補体が関係している眼の状態の予防および治療
本発明は、Ｄ因子アンタゴニストの投与による、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）のような、補体が関係している眼の状態の予防および治療に関する。本発明によって処置される状態としては、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生が挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）のような、補体が関係している眼の状態の予防および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、通常は不活性なプロ酵素の形態で存在する、一連の血清糖タンパク質からなる複合酵素カスケードである。２つの主要な経路（古典経路と第２経路）は補体を活性化することが可能であり、これらはＣ３のレベルで統合され、ここでは、２つの類似しているＣ３転換酵素が、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂになるように切断する。
【０００３】
マクロファージは、細胞表面で発現される識別タグの構造（いわゆる、分子パターン）の微妙な差異を認識する先天的な能力を示す特殊な細胞である（Ｔａｙｌｏｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３、２０９０−２０９７（２００３）；Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３、９０１−９４４（２００５））。これらの表面構造の直接の認識は先天性免疫の基本的な特徴であるが、オプソニン作用によっても、一般的なマクロファージ受容体が飲み込みを媒介することが可能になり、それにより、食細胞の効率が上がり、認識レパートリーが多様化する（ＳｔｕａｒｔおよびＥｚｅｋｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２、５３９−５５０（２００５））、食作用のプロセスには、多数のリガンド−受容体相互作用が関与しており、現在、様々なオプソニン（免疫グロブリン、コレクチン、および補体成分を含む）がマクロファージの細胞表面受容体との相互作用による病原体のインターナリゼーションに必要な細胞活動を導くことが明らかになっている（ＡｄｅｒｅｍおよびＵｎｄｅｒｈｉｌｌ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７、５９３−６２３（１９９９）；ＵｎｄｅｒｈｉｌｌおよびＯｚｉｎｓｋｙ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、８２５−８５２（２００２）に概説されている）。生殖細胞系列の遺伝子によってコードされる天然の免疫グロブリンは多種多様な病原体を認識できるが、オプソニン作用のあるＩｇＧ（ｏｐｓｏｎｉｚｉｎｇ ＩｇＧ）の大部分は適応免疫によって生じ、したがって、Ｆｃ受容体による効率的なクリアランスは迅速ではない（Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５、９８１−９８６（２００４））。一方、補体は病原体表面の分子を迅速に認識し、補体受容体による粒子の取り込みのきっかけをつくる（Ｂｒｏｗｎ、Ｉｎｆｅｃｔ Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ １、６３−７０（１９９１））。
【０００４】
補体は、補体受容体によって認識される多種多様な病原体をオプソニン化する３０を超える血清タンパク質からなる。カスケードの最初の誘因に応じて、３つの経路に区別できる（Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４、１０５８−１０６６（２００１）に概説されている）。３つの全てが中心的構成成分Ｃ３を活性化させる共通の工程を共有しているが、これらは認識の性質と、Ｃ３活性化を導く最初の生化学的工程により異なる。古典経路は病原体表面に結合した抗体によって活性化され、これは次いでＣ１ｑ補体成分に結合し、Ｃ３をその活性化形態であるＣ３ｂまで最終的に切断するセリン・プロテアーゼ・カスケードを誘発する。レクチン経路は、レクチンタンパク質による炭水化物モチーフの認識後に活性化される。今日までに、この経路の３つのメンバーが同定されている：マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、レクチンのＳＩＧＮ−Ｒ１ファミリー、およびフィコリン（Ｐｙｚら、Ａｎｎ Ｍｅｄ ３８、２４２−２５１（２００６））。ＭＢＬとフィコリンはいずれもセリンプロテアーゼと関係があり、これは古典経路においてＣ１と同様に作用して成分Ｃ２およびＣ４を活性化させて、中心的なＣ３工程を導く。第２経路は、これが、内部Ｃ３エステルの病原体表面上の認識モチーフとの直接の反応が原因で活性化される点で、古典経路およびレクチン経路のいずれとも対照的である。活性化表面への内部Ｃ３の結合によっては、第２経路のプロテアーゼであるＢ因子およびＤ因子の作用によりＣ３ｂの蓄積の迅速な増幅が導かれる。重要なことは、古典経路またはレクチン経路のいずれかにより蓄積したＣ３ｂもまた、Ｂ因子およびＤ因子の作用によりＣ３ｂの蓄積の増幅を導き得ることである。補体活性化の３つの経路の全てにおいて、オプソニン化の中枢的工程は成分Ｃ３のＣ３ｂへの変換である。補体カスケードの酵素によるＣ３の切断は、チオエステルを求核攻撃に曝し、それによりチオエステルドメインを介する抗原表面上へのＣ３ｂの共有結合を可能にする。これは、補体オプソニン作用の最初の工程である。続いて、結合したＣ３ｂのタンパク質分解によって、異なる受容体によって認識される断片であるｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｄｇが生じる（ＲｏｓｓおよびＭｅｄｏｆ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７、２１７−２６７（１９８５））。この切断により、Ｃ３ｂの蓄積をさらに増幅させるＣ３ｂの能力が消失し、直接膜を損傷させることができる補体カスケードの後期成分（膜攻撃複合体を含む）が活性化される。しかしながら、マクロファージの食細胞受容体はＣ３ｂとその断片を優先的に認識する。エステル結合の形成の多様性の理由から、Ｃ３媒介性オプソニン作用は病原体認識の中核をなし（Ｈｏｌｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １３、２３１−２３６（１９９２））、したがって、様々なＣ３分解産物の受容体は宿主免疫応答において重要な役割を果たす。
【０００５】
Ｃ３自体は、１３個の異なるドメインからなる複合体である可撓性タンパク質である。分子のコアは８個のいわゆるマクログロブリン（ＭＧ）ドメインからなり、これらはＣ３の密集した状態のα鎖およびβ鎖を構成する。この構造にはＣＵＢ（Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ ａｎｄ Ｂｏｎｅ ｍｏｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ）とＴＥＤドメインが挿入されており、後者には、病原体表面とのＣ３ｂの共有結合を可能にするチオエステル結合が含まれている。残りのドメインにはＣ３ａが含まれるか、または残りのドメインはコアドメインのリンカーおよびスペーサーとして作用する。Ｃ３に対するＣ３ｂとＣ３ｃの構造の比較により、この分子が、ＴＥＤだけではなく、細胞性受容体と相互作用できる分子のさらに新しい表面をも露出させる、重要な立体構造の再配置をそれぞれのタンパク質分解によって受けることが明らかである（ＪａｎｓｓｅｎおよびＧｒｏｓ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４、３−１０（２００７））。
【０００６】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、全世界において高齢者の失明の主原因である。ＡＭＤは、良好な視力に関連する眼の網膜の非常に特殊な領域である黄斑における退化性であり、新生血管変化が原因で中心部視野が除々に失われることを特徴とする。最近の試算は、１４００万人がＡＭＤが原因で失明しているか、または重篤な視力障害があることを示している。この疾患は高齢者集団と彼らの家族の身体および心の健康に多大な影響を与え、公衆衛生における大きな負担となりつつある。
【０００７】
しかしながら、新しい発見によると、初期ＡＭＤと関係がある関連する細胞性事象、遺伝的因子、および生化学的プロセスのより鮮明な概念の提供が開始されつつある。補体Ｈ因子遺伝子は、複数の無関係な実験において同定された最初の遺伝子であり、これはＡＭＤの発症に関して有意な遺伝的リスクを与える。それゆえ、Ｈ因子のアミノ酸４０２位のチロシン−ヒスチジン多形がＡＭＤの発症と関係があることが３つの別のグループによって報告された（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。疾患と関係があるＨ因子対立遺伝子による第２経路の阻害の低下が、ＡＭＤの発症を引き起こすかまたはＡＭＤの発症に有意に寄与するかのいずれかであることが示唆されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０８：３８５−３８９
【非特許文献２】Ｈａｉｎｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０８：４１９−４２１
【非特許文献３】Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０８：４２１−４２４
【非特許文献４】ＴｈｕｒｍａｎおよびＨｏｌｅｒｓ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１７６：１３０５−１３１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様においては、本発明は、有効量のＤ因子アンタゴニストを必要な被験体に投与する工程を含む、補体が関係している眼の状態の予防または治療方法に関する。
【００１０】
様々な実施形態において、必要な被験体は哺乳動物（例えば、ヒト）であり、Ｄ因子アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体およびその断片、結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに非ペプチド低分子からなる群より選択される。
【００１１】
好ましい実施形態においては、Ｄ因子アンタゴニストは抗体または抗体断片である。様々な実施形態において、抗体はＤ因子の活性部位に結合する場合があり、また、Ｄ因子の活性化部位残基を含むエピトープに結合する場合もある。
【００１２】
本発明の範囲に含まれる特異的な抗体としては、抗体２０Ｄ１２、３１Ａ９、２５Ａ１、および３２Ｈ１２、ならびにそれらの変異体が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態においては、抗体または抗体断片は本質的に抗体２０Ｄ１２と同じエピトープに結合するか、または、抗体２０Ｄ１２の重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号：１および２）を含むか、または抗体２０Ｄ１２もしくはその断片である。
【００１３】
抗Ｄ因子抗体としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体が挙げられる。
【００１４】
抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成された多特異的抗体であり得る。
【００１５】
補体が関係している眼の状態としては、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生が挙げられる。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、Ｄ因子アンタゴニストと、補体が関係している眼の状態を治療するために上記アンタゴニストを投与するための説明書を含むキットに関する。
【００１７】
なお別の態様においては、本発明は、補体が関係している眼の状態の治療のための医薬品の調製におけるＤ因子アンタゴニストの使用に関する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、補体が関係している眼の状態の治療での使用のためのＤ因子アンタゴニストに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】正常な眼とＡＭＤドナーの眼から得られた硝子体およびブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ）中でのＤ因子のレベル。Ｄ因子のレベルは記載するようにＤ因子特異的ＥＬＩＳＡによって測定した：眼の中のＤ因子の総レベルは、ブルッフ膜の中で発現されたＤ因子の全体に対する寄与（ｔｏｔａｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）と硝子体の中で見られるＤ因子の総量を計算することによって決定した。
【図２】ＡＭＤドナーの眼に由来するブルッフ膜の切断面のＤ因子の免疫組織化学。差し込み図は、ブルッフ膜の上部に層をなしたドルーゼ（Ｄｒｕｓｅ）の中のＤ因子の染色を示す。ドルーゼに加えて、ブルッフ膜と脈絡膜もＤ因子についてポジティブであった。
【図３】補体の第２経路について選択的である溶血アッセイにおける１２Ｄ２０の特性。ＩＣ５０値を下に示し、アッセイは方法セクションに記載するように行った。
【図４】マウスモノクローナル抗体１２Ｄ２０の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列（配列番号：１および２）。
【図５】様々な抗Ｄ因子抗体のエピトープマッピング。溶血アッセイでのそれらの相対的な効力を示す。
【図６】天然のヒトＤ因子ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）。
【図７】表１：ＡＭＤにおける補体成分の分析。
【図８】表２：実験で使用したドナーの組織。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．定義
用語「Ｄ因子」および「補体Ｄ因子」は互換的に使用され、天然配列と変異体Ｄ因子ポリペプチドをいう。
【００２１】
「天然配列」のＤ因子は、その調製様式にかかわらず、自然界に由来するＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドである。したがって、天然配列のＤ因子は自然界から単離することができ、また、組み換えおよび／もしくは合成手段によって生産することもできる。成熟Ｄ因子タンパク質（例えば、成熟ヒトＤ因子タンパク質（ＮＭ-００１９２８；配列番号３））に加えて、用語「天然配列のＤ因子」には、具体的に、Ｄ因子の自然界に存在する前駆体形態（例えば、タンパク質分解によって切断されて活性化形態を生じる不活性な前タンパク質）、自然界に存在する変異体形態（例えば、オルタナティブスプライシングされた形態）、およびＤ因子の自然界に存在する対立遺伝子変異体、ならびに自然界から導かれたＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているＤ因子分子の立体構造変異体が含まれる。ヒト以外の動物（高等霊長類およびヒト以外の哺乳動物を含む）のＤ因子ポリペプチドは具体的にこの定義に含まれる。
【００２２】
「Ｄ因子変異体」または「補体Ｄ因子変異体」は、天然配列のＤ因子ポリペプチド（例えば、配列番号３の天然配列のヒトＤ因子ポリペプチド）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有している、以下で定義されるような活性なＤ因子ポリペプチドを意味する。通常、Ｄ因子変異体は、配列番号３の成熟ヒトアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。最高度の配列同一性がＤ因子の活性部位の中にあることが好ましい。
【００２３】
Ｄ因子の「活性部位」は、ヒトＤ因子配列においてはＨｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２、およびＳｅｒ−１９５（キモトリプシンノーゲン・ナンバリング）によって定義される。Ｄ因子は、主要な特異性ポケットの底にＡｓｐ１８９（キモトリプシン・ナンバリング）を有しており、Ａｒｇペプチド結合を切断する。触媒３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）は、Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２およびＳｅｒ−１９５からなる。Ａｓｐ−１０２とＨｉｓ５７は、他のセリンプロテアーゼと比較して非定型の立体構造を呈する（Ｎａｒａｙａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（１９９４）、６９５−７０８）。特有のｓａｌ架橋が、Ｓ１ポケットの底にあるＡｓｐ１８９とＡｒｇ２１８の間で観察され、これは、ループ２１４−２１８を押し上げ（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｏｏｐ）、深くて狭いＳ１ポケットをもたらす（Ｊｉｎｇｅｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２（１９９８）１０６１−１０８１）。このループと、活性部位の周囲にあるいくつかの他の残基は、Ｄ因子エステル分解活性の鍵となる構造的決定要因であることが変異分析によって示されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）２４３９９−２４４０５）。これらの結果に基づき、Ｄ因子はＣ３ｂに結合したＢ因子に結合すると立体構造の変化を受けて、タンパク質分解活性の発現を生じる可能性があると提唱された（ＶｏｌａｎａｋｉｓおよびＮａｒａｙａｎａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５（１９９６）５５３−５６４）。
【００２４】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮しない、参照Ｄ因子配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的におけるアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手できるコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。当業者はアラインメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。これには、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。その後、配列同一性はより長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部分と１００％の配列同一性を示す場合でもなお、全体的な配列同一性は１００％未満であり得る。
【００２５】
「核酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、参照Ｄ因子コード配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドの割合として定義される。核酸配列同一性パーセントを決定する目的におけるアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手できるコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。これには、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。その後、配列同一性はより長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部分と１００％の配列同一性を示す場合でもなお、全体的な配列同一性は１００％未満であり得る。
【００２６】
「単離された」核酸分子は、、核酸の天然の供給源において通常会合している少なくとも１つの混入している核酸分子から同定かつ分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、自然界において見られる形態または環境以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、それが天然の細胞の中に存在する場合の核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子には、例えば、天然の細胞の中での染色体位置とは異なる染色体位置にその核酸分子が存在している場合に、コードされるポリペプチドを通常どおり発現する細胞中に含まれる核酸分子も含まれる。
【００２７】
「単離された」Ｄ因子ポリペプチドをコードする核酸分子は、、Ｄ因子をコードする核酸の天然の供給源の中では通常会合している少なくとも１つの混入している核酸分子から同定かつ分離された核酸分子である。単離されたＤ因子ポリペプチドをコードする核酸分子は、自然界において見られる形態または環境以外のものである。したがって、単離されたＤ因子ポリペプチドをコードする核酸分子は、それらが天然の細胞の中に存在する場合のコード核酸分子とは区別される。しかしながら、単離されたＤ因子をコードする核酸分子には、例えば、その核酸分子が天然の細胞の中での染色体位置とは異なる染色体位置でＤ因子を通常発現する細胞中に含まれるＤ因子をコードする核酸分子も含まれる。
【００２８】
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、Ｄ因子の生物学的活性を中和する、ブロックする、部分的もしくは完全に阻害する、破棄する、低下させる、あるいは妨害することができる任意の分子が含まれる。Ｄ因子アンタゴニストとしては、抗Ｄ因子抗体およびその抗原結合断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに、Ｄ因子に結合してＤ因子の活性（例えば、補体が関係している眼の病状に関与するＤ因子の能力）を中和する、ブロックする、部分的もしくは完全に阻害する、破棄する、低下させる、または妨害することができる非ペプチド低分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「低分子」は、本明細書中では、約６００ダルトン未満、好ましくは、約１０００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【００３０】
「活性である」または「活性」または「生物学的活性」は本発明のＤ因子アンタゴニストの状況では、Ｄ因子の生物学的活性をアンタゴナイズする（部分的または完全に阻害する）能力である。Ｄ因子アンタゴニストの好ましい生物学的活性は、例えば、補体が関係している眼の状態のようなＤ因子が関係している疾患または状態の状態（例えば、病状）の測定可能な改善を達成する能力である。活性は、インビトロまたはインビボ試験（結合アッセイを含む）において、関連する動物モデルまたはヒトの臨床試験を使用して決定することができる。
【００３１】
用語「補体が関係している眼の状態」は最も広い意味で使用され、その病状に補体（補体の古典経路と第２経路、および特に第２経路を含む）が関係している全ての眼の状態が含まれる。補体が関係している眼の状態としては、黄斑変性疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階、乾性形態と湿性形態（非滲出型と滲出型）を含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、ならびに他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。補体が関係している眼の状態の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出型（湿性）ＡＭＤおよび滲出型（乾性または萎縮型）ＡＭＤを含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が挙げられる。
【００３２】
「治療は、障害の発症を予防するか、または障害の病状を変化させる意図で行われる介入である。したがって、「治療」は、治療的治療と、予防的治療または予防対策の両方をいう。治療が必要なものには、すでに障害を有しているもの、ならびに障害が予防されるものが含まれる。免疫関連の疾患の治療においては、治療薬は免疫応答の成分の応答の大きさを直接変化させる場合があり、また、他の治療薬（例えば、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬など）による治療に対して疾患をより敏感にする場合もある。
【００３３】
疾患の病状（例えば、補体が関係している眼の状態）には、患者の満足できる生活状態を損なうあらゆる表現形が含まれる。これには、異常なまたは制御不可能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）、抗体生産、自己抗体の生産、補体の生産、近隣細胞の正常な機能の妨害、サイトカインの放出、または異常なレベルでの他の分泌産物、任意の炎症応用もしくは免疫学的応答の抑制または激化、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の細胞空間への浸潤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用されるとき、ヒト、高等霊長類、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、動物園用、競技用、またはペット用の動物（例えば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびイタチなど）が挙げられるが、これらに限定されない、哺乳動物と分類される任意の動物をいう。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【００３５】
１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（併用）投与および任意の順序での連続投与が含まれる。
【００３６】
「治療有効量」は、例えば、補体が関係している眼の状態のような標的である疾患または状態の状態（例えば、病状）の測定可能な改善を達成するために必要な「Ｄ因子アンタゴニスト」の量である。
【００３７】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物の中での作動可能に連結されたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、状況に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００３８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配置されている場合に「作動可能に連結され」ている。例えば、先行配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結される。または、リボソーム結合部位が、それが翻訳を促進するように配置される場合には、コード配列に作動可能に連結される。一般的には、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は使いやすい制限酵素部位での連結によって行われる。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実施方法にしたがって使用される。
【００３９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定可能であり、一般的には、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、より長いプローブには、適切なアニーリングのためにより高い温度が必要であり、一方、より短いプローブには、より低い温度が必要である。ハイブリダイゼーションは一般的には、相補的な鎖がそれらの融解温度よりも低い環境に存在する時の、変性したＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイゼーション可能な配列との間で所望される相同性の程度が大きければ大きいほど、使用できる相対的な温度は高くなる。したがって、結果として、より高い相対的温度が反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度は反応条件のストリンジェンシーをより低くする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細と説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照のこと。
【００４０】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシーの条件」は、本明細書中で定義される場合には以下によって特定され得る：（１）洗浄において、低いイオン強度と高温（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）を使用する；（２）ホルムアミドのような変性剤（例えば、４２℃で、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）をハイブリダイゼーションの間に使用する；または、（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸塩を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃で、５０％のホルムアミド中５５℃で洗浄し、５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄が続く。
【００４１】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載されているように同定することができ、これには、上記よりもストリンジェンシーの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ％）の使用が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸塩、および２０ｍｇ／ｍＬの変性させて剪断したサケの精液ＤＮＡを含む溶液中で３７℃で一晩のインキュベーションであり、その後に、約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が続く。当業者は、プローブの長さなどの要因に適合させる必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を理解しているであろう。
【００４２】
用語「エピトープタグ化」は、本明細書中で使用されるとき、「タグポリペプチド」と融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製できるエピトープを提供するのに十分な長さを有しているが、それに対して融合するポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い。タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように極めて固有なものであることが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は、約８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
【００４３】
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、これには具体的に、単鎖抗Ｄ因子モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ならびに多エピトープ特異性を有している抗Ｄ因子抗体組成物が含まれるが、これらに限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られた１つの抗体をいい、すなわち、個々の抗体を含む集団は、主要ではない量で存在する可能性がある自然界において起こる可能性がある変異を除いて同一である。
【００４４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られた１つの抗体をいい、すなわち、個々の抗体を含む集団は、主要ではない量で存在する可能性がある自然界において起こる可能性がある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、１つの抗原性部位を指向する。さらに、伝統的な（ポリクローナル）抗体調製物（これには、通常は、異なる決定基（エピトープ）に特異的な様々な抗体が含まれている）とは対照的に、個々のモノクローナル抗体は抗原上にある１つの決定基に特異的である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られたという抗体の特性を示し、任意の特定の方法によって抗体を生産する必要があるとは解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製される場合があり、また、組み換えＤＮＡ法によって作製される場合もある（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている技術を使用して単離される場合もある。
【００４５】
本明細書中でのモノクローナル抗体には、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれる。ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している抗体中の対応している配列と同一であるか相同であるが、それらが所望される生物学的活性を示すとの条件で、鎖の残りは別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体、さらにはそのような抗体の断片中の対応している配列と同一であるかあるいは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
【００４６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態はキメラ抗体であり、これには、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列が含まれる。大部分については、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その中のレシピエントの超可変領域由来の残基がヒト以外の種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または所望される特異性、親和性、および能力を有しているヒト以外の霊長類）の超可変領域由来の残基によって置き換えられる。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応しているヒト以外の残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体には、レシピエント抗体の中にも、またドナー抗体の中にも見られない残基が含まれる場合がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。一般的には、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全体が含まれるであろう。ここでは、超可変ループ全体または実質的に全体が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域全体または実質的に全体がヒト免疫グロブリン配列の物である。ヒト化抗体にはまた、状況に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（通常は、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分も含まれるであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。
【００４７】
「種依存性抗体」は、第１の哺乳動物種に由来する抗原に対して、第２の哺乳動物種に由来するその抗原のホモログに対して有しているよりも強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは、約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは、約１×１０−９以下Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種由来のその抗原のホモログに対して結合親和性を有しており、これはヒト抗原に対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い。種依存性抗体は、上記で定義された様々なタイプの抗体のうちのいずれかであり得るが、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが好ましい。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、「抗体突然変異体」または「抗体変異体」は、種依存性抗体のアミノ酸残基のうちの１つ以上が修飾されている、種依存性抗体のアミノ酸配列変異体をいう。そのような突然変異体は、種依存性抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を必ず有する。好ましい実施形態においては、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中では、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、種依存性抗体残基と同一である（すなわち、同じ残基）または類似している（すなわち、共通する側鎖特性に基づく同じグループに由来するアミノ酸残基）、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸張、欠失、あるいは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を与えないと解釈されるべきである。
【００４９】
「単離された」抗体は、同定され、その自然界での環境にある成分とは分離されている、および／またはそれらから回収されたものである。その自然界での環境の混入している成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する可能性がある物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態においては、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定された場合には、アンタゴニストのうち９５重量％より高く、好ましくは９９重量％より高く、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する、還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性を示すように、精製されるであろう。抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在することはないので、単離された抗体には、組換え体細胞内でインサイチュでの抗体が含まれる。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分をいう。ＶＨは、重鎖の可変ドメインをいう。ＶＬは軽鎖の可変ドメインをいう。本発明で使用される方法に従うと、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸位置はＫａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ、１９８７および１９９１））にしたがって定義され得る。抗体または抗原結合断片のアミノ酸ナンバリングもまたＫａｂａｔのものにしたがう。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、その存在が抗原結合に不可欠である抗体可変ドメインのアミノ酸残基をいう。個々の可変ドメインは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として特定された３個のＣＤＲ領域を有する。個々の相補性決定領域には、Ｋａｂａｔによって定義された「相補性決定領域」に由来するアミノ酸残基が含まれ得る（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２４〜３４（Ｌ１）、残基約５０〜５６（Ｌ２）および残基約８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基約３１〜３５（Ｈ１）、残基約５０〜６５（Ｈ２）および残基約９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））由来のアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｌ１）、残基約５０〜５２（Ｌ２）および残基約９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｈ１）、残基約５３〜５５（Ｈ２）および残基約９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）由来の残基が含まれ得る。いくつかの場合には、相補性決定領域には、Ｋａｂａｔにしたがって定義されたＣＤＲ領域と超可変ループの両方に由来するアミノ酸が含まれ得る。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖ＣＤＲＨ１にはアミノ酸２６〜３５が含まれる。
【００５２】
「フレームワーク領域」（本明細書中、以後、「ＦＲ」）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域の残基である。個々の可変ドメインは、通常は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４として同定された４個のＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔにしたがって定義される場合は、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、約３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、約５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、および約９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）にあり、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の中の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、約３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、約６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、および約１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）にある。ＣＤＲに超可変ループ由来のアミノ酸残基が含まれる場合は、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖の中の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、約３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、約５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、および約９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）にあり、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の中の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、約３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、約５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、および約１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）にある。ＣＤＲに、Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲと超可変ループのものの両方に由来するアミノ酸が含まれるいくつかの場合には、ＦＲ残基は、それに応じて調製されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１にアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５が含まれる場合には、重鎖ＦＲ１残基は１〜２５位にあり、ＦＲ２残基は３６〜４９位にある。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、「コドンセット」は、所望される変異体アミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列の１つのセットをいう。コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組み合わせの全てを提示し、アミノ酸の所望されるグループをコードするであろう配列を含むオリゴヌクレオチドの１つセットは、例えば、固相合成によって合成することができる。コドン表示の標準的な形態はＩＵＢコードのコドン表示である。これは当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。コドンセットは、通常、斜体の３つの大文字（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなど）によって表される。したがって、「非無作為コドンセット」は本明細書中で使用されるとき、本明細書中に記載されるアミノ酸選択の基準を部分的に（好ましくは完全に）満たす選択されたアミノ酸をコードするコドンセットをいう。特定の位置に選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知である。例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）；ＧａｒｒａｒｄおよびＨｅｎｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：１０３）。特定のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのそのようなセットは、市販されている核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手できる）を使用して合成することができ、また商業的に入手することもできる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有している合成されたオリゴヌクレオチドの１つのセットには、通常、様々な配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドが含まれるであろう。これらの差異は、配列全体の中にコドンセットによって確立される。本発明にしたがって使用されるとき、オリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、例えば、クローニングの目的に有用である制限酵素部位を含むことができるが、これは必ずしも必要ではない。
【００５４】
用語「抗体断片」は本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、例えば、ｓｃＦｖにおいて堅く会合した（本来は共有結合であり得る）１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの２量体からなる。この立体配置においては、個々の可変ドメインの３個のＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位の輪郭を提示する。まとめると、６個のＣＤＲまたはそれらのサブセットが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３個しか含まないＦｖの半分）もなお抗原を認識して抗原に結合する能力を有しているが、通常は、完全な結合部位よりも親和性が低い。
【００５６】
「Ｆａｂ」断片には、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）が含まれる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片には１対のＦａｂ断片が含まれ、これは通常、それらの間にあるヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有結合する。抗体断片の他の化学的カップリングもまた当該分野で公知である。
【００５７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片には、抗体のＶＨおよびＶＬドメインが含まれる。ここでは、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖の中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドにはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーが含まれ、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための所望される構造を形成することができる。ｓｃＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００５８】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片をいう。この断片には、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）の中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれる。同じ鎖上にある２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対合するように向けられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８にさらに詳細に記載されている。
【００５９】
表現「直鎖抗体」は、Ｚａｐａｔａら（１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、８（１０）：１０５７−１０６２）に記載されている抗体をいう。簡単に説明すると、これらの抗体には、１対のタンデムなＦｄセグメントの（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）が含まれる。これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に、１対の抗原結合領域を形成する。直鎖抗体は二重特異的であって、また単特異的でもあり得る。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、「ライブラリー」は、複数の抗体または抗体断片配列（例えば、本発明のポリペプチド）、またはこれらの配列をコードする核酸をいう。これらの配列は、本発明の方法にしたがってこれらの配列の中に導入される変異体アミノ酸の組み合わせが異なる。
【００６１】
「ファージディスプレイ」は、それによって変異体ポリペプチドが、ファージ（例えば、糸状ファージ）粒子”の表面上にある外被タンパク質の少なくとも一部に対する融合タンパク質として提示される技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化されたタンパク質変異体の大きなライブラリーが、高い親和性を有している標的抗原に結合するそのような配列について迅速に、かつ効率よく選別され得るという事実にある。ファージ上にあるペプチドおよびタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有しているものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合によって小さい無作為ペプチドおよび小さいタンパク質を提示するために使用されている。ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：３５５−３６２、および本明細書中で引用される参考文献。１価のファージディスプレイにおいては、タンパク質またはペプチドライブラリーは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合させられ、ファージ粒子が１コピーの融合タンパク質を提示するか、または融合タンパク質を全く提示しないように、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現する。親和性効果は多価ファージと比較して低く、結果として、選別は固有のリガンド親和性に基づき、ファージミドベクターが使用され、これはＤＮＡの操作を簡素化する。ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３：２０５−０２１６。
【００６２】
「ファージミド」は、細菌の複製起点（例えば、Ｃｏ１Ｅ１）とバクテリオファージの遺伝子間領域の１つのコピーを有しているプラスミドベクターである。ファージミドは、任意の公知のバクテリオファージ（糸状バクテリオファージおよびラムダ型バクテリオファージを含む）に対して使用することができる。プラスミドにはまた、一般的には、抗生物質耐性のための選択マーカーが含まれるであろう。これらのベクターの中にクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖させることができる。これらのベクターを保有している細胞がファージ粒子の生産に必要な遺伝子全てとともに提供されると、プラスミドの複製の態様が複製サイクルを回転させるように変化して、プラスミドＤＮＡの一方の鎖のコピーとパッケージファージ粒子が作製される。ファージミドは感染性ファージ粒子を形成する場合も、また非感染性ファージ粒子を形成する場合もある。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子に連結したファージ外被タンパク質遺伝子またはその断片を含むファージミドが含まれる。
【００６３】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み、複製が可能なバクテリオファージの二本鎖の複製可能な形態を意味する。ファージベクターは、ファージの複製とファージ粒子の形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージのような糸状バクテリオファージまたはそれらの誘導体、あるいは、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４などのラムダ型ファージまたはそれらの誘導体であることが好ましい。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、「溶媒が接近しやすい位置（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、抗体もしくは抗原結合断片の構造、構造の集合体、および／またはモデル化された構造に基づいて、分子（例えば、抗体特異的抗原）との溶媒の接近および／または接触に利用される可能性があるとして決定される、供給源である抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変領域中のアミノ酸残基の位置をいう。これらの位置は、通常、ＣＤＲの中、およびタンパク質の外側に見られる。抗体または抗原結合断片の溶媒が接近しやすい位置は、本明細書中で定義される場合は、当該分野で公知の多数のアルゴリズムのうちの任意のものを使用して決定され、好ましくは、溶媒が接近しやすい位置は、抗体の３次元モデルから座標を使用して、好ましくは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のようなコンピュータープログラムを使用して決定される。溶媒が接近しやすい位置はまた、当該分野で公知のアルゴリズムを使用して決定することもできる（例えば、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５、３７９、およびＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６、５４８を参照のこと）。溶媒が接近しやすい位置の決定は、抗体から得られたタンパク質のモデル化および３次元構造情報に好適なソフトウェアを使用して行うことができる。これらの目的のために利用できるソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。一般的には、好ましくは、アルゴリズム（プログラム）に使用者がサイズパラメーターを入力する必要がある場合には、計算に使用されるプローブの「サイズ」は、約１．４オングストローム以下の半径に設定される。加えて、パーソナル・コンピュータ用のソフトウェアを使用する溶媒が接近しやすい領域および範囲の決定は、Ｐａｃｉｏｓ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６によって記載されている。
【００６５】
ＩＩ．詳細な説明
補体は体の防御において重要な役割を果たしており、免疫系の他の成分とともに、体への病原体の侵入から個体を防御する。しかしながら、適切に活性化または制御されなければ、補体もまた宿主組織に対して損傷を引き起こす可能性がある。補体の不適切な活性化は、補体が関係している疾患または障害（例えば、免疫複合体および自己免疫疾患）ならびに様々な炎症状態（補体によって媒介される炎症性の組織損傷を含む）と呼ばれる様々な疾患の病状に関係している。補体が関係している疾患の病状は様々であり、これには、長期間または短期間の補体活性化、カスケード全体の活性化、複数のカスケードのうちの１つだけ（例えば、古典経路または第２経路）の活性化、カスケードのうちのいくつかの成分だけの活性化などが関係している可能性がある。いくつかの疾患においては、補体断片の補体生物学的活性が組織の損傷および疾患を生じる。したがって、補体の阻害剤は治療的有効性が高い。第２経路の選択的阻害剤は、古典経路による血液からの病原体および他の微生物のクリアランスがまだ損なわれていないので、特に有用であろう。
【００６６】
本発明のＤ因子アンタゴニストは、補体が関係している眼の状態（その病状に補体（補体の古典経路と第２経路、特に、第２経路を含む）が関係している全ての眼の状態および疾患であって、例えば、黄斑変性疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階（乾性形態と湿性形態（非滲出型と滲出型）を含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、ならびに他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生の予防および治療に有用である。補体が関係している眼の状態の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出型（湿性）ＡＭＤおよび滲出型（乾性）ＡＭＤを含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が含まれる。
【００６７】
ＡＭＤは、黄斑の加齢性の変性である。これは、６０歳を超えた個体における不可逆的な視力障害の主原因である。ＡＭＤには２種類のタイプ：非滲出性（乾性）ＡＭＤと滲出性（湿性）ＡＭＤがある。乾性、すなわち、非滲出性の形態には、中心網膜（黄斑）の基部にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性変化および肥大性変化、ならびにＲＰＥ上への蓄積（ドルーゼ）が含まれる。非滲出性ＡＭＤの患者は、ＡＭＤの湿性（すなわち、滲出型）形態へと進行する可能性があり、ここでは、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭｓ）と呼ばれる異常な血管が網膜の下に生じ、体液と血液が漏出し、最終的には網膜中および網膜下に失明にいたる円盤状の瘢痕が生じる。非滲出性ＡＭＤ（これは、通常は滲出型ＡＭＤの前兆である）がより多く見られる。非滲出性ＡＭＤの状態は様々である；堅いドルーゼ、柔らかいドルーゼ、ＲＰＥ地図状萎縮（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｔｒｏｐｈｙ）、および色素クランピング（ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｌｕｍｐｉｎｇ）が存在し得る。補体成分はＡＭＤの初期にＲＰＥ上に蓄積し、ドルーゼドルーゼの主要な構成成分である。
【００６８】
本発明は特に、カテゴリー３およびカテゴリー４のＡＭＤを含むハイリスクＡＭＤの治療に関する。カテゴリー３のＡＭＤは、いずれの眼にも進行したＡＭＤは存在せず、少なくとも一方の眼が２０／３２以上の視力を有しており、少なくとも１つの大きなドルーゼ（例えば、１２５μｍ）、広範囲に及ぶ（ドルーゼの面積によって測定される場合）中程度のドルーゼ、または地図状萎縮（ＧＡ）（これには黄斑の中心部は含まれない）、あるいはこれらの任意の組み合わせが伴うことを特徴とする。カテゴリー３のＡＭＤ（これは、まだ「乾性」ＡＭＤと考えられる）は脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に転化するリスクが高い。
【００６９】
カテゴリー４のハイリスクＡＭＤ（「湿性」ＡＭＤと分類される）は、２０／３２以上の視力と、指標となる眼には進行していない（ｎｏ ａｄｖａｎｃｅｄ）ＡＭＤが存在する（ＧＡに黄斑の中心または脈絡膜新生血管の特徴が含まれている）ことを特徴とする。もう一方の（ｆｅｌｌｏｗ）眼は、進行したＡＭＤ、またはＡＭＤ黄斑変性症が原因である２０／３２未満の視力を特徴とする。通常、ハイリスクＡＭＤは、治療しなければ、迅速に脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）へと、カテゴリー１または２（ハイリスクではない）のＡＭＤの進行速度の約１０〜３０倍の速度で進行する。
【００７０】
Ｄ因子アンタゴニストは、ＣＮＶへのＡＭＤ（特に、カテゴリー３またはカテゴリー４のＡＭＤ）の進行の予防、および／または、罹患していないかもしくは罹患の程度の低いもう一方の眼のＡＭＤまたはＣＮＶの発症／進行の予防に特に有用性が見出されている。この状況では、用語「予防」は、疾患の進行の完全なまたは部分的なブロックおよび進行速度を遅らせること、ならびに、疾患のより重篤な形態の発症（ｕｎｓｅｔ）を遅らせることを含むように、最も広い意味で使用される。ハイリスク（カテゴリー４）のＡＭＤまたはＣＭＶを発症するか、またはそれへと進行するリスクが高い患者は、本発明のこの態様によって特に利点が得られる。
【００７１】
補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形がＡＭＤおよび／またはＣＮＶを発症する個体のリスクと関係があることは公知である。ＣＦＨの中での突然変異は補体を活性化させる可能性があり、これは次いで、ＡＭＤ／ＣＮＶに至る場合がある。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形がＡＭＤの寄与リスクの５０％を占めることが最近報告されている（Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９（２００５））。ＣＦＨの一般的なハプロタイプ（ｈａｌｐｏｔｙｐｅ）（ＨＦ１／ＣＦＨ）は、個体を加齢性黄斑変性にかかりやすくする素因であることが明らかになっている（Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２（２）：７２２７−７２３２（２００５））。ＡＭＤは常染色体優性形質として分離されており、マーカーＤ１Ｓ４６６〜Ｄ１Ｓ４１３間の染色体１ｑ２５−ｑ３１に、約３．２０の最大ロッドスコアで（Ｋｌｅｉｎら、Ａｒｃｈ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１６（８）：１０８２−９（１９９８）；Ｍａｊｅｗｓｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（３）：５４０−５０（２００３）；Ｓｅｄｄｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（４）：７８０−９０（２００３）；Ｗｅｅｋｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３２（５）：６８２−９２（２００１）；Ｉｙｅｎｇａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７４（１）：２０−３９（２００４））；マーカーＤ１２Ｓ１３９１〜Ｄ２Ｓ１３８４間の染色体２ｑ３／２ｑ３２に、２．３２／２．０３の最大ロッドスコアで（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）；マーカーＤ１２Ｓ１３００〜Ｄ１２Ｓ１７６３間の３ｐ１３に、２．１９の最大ロッドスコアで（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｓｃｈｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７２（６）：１４１２−２４（２００３））；マーカーＤ６Ｓ１０５６〜ＤＳ２４９間の６ｑ１４に、３．５９／３．１７の最大ロッドスコアで（Ｋｎｉａｚｅｖａら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈｌｍｏｌ．１３０（２）：１９７−２０２（２０００））；マーカーＤ９Ｓ９３４にある９ｑ３３に、２．０６の最大ロッドスコアで（Ｍｅｊｗｓｋｉら、前出）；マーカーＤ１０Ｓ１２３０にある１０ｑ２６に、３．０６最大ロッドスコアで（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｉｙｅｎｇａｒら、前出；Ｋｅｎｅａｌｙら、Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．１０：５７−６１（２００４）；マーカーＤ１７Ｓ９２８にある１７ｑ２５に、３．１６の最大ロッドスコアで（Ｗｅｅｋｓら、前出）；および、マーカーＤ２２Ｓ１０４５にある２２ｑ１２に、２．０の最大ロッドスコアで（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）疾患遺伝子マッピングされている。したがって、遺伝子スクリーニングは予防的治療（より重篤な形態への（例えば、ＡＭＤからＣＮＶへの）疾患の進行の予防を含む）のための特に良好な候補である患者を同定する重要な部分である。
【００７２】
１．抗Ｄ因子抗体
本明細書中の本発明には、抗Ｄ因子抗体の生産と使用が含まれる。抗体の代表的な作製方法が以下の節でさらに詳細に記載される。
【００７３】
抗Ｄ因子抗体は、哺乳動物種由来のＤ因子抗原を使用して選択される。抗原がヒトＤ因子であることが好ましい。しかしながら、他の種に由来するＤ因子（例えば、マウスＤ因子）もまた標的抗原として使用できる。様々な哺乳動物種に由来するＤ因子抗原を天然の供給源から単離することができる。他の実施形態においては、抗原は組み換えによって生産されるか、または、当該分野で公知の他の合成方法を使用して作成される。
【００７４】
選択された抗体は、通常は、Ｄ因子抗原に対して十分に強い結合親和性を有するであろう。例えば、抗体は、約５ｎＭ以下、好ましくは約２ｎＭ以下、より好ましくは約５００ｐＭ以下のＫｄ値でヒトＤ因子に結合し得る。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、実施例に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫中着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ’ｓ）によって決定され得る。
【００７５】
また、抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するための、他の生物学的活性のアッセイにも供することができる。そのようなアッセイは当該分野で公知であり、標的抗原と抗体について意図される用途に応じて様々である。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ（以下の実施例に記載される）；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２号に記載されている）；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；ならびに、Ｄ因子アンタゴニストについて以下に記載されるインビトロおよびインビボでのアッセイが挙げられる。
【００７６】
目的の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、日常的に行われているクロス・ブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているアッセイ）を行うことができる。あるいは、エピトープマッピング（例えば、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されている）を、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定するために行うことができる。
【００７７】
好ましい実施形態においては、抗Ｄ因子抗体は特有のファージディスプレイアプローチを使用して選択される。このアプローチには単一のフレームワーク鋳型に基づく合成の抗体ファージライブラリーの作製、可変ドメインの中での十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有しているポリペプチドのディスプレイ、標的Ｄ因子抗原に対して高い親和性を有している候補抗体の選択、および選択された抗体の単離が含まれる。
【００７８】
ファージディスプレイ方法の詳細は、例えば、２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７号に見ることができる。
【００７９】
１つの態様においては、抗体ライブラリーは、抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲの中にある溶媒が接近しやすい位置および／または多様性に富む位置を突然変異させることによって作製することができる。ＣＤＲのいくつかまたは全てを、本明細書中に提供される方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させることによって、または、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させること、または、ＣＤＲＬ３とＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させることにより、多様性抗体ライブラリーを作製することが好ましい場合がある。
【００８０】
例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の溶媒が接近しやすい位置および／または多様性に富む位置の中に複数の突然変異を有している抗体可変ドメインのライブラリーを作製することができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の中に複数の突然変異を有している別のライブラリーを作製することができる。これらのライブラリーはまた、所望される親和性のバインダーを作製するために、互いに組み合わせて使用することもできる。例えば、標的抗原に対する結合についての重鎖ライブラリーの１回以上の選択の後、軽鎖ライブラリーを、バインダーの親和性を増大させるためのさらなる回の選択のために、重鎖バインダーの集団の中に入れることができる。
【００８１】
好ましくは、ライブラリーは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域中での、変異体アミノ酸でのもとのアミノ酸の置換によって作製される。得られるライブラリーには複数の抗体配列が含まれ得る。ここでは、配列多様性は、主に、重鎖配列のＣＤＲＨ３領域の中にある。
【００８２】
１つの態様においては、ライブラリーは、ヒト化抗体４Ｄ５配列、またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の状況において作製される。好ましくは、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸での重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。ここでは、ＤＶＫコドンセットは、これらの位置の全ての変異体アミノ酸の１つのセットをコードするために使用される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの一例には、配列（ＤＶＫ）７が含まれる。いくつかの実施形態においては、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での、少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの例には、配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）が含まれる。別の実施形態においては、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での、少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの一例には、配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）が含まれる。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例には配列（ＮＮＫ）６が含まれる。適切なオリゴヌクレオチド配列の他の例は、本明細書中に記載される基準にしたがって当業者によって決定され得る。
【００８３】
別の実施形態においては、様々なＣＤＲＨ３のデザインが、高親和性バインダーを単離するため、様々なエピトープに対するバインダーを単離するために利用される。このライブラリーの中で作製されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１〜１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さもまた作製され得る。Ｈ３多様性は、ＮＮＫ、ＤＶＫ、およびＮＶＫコドンセット、ならびに、Ｎ末端および／またはＣ末端でのより限定された多様性を使用することにより拡大させることができる。
【００８４】
多様性はまた、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の中に作製することもできる。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性のデザインは、以前のデザインよりも自然界での多様性にさらにきっちりと適合する多様性に焦点を合わせた修飾を用いる、記載されるような天然の抗体レパートリーを模倣するための標的化のストラテジーにしたがう。
【００８５】
ＣＤＲＨ１３の中での多様性については、様々なＨ３の長さを有している複数のライブラリーを別々に構築し、その後、標的抗原に対するバインダーについて選択するために合わせて１つにすることができる。複数のライブラリーは、プールすることができ、以前に記載されており、本明細書中に記載されるように、固体支持体選択と溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方法論を使用することができる。例えば、１つのバリエーションには、固体に結合した標的についての選別、それに続く、融合ポリペプチド上に存在し得るタグ（例えば、抗ｇＤタグ）についての選別、その後の、固体に結合した標的についての別の選別が含まれる。あるいは、ライブラリーは、固体表面に結合した標的について最初に選別され得、溶離したバインダーが、その後、標的抗原の濃度を低下させつつ、溶液相の結合を使用して餞別される。様々な選別方法の組み合わせを利用することにより、高度に発現された配列だけの選択の最小化が提供され、多数の様々な高親和性クローンの選択が提供される。
【００８６】
標的Ｄ因子抗原に対する高親和性バインダーをライブラリーから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域の中の多様性を制限することにより、縮重性は約１０４倍〜１０５倍減少し、さらなるＨ３多様性がより高親和性のバインダーを提供することを可能にする。ＣＤＲＨ３の中に様々なタイプの多様性を有しているライブラリーを利用する（例えば、ＤＶＫまたはＮＶＴを利用する）ことにより、標的抗原の様々なエピトープに結合し得るバインダーの単離が提供される。
【００８７】
別の実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域の中に多様性を有しているライブラリー（１つ以上）が作製される。この実施形態においては、ＣＤＲＨ３の中の多様性は、様々な長さのＨ３領域を使用し、主要なコドンセットＸＹＺおよびＮＮＫまたはＮＮＳを使用して作製される。複数のライブラリーが個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成され得、プールされ得るか、またはオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのサブセットを形成させるためにプールされ得る。この実施形態の複数のライブラリーは、固体に結合したした標的に対して選別することができる。複数回の選別によって単離されたクローンは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性および親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンは所望される標的抗原ならびに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対するこれらのバインダーは、その後、溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性バインダーは、上記に記載されたように調製されたＸＹＺコドンセットを利用してライブラリーから単離することができる。これらのバインダーは、細胞培養物中で高収率で抗体または抗原結合断片として容易に生産することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態においては、ＣＤＲＨ３領域の長さに関して、より大きな多様性を有しているライブラリーを生じさせることが所望され得る。約７〜１９アミノ酸までの範囲のＣＤＲＨ３領域を有しているライブラリーを作製することが所望され得る。
【００８９】
これらの実施形態のライブラリーから単離された高親和性バインダーは、細菌および真核生物細胞培養物の中で高収率で容易に生産される。ベクターは、ｇＤタグ、ウイルス外被タンパク質成分配列のような配列を容易に除去しおよび／または高収率での全長抗体または抗原結合断片の生産がもたらされるように定常領域配列の中に加えるように設計され得る。
【００９０】
ＣＤＲＨ３の中に突然変異を有しているライブラリーは、他のＣＤＲの変異体バージョン（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、および／またはＣＤＲＨ２）を含むライブラリーと組み合わせることができる。したがって、例えば１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ３ライブラリーは、予め決定されたコドンセットを使用して２８、２９、３０、３１、および／または３２位に変異体アミノ酸を有しているヒト化４Ｄ５抗体配列の状況において作製されたＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わせられる。別の実施形態においては、ＣＤＲＨ３に突然変異を有しているライブラリーは、変異体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリーと組み合わせることができる。１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ１ライブラリーは、２８、３０、３１、３２、および３３位に変異体アミノ酸を有しているヒト化抗体４Ｄ５配列を用いて作製される。ＣＤＲＨ２ライブラリーは、予め決定されたコドンセットを使用して５０、５２、５３、５４、５６、および５８位に変異体アミノ酸を有しているヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いて作製され得る。
【００９１】
ファージライブラリーから作製された抗Ｄ因子抗体は、もとの抗体を上回る改善された物理的、化学的、および／または生物学的特性を有する抗体突然変異体を生じるようにさらに修飾することができる。使用されるアッセイが生物学的活性のアッセイである場合には、抗体突然変異体は、好ましくは、選択されたアッセイにおいて生物学的活性を有し、これはそのアッセイにおけるもとの抗体の生物学的活性よりも、少なくとも約１０倍大きい、好ましくは少なくとも約２０倍大きい、より好ましくは少なくとも約５０倍大きい、多くの場合は少なくとも約１００倍または２００倍大きい。例えば、抗Ｄ因子抗体突然変異体は、好ましくは、ＮＲＰに対して結合親和性を有し、これは、もとの抗Ｄ因子抗体（例えば、図５に示される抗体のうちのいずれか、具体的には、抗体２０Ｄ１２）の結合親和性よりも少なくとも約１０倍強い、好ましくは少なくとも約２０倍強い、より好ましくは、少なくとも約５０倍強い、多くの場合は少なくとも約１００倍または２００倍強い。
【００９２】
抗体突然変異体を作製するためには、１つ以上のアミノ酸の変更（例えば、置換）が、もとの抗体の１つ以上の超可変領域の中に導入される。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の１つ以上の変更（例えば、置換）がもとの抗体の中に導入され得、ここでは、これらは第２の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の改善を生じる。修飾されるフレームワーク領域残基の例としては、抗原に直接非共有結合するもの（Ａｍｉｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲの立体構造と相互作用する／立体構造に影響を与えるもの（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（ＥＰ ２３９ ４００Ｂ１）が挙げられる。特定の実施形態においては、１つ以上のそのようなフレームワーク領域残基の修飾は、第２の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強を生じる。例えば、約１個から約５個のフレームワーク残基が本発明のこの実施形態において変化させられ得る。多くの場合には、これは、超可変領域残基がいずれも変化させられていない場合でもなお、前臨床試験での使用に好適な抗体突然変異体を得るために十分であり得る。しかしながら、通常は、抗体突然変異体にはさらなる超可変領域の変更が含まれるであろう。
【００９３】
変更される超可変領域残基は無作為に変化させることができ、特に、もとの抗体の最初の結合親和性がそのような無作為に生産された抗体突然変異体である場合に、容易にスクリーニングできる。
【００９４】
そのような抗体突然変異体を作製するための１つの有用な手順は「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。ここでは、１つ以上の超可変領域残基が、第２の哺乳動物種に由来する抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与えるアラニンまたはポリアラニン残基によって置き換えられる。置換に対して機能的感度を示しているこれらの超可変領域残基は、その後、置換部位に、もしくは置換部位についてさらなるまたは他の突然変異を導入することによって詳細に調べられる。したがって、アミノ酸配列のバリエーションを導入するための部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。この方法で生産されたａｌａ突然変異体は、本明細書中に記載されるようにそれらの生物学的活性についてスクリーニングされる。
【００９５】
通常、当業者は、「好ましい置換基」の表題で以下に示されるような保存的置換を用いて開始するであろう。そのような置換が生物学的活性（例えば、結合親和性）において変化を生じる場合には、以下の表において、またはアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載されるように「代表的な置換基」と命名されたさらなる置換変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。好ましい置換は以下の表に列挙される。
【００９６】
【表１】
抗体の生物学的特性のなおさらに実質的な修飾は、（ａ）置換の領域内にあるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックス構造）、（ｂ）標的部位にある分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさ、を維持することに対するそれらの作用が有意に異なる置換基を選択することによって行われる。自然界に存在している残基は共通する側鎖特性に基づいて複数のグループに分類される。
【００９７】
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００９８】
非保存的置換には、別のクラスをこれらのクラスのうちの１つのメンバーで交換することを必然的に伴うであろう。
【００９９】
別の実施形態においては、修飾のために選択された部位は、ファージディスプレイを使用して親和性が発達する（上記を参照のこと）。
【０１００】
アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、もとの抗体の以前に調製された突然変異体または非突然変異体バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。突然変異を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８を参照のこと）。
【０１０１】
特定の実施形態においては、抗体突然変異体は、単一の置換された超可変領域残基のみを有するであろう。他の実施形態においては、もとの抗体の超可変領域残基のうちの２つ以上が置換されているであろう（例えば、約２〜約１０個までの超可変領域置換）。
【０１０２】
通常は、改善された生物学的特性を有している抗体突然変異体は、もとの抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中では、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、もとの抗体残基と同一である（すなわち、同じ残基）または類似している（すなわち、共通する側鎖特性に基づく同じグループに由来するアミノ酸残基、上記を参照のこと）、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸張、欠失、あるいは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を与えないと解釈されるべきである。
【０１０３】
抗体突然変異体の生産後、もとの抗体と比較した分子の生物学的活性が決定される。上記のように、これには、抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の決定が含まれ得る。本発明の好ましい実施形態においては、抗体変異体のパネルが調製され、抗原（例えば、ＮＲＰ１）またはその断片に対する結合親和性についてスクリーニングされる。この最初のスクリーニングによって選択された抗体突然変異体のうちの１つ以上が、状況に応じて、結合親和性が増大したこの抗体突然変異体が実際に（例えば、前臨床試験に）有用であることを確認するために、１つ以上のさらなる生物学的活性のアッセイに供される。
【０１０４】
そのように選択された抗体突然変異体は、多くの場合には、抗体の意図される用途に応じたさらなる修飾に供され得る。そのような修飾としては、アミノ酸配列のさらなる変更、異種ポリペプチドに対する融合、および／または以下に詳細に述べられるもののような共有結合による修飾を挙げることができる。アミノ酸配列の変更に関しては、代表的な修飾は上記で詳細に述べられる。例えば、抗体突然変異体の適切な立体構造の維持には関与していない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化能力を改善し、異常な架橋を防ぐために、通常はセリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、その安定性を改善するために抗体に付加され得る（特に、抗体がＦｃ断片のような抗体断片である場合）。アミノ酸突然変異体の別のタイプは、変更されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体の中に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体の中には存在しない１つ以上のグリコシル化部分を付加することによって行われ得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンとアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンまたはスレオニン）に対する結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。抗体に対するグリコシル化部位の付加は、１つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ結合グリコシル化部位について）。変更はまた、もとの抗体の配列に対する１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加またはそれらによる置換によっても行われ得る（Ｏ結合グリコシル化部位について）。
【０１０５】
本発明の抗Ｄ因子抗体は、容易に入手できる技術と材料を使用して組み換えによって生産することができる。
【０１０６】
抗Ｄ因子抗体の組み換え生産のためには、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために複製可能ベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離または合成される。多くのベクターを利用できる。一般的には、ベクター成分には、以下のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロオーター、および転写終結配列。
【０１０７】
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、組み換えによって直接生産できるだけではなく、異種ポリペプチド（これは、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有している他のポリペプチド）を持つ融合ポリペプチドとしても生産できる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。本来の抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列列は、選択された原核生物シグナル配列（例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーのグループに由来する）によって置換される。酵母からの分泌については、本来のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、あるいは、ＷＯ９０／１３６４６号に記載されているシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を利用できる。そのような先行領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに対してリーディングフレーム内になるように連結される。
【０１０８】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターにはいずれも、１つ以上の選択された宿主細胞の中でのベクターの複製を可能にする核酸配列が含まれる。一般的には、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主の染色体ＤＮＡとは無関係にベクターが複製することを可能にするものであり、これには複製起点または自律複製配列が含まれる。そのような配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点が酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は通常、これに初期プロモーターが含まれるので、単独で使用され得る）。
【０１０９】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターとクローニングベクターには選択遺伝子が含まれる場合があり、これは選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補う、あるいは（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１１０】
選択方式の一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬物が利用される。異種遺伝子でうまく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、それにより、選択レジュメを生き残る。そのような優性選択の例では、薬物であるネオマイシン、マイコフェノール酸、およびハイグロマイシンが使用される。
【０１１１】
哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの別の例は、抗体核酸を取り込むための細胞成分（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）の同定を可能にするものである。
【０１１２】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって最初に同定される。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが使用される場合には、ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１１３】
あるいは、抗体である野生型ＤＨＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換されたか、または別の選択マーカー（例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））と一緒に同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択マーカーについての選択試薬（例えば、アミノグリコシド性抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８）を含む培地の中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１１４】
酵母において使用される適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７の中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力が欠失している酵母の突然変異株（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１）についての選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２。それにより、酵母の宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンが存在しない条件下での増殖により形質転換体を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有している公知のプラスミドによって補われる。
【０１１５】
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組み換え体ウシキモシンの大規模生産のための発現システムが、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告されている。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの産業用株による成熟組み換え体ヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピーの発現ベクターもまた開示されているＦｌｅｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５。
【０１１６】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターとクローニングベクターには、通常、宿主生物によって認識され、抗体核酸に対して作動可能に連結された１つのプロモーターが含まれる。プロモーターは、原核細胞宿主とともに使用される好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用されるプロモーターにはまた、抗体をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列も含まれるであろう。
【０１１７】
真核生物細胞についてのプロモーター配列も知られている。事実全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴを多く含む領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０〜８０塩基上流に見られる他の配列は、１つのＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎどの核酸でもよい）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの全ての配列は、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０１１８】
酵母宿主とともに使用される適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、または他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）のためのプロモーターが挙げられる。
【０１１９】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有している誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデハイドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係がある分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースの利用に関与している酵素のプロモーター領域である。酵母発現に使用される好適なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターとともに好都合に使用される。
【０１２０】
哺乳動物の宿主細胞の中でのベクターからの抗体の転写は、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスそして最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）によって、熱ショックプロモーターによって、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合するとの条件で制御される。
【０１２１】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限酵素断片として簡単に得られる。ヒトのサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素処理断片として簡単に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用する哺乳動物宿主の中でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に記載されている。この系の修飾は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下での、マウス細胞中でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｒｓら（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：５９８−６０１もまた参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用できる。
【０１２２】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物細胞による転写は、多くの場合、そのベクターの中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インシュリン）に由来する多くのエンハンサー配列が、現在知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例として、複製起点（１００〜２７０ｂｐ）の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物細胞のプロモーターの活性化のためのエンハンスエレメントについては、Ｙａｎｉｖ（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：１７−１８（１９８２））もまた参照のこと。このエンハンサーはベクターの中で、抗体をコードする配列の５’位置または３’位置でスプライシングされ得るが、プロモーターから５’の位置に配置されることが好ましい。
【０１２３】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞において使用される発現ベクター（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）には、転写の終結のため、ｍＲＮＡの安定化のために必要な配列もまた含まれるであろう。このような配列は、通常、真核生物もしくはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によっては、３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域には、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分の中にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントが含まれる。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６および本明細書中に開示される発現ベクターを参照のこと。
【０１２４】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択と形質転換
本明細書中のベクター中でのＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記に記載された原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物としては、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物のような真正細菌、例えば、腸内細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、およびＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）のような他の株も好適である。これらの例は限定でなく例示である。
【０１２５】
原核生物細胞に加えて、神格微生物（例えば、糸状菌または酵母）が抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（すなわち、一般的なパン酵母）は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般的に使用されている。しかしながら、以下のような多数の他の属、種、および株も一般に利用することができ、本明細書中で有用である：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに、糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ））。
【０１２６】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株と変異体、以下のような宿主に由来する対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ハエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ。トランスフェクションのための様々なウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）は公に入手することができ、そのようなウイルスは本発明に従って本明細書中でウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペツニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養もまた宿主として利用できる。
【０１２７】
しかしながら、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられており、培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖は日常的に行われている作業となってきた。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞株（２９３、または懸濁培養中の増殖についてサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚管腫瘍細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞、およびヒト肝ガン細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【０１２８】
宿主細胞は、抗体生産のために上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された通常の栄養培地の中で培養される。
【０１２９】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生産するために使用される宿主細胞は様々な培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ−１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（「ＭＥＭ」、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（「Ｄ−ＭＥＭ」、Ｓｉｇｍａ）などの商業的に入手することができる培地は、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍら（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；あるいは、米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のうちの任意のものが、宿主細胞用の培養培地として使用され得る。これらの培地にはいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）））、微量元素（最終濃度がマイクロモルの範囲で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。いずれの他の必要な添加物も、当業者に公知であろう好適な濃度で含められ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。
【０１３０】
（ｉｘ）抗体精製
組み換え技術を使用する場合には、抗体を、細胞内で、ペリプラズム空間で生産させることができ、また、培地に直接分泌させることもできる。抗体が細胞内で生産される場合には、最初の工程として、特定の破片（宿主細胞または溶解した断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または超遠心分離によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に説明すると、細胞ペーストが酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍される。細胞の破片は遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、そのような発現システムに由来する上清は、通常は、市販されているタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害するために上記工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は、付随する混入物質の増殖を防ぐために含めることができる。
【０１３１】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体の中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、全てのマウスイソ型およびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５）。親和性リガンドがそれに対して結合するマトリックスは、最も多くの場合にはアガロースであるが、他のマトリックスを利用することもできる。機械的に安定なマトリックス（例えば、多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン））は、アガロースを用いて得ることができるよりも早い流速と短い処理時間を可能にする。抗体にＣＨ３ドメインが含まれる場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術（例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標））上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に応じて利用することができる。
【０１３２】
任意の予備的な精製工程の後、目的の抗体と混入物質を含む混合物は、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、約２．５〜４．５のｐＨの溶離緩衝液を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【０１３３】
２．Ｄ因子アンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイと動物モデル
Ｄ因子アンタゴニストは、補体が関係している疾患または障害の様々な細胞をベースとするアッセイおよび動物モデルにおいて評価することができる。
【０１３４】
したがって、例えば、組み換え体（トランスジェニック）動物モデルを、トランスジェニック動物を作製するための標準的な技術を使用して、目的の動物のゲノムの中に目的の遺伝子のコード部分を導入することによって操作することができる。トランスジェニック操作の標的となり得る動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、および他のサル）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような動物にトランスジーンを導入するための当該分野で公知の技術としては、プロ核酸マイクロインジェクション（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉｃ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＨｏｐｐｅおよびＷａｎｇｅｒ、米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系列へのレトロウイルスを介した遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、６１４８−６１５［１９８５］）；胚性幹細胞の中での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６、３１３−３２１［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、１８０３−１８１４［１９８３］）；精液を介した遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７、７１７−７３［１９８９］）が挙げられる。概要については、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
【０１３５】
本発明の目的については、トランスジェニック動物には、それらの細胞の一部にのみトランスジーンを持つ動物（「モザイク動物」）が含まれる。トランスジーンは、単一のトランスジーンとして、またはコンカタマー（例えば、頭−頭、または頭−尾のタンデム）中のいずれかに組み込まれ得る。特定の細胞タイプへのトランスジーンの選択的導入もまた、例えば、Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、６２３−６３６（１９９２）の技術にしたがって可能である。
【０１３６】
トランスジェニック動物中でのトランスジーンの発現は標準的な技術によってモニターすることができる。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅をトランスジーンの組み込みを確認するために使用することができる。その後、ｍＲＮＡの発現レベルを、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学技術のような技術を使用して分析することができる。
【０１３７】
動物はさらに、免疫疾患の病状の兆候について、例えば、特異的組織への免疫細胞の浸潤を決定するための組織学的試験によって試験され得る。ブロッキング実験もまた行うことができ、ここでは、トランスジェニック動物は、補体および補体活性化（古典経路または第２経路を含む）またはＴ細胞の増殖に対する効果の程度を決定するために候補のＤ因子アンタゴニストで処理される。これらの実験では、本発明のポリペプチドに結合するブロッキング抗体が動物に投与され、目的の生物学的効果がモニターされる。
【０１３８】
あるいは、Ｄ因子ポリペプチドをコードする内因性遺伝子と、動物の胚性細胞に導入された同じポリペプチドをコードする変更されたゲノムＤＮＡとの間での相同組み換えの結果として、Ｄ因子をコードする欠損遺伝子または変更された遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、Ｄ因子をコードするｃＤＮＡを使用して、確立されている技術にしたがってＤ因子をコードするゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。Ｄ因子をコードするゲノムＤＮＡの部分は欠失させることも、また別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用することができる選択マーカーをコードする遺伝子）で置き換えることもできる。通常は、数キロ塩基の変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）がベクターに含まれる（相同組み換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。ベクターは胚性幹細胞株の中に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、その中で導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組み換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。選択された細胞は、その後、動物（例えば、マウスまたはラット）の未分化胚芽細胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の中に注入されて、キメラ凝集体が形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。キメラ胚はその後、適切な偽妊娠させた雌の里親動物および胚に移植することができ、「ノックアウト」動物を作製するための期間が与えられる。相同組み換えされたＤＮＡをそれらの生殖細胞系列細胞の中に有している子孫は標準的な技術によって同定することができ、その動物の全ての細胞が相同組み換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させるために使用される。ノックアウト動物は、例えば、特定の複数の病理学的状態に対して防御するそれらの能力、およびＤ因子ポリペプチドが存在しないことが原因である複数の病理学的状態のそれらの発症を特徴とする。
【０１３９】
したがって、潜在的Ｄ因子アンタゴニストの生物学的活性は、マウスＤ因子ノックアウトマウスにおいてさらに実験することができる。
【０１４０】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の動物モデルは、Ｃｃｌ−２またはＣｃｒ−２遺伝子にヌル変異を有しているマウスからなる。これらのマウスはＡＭＤの基本的な特徴を発症し、これには、リポフスシンの蓄積、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の真下にあるドルーゼ、光受容体アトロフィー、および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が含まれる。これらの特徴は、６ヶ月の年齢を過ぎて発祥する。候補のＤ因子アンタゴニストは、ドルーゼの形成、光受容体後ロフィー、および脈絡膜新生血管について試験することができる。
【０１４１】
３．薬学的組成物
本発明のＤ因子アンタゴニスト（抗Ｄ因子抗体、および上記に開示されたスクリーニングアッセイによって同定された他の分子を含む）は、薬学的組成物の形態で、補体が関係している眼の状態の治療のための投与することができる。
【０１４２】
本発明のＤ因子アンタゴニストの治療用処方物は、所望される純度を有している活性分子を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥した処方物または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これらとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）：低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭化水素（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、トゥイーン（ＴＷＥＥＮ（商標））、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０１４３】
リポフェクションまたはリポソームもまた、ポリペプチド、抗体、または抗体断片を細胞に送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成することができ、および／または組み換えＤＮＡ技術によって生産することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、７８８９−７８９３［１９９３］を参照のこと）。
【０１４４】
活性分子はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）の中に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の中に、あるいは、マイクロエマルジョンの中に捕捉される場合もある。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１４５】
インビボでの投与に使用される処方物は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に行われる。
【０１４６】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは成型されたもの（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニルコポリマー、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グルコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは１００日を越える期間にわたり分子を放出することができるが、特定のヒドロゲルはより短い期間にわたりタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間留まる場合には、これらは、３７℃で水分に曝された結果として変性または凝集する可能性があり、それにより生物学的活性の消滅が生じ、免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方法論は、関係がある機構に応じた安定化のために考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を生じさせることによって行われ得る。
【０１４７】
眼の疾患もしくは状態の予防または治療のための本発明の化合物は、通常は、眼への注射、眼内注射、および／または硝子体内注射によって投与される。他の投与方法もまた使用され、これには、局所投与、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、鼻腔内投与、および病変内投与が含まれるが、これらに限定されない。非経口での注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。
【０１４８】
眼への投与、眼内投与、および／または硝子体内投与のための処方物は、当該分野で公知の方法によって、当該分野で公知の成分を使用して調製することができる。有効な治療の主要な要件は、眼からの適切な浸透である。薬物を局所的に送達することができる眼の前部の疾患とは異なり、網膜の疾患にはより部位特異的なアプローチが必要である。点眼薬および眼用軟膏はまれにしか眼の裏側に浸透せず、血液−眼バリアは、全身投与された薬物の眼組織への浸透の妨げとなる。したがって、通常は、網膜の疾患（例えば、ＡＭＤおよびＣＮＶ）を治療するための薬物送達に選択される方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常は、患者の状態、および送達される薬物の特性と半減期に応じた間隔で繰り返される。眼内（例えば、硝子体内）への浸透のためには、通常は、より小さな大きさの分子が好ましい。
【０１４９】
補体が関係している眼の状態（例えば、ＡＭＤまたはＣＮＶ）の治療の有効性は、眼内疾患の評価において一般的に使用されている様々な評価項目によって測定することができる。例えば、失明を評価することができる。失明は、例えば、ベースラインから所望される時点までの最も正確な視力（ＢＣＶＡ）の平均変化による測定（例えば、ＢＣＶＡはＥａｒｌｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ Ｓｔｕｄｙ（ＥＴＤＲＳ）視力チャートと、４メートルの試験距離での評価に基づく）、ベースラインと比較して所望される時点で視力において１５文字未満の視力低下がある被験体の集団の測定、ベースラインと比較して所望される時点で１５文字以上の視力を取り戻した（ｇａｉｎ）被験体の集団の測定、所望される時点で２０／２０００またはそれよりもさらに悪いＳｎｅｌｌｅｎ視力を有している被験体の集団の測定、ＮＥＩ Ｖｉｓｕａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅの測定、所望される時点でのＣＮＶの大きさとＣＮＶの漏出量の測定（例えば、フルオレセイン血管造影法による）などによって評価することができるが、これらに限定されない。例えば、眼の検査を行うこと、眼内圧を測定すること、視力を評価すること、スリットランプ圧（ｓｌｉｔｌａｍｐ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を測定すること、眼内の炎症を評価することなどを含むがこれらに限定されない、眼の評価を行うことができる。
【０１５０】
以下の実施例は、例示の目的だけのために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【０１５１】
本明細書中で引用された全ての特許および参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【実施例】
【０１５２】
実施例において言及される市販されている試薬は、他の場所に明記されない限りは、製造業者の説明書にしたがって使用した。以下の実施例の中、および明細書全体を通じてＡＴＣＣ登録番号によって特定されたこれらの細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９である。
【０１５３】
（実施例１）
抗Ｄ因子抗体の調製と試験
方法：
タンパク質分析のための硝子体液とブルッフ膜の調製
ヒトＡＭＤと非ＡＭＤ死体眼を解凍し、硝子体、網膜、およびＲＰＥに沿って前眼部を取り出した。硝子体をマイクロチューブの中に回収し、ドライアイス上で凍結させ、さらに処理するまで−７０℃で保存した。ブルッフ膜−脈絡膜層を後半分の眼球（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｈａｌｆ−ｇｌｏｂｅ）から剥がし（Ｃｒａｂｂ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９９：１４６８２−７（２００２））、４ｍｍまたは６ｍｍのいずれかのトレフィンで手術した試料を、黄斑と中心領域の周囲から、その後の分析のために単離した。ブルッフ膜の調製、年齢、性別、ＡＭＤの病期、解剖所見、およびプロテオミクス分析に使用した量についての添付のまとめの表（表２）を参照のこと。１つの角膜切除した４ｍｍの直径の試料を、補体Ｄ因子タンパク質レベルの分析に使用した。この試料をＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）中で１０分間超音波処理し、可溶性画分と不溶性画分を、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって分離させた。可溶性画分をＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
【０１５４】
ヒトＤ因子に対するモノクローナル抗体の作製
ヒトＤ因子に対するモノクローナル抗体を、モノホスホリルリピッドＡ／トレハロースジコリノミコレートアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）中の２μｇのＤ因子（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ、Ｔａｙｌｏｒ、ＴＸ）をＢａｌｂ／ｃマウスの足裏に１１回注射することによって作製した。マウスに由来する膝窩リンパ節をＰ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．１骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、結合親和性についてマウスＤ因子に対してスクリーニングした。抗体を生産している細胞株を限界稀釈によってクローニングした。
【０１５５】
溶血アッセイ
第２経路の活性を決定するために、ウサギの赤血球（Ｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ）をＧＶＢ中で３回洗浄し、２×１０９／ｍｌになるように再度懸濁した。阻害剤（５０μｌ）と２０μｌのＥｒ懸濁液を、ＧＶＢ／０．１ＭのＥＧＴＡ／０．１ＭのＭｇＣｌ２と１：１で混合した。補体活性化をＣ１ｑ枯渇ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ；ＧＶＢ中に１：３で希釈した３０μｌ）の添加によって開始させた．室温で３０分のインキュベーションの後、２００μｌのＧＶＢ／１０ｍＭのＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、試料を５００ｇで５分間遠心分離した。溶血を４１２ｎｍで吸光度を測定することによって２００μｌの上清の中で決定した。データは、阻害剤が存在しない場合に誘導された溶血に対する％として表した。補体の古典経路に対するＤ因子抗体の効果を決定するために、ＥｒをＩｇＭでコーティングしたヒツジの赤血球（Ｅ−ＩｇＭ、ＣｏｍｐＴｅｃｈ）で置き換えたことを除いて同様の手順を行い、アッセイをＧＶＢ＋＋中のＢ因子欠損ヒト血清中で行った。
【０１５６】
ヒトＤ因子についてのＥＬＩＳＡ
抗ヒト補体Ｄ因子ヤギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に１μｇ／ｍＬになるように希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル、高結合プレート（ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄ ｐｌａｔｅｓ）、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｉｎｔ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）上に、４℃で一晩のインキュベーションの間にコーティングした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）での３回の洗浄後、プレートをＰＢＳ／０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１から２時間ブロックした。このインキュベーションと全ての他のインキュベーションは、オービタルシェーカー上で室温で行った。ヒトの硝子体液とブルッフ膜の溶解物試料をアッセイ希釈液（Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）（ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）を使用して稀釈した。同じ緩衝液を使用して、Ｄ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｔｙｌｅｒ、Ｔｅｘａｓ）標準曲線（１５．６ｐｇ／ｍＬ〜１，０００ｐｇ／ｍＬ）の段階稀釈物を調製した。標準曲線の高、中、および低領域で定量するために予め稀釈した凍結させた対照試料を解凍した。ブロッキング工程の後、プレートを洗浄し、試料、標準物、および対照を添加し、２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化抗ヒトＤ因子モノクローナル抗体９Ｇ７．１．１６を６２．５ｎｇ／ｍＬになるように希釈し、１から２時間のインキュベーションのためのプレートに添加した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）をアッセイ希釈液の中に１／１０，０００に稀釈し、洗浄したプレートに添えた。３０分のインキュベーションと最後の洗浄工程の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加し、５から７分間発色させた。最後に、反応を１Ｍのリン酸の添加によって停止させた。光学密度をマイクロプレートリーダー（４５０ｎｍ、６５０ｎｍの参照）を使用して得、試料濃度を標準曲線の４パラメーターフィットから計算した。ヒトの硝子体液とブルッフ膜の溶解物試料中のＤ因子の最小定量可能濃度は、それぞれ、７８０ｐｇ／ｍＬ（１／５０の最小稀釈）および１５６ｐｇ／ｍＬ（１／１０の最小稀釈）であった。
【０１５７】
免疫組織化学
ブルッフ膜試料をＯＣＴ化合物中で凍結させ、７μｍの切片になるようにクライオミクロトーム（ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）上で切断した。免疫染色。切片を、切片化後に５分間アセトンの中で固定し、染色の準備まで−８０℃で保存した。凍結したスライドをＰＢＳ中で２回濯ぎ、その後、０．１％のＴｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳＴ）で２回濯いだ。内因性のアビジンとビオチンをＶｅｃｔｏｒ Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＰ−２００１）で、製造業者の指示にしたがって室温でブロックした。切片をＴＢＳＴで、２回交換してそれぞれ５分間濯ぎ、内因性の免疫グロブリンを３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中の１０％のウマ血清で、室温で３０分間ブロックした。切片を、１０％のウマ血清中に１０μｇ／ｍｌになるように希釈した抗ヒトＤ因子（９Ｇ７．１．１６）抗体とともに、室温で６０分間インキュベートした。Ｎａｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ＠１０μｇ／ｍｌ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をネガティブ対照として使用した。ＴＢＳＴ中で、２回交換して、それぞれ５分間濯いだ後、切片を、ウマ血清の中に２．５μｇ／ｍｌになるように（１：２００）希釈したビオチン化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）とともに３０分間インキュベートした。切片をＴＢＳＴ中で、２回交換して、それぞれ５分間濯ぎ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡＰ Ｅｌｉｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔとともに室温で３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で濯ぎ（２回交換、それぞれ５分間）、新しく調製したＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ溶液中でインキュベートした。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄは以下のように調製した：２００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌについては、１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌをｄＨ２Ｏ中で１：５に希釈した（１部のＴｒｉｓ ＨＣｌと４部のｄＨ２０）。１滴のレバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）を各５ｍｌの２００ｍＭの新しく調製したＴｒｉｓ ＨＣｌ中に混合した。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄキットによる２滴の試薬１、２、および３を、５ｍｌの２００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ−レバミゾール溶液中に個別に混合した。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄキットによる試薬３の添加から５〜１０分以内に使用した。切片をＨ２Ｏ中で濯ぎ、ヘマトキシリン中に１０〜１５回浸す（２０〜３０秒間）ことによってＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、水およびブルー（ｂｌｕｅ）で濯ぎ、ブルーイング試薬（ｂｌｕｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）を洗い流すために５分間流水中で十分に濯いだ。切片をＣｒｙｓｔａｌ Ｍｏｕｎｔ溶液でマウントし、一晩放置して乾燥させた。乾燥したＣｒｙｓｔａｌマウントカバースライドをキシレンに浸し、ｐｅｒｍａｍｏｕｎｔ封入剤を使用してカバースライドをかけた。
【０１５８】
２０Ｄ１２の重鎖と軽鎖のクローニング
全ＲＮＡを、マウス抗ヒトＤ因子モノクローナル２０Ｄ１２を生産しているハイブリドーマ細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと可変重鎖（ＶＨ）ドメインをＲＴ−ＰＣＲを使用して、以下の縮重プライマーを用いて増幅させた：
軽鎖（ＬＣ）正方向：
５’ＧＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＴＲＡＴＧＡＣＨＣＡＲＴＣＴＣＡ３’（配列番号４）
軽鎖逆方向：
５’ＴＴＴＤＡＫＹＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣ３’（配列番号５）
重鎖（ＨＣ）正方向：
５’ＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＣＡＧＧＴＹＣＡＲＹＴＧＣＡＲＣＡＲＴＣＴＧＧ３’ （配列番号６）
重鎖逆方向：
５’ＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＭＲＧＡＧＡＣＤＧＴＧＡＳＨＲＤＲＧＴ３’（配列番号７） 。
【０１５９】
正方向プライマーはＶＬ領域とＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。ＬＣ逆方向プライマーとＨＣ逆方向プライマーはそれぞれ、種間で高度に保存されている軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）の中の領域にアニーリングするように設計した。
【０１６０】
増幅したＶＬを、ヒトκ定常ドメインを含むｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクター（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００；２７６：６５９１−６０４）にクローニングした。増幅したＶＨは全長のヒトＩｇＧ定常ドメインをコードするｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。これにより、２０Ｄ１２をマウス−ヒトＩｇＧキメラに構築し直した。
【０１６１】
上記に記載された詳細は、当業者が本発明を実施できるために十分であると考えられる。本発明は寄託された構築物により範囲が限定されることはない。なぜなら寄託された実施形態は本発明の特定の態様についての単なる説明と意図され、機能的に等価である任意の構築物が本発明の範囲に含まれる。本明細書中の材料の寄託は、本明細書中に含まれる記載された記述が本発明の任意の態様の実施（その最良の態様を含む）を可能にするには不適切であるという事実の承認に寄与するものではなく、それが提示する特異的な説明に対する特許請求の範囲の限定とも解釈されない。
【０１６２】
実際、示され、本明細書中に記載されたものに加えて様々な本発明の改変が、上記の記載から当業者に明らかとなるであろう。そしてこれらは添付の特許請求の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）のような、補体が関係している眼の状態の予防および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、通常は不活性なプロ酵素の形態で存在する、一連の血清糖タンパク質からなる複合酵素カスケードである。２つの主要な経路（古典経路と第２経路）は補体を活性化することが可能であり、これらはＣ３のレベルで統合され、ここでは、２つの類似しているＣ３転換酵素が、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂになるように切断する。
【０００３】
マクロファージは、細胞表面で発現される識別タグの構造（いわゆる、分子パターン）の微妙な差異を認識する先天的な能力を示す特殊な細胞である（Ｔａｙｌｏｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３、２０９０−２０９７（２００３）；Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３、９０１−９４４（２００５））。これらの表面構造の直接の認識は先天性免疫の基本的な特徴であるが、オプソニン作用によっても、一般的なマクロファージ受容体が飲み込みを媒介することが可能になり、それにより、食細胞の効率が上がり、認識レパートリーが多様化する（ＳｔｕａｒｔおよびＥｚｅｋｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２、５３９−５５０（２００５））、食作用のプロセスには、多数のリガンド−受容体相互作用が関与しており、現在、様々なオプソニン（免疫グロブリン、コレクチン、および補体成分を含む）がマクロファージの細胞表面受容体との相互作用による病原体のインターナリゼーションに必要な細胞活動を導くことが明らかになっている（ＡｄｅｒｅｍおよびＵｎｄｅｒｈｉｌｌ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７、５９３−６２３（１９９９）；ＵｎｄｅｒｈｉｌｌおよびＯｚｉｎｓｋｙ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、８２５−８５２（２００２）に概説されている）。生殖細胞系列の遺伝子によってコードされる天然の免疫グロブリンは多種多様な病原体を認識できるが、オプソニン作用のあるＩｇＧ（ｏｐｓｏｎｉｚｉｎｇ ＩｇＧ）の大部分は適応免疫によって生じ、したがって、Ｆｃ受容体による効率的なクリアランスは迅速ではない（Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５、９８１−９８６（２００４））。一方、補体は病原体表面の分子を迅速に認識し、補体受容体による粒子の取り込みのきっかけをつくる（Ｂｒｏｗｎ、Ｉｎｆｅｃｔ Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ １、６３−７０（１９９１））。
【０００４】
補体は、補体受容体によって認識される多種多様な病原体をオプソニン化する３０を超える血清タンパク質からなる。カスケードの最初の誘因に応じて、３つの経路に区別できる（Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４、１０５８−１０６６（２００１）に概説されている）。３つの全てが中心的構成成分Ｃ３を活性化させる共通の工程を共有しているが、これらは認識の性質と、Ｃ３活性化を導く最初の生化学的工程により異なる。古典経路は病原体表面に結合した抗体によって活性化され、これは次いでＣ１ｑ補体成分に結合し、Ｃ３をその活性化形態であるＣ３ｂまで最終的に切断するセリン・プロテアーゼ・カスケードを誘発する。レクチン経路は、レクチンタンパク質による炭水化物モチーフの認識後に活性化される。今日までに、この経路の３つのメンバーが同定されている：マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、レクチンのＳＩＧＮ−Ｒ１ファミリー、およびフィコリン（Ｐｙｚら、Ａｎｎ Ｍｅｄ ３８、２４２−２５１（２００６））。ＭＢＬとフィコリンはいずれもセリンプロテアーゼと関係があり、これは古典経路においてＣ１と同様に作用して成分Ｃ２およびＣ４を活性化させて、中心的なＣ３工程を導く。第２経路は、これが、内部Ｃ３エステルの病原体表面上の認識モチーフとの直接の反応が原因で活性化される点で、古典経路およびレクチン経路のいずれとも対照的である。活性化表面への内部Ｃ３の結合によっては、第２経路のプロテアーゼであるＢ因子およびＤ因子の作用によりＣ３ｂの蓄積の迅速な増幅が導かれる。重要なことは、古典経路またはレクチン経路のいずれかにより蓄積したＣ３ｂもまた、Ｂ因子およびＤ因子の作用によりＣ３ｂの蓄積の増幅を導き得ることである。補体活性化の３つの経路の全てにおいて、オプソニン化の中枢的工程は成分Ｃ３のＣ３ｂへの変換である。補体カスケードの酵素によるＣ３の切断は、チオエステルを求核攻撃に曝し、それによりチオエステルドメインを介する抗原表面上へのＣ３ｂの共有結合を可能にする。これは、補体オプソニン作用の最初の工程である。続いて、結合したＣ３ｂのタンパク質分解によって、異なる受容体によって認識される断片であるｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｄｇが生じる（ＲｏｓｓおよびＭｅｄｏｆ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７、２１７−２６７（１９８５））。この切断により、Ｃ３ｂの蓄積をさらに増幅させるＣ３ｂの能力が消失し、直接膜を損傷させることができる補体カスケードの後期成分（膜攻撃複合体を含む）が活性化される。しかしながら、マクロファージの食細胞受容体はＣ３ｂとその断片を優先的に認識する。エステル結合の形成の多様性の理由から、Ｃ３媒介性オプソニン作用は病原体認識の中核をなし（Ｈｏｌｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １３、２３１−２３６（１９９２））、したがって、様々なＣ３分解産物の受容体は宿主免疫応答において重要な役割を果たす。
【０００５】
Ｃ３自体は、１３個の異なるドメインからなる複合体である可撓性タンパク質である。分子のコアは８個のいわゆるマクログロブリン（ＭＧ）ドメインからなり、これらはＣ３の密集した状態のα鎖およびβ鎖を構成する。この構造にはＣＵＢ（Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ ａｎｄ Ｂｏｎｅ ｍｏｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ）とＴＥＤドメインが挿入されており、後者には、病原体表面とのＣ３ｂの共有結合を可能にするチオエステル結合が含まれている。残りのドメインにはＣ３ａが含まれるか、または残りのドメインはコアドメインのリンカーおよびスペーサーとして作用する。Ｃ３に対するＣ３ｂとＣ３ｃの構造の比較により、この分子が、ＴＥＤだけではなく、細胞性受容体と相互作用できる分子のさらに新しい表面をも露出させる、重要な立体構造の再配置をそれぞれのタンパク質分解によって受けることが明らかである（ＪａｎｓｓｅｎおよびＧｒｏｓ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４、３−１０（２００７））。
【０００６】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、全世界において高齢者の失明の主原因である。ＡＭＤは、良好な視力に関連する眼の網膜の非常に特殊な領域である黄斑における退化性であり、新生血管変化が原因で中心部視野が除々に失われることを特徴とする。最近の試算は、１４００万人がＡＭＤが原因で失明しているか、または重篤な視力障害があることを示している。この疾患は高齢者集団と彼らの家族の身体および心の健康に多大な影響を与え、公衆衛生における大きな負担となりつつある。
【０００７】
しかしながら、新しい発見によると、初期ＡＭＤと関係がある関連する細胞性事象、遺伝的因子、および生化学的プロセスのより鮮明な概念の提供が開始されつつある。補体Ｈ因子遺伝子は、複数の無関係な実験において同定された最初の遺伝子であり、これはＡＭＤの発症に関して有意な遺伝的リスクを与える。それゆえ、Ｈ因子のアミノ酸４０２位のチロシン−ヒスチジン多形がＡＭＤの発症と関係があることが３つの別のグループによって報告された（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。疾患と関係があるＨ因子対立遺伝子による第２経路の阻害の低下が、ＡＭＤの発症を引き起こすかまたはＡＭＤの発症に有意に寄与するかのいずれかであることが示唆されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０８：３８５−３８９
【非特許文献２】Ｈａｉｎｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０８：４１９−４２１
【非特許文献３】Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０８：４２１−４２４
【非特許文献４】ＴｈｕｒｍａｎおよびＨｏｌｅｒｓ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１７６：１３０５−１３１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様においては、本発明は、有効量のＤ因子アンタゴニストを必要な被験体に投与する工程を含む、補体が関係している眼の状態の予防または治療方法に関する。
【００１０】
様々な実施形態において、必要な被験体は哺乳動物（例えば、ヒト）であり、Ｄ因子アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体およびその断片、結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに非ペプチド低分子からなる群より選択される。
【００１１】
好ましい実施形態においては、Ｄ因子アンタゴニストは抗体または抗体断片である。様々な実施形態において、抗体はＤ因子の活性部位に結合する場合があり、また、Ｄ因子の活性化部位残基を含むエピトープに結合する場合もある。
【００１２】
本発明の範囲に含まれる特異的な抗体としては、抗体２０Ｄ１２、３１Ａ９、２５Ａ１、および３２Ｈ１２、ならびにそれらの変異体が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態においては、抗体または抗体断片は本質的に抗体２０Ｄ１２と同じエピトープに結合するか、または、抗体２０Ｄ１２の重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号：１および２）を含むか、または抗体２０Ｄ１２もしくはその断片である。
【００１３】
抗Ｄ因子抗体としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体が挙げられる。
【００１４】
抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成された多特異的抗体であり得る。
【００１５】
補体が関係している眼の状態としては、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生が挙げられる。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、Ｄ因子アンタゴニストと、補体が関係している眼の状態を治療するために上記アンタゴニストを投与するための説明書を含むキットに関する。
【００１７】
なお別の態様においては、本発明は、補体が関係している眼の状態の治療のための医薬品の調製におけるＤ因子アンタゴニストの使用に関する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、補体が関係している眼の状態の治療での使用のためのＤ因子アンタゴニストに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】正常な眼とＡＭＤドナーの眼から得られた硝子体およびブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ）中でのＤ因子のレベル。Ｄ因子のレベルは記載するようにＤ因子特異的ＥＬＩＳＡによって測定した：眼の中のＤ因子の総レベルは、ブルッフ膜の中で発現されたＤ因子の全体に対する寄与（ｔｏｔａｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）と硝子体の中で見られるＤ因子の総量を計算することによって決定した。
【図２】ＡＭＤドナーの眼に由来するブルッフ膜の切断面のＤ因子の免疫組織化学。差し込み図は、ブルッフ膜の上部に層をなしたドルーゼ（Ｄｒｕｓｅ）の中のＤ因子の染色を示す。ドルーゼに加えて、ブルッフ膜と脈絡膜もＤ因子についてポジティブであった。
【図３】補体の第２経路について選択的である溶血アッセイにおける１２Ｄ２０の特性。ＩＣ５０値を下に示し、アッセイは方法セクションに記載するように行った。
【図４】マウスモノクローナル抗体１２Ｄ２０の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列（配列番号：１および２）。
【図５】様々な抗Ｄ因子抗体のエピトープマッピング。溶血アッセイでのそれらの相対的な効力を示す。
【図６】天然のヒトＤ因子ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）。
【図７】表１：ＡＭＤにおける補体成分の分析。
【図８】表２：実験で使用したドナーの組織。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．定義
用語「Ｄ因子」および「補体Ｄ因子」は互換的に使用され、天然配列と変異体Ｄ因子ポリペプチドをいう。
【００２１】
「天然配列」のＤ因子は、その調製様式にかかわらず、自然界に由来するＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドである。したがって、天然配列のＤ因子は自然界から単離することができ、また、組み換えおよび／もしくは合成手段によって生産することもできる。成熟Ｄ因子タンパク質（例えば、成熟ヒトＤ因子タンパク質（ＮＭ-００１９２８；配列番号３））に加えて、用語「天然配列のＤ因子」には、具体的に、Ｄ因子の自然界に存在する前駆体形態（例えば、タンパク質分解によって切断されて活性化形態を生じる不活性な前タンパク質）、自然界に存在する変異体形態（例えば、オルタナティブスプライシングされた形態）、およびＤ因子の自然界に存在する対立遺伝子変異体、ならびに自然界から導かれたＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているＤ因子分子の立体構造変異体が含まれる。ヒト以外の動物（高等霊長類およびヒト以外の哺乳動物を含む）のＤ因子ポリペプチドは具体的にこの定義に含まれる。
【００２２】
「Ｄ因子変異体」または「補体Ｄ因子変異体」は、天然配列のＤ因子ポリペプチド（例えば、配列番号３の天然配列のヒトＤ因子ポリペプチド）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有している、以下で定義されるような活性なＤ因子ポリペプチドを意味する。通常、Ｄ因子変異体は、配列番号３の成熟ヒトアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。最高度の配列同一性がＤ因子の活性部位の中にあることが好ましい。
【００２３】
Ｄ因子の「活性部位」は、ヒトＤ因子配列においてはＨｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２、およびＳｅｒ−１９５（キモトリプシンノーゲン・ナンバリング）によって定義される。Ｄ因子は、主要な特異性ポケットの底にＡｓｐ１８９（キモトリプシン・ナンバリング）を有しており、Ａｒｇペプチド結合を切断する。触媒３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）は、Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２およびＳｅｒ−１９５からなる。Ａｓｐ−１０２とＨｉｓ５７は、他のセリンプロテアーゼと比較して非定型の立体構造を呈する（Ｎａｒａｙａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（１９９４）、６９５−７０８）。特有のｓａｌ架橋が、Ｓ１ポケットの底にあるＡｓｐ１８９とＡｒｇ２１８の間で観察され、これは、ループ２１４−２１８を押し上げ（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｏｏｐ）、深くて狭いＳ１ポケットをもたらす（Ｊｉｎｇｅｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２（１９９８）１０６１−１０８１）。このループと、活性部位の周囲にあるいくつかの他の残基は、Ｄ因子エステル分解活性の鍵となる構造的決定要因であることが変異分析によって示されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）２４３９９−２４４０５）。これらの結果に基づき、Ｄ因子はＣ３ｂに結合したＢ因子に結合すると立体構造の変化を受けて、タンパク質分解活性の発現を生じる可能性があると提唱された（ＶｏｌａｎａｋｉｓおよびＮａｒａｙａｎａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５（１９９６）５５３−５６４）。
【００２４】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮しない、参照Ｄ因子配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的におけるアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手できるコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。当業者はアラインメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。これには、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。その後、配列同一性はより長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部分と１００％の配列同一性を示す場合でもなお、全体的な配列同一性は１００％未満であり得る。
【００２５】
「核酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、参照Ｄ因子コード配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドの割合として定義される。核酸配列同一性パーセントを決定する目的におけるアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手できるコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。これには、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。その後、配列同一性はより長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部分と１００％の配列同一性を示す場合でもなお、全体的な配列同一性は１００％未満であり得る。
【００２６】
「単離された」核酸分子は、、核酸の天然の供給源において通常会合している少なくとも１つの混入している核酸分子から同定かつ分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、自然界において見られる形態または環境以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、それが天然の細胞の中に存在する場合の核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子には、例えば、天然の細胞の中での染色体位置とは異なる染色体位置にその核酸分子が存在している場合に、コードされるポリペプチドを通常どおり発現する細胞中に含まれる核酸分子も含まれる。
【００２７】
「単離された」Ｄ因子ポリペプチドをコードする核酸分子は、、Ｄ因子をコードする核酸の天然の供給源の中では通常会合している少なくとも１つの混入している核酸分子から同定かつ分離された核酸分子である。単離されたＤ因子ポリペプチドをコードする核酸分子は、自然界において見られる形態または環境以外のものである。したがって、単離されたＤ因子ポリペプチドをコードする核酸分子は、それらが天然の細胞の中に存在する場合のコード核酸分子とは区別される。しかしながら、単離されたＤ因子をコードする核酸分子には、例えば、その核酸分子が天然の細胞の中での染色体位置とは異なる染色体位置でＤ因子を通常発現する細胞中に含まれるＤ因子をコードする核酸分子も含まれる。
【００２８】
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、Ｄ因子の生物学的活性を中和する、ブロックする、部分的もしくは完全に阻害する、破棄する、低下させる、あるいは妨害することができる任意の分子が含まれる。Ｄ因子アンタゴニストとしては、抗Ｄ因子抗体およびその抗原結合断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに、Ｄ因子に結合してＤ因子の活性（例えば、補体が関係している眼の病状に関与するＤ因子の能力）を中和する、ブロックする、部分的もしくは完全に阻害する、破棄する、低下させる、または妨害することができる非ペプチド低分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「低分子」は、本明細書中では、約６００ダルトン未満、好ましくは、約１０００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【００３０】
「活性である」または「活性」または「生物学的活性」は本発明のＤ因子アンタゴニストの状況では、Ｄ因子の生物学的活性をアンタゴナイズする（部分的または完全に阻害する）能力である。Ｄ因子アンタゴニストの好ましい生物学的活性は、例えば、補体が関係している眼の状態のようなＤ因子が関係している疾患または状態の状態（例えば、病状）の測定可能な改善を達成する能力である。活性は、インビトロまたはインビボ試験（結合アッセイを含む）において、関連する動物モデルまたはヒトの臨床試験を使用して決定することができる。
【００３１】
用語「補体が関係している眼の状態」は最も広い意味で使用され、その病状に補体（補体の古典経路と第２経路、および特に第２経路を含む）が関係している全ての眼の状態が含まれる。補体が関係している眼の状態としては、黄斑変性疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階、乾性形態と湿性形態（非滲出型と滲出型）を含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、ならびに他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。補体が関係している眼の状態の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出型（湿性）ＡＭＤおよび滲出型（乾性または萎縮型）ＡＭＤを含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が挙げられる。
【００３２】
「治療は、障害の発症を予防するか、または障害の病状を変化させる意図で行われる介入である。したがって、「治療」は、治療的治療と、予防的治療または予防対策の両方をいう。治療が必要なものには、すでに障害を有しているもの、ならびに障害が予防されるものが含まれる。免疫関連の疾患の治療においては、治療薬は免疫応答の成分の応答の大きさを直接変化させる場合があり、また、他の治療薬（例えば、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬など）による治療に対して疾患をより敏感にする場合もある。
【００３３】
疾患の病状（例えば、補体が関係している眼の状態）には、患者の満足できる生活状態を損なうあらゆる表現形が含まれる。これには、異常なまたは制御不可能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）、抗体生産、自己抗体の生産、補体の生産、近隣細胞の正常な機能の妨害、サイトカインの放出、または異常なレベルでの他の分泌産物、任意の炎症応用もしくは免疫学的応答の抑制または激化、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の細胞空間への浸潤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用されるとき、ヒト、高等霊長類、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、動物園用、競技用、またはペット用の動物（例えば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびイタチなど）が挙げられるが、これらに限定されない、哺乳動物と分類される任意の動物をいう。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【００３５】
１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（併用）投与および任意の順序での連続投与が含まれる。
【００３６】
「治療有効量」は、例えば、補体が関係している眼の状態のような標的である疾患または状態の状態（例えば、病状）の測定可能な改善を達成するために必要な「Ｄ因子アンタゴニスト」の量である。
【００３７】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物の中での作動可能に連結されたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、状況に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００３８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配置されている場合に「作動可能に連結され」ている。例えば、先行配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結される。または、リボソーム結合部位が、それが翻訳を促進するように配置される場合には、コード配列に作動可能に連結される。一般的には、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は使いやすい制限酵素部位での連結によって行われる。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実施方法にしたがって使用される。
【００３９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定可能であり、一般的には、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、より長いプローブには、適切なアニーリングのためにより高い温度が必要であり、一方、より短いプローブには、より低い温度が必要である。ハイブリダイゼーションは一般的には、相補的な鎖がそれらの融解温度よりも低い環境に存在する時の、変性したＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイゼーション可能な配列との間で所望される相同性の程度が大きければ大きいほど、使用できる相対的な温度は高くなる。したがって、結果として、より高い相対的温度が反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度は反応条件のストリンジェンシーをより低くする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細と説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照のこと。
【００４０】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシーの条件」は、本明細書中で定義される場合には以下によって特定され得る：（１）洗浄において、低いイオン強度と高温（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）を使用する；（２）ホルムアミドのような変性剤（例えば、４２℃で、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）をハイブリダイゼーションの間に使用する；または、（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸塩を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃で、５０％のホルムアミド中５５℃で洗浄し、５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄が続く。
【００４１】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載されているように同定することができ、これには、上記よりもストリンジェンシーの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ％）の使用が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸塩、および２０ｍｇ／ｍＬの変性させて剪断したサケの精液ＤＮＡを含む溶液中で３７℃で一晩のインキュベーションであり、その後に、約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が続く。当業者は、プローブの長さなどの要因に適合させる必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を理解しているであろう。
【００４２】
用語「エピトープタグ化」は、本明細書中で使用されるとき、「タグポリペプチド」と融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製できるエピトープを提供するのに十分な長さを有しているが、それに対して融合するポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い。タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように極めて固有なものであることが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は、約８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
【００４３】
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、これには具体的に、単鎖抗Ｄ因子モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ならびに多エピトープ特異性を有している抗Ｄ因子抗体組成物が含まれるが、これらに限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られた１つの抗体をいい、すなわち、個々の抗体を含む集団は、主要ではない量で存在する可能性がある自然界において起こる可能性がある変異を除いて同一である。
【００４４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られた１つの抗体をいい、すなわち、個々の抗体を含む集団は、主要ではない量で存在する可能性がある自然界において起こる可能性がある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、１つの抗原性部位を指向する。さらに、伝統的な（ポリクローナル）抗体調製物（これには、通常は、異なる決定基（エピトープ）に特異的な様々な抗体が含まれている）とは対照的に、個々のモノクローナル抗体は抗原上にある１つの決定基に特異的である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られたという抗体の特性を示し、任意の特定の方法によって抗体を生産する必要があるとは解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製される場合があり、また、組み換えＤＮＡ法によって作製される場合もある（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている技術を使用して単離される場合もある。
【００４５】
本明細書中でのモノクローナル抗体には、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれる。ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している抗体中の対応している配列と同一であるか相同であるが、それらが所望される生物学的活性を示すとの条件で、鎖の残りは別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体、さらにはそのような抗体の断片中の対応している配列と同一であるかあるいは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
【００４６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態はキメラ抗体であり、これには、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列が含まれる。大部分については、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その中のレシピエントの超可変領域由来の残基がヒト以外の種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または所望される特異性、親和性、および能力を有しているヒト以外の霊長類）の超可変領域由来の残基によって置き換えられる。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応しているヒト以外の残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体には、レシピエント抗体の中にも、またドナー抗体の中にも見られない残基が含まれる場合がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。一般的には、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全体が含まれるであろう。ここでは、超可変ループ全体または実質的に全体が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域全体または実質的に全体がヒト免疫グロブリン配列の物である。ヒト化抗体にはまた、状況に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（通常は、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分も含まれるであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。
【００４７】
「種依存性抗体」は、第１の哺乳動物種に由来する抗原に対して、第２の哺乳動物種に由来するその抗原のホモログに対して有しているよりも強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは、約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは、約１×１０−９以下Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種由来のその抗原のホモログに対して結合親和性を有しており、これはヒト抗原に対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い。種依存性抗体は、上記で定義された様々なタイプの抗体のうちのいずれかであり得るが、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが好ましい。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、「抗体突然変異体」または「抗体変異体」は、種依存性抗体のアミノ酸残基のうちの１つ以上が修飾されている、種依存性抗体のアミノ酸配列変異体をいう。そのような突然変異体は、種依存性抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を必ず有する。好ましい実施形態においては、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中では、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、種依存性抗体残基と同一である（すなわち、同じ残基）または類似している（すなわち、共通する側鎖特性に基づく同じグループに由来するアミノ酸残基）、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸張、欠失、あるいは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を与えないと解釈されるべきである。
【００４９】
「単離された」抗体は、同定され、その自然界での環境にある成分とは分離されている、および／またはそれらから回収されたものである。その自然界での環境の混入している成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する可能性がある物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態においては、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定された場合には、アンタゴニストのうち９５重量％より高く、好ましくは９９重量％より高く、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する、還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性を示すように、精製されるであろう。抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在することはないので、単離された抗体には、組換え体細胞内でインサイチュでの抗体が含まれる。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分をいう。ＶＨは、重鎖の可変ドメインをいう。ＶＬは軽鎖の可変ドメインをいう。本発明で使用される方法に従うと、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸位置はＫａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ、１９８７および１９９１））にしたがって定義され得る。抗体または抗原結合断片のアミノ酸ナンバリングもまたＫａｂａｔのものにしたがう。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、その存在が抗原結合に不可欠である抗体可変ドメインのアミノ酸残基をいう。個々の可変ドメインは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として特定された３個のＣＤＲ領域を有する。個々の相補性決定領域には、Ｋａｂａｔによって定義された「相補性決定領域」に由来するアミノ酸残基が含まれ得る（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２４〜３４（Ｌ１）、残基約５０〜５６（Ｌ２）および残基約８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基約３１〜３５（Ｈ１）、残基約５０〜６５（Ｈ２）および残基約９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））由来のアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｌ１）、残基約５０〜５２（Ｌ２）および残基約９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｈ１）、残基約５３〜５５（Ｈ２）および残基約９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）由来の残基が含まれ得る。いくつかの場合には、相補性決定領域には、Ｋａｂａｔにしたがって定義されたＣＤＲ領域と超可変ループの両方に由来するアミノ酸が含まれ得る。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖ＣＤＲＨ１にはアミノ酸２６〜３５が含まれる。
【００５２】
「フレームワーク領域」（本明細書中、以後、「ＦＲ」）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域の残基である。個々の可変ドメインは、通常は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４として同定された４個のＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔにしたがって定義される場合は、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、約３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、約５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、および約９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）にあり、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の中の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、約３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、約６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、および約１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）にある。ＣＤＲに超可変ループ由来のアミノ酸残基が含まれる場合は、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖の中の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、約３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、約５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、および約９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）にあり、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の中の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、約３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、約５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、および約１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）にある。ＣＤＲに、Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲと超可変ループのものの両方に由来するアミノ酸が含まれるいくつかの場合には、ＦＲ残基は、それに応じて調製されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１にアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５が含まれる場合には、重鎖ＦＲ１残基は１〜２５位にあり、ＦＲ２残基は３６〜４９位にある。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、「コドンセット」は、所望される変異体アミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列の１つのセットをいう。コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組み合わせの全てを提示し、アミノ酸の所望されるグループをコードするであろう配列を含むオリゴヌクレオチドの１つセットは、例えば、固相合成によって合成することができる。コドン表示の標準的な形態はＩＵＢコードのコドン表示である。これは当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。コドンセットは、通常、斜体の３つの大文字（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなど）によって表される。したがって、「非無作為コドンセット」は本明細書中で使用されるとき、本明細書中に記載されるアミノ酸選択の基準を部分的に（好ましくは完全に）満たす選択されたアミノ酸をコードするコドンセットをいう。特定の位置に選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知である。例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）；ＧａｒｒａｒｄおよびＨｅｎｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：１０３）。特定のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのそのようなセットは、市販されている核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手できる）を使用して合成することができ、また商業的に入手することもできる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有している合成されたオリゴヌクレオチドの１つのセットには、通常、様々な配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドが含まれるであろう。これらの差異は、配列全体の中にコドンセットによって確立される。本発明にしたがって使用されるとき、オリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、例えば、クローニングの目的に有用である制限酵素部位を含むことができるが、これは必ずしも必要ではない。
【００５４】
用語「抗体断片」は本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、例えば、ｓｃＦｖにおいて堅く会合した（本来は共有結合であり得る）１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの２量体からなる。この立体配置においては、個々の可変ドメインの３個のＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位の輪郭を提示する。まとめると、６個のＣＤＲまたはそれらのサブセットが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３個しか含まないＦｖの半分）もなお抗原を認識して抗原に結合する能力を有しているが、通常は、完全な結合部位よりも親和性が低い。
【００５６】
「Ｆａｂ」断片には、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）が含まれる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片には１対のＦａｂ断片が含まれ、これは通常、それらの間にあるヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有結合する。抗体断片の他の化学的カップリングもまた当該分野で公知である。
【００５７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片には、抗体のＶＨおよびＶＬドメインが含まれる。ここでは、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖の中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドにはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーが含まれ、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための所望される構造を形成することができる。ｓｃＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００５８】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片をいう。この断片には、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）の中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれる。同じ鎖上にある２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対合するように向けられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８にさらに詳細に記載されている。
【００５９】
表現「直鎖抗体」は、Ｚａｐａｔａら（１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、８（１０）：１０５７−１０６２）に記載されている抗体をいう。簡単に説明すると、これらの抗体には、１対のタンデムなＦｄセグメントの（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）が含まれる。これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に、１対の抗原結合領域を形成する。直鎖抗体は二重特異的であって、また単特異的でもあり得る。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、「ライブラリー」は、複数の抗体または抗体断片配列（例えば、本発明のポリペプチド）、またはこれらの配列をコードする核酸をいう。これらの配列は、本発明の方法にしたがってこれらの配列の中に導入される変異体アミノ酸の組み合わせが異なる。
【００６１】
「ファージディスプレイ」は、それによって変異体ポリペプチドが、ファージ（例えば、糸状ファージ）粒子”の表面上にある外被タンパク質の少なくとも一部に対する融合タンパク質として提示される技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化されたタンパク質変異体の大きなライブラリーが、高い親和性を有している標的抗原に結合するそのような配列について迅速に、かつ効率よく選別され得るという事実にある。ファージ上にあるペプチドおよびタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有しているものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合によって小さい無作為ペプチドおよび小さいタンパク質を提示するために使用されている。ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：３５５−３６２、および本明細書中で引用される参考文献。１価のファージディスプレイにおいては、タンパク質またはペプチドライブラリーは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合させられ、ファージ粒子が１コピーの融合タンパク質を提示するか、または融合タンパク質を全く提示しないように、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現する。親和性効果は多価ファージと比較して低く、結果として、選別は固有のリガンド親和性に基づき、ファージミドベクターが使用され、これはＤＮＡの操作を簡素化する。ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３：２０５−０２１６。
【００６２】
「ファージミド」は、細菌の複製起点（例えば、Ｃｏ１Ｅ１）とバクテリオファージの遺伝子間領域の１つのコピーを有しているプラスミドベクターである。ファージミドは、任意の公知のバクテリオファージ（糸状バクテリオファージおよびラムダ型バクテリオファージを含む）に対して使用することができる。プラスミドにはまた、一般的には、抗生物質耐性のための選択マーカーが含まれるであろう。これらのベクターの中にクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖させることができる。これらのベクターを保有している細胞がファージ粒子の生産に必要な遺伝子全てとともに提供されると、プラスミドの複製の態様が複製サイクルを回転させるように変化して、プラスミドＤＮＡの一方の鎖のコピーとパッケージファージ粒子が作製される。ファージミドは感染性ファージ粒子を形成する場合も、また非感染性ファージ粒子を形成する場合もある。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子に連結したファージ外被タンパク質遺伝子またはその断片を含むファージミドが含まれる。
【００６３】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み、複製が可能なバクテリオファージの二本鎖の複製可能な形態を意味する。ファージベクターは、ファージの複製とファージ粒子の形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージのような糸状バクテリオファージまたはそれらの誘導体、あるいは、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４などのラムダ型ファージまたはそれらの誘導体であることが好ましい。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、「溶媒が接近しやすい位置（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、抗体もしくは抗原結合断片の構造、構造の集合体、および／またはモデル化された構造に基づいて、分子（例えば、抗体特異的抗原）との溶媒の接近および／または接触に利用される可能性があるとして決定される、供給源である抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変領域中のアミノ酸残基の位置をいう。これらの位置は、通常、ＣＤＲの中、およびタンパク質の外側に見られる。抗体または抗原結合断片の溶媒が接近しやすい位置は、本明細書中で定義される場合は、当該分野で公知の多数のアルゴリズムのうちの任意のものを使用して決定され、好ましくは、溶媒が接近しやすい位置は、抗体の３次元モデルから座標を使用して、好ましくは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のようなコンピュータープログラムを使用して決定される。溶媒が接近しやすい位置はまた、当該分野で公知のアルゴリズムを使用して決定することもできる（例えば、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５、３７９、およびＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６、５４８を参照のこと）。溶媒が接近しやすい位置の決定は、抗体から得られたタンパク質のモデル化および３次元構造情報に好適なソフトウェアを使用して行うことができる。これらの目的のために利用できるソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。一般的には、好ましくは、アルゴリズム（プログラム）に使用者がサイズパラメーターを入力する必要がある場合には、計算に使用されるプローブの「サイズ」は、約１．４オングストローム以下の半径に設定される。加えて、パーソナル・コンピュータ用のソフトウェアを使用する溶媒が接近しやすい領域および範囲の決定は、Ｐａｃｉｏｓ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６によって記載されている。
【００６５】
ＩＩ．詳細な説明
補体は体の防御において重要な役割を果たしており、免疫系の他の成分とともに、体への病原体の侵入から個体を防御する。しかしながら、適切に活性化または制御されなければ、補体もまた宿主組織に対して損傷を引き起こす可能性がある。補体の不適切な活性化は、補体が関係している疾患または障害（例えば、免疫複合体および自己免疫疾患）ならびに様々な炎症状態（補体によって媒介される炎症性の組織損傷を含む）と呼ばれる様々な疾患の病状に関係している。補体が関係している疾患の病状は様々であり、これには、長期間または短期間の補体活性化、カスケード全体の活性化、複数のカスケードのうちの１つだけ（例えば、古典経路または第２経路）の活性化、カスケードのうちのいくつかの成分だけの活性化などが関係している可能性がある。いくつかの疾患においては、補体断片の補体生物学的活性が組織の損傷および疾患を生じる。したがって、補体の阻害剤は治療的有効性が高い。第２経路の選択的阻害剤は、古典経路による血液からの病原体および他の微生物のクリアランスがまだ損なわれていないので、特に有用であろう。
【００６６】
本発明のＤ因子アンタゴニストは、補体が関係している眼の状態（その病状に補体（補体の古典経路と第２経路、特に、第２経路を含む）が関係している全ての眼の状態および疾患であって、例えば、黄斑変性疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階（乾性形態と湿性形態（非滲出型と滲出型）を含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、眼内炎、ならびに他の眼内血管新生疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生の予防および治療に有用である。補体が関係している眼の状態の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出型（湿性）ＡＭＤおよび滲出型（乾性）ＡＭＤを含む）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が含まれる。
【００６７】
ＡＭＤは、黄斑の加齢性の変性である。これは、６０歳を超えた個体における不可逆的な視力障害の主原因である。ＡＭＤには２種類のタイプ：非滲出性（乾性）ＡＭＤと滲出性（湿性）ＡＭＤがある。乾性、すなわち、非滲出性の形態には、中心網膜（黄斑）の基部にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性変化および肥大性変化、ならびにＲＰＥ上への蓄積（ドルーゼ）が含まれる。非滲出性ＡＭＤの患者は、ＡＭＤの湿性（すなわち、滲出型）形態へと進行する可能性があり、ここでは、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭｓ）と呼ばれる異常な血管が網膜の下に生じ、体液と血液が漏出し、最終的には網膜中および網膜下に失明にいたる円盤状の瘢痕が生じる。非滲出性ＡＭＤ（これは、通常は滲出型ＡＭＤの前兆である）がより多く見られる。非滲出性ＡＭＤの状態は様々である；堅いドルーゼ、柔らかいドルーゼ、ＲＰＥ地図状萎縮（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｔｒｏｐｈｙ）、および色素クランピング（ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｌｕｍｐｉｎｇ）が存在し得る。補体成分はＡＭＤの初期にＲＰＥ上に蓄積し、ドルーゼドルーゼの主要な構成成分である。
【００６８】
本発明は特に、カテゴリー３およびカテゴリー４のＡＭＤを含むハイリスクＡＭＤの治療に関する。カテゴリー３のＡＭＤは、いずれの眼にも進行したＡＭＤは存在せず、少なくとも一方の眼が２０／３２以上の視力を有しており、少なくとも１つの大きなドルーゼ（例えば、１２５μｍ）、広範囲に及ぶ（ドルーゼの面積によって測定される場合）中程度のドルーゼ、または地図状萎縮（ＧＡ）（これには黄斑の中心部は含まれない）、あるいはこれらの任意の組み合わせが伴うことを特徴とする。カテゴリー３のＡＭＤ（これは、まだ「乾性」ＡＭＤと考えられる）は脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に転化するリスクが高い。
【００６９】
カテゴリー４のハイリスクＡＭＤ（「湿性」ＡＭＤと分類される）は、２０／３２以上の視力と、指標となる眼には進行していない（ｎｏ ａｄｖａｎｃｅｄ）ＡＭＤが存在する（ＧＡに黄斑の中心または脈絡膜新生血管の特徴が含まれている）ことを特徴とする。もう一方の（ｆｅｌｌｏｗ）眼は、進行したＡＭＤ、またはＡＭＤ黄斑変性症が原因である２０／３２未満の視力を特徴とする。通常、ハイリスクＡＭＤは、治療しなければ、迅速に脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）へと、カテゴリー１または２（ハイリスクではない）のＡＭＤの進行速度の約１０〜３０倍の速度で進行する。
【００７０】
Ｄ因子アンタゴニストは、ＣＮＶへのＡＭＤ（特に、カテゴリー３またはカテゴリー４のＡＭＤ）の進行の予防、および／または、罹患していないかもしくは罹患の程度の低いもう一方の眼のＡＭＤまたはＣＮＶの発症／進行の予防に特に有用性が見出されている。この状況では、用語「予防」は、疾患の進行の完全なまたは部分的なブロックおよび進行速度を遅らせること、ならびに、疾患のより重篤な形態の発症（ｕｎｓｅｔ）を遅らせることを含むように、最も広い意味で使用される。ハイリスク（カテゴリー４）のＡＭＤまたはＣＭＶを発症するか、またはそれへと進行するリスクが高い患者は、本発明のこの態様によって特に利点が得られる。
【００７１】
補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形がＡＭＤおよび／またはＣＮＶを発症する個体のリスクと関係があることは公知である。ＣＦＨの中での突然変異は補体を活性化させる可能性があり、これは次いで、ＡＭＤ／ＣＮＶに至る場合がある。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形がＡＭＤの寄与リスクの５０％を占めることが最近報告されている（Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９（２００５））。ＣＦＨの一般的なハプロタイプ（ｈａｌｐｏｔｙｐｅ）（ＨＦ１／ＣＦＨ）は、個体を加齢性黄斑変性にかかりやすくする素因であることが明らかになっている（Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２（２）：７２２７−７２３２（２００５））。ＡＭＤは常染色体優性形質として分離されており、マーカーＤ１Ｓ４６６〜Ｄ１Ｓ４１３間の染色体１ｑ２５−ｑ３１に、約３．２０の最大ロッドスコアで（Ｋｌｅｉｎら、Ａｒｃｈ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１６（８）：１０８２−９（１９９８）；Ｍａｊｅｗｓｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（３）：５４０−５０（２００３）；Ｓｅｄｄｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（４）：７８０−９０（２００３）；Ｗｅｅｋｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３２（５）：６８２−９２（２００１）；Ｉｙｅｎｇａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７４（１）：２０−３９（２００４））；マーカーＤ１２Ｓ１３９１〜Ｄ２Ｓ１３８４間の染色体２ｑ３／２ｑ３２に、２．３２／２．０３の最大ロッドスコアで（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）；マーカーＤ１２Ｓ１３００〜Ｄ１２Ｓ１７６３間の３ｐ１３に、２．１９の最大ロッドスコアで（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｓｃｈｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７２（６）：１４１２−２４（２００３））；マーカーＤ６Ｓ１０５６〜ＤＳ２４９間の６ｑ１４に、３．５９／３．１７の最大ロッドスコアで（Ｋｎｉａｚｅｖａら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈｌｍｏｌ．１３０（２）：１９７−２０２（２０００））；マーカーＤ９Ｓ９３４にある９ｑ３３に、２．０６の最大ロッドスコアで（Ｍｅｊｗｓｋｉら、前出）；マーカーＤ１０Ｓ１２３０にある１０ｑ２６に、３．０６最大ロッドスコアで（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｉｙｅｎｇａｒら、前出；Ｋｅｎｅａｌｙら、Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．１０：５７−６１（２００４）；マーカーＤ１７Ｓ９２８にある１７ｑ２５に、３．１６の最大ロッドスコアで（Ｗｅｅｋｓら、前出）；および、マーカーＤ２２Ｓ１０４５にある２２ｑ１２に、２．０の最大ロッドスコアで（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）疾患遺伝子マッピングされている。したがって、遺伝子スクリーニングは予防的治療（より重篤な形態への（例えば、ＡＭＤからＣＮＶへの）疾患の進行の予防を含む）のための特に良好な候補である患者を同定する重要な部分である。
【００７２】
１．抗Ｄ因子抗体
本明細書中の本発明には、抗Ｄ因子抗体の生産と使用が含まれる。抗体の代表的な作製方法が以下の節でさらに詳細に記載される。
【００７３】
抗Ｄ因子抗体は、哺乳動物種由来のＤ因子抗原を使用して選択される。抗原がヒトＤ因子であることが好ましい。しかしながら、他の種に由来するＤ因子（例えば、マウスＤ因子）もまた標的抗原として使用できる。様々な哺乳動物種に由来するＤ因子抗原を天然の供給源から単離することができる。他の実施形態においては、抗原は組み換えによって生産されるか、または、当該分野で公知の他の合成方法を使用して作成される。
【００７４】
選択された抗体は、通常は、Ｄ因子抗原に対して十分に強い結合親和性を有するであろう。例えば、抗体は、約５ｎＭ以下、好ましくは約２ｎＭ以下、より好ましくは約５００ｐＭ以下のＫｄ値でヒトＤ因子に結合し得る。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、実施例に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫中着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ’ｓ）によって決定され得る。
【００７５】
また、抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するための、他の生物学的活性のアッセイにも供することができる。そのようなアッセイは当該分野で公知であり、標的抗原と抗体について意図される用途に応じて様々である。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ（以下の実施例に記載される）；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２号に記載されている）；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；ならびに、Ｄ因子アンタゴニストについて以下に記載されるインビトロおよびインビボでのアッセイが挙げられる。
【００７６】
目的の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、日常的に行われているクロス・ブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているアッセイ）を行うことができる。あるいは、エピトープマッピング（例えば、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されている）を、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定するために行うことができる。
【００７７】
好ましい実施形態においては、抗Ｄ因子抗体は特有のファージディスプレイアプローチを使用して選択される。このアプローチには単一のフレームワーク鋳型に基づく合成の抗体ファージライブラリーの作製、可変ドメインの中での十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有しているポリペプチドのディスプレイ、標的Ｄ因子抗原に対して高い親和性を有している候補抗体の選択、および選択された抗体の単離が含まれる。
【００７８】
ファージディスプレイ方法の詳細は、例えば、２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７号に見ることができる。
【００７９】
１つの態様においては、抗体ライブラリーは、抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲの中にある溶媒が接近しやすい位置および／または多様性に富む位置を突然変異させることによって作製することができる。ＣＤＲのいくつかまたは全てを、本明細書中に提供される方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させることによって、または、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させること、または、ＣＤＲＬ３とＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の中の複数の位置を突然変異させて１つのライブラリーを形成させることにより、多様性抗体ライブラリーを作製することが好ましい場合がある。
【００８０】
例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の溶媒が接近しやすい位置および／または多様性に富む位置の中に複数の突然変異を有している抗体可変ドメインのライブラリーを作製することができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の中に複数の突然変異を有している別のライブラリーを作製することができる。これらのライブラリーはまた、所望される親和性のバインダーを作製するために、互いに組み合わせて使用することもできる。例えば、標的抗原に対する結合についての重鎖ライブラリーの１回以上の選択の後、軽鎖ライブラリーを、バインダーの親和性を増大させるためのさらなる回の選択のために、重鎖バインダーの集団の中に入れることができる。
【００８１】
好ましくは、ライブラリーは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域中での、変異体アミノ酸でのもとのアミノ酸の置換によって作製される。得られるライブラリーには複数の抗体配列が含まれ得る。ここでは、配列多様性は、主に、重鎖配列のＣＤＲＨ３領域の中にある。
【００８２】
１つの態様においては、ライブラリーは、ヒト化抗体４Ｄ５配列、またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の状況において作製される。好ましくは、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸での重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。ここでは、ＤＶＫコドンセットは、これらの位置の全ての変異体アミノ酸の１つのセットをコードするために使用される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの一例には、配列（ＤＶＫ）７が含まれる。いくつかの実施形態においては、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での、少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの例には、配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）が含まれる。別の実施形態においては、ライブラリーは、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での、少なくとも残基９５〜１００ａの置換によって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの一例には、配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）が含まれる。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例には配列（ＮＮＫ）６が含まれる。適切なオリゴヌクレオチド配列の他の例は、本明細書中に記載される基準にしたがって当業者によって決定され得る。
【００８３】
別の実施形態においては、様々なＣＤＲＨ３のデザインが、高親和性バインダーを単離するため、様々なエピトープに対するバインダーを単離するために利用される。このライブラリーの中で作製されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１〜１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さもまた作製され得る。Ｈ３多様性は、ＮＮＫ、ＤＶＫ、およびＮＶＫコドンセット、ならびに、Ｎ末端および／またはＣ末端でのより限定された多様性を使用することにより拡大させることができる。
【００８４】
多様性はまた、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の中に作製することもできる。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性のデザインは、以前のデザインよりも自然界での多様性にさらにきっちりと適合する多様性に焦点を合わせた修飾を用いる、記載されるような天然の抗体レパートリーを模倣するための標的化のストラテジーにしたがう。
【００８５】
ＣＤＲＨ１３の中での多様性については、様々なＨ３の長さを有している複数のライブラリーを別々に構築し、その後、標的抗原に対するバインダーについて選択するために合わせて１つにすることができる。複数のライブラリーは、プールすることができ、以前に記載されており、本明細書中に記載されるように、固体支持体選択と溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方法論を使用することができる。例えば、１つのバリエーションには、固体に結合した標的についての選別、それに続く、融合ポリペプチド上に存在し得るタグ（例えば、抗ｇＤタグ）についての選別、その後の、固体に結合した標的についての別の選別が含まれる。あるいは、ライブラリーは、固体表面に結合した標的について最初に選別され得、溶離したバインダーが、その後、標的抗原の濃度を低下させつつ、溶液相の結合を使用して餞別される。様々な選別方法の組み合わせを利用することにより、高度に発現された配列だけの選択の最小化が提供され、多数の様々な高親和性クローンの選択が提供される。
【００８６】
標的Ｄ因子抗原に対する高親和性バインダーをライブラリーから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域の中の多様性を制限することにより、縮重性は約１０４倍〜１０５倍減少し、さらなるＨ３多様性がより高親和性のバインダーを提供することを可能にする。ＣＤＲＨ３の中に様々なタイプの多様性を有しているライブラリーを利用する（例えば、ＤＶＫまたはＮＶＴを利用する）ことにより、標的抗原の様々なエピトープに結合し得るバインダーの単離が提供される。
【００８７】
別の実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域の中に多様性を有しているライブラリー（１つ以上）が作製される。この実施形態においては、ＣＤＲＨ３の中の多様性は、様々な長さのＨ３領域を使用し、主要なコドンセットＸＹＺおよびＮＮＫまたはＮＮＳを使用して作製される。複数のライブラリーが個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成され得、プールされ得るか、またはオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのサブセットを形成させるためにプールされ得る。この実施形態の複数のライブラリーは、固体に結合したした標的に対して選別することができる。複数回の選別によって単離されたクローンは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性および親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンは所望される標的抗原ならびに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対するこれらのバインダーは、その後、溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性バインダーは、上記に記載されたように調製されたＸＹＺコドンセットを利用してライブラリーから単離することができる。これらのバインダーは、細胞培養物中で高収率で抗体または抗原結合断片として容易に生産することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態においては、ＣＤＲＨ３領域の長さに関して、より大きな多様性を有しているライブラリーを生じさせることが所望され得る。約７〜１９アミノ酸までの範囲のＣＤＲＨ３領域を有しているライブラリーを作製することが所望され得る。
【００８９】
これらの実施形態のライブラリーから単離された高親和性バインダーは、細菌および真核生物細胞培養物の中で高収率で容易に生産される。ベクターは、ｇＤタグ、ウイルス外被タンパク質成分配列のような配列を容易に除去しおよび／または高収率での全長抗体または抗原結合断片の生産がもたらされるように定常領域配列の中に加えるように設計され得る。
【００９０】
ＣＤＲＨ３の中に突然変異を有しているライブラリーは、他のＣＤＲの変異体バージョン（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、および／またはＣＤＲＨ２）を含むライブラリーと組み合わせることができる。したがって、例えば１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ３ライブラリーは、予め決定されたコドンセットを使用して２８、２９、３０、３１、および／または３２位に変異体アミノ酸を有しているヒト化４Ｄ５抗体配列の状況において作製されたＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わせられる。別の実施形態においては、ＣＤＲＨ３に突然変異を有しているライブラリーは、変異体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリーと組み合わせることができる。１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ１ライブラリーは、２８、３０、３１、３２、および３３位に変異体アミノ酸を有しているヒト化抗体４Ｄ５配列を用いて作製される。ＣＤＲＨ２ライブラリーは、予め決定されたコドンセットを使用して５０、５２、５３、５４、５６、および５８位に変異体アミノ酸を有しているヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いて作製され得る。
【００９１】
ファージライブラリーから作製された抗Ｄ因子抗体は、もとの抗体を上回る改善された物理的、化学的、および／または生物学的特性を有する抗体突然変異体を生じるようにさらに修飾することができる。使用されるアッセイが生物学的活性のアッセイである場合には、抗体突然変異体は、好ましくは、選択されたアッセイにおいて生物学的活性を有し、これはそのアッセイにおけるもとの抗体の生物学的活性よりも、少なくとも約１０倍大きい、好ましくは少なくとも約２０倍大きい、より好ましくは少なくとも約５０倍大きい、多くの場合は少なくとも約１００倍または２００倍大きい。例えば、抗Ｄ因子抗体突然変異体は、好ましくは、ＮＲＰに対して結合親和性を有し、これは、もとの抗Ｄ因子抗体（例えば、図５に示される抗体のうちのいずれか、具体的には、抗体２０Ｄ１２）の結合親和性よりも少なくとも約１０倍強い、好ましくは少なくとも約２０倍強い、より好ましくは、少なくとも約５０倍強い、多くの場合は少なくとも約１００倍または２００倍強い。
【００９２】
抗体突然変異体を作製するためには、１つ以上のアミノ酸の変更（例えば、置換）が、もとの抗体の１つ以上の超可変領域の中に導入される。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の１つ以上の変更（例えば、置換）がもとの抗体の中に導入され得、ここでは、これらは第２の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の改善を生じる。修飾されるフレームワーク領域残基の例としては、抗原に直接非共有結合するもの（Ａｍｉｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲの立体構造と相互作用する／立体構造に影響を与えるもの（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（ＥＰ ２３９ ４００Ｂ１）が挙げられる。特定の実施形態においては、１つ以上のそのようなフレームワーク領域残基の修飾は、第２の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強を生じる。例えば、約１個から約５個のフレームワーク残基が本発明のこの実施形態において変化させられ得る。多くの場合には、これは、超可変領域残基がいずれも変化させられていない場合でもなお、前臨床試験での使用に好適な抗体突然変異体を得るために十分であり得る。しかしながら、通常は、抗体突然変異体にはさらなる超可変領域の変更が含まれるであろう。
【００９３】
変更される超可変領域残基は無作為に変化させることができ、特に、もとの抗体の最初の結合親和性がそのような無作為に生産された抗体突然変異体である場合に、容易にスクリーニングできる。
【００９４】
そのような抗体突然変異体を作製するための１つの有用な手順は「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。ここでは、１つ以上の超可変領域残基が、第２の哺乳動物種に由来する抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与えるアラニンまたはポリアラニン残基によって置き換えられる。置換に対して機能的感度を示しているこれらの超可変領域残基は、その後、置換部位に、もしくは置換部位についてさらなるまたは他の突然変異を導入することによって詳細に調べられる。したがって、アミノ酸配列のバリエーションを導入するための部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。この方法で生産されたａｌａ突然変異体は、本明細書中に記載されるようにそれらの生物学的活性についてスクリーニングされる。
【００９５】
通常、当業者は、「好ましい置換基」の表題で以下に示されるような保存的置換を用いて開始するであろう。そのような置換が生物学的活性（例えば、結合親和性）において変化を生じる場合には、以下の表において、またはアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載されるように「代表的な置換基」と命名されたさらなる置換変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。好ましい置換は以下の表に列挙される。
【００９６】
【表１】
抗体の生物学的特性のなおさらに実質的な修飾は、（ａ）置換の領域内にあるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックス構造）、（ｂ）標的部位にある分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさ、を維持することに対するそれらの作用が有意に異なる置換基を選択することによって行われる。自然界に存在している残基は共通する側鎖特性に基づいて複数のグループに分類される。
【００９７】
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００９８】
非保存的置換には、別のクラスをこれらのクラスのうちの１つのメンバーで交換することを必然的に伴うであろう。
【００９９】
別の実施形態においては、修飾のために選択された部位は、ファージディスプレイを使用して親和性が発達する（上記を参照のこと）。
【０１００】
アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、もとの抗体の以前に調製された突然変異体または非突然変異体バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。突然変異を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８を参照のこと）。
【０１０１】
特定の実施形態においては、抗体突然変異体は、単一の置換された超可変領域残基のみを有するであろう。他の実施形態においては、もとの抗体の超可変領域残基のうちの２つ以上が置換されているであろう（例えば、約２〜約１０個までの超可変領域置換）。
【０１０２】
通常は、改善された生物学的特性を有している抗体突然変異体は、もとの抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中では、配列をアラインメントし、必要である場合にはギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を得た後の、もとの抗体残基と同一である（すなわち、同じ残基）または類似している（すなわち、共通する側鎖特性に基づく同じグループに由来するアミノ酸残基、上記を参照のこと）、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸張、欠失、あるいは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を与えないと解釈されるべきである。
【０１０３】
抗体突然変異体の生産後、もとの抗体と比較した分子の生物学的活性が決定される。上記のように、これには、抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の決定が含まれ得る。本発明の好ましい実施形態においては、抗体変異体のパネルが調製され、抗原（例えば、ＮＲＰ１）またはその断片に対する結合親和性についてスクリーニングされる。この最初のスクリーニングによって選択された抗体突然変異体のうちの１つ以上が、状況に応じて、結合親和性が増大したこの抗体突然変異体が実際に（例えば、前臨床試験に）有用であることを確認するために、１つ以上のさらなる生物学的活性のアッセイに供される。
【０１０４】
そのように選択された抗体突然変異体は、多くの場合には、抗体の意図される用途に応じたさらなる修飾に供され得る。そのような修飾としては、アミノ酸配列のさらなる変更、異種ポリペプチドに対する融合、および／または以下に詳細に述べられるもののような共有結合による修飾を挙げることができる。アミノ酸配列の変更に関しては、代表的な修飾は上記で詳細に述べられる。例えば、抗体突然変異体の適切な立体構造の維持には関与していない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化能力を改善し、異常な架橋を防ぐために、通常はセリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、その安定性を改善するために抗体に付加され得る（特に、抗体がＦｃ断片のような抗体断片である場合）。アミノ酸突然変異体の別のタイプは、変更されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体の中に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体の中には存在しない１つ以上のグリコシル化部分を付加することによって行われ得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンとアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンまたはスレオニン）に対する結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。抗体に対するグリコシル化部位の付加は、１つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ結合グリコシル化部位について）。変更はまた、もとの抗体の配列に対する１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加またはそれらによる置換によっても行われ得る（Ｏ結合グリコシル化部位について）。
【０１０５】
本発明の抗Ｄ因子抗体は、容易に入手できる技術と材料を使用して組み換えによって生産することができる。
【０１０６】
抗Ｄ因子抗体の組み換え生産のためには、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために複製可能ベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離または合成される。多くのベクターを利用できる。一般的には、ベクター成分には、以下のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロオーター、および転写終結配列。
【０１０７】
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、組み換えによって直接生産できるだけではなく、異種ポリペプチド（これは、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有している他のポリペプチド）を持つ融合ポリペプチドとしても生産できる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。本来の抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列列は、選択された原核生物シグナル配列（例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーのグループに由来する）によって置換される。酵母からの分泌については、本来のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、あるいは、ＷＯ９０／１３６４６号に記載されているシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を利用できる。そのような先行領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに対してリーディングフレーム内になるように連結される。
【０１０８】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターにはいずれも、１つ以上の選択された宿主細胞の中でのベクターの複製を可能にする核酸配列が含まれる。一般的には、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主の染色体ＤＮＡとは無関係にベクターが複製することを可能にするものであり、これには複製起点または自律複製配列が含まれる。そのような配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点が酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は通常、これに初期プロモーターが含まれるので、単独で使用され得る）。
【０１０９】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターとクローニングベクターには選択遺伝子が含まれる場合があり、これは選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補う、あるいは（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１１０】
選択方式の一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬物が利用される。異種遺伝子でうまく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、それにより、選択レジュメを生き残る。そのような優性選択の例では、薬物であるネオマイシン、マイコフェノール酸、およびハイグロマイシンが使用される。
【０１１１】
哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの別の例は、抗体核酸を取り込むための細胞成分（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）の同定を可能にするものである。
【０１１２】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって最初に同定される。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが使用される場合には、ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１１３】
あるいは、抗体である野生型ＤＨＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換されたか、または別の選択マーカー（例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））と一緒に同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択マーカーについての選択試薬（例えば、アミノグリコシド性抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８）を含む培地の中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１１４】
酵母において使用される適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７の中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力が欠失している酵母の突然変異株（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１）についての選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２。それにより、酵母の宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンが存在しない条件下での増殖により形質転換体を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有している公知のプラスミドによって補われる。
【０１１５】
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組み換え体ウシキモシンの大規模生産のための発現システムが、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告されている。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの産業用株による成熟組み換え体ヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピーの発現ベクターもまた開示されているＦｌｅｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５。
【０１１６】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターとクローニングベクターには、通常、宿主生物によって認識され、抗体核酸に対して作動可能に連結された１つのプロモーターが含まれる。プロモーターは、原核細胞宿主とともに使用される好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用されるプロモーターにはまた、抗体をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列も含まれるであろう。
【０１１７】
真核生物細胞についてのプロモーター配列も知られている。事実全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴを多く含む領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０〜８０塩基上流に見られる他の配列は、１つのＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎどの核酸でもよい）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの全ての配列は、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０１１８】
酵母宿主とともに使用される適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、または他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）のためのプロモーターが挙げられる。
【０１１９】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有している誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデハイドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係がある分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースの利用に関与している酵素のプロモーター領域である。酵母発現に使用される好適なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターとともに好都合に使用される。
【０１２０】
哺乳動物の宿主細胞の中でのベクターからの抗体の転写は、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスそして最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）によって、熱ショックプロモーターによって、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合するとの条件で制御される。
【０１２１】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限酵素断片として簡単に得られる。ヒトのサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素処理断片として簡単に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用する哺乳動物宿主の中でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に記載されている。この系の修飾は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下での、マウス細胞中でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｒｓら（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：５９８−６０１もまた参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用できる。
【０１２２】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物細胞による転写は、多くの場合、そのベクターの中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インシュリン）に由来する多くのエンハンサー配列が、現在知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例として、複製起点（１００〜２７０ｂｐ）の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物細胞のプロモーターの活性化のためのエンハンスエレメントについては、Ｙａｎｉｖ（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：１７−１８（１９８２））もまた参照のこと。このエンハンサーはベクターの中で、抗体をコードする配列の５’位置または３’位置でスプライシングされ得るが、プロモーターから５’の位置に配置されることが好ましい。
【０１２３】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞において使用される発現ベクター（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）には、転写の終結のため、ｍＲＮＡの安定化のために必要な配列もまた含まれるであろう。このような配列は、通常、真核生物もしくはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によっては、３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域には、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分の中にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントが含まれる。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６および本明細書中に開示される発現ベクターを参照のこと。
【０１２４】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択と形質転換
本明細書中のベクター中でのＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記に記載された原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物としては、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物のような真正細菌、例えば、腸内細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、およびＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）のような他の株も好適である。これらの例は限定でなく例示である。
【０１２５】
原核生物細胞に加えて、神格微生物（例えば、糸状菌または酵母）が抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（すなわち、一般的なパン酵母）は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般的に使用されている。しかしながら、以下のような多数の他の属、種、および株も一般に利用することができ、本明細書中で有用である：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに、糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ））。
【０１２６】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株と変異体、以下のような宿主に由来する対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ハエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ。トランスフェクションのための様々なウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）は公に入手することができ、そのようなウイルスは本発明に従って本明細書中でウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペツニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養もまた宿主として利用できる。
【０１２７】
しかしながら、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられており、培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖は日常的に行われている作業となってきた。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞株（２９３、または懸濁培養中の増殖についてサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚管腫瘍細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞、およびヒト肝ガン細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【０１２８】
宿主細胞は、抗体生産のために上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された通常の栄養培地の中で培養される。
【０１２９】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生産するために使用される宿主細胞は様々な培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ−１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（「ＭＥＭ」、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（「Ｄ−ＭＥＭ」、Ｓｉｇｍａ）などの商業的に入手することができる培地は、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍら（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；あるいは、米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のうちの任意のものが、宿主細胞用の培養培地として使用され得る。これらの培地にはいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）））、微量元素（最終濃度がマイクロモルの範囲で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。いずれの他の必要な添加物も、当業者に公知であろう好適な濃度で含められ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。
【０１３０】
（ｉｘ）抗体精製
組み換え技術を使用する場合には、抗体を、細胞内で、ペリプラズム空間で生産させることができ、また、培地に直接分泌させることもできる。抗体が細胞内で生産される場合には、最初の工程として、特定の破片（宿主細胞または溶解した断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または超遠心分離によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に説明すると、細胞ペーストが酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍される。細胞の破片は遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、そのような発現システムに由来する上清は、通常は、市販されているタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害するために上記工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は、付随する混入物質の増殖を防ぐために含めることができる。
【０１３１】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体の中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、全てのマウスイソ型およびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５）。親和性リガンドがそれに対して結合するマトリックスは、最も多くの場合にはアガロースであるが、他のマトリックスを利用することもできる。機械的に安定なマトリックス（例えば、多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン））は、アガロースを用いて得ることができるよりも早い流速と短い処理時間を可能にする。抗体にＣＨ３ドメインが含まれる場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術（例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標））上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に応じて利用することができる。
【０１３２】
任意の予備的な精製工程の後、目的の抗体と混入物質を含む混合物は、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、約２．５〜４．５のｐＨの溶離緩衝液を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【０１３３】
２．Ｄ因子アンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイと動物モデル
Ｄ因子アンタゴニストは、補体が関係している疾患または障害の様々な細胞をベースとするアッセイおよび動物モデルにおいて評価することができる。
【０１３４】
したがって、例えば、組み換え体（トランスジェニック）動物モデルを、トランスジェニック動物を作製するための標準的な技術を使用して、目的の動物のゲノムの中に目的の遺伝子のコード部分を導入することによって操作することができる。トランスジェニック操作の標的となり得る動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、および他のサル）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような動物にトランスジーンを導入するための当該分野で公知の技術としては、プロ核酸マイクロインジェクション（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉｃ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＨｏｐｐｅおよびＷａｎｇｅｒ、米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系列へのレトロウイルスを介した遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、６１４８−６１５［１９８５］）；胚性幹細胞の中での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６、３１３−３２１［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、１８０３−１８１４［１９８３］）；精液を介した遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７、７１７−７３［１９８９］）が挙げられる。概要については、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
【０１３５】
本発明の目的については、トランスジェニック動物には、それらの細胞の一部にのみトランスジーンを持つ動物（「モザイク動物」）が含まれる。トランスジーンは、単一のトランスジーンとして、またはコンカタマー（例えば、頭−頭、または頭−尾のタンデム）中のいずれかに組み込まれ得る。特定の細胞タイプへのトランスジーンの選択的導入もまた、例えば、Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、６２３−６３６（１９９２）の技術にしたがって可能である。
【０１３６】
トランスジェニック動物中でのトランスジーンの発現は標準的な技術によってモニターすることができる。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅をトランスジーンの組み込みを確認するために使用することができる。その後、ｍＲＮＡの発現レベルを、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学技術のような技術を使用して分析することができる。
【０１３７】
動物はさらに、免疫疾患の病状の兆候について、例えば、特異的組織への免疫細胞の浸潤を決定するための組織学的試験によって試験され得る。ブロッキング実験もまた行うことができ、ここでは、トランスジェニック動物は、補体および補体活性化（古典経路または第２経路を含む）またはＴ細胞の増殖に対する効果の程度を決定するために候補のＤ因子アンタゴニストで処理される。これらの実験では、本発明のポリペプチドに結合するブロッキング抗体が動物に投与され、目的の生物学的効果がモニターされる。
【０１３８】
あるいは、Ｄ因子ポリペプチドをコードする内因性遺伝子と、動物の胚性細胞に導入された同じポリペプチドをコードする変更されたゲノムＤＮＡとの間での相同組み換えの結果として、Ｄ因子をコードする欠損遺伝子または変更された遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、Ｄ因子をコードするｃＤＮＡを使用して、確立されている技術にしたがってＤ因子をコードするゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。Ｄ因子をコードするゲノムＤＮＡの部分は欠失させることも、また別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用することができる選択マーカーをコードする遺伝子）で置き換えることもできる。通常は、数キロ塩基の変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）がベクターに含まれる（相同組み換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。ベクターは胚性幹細胞株の中に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、その中で導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組み換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。選択された細胞は、その後、動物（例えば、マウスまたはラット）の未分化胚芽細胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の中に注入されて、キメラ凝集体が形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。キメラ胚はその後、適切な偽妊娠させた雌の里親動物および胚に移植することができ、「ノックアウト」動物を作製するための期間が与えられる。相同組み換えされたＤＮＡをそれらの生殖細胞系列細胞の中に有している子孫は標準的な技術によって同定することができ、その動物の全ての細胞が相同組み換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させるために使用される。ノックアウト動物は、例えば、特定の複数の病理学的状態に対して防御するそれらの能力、およびＤ因子ポリペプチドが存在しないことが原因である複数の病理学的状態のそれらの発症を特徴とする。
【０１３９】
したがって、潜在的Ｄ因子アンタゴニストの生物学的活性は、マウスＤ因子ノックアウトマウスにおいてさらに実験することができる。
【０１４０】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の動物モデルは、Ｃｃｌ−２またはＣｃｒ−２遺伝子にヌル変異を有しているマウスからなる。これらのマウスはＡＭＤの基本的な特徴を発症し、これには、リポフスシンの蓄積、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の真下にあるドルーゼ、光受容体アトロフィー、および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が含まれる。これらの特徴は、６ヶ月の年齢を過ぎて発祥する。候補のＤ因子アンタゴニストは、ドルーゼの形成、光受容体後ロフィー、および脈絡膜新生血管について試験することができる。
【０１４１】
３．薬学的組成物
本発明のＤ因子アンタゴニスト（抗Ｄ因子抗体、および上記に開示されたスクリーニングアッセイによって同定された他の分子を含む）は、薬学的組成物の形態で、補体が関係している眼の状態の治療のための投与することができる。
【０１４２】
本発明のＤ因子アンタゴニストの治療用処方物は、所望される純度を有している活性分子を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥した処方物または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これらとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）：低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭化水素（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、トゥイーン（ＴＷＥＥＮ（商標））、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０１４３】
リポフェクションまたはリポソームもまた、ポリペプチド、抗体、または抗体断片を細胞に送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成することができ、および／または組み換えＤＮＡ技術によって生産することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、７８８９−７８９３［１９９３］を参照のこと）。
【０１４４】
活性分子はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）の中に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の中に、あるいは、マイクロエマルジョンの中に捕捉される場合もある。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１４５】
インビボでの投与に使用される処方物は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に行われる。
【０１４６】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは成型されたもの（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニルコポリマー、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グルコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは１００日を越える期間にわたり分子を放出することができるが、特定のヒドロゲルはより短い期間にわたりタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間留まる場合には、これらは、３７℃で水分に曝された結果として変性または凝集する可能性があり、それにより生物学的活性の消滅が生じ、免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方法論は、関係がある機構に応じた安定化のために考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を生じさせることによって行われ得る。
【０１４７】
眼の疾患もしくは状態の予防または治療のための本発明の化合物は、通常は、眼への注射、眼内注射、および／または硝子体内注射によって投与される。他の投与方法もまた使用され、これには、局所投与、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、鼻腔内投与、および病変内投与が含まれるが、これらに限定されない。非経口での注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。
【０１４８】
眼への投与、眼内投与、および／または硝子体内投与のための処方物は、当該分野で公知の方法によって、当該分野で公知の成分を使用して調製することができる。有効な治療の主要な要件は、眼からの適切な浸透である。薬物を局所的に送達することができる眼の前部の疾患とは異なり、網膜の疾患にはより部位特異的なアプローチが必要である。点眼薬および眼用軟膏はまれにしか眼の裏側に浸透せず、血液−眼バリアは、全身投与された薬物の眼組織への浸透の妨げとなる。したがって、通常は、網膜の疾患（例えば、ＡＭＤおよびＣＮＶ）を治療するための薬物送達に選択される方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常は、患者の状態、および送達される薬物の特性と半減期に応じた間隔で繰り返される。眼内（例えば、硝子体内）への浸透のためには、通常は、より小さな大きさの分子が好ましい。
【０１４９】
補体が関係している眼の状態（例えば、ＡＭＤまたはＣＮＶ）の治療の有効性は、眼内疾患の評価において一般的に使用されている様々な評価項目によって測定することができる。例えば、失明を評価することができる。失明は、例えば、ベースラインから所望される時点までの最も正確な視力（ＢＣＶＡ）の平均変化による測定（例えば、ＢＣＶＡはＥａｒｌｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ Ｓｔｕｄｙ（ＥＴＤＲＳ）視力チャートと、４メートルの試験距離での評価に基づく）、ベースラインと比較して所望される時点で視力において１５文字未満の視力低下がある被験体の集団の測定、ベースラインと比較して所望される時点で１５文字以上の視力を取り戻した（ｇａｉｎ）被験体の集団の測定、所望される時点で２０／２０００またはそれよりもさらに悪いＳｎｅｌｌｅｎ視力を有している被験体の集団の測定、ＮＥＩ Ｖｉｓｕａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅの測定、所望される時点でのＣＮＶの大きさとＣＮＶの漏出量の測定（例えば、フルオレセイン血管造影法による）などによって評価することができるが、これらに限定されない。例えば、眼の検査を行うこと、眼内圧を測定すること、視力を評価すること、スリットランプ圧（ｓｌｉｔｌａｍｐ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を測定すること、眼内の炎症を評価することなどを含むがこれらに限定されない、眼の評価を行うことができる。
【０１５０】
以下の実施例は、例示の目的だけのために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【０１５１】
本明細書中で引用された全ての特許および参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【実施例】
【０１５２】
実施例において言及される市販されている試薬は、他の場所に明記されない限りは、製造業者の説明書にしたがって使用した。以下の実施例の中、および明細書全体を通じてＡＴＣＣ登録番号によって特定されたこれらの細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９である。
【０１５３】
（実施例１）
抗Ｄ因子抗体の調製と試験
方法：
タンパク質分析のための硝子体液とブルッフ膜の調製
ヒトＡＭＤと非ＡＭＤ死体眼を解凍し、硝子体、網膜、およびＲＰＥに沿って前眼部を取り出した。硝子体をマイクロチューブの中に回収し、ドライアイス上で凍結させ、さらに処理するまで−７０℃で保存した。ブルッフ膜−脈絡膜層を後半分の眼球（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｈａｌｆ−ｇｌｏｂｅ）から剥がし（Ｃｒａｂｂ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９９：１４６８２−７（２００２））、４ｍｍまたは６ｍｍのいずれかのトレフィンで手術した試料を、黄斑と中心領域の周囲から、その後の分析のために単離した。ブルッフ膜の調製、年齢、性別、ＡＭＤの病期、解剖所見、およびプロテオミクス分析に使用した量についての添付のまとめの表（表２）を参照のこと。１つの角膜切除した４ｍｍの直径の試料を、補体Ｄ因子タンパク質レベルの分析に使用した。この試料をＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）中で１０分間超音波処理し、可溶性画分と不溶性画分を、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって分離させた。可溶性画分をＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
【０１５４】
ヒトＤ因子に対するモノクローナル抗体の作製
ヒトＤ因子に対するモノクローナル抗体を、モノホスホリルリピッドＡ／トレハロースジコリノミコレートアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）中の２μｇのＤ因子（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ、Ｔａｙｌｏｒ、ＴＸ）をＢａｌｂ／ｃマウスの足裏に１１回注射することによって作製した。マウスに由来する膝窩リンパ節をＰ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．１骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、結合親和性についてマウスＤ因子に対してスクリーニングした。抗体を生産している細胞株を限界稀釈によってクローニングした。
【０１５５】
溶血アッセイ
第２経路の活性を決定するために、ウサギの赤血球（Ｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ）をＧＶＢ中で３回洗浄し、２×１０９／ｍｌになるように再度懸濁した。阻害剤（５０μｌ）と２０μｌのＥｒ懸濁液を、ＧＶＢ／０．１ＭのＥＧＴＡ／０．１ＭのＭｇＣｌ２と１：１で混合した。補体活性化をＣ１ｑ枯渇ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ；ＧＶＢ中に１：３で希釈した３０μｌ）の添加によって開始させた．室温で３０分のインキュベーションの後、２００μｌのＧＶＢ／１０ｍＭのＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、試料を５００ｇで５分間遠心分離した。溶血を４１２ｎｍで吸光度を測定することによって２００μｌの上清の中で決定した。データは、阻害剤が存在しない場合に誘導された溶血に対する％として表した。補体の古典経路に対するＤ因子抗体の効果を決定するために、ＥｒをＩｇＭでコーティングしたヒツジの赤血球（Ｅ−ＩｇＭ、ＣｏｍｐＴｅｃｈ）で置き換えたことを除いて同様の手順を行い、アッセイをＧＶＢ＋＋中のＢ因子欠損ヒト血清中で行った。
【０１５６】
ヒトＤ因子についてのＥＬＩＳＡ
抗ヒト補体Ｄ因子ヤギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に１μｇ／ｍＬになるように希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル、高結合プレート（ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄ ｐｌａｔｅｓ）、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｉｎｔ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）上に、４℃で一晩のインキュベーションの間にコーティングした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）での３回の洗浄後、プレートをＰＢＳ／０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１から２時間ブロックした。このインキュベーションと全ての他のインキュベーションは、オービタルシェーカー上で室温で行った。ヒトの硝子体液とブルッフ膜の溶解物試料をアッセイ希釈液（Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）（ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）を使用して稀釈した。同じ緩衝液を使用して、Ｄ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｔｙｌｅｒ、Ｔｅｘａｓ）標準曲線（１５．６ｐｇ／ｍＬ〜１，０００ｐｇ／ｍＬ）の段階稀釈物を調製した。標準曲線の高、中、および低領域で定量するために予め稀釈した凍結させた対照試料を解凍した。ブロッキング工程の後、プレートを洗浄し、試料、標準物、および対照を添加し、２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化抗ヒトＤ因子モノクローナル抗体９Ｇ７．１．１６を６２．５ｎｇ／ｍＬになるように希釈し、１から２時間のインキュベーションのためのプレートに添加した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）をアッセイ希釈液の中に１／１０，０００に稀釈し、洗浄したプレートに添えた。３０分のインキュベーションと最後の洗浄工程の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加し、５から７分間発色させた。最後に、反応を１Ｍのリン酸の添加によって停止させた。光学密度をマイクロプレートリーダー（４５０ｎｍ、６５０ｎｍの参照）を使用して得、試料濃度を標準曲線の４パラメーターフィットから計算した。ヒトの硝子体液とブルッフ膜の溶解物試料中のＤ因子の最小定量可能濃度は、それぞれ、７８０ｐｇ／ｍＬ（１／５０の最小稀釈）および１５６ｐｇ／ｍＬ（１／１０の最小稀釈）であった。
【０１５７】
免疫組織化学
ブルッフ膜試料をＯＣＴ化合物中で凍結させ、７μｍの切片になるようにクライオミクロトーム（ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）上で切断した。免疫染色。切片を、切片化後に５分間アセトンの中で固定し、染色の準備まで−８０℃で保存した。凍結したスライドをＰＢＳ中で２回濯ぎ、その後、０．１％のＴｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳＴ）で２回濯いだ。内因性のアビジンとビオチンをＶｅｃｔｏｒ Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＰ−２００１）で、製造業者の指示にしたがって室温でブロックした。切片をＴＢＳＴで、２回交換してそれぞれ５分間濯ぎ、内因性の免疫グロブリンを３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中の１０％のウマ血清で、室温で３０分間ブロックした。切片を、１０％のウマ血清中に１０μｇ／ｍｌになるように希釈した抗ヒトＤ因子（９Ｇ７．１．１６）抗体とともに、室温で６０分間インキュベートした。Ｎａｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ＠１０μｇ／ｍｌ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をネガティブ対照として使用した。ＴＢＳＴ中で、２回交換して、それぞれ５分間濯いだ後、切片を、ウマ血清の中に２．５μｇ／ｍｌになるように（１：２００）希釈したビオチン化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）とともに３０分間インキュベートした。切片をＴＢＳＴ中で、２回交換して、それぞれ５分間濯ぎ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡＰ Ｅｌｉｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔとともに室温で３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で濯ぎ（２回交換、それぞれ５分間）、新しく調製したＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ溶液中でインキュベートした。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄは以下のように調製した：２００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌについては、１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌをｄＨ２Ｏ中で１：５に希釈した（１部のＴｒｉｓ ＨＣｌと４部のｄＨ２０）。１滴のレバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）を各５ｍｌの２００ｍＭの新しく調製したＴｒｉｓ ＨＣｌ中に混合した。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄキットによる２滴の試薬１、２、および３を、５ｍｌの２００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ−レバミゾール溶液中に個別に混合した。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄキットによる試薬３の添加から５〜１０分以内に使用した。切片をＨ２Ｏ中で濯ぎ、ヘマトキシリン中に１０〜１５回浸す（２０〜３０秒間）ことによってＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、水およびブルー（ｂｌｕｅ）で濯ぎ、ブルーイング試薬（ｂｌｕｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）を洗い流すために５分間流水中で十分に濯いだ。切片をＣｒｙｓｔａｌ Ｍｏｕｎｔ溶液でマウントし、一晩放置して乾燥させた。乾燥したＣｒｙｓｔａｌマウントカバースライドをキシレンに浸し、ｐｅｒｍａｍｏｕｎｔ封入剤を使用してカバースライドをかけた。
【０１５８】
２０Ｄ１２の重鎖と軽鎖のクローニング
全ＲＮＡを、マウス抗ヒトＤ因子モノクローナル２０Ｄ１２を生産しているハイブリドーマ細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと可変重鎖（ＶＨ）ドメインをＲＴ−ＰＣＲを使用して、以下の縮重プライマーを用いて増幅させた：
軽鎖（ＬＣ）正方向：
５’ＧＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＴＲＡＴＧＡＣＨＣＡＲＴＣＴＣＡ３’（配列番号４）
軽鎖逆方向：
５’ＴＴＴＤＡＫＹＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣ３’（配列番号５）
重鎖（ＨＣ）正方向：
５’ＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＣＡＧＧＴＹＣＡＲＹＴＧＣＡＲＣＡＲＴＣＴＧＧ３’ （配列番号６）
重鎖逆方向：
５’ＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＭＲＧＡＧＡＣＤＧＴＧＡＳＨＲＤＲＧＴ３’（配列番号７） 。
【０１５９】
正方向プライマーはＶＬ領域とＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。ＬＣ逆方向プライマーとＨＣ逆方向プライマーはそれぞれ、種間で高度に保存されている軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）の中の領域にアニーリングするように設計した。
【０１６０】
増幅したＶＬを、ヒトκ定常ドメインを含むｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクター（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００；２７６：６５９１−６０４）にクローニングした。増幅したＶＨは全長のヒトＩｇＧ定常ドメインをコードするｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。これにより、２０Ｄ１２をマウス−ヒトＩｇＧキメラに構築し直した。
【０１６１】
上記に記載された詳細は、当業者が本発明を実施できるために十分であると考えられる。本発明は寄託された構築物により範囲が限定されることはない。なぜなら寄託された実施形態は本発明の特定の態様についての単なる説明と意図され、機能的に等価である任意の構築物が本発明の範囲に含まれる。本明細書中の材料の寄託は、本明細書中に含まれる記載された記述が本発明の任意の態様の実施（その最良の態様を含む）を可能にするには不適切であるという事実の承認に寄与するものではなく、それが提示する特異的な説明に対する特許請求の範囲の限定とも解釈されない。
【０１６２】
実際、示され、本明細書中に記載されたものに加えて様々な本発明の改変が、上記の記載から当業者に明らかとなるであろう。そしてこれらは添付の特許請求の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＤ因子アンタゴニストを必要な被験体に投与する工程を含む、補体が関係している眼の状態の予防または治療方法。
【請求項２】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｄ因子アンタゴニストが、抗Ｄ因子抗体およびその断片、結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに非ペプチド低分子からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｄ因子アンタゴニストが抗体または抗体断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がＤ因子の活性部位に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＤ因子の活性部位の残基を含むエピトープに結合する。請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、抗体２０Ｄ１２、３１Ａ９、２５Ａ１、および３２Ｈ１２、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が本質的に抗体２０Ｄ１２と同じエピトープに結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体に、抗体２０Ｄ１２の重鎖ＣＤＲ配列および／または軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号１および２）が含まれている、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体断片から形成された多特異的抗体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、または（ｓｃＦｖ）２断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補体が関係している眼の状態が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＭＤが乾性ＡＭＤである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＭＤが湿性ＡＭＤである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄ因子アンタゴニストと、補体が関係している眼の状態を治療するために該アンタゴニストを投与するための説明書を含む、キット。
【請求項１８】
前記補体が関係している眼の状態が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生からなる群より選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記補体が関係している眼の状態がＡＭＤまたはＣＮＶである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
補体が関係している眼の状態の治療のための医薬品の調製におけるＤ因子アンタゴニストの使用。
【請求項２１】
補体が関係している眼の状態の治療に使用されるＤ因子アンタゴニスト。
【請求項１】
有効量のＤ因子アンタゴニストを必要な被験体に投与する工程を含む、補体が関係している眼の状態の予防または治療方法。
【請求項２】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｄ因子アンタゴニストが、抗Ｄ因子抗体およびその断片、結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに非ペプチド低分子からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｄ因子アンタゴニストが抗体または抗体断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がＤ因子の活性部位に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＤ因子の活性部位の残基を含むエピトープに結合する。請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、抗体２０Ｄ１２、３１Ａ９、２５Ａ１、および３２Ｈ１２、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が本質的に抗体２０Ｄ１２と同じエピトープに結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体に、抗体２０Ｄ１２の重鎖ＣＤＲ配列および／または軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号１および２）が含まれている、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体断片から形成された多特異的抗体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、または（ｓｃＦｖ）２断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補体が関係している眼の状態が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＭＤが乾性ＡＭＤである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＭＤが湿性ＡＭＤである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄ因子アンタゴニストと、補体が関係している眼の状態を治療するために該アンタゴニストを投与するための説明書を含む、キット。
【請求項１８】
前記補体が関係している眼の状態が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血に関係する網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに網膜血管新生からなる群より選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記補体が関係している眼の状態がＡＭＤまたはＣＮＶである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
補体が関係している眼の状態の治療のための医薬品の調製におけるＤ因子アンタゴニストの使用。
【請求項２１】
補体が関係している眼の状態の治療に使用されるＤ因子アンタゴニスト。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５２８０４７（Ｐ２０１０−５２８０４７Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９５５４（Ｐ２０１０−５０９５５４）
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７８８３
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７８８３
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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