試験片およびその製造方法
【課題】
目視で容易に生理学的複合反応の検出を判定することを可能とする安価な試験片の開発が求められる。
【解決手段】
本発明は、医療現場において使用されうる生理学的複合反応を検出する試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。具体的には、基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、前記生理活性物質固定領域および前記比色領域の配色に特徴を持たせた試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。
本発明の試験片は、固定化された生理活性物質の数が多数に至る場合、測定者の解析の負担を要することなく生理学的複合反応の検出を可能とし、医療現場における迅速な対応を可能とすることができ、かつ、その製造も安価である。
目視で容易に生理学的複合反応の検出を判定することを可能とする安価な試験片の開発が求められる。
【解決手段】
本発明は、医療現場において使用されうる生理学的複合反応を検出する試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。具体的には、基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、前記生理活性物質固定領域および前記比色領域の配色に特徴を持たせた試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。
本発明の試験片は、固定化された生理活性物質の数が多数に至る場合、測定者の解析の負担を要することなく生理学的複合反応の検出を可能とし、医療現場における迅速な対応を可能とすることができ、かつ、その製造も安価である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療現場において使用されうる生理学的複合反応を検出する試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。具体的には、基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、前記生理活性物質固定領域および前記比色領域の配色に特徴を持たせた試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノムシークエンシングの進展により各生物のゲノムの全塩基配列が明らかにされつつある中、この結果を有効に利用する技術が望まれている。
核酸マイクロアレイは複数の遺伝子を同時に解析できる技術であり、塩基配列決定法のみではなく、遺伝子の発現量や多型などを効率よく調べる方法として開発され、テーラーメイド医療、菌類などの生物学的分類の特定および疾病の診断などへの技術開発が展開されている。
【０００３】
一般に、テーラーメイド医療、ならびに生物学的分類または変異体の同定に用いられうる核酸マイクロアレイは、特定の塩基配列を定性的に検出する程度で十分であり、試験紙のような，安価な使い捨て用のものが求められている。
例えば、特許文献１にはＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）単離物の同定方法に用いる核酸マイクロアレイとして、ラインプローブ（ＬｉＰＡ：Line Probe Assay、イノジジェネティクス社商標）法が開示されている。このアッセイは、ポリアミド膜片上に平行線として核酸プローブが固定されたものであり、迅速なＤＮＡの検出を可能とする。
【０００４】
また、核酸マイクロアレイに固定化する核酸プローブは、野生型の遺伝子から１０〜４０ｂｐの長さで設計されるため、固定化されうる核酸プローブの種類（スポットまたはラインの数）が多く、その数は多くて約１００種類にも及ぶ。つまり、上記の核酸マイクロアレイなどを用いたハイブリダイズの有無の判定は、測定者が、ハイブリダイズされたスポットまたはライン数を数える必要があり、その作業は煩雑であった。
【０００５】
かかる問題を解決する手段として、リソグラフィー技術により基板に凹凸を設け、凸部に核酸プローブを固定した核酸マイクロアレイが挙げられる（特許文献２）。これらのマイクロアレイは、核酸プローブの位置が明確であるため、凸部の発色または発光の有無からハイブリダイズの有無を容易に判定することができる。
しかしながら、テーラーメイド医療または一部の診断に用いられうる核酸マイクロアレイは、試験紙のような使い捨て用であることが要求されるため、リソグラフィー技術は製造コストの点で問題がある。
【０００６】
一方、特許文献３では、核酸プローブが固定化されたスポットの周囲にマーカーを設けた技術が開示されている。この核酸マイクロアレイは、インクジェット法を用いて製造されるため、リソグラフィー技術により製造された核酸マイクロアレイと比較すると製造コストの面で安価である。
しかしながら、スポットに周囲にマーカーを設けたとしても、核酸プローブの数が多くなればなるほど視覚的な錯覚をおこしやすくなり、多数のスポットから未反応のスポットを探すことは容易ではない。
【０００７】
さらに、特許文献２または３に開示された核酸マイクロアレイを用いた検出は、スキャナなどの専門の機械を用いて検出を行うため、目視で直接判定することが困難である。また、専門の機械を導入する必要があるため、医療機関の負担を要する。
【０００８】
【特許文献１】特表平７−５０３１４３号公報
【特許文献２】特開２００４−２６４２８９号公報
【特許文献３】特開２０００−２７０８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、目視で容易に生理学的複合反応の検出を判定することが可能とする安価な試験片の開発が求められる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
［１］ 基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ色であり、
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ色である。
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］、
［２］ 生理活性物質が、核酸、抗原、抗体、リガンドまたはレセプターである［１］に記載の試験片、
［３］ 生理活性物質が、核酸である［１］に記載の試験片、
［４］ 比色領域が、該基材表面における該生理活性物質固定領域以外の領域全てである［１］に記載の試験片、
［５］ 基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片の製造方法；
(i) 次式（１）の関係が成り立つ物体色を呈する基材を製造または準備する工程、
【数１】
(ii) 次式（２）の関係が成り立つ物体色を着色することにより比色領域を設けると同時に、生理活性物質固定領域を定める工程、
【数２】
(iii) 生理活性物質固定領域に生理活性物質を固定する工程
を含むことを特徴とする試験片の製造方法
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］、
［６］ 基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片を用いて、発色反応により生理学的複合体形成反応を検出する方法であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足することを特徴とする生理学的複合体形成反応検出方法；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］、
［７］ 発色反応が、酵素発色法によるものであることを特徴とする［６］に記載の検出方法、
および、［８］ 発色反応が、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法によるものであることを特徴とする［７］に記載の検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の試験片は、目視により容易に生理学的複合反応の検出を可能とするため、測定者の解析の負担がなく、医療現場における迅速な対応を可能とすることができる。また、リソグラフィー技術を用いないため、製造コストを大幅に抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の試験片とは、特別な配色により目視で容易に判定することを可能としたものをいう。また、得られた結果から疾病の診断、微生物の生物学的分類または変異体の同定ならびに個人の体質に関連する情報などを得るためのものをいう。
【００１３】
上記微生物の生物学的分類または変異体の同定とは、特に限定されるものではないが、例えば、患者に感染したＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）の種類または結核菌の持つ治療薬剤の耐性の同定などが挙げられる。
【００１４】
また、上記個人の体質に関連する情報とは、特に限定されるものではないが、例えば、個人の将来的な骨密度の変化の予測、ならびに、治療薬剤の感受性、耐性または副作用が生じる可能性の予測などが挙げられる。
【００１５】
上記生理学的複合反応とは、生体由来の物質同士の複合体形成に基づく反応をいい、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＰＮＡ（ペプチド核酸）ハイブリダイゼーション、抗原−抗体反応およびリガンド−レセプター反応などが挙げられる。
【００１６】
したがって、本発明の試験片に固定されうる生理活性物質とは、複合体形成を可能な物質であればよく、例えば、核酸、抗原、抗体、リガンドおよびレセプターなどが挙げられる。中でもテーラーメイド医療への展開としては、核酸が主に用いられる。以降の説明は、使用頻度の観点を考慮して核酸の検出の説明を中心とするが、本発明は核酸以外の物質にも準用できるものであり、必ずしも限定されるものではない。
【００１７】
上記核酸とは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが挙げられる。中でも製造コストおよび使用頻度の観点から一本鎖のＤＮＡが好ましい。これら試験片に固定されうる核酸は、一般的に核酸プローブと称されるものであり、核酸が一本鎖のＤＮＡである場合は、ＤＮＡプローブと称されるものである。
【００１８】
上記核酸プローブの製造は、特に限定されるものではなく、例えば、ＤＮＡプローブの場合、合成されたＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）またはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであってもよい。前記オリゴヌクレオチドの合成は、市販の核酸の自動合成機などで適宜合成することができる。
【００１９】
また、上記核酸は、目的対象の核酸の特定の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列を有するように設計される。前記特定の塩基配列とは、本発明の試験片の使用目的により当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば、上記微生物の生物学的分類に相関するゲノムＤＮＡの野生型およびその変異型を含む塩基配列をいう。
【００２０】
さらに、上記核酸の塩基配列は、上記特定の塩基配列とハイブリダイズすることが可能な範囲内であれば、前記特定の塩基配列の完全相補的な塩基配列から塩基の挿入、変異および欠失された塩基配列であってもよい。しかしながら、例えば、一塩基レベルの変異を検出することを目的とした場合、反応精度の観点から、完全相補的な塩基配列であることが好ましい。
【００２１】
また、上記核酸プローブの重合度は、検出する特定の塩基配列の種類によって異なるため、特に限定されるものではないが、例えば、生物から抽出されたゲノムＤＮＡ一塩基レベルの変異を検出する場合は、検出する時の温度にもよるが、検出精度の観点から約１０〜３０塩基、好ましくは約１２〜２６塩基である。
【００２２】
本発明の試験片に固定化する生理活性物質の種類は、当業者が適宜設定できるものであり、特に限定されるものではない。
【００２３】
例えば、ある２種類以上の公知の変異が存在する野生型の遺伝子を検出する場合、野生型の特定の塩基配列とハイブリダイズし、公知の変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしない塩基配列を有する核酸プローブをそれぞれ設計することができる。
【００２４】
また、例えば、ある未知の変異が多数存在しうる野生型遺伝子を検出する場合、野生型の特定の塩基配列とハイブリダイズし、何らかの変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしないような塩基配列を有する核酸プローブを設計することができる。この時、核酸プローブの長さを１０〜３０塩基、好ましくは１２〜２６塩基程度の設計をすれば、一塩基レベルの変異を検出することができる。つまり、野生型遺伝子の重合度が長ければ長いほど、核酸プローブも種類も多くなる。さらに、隣接するプローブ同士が約４−７塩基程重なるように上流又は下流から順に設計すれば、少なくとも重複した部分に未知の変異が存在したとしても、どちらかのプローブで検知することができるため、その検出精度が向上して好ましいが、設計される核酸プローブの種類はさらに多くなる。
【００２５】
上記未知の変異が多数存在しうる野生型遺伝子を検出する例としては、例えば、結核菌の野生型のｐｎｃＡ遺伝子の検出などが挙げられる。前記結核菌のｐｎｃＡ遺伝子は、結核菌のピラジナミドの薬剤耐性に相関すると言われており、ｐｎｃＡ遺伝子におけるピラジアミダーゼをコードする塩基は、５８０塩基である。したがって、核酸プローブの種類は、例えば、全ての核酸プローブの重合度を３０塩基に統一し、隣接する核酸プローブと４塩基重複するように設計した場合、少なくとも２２種類以上は必要となる。
【００２６】
本発明における生理活性物質固定領域とは、生理活性物質が固定された領域であり、生理学的複合反応の検出において、発色反応により発色する箇所をいい、作業者が生理学的複合反応の有無を判定するために注目するべき基材表面上に設けられた閉じた領域をいう。前記生理活性物質固定領域は、基材上のどの位置に定めることができる。特に目視判定が容易である観点から、生理活性物質固定領域全てが同一表面上であることが好ましい。
【００２７】
上記基材としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートおよびニトロセルロースなどの有機材料、ガラスおよびシリカなどの無機材料、ならびに、金、銀および胴などの金属材料などが挙げられる。中でも成形加工性が容易である点から、有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチルおよびポリアミドであるが、これに限定されるものではない。また、上記基材と生理活性物質固定領域は、同一の材料であっても、異なる材料であってもよい。
【００２８】
上記基材は、例えば、基板、容器、フィルムおよびチューブなどが挙げられる。中でも取り扱いが容易である観点から、フィルムおよび基板が好ましいが、これに限定されるものではない。また、基材の大きさなども、特に限定されるものではないないが、検出を容易にする観点から、検出する面はある程度の面積が必要である。例えば、基材が長方形状のフィルムまたは基板である場合、上表面の面積は、約４０〜１０００ｍｍ２、好ましくは約６０〜３００ｍｍ２である。
【００２９】
上記基材は、当業者により状況に応じて製造することができ、特に限定されるものではない。例えば、押出成形、射出成形、溶融成形および圧縮成形などが挙げられるが、製造コストおよび容易性の観点から、押出成形が好ましい。
【００３０】
本発明における生理活性物質固定領域は、生理活性物質が固定され、発色反応により発色する箇所であるため、目視で容易に発色の判別を可能にする範囲の物体色を呈する。本発明では、目視で容易に発色の判別を可能にする範囲の物体色として、次式（１）の条件を満足する色をいう。
【００３１】
【数１】
【００３２】
ここで、上記式（１）中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である。
【００３３】
上記Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系とは、１９７６年に国際照明委員会（ＣＩＥ）で規格化され、日本でもＪＩＳにおいて採用された規格（ＣＩＥ １９７６、およびＪＩＳ Ｚ ８７２９）をいい、明度（輝度）をＬ＊、色相と彩度を示す色度をクロマティクネス指数ａ＊、ｂ＊で表現される表色系をいう。ａ＊、ｂ＊は、色の方向を示しており、ａ＊は赤方向、−ａ＊は緑方向、そしてｂ＊は黄方向、−ｂ＊は青方向をそれぞれ示すパラメーターである。ａ＊および／またはｂ＊の数値が大きくなる程、色が鮮やかになり、ａ＊およびｂ＊が０に近づく程、くすんだ色にとなる。
【００３４】
図２は、縦軸をＬ＊、横軸を［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２とした色調図である。ここで、［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２とは、物体色の彩度を示すパラメーターであり、Ｃ＊で表現されることもある。つまり、上記式（１）における条件を満足する物体色とは、図２におけるＡの領域で表現される物体色をいい、明度（Ｌ＊）および彩度｛［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２またはＣ＊｝のみを考慮すればよく、色相は考慮されない。言い換えれば、いわゆる白系統の色をいう。上記生理活性物質固定領域の物体色は、式（１）の条件を満足する物体色であり、上記発色反応が目視で容易に判定することができる色であれば、特に限定されるものではないが、例えば、日本工業規格「物体色の色名」（ＪＩＳ Ｚ ８１０２）における白、赤みの白、青みの白、黄色みの白および緑みの白などが挙げられる。中でも目視での判定を最も容易にする観点から白が好ましい。
【００３５】
上記生理活性物質固定領域の物体色を上記式（１）の条件を満足するためには、例えば、上記式（１）の条件を満足する色を持つ基材に成形加工する方法、基材表面に上記式（１）の条件を満足する色を持つ素材（インクなど）をコーティングまたは塗装する方法などが挙げられる。中でも製造が容易である観点から、基材自体を上記式（１）の条件を満足するように成形加工する方法が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３６】
また、上記基材として非晶性高分子およびガラスなどの透明な基材を用いる場合、上記生理活性物質固定領域は透明であってもよい。本発明における透明とは、可視光の少なくとも一部の透過率が５０％以上のものをいう。この場合における前記生理活性物質固定領域の物体色は、上記基材を、式（１）の条件を満足する物体色を有する背景に置いた時に、生理活性物質固定領域が表現する色を近似する色として扱う。
【００３７】
上記基材自体を上記式（１）の条件を満足するように成形加工する方法として、例えば、基材の材料はポリプロピレンおよびポリカーボネートなどの有機材料である場合は、無機フィラー（練りこみ材または増量材ともいう）を添加する方法などが挙げられる。前記無機フィラーとしては、例えば、二酸化チタンが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
上記Ｌ＊、ａ＊およびｂ＊は、例えば、市販の色彩計および分光測色計などの測定装置により測定することができる。また、生理活性物質固定領域の物体色と市販のカラーシートとを目視で比較し、対応する色をスリーニングし、その色のＲＧＢ値（１０進数、１６進数は問わない）から、例えば、財団法人日本色彩研究所のホームページ（ＵＲＬ：http://www.jcri.jp/）のコンテンツで公開されている表色系換算のソフトなどを用いて、Ｌ＊、ａ＊およびｂ＊値に換算する方法なども挙げられる。これらの手法は当業者が適宜選択できるものであり、特に限定されるものではないが、測定感度の観点から、好ましくは色彩計および分光測色計であり、さらに好ましくは分光測色計である。
【００３９】
上記生理活性物質固定領域の形状としては、生理活性物質の固定の方法により当業者が適宜設定できるものであり、特に限定されるものではない。例えば、生理活性物質の溶液を調製し、スポッティング法により基材に滴下することにより固定化する場合は、円形状を選択することができる。また、インクジェット法および押出し法により生理活性物質を固定化する場合は、長方形状（帯形状）を選択することができる。また、上記生理活性物質固定領域の面積は、基材の全体の面積および、固定される生理活性物質の種類に依存し、特に限定されるものではないが、目視判定を容易とする観点から、約３〜１５０ｍｍ２、好ましくは約６〜１００ｍｍ２である。
【００４０】
上記生理活性物質は、基材表面上の生理活性物質固定領域内に固定される。前記生理活性物質の固定は、物理的または化学的処理により固定化することができる。
【００４１】
上記物理的な処理による固定化としては、上記生理活性物質の溶液を生理活性物質固定領域に滴下する方法であれば特に限定されるものではない。このような滴下の方法としては、スポッティング法、ディスペンサなどを用いた押出し法およびインクジェット法などが挙げられる。製造コストの観点からはスポッティング法および押出し法が、固定化の精度の観点からはインクジェット法が好ましい。
【００４２】
また、生理活性物質が核酸である場合、このような物理的な処理により固定化する場合は、上記核酸プローブに無関係な塩基配列を付加すれば、ＵＶ照射により基材に固定化率が向上して好ましい。前記核酸プローブに無関係な塩基配列とは、ポリアデニン、ポリシトシン、ポリチミンおよびポリグアニンなどが挙げられるが、固定化率が最も高い観点からポリチミンが好ましい。
【００４３】
また、核酸プローブは親水性高分子であるため、生理活性物質固定領域に何らかの処理を行ってもよい。例えば、
(A) ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を生理活性物質固定領域表面に被覆する方法、
(B) 生理活性物質固定領域がガラスなどの無機材料である場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤などで処理する方法、
および、(C) 生理活性物質固定領域が金などの金属材料である場合は、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理する方法
などが挙げられる。
【００４４】
一方で、共有結合による化学に固定化する方法としては、核酸プローブの末端に生理活性物質固定領域と共有結合形成可能な官能基を修飾する方法、もしくは、核酸プローブの末端および生理活性物質固定領域にそれぞれ共有結合可能な官能基を修飾する方法などが挙げられる。例えば、
(a) 生理活性物質固定領域が、ガラスおよびシリコンなどの無機材料の場合、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、シランカップリング反応により固定化する方法、
および、(b) 生理活性物質固定領域が、ガラス、シリコンなどの無機材料の場合、上記無機材料基材上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、生理活性物質固定領域の表面をアミノ化する。一方で、核酸プローブの末端にカルボン酸を修飾する。そして、生理活性物質固定領域表面のアミノ基と核酸プローブのカルボン酸のアミノカップリング反応によりアミド結合を形成させて固定化する方法
などが挙げられる。
また、生理活性物質固定領域が金、銀などの金属材料の場合であっても、当業者は、前記シランカップリング結合を、金属−チオールまたは金属−ジスルフィド結合に置きかえることによって固定化することは容易に想到することができる。
【００４５】
以上の固定化方法の中でも、核酸の固定化に関しては、製造が用意である観点から、上記核酸プローブの末端にポリチミンを付加し、ＵＶ照射により固定化する方法が好ましいが、これに限定するものではない。
【００４６】
本発明の試験片は、上記生理活性物質固定領域の周囲に比色領域を備える。前記比色領域とは、上記生理活性物質固定領域の物体色と視覚的に区別可能な範囲での異なる色により示す手段をいう。本発明では、上記生理活性物質固定領域の物体色と視覚的に区別可能な範囲での異なる色として、次式（２）の条件を満足する色をいう。
【００４７】
【数２】
【００４８】
ここで、上記式（２）中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である。
【００４９】
上記式（２）の条件を満足する物体色とは、図４におけるＢの領域で表現される物体色をいい、上記生理活性物質固定領域同様、明度指数（Ｌ＊）および彩度｛［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２またはＣ＊｝のみを考慮すればよく、色相は考慮されない。上記生理活性物質固定領域の物体色は、式（２）の条件を満足する物体色であれば、特に限定されるものではないが、例えば、日本工業規格「物体色の色名」（ＪＩＳ Ｚ ８１０２）における、黒、青みの黒、暗い灰色、黄色みの暗い灰色、中位の灰色、緑みの灰色、ごく暗い紫、暗い灰みの赤紫、灰みの黄緑、くすんだ赤、やわらかい青緑、濃い緑、つよい黄色およびごくあざやかな赤などが挙げられる。
【００５０】
また、本発明において、上記基材として金、銀および銅などの金属光沢を有するものを用いる場合、上記生理活性物質固定領域の色は、色見本などで近似されうる物体色とみなす。例えば、金の場合はくすんだ黄、銀の場合は灰色とみなし、式（２）の条件を満足する物体色として扱うことができる。
【００５１】
ここで、上記式（１）の条件を満足する色および上記式（２）の条件を満足する色は、ヒトの目で異なる色であることを明確に区別できる程度の色差である。前記色差は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系において、前記式（１）の条件を満足する色と、前記式（２）の条件を満足する色の距離に相当し、一般的に量記号としてΔＥ＊ａｂで表現される。本発明における前記式（１）の条件を満足する色および前記式（２）の条件を満足する色との最小の色差は、図２に示す同一座標面上（例えば、ａ＊またはｂ＊を一定の定数と仮定する）における前記式（１）と前記式（２）の最小の距離を考慮すればよい。この最小の距離は、約１３．４２となる。一般に、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系における異なる２種類の色の色差（ΔＥ＊ａｂ）が１２以上であれば、ヒトは異なる色であることを明確に区別できる程度の色差であるとされており、本発明はこの条件を十分に満足するものである。以上のことから、表色学的論理においても、本発明における上記生理活性物質固定領域の色と、上記比色領域の色は、測定者が明確に区別できる程度の色差であり、生理活性物質が固定されている領域が明確となることは明らかである。
【００５２】
上記比色領域は、上記生理活性物質固定領域を識別できる程度の大きさであればよい。
例えば、生理活性物質固定領域端部から少なくとも１ｍｍ以内の領域である。また、目視での判定をより容易とする観点から、上記生理活性物質固定領域以外は、比色領域とすることが好ましいが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではない。
【００５３】
上記比色領域の物体色を上記式（２）の条件を満足するためには、例えば、上記生理活性物質固定領域と同様に、例えば、上記式（２）の条件を満足する色を持つ基材に成形加工する方法、基材表面に上記式（２）の条件を満足する色を持つ素材（インクなど）をコーティングまたは塗装する方法などで製造することができる。中でも、基材が式（１）の条件を満足する物体色を持つように成形加工することが容易である観点から、基材表面に上記式（２）の条件を満足する色を持つ素材（インクなど）をコーティングまたは塗装する方法が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５４】
また、上記生理活性物質がＤＮＡなどの親水性高分子を、無機フィラー（増量材）などを混練したポリプロピレン、ポリアミドおよびポリカーボネートなどの基材、つまり、上記式（１）の条件を満足する物体色を持つ基材に固定化する場合は、基材表面に上記式（２）の条件を満足する疎水性の素材（疎水性のインク）で塗装することにより比色領域を設ける方法が好ましい。つまり、上記生理活性物質固定領域は、基材自体であり、比色領域は疎水性の材料となる。このことにより、上記ＤＮＡを固定化する際、疎水性の比色領域はＤＮＡの水溶液をはじくため、生理活性物質固定領域のみにＤＮＡを固定化することができるからである。
【００５５】
以下に本発明の試験片の使用方法を、図面を用い、核酸の検出を例に挙げて説明するが、以下に説明は、当業者により適宜設定できるものであり、核酸の検出方法のみに限定されるものではない。
【００５６】
試験片
図１は、本発明の試験片の一実施態様である。長方形状のフィルム１上に縦４つ、横５つの正方形の白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した生理活性物質固定領域２が備えられ、一本鎖のＤＮＡプローブが固定されている。さらに、前記生理活性物質固定領域２の周囲には、黒色（Ｌ＊＝１４．２、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した比色領域３が備えられている。
【００５７】
試料の調製
まず、本発明の試験片に接触させる目的のサンプルを調製する。まず、動物の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する。生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法およびバナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。
【００５８】
核酸の増幅
次に、好ましくは、上記抽出されたゲノムＤＮＡから検出すべき特定の塩基配列を増幅する。核酸を増幅する手法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法およびＩＣＡＮ法などが挙げられる。中でも試薬のコストの観点から、ＰＣＲ法が好ましい。
【００５９】
上記ＰＣＲ法は、例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
【００６０】
また、上記ＰＣＲ法に用いられるプライマー対は、上記抽出されたゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができ、上記特定の塩基配列を含む核酸を増幅しうる塩基配列を有し、その重合度は約１５〜４０塩基程度のものであればよい。これらプライマーは、自動合成機などで合成することができる。
【００６１】
さらに、上記プライマーの末端に検出物質を修飾することにより、核酸の検出をさらに容易にすることができて好ましい。上記検出物質としては、発色反応を可能とする酵素（酵素発色法を可能とする物質）ならびにこれらの物質と結合可能なリンカー物質などが挙げられる。
【００６２】
上記酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００６３】
また、上記リンカー物質とは、上記酵素と結合可能な物質をいい、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ジスルフィド結合および配位結合などの化学的結合ならびに本発明における生理学的複合反応に影響を及ぼさない抗原−抗体結合などの生化学的結合を可能とする物質をいう。中でも本発明の試験片は主にＤＮＡの検出に用いられる観点および製造コストの観点から、抗原−抗体結合を可能とする物質が好ましい。上記抗原−抗体結合の形態としては、リンカー物質として抗原を選択した場合、上記酵素に上記抗原と結合可能な抗体を修飾したものを別途用意する必要がある。また、リンカー物質として抗体を選択した場合はその逆である。このような抗原−抗体結合の例としては、アビジン−ビオチン結合が挙げられる。前記リンカー物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ポリミキシンＢおよびＩｇＧなどが挙げられ、入手が容易であることおよび核酸の検出においてビオチン修飾核酸およびストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼを用いたＮＢＴ／ＢＣＩＰ法が一般的に用いられている観点から、アビジンおよびビオチンである。
【００６４】
ハイブリダイゼーション
次に増幅された試料核酸を、本発明の試験片と接触させ、ハイブリダイズ反応を行う。前期ハイブリダイズ反応の条件は、基材に固定化されたＤＮＡプローブのガラス転移温度による。例えば、前記ＤＮＡプローブの熱変性温度が、約５５．０〜７５．０℃程度である場合、約６１．５〜６２．５℃が一般的である。
【００６５】
二本鎖ＤＮＡの検出
上記ハイブリダイゼーションにより二本鎖となったＤＮＡを、酵素の基質を添加して発色させることにより目視で確認することができる。上記基質としては、上記酵素がアルカリホスファターゼである場合、例えば、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）の併用が挙げられる。これら発色基質は、酵素反応により上記式（２）の条件を満足する
【００６６】
以上のようにして本発明の図１の試験片を用いて核酸を検出した場合、二本鎖ＤＮＡを形成した領域は、上記発色反応により、白色の領域が塗りつぶされるようになる（図１（ｂ））。一方、二本鎖ＤＮＡを形成しなかった領域は、白色が残ったままとなる（図１（ｃ））。このことにより、本発明の試験片はハイブリダイゼーションが行われたかどうかを目視で容易に判定することができる。
【００６７】
図３は、本発明の試験片の図１とは異なる一実施態様である。長方形状のフィルム上１に縦３つ、横６つの円形の白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した生理活性物質固定領域２が備えられている。さらに、生理活性物質固定領域２周辺の領域は、暗い灰色（Ｌ＊＝３２．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した比色領域３が備えられている。見た目では、計１８個の○が配列しており、○内の部分が生理活性物質固定領域であとなる（図３（ａ））。
【００６８】
図４は、本発明の試験片の図１および図３とは異なる一実施態様である。長方形状のフィルム上１に、白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した生理活性物質固定領域２と、灰色（Ｌ＊＝５０．４、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した比色領域３が交互に並び、縦縞状に備えられている。（図４（ａ））。
【００６９】
上記図３（ａ）または図４（ａ）の試験片を用いて複合反応を、発色反応にて検出した場合であっても、生理学的複合体を形成した生理活性物質固定領域２は、見た目は白色が塗りつぶされるようになる（図３（ｂ）および図４（ｂ））。一方、生理学的複合体を形成しなかった生理活性物質固定領域２は、塗りつぶされないままとなる（図３（ｃ）および図４（ｃ））。このことにより、測定者が容易に生理学的複合反応が行われたかどうかを目視で容易に判定することができる。
【００７０】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
実施例１：試験片の製造
ＤＮＡプローブ
まず、配列番号１〜６の塩基配列をそれぞれ有するＤＮＡプローブを合成した。配列番号１〜６のＤＮＡプローブは、結核菌のｐｎｃＡ野生型遺伝子にそれぞれ異なる位置でハイブリダイズすることができる配列をからなる。これらのＤＮＡプローブに５'末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、デオキシチミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１および２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０×ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ（平均約４００ｂｐ長）２ｐｍｏｌ／μｌをそれぞれ得た。
【００７２】
配列番号１：cggcgcgacc tcctctacgc
配列番号２：gacctcctct acgcgtggc
配列番号３：atgatcaacg cccgcatac
配列番号４：ggcgtcatgg accctatatc
配列番号５：caacagttca tcccggttc
配列番号６：gtcgttctgc acgtcgac
【００７３】
上記ＤＮＡプローブを固定化する基材１として、ポリアミド膜（２００ｍｍ×３００ｍｍ）を選択した。このポリアミド膜は、白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈していた。次に、黒（Ｌ＊＝１４．２、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）の油性のインクを用いて６つの正方形の生理活性物質固定領域および比色領域を作成した。そして、上記６種類のＤＮＡプローブの溶液を、それぞれの生理活性物質固定領域２に塗布した。約２５℃で乾燥後、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射することにより、ＤＮＡプローブをポリアミド膜上に固定化した。固定化後、１０×ＳＳＣ溶液で洗浄することで、未吸着のＤＮＡプローブを除去することで本発明の試験片を得た。ここで、配列番号１〜６のＤＮＡプローブの固定位置は、図５中の２１〜２６にそれぞれ対応する。
【００７４】
実験例１：核酸の検出
検体のゲノムＤＮＡの抽出
表１に示す試料１〜３の結核菌のゲノムＤＮＡを、フェノール抽出法により抽出した。表１は、ｐｎｃＡ遺伝子における変異の位置を示すものである。ここで、上記配列番号３のプローブＤＮＡは試料２に、上記配列番号６のプローブＤＮＡは試料３にそれぞれ対応する。
【００７５】
【表１】
【００７６】
検体のゲノムＤＮＡの増幅
配列番号７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号８に示す塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法により、ｐｎｃＡ遺伝子を含む塩基配列の増幅を行った。増幅反応は、変性過程を９５℃、1分、アニール過程を５５℃、１分、鎖伸長過程を７２℃、１分の１サイクルを３０サイクル行った。
【００７７】
配列番号７：ggcgtcatgg accctatatc
配列番号８：caacagttca tcccggttc
【００７８】
核酸の検出
増幅したＤＮＡ溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（２０％）（１０μＬ）を加えてよく攪拌した。５分間放置して、増幅したＤＮＡを１本鎖に変性させた。変性ＤＮＡを含む溶液に、１０％ ラウリル硫酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加え、実施例１の試験片を浸漬させ、反応温度６２℃で３０分間振とうしてハイブリダイゼーションを行った。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を加えて、各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼによる発色反応を行った。
【００７９】
その結果を図５に示す。試料１のｐｎｃＡ遺伝子は変異が存在しないために、全てのプローブとハイブリダイズし、全ての白色の生理活性物質固定領域を塗りつぶされるように発色した。一方、試料２および３は、それぞれ配列番号３および配列番号６のＤＮＡプローブに対応する箇所で変異が存在するため、ハイブリダイズすることがなく、発色反応後も生理活性物質固定領域２は、白のままであった。以上のことから、本発明の試験片が目視で容易にハイブリダイズの有無の判定が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の試験片は、固定化された生理活性物質の数が多数に至る場合、測定者の解析の負担を要することなく生理学的複合反応の検出を可能とし、医療現場における迅速な対応を可能とすることができ、かつ、その製造も安価である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の試験片の一実施態様である。
【図２】本発明の式（１）と式（２）を示すグラフである。
【図３】本発明の図１とは異なる一実施態様および当該試験片を用いた検出の模式図である。
【図４】本発明の図１および図３とは異なる一実施態様および当該試験片を用いた検出の模式図である。
【図５】本発明の実施例１の試験片および当該試験片を用いた実験例１の検出結果を示す図である。
【符号の説明】
【００８２】
１ 基材
２ 生理活性物質固定領域
２１ 配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２２ 配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２３ 配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２４ 配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２５ 配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２６ 配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
３ 比色領域
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療現場において使用されうる生理学的複合反応を検出する試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。具体的には、基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、前記生理活性物質固定領域および前記比色領域の配色に特徴を持たせた試験片、その製造方法および前記試験片を用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノムシークエンシングの進展により各生物のゲノムの全塩基配列が明らかにされつつある中、この結果を有効に利用する技術が望まれている。
核酸マイクロアレイは複数の遺伝子を同時に解析できる技術であり、塩基配列決定法のみではなく、遺伝子の発現量や多型などを効率よく調べる方法として開発され、テーラーメイド医療、菌類などの生物学的分類の特定および疾病の診断などへの技術開発が展開されている。
【０００３】
一般に、テーラーメイド医療、ならびに生物学的分類または変異体の同定に用いられうる核酸マイクロアレイは、特定の塩基配列を定性的に検出する程度で十分であり、試験紙のような，安価な使い捨て用のものが求められている。
例えば、特許文献１にはＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）単離物の同定方法に用いる核酸マイクロアレイとして、ラインプローブ（ＬｉＰＡ：Line Probe Assay、イノジジェネティクス社商標）法が開示されている。このアッセイは、ポリアミド膜片上に平行線として核酸プローブが固定されたものであり、迅速なＤＮＡの検出を可能とする。
【０００４】
また、核酸マイクロアレイに固定化する核酸プローブは、野生型の遺伝子から１０〜４０ｂｐの長さで設計されるため、固定化されうる核酸プローブの種類（スポットまたはラインの数）が多く、その数は多くて約１００種類にも及ぶ。つまり、上記の核酸マイクロアレイなどを用いたハイブリダイズの有無の判定は、測定者が、ハイブリダイズされたスポットまたはライン数を数える必要があり、その作業は煩雑であった。
【０００５】
かかる問題を解決する手段として、リソグラフィー技術により基板に凹凸を設け、凸部に核酸プローブを固定した核酸マイクロアレイが挙げられる（特許文献２）。これらのマイクロアレイは、核酸プローブの位置が明確であるため、凸部の発色または発光の有無からハイブリダイズの有無を容易に判定することができる。
しかしながら、テーラーメイド医療または一部の診断に用いられうる核酸マイクロアレイは、試験紙のような使い捨て用であることが要求されるため、リソグラフィー技術は製造コストの点で問題がある。
【０００６】
一方、特許文献３では、核酸プローブが固定化されたスポットの周囲にマーカーを設けた技術が開示されている。この核酸マイクロアレイは、インクジェット法を用いて製造されるため、リソグラフィー技術により製造された核酸マイクロアレイと比較すると製造コストの面で安価である。
しかしながら、スポットに周囲にマーカーを設けたとしても、核酸プローブの数が多くなればなるほど視覚的な錯覚をおこしやすくなり、多数のスポットから未反応のスポットを探すことは容易ではない。
【０００７】
さらに、特許文献２または３に開示された核酸マイクロアレイを用いた検出は、スキャナなどの専門の機械を用いて検出を行うため、目視で直接判定することが困難である。また、専門の機械を導入する必要があるため、医療機関の負担を要する。
【０００８】
【特許文献１】特表平７−５０３１４３号公報
【特許文献２】特開２００４−２６４２８９号公報
【特許文献３】特開２０００−２７０８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、目視で容易に生理学的複合反応の検出を判定することが可能とする安価な試験片の開発が求められる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
［１］ 基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ色であり、
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ色である。
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］、
［２］ 生理活性物質が、核酸、抗原、抗体、リガンドまたはレセプターである［１］に記載の試験片、
［３］ 生理活性物質が、核酸である［１］に記載の試験片、
［４］ 比色領域が、該基材表面における該生理活性物質固定領域以外の領域全てである［１］に記載の試験片、
［５］ 基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片の製造方法；
(i) 次式（１）の関係が成り立つ物体色を呈する基材を製造または準備する工程、
【数１】
(ii) 次式（２）の関係が成り立つ物体色を着色することにより比色領域を設けると同時に、生理活性物質固定領域を定める工程、
【数２】
(iii) 生理活性物質固定領域に生理活性物質を固定する工程
を含むことを特徴とする試験片の製造方法
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］、
［６］ 基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片を用いて、発色反応により生理学的複合体形成反応を検出する方法であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足することを特徴とする生理学的複合体形成反応検出方法；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］、
［７］ 発色反応が、酵素発色法によるものであることを特徴とする［６］に記載の検出方法、
および、［８］ 発色反応が、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法によるものであることを特徴とする［７］に記載の検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の試験片は、目視により容易に生理学的複合反応の検出を可能とするため、測定者の解析の負担がなく、医療現場における迅速な対応を可能とすることができる。また、リソグラフィー技術を用いないため、製造コストを大幅に抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の試験片とは、特別な配色により目視で容易に判定することを可能としたものをいう。また、得られた結果から疾病の診断、微生物の生物学的分類または変異体の同定ならびに個人の体質に関連する情報などを得るためのものをいう。
【００１３】
上記微生物の生物学的分類または変異体の同定とは、特に限定されるものではないが、例えば、患者に感染したＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）の種類または結核菌の持つ治療薬剤の耐性の同定などが挙げられる。
【００１４】
また、上記個人の体質に関連する情報とは、特に限定されるものではないが、例えば、個人の将来的な骨密度の変化の予測、ならびに、治療薬剤の感受性、耐性または副作用が生じる可能性の予測などが挙げられる。
【００１５】
上記生理学的複合反応とは、生体由来の物質同士の複合体形成に基づく反応をいい、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＰＮＡ（ペプチド核酸）ハイブリダイゼーション、抗原−抗体反応およびリガンド−レセプター反応などが挙げられる。
【００１６】
したがって、本発明の試験片に固定されうる生理活性物質とは、複合体形成を可能な物質であればよく、例えば、核酸、抗原、抗体、リガンドおよびレセプターなどが挙げられる。中でもテーラーメイド医療への展開としては、核酸が主に用いられる。以降の説明は、使用頻度の観点を考慮して核酸の検出の説明を中心とするが、本発明は核酸以外の物質にも準用できるものであり、必ずしも限定されるものではない。
【００１７】
上記核酸とは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが挙げられる。中でも製造コストおよび使用頻度の観点から一本鎖のＤＮＡが好ましい。これら試験片に固定されうる核酸は、一般的に核酸プローブと称されるものであり、核酸が一本鎖のＤＮＡである場合は、ＤＮＡプローブと称されるものである。
【００１８】
上記核酸プローブの製造は、特に限定されるものではなく、例えば、ＤＮＡプローブの場合、合成されたＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）またはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであってもよい。前記オリゴヌクレオチドの合成は、市販の核酸の自動合成機などで適宜合成することができる。
【００１９】
また、上記核酸は、目的対象の核酸の特定の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列を有するように設計される。前記特定の塩基配列とは、本発明の試験片の使用目的により当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば、上記微生物の生物学的分類に相関するゲノムＤＮＡの野生型およびその変異型を含む塩基配列をいう。
【００２０】
さらに、上記核酸の塩基配列は、上記特定の塩基配列とハイブリダイズすることが可能な範囲内であれば、前記特定の塩基配列の完全相補的な塩基配列から塩基の挿入、変異および欠失された塩基配列であってもよい。しかしながら、例えば、一塩基レベルの変異を検出することを目的とした場合、反応精度の観点から、完全相補的な塩基配列であることが好ましい。
【００２１】
また、上記核酸プローブの重合度は、検出する特定の塩基配列の種類によって異なるため、特に限定されるものではないが、例えば、生物から抽出されたゲノムＤＮＡ一塩基レベルの変異を検出する場合は、検出する時の温度にもよるが、検出精度の観点から約１０〜３０塩基、好ましくは約１２〜２６塩基である。
【００２２】
本発明の試験片に固定化する生理活性物質の種類は、当業者が適宜設定できるものであり、特に限定されるものではない。
【００２３】
例えば、ある２種類以上の公知の変異が存在する野生型の遺伝子を検出する場合、野生型の特定の塩基配列とハイブリダイズし、公知の変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしない塩基配列を有する核酸プローブをそれぞれ設計することができる。
【００２４】
また、例えば、ある未知の変異が多数存在しうる野生型遺伝子を検出する場合、野生型の特定の塩基配列とハイブリダイズし、何らかの変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしないような塩基配列を有する核酸プローブを設計することができる。この時、核酸プローブの長さを１０〜３０塩基、好ましくは１２〜２６塩基程度の設計をすれば、一塩基レベルの変異を検出することができる。つまり、野生型遺伝子の重合度が長ければ長いほど、核酸プローブも種類も多くなる。さらに、隣接するプローブ同士が約４−７塩基程重なるように上流又は下流から順に設計すれば、少なくとも重複した部分に未知の変異が存在したとしても、どちらかのプローブで検知することができるため、その検出精度が向上して好ましいが、設計される核酸プローブの種類はさらに多くなる。
【００２５】
上記未知の変異が多数存在しうる野生型遺伝子を検出する例としては、例えば、結核菌の野生型のｐｎｃＡ遺伝子の検出などが挙げられる。前記結核菌のｐｎｃＡ遺伝子は、結核菌のピラジナミドの薬剤耐性に相関すると言われており、ｐｎｃＡ遺伝子におけるピラジアミダーゼをコードする塩基は、５８０塩基である。したがって、核酸プローブの種類は、例えば、全ての核酸プローブの重合度を３０塩基に統一し、隣接する核酸プローブと４塩基重複するように設計した場合、少なくとも２２種類以上は必要となる。
【００２６】
本発明における生理活性物質固定領域とは、生理活性物質が固定された領域であり、生理学的複合反応の検出において、発色反応により発色する箇所をいい、作業者が生理学的複合反応の有無を判定するために注目するべき基材表面上に設けられた閉じた領域をいう。前記生理活性物質固定領域は、基材上のどの位置に定めることができる。特に目視判定が容易である観点から、生理活性物質固定領域全てが同一表面上であることが好ましい。
【００２７】
上記基材としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートおよびニトロセルロースなどの有機材料、ガラスおよびシリカなどの無機材料、ならびに、金、銀および胴などの金属材料などが挙げられる。中でも成形加工性が容易である点から、有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチルおよびポリアミドであるが、これに限定されるものではない。また、上記基材と生理活性物質固定領域は、同一の材料であっても、異なる材料であってもよい。
【００２８】
上記基材は、例えば、基板、容器、フィルムおよびチューブなどが挙げられる。中でも取り扱いが容易である観点から、フィルムおよび基板が好ましいが、これに限定されるものではない。また、基材の大きさなども、特に限定されるものではないないが、検出を容易にする観点から、検出する面はある程度の面積が必要である。例えば、基材が長方形状のフィルムまたは基板である場合、上表面の面積は、約４０〜１０００ｍｍ２、好ましくは約６０〜３００ｍｍ２である。
【００２９】
上記基材は、当業者により状況に応じて製造することができ、特に限定されるものではない。例えば、押出成形、射出成形、溶融成形および圧縮成形などが挙げられるが、製造コストおよび容易性の観点から、押出成形が好ましい。
【００３０】
本発明における生理活性物質固定領域は、生理活性物質が固定され、発色反応により発色する箇所であるため、目視で容易に発色の判別を可能にする範囲の物体色を呈する。本発明では、目視で容易に発色の判別を可能にする範囲の物体色として、次式（１）の条件を満足する色をいう。
【００３１】
【数１】
【００３２】
ここで、上記式（１）中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である。
【００３３】
上記Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系とは、１９７６年に国際照明委員会（ＣＩＥ）で規格化され、日本でもＪＩＳにおいて採用された規格（ＣＩＥ １９７６、およびＪＩＳ Ｚ ８７２９）をいい、明度（輝度）をＬ＊、色相と彩度を示す色度をクロマティクネス指数ａ＊、ｂ＊で表現される表色系をいう。ａ＊、ｂ＊は、色の方向を示しており、ａ＊は赤方向、−ａ＊は緑方向、そしてｂ＊は黄方向、−ｂ＊は青方向をそれぞれ示すパラメーターである。ａ＊および／またはｂ＊の数値が大きくなる程、色が鮮やかになり、ａ＊およびｂ＊が０に近づく程、くすんだ色にとなる。
【００３４】
図２は、縦軸をＬ＊、横軸を［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２とした色調図である。ここで、［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２とは、物体色の彩度を示すパラメーターであり、Ｃ＊で表現されることもある。つまり、上記式（１）における条件を満足する物体色とは、図２におけるＡの領域で表現される物体色をいい、明度（Ｌ＊）および彩度｛［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２またはＣ＊｝のみを考慮すればよく、色相は考慮されない。言い換えれば、いわゆる白系統の色をいう。上記生理活性物質固定領域の物体色は、式（１）の条件を満足する物体色であり、上記発色反応が目視で容易に判定することができる色であれば、特に限定されるものではないが、例えば、日本工業規格「物体色の色名」（ＪＩＳ Ｚ ８１０２）における白、赤みの白、青みの白、黄色みの白および緑みの白などが挙げられる。中でも目視での判定を最も容易にする観点から白が好ましい。
【００３５】
上記生理活性物質固定領域の物体色を上記式（１）の条件を満足するためには、例えば、上記式（１）の条件を満足する色を持つ基材に成形加工する方法、基材表面に上記式（１）の条件を満足する色を持つ素材（インクなど）をコーティングまたは塗装する方法などが挙げられる。中でも製造が容易である観点から、基材自体を上記式（１）の条件を満足するように成形加工する方法が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３６】
また、上記基材として非晶性高分子およびガラスなどの透明な基材を用いる場合、上記生理活性物質固定領域は透明であってもよい。本発明における透明とは、可視光の少なくとも一部の透過率が５０％以上のものをいう。この場合における前記生理活性物質固定領域の物体色は、上記基材を、式（１）の条件を満足する物体色を有する背景に置いた時に、生理活性物質固定領域が表現する色を近似する色として扱う。
【００３７】
上記基材自体を上記式（１）の条件を満足するように成形加工する方法として、例えば、基材の材料はポリプロピレンおよびポリカーボネートなどの有機材料である場合は、無機フィラー（練りこみ材または増量材ともいう）を添加する方法などが挙げられる。前記無機フィラーとしては、例えば、二酸化チタンが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
上記Ｌ＊、ａ＊およびｂ＊は、例えば、市販の色彩計および分光測色計などの測定装置により測定することができる。また、生理活性物質固定領域の物体色と市販のカラーシートとを目視で比較し、対応する色をスリーニングし、その色のＲＧＢ値（１０進数、１６進数は問わない）から、例えば、財団法人日本色彩研究所のホームページ（ＵＲＬ：http://www.jcri.jp/）のコンテンツで公開されている表色系換算のソフトなどを用いて、Ｌ＊、ａ＊およびｂ＊値に換算する方法なども挙げられる。これらの手法は当業者が適宜選択できるものであり、特に限定されるものではないが、測定感度の観点から、好ましくは色彩計および分光測色計であり、さらに好ましくは分光測色計である。
【００３９】
上記生理活性物質固定領域の形状としては、生理活性物質の固定の方法により当業者が適宜設定できるものであり、特に限定されるものではない。例えば、生理活性物質の溶液を調製し、スポッティング法により基材に滴下することにより固定化する場合は、円形状を選択することができる。また、インクジェット法および押出し法により生理活性物質を固定化する場合は、長方形状（帯形状）を選択することができる。また、上記生理活性物質固定領域の面積は、基材の全体の面積および、固定される生理活性物質の種類に依存し、特に限定されるものではないが、目視判定を容易とする観点から、約３〜１５０ｍｍ２、好ましくは約６〜１００ｍｍ２である。
【００４０】
上記生理活性物質は、基材表面上の生理活性物質固定領域内に固定される。前記生理活性物質の固定は、物理的または化学的処理により固定化することができる。
【００４１】
上記物理的な処理による固定化としては、上記生理活性物質の溶液を生理活性物質固定領域に滴下する方法であれば特に限定されるものではない。このような滴下の方法としては、スポッティング法、ディスペンサなどを用いた押出し法およびインクジェット法などが挙げられる。製造コストの観点からはスポッティング法および押出し法が、固定化の精度の観点からはインクジェット法が好ましい。
【００４２】
また、生理活性物質が核酸である場合、このような物理的な処理により固定化する場合は、上記核酸プローブに無関係な塩基配列を付加すれば、ＵＶ照射により基材に固定化率が向上して好ましい。前記核酸プローブに無関係な塩基配列とは、ポリアデニン、ポリシトシン、ポリチミンおよびポリグアニンなどが挙げられるが、固定化率が最も高い観点からポリチミンが好ましい。
【００４３】
また、核酸プローブは親水性高分子であるため、生理活性物質固定領域に何らかの処理を行ってもよい。例えば、
(A) ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を生理活性物質固定領域表面に被覆する方法、
(B) 生理活性物質固定領域がガラスなどの無機材料である場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤などで処理する方法、
および、(C) 生理活性物質固定領域が金などの金属材料である場合は、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理する方法
などが挙げられる。
【００４４】
一方で、共有結合による化学に固定化する方法としては、核酸プローブの末端に生理活性物質固定領域と共有結合形成可能な官能基を修飾する方法、もしくは、核酸プローブの末端および生理活性物質固定領域にそれぞれ共有結合可能な官能基を修飾する方法などが挙げられる。例えば、
(a) 生理活性物質固定領域が、ガラスおよびシリコンなどの無機材料の場合、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、シランカップリング反応により固定化する方法、
および、(b) 生理活性物質固定領域が、ガラス、シリコンなどの無機材料の場合、上記無機材料基材上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、生理活性物質固定領域の表面をアミノ化する。一方で、核酸プローブの末端にカルボン酸を修飾する。そして、生理活性物質固定領域表面のアミノ基と核酸プローブのカルボン酸のアミノカップリング反応によりアミド結合を形成させて固定化する方法
などが挙げられる。
また、生理活性物質固定領域が金、銀などの金属材料の場合であっても、当業者は、前記シランカップリング結合を、金属−チオールまたは金属−ジスルフィド結合に置きかえることによって固定化することは容易に想到することができる。
【００４５】
以上の固定化方法の中でも、核酸の固定化に関しては、製造が用意である観点から、上記核酸プローブの末端にポリチミンを付加し、ＵＶ照射により固定化する方法が好ましいが、これに限定するものではない。
【００４６】
本発明の試験片は、上記生理活性物質固定領域の周囲に比色領域を備える。前記比色領域とは、上記生理活性物質固定領域の物体色と視覚的に区別可能な範囲での異なる色により示す手段をいう。本発明では、上記生理活性物質固定領域の物体色と視覚的に区別可能な範囲での異なる色として、次式（２）の条件を満足する色をいう。
【００４７】
【数２】
【００４８】
ここで、上記式（２）中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である。
【００４９】
上記式（２）の条件を満足する物体色とは、図４におけるＢの領域で表現される物体色をいい、上記生理活性物質固定領域同様、明度指数（Ｌ＊）および彩度｛［（ａ＊）２＋（ｂ＊）２］１／２またはＣ＊｝のみを考慮すればよく、色相は考慮されない。上記生理活性物質固定領域の物体色は、式（２）の条件を満足する物体色であれば、特に限定されるものではないが、例えば、日本工業規格「物体色の色名」（ＪＩＳ Ｚ ８１０２）における、黒、青みの黒、暗い灰色、黄色みの暗い灰色、中位の灰色、緑みの灰色、ごく暗い紫、暗い灰みの赤紫、灰みの黄緑、くすんだ赤、やわらかい青緑、濃い緑、つよい黄色およびごくあざやかな赤などが挙げられる。
【００５０】
また、本発明において、上記基材として金、銀および銅などの金属光沢を有するものを用いる場合、上記生理活性物質固定領域の色は、色見本などで近似されうる物体色とみなす。例えば、金の場合はくすんだ黄、銀の場合は灰色とみなし、式（２）の条件を満足する物体色として扱うことができる。
【００５１】
ここで、上記式（１）の条件を満足する色および上記式（２）の条件を満足する色は、ヒトの目で異なる色であることを明確に区別できる程度の色差である。前記色差は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系において、前記式（１）の条件を満足する色と、前記式（２）の条件を満足する色の距離に相当し、一般的に量記号としてΔＥ＊ａｂで表現される。本発明における前記式（１）の条件を満足する色および前記式（２）の条件を満足する色との最小の色差は、図２に示す同一座標面上（例えば、ａ＊またはｂ＊を一定の定数と仮定する）における前記式（１）と前記式（２）の最小の距離を考慮すればよい。この最小の距離は、約１３．４２となる。一般に、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系における異なる２種類の色の色差（ΔＥ＊ａｂ）が１２以上であれば、ヒトは異なる色であることを明確に区別できる程度の色差であるとされており、本発明はこの条件を十分に満足するものである。以上のことから、表色学的論理においても、本発明における上記生理活性物質固定領域の色と、上記比色領域の色は、測定者が明確に区別できる程度の色差であり、生理活性物質が固定されている領域が明確となることは明らかである。
【００５２】
上記比色領域は、上記生理活性物質固定領域を識別できる程度の大きさであればよい。
例えば、生理活性物質固定領域端部から少なくとも１ｍｍ以内の領域である。また、目視での判定をより容易とする観点から、上記生理活性物質固定領域以外は、比色領域とすることが好ましいが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではない。
【００５３】
上記比色領域の物体色を上記式（２）の条件を満足するためには、例えば、上記生理活性物質固定領域と同様に、例えば、上記式（２）の条件を満足する色を持つ基材に成形加工する方法、基材表面に上記式（２）の条件を満足する色を持つ素材（インクなど）をコーティングまたは塗装する方法などで製造することができる。中でも、基材が式（１）の条件を満足する物体色を持つように成形加工することが容易である観点から、基材表面に上記式（２）の条件を満足する色を持つ素材（インクなど）をコーティングまたは塗装する方法が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５４】
また、上記生理活性物質がＤＮＡなどの親水性高分子を、無機フィラー（増量材）などを混練したポリプロピレン、ポリアミドおよびポリカーボネートなどの基材、つまり、上記式（１）の条件を満足する物体色を持つ基材に固定化する場合は、基材表面に上記式（２）の条件を満足する疎水性の素材（疎水性のインク）で塗装することにより比色領域を設ける方法が好ましい。つまり、上記生理活性物質固定領域は、基材自体であり、比色領域は疎水性の材料となる。このことにより、上記ＤＮＡを固定化する際、疎水性の比色領域はＤＮＡの水溶液をはじくため、生理活性物質固定領域のみにＤＮＡを固定化することができるからである。
【００５５】
以下に本発明の試験片の使用方法を、図面を用い、核酸の検出を例に挙げて説明するが、以下に説明は、当業者により適宜設定できるものであり、核酸の検出方法のみに限定されるものではない。
【００５６】
試験片
図１は、本発明の試験片の一実施態様である。長方形状のフィルム１上に縦４つ、横５つの正方形の白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した生理活性物質固定領域２が備えられ、一本鎖のＤＮＡプローブが固定されている。さらに、前記生理活性物質固定領域２の周囲には、黒色（Ｌ＊＝１４．２、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した比色領域３が備えられている。
【００５７】
試料の調製
まず、本発明の試験片に接触させる目的のサンプルを調製する。まず、動物の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する。生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法およびバナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。
【００５８】
核酸の増幅
次に、好ましくは、上記抽出されたゲノムＤＮＡから検出すべき特定の塩基配列を増幅する。核酸を増幅する手法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法およびＩＣＡＮ法などが挙げられる。中でも試薬のコストの観点から、ＰＣＲ法が好ましい。
【００５９】
上記ＰＣＲ法は、例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
【００６０】
また、上記ＰＣＲ法に用いられるプライマー対は、上記抽出されたゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができ、上記特定の塩基配列を含む核酸を増幅しうる塩基配列を有し、その重合度は約１５〜４０塩基程度のものであればよい。これらプライマーは、自動合成機などで合成することができる。
【００６１】
さらに、上記プライマーの末端に検出物質を修飾することにより、核酸の検出をさらに容易にすることができて好ましい。上記検出物質としては、発色反応を可能とする酵素（酵素発色法を可能とする物質）ならびにこれらの物質と結合可能なリンカー物質などが挙げられる。
【００６２】
上記酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００６３】
また、上記リンカー物質とは、上記酵素と結合可能な物質をいい、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ジスルフィド結合および配位結合などの化学的結合ならびに本発明における生理学的複合反応に影響を及ぼさない抗原−抗体結合などの生化学的結合を可能とする物質をいう。中でも本発明の試験片は主にＤＮＡの検出に用いられる観点および製造コストの観点から、抗原−抗体結合を可能とする物質が好ましい。上記抗原−抗体結合の形態としては、リンカー物質として抗原を選択した場合、上記酵素に上記抗原と結合可能な抗体を修飾したものを別途用意する必要がある。また、リンカー物質として抗体を選択した場合はその逆である。このような抗原−抗体結合の例としては、アビジン−ビオチン結合が挙げられる。前記リンカー物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ポリミキシンＢおよびＩｇＧなどが挙げられ、入手が容易であることおよび核酸の検出においてビオチン修飾核酸およびストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼを用いたＮＢＴ／ＢＣＩＰ法が一般的に用いられている観点から、アビジンおよびビオチンである。
【００６４】
ハイブリダイゼーション
次に増幅された試料核酸を、本発明の試験片と接触させ、ハイブリダイズ反応を行う。前期ハイブリダイズ反応の条件は、基材に固定化されたＤＮＡプローブのガラス転移温度による。例えば、前記ＤＮＡプローブの熱変性温度が、約５５．０〜７５．０℃程度である場合、約６１．５〜６２．５℃が一般的である。
【００６５】
二本鎖ＤＮＡの検出
上記ハイブリダイゼーションにより二本鎖となったＤＮＡを、酵素の基質を添加して発色させることにより目視で確認することができる。上記基質としては、上記酵素がアルカリホスファターゼである場合、例えば、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）の併用が挙げられる。これら発色基質は、酵素反応により上記式（２）の条件を満足する
【００６６】
以上のようにして本発明の図１の試験片を用いて核酸を検出した場合、二本鎖ＤＮＡを形成した領域は、上記発色反応により、白色の領域が塗りつぶされるようになる（図１（ｂ））。一方、二本鎖ＤＮＡを形成しなかった領域は、白色が残ったままとなる（図１（ｃ））。このことにより、本発明の試験片はハイブリダイゼーションが行われたかどうかを目視で容易に判定することができる。
【００６７】
図３は、本発明の試験片の図１とは異なる一実施態様である。長方形状のフィルム上１に縦３つ、横６つの円形の白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した生理活性物質固定領域２が備えられている。さらに、生理活性物質固定領域２周辺の領域は、暗い灰色（Ｌ＊＝３２．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した比色領域３が備えられている。見た目では、計１８個の○が配列しており、○内の部分が生理活性物質固定領域であとなる（図３（ａ））。
【００６８】
図４は、本発明の試験片の図１および図３とは異なる一実施態様である。長方形状のフィルム上１に、白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した生理活性物質固定領域２と、灰色（Ｌ＊＝５０．４、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈した比色領域３が交互に並び、縦縞状に備えられている。（図４（ａ））。
【００６９】
上記図３（ａ）または図４（ａ）の試験片を用いて複合反応を、発色反応にて検出した場合であっても、生理学的複合体を形成した生理活性物質固定領域２は、見た目は白色が塗りつぶされるようになる（図３（ｂ）および図４（ｂ））。一方、生理学的複合体を形成しなかった生理活性物質固定領域２は、塗りつぶされないままとなる（図３（ｃ）および図４（ｃ））。このことにより、測定者が容易に生理学的複合反応が行われたかどうかを目視で容易に判定することができる。
【００７０】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
実施例１：試験片の製造
ＤＮＡプローブ
まず、配列番号１〜６の塩基配列をそれぞれ有するＤＮＡプローブを合成した。配列番号１〜６のＤＮＡプローブは、結核菌のｐｎｃＡ野生型遺伝子にそれぞれ異なる位置でハイブリダイズすることができる配列をからなる。これらのＤＮＡプローブに５'末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、デオキシチミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１および２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０×ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ（平均約４００ｂｐ長）２ｐｍｏｌ／μｌをそれぞれ得た。
【００７２】
配列番号１：cggcgcgacc tcctctacgc
配列番号２：gacctcctct acgcgtggc
配列番号３：atgatcaacg cccgcatac
配列番号４：ggcgtcatgg accctatatc
配列番号５：caacagttca tcccggttc
配列番号６：gtcgttctgc acgtcgac
【００７３】
上記ＤＮＡプローブを固定化する基材１として、ポリアミド膜（２００ｍｍ×３００ｍｍ）を選択した。このポリアミド膜は、白色（Ｌ＊＝９３．７、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）を呈していた。次に、黒（Ｌ＊＝１４．２、ａ＊＝０およびｂ＊＝０）の油性のインクを用いて６つの正方形の生理活性物質固定領域および比色領域を作成した。そして、上記６種類のＤＮＡプローブの溶液を、それぞれの生理活性物質固定領域２に塗布した。約２５℃で乾燥後、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射することにより、ＤＮＡプローブをポリアミド膜上に固定化した。固定化後、１０×ＳＳＣ溶液で洗浄することで、未吸着のＤＮＡプローブを除去することで本発明の試験片を得た。ここで、配列番号１〜６のＤＮＡプローブの固定位置は、図５中の２１〜２６にそれぞれ対応する。
【００７４】
実験例１：核酸の検出
検体のゲノムＤＮＡの抽出
表１に示す試料１〜３の結核菌のゲノムＤＮＡを、フェノール抽出法により抽出した。表１は、ｐｎｃＡ遺伝子における変異の位置を示すものである。ここで、上記配列番号３のプローブＤＮＡは試料２に、上記配列番号６のプローブＤＮＡは試料３にそれぞれ対応する。
【００７５】
【表１】
【００７６】
検体のゲノムＤＮＡの増幅
配列番号７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号８に示す塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法により、ｐｎｃＡ遺伝子を含む塩基配列の増幅を行った。増幅反応は、変性過程を９５℃、1分、アニール過程を５５℃、１分、鎖伸長過程を７２℃、１分の１サイクルを３０サイクル行った。
【００７７】
配列番号７：ggcgtcatgg accctatatc
配列番号８：caacagttca tcccggttc
【００７８】
核酸の検出
増幅したＤＮＡ溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（２０％）（１０μＬ）を加えてよく攪拌した。５分間放置して、増幅したＤＮＡを１本鎖に変性させた。変性ＤＮＡを含む溶液に、１０％ ラウリル硫酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加え、実施例１の試験片を浸漬させ、反応温度６２℃で３０分間振とうしてハイブリダイゼーションを行った。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を加えて、各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼによる発色反応を行った。
【００７９】
その結果を図５に示す。試料１のｐｎｃＡ遺伝子は変異が存在しないために、全てのプローブとハイブリダイズし、全ての白色の生理活性物質固定領域を塗りつぶされるように発色した。一方、試料２および３は、それぞれ配列番号３および配列番号６のＤＮＡプローブに対応する箇所で変異が存在するため、ハイブリダイズすることがなく、発色反応後も生理活性物質固定領域２は、白のままであった。以上のことから、本発明の試験片が目視で容易にハイブリダイズの有無の判定が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の試験片は、固定化された生理活性物質の数が多数に至る場合、測定者の解析の負担を要することなく生理学的複合反応の検出を可能とし、医療現場における迅速な対応を可能とすることができ、かつ、その製造も安価である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の試験片の一実施態様である。
【図２】本発明の式（１）と式（２）を示すグラフである。
【図３】本発明の図１とは異なる一実施態様および当該試験片を用いた検出の模式図である。
【図４】本発明の図１および図３とは異なる一実施態様および当該試験片を用いた検出の模式図である。
【図５】本発明の実施例１の試験片および当該試験片を用いた実験例１の検出結果を示す図である。
【符号の説明】
【００８２】
１ 基材
２ 生理活性物質固定領域
２１ 配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２２ 配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２３ 配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２４ 配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２５ 配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
２６ 配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡプローブ
３ 比色領域
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ色であり、
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ色である。
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］。
【請求項２】
生理活性物質が、核酸、抗原、抗体、リガンドまたはレセプターである請求項１に記載の試験片。
【請求項３】
生理活性物質が、核酸である請求項１に記載の試験片。
【請求項４】
比色領域が、該基材表面における該生理活性物質固定領域以外の領域全てである請求項１に記載の試験片。
【請求項５】
基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片の製造方法；
(i) 次式（１）の関係が成り立つ物体色を呈する基材を製造または準備する工程、
【数１】
(ii) 次式（２）の関係が成り立つ物体色を着色することにより比色領域を設けると同時に、生理活性物質固定領域を定める工程、
【数２】
(iii) 生理活性物質固定領域に生理活性物質を固定する工程
を含むことを特徴とする試験片の製造方法
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］。
【請求項６】
基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片を用いて、発色反応により生理学的複合体形成反応を検出する方法であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足することを特徴とする生理学的複合体検出方法；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］。
【請求項７】
発色反応が、酵素発色法によるものであることを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
発色反応が、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法によるものであることを特徴とする請求項７に記載の検出方法。
【請求項１】
基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ色であり、
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ色である。
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］。
【請求項２】
生理活性物質が、核酸、抗原、抗体、リガンドまたはレセプターである請求項１に記載の試験片。
【請求項３】
生理活性物質が、核酸である請求項１に記載の試験片。
【請求項４】
比色領域が、該基材表面における該生理活性物質固定領域以外の領域全てである請求項１に記載の試験片。
【請求項５】
基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足する試験片の製造方法；
(i) 次式（１）の関係が成り立つ物体色を呈する基材を製造または準備する工程、
【数１】
(ii) 次式（２）の関係が成り立つ物体色を着色することにより比色領域を設けると同時に、生理活性物質固定領域を定める工程、
【数２】
(iii) 生理活性物質固定領域に生理活性物質を固定する工程
を含むことを特徴とする試験片の製造方法
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］。
【請求項６】
基材と、生理活性物質が固定され、該基材上に備えた生理活性物質固定領域および該生理活性物質固定領域の周囲に配置し、該基材上に備えた比色領域を含む試験片を用いて、発色反応により生理学的複合体形成反応を検出する方法であって、以下の(i)および(ii)の条件を満足することを特徴とする生理学的複合体検出方法；
(i) 該生理活性物質固定領域の物体色は、次式（１）の関係が成り立つ
【数１】
(ii) 該比色領域の物体色は、次式（２）の関係が成り立つ
【数２】
［ここで、式中のＬ＊はＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ １９７６、またはＪＩＳ Ｚ ８７２９）における明度指数、ａ＊およびｂ＊はそれぞれ同表色系におけるクロマティクネス指数である］。
【請求項７】
発色反応が、酵素発色法によるものであることを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
発色反応が、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法によるものであることを特徴とする請求項７に記載の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−６４９２６（Ｐ２００７−６４９２６Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５４８１４（Ｐ２００５−２５４８１４）
【出願日】平成１７年９月２日（２００５．９．２）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２日（２００５．９．２）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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