複合粒子
【課題】 酵素の活性を高度に安定化した複合粒子、その製造方法及びそれを含有する洗浄組成物の提供。
【解決手段】 パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを含有する、複合粒子、この複合粒子を含有する洗浄組成物、並びにパラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び上記酵素活性安定化剤を混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化する複合粒子の製造方法。
【解決手段】 パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを含有する、複合粒子、この複合粒子を含有する洗浄組成物、並びにパラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び上記酵素活性安定化剤を混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化する複合粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄組成物に使用した場合に安定性を維持できる酵素材料を形成する、複合粒子、その製造法及びそれを含有する洗浄組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自動食器洗浄機用洗剤において、でんぷん分解酵素（以降、単に酵素という場合もある）を配合することは、高い洗浄力を得る上で非常に重要である。しかしながら、酵素は多量の水の共存下や、他の剤との接触、酵素自身による自己消化などによって失活しやすい。このような理由から、通常はポリエチレングリコールなどのような水溶性高分子や無機塩と共に造粒を行い、その乾燥造粒物として粉末状洗剤に配合されることが多い。
【０００３】
一方、粉末状洗剤は水道水に完全に溶解しないことがまれにある（これを溶け残りという）。この場合、洗浄力が弱まるばかりか、洗浄機内の排水口に溶け残りが溜まってしまい、時には排水を妨げることが問題となる。
【０００４】
そこで、洗剤を液体状とすることで溶け残りの問題は解消されるが、前述のように酵素は多量の水と共存すると失活しやすくなるため、これを安定に配合することは容易ではない。特に洗浄液は高い油脂洗浄力を得るためにアルカリ性であることが多い。即ち、多量のアルカリ水の共存下において酵素活性を高く保つ技術は、洗剤の溶け残りを防止し、かつ酵素の強力な洗浄力を得るためには重要な技術である。
【０００５】
従来、酵素の安定化技術は様々に検討がなされてきた。例えば、特許文献１には特定のポリマーを配合することによって酵素の安定性を増加させた、アルカリ剤配合の液体洗浄剤組成物が開示されている。しかし、その効果は十分であるとは言えない。
【０００６】
また、特許文献２には、コア粒子をパラフィンでコーティングすることによってコア粒子の活性を安定化させる技術が開示されている。しかし、コア粒子として酵素を用いた場合、パラフィンでコーティングするのみでは、アルカリ水中や過炭酸ナトリウムを配合した粉末状洗剤中において十分な安定性を得ることは出来ない。
【特許文献１】特開平１１−１９３３９８号公報
【特許文献２】特開平６−３１３２００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、上述した種々の問題を解決し、酵素の活性を高度に安定化した複合粒子、その製造方法及びそれを含有する洗浄組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、酵素を含有する粒子中に特定の酵素活性安定化剤を複合化させることにより、酵素の安定性を向上できることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを含有する、複合粒子、並びにこの複合粒子を含有する洗浄組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化する、複合粒子の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の複合粒子は、酵素の活性が高度に安定化され、本発明によると、酵素を含有しても長期間良好な配合安定性を有する洗浄組成物を提供することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
［でんぷん分解酵素］
本発明に用いられるでんぷん分解酵素としては、でんぷんを分解する酵素であれば特に限定されない。例えばバチルス属（Bacillus sp.）に属するアミラーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造することができる。ここでアミラーゼとしては、例えば工業技術院生命工学技術研究所にバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６８１６）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６８１７）として寄託された微生物、及びその変異株、更に当該酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体から生産されるアミラーゼ等が挙げられる。中でもグラム陽性菌により生産されるアミラーゼが好ましく、特にバチルス属（Bacillus sp.）由来のアミラーゼ及び洗浄性能の改善されたアミラーゼの突然変異酵素又は酵素変異体が好ましい。これらの酵素は当該アミラーゼの生産菌、及び当該酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより製造できる。市販品としては、以下を挙げることが出来る。例えば、α−アミラーゼとして、Bacillus licheniformisやBacillus subtilisから得られた酵素が使用でき、“ターマミル”（登録商標、ノボ・インダストリー社）、“マキサミル”（登録商標、ギスト社）等が挙げられる。β−アミラーゼとして、Bacillus sp.等の細菌や、ダイズ、麦芽等から得られた酵素が使用でき、“アマノ”（登録商標、天野製薬（株））、“マルチトーム”（登録商標、ナガセ生化学工業（株））等が挙げられる。プルラナーゼとして、“スプレンターゼ”（登録商標、天野製薬（株））、“プロモザイム２００Ｌ”（登録商標、ノボ・インダストリー社）等が挙げられる。イソアミラーゼとして、“イソアミラーゼ”（試薬、生化学工業（株））等が挙げられる。
【００１３】
［酵素活性安定化剤］
本発明に用いられる酵素活性安定化剤は、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれ、これらの１種又は２種以上を用いることができる。
【００１４】
多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、スクロース、トレハロース等が挙げられる。
【００１５】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（アルキル基の炭素数８〜２０）エーテル、アルキル（アルキル基の炭素数８〜２０）ポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（アルキル基の炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（脂肪酸の炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（脂肪酸の炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー等が挙げられる。これらの中では、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００１６】
水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼイン中和物、大豆タンパク等が挙げられる。ここで水溶性とは、水への溶解度が１ｇ／１００ｇ以上であるものをいう。
【００１７】
［パラフィンワックス］
本発明に用いられるパラフィンワックスとしては、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、ペトロラタムなどを用いることが出来る。本発明の複合粒子は、一般的な食器洗浄機用の洗浄組成物に配合される場合、食器洗浄機の洗浄温度で複合粒子が軟化または融解し、酵素が粒子外へ放出される事が好ましい。よってパラフィンワックスの軟化温度（又は融点）は、保存安定性の観点から、４０℃以上が好ましく、４５℃以上がより好ましい。また、実使用において良好な酵素の放出を得る観点から７０℃以下が好ましく、６０℃以下がより好ましい。ただし、こうした機構を妨げない程度に、融点の高いワックス成分または融点の低いワックス成分を混合しても良い。パラフィンワックスの融点は、ＪＩＳ Ｋ００６４：１９９２により測定できる。
【００１８】
［複合粒子］
本発明の複合粒子は、パラフィンワックス、でんぷん分解酵素及び上記酵素活性安定化剤を主成分とするもので、本発明の効果を損なわない限り、その他の成分、例えば無機及び有機顔料、有機染料等の色材、非イオン性界面活性剤以外の界面活性剤、シリコーン化合物あるいは酸化防止剤等を含有しても良い。
【００１９】
複合粒子中のパラフィンワックスの含有量は、十分な酵素の保護効果を得る観点、及び十分な酵素比率を確保する観点から、５０〜９９．９重量％が好ましく、７０〜９９重量％が更に好ましく、８５〜９７重量％が特に好ましい。
【００２０】
複合粒子中のでんぷん分解酵素の含有量は、十分な酵素の保護効果を得る観点、及び十分な酵素比率を確保する観点から、０．１〜５０重量％が好ましく、０．５〜１０重量％が更に好ましい。
【００２１】
複合粒子中の酵素活性安定化剤の含有量は、十分な酵素の保護効果を得る観点、及び十分な酵素比率を確保する観点から、でんぷん分解酵素１００重量部に対し、１〜１０００重量部が好ましく、１０〜５００重量部が更に好ましく、５０〜３００重量部が特に好ましい。
【００２２】
本発明の複合粒子の体積基準メジアン粒径は、酵素活性を安定に保つ観点から、１００μｍ以上が好ましく、２００μｍ以上が更に好ましい。上限は特にないが、外観上５ｍｍ以下が好ましく、２ｍｍ以下がより好ましい。
【００２３】
ここで体積基準メジアン粒径は、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置を用いて、ラウリル硫酸エステルナトリウム塩０．１％水溶液中で測定したメジアン径の値である。レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置としては、例えばＬＡ−９２０（堀場製作所株式会社製）を用いることができる。
【００２４】
本発明の複合粒子の形状は、球形が、外観上および安定性上の観点から好ましい。
【００２５】
［複合粒子の製法］
本発明の複合粒子は、パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び上記酵素活性安定化剤を混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化することにより製造することができる。
【００２６】
パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び酵素活性安定化剤の混合は一度に行ってもよいが、まず、酵素と酵素活性安定化剤を均一な水溶液とし、これを凍結乾燥法等で脱水することで、酵素と酵素活性安定化剤を均一に混合することができ、好ましい。この場合、得られた乾燥粉末をパラフィンワックスと混合することで粒子化前混合物を得ることができる。
【００２７】
乾燥粉末とパラフィンワックスとの混合は、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上で均一になるように混合することが好ましく、混合方法としては、プラストミル、プラネタリー、ロールミル、ニーダー、エクストルーダー、ホモミキサー、ビーズミルなどを用いることができる。
【００２８】
得られた粒子化前混合物は、種々の方法を用いて造粒することができ、好ましい造粒法は溶融成形法である。溶融成形法とは、パラフィンワックスの融点以上の温度で成形し、冷却固化させることで、粒子状物として得る方法である。具体的には、ロールドロップ式造粒法、ロートフォーム式造粒法、溶融噴霧冷却法等が挙げられる。特に溶融噴霧冷却法が好ましく用いられる。
【００２９】
溶融噴霧冷却法は、溶融した粒子化前混合物をパラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度で、冷媒中に噴霧して冷却固化する方法であり、このような方法で得られた複合粒子は、表面にクラックや孔が生じにくく、粒子内部の成分を外界から遮蔽することが可能である。
【００３０】
噴霧方法としては、回転ディスクアトマイザー、１流体又は２流体以上の複数流体ノズルの使用が例示される。噴霧温度は、良好な噴霧性が得られる温度以上とすることが必要である。噴霧温度が高い方が、被噴霧物の溶融粘度が下がり、良好な噴霧性が得られる。噴霧温度の上限は特に設けないが、組成物の熱分解点以下、酵素の失活温度以下が好ましい。
【００３１】
好ましい噴霧方法は、２流体以上の複数流体ノズルを使用し、圧縮ガスと共に、冷媒中に噴霧する方法である。流体として使用する圧縮ガスは、圧縮空気や圧縮窒素を用いることができる。圧縮ガスは、噴霧温度以上に加熱したものを使用することが、ノズル部での冷却によるつまりを防止し、連続的に粒子を製造できるため、好ましい。冷媒としては、気相が好ましく、空気や窒素を用いることができる。冷媒の温度は５〜４０℃が好ましい。
【００３２】
［洗浄組成物］
本発明の洗浄組成物は、本発明に係わる複合粒子を含有するもので、その形態は用途に応じて適宜選択することができ、液体状、粉末状等いずれの形状でもよい。
【００３３】
本発明の洗浄組成物中の本発明に係わる複合粒子の含有量は、十分な洗浄力を確保する観点から、０．１〜１０重量％が好ましく、０．５〜５重量％が更に好ましい。
【００３４】
本発明の洗浄組成物には、界面活性剤、二価金属イオン捕捉剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、漂白剤等の公知の洗浄成分を配合することができる。
【００３５】
本発明の洗浄組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００３６】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩、脂肪酸塩等が挙げられ、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４、更に１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましい。陰イオン性界面活性剤の対イオンとしては、アルカリ金属イオンやアミン類が好ましく、特にナトリウム、カリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００３７】
非イオン性界面活性剤としては、前記の酵素活性安定化剤として用いられるものと同様の非イオン性界面活性剤が挙げられ、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３８】
本発明の洗浄組成物中の界面活性剤の含有量は、０．５〜６０重量％が好ましく、特に粉末状洗浄組成物については１０〜４５重量％、液体状洗浄組成物については２０〜５０重量％が好ましい。また本発明の洗浄組成物が漂白洗浄組成物、または自動食器洗浄機用洗浄組成物である場合、界面活性剤の含有量は１〜１０重量％が好ましく、１〜５重量％が更に好ましい。
【００３９】
本発明の洗浄組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００４０】
本発明の洗浄組成物中の二価金属イオン捕捉剤の含有量は、０．０１〜５０重量％が好ましく、５〜４０重量％が更に好ましい。
【００４１】
本発明の洗浄組成物に用いられるアルカリ剤としては、粉末状洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリ剤としてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体状洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミン等が挙げられ、これらは陰イオン性界面活性剤の対イオンとしても使用できる。本発明の洗浄組成物中のアルカリ剤の含有量は０．０１〜８０重量％が好ましく、１〜４０重量％が更に好ましい。
【００４２】
本発明の洗浄組成物に用いられる再汚染防止剤としては、ポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸との共重合体が好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００４３】
本発明の洗浄組成物中の再汚染防止剤の含有量は０．００１〜１０重量％が好ましく、１〜５重量％が更に好ましい。
【００４４】
本発明の洗浄組成物に用いられる漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩などが挙げられる。本発明の洗浄組成物中の漂白剤の含有量は１〜１０重量％が好ましい。
【００４５】
漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報等に記載の漂白活性化剤（アクチベーター）を配合することができる。本発明の洗浄組成物中の漂白活性化剤の含有量は０．０１〜１０重量％が好ましい。
【００４６】
本発明の洗浄組成物には、その他に蛍光剤、ビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４７】
本発明の洗浄組成物は、硬質表面用洗浄剤、漂白洗浄剤、衣料洗浄剤等として使用することができるが、特に自動食器洗浄機用洗剤として有用である。
【実施例】
【００４８】
例中の「％」、「部」は、特に記載がない限り、それぞれ「重量％」、「重量部」である。また、パラフィンワックスの融点は、ＪＩＳ Ｋ００６４：１９９２により測定した値である。また、以下の例では、次の物質を用いた。
【００４９】
酵素原末１：α−アミラーゼ／和光純薬工業株式会社製（枯草菌製，Ｐｒ．Ｇ．）
酵素原末２：バチルス エスピーＫＳＭ−Ｋ３８から下記方法により生産されたアミラーゼの凍結乾燥原末
培地に、ＫＳＭ−Ｋ３８株（寄託番号：第１６８１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１７））を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。得られたバチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて攪拌後、生成した沈殿を回収し、２mM ＣａＣｌ2 を含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いて０−１Ｍの食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。さらに凍結乾燥にて原末化した。
【００５０】
トレハロース二水和物：一級／和光純薬工業株式会社製
ＰＶＰ Ｋ−９０：ポリビニルピロリドン，ISP TECHNOLOGIES, INC製
カゼイン：ミルク由来，ＳＡＪ１級／シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製
アンモニア水：１ｍｏｌ／Ｌ，関東化学株式会社製
エマルゲン３２０Ｐ：ポリオキシエチレンステアリルエーテル／花王株式会社製
パラフィンワックス：融点５４〜５６℃、１級／和光純薬工業株式会社製
ジルコニアボール：直径１ｍｍ、アズワン株式会社から入手。
【００５１】
実施例１
まず、酵素活性安定化剤としてトレハロース二水和物２．０ｇとイオン交換水５０ｇを混合し、均一に溶解するまでスパーチュラを用いて撹拌した。次いで、常温において酵素原末１を２．０ｇ更に混合し、スパーチュラを用いて均一に溶解するまで撹拌し、得られた水溶液を凍結乾燥処理することで酵素と酵素活性安定化剤の複合原末を得た。１００ｍＬのポリエチレン容器に、複合原末１．８ｇと、パラフィンワックスを２８．２ｇと、ジルコニアボール２０．０ｇを計量した。７５℃の温浴で加熱し、パラフィンが溶解した状態でポリエチレン容器を振とうし、全体を均一に混合した。振とうは約９００回行った。篩を用いてジルコニアボールを除去することで得られた、酵素活性安定化剤、酵素、パラフィンワックスの混合物を、パラフィンワックスの溶融状態（７５℃）で、２流体ノズルを用いて、窒素を圧縮ガスとして用い、２５℃の空気中に噴霧し、冷却固化した粒子を回収し、６００μｍの篩で粗大粒子を除去することで、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２４８μｍであった。
【００５２】
実施例２
実施例１において、酵素活性安定化剤としてトレハロース二水和物の代わりにＰＶＰ Ｋ−９０を用い、酵素原末として酵素原末２を用いた以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２６５μｍであった。
【００５３】
実施例３
実施例２において、酵素活性安定化剤としてＰＶＰ Ｋ−９０の代わりに、カゼイン４．０ｇと１Ｎのアンモニア水４．０ｇを用い、複合原末とパラフィンワックスの計量をそれぞれ２．７ｇと２７．３ｇとした以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２０９μｍであった。
【００５４】
実施例４
実施例３において、酵素活性安定化剤としてエマルゲン３２０Ｐを４．０ｇ用いた以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２０５μｍであった。
【００５５】
比較例１
１００ｍＬのポリエチレン容器に、酵素原末１を０．９ｇと、パラフィンワックス２９．１ｇと、ジルコニアボール２０．０ｇを計量した。７５℃の温浴で加熱し、パラフィンワックスが溶解した状態でポリエチレン容器を振とうし、全体を均一に混合した。振とうは約９００回行った。篩を用いてジルコニアボールを除去することで得られた、酵素とパラフィンワックスの混合物を、パラフィンワックスの溶融状態で、２流体ノズルを用いて２５℃気相中に噴霧し、冷却固化した粒子を回収し、６００μｍの篩で粗大粒子を除去することで、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２５３μｍであった。
【００５６】
比較例２
比較例１において、酵素原末として酵素原末２を用いた以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２２９μｍであった。
【００５７】
比較例３
酵素原末１をそのまま用いた。
【００５８】
比較例４
酵素原末２をそのまま用いた。
【００５９】
実施例及び比較例で得られた複合粒子の組成を表１にまとめて示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
試験例１：アルカリジェル中の保存試験
アクリル酸系増粘剤（ＥＴＤ２０２０、ＢＦＧｏｏｄｒｉｃｈ社製）０．３ｇ、イオン交換水９９９．７ｇ、水酸化ナトリウム適量を混合し、ｐＨ＝１１．０のアルカリジェルを調製した。
【００６２】
１０ｍＬスクリュー管に、実施例及び比較例で得られた複合粒子を０．１ｇとアルカリジェル１．０ｇを仕込み、スパーチュラで均一に混合し、４０℃の恒温室に保存した。比較例３及び４のみ酵素原末０．０３ｇの仕込み量とした。最長２８日間保存したサンプルについて、以下の方法で酵素活性測定を行い、酵素活性保持率を算出した。結果を表２に示す。
【００６３】
＜酵素活性測定方法＞
・測定試薬
（１）ブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ８．５）
（２）ネオ・アミラーゼテスト（第一化学薬品（株）製）
（３）水酸化ナトリウム（１Ｎ）
【００６４】
・酵素希釈液の調製（ブランク）
複合粒子０．１ｇ（比較例３及び４のみ酵素原末０．０３ｇ、室温保存したもの）とブリットンロビンソン緩衝液５４．９ｇを２００ｍＬトールビーカー中で混合し、６０℃の温浴で１０分間加熱処理した後、氷冷した。溶解し、再固化したパラフィンを除いた液を酵素希釈液とした。
【００６５】
・酵素希釈液の調製（保存サンプル）
保存サンプルであるアルカリジェル分散物（１０ｍＬスクリュー管）に冷却したブリットンロビンソン緩衝液を入れ、容器内部にアルカリジェル分散物が残らないように、２００ｍＬビーカーにアルカリジェル分散物を洗い移し、最終的にアルカリジェル分散物とブリットンロビンソン緩衝液５３．９ｇの混合物となるように調整した。６０℃の温浴中に１０分間静置した後、氷冷した。溶解し、再固化したパラフィンを除いた液を酵素希釈液とした。
【００６６】
・酵素活性の測定
試験管にブリットンロビンソン緩衝液４ｍＬと、ネオ・アミラーゼテスト１錠を入れ、試験管攪拌機で１０秒間撹拌した。ここに酵素希釈液を０．０５ｍＬ混合し、５０℃温浴に１５分間保温後、水酸化ナトリウム（１Ｎ）を０．９ｍＬを混合し、氷冷した。遠心分離処理（１５００ｒｐｍ・５分間）を行い、上澄み液の６２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（島津製作所（株）製、ＵＶ２５５０）で測定した。
【００６７】
・酵素活性保持率の計算方法
下記の式（Ｉ）に従って酵素活性保持率を求めた。
【００６８】
酵素活性保持率[％]＝(保存サンプルの吸光度／ブランクの吸光度)×１００ （Ｉ）
【００６９】
【表２】
【００７０】
試験例１の結果より、本発明の複合粒子はアルカリジェル中において優れた酵素活性保持率を示すことが明らかである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄組成物に使用した場合に安定性を維持できる酵素材料を形成する、複合粒子、その製造法及びそれを含有する洗浄組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自動食器洗浄機用洗剤において、でんぷん分解酵素（以降、単に酵素という場合もある）を配合することは、高い洗浄力を得る上で非常に重要である。しかしながら、酵素は多量の水の共存下や、他の剤との接触、酵素自身による自己消化などによって失活しやすい。このような理由から、通常はポリエチレングリコールなどのような水溶性高分子や無機塩と共に造粒を行い、その乾燥造粒物として粉末状洗剤に配合されることが多い。
【０００３】
一方、粉末状洗剤は水道水に完全に溶解しないことがまれにある（これを溶け残りという）。この場合、洗浄力が弱まるばかりか、洗浄機内の排水口に溶け残りが溜まってしまい、時には排水を妨げることが問題となる。
【０００４】
そこで、洗剤を液体状とすることで溶け残りの問題は解消されるが、前述のように酵素は多量の水と共存すると失活しやすくなるため、これを安定に配合することは容易ではない。特に洗浄液は高い油脂洗浄力を得るためにアルカリ性であることが多い。即ち、多量のアルカリ水の共存下において酵素活性を高く保つ技術は、洗剤の溶け残りを防止し、かつ酵素の強力な洗浄力を得るためには重要な技術である。
【０００５】
従来、酵素の安定化技術は様々に検討がなされてきた。例えば、特許文献１には特定のポリマーを配合することによって酵素の安定性を増加させた、アルカリ剤配合の液体洗浄剤組成物が開示されている。しかし、その効果は十分であるとは言えない。
【０００６】
また、特許文献２には、コア粒子をパラフィンでコーティングすることによってコア粒子の活性を安定化させる技術が開示されている。しかし、コア粒子として酵素を用いた場合、パラフィンでコーティングするのみでは、アルカリ水中や過炭酸ナトリウムを配合した粉末状洗剤中において十分な安定性を得ることは出来ない。
【特許文献１】特開平１１−１９３３９８号公報
【特許文献２】特開平６−３１３２００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、上述した種々の問題を解決し、酵素の活性を高度に安定化した複合粒子、その製造方法及びそれを含有する洗浄組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、酵素を含有する粒子中に特定の酵素活性安定化剤を複合化させることにより、酵素の安定性を向上できることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを含有する、複合粒子、並びにこの複合粒子を含有する洗浄組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化する、複合粒子の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の複合粒子は、酵素の活性が高度に安定化され、本発明によると、酵素を含有しても長期間良好な配合安定性を有する洗浄組成物を提供することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
［でんぷん分解酵素］
本発明に用いられるでんぷん分解酵素としては、でんぷんを分解する酵素であれば特に限定されない。例えばバチルス属（Bacillus sp.）に属するアミラーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造することができる。ここでアミラーゼとしては、例えば工業技術院生命工学技術研究所にバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６８１６）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６８１７）として寄託された微生物、及びその変異株、更に当該酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体から生産されるアミラーゼ等が挙げられる。中でもグラム陽性菌により生産されるアミラーゼが好ましく、特にバチルス属（Bacillus sp.）由来のアミラーゼ及び洗浄性能の改善されたアミラーゼの突然変異酵素又は酵素変異体が好ましい。これらの酵素は当該アミラーゼの生産菌、及び当該酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより製造できる。市販品としては、以下を挙げることが出来る。例えば、α−アミラーゼとして、Bacillus licheniformisやBacillus subtilisから得られた酵素が使用でき、“ターマミル”（登録商標、ノボ・インダストリー社）、“マキサミル”（登録商標、ギスト社）等が挙げられる。β−アミラーゼとして、Bacillus sp.等の細菌や、ダイズ、麦芽等から得られた酵素が使用でき、“アマノ”（登録商標、天野製薬（株））、“マルチトーム”（登録商標、ナガセ生化学工業（株））等が挙げられる。プルラナーゼとして、“スプレンターゼ”（登録商標、天野製薬（株））、“プロモザイム２００Ｌ”（登録商標、ノボ・インダストリー社）等が挙げられる。イソアミラーゼとして、“イソアミラーゼ”（試薬、生化学工業（株））等が挙げられる。
【００１３】
［酵素活性安定化剤］
本発明に用いられる酵素活性安定化剤は、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれ、これらの１種又は２種以上を用いることができる。
【００１４】
多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、スクロース、トレハロース等が挙げられる。
【００１５】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（アルキル基の炭素数８〜２０）エーテル、アルキル（アルキル基の炭素数８〜２０）ポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（アルキル基の炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（脂肪酸の炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（脂肪酸の炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー等が挙げられる。これらの中では、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００１６】
水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼイン中和物、大豆タンパク等が挙げられる。ここで水溶性とは、水への溶解度が１ｇ／１００ｇ以上であるものをいう。
【００１７】
［パラフィンワックス］
本発明に用いられるパラフィンワックスとしては、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、ペトロラタムなどを用いることが出来る。本発明の複合粒子は、一般的な食器洗浄機用の洗浄組成物に配合される場合、食器洗浄機の洗浄温度で複合粒子が軟化または融解し、酵素が粒子外へ放出される事が好ましい。よってパラフィンワックスの軟化温度（又は融点）は、保存安定性の観点から、４０℃以上が好ましく、４５℃以上がより好ましい。また、実使用において良好な酵素の放出を得る観点から７０℃以下が好ましく、６０℃以下がより好ましい。ただし、こうした機構を妨げない程度に、融点の高いワックス成分または融点の低いワックス成分を混合しても良い。パラフィンワックスの融点は、ＪＩＳ Ｋ００６４：１９９２により測定できる。
【００１８】
［複合粒子］
本発明の複合粒子は、パラフィンワックス、でんぷん分解酵素及び上記酵素活性安定化剤を主成分とするもので、本発明の効果を損なわない限り、その他の成分、例えば無機及び有機顔料、有機染料等の色材、非イオン性界面活性剤以外の界面活性剤、シリコーン化合物あるいは酸化防止剤等を含有しても良い。
【００１９】
複合粒子中のパラフィンワックスの含有量は、十分な酵素の保護効果を得る観点、及び十分な酵素比率を確保する観点から、５０〜９９．９重量％が好ましく、７０〜９９重量％が更に好ましく、８５〜９７重量％が特に好ましい。
【００２０】
複合粒子中のでんぷん分解酵素の含有量は、十分な酵素の保護効果を得る観点、及び十分な酵素比率を確保する観点から、０．１〜５０重量％が好ましく、０．５〜１０重量％が更に好ましい。
【００２１】
複合粒子中の酵素活性安定化剤の含有量は、十分な酵素の保護効果を得る観点、及び十分な酵素比率を確保する観点から、でんぷん分解酵素１００重量部に対し、１〜１０００重量部が好ましく、１０〜５００重量部が更に好ましく、５０〜３００重量部が特に好ましい。
【００２２】
本発明の複合粒子の体積基準メジアン粒径は、酵素活性を安定に保つ観点から、１００μｍ以上が好ましく、２００μｍ以上が更に好ましい。上限は特にないが、外観上５ｍｍ以下が好ましく、２ｍｍ以下がより好ましい。
【００２３】
ここで体積基準メジアン粒径は、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置を用いて、ラウリル硫酸エステルナトリウム塩０．１％水溶液中で測定したメジアン径の値である。レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置としては、例えばＬＡ−９２０（堀場製作所株式会社製）を用いることができる。
【００２４】
本発明の複合粒子の形状は、球形が、外観上および安定性上の観点から好ましい。
【００２５】
［複合粒子の製法］
本発明の複合粒子は、パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び上記酵素活性安定化剤を混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化することにより製造することができる。
【００２６】
パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び酵素活性安定化剤の混合は一度に行ってもよいが、まず、酵素と酵素活性安定化剤を均一な水溶液とし、これを凍結乾燥法等で脱水することで、酵素と酵素活性安定化剤を均一に混合することができ、好ましい。この場合、得られた乾燥粉末をパラフィンワックスと混合することで粒子化前混合物を得ることができる。
【００２７】
乾燥粉末とパラフィンワックスとの混合は、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上で均一になるように混合することが好ましく、混合方法としては、プラストミル、プラネタリー、ロールミル、ニーダー、エクストルーダー、ホモミキサー、ビーズミルなどを用いることができる。
【００２８】
得られた粒子化前混合物は、種々の方法を用いて造粒することができ、好ましい造粒法は溶融成形法である。溶融成形法とは、パラフィンワックスの融点以上の温度で成形し、冷却固化させることで、粒子状物として得る方法である。具体的には、ロールドロップ式造粒法、ロートフォーム式造粒法、溶融噴霧冷却法等が挙げられる。特に溶融噴霧冷却法が好ましく用いられる。
【００２９】
溶融噴霧冷却法は、溶融した粒子化前混合物をパラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度で、冷媒中に噴霧して冷却固化する方法であり、このような方法で得られた複合粒子は、表面にクラックや孔が生じにくく、粒子内部の成分を外界から遮蔽することが可能である。
【００３０】
噴霧方法としては、回転ディスクアトマイザー、１流体又は２流体以上の複数流体ノズルの使用が例示される。噴霧温度は、良好な噴霧性が得られる温度以上とすることが必要である。噴霧温度が高い方が、被噴霧物の溶融粘度が下がり、良好な噴霧性が得られる。噴霧温度の上限は特に設けないが、組成物の熱分解点以下、酵素の失活温度以下が好ましい。
【００３１】
好ましい噴霧方法は、２流体以上の複数流体ノズルを使用し、圧縮ガスと共に、冷媒中に噴霧する方法である。流体として使用する圧縮ガスは、圧縮空気や圧縮窒素を用いることができる。圧縮ガスは、噴霧温度以上に加熱したものを使用することが、ノズル部での冷却によるつまりを防止し、連続的に粒子を製造できるため、好ましい。冷媒としては、気相が好ましく、空気や窒素を用いることができる。冷媒の温度は５〜４０℃が好ましい。
【００３２】
［洗浄組成物］
本発明の洗浄組成物は、本発明に係わる複合粒子を含有するもので、その形態は用途に応じて適宜選択することができ、液体状、粉末状等いずれの形状でもよい。
【００３３】
本発明の洗浄組成物中の本発明に係わる複合粒子の含有量は、十分な洗浄力を確保する観点から、０．１〜１０重量％が好ましく、０．５〜５重量％が更に好ましい。
【００３４】
本発明の洗浄組成物には、界面活性剤、二価金属イオン捕捉剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、漂白剤等の公知の洗浄成分を配合することができる。
【００３５】
本発明の洗浄組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００３６】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩、脂肪酸塩等が挙げられ、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４、更に１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましい。陰イオン性界面活性剤の対イオンとしては、アルカリ金属イオンやアミン類が好ましく、特にナトリウム、カリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００３７】
非イオン性界面活性剤としては、前記の酵素活性安定化剤として用いられるものと同様の非イオン性界面活性剤が挙げられ、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３８】
本発明の洗浄組成物中の界面活性剤の含有量は、０．５〜６０重量％が好ましく、特に粉末状洗浄組成物については１０〜４５重量％、液体状洗浄組成物については２０〜５０重量％が好ましい。また本発明の洗浄組成物が漂白洗浄組成物、または自動食器洗浄機用洗浄組成物である場合、界面活性剤の含有量は１〜１０重量％が好ましく、１〜５重量％が更に好ましい。
【００３９】
本発明の洗浄組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００４０】
本発明の洗浄組成物中の二価金属イオン捕捉剤の含有量は、０．０１〜５０重量％が好ましく、５〜４０重量％が更に好ましい。
【００４１】
本発明の洗浄組成物に用いられるアルカリ剤としては、粉末状洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリ剤としてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体状洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミン等が挙げられ、これらは陰イオン性界面活性剤の対イオンとしても使用できる。本発明の洗浄組成物中のアルカリ剤の含有量は０．０１〜８０重量％が好ましく、１〜４０重量％が更に好ましい。
【００４２】
本発明の洗浄組成物に用いられる再汚染防止剤としては、ポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸との共重合体が好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００４３】
本発明の洗浄組成物中の再汚染防止剤の含有量は０．００１〜１０重量％が好ましく、１〜５重量％が更に好ましい。
【００４４】
本発明の洗浄組成物に用いられる漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩などが挙げられる。本発明の洗浄組成物中の漂白剤の含有量は１〜１０重量％が好ましい。
【００４５】
漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報等に記載の漂白活性化剤（アクチベーター）を配合することができる。本発明の洗浄組成物中の漂白活性化剤の含有量は０．０１〜１０重量％が好ましい。
【００４６】
本発明の洗浄組成物には、その他に蛍光剤、ビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４７】
本発明の洗浄組成物は、硬質表面用洗浄剤、漂白洗浄剤、衣料洗浄剤等として使用することができるが、特に自動食器洗浄機用洗剤として有用である。
【実施例】
【００４８】
例中の「％」、「部」は、特に記載がない限り、それぞれ「重量％」、「重量部」である。また、パラフィンワックスの融点は、ＪＩＳ Ｋ００６４：１９９２により測定した値である。また、以下の例では、次の物質を用いた。
【００４９】
酵素原末１：α−アミラーゼ／和光純薬工業株式会社製（枯草菌製，Ｐｒ．Ｇ．）
酵素原末２：バチルス エスピーＫＳＭ−Ｋ３８から下記方法により生産されたアミラーゼの凍結乾燥原末
培地に、ＫＳＭ−Ｋ３８株（寄託番号：第１６８１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１７））を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。得られたバチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて攪拌後、生成した沈殿を回収し、２mM ＣａＣｌ2 を含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いて０−１Ｍの食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。さらに凍結乾燥にて原末化した。
【００５０】
トレハロース二水和物：一級／和光純薬工業株式会社製
ＰＶＰ Ｋ−９０：ポリビニルピロリドン，ISP TECHNOLOGIES, INC製
カゼイン：ミルク由来，ＳＡＪ１級／シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製
アンモニア水：１ｍｏｌ／Ｌ，関東化学株式会社製
エマルゲン３２０Ｐ：ポリオキシエチレンステアリルエーテル／花王株式会社製
パラフィンワックス：融点５４〜５６℃、１級／和光純薬工業株式会社製
ジルコニアボール：直径１ｍｍ、アズワン株式会社から入手。
【００５１】
実施例１
まず、酵素活性安定化剤としてトレハロース二水和物２．０ｇとイオン交換水５０ｇを混合し、均一に溶解するまでスパーチュラを用いて撹拌した。次いで、常温において酵素原末１を２．０ｇ更に混合し、スパーチュラを用いて均一に溶解するまで撹拌し、得られた水溶液を凍結乾燥処理することで酵素と酵素活性安定化剤の複合原末を得た。１００ｍＬのポリエチレン容器に、複合原末１．８ｇと、パラフィンワックスを２８．２ｇと、ジルコニアボール２０．０ｇを計量した。７５℃の温浴で加熱し、パラフィンが溶解した状態でポリエチレン容器を振とうし、全体を均一に混合した。振とうは約９００回行った。篩を用いてジルコニアボールを除去することで得られた、酵素活性安定化剤、酵素、パラフィンワックスの混合物を、パラフィンワックスの溶融状態（７５℃）で、２流体ノズルを用いて、窒素を圧縮ガスとして用い、２５℃の空気中に噴霧し、冷却固化した粒子を回収し、６００μｍの篩で粗大粒子を除去することで、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２４８μｍであった。
【００５２】
実施例２
実施例１において、酵素活性安定化剤としてトレハロース二水和物の代わりにＰＶＰ Ｋ−９０を用い、酵素原末として酵素原末２を用いた以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２６５μｍであった。
【００５３】
実施例３
実施例２において、酵素活性安定化剤としてＰＶＰ Ｋ−９０の代わりに、カゼイン４．０ｇと１Ｎのアンモニア水４．０ｇを用い、複合原末とパラフィンワックスの計量をそれぞれ２．７ｇと２７．３ｇとした以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２０９μｍであった。
【００５４】
実施例４
実施例３において、酵素活性安定化剤としてエマルゲン３２０Ｐを４．０ｇ用いた以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２０５μｍであった。
【００５５】
比較例１
１００ｍＬのポリエチレン容器に、酵素原末１を０．９ｇと、パラフィンワックス２９．１ｇと、ジルコニアボール２０．０ｇを計量した。７５℃の温浴で加熱し、パラフィンワックスが溶解した状態でポリエチレン容器を振とうし、全体を均一に混合した。振とうは約９００回行った。篩を用いてジルコニアボールを除去することで得られた、酵素とパラフィンワックスの混合物を、パラフィンワックスの溶融状態で、２流体ノズルを用いて２５℃気相中に噴霧し、冷却固化した粒子を回収し、６００μｍの篩で粗大粒子を除去することで、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２５３μｍであった。
【００５６】
比較例２
比較例１において、酵素原末として酵素原末２を用いた以外は、全て同じ方法で行い、複合粒子を得た。複合粒子の体積基準メジアン粒径は２２９μｍであった。
【００５７】
比較例３
酵素原末１をそのまま用いた。
【００５８】
比較例４
酵素原末２をそのまま用いた。
【００５９】
実施例及び比較例で得られた複合粒子の組成を表１にまとめて示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
試験例１：アルカリジェル中の保存試験
アクリル酸系増粘剤（ＥＴＤ２０２０、ＢＦＧｏｏｄｒｉｃｈ社製）０．３ｇ、イオン交換水９９９．７ｇ、水酸化ナトリウム適量を混合し、ｐＨ＝１１．０のアルカリジェルを調製した。
【００６２】
１０ｍＬスクリュー管に、実施例及び比較例で得られた複合粒子を０．１ｇとアルカリジェル１．０ｇを仕込み、スパーチュラで均一に混合し、４０℃の恒温室に保存した。比較例３及び４のみ酵素原末０．０３ｇの仕込み量とした。最長２８日間保存したサンプルについて、以下の方法で酵素活性測定を行い、酵素活性保持率を算出した。結果を表２に示す。
【００６３】
＜酵素活性測定方法＞
・測定試薬
（１）ブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ８．５）
（２）ネオ・アミラーゼテスト（第一化学薬品（株）製）
（３）水酸化ナトリウム（１Ｎ）
【００６４】
・酵素希釈液の調製（ブランク）
複合粒子０．１ｇ（比較例３及び４のみ酵素原末０．０３ｇ、室温保存したもの）とブリットンロビンソン緩衝液５４．９ｇを２００ｍＬトールビーカー中で混合し、６０℃の温浴で１０分間加熱処理した後、氷冷した。溶解し、再固化したパラフィンを除いた液を酵素希釈液とした。
【００６５】
・酵素希釈液の調製（保存サンプル）
保存サンプルであるアルカリジェル分散物（１０ｍＬスクリュー管）に冷却したブリットンロビンソン緩衝液を入れ、容器内部にアルカリジェル分散物が残らないように、２００ｍＬビーカーにアルカリジェル分散物を洗い移し、最終的にアルカリジェル分散物とブリットンロビンソン緩衝液５３．９ｇの混合物となるように調整した。６０℃の温浴中に１０分間静置した後、氷冷した。溶解し、再固化したパラフィンを除いた液を酵素希釈液とした。
【００６６】
・酵素活性の測定
試験管にブリットンロビンソン緩衝液４ｍＬと、ネオ・アミラーゼテスト１錠を入れ、試験管攪拌機で１０秒間撹拌した。ここに酵素希釈液を０．０５ｍＬ混合し、５０℃温浴に１５分間保温後、水酸化ナトリウム（１Ｎ）を０．９ｍＬを混合し、氷冷した。遠心分離処理（１５００ｒｐｍ・５分間）を行い、上澄み液の６２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（島津製作所（株）製、ＵＶ２５５０）で測定した。
【００６７】
・酵素活性保持率の計算方法
下記の式（Ｉ）に従って酵素活性保持率を求めた。
【００６８】
酵素活性保持率[％]＝(保存サンプルの吸光度／ブランクの吸光度)×１００ （Ｉ）
【００６９】
【表２】
【００７０】
試験例１の結果より、本発明の複合粒子はアルカリジェル中において優れた酵素活性保持率を示すことが明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを含有する、複合粒子。
【請求項２】
酵素活性安定化剤の含有量が、でんぷん分解酵素１００重量部に対し、１〜１０００重量部である請求項１記載の複合粒子。
【請求項３】
体積基準メジアン粒径が１００μｍ以上、５ｍｍ以下の球状である、請求項１又は２記載の複合粒子。
【請求項４】
パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び酵素活性安定化剤を混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化する、請求項１〜３いずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項５】
パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び酵素活性安定化剤の混合物が、まずでんぷん分解酵素と酵素活性安定化剤を均一な水溶液とした後に脱水することで乾燥粉末とし、その後パラフィンワックスとともにパラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度で混合することにより得られたものである、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
冷却固化による粒子化を、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度の混合物を溶融噴霧冷却法によって粒子化することで行う、請求項４又は５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれかに記載の複合粒子を含有する洗浄組成物。
【請求項１】
パラフィンワックスと、でんぷん分解酵素と、多価アルコール、非イオン性界面活性剤及び水溶性高分子から選ばれる少なくとも１種の酵素活性安定化剤とを含有する、複合粒子。
【請求項２】
酵素活性安定化剤の含有量が、でんぷん分解酵素１００重量部に対し、１〜１０００重量部である請求項１記載の複合粒子。
【請求項３】
体積基準メジアン粒径が１００μｍ以上、５ｍｍ以下の球状である、請求項１又は２記載の複合粒子。
【請求項４】
パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び酵素活性安定化剤を混合し、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度に調整した混合物を、冷却固化する、請求項１〜３いずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項５】
パラフィンワックス、でんぷん分解酵素、及び酵素活性安定化剤の混合物が、まずでんぷん分解酵素と酵素活性安定化剤を均一な水溶液とした後に脱水することで乾燥粉末とし、その後パラフィンワックスとともにパラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度で混合することにより得られたものである、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
冷却固化による粒子化を、パラフィンワックスの軟化温度（又は融点）以上の温度の混合物を溶融噴霧冷却法によって粒子化することで行う、請求項４又は５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれかに記載の複合粒子を含有する洗浄組成物。
【公開番号】特開２００７−３０２７６０（Ｐ２００７−３０２７６０Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３１１７３（Ｐ２００６−１３１１７３）
【出願日】平成１８年５月１０日（２００６．５．１０）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１０日（２００６．５．１０）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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