複合サイトカイン−抗体複合体
【課題】２つ以上の異なるサイトカイン間での複合体または融合体を提供すること。
【解決手段】本発明は、少なくとも２つの異なるサイトカイン分子を含むタンパク質複合体および融合タンパク質に関する。タンパク質複合体および融合タンパク質は、免疫グロブリンの領域のような標的化部分をさらに含み得る。このタンパク質複合体および融合タンパク質を使用する方法がまた、開示される。本発明は、２つ以上の異なるサイトカイン間での複合体または融合体を提供し、その複合体または融合体は、概して、標的免疫治療と同様に有用である。これらの複合体または融合体は、必要に応じて他のタンパク質機能基を含む。そのような複合体または融合体の１つの特徴は、固定された比率でその成分のサイトカインの活性を提供することである。
【解決手段】本発明は、少なくとも２つの異なるサイトカイン分子を含むタンパク質複合体および融合タンパク質に関する。タンパク質複合体および融合タンパク質は、免疫グロブリンの領域のような標的化部分をさらに含み得る。このタンパク質複合体および融合タンパク質を使用する方法がまた、開示される。本発明は、２つ以上の異なるサイトカイン間での複合体または融合体を提供し、その複合体または融合体は、概して、標的免疫治療と同様に有用である。これらの複合体または融合体は、必要に応じて他のタンパク質機能基を含む。そのような複合体または融合体の１つの特徴は、固定された比率でその成分のサイトカインの活性を提供することである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（出願に関する参考文献）
本出願は、１９９９年８月９日に提出された米国出願第６０／１４７，９２４号の利益を主張し、その開示を本明細書中で参考文献として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、複合サイトカインタンパク質複合体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｓ）およびそれらの組成物の構築および発現方法に関する。さらに詳細には、本発明は、複合サイトカインおよび標的化成分よりなる融合タンパク質、ならびに癌およびウイルス感染のような疾患の処置に融合タンパク質を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫系を制御する調節ネットワークは、免疫細胞の機能を表すおよび表さない、そのうえ細胞の増殖を制御するための、サイトカインと呼ばれる分泌タンパク質シグナル伝達分子による。これらの反応は、概して、所望される生物学的効果を活発にするように協調して作用する複合サイトカインを含む。インターロイキン−２（ＩＬ−２）のような一定のサイトカインは、自己で免疫細胞増殖を誘導し得、そして第２のサイトカイン分泌を含む他の機能を活性化し得る。別のサイトカイン（インターロイキン−１２（ＩＬ−１２））（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉによって概説された、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８４：４００８−４０２７）は、一定の免疫細胞の増殖を誘導し得、別の重要な免疫モジュレーター（インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ））を誘導し得る。このＩＦＬ−γの誘導は、ＩＬ−１２の重要な活性であるが、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ独立性の別の重要な活性を有する。ＩＬ−１２自身は、感染症状況の初期段階で誘導されるため、先天免疫系および後天免疫系に連結すると考えられる。
【０００４】
マウスおよびヒト免疫細胞の両方を用いた多くのインビトロの研究は、最適な免疫反応の開発におけるサイトカイン組み合わせの重要性を示した。例えば、ほとんどのＴ細胞は、マイトジェンで活性化されるか、または高濃度のＩＬ−２中で培養されるまでは、ＩＬ−１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）を発現しない（Ｄｅｓａｉら、（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３１２５−３１３２）。一旦、そのレセプターが発現されると、細胞はＩＬ−１２に対してはるかに敏感になる。さらに、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ転写を誘導するが、ＩＦＮ−γｍＲＮＡは、その後じきに減る。ＩＬ−２の存在下、ｍＲＮＡは、安定し、そしてＩＦＮ−γ生成量の劇的な増加を生じる（Ｃｈａｎら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：９２−９８）。他の研究においては、ＩＬ−３およびＩＬ−１１のサイトカイン組み合わせまたはＩＬ−３およびスチールファクター（Ｓｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ）のサイトカイン組み合わせは、初期造血前駆細胞の増殖においてＩＬ−１２との相乗効果を有する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、１９９４；上記に引用）ことが見出された。インターロイキン−４およびＧＭ−ＣＳＦの組み合わせは、樹状細胞の刺激において特に有効である（Ｐａｌｕｃｋａら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：４５８７−４５９５）。細胞性免疫反応の刺激にとって、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８（最近発見されたＩＬ−１２に相補性のいくつかの活性を有するＴｈ１促進サイトカイン（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６３：５８３−５８９；Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３６４２−３６４７））の組み合わせもまた、有用である。さらに、ＩＬ−２およびインターフェロン−γは、一定の状況で相乗的である（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ、Ｍ．Ａ．、米国特許第５，０８２，６５８号）。
【０００５】
多くのこれらの相乗作用研究において、各サイトカインの相対的なレベルが、非常に重要であることが発見された。ＩＬ−２の最適以下の量の存在下でのＩＬ−１２の添加は、増殖の誘導、細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ誘導に相乗作用を導くが、１つのサイトカインを高い用量で使用するＩＬ−２およびＩＬ−１２の組み合わせは、拮抗することが見いだされた（Ｐｅｒｕｓｓｉａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３４９５−３５０２（１９９２）；Ｍｅｈｒｏｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２４４４−２４５２（１９９３））同様の状況はまた、ＩＬ−１２およびＩＬ−７の組み合わせにおいても現れる。
【０００６】
マウスにおける抗腫瘍反応の発生のためのＩＬ−１２と他のサイトカインとの間の相乗作用研究はまた、混合した結果を示した。いくつかのモデルにおいて、各サイトカインの最適以下の用量で相乗作用が見られ、そしてさらに高い用量は、高い毒性を導いたが、一方他のモデルにおいて、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の組み合わせは、ほとんどまたはまったく相乗作用を示さなかった（例えば、Ｎａｓｔａｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１６９７−１７０６（１９９４）参照のこと）。特に、異なる薬学的な性質（異なる循環半減期および生分布など）を有する、２つの薬剤の活性の固定比率を維持する必要性があるとき、これらの結果は、インビボにおける２つの潜在的な相乗作用の薬剤の組み合わせの本来の違いを反映し得る。
【０００７】
インビトロの細胞培養実験において、サイトカインレベルを制御することは、簡単であるが、インビボでは多くのファクターが、サイトカインの相対的な生分布および局在性に影響を及ぼし得、従って、サイトカインの免疫刺激能に影響を及ぼす。これらのファクターの最も重要なものは、半減期である。ボーラス注射後の血行中のＩＬ−２の半減期は、約１０分である。これらの薬物動態性質と著しい対照としては、ＩＬ−１２の循環半減期は、マウス中では３時間より長く（Ｗｙｓｏｃｋａら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：６７２）、そしてヒトでは５〜１０時間である（Ｌｏｔｚｅら、（１９９６）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７９５：４４０−４５４）と報告された。
【０００８】
この違いは、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦ共に相対的に小さいサイズ（ＩＬ−１２が７５ｋＤａに対して、１５〜２５ｋＤ）であり、腎濾過によって、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦが浄化され得ることによると考えられる。約５０ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質は、腎濾過によって浄化される。ほとんど全てのサイトカインは、５０ｋＤａより小さく、そして同様に速やかに腎濾過による浄化をこうむる。２つのそのように小さく速やかに浄化されるサイトカインを用いる処置が、所望される場合、単純にサイトカインの同時投与で十分である。しかし、同時投与は、有意に半減期に差のあるサイトカインには最適ではない。
【０００９】
サイトカインの全身投与は、有害な副作用のため難しい。例えば、高いレベルのインターフェロン−αは、重大な副作用（皮膚、神経学的、免疫および内分泌の毒性を含む）を生じる。複合サイトカイン融合体は、著しい重篤な副作用を示し得ると予想される。
【００１０】
サイトカインの全身投与の副作用を低減するため、１つのストラテジーは、サイトカインとターゲッティング能力を有する第２の分子とを融合することである。Ｆｃ領域が別のタンパク質のＮ末端に配置される融合体（「免疫融合体」または、Ｘがインターフェロン−αなどのリガンドである「Ｆｃ−Ｘ」融合体と呼ばれる）は、多数の特有の、有利な生物学的性質を有する（Ｌｏら、米国特許第５，７２６，０４４号および同第５，５４１，０８７号；Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５）。特に、そのような融合体タンパク質は細胞表面の関連のＦｃレセプターに今まで通り結合し得る。しかし、リガンドが細胞表面のレセプターに結合する場合、Ｆｃ領域の配位が変化し、そして抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体結合を媒介する配列が閉塞される（ｏｃｃｕｌｕｄｅｄ）と思われる。結果として、Ｆｃ−Ｘ分子のＦｃ領域は、ＡＤＣＣまたは補体結合を効果的に媒介できない。Ｎ末端サイトカインおよびＣ末端Ｆｃ領域との融合体による細胞障害性の影響は、周知である。例えば、Ｆｃ領域のＮ末端とＩＬ−２との融合体は、ＩＬ−２レセプター、固定補体を保有する細胞に結合し得る分子を生成し、そして結果として細胞を溶解する（Ｌａｎｄｏｌｆｉら、Ｎ．Ｆ．（１９９３）米国特許第５，３４９，０５３号）。対照的に、Ｆｃ−ＩＬ−２融合体タンパク質は、この性質を有さない。したがって、Ｆｃ−Ｘ融合体は、ＡＤＣＣおよび補体結合の有害な影響を受けずに、血清半減期および相対的肝臓中濃度を増加する効力を有すると予想される。
【００１１】
短い血清半減期を有する多くの異なったタンパク質を、Ｆｃ−Ｘ配置でＦｃ領域と融合させ得、その結果得られた融合体はかなり長い血清半減期を有することが、証明された。しかし、２つの異なるＦｃ融合体の血清半減期は、概して同一ではない。従って、２つの異なるＸ機能基の送達が、所望される場合、２つの異なるＦｃ−Ｘタンパク質の同時投与は、概して最適ではない。
【００１２】
いくつかの環境下で、より良いアプローチは、サイトカインと、細胞表面抗原への特異性および親和性を有する抗体（または抗体由来のフラグメント）とを融合させること（Ｇｉｌｌｉｅｓら、米国特許第５，６５０，１５０号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１４２８）によって、または融合タンパク質型のペプチド結合を介してタンパク質抗原および刺激性のサイトカインを結合させること（Ｈａｚａｍａら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：６２９）によって、この細胞表面抗原に対するサイトカインの効果を標的とすることである。抗体自身は融合サイトカインの半減期を増加し得るが、同一抗体を用いた異なるサイトカイン融合間にはまだ違いがあり（例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：２３０−２３５（１９９３）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５−６２０３を参照のこと）、その違いは、標的部位での同時局在性を困難にする。上記に論じたように、このことが、サイトカインの活性の不均等を導き得、そして所望の相乗効果を減少させ得る。さらに、２つの異なる融合タンパク質の使用は、その安全性および有効性のプロフィールのため各融合体別々の試験を必要とし、ついでさらに混合物として試験を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、２つ以上の異なるサイトカイン間での複合体または融合体を提供し、その複合体または融合体は、概して、標的免疫治療と同様に有用である。これらの複合体または融合体は、必要に応じて他のタンパク質機能基を含む。そのような複合体または融合体の１つの特徴は、固定された比率でその成分のサイトカインの活性を提供することである。
【００１４】
概して、本発明は、少なくとも２つの異なるサイトカインを含むタンパク質複合体に関する。そのサイトカインは、同じポリペプチド鎖であり得、またはジスルフィド結合もしくは化学的架橋によって形成される結合などの共有結合によって結合され得る。あるいは、そのサイトカインは、安定な非共有結合的な結合であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、タンパク質複合体は、哺乳動物中のある部位対して複合体を標的とする標的機能基（抗体または抗体フラグメントなど）を含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、２鎖サイトカイン（ＩＬ−１２など）の生物活性と第２のサイトカインの生物活性とを組み合わせたタンパク質複合体を提供する。そのサイトカインは互いに共有結合的に結合され（例えば、融合され）得る。そのサイトカインはまた、他の機能基を介して結合され得る。例えば、第２のサイトカインを含むポリペプチド鎖として、ＩＬ−１２を特異的に結合する結合機能基（例えば、ＩＬ−１２に対する抗体またはＩＬ−１２に対するレセプター）が挙げられる。あるいは、結合機能基はＩＬ−１２と結合された第２の機能基と相互に作用し得る。例えば、ＩＬ−１２のサブユニットをコードするポリペプチド鎖として、アビジンが挙げられる場合、第２のサイトカインを含むポリペプチドとして、標的機能基としてのビオチンが挙げられ得る。ひとつの実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ−２である。
【００１６】
本発明は、ＩＬ−１２自体の薬物動態の動きと類似した、より長く単一の薬物動態の動きを提供し、そのことが、第２のサイトカインの活性の持続を増加し、そして動物へ注入した後の２つのサイトカインの活性のバランスを維持しながら、ＩＬ−１２の活性および第２のサイトカインの活性の両方を維持するＩＬ−１２の融合タンパク質の生成に関する方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、融合タンパク質は、ＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットが、ジスルフィド結合によって結合され、そしてＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットのアミノまたはカルボキシル末端どちらか一方で、ＩＬ−１２−ＸまたはＸ−ＩＬ−１２の一般式（ここでＸは第２のサイトカインである）で第２のサイトカインと共有結合的に結合した、ＩＬ−１２のヘテロダイマー型を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、融合タンパク質は、可撓性のペプチドリンカーを介して結合された２つのポリペプチドサブユニットを含むＩＬ−１２の単鎖（ｓｃ）型とアミノまたはカルボニル末端のどちらか一方で、一般式ｓｃＩＬ−１２−ＸまたはＸ−ｓｃＩＬ−１２で共有結合された、第２のサイトカインを含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、２つのサイトカインはさらに、タンパク質鎖のアミノまたはカルボキシ末端のいずれか一方で二量化または多量体化構造を形成し得るタンパク質と融合される。この実施形態の好ましい形態において、第２のサイトカインとＩＬ−１２の融合タンパク質形成のひとつは、さらに、免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖の一部（二量化し得るＦｃ領域など）と、融合される。さらなる実施形態としては、Ｉｇ鎖の一部のいずれかの末端でＩＬ−１２の少なくともひとつのポリペプチド鎖および他の末端で融合された第２のサイトカインとの融合が挙げられる。
【００２０】
別の実施形態において、２つ以上のサイトカインは、特異的レセプターへの結合によって、標的能力を有するタンパク質と融合される。例えば、Ｆｃ領域は、肝臓中に豊富であるＦｃレセプターと結合し得る。複合結合サイトカインとＦｃ領域の融合は、二量化および標的共の利点を例示する、しかし、いくつかの状況においては、多量体化能力または標的能力のみを有するが両方の能力は有していない複合化サイトカインの融合体を構築することが有用である。
【００２１】
さらに、別の実施形態においては、複合サイトカインを含む、融合タンパク質は、さらに、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで、多様な標的能力を有する多くのクラスの分子（抗体、または骨格を持っているかもしくは持っていないペプチドアプタマーなど）と、融合される（Ｃｏｌａｓら、（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４２７２−７）。特定の実施形態は、複合サイトカインと、抗原と結合し得る抗体の少なくとも一部分（インタクトな抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ領域など）との融合である。さらに実施形態としては、抗原と結合し得る抗体鎖の少なくとも一部のいずれかの末端部分でＩＬ−１２の少なくとも１つのポリペプチド鎖および、他の末端で融合した第２のサイトカインとの融合が挙げられる。
【００２２】
上記の記述に従って、概して、遺伝工学技術によって、複合サイトカイン融合タンパク質と複合サイトカイン抗体融合タンパク質を構築することが好ましい、この結果、タンパク質成分が、アミド結合またはジスルフィド結合などの共有結合によって結合される。しかし、そのようなタンパク質複合体を構築するために、化学架橋を使用することもまた、有用である。そのような方法は、タンパク質化学分野で良く確立される。あるいは、異なるサイトカインと、安定した非共有結合複合体を形成するパートナータンパク質とを融合することでタンパク質複合体を生むことが、時には、十分である。例えば、非共有結合ヘテロ二量体サポートタンパク質は、以下のように使用される：第１のサイトカインを、ヘテロ二量体のひとつのサブユニットと融合する、第２のサイトカインを、ヘテロ二量体の第２のサブユニットと融合する、そして２つの融合タンパク質を、適切な条件で混合する。例えば、２つのサブユニット−サイトカイン融合タンパク質をコードした核酸は、同じ細胞中で発現される。この場合、複合サイトカインタンパク質複合体は、サイトカイン組成成分が直接または非直接に共有結合的に結合されずに、構築され得る。本発明の目的を達成するために、そのような複合体が、動物の投与の際に維持され、そして生物学的効果を達成するために十分に安定であることが、必要である。
【００２３】
本発明はまた、２つ以上のサイトカインを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する、ここで、サイトカインの１つは、好ましくはＩＬ−１２であり、そして、核酸によってコードされた融合タンパク質は、必要に応じて、他のタンパク質部分を含む。好ましい実施形態として、２つ以上のサイトカインと二量化タンパク質（抗体鎖のＦｃ部分）との融合体をコードする核酸が挙げられる。別の好ましい実施形態のセットは、２つ以上のサイトカインと標的能力を有するタンパク質（抗体など）との融合体をコードする核酸である。
【００２４】
本発明はまた、２つ以上のサイトカインの融合体の構築のための方法、およびそのような融合タンパク質を発現方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、疾患および他の医学的病気の処置方法を提供する、ここで、その処置は、２つ以上のタンパク質の活性の有用な組み合わせを含む。１つの実施形態において、少なくとも１つのタンパク質は、短い（例えば、２０分以下）または中程度にだけ長い（例えば、４０分以下）血清半減期を有する。そのタンパク質は、遺伝工学技術、または他の技術によって融合され、ヒトまたは動物へ投与される。この場合、２つのタンパク質の活性は固定比で現れ、そして２つのタンパク質の異なる投薬スケジュールでの別個の投与を、要求されない。さらに、融合タンパク質の血清半減期は、概して、より長い血清半減期を有するタンパク質成分の血清半減期とさらに類似である、従って、より短い血清半減期を有するタンパク質の有効半減期を長くする。
【００２６】
より詳細には、本発明は、癌もしくは感染などの疾患、または他の疾患の免疫治療処置方法を提供し、２重鎖サイトカイン（第２のサイトカインと結合したＩＬ−１２など）を用いて有効的に処置され得る。好ましい実施形態において、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦと融合され、そして動物またはヒトに投与される。他の好ましい実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−４と融合され、動物またはヒトへ投与される。別の実施形態において、ＩＬ−１２は、ＩＬ−８と融合され、動物またはヒトへ投与される。そのような処置は他の疾患処置と組み合わせて使用され得る。さらに、本発明は、多様な抗原に対するワクチン接種方法を提供し、様々な疾患を予防または処置するために使用され得る。
【００２７】
これらの方法の他の実施形態において、２つの異なるサイトカインが、二量体タンパク質の一部分（抗体のＦｃ領域など）と融合され、そして、動物またはヒトに投与される。これらの方法の好ましい形態では、サイトカインＩＬ−１２は、第２のサイトカインと共にＦｃ領域と融合され、さらに好ましくは、その第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００２８】
さらにこれらの方法の他の実施形態において、２つの異なるサイトカインが、インタクトな抗体と融合され、そして動物またはヒトに投与される。この方法の好ましい形態において、サイトカインＩＬ−１２が、第２のサイトカインと共に抗体の一部分と融合され、さらに好ましくは、その第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。本発明はまた、疾患を処置する点で有用な抗体サイトカイン融合タンパク質の混合物を開示する。１つの実施形態において、抗体ＩＬ−２融合タンパク質と抗体ＩＬ−１２融合タンパク質の混合物が、疾患の処置に使用される。例えば、癌、ウイルス感染、またはバクテリア感染が処置される。
本発明はまた、例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）免疫グロブリン領域（Ｉｇ）、第１のサイトカイン（Ｃ１）および第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）を規定するポリペプチド鎖を含む、多機能融合タンパク質。
（項目２）項目１に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記Ｉｇ、前記Ｃ１および前記Ｃ２は、Ｎ末端からＣ末端の方向に配置され、以下：
（ｉ）Ｉｇ−Ｃ１−Ｃ２；
（ｉｉ）Ｃ１−Ｉｇ−Ｃ２；および
（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ２−Ｉｇ
（ここで、棒線は、ポリペプチド結合またはポリペプチドリンカーを表す）からなる群より選択される式によって規定される融合タンパク質を産生する、融合タンパク質。
（項目３）前記Ｃ１または前記Ｃ２が、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４）前記Ｃ１または前記Ｃ２が、ヘテロ二量体サイトカインのサブユニットを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５）前記Ｃ１が、ケモカインである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６）前記サブユニットが、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットまたはＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを含む、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目７）前記Ｃ１または前記Ｃ２が、ヒトサイトカインである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン（ＶH）を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目９）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、項目１または８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）前記定常領域が、ヒンジ領域ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１１）前記定常領域が、さらにＣＨ１ドメインを含む、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）前記ＶHが、癌特異的抗原またはウイルス抗原と免疫学的に反応性である、項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１３）前記Ｃ１および前記Ｃ２が、前記融合タンパク質に結合される場合、インビボにおいて類似した循環半減期を有する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１４）前記Ｉｇ、前記Ｃ１、および前記Ｃ２が、同じ条件下において全て活性である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１５）多機能タンパク質複合体であって、
免疫グロブリン領域および第１のサイトカインの第１の部分を規定する、第１のポリペプチド鎖、および
第２のサイトカインおよび該第１のサイトカインの第２の部分を規定する、第２のポリペプチド鎖、
を含む、多機能タンパク質複合体。
（項目１６）前記第１のポリペプチド鎖が、前記第２のポリペプチド鎖に共有結合される、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目１７）前記第１のサイトカインが、二量体サイトカインである、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目１８）前記第１のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目１９）前記第２のサイトカインが、ＩＬ−２である、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目２０）多機能タンパク質複合体であって、少なくとも：
免疫グロブリン軽鎖の少なくとも一部に融合された第１のサイトカインを含む、第１の融合タンパク質、および
免疫グロブリン重鎖の少なくとも一部に融合された第２の異なるサイトカインを含む、第２の融合タンパク質、
を含む、多機能タンパク質複合体。
（項目２１）前記第１の融合タンパク質が、前記第２の融合タンパク質に共有結合される、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２２）前記免疫グロブリン軽鎖の一部が、前記免疫グロブリン重鎖の一部にジスルフィド結合される、項目２１に記載のタンパク質複合体。
（項目２３）前記第１のサイトカインのアミノ末端が、前記免疫グロブリン軽鎖のカルボキシ末端に融合される、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２４）前記第２のサイトカインのアミノ末端が、前記免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端に融合される、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２５）前記第１のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２６）前記第２のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２７）第１のサイトカイン（Ｃ１）および第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）を規定するポリペプチド鎖を含む、多機能融合タンパク質であって、ここで、該Ｃ２は、遊離の場合、遊離のＣ１の約２倍より大きいインビボにおける循環半減期を有するが、該Ｃ１が該融合タンパク質において該Ｃ２に連結される場合、該Ｃ１は、該融合タンパク質において該Ｃ２とほぼ同じのインビボにおける循環半減期を有する、多機能融合タンパク質。
（項目２８）前記Ｃ１が、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目２９）前記Ｃ２が、ＩＬ−４、ＩＬ−１２またはこれらのサブユニットである、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３０）前記Ｃ１のＣ末端が、前記Ｃ２のＮ末端に連結される、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３１）前記Ｃ２のＣ末端が、前記Ｃ１のＮ末端に連結される、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３２）前記Ｃ末端が、前記Ｎ末端にポリペプチドリンカーを介して連結される、項目３０または３１に記載の融合タンパク質。
（項目３３）免疫グロブリン領域（Ｉｇ）をさらに含む、項目３２に記載の融合タンパク質。
（項目３４）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン（ＶH）を含む、項目３３に記載の融合タンパク質。
（項目３５）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、項目３３に記載の融合タンパク質。
（項目３６）前記定常領域が、ヒンジ領域ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３７）前記重鎖定常領域が、ＣＨ１ドメインをさらに含む、項目３６に記載の融合タンパク質。
（項目３８）前記遊離のＣ２が、Ｃ１よりも少なくとも約４倍大きいインビボにおける循環半減期を有する、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３９）前記Ｃ２が、Ｃ１よりも約８倍大きい循環半減期を有する、項目３８に記載の融合タンパク質。
（項目４０）項目１、１５、２０または２７に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
（項目４１）項目４０に記載の核酸を含む、細胞。
（項目４２）融合タンパク質を調製する方法であって、該融合タンパク質は、第１のサイトカイン（Ｃ１）、第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）、および哺乳動物において予め選択された位置を標的化し得る標的化部分を含み、該方法は、以下の工程：
（ａ）宿主細胞において融合タンパク質をコードする核酸を発現させる工程であって、該融合タンパク質は、Ｃ１、Ｃ２および該融合タンパク質が該哺乳動物に投与された場合に予め選択された位置において該融合タンパク質を標的化し得る標的化部分を含む、工程；および
（ｂ）該融合タンパク質を収集する工程
を包含する、方法。
（項目４３）第１のサイトカイン（Ｃ１）および第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）を、哺乳動物において予め選択された位置に対して標的化する方法であって、該方法は、以下：
該哺乳動物に多機能融合タンパク質を投与する工程であって、該多機能融合タンパク質は、Ｃ１、Ｃ２、および該融合タンパク質を該哺乳動物において予め選択された位置に対して標的化し得る免疫グロブリン領域（Ｉｇ）を含む、工程、
を包含する、方法。
（項目４４）項目４２または４３に記載の方法であって、前記Ｉｇが、前記哺乳動物において前記予め選択された位置に配置された抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインを含む、方法。
（項目４５）前記抗原が、癌特異的抗原またはウイルス抗原である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）項目４２または４３に記載の方法であって、前記Ｉｇが、前記哺乳動物において前記予め選択された位置に配置された免疫グロブリンＦｃレセプターに結合し得る免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、方法。
（項目４７）前記Ｉｇ、前記Ｃ１、および前記Ｃ２が、前記融合タンパク質が前記哺乳動物に投与された場合に、全て活性である、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４８）前記哺乳動物が、ヒトである、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４９）前記Ｃ１が、ＩＬ−１２またはそのサブユニットである、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５０）前記Ｃ２が、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、項目１、１５、２０または２７に記載のタンパク質を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５２）哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、項目４０に記載の核酸を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５３）哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、項目４１に記載の細胞を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
前述および本発明の他の目的、ならびにそれらの様々な特徴は、添付の図面と共に読むときに、以下の記述から、より完全に理解され得る、図面の全体を通じて、同様の数は、同様の構造を言及する。
【図１】図１Ａは、２つのサイトカインの融合をその最も簡単な形態で略図で図解する：１つのサイトカインが、必要に応じてリンカーを介して第２のサイトカインと融合される。図１Ｂ〜１Ｉは、第２のサイトカイン（「ｃｙｔ」と標示された）が、ヘテロ二量体サイトカインＩＬ−１２と結び付けられ得る、様々な方法を示す。特に、第２のサイトカインは、ｐ４０のＣ−末端（図１Ｂ）、ｐ４０のＮ−末端（図１Ｃ）、ｐ３５のＣ−末端（図１Ｄ）またはｐ３５のＮ−末端（図１Ｅ）と融合され得る。さらに、図１は、第２のサイトカインが、ＩＬ−１２の単鎖バージョンと融合され得る方法を示す。特に、単鎖ＩＬ−１２分子は、ｐ３５のＮ−末端からｐ４０に向かい、そのＣ−末端（図１Ｆ）またはＮ−末端（図１Ｇ）で第２のサイトカインを有し得る。あるいは、単鎖ＩＬ−１２分子は、ｐ４０のＮ−末端からｐ３５に向かい、そのＣ−末端（図１Ｈ）またはＮ−末端（図１Ｉ）で第２のサイカインと共に、ｐ３５のＮ−末端とＰ４０を有し得る。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、図１で描かれた複合サイトカイン融合体（箱）が、抗体のＦｃ領域（ここではヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（長円形）として示される）とさらに融合され得る方法を、略図的に示す。特に、図１の８分子のいずれかは、Ｆｃ領域のＣ−末端（図２Ａ）またはＮ−末端（図２Ｂ）のいずれかと融合され得る。さらに、第１のサイトカインおよび第２のサイトカイン（それぞれ箱）は、それぞれと直接結び付けられる必要はないが、Ｆｃ部分を介して結合され得る（図２Ｃ）。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｇは、複合サイトカイン融合タンパク質が、さらにＩｇＧなどのインタクトな免疫グロブリンと融合され得る方法のサブセットを略図的に示す。重鎖Ｖ領域は、ＶHと標示された長円形として示され、軽鎖Ｖ領域は、ＶLと標示された長円形として示され、そして、定常領域は、空白の長円形である。図１に図解した複合サイトカイン融合体は、重鎖のＣ−末端（図３Ａ）、重鎖のＮ−末端（図３Ｂ）軽鎖のＮ−末端（図３Ｃ）または軽鎖のＣ−末端（図３Ｄ）に配置され得る。さらに、多くの方法があり、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、重鎖および軽鎖のＮ−末端およびＣ−末端で、別個に結び付けられ得る、これらの３つを、図３Ｅ〜３Ｇに示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｇは、複合サイトカイン融合タンパク質が、さらにＩｇＧなどのインタクトな免疫グロブリンと融合され得る方法のサブセットを略図的に示す。重鎖Ｖ領域は、ＶHと標示された長円形として示され、軽鎖Ｖ領域は、ＶLと標示された長円形として示され、そして、定常領域は、空白の長円形である。図１に図解した複合サイトカイン融合体は、重鎖のＣ−末端（図３Ａ）、重鎖のＮ−末端（図３Ｂ）軽鎖のＮ−末端（図３Ｃ）または軽鎖のＣ−末端（図３Ｄ）に配置され得る。さらに、多くの方法があり、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、重鎖および軽鎖のＮ−末端およびＣ−末端で、別個に結び付けられ得る、これらの３つを、図３Ｅ〜３Ｇに示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、可変軽鎖および可変重鎖が融合された「単鎖」抗体と、融合され得、そして、タンパク質が単一ポリペプチドとして発現され、次いでホモ二量化される方法を、略図的に示す。特に、複合サイトカイン融合は、Ｃ−末端（図４Ａ）またはＮ−末端（図４Ｂ）に配置され得る。さらに、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、それぞれと直接結び付けられる必要はないが、単鎖抗体部分を介して結合され得る（図４Ｃ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、第１のサイトカインと第２のサイトカインが、重鎖および軽鎖由来の融合された可変領域からなる単鎖Ｆｖ領域と融合され得る方法を略図的に示す。特に、第１のサイトカイン−サイトカイン融合は、Ｃ−末端（図５Ａ）またはＮ−末端（図５Ｂ）で配置され得る。さらに、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインは、直接結び付けられる必要はないが、単鎖Ｆｖ部分を介して結合され得る（図５Ｃ）。
【図６Ａ】図６Ａは、別個のサイトカインまたは融合タンパク質に応答したヒト末梢血球単核細胞（ＰＢＭＣ）によるインターフェロン−γの誘導における、ＩＬ−１２とＩＬ−２との間の相乗効果を示す。図６Ａにおいて、細胞を、植物性血球凝集素活性の前（四角）もしくは後（×）にヒトＩＬ−１２を使用して、または植物性血球凝集素活性の前（ひし形）もしくは後（三角）にＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を使用して処理した。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは、融合タンパク質として存在するＩＬ−１２の濃度を、ｐｇ／ｍｌで示す。ｙ軸は、ＥＬＩＳＡでアッセイされたＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、別個のサイトカインまたは融合タンパク質に応答したヒト末梢血球単核細胞（ＰＢＭＣ）によるインターフェロン−γの誘導における、ＩＬ−１２とＩＬ−２との間の相乗効果を示す。図６Ｂは、細胞を、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を１：１のモル比で添加した混合物（黒色ひし形）、ヒトＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（灰色四角）およびヒト抗体−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（明るい灰色三角）を用いて処置した実験を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは、融合タンパク質として存在するＩＬ−１２の濃度を、ｐｇ／ｍｌで示す。ｙ軸は、ＥＬＩＳＡでアッセイされたＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図７】図７は、別々に融合タンパク質の活性を測定し、そして、非融合ＩＬ−１２分子の活性と融合タンパク質の活性を比較する、典型的なＩＬ−１２のバイオアッセイを示す。描かれているのは、マウスＩＬ−１２（白丸）、マウスＩＬ−１２およびＩＬ−２を１：１のモル比で添加された混合物（黒四角）、マウスＩＬ−２（白三角）および抗体−マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（黒ひし形）に応答した、ヒトＰＢＭＣの3Ｈ−チミジン取り込みの刺激である。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質として、または融合タンパク質として存在する単量体のサイトカインの濃度（ｐＭ）を示し；ｙ軸はトリチウムチミジン組み込みのｃｐｍを示す。
【図８】図８は、標準ＩＬ−２バイオ活性アッセイを示す。グラフは、マウスＩＬ−２（丸）、抗体−マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（ひし形）およびマウスＩＬ−１２（四角）に応答した、マウスＣＴＬＬ細胞増殖の刺激を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質として、または融合タンパク質として存在する単量体サイトカインの濃度（ｐＭ）を示す。細胞を、様々な量のサイトカインまたは融合タンパク質を含む培地で、４８時間、インキュベートし、次いで、ＭＴＴ／ＭＴＳアッセイを使用して、生存細胞数をアッセイした。ｙ軸は、光学密度（ＯＤ）の単位にして、４９０ナノメーターの吸光度を示す。
【図９】図９は、マウスＩＬ−１２（白丸）、マウスＩＬ−１２およびＩＬ−２を１：１のモル比で添加した混合物（黒丸）、マウスＦｃ−単鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（黒三角）およびマウスＩＬ−２と融合されたマウス単鎖ＩＬ−１２（黒ひし形）に応答した、ヒトＰＢＭＣによる3Ｈ−チミジン取り込みの刺激を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは融合タンパク質として存在する単量体のサイトカインの濃度（ｐＭ）を示す；ｙ軸はトリチウムチミジン組み込みのｃｐｍを示す。
【図１０】図１０は、マウスＩＬ−１２（白丸）、マウスＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦを１：１のモル比で添加した混合物（黒丸）、マウスＧＭ−ＣＳＦ（黒三角）およびマウスＦｃ−マウスＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（×）に応答した、ヒトＰＢＭＣによる3Ｈ−チミジン取り込みの刺激を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは融合タンパク質として存在する、単量体のサイトカインの濃度（ｐＭ）を示す；ｙ軸はトリチウムチミジン組み込みのｃｐｍを示す。
【図１１】図１１は、ＫＳ−１／４の抗原であるヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたＣＴ２６結腸癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するＢａｌｂ／Ｃマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処理の影響を示す。黒ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、６マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、３．４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−２、および５．３マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたＣＴ２６結腸癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合たんぱく質処置の影響を示す。ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、６マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２で処置されたマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、３．４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２および５．３マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２で処置されたマウスの平均腫瘍容積を示す。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１３】図１３は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞の皮下腫瘍を保有するマウスの抗体−サイトカイン処置および抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を比較する。ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２を０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２を０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。Ｘは、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２を０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１４】図１４は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたルイス肺癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスの抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を示す。ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、１１．５マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２および１８マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＥｐＣＡＭを発現する、またはしないいずれかのルイス肺癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を示す。黒四角は、ＬＬＣ／ＫＳＡ由来腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍容積を示す。黒ひし形は、ＬＬＣ由来腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍容積を示す。マウスは、０、１、２、３および４日目に２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で処置した。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１６】図１６は、ルイス肺癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を示す。約１０6の細胞を、０日目に皮下に注射した。ひし形は、ナイーブなマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、ヒトＥｐＣＡＭを発現をするように操作されたルイス肺ガン細胞由来の皮下腫瘍をあらかじめ有しており、そして、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２の処置によってこれらの腫瘍を治癒されたマウスの、平均腫瘍容積を示す。Ｘ軸は、注射後の経過日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、正常な免疫系を有する動物中で、細胞が腫瘍を形成する能力に対する、腫瘍細胞による単一または複合サイトカインタンパク質分泌の影響を示す。図１７Ａにおいて、４セットのマウスを比較した：１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（黒ひし形）；５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白ひし形）；ｓｃＩＬ−１２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（黒三角）；およびｓｃＩＬ−１２を発現する５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白三角）。Ｘ軸は、腫瘍細胞の注射後の日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、正常な免疫系を有する動物中で、細胞が腫瘍を形成する能力に対する、腫瘍細胞による単一または複合サイトカインタンパク質分泌の影響を示す。図１７Ｂは、１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（黒ひし形）；５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白ひし形）；ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（×）；およびｓｃＩＬ−１２を発現する５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白丸）。Ｘ軸は、腫瘍細胞の注射後の日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１８】図１８は、免疫欠損の動物において細胞が腫瘍を形成する能力に対する、腫瘍細胞による、単一または複合サイトカインタンパク質分泌の影響を示す。この図は、１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＳＣＩＤマウス（黒ひし形）；ｓｃＩＬ−１２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞皮下注射したＳＣＩＤマウス（黒三角）；およびｓｃＩＬ−１２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＳＣＩＤマウス（白丸）を比較する。Ｘ軸は、腫瘍細胞の注射後の日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、２つ以上の別個のサイトカインが融合または複合体化するタンパク質分子を提供する。そのタンパク質複合体または融合タンパク質は、必要に応じて、さらなるタンパク質部分（抗体Ｆｃ領域および抗原結合部位を含む抗体領域などの多量体化および標的化を可能にする部分を含む）を含む。本発明はまた、複合サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、疾患の処置および医療条件における、複合サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸の構築のための方法、複合サイトカイン融合タンパク質の産生のための方法、および複合サイトカイン融合タンパク質の使用についての方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは、免疫系の細胞の活性を調節する分泌タンパク質またはその活性化フラグメントまたはその変異体をいう。サイトカインの例としては、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、腫瘍壊死因子、免疫細胞前駆体についてのコロニー刺激因子などが挙げられる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ヘテロ二量体サイトカイン」とは、２つの別個のタンパク質サブユニットからなるサイトカインについていう。現在、ＩＬ−１２が、唯一の天然に存在する公知のヘテロ二量体サイトカインである。しかし、人工のヘテロ二量体サイトカインが構築され得る。例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒの可溶性フラグメントは組み合わされ、ＣＮＴＦおよびＣＮＴＦ−Ｒαが形成し得るように、ヘテロ二量体サイトカインを形成し得る［Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８４：４００８］。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「インターロイキン−１２」（ＩＬ−１２）とは、ｐ３５およびｐ４０サブユニット、またはｐ３５およびｐ４０の活性単鎖融合体、または、これらの種改変体、フラグメント、もしくは誘導体からなる２つのサブユニットのサイトカインをいう。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「インターロイキン−２」（ＩＬ−２）とは、任意の哺乳動物ＩＬ−２（例えば、ヒトＩＬ−２、マウスＩＬ−２）または、これらの活性種もしくは対立遺伝子改変体、フラグメントもしくは誘導体をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「ＧＭ−ＣＳＦ」とは、哺乳動物顆粒球／単球コロニー刺激因子サイトカインタンパク質（例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、マウスＧＭ−ＣＳＦ）、またはこれらの活性種もしくは対立遺伝子改変体、フラグメントもしくは誘導体をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはそのアナログもしくはその部分を意味する。例えば、ＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくともヒンジ領域の一部（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み得る。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくともヒンジ領域の一部およびＣＨ３ドメインを含む。別の好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくともＣＨ２領域を含み、そしてより好ましくは、ヒンジ領域の少なくとも一部をまた含む。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「ペプチドリンカー」とは、２つのタンパク質（例えば、タンパク質およびＦｃ領域）を共に結合するために使用される１つ以上のペプチドを意味する。このペプチドリンカーはしばしば、一連のアミノ酸（例えば、主にグリシンおよび／またはセリン）である。好ましくは、このペプチドリンカーは、主にグリシンおよびセリン残基の一連の混合物であり、そして、約１０〜１５アミノ酸長である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「多量体の」とは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）または非共有結合の相互作用を介して２つ以上のタンパク質サブユニットの安定した会合をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「二量体の」とは、２つのタンパク質サブユニットが共有結合または非共有結合の相互作用を介して安定して会合する特定の多量体分子をいう。安定した複合体は、少なくとも数分の解離速度（すなわち、オフの速度）を有する複合体である（結果として、この複合体は、インビボ使用中に標的組織に到達するのに十分な安定した長さであり、そして、生物学的効果を有する）。Ｆｃフラグメントはそれ自身が、代表的に、ヒンジ領域の一部、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む重鎖フラグメントの二量体を形成する。しかし、多数のタンパク質リガンドは、二量体としてそれらのレセプターに結合することが公知である。サイトカインＸが自然に二量体化する場合、Ｆｃ−Ｘ分子のＸ部分は、はるかに大きい程度に、二量体化する。なぜなら、この二量体化プロセスは、濃度依存性であるからである。このＦｃによって結合される２つのＸ部分の物理的近接は、二量体化を細胞内プロセスとし、二量体の方へ平衡状態を大きく変化させ、そして、レセプターに対するこの結合を増強する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」とは、宿主細胞に取り込まれ、そして、組換えられて宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、または、エピソームとして自律的に増幅されるのに適格性のヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。このようなベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの非制限的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子発現」または「タンパク質の発現」とは、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳、およびタンパク質産物の分泌または単離可能な形態でのタンパク質産物の産生のどちらかを意味することが理解される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「免疫サイトカイン」とは、米国特許第５，６５０，１５０号で開示されるように、抗体およびサイトカインを含む融合タンパク質である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「リーダー配列」とは、第２のタンパク質配列（通常Ｎ末端）に付着され、そして、この第２のタンパク質配列を細胞から分泌されるように指向するタンパク質配列である。このリーダー配列は、通常、第２のタンパク質配列から切断されそして除去され、これは、成熟タンパク質となる。この用語「リーダー配列」は、一般的に「シグナル配列」と同義語である。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「ＥｐＣＡＭ」とは、上皮細胞付着分子をいい（Ｃｉｒｕｌｌｉら［１９９８］１４０：１５１９−１５３４）、そして、モノクローナル抗体ＫＳ−１／４によって結合される抗原を意味する「ＫＳＡ」と同義語である。ＥｐＣＡＭは、上皮細胞に由来する癌細胞上で豊富に発現される細胞表面タンパク質である。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ＫＳ−１／４」とは、ＥｐＣＡＭに結合する特定のモノクローナル抗体をいう。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「ＫＳ−ＩＬ２」「ＫＳ−ＩＬ１２」および「ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２」などは、インターロイキン２を有するＫＳ−１／４、インターロイキン１２を有するＫＳ−１／４、ならびにインターロイキン１２およびインターロイキン２の両方を有するＫＳ−１／４からそれぞれなる抗体−サイトカイン融合タンパク質をいう。類似の名前の融合タンパク質構築物もまた本明細書中で使用される。抗体分子のいくつかの部位でサイトカインを融合することが可能であるので、「ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２」などの記載は、明確に他を示さなければ、任意の可能な部位で融合されたインターロイキン１２およびインターロイキン２の両方を有するＫＳ−１／４を含むタンパク質の分類をいう。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「１４．１８」とは、腫瘍特異的抗原ＧＤ２に結合する特定のモノクローナル抗体をいう。
【００４７】
本発明を使用するタンパク質構築物のいくつかの例示的な実施形態は、図１〜５に例示される。図２〜５に概略される分子の一部は、１Ａ〜１Ｉと標識され、図１Ａ〜１Ｉに示される融合タンパク質についていい、そして、図１由来の融合タンパク質のいずれかが、示されるように他のタンパク質にさらに融合され得ることを例示する。サイトカインは長方形として示され、抗体の定常領域は楕円形として示され、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は標識された楕円形として示されている。
【００４８】
本発明は、２つの異なったサイトカインおよび必要に応じてさらなるタンパク質部分を含むタンパク質複合体を記載する。ホモ二量体サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−５、ＩＬ−８など）は、複数のサブユニットを含むが、それにも関わらず、単一のサイトカインである。同様に、ＩＬ−１２などのヘテロ二量体サイトカインは、異なったサブユニットを含むが、単一のサイトカインである。さらに、通常はホモ二量体サイトカインのヘテロ二量体形態（例えば、ＭＣＰ−１／ＭＣＰ−２ヘテロ二量体）または、通常はへテロ二量体サイトカインの２つの対立形質（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［１９９４］２６９：１５９１８−２４）は、単一のサイトカインである。本発明の複合体は、２つの異なったサイトカインを含み、これらのそれぞれ（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１２；ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＣＰ−１およびエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）など）は、免疫系の細胞の活性を調節することができる。
【００４９】
図１Ａは、本発明の好ましい実施形態を示す：融合タンパク質１０では、第１のサイトカイン１２のＣ末端は、必要に応じてリンカー領域を介して（データは示されていない）、第２のサイトカイン１４のＮ末端に融合される。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のタンパク質複合体は、有意に異なる血清の半減期を有する少なくとも２つのサイトカインを含む。例えば、小さいタンパク質および大きいタンパク質を使用することは、しばしば、より大きいタンパク質に特徴的な循環半減期を有する融合タンパク質を生じる。従って、ＩＬ−１２および第２のサイトカインの組み合わせた効果が所望である状況では、以下の一般式の融合タンパク質として２つのサイトカインを発現することが有利である：ＩＬ−１２−ＸまたはＸ−ＩＬ−１２（ここで、Ｘは、第２のサイトカインである）。２つの特定の利点が見出される。第１に、より速く清澄されるサイトカインの血清半減期が延びる。第２に、両方のサイトカインの血清半減期は、お互いに非常に類似するようになる。
【００５０】
ＩＬ−１２などの２鎖のサイトカインは、２鎖のサイトカインのどちらかの鎖のＮ末端またはＣ末端で、別のサイトカインに融合され得る。１つの実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットのいずれかのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合される（図１Ｂ〜１Ｅ）。図１Ｂの融合タンパク質１６では、第１のサイトカイン１２のＮ末端は、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニット１８のＣ末端に融合される。ｐ４０サブユニット１８は、共有結合２２によってＩＬ−１２のｐ３５サブユニット２０に連結される。図１Ｃの融合タンパク質２４では、ｐ４０サブユニット１８のＮ末端は、第１のサイトカイン１２のＣ末端に融合され、そして、共有結合２２によってｐ３５サブユニット２０に連結される。図１Ｄは、第１のサイトカイン１２のＮ末端がｐ３５サブユニット２０のＣ末端に融合される融合タンパク質２６を示し、ｐ３５サブユニット２０は、共有結合２０によって、ｐ４０サブユニット１８に連結される。図１Ｅでは、融合タンパク質２８は、ｐ３５サブユニット２０を含み、これは、そのＮ末端が第１のサイトカイン１２のＣ末端に融合され、そして、共有結合２２によって、ｐ４０サブユニット１８に連結される。
【００５１】
第２の実施形態では、ＩＬ−１２のサブユニットは融合され、Ｎ末端の位置で、ｐ３５サブユニットまたはｐ４０サブユニットのいずれかと、単鎖タンパク質（ｓｃＩＬ−１２）を形成し得る；第２のサイトカインは、生じるｓｃＩＬ−１２のＮ末端またはＣ末端に付着され得る（図１Ｆ〜１Ｉ）。従って、図１Ｆに示される好ましい実施形態では、融合タンパク質３０は、単鎖ＩＬ−１２を含み、ここで、ｐ４０サブユニット１８のＮ末端は、必要に応じてペプチドリンカーを介して、ｐ３５サブユニット２０のＣ末端に融合される。この実施形態では、サイトカイン１２のＮ末端は、ｐ４０サブユニット１８のＣ末端に融合される。図１Ｇに示される実施形態では、ｐ３５サブユニット２０のＮ末端は、必要に応じてペプチドリンカーを介して、サイトカイン１２のＣ末端に融合される。図１Ｈおよび１Ｉは、ｐ３５サブユニットのＮ末端が、必要に応じてペプチドリンカーを介して、ｐ４０サブユニットのＣ末端に融合される、ＩＬ−１２の別の単鎖バージョンを含む融合タンパク質３４および３６を示す。融合タンパク質３４（図１Ｈに示される）において、サイトカイン１２のＮ末端は、ｐ３５サブユニット２０のＣ末端に融合される。融合タンパク質３６（図１Ｉに示される）において、ｐ４０サブユニット１８のＮ末端は、サイトカイン１２のＣ末端に融合される。大いに好ましい実施形態では、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２に融合される。
【００５２】
このような分子の生成は、さらに実施例において例示される。
【００５３】
ヘテロ多量体分子（例えば、ＩＬ−１２または抗体）を、非同一のサブユニットが、短いアミノ酸リンカーによって連結される単鎖分子として発現することは、しばしば、都合がよい［Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９；Ｌｉｅｓｃｈｋｅら（１９９７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：３５；Ｌｉｅｓｃｈｋｅ；Ｇ．Ｊ．およびＭｕｌｌｉｇａｎ；Ｒ．Ｃ．、米国特許第５，８９１，６８０号］。遺伝子融合が構築され、次いで、単一の組換えＤＮＡ構築物を含む細胞中で、所望のタンパク質が発現され得る。このようなヘテロ多量体サイトカインの単鎖バージョンは、さらに、第２のサイトカインに融合され得、これは、さらに、単一の組換えＤＮＡ構築物から発現される所望の活性を有する融合タンパク質を可能にする。このような分子の発現は、実施例で例示される。
【００５４】
本発明はまた、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む融合タンパク質を記載する。この組み合わせは、樹状細胞によって提示される抗原を機能的に刺激する際に、特に有用である。別の有用な融合体は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を含む。これらの両方のサイトカインは、Ｔｈ１応答を促進するが、いくらか異なった相補的な活性を有する。
【００５５】
本発明はまた、多数の別個の融合サイトカインが、多量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得るタンパク質にさらに融合される融合タンパク質を記載する。このような分子の利点は、１つ以上のサイトカインの効力が、二量体化によって、増強され得るということである。いくつかの場合では、このサイトカインが二量体としてそのレセプターに結合するので、二量体化による効力の増強が発生し得る。１つの実施形態では、複合サイトカインは、抗体分子の一部（例えば、Ｆｃ領域）に融合される（図２）。別の実施形態では、ＩＬ−１２および第２のサイトカインは、ホモ二量体化タンパク質部分に融合される。好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。この融合タンパク質は、種々の方法によって作製され得、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までのいくつかの別個のタンパク質部分の全ての多様な順序を反映する。例えば、インターロイキン１２および第２のサイトカインが、Ｆｃ領域に融合される場合、この２つのサイトカインは、両方とも、このＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に対して任意の順序で融合されるかもしれないし、または、一方のサイトカインが、Ｎ末端に融合され、他方がＣ末端に融合されるかもしれない。
【００５６】
これらの順列のいくつかは、図２に例示される。例えば、図２Ａに示される実施形態では、本発明の融合タンパク質４４は、ヒンジ領域３８、ＣＨ２領域４０およびＣＨ３領域４２を含むＦｃ領域のＣ末端に融合される。融合タンパク質４４は、種々の構造を有し得、例えば、図１Ａ〜１Ｉに示される融合タンパク質１０、１６、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６の構造が挙げられる。融合タンパク質４４が、１つより多くのＮ末端およびＣ末端を有する場合（融合タンパク質１６、２４、２６、および２８におけるように）、Ｆｃ領域は、融合タンパク質４４のいずれかのＮ末端に融合され得る。図２Ｂに示されるように、融合タンパク質４４は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合され得る。図２Ｃに示される実施形態では、第１のサイトカイン１２は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合され得、そして、第２のサイトカイン１４は、このＦｃ領域のＣ末端に融合され得る。
【００５７】
（構造的考慮）
サイトカイン（タンパク質の１クラスとしての）は、サイズおよび一般的な折り畳み特性において、類似していることに注意するのは重要である。従って、本明細書中で開示される特定の実施例は、サイトカインタンパク質のファミリーについての複合サイトカイン融合タンパク質をどのように構築するかを例示する。例えば、多くのサイトカインは、「４つのへリックス束」と呼ばれるタンパク質折り畳みクラスに分類される。４つのへリックス束タンパク質としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、エリトロポイエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、ＩＬ−１０、インターフェロン−β、インターフェロン−αおよび密接に関連したインターフェロンτ、ならびにインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。
【００５８】
ＩＬ−５およびＩＮＦ−γを除き、これらのタンパク質の全ては、４つのおおよそ平行なαへリックスおよび２つのクロスオーバー連結を使用して、モノマーとして折り畳まれる。ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを除くそれぞれの場合に、Ｎ末端およびＣ末端は、タンパク質の同じ面上に存在する。４つのへリックス束のタンパク質（ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを除く）は、同じ折り畳みパターンを有するので、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦについて本明細書中に記載される方法はまた、他の４つのへリックス束タンパク質およびモノマーとして折り畳まれる他の小サイトカインタンパク質に適用される。
【００５９】
ケモカインは、細胞外勾配を形成し、そして、免疫細胞の特定のクラスの走化性を媒介すると考えられるサイトカインの特定のクラスである。例えば、ＭＣＰ−１は、単球、マクロファージ、および活性化Ｔ細胞についての化学誘引物質であり；エオタキシンは、好酸球についての化学誘引物質であり；そして、インターロイキン８は、好中球についての化学誘引物質である。これらの化学誘引物質機能に加えて、ケモカインは、他のサイトカインのように、特定の標的細胞における特定の遺伝子の発現を誘導し得る。例えば、ＭＣＰ−１は、血管の平滑筋細胞における組織因子の発現を誘導すると考えられている（Ｓｃｈｅｃｔｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．［１９９７］２７２：２８５６８−７３）。
【００６０】
本発明は、１つ以上のサイトカインがケモカインである、サイトカイン−サイトカイン融合体および抗体−サイトカイン−サイトカイン融合体を開示する。本発明はまた、３つ以上のサイトカインを有するタンパク質構築物を開示し、ここで、１つ以上のサイトカインがケモカインである。例えば、ケモカインＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、マクロファージ化学誘引物質タンパク質、エオタキシン、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＢＬＣは、抗体部分のような他の部分を有するかまたは有さない第２のサイトカインに融合され得る。
【００６１】
例えば、ヒトゲノムは、少なくとも５０のケモカインをコードする。公知のケモカインは、概して、類似の３次元モノマー構造およびタンパク質折り畳みパターンを共有する。従って、本明細書中に開示されるタンパク質構築物および構築ストラテジーの一般的な形態は、種々の公知のケモカインまたは未だ発見されていないケモカインに対して適用され得る。
【００６２】
ケモカインは、３つのβ鎖および１つのαへリックスを有する別個の折り畳みパターンを有する。ケモカインは、モノマーのように折り畳み、次いで、全てではないがいくつかの場合で、折り畳み後、二量体化する。全てのケモカインについて、モノマーサブユニットの折り畳みパターンは、同一であって、そして、全体の構造は、極めて類似している。例えば、インターロイキン−８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質、ＭＩＰ、ＲＡＮＴＥＳ（活性化の際にレギュレートされ、正常なＴ細胞が発現および分泌される）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１、ＭＣＡＦ）、エオタキシン、単球化学誘引物質タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、フラクタルカイン（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）のケモカインドメイン、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−２、ケモカインｈｃｃ−２（マクロファージ炎症性タンパク質−５）、Ｇｒｏ β、サイトカイン誘導性好中球化学誘引物質およびＣＩＮＣ／Ｇｒｏの三次元構造は、Ｘ線結晶学および／またはＮＭＲ法によって決定されている；これらの構造の全ては、同一の折り畳みを示し、そして、一般的に類似している。これらのケモカインは、同一の折り畳みパターンを有しているので、リンホタクチンについて本明細書中で使用される方法はまた、他のケモカインタンパク質にも適用される。
【００６３】
ケモカインの遊離Ｎ末端は、しばしば、その機能について重要である。従って、第２のサイトカイン、抗体部分、または他のタンパク質部分が、このケモカインのＣ末端に融合され得る融合体を構築することは、いくつかの実施形態において有利である。２つの活性なケモカインを含むタンパク質複合体を構築するために、例えば、２つの異なったケモカインを、抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に融合することは有用である。いくつかのケモカイン（例えば、ＩＬ−８）は、生理学的条件下で、二量体である。特定の適用のために、複合サイトカイン抗体融合体（例えば、ＩＬ−８−抗体−サイトカイン融合体）を、融合していないＩＬ−８部分または抗体部分と相互作用しない異なった融合パートナーを有するＩＬ−８部分と共に、同時発現することは有用である。この方法では、異なったＩＬ−８部分は、全てのＩＬ−８部分が抗体鎖に融合された場合に生じ得る空間的束縛または重合なしで、ヘテロ二量体化し得る。次いで、この所望の複合サイトカイン融合タンパク質は、サイズに基づいてかまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａ タンパク質のような抗体結合タンパク質への結合に基づいて、分離され得る。
【００６４】
１つのケモカインを含む複合サイトカイン融合タンパク質については、この融合タンパク質がまた、局在化機能（例えば、抗原に結合する抗体部分）を含む実施形態が、好ましい実施形態である。理論により束縛されることを望まないが、身体へのケモカインの広範な分布は、何も効果を有さないか、またはそのケモカインに対する細胞の一般的な脱感作を導くことが、一般的に考えられている。さらに、ケモカインの化学誘引剤機能は、そのケモカインの濃度差異が存在する場合にのみ、顕著であり得ると考えられている。
【００６５】
好ましい実施形態は、リンホカイン−抗体−インターロイキン−２融合タンパク質である。別の好ましい実施形態は、ケモカインおよび第２のサイトカインの両方が、Ｔｈ１応答を促進する、実施形態である。例えば、ＩＰ−１０およびＩＬ−１２を含む融合タンパク質は、１つの非常に好ましい実施形態である。
【００６６】
（短い血清半減期を有する複数のサイトカインの半減期の延長）
本発明はまた、長い血清半減期を有する第３の部分に融合した、２つのサイトカイン（両方が短い血清半減期を有する）を含む融合タンパク質を記載する。例えば、樹状細胞の刺激が所望である場合には、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの活性を組み合わせることが、有用である（Ｔｈｕｒｎｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ［１９９９］２２３：１−１５；Ｐａｌｕｃｋａら、［１９９８］Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４５８７−４５９５）。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの両方は、短い血清半減期を有する低分子であるので、Ｆｃ領域、ＩＬ−４、およびＧＭ−ＣＳＦを含む融合タンパク質を構築することが、有用である。得られる分子は、樹状細胞の増殖および活性の強力な刺激剤である。同様に、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの両方は、所定の抗原を発現する細胞の部位に対する、組み合わせられたサイトカイン活性を誘導する目的で、抗体のような標的成分に融合され得る。
【００６７】
Ｆｃ領域は、単独でかまたはインタクトな抗体の一部として、複合サイトカイン融合体に、特定の適用に依存して、有利であり得るかまたは不利であり得るいくつかの特性を与え得る。これらの特性としては、二量化、血清半減期の延長、相補体を固定する能力、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力、およびＦｃレセプターへの結合が挙げられる。血清半減期の延長が、主として望ましい特徴であり、そしてＦｃ領域の免疫学的特性が重要ではないかまたは所望ではない場合には、天然の改変体であるかまたは１つ以上の免疫学的特性を欠く変異体である、Ｆｃ領域を使用することが、好ましい。例えば、短い血清半減期を有する２つ以上のサイトカインの血清半減期を等しくし、そして延長することが望ましい場合には、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４（これらはそれぞれ、Ｆｃレセプターに対する親和性が減少しているかまたは有さない）由来のＦｃ領域を含む複合サイトカイン融合タンパク質を構築すること、あるいはＦｃレセプター結合部位において変異を有するＦｃ領域を使用することが、好ましい。実際に、いくつかのサイトカインが抗体に融合することによって、この融合タンパク質のＦｃレセプターに対する親和性が増加すること、およびこのことによって、動物におけるクリアランスの速度がより速くなることが、既に示されている。Ｆｃレセプターに対する親和性が減少したＦｃ領域を使用することは、これらの分子の血清半減期を大いに改善することが示された（Ｇｉｌｌｉｅｓら、［１９９９］Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２１５９−２１６６）。いくつかの状況下において、そして使用されるサイトカインに依存して、Ｆｃレセプターに結合するＦｃ領域は、複合サイトカイン融合タンパク質のインターナリゼーション、および１以上のサイトカイン部分の分解を生じる。
【００６８】
（標的化）
本発明はまた、２つ以上のサイトカインが、これらのサイトカインを特定の標的分子、細胞、または身体位置に局在化させ得るタンパク質に付着した、融合タンパク質を記載する。局在化能力を有する好ましい分子は、抗体、または抗体の抗原結合可変領域を含む部分である。しかし、他の局在化分子（またはそのドメイン）が使用され得る（例えば、特定のリガンドまたはレセプター、天然に存在する結合タンパク質、特定の基質に結合する酵素、特定の結合能力または局在化能力に関して選択された人工的に生成したペプチド、標的化能力を生じる別の物理化学的特性を有するペプチド、標的化される別の分子に結合することによって標的化能力を有するタンパク質、あるいは他の型のタンパク質）。２つのサイトカインを標的化分子に融合させる場合には、好ましい第１のサイトカインは、ＩＬ−１２である。ＩＬ−１２が使用される場合には、好ましい第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００６９】
抗体の場合には、２つ以上のサイトカインが融合され得る多数の方法が存在する。なぜなら、いくつかの付着可能な部位が存在するからである。例えば、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。これら２つのサイトカインは、互いに融合され、次いで、この重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。あるいは、各サイトカインは、抗体分子のＮ末端またはＣ末端の１つに、別々に融合し得る。
【００７０】
図３は、２つのサイトカインが１つの抗体分子に融合し得る様式のサブセットを示す。例えば、図３Ａを参照すると、本発明の融合タンパク質４４は、免疫グロブリン重鎖４６のＣ末端に融合し得、この重鎖は、免疫グロブリン軽鎖４８に結合している。図２においてと同様に、融合タンパク質４４は、種々の構造（例えば、図１Ａ〜１Ｉに示す、融合タンパク質１０、１６、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６の構造を含む）を有し得る。図３Ｂに示すように、融合タンパク質４４は、免疫グロブリン軽鎖４８に結合した免疫グロブリン重鎖４６のＮ末端に、融合し得る。図３Ｃおよび３Ｄに示す実施形態においては、融合タンパク質４４は、免疫グロブリン重鎖４６に結合した免疫グロブリン軽鎖４８のＮ末端（図３Ｃ）またはＣ末端（図３Ｄ）に融合する。図３Ｅおよび３Ｆに示すように、第１のサイトカイン１２は、第２のサイトカイン１４に融合した免疫グロブリン重鎖４６に結合した、免疫グロブリン軽鎖４８に融合し得る。サイトカイン１２および１４は、免疫グロブリン鎖のＮ末端（図３Ｅ）またはＣ末端（図３Ｆ）に融合し得る。あるいは、図３Ｇにおいてと同様に、第１のサイトカイン１２は、免疫グロブリン軽鎖４８のＮ末端に融合し得、一方で第２のサイトカイン１４は、免疫グロブリン重鎖４６のＣ末端に融合する。
【００７１】
（単鎖抗体への融合）
抗体を単鎖分子として表すことが、時々好都合である。本発明はまた、２つ以上のサイトカインが単鎖抗体に融合した、融合タンパク質を提供する。これは、所望の融合タンパク質を発現させる場合に使用されるＤＮＡ構築物の数を減少させるという利点を有し、このことは、遺伝子治療において特に有用であり得る。特に、サイトカインが単鎖分子である場合には、これらのサイトカインの、単鎖抗体への融合は、融合タンパク質が単一のタンパク質鎖として発現することを可能にする。
【００７２】
図４Ａ〜４Ｃに示されるように、いくつかの実施形態において、サイトカインは、単鎖抗体に、そのＮ末端、そのＣ末端、または両方の末端において、融合し得る。例えば、図４Ａに示すように、融合タンパク質４４は、軽鎖可変領域５２および重鎖可変領域５４を有する単鎖抗体５０のＣ末端に融合し得る。図４Ｂに示すように、融合タンパク質４４はまた、単鎖抗体５０のＮ末端に融合し得る。図４Ｃに示す実施形態においては、第１のサイトカイン１２は、単鎖抗体５０のＮ末端に融合し、そして第２のサイトカイン１４は、単鎖抗体５０のＣ末端に融合する。
【００７３】
好ましい実施形態は、ＩＬ−１２および単鎖抗体に対する第２のサイトカインの融合体を含む。より好ましい実施形態は、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦを、第２のサイトカインとして含む。
【００７４】
抗体の定常領域は、種々のエフェクター機能を媒介する可能性を有する。例えば、ＩｇＧ１は、相補体の結合、ＡＤＣＣ，およびＦｃレセプターへの結合を媒介する。サイトカインが融合する位置は、抗体定常領域のエフェクター機能を変化させ得、このことは、これらのエフェクター機能の改変が所望である場合に、有用である。
【００７５】
いくつかの場合においては、２つ以上のサイトカインの、抗体の標的化領域を有するが定常領域を有さない部分への融合体を構築することが、望ましくあり得る。このような融合タンパク質は、２つ以上のサイトカインへの完全抗体の融合体より小さく、このことは、特定の目的において有利であり得る。さらに、このような融合タンパク質は、インタクトな抗体の１つ以上のエフェクター機能を欠くが、抗体の標的化能力を維持する。
【００７６】
従って、本発明は、２つ以上のサイトカインが１つの単鎖Ｆｖ領域に融合した、融合タンパク質を特徴とする。図５Ａ〜５Ｃに図示する実施形態に示すように、２つのサイトカインが、Ｆｖ領域のＮ末端もしくはＣ末端に融合され得るか、または１つのサイトカインが各末端に融合され得る。例えば、図５Ａに示すように、本発明の融合タンパク質４４は、免疫グロブリン軽鎖可変領域５２および免疫グロブリン重鎖可変領域５４を含む、単鎖Ｆｖ領域のＣ末端に融合され得る。融合タンパク質４４はまた、図５Ｂに示すように、Ｆｖ領域のＮ末端に融合され得る。図５Ｃに示すように、第１のサイトカイン１２がＦｖ領域のＮ末端に融合し得、そして第２のサイトカイン１４がＦｖ領域のＣ末端に融合し得る。
【００７７】
（複数のサイトカインのためのヘテロ二量体ビヒクルとしての抗体）
いくつかの状況において、サイトカインの２つに関してタンパク質の同一の末端が活性のために必須である、２つ以上のサイトカインの融合体を構築することが、望ましい。例えば、２つの異なるサイトカインの天然に存在するＮ末端が、各サイトカインの活性のために必須であり得る。両方のサイトカイン部分が活性である単一ポリペプチド鎖融合タンパク質を構築することは、不可能である。
【００７８】
抗体とは、ジスルフィド結合によって共有結合される重鎖および軽鎖からなる、ヘテロ二量体タンパク質である。両方がインタクトな融合していないＮ末端を必要とする２つのサイトカイン部分を有する、複合サイトカイン融合タンパク質を構築することが、所望である場合には、これら２つのサイトカインを抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に別々に融合させることが、好ましい（図３Ｅ）。同様に、両方がインタクトな融合していないＣ末端を必要とする２つのサイトカイン部分を有する、複合サイトカイン融合タンパク質を構築することが所望である場合には、これら２つのサイトカインを、抗体の重鎖および軽鎖のＣ末端に別個に融合させることが、好ましい（図３Ｆ）。抗体が、２つのサイトカインをこの様式で接続するためのビヒクルとしてのみ使用される場合には、免疫機能に関連するさらなる特性を与える抗体の部分を、変異または欠失させることが、有用であり得る。例えば、Ｆａｂ領域をビヒクルとして使用することは、好ましくあり得る。なぜなら、Ｆａｂ領域は、抗体のヘテロ二量化特性を維持するが、Ｆｃ領域に特徴的な機能を欠くからである。抗原結合部位が非機能的である抗体または抗体フラグメントを使用することもまた、有用であり得る。
【００７９】
抗体への複数のサイトカインの融合は、本発明の新規特徴の多くを組み合わせる。抗体−複合サイトカイン融合体において、これらのサイトカインの血清半減期は、等しくされ、そして延長される；両方のサイトカインの活性は、標的に局在化され、そして特に毒性の効果は、複数の相乗的に作用するサイトカインの全身投与に起因して、回避される；各サイトカインは、効果的に二量化または多量体化される；そしてこれらのサイトカインは、必ずしも直接的に融合される必要はなく、抗体分子の重鎖および軽鎖の異なる部位に融合され得る。
【００８０】
複数のサイトカインおよび１つの抗体を含む融合タンパク質を設計する際には、多数の選択肢および構造が存在し、これらは、慣用的な実験によって区別され得る。構造的生物学的考慮もまた、有用である。例えば、多くのサイトカインは、４ヘリックス束と称されるクラスに入る。これらの構造は、４つのαヘリックスからなり、そして同じ接近のＮ末端およびＣ末端を有する。一般に、Ｎ末端およびＣ末端の周囲のサイトカインの面は、サイトカインレセプターへの結合において使用されず、従って、いずれかの末端が、抗体または第２のサイトカインへの融合のために使用され得る。しかし、４ヘリックス束のサイトカインのＮ末端およびＣ末端の両方を、異なる部分に直接融合させることは、立体的な理由により、時々困難である。２つの異なる４ヘリックス束サイトカインを抗体に融合させることが所望である場合には、従って、各サイトカインをその抗体の異なる部位に融合させることが、有用である。あるいは、Ｉｇ鎖−サイトカイン−サイトカインの形態のポリペプチド鎖を構築することが必要である場合には、１つ以上の可撓性リンカーを使用して、立体の問題を克服し得る。
【００８１】
抗体の代わりに、他の分泌ヘテロ二量体分子を使用して、複数のサイトカインを保有することもまた、可能である。例えば、前立腺特異的抗原およびこれが複合体化するプロテアーゼインヒビター、ＩｇＡ重鎖およびＪ鎖、ＴＧＦ−βファミリーメンバーならびにこれらのアスタシン様結合パートナーを含む複合体、またはＩＬ−１２が、使用され得る。
【００８２】
（核酸）
本発明はまた、上記型のタンパク質の各々を発現し得る核酸を特徴とする。これらとしては、２つ以上のサイトカインを含む融合タンパク質をコードする核酸、２つ以上のサイトカインおよび１つの二量化ドメイン（例えば、Ｆｃ領域）を含む融合体、１つの抗体に融合した２つ以上のサイトカインを含む融合体、ならびに１つのＦｖ領域に融合した２つ以上のサイトカインが挙げられる。これらの核酸の好ましい形態は、ＤＮＡベクターであり、これから、融合タンパク質が、細菌細胞または哺乳動物細胞のいずれかにおいて、発現され得る。複数のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質については、１つより多くのコード核酸が使用され得る。あるいは、２つ以上の融合タンパク質コード配列を、単一の核酸分子上に位置させることが、有用であり得る。これらの例は、複数のサイトカインをコードする特徴付けられた核酸の特定の形態を示す。
【００８３】
本発明の核酸は、複合サイトカイン融合タンパク質の生成のためかまたは遺伝子治療の目的のためかのいずれかで、複合サイトカイン融合タンパク質の発現のために特に有用である。
【００８４】
本発明の有用な実施形態を合成するための方法、ならびにこれらの薬理学的活性を試験するために有用なアッセイは、実施例に記載される。
【００８５】
本発明はまた、薬学的組成物、ならびに広範な種々の疾患の処置および予防（種々の感染および癌の処置、ならびに種々の疾患に対するワクチン接種が挙げられるがこれらに限定されない）におけるこれらの使用の方法を提供する。
【００８６】
複合サイトカイン融合タンパク質を使用して、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染、またはウイルス感染、あるいは癌を処置し得る。例えば、ＩＬ−１２は、多くの型の感染（細菌Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；寄生虫Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ、およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ；真菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ；ならびにウイルスの脈絡髄膜炎ウイルスおよびサイトメガロウイルスによる感染が挙げられるがこれらに限定されない）において、予防的効果を有することが、公知である。サイトカインは、一般に、組み合わせで作用するので、同時に作用することが既知である２つ以上のサイトカインを含む融合タンパク質を使用することは、しばしば有用である。例えば、ＩＬ−２は、ＩＬ−１２の効果と相乗するので、これらのサイトカインを、細菌、寄生虫、真菌およびウイルスによる疾患の処置において組み合わせることは、有用である。
【００８７】
感染性疾患の処置の好ましい方法は、複数のサイトカインを感染の部位に配置する標的化剤にさらに融合した、複合サイトカイン融合タンパク質を使用することである。種々の標的化ストラテジーを、以下に記載する。
【００８８】
本発明の薬学的組成物は、固体、半固体、または液体の投薬形態（例えば、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤などのような）の形態で、好ましくは、正確な投薬量の投与に適した単位投薬形態で、使用され得る。これらの組成物は、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤を含有し、そしてさらに、他の医薬、薬学的薬剤、キャリア、アジュバントなどを含有し得る。このような賦形剤は、他のタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿タンパク質）を含有し得る。このような投薬形態を調製する実際の方法は、公知であるか、または当業者に明らかである。投与される組成物または処方物は、いずれの場合においても、特定の量の活性成分を、処置されている被験体において所望の効果を達成するに有効な量で含有する。
【００８９】
本明細書の組成物の投与は、このような活性を示す薬剤のための投与の受容可能な形態のいずれかにより得る。これらの方法としては、経口投与、非経口投与、または局所投与および他の全身形態が挙げられる。注射は、投与の好ましい方法である。
【００９０】
投与される活性化合物の量は、もちろん、処置されている被験体、苦痛の重篤度、投与の様式、および処方する医師の判断に依存する。
【００９１】
上記のように、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびその他のようなサイトカインは、癌の処置について調査されている。いくつかの状況下においては、癌の処置において、複合サイトカイン融合タンパク質を使用することが有利である。この理由は、より単純な投与、成分サイトカインの１つの増加した血清半減期、および／または２つのサイトカインの相対的活性の優れた調節である。
【００９２】
癌の処置の好ましい方法は、サイトカインの効果が濃縮され得るように、そして全身分布の副作用が回避され得るように、サイトカインを特定の器官または組織に標的化することである。例えば、複数のサイトカインの、Ｆｃ領域への融合体は、肝臓に濃縮されることが予測され、このことは、肝臓に制限される癌を処置する際に、有用であり得る。より好ましい方法は、抗体のような標的化剤にさらに融合された、複合サイトカイン融合タンパク質を使用することである。特に、抗体ＫＳ−１／４および１４．１８は、腫瘍特異的抗原に指向される（Ｖａｒｋｉ ＮＭら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ［１９８４］４４：６８１−７；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１［１９８９］；米国特許第４，９７５，３６９号および同第５，６５０，１５０号）。抗体−複合サイトカイン融合体を使用する場合には、腫瘍の型を調査し、そしてその型の腫瘍に存在しやすい抗原に指向される抗体を選択することが、しばしば有用である。例えば、腫瘍を、ＦＡＣＳ分析、ウェスタンブロット、腫瘍のＤＮＡの試験、または腫瘍細胞の型を単に同定することによって、腫瘍を特徴付けることが、有用であり得る。腫瘍の特徴付けのこのような方法は、腫瘍の特徴付けの当業者（例えば、腫瘍遺伝子学者および腫瘍生物学者）に周知である。複合サイトカイン融合タンパク質を、種々の他の手段（例えば、特定のリガンドまたはレセプター部分への融合、予め選択された結合活性を有するペプチドアプタマーへの融合、局在化特性を有する低分子への化学的結合体化など）によって標的化することもまた、可能である。これらの標的化方法はまた、他の疾患（例えば、感染）の処置のために、使用され得る。
【００９３】
（癌および他の細胞疾患の、遺伝子治療による処置）
本発明の核酸は、癌、および免疫系を特定の細胞型に標的化することが所望である他の疾患の処置のための遺伝子治療剤として、使用され得る。例えば、癌細胞がヒトまたは動物から取り出され、複合サイトカイン融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸がこれらの癌細胞にトランスフェクトされ、次いで、これらの癌細胞がヒトまたは動物に再導入される。あるいは、ＤＮＡが、癌細胞にインサイチュで導入され得る。次いで、このヒトまたは動物は、これらの癌細胞に対する免疫応答を増加させ、このことは、この癌を治癒またはこの癌の重篤度を低下させ得る。哺乳動物細胞における発現を促進するために適切な調節エレメントに結合された、複合サイトカイン遺伝子融合体が、種々の技術（リン酸カルシウム法、「遺伝子銃」、アデノウイルスベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルスベクター、または他の任意の効率的なトランスフェクション方法が挙げられる）のいずれかによって、癌細胞にトランスフェクトされ得る。この核酸は、他の部分にさらに融合された複合サイトカイン融合タンパク質を、コードし得る。
【００９４】
１つより多くの融合サイトカインの融合体を発現する核酸を用いた抗癌遺伝子治療を、融合サイトカイン蛋白質の免疫刺激特性を増大させうる処置などの他の癌治療と組み合わせて行いうる。例えば、本発明核酸は、癌細胞で発現される抗原に対する免疫応答を促進しうる他の蛋白質部分を発現すること、または、そのような蛋白質部分を発現する他の核酸と同時トランスフェクションすることも可能である。特に、Ｂ７副刺激表面蛋白質を発現する核酸を癌細胞に共にトランスフェクションしうる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、米国特許第５，７３８，８５２号）。複合サイトカイン融合を発現する核酸を用いた癌細胞のトランスフェクションはまた、癌細胞を標的とする抗体または免疫サイトカインを用いた処置とともに行われうる（Ｌｏｄｅら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：２４７５）。複合サイトカイン融合蛋白質を発現する核酸を用いた癌細胞のトランスフェクションはまた、血管新生ブロッカーを用いた処置とともに行われうる（Ｌｏｄｅら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９：１５９１）。
【００９５】
付加的な免疫刺激剤および／または血管新生ブロッカーを用いた治療もまた、複合サイトカイン融合蛋白質を用いた全身的治療と組み合わせうる。付加的免疫刺激剤または血管新生ブロッカーを併用した治療の長所は、これらの治療がＤＮＡに損傷を与える薬剤および細胞周期ブロッカーとは異なり、複合サイトカイン融合蛋白質による刺激の結果分裂しうる免疫細胞を殺傷しないということである。
【００９６】
この遺伝子治療方法の好適な実施態様は、ＩＬ−１２および第２のサイトカインをコードする一つ以上の核酸を癌細胞へ導入し、次にその癌細胞をヒトまたは動物へ再導入するということである。第二のサイトカインは、好適には、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００９７】
アジュバントとして融合させた二つ以上のサイトカインを用い、ワクチンを与えられた宿主哺乳類においてある一定の病原体に対して保護的な細胞性免疫応答を誘導することを目的とした新規ワクチン組成およびワクチンの活性賦活方法が、本発明により提供される。例えば、Ｔｈ１免疫応答を所望する場合、複合Ｔｈ−１促進サイトカインを融合させることが可能であり、その結果得られた融合蛋白質を抗原と組み合わせて動物に投与しうる。
【００９８】
特に、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を融合させ、抗原とともに投与しうる。あるいは、ＩＬ−１２およびＩＬ−２をさらに抗原性蛋白質そのものと融合させ、免疫応答に刺激を与えるために使用しうる。この場合、本発明は、宿主細胞性免疫に依存したワクチンに向けられる。つまり、特定の病原性の感染に対する防御反応を引き起こすために細胞傷害性Ｔリンパ球および活性化食細胞を誘導するということである。ＩＬ−１２、ＩＬ−２および抗原という組み合わせは抗原に対するＴｈ１応答を標的としているため、ＩＬ−１２、ＩＬ−２および抗原を含む融合蛋白質を用いたワクチン投与を行うことは特に有用である。ヒトにおいて使用されている、ミョウバンのような、従来のアジュバントは、Ｔｈ２応答を誘導する傾向がある。
【００９９】
Ｔｈ２免疫応答が所望される場合、Ｔｈ−２促進サイトカインの組み合わせを融合させて使用しうる。例えば、単一分子を形成させるために、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を融合させ、その結果得られた融合蛋白質をアジュバントとして使用することは有用でありうる。特に、動物において樹状細胞を補給することが所望される場合、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの組み合わせを融合させたものを、さらに抗原提示細胞との結合を促進するためにＦｃ領域と融合させうる、または、さらに融合サイトカインを腫瘍などの標的細胞へ向けることを可能とする抗体と融合させうる。
【０１００】
本発明はまた、新規治療組成物および、癌細胞上に生じうる選択抗原を含みうる、いわゆる「癌ワクチン」を含む所定の治療組成物との相乗効果をもたらすことを意図した免疫活性賦活方法を提供する。例えば、二つ以上の融合サイトカインを含む蛋白質を直接、適切な経路により、適切に処置された癌細胞とともに投与しうる。
【実施例】
【０１０１】
（実施例）
（実施例１：サイトカイン−サイトカイン融合蛋白質発現を可能とする遺伝子融合体の構築）
複数のサイトカインを持つ多機能蛋白質を得るために、ＩＬ−１２のｐ４０とＩＬ−２との間、およびＩＬ−１２のｐ４０とＧＭ−ＣＳＦとの間の遺伝子融合体を合成した。さらに、成熟マウスｐ３５（配列番号１）のコード配列を、高レベル発現および効率の良い分泌を可能にするプロモーターおよびリーダー配列と融合させた。マウスｐ４０−ＩＬ−２およびｐ４０−ＧＭ−ＣＳＦのコード配列を、それぞれ、配列番号２、配列番号３にて示す。ヒトｐ４０−ＩＬ−２融合体もまた構築した（配列番号４）。ＩｇＧ２ａのマウスＦｃ領域とマウスｐ３５との融合体（配列番号５）および、ＩｇＧ１のヒトＦｃ領域とヒトｐ３５との融合体（配列番号６）を、以前に開示されている発現プラスミド（Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１１：４９５−５００（１９９８）；Ｌｏら、米国特許第５，７２６，０８７号）を用いて構築した。
【０１０２】
成熟マウスおよびヒトｐ３５とＫＳ−１／４抗体重鎖のＣ末端との融合について、Ｇｉｌｌｉｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６０：６１９５−６２０３）により記述されている。成熟マウスおよびヒトｐ３５と１４．１８抗体重鎖のＣ−末端との融合体を類似の方法により構築した（ＰＣＴ 国際公開第ＷＯ９９／２９７３２）。
【０１０３】
ｐ４０とＩＬ−２を融合させること、およびｐ４０とＧＭ−ＣＳＦを融合させることを目的としてここで論じている種類の方法は、一般的に二つ以上のサイトカインの融合に対して適用可能である。特に、Ｃ−末端部分はシグナル配列を必要としない一方、殆どのＮ−末端部分のコード配列には分泌のシグナル配列が含まれている。ある環境下において、二つのサイトカインのコード配列間に、好適には、１０−１５アミノ酸長で、グリシンおよびセリンリッチである短いペプチド性リンカーに対するコード配列を配置することは有用でありうる。全てのそのような種類の融合体作製に関連するＤＮＡ操作は、当該分野の技術の範囲内である。
【０１０４】
例えば、マウスＩＬ−１２ ｐ４０サブユニットおよびマウスＩＬ−２間の融合体構築の詳細は、次に示すものであった。マウスＩＬ−１２のｐ４０サブユニットの全長ｃＤＮＡを、コンカナバリン Ａ（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ Ａ）（培養液中に５μｇ／ｍｌの濃度で、３日間）で活性化されたマウス脾臓細胞からＰＣＲによりクローニングした。フォワードプライマーの配列は、ＡＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＡ ＡＣＣ（配列番号７）で、ＮｈｅＩ部位であるＧＣＴＡＧＣ（配列番号７の第３−８残基）を、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に置いたものであった。リバースプライマーの配列は、ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＧＧＡ ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＧ（配列番号８）で、ＸｈｏＩ部位であるＣＴＣＧＡＧ（配列番号８の第１−６残基）を、翻訳停止コドンＴＡＧ（アンチコドンＣＴＡ）のすぐ下流に置いたものであった。配列確認後、そのネイティブのリーダーとともにｍｕ−ｐ４０を含むＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ消化した発現ベクターｐｄＣｓ（Ｌｏら、（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００）にライゲーションした。ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限部位は、一致する粘着末端を持ち、また、ｍｕ−ｐ４０は内部ＸｂａＩ部位を持つので、ＮｈｅＩ部位をｍｕ−ｐ４０のクローニングのために使用した。
【０１０５】
ｍｕ−ｐ４０−ｍｕＩＬ−２をコードするＤＮＡを構築するために、ｍｕ−ｐ４０ＤＮＡを、そのＰｓｔＩ部位（Ｃ ＴＧＣ ＡＧ）を経由して成熟マウスＩＬ−２のｃＤＮＡを含むＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片とつなぐため、オリゴヌクレオチドリンカーを用いた。融合蛋白質の連結部位のＤＮＡ配列は、Ｃ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＧＡ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＣＣ（配列番号９）で、その中のＣ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号９の第１−６残基）はＰｓｔＩ部位であり、Ｃ ＣＣＧ ＧＧ（配列番号９の第１５−２０残基）はＳｍａＩ部位で、ＴＣＣはマウスｐ４０のＣ−末端アミノ酸残基、ＧＣＡは成熟マウスＩＬ−２のＮ−末端残基であった。
【０１０６】
単鎖ｍｕＩＬ１２−ｍｕＧＭＣＳＦをコードするＤＮＡは、前記単鎖ｍｕＩＬ１２−ｍｕＩＬ２をコードするＤＮＡ構築物に由来し、ｍｕＩＬ２ｃＤＮＡをＳｍａＩ部位でｍｕＧＭＣＳＦ ｃＤＮＡに置き換えることによって構築したものであった。単鎖ｍｕＩＬ１２およびｍｕＧＭＣＳＦの連結部のＤＮＡ配列は、Ｃ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＧＡ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＡ（配列番号１０）であり、Ｃ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号１０の第１−６残基）はＰｓｔＩ部位であり、Ｃ ＣＣＧ ＧＧ（配列番号１０の第１７−２２残基）はＳｍａＩ部位、ＴＣＣはマウスｐ４０のＣ−末端アミノ酸残基、ＧＣＡは成熟マウスＧＭＣＳＦのＮ−末端残基であった。
【０１０７】
（実施例２：ＩＬ−１２融合蛋白質の発現）
ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質を次のように発現させた。ｐ４０融合体をコードする個々のベクターおよびｐ３５を含む蛋白質をコードするベクターの異なる組み合わせを、一時的に融合蛋白質を発現させるためにヒト２９３上皮癌細胞へ同時トランスフェクションした。調製済みキット（Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡを精製し、滅菌するためにエタノール沈殿を行ない、滅菌水で再懸濁した。
【０１０８】
生物学的に活性のあるＩＬ−１２融合蛋白質ヘテロ二量体を発現させるために、ヒト２９３上皮癌細胞の同時トランスフェクションにより、サブユニットの融合体および非融合体をコードする個々のベクターの異なる組み合わせを一時的に発現させた。調製済みキット（Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡを精製し、滅菌するためにエタノール沈殿を行ない、滅菌水で再懸濁した。１０μｇ／ｍｌのＤＮＡ（二つのプラスミドを同時トランスフェクションする場合、それぞれを５μｇずつ含む）を用いて標準的方法によって、リン酸カルシウム沈殿を用意し、およそ７０％コンフレントになった状態で６０ｍｍプレート上にて成長している２９３培養物に、０．５ｍｌ／プレートを添加した（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。１６時間後、沈殿物を含む培地を除去し、新鮮な培地に交換した。３日後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡ、ＩＬ−１２活性の生物学的測定、または免疫沈澱法および放射性標識蛋白質のＳＤＳゲル上での分析により、トランスフェクションされた遺伝子の発現の産生について分析した。標識するために、培養第二日目に、培地を、メチオニンを含まない生育培地に交換し、35Ｓ−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）を添加した。さらに１６時間インキュベーションした後、培地を回収し、遠心（卓上遠心機で５分間、１３，０００ｒｐｍ）により清澄化し、プロテインＡセファロースビーズ（１ｍｌの培養上清に対して１０μｌのビーズ容積を含む）とともにインキュベーションを行った。室温にて１時間置いた後、遠心および１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ＮＰ−４０）を含むＰＢＳバッファーを用いて再懸濁を繰り返し、ビーズを洗浄した。最終的な沈殿物を、ＳＤＳ含有ゲルバッファーで再懸濁し、２分間煮沸した。遠心によりビーズを除去した後、上清を２等分した。一方の試料に還元剤（５％ ２−メルカプトエタノール）を添加し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに充填する前に、両試料を５分間煮沸した。電気泳動後、ゲルをＸ線フィルムに対して曝露した（オートラジオグラフィー）。
【０１０９】
次の発現プラスミドを用いたトランスフェクションを行った。すなわち、ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ＫＳ−１／４−ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０、ＫＳ−１／４−ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、１４．１８−ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ｈｕ．Ｆｃ−ｐ３５およびｈｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ＫＳ−１／４−ｈｕ．ｐ３５およびｈｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ならびに１４．１８−ｈｕ．ｐ３５およびｈｕ．ｐ４０−ＩＬ−２である。ここで、「ｍｕ」とは、マウス蛋白質を、「ｈｕ」とは、ヒト蛋白質を意味する。
【０１１０】
35Ｓ−メチオニンで細胞を代謝的に標識し、分泌された蛋白質を還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより試験したところ、それぞれの場合において高レベルの発現が観察された。成分蛋白質の分子量を基にして、還元融合蛋白質の分子量を次のように予測した。すなわち、ＩＬ−１２のｐ３５、３５ｋＤ；ＩＬ−１２のｐ４０、４０ｋＤ；ＩＬ−２、１６ｋＤ；Ｆｃ、３２ｋＤ；Ｉｇ重鎖、５５ｋＤ；およびＩｇ軽鎖、２８ｋＤと予測した。予測した分子量を有する蛋白質移動度が観察された。
【０１１１】
安定的にトランスフェクトされ、複合サイトカイン融合蛋白質を発現している細胞系列もまた分離した。ヘテロ二量体構築物の場合、ＩＬ−１２ ｐ４０−ＩＬ−２融合タンパク質コード化発現ベクターまたはＩＬ−１２ ｐ４０−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質コード化発現ベクターは、ＩＬ−１２ ｐ４０サブユニットのみに関して先に記述されている（Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５−６２０３０）ように構築された。記述されているように（Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５−６２０３０）、ｐ４０融合蛋白質を発現しているトランスフェクション細胞系列に対して、ＩＬ−１２ ｐ３５サブユニット、Ｆｃ−ｐ３５蛋白質または抗体−ｐ３５融合蛋白質発現ベクターのいずれかをコードする発現ベクターを２回トランスフェクションした。
【０１１２】
ヒトＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現している（すなわちＫＳ−ｐ３５およびｐ４０−ＩＬ−２を発現している）安定的トランスフェクション細胞培養液から上清を回収し、製造者の手順（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）に従って、プロテインＡセファロースと結合させ溶出させることにより、その産物を精製した。ＩＬ−１２およびＩＬ−２含量に関して、ＥＬＩＳＡによって精製蛋白質を解析した。その結果から、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の個々のサイトカイン含量において、質量としておよそ４倍の相違があることが示された。これはＩＬ−１２およびＩＬ−２の間の分子量に４倍の相違があることに相関する。同じように、ＥＬＩＳＡによる、ＩＬ−１２およびＩＬ−２レベルに関するヒトＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現しているトランスフェクション細胞の産物解析により、ＩＬ−１２およびＩＬ−２について同様の値が示された。従って、ＥＬＩＳＡの精度の範囲内で、測定値から、ＩＬ−１２およびＩＬ−２がおよそ１：１のモル比で産生されているであろうことが示される。Ｆｃまたは全抗体のどちらかを用いて作製されたＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合蛋白質において同様の結果を得た。
【０１１３】
（実施例３：ＩＦＮ−γ誘導解析における融合蛋白質の相乗活性）
ヒトボランティアから得た休止または分裂促進因子活性化ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）のどちらかを用いたＩＦＮ−γ誘導解析において、ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質の生物学的活性を測定した（図６）。ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１４】
健康なボランティアより、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を得て、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）勾配を用いて遠心（１７００ｒｐｍ、２０分間）し精製した。ＰＢＭＣを含む軟膜を無血清培養液（ＳＦ−ＲＰＭＩ）で５０ｍｌ容積になるように希釈し、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心により回収した。勾配遠心後、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；１０μｇ／ｍｌ）を含む、または含まない、１０％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＲＰＭＩ−１０）で、細胞密度が５ｘ１０6細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁し、加湿ＣＯ2インキュベーター中で、３７℃にて３日間培養を行った。遠心により細胞を回収し、等量のＳＦ−ＲＰＭＩで３回洗浄した後、新鮮なＲＰＭＩ−１０で再懸濁した（１ｘ１０6細胞／ｍｌ）。９６ウェルマルチプレートのウェルに、最終的な細胞数が各ウェルに１０5個になるように、一部（１００μｌ）を添加した。細胞を培養した培養液からの試験試料を新鮮な培養液で連続希釈し、９６ウェルプレートのウェルに添加した。コントロール用ウェルには、ＩＬ−１２（図６Ａ）または、市販のＩＬ−２およびＩＬ−１２の等モル混合物（図６Ｂ；Ｒ＆Ｄシステムより購入したサイトカイン）を添加した。ＣＯ2インキュベーター中で４８時間、３７℃にて、プレートのインキュベーションを行い、製造者（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ．ＵＳＡ）による説明書に従ってＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ濃度を解析するために、一部分（２０μｌ）を分取した。
【０１１５】
図６Ａにおいて、ヒトＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質の活性を、ＩＬ−１２単独の場合と比較した。その結果から、ＩＬ−１２単独の場合はＩＦＮ−γ誘導レベルが中程度であったが、その一方、ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質はＩＦＮ−γ合成を強く誘導したということが示される。ＩＬ−２もまた、ＩＦＮ−γ合成には不十分であることが知られているため、これらの結果から、ＩＬ−１２およびＩＬ−２部分が融合蛋白質中で両方とも機能的であり、また相乗的に機能するということが示される。
【０１１６】
次にＩＦＮ−γ誘導活性に関して、Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質、ＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質およびＩＬ−１２とＩＬ−２の１：１モル比混合物の活性を比較した。図６Ｂにおける結果から、Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質およびＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質が、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の等モル混合物とほぼ同程度の活性を持つことが示される。ヒト型に対して用いた、実施例１において記述した方法で構築したマウス型のＩＬ−２およびＩＬ−１２を融合蛋白質の構築に使用した場合、同様の結果が得られた。
【０１１７】
（実施例４：ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質のＩＬ−２およびＩＬ−１２生理活性）
増殖を基にした解析において、融合蛋白質におけるＩＬ−２およびＩＬ−１２の活性を遊離サイトカインと比較した。典型的なＩＬ−１２増殖解析において、マウス抗体１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２分子の活性を試験した。ボランティアよりヒトＰＢＭＣｓを得て、標準的な手順（Ｇａｔｅｌｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，Ｒ．およびＰｒｅｓｋｙ，Ｄ．Ｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）ｐｐ．６．１６．６−６．１６．１５）に従って、５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン−Ｐと共に３日間培養し、Ｈａｎｋ‘ｓＨＢＳＳで洗浄した後、１０5細胞／ウェルになるようにマイクロタイタープレートに播種した。様々な試験蛋白質存在下で、４８時間、細胞をインキュベーションし、放射性取り込みレベル測定の１０時間前に０．３μＣｉの3Ｈ−チミジンを添加した。ＩＬ−１２および、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の等モル混合物により、用量依存的に細胞への3Ｈ−チミジン取り込みが刺激され、また、１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質は、3Ｈ−チミジン取り込みに対する刺激に関してこれとほぼ同様の効果を示した。3Ｈ−チミジン取り込みに対するＩＬ−２による刺激はより高いモル濃度でしか見られなかったことから、観察された3Ｈ−チミジン取り込みに対する１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質による刺激は、主にＩＬ−１２活性によるものであるということが示された。結果を図７で示す。
【０１１８】
さらに、異なる細胞増殖解析において、標準的手順（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｓ．，Ｌｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．および、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｋ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）ｐ．６．３．１．−６．３．７）に従って、ＩＬ−２部分の生物学的活性について試験した。マウスＣＴＬＬ−２細胞系列の増殖はＩＬ−２に依存する。ＣＴＬＬ−２細胞系列はまた、ＩＬ−４にも応答して増殖しうるが、ＩＬ−１２に対しては応答しない。活発な対数増殖期におけるＣＴＬＬ−２細胞を、ＩＬ−２を含まない培地で２回洗浄し、様々な量の市販マウスＩＬ−２、マウス１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質、または市販マウスＩＬ−１２の存在下で、マイクロタイタープレートに約１ｘ１０4細胞／ウェルになるように播種し、４８時間培養した。増殖期の終わりに、ＭＴＴ／ＭＴＳ解析を用いて生存細胞数を定量した。図８にて、ＩＬ−２，ＩＬ−１２または、１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質レベルを変化させた実験を示す。これらの結果により、マウスＩＬ−１２は量を増やしても検出可能な細胞増殖刺激が見られなかった一方、マウスＩＬ−２およびマウス１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質は、増殖刺激に関してほぼ同等の効力を持つことが示される。この結果から、１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質によるＣＴＬＬ−２細胞増殖刺激がＩＬ−２部分によるもので、ＩＬ−１２部分によるものではないことが示される。
【０１１９】
（実施例５：抗体部分を伴う、および伴わない、単鎖および多重鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質の構築と発現）
一本鎖マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を、以下のように構築した。ｐ４０−ＩＬ−２コード配列融合体を、実施例１のヒトｐ４０−ＩＬ−２融合体の構築に使用したものと類似の方法によって構築した。ＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットをコードするＤＮＡを連結し、シングルコード配列を作製するために、５’末端にＸｈｏＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するリンカーをコードするＤＮＡを合成した。成熟ｐ４０−ＩＬ−２コード配列の５’末端を改変して、制限部位を導入し、次いで、このリンカーの３’末端に連結した。マウスｐ３５コード配列の３’末端を改変して、制限部位を作製し、そしてこのリンカーのＸｈｏＩ部位に連結した。実施例１に記載されるように、一本鎖のｍｕＩＬ１２およびｍｕ−ｐ４０−ｍｕＩＬ２をコードするｃＤＮＡを、ｐ４０中の好都合な制限部位を用いることによって結合させ、一本鎖ｍｕＩＬ１２−ｍｕＩＬ２をコードする第３のＤＮＡ構築物を得た。これらの工程を、必要とされる場合、種々のベクターおよびＤＮＡフラグメント単離物を用いて実行した。得られたマウスｐ３５−リンカー−ｐ４０−ＩＬ−２コード領域の配列は、配列番号１１である。
【０１２０】
同時に、対応する一本鎖マウスＩＬ−１２コード配列を、対応する方法によって構築した。このコード配列は、配列番号１２である。
【０１２１】
さらに、本発明者らは、さらに、ｐ３５−リンカー−ｐ４０−ＩＬ−２のＮ末端に融合させたＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。
【０１２２】
培養された２９３細胞を、マウス一本鎖Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２およびＦｃ−ＩＬ−１２タンパク質をコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。融合タンパク質の発現を、実施例２に記載されるようにアッセイした。Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡセファロースへのこれらの結合によって精製し、そして高いレベルのＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２およびＦｃ−ＩＬ−１２が、観察された。ＳＤＳゲル上での移動からの見かけ上の分子量（Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２、１２３ｋＤ；およびＦｃ−ＩＬ−１２、１０７ｋＤ）によって推測されるように、これらのタンパク質をインタクトで合成した。
【０１２３】
実施例１に記載のＫＳ−ｓｃＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質は、２つの異なるポリペプチド鎖（ＫＳ−１／４軽鎖およびＣ末端にｓｃＩＬ１２−ＩＬ２部分を有するＫＳ−１／４重鎖）を有する四量体である。抗体分子上のいずれの部位がサイトカイン部分の付着に適しているかを調べるために、第２の融合タンパク質を構築し、これは、ＫＳ１／４抗体、ＩＬ−１２部分、およびＩＬ−２部分を、実施例１のＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２配置とは異なる配置であった。この第２のタンパク質は、四量体であり、そして２つの異なるポリペプチドからなった。一方のポリペプチドは、ＫＩＳ−１／４抗体の軽鎖から成った。他方のポリペプチドは、ＫＳ−１／４抗体の重鎖の成熟Ｎ末端に融合された一本鎖ｍｕＩＬ１２、続いてこの重鎖のカルボキシル末端のマウスＩＬ−２からなった。
【０１２４】
マウスＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードするｃＤＮＡを、コンカナバリンＡ（培養培地において５μｇ／ｍｌで３日間）で活性化されたマウス脾細胞からＰＣＲによってクローン化した。正方向プライマーは、配列：ＡＡＧＣＴＴ ＧＣＴＡＧＣＡＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＡＣ（配列番号１４）（ここで、ＨｉｎｄＩＩＩ部位であるＡＡＧＣＴＴ（配列番号１４の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置される）を有し、そして逆方向プライマーは、配列：ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＣ（配列番号１５）（ここで、ＸｈｏＩ部位であるＣＴＣＧＡＧ（配列番号１５の残基１〜６）は、翻訳終止コドンＴＧＡ（アンチコドンＴＣＡ）の下流に配置される）を有する。
【０１２５】
一本鎖ＩＬ−１２をコードするこのＤＮＡは、グリシン残基およびセリン残基に富むリンカーをコードするオリゴヌクレオチドに連結されたｍｕｐ３５ ＤＮＡ、続いてｍｕｐ４０ ＤＮＡから成る。得られた構築物は、オリゴヌクレオチド連結部に以下：
【０１２６】
【化１】
の配列を有する。ここで、Ｇ ＡＧＣ ＴＣ（配列番号１６の残基１〜６）は、マウスｐ３５翻訳終止コドンのちょうど上流のＳａｃＩ制限部位であり、ＧＣＧは、マウスｐ３５のＣ末端アミノ酸残基をコードし、ＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号１６の残基５０〜５５）は、連結を容易にするために導入されたＢａｍＨＩ制限部位であり、そしてＡＴＧは、成熟ｍｕ−ｐ４０のＮ末端残基をコードする。
【０１２７】
一本鎖ｍｕＩＬ１２−ＫＳ重鎖−ｍｕＧＭＣＳＦをコードするＤＮＡは、ｍｕｐ４０およびＫＳ重鎖の成熟Ｎ末端の連結部に、以下：
【０１２８】
【化２】
の配列を有する。ここで、ここで、Ｃ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号１８の残基１〜６）は、マウスｐ４０翻訳終止コドンのちょうど上流のＰｓｔＩ部位であり、ＴＣＣは、マウスｐ４０のＣ末端アミノ酸残基をコードし、ＣＡＧは、成熟ＫＳ重鎖のＮ末端残基をコードする。次いで、一本鎖ｍｕＩＬ１２−ＫＳ重鎖−ｍｕＩＬ２をコードする得られたＤＮＡを、ＫＳ軽鎖と共に同時発現させた。
【０１２９】
抗体分子のどの末端が融合連結の作製に利用可能であるかをさらに調べるため、そしてどのように多くの異なるポリペプチドが複合サイトカイン融合タンパク質にアセンブルされ得るかを調べるために、ＫＳ−１／４、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２を含む第３のタンパク質（すなわち、ＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２）を、発現させ、そして活性に関して試験した。この融合タンパク質は、六量体であり、そして３つの異なるポリペプチドを含む。１つのポリペプチドは、ＫＳ１／４抗体の軽鎖に融合したマウスｐ３５からなる。第２のポリペプチドは、ヒトＩＬ−２に融合したＫＳ１／４抗体の重鎖からなる（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１４２８）、そして第３のポリペプチドは、マウスｐ４０である。発現の際、２つの軽鎖および２つの重鎖が、ジスルフィド結合して、四量体の抗体−サイトカイン構造を形成する。さらに、軽鎖のＮ末端におけるｐ３５もまた、ｐ４０とジスルフィド結合する。
【０１３０】
ｍｕｐ３５−ＫＳ軽鎖をコードするＤＮＡは、その連結部に以下：
【０１３１】
【化３】
の配列を有する。ここで、Ｇ ＡＧＣ ＴＣ（配列番号２０の残基１〜６）は、マウスｐ３５翻訳終止コドンのすぐ上流のＳａｃＩ制限部位であり、ＧＣＧは、マウスｐ３５のＣ末端アミノ酸残基をコードし、ＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号２０の残基５０〜５５）は、連結を容易にするために導入されたＢａｍＨＩ制限部位であり、そしてＧＡＧは、軽鎖のＮ末端アミノ酸残基をコードする。
【０１３２】
この六量体融合タンパク質の発現のために、マウスｐ４０を発現する細胞株を、ネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターでのトランスフェクションおよびＧ４１８による選択によって作製した。次いで、マウスｐ４０を発現する細胞株を、軽鎖および重鎖の転写単位およびジヒドロ葉酸還元酵素選択マーカー（これは、メトトレキサートによる選択を可能にする（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５））の両方を含む発現ベクターでトランスフェクトした。
【０１３３】
（実施例６：マウス一本鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質の活性）
実施例４に使用される方法と同じ方法を使用して、一過性発現によって産生されるマウス一本鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２の活性を試験した。細胞培養上清における各サイトカインの量を、まずＥＬＩＳＡによって決定し、そしてこれを使用して、用量応答曲線を設定した。この活性は、Ｆｃおよび抗体ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を用いて見出されたことならびに上記のことと親密に対応した。
【０１３４】
詳細には、マウス一本鎖（ｓｃ）ＩＬ−１２−ＩＬ−２およびマウスＦｃ ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２分子のＩＬ−１２活性を、実施例４に記載されるヒトＰＢＭＣ細胞増殖アッセイにおいて試験した。ＩＬ−１２ならびにＩＬ−１２およびＩＬ−２の等モル混合物は、細胞への3Ｈ−チミジンの取り込みを用量依存的様式で刺激した。１モル濃度当たりの基準に対して、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質およびＦｃ−ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質の両方は、3Ｈ−チミジン取り込みの刺激の際にほぼＩＬ−１２のように効果的であった（図９）。実施例４に記載されるように、ＩＬ−２は、3Ｈ−チミジンの取り込みを、最も高いモル濃度でのみ刺激し、これは、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質によって刺激された3Ｈ−チミジンの観察された取り込みが、主にそのＩＬ−１２活性に起因することを示す。
【０１３５】
さらに、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質におけるＩＬ−２部分の生物学的活性を、細胞ベースのアッセイで試験し、そして、このアッセイの正確さの範囲内に対し、１モルの基準に対して市販のＩＬ−２とほぼ同じであることが見出された。ＩＬ−２部分の生物学的活性を、実施例４に記載されるように、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイにおいて試験した。この結果により、マウスＩＬ−２、マウスｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２、およびマウスＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質が、刺激増幅においてほぼ等しい効力であることが示される。マウスＩＬ−１２は、検出可能なＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激を生じなかった。これらの結果により、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質によるＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激が、ＩＬ−１２部分ではなく、ＩＬ−２部分に起因したことが示される。
【０１３６】
実施例５に記載されるＦｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２、およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２のタンパク質の、ＩＬ−１２活性およびＩＬ−２活性をまた、細胞ベースのアッセイにおいて試験した。ＰＢＭＣ細胞増殖／トリチル化チミジン取り込みアッセイを用いて、Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２、およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２タンパク質の全てが、強力なＩＬ−１２活性を示した。同様に、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを用いて、Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２、およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２タンパク質は全て、強力なＩＬ−２活性を示した。さらに、ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２タンパク質は両方とも、例え、重鎖および軽鎖のＶ領域がそれぞれそれらのＮ末端において別のタンパク質に融合していたとしても、ＥｐＣＡＭ抗原にしっかりと結合した。
【０１３７】
（実施例７．マウスＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の活性）
マウスＦｃ−ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ分子のＩＬ−１２活性を、細胞増殖アッセイにおいて試験した（図１０）。ヒトＰＢＭＣを、３人のボランティアから得て、そして５μｇ／ｍｌ フィトヘマグルチニン−Ｐを用いて３日間培養し、Ｈａｎｋ’ｓ ＨＢＳＳを用いて洗浄し、そして１ウェル当たり１０5細胞でマイクロタイタープレートにプレートした（これらは、標準的な手順（Ｇａｔｅｌｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，Ｒ．，およびＰｒｅｓｋｙ，Ｄ．Ｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）６．１６．１−６．１６．１５頁）に従った））。細胞を、種々の試験タンパク質の存在下で４８時間インキュベートし、次いで、０．３マイクロキュリーの3Ｈ−チミジンを、放射性取り込みのレベルを決定する１０時間前に添加した。ＩＬ−１２およびＩＬ−１２とＧＭ−ＣＳＦの等モル混合物は、3Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを用量依存様式で刺激し、そして、１４．１８−ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、3Ｈ−チミジンの刺激取り込みにおいてほぼ等しい効率であった。ＧＭ−ＣＳＦは、試験された濃度において3Ｈ−チミジンの取り込みを刺激しなかった。これは、１４．１８−ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質によって刺激された3Ｈ−チミジンの観察された取り込みが、主に、そのＩＬ−１２活性に起因したことを示す。
【０１３８】
さらに、種々のＩＬ−１２−Ｇｍ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ部分の生物学的活性を、細胞ベースのアッセイにおいて試験した。これにより、ＧＭ−ＣＳＦ部分が活性であり、これは市販のＧＭ−ＣＳＦと同じ一般的な範囲である１分子当たりの活性を伴った。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ部分の生物学的活性を、分子免疫学の当業者に公知の手順に従って異なる細胞増殖アッセイにおいて試験する（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．Ｃ．およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）６．４．１−６．４．０頁）。マウス３２Ｄ（ＧＭ）細胞株は、増殖に関してＧＭ−ＣＳＦに依存する；この株は、本来の３２Ｄ細胞株（ＣｏｏｐｅｒおよびＢｒｏｘｍｅｙｅｒによって記載される）からＧＭ−ＣＳＦに対して特に感受性であるように適応されている（Ｆａａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）２３：１２０１−１４）。３２Ｄ（ＧＭ）細胞株は、ＩＬ−１２に応答性ではなかった。活性な対数増殖における３２Ｄ（ＧＭ）細胞を、ＧＭ−ＣＳＦを欠く培地で２回洗浄し、そして、種々の量の、市販のマウスＧＭ−ＣＳＦまたはマウスＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の存在下で、マイクロタイターウェルの１ウェル当たり５×１０3個の細胞をプレートし、そして４８時間増殖させる。０．３マイクロキュリーの3Ｈ−チミジンを、放射性取り込みのレベルを決定する１６時間前に添加する。漸増レベルのＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を用いた3Ｈ−チミジンの取り込みに、用量応答性の増加が存在した。これは、ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ部分が活性であることを示す。さらに、モル濃度基準で算出されたこの融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ生物学的活性は、市販のマウスのＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性に匹敵する。
【０１３９】
（実施例８．複合サイトカイン融合タンパク質を用いた免疫堪能動物（ｉｍｍｕｎｅ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｍｍａｌ）における結腸癌腫の処置）
複合サイトカイン−抗体融合タンパク質を使用して、インタクトな免疫系を有する哺乳動物における結腸癌腫を処置し得るか否かを試験するために、以下の実験を実施した。ＣＴ２６は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の結腸癌腫細胞株である。標準的な遺伝子操作技術によって、この細胞株を操作し、ヒト上皮細胞接着分子を発現させた。この分子は、ＫＳ−１／４抗体によって認識される抗原である；これらの細胞を、ＣＴ２６／ＫＳＡ細胞と名付ける。
【０１４０】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを２×１０6ＣＴ２６／ＫＳＡ細胞を用いて皮下接種した。腫瘍が約１００〜２００立方ミリメートルの容積に達する場合、マウスをさらなる研究のための９匹のマウスの３つのグループに無作為化した。０日目から開始して、腫瘍保有マウスを、ＰＢＳ、約５．３マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２と混合された約３．４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２、または約６マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２−ＩＬ１２を用いて処理した。これらの用量は、各セットのマウスに対して等しい数のＩＬ−１２分子およびＩＬ−２分子を送達するために設計する。マウスを、５日間、１日に１回腫瘍内注射した。腫瘍のサイズを、カリパーを用いて測定した。
【０１４１】
１つのこのような実験の結果を、図１１に示す。この実験において、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２は、腫瘍増殖の強い阻害を引き起こした。ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物もまた、腫瘍増殖の有意な阻害を引き起こしたが、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２のように完全ではなかった。ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で処理されたマウスのグループにおいて、９匹のマウスのうちの６匹は、これらの腫瘍を明らかに治癒した：これらの６匹のマウスは、実験を終了した場合、９３日目まで生存した；そしてこれらのマウスにおける腫瘍は、縮みそして消失し、その結果、３９日目〜９３日目からは皮下腫瘍は検出され得なかった。他の３匹のマウスは、増殖が遅延される腫瘍を有し、その結果、腫瘍大敵は、たった８７日後に４，０００立方ミリメートルを超えた。
【０１４２】
ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物で処理されたマウスのうち、２匹のマウスは、その皮下腫瘍が明らかに治癒され、そして実験の終わりまで生存した。残りの７匹のマウスの腫瘍は、消失せず、そして最終的には、１，０００立方ミリメートル（１匹のマウス）または４，０００立方ミリメートルより大きく（６匹のマウス）増殖した。
【０１４３】
ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２が、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２等モル混合物よりも、より効果的であるという事実は、驚くべきことである。この実験における用量は、１用量当たり約１５ピコモルの融合タンパク質を送達し、これは約９×１０12分子に対応する。処置の開始において、各腫瘍は、約１６０立方ミリメートルの容積を有し、これは、約１億６０００万の細胞に対応する。各細胞は、約１０6分子のＥｐＣＡＭを発現し、そうなので、ＫＳ抗体が結合する約１．６×１０14個のＥｐＣＡＭ抗原分子が存在する。従って、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２が混合され、そしてそのような腫瘍を保有するマウスに注射された場合、これらの２つの免疫サイトカイン融合タンパク質は、おそらく抗原結合部位に関して互いに競合しない。従って、腫瘍部位における効果的な用量のＩＬ−１２およびＩＬ−２は、少なくとも、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物に関して、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２に関するような高さであるべきであった。
【０１４４】
（実施例９．複合サイトカイン融合タンパク質を用いた免疫不全動物における結腸癌腫の処置）
多くの形態の癌治療が、免疫系の細胞を含む分裂細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）の殺傷に効果を有する。結果として、癌患者は、しばしば、免疫抑制になる。複合サイトカイン融合タンパク質を使用して、抑制された免疫系を有する哺乳動物を処置し得るか否かに取り組むために、ＣＴ２６／ＫＳＡ腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスを、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物、またはＰＢＳで処理した。ＳＣＩＤマウスは、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方が欠失であり、そして感染と戦うその能力については生来の免疫系（例えば、ＮＫ細胞）の分枝に依存する。
【０１４５】
皮下ＣＴ２６／ＫＳＡ腫瘍を有するマウスを、実施例８に記載されるように作製した。８匹のマウスの３つの群（各々は、約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）を、実施例８と同じ用量およびスケジュールを用いて腫瘍内注射によって処理した。結果を、図１２に示す。この場合、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質およびＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物は、ほぼ等しく効果的であった：８匹のマウスのうちの５匹は、各グループにおいて２５日目までに治癒された。しかし、治癒されなかったマウスにおいて、６個の腫瘍のうちの５個は、未処理動物における腫瘍に特徴的な速度で増殖し始め、約１４〜２１日の効果的な遅延であった。これは、実施例８の免疫堪能マウスにおける腫瘍と対照的である：腫瘍がＫＳ−ＩＬ １２−ＩＬ２を用いた処理によって完全に排除されなかった場合でさえ、この腫瘍は、この実験の開始後、約６０日までは急速に増殖し始めなかった。
【０１４６】
これらの実験は、複合サイトカイン抗体融合タンパク質を使用して、免疫抑制された動物における癌を処置し得ることを示す。
【０１４７】
（実施例１０．複合サイトカイン融合タンパク質の腫瘍内注射による肺癌腫の処理：個々の免疫サイトカインによる処理との比較）
複合サイトカイン融合タンパク質および単一サイトカイン部分を有する免疫サイトカインの、肺細胞由来の癌に対する効果に取り組むために、以下の実験を実施した。
【０１４８】
Ｌｅｗｉｓ肺癌腫（ＬＬＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の急速進行性の腫瘍である。ヒトＥｐＣＡＭタンパク質を発現するＬＬＣ細胞株を、標準的な遺伝子操作技術によって構築した；この細胞株を、ＬＬＣ／ＫＳＡと命名した。
【０１４９】
皮下ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、実施例８に記載されるように作成した（ＫＭＬを有するチェック＃の細胞）。各５匹のマウスの４つのグループ（各々は、約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）を、５日間、腫瘍内注射で処理した。マウスを、ＰＢＳ、約２０ミリグラムのＫＳ−ＩＬ１２、約２０ミリグラムのＫＳ−ＩＬ１２、または約２０ミリグラムのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で注射した。
【０１５０】
結果を、図１３に示す。この場合、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質は、ＫＳ−ＩＬ１２またはＫＳ−ＩＬ２のいずれよりも、よりさらに効果的であった。ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質を用いて処理された全てのマウスにおいて、これらの腫瘍は、２７日までに消失した。７４日目に、これらのマウスを、実施例１４に記載されるような肺転移アッセイに使用した；本来の皮下腫瘍は、介在期間または第２の実験の間に再び出現しなかった。対照的に、ＫＳ−ＩＬ２またはＫＳ−ＩＬ１２のいずれかを用いた処理は、いくつかの明らかな腫瘍の縮小および有意な腫瘍増殖の遅延を引き起こしたが、これらの腫瘍は、最終的には増殖した。この実施例および以前の実施例の結果の比較により、特定の疾患および投与形態に関して、異なるサイトカイン部分を保有する免疫サイトカインの混合物を用いた処理が、単一型の免疫サイトカインを用いた処理よりも優れていることを示す。
【０１５１】
（実施例１２ 複合サイトカイン融合タンパク質の腫瘍内注射による肺癌腫の処置：免疫サイトカインの混合物による処理との比較）
複合サイトカイン融合タンパク質、および異なるサイトカイン部分を保有する免疫サイトカインの混合物の、肺細胞由来の癌に対する効果を示すために、以下の実験を実施した。
【０１５２】
皮下ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１１に記載されるように作製した。７匹のマウス（各々は、約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）の３つの群を、５日間、腫瘍内注射によって処理した。マウスを、ＰＢＳ、約１８μｇのＫＳ−ＩＬ１２と約１１．５μｇのＫＳ−ＩＬ１２との混合物、または約２０μｇのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で注射した。
【０１５３】
結果を図１４に示す。この場合、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質は、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２との混合物よりも、よりさらに効果的であった。ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質で処理された全てのマウスにおいて、腫瘍は、２７日目までに消失した。対照的に、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２との混合物での処理は、いくらかの明らかな腫瘍の縮みおよび腫瘍増殖の有意な遅延をもたらしたが、この処置群において全ての腫瘍は、最終的に再び増殖した。
【０１５４】
（実施例１３．複合サイトカイン−抗体融合タンパク質の、抗腫瘍活性の抗原依存性）
腫瘍の処置における複合サイトカイン−抗体融合タンパク質の効果が、抗体によって認識される抗原の腫瘍特異的発現に依存するか否かを示すために、以下の実験を実施した。
【０１５５】
皮下ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を有する７匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのセット、および親ＬＬＣ細胞株から誘導された腫瘍を有する９匹のマウスの第２のセットを、実施例１１に記載されるように作製した。これら２つの群のマウス（約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）を、５日間、腫瘍内注射によって処理した。マウスを、約２０μｇのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で注射した。
【０１５６】
結果を図１５に示す。この場合、ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を保有するマウスは全て、これらの腫瘍が完全に治癒した。対照的に、ＬＬＣ腫瘍を保有するマウスのうちの２匹のみが、治癒した；他のＬＬＣ腫瘍保有マウスは全て、その腫瘍容積における一過性の減少を享受したが、その腫瘍は、最終的に大きな容積に増殖した。
【０１５７】
これらの結果は、ＥｐＣＡＭ表面抗原の認識が、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２のＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍細胞の表面への接着を促進すること、および生じる免疫応答が増強されることをしめす。いくつかの抗腫瘍効果は、ＬＬＣ由来の腫瘍に対しても同様に観察され；（理論に束縛されることを望まないが）この場合におけるＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２の抗腫瘍効果は、融合タンパク質が直接腫瘍に注射され、従って、その腫瘍に一過性に局在した事実に起因し得る。
【０１５８】
（実施例１４．腫瘍細胞型に対する免疫記憶の生成）
転移の発達は、癌の処置における主要な問題である。複合サイトカイン抗体融合タンパク質を用いた処置が、腫瘍細胞型に対する長期の免疫記憶の形成を導き得るか否か、および転移の確立を妨害し得るか否かを試験するために、以下の実験を実施した。
【０１５９】
実施例１１由来の５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で処理し、そしてこれらの皮下腫瘍が明らかに治癒された。実施例１４に記載されるように、処置の開始に対して７４日目に、これらの５匹のマウスを、１０6のＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を用いて静脈内注射した。コントロールとして、８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスをまた、１０6のＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を用いて静脈内注射した。
【０１６０】
２８日目に、マウスを屠殺し、そして肺を転移に関して調べた。８匹のコントロールマウスの肺は、７０％〜１００％が転移で覆われ、平均８５％の肺表面範囲を有した。これらのマウスの平均肺重量は、０．８６グラムであった。対照的に、５匹の前処理したマウス由来の肺表面上には、転移は見出されず、そして平均肺重量は、０．２８グラム（これは、正常マウス肺の重量に対応する）であった。これらの結果は、本来の腫瘍細胞の処置が、この腫瘍細胞に対する長期の免疫記憶を生じることを示し；この記憶は、この腫瘍細胞型の転移の確立を妨害した。
【０１６１】
（表Ｘ．ＬＬＣ−ＫＳＡ肺転移からの「後退した」マウスの保護）
【０１６２】
【表１】
腫瘍を有さないコントロール群の平均肺重量は０．２ｇであった。転移スコアは、融合された転移小節の％表面範囲に基づき、ここで、０＝転移なし；１＝１〜２５％の範囲；２＝２５〜５０％の範囲；３＝５０〜７５％の範囲；および４＝７５〜１００％の範囲である。
【０１６３】
免疫記憶形成に関して試験するための第２の実験は、ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍細胞で注射され、皮下腫瘍が発生し、そしてこれらの腫瘍が消失した実施例１２由来の７匹のマウスのうちの６匹を使用した。実施例１２の処置の開始６２日後に、６匹の前処理したマウスおよび１０匹のナイーブな未処理のＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスを、１０6のＬＬＣ細胞で皮下注射した。これらの細胞は、ヒトＫＳ抗原ＥｐＣＡＭを発現しない。
【０１６４】
ナイーブなマウスにおいて、注射されたＬＬＣ細胞は、全てのマウスにおいて急速に増殖する腫瘍を形成した。対照的に、前処理されたマウスにおける腫瘍は、よりさらにゆっくりと増殖し、そして１匹のマウスにおいては、皮下腫瘍は検出されなかった。これらの結果を、図１６に示す。ヒトＫＳ抗原であるＥｐＣＡＭがＬＬＣ細胞上で発現されないので、ＬＬＣ細胞に対する免疫応答は、これらの細胞によって発現される別の抗原に基づいた。
【０１６５】
（実施例１５：ワクチンとしての複合サイトカイン融合タンパク質）
複合サイトカイン融合タンパク質は、抗原タンパク質に融合される場合、ワクチンとして使用され得る。Ｎ末端からＣ末端への部分の特定の順番、または融合タンパク質が単一ポリペプチド鎖であるかオリゴマーであるかは、発現されるプラスミドの構築の利便性に依存して変化し得る。このタンパク質は、種々の経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内など）によって投与され得る。同様に、投与の用量および頻度は、一般的に、ヒトワクチンに関する標準的な慣例と同様に、ならびにワクチン開発の当業者に周知であるのと同様に、経験的に決定される必要がある。
【０１６６】
例えば、抗原−ＩＬ−１２−サイトカインの形式の融合タンパク質は、マウスに投与され、ここで、この融合タンパク質中のサイトカインは、ＩＬ−１２とは異なる第２のサイトカインである。コントロールマウスは、同じ量の抗原−サイトカイン、抗原−ＩＬ−１２、または抗原単独を受ける。抗原融合タンパク質の投与の間および／またはこの投与後の種々の時間において、血液サンプルを、レトロ眼窩出血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって収集し、そして血漿を調製し、そしてこの抗原に対して指向する抗体の存在に関して分析する。抗体が、この抗原に対して作製されたことが見出された。さらに、この抗原に対する免疫応答の性質は、Ｔｈ１応答特有である。抗体応答は、特定のコントロール免疫においてよりも、より強くそして産生された抗体の型は異なる。
【０１６７】
より詳細には、ＰＢＳ緩衝液中のヒト化抗体−マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射（５μｇ／日×５）で注射する。コントロールマウスは、同じ抗体を、同じ量だが、ＩＬ−１２−ＩＬ−２を接着させること無しで受ける。いずれの注射溶液も、いずれの他の型のアジュバントも含まない。１０日目に、血液サンプルをレトロ眼窩出血によって微量遠心分離チューブに収集し、そして血漿を、クエン酸ナトリウムを含むプラスチックチューブ中に血液サンプルを収集し、続いてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上微量遠心分離機で最大回転で遠心することによって調製する。ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）をヒト化抗体タンパク質（これは、ヒト定常領域を含み、そしてこの免疫に応答して作製される任意のマウス抗体を捕獲するために使用される）を用いてコートする。未結合物質を洗浄して除去した後、結合したマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出する。任意の結合した抗体は、ヒト定常領域または可変領域（これらの両方は、ヒト化抗体と融合タンパク質との間で共有される）のいずれかを指向し得る。
【０１６８】
融合されたＩＬ−１２−ＩＬ−２がないヒト化抗体に対しては、ほとんどまたは全く反応性がない。一方、融合タンパク質は、外因性アジュバントの非存在下および静脈内投与の経路が皮下投与または腹腔内投与のいずれかと比較して、そのような応答を誘導することに関して非常に望ましくない事実にもかかわらず、強力な抗体応答を誘導する。ＩｇＧ２ａアイソタイプの抗体（これは、代表的なＩＬ−１２増強された応答である）は、抗体−ＩＬ−１２−ＩＬ−２注射された群において見出されるが、ヒト抗体で注射された群には見出されない。
【０１６９】
種々の経路によって投与される抗原−ＩＬ−１２複合サイトカイン融合タンパク質の免疫原性を、ＰＢＳもしくは他の生体適合性の緩衝液、または公知のアジュバント（例えば、フロイントの非完全アジュバントおよびフロイントの完全アジュバント）中のこの融合タンパク質（例えば、上記に記載される）の溶液を注射することによって試験する。例えば、単一または複数の、皮下注射、皮内注射または腹腔内注射が、２週間毎に提供され得る。あるいは、融合タンパク質は、まず皮下注射によって投与され得、次いで続いて、腹腔内注射され得る。フロイントのアジュバントは、注射部位における過敏に起因して、ヒトの用途に対しては使用することができない。水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）の沈澱物のような代替のアジュバントが、ヒトの用途に対して承認され、そして本発明において使用され得る。スクアレンおよび脂質に基づく新規有機化学アジュバントがまた、皮膚への注射に使用され得る。
【０１７０】
（実施例１６：複合サイトカイン融合タンパク質を用いた遺伝子治療）
遺伝子治療法によって送達される複合サイトカイン融合タンパク質の抗癌活性をまた、肺癌の処置に関して示した。Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞を、上記に記載されるウイルスベクター系（ＰＡ３１７パッケージング細胞株へトランスフェクトされるｐＬＮＣＸ−ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２またはｐＬＮＣＸ−ｓｃＩＬ−１２ ＤＮＡ）を用いて安定にトランスフェクトした。これらの構築物は、ＩＬ−１２の一本鎖バージョンをコードし、ここで、ｐ３５およびｐ４０サブユニットは、リンカーで結合されている。クローンを、Ｇ４１８含有培地を用いてインビトロで選択し、そして約５０〜６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を安定に発現するクローンを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって同定した。
【０１７１】
ｓｃＩＬ−１２またはｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現する、約１×１０6および約５×１０6ＬＬＣ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびまたＳＣＩＤマウスに皮下注射した。コントロールとして、２×１０6 ＬＬＣ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびまたＳＣＩＤマウスに注射した。ＩＬ−１２を発現するＬＬＣ細胞は、サイトカインを発現するように操作されていないＬＬＣ細胞から誘導された腫瘍とほぼ同じ速度で増殖する腫瘍を形成する。しかし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびまたＳＣＩＤマウスの両方において、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現するＬＬＣ細胞は、皮下腫瘍を形成しないか、または引続いて縮みそして消失する腫瘍を形成するかのいずれかであった（図１７および１８）。
【０１７２】
（実施例１７．ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む複合サイトカイン融合タンパク質の構築）
サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、組み合わせて使用される場合、樹状細胞の強力なアクチベーターである。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの活性を含む複合サイトカイン−抗体融合タンパク質が、以下のように構築された。ＧＭ−ＣＳＦのコード配列が、ＫＳ−１／４抗体重鎖のコード配列の３’末端にインフレームで融合され、これには、リーダー配列が先行した。さらに、ＩＬ−４のコード配列（リーダー配列を含む）は、成熟ＫＳ−１／４抗体軽鎖のコード配列の５’末端に、リンカーを用いてインフレームで融合された。
【０１７３】
詳細には、マウスＩＬ−４とＫＳ−１／４抗体の軽鎖との融合タンパク質をコードするＤＮＡを構築するために、マウスＩＬ−４ ｃＤＮＡを、正方向プライマー：ＴＣＴＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＣ ＣＡＧ Ｃ（配列番号２２）（ここで、ＸｂａＩ部位のＴＣＴＡＧＡ（配列番号２２の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置される）および逆方向プライマー：Ｃ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＡＧ Ｇ（配列番号２３）（これは、マウスＩＬ−４のＣ末端アミノ酸残基をコードするＴＣＧコドン（アンチコドンＣＧＡ）に対してすぐ３’にＢａｍＨＩ部位であるＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号２３の残基２〜７）を含む）を用いて、ＰＣＲによって適応させた。ＰＣＲフラグメントのクローニングおよび配列確認の後、マウスＩＬ−４ ｃＤＮＡを含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、グリシンおよびセリン残基に富むフレキシブルペプチドリンカーをコードするＢａｍＨＩ−ＡｆｌＩＩオリゴヌクレオチド二重鎖に連結した。次に、ＡｆｌＩＩ末端を、マウスＫＳ−１／４軽鎖のＮ末端に先行する人工的に配置されたＡｆｌＩＩ部位に結合させた。２つの連結から生じる連結におけるＤＮＡおよびタンパク質の配列を、以下に提供する。
【０１７４】
【化４】
このＤＮＡ配列において、ＧＧＡＴＣＣ（配列番号２４の残基４〜９）およびＣＴＴＡＡＧ（配列番号２４の残基４８〜５３）は、それぞれ、再構築に使用される２つの制限部位のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩであり；ＴＣＧは、マウスＩＬ−４のＣ末端セリン残基をコードする；ＧＡＧは、ＫＳ−１／４軽鎖の成熟Ｎ末端をコードする；そして、ＧｌｙＳｅｒリッチのペプチドリンカーのアミノ酸配列をそのＤＮＡ配列の下に示す。強力なプロモーターを含む高レベルの発現のための補助的配列を、前の実施例に記載される技術および分子生物学の他の標準的な技術を用いて、融合ポリペプチドの両方をコードするＤＮＡセグメントのほぼ周辺に配置した。
【０１７５】
ＩＬ４−ＫＳ（軽鎖）およびＫＳ（重鎖）−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＮＳ／０細胞にトランスフェクトし、そして対応するポリペプチドが、高レベルで発現された。還元状態下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約８０ｋＤに重鎖−ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドに対応する散在したバンド、および約５０ｋＤにＩＬ４−軽鎖融合体に対応する複合バンドが見出された。散在したバンドおよび複合バンドの出現は、それぞれ、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの可変のグリコシル化に起因した。
【０１７６】
サブユニットは、図３Ｇの一般的な構造に対応する構造を有するジスルフィド結合した四量体タンパク質へアセンブルした。このタンパク質は、ＫＳ−１／４の抗原結合活性、そのＦｃ領域を介したＳｔａｐｈ Ａタンパク質への結合する能力、ならびにＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦのサイトカイン活性を有した。ＩＬ−４活性を、ＩＬ−４依存性刺激によるＣＴＬＬ−２細胞のトリチウム化チミジン取り込みによって測定した。ＧＭ−ＣＳＦ活性を、ＧＭ−ＣＳＦ依存性刺激による３２（Ｄ）ＧＭ細胞のトリチウム化チミジン取り込みによって測定した。モル濃度の基準に対して、ＫＳ−ＩＬ４−ＧＭＣＳＦのＩＬ−４活性およびＧＭ−ＣＳＦ活性は、精製されたＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦと類似していた。
【０１７７】
抗体配列と結合していないサイトカインＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの融合体を、以下のように構築した。マウスＩＬ−４を、マウス脾細胞のＲＮＡからＰＣＲによってクローン化した。正方向プライマーは、配列：ＴＣＴＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＣ ＣＡＧ Ｃ（配列番号２６）（ここで、ＸｂａＩ部位のＴＣＴＡＧＡ（配列番号２６の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置された）を有し、そして逆方向プライマーは、配列：ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＣＣ ＧＧＡ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＡＧ Ｇ（配列番号２７）（これは、マウスＩＬ−４のＣ末端アミノ酸残基をコードするＴＣＧコドン（アンチコドンＣＧＡ）のすぐ３’にＥｃｏＲＶ部位のＧＡＴ ＡＴＣ（配列番号２７の残基２〜７）を配置した）を有した。配列確認の後、そのネイティブなリーダーと共にｍｕＩＬ−４ ｃＤＮＡを含むＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｍｕＧＭ−ＣＳＦを含むＳｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントに連結させ、ｍｕＩＬ−４とｍｕＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡとの間の融合体の連結部に以下の配列を得た：ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＧＣ（配列番号２８）（ここで、ｍｕＩＬ４のＣ末端配列およびｍｕＧＭ−ＣＳＦのＮ末端配列を、下線で示し、そして、ＧＡＴＧ ＧＧ（配列番号２８の残基１７〜２２）は、ＥｃｏＲＶ平滑末端からＳｍａＩ平滑末端への連結から生じる配列である）。ｍｕＩＬ４−ｍｕＧＭＣＳＦをコードする生じたＤＮＡを、次いで、発現ベクターにクローン化した。この発現されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そして、４５〜５０ｋＤの見かけ上の分子量を有する散在バンドとして泳動されることが見出された。モル濃度の基準に対して、ＩＬ４−ＧＭＣＳＦのＩＬ−４活性およびＧＭ−ＣＳＦ活性は、精製されたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと類似していた。
【０１７８】
（実施例１８．リンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ１２（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ−ＫＳ−ＩＬ２）をコードするＤＮＡの構築およびリンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２タンパク質の発現）
ケモカインは、勾配を形成し、免疫細胞の化学走性を媒介すると考えられている、異なるクラスのサイトカインである。さらに、他のサイトカインのように、ケモカインは、標的細胞において特定の遺伝子の発現を誘導し得る。ケモカインの１つの特徴は、遊離のＮ末端がしばしば活性に必要とされることであり、これにより、融合タンパク質が構築され得る方法に限定を置くかもしれない。
【０１７９】
サイトカインリンホタクチン（これは、ケモカインである）、抗体ＫＳ−１／４、およびサイトカインＩＬ−２からなる、サイトカイン−抗体−サイトカイン融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、四量体であり、そして２つの異なるポリペプチドを含んだ。１つのポリペプチドは、ＫＳ−１／４抗体の重鎖のＮ末端に融合されたマウスリンホタクチンからなる（Ｃ末端にＩＬ−２が続く）。Ｃ末端にＩＬ−２を有するＫＳ−１／４重鎖の融合体（「ＫＳ−ＩＬ２重鎖」）は、以前に記載された（Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８）。もう一方のポリペプチドは、ＫＳ１／４抗体の軽鎖からなる。
【０１８０】
マウスリンホタクチンの完全なコード配列は、ＫｅｌｎｅｒおよびＺｌｏｔｎｉｋ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３９５（１９９８））によって公開された。マウスリンホタクチンとＫＳ−ＩＬ２の重鎖との融合タンパク質をコードするＤＮＡを構築するために、マウスリンホタクチンｃＤＮＡを、正方向プライマー：ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＣ（配列番号２９）（ここで、ＸｂａＩ部位のＴＣＴＡＧＡ（配列番号２９の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置された）、および逆方向プライマー：ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＧＣ ＴＧ（配列番号３０）（これは、マウスリンホタクチンのＣ末端アミノ酸残基をコードするＧＧＧコドン（アンチコドンＣＣＣ）のすぐ３’にＢａｍＨＩ部位のＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号３０の残基１〜６）を配置した）を用いて、ＰＣＲによって適応させた。ＰＣＲフラグメントのクローニングおよび配列確認の後、マウスリンホタクチンｃＤＮＡを含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、グリシンおよびセリン残基に富むフレキシブルペプチドリンカーをコードするＢａｍＨＩ−ＡｆｌＩＩオリゴヌクレオチド二重鎖に連結した。次に、ＡｆｌＩＩ末端を、ＫＳ−ＩＬ２重鎖の成熟Ｎ末端に先行する人工的ＡｆｌＩＩ部位に結合させた。２つの連結から生じる連結におけるＤＮＡ配列を、以下に提供する。
【０１８１】
【化５】
ここで、ＧＧＡＴＣＣ（配列番号３１の残基４〜９）およびＣＴＴＡＡＧ（配列番号３１の残基４８〜５３）は、それぞれ、構築に使用される２つの制限部位のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩであり；ＣＣＣは、マウスリンホタクチンのＣ末端アミノ酸残基をコードする；ＣＡＧは、ＫＳ−ＩＬ２重鎖の成熟Ｎ末端をコードする；そして、ＧｌｙＳｅｒリッチのペプチドリンカーのアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列の上に示す。次いで、マウスリンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２重鎖をコードするＤＮＡを、発現ベクターにクローン化し、次いで、ＫＳ１／４軽鎖と同時発現させた。
【０１８２】
発現されたリンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質を、Ｔ細胞を用いてＢｏｙｄｅｎチャンバー移動アッセイにおけるリンホタクチン活性に関して試験する（Ｌｅｏｎａｒｄら、（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６．１２．３頁）。あるいは、ＮＫ細胞を使用する。あるいは、リンホタクチン活性を、Ｇタンパク質結合レセプターの活性化に対する応答におけるカルシウム流動に関する、標準的な細胞アッセイにおいて観察する（Ｍａｇｈａｚａｃｈｉら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９７）；１１：７６５−７４）。さらに、リンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質を、試験し、そしてＥｐＣＡＭへ結合する能力に関するアッセイにおいて活性であることが見出され、そしてまた、ＩＬ−２活性に関するアッセイ（例えば、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイ）において活性である。
【０１８３】
（参考としての援用）
本明細書上記に引用された全ての刊行物は、その全体が本出願に参考として援用される。
【０１８４】
（等価物）
本発明は、本発明の精神または基本的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形式で具体化され得る。従って、上記の実施形態は、全ての関係において、本明細書中に記載される本発明に対する限定よりも、例示的であるとみなされる。従って、本発明の範囲は、前述の発明の詳細な説明よりも、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、特許請求の範囲の等価物の意義および範囲内にある全ての変更は、本発明に含まれることが意図される。
［配列表］
【０１８５】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
（出願に関する参考文献）
本出願は、１９９９年８月９日に提出された米国出願第６０／１４７，９２４号の利益を主張し、その開示を本明細書中で参考文献として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、複合サイトカインタンパク質複合体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｓ）およびそれらの組成物の構築および発現方法に関する。さらに詳細には、本発明は、複合サイトカインおよび標的化成分よりなる融合タンパク質、ならびに癌およびウイルス感染のような疾患の処置に融合タンパク質を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫系を制御する調節ネットワークは、免疫細胞の機能を表すおよび表さない、そのうえ細胞の増殖を制御するための、サイトカインと呼ばれる分泌タンパク質シグナル伝達分子による。これらの反応は、概して、所望される生物学的効果を活発にするように協調して作用する複合サイトカインを含む。インターロイキン−２（ＩＬ−２）のような一定のサイトカインは、自己で免疫細胞増殖を誘導し得、そして第２のサイトカイン分泌を含む他の機能を活性化し得る。別のサイトカイン（インターロイキン−１２（ＩＬ−１２））（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉによって概説された、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８４：４００８−４０２７）は、一定の免疫細胞の増殖を誘導し得、別の重要な免疫モジュレーター（インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ））を誘導し得る。このＩＦＬ−γの誘導は、ＩＬ−１２の重要な活性であるが、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ独立性の別の重要な活性を有する。ＩＬ−１２自身は、感染症状況の初期段階で誘導されるため、先天免疫系および後天免疫系に連結すると考えられる。
【０００４】
マウスおよびヒト免疫細胞の両方を用いた多くのインビトロの研究は、最適な免疫反応の開発におけるサイトカイン組み合わせの重要性を示した。例えば、ほとんどのＴ細胞は、マイトジェンで活性化されるか、または高濃度のＩＬ−２中で培養されるまでは、ＩＬ−１２レセプター（ＩＬ−１２Ｒ）を発現しない（Ｄｅｓａｉら、（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３１２５−３１３２）。一旦、そのレセプターが発現されると、細胞はＩＬ−１２に対してはるかに敏感になる。さらに、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ転写を誘導するが、ＩＦＮ−γｍＲＮＡは、その後じきに減る。ＩＬ−２の存在下、ｍＲＮＡは、安定し、そしてＩＦＮ−γ生成量の劇的な増加を生じる（Ｃｈａｎら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：９２−９８）。他の研究においては、ＩＬ−３およびＩＬ−１１のサイトカイン組み合わせまたはＩＬ−３およびスチールファクター（Ｓｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ）のサイトカイン組み合わせは、初期造血前駆細胞の増殖においてＩＬ−１２との相乗効果を有する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、１９９４；上記に引用）ことが見出された。インターロイキン−４およびＧＭ−ＣＳＦの組み合わせは、樹状細胞の刺激において特に有効である（Ｐａｌｕｃｋａら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：４５８７−４５９５）。細胞性免疫反応の刺激にとって、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８（最近発見されたＩＬ−１２に相補性のいくつかの活性を有するＴｈ１促進サイトカイン（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６３：５８３−５８９；Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３６４２−３６４７））の組み合わせもまた、有用である。さらに、ＩＬ−２およびインターフェロン−γは、一定の状況で相乗的である（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ、Ｍ．Ａ．、米国特許第５，０８２，６５８号）。
【０００５】
多くのこれらの相乗作用研究において、各サイトカインの相対的なレベルが、非常に重要であることが発見された。ＩＬ−２の最適以下の量の存在下でのＩＬ−１２の添加は、増殖の誘導、細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ誘導に相乗作用を導くが、１つのサイトカインを高い用量で使用するＩＬ−２およびＩＬ−１２の組み合わせは、拮抗することが見いだされた（Ｐｅｒｕｓｓｉａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３４９５−３５０２（１９９２）；Ｍｅｈｒｏｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２４４４−２４５２（１９９３））同様の状況はまた、ＩＬ−１２およびＩＬ−７の組み合わせにおいても現れる。
【０００６】
マウスにおける抗腫瘍反応の発生のためのＩＬ−１２と他のサイトカインとの間の相乗作用研究はまた、混合した結果を示した。いくつかのモデルにおいて、各サイトカインの最適以下の用量で相乗作用が見られ、そしてさらに高い用量は、高い毒性を導いたが、一方他のモデルにおいて、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の組み合わせは、ほとんどまたはまったく相乗作用を示さなかった（例えば、Ｎａｓｔａｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１６９７−１７０６（１９９４）参照のこと）。特に、異なる薬学的な性質（異なる循環半減期および生分布など）を有する、２つの薬剤の活性の固定比率を維持する必要性があるとき、これらの結果は、インビボにおける２つの潜在的な相乗作用の薬剤の組み合わせの本来の違いを反映し得る。
【０００７】
インビトロの細胞培養実験において、サイトカインレベルを制御することは、簡単であるが、インビボでは多くのファクターが、サイトカインの相対的な生分布および局在性に影響を及ぼし得、従って、サイトカインの免疫刺激能に影響を及ぼす。これらのファクターの最も重要なものは、半減期である。ボーラス注射後の血行中のＩＬ−２の半減期は、約１０分である。これらの薬物動態性質と著しい対照としては、ＩＬ−１２の循環半減期は、マウス中では３時間より長く（Ｗｙｓｏｃｋａら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：６７２）、そしてヒトでは５〜１０時間である（Ｌｏｔｚｅら、（１９９６）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７９５：４４０−４５４）と報告された。
【０００８】
この違いは、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦ共に相対的に小さいサイズ（ＩＬ−１２が７５ｋＤａに対して、１５〜２５ｋＤ）であり、腎濾過によって、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦが浄化され得ることによると考えられる。約５０ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質は、腎濾過によって浄化される。ほとんど全てのサイトカインは、５０ｋＤａより小さく、そして同様に速やかに腎濾過による浄化をこうむる。２つのそのように小さく速やかに浄化されるサイトカインを用いる処置が、所望される場合、単純にサイトカインの同時投与で十分である。しかし、同時投与は、有意に半減期に差のあるサイトカインには最適ではない。
【０００９】
サイトカインの全身投与は、有害な副作用のため難しい。例えば、高いレベルのインターフェロン−αは、重大な副作用（皮膚、神経学的、免疫および内分泌の毒性を含む）を生じる。複合サイトカイン融合体は、著しい重篤な副作用を示し得ると予想される。
【００１０】
サイトカインの全身投与の副作用を低減するため、１つのストラテジーは、サイトカインとターゲッティング能力を有する第２の分子とを融合することである。Ｆｃ領域が別のタンパク質のＮ末端に配置される融合体（「免疫融合体」または、Ｘがインターフェロン−αなどのリガンドである「Ｆｃ−Ｘ」融合体と呼ばれる）は、多数の特有の、有利な生物学的性質を有する（Ｌｏら、米国特許第５，７２６，０４４号および同第５，５４１，０８７号；Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５）。特に、そのような融合体タンパク質は細胞表面の関連のＦｃレセプターに今まで通り結合し得る。しかし、リガンドが細胞表面のレセプターに結合する場合、Ｆｃ領域の配位が変化し、そして抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体結合を媒介する配列が閉塞される（ｏｃｃｕｌｕｄｅｄ）と思われる。結果として、Ｆｃ−Ｘ分子のＦｃ領域は、ＡＤＣＣまたは補体結合を効果的に媒介できない。Ｎ末端サイトカインおよびＣ末端Ｆｃ領域との融合体による細胞障害性の影響は、周知である。例えば、Ｆｃ領域のＮ末端とＩＬ−２との融合体は、ＩＬ−２レセプター、固定補体を保有する細胞に結合し得る分子を生成し、そして結果として細胞を溶解する（Ｌａｎｄｏｌｆｉら、Ｎ．Ｆ．（１９９３）米国特許第５，３４９，０５３号）。対照的に、Ｆｃ−ＩＬ−２融合体タンパク質は、この性質を有さない。したがって、Ｆｃ−Ｘ融合体は、ＡＤＣＣおよび補体結合の有害な影響を受けずに、血清半減期および相対的肝臓中濃度を増加する効力を有すると予想される。
【００１１】
短い血清半減期を有する多くの異なったタンパク質を、Ｆｃ−Ｘ配置でＦｃ領域と融合させ得、その結果得られた融合体はかなり長い血清半減期を有することが、証明された。しかし、２つの異なるＦｃ融合体の血清半減期は、概して同一ではない。従って、２つの異なるＸ機能基の送達が、所望される場合、２つの異なるＦｃ−Ｘタンパク質の同時投与は、概して最適ではない。
【００１２】
いくつかの環境下で、より良いアプローチは、サイトカインと、細胞表面抗原への特異性および親和性を有する抗体（または抗体由来のフラグメント）とを融合させること（Ｇｉｌｌｉｅｓら、米国特許第５，６５０，１５０号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１４２８）によって、または融合タンパク質型のペプチド結合を介してタンパク質抗原および刺激性のサイトカインを結合させること（Ｈａｚａｍａら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：６２９）によって、この細胞表面抗原に対するサイトカインの効果を標的とすることである。抗体自身は融合サイトカインの半減期を増加し得るが、同一抗体を用いた異なるサイトカイン融合間にはまだ違いがあり（例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：２３０−２３５（１９９３）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５−６２０３を参照のこと）、その違いは、標的部位での同時局在性を困難にする。上記に論じたように、このことが、サイトカインの活性の不均等を導き得、そして所望の相乗効果を減少させ得る。さらに、２つの異なる融合タンパク質の使用は、その安全性および有効性のプロフィールのため各融合体別々の試験を必要とし、ついでさらに混合物として試験を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、２つ以上の異なるサイトカイン間での複合体または融合体を提供し、その複合体または融合体は、概して、標的免疫治療と同様に有用である。これらの複合体または融合体は、必要に応じて他のタンパク質機能基を含む。そのような複合体または融合体の１つの特徴は、固定された比率でその成分のサイトカインの活性を提供することである。
【００１４】
概して、本発明は、少なくとも２つの異なるサイトカインを含むタンパク質複合体に関する。そのサイトカインは、同じポリペプチド鎖であり得、またはジスルフィド結合もしくは化学的架橋によって形成される結合などの共有結合によって結合され得る。あるいは、そのサイトカインは、安定な非共有結合的な結合であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、タンパク質複合体は、哺乳動物中のある部位対して複合体を標的とする標的機能基（抗体または抗体フラグメントなど）を含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、２鎖サイトカイン（ＩＬ−１２など）の生物活性と第２のサイトカインの生物活性とを組み合わせたタンパク質複合体を提供する。そのサイトカインは互いに共有結合的に結合され（例えば、融合され）得る。そのサイトカインはまた、他の機能基を介して結合され得る。例えば、第２のサイトカインを含むポリペプチド鎖として、ＩＬ−１２を特異的に結合する結合機能基（例えば、ＩＬ−１２に対する抗体またはＩＬ−１２に対するレセプター）が挙げられる。あるいは、結合機能基はＩＬ−１２と結合された第２の機能基と相互に作用し得る。例えば、ＩＬ−１２のサブユニットをコードするポリペプチド鎖として、アビジンが挙げられる場合、第２のサイトカインを含むポリペプチドとして、標的機能基としてのビオチンが挙げられ得る。ひとつの実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ−２である。
【００１６】
本発明は、ＩＬ−１２自体の薬物動態の動きと類似した、より長く単一の薬物動態の動きを提供し、そのことが、第２のサイトカインの活性の持続を増加し、そして動物へ注入した後の２つのサイトカインの活性のバランスを維持しながら、ＩＬ−１２の活性および第２のサイトカインの活性の両方を維持するＩＬ−１２の融合タンパク質の生成に関する方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、融合タンパク質は、ＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットが、ジスルフィド結合によって結合され、そしてＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットのアミノまたはカルボキシル末端どちらか一方で、ＩＬ−１２−ＸまたはＸ−ＩＬ−１２の一般式（ここでＸは第２のサイトカインである）で第２のサイトカインと共有結合的に結合した、ＩＬ−１２のヘテロダイマー型を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、融合タンパク質は、可撓性のペプチドリンカーを介して結合された２つのポリペプチドサブユニットを含むＩＬ−１２の単鎖（ｓｃ）型とアミノまたはカルボニル末端のどちらか一方で、一般式ｓｃＩＬ−１２−ＸまたはＸ−ｓｃＩＬ−１２で共有結合された、第２のサイトカインを含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、２つのサイトカインはさらに、タンパク質鎖のアミノまたはカルボキシ末端のいずれか一方で二量化または多量体化構造を形成し得るタンパク質と融合される。この実施形態の好ましい形態において、第２のサイトカインとＩＬ−１２の融合タンパク質形成のひとつは、さらに、免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖の一部（二量化し得るＦｃ領域など）と、融合される。さらなる実施形態としては、Ｉｇ鎖の一部のいずれかの末端でＩＬ−１２の少なくともひとつのポリペプチド鎖および他の末端で融合された第２のサイトカインとの融合が挙げられる。
【００２０】
別の実施形態において、２つ以上のサイトカインは、特異的レセプターへの結合によって、標的能力を有するタンパク質と融合される。例えば、Ｆｃ領域は、肝臓中に豊富であるＦｃレセプターと結合し得る。複合結合サイトカインとＦｃ領域の融合は、二量化および標的共の利点を例示する、しかし、いくつかの状況においては、多量体化能力または標的能力のみを有するが両方の能力は有していない複合化サイトカインの融合体を構築することが有用である。
【００２１】
さらに、別の実施形態においては、複合サイトカインを含む、融合タンパク質は、さらに、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで、多様な標的能力を有する多くのクラスの分子（抗体、または骨格を持っているかもしくは持っていないペプチドアプタマーなど）と、融合される（Ｃｏｌａｓら、（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４２７２−７）。特定の実施形態は、複合サイトカインと、抗原と結合し得る抗体の少なくとも一部分（インタクトな抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ領域など）との融合である。さらに実施形態としては、抗原と結合し得る抗体鎖の少なくとも一部のいずれかの末端部分でＩＬ−１２の少なくとも１つのポリペプチド鎖および、他の末端で融合した第２のサイトカインとの融合が挙げられる。
【００２２】
上記の記述に従って、概して、遺伝工学技術によって、複合サイトカイン融合タンパク質と複合サイトカイン抗体融合タンパク質を構築することが好ましい、この結果、タンパク質成分が、アミド結合またはジスルフィド結合などの共有結合によって結合される。しかし、そのようなタンパク質複合体を構築するために、化学架橋を使用することもまた、有用である。そのような方法は、タンパク質化学分野で良く確立される。あるいは、異なるサイトカインと、安定した非共有結合複合体を形成するパートナータンパク質とを融合することでタンパク質複合体を生むことが、時には、十分である。例えば、非共有結合ヘテロ二量体サポートタンパク質は、以下のように使用される：第１のサイトカインを、ヘテロ二量体のひとつのサブユニットと融合する、第２のサイトカインを、ヘテロ二量体の第２のサブユニットと融合する、そして２つの融合タンパク質を、適切な条件で混合する。例えば、２つのサブユニット−サイトカイン融合タンパク質をコードした核酸は、同じ細胞中で発現される。この場合、複合サイトカインタンパク質複合体は、サイトカイン組成成分が直接または非直接に共有結合的に結合されずに、構築され得る。本発明の目的を達成するために、そのような複合体が、動物の投与の際に維持され、そして生物学的効果を達成するために十分に安定であることが、必要である。
【００２３】
本発明はまた、２つ以上のサイトカインを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する、ここで、サイトカインの１つは、好ましくはＩＬ−１２であり、そして、核酸によってコードされた融合タンパク質は、必要に応じて、他のタンパク質部分を含む。好ましい実施形態として、２つ以上のサイトカインと二量化タンパク質（抗体鎖のＦｃ部分）との融合体をコードする核酸が挙げられる。別の好ましい実施形態のセットは、２つ以上のサイトカインと標的能力を有するタンパク質（抗体など）との融合体をコードする核酸である。
【００２４】
本発明はまた、２つ以上のサイトカインの融合体の構築のための方法、およびそのような融合タンパク質を発現方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、疾患および他の医学的病気の処置方法を提供する、ここで、その処置は、２つ以上のタンパク質の活性の有用な組み合わせを含む。１つの実施形態において、少なくとも１つのタンパク質は、短い（例えば、２０分以下）または中程度にだけ長い（例えば、４０分以下）血清半減期を有する。そのタンパク質は、遺伝工学技術、または他の技術によって融合され、ヒトまたは動物へ投与される。この場合、２つのタンパク質の活性は固定比で現れ、そして２つのタンパク質の異なる投薬スケジュールでの別個の投与を、要求されない。さらに、融合タンパク質の血清半減期は、概して、より長い血清半減期を有するタンパク質成分の血清半減期とさらに類似である、従って、より短い血清半減期を有するタンパク質の有効半減期を長くする。
【００２６】
より詳細には、本発明は、癌もしくは感染などの疾患、または他の疾患の免疫治療処置方法を提供し、２重鎖サイトカイン（第２のサイトカインと結合したＩＬ−１２など）を用いて有効的に処置され得る。好ましい実施形態において、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦと融合され、そして動物またはヒトに投与される。他の好ましい実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−４と融合され、動物またはヒトへ投与される。別の実施形態において、ＩＬ−１２は、ＩＬ−８と融合され、動物またはヒトへ投与される。そのような処置は他の疾患処置と組み合わせて使用され得る。さらに、本発明は、多様な抗原に対するワクチン接種方法を提供し、様々な疾患を予防または処置するために使用され得る。
【００２７】
これらの方法の他の実施形態において、２つの異なるサイトカインが、二量体タンパク質の一部分（抗体のＦｃ領域など）と融合され、そして、動物またはヒトに投与される。これらの方法の好ましい形態では、サイトカインＩＬ−１２は、第２のサイトカインと共にＦｃ領域と融合され、さらに好ましくは、その第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００２８】
さらにこれらの方法の他の実施形態において、２つの異なるサイトカインが、インタクトな抗体と融合され、そして動物またはヒトに投与される。この方法の好ましい形態において、サイトカインＩＬ−１２が、第２のサイトカインと共に抗体の一部分と融合され、さらに好ましくは、その第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。本発明はまた、疾患を処置する点で有用な抗体サイトカイン融合タンパク質の混合物を開示する。１つの実施形態において、抗体ＩＬ−２融合タンパク質と抗体ＩＬ−１２融合タンパク質の混合物が、疾患の処置に使用される。例えば、癌、ウイルス感染、またはバクテリア感染が処置される。
本発明はまた、例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）免疫グロブリン領域（Ｉｇ）、第１のサイトカイン（Ｃ１）および第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）を規定するポリペプチド鎖を含む、多機能融合タンパク質。
（項目２）項目１に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記Ｉｇ、前記Ｃ１および前記Ｃ２は、Ｎ末端からＣ末端の方向に配置され、以下：
（ｉ）Ｉｇ−Ｃ１−Ｃ２；
（ｉｉ）Ｃ１−Ｉｇ−Ｃ２；および
（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ２−Ｉｇ
（ここで、棒線は、ポリペプチド結合またはポリペプチドリンカーを表す）からなる群より選択される式によって規定される融合タンパク質を産生する、融合タンパク質。
（項目３）前記Ｃ１または前記Ｃ２が、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４）前記Ｃ１または前記Ｃ２が、ヘテロ二量体サイトカインのサブユニットを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５）前記Ｃ１が、ケモカインである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６）前記サブユニットが、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットまたはＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを含む、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目７）前記Ｃ１または前記Ｃ２が、ヒトサイトカインである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン（ＶH）を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目９）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、項目１または８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）前記定常領域が、ヒンジ領域ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１１）前記定常領域が、さらにＣＨ１ドメインを含む、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）前記ＶHが、癌特異的抗原またはウイルス抗原と免疫学的に反応性である、項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１３）前記Ｃ１および前記Ｃ２が、前記融合タンパク質に結合される場合、インビボにおいて類似した循環半減期を有する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１４）前記Ｉｇ、前記Ｃ１、および前記Ｃ２が、同じ条件下において全て活性である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１５）多機能タンパク質複合体であって、
免疫グロブリン領域および第１のサイトカインの第１の部分を規定する、第１のポリペプチド鎖、および
第２のサイトカインおよび該第１のサイトカインの第２の部分を規定する、第２のポリペプチド鎖、
を含む、多機能タンパク質複合体。
（項目１６）前記第１のポリペプチド鎖が、前記第２のポリペプチド鎖に共有結合される、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目１７）前記第１のサイトカインが、二量体サイトカインである、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目１８）前記第１のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目１９）前記第２のサイトカインが、ＩＬ−２である、項目１５に記載の多機能タンパク質複合体。
（項目２０）多機能タンパク質複合体であって、少なくとも：
免疫グロブリン軽鎖の少なくとも一部に融合された第１のサイトカインを含む、第１の融合タンパク質、および
免疫グロブリン重鎖の少なくとも一部に融合された第２の異なるサイトカインを含む、第２の融合タンパク質、
を含む、多機能タンパク質複合体。
（項目２１）前記第１の融合タンパク質が、前記第２の融合タンパク質に共有結合される、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２２）前記免疫グロブリン軽鎖の一部が、前記免疫グロブリン重鎖の一部にジスルフィド結合される、項目２１に記載のタンパク質複合体。
（項目２３）前記第１のサイトカインのアミノ末端が、前記免疫グロブリン軽鎖のカルボキシ末端に融合される、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２４）前記第２のサイトカインのアミノ末端が、前記免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端に融合される、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２５）前記第１のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２６）前記第２のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目２０に記載のタンパク質複合体。
（項目２７）第１のサイトカイン（Ｃ１）および第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）を規定するポリペプチド鎖を含む、多機能融合タンパク質であって、ここで、該Ｃ２は、遊離の場合、遊離のＣ１の約２倍より大きいインビボにおける循環半減期を有するが、該Ｃ１が該融合タンパク質において該Ｃ２に連結される場合、該Ｃ１は、該融合タンパク質において該Ｃ２とほぼ同じのインビボにおける循環半減期を有する、多機能融合タンパク質。
（項目２８）前記Ｃ１が、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目２９）前記Ｃ２が、ＩＬ−４、ＩＬ−１２またはこれらのサブユニットである、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３０）前記Ｃ１のＣ末端が、前記Ｃ２のＮ末端に連結される、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３１）前記Ｃ２のＣ末端が、前記Ｃ１のＮ末端に連結される、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３２）前記Ｃ末端が、前記Ｎ末端にポリペプチドリンカーを介して連結される、項目３０または３１に記載の融合タンパク質。
（項目３３）免疫グロブリン領域（Ｉｇ）をさらに含む、項目３２に記載の融合タンパク質。
（項目３４）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン（ＶH）を含む、項目３３に記載の融合タンパク質。
（項目３５）前記Ｉｇが、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、項目３３に記載の融合タンパク質。
（項目３６）前記定常領域が、ヒンジ領域ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３７）前記重鎖定常領域が、ＣＨ１ドメインをさらに含む、項目３６に記載の融合タンパク質。
（項目３８）前記遊離のＣ２が、Ｃ１よりも少なくとも約４倍大きいインビボにおける循環半減期を有する、項目２７に記載の融合タンパク質。
（項目３９）前記Ｃ２が、Ｃ１よりも約８倍大きい循環半減期を有する、項目３８に記載の融合タンパク質。
（項目４０）項目１、１５、２０または２７に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
（項目４１）項目４０に記載の核酸を含む、細胞。
（項目４２）融合タンパク質を調製する方法であって、該融合タンパク質は、第１のサイトカイン（Ｃ１）、第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）、および哺乳動物において予め選択された位置を標的化し得る標的化部分を含み、該方法は、以下の工程：
（ａ）宿主細胞において融合タンパク質をコードする核酸を発現させる工程であって、該融合タンパク質は、Ｃ１、Ｃ２および該融合タンパク質が該哺乳動物に投与された場合に予め選択された位置において該融合タンパク質を標的化し得る標的化部分を含む、工程；および
（ｂ）該融合タンパク質を収集する工程
を包含する、方法。
（項目４３）第１のサイトカイン（Ｃ１）および第２の異なるサイトカイン（Ｃ２）を、哺乳動物において予め選択された位置に対して標的化する方法であって、該方法は、以下：
該哺乳動物に多機能融合タンパク質を投与する工程であって、該多機能融合タンパク質は、Ｃ１、Ｃ２、および該融合タンパク質を該哺乳動物において予め選択された位置に対して標的化し得る免疫グロブリン領域（Ｉｇ）を含む、工程、
を包含する、方法。
（項目４４）項目４２または４３に記載の方法であって、前記Ｉｇが、前記哺乳動物において前記予め選択された位置に配置された抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインを含む、方法。
（項目４５）前記抗原が、癌特異的抗原またはウイルス抗原である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）項目４２または４３に記載の方法であって、前記Ｉｇが、前記哺乳動物において前記予め選択された位置に配置された免疫グロブリンＦｃレセプターに結合し得る免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、方法。
（項目４７）前記Ｉｇ、前記Ｃ１、および前記Ｃ２が、前記融合タンパク質が前記哺乳動物に投与された場合に、全て活性である、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４８）前記哺乳動物が、ヒトである、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４９）前記Ｃ１が、ＩＬ−１２またはそのサブユニットである、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５０）前記Ｃ２が、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、項目１、１５、２０または２７に記載のタンパク質を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５２）哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、項目４０に記載の核酸を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５３）哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、項目４１に記載の細胞を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
前述および本発明の他の目的、ならびにそれらの様々な特徴は、添付の図面と共に読むときに、以下の記述から、より完全に理解され得る、図面の全体を通じて、同様の数は、同様の構造を言及する。
【図１】図１Ａは、２つのサイトカインの融合をその最も簡単な形態で略図で図解する：１つのサイトカインが、必要に応じてリンカーを介して第２のサイトカインと融合される。図１Ｂ〜１Ｉは、第２のサイトカイン（「ｃｙｔ」と標示された）が、ヘテロ二量体サイトカインＩＬ−１２と結び付けられ得る、様々な方法を示す。特に、第２のサイトカインは、ｐ４０のＣ−末端（図１Ｂ）、ｐ４０のＮ−末端（図１Ｃ）、ｐ３５のＣ−末端（図１Ｄ）またはｐ３５のＮ−末端（図１Ｅ）と融合され得る。さらに、図１は、第２のサイトカインが、ＩＬ−１２の単鎖バージョンと融合され得る方法を示す。特に、単鎖ＩＬ−１２分子は、ｐ３５のＮ−末端からｐ４０に向かい、そのＣ−末端（図１Ｆ）またはＮ−末端（図１Ｇ）で第２のサイトカインを有し得る。あるいは、単鎖ＩＬ−１２分子は、ｐ４０のＮ−末端からｐ３５に向かい、そのＣ−末端（図１Ｈ）またはＮ−末端（図１Ｉ）で第２のサイカインと共に、ｐ３５のＮ−末端とＰ４０を有し得る。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、図１で描かれた複合サイトカイン融合体（箱）が、抗体のＦｃ領域（ここではヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（長円形）として示される）とさらに融合され得る方法を、略図的に示す。特に、図１の８分子のいずれかは、Ｆｃ領域のＣ−末端（図２Ａ）またはＮ−末端（図２Ｂ）のいずれかと融合され得る。さらに、第１のサイトカインおよび第２のサイトカイン（それぞれ箱）は、それぞれと直接結び付けられる必要はないが、Ｆｃ部分を介して結合され得る（図２Ｃ）。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｇは、複合サイトカイン融合タンパク質が、さらにＩｇＧなどのインタクトな免疫グロブリンと融合され得る方法のサブセットを略図的に示す。重鎖Ｖ領域は、ＶHと標示された長円形として示され、軽鎖Ｖ領域は、ＶLと標示された長円形として示され、そして、定常領域は、空白の長円形である。図１に図解した複合サイトカイン融合体は、重鎖のＣ−末端（図３Ａ）、重鎖のＮ−末端（図３Ｂ）軽鎖のＮ−末端（図３Ｃ）または軽鎖のＣ−末端（図３Ｄ）に配置され得る。さらに、多くの方法があり、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、重鎖および軽鎖のＮ−末端およびＣ−末端で、別個に結び付けられ得る、これらの３つを、図３Ｅ〜３Ｇに示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｇは、複合サイトカイン融合タンパク質が、さらにＩｇＧなどのインタクトな免疫グロブリンと融合され得る方法のサブセットを略図的に示す。重鎖Ｖ領域は、ＶHと標示された長円形として示され、軽鎖Ｖ領域は、ＶLと標示された長円形として示され、そして、定常領域は、空白の長円形である。図１に図解した複合サイトカイン融合体は、重鎖のＣ−末端（図３Ａ）、重鎖のＮ−末端（図３Ｂ）軽鎖のＮ−末端（図３Ｃ）または軽鎖のＣ−末端（図３Ｄ）に配置され得る。さらに、多くの方法があり、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、重鎖および軽鎖のＮ−末端およびＣ−末端で、別個に結び付けられ得る、これらの３つを、図３Ｅ〜３Ｇに示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、可変軽鎖および可変重鎖が融合された「単鎖」抗体と、融合され得、そして、タンパク質が単一ポリペプチドとして発現され、次いでホモ二量化される方法を、略図的に示す。特に、複合サイトカイン融合は、Ｃ−末端（図４Ａ）またはＮ−末端（図４Ｂ）に配置され得る。さらに、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインが、それぞれと直接結び付けられる必要はないが、単鎖抗体部分を介して結合され得る（図４Ｃ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、第１のサイトカインと第２のサイトカインが、重鎖および軽鎖由来の融合された可変領域からなる単鎖Ｆｖ領域と融合され得る方法を略図的に示す。特に、第１のサイトカイン−サイトカイン融合は、Ｃ−末端（図５Ａ）またはＮ−末端（図５Ｂ）で配置され得る。さらに、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインは、直接結び付けられる必要はないが、単鎖Ｆｖ部分を介して結合され得る（図５Ｃ）。
【図６Ａ】図６Ａは、別個のサイトカインまたは融合タンパク質に応答したヒト末梢血球単核細胞（ＰＢＭＣ）によるインターフェロン−γの誘導における、ＩＬ−１２とＩＬ−２との間の相乗効果を示す。図６Ａにおいて、細胞を、植物性血球凝集素活性の前（四角）もしくは後（×）にヒトＩＬ−１２を使用して、または植物性血球凝集素活性の前（ひし形）もしくは後（三角）にＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を使用して処理した。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは、融合タンパク質として存在するＩＬ−１２の濃度を、ｐｇ／ｍｌで示す。ｙ軸は、ＥＬＩＳＡでアッセイされたＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、別個のサイトカインまたは融合タンパク質に応答したヒト末梢血球単核細胞（ＰＢＭＣ）によるインターフェロン−γの誘導における、ＩＬ−１２とＩＬ−２との間の相乗効果を示す。図６Ｂは、細胞を、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を１：１のモル比で添加した混合物（黒色ひし形）、ヒトＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（灰色四角）およびヒト抗体−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（明るい灰色三角）を用いて処置した実験を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは、融合タンパク質として存在するＩＬ−１２の濃度を、ｐｇ／ｍｌで示す。ｙ軸は、ＥＬＩＳＡでアッセイされたＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図７】図７は、別々に融合タンパク質の活性を測定し、そして、非融合ＩＬ−１２分子の活性と融合タンパク質の活性を比較する、典型的なＩＬ−１２のバイオアッセイを示す。描かれているのは、マウスＩＬ−１２（白丸）、マウスＩＬ−１２およびＩＬ−２を１：１のモル比で添加された混合物（黒四角）、マウスＩＬ−２（白三角）および抗体−マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（黒ひし形）に応答した、ヒトＰＢＭＣの3Ｈ−チミジン取り込みの刺激である。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質として、または融合タンパク質として存在する単量体のサイトカインの濃度（ｐＭ）を示し；ｙ軸はトリチウムチミジン組み込みのｃｐｍを示す。
【図８】図８は、標準ＩＬ−２バイオ活性アッセイを示す。グラフは、マウスＩＬ−２（丸）、抗体−マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（ひし形）およびマウスＩＬ−１２（四角）に応答した、マウスＣＴＬＬ細胞増殖の刺激を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質として、または融合タンパク質として存在する単量体サイトカインの濃度（ｐＭ）を示す。細胞を、様々な量のサイトカインまたは融合タンパク質を含む培地で、４８時間、インキュベートし、次いで、ＭＴＴ／ＭＴＳアッセイを使用して、生存細胞数をアッセイした。ｙ軸は、光学密度（ＯＤ）の単位にして、４９０ナノメーターの吸光度を示す。
【図９】図９は、マウスＩＬ−１２（白丸）、マウスＩＬ−１２およびＩＬ−２を１：１のモル比で添加した混合物（黒丸）、マウスＦｃ−単鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質（黒三角）およびマウスＩＬ−２と融合されたマウス単鎖ＩＬ−１２（黒ひし形）に応答した、ヒトＰＢＭＣによる3Ｈ−チミジン取り込みの刺激を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは融合タンパク質として存在する単量体のサイトカインの濃度（ｐＭ）を示す；ｙ軸はトリチウムチミジン組み込みのｃｐｍを示す。
【図１０】図１０は、マウスＩＬ−１２（白丸）、マウスＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦを１：１のモル比で添加した混合物（黒丸）、マウスＧＭ−ＣＳＦ（黒三角）およびマウスＦｃ−マウスＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（×）に応答した、ヒトＰＢＭＣによる3Ｈ−チミジン取り込みの刺激を示す。Ｘ軸は、インタクトなタンパク質としてまたは融合タンパク質として存在する、単量体のサイトカインの濃度（ｐＭ）を示す；ｙ軸はトリチウムチミジン組み込みのｃｐｍを示す。
【図１１】図１１は、ＫＳ−１／４の抗原であるヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたＣＴ２６結腸癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するＢａｌｂ／Ｃマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処理の影響を示す。黒ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、６マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、３．４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−２、および５．３マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたＣＴ２６結腸癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合たんぱく質処置の影響を示す。ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、６マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２で処置されたマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、３．４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２および５．３マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２で処置されたマウスの平均腫瘍容積を示す。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１３】図１３は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞の皮下腫瘍を保有するマウスの抗体−サイトカイン処置および抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を比較する。ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２を０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２を０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。Ｘは、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２を０、１、２、３および４日目に腫瘍内注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１４】図１４は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作されたルイス肺癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスの抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を示す。ひし形は、コントロールとして、ＰＢＳを０、１、２、３および４日目に注射したマウスの平均腫瘍容積を示す。三角は、２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、１１．５マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２および１８マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＥｐＣＡＭを発現する、またはしないいずれかのルイス肺癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を示す。黒四角は、ＬＬＣ／ＫＳＡ由来腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍容積を示す。黒ひし形は、ＬＬＣ由来腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍容積を示す。マウスは、０、１、２、３および４日目に２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で処置した。腫瘍内注射を行った。Ｘ軸は、最初の注射後の経過日数を示す；ｙ軸は１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１６】図１６は、ルイス肺癌細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスの、抗体−サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質処置の影響を示す。約１０6の細胞を、０日目に皮下に注射した。ひし形は、ナイーブなマウスの平均腫瘍容積を示す。四角は、ヒトＥｐＣＡＭを発現をするように操作されたルイス肺ガン細胞由来の皮下腫瘍をあらかじめ有しており、そして、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２の処置によってこれらの腫瘍を治癒されたマウスの、平均腫瘍容積を示す。Ｘ軸は、注射後の経過日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、正常な免疫系を有する動物中で、細胞が腫瘍を形成する能力に対する、腫瘍細胞による単一または複合サイトカインタンパク質分泌の影響を示す。図１７Ａにおいて、４セットのマウスを比較した：１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（黒ひし形）；５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白ひし形）；ｓｃＩＬ−１２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（黒三角）；およびｓｃＩＬ−１２を発現する５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白三角）。Ｘ軸は、腫瘍細胞の注射後の日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、正常な免疫系を有する動物中で、細胞が腫瘍を形成する能力に対する、腫瘍細胞による単一または複合サイトカインタンパク質分泌の影響を示す。図１７Ｂは、１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（黒ひし形）；５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白ひし形）；ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（×）；およびｓｃＩＬ−１２を発現する５×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（白丸）。Ｘ軸は、腫瘍細胞の注射後の日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【図１８】図１８は、免疫欠損の動物において細胞が腫瘍を形成する能力に対する、腫瘍細胞による、単一または複合サイトカインタンパク質分泌の影響を示す。この図は、１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＳＣＩＤマウス（黒ひし形）；ｓｃＩＬ−１２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞皮下注射したＳＣＩＤマウス（黒三角）；およびｓｃＩＬ−１２を発現する１×１０6のＬＬＣ腫瘍細胞を皮下注射したＳＣＩＤマウス（白丸）を比較する。Ｘ軸は、腫瘍細胞の注射後の日数を示す；ｙ軸は、１立方ミリメートル中の平均腫瘍容積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、２つ以上の別個のサイトカインが融合または複合体化するタンパク質分子を提供する。そのタンパク質複合体または融合タンパク質は、必要に応じて、さらなるタンパク質部分（抗体Ｆｃ領域および抗原結合部位を含む抗体領域などの多量体化および標的化を可能にする部分を含む）を含む。本発明はまた、複合サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、疾患の処置および医療条件における、複合サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸の構築のための方法、複合サイトカイン融合タンパク質の産生のための方法、および複合サイトカイン融合タンパク質の使用についての方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは、免疫系の細胞の活性を調節する分泌タンパク質またはその活性化フラグメントまたはその変異体をいう。サイトカインの例としては、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、腫瘍壊死因子、免疫細胞前駆体についてのコロニー刺激因子などが挙げられる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ヘテロ二量体サイトカイン」とは、２つの別個のタンパク質サブユニットからなるサイトカインについていう。現在、ＩＬ−１２が、唯一の天然に存在する公知のヘテロ二量体サイトカインである。しかし、人工のヘテロ二量体サイトカインが構築され得る。例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒの可溶性フラグメントは組み合わされ、ＣＮＴＦおよびＣＮＴＦ−Ｒαが形成し得るように、ヘテロ二量体サイトカインを形成し得る［Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８４：４００８］。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「インターロイキン−１２」（ＩＬ−１２）とは、ｐ３５およびｐ４０サブユニット、またはｐ３５およびｐ４０の活性単鎖融合体、または、これらの種改変体、フラグメント、もしくは誘導体からなる２つのサブユニットのサイトカインをいう。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「インターロイキン−２」（ＩＬ−２）とは、任意の哺乳動物ＩＬ−２（例えば、ヒトＩＬ−２、マウスＩＬ−２）または、これらの活性種もしくは対立遺伝子改変体、フラグメントもしくは誘導体をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「ＧＭ−ＣＳＦ」とは、哺乳動物顆粒球／単球コロニー刺激因子サイトカインタンパク質（例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、マウスＧＭ−ＣＳＦ）、またはこれらの活性種もしくは対立遺伝子改変体、フラグメントもしくは誘導体をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはそのアナログもしくはその部分を意味する。例えば、ＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくともヒンジ領域の一部（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み得る。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくともヒンジ領域の一部およびＣＨ３ドメインを含む。別の好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくともＣＨ２領域を含み、そしてより好ましくは、ヒンジ領域の少なくとも一部をまた含む。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「ペプチドリンカー」とは、２つのタンパク質（例えば、タンパク質およびＦｃ領域）を共に結合するために使用される１つ以上のペプチドを意味する。このペプチドリンカーはしばしば、一連のアミノ酸（例えば、主にグリシンおよび／またはセリン）である。好ましくは、このペプチドリンカーは、主にグリシンおよびセリン残基の一連の混合物であり、そして、約１０〜１５アミノ酸長である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「多量体の」とは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）または非共有結合の相互作用を介して２つ以上のタンパク質サブユニットの安定した会合をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「二量体の」とは、２つのタンパク質サブユニットが共有結合または非共有結合の相互作用を介して安定して会合する特定の多量体分子をいう。安定した複合体は、少なくとも数分の解離速度（すなわち、オフの速度）を有する複合体である（結果として、この複合体は、インビボ使用中に標的組織に到達するのに十分な安定した長さであり、そして、生物学的効果を有する）。Ｆｃフラグメントはそれ自身が、代表的に、ヒンジ領域の一部、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む重鎖フラグメントの二量体を形成する。しかし、多数のタンパク質リガンドは、二量体としてそれらのレセプターに結合することが公知である。サイトカインＸが自然に二量体化する場合、Ｆｃ−Ｘ分子のＸ部分は、はるかに大きい程度に、二量体化する。なぜなら、この二量体化プロセスは、濃度依存性であるからである。このＦｃによって結合される２つのＸ部分の物理的近接は、二量体化を細胞内プロセスとし、二量体の方へ平衡状態を大きく変化させ、そして、レセプターに対するこの結合を増強する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」とは、宿主細胞に取り込まれ、そして、組換えられて宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、または、エピソームとして自律的に増幅されるのに適格性のヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。このようなベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの非制限的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子発現」または「タンパク質の発現」とは、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳、およびタンパク質産物の分泌または単離可能な形態でのタンパク質産物の産生のどちらかを意味することが理解される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「免疫サイトカイン」とは、米国特許第５，６５０，１５０号で開示されるように、抗体およびサイトカインを含む融合タンパク質である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「リーダー配列」とは、第２のタンパク質配列（通常Ｎ末端）に付着され、そして、この第２のタンパク質配列を細胞から分泌されるように指向するタンパク質配列である。このリーダー配列は、通常、第２のタンパク質配列から切断されそして除去され、これは、成熟タンパク質となる。この用語「リーダー配列」は、一般的に「シグナル配列」と同義語である。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「ＥｐＣＡＭ」とは、上皮細胞付着分子をいい（Ｃｉｒｕｌｌｉら［１９９８］１４０：１５１９−１５３４）、そして、モノクローナル抗体ＫＳ−１／４によって結合される抗原を意味する「ＫＳＡ」と同義語である。ＥｐＣＡＭは、上皮細胞に由来する癌細胞上で豊富に発現される細胞表面タンパク質である。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ＫＳ−１／４」とは、ＥｐＣＡＭに結合する特定のモノクローナル抗体をいう。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「ＫＳ−ＩＬ２」「ＫＳ−ＩＬ１２」および「ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２」などは、インターロイキン２を有するＫＳ−１／４、インターロイキン１２を有するＫＳ−１／４、ならびにインターロイキン１２およびインターロイキン２の両方を有するＫＳ−１／４からそれぞれなる抗体−サイトカイン融合タンパク質をいう。類似の名前の融合タンパク質構築物もまた本明細書中で使用される。抗体分子のいくつかの部位でサイトカインを融合することが可能であるので、「ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２」などの記載は、明確に他を示さなければ、任意の可能な部位で融合されたインターロイキン１２およびインターロイキン２の両方を有するＫＳ−１／４を含むタンパク質の分類をいう。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「１４．１８」とは、腫瘍特異的抗原ＧＤ２に結合する特定のモノクローナル抗体をいう。
【００４７】
本発明を使用するタンパク質構築物のいくつかの例示的な実施形態は、図１〜５に例示される。図２〜５に概略される分子の一部は、１Ａ〜１Ｉと標識され、図１Ａ〜１Ｉに示される融合タンパク質についていい、そして、図１由来の融合タンパク質のいずれかが、示されるように他のタンパク質にさらに融合され得ることを例示する。サイトカインは長方形として示され、抗体の定常領域は楕円形として示され、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は標識された楕円形として示されている。
【００４８】
本発明は、２つの異なったサイトカインおよび必要に応じてさらなるタンパク質部分を含むタンパク質複合体を記載する。ホモ二量体サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−５、ＩＬ−８など）は、複数のサブユニットを含むが、それにも関わらず、単一のサイトカインである。同様に、ＩＬ−１２などのヘテロ二量体サイトカインは、異なったサブユニットを含むが、単一のサイトカインである。さらに、通常はホモ二量体サイトカインのヘテロ二量体形態（例えば、ＭＣＰ−１／ＭＣＰ−２ヘテロ二量体）または、通常はへテロ二量体サイトカインの２つの対立形質（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［１９９４］２６９：１５９１８−２４）は、単一のサイトカインである。本発明の複合体は、２つの異なったサイトカインを含み、これらのそれぞれ（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１２；ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＣＰ−１およびエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）など）は、免疫系の細胞の活性を調節することができる。
【００４９】
図１Ａは、本発明の好ましい実施形態を示す：融合タンパク質１０では、第１のサイトカイン１２のＣ末端は、必要に応じてリンカー領域を介して（データは示されていない）、第２のサイトカイン１４のＮ末端に融合される。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のタンパク質複合体は、有意に異なる血清の半減期を有する少なくとも２つのサイトカインを含む。例えば、小さいタンパク質および大きいタンパク質を使用することは、しばしば、より大きいタンパク質に特徴的な循環半減期を有する融合タンパク質を生じる。従って、ＩＬ−１２および第２のサイトカインの組み合わせた効果が所望である状況では、以下の一般式の融合タンパク質として２つのサイトカインを発現することが有利である：ＩＬ−１２−ＸまたはＸ−ＩＬ−１２（ここで、Ｘは、第２のサイトカインである）。２つの特定の利点が見出される。第１に、より速く清澄されるサイトカインの血清半減期が延びる。第２に、両方のサイトカインの血清半減期は、お互いに非常に類似するようになる。
【００５０】
ＩＬ−１２などの２鎖のサイトカインは、２鎖のサイトカインのどちらかの鎖のＮ末端またはＣ末端で、別のサイトカインに融合され得る。１つの実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットのいずれかのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合される（図１Ｂ〜１Ｅ）。図１Ｂの融合タンパク質１６では、第１のサイトカイン１２のＮ末端は、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニット１８のＣ末端に融合される。ｐ４０サブユニット１８は、共有結合２２によってＩＬ−１２のｐ３５サブユニット２０に連結される。図１Ｃの融合タンパク質２４では、ｐ４０サブユニット１８のＮ末端は、第１のサイトカイン１２のＣ末端に融合され、そして、共有結合２２によってｐ３５サブユニット２０に連結される。図１Ｄは、第１のサイトカイン１２のＮ末端がｐ３５サブユニット２０のＣ末端に融合される融合タンパク質２６を示し、ｐ３５サブユニット２０は、共有結合２０によって、ｐ４０サブユニット１８に連結される。図１Ｅでは、融合タンパク質２８は、ｐ３５サブユニット２０を含み、これは、そのＮ末端が第１のサイトカイン１２のＣ末端に融合され、そして、共有結合２２によって、ｐ４０サブユニット１８に連結される。
【００５１】
第２の実施形態では、ＩＬ−１２のサブユニットは融合され、Ｎ末端の位置で、ｐ３５サブユニットまたはｐ４０サブユニットのいずれかと、単鎖タンパク質（ｓｃＩＬ−１２）を形成し得る；第２のサイトカインは、生じるｓｃＩＬ−１２のＮ末端またはＣ末端に付着され得る（図１Ｆ〜１Ｉ）。従って、図１Ｆに示される好ましい実施形態では、融合タンパク質３０は、単鎖ＩＬ−１２を含み、ここで、ｐ４０サブユニット１８のＮ末端は、必要に応じてペプチドリンカーを介して、ｐ３５サブユニット２０のＣ末端に融合される。この実施形態では、サイトカイン１２のＮ末端は、ｐ４０サブユニット１８のＣ末端に融合される。図１Ｇに示される実施形態では、ｐ３５サブユニット２０のＮ末端は、必要に応じてペプチドリンカーを介して、サイトカイン１２のＣ末端に融合される。図１Ｈおよび１Ｉは、ｐ３５サブユニットのＮ末端が、必要に応じてペプチドリンカーを介して、ｐ４０サブユニットのＣ末端に融合される、ＩＬ−１２の別の単鎖バージョンを含む融合タンパク質３４および３６を示す。融合タンパク質３４（図１Ｈに示される）において、サイトカイン１２のＮ末端は、ｐ３５サブユニット２０のＣ末端に融合される。融合タンパク質３６（図１Ｉに示される）において、ｐ４０サブユニット１８のＮ末端は、サイトカイン１２のＣ末端に融合される。大いに好ましい実施形態では、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２に融合される。
【００５２】
このような分子の生成は、さらに実施例において例示される。
【００５３】
ヘテロ多量体分子（例えば、ＩＬ−１２または抗体）を、非同一のサブユニットが、短いアミノ酸リンカーによって連結される単鎖分子として発現することは、しばしば、都合がよい［Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９；Ｌｉｅｓｃｈｋｅら（１９９７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：３５；Ｌｉｅｓｃｈｋｅ；Ｇ．Ｊ．およびＭｕｌｌｉｇａｎ；Ｒ．Ｃ．、米国特許第５，８９１，６８０号］。遺伝子融合が構築され、次いで、単一の組換えＤＮＡ構築物を含む細胞中で、所望のタンパク質が発現され得る。このようなヘテロ多量体サイトカインの単鎖バージョンは、さらに、第２のサイトカインに融合され得、これは、さらに、単一の組換えＤＮＡ構築物から発現される所望の活性を有する融合タンパク質を可能にする。このような分子の発現は、実施例で例示される。
【００５４】
本発明はまた、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む融合タンパク質を記載する。この組み合わせは、樹状細胞によって提示される抗原を機能的に刺激する際に、特に有用である。別の有用な融合体は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を含む。これらの両方のサイトカインは、Ｔｈ１応答を促進するが、いくらか異なった相補的な活性を有する。
【００５５】
本発明はまた、多数の別個の融合サイトカインが、多量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得るタンパク質にさらに融合される融合タンパク質を記載する。このような分子の利点は、１つ以上のサイトカインの効力が、二量体化によって、増強され得るということである。いくつかの場合では、このサイトカインが二量体としてそのレセプターに結合するので、二量体化による効力の増強が発生し得る。１つの実施形態では、複合サイトカインは、抗体分子の一部（例えば、Ｆｃ領域）に融合される（図２）。別の実施形態では、ＩＬ−１２および第２のサイトカインは、ホモ二量体化タンパク質部分に融合される。好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。この融合タンパク質は、種々の方法によって作製され得、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までのいくつかの別個のタンパク質部分の全ての多様な順序を反映する。例えば、インターロイキン１２および第２のサイトカインが、Ｆｃ領域に融合される場合、この２つのサイトカインは、両方とも、このＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に対して任意の順序で融合されるかもしれないし、または、一方のサイトカインが、Ｎ末端に融合され、他方がＣ末端に融合されるかもしれない。
【００５６】
これらの順列のいくつかは、図２に例示される。例えば、図２Ａに示される実施形態では、本発明の融合タンパク質４４は、ヒンジ領域３８、ＣＨ２領域４０およびＣＨ３領域４２を含むＦｃ領域のＣ末端に融合される。融合タンパク質４４は、種々の構造を有し得、例えば、図１Ａ〜１Ｉに示される融合タンパク質１０、１６、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６の構造が挙げられる。融合タンパク質４４が、１つより多くのＮ末端およびＣ末端を有する場合（融合タンパク質１６、２４、２６、および２８におけるように）、Ｆｃ領域は、融合タンパク質４４のいずれかのＮ末端に融合され得る。図２Ｂに示されるように、融合タンパク質４４は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合され得る。図２Ｃに示される実施形態では、第１のサイトカイン１２は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合され得、そして、第２のサイトカイン１４は、このＦｃ領域のＣ末端に融合され得る。
【００５７】
（構造的考慮）
サイトカイン（タンパク質の１クラスとしての）は、サイズおよび一般的な折り畳み特性において、類似していることに注意するのは重要である。従って、本明細書中で開示される特定の実施例は、サイトカインタンパク質のファミリーについての複合サイトカイン融合タンパク質をどのように構築するかを例示する。例えば、多くのサイトカインは、「４つのへリックス束」と呼ばれるタンパク質折り畳みクラスに分類される。４つのへリックス束タンパク質としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、エリトロポイエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、ＩＬ−１０、インターフェロン−β、インターフェロン−αおよび密接に関連したインターフェロンτ、ならびにインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。
【００５８】
ＩＬ−５およびＩＮＦ−γを除き、これらのタンパク質の全ては、４つのおおよそ平行なαへリックスおよび２つのクロスオーバー連結を使用して、モノマーとして折り畳まれる。ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを除くそれぞれの場合に、Ｎ末端およびＣ末端は、タンパク質の同じ面上に存在する。４つのへリックス束のタンパク質（ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを除く）は、同じ折り畳みパターンを有するので、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦについて本明細書中に記載される方法はまた、他の４つのへリックス束タンパク質およびモノマーとして折り畳まれる他の小サイトカインタンパク質に適用される。
【００５９】
ケモカインは、細胞外勾配を形成し、そして、免疫細胞の特定のクラスの走化性を媒介すると考えられるサイトカインの特定のクラスである。例えば、ＭＣＰ−１は、単球、マクロファージ、および活性化Ｔ細胞についての化学誘引物質であり；エオタキシンは、好酸球についての化学誘引物質であり；そして、インターロイキン８は、好中球についての化学誘引物質である。これらの化学誘引物質機能に加えて、ケモカインは、他のサイトカインのように、特定の標的細胞における特定の遺伝子の発現を誘導し得る。例えば、ＭＣＰ−１は、血管の平滑筋細胞における組織因子の発現を誘導すると考えられている（Ｓｃｈｅｃｔｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．［１９９７］２７２：２８５６８−７３）。
【００６０】
本発明は、１つ以上のサイトカインがケモカインである、サイトカイン−サイトカイン融合体および抗体−サイトカイン−サイトカイン融合体を開示する。本発明はまた、３つ以上のサイトカインを有するタンパク質構築物を開示し、ここで、１つ以上のサイトカインがケモカインである。例えば、ケモカインＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、マクロファージ化学誘引物質タンパク質、エオタキシン、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＢＬＣは、抗体部分のような他の部分を有するかまたは有さない第２のサイトカインに融合され得る。
【００６１】
例えば、ヒトゲノムは、少なくとも５０のケモカインをコードする。公知のケモカインは、概して、類似の３次元モノマー構造およびタンパク質折り畳みパターンを共有する。従って、本明細書中に開示されるタンパク質構築物および構築ストラテジーの一般的な形態は、種々の公知のケモカインまたは未だ発見されていないケモカインに対して適用され得る。
【００６２】
ケモカインは、３つのβ鎖および１つのαへリックスを有する別個の折り畳みパターンを有する。ケモカインは、モノマーのように折り畳み、次いで、全てではないがいくつかの場合で、折り畳み後、二量体化する。全てのケモカインについて、モノマーサブユニットの折り畳みパターンは、同一であって、そして、全体の構造は、極めて類似している。例えば、インターロイキン−８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質、ＭＩＰ、ＲＡＮＴＥＳ（活性化の際にレギュレートされ、正常なＴ細胞が発現および分泌される）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１、ＭＣＡＦ）、エオタキシン、単球化学誘引物質タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、フラクタルカイン（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）のケモカインドメイン、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−２、ケモカインｈｃｃ−２（マクロファージ炎症性タンパク質−５）、Ｇｒｏ β、サイトカイン誘導性好中球化学誘引物質およびＣＩＮＣ／Ｇｒｏの三次元構造は、Ｘ線結晶学および／またはＮＭＲ法によって決定されている；これらの構造の全ては、同一の折り畳みを示し、そして、一般的に類似している。これらのケモカインは、同一の折り畳みパターンを有しているので、リンホタクチンについて本明細書中で使用される方法はまた、他のケモカインタンパク質にも適用される。
【００６３】
ケモカインの遊離Ｎ末端は、しばしば、その機能について重要である。従って、第２のサイトカイン、抗体部分、または他のタンパク質部分が、このケモカインのＣ末端に融合され得る融合体を構築することは、いくつかの実施形態において有利である。２つの活性なケモカインを含むタンパク質複合体を構築するために、例えば、２つの異なったケモカインを、抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に融合することは有用である。いくつかのケモカイン（例えば、ＩＬ−８）は、生理学的条件下で、二量体である。特定の適用のために、複合サイトカイン抗体融合体（例えば、ＩＬ−８−抗体−サイトカイン融合体）を、融合していないＩＬ−８部分または抗体部分と相互作用しない異なった融合パートナーを有するＩＬ−８部分と共に、同時発現することは有用である。この方法では、異なったＩＬ−８部分は、全てのＩＬ−８部分が抗体鎖に融合された場合に生じ得る空間的束縛または重合なしで、ヘテロ二量体化し得る。次いで、この所望の複合サイトカイン融合タンパク質は、サイズに基づいてかまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａ タンパク質のような抗体結合タンパク質への結合に基づいて、分離され得る。
【００６４】
１つのケモカインを含む複合サイトカイン融合タンパク質については、この融合タンパク質がまた、局在化機能（例えば、抗原に結合する抗体部分）を含む実施形態が、好ましい実施形態である。理論により束縛されることを望まないが、身体へのケモカインの広範な分布は、何も効果を有さないか、またはそのケモカインに対する細胞の一般的な脱感作を導くことが、一般的に考えられている。さらに、ケモカインの化学誘引剤機能は、そのケモカインの濃度差異が存在する場合にのみ、顕著であり得ると考えられている。
【００６５】
好ましい実施形態は、リンホカイン−抗体−インターロイキン−２融合タンパク質である。別の好ましい実施形態は、ケモカインおよび第２のサイトカインの両方が、Ｔｈ１応答を促進する、実施形態である。例えば、ＩＰ−１０およびＩＬ−１２を含む融合タンパク質は、１つの非常に好ましい実施形態である。
【００６６】
（短い血清半減期を有する複数のサイトカインの半減期の延長）
本発明はまた、長い血清半減期を有する第３の部分に融合した、２つのサイトカイン（両方が短い血清半減期を有する）を含む融合タンパク質を記載する。例えば、樹状細胞の刺激が所望である場合には、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの活性を組み合わせることが、有用である（Ｔｈｕｒｎｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ［１９９９］２２３：１−１５；Ｐａｌｕｃｋａら、［１９９８］Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４５８７−４５９５）。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの両方は、短い血清半減期を有する低分子であるので、Ｆｃ領域、ＩＬ−４、およびＧＭ−ＣＳＦを含む融合タンパク質を構築することが、有用である。得られる分子は、樹状細胞の増殖および活性の強力な刺激剤である。同様に、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの両方は、所定の抗原を発現する細胞の部位に対する、組み合わせられたサイトカイン活性を誘導する目的で、抗体のような標的成分に融合され得る。
【００６７】
Ｆｃ領域は、単独でかまたはインタクトな抗体の一部として、複合サイトカイン融合体に、特定の適用に依存して、有利であり得るかまたは不利であり得るいくつかの特性を与え得る。これらの特性としては、二量化、血清半減期の延長、相補体を固定する能力、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力、およびＦｃレセプターへの結合が挙げられる。血清半減期の延長が、主として望ましい特徴であり、そしてＦｃ領域の免疫学的特性が重要ではないかまたは所望ではない場合には、天然の改変体であるかまたは１つ以上の免疫学的特性を欠く変異体である、Ｆｃ領域を使用することが、好ましい。例えば、短い血清半減期を有する２つ以上のサイトカインの血清半減期を等しくし、そして延長することが望ましい場合には、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４（これらはそれぞれ、Ｆｃレセプターに対する親和性が減少しているかまたは有さない）由来のＦｃ領域を含む複合サイトカイン融合タンパク質を構築すること、あるいはＦｃレセプター結合部位において変異を有するＦｃ領域を使用することが、好ましい。実際に、いくつかのサイトカインが抗体に融合することによって、この融合タンパク質のＦｃレセプターに対する親和性が増加すること、およびこのことによって、動物におけるクリアランスの速度がより速くなることが、既に示されている。Ｆｃレセプターに対する親和性が減少したＦｃ領域を使用することは、これらの分子の血清半減期を大いに改善することが示された（Ｇｉｌｌｉｅｓら、［１９９９］Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２１５９−２１６６）。いくつかの状況下において、そして使用されるサイトカインに依存して、Ｆｃレセプターに結合するＦｃ領域は、複合サイトカイン融合タンパク質のインターナリゼーション、および１以上のサイトカイン部分の分解を生じる。
【００６８】
（標的化）
本発明はまた、２つ以上のサイトカインが、これらのサイトカインを特定の標的分子、細胞、または身体位置に局在化させ得るタンパク質に付着した、融合タンパク質を記載する。局在化能力を有する好ましい分子は、抗体、または抗体の抗原結合可変領域を含む部分である。しかし、他の局在化分子（またはそのドメイン）が使用され得る（例えば、特定のリガンドまたはレセプター、天然に存在する結合タンパク質、特定の基質に結合する酵素、特定の結合能力または局在化能力に関して選択された人工的に生成したペプチド、標的化能力を生じる別の物理化学的特性を有するペプチド、標的化される別の分子に結合することによって標的化能力を有するタンパク質、あるいは他の型のタンパク質）。２つのサイトカインを標的化分子に融合させる場合には、好ましい第１のサイトカインは、ＩＬ−１２である。ＩＬ−１２が使用される場合には、好ましい第２のサイトカインは、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００６９】
抗体の場合には、２つ以上のサイトカインが融合され得る多数の方法が存在する。なぜなら、いくつかの付着可能な部位が存在するからである。例えば、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。これら２つのサイトカインは、互いに融合され、次いで、この重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。あるいは、各サイトカインは、抗体分子のＮ末端またはＣ末端の１つに、別々に融合し得る。
【００７０】
図３は、２つのサイトカインが１つの抗体分子に融合し得る様式のサブセットを示す。例えば、図３Ａを参照すると、本発明の融合タンパク質４４は、免疫グロブリン重鎖４６のＣ末端に融合し得、この重鎖は、免疫グロブリン軽鎖４８に結合している。図２においてと同様に、融合タンパク質４４は、種々の構造（例えば、図１Ａ〜１Ｉに示す、融合タンパク質１０、１６、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６の構造を含む）を有し得る。図３Ｂに示すように、融合タンパク質４４は、免疫グロブリン軽鎖４８に結合した免疫グロブリン重鎖４６のＮ末端に、融合し得る。図３Ｃおよび３Ｄに示す実施形態においては、融合タンパク質４４は、免疫グロブリン重鎖４６に結合した免疫グロブリン軽鎖４８のＮ末端（図３Ｃ）またはＣ末端（図３Ｄ）に融合する。図３Ｅおよび３Ｆに示すように、第１のサイトカイン１２は、第２のサイトカイン１４に融合した免疫グロブリン重鎖４６に結合した、免疫グロブリン軽鎖４８に融合し得る。サイトカイン１２および１４は、免疫グロブリン鎖のＮ末端（図３Ｅ）またはＣ末端（図３Ｆ）に融合し得る。あるいは、図３Ｇにおいてと同様に、第１のサイトカイン１２は、免疫グロブリン軽鎖４８のＮ末端に融合し得、一方で第２のサイトカイン１４は、免疫グロブリン重鎖４６のＣ末端に融合する。
【００７１】
（単鎖抗体への融合）
抗体を単鎖分子として表すことが、時々好都合である。本発明はまた、２つ以上のサイトカインが単鎖抗体に融合した、融合タンパク質を提供する。これは、所望の融合タンパク質を発現させる場合に使用されるＤＮＡ構築物の数を減少させるという利点を有し、このことは、遺伝子治療において特に有用であり得る。特に、サイトカインが単鎖分子である場合には、これらのサイトカインの、単鎖抗体への融合は、融合タンパク質が単一のタンパク質鎖として発現することを可能にする。
【００７２】
図４Ａ〜４Ｃに示されるように、いくつかの実施形態において、サイトカインは、単鎖抗体に、そのＮ末端、そのＣ末端、または両方の末端において、融合し得る。例えば、図４Ａに示すように、融合タンパク質４４は、軽鎖可変領域５２および重鎖可変領域５４を有する単鎖抗体５０のＣ末端に融合し得る。図４Ｂに示すように、融合タンパク質４４はまた、単鎖抗体５０のＮ末端に融合し得る。図４Ｃに示す実施形態においては、第１のサイトカイン１２は、単鎖抗体５０のＮ末端に融合し、そして第２のサイトカイン１４は、単鎖抗体５０のＣ末端に融合する。
【００７３】
好ましい実施形態は、ＩＬ−１２および単鎖抗体に対する第２のサイトカインの融合体を含む。より好ましい実施形態は、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦを、第２のサイトカインとして含む。
【００７４】
抗体の定常領域は、種々のエフェクター機能を媒介する可能性を有する。例えば、ＩｇＧ１は、相補体の結合、ＡＤＣＣ，およびＦｃレセプターへの結合を媒介する。サイトカインが融合する位置は、抗体定常領域のエフェクター機能を変化させ得、このことは、これらのエフェクター機能の改変が所望である場合に、有用である。
【００７５】
いくつかの場合においては、２つ以上のサイトカインの、抗体の標的化領域を有するが定常領域を有さない部分への融合体を構築することが、望ましくあり得る。このような融合タンパク質は、２つ以上のサイトカインへの完全抗体の融合体より小さく、このことは、特定の目的において有利であり得る。さらに、このような融合タンパク質は、インタクトな抗体の１つ以上のエフェクター機能を欠くが、抗体の標的化能力を維持する。
【００７６】
従って、本発明は、２つ以上のサイトカインが１つの単鎖Ｆｖ領域に融合した、融合タンパク質を特徴とする。図５Ａ〜５Ｃに図示する実施形態に示すように、２つのサイトカインが、Ｆｖ領域のＮ末端もしくはＣ末端に融合され得るか、または１つのサイトカインが各末端に融合され得る。例えば、図５Ａに示すように、本発明の融合タンパク質４４は、免疫グロブリン軽鎖可変領域５２および免疫グロブリン重鎖可変領域５４を含む、単鎖Ｆｖ領域のＣ末端に融合され得る。融合タンパク質４４はまた、図５Ｂに示すように、Ｆｖ領域のＮ末端に融合され得る。図５Ｃに示すように、第１のサイトカイン１２がＦｖ領域のＮ末端に融合し得、そして第２のサイトカイン１４がＦｖ領域のＣ末端に融合し得る。
【００７７】
（複数のサイトカインのためのヘテロ二量体ビヒクルとしての抗体）
いくつかの状況において、サイトカインの２つに関してタンパク質の同一の末端が活性のために必須である、２つ以上のサイトカインの融合体を構築することが、望ましい。例えば、２つの異なるサイトカインの天然に存在するＮ末端が、各サイトカインの活性のために必須であり得る。両方のサイトカイン部分が活性である単一ポリペプチド鎖融合タンパク質を構築することは、不可能である。
【００７８】
抗体とは、ジスルフィド結合によって共有結合される重鎖および軽鎖からなる、ヘテロ二量体タンパク質である。両方がインタクトな融合していないＮ末端を必要とする２つのサイトカイン部分を有する、複合サイトカイン融合タンパク質を構築することが、所望である場合には、これら２つのサイトカインを抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に別々に融合させることが、好ましい（図３Ｅ）。同様に、両方がインタクトな融合していないＣ末端を必要とする２つのサイトカイン部分を有する、複合サイトカイン融合タンパク質を構築することが所望である場合には、これら２つのサイトカインを、抗体の重鎖および軽鎖のＣ末端に別個に融合させることが、好ましい（図３Ｆ）。抗体が、２つのサイトカインをこの様式で接続するためのビヒクルとしてのみ使用される場合には、免疫機能に関連するさらなる特性を与える抗体の部分を、変異または欠失させることが、有用であり得る。例えば、Ｆａｂ領域をビヒクルとして使用することは、好ましくあり得る。なぜなら、Ｆａｂ領域は、抗体のヘテロ二量化特性を維持するが、Ｆｃ領域に特徴的な機能を欠くからである。抗原結合部位が非機能的である抗体または抗体フラグメントを使用することもまた、有用であり得る。
【００７９】
抗体への複数のサイトカインの融合は、本発明の新規特徴の多くを組み合わせる。抗体−複合サイトカイン融合体において、これらのサイトカインの血清半減期は、等しくされ、そして延長される；両方のサイトカインの活性は、標的に局在化され、そして特に毒性の効果は、複数の相乗的に作用するサイトカインの全身投与に起因して、回避される；各サイトカインは、効果的に二量化または多量体化される；そしてこれらのサイトカインは、必ずしも直接的に融合される必要はなく、抗体分子の重鎖および軽鎖の異なる部位に融合され得る。
【００８０】
複数のサイトカインおよび１つの抗体を含む融合タンパク質を設計する際には、多数の選択肢および構造が存在し、これらは、慣用的な実験によって区別され得る。構造的生物学的考慮もまた、有用である。例えば、多くのサイトカインは、４ヘリックス束と称されるクラスに入る。これらの構造は、４つのαヘリックスからなり、そして同じ接近のＮ末端およびＣ末端を有する。一般に、Ｎ末端およびＣ末端の周囲のサイトカインの面は、サイトカインレセプターへの結合において使用されず、従って、いずれかの末端が、抗体または第２のサイトカインへの融合のために使用され得る。しかし、４ヘリックス束のサイトカインのＮ末端およびＣ末端の両方を、異なる部分に直接融合させることは、立体的な理由により、時々困難である。２つの異なる４ヘリックス束サイトカインを抗体に融合させることが所望である場合には、従って、各サイトカインをその抗体の異なる部位に融合させることが、有用である。あるいは、Ｉｇ鎖−サイトカイン−サイトカインの形態のポリペプチド鎖を構築することが必要である場合には、１つ以上の可撓性リンカーを使用して、立体の問題を克服し得る。
【００８１】
抗体の代わりに、他の分泌ヘテロ二量体分子を使用して、複数のサイトカインを保有することもまた、可能である。例えば、前立腺特異的抗原およびこれが複合体化するプロテアーゼインヒビター、ＩｇＡ重鎖およびＪ鎖、ＴＧＦ−βファミリーメンバーならびにこれらのアスタシン様結合パートナーを含む複合体、またはＩＬ−１２が、使用され得る。
【００８２】
（核酸）
本発明はまた、上記型のタンパク質の各々を発現し得る核酸を特徴とする。これらとしては、２つ以上のサイトカインを含む融合タンパク質をコードする核酸、２つ以上のサイトカインおよび１つの二量化ドメイン（例えば、Ｆｃ領域）を含む融合体、１つの抗体に融合した２つ以上のサイトカインを含む融合体、ならびに１つのＦｖ領域に融合した２つ以上のサイトカインが挙げられる。これらの核酸の好ましい形態は、ＤＮＡベクターであり、これから、融合タンパク質が、細菌細胞または哺乳動物細胞のいずれかにおいて、発現され得る。複数のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質については、１つより多くのコード核酸が使用され得る。あるいは、２つ以上の融合タンパク質コード配列を、単一の核酸分子上に位置させることが、有用であり得る。これらの例は、複数のサイトカインをコードする特徴付けられた核酸の特定の形態を示す。
【００８３】
本発明の核酸は、複合サイトカイン融合タンパク質の生成のためかまたは遺伝子治療の目的のためかのいずれかで、複合サイトカイン融合タンパク質の発現のために特に有用である。
【００８４】
本発明の有用な実施形態を合成するための方法、ならびにこれらの薬理学的活性を試験するために有用なアッセイは、実施例に記載される。
【００８５】
本発明はまた、薬学的組成物、ならびに広範な種々の疾患の処置および予防（種々の感染および癌の処置、ならびに種々の疾患に対するワクチン接種が挙げられるがこれらに限定されない）におけるこれらの使用の方法を提供する。
【００８６】
複合サイトカイン融合タンパク質を使用して、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染、またはウイルス感染、あるいは癌を処置し得る。例えば、ＩＬ−１２は、多くの型の感染（細菌Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；寄生虫Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ、およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ；真菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ；ならびにウイルスの脈絡髄膜炎ウイルスおよびサイトメガロウイルスによる感染が挙げられるがこれらに限定されない）において、予防的効果を有することが、公知である。サイトカインは、一般に、組み合わせで作用するので、同時に作用することが既知である２つ以上のサイトカインを含む融合タンパク質を使用することは、しばしば有用である。例えば、ＩＬ−２は、ＩＬ−１２の効果と相乗するので、これらのサイトカインを、細菌、寄生虫、真菌およびウイルスによる疾患の処置において組み合わせることは、有用である。
【００８７】
感染性疾患の処置の好ましい方法は、複数のサイトカインを感染の部位に配置する標的化剤にさらに融合した、複合サイトカイン融合タンパク質を使用することである。種々の標的化ストラテジーを、以下に記載する。
【００８８】
本発明の薬学的組成物は、固体、半固体、または液体の投薬形態（例えば、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤などのような）の形態で、好ましくは、正確な投薬量の投与に適した単位投薬形態で、使用され得る。これらの組成物は、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤を含有し、そしてさらに、他の医薬、薬学的薬剤、キャリア、アジュバントなどを含有し得る。このような賦形剤は、他のタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿タンパク質）を含有し得る。このような投薬形態を調製する実際の方法は、公知であるか、または当業者に明らかである。投与される組成物または処方物は、いずれの場合においても、特定の量の活性成分を、処置されている被験体において所望の効果を達成するに有効な量で含有する。
【００８９】
本明細書の組成物の投与は、このような活性を示す薬剤のための投与の受容可能な形態のいずれかにより得る。これらの方法としては、経口投与、非経口投与、または局所投与および他の全身形態が挙げられる。注射は、投与の好ましい方法である。
【００９０】
投与される活性化合物の量は、もちろん、処置されている被験体、苦痛の重篤度、投与の様式、および処方する医師の判断に依存する。
【００９１】
上記のように、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびその他のようなサイトカインは、癌の処置について調査されている。いくつかの状況下においては、癌の処置において、複合サイトカイン融合タンパク質を使用することが有利である。この理由は、より単純な投与、成分サイトカインの１つの増加した血清半減期、および／または２つのサイトカインの相対的活性の優れた調節である。
【００９２】
癌の処置の好ましい方法は、サイトカインの効果が濃縮され得るように、そして全身分布の副作用が回避され得るように、サイトカインを特定の器官または組織に標的化することである。例えば、複数のサイトカインの、Ｆｃ領域への融合体は、肝臓に濃縮されることが予測され、このことは、肝臓に制限される癌を処置する際に、有用であり得る。より好ましい方法は、抗体のような標的化剤にさらに融合された、複合サイトカイン融合タンパク質を使用することである。特に、抗体ＫＳ−１／４および１４．１８は、腫瘍特異的抗原に指向される（Ｖａｒｋｉ ＮＭら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ［１９８４］４４：６８１−７；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１［１９８９］；米国特許第４，９７５，３６９号および同第５，６５０，１５０号）。抗体−複合サイトカイン融合体を使用する場合には、腫瘍の型を調査し、そしてその型の腫瘍に存在しやすい抗原に指向される抗体を選択することが、しばしば有用である。例えば、腫瘍を、ＦＡＣＳ分析、ウェスタンブロット、腫瘍のＤＮＡの試験、または腫瘍細胞の型を単に同定することによって、腫瘍を特徴付けることが、有用であり得る。腫瘍の特徴付けのこのような方法は、腫瘍の特徴付けの当業者（例えば、腫瘍遺伝子学者および腫瘍生物学者）に周知である。複合サイトカイン融合タンパク質を、種々の他の手段（例えば、特定のリガンドまたはレセプター部分への融合、予め選択された結合活性を有するペプチドアプタマーへの融合、局在化特性を有する低分子への化学的結合体化など）によって標的化することもまた、可能である。これらの標的化方法はまた、他の疾患（例えば、感染）の処置のために、使用され得る。
【００９３】
（癌および他の細胞疾患の、遺伝子治療による処置）
本発明の核酸は、癌、および免疫系を特定の細胞型に標的化することが所望である他の疾患の処置のための遺伝子治療剤として、使用され得る。例えば、癌細胞がヒトまたは動物から取り出され、複合サイトカイン融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸がこれらの癌細胞にトランスフェクトされ、次いで、これらの癌細胞がヒトまたは動物に再導入される。あるいは、ＤＮＡが、癌細胞にインサイチュで導入され得る。次いで、このヒトまたは動物は、これらの癌細胞に対する免疫応答を増加させ、このことは、この癌を治癒またはこの癌の重篤度を低下させ得る。哺乳動物細胞における発現を促進するために適切な調節エレメントに結合された、複合サイトカイン遺伝子融合体が、種々の技術（リン酸カルシウム法、「遺伝子銃」、アデノウイルスベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルスベクター、または他の任意の効率的なトランスフェクション方法が挙げられる）のいずれかによって、癌細胞にトランスフェクトされ得る。この核酸は、他の部分にさらに融合された複合サイトカイン融合タンパク質を、コードし得る。
【００９４】
１つより多くの融合サイトカインの融合体を発現する核酸を用いた抗癌遺伝子治療を、融合サイトカイン蛋白質の免疫刺激特性を増大させうる処置などの他の癌治療と組み合わせて行いうる。例えば、本発明核酸は、癌細胞で発現される抗原に対する免疫応答を促進しうる他の蛋白質部分を発現すること、または、そのような蛋白質部分を発現する他の核酸と同時トランスフェクションすることも可能である。特に、Ｂ７副刺激表面蛋白質を発現する核酸を癌細胞に共にトランスフェクションしうる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、米国特許第５，７３８，８５２号）。複合サイトカイン融合を発現する核酸を用いた癌細胞のトランスフェクションはまた、癌細胞を標的とする抗体または免疫サイトカインを用いた処置とともに行われうる（Ｌｏｄｅら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：２４７５）。複合サイトカイン融合蛋白質を発現する核酸を用いた癌細胞のトランスフェクションはまた、血管新生ブロッカーを用いた処置とともに行われうる（Ｌｏｄｅら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９：１５９１）。
【００９５】
付加的な免疫刺激剤および／または血管新生ブロッカーを用いた治療もまた、複合サイトカイン融合蛋白質を用いた全身的治療と組み合わせうる。付加的免疫刺激剤または血管新生ブロッカーを併用した治療の長所は、これらの治療がＤＮＡに損傷を与える薬剤および細胞周期ブロッカーとは異なり、複合サイトカイン融合蛋白質による刺激の結果分裂しうる免疫細胞を殺傷しないということである。
【００９６】
この遺伝子治療方法の好適な実施態様は、ＩＬ−１２および第２のサイトカインをコードする一つ以上の核酸を癌細胞へ導入し、次にその癌細胞をヒトまたは動物へ再導入するということである。第二のサイトカインは、好適には、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００９７】
アジュバントとして融合させた二つ以上のサイトカインを用い、ワクチンを与えられた宿主哺乳類においてある一定の病原体に対して保護的な細胞性免疫応答を誘導することを目的とした新規ワクチン組成およびワクチンの活性賦活方法が、本発明により提供される。例えば、Ｔｈ１免疫応答を所望する場合、複合Ｔｈ−１促進サイトカインを融合させることが可能であり、その結果得られた融合蛋白質を抗原と組み合わせて動物に投与しうる。
【００９８】
特に、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を融合させ、抗原とともに投与しうる。あるいは、ＩＬ−１２およびＩＬ−２をさらに抗原性蛋白質そのものと融合させ、免疫応答に刺激を与えるために使用しうる。この場合、本発明は、宿主細胞性免疫に依存したワクチンに向けられる。つまり、特定の病原性の感染に対する防御反応を引き起こすために細胞傷害性Ｔリンパ球および活性化食細胞を誘導するということである。ＩＬ−１２、ＩＬ−２および抗原という組み合わせは抗原に対するＴｈ１応答を標的としているため、ＩＬ−１２、ＩＬ−２および抗原を含む融合蛋白質を用いたワクチン投与を行うことは特に有用である。ヒトにおいて使用されている、ミョウバンのような、従来のアジュバントは、Ｔｈ２応答を誘導する傾向がある。
【００９９】
Ｔｈ２免疫応答が所望される場合、Ｔｈ−２促進サイトカインの組み合わせを融合させて使用しうる。例えば、単一分子を形成させるために、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を融合させ、その結果得られた融合蛋白質をアジュバントとして使用することは有用でありうる。特に、動物において樹状細胞を補給することが所望される場合、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの組み合わせを融合させたものを、さらに抗原提示細胞との結合を促進するためにＦｃ領域と融合させうる、または、さらに融合サイトカインを腫瘍などの標的細胞へ向けることを可能とする抗体と融合させうる。
【０１００】
本発明はまた、新規治療組成物および、癌細胞上に生じうる選択抗原を含みうる、いわゆる「癌ワクチン」を含む所定の治療組成物との相乗効果をもたらすことを意図した免疫活性賦活方法を提供する。例えば、二つ以上の融合サイトカインを含む蛋白質を直接、適切な経路により、適切に処置された癌細胞とともに投与しうる。
【実施例】
【０１０１】
（実施例）
（実施例１：サイトカイン−サイトカイン融合蛋白質発現を可能とする遺伝子融合体の構築）
複数のサイトカインを持つ多機能蛋白質を得るために、ＩＬ−１２のｐ４０とＩＬ−２との間、およびＩＬ−１２のｐ４０とＧＭ−ＣＳＦとの間の遺伝子融合体を合成した。さらに、成熟マウスｐ３５（配列番号１）のコード配列を、高レベル発現および効率の良い分泌を可能にするプロモーターおよびリーダー配列と融合させた。マウスｐ４０−ＩＬ−２およびｐ４０−ＧＭ−ＣＳＦのコード配列を、それぞれ、配列番号２、配列番号３にて示す。ヒトｐ４０−ＩＬ−２融合体もまた構築した（配列番号４）。ＩｇＧ２ａのマウスＦｃ領域とマウスｐ３５との融合体（配列番号５）および、ＩｇＧ１のヒトＦｃ領域とヒトｐ３５との融合体（配列番号６）を、以前に開示されている発現プラスミド（Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１１：４９５−５００（１９９８）；Ｌｏら、米国特許第５，７２６，０８７号）を用いて構築した。
【０１０２】
成熟マウスおよびヒトｐ３５とＫＳ−１／４抗体重鎖のＣ末端との融合について、Ｇｉｌｌｉｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６０：６１９５−６２０３）により記述されている。成熟マウスおよびヒトｐ３５と１４．１８抗体重鎖のＣ−末端との融合体を類似の方法により構築した（ＰＣＴ 国際公開第ＷＯ９９／２９７３２）。
【０１０３】
ｐ４０とＩＬ−２を融合させること、およびｐ４０とＧＭ−ＣＳＦを融合させることを目的としてここで論じている種類の方法は、一般的に二つ以上のサイトカインの融合に対して適用可能である。特に、Ｃ−末端部分はシグナル配列を必要としない一方、殆どのＮ−末端部分のコード配列には分泌のシグナル配列が含まれている。ある環境下において、二つのサイトカインのコード配列間に、好適には、１０−１５アミノ酸長で、グリシンおよびセリンリッチである短いペプチド性リンカーに対するコード配列を配置することは有用でありうる。全てのそのような種類の融合体作製に関連するＤＮＡ操作は、当該分野の技術の範囲内である。
【０１０４】
例えば、マウスＩＬ−１２ ｐ４０サブユニットおよびマウスＩＬ−２間の融合体構築の詳細は、次に示すものであった。マウスＩＬ−１２のｐ４０サブユニットの全長ｃＤＮＡを、コンカナバリン Ａ（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ Ａ）（培養液中に５μｇ／ｍｌの濃度で、３日間）で活性化されたマウス脾臓細胞からＰＣＲによりクローニングした。フォワードプライマーの配列は、ＡＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＡ ＡＣＣ（配列番号７）で、ＮｈｅＩ部位であるＧＣＴＡＧＣ（配列番号７の第３−８残基）を、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に置いたものであった。リバースプライマーの配列は、ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＧＧＡ ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＧ（配列番号８）で、ＸｈｏＩ部位であるＣＴＣＧＡＧ（配列番号８の第１−６残基）を、翻訳停止コドンＴＡＧ（アンチコドンＣＴＡ）のすぐ下流に置いたものであった。配列確認後、そのネイティブのリーダーとともにｍｕ−ｐ４０を含むＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ消化した発現ベクターｐｄＣｓ（Ｌｏら、（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００）にライゲーションした。ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限部位は、一致する粘着末端を持ち、また、ｍｕ−ｐ４０は内部ＸｂａＩ部位を持つので、ＮｈｅＩ部位をｍｕ−ｐ４０のクローニングのために使用した。
【０１０５】
ｍｕ−ｐ４０−ｍｕＩＬ−２をコードするＤＮＡを構築するために、ｍｕ−ｐ４０ＤＮＡを、そのＰｓｔＩ部位（Ｃ ＴＧＣ ＡＧ）を経由して成熟マウスＩＬ−２のｃＤＮＡを含むＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片とつなぐため、オリゴヌクレオチドリンカーを用いた。融合蛋白質の連結部位のＤＮＡ配列は、Ｃ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＧＡ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＣＣ（配列番号９）で、その中のＣ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号９の第１−６残基）はＰｓｔＩ部位であり、Ｃ ＣＣＧ ＧＧ（配列番号９の第１５−２０残基）はＳｍａＩ部位で、ＴＣＣはマウスｐ４０のＣ−末端アミノ酸残基、ＧＣＡは成熟マウスＩＬ−２のＮ−末端残基であった。
【０１０６】
単鎖ｍｕＩＬ１２−ｍｕＧＭＣＳＦをコードするＤＮＡは、前記単鎖ｍｕＩＬ１２−ｍｕＩＬ２をコードするＤＮＡ構築物に由来し、ｍｕＩＬ２ｃＤＮＡをＳｍａＩ部位でｍｕＧＭＣＳＦ ｃＤＮＡに置き換えることによって構築したものであった。単鎖ｍｕＩＬ１２およびｍｕＧＭＣＳＦの連結部のＤＮＡ配列は、Ｃ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＧＡ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＡ（配列番号１０）であり、Ｃ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号１０の第１−６残基）はＰｓｔＩ部位であり、Ｃ ＣＣＧ ＧＧ（配列番号１０の第１７−２２残基）はＳｍａＩ部位、ＴＣＣはマウスｐ４０のＣ−末端アミノ酸残基、ＧＣＡは成熟マウスＧＭＣＳＦのＮ−末端残基であった。
【０１０７】
（実施例２：ＩＬ−１２融合蛋白質の発現）
ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質を次のように発現させた。ｐ４０融合体をコードする個々のベクターおよびｐ３５を含む蛋白質をコードするベクターの異なる組み合わせを、一時的に融合蛋白質を発現させるためにヒト２９３上皮癌細胞へ同時トランスフェクションした。調製済みキット（Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡを精製し、滅菌するためにエタノール沈殿を行ない、滅菌水で再懸濁した。
【０１０８】
生物学的に活性のあるＩＬ−１２融合蛋白質ヘテロ二量体を発現させるために、ヒト２９３上皮癌細胞の同時トランスフェクションにより、サブユニットの融合体および非融合体をコードする個々のベクターの異なる組み合わせを一時的に発現させた。調製済みキット（Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡを精製し、滅菌するためにエタノール沈殿を行ない、滅菌水で再懸濁した。１０μｇ／ｍｌのＤＮＡ（二つのプラスミドを同時トランスフェクションする場合、それぞれを５μｇずつ含む）を用いて標準的方法によって、リン酸カルシウム沈殿を用意し、およそ７０％コンフレントになった状態で６０ｍｍプレート上にて成長している２９３培養物に、０．５ｍｌ／プレートを添加した（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。１６時間後、沈殿物を含む培地を除去し、新鮮な培地に交換した。３日後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡ、ＩＬ−１２活性の生物学的測定、または免疫沈澱法および放射性標識蛋白質のＳＤＳゲル上での分析により、トランスフェクションされた遺伝子の発現の産生について分析した。標識するために、培養第二日目に、培地を、メチオニンを含まない生育培地に交換し、35Ｓ−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）を添加した。さらに１６時間インキュベーションした後、培地を回収し、遠心（卓上遠心機で５分間、１３，０００ｒｐｍ）により清澄化し、プロテインＡセファロースビーズ（１ｍｌの培養上清に対して１０μｌのビーズ容積を含む）とともにインキュベーションを行った。室温にて１時間置いた後、遠心および１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ＮＰ−４０）を含むＰＢＳバッファーを用いて再懸濁を繰り返し、ビーズを洗浄した。最終的な沈殿物を、ＳＤＳ含有ゲルバッファーで再懸濁し、２分間煮沸した。遠心によりビーズを除去した後、上清を２等分した。一方の試料に還元剤（５％ ２−メルカプトエタノール）を添加し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに充填する前に、両試料を５分間煮沸した。電気泳動後、ゲルをＸ線フィルムに対して曝露した（オートラジオグラフィー）。
【０１０９】
次の発現プラスミドを用いたトランスフェクションを行った。すなわち、ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ＫＳ−１／４−ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０、ＫＳ−１／４−ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、１４．１８−ｍｕ．ｐ３５およびｍｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ｈｕ．Ｆｃ−ｐ３５およびｈｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ＫＳ−１／４−ｈｕ．ｐ３５およびｈｕ．ｐ４０−ＩＬ−２、ならびに１４．１８−ｈｕ．ｐ３５およびｈｕ．ｐ４０−ＩＬ−２である。ここで、「ｍｕ」とは、マウス蛋白質を、「ｈｕ」とは、ヒト蛋白質を意味する。
【０１１０】
35Ｓ−メチオニンで細胞を代謝的に標識し、分泌された蛋白質を還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより試験したところ、それぞれの場合において高レベルの発現が観察された。成分蛋白質の分子量を基にして、還元融合蛋白質の分子量を次のように予測した。すなわち、ＩＬ−１２のｐ３５、３５ｋＤ；ＩＬ−１２のｐ４０、４０ｋＤ；ＩＬ−２、１６ｋＤ；Ｆｃ、３２ｋＤ；Ｉｇ重鎖、５５ｋＤ；およびＩｇ軽鎖、２８ｋＤと予測した。予測した分子量を有する蛋白質移動度が観察された。
【０１１１】
安定的にトランスフェクトされ、複合サイトカイン融合蛋白質を発現している細胞系列もまた分離した。ヘテロ二量体構築物の場合、ＩＬ−１２ ｐ４０−ＩＬ−２融合タンパク質コード化発現ベクターまたはＩＬ−１２ ｐ４０−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質コード化発現ベクターは、ＩＬ−１２ ｐ４０サブユニットのみに関して先に記述されている（Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５−６２０３０）ように構築された。記述されているように（Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５−６２０３０）、ｐ４０融合蛋白質を発現しているトランスフェクション細胞系列に対して、ＩＬ−１２ ｐ３５サブユニット、Ｆｃ−ｐ３５蛋白質または抗体−ｐ３５融合蛋白質発現ベクターのいずれかをコードする発現ベクターを２回トランスフェクションした。
【０１１２】
ヒトＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現している（すなわちＫＳ−ｐ３５およびｐ４０−ＩＬ−２を発現している）安定的トランスフェクション細胞培養液から上清を回収し、製造者の手順（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）に従って、プロテインＡセファロースと結合させ溶出させることにより、その産物を精製した。ＩＬ−１２およびＩＬ−２含量に関して、ＥＬＩＳＡによって精製蛋白質を解析した。その結果から、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の個々のサイトカイン含量において、質量としておよそ４倍の相違があることが示された。これはＩＬ−１２およびＩＬ−２の間の分子量に４倍の相違があることに相関する。同じように、ＥＬＩＳＡによる、ＩＬ−１２およびＩＬ−２レベルに関するヒトＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現しているトランスフェクション細胞の産物解析により、ＩＬ−１２およびＩＬ−２について同様の値が示された。従って、ＥＬＩＳＡの精度の範囲内で、測定値から、ＩＬ−１２およびＩＬ−２がおよそ１：１のモル比で産生されているであろうことが示される。Ｆｃまたは全抗体のどちらかを用いて作製されたＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合蛋白質において同様の結果を得た。
【０１１３】
（実施例３：ＩＦＮ−γ誘導解析における融合蛋白質の相乗活性）
ヒトボランティアから得た休止または分裂促進因子活性化ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）のどちらかを用いたＩＦＮ−γ誘導解析において、ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質の生物学的活性を測定した（図６）。ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１４】
健康なボランティアより、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を得て、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）勾配を用いて遠心（１７００ｒｐｍ、２０分間）し精製した。ＰＢＭＣを含む軟膜を無血清培養液（ＳＦ−ＲＰＭＩ）で５０ｍｌ容積になるように希釈し、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心により回収した。勾配遠心後、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；１０μｇ／ｍｌ）を含む、または含まない、１０％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＲＰＭＩ−１０）で、細胞密度が５ｘ１０6細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁し、加湿ＣＯ2インキュベーター中で、３７℃にて３日間培養を行った。遠心により細胞を回収し、等量のＳＦ−ＲＰＭＩで３回洗浄した後、新鮮なＲＰＭＩ−１０で再懸濁した（１ｘ１０6細胞／ｍｌ）。９６ウェルマルチプレートのウェルに、最終的な細胞数が各ウェルに１０5個になるように、一部（１００μｌ）を添加した。細胞を培養した培養液からの試験試料を新鮮な培養液で連続希釈し、９６ウェルプレートのウェルに添加した。コントロール用ウェルには、ＩＬ−１２（図６Ａ）または、市販のＩＬ−２およびＩＬ−１２の等モル混合物（図６Ｂ；Ｒ＆Ｄシステムより購入したサイトカイン）を添加した。ＣＯ2インキュベーター中で４８時間、３７℃にて、プレートのインキュベーションを行い、製造者（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ．ＵＳＡ）による説明書に従ってＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ濃度を解析するために、一部分（２０μｌ）を分取した。
【０１１５】
図６Ａにおいて、ヒトＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質の活性を、ＩＬ−１２単独の場合と比較した。その結果から、ＩＬ−１２単独の場合はＩＦＮ−γ誘導レベルが中程度であったが、その一方、ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質はＩＦＮ−γ合成を強く誘導したということが示される。ＩＬ−２もまた、ＩＦＮ−γ合成には不十分であることが知られているため、これらの結果から、ＩＬ−１２およびＩＬ−２部分が融合蛋白質中で両方とも機能的であり、また相乗的に機能するということが示される。
【０１１６】
次にＩＦＮ−γ誘導活性に関して、Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質、ＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質およびＩＬ−１２とＩＬ−２の１：１モル比混合物の活性を比較した。図６Ｂにおける結果から、Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質およびＫＳ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質が、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の等モル混合物とほぼ同程度の活性を持つことが示される。ヒト型に対して用いた、実施例１において記述した方法で構築したマウス型のＩＬ−２およびＩＬ−１２を融合蛋白質の構築に使用した場合、同様の結果が得られた。
【０１１７】
（実施例４：ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質のＩＬ−２およびＩＬ−１２生理活性）
増殖を基にした解析において、融合蛋白質におけるＩＬ−２およびＩＬ−１２の活性を遊離サイトカインと比較した。典型的なＩＬ−１２増殖解析において、マウス抗体１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２分子の活性を試験した。ボランティアよりヒトＰＢＭＣｓを得て、標準的な手順（Ｇａｔｅｌｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，Ｒ．およびＰｒｅｓｋｙ，Ｄ．Ｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）ｐｐ．６．１６．６−６．１６．１５）に従って、５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン−Ｐと共に３日間培養し、Ｈａｎｋ‘ｓＨＢＳＳで洗浄した後、１０5細胞／ウェルになるようにマイクロタイタープレートに播種した。様々な試験蛋白質存在下で、４８時間、細胞をインキュベーションし、放射性取り込みレベル測定の１０時間前に０．３μＣｉの3Ｈ−チミジンを添加した。ＩＬ−１２および、ＩＬ−１２およびＩＬ−２の等モル混合物により、用量依存的に細胞への3Ｈ−チミジン取り込みが刺激され、また、１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質は、3Ｈ−チミジン取り込みに対する刺激に関してこれとほぼ同様の効果を示した。3Ｈ−チミジン取り込みに対するＩＬ−２による刺激はより高いモル濃度でしか見られなかったことから、観察された3Ｈ−チミジン取り込みに対する１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質による刺激は、主にＩＬ−１２活性によるものであるということが示された。結果を図７で示す。
【０１１８】
さらに、異なる細胞増殖解析において、標準的手順（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｓ．，Ｌｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．および、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｋ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）ｐ．６．３．１．−６．３．７）に従って、ＩＬ−２部分の生物学的活性について試験した。マウスＣＴＬＬ−２細胞系列の増殖はＩＬ−２に依存する。ＣＴＬＬ−２細胞系列はまた、ＩＬ−４にも応答して増殖しうるが、ＩＬ−１２に対しては応答しない。活発な対数増殖期におけるＣＴＬＬ−２細胞を、ＩＬ−２を含まない培地で２回洗浄し、様々な量の市販マウスＩＬ−２、マウス１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質、または市販マウスＩＬ−１２の存在下で、マイクロタイタープレートに約１ｘ１０4細胞／ウェルになるように播種し、４８時間培養した。増殖期の終わりに、ＭＴＴ／ＭＴＳ解析を用いて生存細胞数を定量した。図８にて、ＩＬ−２，ＩＬ−１２または、１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質レベルを変化させた実験を示す。これらの結果により、マウスＩＬ−１２は量を増やしても検出可能な細胞増殖刺激が見られなかった一方、マウスＩＬ−２およびマウス１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質は、増殖刺激に関してほぼ同等の効力を持つことが示される。この結果から、１４．１８−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質によるＣＴＬＬ−２細胞増殖刺激がＩＬ−２部分によるもので、ＩＬ−１２部分によるものではないことが示される。
【０１１９】
（実施例５：抗体部分を伴う、および伴わない、単鎖および多重鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合蛋白質の構築と発現）
一本鎖マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を、以下のように構築した。ｐ４０−ＩＬ−２コード配列融合体を、実施例１のヒトｐ４０−ＩＬ−２融合体の構築に使用したものと類似の方法によって構築した。ＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットをコードするＤＮＡを連結し、シングルコード配列を作製するために、５’末端にＸｈｏＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するリンカーをコードするＤＮＡを合成した。成熟ｐ４０−ＩＬ−２コード配列の５’末端を改変して、制限部位を導入し、次いで、このリンカーの３’末端に連結した。マウスｐ３５コード配列の３’末端を改変して、制限部位を作製し、そしてこのリンカーのＸｈｏＩ部位に連結した。実施例１に記載されるように、一本鎖のｍｕＩＬ１２およびｍｕ−ｐ４０−ｍｕＩＬ２をコードするｃＤＮＡを、ｐ４０中の好都合な制限部位を用いることによって結合させ、一本鎖ｍｕＩＬ１２−ｍｕＩＬ２をコードする第３のＤＮＡ構築物を得た。これらの工程を、必要とされる場合、種々のベクターおよびＤＮＡフラグメント単離物を用いて実行した。得られたマウスｐ３５−リンカー−ｐ４０−ＩＬ−２コード領域の配列は、配列番号１１である。
【０１２０】
同時に、対応する一本鎖マウスＩＬ−１２コード配列を、対応する方法によって構築した。このコード配列は、配列番号１２である。
【０１２１】
さらに、本発明者らは、さらに、ｐ３５−リンカー−ｐ４０−ＩＬ−２のＮ末端に融合させたＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。
【０１２２】
培養された２９３細胞を、マウス一本鎖Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２およびＦｃ−ＩＬ−１２タンパク質をコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。融合タンパク質の発現を、実施例２に記載されるようにアッセイした。Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡセファロースへのこれらの結合によって精製し、そして高いレベルのＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２およびＦｃ−ＩＬ−１２が、観察された。ＳＤＳゲル上での移動からの見かけ上の分子量（Ｆｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２、１２３ｋＤ；およびＦｃ−ＩＬ−１２、１０７ｋＤ）によって推測されるように、これらのタンパク質をインタクトで合成した。
【０１２３】
実施例１に記載のＫＳ−ｓｃＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質は、２つの異なるポリペプチド鎖（ＫＳ−１／４軽鎖およびＣ末端にｓｃＩＬ１２−ＩＬ２部分を有するＫＳ−１／４重鎖）を有する四量体である。抗体分子上のいずれの部位がサイトカイン部分の付着に適しているかを調べるために、第２の融合タンパク質を構築し、これは、ＫＳ１／４抗体、ＩＬ−１２部分、およびＩＬ−２部分を、実施例１のＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２配置とは異なる配置であった。この第２のタンパク質は、四量体であり、そして２つの異なるポリペプチドからなった。一方のポリペプチドは、ＫＩＳ−１／４抗体の軽鎖から成った。他方のポリペプチドは、ＫＳ−１／４抗体の重鎖の成熟Ｎ末端に融合された一本鎖ｍｕＩＬ１２、続いてこの重鎖のカルボキシル末端のマウスＩＬ−２からなった。
【０１２４】
マウスＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードするｃＤＮＡを、コンカナバリンＡ（培養培地において５μｇ／ｍｌで３日間）で活性化されたマウス脾細胞からＰＣＲによってクローン化した。正方向プライマーは、配列：ＡＡＧＣＴＴ ＧＣＴＡＧＣＡＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＡＣ（配列番号１４）（ここで、ＨｉｎｄＩＩＩ部位であるＡＡＧＣＴＴ（配列番号１４の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置される）を有し、そして逆方向プライマーは、配列：ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＣ（配列番号１５）（ここで、ＸｈｏＩ部位であるＣＴＣＧＡＧ（配列番号１５の残基１〜６）は、翻訳終止コドンＴＧＡ（アンチコドンＴＣＡ）の下流に配置される）を有する。
【０１２５】
一本鎖ＩＬ−１２をコードするこのＤＮＡは、グリシン残基およびセリン残基に富むリンカーをコードするオリゴヌクレオチドに連結されたｍｕｐ３５ ＤＮＡ、続いてｍｕｐ４０ ＤＮＡから成る。得られた構築物は、オリゴヌクレオチド連結部に以下：
【０１２６】
【化１】
の配列を有する。ここで、Ｇ ＡＧＣ ＴＣ（配列番号１６の残基１〜６）は、マウスｐ３５翻訳終止コドンのちょうど上流のＳａｃＩ制限部位であり、ＧＣＧは、マウスｐ３５のＣ末端アミノ酸残基をコードし、ＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号１６の残基５０〜５５）は、連結を容易にするために導入されたＢａｍＨＩ制限部位であり、そしてＡＴＧは、成熟ｍｕ−ｐ４０のＮ末端残基をコードする。
【０１２７】
一本鎖ｍｕＩＬ１２−ＫＳ重鎖−ｍｕＧＭＣＳＦをコードするＤＮＡは、ｍｕｐ４０およびＫＳ重鎖の成熟Ｎ末端の連結部に、以下：
【０１２８】
【化２】
の配列を有する。ここで、ここで、Ｃ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号１８の残基１〜６）は、マウスｐ４０翻訳終止コドンのちょうど上流のＰｓｔＩ部位であり、ＴＣＣは、マウスｐ４０のＣ末端アミノ酸残基をコードし、ＣＡＧは、成熟ＫＳ重鎖のＮ末端残基をコードする。次いで、一本鎖ｍｕＩＬ１２−ＫＳ重鎖−ｍｕＩＬ２をコードする得られたＤＮＡを、ＫＳ軽鎖と共に同時発現させた。
【０１２９】
抗体分子のどの末端が融合連結の作製に利用可能であるかをさらに調べるため、そしてどのように多くの異なるポリペプチドが複合サイトカイン融合タンパク質にアセンブルされ得るかを調べるために、ＫＳ−１／４、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２を含む第３のタンパク質（すなわち、ＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２）を、発現させ、そして活性に関して試験した。この融合タンパク質は、六量体であり、そして３つの異なるポリペプチドを含む。１つのポリペプチドは、ＫＳ１／４抗体の軽鎖に融合したマウスｐ３５からなる。第２のポリペプチドは、ヒトＩＬ−２に融合したＫＳ１／４抗体の重鎖からなる（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１４２８）、そして第３のポリペプチドは、マウスｐ４０である。発現の際、２つの軽鎖および２つの重鎖が、ジスルフィド結合して、四量体の抗体−サイトカイン構造を形成する。さらに、軽鎖のＮ末端におけるｐ３５もまた、ｐ４０とジスルフィド結合する。
【０１３０】
ｍｕｐ３５−ＫＳ軽鎖をコードするＤＮＡは、その連結部に以下：
【０１３１】
【化３】
の配列を有する。ここで、Ｇ ＡＧＣ ＴＣ（配列番号２０の残基１〜６）は、マウスｐ３５翻訳終止コドンのすぐ上流のＳａｃＩ制限部位であり、ＧＣＧは、マウスｐ３５のＣ末端アミノ酸残基をコードし、ＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号２０の残基５０〜５５）は、連結を容易にするために導入されたＢａｍＨＩ制限部位であり、そしてＧＡＧは、軽鎖のＮ末端アミノ酸残基をコードする。
【０１３２】
この六量体融合タンパク質の発現のために、マウスｐ４０を発現する細胞株を、ネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターでのトランスフェクションおよびＧ４１８による選択によって作製した。次いで、マウスｐ４０を発現する細胞株を、軽鎖および重鎖の転写単位およびジヒドロ葉酸還元酵素選択マーカー（これは、メトトレキサートによる選択を可能にする（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１９５））の両方を含む発現ベクターでトランスフェクトした。
【０１３３】
（実施例６：マウス一本鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質の活性）
実施例４に使用される方法と同じ方法を使用して、一過性発現によって産生されるマウス一本鎖ＩＬ−１２−ＩＬ−２の活性を試験した。細胞培養上清における各サイトカインの量を、まずＥＬＩＳＡによって決定し、そしてこれを使用して、用量応答曲線を設定した。この活性は、Ｆｃおよび抗体ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を用いて見出されたことならびに上記のことと親密に対応した。
【０１３４】
詳細には、マウス一本鎖（ｓｃ）ＩＬ−１２−ＩＬ−２およびマウスＦｃ ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２分子のＩＬ−１２活性を、実施例４に記載されるヒトＰＢＭＣ細胞増殖アッセイにおいて試験した。ＩＬ−１２ならびにＩＬ−１２およびＩＬ−２の等モル混合物は、細胞への3Ｈ−チミジンの取り込みを用量依存的様式で刺激した。１モル濃度当たりの基準に対して、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質およびＦｃ−ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質の両方は、3Ｈ−チミジン取り込みの刺激の際にほぼＩＬ−１２のように効果的であった（図９）。実施例４に記載されるように、ＩＬ−２は、3Ｈ−チミジンの取り込みを、最も高いモル濃度でのみ刺激し、これは、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質によって刺激された3Ｈ−チミジンの観察された取り込みが、主にそのＩＬ−１２活性に起因することを示す。
【０１３５】
さらに、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質におけるＩＬ−２部分の生物学的活性を、細胞ベースのアッセイで試験し、そして、このアッセイの正確さの範囲内に対し、１モルの基準に対して市販のＩＬ−２とほぼ同じであることが見出された。ＩＬ−２部分の生物学的活性を、実施例４に記載されるように、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイにおいて試験した。この結果により、マウスＩＬ−２、マウスｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２、およびマウスＦｃ−ＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質が、刺激増幅においてほぼ等しい効力であることが示される。マウスＩＬ−１２は、検出可能なＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激を生じなかった。これらの結果により、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質によるＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激が、ＩＬ−１２部分ではなく、ＩＬ−２部分に起因したことが示される。
【０１３６】
実施例５に記載されるＦｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２、およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２のタンパク質の、ＩＬ−１２活性およびＩＬ−２活性をまた、細胞ベースのアッセイにおいて試験した。ＰＢＭＣ細胞増殖／トリチル化チミジン取り込みアッセイを用いて、Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２、およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２タンパク質の全てが、強力なＩＬ−１２活性を示した。同様に、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを用いて、Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２、およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２タンパク質は全て、強力なＩＬ−２活性を示した。さらに、ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＬ１２−ＫＳ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＫＳ（軽鎖）＋ＫＳ（重鎖）−ＩＬ２タンパク質は両方とも、例え、重鎖および軽鎖のＶ領域がそれぞれそれらのＮ末端において別のタンパク質に融合していたとしても、ＥｐＣＡＭ抗原にしっかりと結合した。
【０１３７】
（実施例７．マウスＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の活性）
マウスＦｃ−ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ分子のＩＬ−１２活性を、細胞増殖アッセイにおいて試験した（図１０）。ヒトＰＢＭＣを、３人のボランティアから得て、そして５μｇ／ｍｌ フィトヘマグルチニン−Ｐを用いて３日間培養し、Ｈａｎｋ’ｓ ＨＢＳＳを用いて洗浄し、そして１ウェル当たり１０5細胞でマイクロタイタープレートにプレートした（これらは、標準的な手順（Ｇａｔｅｌｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，Ｒ．，およびＰｒｅｓｋｙ，Ｄ．Ｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）６．１６．１−６．１６．１５頁）に従った））。細胞を、種々の試験タンパク質の存在下で４８時間インキュベートし、次いで、０．３マイクロキュリーの3Ｈ−チミジンを、放射性取り込みのレベルを決定する１０時間前に添加した。ＩＬ−１２およびＩＬ−１２とＧＭ−ＣＳＦの等モル混合物は、3Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを用量依存様式で刺激し、そして、１４．１８−ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、3Ｈ−チミジンの刺激取り込みにおいてほぼ等しい効率であった。ＧＭ−ＣＳＦは、試験された濃度において3Ｈ−チミジンの取り込みを刺激しなかった。これは、１４．１８−ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質によって刺激された3Ｈ−チミジンの観察された取り込みが、主に、そのＩＬ−１２活性に起因したことを示す。
【０１３８】
さらに、種々のＩＬ−１２−Ｇｍ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ部分の生物学的活性を、細胞ベースのアッセイにおいて試験した。これにより、ＧＭ−ＣＳＦ部分が活性であり、これは市販のＧＭ−ＣＳＦと同じ一般的な範囲である１分子当たりの活性を伴った。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ部分の生物学的活性を、分子免疫学の当業者に公知の手順に従って異なる細胞増殖アッセイにおいて試験する（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．Ｃ．およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）６．４．１−６．４．０頁）。マウス３２Ｄ（ＧＭ）細胞株は、増殖に関してＧＭ−ＣＳＦに依存する；この株は、本来の３２Ｄ細胞株（ＣｏｏｐｅｒおよびＢｒｏｘｍｅｙｅｒによって記載される）からＧＭ−ＣＳＦに対して特に感受性であるように適応されている（Ｆａａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）２３：１２０１−１４）。３２Ｄ（ＧＭ）細胞株は、ＩＬ−１２に応答性ではなかった。活性な対数増殖における３２Ｄ（ＧＭ）細胞を、ＧＭ−ＣＳＦを欠く培地で２回洗浄し、そして、種々の量の、市販のマウスＧＭ−ＣＳＦまたはマウスＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の存在下で、マイクロタイターウェルの１ウェル当たり５×１０3個の細胞をプレートし、そして４８時間増殖させる。０．３マイクロキュリーの3Ｈ−チミジンを、放射性取り込みのレベルを決定する１６時間前に添加する。漸増レベルのＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を用いた3Ｈ−チミジンの取り込みに、用量応答性の増加が存在した。これは、ＩＬ−１２−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ部分が活性であることを示す。さらに、モル濃度基準で算出されたこの融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ生物学的活性は、市販のマウスのＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性に匹敵する。
【０１３９】
（実施例８．複合サイトカイン融合タンパク質を用いた免疫堪能動物（ｉｍｍｕｎｅ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｍｍａｌ）における結腸癌腫の処置）
複合サイトカイン−抗体融合タンパク質を使用して、インタクトな免疫系を有する哺乳動物における結腸癌腫を処置し得るか否かを試験するために、以下の実験を実施した。ＣＴ２６は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の結腸癌腫細胞株である。標準的な遺伝子操作技術によって、この細胞株を操作し、ヒト上皮細胞接着分子を発現させた。この分子は、ＫＳ−１／４抗体によって認識される抗原である；これらの細胞を、ＣＴ２６／ＫＳＡ細胞と名付ける。
【０１４０】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを２×１０6ＣＴ２６／ＫＳＡ細胞を用いて皮下接種した。腫瘍が約１００〜２００立方ミリメートルの容積に達する場合、マウスをさらなる研究のための９匹のマウスの３つのグループに無作為化した。０日目から開始して、腫瘍保有マウスを、ＰＢＳ、約５．３マイクログラムのＫＳ−ＩＬ−１２と混合された約３．４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２、または約６マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２−ＩＬ１２を用いて処理した。これらの用量は、各セットのマウスに対して等しい数のＩＬ−１２分子およびＩＬ−２分子を送達するために設計する。マウスを、５日間、１日に１回腫瘍内注射した。腫瘍のサイズを、カリパーを用いて測定した。
【０１４１】
１つのこのような実験の結果を、図１１に示す。この実験において、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２は、腫瘍増殖の強い阻害を引き起こした。ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物もまた、腫瘍増殖の有意な阻害を引き起こしたが、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２のように完全ではなかった。ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で処理されたマウスのグループにおいて、９匹のマウスのうちの６匹は、これらの腫瘍を明らかに治癒した：これらの６匹のマウスは、実験を終了した場合、９３日目まで生存した；そしてこれらのマウスにおける腫瘍は、縮みそして消失し、その結果、３９日目〜９３日目からは皮下腫瘍は検出され得なかった。他の３匹のマウスは、増殖が遅延される腫瘍を有し、その結果、腫瘍大敵は、たった８７日後に４，０００立方ミリメートルを超えた。
【０１４２】
ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物で処理されたマウスのうち、２匹のマウスは、その皮下腫瘍が明らかに治癒され、そして実験の終わりまで生存した。残りの７匹のマウスの腫瘍は、消失せず、そして最終的には、１，０００立方ミリメートル（１匹のマウス）または４，０００立方ミリメートルより大きく（６匹のマウス）増殖した。
【０１４３】
ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２が、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２等モル混合物よりも、より効果的であるという事実は、驚くべきことである。この実験における用量は、１用量当たり約１５ピコモルの融合タンパク質を送達し、これは約９×１０12分子に対応する。処置の開始において、各腫瘍は、約１６０立方ミリメートルの容積を有し、これは、約１億６０００万の細胞に対応する。各細胞は、約１０6分子のＥｐＣＡＭを発現し、そうなので、ＫＳ抗体が結合する約１．６×１０14個のＥｐＣＡＭ抗原分子が存在する。従って、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２が混合され、そしてそのような腫瘍を保有するマウスに注射された場合、これらの２つの免疫サイトカイン融合タンパク質は、おそらく抗原結合部位に関して互いに競合しない。従って、腫瘍部位における効果的な用量のＩＬ−１２およびＩＬ−２は、少なくとも、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物に関して、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２に関するような高さであるべきであった。
【０１４４】
（実施例９．複合サイトカイン融合タンパク質を用いた免疫不全動物における結腸癌腫の処置）
多くの形態の癌治療が、免疫系の細胞を含む分裂細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）の殺傷に効果を有する。結果として、癌患者は、しばしば、免疫抑制になる。複合サイトカイン融合タンパク質を使用して、抑制された免疫系を有する哺乳動物を処置し得るか否かに取り組むために、ＣＴ２６／ＫＳＡ腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスを、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物、またはＰＢＳで処理した。ＳＣＩＤマウスは、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方が欠失であり、そして感染と戦うその能力については生来の免疫系（例えば、ＮＫ細胞）の分枝に依存する。
【０１４５】
皮下ＣＴ２６／ＫＳＡ腫瘍を有するマウスを、実施例８に記載されるように作製した。８匹のマウスの３つの群（各々は、約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）を、実施例８と同じ用量およびスケジュールを用いて腫瘍内注射によって処理した。結果を、図１２に示す。この場合、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質およびＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２の混合物は、ほぼ等しく効果的であった：８匹のマウスのうちの５匹は、各グループにおいて２５日目までに治癒された。しかし、治癒されなかったマウスにおいて、６個の腫瘍のうちの５個は、未処理動物における腫瘍に特徴的な速度で増殖し始め、約１４〜２１日の効果的な遅延であった。これは、実施例８の免疫堪能マウスにおける腫瘍と対照的である：腫瘍がＫＳ−ＩＬ １２−ＩＬ２を用いた処理によって完全に排除されなかった場合でさえ、この腫瘍は、この実験の開始後、約６０日までは急速に増殖し始めなかった。
【０１４６】
これらの実験は、複合サイトカイン抗体融合タンパク質を使用して、免疫抑制された動物における癌を処置し得ることを示す。
【０１４７】
（実施例１０．複合サイトカイン融合タンパク質の腫瘍内注射による肺癌腫の処理：個々の免疫サイトカインによる処理との比較）
複合サイトカイン融合タンパク質および単一サイトカイン部分を有する免疫サイトカインの、肺細胞由来の癌に対する効果に取り組むために、以下の実験を実施した。
【０１４８】
Ｌｅｗｉｓ肺癌腫（ＬＬＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の急速進行性の腫瘍である。ヒトＥｐＣＡＭタンパク質を発現するＬＬＣ細胞株を、標準的な遺伝子操作技術によって構築した；この細胞株を、ＬＬＣ／ＫＳＡと命名した。
【０１４９】
皮下ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、実施例８に記載されるように作成した（ＫＭＬを有するチェック＃の細胞）。各５匹のマウスの４つのグループ（各々は、約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）を、５日間、腫瘍内注射で処理した。マウスを、ＰＢＳ、約２０ミリグラムのＫＳ−ＩＬ１２、約２０ミリグラムのＫＳ−ＩＬ１２、または約２０ミリグラムのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で注射した。
【０１５０】
結果を、図１３に示す。この場合、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質は、ＫＳ−ＩＬ１２またはＫＳ−ＩＬ２のいずれよりも、よりさらに効果的であった。ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質を用いて処理された全てのマウスにおいて、これらの腫瘍は、２７日までに消失した。７４日目に、これらのマウスを、実施例１４に記載されるような肺転移アッセイに使用した；本来の皮下腫瘍は、介在期間または第２の実験の間に再び出現しなかった。対照的に、ＫＳ−ＩＬ２またはＫＳ−ＩＬ１２のいずれかを用いた処理は、いくつかの明らかな腫瘍の縮小および有意な腫瘍増殖の遅延を引き起こしたが、これらの腫瘍は、最終的には増殖した。この実施例および以前の実施例の結果の比較により、特定の疾患および投与形態に関して、異なるサイトカイン部分を保有する免疫サイトカインの混合物を用いた処理が、単一型の免疫サイトカインを用いた処理よりも優れていることを示す。
【０１５１】
（実施例１２ 複合サイトカイン融合タンパク質の腫瘍内注射による肺癌腫の処置：免疫サイトカインの混合物による処理との比較）
複合サイトカイン融合タンパク質、および異なるサイトカイン部分を保有する免疫サイトカインの混合物の、肺細胞由来の癌に対する効果を示すために、以下の実験を実施した。
【０１５２】
皮下ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１１に記載されるように作製した。７匹のマウス（各々は、約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）の３つの群を、５日間、腫瘍内注射によって処理した。マウスを、ＰＢＳ、約１８μｇのＫＳ−ＩＬ１２と約１１．５μｇのＫＳ−ＩＬ１２との混合物、または約２０μｇのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で注射した。
【０１５３】
結果を図１４に示す。この場合、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質は、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２との混合物よりも、よりさらに効果的であった。ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２融合タンパク質で処理された全てのマウスにおいて、腫瘍は、２７日目までに消失した。対照的に、ＫＳ−ＩＬ１２とＫＳ−ＩＬ２との混合物での処理は、いくらかの明らかな腫瘍の縮みおよび腫瘍増殖の有意な遅延をもたらしたが、この処置群において全ての腫瘍は、最終的に再び増殖した。
【０１５４】
（実施例１３．複合サイトカイン−抗体融合タンパク質の、抗腫瘍活性の抗原依存性）
腫瘍の処置における複合サイトカイン−抗体融合タンパク質の効果が、抗体によって認識される抗原の腫瘍特異的発現に依存するか否かを示すために、以下の実験を実施した。
【０１５５】
皮下ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を有する７匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのセット、および親ＬＬＣ細胞株から誘導された腫瘍を有する９匹のマウスの第２のセットを、実施例１１に記載されるように作製した。これら２つの群のマウス（約１００〜２００立方ミリメートルの腫瘍を保有する）を、５日間、腫瘍内注射によって処理した。マウスを、約２０μｇのＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で注射した。
【０１５６】
結果を図１５に示す。この場合、ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍を保有するマウスは全て、これらの腫瘍が完全に治癒した。対照的に、ＬＬＣ腫瘍を保有するマウスのうちの２匹のみが、治癒した；他のＬＬＣ腫瘍保有マウスは全て、その腫瘍容積における一過性の減少を享受したが、その腫瘍は、最終的に大きな容積に増殖した。
【０１５７】
これらの結果は、ＥｐＣＡＭ表面抗原の認識が、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２のＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍細胞の表面への接着を促進すること、および生じる免疫応答が増強されることをしめす。いくつかの抗腫瘍効果は、ＬＬＣ由来の腫瘍に対しても同様に観察され；（理論に束縛されることを望まないが）この場合におけるＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２の抗腫瘍効果は、融合タンパク質が直接腫瘍に注射され、従って、その腫瘍に一過性に局在した事実に起因し得る。
【０１５８】
（実施例１４．腫瘍細胞型に対する免疫記憶の生成）
転移の発達は、癌の処置における主要な問題である。複合サイトカイン抗体融合タンパク質を用いた処置が、腫瘍細胞型に対する長期の免疫記憶の形成を導き得るか否か、および転移の確立を妨害し得るか否かを試験するために、以下の実験を実施した。
【０１５９】
実施例１１由来の５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＫＳ−ＩＬ１２−ＩＬ２で処理し、そしてこれらの皮下腫瘍が明らかに治癒された。実施例１４に記載されるように、処置の開始に対して７４日目に、これらの５匹のマウスを、１０6のＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を用いて静脈内注射した。コントロールとして、８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスをまた、１０6のＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を用いて静脈内注射した。
【０１６０】
２８日目に、マウスを屠殺し、そして肺を転移に関して調べた。８匹のコントロールマウスの肺は、７０％〜１００％が転移で覆われ、平均８５％の肺表面範囲を有した。これらのマウスの平均肺重量は、０．８６グラムであった。対照的に、５匹の前処理したマウス由来の肺表面上には、転移は見出されず、そして平均肺重量は、０．２８グラム（これは、正常マウス肺の重量に対応する）であった。これらの結果は、本来の腫瘍細胞の処置が、この腫瘍細胞に対する長期の免疫記憶を生じることを示し；この記憶は、この腫瘍細胞型の転移の確立を妨害した。
【０１６１】
（表Ｘ．ＬＬＣ−ＫＳＡ肺転移からの「後退した」マウスの保護）
【０１６２】
【表１】
腫瘍を有さないコントロール群の平均肺重量は０．２ｇであった。転移スコアは、融合された転移小節の％表面範囲に基づき、ここで、０＝転移なし；１＝１〜２５％の範囲；２＝２５〜５０％の範囲；３＝５０〜７５％の範囲；および４＝７５〜１００％の範囲である。
【０１６３】
免疫記憶形成に関して試験するための第２の実験は、ＬＬＣ／ＫＳＡ腫瘍細胞で注射され、皮下腫瘍が発生し、そしてこれらの腫瘍が消失した実施例１２由来の７匹のマウスのうちの６匹を使用した。実施例１２の処置の開始６２日後に、６匹の前処理したマウスおよび１０匹のナイーブな未処理のＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスを、１０6のＬＬＣ細胞で皮下注射した。これらの細胞は、ヒトＫＳ抗原ＥｐＣＡＭを発現しない。
【０１６４】
ナイーブなマウスにおいて、注射されたＬＬＣ細胞は、全てのマウスにおいて急速に増殖する腫瘍を形成した。対照的に、前処理されたマウスにおける腫瘍は、よりさらにゆっくりと増殖し、そして１匹のマウスにおいては、皮下腫瘍は検出されなかった。これらの結果を、図１６に示す。ヒトＫＳ抗原であるＥｐＣＡＭがＬＬＣ細胞上で発現されないので、ＬＬＣ細胞に対する免疫応答は、これらの細胞によって発現される別の抗原に基づいた。
【０１６５】
（実施例１５：ワクチンとしての複合サイトカイン融合タンパク質）
複合サイトカイン融合タンパク質は、抗原タンパク質に融合される場合、ワクチンとして使用され得る。Ｎ末端からＣ末端への部分の特定の順番、または融合タンパク質が単一ポリペプチド鎖であるかオリゴマーであるかは、発現されるプラスミドの構築の利便性に依存して変化し得る。このタンパク質は、種々の経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内など）によって投与され得る。同様に、投与の用量および頻度は、一般的に、ヒトワクチンに関する標準的な慣例と同様に、ならびにワクチン開発の当業者に周知であるのと同様に、経験的に決定される必要がある。
【０１６６】
例えば、抗原−ＩＬ−１２−サイトカインの形式の融合タンパク質は、マウスに投与され、ここで、この融合タンパク質中のサイトカインは、ＩＬ−１２とは異なる第２のサイトカインである。コントロールマウスは、同じ量の抗原−サイトカイン、抗原−ＩＬ−１２、または抗原単独を受ける。抗原融合タンパク質の投与の間および／またはこの投与後の種々の時間において、血液サンプルを、レトロ眼窩出血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって収集し、そして血漿を調製し、そしてこの抗原に対して指向する抗体の存在に関して分析する。抗体が、この抗原に対して作製されたことが見出された。さらに、この抗原に対する免疫応答の性質は、Ｔｈ１応答特有である。抗体応答は、特定のコントロール免疫においてよりも、より強くそして産生された抗体の型は異なる。
【０１６７】
より詳細には、ＰＢＳ緩衝液中のヒト化抗体−マウスＩＬ−１２−ＩＬ−２融合タンパク質を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射（５μｇ／日×５）で注射する。コントロールマウスは、同じ抗体を、同じ量だが、ＩＬ−１２−ＩＬ−２を接着させること無しで受ける。いずれの注射溶液も、いずれの他の型のアジュバントも含まない。１０日目に、血液サンプルをレトロ眼窩出血によって微量遠心分離チューブに収集し、そして血漿を、クエン酸ナトリウムを含むプラスチックチューブ中に血液サンプルを収集し、続いてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上微量遠心分離機で最大回転で遠心することによって調製する。ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）をヒト化抗体タンパク質（これは、ヒト定常領域を含み、そしてこの免疫に応答して作製される任意のマウス抗体を捕獲するために使用される）を用いてコートする。未結合物質を洗浄して除去した後、結合したマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出する。任意の結合した抗体は、ヒト定常領域または可変領域（これらの両方は、ヒト化抗体と融合タンパク質との間で共有される）のいずれかを指向し得る。
【０１６８】
融合されたＩＬ−１２−ＩＬ−２がないヒト化抗体に対しては、ほとんどまたは全く反応性がない。一方、融合タンパク質は、外因性アジュバントの非存在下および静脈内投与の経路が皮下投与または腹腔内投与のいずれかと比較して、そのような応答を誘導することに関して非常に望ましくない事実にもかかわらず、強力な抗体応答を誘導する。ＩｇＧ２ａアイソタイプの抗体（これは、代表的なＩＬ−１２増強された応答である）は、抗体−ＩＬ−１２−ＩＬ−２注射された群において見出されるが、ヒト抗体で注射された群には見出されない。
【０１６９】
種々の経路によって投与される抗原−ＩＬ−１２複合サイトカイン融合タンパク質の免疫原性を、ＰＢＳもしくは他の生体適合性の緩衝液、または公知のアジュバント（例えば、フロイントの非完全アジュバントおよびフロイントの完全アジュバント）中のこの融合タンパク質（例えば、上記に記載される）の溶液を注射することによって試験する。例えば、単一または複数の、皮下注射、皮内注射または腹腔内注射が、２週間毎に提供され得る。あるいは、融合タンパク質は、まず皮下注射によって投与され得、次いで続いて、腹腔内注射され得る。フロイントのアジュバントは、注射部位における過敏に起因して、ヒトの用途に対しては使用することができない。水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）の沈澱物のような代替のアジュバントが、ヒトの用途に対して承認され、そして本発明において使用され得る。スクアレンおよび脂質に基づく新規有機化学アジュバントがまた、皮膚への注射に使用され得る。
【０１７０】
（実施例１６：複合サイトカイン融合タンパク質を用いた遺伝子治療）
遺伝子治療法によって送達される複合サイトカイン融合タンパク質の抗癌活性をまた、肺癌の処置に関して示した。Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞を、上記に記載されるウイルスベクター系（ＰＡ３１７パッケージング細胞株へトランスフェクトされるｐＬＮＣＸ−ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２またはｐＬＮＣＸ−ｓｃＩＬ−１２ ＤＮＡ）を用いて安定にトランスフェクトした。これらの構築物は、ＩＬ−１２の一本鎖バージョンをコードし、ここで、ｐ３５およびｐ４０サブユニットは、リンカーで結合されている。クローンを、Ｇ４１８含有培地を用いてインビトロで選択し、そして約５０〜６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を安定に発現するクローンを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって同定した。
【０１７１】
ｓｃＩＬ−１２またはｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現する、約１×１０6および約５×１０6ＬＬＣ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびまたＳＣＩＤマウスに皮下注射した。コントロールとして、２×１０6 ＬＬＣ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびまたＳＣＩＤマウスに注射した。ＩＬ−１２を発現するＬＬＣ細胞は、サイトカインを発現するように操作されていないＬＬＣ細胞から誘導された腫瘍とほぼ同じ速度で増殖する腫瘍を形成する。しかし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびまたＳＣＩＤマウスの両方において、ｓｃＩＬ−１２−ＩＬ−２を発現するＬＬＣ細胞は、皮下腫瘍を形成しないか、または引続いて縮みそして消失する腫瘍を形成するかのいずれかであった（図１７および１８）。
【０１７２】
（実施例１７．ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む複合サイトカイン融合タンパク質の構築）
サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、組み合わせて使用される場合、樹状細胞の強力なアクチベーターである。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの活性を含む複合サイトカイン−抗体融合タンパク質が、以下のように構築された。ＧＭ−ＣＳＦのコード配列が、ＫＳ−１／４抗体重鎖のコード配列の３’末端にインフレームで融合され、これには、リーダー配列が先行した。さらに、ＩＬ−４のコード配列（リーダー配列を含む）は、成熟ＫＳ−１／４抗体軽鎖のコード配列の５’末端に、リンカーを用いてインフレームで融合された。
【０１７３】
詳細には、マウスＩＬ−４とＫＳ−１／４抗体の軽鎖との融合タンパク質をコードするＤＮＡを構築するために、マウスＩＬ−４ ｃＤＮＡを、正方向プライマー：ＴＣＴＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＣ ＣＡＧ Ｃ（配列番号２２）（ここで、ＸｂａＩ部位のＴＣＴＡＧＡ（配列番号２２の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置される）および逆方向プライマー：Ｃ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＡＧ Ｇ（配列番号２３）（これは、マウスＩＬ−４のＣ末端アミノ酸残基をコードするＴＣＧコドン（アンチコドンＣＧＡ）に対してすぐ３’にＢａｍＨＩ部位であるＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号２３の残基２〜７）を含む）を用いて、ＰＣＲによって適応させた。ＰＣＲフラグメントのクローニングおよび配列確認の後、マウスＩＬ−４ ｃＤＮＡを含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、グリシンおよびセリン残基に富むフレキシブルペプチドリンカーをコードするＢａｍＨＩ−ＡｆｌＩＩオリゴヌクレオチド二重鎖に連結した。次に、ＡｆｌＩＩ末端を、マウスＫＳ−１／４軽鎖のＮ末端に先行する人工的に配置されたＡｆｌＩＩ部位に結合させた。２つの連結から生じる連結におけるＤＮＡおよびタンパク質の配列を、以下に提供する。
【０１７４】
【化４】
このＤＮＡ配列において、ＧＧＡＴＣＣ（配列番号２４の残基４〜９）およびＣＴＴＡＡＧ（配列番号２４の残基４８〜５３）は、それぞれ、再構築に使用される２つの制限部位のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩであり；ＴＣＧは、マウスＩＬ−４のＣ末端セリン残基をコードする；ＧＡＧは、ＫＳ−１／４軽鎖の成熟Ｎ末端をコードする；そして、ＧｌｙＳｅｒリッチのペプチドリンカーのアミノ酸配列をそのＤＮＡ配列の下に示す。強力なプロモーターを含む高レベルの発現のための補助的配列を、前の実施例に記載される技術および分子生物学の他の標準的な技術を用いて、融合ポリペプチドの両方をコードするＤＮＡセグメントのほぼ周辺に配置した。
【０１７５】
ＩＬ４−ＫＳ（軽鎖）およびＫＳ（重鎖）−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＮＳ／０細胞にトランスフェクトし、そして対応するポリペプチドが、高レベルで発現された。還元状態下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約８０ｋＤに重鎖−ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドに対応する散在したバンド、および約５０ｋＤにＩＬ４−軽鎖融合体に対応する複合バンドが見出された。散在したバンドおよび複合バンドの出現は、それぞれ、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの可変のグリコシル化に起因した。
【０１７６】
サブユニットは、図３Ｇの一般的な構造に対応する構造を有するジスルフィド結合した四量体タンパク質へアセンブルした。このタンパク質は、ＫＳ−１／４の抗原結合活性、そのＦｃ領域を介したＳｔａｐｈ Ａタンパク質への結合する能力、ならびにＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦのサイトカイン活性を有した。ＩＬ−４活性を、ＩＬ−４依存性刺激によるＣＴＬＬ−２細胞のトリチウム化チミジン取り込みによって測定した。ＧＭ−ＣＳＦ活性を、ＧＭ−ＣＳＦ依存性刺激による３２（Ｄ）ＧＭ細胞のトリチウム化チミジン取り込みによって測定した。モル濃度の基準に対して、ＫＳ−ＩＬ４−ＧＭＣＳＦのＩＬ−４活性およびＧＭ−ＣＳＦ活性は、精製されたＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦと類似していた。
【０１７７】
抗体配列と結合していないサイトカインＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの融合体を、以下のように構築した。マウスＩＬ−４を、マウス脾細胞のＲＮＡからＰＣＲによってクローン化した。正方向プライマーは、配列：ＴＣＴＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＣ ＣＡＧ Ｃ（配列番号２６）（ここで、ＸｂａＩ部位のＴＣＴＡＧＡ（配列番号２６の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置された）を有し、そして逆方向プライマーは、配列：ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＣＣ ＧＧＡ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＡＧ Ｇ（配列番号２７）（これは、マウスＩＬ−４のＣ末端アミノ酸残基をコードするＴＣＧコドン（アンチコドンＣＧＡ）のすぐ３’にＥｃｏＲＶ部位のＧＡＴ ＡＴＣ（配列番号２７の残基２〜７）を配置した）を有した。配列確認の後、そのネイティブなリーダーと共にｍｕＩＬ−４ ｃＤＮＡを含むＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｍｕＧＭ−ＣＳＦを含むＳｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントに連結させ、ｍｕＩＬ−４とｍｕＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡとの間の融合体の連結部に以下の配列を得た：ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＧＣ（配列番号２８）（ここで、ｍｕＩＬ４のＣ末端配列およびｍｕＧＭ−ＣＳＦのＮ末端配列を、下線で示し、そして、ＧＡＴＧ ＧＧ（配列番号２８の残基１７〜２２）は、ＥｃｏＲＶ平滑末端からＳｍａＩ平滑末端への連結から生じる配列である）。ｍｕＩＬ４−ｍｕＧＭＣＳＦをコードする生じたＤＮＡを、次いで、発現ベクターにクローン化した。この発現されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そして、４５〜５０ｋＤの見かけ上の分子量を有する散在バンドとして泳動されることが見出された。モル濃度の基準に対して、ＩＬ４−ＧＭＣＳＦのＩＬ−４活性およびＧＭ−ＣＳＦ活性は、精製されたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと類似していた。
【０１７８】
（実施例１８．リンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ１２（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ−ＫＳ−ＩＬ２）をコードするＤＮＡの構築およびリンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２タンパク質の発現）
ケモカインは、勾配を形成し、免疫細胞の化学走性を媒介すると考えられている、異なるクラスのサイトカインである。さらに、他のサイトカインのように、ケモカインは、標的細胞において特定の遺伝子の発現を誘導し得る。ケモカインの１つの特徴は、遊離のＮ末端がしばしば活性に必要とされることであり、これにより、融合タンパク質が構築され得る方法に限定を置くかもしれない。
【０１７９】
サイトカインリンホタクチン（これは、ケモカインである）、抗体ＫＳ−１／４、およびサイトカインＩＬ−２からなる、サイトカイン−抗体−サイトカイン融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、四量体であり、そして２つの異なるポリペプチドを含んだ。１つのポリペプチドは、ＫＳ−１／４抗体の重鎖のＮ末端に融合されたマウスリンホタクチンからなる（Ｃ末端にＩＬ−２が続く）。Ｃ末端にＩＬ−２を有するＫＳ−１／４重鎖の融合体（「ＫＳ−ＩＬ２重鎖」）は、以前に記載された（Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８）。もう一方のポリペプチドは、ＫＳ１／４抗体の軽鎖からなる。
【０１８０】
マウスリンホタクチンの完全なコード配列は、ＫｅｌｎｅｒおよびＺｌｏｔｎｉｋ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３９５（１９９８））によって公開された。マウスリンホタクチンとＫＳ−ＩＬ２の重鎖との融合タンパク質をコードするＤＮＡを構築するために、マウスリンホタクチンｃＤＮＡを、正方向プライマー：ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＣ（配列番号２９）（ここで、ＸｂａＩ部位のＴＣＴＡＧＡ（配列番号２９の残基１〜６）は、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置された）、および逆方向プライマー：ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＧＣ ＴＧ（配列番号３０）（これは、マウスリンホタクチンのＣ末端アミノ酸残基をコードするＧＧＧコドン（アンチコドンＣＣＣ）のすぐ３’にＢａｍＨＩ部位のＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号３０の残基１〜６）を配置した）を用いて、ＰＣＲによって適応させた。ＰＣＲフラグメントのクローニングおよび配列確認の後、マウスリンホタクチンｃＤＮＡを含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、グリシンおよびセリン残基に富むフレキシブルペプチドリンカーをコードするＢａｍＨＩ−ＡｆｌＩＩオリゴヌクレオチド二重鎖に連結した。次に、ＡｆｌＩＩ末端を、ＫＳ−ＩＬ２重鎖の成熟Ｎ末端に先行する人工的ＡｆｌＩＩ部位に結合させた。２つの連結から生じる連結におけるＤＮＡ配列を、以下に提供する。
【０１８１】
【化５】
ここで、ＧＧＡＴＣＣ（配列番号３１の残基４〜９）およびＣＴＴＡＡＧ（配列番号３１の残基４８〜５３）は、それぞれ、構築に使用される２つの制限部位のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩであり；ＣＣＣは、マウスリンホタクチンのＣ末端アミノ酸残基をコードする；ＣＡＧは、ＫＳ−ＩＬ２重鎖の成熟Ｎ末端をコードする；そして、ＧｌｙＳｅｒリッチのペプチドリンカーのアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列の上に示す。次いで、マウスリンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２重鎖をコードするＤＮＡを、発現ベクターにクローン化し、次いで、ＫＳ１／４軽鎖と同時発現させた。
【０１８２】
発現されたリンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質を、Ｔ細胞を用いてＢｏｙｄｅｎチャンバー移動アッセイにおけるリンホタクチン活性に関して試験する（Ｌｅｏｎａｒｄら、（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６．１２．３頁）。あるいは、ＮＫ細胞を使用する。あるいは、リンホタクチン活性を、Ｇタンパク質結合レセプターの活性化に対する応答におけるカルシウム流動に関する、標準的な細胞アッセイにおいて観察する（Ｍａｇｈａｚａｃｈｉら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９７）；１１：７６５−７４）。さらに、リンホタクチン−ＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質を、試験し、そしてＥｐＣＡＭへ結合する能力に関するアッセイにおいて活性であることが見出され、そしてまた、ＩＬ−２活性に関するアッセイ（例えば、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイ）において活性である。
【０１８３】
（参考としての援用）
本明細書上記に引用された全ての刊行物は、その全体が本出願に参考として援用される。
【０１８４】
（等価物）
本発明は、本発明の精神または基本的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形式で具体化され得る。従って、上記の実施形態は、全ての関係において、本明細書中に記載される本発明に対する限定よりも、例示的であるとみなされる。従って、本発明の範囲は、前述の発明の詳細な説明よりも、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、特許請求の範囲の等価物の意義および範囲内にある全ての変更は、本発明に含まれることが意図される。
［配列表］
【０１８５】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【公開番号】特開２０１１−６７２１１（Ｐ２０１１−６７２１１Ａ）
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５０３４１（Ｐ２０１０−２５０３４１）
【出願日】平成２２年１１月８日（２０１０．１１．８）
【分割の表示】特願２００１−５１５７１９（Ｐ２００１−５１５７１９）の分割
【原出願日】平成１２年８月９日（２０００．８．９）
【出願人】（３０８０１４８４６）メルク パテント ゲーエムベーハー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月８日（２０１０．１１．８）
【分割の表示】特願２００１−５１５７１９（Ｐ２００１−５１５７１９）の分割
【原出願日】平成１２年８月９日（２０００．８．９）
【出願人】（３０８０１４８４６）メルク パテント ゲーエムベーハー (12)
【Ｆターム（参考）】
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