試料の染色方法及び解析方法
【課題】固相化された物質の分子間相互作用の判定と質量分析とを同一支持体上で行うことができる方法を提供する。
【解決手段】支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａに対する特異的結合能を有する物質Ｂとを用いることによって、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【解決手段】支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａに対する特異的結合能を有する物質Ｂとを用いることによって、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床・診断・生化学・分子生物学に関わる分野のすべてに関する。特に、本発明は、免疫化学反応を利用した生体分子等の解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
二次元電気泳動などのクロマトグラフィーにより分離された生体分子等の解析方法として、以下の方法が知られている。
【０００３】
（１）マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI-MS ）の有用性が認められている（J. Mass Spectrom. Soc. Jpn (2003), Vol. 51, pp. 530-537）。また、対象サンプルの保存性、あるいはピエゾ素子等のインクジェット技術を用いた微量分注・解析システムへの応用が可能であるという利点から、対象物質をメンブレン上に固相化（ブロット）し、直接メンブレン上で解析する系が提唱されている（特表２００１−５２１６２３号公報、 Molecular & Cellular Proteomics (2002) vol. 1, pp. 490-499 ）。
【０００４】
（２）対象物質を電気泳動等により展開し、固体支持体上に固相化した後、該対象物質に対して相互作用する分子を反応させ、その存在を検出する方法が広く用いられている（主に免疫ブロット法）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５２１６２３号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ザ・マス・スペクトロメトリー・ソサイエティー・オブ・ジャパン（Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan）、第５１巻、２００３年、ｐ．５３０−５３７
【非特許文献２】モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular Proteomics ）第１巻、２００２年、ｐ．４９０−４９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
支持体に固相化された物質の分子間相互作用を判定するために用いられる試薬等は、質量分析による物質の同定解析を行うときに解析の妨害となる。このため、従来より行われてきた生体分子などの解析方法においては、固相化された物質の分子間相互作用を判定する工程と、固相化された物質の同定解析を行う工程とを行う場合、それぞれの工程は別々の支持体上で行われている。すなわち、同一試料を同条件で固相化させた支持体を複数用意するか、或いはそのように固相化された一つの支持体を切り分ける必要がある。このように、従来の方法では、支持体上の同一試料に対して行うことができる処理の数が限られており、解析効率が低い。
【０００７】
そこで本発明の目的は、固相化された物質の分子間相互作用の判定と質量分析とを同一支持体上で行うことができる方法を提供することにある。また、本発明の目的は、微量分注技術並びに質量分析技術を応用することで、一連の作業の大幅な省力化を図る系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の発明を含む。
下記＜１＞〜＜１６＞は、質量分析を妨害しないブロッキング試薬を用いる、試料の染色方法に関する。このうち下記＜１＞〜＜３＞は、支持体上に固相化された物質Ａ及び特異的結合物質Ｂが関連する形態に関する。さらに下記＜５＞〜＜１０＞は、支持体上に固相化された物質Ａ、そこから調製される物質Ａ’、及び特異的結合物質Ｂが関連する形態に関する。
【０００９】
＜１＞ 支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａに対する特異的結合能を有する物質Ｂとを用いることによって、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【００１０】
＜２＞ 前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂを断片化する条件によって、前記物質Ａから生じる断片及び前記物質Ｂから生じる断片のいかなる断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有する、＜１＞に記載の試料の染色方法。
【００１１】
＜３＞ 前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜１＞又は＜２＞に記載の試料の染色方法。
＜４＞ 前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１２】
＜５＞ 支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
前記支持体上で前記対象物質Ａから物質Ａ’を調製する工程と、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａから前記支持体上で調製される物質Ａ’に対する特異的結合能を有する物質Ｂを用いることによって、前記物質Ａ’と前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【００１３】
＜６＞ 前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを断片化することができる条件によって前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂから生じる断片よりも小さい分子量の断片を生じない構造を有する、＜５＞に記載の試料の染色方法。
【００１４】
＜７＞ 前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜５＞又は＜６＞に記載の試料の染色方法。
＜８＞ 前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜５＞〜＜７＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１５】
＜９＞ 前記物質Ａ’がタンパク質である、＜５＞〜＜８＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
＜１０＞ 支持体上に固相化された、核酸を含む試料に対し、
転写試薬及び/又は翻訳試薬、及び、標識部とタンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合することができるアクセプター部とを有する標識物質を同時に用いることによって、
前記核酸から転写及び/又は翻訳によってタンパク質を調製し、同時に調製された前記タンパク質を前記標識物質の結合によってラベル化タンパク質とする、＜９＞に記載の試料の染色方法。
【００１６】
＜１１＞ 前記ブロッキング試薬がポリビニルピロリドン又はn-オクチル-β-D-グルコピラノシドである、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１７】
＜１２＞ 前記物質Ｂが、標識物質によりラベル化されているラベル化分子である、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
＜１３＞ 前記標識物質が蛍光標識物質である、＜１２＞に記載の試料の染色方法。
【００１８】
＜１４＞ 免疫ブロット法によって前記相互作用を判定する、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１９】
＜１５＞ 前記支持体に、メンブレン、プレート、非磁性粒子及び磁性粒子から選ばれる少なくとも１つが用いられる、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
＜１６＞ 前記支持体が、質量分析用プレートであり、
前記物質Ａを含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用プレートとを、接触させることにより、前記質量分析用プレート上に固相化された前記物質Ａを得る、＜１５＞に記載の試料の染色方法。
【００２０】
下記＜１７＞〜＜２０＞は、上記＜１＞〜＜１６＞の染色方法を用いた試料の解析方法に関する。
【００２１】
＜１７＞ （１）＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の試料の染色方法を行うことによって、前記対象物質Ａと、前記特異的結合物質Ｂとの相互作用を判定する工程と、
（２）相互作用すると判定された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で断片化する工程と、
（３）断片化された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で質量分析によって同定する工程とを含む、試料の解析方法。
【００２２】
＜１８＞ 前記工程（２）において、微量分注装置を用いて、断片化のための試薬を添加する、＜１７＞に記載の試料の解析方法。
【００２３】
＜１９＞ 前記工程（３）において、前記工程（２）で得られた少なくとも１つの断片についてMS解析を行い、さらに、前記MS解析によって得られたデータにおける少なくとも１つの断片についてMS/MS解析を行う、＜１７＞又は＜１８＞に記載の試料の解析方法。
【００２４】
＜２０＞ 前記工程（３）において、ＭＡＬＤＩ法によって質量分析を行う、＜１７＞〜＜１９＞のいずれかに記載の試料の解析方法。
＜２１＞ 微量分注装置を用いてマトリックス溶液を添加する、＜２０＞に記載の試料の解析方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によると、固相化された物質の分子間相互作用の判定と質量分析とを同一支持体上で行うことができる方法を提供することができる。また、本発明によると、微量分注技術並びに質量分析技術を応用することで、一連の作業の大幅な省力化を図る系を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、主に免疫ブロット法において、質量分析を妨害しないブロッキング試薬を用いる試料の染色方法である。本発明の染色方法は、免疫染色を行うための試料が固相化されている支持体と同一の支持体上で質量分析を行う場合に特に有用な方法である。なお本発明において、染色するとは、色を付ける形態に限定されず、特定の条件下で可視化することによって認識することができる形態も含まれる。また、本発明において支持体に固相化しているとは、共有結合などによって支持体に固定化している状態と、共有結合などによらず支持体上に載っている状態との両方を含む意味で用いる。
【００２７】
本発明においてブロッキング試薬とは、解析対象となる物質が固相化された支持体上に、その物質に対する特異的結合物質が非特異的に結合するのを防止する物質である。そして、質量分析を妨害しないブロッキング試薬とは、質量分析の支障となるマススペクトルピークを呈さないブロッキング試薬である。すなわち、本発明において用いられるブロッキング試薬は、同定解析の対象となる物質に由来するピーク範囲内に検出されないものである。具体的には、本発明のブロッキング試薬は、同定解析の対象となる物質よりも大きい分子量を有し、且つ同定解析の対象となる物質を断片化することができる条件によって、その物質から生じる得る断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有する物質である。
このようなブロッキング試薬としては、ポリビニルピロリドン（PVP）や、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド等が挙げられる。
【００２８】
ブロッキング試薬は、適当な溶媒に溶解して使用する。通常、後述する物質Ｂ（抗体等）とともに溶解して使用する。溶媒としては、TBSバッファなどを用いると良い。ブロッキング試薬の濃度としては、使用するブロッキング試薬の量にも依るが、０．１〜５%(w/v)で用いることができる。例えば、ポリビニルピロリドン（PVP）の場合であれば、０．２５%(w/v)程度を用いると良い。また、使用するブロッキング試薬溶液の量としては、試料の種類や、溶解しているブロッキング試薬や物質Ｂの量等にも依るため特に限定されないが、通常はメンブレン１cm2当たり１０mlを超えない量で用いる。ブロッキング試薬溶液は通常、少ない量が好ましく用いられるため、その量の下限値は特に限定されないが、例えば０．２ml、より好ましくは０．０９ml程度である。
【００２９】
一方、従来からウエスタンブロット等において用いられるブロッキング試薬は、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン、血清、界面活性剤等である。これらは低分子であったり、或いは、酵素消化が行われることにより分解されて低分子の断片が生じたりするものである。このため、これらの従来のウエスタンブロット法を行った後に同定対象となる物質を同一支持体上で質量分析に供すると、同定解析の対象となる物質のピーク範囲内に夾雑物として検出される。
【００３０】
本発明における試料の染色方法のその他の条件としては、通常行われる染色方法における条件を用いればよい。具体的には、対象物質Ａを含む試料が固相化された支持体を用意し；この支持体上の試料に対し、ブロッキング試薬と、対象物質Ａに対する特異的結合能力を有する物質Ｂとを添加し；物質Ａと物質Ｂとの相互作用を判定することにより行う。従って本発明において用いられるブロッキング試薬は、物質Ｂが非特異的に結合し得る、支持体上の部位をブロックすることができるものであって、物質Ａ及び/又は物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである。さらに、本発明におけるブロッキング試薬は、物質Ａ及び/又は物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ、物質Ａ及び/又は物質Ｂを断片化することができる条件下において物質Ａ及び/又は物質Ｂから生じ得る断片が有する分子量以下の分子量の断片を生じない構造を有する。
【００３１】
対象物質Ａとしては、具体例には、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる。
物質Ｂは、対象物質Ａに特異的に結合することができる物質であり、通常は、対象物質Ａとの免疫化学的反応により物質Ａ−物質Ｂ複合体を形成しうる物質である。具体例には、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる。さらに物質Ｂは、標識物質によりラベル化されているラベル化分子であってもよい。標識物質としては、蛍光標識物質等が挙げられる。このような物質Ｂは、適宜、溶液などに含ませて用いる。
【００３２】
支持体には、メンブレン、プレート、非磁性粒子、磁性粒子等から選ばれる少なくとも１つが用いられる。メンブレンを用いる場合、物質Ａを含む試料は、電気的にメンブレンに転写させて使用することができる。メンブレンとしては、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ポリアミド、ポリエチレン等の有機合成高分子及びその誘導体を挙げることができる。ポリアミドとしては、ナイロン等が挙げられる。
【００３３】
プレートとしては、ガラス製プレート、樹脂製プレート、金属製プレート等が挙げられる、このようなプレートを用いる場合は、物質Ａを含む試料の電気泳動後のゲルや、物質Ａを含む試料が転写されたメンブレンを、プレートの表面に接触させて使用することができる。
【００３４】
本発明が質量分析のために用いられる場合は、前記支持体には好ましくは金属製プレート、例えば質量分析用サンプルプレートが用いられる。支持体として質量分析用サンプルプレートを用いた場合は、相互作用判定後、同一支持体上で質量分析が可能となる点で好ましい。このとき、質量分析用サンプルプレート上に固相化された物質Ａは、物質Ａを含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用サンプルプレートとを接触させて得たものとすることができる。また、質量分析用サンプルプレートに、物質Ａを含む試料を（電気泳動後のゲル等から）メンブレンに転写したものを貼り付ける等行うことによって固着させて得たものであっても良い。なお固着には導電性両面粘着テープ等を用いた固定を行うと良い。
【００３５】
さらに、非磁性粒子を用いた支持体としては、ポリサッカライドゲルや合成ポリマー等を用いた支持体が用いられる。磁性粒子を用いた支持体としては、電気泳動後の被転写支持体としての支持体の基本構造に通電性の磁性金属を使用したもの等が用いられる。さらに、アビディティーを向上させる目的のスペーサーを結合させた磁性粒子を支持体にしたもの等が挙げられる。
【００３６】
本発明は、特に免疫ブロット法に有用に用いることができる。従ってこの場合、支持体上に固相化された物質Ａの具体例としては、タンパク質を電気泳動した後メンブレンに転写したものが挙げられ、物質Ｂの具体例としては抗体が挙げられる。そして、物質Ａと物質Ｂとの抗原抗体反応を確認することによって両物質間の相互作用を判定する。
【００３７】
なお、本発明において、物質間の相互作用を判定するとは、支持体上に固相化された試料中の物質Ａがあらかじめ想定されたものであって、想定された物質Ａに対する特異的結合物質Ｂを作用させることによって、物質Ａの支持体上の位置を確認する形態と；物質Ａが未知の物質であって、可能性のある様々な物質Ｂを作用させることによって、物質Ａに作用させた物質Ｂのうちどれが特異的に結合したかを判定するとともに物質Ａの位置を確認する形態との両方を含む意味で用いる。
【００３８】
また、本発明における試料の染色方法としては、以下のような方法も挙げられる。この形態においては、対象物質Ａを含む試料が固相化された支持体を用意し；この支持体上の対象物質Ａから合成される物質Ａ’を調製し；この支持体上に調製された物質Ａ’に対し、ブロッキング試薬と、物質Ａ’に対する特異的結合物質Ｂとを添加し；物質Ａ’と物質Ｂとの相互作用を判定する。
【００３９】
このとき用いられるブロッキング試薬は、物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである。さらに、この場合におけるブロッキング試薬は、物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ、物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂを断片化することができる条件下において物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂから生じ得る断片が有する分子量以下の分子量の断片を生じない構造を有する。
【００４０】
物質Ａ’としては、タンパク質などである。このようなタンパク質は、支持体上に物質Ａとして固相化された核酸から、支持体上における無細胞タンパク質合成によって調製することができる。すなわち、支持体上に固相化された、核酸を含む試料に対し、転写試薬及び/又は翻訳試薬を添加することによって構築した転写系及び/又は翻訳系で発現させることにより調製することができる。
【００４１】
またこのようなタンパク質は、ラベル化タンパク質として得ることもできる。このようなラベル化タンパク質は、転写試薬及び/又は翻訳試薬と、ラベル化試薬とを用いることによって調製することができる。このとき用いられるラベル化試薬は、ラベル部と、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合することができるアクセプター部とを有する。そして、このラベル化試薬が、転写系及び/又は翻訳系で発現したタンパク質に結合することによって、ラベル化タンパク質が調製される。
【００４２】
本発明においては、微量分注装置を用いて支持体上に溶液を添加しても良いし、支持体を溶液に浸漬しても良い。微量分注装置としては、インクジェット法の機構を搭載した装置を用いることができる。このような装置としては、CHIP-1000（島津製作所製）などが挙げられる。
【００４３】
本発明においては、微量分注装置を用いることにより、添加される溶液の量を大幅に制御することができる。例えば、インクジェット法の機構を搭載した装置の場合、一個のインクジェット吐出部から１回の分注操作につき添加される試薬量を、例えば１００ｐｌ程度に制御することができる。インクジェットの機構によっては、これよりさらに少ない量に制御することもできる。また、吐出を繰り返すことができるため、試薬量を分注する量の上限も特に限定されない。特定の１つの領域に対しては、例えばナノリットルレベル、通常１００ｎｌ程度の試薬量を分注することができる。従って、抗体溶液等、希少かつ高価な試薬であっても必要最低限の使用量しか消費しないため、大幅なコストダウンを図ることができる。
【００４４】
微量分注装置を用いることによって、例えば１００ｐｌ程度の吐出によって７８００μｍ２程度の極小の分注範囲を生じる。この分注範囲は、インクジェットの機構によってさらに小さい範囲に限局することもできる。さらに、インクジェット吐出部の支持体上の相対位置を変えることにより分注位置をずらしていくことができるため、任意の領域に溶液を分注することができる。このため、分注範囲の上限も特に限定されない。特定の領域にアレイとして分注する場合は、例えば１ｍｍ２あたり４〜１００スポット分注することができる。
【００４５】
また、同一支持体上に溶液を添加すべき領域を２つ以上設定することも可能である。従って、同一支持体上でも異なる領域で別種の溶液を添加することが可能になり、相互作用の判定を効率よく行うことが可能になる。
【００４６】
このように微量分注装置は、微量の溶液を添加することができるため、支持体上における所望の極小領域のみを処理することが可能になる。このため、大量検体処理が容易になり、ひいては、相互作用する分子を確実に同定するためのハイスループット（高効率）相互作用スクリーニングが可能になる。
【００４７】
これまで述べた本発明の染色法は、物質Ａ及び/又は物質Ｂが有する物理的情報や化学的情報を得るために利用することができる。このような情報を得るために、質量分析法、蛍光法、ＲＩ法、表面プラズモン共鳴法等が用いられる。特に本発明の染色法は、質量分析を妨害しないブロッキング試薬を用いるため、試料が固相化されている支持体と同一の支持体上で質量分析を行うことが可能になることから、質量分析による解析を行う場合に有用である。
【００４８】
さらに本発明は、支持体上に固相化された試料について上述した染色を行うことによる、試料の解析方法である。本発明の解析方法は、（１）前述した試料の染色法によって、試料中の物質Ａ（又は物質Ａから支持体上で調製される物質Ａ’；以下、これらをまとめて単に物質Ａと表記する。）と特異的結合物質Ｂとの相互作用を判定する工程と、（２）相互作用すると判定された、試料中の物質Ａを同一支持体上で断片化する工程と、（３）断片化された物質Ａを、同一支持体上で質量分析によって同定する工程とを含む。
【００４９】
本発明の解析方法は、工程（１）において、同定解析の対象となる物質の質量分析の支障となるマススペクトルピークを呈さないブロッキング試薬を用いる。このブロッキング試薬は、すでにのべた通り、本発明において用いられるブロッキング試薬は、同定解析の対象となる物質に由来するピーク範囲内に検出されないものである。具体的には、同定解析の対象となる物質よりも大きい分子量を有し、且つ同定解析の対象となる物質を断片化することができる条件すなわち工程（２）における条件によって、その物質から生じ得る断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有するものである。
【００５０】
工程（２）の断片化においては、公知の方法に基づいた断片化を行うことができる。例えば、トリプシン消化などを行うとよい。本発明においては、本工程の条件によって低分子量の断片を生じない構造を有するブロッキング試薬を用いているため、工程（１）によって相互作用を示した物質の、同じ支持体上における同じ位置で断片化処理を行っても、その位置に存在しうるブロッキング試薬から、後の工程（３）の質量分析の支障となるマススペクトルピークを呈する断片を生じさせることなく、解析対象となる物質を適切に断片化することができる。このように、本発明は、同一試料に対して異なる複数の処理を行うことができるため、解析効率が高い。
【００５１】
また、本工程で用いられる断片化のための試薬、例えばトリプシン溶液等は、微量分注装置を用いて添加することができる。微量分注装置については、上述の染色法において述べたとおりである。従って、工程（１）において相互作用を示した対象物質が存在する所望の微小領域について断片化処理を行うことができる。
【００５２】
工程（３）の質量分析においては、上記工程（１）及び（２）と同一の支持体上の同一の位置で測定を行うことができる。従って、本工程によってその位置に存在しうるブロッキング試薬も同時に測定されることもある。しかしながら、本工程においては、同定すべき物質の解析に必要なマススペクトルのピーク範囲内にブロッキング試薬のピークは検出されない。なぜなら、本発明において用いられるブロッキング試薬が、同定解析の対象となる物質よりも大きい分子量を有し、且つ工程（２）における断片化条件によって、同定解析の対象となる物質から生じる断片が有する分子量以下の分子量の断片を生じない構造を有するものに工夫されているためである。従って、本工程においては、ブロッキング試薬が同定すべき物質の解析に支障を与えることはない。このように本発明の解析の方法は、工程（１）から工程（３）までを、同一支持体上の同一位置において行うことができるため、解析の効率が大変高い。
【００５３】
このように工程（１）におけるブロッキング試薬の工夫により、本工程では高感度に解析を行うことができる。従って、MS解析のみならずMS/MS解析も可能となる。すなわち、前記工程（２）で得られた少なくとも１つの断片についてMS解析を行い、さらに、前記MS解析によって得られたデータにおける少なくとも１つの断片についてMS/MS解析を行うことが可能となる。このようにMS/MS解析が可能になることによって、MS解析だけでは十分なデータが得ることができないような物質についても同定が可能となる。
【００５４】
MS解析だけでは十分なデータが得ることができない物質としては、その物質の分子量や特性が関係するが、特に低分子量のものが挙げられる。例えば、10kDa〜60kDa程度の分子量、あるいはそれ以下の分子量の物質である。具体的には、低分子量タンパク質のGroES（10kDa）などが挙げられる。例えば、GroESについて工程（１）及び（２）の操作を行った後MS測定を行うと、得られるマススペクトルにおいてGroES由来のペプチドフラグメントのピークが少なく、十分な同定に至らない。しかしながら、このうちの１つのペプチドフラグメントに対しMS/MS測定を行うと、さらなる情報を入手することができるため、十分な同定解析を行うことが可能になる。すなわち、物質Ａの分子量が10kDa〜60kDa程度、あるいはそれ以下の低分子量であっても、MS/MS測定によって十分な同定解析が可能になる。なお、物質Ａの分子量がここに示したよりも大きい分子量であっても、その解析が可能であることはいうまでもない。
【００５５】
また、本工程においてはレーザー脱離イオン化質量分析法を用いることが好ましい。この場合、断片化された物質が存在する位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。さらに、本工程においては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ法）を用いることが好ましい。この場合、処理された物質に対し、好ましくは微量分注装置を用いてマトリクス溶液を重ねて分注し、その分注位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。微量分注装置を用いると、質量分析の対象が微小な範囲に限定されるため、このときに得られるマススペクトルにおいては、所望の領域以外からの不必要なシグナル、すなわちバックグラウンドを低減することができる。また、（１）及び/又は（２）の工程において、同一支持体上で複数の処理を行った場合、マトリクス溶液の分注やレーザー照射を、処理が行われた複数の位置のそれぞれに対して行うことによって、解析のための一連の作業の大幅な省力化が可能になる。
【００５６】
このように、本発明の染色法及び解析方法は、解析の効率が大変高い。これら本発明の方法における一連の作業工程は、自動制御することもできる。例えば、（ａ）対象物質Ａを含む試料を支持体上に固相化する装置と、（ｂ）前記対象物質Ａを、前記対象物質Ａに対する特異的結合物質Ｂとの接触によって捕捉する装置と、（ｃ）前記対象物質Ａ及び/又は前記特異的結合物質Ｂの、物理的及び/又は化学的情報を入手する装置とを少なくとも含む、解析装置等として自動制御することができる。この場合、装置（ｃ）は、質量分析法、蛍光法、ＲＩ法及び表面プラズモン共鳴法から選ばれる方法を用いることができる。このような自動制御によって、さらなるスループット性の向上と作業の省力化とを図ることが可能となる。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞
牛血清アルブミン（BSA；Bovine Serum Albumin）をSDS-PAGE 後、疎水性のメンブレンに転写し、転写したメンブレンをサンプルプレートへ固定した。このように、電気泳動後のゲルをメンブレン上に転写する過程を模式的に示した図を図１に示す。転写したメンブレンに対し、Rapid Immunodetection Method (Millipore Application Note RP562)のプロトコルに準じてウエスタンブロットを行った。ただし本実施例では、Rapid Immunodetection Methodにおいて実際に用いられる界面活性剤を用いずに、ポリビニルピロリドン（PVP）を用いて行った。すなわち、PVPを用いて固体支持体をブロッキングし、蛍光標識されたBSA抗体を用いて免疫ブロット法により陽性バンドを検出した。このとき得られた結果を図２に示す。この陽性バンドに対し、微量分注装置（島津製作所製CHIP-1000）を用いて酵素消化を行った。その後、質量分析装置（島津製作所製AXIMA）を用いて直接メンブレン上でPMF解析を行った。このとき得られたマススペクトルを図３に示す。図３中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)を表し、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。図３で検出されたすべてのイオンピークについて、mascotデータベース(http://www.matrixscience.com/)による検索を行った。検索の結果、高いスコア（スコア７２）でBSAと同定することができた。以下、本実施例において行われたウエスタンブロットのプロトコルについて具体的に示す。
【００５８】
［メンブレンの乾燥］
１．メンブレンを、１００％メタノールに１０秒間浸漬した。
２．ブロットを濾紙上に１５分間載置した。
３．ブロットをバキュームチャンバー内に３０分間放置した。
４．ブロットを３７℃で１時間インキュベートした。
５．ブロットをラボベンチ上に置き、室温で２時間乾燥させた。
【００５９】
［免疫検出］
１．ブロットを、0.25%(w/v)のポリビニルピロリドン（PVP-40；シグマ社製）と一次抗体とを含むTBSバッファに１時間浸漬した。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
２．TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
３．ブロットを、0.25%(w/v)のポリビニルピロリドン（PVP-40；シグマ社製）と二次抗体とを含むTBSバッファに１時間浸漬した。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
４． TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
５．ブロットをMilli-Q water（ミリポア社製）でリンスした。
６．ブロットをラボベンチ上に置き、室温で乾燥させた。
【００６０】
＜実施例２＞
大腸菌の可溶性画分（100 mg）を用いて等電点電気泳動（pH 4.0-7.0）を行った。二次元目に SDS-PAGE（12.5%）を行った。その後、メンブレンに転写した。転写したメンブレンを、上記実施例１における染色法プロトコルと同様の操作を行うことにより乾燥させた。
【００６１】
１．乾燥させたメンブレンを0.25%(w/v)のPVPと一次抗体（Molecular Probe社製、anti-GroEL）とを含むTBSバッファ中で1 時間振とうした。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
２．TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
３．ブロットを、0.25%(w/v)のPVPと二次抗体（蛍光標識のものを使用した）とを含むTBSバッファ中で30 分振とうした。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
４．TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
５．蛍光イメージアナライザー（富士フィルム社製）を用いてGroEL タンパク質のスポットを検出した。このとき得られた結果を図４に示す。
６．可視化により確認するため Direct Blue 71（シグマ社製）を用いてタンパク質を染色した。このとき得られた結果を図５に示す。
７．蛍光イメージアナライザーで検出したスポットとDirect Blue 71で染色されたスポットを重ね合わせ、重なったスポットに対し、CHIP-1000を用いて酵素消化、マトリックスの順で添加し、質量分析装置により測定を行った。このとき得られた結果を図６に示す。図６中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)を表し、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。図６で検出されたイオンピークについて、mascot検索(http://www.matrixscience.com/)を行った。（検索条件は、以下のとおりである。Taxonomy: All entries, Enzyme: Trypsin, Allow up to 1 missed cleavage, Peptide tol. : ±0.4 Da, Variable modification: Oxidation (M)）検索の結果、十分なスコア及びシーケンスカバレージ（スコア９７、１２％シーケンスカバレージ）で同定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本実施例１において、電気泳動後のゲルをメンブレン上に転写する過程を模式的に示した図である。
【図２】本実施例１において、ＢＳＡをウエスタンブロットによって検出した結果である。
【図３】本実施例１において得られた質量分析結果である。
【図４】本実施例２において、大腸菌可溶画分のタンパク質スポットを蛍光イメージアナライザーによって検出した結果である。
【図５】本実施例２において、大腸菌可溶画分のタンパク質スポットを染色した結果である。
【図６】本実施例２において得られた質量分析結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床・診断・生化学・分子生物学に関わる分野のすべてに関する。特に、本発明は、免疫化学反応を利用した生体分子等の解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
二次元電気泳動などのクロマトグラフィーにより分離された生体分子等の解析方法として、以下の方法が知られている。
【０００３】
（１）マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI-MS ）の有用性が認められている（J. Mass Spectrom. Soc. Jpn (2003), Vol. 51, pp. 530-537）。また、対象サンプルの保存性、あるいはピエゾ素子等のインクジェット技術を用いた微量分注・解析システムへの応用が可能であるという利点から、対象物質をメンブレン上に固相化（ブロット）し、直接メンブレン上で解析する系が提唱されている（特表２００１−５２１６２３号公報、 Molecular & Cellular Proteomics (2002) vol. 1, pp. 490-499 ）。
【０００４】
（２）対象物質を電気泳動等により展開し、固体支持体上に固相化した後、該対象物質に対して相互作用する分子を反応させ、その存在を検出する方法が広く用いられている（主に免疫ブロット法）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５２１６２３号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ザ・マス・スペクトロメトリー・ソサイエティー・オブ・ジャパン（Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan）、第５１巻、２００３年、ｐ．５３０−５３７
【非特許文献２】モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular Proteomics ）第１巻、２００２年、ｐ．４９０−４９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
支持体に固相化された物質の分子間相互作用を判定するために用いられる試薬等は、質量分析による物質の同定解析を行うときに解析の妨害となる。このため、従来より行われてきた生体分子などの解析方法においては、固相化された物質の分子間相互作用を判定する工程と、固相化された物質の同定解析を行う工程とを行う場合、それぞれの工程は別々の支持体上で行われている。すなわち、同一試料を同条件で固相化させた支持体を複数用意するか、或いはそのように固相化された一つの支持体を切り分ける必要がある。このように、従来の方法では、支持体上の同一試料に対して行うことができる処理の数が限られており、解析効率が低い。
【０００７】
そこで本発明の目的は、固相化された物質の分子間相互作用の判定と質量分析とを同一支持体上で行うことができる方法を提供することにある。また、本発明の目的は、微量分注技術並びに質量分析技術を応用することで、一連の作業の大幅な省力化を図る系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の発明を含む。
下記＜１＞〜＜１６＞は、質量分析を妨害しないブロッキング試薬を用いる、試料の染色方法に関する。このうち下記＜１＞〜＜３＞は、支持体上に固相化された物質Ａ及び特異的結合物質Ｂが関連する形態に関する。さらに下記＜５＞〜＜１０＞は、支持体上に固相化された物質Ａ、そこから調製される物質Ａ’、及び特異的結合物質Ｂが関連する形態に関する。
【０００９】
＜１＞ 支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａに対する特異的結合能を有する物質Ｂとを用いることによって、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【００１０】
＜２＞ 前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂを断片化する条件によって、前記物質Ａから生じる断片及び前記物質Ｂから生じる断片のいかなる断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有する、＜１＞に記載の試料の染色方法。
【００１１】
＜３＞ 前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜１＞又は＜２＞に記載の試料の染色方法。
＜４＞ 前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１２】
＜５＞ 支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
前記支持体上で前記対象物質Ａから物質Ａ’を調製する工程と、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａから前記支持体上で調製される物質Ａ’に対する特異的結合能を有する物質Ｂを用いることによって、前記物質Ａ’と前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【００１３】
＜６＞ 前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを断片化することができる条件によって前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂから生じる断片よりも小さい分子量の断片を生じない構造を有する、＜５＞に記載の試料の染色方法。
【００１４】
＜７＞ 前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜５＞又は＜６＞に記載の試料の染色方法。
＜８＞ 前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、＜５＞〜＜７＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１５】
＜９＞ 前記物質Ａ’がタンパク質である、＜５＞〜＜８＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
＜１０＞ 支持体上に固相化された、核酸を含む試料に対し、
転写試薬及び/又は翻訳試薬、及び、標識部とタンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合することができるアクセプター部とを有する標識物質を同時に用いることによって、
前記核酸から転写及び/又は翻訳によってタンパク質を調製し、同時に調製された前記タンパク質を前記標識物質の結合によってラベル化タンパク質とする、＜９＞に記載の試料の染色方法。
【００１６】
＜１１＞ 前記ブロッキング試薬がポリビニルピロリドン又はn-オクチル-β-D-グルコピラノシドである、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１７】
＜１２＞ 前記物質Ｂが、標識物質によりラベル化されているラベル化分子である、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
＜１３＞ 前記標識物質が蛍光標識物質である、＜１２＞に記載の試料の染色方法。
【００１８】
＜１４＞ 免疫ブロット法によって前記相互作用を判定する、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
【００１９】
＜１５＞ 前記支持体に、メンブレン、プレート、非磁性粒子及び磁性粒子から選ばれる少なくとも１つが用いられる、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の試料の染色方法。
＜１６＞ 前記支持体が、質量分析用プレートであり、
前記物質Ａを含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用プレートとを、接触させることにより、前記質量分析用プレート上に固相化された前記物質Ａを得る、＜１５＞に記載の試料の染色方法。
【００２０】
下記＜１７＞〜＜２０＞は、上記＜１＞〜＜１６＞の染色方法を用いた試料の解析方法に関する。
【００２１】
＜１７＞ （１）＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の試料の染色方法を行うことによって、前記対象物質Ａと、前記特異的結合物質Ｂとの相互作用を判定する工程と、
（２）相互作用すると判定された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で断片化する工程と、
（３）断片化された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で質量分析によって同定する工程とを含む、試料の解析方法。
【００２２】
＜１８＞ 前記工程（２）において、微量分注装置を用いて、断片化のための試薬を添加する、＜１７＞に記載の試料の解析方法。
【００２３】
＜１９＞ 前記工程（３）において、前記工程（２）で得られた少なくとも１つの断片についてMS解析を行い、さらに、前記MS解析によって得られたデータにおける少なくとも１つの断片についてMS/MS解析を行う、＜１７＞又は＜１８＞に記載の試料の解析方法。
【００２４】
＜２０＞ 前記工程（３）において、ＭＡＬＤＩ法によって質量分析を行う、＜１７＞〜＜１９＞のいずれかに記載の試料の解析方法。
＜２１＞ 微量分注装置を用いてマトリックス溶液を添加する、＜２０＞に記載の試料の解析方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によると、固相化された物質の分子間相互作用の判定と質量分析とを同一支持体上で行うことができる方法を提供することができる。また、本発明によると、微量分注技術並びに質量分析技術を応用することで、一連の作業の大幅な省力化を図る系を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、主に免疫ブロット法において、質量分析を妨害しないブロッキング試薬を用いる試料の染色方法である。本発明の染色方法は、免疫染色を行うための試料が固相化されている支持体と同一の支持体上で質量分析を行う場合に特に有用な方法である。なお本発明において、染色するとは、色を付ける形態に限定されず、特定の条件下で可視化することによって認識することができる形態も含まれる。また、本発明において支持体に固相化しているとは、共有結合などによって支持体に固定化している状態と、共有結合などによらず支持体上に載っている状態との両方を含む意味で用いる。
【００２７】
本発明においてブロッキング試薬とは、解析対象となる物質が固相化された支持体上に、その物質に対する特異的結合物質が非特異的に結合するのを防止する物質である。そして、質量分析を妨害しないブロッキング試薬とは、質量分析の支障となるマススペクトルピークを呈さないブロッキング試薬である。すなわち、本発明において用いられるブロッキング試薬は、同定解析の対象となる物質に由来するピーク範囲内に検出されないものである。具体的には、本発明のブロッキング試薬は、同定解析の対象となる物質よりも大きい分子量を有し、且つ同定解析の対象となる物質を断片化することができる条件によって、その物質から生じる得る断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有する物質である。
このようなブロッキング試薬としては、ポリビニルピロリドン（PVP）や、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド等が挙げられる。
【００２８】
ブロッキング試薬は、適当な溶媒に溶解して使用する。通常、後述する物質Ｂ（抗体等）とともに溶解して使用する。溶媒としては、TBSバッファなどを用いると良い。ブロッキング試薬の濃度としては、使用するブロッキング試薬の量にも依るが、０．１〜５%(w/v)で用いることができる。例えば、ポリビニルピロリドン（PVP）の場合であれば、０．２５%(w/v)程度を用いると良い。また、使用するブロッキング試薬溶液の量としては、試料の種類や、溶解しているブロッキング試薬や物質Ｂの量等にも依るため特に限定されないが、通常はメンブレン１cm2当たり１０mlを超えない量で用いる。ブロッキング試薬溶液は通常、少ない量が好ましく用いられるため、その量の下限値は特に限定されないが、例えば０．２ml、より好ましくは０．０９ml程度である。
【００２９】
一方、従来からウエスタンブロット等において用いられるブロッキング試薬は、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン、血清、界面活性剤等である。これらは低分子であったり、或いは、酵素消化が行われることにより分解されて低分子の断片が生じたりするものである。このため、これらの従来のウエスタンブロット法を行った後に同定対象となる物質を同一支持体上で質量分析に供すると、同定解析の対象となる物質のピーク範囲内に夾雑物として検出される。
【００３０】
本発明における試料の染色方法のその他の条件としては、通常行われる染色方法における条件を用いればよい。具体的には、対象物質Ａを含む試料が固相化された支持体を用意し；この支持体上の試料に対し、ブロッキング試薬と、対象物質Ａに対する特異的結合能力を有する物質Ｂとを添加し；物質Ａと物質Ｂとの相互作用を判定することにより行う。従って本発明において用いられるブロッキング試薬は、物質Ｂが非特異的に結合し得る、支持体上の部位をブロックすることができるものであって、物質Ａ及び/又は物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである。さらに、本発明におけるブロッキング試薬は、物質Ａ及び/又は物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ、物質Ａ及び/又は物質Ｂを断片化することができる条件下において物質Ａ及び/又は物質Ｂから生じ得る断片が有する分子量以下の分子量の断片を生じない構造を有する。
【００３１】
対象物質Ａとしては、具体例には、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる。
物質Ｂは、対象物質Ａに特異的に結合することができる物質であり、通常は、対象物質Ａとの免疫化学的反応により物質Ａ−物質Ｂ複合体を形成しうる物質である。具体例には、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる。さらに物質Ｂは、標識物質によりラベル化されているラベル化分子であってもよい。標識物質としては、蛍光標識物質等が挙げられる。このような物質Ｂは、適宜、溶液などに含ませて用いる。
【００３２】
支持体には、メンブレン、プレート、非磁性粒子、磁性粒子等から選ばれる少なくとも１つが用いられる。メンブレンを用いる場合、物質Ａを含む試料は、電気的にメンブレンに転写させて使用することができる。メンブレンとしては、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ポリアミド、ポリエチレン等の有機合成高分子及びその誘導体を挙げることができる。ポリアミドとしては、ナイロン等が挙げられる。
【００３３】
プレートとしては、ガラス製プレート、樹脂製プレート、金属製プレート等が挙げられる、このようなプレートを用いる場合は、物質Ａを含む試料の電気泳動後のゲルや、物質Ａを含む試料が転写されたメンブレンを、プレートの表面に接触させて使用することができる。
【００３４】
本発明が質量分析のために用いられる場合は、前記支持体には好ましくは金属製プレート、例えば質量分析用サンプルプレートが用いられる。支持体として質量分析用サンプルプレートを用いた場合は、相互作用判定後、同一支持体上で質量分析が可能となる点で好ましい。このとき、質量分析用サンプルプレート上に固相化された物質Ａは、物質Ａを含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用サンプルプレートとを接触させて得たものとすることができる。また、質量分析用サンプルプレートに、物質Ａを含む試料を（電気泳動後のゲル等から）メンブレンに転写したものを貼り付ける等行うことによって固着させて得たものであっても良い。なお固着には導電性両面粘着テープ等を用いた固定を行うと良い。
【００３５】
さらに、非磁性粒子を用いた支持体としては、ポリサッカライドゲルや合成ポリマー等を用いた支持体が用いられる。磁性粒子を用いた支持体としては、電気泳動後の被転写支持体としての支持体の基本構造に通電性の磁性金属を使用したもの等が用いられる。さらに、アビディティーを向上させる目的のスペーサーを結合させた磁性粒子を支持体にしたもの等が挙げられる。
【００３６】
本発明は、特に免疫ブロット法に有用に用いることができる。従ってこの場合、支持体上に固相化された物質Ａの具体例としては、タンパク質を電気泳動した後メンブレンに転写したものが挙げられ、物質Ｂの具体例としては抗体が挙げられる。そして、物質Ａと物質Ｂとの抗原抗体反応を確認することによって両物質間の相互作用を判定する。
【００３７】
なお、本発明において、物質間の相互作用を判定するとは、支持体上に固相化された試料中の物質Ａがあらかじめ想定されたものであって、想定された物質Ａに対する特異的結合物質Ｂを作用させることによって、物質Ａの支持体上の位置を確認する形態と；物質Ａが未知の物質であって、可能性のある様々な物質Ｂを作用させることによって、物質Ａに作用させた物質Ｂのうちどれが特異的に結合したかを判定するとともに物質Ａの位置を確認する形態との両方を含む意味で用いる。
【００３８】
また、本発明における試料の染色方法としては、以下のような方法も挙げられる。この形態においては、対象物質Ａを含む試料が固相化された支持体を用意し；この支持体上の対象物質Ａから合成される物質Ａ’を調製し；この支持体上に調製された物質Ａ’に対し、ブロッキング試薬と、物質Ａ’に対する特異的結合物質Ｂとを添加し；物質Ａ’と物質Ｂとの相互作用を判定する。
【００３９】
このとき用いられるブロッキング試薬は、物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである。さらに、この場合におけるブロッキング試薬は、物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ、物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂを断片化することができる条件下において物質Ａ、物質Ａ’、及び/又は物質Ｂから生じ得る断片が有する分子量以下の分子量の断片を生じない構造を有する。
【００４０】
物質Ａ’としては、タンパク質などである。このようなタンパク質は、支持体上に物質Ａとして固相化された核酸から、支持体上における無細胞タンパク質合成によって調製することができる。すなわち、支持体上に固相化された、核酸を含む試料に対し、転写試薬及び/又は翻訳試薬を添加することによって構築した転写系及び/又は翻訳系で発現させることにより調製することができる。
【００４１】
またこのようなタンパク質は、ラベル化タンパク質として得ることもできる。このようなラベル化タンパク質は、転写試薬及び/又は翻訳試薬と、ラベル化試薬とを用いることによって調製することができる。このとき用いられるラベル化試薬は、ラベル部と、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合することができるアクセプター部とを有する。そして、このラベル化試薬が、転写系及び/又は翻訳系で発現したタンパク質に結合することによって、ラベル化タンパク質が調製される。
【００４２】
本発明においては、微量分注装置を用いて支持体上に溶液を添加しても良いし、支持体を溶液に浸漬しても良い。微量分注装置としては、インクジェット法の機構を搭載した装置を用いることができる。このような装置としては、CHIP-1000（島津製作所製）などが挙げられる。
【００４３】
本発明においては、微量分注装置を用いることにより、添加される溶液の量を大幅に制御することができる。例えば、インクジェット法の機構を搭載した装置の場合、一個のインクジェット吐出部から１回の分注操作につき添加される試薬量を、例えば１００ｐｌ程度に制御することができる。インクジェットの機構によっては、これよりさらに少ない量に制御することもできる。また、吐出を繰り返すことができるため、試薬量を分注する量の上限も特に限定されない。特定の１つの領域に対しては、例えばナノリットルレベル、通常１００ｎｌ程度の試薬量を分注することができる。従って、抗体溶液等、希少かつ高価な試薬であっても必要最低限の使用量しか消費しないため、大幅なコストダウンを図ることができる。
【００４４】
微量分注装置を用いることによって、例えば１００ｐｌ程度の吐出によって７８００μｍ２程度の極小の分注範囲を生じる。この分注範囲は、インクジェットの機構によってさらに小さい範囲に限局することもできる。さらに、インクジェット吐出部の支持体上の相対位置を変えることにより分注位置をずらしていくことができるため、任意の領域に溶液を分注することができる。このため、分注範囲の上限も特に限定されない。特定の領域にアレイとして分注する場合は、例えば１ｍｍ２あたり４〜１００スポット分注することができる。
【００４５】
また、同一支持体上に溶液を添加すべき領域を２つ以上設定することも可能である。従って、同一支持体上でも異なる領域で別種の溶液を添加することが可能になり、相互作用の判定を効率よく行うことが可能になる。
【００４６】
このように微量分注装置は、微量の溶液を添加することができるため、支持体上における所望の極小領域のみを処理することが可能になる。このため、大量検体処理が容易になり、ひいては、相互作用する分子を確実に同定するためのハイスループット（高効率）相互作用スクリーニングが可能になる。
【００４７】
これまで述べた本発明の染色法は、物質Ａ及び/又は物質Ｂが有する物理的情報や化学的情報を得るために利用することができる。このような情報を得るために、質量分析法、蛍光法、ＲＩ法、表面プラズモン共鳴法等が用いられる。特に本発明の染色法は、質量分析を妨害しないブロッキング試薬を用いるため、試料が固相化されている支持体と同一の支持体上で質量分析を行うことが可能になることから、質量分析による解析を行う場合に有用である。
【００４８】
さらに本発明は、支持体上に固相化された試料について上述した染色を行うことによる、試料の解析方法である。本発明の解析方法は、（１）前述した試料の染色法によって、試料中の物質Ａ（又は物質Ａから支持体上で調製される物質Ａ’；以下、これらをまとめて単に物質Ａと表記する。）と特異的結合物質Ｂとの相互作用を判定する工程と、（２）相互作用すると判定された、試料中の物質Ａを同一支持体上で断片化する工程と、（３）断片化された物質Ａを、同一支持体上で質量分析によって同定する工程とを含む。
【００４９】
本発明の解析方法は、工程（１）において、同定解析の対象となる物質の質量分析の支障となるマススペクトルピークを呈さないブロッキング試薬を用いる。このブロッキング試薬は、すでにのべた通り、本発明において用いられるブロッキング試薬は、同定解析の対象となる物質に由来するピーク範囲内に検出されないものである。具体的には、同定解析の対象となる物質よりも大きい分子量を有し、且つ同定解析の対象となる物質を断片化することができる条件すなわち工程（２）における条件によって、その物質から生じ得る断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有するものである。
【００５０】
工程（２）の断片化においては、公知の方法に基づいた断片化を行うことができる。例えば、トリプシン消化などを行うとよい。本発明においては、本工程の条件によって低分子量の断片を生じない構造を有するブロッキング試薬を用いているため、工程（１）によって相互作用を示した物質の、同じ支持体上における同じ位置で断片化処理を行っても、その位置に存在しうるブロッキング試薬から、後の工程（３）の質量分析の支障となるマススペクトルピークを呈する断片を生じさせることなく、解析対象となる物質を適切に断片化することができる。このように、本発明は、同一試料に対して異なる複数の処理を行うことができるため、解析効率が高い。
【００５１】
また、本工程で用いられる断片化のための試薬、例えばトリプシン溶液等は、微量分注装置を用いて添加することができる。微量分注装置については、上述の染色法において述べたとおりである。従って、工程（１）において相互作用を示した対象物質が存在する所望の微小領域について断片化処理を行うことができる。
【００５２】
工程（３）の質量分析においては、上記工程（１）及び（２）と同一の支持体上の同一の位置で測定を行うことができる。従って、本工程によってその位置に存在しうるブロッキング試薬も同時に測定されることもある。しかしながら、本工程においては、同定すべき物質の解析に必要なマススペクトルのピーク範囲内にブロッキング試薬のピークは検出されない。なぜなら、本発明において用いられるブロッキング試薬が、同定解析の対象となる物質よりも大きい分子量を有し、且つ工程（２）における断片化条件によって、同定解析の対象となる物質から生じる断片が有する分子量以下の分子量の断片を生じない構造を有するものに工夫されているためである。従って、本工程においては、ブロッキング試薬が同定すべき物質の解析に支障を与えることはない。このように本発明の解析の方法は、工程（１）から工程（３）までを、同一支持体上の同一位置において行うことができるため、解析の効率が大変高い。
【００５３】
このように工程（１）におけるブロッキング試薬の工夫により、本工程では高感度に解析を行うことができる。従って、MS解析のみならずMS/MS解析も可能となる。すなわち、前記工程（２）で得られた少なくとも１つの断片についてMS解析を行い、さらに、前記MS解析によって得られたデータにおける少なくとも１つの断片についてMS/MS解析を行うことが可能となる。このようにMS/MS解析が可能になることによって、MS解析だけでは十分なデータが得ることができないような物質についても同定が可能となる。
【００５４】
MS解析だけでは十分なデータが得ることができない物質としては、その物質の分子量や特性が関係するが、特に低分子量のものが挙げられる。例えば、10kDa〜60kDa程度の分子量、あるいはそれ以下の分子量の物質である。具体的には、低分子量タンパク質のGroES（10kDa）などが挙げられる。例えば、GroESについて工程（１）及び（２）の操作を行った後MS測定を行うと、得られるマススペクトルにおいてGroES由来のペプチドフラグメントのピークが少なく、十分な同定に至らない。しかしながら、このうちの１つのペプチドフラグメントに対しMS/MS測定を行うと、さらなる情報を入手することができるため、十分な同定解析を行うことが可能になる。すなわち、物質Ａの分子量が10kDa〜60kDa程度、あるいはそれ以下の低分子量であっても、MS/MS測定によって十分な同定解析が可能になる。なお、物質Ａの分子量がここに示したよりも大きい分子量であっても、その解析が可能であることはいうまでもない。
【００５５】
また、本工程においてはレーザー脱離イオン化質量分析法を用いることが好ましい。この場合、断片化された物質が存在する位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。さらに、本工程においては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ法）を用いることが好ましい。この場合、処理された物質に対し、好ましくは微量分注装置を用いてマトリクス溶液を重ねて分注し、その分注位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。微量分注装置を用いると、質量分析の対象が微小な範囲に限定されるため、このときに得られるマススペクトルにおいては、所望の領域以外からの不必要なシグナル、すなわちバックグラウンドを低減することができる。また、（１）及び/又は（２）の工程において、同一支持体上で複数の処理を行った場合、マトリクス溶液の分注やレーザー照射を、処理が行われた複数の位置のそれぞれに対して行うことによって、解析のための一連の作業の大幅な省力化が可能になる。
【００５６】
このように、本発明の染色法及び解析方法は、解析の効率が大変高い。これら本発明の方法における一連の作業工程は、自動制御することもできる。例えば、（ａ）対象物質Ａを含む試料を支持体上に固相化する装置と、（ｂ）前記対象物質Ａを、前記対象物質Ａに対する特異的結合物質Ｂとの接触によって捕捉する装置と、（ｃ）前記対象物質Ａ及び/又は前記特異的結合物質Ｂの、物理的及び/又は化学的情報を入手する装置とを少なくとも含む、解析装置等として自動制御することができる。この場合、装置（ｃ）は、質量分析法、蛍光法、ＲＩ法及び表面プラズモン共鳴法から選ばれる方法を用いることができる。このような自動制御によって、さらなるスループット性の向上と作業の省力化とを図ることが可能となる。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞
牛血清アルブミン（BSA；Bovine Serum Albumin）をSDS-PAGE 後、疎水性のメンブレンに転写し、転写したメンブレンをサンプルプレートへ固定した。このように、電気泳動後のゲルをメンブレン上に転写する過程を模式的に示した図を図１に示す。転写したメンブレンに対し、Rapid Immunodetection Method (Millipore Application Note RP562)のプロトコルに準じてウエスタンブロットを行った。ただし本実施例では、Rapid Immunodetection Methodにおいて実際に用いられる界面活性剤を用いずに、ポリビニルピロリドン（PVP）を用いて行った。すなわち、PVPを用いて固体支持体をブロッキングし、蛍光標識されたBSA抗体を用いて免疫ブロット法により陽性バンドを検出した。このとき得られた結果を図２に示す。この陽性バンドに対し、微量分注装置（島津製作所製CHIP-1000）を用いて酵素消化を行った。その後、質量分析装置（島津製作所製AXIMA）を用いて直接メンブレン上でPMF解析を行った。このとき得られたマススペクトルを図３に示す。図３中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)を表し、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。図３で検出されたすべてのイオンピークについて、mascotデータベース(http://www.matrixscience.com/)による検索を行った。検索の結果、高いスコア（スコア７２）でBSAと同定することができた。以下、本実施例において行われたウエスタンブロットのプロトコルについて具体的に示す。
【００５８】
［メンブレンの乾燥］
１．メンブレンを、１００％メタノールに１０秒間浸漬した。
２．ブロットを濾紙上に１５分間載置した。
３．ブロットをバキュームチャンバー内に３０分間放置した。
４．ブロットを３７℃で１時間インキュベートした。
５．ブロットをラボベンチ上に置き、室温で２時間乾燥させた。
【００５９】
［免疫検出］
１．ブロットを、0.25%(w/v)のポリビニルピロリドン（PVP-40；シグマ社製）と一次抗体とを含むTBSバッファに１時間浸漬した。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
２．TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
３．ブロットを、0.25%(w/v)のポリビニルピロリドン（PVP-40；シグマ社製）と二次抗体とを含むTBSバッファに１時間浸漬した。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
４． TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
５．ブロットをMilli-Q water（ミリポア社製）でリンスした。
６．ブロットをラボベンチ上に置き、室温で乾燥させた。
【００６０】
＜実施例２＞
大腸菌の可溶性画分（100 mg）を用いて等電点電気泳動（pH 4.0-7.0）を行った。二次元目に SDS-PAGE（12.5%）を行った。その後、メンブレンに転写した。転写したメンブレンを、上記実施例１における染色法プロトコルと同様の操作を行うことにより乾燥させた。
【００６１】
１．乾燥させたメンブレンを0.25%(w/v)のPVPと一次抗体（Molecular Probe社製、anti-GroEL）とを含むTBSバッファ中で1 時間振とうした。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
２．TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
３．ブロットを、0.25%(w/v)のPVPと二次抗体（蛍光標識のものを使用した）とを含むTBSバッファ中で30 分振とうした。このとき、ブロット１cm2に対して0.09ml のTBSバッファを用いた。
４．TBSを用いてブロットを10秒間洗浄した。このとき、ブロット１cm2に対して0.9mlのTBSバッファを用いた。この洗浄操作を２回繰り返した。
５．蛍光イメージアナライザー（富士フィルム社製）を用いてGroEL タンパク質のスポットを検出した。このとき得られた結果を図４に示す。
６．可視化により確認するため Direct Blue 71（シグマ社製）を用いてタンパク質を染色した。このとき得られた結果を図５に示す。
７．蛍光イメージアナライザーで検出したスポットとDirect Blue 71で染色されたスポットを重ね合わせ、重なったスポットに対し、CHIP-1000を用いて酵素消化、マトリックスの順で添加し、質量分析装置により測定を行った。このとき得られた結果を図６に示す。図６中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)を表し、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。図６で検出されたイオンピークについて、mascot検索(http://www.matrixscience.com/)を行った。（検索条件は、以下のとおりである。Taxonomy: All entries, Enzyme: Trypsin, Allow up to 1 missed cleavage, Peptide tol. : ±0.4 Da, Variable modification: Oxidation (M)）検索の結果、十分なスコア及びシーケンスカバレージ（スコア９７、１２％シーケンスカバレージ）で同定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本実施例１において、電気泳動後のゲルをメンブレン上に転写する過程を模式的に示した図である。
【図２】本実施例１において、ＢＳＡをウエスタンブロットによって検出した結果である。
【図３】本実施例１において得られた質量分析結果である。
【図４】本実施例２において、大腸菌可溶画分のタンパク質スポットを蛍光イメージアナライザーによって検出した結果である。
【図５】本実施例２において、大腸菌可溶画分のタンパク質スポットを染色した結果である。
【図６】本実施例２において得られた質量分析結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａに対する特異的結合能を有する物質Ｂとを用いることによって、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【請求項２】
前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂを断片化する条件によって、前記物質Ａから生じる断片及び前記物質Ｂから生じる断片のいかなる断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有する、請求項１に記載の試料の染色方法。
【請求項３】
前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項１又は２に記載の試料の染色方法。
【請求項４】
前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項５】
支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
前記支持体上で前記対象物質Ａから物質Ａ’を調製する工程と、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａから前記支持体上で調製される物質Ａ’に対する特異的結合能を有する物質Ｂを用いることによって、前記物質Ａ’と前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【請求項６】
前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを断片化することができる条件によって前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂから生じる断片よりも小さい分子量の断片を生じない構造を有する、請求項５に記載の試料の染色方法。
【請求項７】
前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項５又は６に記載の試料の染色方法。
【請求項８】
前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項９】
前記物質Ａ’がタンパク質である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１０】
支持体上に固相化された、核酸を含む試料に対し、
転写試薬及び/又は翻訳試薬、及び、標識部とタンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合することができるアクセプター部とを有する標識物質を同時に用いることによって、
前記核酸から転写及び/又は翻訳によってタンパク質を調製し、同時に調製された前記タンパク質を前記標識物質の結合によってラベル化タンパク質とする、請求項９に記載の試料の染色方法。
【請求項１１】
前記ブロッキング試薬がポリビニルピロリドン又はn-オクチル-β-D-グルコピラノシドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１２】
前記物質Ｂが、標識物質によりラベル化されているラベル化分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１３】
前記標識物質が蛍光標識物質である、請求項１２に記載の試料の染色方法。
【請求項１４】
免疫ブロット法によって前記相互作用を判定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１５】
前記支持体に、メンブレン、プレート、非磁性粒子及び磁性粒子から選ばれる少なくとも１つが用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１６】
前記支持体が、質量分析用プレートであり、
前記物質Ａを含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用プレートとを、接触させることにより、前記質量分析用プレート上に固相化された前記物質Ａを得る、請求項１５に記載の試料の染色方法。
【請求項１７】
（１）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の試料の染色方法を行うことによって、前記対象物質Ａと、前記特異的結合物質Ｂとの相互作用を判定する工程と、
（２）相互作用すると判定された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で断片化する工程と、
（３）断片化された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で質量分析によって同定する工程とを含む、試料の解析方法。
【請求項１８】
前記工程（２）において、微量分注装置を用いて、断片化のための試薬を添加する、請求項１７に記載の試料の解析方法。
【請求項１９】
前記工程（３）において、前記工程（２）で得られた少なくとも１つの断片についてMS解析を行い、さらに、前記MS解析によって得られたデータにおける少なくとも１つの断片についてMS/MS解析を行う、請求項１７又は１８に記載の試料の解析方法。
【請求項２０】
前記工程（３）において、ＭＡＬＤＩ法によって質量分析を行う、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の試料の解析方法。
【請求項２１】
微量分注装置を用いてマトリックス溶液を添加する、請求項２０に記載の試料の解析方法。
【請求項１】
支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａに対する特異的結合能を有する物質Ｂとを用いることによって、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【請求項２】
前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ及び/又は前記物質Ｂを断片化する条件によって、前記物質Ａから生じる断片及び前記物質Ｂから生じる断片のいかなる断片が有する分子量以下の分子量を有する断片を生じない構造を有する、請求項１に記載の試料の染色方法。
【請求項３】
前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項１又は２に記載の試料の染色方法。
【請求項４】
前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項５】
支持体上に固相化された、対象物質Ａを含む試料に対し、
前記支持体上で前記対象物質Ａから物質Ａ’を調製する工程と、
ブロッキング試薬と、前記対象物質Ａから前記支持体上で調製される物質Ａ’に対する特異的結合能を有する物質Ｂを用いることによって、前記物質Ａ’と前記物質Ｂとの相互作用を判定する工程を含み、
前記ブロッキング試薬は、前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂの質量分析による解析結果に支障を与えるマススペクトルピークを呈さないものである、試料の染色方法。
【請求項６】
前記ブロッキング試薬は、
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂよりも大きい分子量を有し、且つ
前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを断片化することができる条件によって前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂから生じる断片よりも小さい分子量の断片を生じない構造を有する、請求項５に記載の試料の染色方法。
【請求項７】
前記物質Ａが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項５又は６に記載の試料の染色方法。
【請求項８】
前記物質Ｂが、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、及びこれらの複合体から選ばれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項９】
前記物質Ａ’がタンパク質である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１０】
支持体上に固相化された、核酸を含む試料に対し、
転写試薬及び/又は翻訳試薬、及び、標識部とタンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合することができるアクセプター部とを有する標識物質を同時に用いることによって、
前記核酸から転写及び/又は翻訳によってタンパク質を調製し、同時に調製された前記タンパク質を前記標識物質の結合によってラベル化タンパク質とする、請求項９に記載の試料の染色方法。
【請求項１１】
前記ブロッキング試薬がポリビニルピロリドン又はn-オクチル-β-D-グルコピラノシドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１２】
前記物質Ｂが、標識物質によりラベル化されているラベル化分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１３】
前記標識物質が蛍光標識物質である、請求項１２に記載の試料の染色方法。
【請求項１４】
免疫ブロット法によって前記相互作用を判定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１５】
前記支持体に、メンブレン、プレート、非磁性粒子及び磁性粒子から選ばれる少なくとも１つが用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の試料の染色方法。
【請求項１６】
前記支持体が、質量分析用プレートであり、
前記物質Ａを含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用プレートとを、接触させることにより、前記質量分析用プレート上に固相化された前記物質Ａを得る、請求項１５に記載の試料の染色方法。
【請求項１７】
（１）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の試料の染色方法を行うことによって、前記対象物質Ａと、前記特異的結合物質Ｂとの相互作用を判定する工程と、
（２）相互作用すると判定された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で断片化する工程と、
（３）断片化された前記物質Ａ、前記物質Ａ’、及び/又は前記物質Ｂを前記支持体上で質量分析によって同定する工程とを含む、試料の解析方法。
【請求項１８】
前記工程（２）において、微量分注装置を用いて、断片化のための試薬を添加する、請求項１７に記載の試料の解析方法。
【請求項１９】
前記工程（３）において、前記工程（２）で得られた少なくとも１つの断片についてMS解析を行い、さらに、前記MS解析によって得られたデータにおける少なくとも１つの断片についてMS/MS解析を行う、請求項１７又は１８に記載の試料の解析方法。
【請求項２０】
前記工程（３）において、ＭＡＬＤＩ法によって質量分析を行う、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の試料の解析方法。
【請求項２１】
微量分注装置を用いてマトリックス溶液を添加する、請求項２０に記載の試料の解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−９８２６６（Ｐ２００６−９８２６６Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８５８７２（Ｐ２００４−２８５８７２）
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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