％以上、グルコース含量が１質量％以上３０質量％以下及びキシロース含量が１質量％以上１０質量％以下
（ｂ）硫酸基含量が１０質量％以上４０質量％以下
【０００７】
さらに、本発明の血管新生阻害剤は、ゲルろ過クロマトグラフィーによるプルラン換算重量平均分子量が０．５万以上３００万以下であってもよい。
【０００８】
本形態においては、前記硫酸化多糖はアオサ藻綱に属する藻類由来とすることができる。また、前記阻害剤は、前記藻類又は前記藻類の抽出物を含むことができ、前記抽出物を前記藻類の熱水抽出物とすることができる。さらに、前記藻類は、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類から選択することができ、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ又はＭｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎｉｔｉｄｕｍを用いることができる。
【０００９】
また、本発明の他の一つの形態によれば、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類又はその抽出物を含有する、血管新生阻害剤が提供される。この形態においては、前記阻害剤は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有していることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の他の一つの形態によれば前記硫酸化多糖がナトリウム塩であることも好ましい態様である。
【００１１】
また、本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかの血管新生阻害剤を含む、血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物が提供される。この形態において、前記疾患は固形腫瘍、血管病変、皮膚疾患、骨・関節症、生殖器疾患、眼疾患及び肺疾患からなる群から選択することができる。さらに、前記疾患は、固形腫瘍の転移であってもよい。また、前記薬剤組成物は、局所投与用とすることもできるし、経口投与用であってもよい。
【００１２】
本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかの血管新生阻害剤を含有する、血管新生阻害を要する疾患の予防又は予後のための食品組成物が提供される。前記食品組成物は、栄養補助組成物とすることができる。さらに、前記食品組成物は、固形腫瘍の転移抑制用とすることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の血管新生阻害剤は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有することを特徴としている。本発明の血管新生阻害剤を投与することにより、血管新生阻害を要する疾患の予防又は治療が可能となる。さらに、本阻害剤を摂取させることにより、血管新生阻害を要する疾患患者又は該疾患についてのリスクを要する個体、具体的には生化学的、身体的又は遺伝的に該疾患の兆候を有する個体、該疾患の治療後の個体、派生的疾患としてこうした疾患の発症が予測される個体において該疾患の発症を予防若しくは遅延し、進行を抑制し、予後を改善し、ＱＯＬを向上させることができる。
【００１４】
なお、本明細書において、「血管新生」とは既存の血管から新しい血管が形成されることを意味している。したがって、胚形成期の初期の段階にみられる最初の血管形成の過程を意味する脈管形成は、本発明において「血管新生」には含まれない。また、本明細書において、血管新生とは、哺乳類及び非哺乳類を含む動物の血管新生を対象としている。また、哺乳類としては、ヒト及び非ヒト動物を含んでおり、非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜、ニワトリ、七面鳥等の家禽、イヌ、ネコ等のペットが含まれる。
【００１５】
以下、本発明の血管新生阻害剤、薬剤組成物及び食品組成物等について詳細に説明する。
（血管新生阻害剤）
本発明の血管新生阻害剤（以下、単に本阻害剤という。）は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有している。本発明における硫酸化多糖としては、例えば、構成糖の３位又は４位が硫酸エステル化されている硫酸化多糖が挙げられる。硫酸化多糖は、その硫酸基において遊離の酸であってもよいし、金属塩などの塩であってもよい。こうした塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属等が挙げられる。本発明においては、好ましくはナトリウム塩である。
【００１６】
本発明における硫酸化多糖の単糖組成は、ラムノースを主成分としており、構成単糖の５０質量％以上がラムノースである。硫酸化多糖におけるラムノースモル比率は、好ましくは、６０質量％以上であり、さらに好ましくは７０質量％以上である。ラムノース比率と血管新生阻害活性との関係は必ずしも明らかではなく本発明を拘束するものではない。
【００１７】
なお、硫酸化多糖における構成単糖の組成については、例えば、酸加水分解法により多糖を構成単糖まで分解後、遊離酸を分離除去し、単糖成分をＨＰＬＣで定量することにより得ることができる。酸加水分解法は、例えば、以下のようにして行うことができる。糖類含有試料を、酸加水分解〈多糖試料（約２０ｍｇ）を２Ｎ硫酸（１０ｍｌ）に溶解させ、沸騰水浴中で２時間加熱〉後、１０％塩化バリウム水溶液を添加し遊離硫酸を硫酸バリウムとして沈降分離（遠心分離）させ、上澄液を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ、カラム温度：３５℃、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）により行った。
【００１８】
また、本発明の硫酸化多糖は、ラムノース以外の構成単糖として、グルコース及び／又はキシロースを含むことができる。好ましくはグルコースを含有し、さらにキシロースを含んでいる。グルコースを含有する場合、その含量は１質量％以上３０質量％以下であることが好ましい。また、キシロースを含有する場合は、その含量は１質量％以上１０質量％以下であることが好ましい。なお、これらの構成単糖についても、ラムノース含量と同様にして算出することができる。
【００１９】
本発明の硫酸化多糖のゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量は、血管新生阻害活性を有する限り特に限定しない。例えば、プルラン換算重量平均分子量が０．５万以上３００万以下のものを用いることができる。本阻害剤又は組成物が経口投与することを考慮すると、例えば、プルラン換算重量平均分子量が２．５万以下のものを好ましく用いることができる。一方、注射等により局所投与する場合には、例えば、プルラン換算重量平均分子量３０万超３００万以下程度のものを好ましく用いることができる。
【００２０】
本発明の硫酸化多糖としては、こうした天然由来の硫酸化多糖を必要に応じて適宜加水分解したものであってもよい。また、本発明の硫酸化多糖としては、こうしてＧＰＣ等により分画した各種の分子量画分を単独又は２種以上の画分を組み合わせて用いることができる。なお、分子量に基づく分画手法としては、例えば、ＧＰＣのほか、限外ろ過法を単独であるいは他の分子量分画法と組み合わせて用いることができる。こうした各種の分画法により分離した画分を組み合わせてもよい。
【００２１】
本発明の硫酸化多糖における硫酸基含有量は、血管新生阻害活性を有する限り特に限定しないが、おおむね１５質量％以上であることが好ましい。また、上限も特に限定しないが、４０質量％以下であることが好ましい。より好ましくは３５質量％以下である。なお、硫酸基含有量は、燃焼フラスコ法、ロジソン酸法により求めることができる。燃焼フラスコ法は、例えば、分析化学、１５巻、６８９〜６９１頁、（１９６６年）、１７巻、１３２２〜１３２４頁、（１９６８年）に記載の燃焼フラスコ法を採用することができる。燃焼フラスコ法により試料中の硫黄元素を定量し、得られた試料中の硫黄原子の含有量（質量％）に３を乗ずることにより硫酸基含有量を算出することができる。また、ロジソン法は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、４１巻、４７１〜４７６頁、（１９７１年）に記載の方法を採用することができる。
【００２２】
こうした硫酸化多糖としては、天然には、アオサ藻綱に属する藻類に含まれ、該藻類から抽出される酸性多糖が挙げられる。したがって、本阻害剤は、こうした硫酸化多糖を含むアオサ藻綱に属する藻類又は該藻類からの抽出物若しくはその一部を含有することができる。本発明を拘束するものではないが、本発明の硫酸化多糖がその由来植物である藻類の抽出物とともにあるいは当該抽出物として本阻害剤に含まれることは、本発明の硫酸化多糖の生理活性上好ましいと考えられる。したがって、本阻害剤としては、こうした藻類又はその抽出物を好ましく用いることができる。より好ましくは、本発明における硫酸化多糖を含有することが好ましく、さらに好ましくは、本発明の硫酸化多糖を含有する抽出画分を用いる。
【００２３】
藻類から硫酸化多糖を得るには、例えば、以下の方法を採用することができる。乾燥させた藻類を洗浄し水で膨潤させた後、水などの水性媒体で抽出する。水性媒体としては、水を主体とし、好ましくは水のみあるいは水と有機酸及び／又は無機酸とを含む酸性水性媒体を用いる。酸としては、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、シュウ酸、Ｌ−アスコルビン酸、酢酸、塩酸、硫酸などを単独であるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、抽出に際しては、適宜原料を細断する。水性媒体による硫酸化多糖の抽出は、水性媒体を加熱して行うことが好ましく、熱水（７０℃以上、好ましくは９５℃以上程度）で行うことが好ましい。抽出時間はおおよそ１時間〜８時間程度である。抽出後は、遠心分離により沈殿物を除いた後、上澄み液をそのまま透析あるいはエタノール等の有機溶媒を添加して硫酸化多糖を沈殿させた後該沈殿物の水溶液を透析して低分子成分を除去することにより、粗硫酸化多糖画分を得ることができる。この粗画分は、このまま本発明の阻害剤として使用することができるが、さらに、この粗画分を、ＤＥＡＥセルロースカラム等を用いてイオン強度勾配をかけて精製することができる。なお、こうした採取操作においては、適時にバイオアッセイを並行して行い、管腔形成の阻害を指標として精製を進めることが好ましい。
【００２４】
また、藻類由来の硫酸化多糖、例えば、ラムナン硫酸は、主としてＮａ，Ｋ，Ｃａ，Ｍｇ塩等の形態を採っているが、本発明の硫酸化多糖は、こうした天然の塩の形態に限定されないで各種の形態を採ることができる。塩の種類を変えるには、硫酸化多糖の硫酸基をイオン交換により一旦フリーとし、その後所望のアルカリで中和すればよい。例えば、本発明における硫酸化多糖のナトリウム塩は、以下のようにして得ることができる。すなわち、硫酸化多糖を例えば、塩酸等で平衡化したカチオン交換樹脂カラム等により硫酸基をフリーとし、その後、硫酸基フリーの硫酸化多糖をＮａＯＨで中和すればよい。
【００２５】
こうした藻類としては、ヒビミドロ目Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ、Ｐｒｏｔｏｍｏｎｏｓｔｒｏｍａや、アオサ目Ｂｌｉｎｄｉｎｇｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ、Ｕｌｖａ、Ｕｌｖａｒｉａが挙げられる。具体的には、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎｉｔｉｄｕｍ（ヒトエグサ）、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ（ヒロハノヒトエグサ）、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｓｒａｖｉｌｌｅｉ（ウスヒトエグサ）、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ａｎｇｉｃａｖａ（エゾヒトエグサ）、Ｐｒｏｔｏｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｕｎｄｕｌａｔｕｍ（シワヒトエグサ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ（スジアオノリ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ボウアオノリ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ（ヒラアオノリ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｌｉｎｚａ（ウスバアオノリ）、Ｕｌｖａ ｐｅｒｔｕｓａ（アナアオサ）、Ｕｌｖａｒｉａ ｆｕｓｃａ（クロヒトエグサ）、Ｂｌｉｎｄｉｎｇｉａ ｍｉｎｉｍａ（ヒメアオノリ）が挙げられる。なかでも、ヒトエグサ、ヒロハノヒトエグサなどが好ましく用いられる。なお、ヒトエグサとヒロハノヒトエグサは類似しており、両者を区別することは必ずしも容易でない。したがって、ある藻類が両者のいずれかであると明確に分類できる場合を除いて、当該藻類をヒトエグサ又はヒロハノヒトエグサとして取り扱うことができる。
【００２６】
また、硫酸化多糖としては、血管新生阻害活性を有する限り天然由来の多糖又は硫酸化多糖を化学修飾した半合成の硫酸化多糖も挙げられる。例えば、上記した藻類を始めとする天然生物から採取した硫酸化多糖あるいはその分解物について硫酸化を施したものであってもよいし、また、部分的に脱硫酸したものであってもよい。さらに、硫酸エステル基を有していない天然由来の多糖又はその分解物を硫酸化してもよい。硫酸化は、水酸基をスルホン化すればよい。水酸基のスルホン化は、例えば、クロロスルホン酸−ピリジン錯体 、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）−硫酸、三酸化イオウ−トリメチルアミン錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で三酸化イオウ−ピリジン錯体を用いる方法などにより実施することができる。
【００２７】
さらに、硫酸化多糖としては、血管新生阻害活性を有する限り、合成多糖を硫酸化したもの又は硫酸化した単糖やオリゴマーを重合したものなどの合成硫酸化多糖も挙げられる。さらに、本発明の硫酸化多糖としては、血管新生阻害活性を有する限り、ラムノース以外の構成単糖に対して糖に施される一般的な化学修飾が施された硫酸化多糖であってもよい。化学修飾としては例えば、水酸基等のアシル化、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化などが挙げられる。こうした糖に対する化学修飾法は当業者であれば必要に応じて行うことができる。
【００２８】
本阻害剤は、こうした硫酸化多糖の１種又は２種以上若しくはこうした硫酸化多糖を含有する藻類若しくはその抽出物を組み合わせて用いることができる。本阻害剤の血管新生阻害活性は、例えば、一般に用いられている管腔形成を指標とする方法により評価することができる。管腔形成を指標とする血管新生阻害の評価の一例を以下に説明する。まず、ヒト臍帯由来静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の所定細胞濃度の細胞浮遊液を調製し、この浮遊液に対して各種濃度の硫酸化多糖を加え、この混合液をマトリゲル（商標）などの細胞培養用ゲル上に播種して、例えば、３７℃で６時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養し、その後、位相差顕微鏡で観察し、培養状態の画像情報をＣＣＤカメラ等で取得してこの画像情報を画像解析装置にてＨＵＶＥＣが形成する管腔の長さを測定する。管腔の長さは、例えば、ＣＣＤカメラを装着した位相差顕微鏡を用いて撮影した画像から選択した少なくとも四視野において形成された管腔の長さを計測し、その平均値として算出することができる。また、阻害率は、硫酸化多糖の非存在下に形成された管腔長（平均値）−硫酸化多糖存在下の管腔長（平均値）／硫酸化多糖非存在下の管腔長×１００（％）として算出することができる。
【００２９】
また、本阻害剤については、例えば、以下の方法により血管新生阻害活性（（１）及び（２））またガン細胞増殖転移抑制効果（３）を確認できる。
【００３０】
（１）血管新生阻害活性−マトリゲル（商標）・インプラントアッセイ
種々の濃度でのヒトエグサ抽出試料などの硫酸化多糖含有試料を、VEGF及びヘパリンの存在下あるいは非存在下にマトリゲルに混入し、このマトリゲルを重症複合免疫不全症（SCID）マウスの皮下に注入する。３日後に、皮下においてマトリゲルに向かって新生した血管の量を顕微鏡下肉眼的に観察し、写真撮影して評価を行う。また、新生血管を含むマトリゲルを試験管内にてコラゲナーゼ処理により溶解し、溶解液中に滲出したヘモグロビン量を測定し、それに基づき新生血管の量を測定する。これによりマトリゲル内に添加した物質の血管新生抑制作用を対照（生理食塩水投与群）と比較し評価を行う。
【００３１】
（２）血管新生阻害活性−CAM（Chorioallantois membrane）アッセイならびにラット角膜アッセイニワトリ胚漿尿膜CAM（Chorioallantois membrane）あるいはラット角膜に試料を含有させたディスク基材を設置し、２，３日後に、ディスクに向かって新生された血管を顕微鏡下肉眼的に観察し、写真撮影をして、対照（生理食塩水投与群）と比較し評価を行う。
【００３２】
（３）ガン細胞増殖転移抑制効果−担癌動物を用いたin vinoテスト
株化乳癌細胞あるいはメラノーマ細胞（５０万個／２００μｌ）をSCIDマウスの皮内に注入し、同時に試料（例えば、１５００ｍｇ／ｋｇ）を連日投与する。投与後、マウス皮内の腫瘍の容積を経時的に観察し、対照（生理食塩水投与群）のマウスと比較する。同時に、腫瘍内における新生血管を血管内皮細胞特異的分子マーカーであるＣＤ３１（PECAM）に対する抗体を用いた免疫染色法により測定し、対照（生理食塩水投与群）のマウスと比較評価を行う。一方、試料の癌細胞の転移に対する効果は、乳ガン細胞あるいはメラノーマ細胞（例えば、５０万個／２００μｌ）をSCIDマウスの尾静脈から注射するとともに、試料（１５００ｍｇ／ｋｇ）を連日投与し、３から５週間後に肺を取り出し、肺に見られる転移巣の数を顕微鏡下で計数し、対照（生理食塩水投与群）のマウスと比較評価を行う。
【００３３】
本阻害剤の血管新生阻害活性は、管腔形成試験以外のインビトロ及びインビボの血管新生阻害活性の評価法によって血管新生阻害活性を確認できたものであってもよい。
【００３４】
本阻害剤は、粉末などの固体、溶液、懸濁液等の各種の形態を取ることができる。一般的には粉末等の固体状態で流通され、提供される。本組成物には、硫酸化多糖以外に硫酸化多糖の安定性等を高めるために適宜添加剤を含んでいてもよい。また、硫酸化多糖以外に、抽出原料由来のタンパク質等を含んでいる場合もある。
【００３５】
本阻害剤は、各種研究用試薬として用いることができるほか、血管新生阻害を要する疾患の予防や治療に用いる薬剤組成物、こうした疾患を有する若しくはリスクを有する個人や健常人に摂取させる食品組成物や外用に用いる化粧料組成物等とすることができる。
【００３６】
（薬剤組成物）
本発明の薬剤組成物は、本阻害剤を含有しており、血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物（以下、本薬剤組成物という。）として使用できる。本薬剤組成物において、血管新生阻害を要する疾患としては、例えば、胃癌、食道癌、舌癌、咽頭癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、胆管癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、多発性骨髄腫瘍などの固形腫瘍が挙げられる。また、血管線維腫、アテローム性動脈硬化、動静脈奇形、血管癒着などの血管病変、肉芽、血管腫、肥大性瘢痕、早老、乾癬、強皮症、ケロイド、いぼなどの皮膚疾患、出血性関節炎、非結合骨折、リウマチ様関節炎、変形性関節症等の骨・関節症、卵巣肥大性症候群、卵胞嚢胞、多嚢胞卵巣等の生殖器疾患、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、新生血管緑内症、角膜移植後血管新生、トラコーマ等の眼疾患、排気腫、慢性気管支炎等の肺疾患などが挙げられる。なお、本薬剤組成物が対象とする疾患はこれらに限定されるものではない。また、上記した各種固形腫瘍の予防又は治療には、これらの各種固形腫瘍の転移の抑制を含んでいる。
【００３７】
本薬剤組成物における硫酸化多糖は、硫酸エステル基における遊離の酸であってもよいし、医薬的に許容される塩であってもよい。こうした塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属等が挙げられる。本発明の硫酸化多糖は、ナトリウム塩であることが好ましい。
【００３８】
また、本薬剤組成物は、本組成物以外の上記疾患に有効な他の薬剤を含有することができる。例えば、抗ガン剤、抗炎症剤、抗菌剤又は抗ウイルス剤などの抗感染症剤などが挙げられる。本薬剤組成物は、また、上記疾患の有効な他の薬剤と併用して投与可能に組み合わせられた薬剤組成物セットとして提供されてもよい。
【００３９】
本薬剤組成物は、少なくとも本阻害剤を有効成分として含むほか、医薬上許容される公知の薬剤担体を含んで、各種の製剤形態を備えることができる。こうした薬剤担体は、当該分野において周知であり、本薬剤組成物に適用される可能性のある製剤形態に用いられる公知の薬剤担体を適宜選択して用いればよい。本薬剤組成物の製剤形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤、チュアブル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、注射剤、坐剤、フィルム剤、ゲル剤が挙げられる。また、こうした製剤形態に用いられる薬剤担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。さらに、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を含んでいてもよい。こうした本薬剤組成物は、各種製剤形態に応じた公知の常套手段により調製することが可能である。
【００４０】
本薬剤組成物は、哺乳類において難消化性の多糖体を含有するため、経口投与しても、口腔、食道、胃、小腸、大腸等の消化管内において血管新生阻害作用を生じさせることができる。この場合には、各種の固形又は液体の経口剤として提供される。また、本薬剤組成物は、腫瘍部位や炎症部位への局所適用剤として使用できる。例えば、腫瘍部位の摘出前又は後にその領域を覆ったり、あるいは所定の標的部位の血管新生を阻害したりするのに本薬剤組成物を用いることができる。また、本薬剤組成物は、リウマチや各種疾患の炎症部位への適用も挙げられる。例えば、本薬剤組成物を、関節、皮膚、口腔、各種内膜、血管内皮、網膜などにおける炎症部位に注入、塗布等することにより、炎症部位での血管新生を阻害することができる。本薬剤組成物は、こうした局所適用の製剤形態として、特に、液剤、用時溶解する固形剤、フィルム剤、ゲル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。また、内視鏡、カテーテル、チューブ等を用いて経管的又は経皮的に本薬剤組成物を送達することもできる。さらに、本薬剤組成物は、バルーンやステントなどの各種の体内留置材料に塗布した医療用具などの形態で適用されてもよい。
【００４１】
本薬剤組成物の有効投与量は、剤型、投与方法、対象者の年齢、体重、症状、投与スケジュール等により、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、硫酸化多糖の投与量は、成人で、1日あたり１ｍｇ〜５０００ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｍｇ〜２０００mgである。これらは、1日に数回に分けて投与しても良い。また、経口摂取以外について投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状により異なり適宜選択決定されるが、一般には、前記有効成分の投与量で、ヒト（例えば成人）０．０００１ｍｇ／体重〜１０００ｍｇ／体重、好ましくは０．０１ｍｇ／体重〜１００ｍｇ／体重、より好ましくは、０．０１ｍｇ／体重〜３０ｍｇ／体重である。また、局所適用する場合には、薬剤組成物における硫酸化多糖の含有量は、例えば薬剤組成物１００重量％中、通常０．００１重量％〜１００重量％、好ましくは０．１重量％〜９０重量％、より好ましくは、１．０重量％〜８００重量％である。
【００４２】
（治療方法）
本発明の治療方法は、本薬剤組成物を血管新生阻害を要する疾患を有する個体又は該疾患に対してリスクを有する個体に対して投与する工程を備えている。また、投与形態としては、これらの個体に経口投与することもできるし、こうした疾患部位又はこうした疾患の発生についてのリスクを有する部位に対して局所投与することもできる。
【００４３】
（食品組成物）
本発明の食品組成物は、本組成物を含有しており、血管新生阻害を要する疾患の予防、改善又は予後のため食品組成物（以下、本食品組成物という。）として利用できる。本食品組成物において、血管新生阻害を要する疾患とは、本薬剤組成物におけるものと同様である。また、本食品組成物に含まれる硫酸化多糖における硫酸エステル基における遊離の酸であってもよいし、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウムなどのアルカリ土類金属等の塩とすることができる。
【００４４】
本食品組成物は、例えば、本発明の硫酸化多糖を含有する加工食品、菓子類、調味料、嗜好性食品、飲料等の一般的な食品とすることができる。具体的形態としては、特に限定しないが、クッキー、ビスケット、キャンディ、ガム、ゼリー等の固形又は半固形嗜好食品類、果汁、茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料類、パン、麺類等の主食系の食品類、スープ、カレー、シチュー、各種ソースなどの副食系食品類、各種の風味・調味料類とすることができる。このほか、栄養補助食品、機能性食品、特定保健用食品、経管栄養剤等とすることもできる。栄養補助食品等としては、上記した薬剤組成物の経口投与形態と同様の製剤形態を採ることもできる。
【００４５】
また、本食品組成物は、本発明の血管新生阻害剤を含むことから、本発明の血管新生阻害作用並びにその作用に基づく、固形腫瘍、血管病変、皮膚疾患、骨・関節症、生殖器疾患、眼疾患及び肺疾患のほか固形腫瘍の転移などを始めとする各種の疾患の予防又は治療用途に使用可能に構成してもよい。
【００４６】
本食品組成物の有効な摂取量は、対象者の年齢、体重、状況等にもよるが、おおよそ硫酸化多糖の摂取量は、例えばヒト成人で、1日あたり１ｍｇ〜５０００ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｍｇ〜２０００mgである。これらは、1日に数回に分けて摂取しても良い。
【００４７】
本食品組成物における硫酸化多糖の含有量は特に限定されるものではないが、例えば、乾燥重量換算で０．０１質量％以上２０質量％以下程度が好ましく、より好ましくは、０．１質量％以上５質量％以下である。
【００４８】
（化粧料組成物）
本組成物を含有する本発明の化粧料組成物（以下、本化粧料組成物という。）は、皮膚外用として化粧料組成物とすることができる。本化粧料組成物は、化粧品、医薬部外品等とすることができ、具体的には、乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等とすることができる。
【００４９】
本化粧料組成物の皮膚外用における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、例えば、全重量の０．００１質量％以上５０質量％以下程度、好ましくは０．０１質量％以上１０質量％以下である。これを１〜数回／日に分けて塗布することができる。これを１〜数回／日に分けて塗布することができる。
【００５０】
（非ヒト動物用薬剤組成物等）
さらに、本阻害剤を含有する組成物は、非ヒト動物用の薬剤組成物や餌料組成物として使用できる。非ヒト動物としては、家畜、家禽、ペット等が挙げられる。非ヒト動物においても、本阻害剤を投与し又は摂取させることにより、血管新生阻害を要する疾患の予防又は治療が可能であり、健康の維持が可能となる。なお、本阻害剤を含有する種々の形態の非ヒト動物用の薬剤組成物や餌料組成物を製造することは当業者において容易である。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）
（ヒトエグサからの硫酸化多糖の抽出）
（試料１）
三重県産養殖ヒトエグサ７５０ｇ（水分約７％）を１８ｌの水に３０分間浸漬させて膨潤させた後、１０分間水切りを行った。この藻体に水１８ｌを加えて沸騰させてクエン酸５．４ｇを添加し、９５℃〜１００℃で６時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を１８．８ｋｇとした上、珪藻土５４０ｇを添加し混合して遠心分離して上澄み液（１５．９ｋｇ）を得た。この上澄み液１．５ｌにさらに珪藻土５ｇを添加して減圧ろ過処理を行った。この操作を繰り返して上澄み液の全量を減圧ろ過し、得られたろ液の総量に水を加えて１６ｋｇとした。
【００５３】
このろ液を次に、限外ろ過膜（分画分子量１万）でろ過した。限外ろ過処理は、膜透過液が５０％の時点で終了させる。この濃縮液に対して減量分（透過液量分）を補充して全量で１６ｋｇとした。この処理を合計３回繰り返した。最終的に得られた１６ｋｇの濃縮液をスプレードライして粉体（試料１：２７０ｇ）を得た。
【００５４】
試料１について、以下のＨＰＬＣ条件でＧＰＣを行った。ＧＰＣによれば、試料６のプルラン換算重量平均分子量は５１万であった。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨ Ｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ２本
溶離液：０．１Ｍ ＮａＣｌ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ
流速：１ｍｌ／分
【００５５】
（試料２）
三重県産養殖ヒトエグサ７５０ｇ（水分約７％）を１８ｌの水に３０分間浸漬させて膨潤させた後、１０分間水切りを行った。この操作を合計３回行って藻体を洗浄した。この藻体に水１８ｌを加えて９５℃〜１００℃で６時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を１８．８ｋｇとした上、珪藻土１０８０ｇを添加し混合して遠心分離して上澄み液（１３．６ｋｇ）を得た。この上澄み液の全量をスプレードライして粉体（試料２：１４０ｇ）を得た。試料１と同様の条件でＧＰＣを行ったところ、試料２のプルラン換算重量平均分子量は２５０万であった。
【００５６】
（試料３〜５）
試料1の約６ｇを７Ｍ尿素０．０５ＭＫＣｌ溶液３００ｍｌに溶解した（２％溶液）。
この溶液を、イオン交換カラムであるＤＥ５２充填カラム（ワットマン社製、直径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ）に注入して、移動相として、７Ｍ尿素０．０５ＭＫＣｌ溶液を５００ｍｌ、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ溶液を同３０００ｍｌ、７Ｍ尿素０．２５ＭＫＣｌ溶液を１５００ｍｌ及び７Ｍ尿素２ＭＫＣｌ溶液を１５００ｍｌ、通液して、ＫＣｌ濃度を段階的に高めて多糖を分画した。７Ｍ尿素０．２５ＭＫＣｌ溶液通液時における溶出分画を、セロファン膜を用いて流水下４〜５日透析して濃縮液を凍結乾燥して試料３とした。また、７Ｍ尿素２ＭＫＣｌ通液時における溶出分画を同様に透析して濃縮液を凍結乾燥して試料４とした。さらに、７Ｍ尿素０．２５ＭＫＣｌ溶液通液時における溶出分画１ｇを蒸留水５０ｍｌに溶解し、カチオン交換樹脂ＳＫ１０４充填カラム（三菱化成株式会社製）を用いて、脱カチオン液を回収し（ｐＨ１．９〜２．４）、１ＮＮａＯＨで中和し、フリーズドライして粉体（試料５）を得た。試料３及び４について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料３，４，５のプルラン換算重量平均分子量はそれぞれ１１９万、２３万、２２万であった。
【００５７】
（試料６）
三重県産養殖ヒトエグサ２４０ｇを６ｌの水に加え３０分間浸漬後、洗浄水を分離し再度水を加え全量６．２４ｋｇとした。このものを液温６０℃〜６５℃に維持しながら２時間温水抽出を行った。遠心分離により温水抽出液３．７９ｋｇと固形分（以下、回収ヒトエグサという。）１．２３ｋｇを得た。この回収ヒトエグサ３００ｇに、水３ｌとクエン酸１００ｍｇを加えて、９５℃〜１００℃で６時間適時加水しながら熱水抽出した。この熱水抽出液をろ過してろ液の全量を凍結乾燥して粉体（３ｇ）を得た。この粉体を０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナゼーＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１について行ったＧＰＣと同様の条件にてＧＰＣを行い、保持時間（ＲＴ）が約１４．５分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブ用いて４〜５日透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体（試料６）を得た。こうして得られた試料６について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料６のプルラン換算重量平均分子量は１８９万であった。
【００５８】
（試料７）
試料６製造時に得られたヒトエグサ温水抽出液５５０ｇを凍結乾燥により粉体３ｇを得た。この粉体３ｇを０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナゼーＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１についてのＧＰＣ条件にて保持時間（ＲＴ）が約１５．５分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブを用いて５日間透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体（試料７）を得た。こうして得られた試料７について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料７のプルラン換算重量平均分子量は６２万であった。
【００５９】
（試料８）
試料１の３ｇを０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナーゼＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１についてのＧＰＣ条件にて保持時間（ＲＴ）が約１７分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブを用いて５日間透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体（試料８）を得た。こうして得られた試料８について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料８のプルラン換算重量平均分子量は２１万であった。
【００６０】
（試料９）
試料６製造時に得られたヒトエグサ温水抽出液５５０ｇを凍結乾燥により粉体３ｇを得た。この粉体３ｇを試料９とした。試料９のＧＰＣによるプルラン換算重量平均分子量は１００万であった。
【００６１】
（試料１０）
三重県産養殖ヒトエグサ４００ｇ（水分約７％）を１０ｌの水に３０分間浸漬させて膨潤させた後、１０分間水切りを行った。この藻体に水１０ｌを加えて沸騰させてリンゴ酸２８．８ｇを添加し、９５℃〜１００℃で４時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を１０ｋｇに調整後、２．５ｋｇを珪藻土ろ過により固液分離を行った。この清澄液３００ｇを透析チューブにて脱塩精製後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥品３ｇを０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナーゼＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１についてのＧＰＣ条件にて保持時間（ＲＴ）が約１８分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブを用いて５日間透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体２ｇ（試料１０）を得た。試料１０について試料１と同様の条件でＧＰＣを行ったところ、そのプルラン換算重量平均分子量は５万であった。
【００６２】
（実施例２）
（血管新生阻害活性の評価）
実施例１で調製した試料１〜８について、ヒト臍帯由来静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて管腔形成を指標とした血管新生阻害活性の評価を行った。まず、氷冷した２４ウェルプレートのアックウェルに氷冷した１０ｍｇ／ｍｌの濃度のマトリゲル（ＢＤ１社製）の０．３ｍｌを速やかに添加したあとに、５％ＣＯ2インキュベーター内（３７℃）で２時間インキュベートさせることによりゲル化させた。
【００６３】
次に、ＨＵＶＥＣをコラーゲンコートシャーレに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＣＤＢ１３１培養液（クロレラ工業株式会社製）を用いて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で対数増殖中期から後期になるまで培養した。次いで、リン酸緩衝化整理食塩水で２回洗浄後、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡで約１分間処理して、シャーレ壁からＨＵＶＥＣを分離浮遊させた。適当量の１０％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培養液を添加し、ピペッティングしてＨＵＶＥＣ浮遊液を調製した。血球計測盤でＨＵＶＥＣ細胞数を計測した後、５％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培養液で希釈して最終的に２×１０４の細胞／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。その後、ＨＵＶＥＣ浮遊液に最終濃度が０、０．０１、０．１及び１μｇ／ｍｌとなるように試料１〜８をそれぞれ加えて、このＨＵＶＥＣ浮遊液１ｍｌをゲル化させたマトリゲル上に静かに播種して、３７℃で６時間ＣＯ２インキュベーター内で培養した。その後、位相差顕微鏡（オリンパス製、倍率１００倍）で観察し、画像をＣＣＤカメラを用いて撮影し、画像データについて画像解析装置（ＮＩＨ ＩＭＡＧＥ）を用いて少なくとも４視野を選択し、それぞれの視野に含まれる管腔の長さを計測し、その平均値をそれぞれの管腔長さとした。こうして得られた管腔長さと、硫酸化多糖不存在下において同様に計測した管腔長さとから、以下の式から管腔形成阻害率（％）を算出した。結果を図１及び図２に示す。
【００６４】
管腔形成阻害率（％）＝（硫酸化多糖不存在下における管腔長さ−試料における管腔長さ）／（硫酸化多糖非存在下の管腔長さ）×１００
【００６５】
図１及び図２に示すように、全ての試料において、管腔形成を阻害しており、なかでも、試料２、試料５，試料６において、対照に対して２０％以下に管腔形成を阻害していた。これらのことから、試料１〜８のいずれの硫酸化多糖は血管新生阻害活性を有しており、なかでも、試料２、試料５、試料６における硫酸化多糖画分は、高い血管新生阻害活性があることがわかった。特に、粗精製画分であってＧＰＣでのプルラン換算重量平均分子量が最大（２５０万）である試料２は高い血管新生阻害活性を示した。また試料６，７及び８ではＧＰＣでの平均分子量が高い成分ほど阻害活性が高いことがわかった。また、一方、ＧＰＣでのプルラン換算重量平均分子量２２万〜２３万である低分子試料４，５において、試料４をイオン交換により脱塩後、ナトリウム単一塩に調整した試料５は、イオン交換処理前の試料４よりも高い血管新生阻害活性を示すことがわかった。
【００６６】
（実施例３）
試料１、２、５〜８及び１０について硫酸含有量と構成単糖の成分比率を測定した。なお、それぞれ以下の方法により測定した。結果を表１に示す。
【００６７】
（１）硫酸基含有量の測定方法
（燃焼フラスコ法）
硫黄原子の元素分析を、分析化学、１５巻、６８９〜６９１頁、（１９６６年）、１７巻、１３２２〜１３２４頁、（１９６８年）に記載の燃焼フラスコ法により行い、得られた試料中の硫黄原子の含有量（重量％）に３を乗ずることにより硫酸基含有量を算出した。
【００６８】
（２）構成単糖の測定方法
試料を酸加水分解〈試料（約２０ｍｇ）を２Ｎ硫酸（１０ｍｌ）に溶解させ、沸騰水浴中で２時間加熱〉後、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ、カラム温度：３５℃、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）にて各種単糖を同定し定量した。
【００６９】
【表１】
【００７０】
表１に示すように、試料１、２、５〜８及び１０は、いずれもラムノースを構成単糖の主成分としており、その質量比率は、６８質量％から９３質量％にわたっており、第２の主成分であるグルコースの質量比率との和では、８６質量％から９７質量％にわたり、さらにキシロースの質量比率を加えると、９２質量％〜１００質量％であった。また、良好な血管新生阻害活性を有している試料２、試料５及び試料６は、ラムノースの質量比率は７５質量％から９３質量％の範囲であった。また、これらの３種の試料について、グルコースの質量比率は、４質量％から１１質量％であり、さらに、キシロースの質量比率は、３質量％から７質量％であった。なお、これらの３種の試料について、ラムノースの質量％とグルコースの質量％との総和は、８６質量％から９７質量％であり、これらの２種の単糖が大部分の単糖を構成していることがわかった。
【００７１】
また、表１に示すように、試料２においては、Rham／Gul比（ラムノースの質量％／グルコースの質量％）が、６．８であり、試料５では２３．３、試料６では、同１８．２となっている。また、Rham／Xylo比（ラムノースの質量％／キシロースの質量％）は、試料２では１０．７、試料５では３１．０、試料６では２２．８であり、（Rham+Gul）／Xylo比（ラムノースの質量％とグルコースの質量％の総和／キシロースの質量％率）は、試料２では、１２．３、試料５では、３２．３、試料６では２４であった。
【００７２】
（実施例４）
本実施例では、In vivoでの癌の転移に及ぼすヒトエグサ抽出成分の影響を以下の方法で評価した。
【００７３】
癌細胞のin vivo転移の測定
各群10匹のC57/BL6マウスを用いて、ヒトエグサ熱水抽出物（実施例１の試料２）の癌細胞の転移に及ぼす効果を測定した。B16マウスメラノーマ細胞（50万個/200μl）をマウスの尾静脈から注射するとともに、ヒトエグサ熱水抽出物（実施例１の試料２）(250 mg/kg)を連日経口投与し、2週間後に肺を取り出し、肺に見られる癌細胞の転移巣の数を顕微鏡下で計数し、対照（蒸留水投与群）のマウスのそれと比較することにより、ヒトエグサ熱水抽出物（実施例１の試料２）の癌細胞の転移に及ぼす影響を評価した。結果を図３及び図４に示す。なお、転移率は、コントロールの転移巣の数に対するヒトエグサ熱水抽出物の転移巣の数の％である。
【００７４】
これに対して、図３及び図４に示すように、C57/BL6マウス尾静脈から注入したB16マウスメラノーマ細胞の肺への転移を２週間後に観察した結果、肺への転移巣の数は、蒸留水投与群に比較して、ヒトエグサ熱水抽出物経口投与群では著しく有意に低下していた。
【００７５】
以上のことから、ヒトエグサの熱水抽出物は、in vivoにおける癌細胞の肺転移を顕著に抑制することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】試料１〜３の管腔形成率（％）を示すグラフ図。
【図２】試料４〜８の管腔形成率（％）を示すグラフ図。
【図３】Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の肺転移を示す図。
【図４】Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の肺転移率を表す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害剤及びその利用に関し、詳しくは、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖を含有する血管新生阻害剤及び該阻害剤を含む血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においては様々な生理的条件下で血管新生が生じているが、ガンの成長や転移に際し、ガン細胞が自身の栄養補給のために血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を誘導して血管新生を生じさせていると考えられている。このため、腫瘍血管新生を阻害してガン細胞の発育や転移を抑制する方法が注目されてきており、血管新生を阻害する薬剤も開示されている（特許文献１）。
【０００３】
一方、藻類由来の酸性多糖としては、フコダイン、ラムナン硫酸、硫酸ガラクタン等が知られており、例えば、硫酸化多糖であるフコダインには、抗がん活性、抗凝血活性などが知られている。また、同じく硫酸化多糖であるラムナン硫酸においては、抗凝血活性が知られている（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００３−９６０７８
【特許文献２】特開昭６３−２３５３０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ラムナン硫酸の血管新生阻害作用については報告されていない。そこで、本発明は、血管新生を阻害することのできる新規な血管新生阻害剤及び該阻害剤を用いた薬剤組成物及び食品組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、緑藻植物のアオサ藻綱に属するヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎ
ｉｔｉｄｕｍ ）やヒロハノヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ）のラムナン硫酸を含有する抽出画分が血管新生阻害作用を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００６】
本発明の一つの形態によれば、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、血管新生阻害剤が提供される。この形態においては、前記硫酸化多糖は、以下の特徴を有することができる。
（ａ）構成多糖の全質量において、ラムノース含量が５０質量％以上、グルコース含量が１質量％以上３０質量％以下及びキシロース含量が１質量％以上１０質量％以下
（ｂ）硫酸基含量が１０質量％以上４０質量％以下
【０００７】
さらに、本発明の血管新生阻害剤は、ゲルろ過クロマトグラフィーによるプルラン換算重量平均分子量が０．５万以上３００万以下であってもよい。
【０００８】
本形態においては、前記硫酸化多糖はアオサ藻綱に属する藻類由来とすることができる。また、前記阻害剤は、前記藻類又は前記藻類の抽出物を含むことができ、前記抽出物を前記藻類の熱水抽出物とすることができる。さらに、前記藻類は、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類から選択することができ、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ又はＭｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎｉｔｉｄｕｍを用いることができる。
【０００９】
また、本発明の他の一つの形態によれば、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類又はその抽出物を含有する、血管新生阻害剤が提供される。この形態においては、前記阻害剤は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有していることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の他の一つの形態によれば前記硫酸化多糖がナトリウム塩であることも好ましい態様である。
【００１１】
また、本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかの血管新生阻害剤を含む、血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物が提供される。この形態において、前記疾患は固形腫瘍、血管病変、皮膚疾患、骨・関節症、生殖器疾患、眼疾患及び肺疾患からなる群から選択することができる。さらに、前記疾患は、固形腫瘍の転移であってもよい。また、前記薬剤組成物は、局所投与用とすることもできるし、経口投与用であってもよい。
【００１２】
本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかの血管新生阻害剤を含有する、血管新生阻害を要する疾患の予防又は予後のための食品組成物が提供される。前記食品組成物は、栄養補助組成物とすることができる。さらに、前記食品組成物は、固形腫瘍の転移抑制用とすることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の血管新生阻害剤は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有することを特徴としている。本発明の血管新生阻害剤を投与することにより、血管新生阻害を要する疾患の予防又は治療が可能となる。さらに、本阻害剤を摂取させることにより、血管新生阻害を要する疾患患者又は該疾患についてのリスクを要する個体、具体的には生化学的、身体的又は遺伝的に該疾患の兆候を有する個体、該疾患の治療後の個体、派生的疾患としてこうした疾患の発症が予測される個体において該疾患の発症を予防若しくは遅延し、進行を抑制し、予後を改善し、ＱＯＬを向上させることができる。
【００１４】
なお、本明細書において、「血管新生」とは既存の血管から新しい血管が形成されることを意味している。したがって、胚形成期の初期の段階にみられる最初の血管形成の過程を意味する脈管形成は、本発明において「血管新生」には含まれない。また、本明細書において、血管新生とは、哺乳類及び非哺乳類を含む動物の血管新生を対象としている。また、哺乳類としては、ヒト及び非ヒト動物を含んでおり、非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜、ニワトリ、七面鳥等の家禽、イヌ、ネコ等のペットが含まれる。
【００１５】
以下、本発明の血管新生阻害剤、薬剤組成物及び食品組成物等について詳細に説明する。
（血管新生阻害剤）
本発明の血管新生阻害剤（以下、単に本阻害剤という。）は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有している。本発明における硫酸化多糖としては、例えば、構成糖の３位又は４位が硫酸エステル化されている硫酸化多糖が挙げられる。硫酸化多糖は、その硫酸基において遊離の酸であってもよいし、金属塩などの塩であってもよい。こうした塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属等が挙げられる。本発明においては、好ましくはナトリウム塩である。
【００１６】
本発明における硫酸化多糖の単糖組成は、ラムノースを主成分としており、構成単糖の５０質量％以上がラムノースである。硫酸化多糖におけるラムノースモル比率は、好ましくは、６０質量％以上であり、さらに好ましくは７０質量％以上である。ラムノース比率と血管新生阻害活性との関係は必ずしも明らかではなく本発明を拘束するものではない。
【００１７】
なお、硫酸化多糖における構成単糖の組成については、例えば、酸加水分解法により多糖を構成単糖まで分解後、遊離酸を分離除去し、単糖成分をＨＰＬＣで定量することにより得ることができる。酸加水分解法は、例えば、以下のようにして行うことができる。糖類含有試料を、酸加水分解〈多糖試料（約２０ｍｇ）を２Ｎ硫酸（１０ｍｌ）に溶解させ、沸騰水浴中で２時間加熱〉後、１０％塩化バリウム水溶液を添加し遊離硫酸を硫酸バリウムとして沈降分離（遠心分離）させ、上澄液を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ、カラム温度：３５℃、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）により行った。
【００１８】
また、本発明の硫酸化多糖は、ラムノース以外の構成単糖として、グルコース及び／又はキシロースを含むことができる。好ましくはグルコースを含有し、さらにキシロースを含んでいる。グルコースを含有する場合、その含量は１質量％以上３０質量％以下であることが好ましい。また、キシロースを含有する場合は、その含量は１質量％以上１０質量％以下であることが好ましい。なお、これらの構成単糖についても、ラムノース含量と同様にして算出することができる。
【００１９】
本発明の硫酸化多糖のゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量は、血管新生阻害活性を有する限り特に限定しない。例えば、プルラン換算重量平均分子量が０．５万以上３００万以下のものを用いることができる。本阻害剤又は組成物が経口投与することを考慮すると、例えば、プルラン換算重量平均分子量が２．５万以下のものを好ましく用いることができる。一方、注射等により局所投与する場合には、例えば、プルラン換算重量平均分子量３０万超３００万以下程度のものを好ましく用いることができる。
【００２０】
本発明の硫酸化多糖としては、こうした天然由来の硫酸化多糖を必要に応じて適宜加水分解したものであってもよい。また、本発明の硫酸化多糖としては、こうしてＧＰＣ等により分画した各種の分子量画分を単独又は２種以上の画分を組み合わせて用いることができる。なお、分子量に基づく分画手法としては、例えば、ＧＰＣのほか、限外ろ過法を単独であるいは他の分子量分画法と組み合わせて用いることができる。こうした各種の分画法により分離した画分を組み合わせてもよい。
【００２１】
本発明の硫酸化多糖における硫酸基含有量は、血管新生阻害活性を有する限り特に限定しないが、おおむね１５質量％以上であることが好ましい。また、上限も特に限定しないが、４０質量％以下であることが好ましい。より好ましくは３５質量％以下である。なお、硫酸基含有量は、燃焼フラスコ法、ロジソン酸法により求めることができる。燃焼フラスコ法は、例えば、分析化学、１５巻、６８９〜６９１頁、（１９６６年）、１７巻、１３２２〜１３２４頁、（１９６８年）に記載の燃焼フラスコ法を採用することができる。燃焼フラスコ法により試料中の硫黄元素を定量し、得られた試料中の硫黄原子の含有量（質量％）に３を乗ずることにより硫酸基含有量を算出することができる。また、ロジソン法は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、４１巻、４７１〜４７６頁、（１９７１年）に記載の方法を採用することができる。
【００２２】
こうした硫酸化多糖としては、天然には、アオサ藻綱に属する藻類に含まれ、該藻類から抽出される酸性多糖が挙げられる。したがって、本阻害剤は、こうした硫酸化多糖を含むアオサ藻綱に属する藻類又は該藻類からの抽出物若しくはその一部を含有することができる。本発明を拘束するものではないが、本発明の硫酸化多糖がその由来植物である藻類の抽出物とともにあるいは当該抽出物として本阻害剤に含まれることは、本発明の硫酸化多糖の生理活性上好ましいと考えられる。したがって、本阻害剤としては、こうした藻類又はその抽出物を好ましく用いることができる。より好ましくは、本発明における硫酸化多糖を含有することが好ましく、さらに好ましくは、本発明の硫酸化多糖を含有する抽出画分を用いる。
【００２３】
藻類から硫酸化多糖を得るには、例えば、以下の方法を採用することができる。乾燥させた藻類を洗浄し水で膨潤させた後、水などの水性媒体で抽出する。水性媒体としては、水を主体とし、好ましくは水のみあるいは水と有機酸及び／又は無機酸とを含む酸性水性媒体を用いる。酸としては、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、シュウ酸、Ｌ−アスコルビン酸、酢酸、塩酸、硫酸などを単独であるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、抽出に際しては、適宜原料を細断する。水性媒体による硫酸化多糖の抽出は、水性媒体を加熱して行うことが好ましく、熱水（７０℃以上、好ましくは９５℃以上程度）で行うことが好ましい。抽出時間はおおよそ１時間〜８時間程度である。抽出後は、遠心分離により沈殿物を除いた後、上澄み液をそのまま透析あるいはエタノール等の有機溶媒を添加して硫酸化多糖を沈殿させた後該沈殿物の水溶液を透析して低分子成分を除去することにより、粗硫酸化多糖画分を得ることができる。この粗画分は、このまま本発明の阻害剤として使用することができるが、さらに、この粗画分を、ＤＥＡＥセルロースカラム等を用いてイオン強度勾配をかけて精製することができる。なお、こうした採取操作においては、適時にバイオアッセイを並行して行い、管腔形成の阻害を指標として精製を進めることが好ましい。
【００２４】
また、藻類由来の硫酸化多糖、例えば、ラムナン硫酸は、主としてＮａ，Ｋ，Ｃａ，Ｍｇ塩等の形態を採っているが、本発明の硫酸化多糖は、こうした天然の塩の形態に限定されないで各種の形態を採ることができる。塩の種類を変えるには、硫酸化多糖の硫酸基をイオン交換により一旦フリーとし、その後所望のアルカリで中和すればよい。例えば、本発明における硫酸化多糖のナトリウム塩は、以下のようにして得ることができる。すなわち、硫酸化多糖を例えば、塩酸等で平衡化したカチオン交換樹脂カラム等により硫酸基をフリーとし、その後、硫酸基フリーの硫酸化多糖をＮａＯＨで中和すればよい。
【００２５】
こうした藻類としては、ヒビミドロ目Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ、Ｐｒｏｔｏｍｏｎｏｓｔｒｏｍａや、アオサ目Ｂｌｉｎｄｉｎｇｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ、Ｕｌｖａ、Ｕｌｖａｒｉａが挙げられる。具体的には、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎｉｔｉｄｕｍ（ヒトエグサ）、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ（ヒロハノヒトエグサ）、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｓｒａｖｉｌｌｅｉ（ウスヒトエグサ）、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ａｎｇｉｃａｖａ（エゾヒトエグサ）、Ｐｒｏｔｏｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｕｎｄｕｌａｔｕｍ（シワヒトエグサ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ（スジアオノリ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ボウアオノリ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ（ヒラアオノリ）、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｌｉｎｚａ（ウスバアオノリ）、Ｕｌｖａ ｐｅｒｔｕｓａ（アナアオサ）、Ｕｌｖａｒｉａ ｆｕｓｃａ（クロヒトエグサ）、Ｂｌｉｎｄｉｎｇｉａ ｍｉｎｉｍａ（ヒメアオノリ）が挙げられる。なかでも、ヒトエグサ、ヒロハノヒトエグサなどが好ましく用いられる。なお、ヒトエグサとヒロハノヒトエグサは類似しており、両者を区別することは必ずしも容易でない。したがって、ある藻類が両者のいずれかであると明確に分類できる場合を除いて、当該藻類をヒトエグサ又はヒロハノヒトエグサとして取り扱うことができる。
【００２６】
また、硫酸化多糖としては、血管新生阻害活性を有する限り天然由来の多糖又は硫酸化多糖を化学修飾した半合成の硫酸化多糖も挙げられる。例えば、上記した藻類を始めとする天然生物から採取した硫酸化多糖あるいはその分解物について硫酸化を施したものであってもよいし、また、部分的に脱硫酸したものであってもよい。さらに、硫酸エステル基を有していない天然由来の多糖又はその分解物を硫酸化してもよい。硫酸化は、水酸基をスルホン化すればよい。水酸基のスルホン化は、例えば、クロロスルホン酸−ピリジン錯体 、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）−硫酸、三酸化イオウ−トリメチルアミン錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で三酸化イオウ−ピリジン錯体を用いる方法などにより実施することができる。
【００２７】
さらに、硫酸化多糖としては、血管新生阻害活性を有する限り、合成多糖を硫酸化したもの又は硫酸化した単糖やオリゴマーを重合したものなどの合成硫酸化多糖も挙げられる。さらに、本発明の硫酸化多糖としては、血管新生阻害活性を有する限り、ラムノース以外の構成単糖に対して糖に施される一般的な化学修飾が施された硫酸化多糖であってもよい。化学修飾としては例えば、水酸基等のアシル化、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化などが挙げられる。こうした糖に対する化学修飾法は当業者であれば必要に応じて行うことができる。
【００２８】
本阻害剤は、こうした硫酸化多糖の１種又は２種以上若しくはこうした硫酸化多糖を含有する藻類若しくはその抽出物を組み合わせて用いることができる。本阻害剤の血管新生阻害活性は、例えば、一般に用いられている管腔形成を指標とする方法により評価することができる。管腔形成を指標とする血管新生阻害の評価の一例を以下に説明する。まず、ヒト臍帯由来静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の所定細胞濃度の細胞浮遊液を調製し、この浮遊液に対して各種濃度の硫酸化多糖を加え、この混合液をマトリゲル（商標）などの細胞培養用ゲル上に播種して、例えば、３７℃で６時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養し、その後、位相差顕微鏡で観察し、培養状態の画像情報をＣＣＤカメラ等で取得してこの画像情報を画像解析装置にてＨＵＶＥＣが形成する管腔の長さを測定する。管腔の長さは、例えば、ＣＣＤカメラを装着した位相差顕微鏡を用いて撮影した画像から選択した少なくとも四視野において形成された管腔の長さを計測し、その平均値として算出することができる。また、阻害率は、硫酸化多糖の非存在下に形成された管腔長（平均値）−硫酸化多糖存在下の管腔長（平均値）／硫酸化多糖非存在下の管腔長×１００（％）として算出することができる。
【００２９】
また、本阻害剤については、例えば、以下の方法により血管新生阻害活性（（１）及び（２））またガン細胞増殖転移抑制効果（３）を確認できる。
【００３０】
（１）血管新生阻害活性−マトリゲル（商標）・インプラントアッセイ
種々の濃度でのヒトエグサ抽出試料などの硫酸化多糖含有試料を、VEGF及びヘパリンの存在下あるいは非存在下にマトリゲルに混入し、このマトリゲルを重症複合免疫不全症（SCID）マウスの皮下に注入する。３日後に、皮下においてマトリゲルに向かって新生した血管の量を顕微鏡下肉眼的に観察し、写真撮影して評価を行う。また、新生血管を含むマトリゲルを試験管内にてコラゲナーゼ処理により溶解し、溶解液中に滲出したヘモグロビン量を測定し、それに基づき新生血管の量を測定する。これによりマトリゲル内に添加した物質の血管新生抑制作用を対照（生理食塩水投与群）と比較し評価を行う。
【００３１】
（２）血管新生阻害活性−CAM（Chorioallantois membrane）アッセイならびにラット角膜アッセイニワトリ胚漿尿膜CAM（Chorioallantois membrane）あるいはラット角膜に試料を含有させたディスク基材を設置し、２，３日後に、ディスクに向かって新生された血管を顕微鏡下肉眼的に観察し、写真撮影をして、対照（生理食塩水投与群）と比較し評価を行う。
【００３２】
（３）ガン細胞増殖転移抑制効果−担癌動物を用いたin vinoテスト
株化乳癌細胞あるいはメラノーマ細胞（５０万個／２００μｌ）をSCIDマウスの皮内に注入し、同時に試料（例えば、１５００ｍｇ／ｋｇ）を連日投与する。投与後、マウス皮内の腫瘍の容積を経時的に観察し、対照（生理食塩水投与群）のマウスと比較する。同時に、腫瘍内における新生血管を血管内皮細胞特異的分子マーカーであるＣＤ３１（PECAM）に対する抗体を用いた免疫染色法により測定し、対照（生理食塩水投与群）のマウスと比較評価を行う。一方、試料の癌細胞の転移に対する効果は、乳ガン細胞あるいはメラノーマ細胞（例えば、５０万個／２００μｌ）をSCIDマウスの尾静脈から注射するとともに、試料（１５００ｍｇ／ｋｇ）を連日投与し、３から５週間後に肺を取り出し、肺に見られる転移巣の数を顕微鏡下で計数し、対照（生理食塩水投与群）のマウスと比較評価を行う。
【００３３】
本阻害剤の血管新生阻害活性は、管腔形成試験以外のインビトロ及びインビボの血管新生阻害活性の評価法によって血管新生阻害活性を確認できたものであってもよい。
【００３４】
本阻害剤は、粉末などの固体、溶液、懸濁液等の各種の形態を取ることができる。一般的には粉末等の固体状態で流通され、提供される。本組成物には、硫酸化多糖以外に硫酸化多糖の安定性等を高めるために適宜添加剤を含んでいてもよい。また、硫酸化多糖以外に、抽出原料由来のタンパク質等を含んでいる場合もある。
【００３５】
本阻害剤は、各種研究用試薬として用いることができるほか、血管新生阻害を要する疾患の予防や治療に用いる薬剤組成物、こうした疾患を有する若しくはリスクを有する個人や健常人に摂取させる食品組成物や外用に用いる化粧料組成物等とすることができる。
【００３６】
（薬剤組成物）
本発明の薬剤組成物は、本阻害剤を含有しており、血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物（以下、本薬剤組成物という。）として使用できる。本薬剤組成物において、血管新生阻害を要する疾患としては、例えば、胃癌、食道癌、舌癌、咽頭癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、胆管癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、多発性骨髄腫瘍などの固形腫瘍が挙げられる。また、血管線維腫、アテローム性動脈硬化、動静脈奇形、血管癒着などの血管病変、肉芽、血管腫、肥大性瘢痕、早老、乾癬、強皮症、ケロイド、いぼなどの皮膚疾患、出血性関節炎、非結合骨折、リウマチ様関節炎、変形性関節症等の骨・関節症、卵巣肥大性症候群、卵胞嚢胞、多嚢胞卵巣等の生殖器疾患、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、新生血管緑内症、角膜移植後血管新生、トラコーマ等の眼疾患、排気腫、慢性気管支炎等の肺疾患などが挙げられる。なお、本薬剤組成物が対象とする疾患はこれらに限定されるものではない。また、上記した各種固形腫瘍の予防又は治療には、これらの各種固形腫瘍の転移の抑制を含んでいる。
【００３７】
本薬剤組成物における硫酸化多糖は、硫酸エステル基における遊離の酸であってもよいし、医薬的に許容される塩であってもよい。こうした塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属等が挙げられる。本発明の硫酸化多糖は、ナトリウム塩であることが好ましい。
【００３８】
また、本薬剤組成物は、本組成物以外の上記疾患に有効な他の薬剤を含有することができる。例えば、抗ガン剤、抗炎症剤、抗菌剤又は抗ウイルス剤などの抗感染症剤などが挙げられる。本薬剤組成物は、また、上記疾患の有効な他の薬剤と併用して投与可能に組み合わせられた薬剤組成物セットとして提供されてもよい。
【００３９】
本薬剤組成物は、少なくとも本阻害剤を有効成分として含むほか、医薬上許容される公知の薬剤担体を含んで、各種の製剤形態を備えることができる。こうした薬剤担体は、当該分野において周知であり、本薬剤組成物に適用される可能性のある製剤形態に用いられる公知の薬剤担体を適宜選択して用いればよい。本薬剤組成物の製剤形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤、チュアブル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、注射剤、坐剤、フィルム剤、ゲル剤が挙げられる。また、こうした製剤形態に用いられる薬剤担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。さらに、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を含んでいてもよい。こうした本薬剤組成物は、各種製剤形態に応じた公知の常套手段により調製することが可能である。
【００４０】
本薬剤組成物は、哺乳類において難消化性の多糖体を含有するため、経口投与しても、口腔、食道、胃、小腸、大腸等の消化管内において血管新生阻害作用を生じさせることができる。この場合には、各種の固形又は液体の経口剤として提供される。また、本薬剤組成物は、腫瘍部位や炎症部位への局所適用剤として使用できる。例えば、腫瘍部位の摘出前又は後にその領域を覆ったり、あるいは所定の標的部位の血管新生を阻害したりするのに本薬剤組成物を用いることができる。また、本薬剤組成物は、リウマチや各種疾患の炎症部位への適用も挙げられる。例えば、本薬剤組成物を、関節、皮膚、口腔、各種内膜、血管内皮、網膜などにおける炎症部位に注入、塗布等することにより、炎症部位での血管新生を阻害することができる。本薬剤組成物は、こうした局所適用の製剤形態として、特に、液剤、用時溶解する固形剤、フィルム剤、ゲル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。また、内視鏡、カテーテル、チューブ等を用いて経管的又は経皮的に本薬剤組成物を送達することもできる。さらに、本薬剤組成物は、バルーンやステントなどの各種の体内留置材料に塗布した医療用具などの形態で適用されてもよい。
【００４１】
本薬剤組成物の有効投与量は、剤型、投与方法、対象者の年齢、体重、症状、投与スケジュール等により、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、硫酸化多糖の投与量は、成人で、1日あたり１ｍｇ〜５０００ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｍｇ〜２０００mgである。これらは、1日に数回に分けて投与しても良い。また、経口摂取以外について投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状により異なり適宜選択決定されるが、一般には、前記有効成分の投与量で、ヒト（例えば成人）０．０００１ｍｇ／体重〜１０００ｍｇ／体重、好ましくは０．０１ｍｇ／体重〜１００ｍｇ／体重、より好ましくは、０．０１ｍｇ／体重〜３０ｍｇ／体重である。また、局所適用する場合には、薬剤組成物における硫酸化多糖の含有量は、例えば薬剤組成物１００重量％中、通常０．００１重量％〜１００重量％、好ましくは０．１重量％〜９０重量％、より好ましくは、１．０重量％〜８００重量％である。
【００４２】
（治療方法）
本発明の治療方法は、本薬剤組成物を血管新生阻害を要する疾患を有する個体又は該疾患に対してリスクを有する個体に対して投与する工程を備えている。また、投与形態としては、これらの個体に経口投与することもできるし、こうした疾患部位又はこうした疾患の発生についてのリスクを有する部位に対して局所投与することもできる。
【００４３】
（食品組成物）
本発明の食品組成物は、本組成物を含有しており、血管新生阻害を要する疾患の予防、改善又は予後のため食品組成物（以下、本食品組成物という。）として利用できる。本食品組成物において、血管新生阻害を要する疾患とは、本薬剤組成物におけるものと同様である。また、本食品組成物に含まれる硫酸化多糖における硫酸エステル基における遊離の酸であってもよいし、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウムなどのアルカリ土類金属等の塩とすることができる。
【００４４】
本食品組成物は、例えば、本発明の硫酸化多糖を含有する加工食品、菓子類、調味料、嗜好性食品、飲料等の一般的な食品とすることができる。具体的形態としては、特に限定しないが、クッキー、ビスケット、キャンディ、ガム、ゼリー等の固形又は半固形嗜好食品類、果汁、茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料類、パン、麺類等の主食系の食品類、スープ、カレー、シチュー、各種ソースなどの副食系食品類、各種の風味・調味料類とすることができる。このほか、栄養補助食品、機能性食品、特定保健用食品、経管栄養剤等とすることもできる。栄養補助食品等としては、上記した薬剤組成物の経口投与形態と同様の製剤形態を採ることもできる。
【００４５】
また、本食品組成物は、本発明の血管新生阻害剤を含むことから、本発明の血管新生阻害作用並びにその作用に基づく、固形腫瘍、血管病変、皮膚疾患、骨・関節症、生殖器疾患、眼疾患及び肺疾患のほか固形腫瘍の転移などを始めとする各種の疾患の予防又は治療用途に使用可能に構成してもよい。
【００４６】
本食品組成物の有効な摂取量は、対象者の年齢、体重、状況等にもよるが、おおよそ硫酸化多糖の摂取量は、例えばヒト成人で、1日あたり１ｍｇ〜５０００ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｍｇ〜２０００mgである。これらは、1日に数回に分けて摂取しても良い。
【００４７】
本食品組成物における硫酸化多糖の含有量は特に限定されるものではないが、例えば、乾燥重量換算で０．０１質量％以上２０質量％以下程度が好ましく、より好ましくは、０．１質量％以上５質量％以下である。
【００４８】
（化粧料組成物）
本組成物を含有する本発明の化粧料組成物（以下、本化粧料組成物という。）は、皮膚外用として化粧料組成物とすることができる。本化粧料組成物は、化粧品、医薬部外品等とすることができ、具体的には、乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等とすることができる。
【００４９】
本化粧料組成物の皮膚外用における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、例えば、全重量の０．００１質量％以上５０質量％以下程度、好ましくは０．０１質量％以上１０質量％以下である。これを１〜数回／日に分けて塗布することができる。これを１〜数回／日に分けて塗布することができる。
【００５０】
（非ヒト動物用薬剤組成物等）
さらに、本阻害剤を含有する組成物は、非ヒト動物用の薬剤組成物や餌料組成物として使用できる。非ヒト動物としては、家畜、家禽、ペット等が挙げられる。非ヒト動物においても、本阻害剤を投与し又は摂取させることにより、血管新生阻害を要する疾患の予防又は治療が可能であり、健康の維持が可能となる。なお、本阻害剤を含有する種々の形態の非ヒト動物用の薬剤組成物や餌料組成物を製造することは当業者において容易である。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）
（ヒトエグサからの硫酸化多糖の抽出）
（試料１）
三重県産養殖ヒトエグサ７５０ｇ（水分約７％）を１８ｌの水に３０分間浸漬させて膨潤させた後、１０分間水切りを行った。この藻体に水１８ｌを加えて沸騰させてクエン酸５．４ｇを添加し、９５℃〜１００℃で６時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を１８．８ｋｇとした上、珪藻土５４０ｇを添加し混合して遠心分離して上澄み液（１５．９ｋｇ）を得た。この上澄み液１．５ｌにさらに珪藻土５ｇを添加して減圧ろ過処理を行った。この操作を繰り返して上澄み液の全量を減圧ろ過し、得られたろ液の総量に水を加えて１６ｋｇとした。
【００５３】
このろ液を次に、限外ろ過膜（分画分子量１万）でろ過した。限外ろ過処理は、膜透過液が５０％の時点で終了させる。この濃縮液に対して減量分（透過液量分）を補充して全量で１６ｋｇとした。この処理を合計３回繰り返した。最終的に得られた１６ｋｇの濃縮液をスプレードライして粉体（試料１：２７０ｇ）を得た。
【００５４】
試料１について、以下のＨＰＬＣ条件でＧＰＣを行った。ＧＰＣによれば、試料６のプルラン換算重量平均分子量は５１万であった。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨ Ｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ２本
溶離液：０．１Ｍ ＮａＣｌ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ
流速：１ｍｌ／分
【００５５】
（試料２）
三重県産養殖ヒトエグサ７５０ｇ（水分約７％）を１８ｌの水に３０分間浸漬させて膨潤させた後、１０分間水切りを行った。この操作を合計３回行って藻体を洗浄した。この藻体に水１８ｌを加えて９５℃〜１００℃で６時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を１８．８ｋｇとした上、珪藻土１０８０ｇを添加し混合して遠心分離して上澄み液（１３．６ｋｇ）を得た。この上澄み液の全量をスプレードライして粉体（試料２：１４０ｇ）を得た。試料１と同様の条件でＧＰＣを行ったところ、試料２のプルラン換算重量平均分子量は２５０万であった。
【００５６】
（試料３〜５）
試料1の約６ｇを７Ｍ尿素０．０５ＭＫＣｌ溶液３００ｍｌに溶解した（２％溶液）。
この溶液を、イオン交換カラムであるＤＥ５２充填カラム（ワットマン社製、直径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ）に注入して、移動相として、７Ｍ尿素０．０５ＭＫＣｌ溶液を５００ｍｌ、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ溶液を同３０００ｍｌ、７Ｍ尿素０．２５ＭＫＣｌ溶液を１５００ｍｌ及び７Ｍ尿素２ＭＫＣｌ溶液を１５００ｍｌ、通液して、ＫＣｌ濃度を段階的に高めて多糖を分画した。７Ｍ尿素０．２５ＭＫＣｌ溶液通液時における溶出分画を、セロファン膜を用いて流水下４〜５日透析して濃縮液を凍結乾燥して試料３とした。また、７Ｍ尿素２ＭＫＣｌ通液時における溶出分画を同様に透析して濃縮液を凍結乾燥して試料４とした。さらに、７Ｍ尿素０．２５ＭＫＣｌ溶液通液時における溶出分画１ｇを蒸留水５０ｍｌに溶解し、カチオン交換樹脂ＳＫ１０４充填カラム（三菱化成株式会社製）を用いて、脱カチオン液を回収し（ｐＨ１．９〜２．４）、１ＮＮａＯＨで中和し、フリーズドライして粉体（試料５）を得た。試料３及び４について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料３，４，５のプルラン換算重量平均分子量はそれぞれ１１９万、２３万、２２万であった。
【００５７】
（試料６）
三重県産養殖ヒトエグサ２４０ｇを６ｌの水に加え３０分間浸漬後、洗浄水を分離し再度水を加え全量６．２４ｋｇとした。このものを液温６０℃〜６５℃に維持しながら２時間温水抽出を行った。遠心分離により温水抽出液３．７９ｋｇと固形分（以下、回収ヒトエグサという。）１．２３ｋｇを得た。この回収ヒトエグサ３００ｇに、水３ｌとクエン酸１００ｍｇを加えて、９５℃〜１００℃で６時間適時加水しながら熱水抽出した。この熱水抽出液をろ過してろ液の全量を凍結乾燥して粉体（３ｇ）を得た。この粉体を０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナゼーＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１について行ったＧＰＣと同様の条件にてＧＰＣを行い、保持時間（ＲＴ）が約１４．５分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブ用いて４〜５日透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体（試料６）を得た。こうして得られた試料６について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料６のプルラン換算重量平均分子量は１８９万であった。
【００５８】
（試料７）
試料６製造時に得られたヒトエグサ温水抽出液５５０ｇを凍結乾燥により粉体３ｇを得た。この粉体３ｇを０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナゼーＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１についてのＧＰＣ条件にて保持時間（ＲＴ）が約１５．５分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブを用いて５日間透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体（試料７）を得た。こうして得られた試料７について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料７のプルラン換算重量平均分子量は６２万であった。
【００５９】
（試料８）
試料１の３ｇを０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナーゼＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１についてのＧＰＣ条件にて保持時間（ＲＴ）が約１７分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブを用いて５日間透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体（試料８）を得た。こうして得られた試料８について、試料１と同様の条件でＧＰＣを行った。試料８のプルラン換算重量平均分子量は２１万であった。
【００６０】
（試料９）
試料６製造時に得られたヒトエグサ温水抽出液５５０ｇを凍結乾燥により粉体３ｇを得た。この粉体３ｇを試料９とした。試料９のＧＰＣによるプルラン換算重量平均分子量は１００万であった。
【００６１】
（試料１０）
三重県産養殖ヒトエグサ４００ｇ（水分約７％）を１０ｌの水に３０分間浸漬させて膨潤させた後、１０分間水切りを行った。この藻体に水１０ｌを加えて沸騰させてリンゴ酸２８．８ｇを添加し、９５℃〜１００℃で４時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を１０ｋｇに調整後、２．５ｋｇを珪藻土ろ過により固液分離を行った。この清澄液３００ｇを透析チューブにて脱塩精製後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥品３ｇを０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製アクチナーゼＥ）約０．１４ｇを加えて５０℃で１５時間インキュベート後、ＤＥ５２充填カラム（７Ｍ尿素０．１５Ｍ ＫＣｌで平衡化）に注入して、７Ｍ尿素０．１５ＭＫＣｌ ３ｌ以上通液後、ＫＣｌ濃度を０．１５Ｍ〜２Ｍまで約１１時間かけてグラジエント通液し、フラクションコレクターにて各溶出画分を回収した。各種の画分について、試料１についてのＧＰＣ条件にて保持時間（ＲＴ）が約１８分となるピークを、主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、この全量を、透析チューブを用いて５日間透析し、濃縮液をフリーズドライして粉体２ｇ（試料１０）を得た。試料１０について試料１と同様の条件でＧＰＣを行ったところ、そのプルラン換算重量平均分子量は５万であった。
【００６２】
（実施例２）
（血管新生阻害活性の評価）
実施例１で調製した試料１〜８について、ヒト臍帯由来静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて管腔形成を指標とした血管新生阻害活性の評価を行った。まず、氷冷した２４ウェルプレートのアックウェルに氷冷した１０ｍｇ／ｍｌの濃度のマトリゲル（ＢＤ１社製）の０．３ｍｌを速やかに添加したあとに、５％ＣＯ2インキュベーター内（３７℃）で２時間インキュベートさせることによりゲル化させた。
【００６３】
次に、ＨＵＶＥＣをコラーゲンコートシャーレに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＣＤＢ１３１培養液（クロレラ工業株式会社製）を用いて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で対数増殖中期から後期になるまで培養した。次いで、リン酸緩衝化整理食塩水で２回洗浄後、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡで約１分間処理して、シャーレ壁からＨＵＶＥＣを分離浮遊させた。適当量の１０％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培養液を添加し、ピペッティングしてＨＵＶＥＣ浮遊液を調製した。血球計測盤でＨＵＶＥＣ細胞数を計測した後、５％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培養液で希釈して最終的に２×１０４の細胞／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。その後、ＨＵＶＥＣ浮遊液に最終濃度が０、０．０１、０．１及び１μｇ／ｍｌとなるように試料１〜８をそれぞれ加えて、このＨＵＶＥＣ浮遊液１ｍｌをゲル化させたマトリゲル上に静かに播種して、３７℃で６時間ＣＯ２インキュベーター内で培養した。その後、位相差顕微鏡（オリンパス製、倍率１００倍）で観察し、画像をＣＣＤカメラを用いて撮影し、画像データについて画像解析装置（ＮＩＨ ＩＭＡＧＥ）を用いて少なくとも４視野を選択し、それぞれの視野に含まれる管腔の長さを計測し、その平均値をそれぞれの管腔長さとした。こうして得られた管腔長さと、硫酸化多糖不存在下において同様に計測した管腔長さとから、以下の式から管腔形成阻害率（％）を算出した。結果を図１及び図２に示す。
【００６４】
管腔形成阻害率（％）＝（硫酸化多糖不存在下における管腔長さ−試料における管腔長さ）／（硫酸化多糖非存在下の管腔長さ）×１００
【００６５】
図１及び図２に示すように、全ての試料において、管腔形成を阻害しており、なかでも、試料２、試料５，試料６において、対照に対して２０％以下に管腔形成を阻害していた。これらのことから、試料１〜８のいずれの硫酸化多糖は血管新生阻害活性を有しており、なかでも、試料２、試料５、試料６における硫酸化多糖画分は、高い血管新生阻害活性があることがわかった。特に、粗精製画分であってＧＰＣでのプルラン換算重量平均分子量が最大（２５０万）である試料２は高い血管新生阻害活性を示した。また試料６，７及び８ではＧＰＣでの平均分子量が高い成分ほど阻害活性が高いことがわかった。また、一方、ＧＰＣでのプルラン換算重量平均分子量２２万〜２３万である低分子試料４，５において、試料４をイオン交換により脱塩後、ナトリウム単一塩に調整した試料５は、イオン交換処理前の試料４よりも高い血管新生阻害活性を示すことがわかった。
【００６６】
（実施例３）
試料１、２、５〜８及び１０について硫酸含有量と構成単糖の成分比率を測定した。なお、それぞれ以下の方法により測定した。結果を表１に示す。
【００６７】
（１）硫酸基含有量の測定方法
（燃焼フラスコ法）
硫黄原子の元素分析を、分析化学、１５巻、６８９〜６９１頁、（１９６６年）、１７巻、１３２２〜１３２４頁、（１９６８年）に記載の燃焼フラスコ法により行い、得られた試料中の硫黄原子の含有量（重量％）に３を乗ずることにより硫酸基含有量を算出した。
【００６８】
（２）構成単糖の測定方法
試料を酸加水分解〈試料（約２０ｍｇ）を２Ｎ硫酸（１０ｍｌ）に溶解させ、沸騰水浴中で２時間加熱〉後、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ、カラム温度：３５℃、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ）にて各種単糖を同定し定量した。
【００６９】
【表１】
【００７０】
表１に示すように、試料１、２、５〜８及び１０は、いずれもラムノースを構成単糖の主成分としており、その質量比率は、６８質量％から９３質量％にわたっており、第２の主成分であるグルコースの質量比率との和では、８６質量％から９７質量％にわたり、さらにキシロースの質量比率を加えると、９２質量％〜１００質量％であった。また、良好な血管新生阻害活性を有している試料２、試料５及び試料６は、ラムノースの質量比率は７５質量％から９３質量％の範囲であった。また、これらの３種の試料について、グルコースの質量比率は、４質量％から１１質量％であり、さらに、キシロースの質量比率は、３質量％から７質量％であった。なお、これらの３種の試料について、ラムノースの質量％とグルコースの質量％との総和は、８６質量％から９７質量％であり、これらの２種の単糖が大部分の単糖を構成していることがわかった。
【００７１】
また、表１に示すように、試料２においては、Rham／Gul比（ラムノースの質量％／グルコースの質量％）が、６．８であり、試料５では２３．３、試料６では、同１８．２となっている。また、Rham／Xylo比（ラムノースの質量％／キシロースの質量％）は、試料２では１０．７、試料５では３１．０、試料６では２２．８であり、（Rham+Gul）／Xylo比（ラムノースの質量％とグルコースの質量％の総和／キシロースの質量％率）は、試料２では、１２．３、試料５では、３２．３、試料６では２４であった。
【００７２】
（実施例４）
本実施例では、In vivoでの癌の転移に及ぼすヒトエグサ抽出成分の影響を以下の方法で評価した。
【００７３】
癌細胞のin vivo転移の測定
各群10匹のC57/BL6マウスを用いて、ヒトエグサ熱水抽出物（実施例１の試料２）の癌細胞の転移に及ぼす効果を測定した。B16マウスメラノーマ細胞（50万個/200μl）をマウスの尾静脈から注射するとともに、ヒトエグサ熱水抽出物（実施例１の試料２）(250 mg/kg)を連日経口投与し、2週間後に肺を取り出し、肺に見られる癌細胞の転移巣の数を顕微鏡下で計数し、対照（蒸留水投与群）のマウスのそれと比較することにより、ヒトエグサ熱水抽出物（実施例１の試料２）の癌細胞の転移に及ぼす影響を評価した。結果を図３及び図４に示す。なお、転移率は、コントロールの転移巣の数に対するヒトエグサ熱水抽出物の転移巣の数の％である。
【００７４】
これに対して、図３及び図４に示すように、C57/BL6マウス尾静脈から注入したB16マウスメラノーマ細胞の肺への転移を２週間後に観察した結果、肺への転移巣の数は、蒸留水投与群に比較して、ヒトエグサ熱水抽出物経口投与群では著しく有意に低下していた。
【００７５】
以上のことから、ヒトエグサの熱水抽出物は、in vivoにおける癌細胞の肺転移を顕著に抑制することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】試料１〜３の管腔形成率（％）を示すグラフ図。
【図２】試料４〜８の管腔形成率（％）を示すグラフ図。
【図３】Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の肺転移を示す図。
【図４】Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の肺転移率を表す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、血管新生阻害剤。
【請求項２】
前記硫酸化多糖は、以下の特徴を有する、請求項１に記載の阻害剤。
（ａ）構成多糖の全質量において、ラムノース含量が５０質量％以上、グルコース含量が１質量％以上３０質量％以下及びキシロース含量が１質量％以上１０質量％以下
（ｂ）硫酸基含量が１０質量％以上４０質量％以下
【請求項３】
ゲルろ過クロマトグラフィーによるプルラン換算重量平均分子量が０．５万以上３００万以下である、請求項１又は２に記載の血管新生阻害剤。
【請求項４】
前記硫酸化多糖は、アオサ藻綱に属する藻類由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
前記阻害剤は、前記藻類又はその抽出物を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
前記抽出物は、前記藻類の熱水抽出物である、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記藻類は、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類から選択される、請求項４〜６のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項８】
前記藻類は、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ又はＭｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎｉｔｉｄｕｍである、請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記硫酸化多糖がナトリウム塩である、請求項１〜８のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１０】
Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類又はその抽出物を含有する、血管新生阻害剤。
【請求項１１】
ラムノースを構成担当の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、請求項１０に記載の血管新生阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の血管新生阻害剤を含む、血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記疾患は固形腫瘍、血管病変、皮膚疾患、骨・関節症、生殖器疾患、眼疾患及び肺疾患からなる群から選択される、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記疾患は、固形腫瘍の転移である、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記薬剤組成物は、局所投与用である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
経口投与用である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載の血管新生阻害剤を含有する、血管新生阻害を要する疾患の予防又は予後のための食品組成物。
【請求項１８】
前記食品組成物は、栄養補助組成物である、請求項１７に記載の食品組成物。
【請求項１９】
前記食品組成物は、固形腫瘍の転移抑制用である、請求項１７又は１８に記載の食品組成物。
【請求項１】
ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、血管新生阻害剤。
【請求項２】
前記硫酸化多糖は、以下の特徴を有する、請求項１に記載の阻害剤。
（ａ）構成多糖の全質量において、ラムノース含量が５０質量％以上、グルコース含量が１質量％以上３０質量％以下及びキシロース含量が１質量％以上１０質量％以下
（ｂ）硫酸基含量が１０質量％以上４０質量％以下
【請求項３】
ゲルろ過クロマトグラフィーによるプルラン換算重量平均分子量が０．５万以上３００万以下である、請求項１又は２に記載の血管新生阻害剤。
【請求項４】
前記硫酸化多糖は、アオサ藻綱に属する藻類由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
前記阻害剤は、前記藻類又はその抽出物を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
前記抽出物は、前記藻類の熱水抽出物である、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記藻類は、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類から選択される、請求項４〜６のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項８】
前記藻類は、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ Ｌａｔｉｓｓｉｍｕｍ又はＭｏｎｏｓｔｒｏｍａ ｎｉｔｉｄｕｍである、請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記硫酸化多糖がナトリウム塩である、請求項１〜８のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１０】
Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ属に属する藻類又はその抽出物を含有する、血管新生阻害剤。
【請求項１１】
ラムノースを構成担当の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有する、請求項１０に記載の血管新生阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の血管新生阻害剤を含む、血管新生阻害を要する疾患の予防用又は治療用の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記疾患は固形腫瘍、血管病変、皮膚疾患、骨・関節症、生殖器疾患、眼疾患及び肺疾患からなる群から選択される、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記疾患は、固形腫瘍の転移である、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記薬剤組成物は、局所投与用である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
経口投与用である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載の血管新生阻害剤を含有する、血管新生阻害を要する疾患の予防又は予後のための食品組成物。
【請求項１８】
前記食品組成物は、栄養補助組成物である、請求項１７に記載の食品組成物。
【請求項１９】
前記食品組成物は、固形腫瘍の転移抑制用である、請求項１７又は１８に記載の食品組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−５７２８５（Ｐ２００９−５７２８５Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４８８６４（Ｐ２００６−１４８８６４）
【出願日】平成１８年５月２９日（２００６．５．２９）
【出願人】（３０４０４０４４１）江南化工株式会社 (4)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２９日（２００６．５．２９）
【出願人】（３０４０４０４４１）江南化工株式会社 (4)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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