血管製造方法
【課題】簡易な操作で、早期に、移植される血管に異物が含まれないように製造する。
【解決手段】常温状態のコラーゲンゲルからなる２つのブロックの間に血管内皮細胞を挟む準備ステップＳ１と、該コラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養する培養ステップＳ２と、該培養ステップＳ２後に冷却してコラーゲンゲルブロックを液化させ、コラーゲンを分離する血管回収ステップＳ３とを含む血管製造方法を提供する。
【解決手段】常温状態のコラーゲンゲルからなる２つのブロックの間に血管内皮細胞を挟む準備ステップＳ１と、該コラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養する培養ステップＳ２と、該培養ステップＳ２後に冷却してコラーゲンゲルブロックを液化させ、コラーゲンを分離する血管回収ステップＳ３とを含む血管製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ゲル化する溶液に、細胞および／または薬学的活性成分等の生体作用物質を含浸させたゲル溶液を多孔質人工血管基材の孔内に含浸させ、孔内に取り込まれたゲル溶液をゲル化させる人工血管の製造方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１２６１２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の製造方法では、予め人工血管基材を用意してその孔内に細胞等を含浸させる必要があり、操作が煩雑で、細胞が生体組織に置き換わるまでに相当の時間を要するとともに、患者の体内に移植される人工血管内にゲル溶液が残存してしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な操作で、早期に、移植される血管に異物が含まれないように製造することができる血管製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、常温状態のコラーゲンゲルからなる２つのブロックの間に血管内皮細胞を挟む準備ステップと、該コラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養する培養ステップと、該培養ステップ後に冷却して前記コラーゲンゲルブロックを液化させ、コラーゲンを分離する血管回収ステップとを含む血管製造方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、準備ステップにおいてコラーゲンゲルブロックに血管内皮細胞を挟み、培養ステップにおいてコラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養し、血管回収ステップにおいて、培養後に冷却してコラーゲンブロックを液化させることでコラーゲンを分離することにより、異物を含まない血管を簡易かつ迅速に製造することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記培養ステップが、静脈血管を生成する静脈血管培養ステップと、動脈血管を生成する動脈血管培養ステップとを含み、前記血管回収ステップが、前記静脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックと、前記動脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックとを重ねて冷却することとしてもよい。
このようにすることで、静脈血管培養ステップにおいてコラーゲンブロック間に挟まれた状態で生成された静脈血管と、動脈血管培養ステップにおいてコラーゲンブロック間に挟まれた状態で生成された動脈血管とが、血管回収ステップにおいて重ね合わせられた状態で冷却されることにより、実際の生体内の構造と同様に、静脈血管と動脈血管とが混在する血管を簡易かつ迅速に製造することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記準備ステップが、コラーゲンゲルを酸性に成分調製することが好ましい。
このようにすることで、より効率的に血管を製造することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡易な操作で、早期に、移植される血管に異物が含まれないように製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施形態に係る血管製造方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る血管製造方法は、図１に示されるように、準備ステップＳ１と、培養ステップＳ２と血管回収ステップＳ３とを含んでいる。
【００１２】
準備ステップＳ１は、図２に示されるように、常温で固体状態となり、低温、例えば、４℃以下で液体状態となるコラーゲンゲルブロック１を２個用意し、それらのコラーゲンゲルブロック１間に血管内皮細胞２を播種して挟むようになっている。
コラーゲンゲルブロック１は、例えば、高研社製細胞培養用コラーゲン酸性溶液（ｐＨ３．０、０．３％濃度、成分：Atelocollagen, Native Collagen）と、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液と、ＭＥＭ培地と、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）とを７：１：１：１の割合で混合したコラーゲン溶液を３７℃〜４２℃に加温することにより硬化させて製造されている。
【００１３】
培養ステップＳ２は、図３に示されるように、上記においてコラーゲンゲルブロック１間に挟まれた状態の血管内皮細胞２を、例えば、シャーレ等の培養容器３内に貯留した内皮細胞基本培地（ＥＢＭ−２）４内に浸漬し、３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下において培養するようになっている。培地４の交換は、２〜３日に１回行い、１０日〜２週間程度培養する。
【００１４】
発明者は、研究の結果、上記コラーゲンゲルブロック１内に血管内皮細胞２を播種して培養するだけで、血管５を製造することができることを確認した。図４は、コラーゲンブロック１間に血管内皮細胞２を播種して、上記培養を行った結果、培養１０日後の血管５の顕微鏡写真であり、図５は製造された血管５の断面の顕微鏡写真である。
【００１５】
血管回収ステップＳ３は、培養ステップＳ２において培養されることにより、コラーゲンゲルブロック１内に３次元培養された血管５を、コラーゲンゲルブロック１ごと４℃以下に冷却する。これにより、図６に示されるように、コラーゲンゲルブロック１が液化させられて、液体状のコラーゲン１′となって製造された血管５の周囲から流れ落ち、血管５にはほとんど残留しないようなる。
【００１６】
このように、本実施形態に係る血管製造方法によれば、簡易な操作で、早期に、コラーゲンゲルのような異物が含まれないように血管５を製造することができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、単に血管５単体を製造する場合について説明したが、これに限定されるものではなく、培養ステップとして、静脈血管培養ステップと動脈血管培養ステップとを行うことにより製造された静脈血管６および動脈血管７が混在する状態の血管５を製造することにしてもよい。
【００１７】
この場合には、静脈血管培養ステップは、２つのコラーゲンゲルブロック１間に血管内皮細胞２を挟んで、タカラバイオ社製内皮細胞添加因子セット−２、ＥＧＭ−２ SingleQuots（ＦＢＳ、ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）、ｈＦＧＦ−Ｂ（組換えヒト線維芽細胞成長因子、塩基性）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、Ｒ３−ＩＧＦ（インシュリン様成長因子）−１、ＧＡ−１０００（50mg/mLゲンタマイシン、50μg/mLアンホテリシン−Ｂ））を用いて培養する。
また、動脈血管培養ステップは、２つのコラーゲンゲルブロック１間に血管内皮細胞２を挟んで、タカラバイオ社製平滑筋細胞培地キット−２、ＳｍＧＭ−２ SingleQuots（ＦＢＳ、ｈＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、インシュリン、ＧＡ−１０００（50mg/mLゲンタマイシン、50μg/mLアンホテリシン−Ｂ））を用いて培養する。
【００１８】
この後に血管回収ステップＳ３においては、図７（ａ）に示されるように、上記培養ステップＳ２において、動脈および静脈が３次元培養されたコラーゲンブロック１を重ねて、コラーゲンゲルブロックごと４℃以下に冷却する。これにより、図７（ｂ）に示されるように、コラーゲンゲルブロック１が液化させられて、液体状のコラーゲン１′となって製造された血管５の周囲から流れ落ち、動脈血管６と静脈血管７とが混在する状態で、かつ、コラーゲン１′がほとんど残留していない血管５を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る血管製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の血管製造方法の準備ステップを示す模式図である。
【図３】図１の血管製造方法の培養ステップを示す模式図である。
【図４】図３の培養ステップにおいて製造された毛細血管の顕微鏡写真である。
【図５】図４と同様の血管部分の断面の顕微鏡写真である。
【図６】図１の血管製造方法の血管回収ステップを示す模式図である。
【図７】図７の血管回収ステップの変形例であり、（ａ）冷却前の状態、（ｂ）冷却後の状態をそれぞれ示す模式図である。
【符号の説明】
【００２０】
Ｓ１ 準備ステップ
Ｓ２ 培養ステップ
Ｓ３ 血管回収ステップ
１ コラーゲンゲルブロック
１′ コラーゲン
２ 血管内皮細胞
６ 動脈血管
７ 静脈血管
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ゲル化する溶液に、細胞および／または薬学的活性成分等の生体作用物質を含浸させたゲル溶液を多孔質人工血管基材の孔内に含浸させ、孔内に取り込まれたゲル溶液をゲル化させる人工血管の製造方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１２６１２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の製造方法では、予め人工血管基材を用意してその孔内に細胞等を含浸させる必要があり、操作が煩雑で、細胞が生体組織に置き換わるまでに相当の時間を要するとともに、患者の体内に移植される人工血管内にゲル溶液が残存してしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な操作で、早期に、移植される血管に異物が含まれないように製造することができる血管製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、常温状態のコラーゲンゲルからなる２つのブロックの間に血管内皮細胞を挟む準備ステップと、該コラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養する培養ステップと、該培養ステップ後に冷却して前記コラーゲンゲルブロックを液化させ、コラーゲンを分離する血管回収ステップとを含む血管製造方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、準備ステップにおいてコラーゲンゲルブロックに血管内皮細胞を挟み、培養ステップにおいてコラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養し、血管回収ステップにおいて、培養後に冷却してコラーゲンブロックを液化させることでコラーゲンを分離することにより、異物を含まない血管を簡易かつ迅速に製造することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記培養ステップが、静脈血管を生成する静脈血管培養ステップと、動脈血管を生成する動脈血管培養ステップとを含み、前記血管回収ステップが、前記静脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックと、前記動脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックとを重ねて冷却することとしてもよい。
このようにすることで、静脈血管培養ステップにおいてコラーゲンブロック間に挟まれた状態で生成された静脈血管と、動脈血管培養ステップにおいてコラーゲンブロック間に挟まれた状態で生成された動脈血管とが、血管回収ステップにおいて重ね合わせられた状態で冷却されることにより、実際の生体内の構造と同様に、静脈血管と動脈血管とが混在する血管を簡易かつ迅速に製造することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記準備ステップが、コラーゲンゲルを酸性に成分調製することが好ましい。
このようにすることで、より効率的に血管を製造することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡易な操作で、早期に、移植される血管に異物が含まれないように製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施形態に係る血管製造方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る血管製造方法は、図１に示されるように、準備ステップＳ１と、培養ステップＳ２と血管回収ステップＳ３とを含んでいる。
【００１２】
準備ステップＳ１は、図２に示されるように、常温で固体状態となり、低温、例えば、４℃以下で液体状態となるコラーゲンゲルブロック１を２個用意し、それらのコラーゲンゲルブロック１間に血管内皮細胞２を播種して挟むようになっている。
コラーゲンゲルブロック１は、例えば、高研社製細胞培養用コラーゲン酸性溶液（ｐＨ３．０、０．３％濃度、成分：Atelocollagen, Native Collagen）と、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液と、ＭＥＭ培地と、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）とを７：１：１：１の割合で混合したコラーゲン溶液を３７℃〜４２℃に加温することにより硬化させて製造されている。
【００１３】
培養ステップＳ２は、図３に示されるように、上記においてコラーゲンゲルブロック１間に挟まれた状態の血管内皮細胞２を、例えば、シャーレ等の培養容器３内に貯留した内皮細胞基本培地（ＥＢＭ−２）４内に浸漬し、３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下において培養するようになっている。培地４の交換は、２〜３日に１回行い、１０日〜２週間程度培養する。
【００１４】
発明者は、研究の結果、上記コラーゲンゲルブロック１内に血管内皮細胞２を播種して培養するだけで、血管５を製造することができることを確認した。図４は、コラーゲンブロック１間に血管内皮細胞２を播種して、上記培養を行った結果、培養１０日後の血管５の顕微鏡写真であり、図５は製造された血管５の断面の顕微鏡写真である。
【００１５】
血管回収ステップＳ３は、培養ステップＳ２において培養されることにより、コラーゲンゲルブロック１内に３次元培養された血管５を、コラーゲンゲルブロック１ごと４℃以下に冷却する。これにより、図６に示されるように、コラーゲンゲルブロック１が液化させられて、液体状のコラーゲン１′となって製造された血管５の周囲から流れ落ち、血管５にはほとんど残留しないようなる。
【００１６】
このように、本実施形態に係る血管製造方法によれば、簡易な操作で、早期に、コラーゲンゲルのような異物が含まれないように血管５を製造することができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、単に血管５単体を製造する場合について説明したが、これに限定されるものではなく、培養ステップとして、静脈血管培養ステップと動脈血管培養ステップとを行うことにより製造された静脈血管６および動脈血管７が混在する状態の血管５を製造することにしてもよい。
【００１７】
この場合には、静脈血管培養ステップは、２つのコラーゲンゲルブロック１間に血管内皮細胞２を挟んで、タカラバイオ社製内皮細胞添加因子セット−２、ＥＧＭ−２ SingleQuots（ＦＢＳ、ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）、ｈＦＧＦ−Ｂ（組換えヒト線維芽細胞成長因子、塩基性）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、Ｒ３−ＩＧＦ（インシュリン様成長因子）−１、ＧＡ−１０００（50mg/mLゲンタマイシン、50μg/mLアンホテリシン−Ｂ））を用いて培養する。
また、動脈血管培養ステップは、２つのコラーゲンゲルブロック１間に血管内皮細胞２を挟んで、タカラバイオ社製平滑筋細胞培地キット−２、ＳｍＧＭ−２ SingleQuots（ＦＢＳ、ｈＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、インシュリン、ＧＡ−１０００（50mg/mLゲンタマイシン、50μg/mLアンホテリシン−Ｂ））を用いて培養する。
【００１８】
この後に血管回収ステップＳ３においては、図７（ａ）に示されるように、上記培養ステップＳ２において、動脈および静脈が３次元培養されたコラーゲンブロック１を重ねて、コラーゲンゲルブロックごと４℃以下に冷却する。これにより、図７（ｂ）に示されるように、コラーゲンゲルブロック１が液化させられて、液体状のコラーゲン１′となって製造された血管５の周囲から流れ落ち、動脈血管６と静脈血管７とが混在する状態で、かつ、コラーゲン１′がほとんど残留していない血管５を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る血管製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の血管製造方法の準備ステップを示す模式図である。
【図３】図１の血管製造方法の培養ステップを示す模式図である。
【図４】図３の培養ステップにおいて製造された毛細血管の顕微鏡写真である。
【図５】図４と同様の血管部分の断面の顕微鏡写真である。
【図６】図１の血管製造方法の血管回収ステップを示す模式図である。
【図７】図７の血管回収ステップの変形例であり、（ａ）冷却前の状態、（ｂ）冷却後の状態をそれぞれ示す模式図である。
【符号の説明】
【００２０】
Ｓ１ 準備ステップ
Ｓ２ 培養ステップ
Ｓ３ 血管回収ステップ
１ コラーゲンゲルブロック
１′ コラーゲン
２ 血管内皮細胞
６ 動脈血管
７ 静脈血管
【特許請求の範囲】
【請求項１】
常温状態のコラーゲンゲルからなる２つのブロックの間に血管内皮細胞を挟む準備ステップと、
該コラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養する培養ステップと、
該培養ステップ後に冷却して前記コラーゲンゲルブロックを液化させ、コラーゲンを分離する血管回収ステップとを含む血管製造方法。
【請求項２】
前記培養ステップが、静脈血管を生成する静脈血管培養ステップと、動脈血管を生成する動脈血管培養ステップとを含み、
前記血管回収ステップが、前記静脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックと、前記動脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックとを重ねて冷却する請求項１に記載の血管製造方法。
【請求項３】
前記準備ステップが、コラーゲンゲルを酸性に成分調製する請求項１または請求項２に記載の血管製造方法。
【請求項１】
常温状態のコラーゲンゲルからなる２つのブロックの間に血管内皮細胞を挟む準備ステップと、
該コラーゲンゲルブロック間に挟まれた状態の血管内皮細胞を培養する培養ステップと、
該培養ステップ後に冷却して前記コラーゲンゲルブロックを液化させ、コラーゲンを分離する血管回収ステップとを含む血管製造方法。
【請求項２】
前記培養ステップが、静脈血管を生成する静脈血管培養ステップと、動脈血管を生成する動脈血管培養ステップとを含み、
前記血管回収ステップが、前記静脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックと、前記動脈血管が生成されたコラーゲンゲルブロックとを重ねて冷却する請求項１に記載の血管製造方法。
【請求項３】
前記準備ステップが、コラーゲンゲルを酸性に成分調製する請求項１または請求項２に記載の血管製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１４２２７８（Ｐ２０１０−１４２２７８Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１９７８４（Ｐ２００８−３１９７８４）
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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