試験管内及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物
本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。原始幹細胞に由来する多数の例となる軟骨形成性細胞株が開示される。本明細書で記載される軟骨形成性細胞株は健全であり、４０の継代を超えて増殖することができ、部位特異的な純度を有するので、研究及び治療での使用のために独特の分子組成を持つ多様な軟骨種を産生する組成物及び方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条のもとで、以下の仮特許出願：２００９年７月１６日に出願された「胚性前駆細胞株を用いた試験管内及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する出願番号第６１／２２６，２３７号、２００９年９月１８日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第６１／２４３，９３９号、２０１０年５月２７日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第６１／３４９，０８８号、及び２０１０年７月１６日に出願された「試験管内及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物」題する出願番号第６１／３６５，３０８号の利益を主張する。これら出願のそれぞれの全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨の限定された再生能力は、外傷又は変性疾患による損傷を回復する生体の自然の能力を限定する。たとえば、変形性関節症（ＯＡ）は、６５歳を超えた７０％の人々を苦しめている（２１００万人のアメリカ人）。半月板又は前十字靭帯への傷害は、患者を関節炎の高いリスクに置くことが多い。変形性関節症は、関節面での軟骨の進行性の喪失を特徴とし、軟骨下骨の痛みを伴う露出を招く。関節軟骨へのこの傷害の後、ヒトの組織はほとんど修復能を示さない。自然の修復応答の結果と思われる新生軟骨は一般に線維性の性質であり、従って修復には好適ではない。
【０００３】
軟骨に損傷を有する対象者を治療するために種々の治療計画が開発されている。これらの治療の例には、機械的な手段（たとえば、研磨及びマイクロフラクチャー術、たとえば、穿孔術、マイクロフラクチャー術、軟骨形成術、スポンジアリゼーション；レーザーによる治療、それらは、冒された軟骨の除去を軟骨再形成と組み合わせる）を用いて対象者における軟骨生成を誘発することを意図するもの、及び損傷部位への組織の移植（又は移植）（たとえば、骨膜移植、骨軟骨移植（モザイク形成）、及び関節軟骨ペースト移植）に頼る治療法が挙げられる。これらの治療法の成功率は様々であり、場合によっては、組織壊死、反応性滑膜炎、軟骨融解、及び関節軟骨変性の加速を含む有害な副作用を有する可能性がある。
【０００４】
自家軟骨細胞療法（ＡＣＴ）として知られる細胞に基づいた軟骨治療計画には、軟骨からの軟骨細胞の取り出し、試験管内での細胞の増殖、及び支持マトリクス（又はそのほかのタンパク質若しくはプロテオグリカン）の存在下又は非存在下でのこれら増殖させた細胞の患者への投与が含まれる。ＡＣＴ療法は、試験管内で培養される場合のヒト関節軟骨細胞の脱分化、並びにそれらが移植部位で豊富な軟骨マトリクスを産生するように細胞を再分化させることの困難さによって複雑なものとなっている。さらに、ヒトからはほんのわずかな数の軟骨細胞しか回収できないので、培養の開始にほんのわずかな数の軟骨細胞しか使用できない。従って、実際上、単離されたヒト軟骨細胞を移植療法に適用する困難さは継続する。
【０００５】
別の治療戦略は、骨髄由来の間葉幹細胞（ｈｂｍＭＳＣ）の利用である。単回用量のｈｂｍＭＳＣ（軟骨原）を利用した臨床試験は、ヒアルロン酸（ＨＡ）対照に比べて疼痛の減少を示す。しかしながら、間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、軟骨の再生における使用に関して２つのハードルを有する。第１に、同種移植としての細胞の使用は、成人ＭＳＣの限定された増殖能のために問題であり、細胞が特定の量に増殖することができるとしても、それらは、軟骨を形成する能力を相対的に急速に失うことが多い。第２のハードルは、骨髄由来のＭＳＣのようなＭＳＣは、高レベルのＣＯＬ１０Ａ１及びＩＨＨの発現を特徴とする肥大軟骨細胞を形成するということである。これらの軟骨細胞の発生における役割は、血管及び骨芽細胞を動員することであり、次いで死滅する。肥大軟骨細胞は、たとえば、長骨の成長板領域で認められる。それらはまた、それらが同様に骨形成で重要な役割を担う骨折部位でも認められる。従って、外傷や、たとえば、変形性関節症のような軟骨の変性疾患の治療でのＭＳＣの使用は、混合した結果をもたらしている。加えて、生体には多数の種類の軟骨が存在する。耳の弾性軟骨は、鼻、胸骨、気管及び体重を支える関節とは異なった分子組成を有する。
【０００６】
従って、再生医療の分野、特に軟骨の再生と修復の分野にいては、商業的な量の様々な種類の永続的で、肥大に対抗する軟骨細胞を生成する新規の細胞製剤のニーズが大きい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様には、軟骨形成に到ることが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物が含まれる。原始幹細胞に由来する多数の例となる軟骨形成性細胞株を開示する。本明細書で記載される軟骨形成性細胞株は、健全であり、４０継代を超えて増殖することができ、部位特異的な純度を有するので、研究及び治療に使用するための独特な分子組成をもつ多様な軟骨の種類を産生する組成物及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】軟骨形成性の微細塊状態の１４日目前後のｑＰＣＲによってアッセイされた細胞株におけるＣＯＬ２Ａ１の誘導のレベルを示す図である。
【図２】未分化及び分化の状態における本発明の細胞株と共にＭＳＣ対照にて示す軟骨関連遺伝子、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＲＴＡＣ１、ＣＤ７４（図２Ａ）、ＬＥＣＴ１、ＩＨＨ及びＬＨＸ８（図２Ｂ）の相対的な発現を示す図である。
【図３】４Ｄ２０．８株とＭＳＣの１４日目ペレットにおけるペレット及びアイソタイプ対照による免疫染色として、すべて分化の２１日目にて、継代６でのＭＳＣと比べた継代１４での株４Ｄ２０．８と比べた脂肪組織幹細胞のサフラニンＯ染色の例を示す図である。
【図４】４Ｄ２０．８ＲＧＤアルギン酸（図４Ａ）、Ｅ１５ＲＧＤアルギン酸及びＳＭ３０ＲＧＤアルギン酸（図４Ｂ）の生体内埋め込みの結果を示す図である。
【図５】細胞株４Ｄ２０．８及びＥ１５についてのガラス質軟骨に似た軟骨細胞様の外見を示す例となる組織像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
略号
ＡＦＰ：α−フェトタンパク質
ＢＭＰ：骨形成性タンパク質
ＢＲＬ：バファローラット肝臓
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＤ：クラスター指定
ｃＧＭＰ：適正製造基準工程
ＣＮＳ：中枢神経系
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＣ：胚性癌
ＥＣ Ｃｅｌｌｓ：胚性癌細胞、ｈＥＣ細胞は、ヒト胚性癌細胞である
ＥＣＭ：細胞外マトリクス
ＥＤ Ｃｅｌｌｓ：胚由来細胞；ｈＥＤ細胞はヒトＥＤ細胞である
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧ Ｃｅｌｌｓ：胚性生殖細胞；ｈＥＧ細胞はヒトＥＧ細胞である
ＥＰ Ｃｅｌｌｓ：胚性前駆細胞は、それらが、ヒトにおける場合、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０又はＴＲＡ−１−８１のようなマーカーの血清陽性をもはや示さないという点で原始幹細胞より分化しているが、完全に分化しているわけではない、原始幹細胞由来の細胞である。胚性前駆細胞は、発生の新生児段階ではなく胚段階に相当する。
ＥＳ Ｃｅｌｌｓ：胚性幹細胞；ｈＥＳ細胞はヒトＥＳ細胞である
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選別
ＥＢＳ：ウシ胎児血清
ＧＭＰ：製造管理及び品質管理に関する基準
ｈＥＤ Ｃｅｌｌｓ：ヒト胚由来細胞
ｈＥＧ Ｃｅｌｌｓ：ヒト胚性生殖細胞は胚組織の原始生殖細胞に由来する幹細胞である
ｈＥＰ Ｃｅｌｌｓ：ヒト胚性前駆細胞はヒト種からの胚性前駆細胞である。
ｈｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ：ヒトから誘導された多能性幹細胞は、たとえば、SOＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＭＹＣ又はＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＯＣＴ４及びＳＯＸのようなｈＥＳ特異的な転写因子に暴露した後の体細胞から得られるｈＥＳ細胞に類似する特性を持つ細胞である。
ＨＳＥ：ヒト皮膚同等物は、創傷修復の促進で試験目的又は治療適用にために製造される細胞と生物学的マトリクス又は合成マトリクスの混合物である。
ＩＣＭ：哺乳類の胚盤胞段階の胚の内部細胞塊
ｉＰＳ細胞：誘導された多能性幹細胞は、たとえば、SOＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＭＹＣ又はＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＯＣＴ４及びＳＯＸのようなｈＥＳ特異的な転写因子に暴露した後の体細胞から得られるｈＥＳ細胞に類似する特性を持つ細胞である。
ＬＯＨ：ヘテロ接合性の消失
ＭＥＭ：最少必須培地
ＮＴ：核移植
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＳ線維芽細胞：瘢痕化前の線維芽細胞は、早期妊娠の皮膚に由来する、又は瘢痕形成することなく皮膚創傷の迅速な治癒を促進するという点で遺伝子発現の出生前のパターンを示すＥＤ細胞に由来する線維芽細胞である。
ＲＡ：レチノイン酸
ＲＦＵ：相対的蛍光単位
ＳＣＮＴ：体細胞核移植
ＳＦＭ：無血清培地
ＳＰＦ：特定病原体未感染
ＳＶ４０：シミアンウイルス４０
Ｔａｇ：ラージＴ抗原
Ｔ−ＥＤＴＡ：トリプシンＥＤＴＡ
【００１０】
定義
用語「分析用再プログラム技術」は、体細胞の遺伝子発現のパターンをさらに多能性状態、たとえば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＥＤ細胞、ＥＣ細胞又はＥＧ細胞のそれに再プログラムする種々の方法を指し、その際、再プログラムは、複数の別個の工程で生じ、体細胞の卵母細胞への移植及びその卵母細胞の活性化に単純に頼らない（２００１年１１月２６出願の米国特許出願第６０／３３２，５１０号；２００２年１１月２６日出願の同第１０／２０４，０２０号；２００３年１１月２６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３７８９９；２００５年８月３日出願の米国特許出願第６０／７０５６２５号；２００５年８月２０日出願の同第６０／７２９１７３号；２００６年７月５日出願の同第６０／８１８８１３号；２００６年８月３日出願のＰＣＴ／ＵＳ０６／３０６３２を参照のこと。そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００１１】
用語「割球／桑実胚の細胞」は、哺乳類の胚における割球若しくは桑実胚の細胞、又はこれらの細胞の分化誘導体を含む追加の細胞の存在下又は非存在下で試験管内にて培養された割球若しくは桑実胚の細胞を指す。
【００１２】
用語「遺伝子Ｘを発現する細胞」「遺伝子Ｘが細胞（又は細胞集団）にて発現される」、又はその同等物は、特定のアッセイプラットホームを用いた細胞の解析が陽性の結果を提供したことを意味する。逆もまた真実である（すなわち、遺伝子Ｘを発現しない細胞又はその同等物によって、特定のアッセイプラットホームを用いた細胞の解析が陰性の結果を提供したことを意味する）。従って、本明細書で記載される遺伝子発現の結果は、示された遺伝子についてアッセイプラットホーム（又はプラットホーム）で採用される特異的なプローブ（単数）又はプローブ（複数）に結びつく。
【００１３】
用語「細胞株」は、試験管内で増える及び増殖することが可能である細胞の死すべき集団又は不死の集団を指す。
【００１４】
用語「細胞性の再構築」は、機能的な細胞を得ることができるように核クロマチンの細胞質への移植を指す。
【００１５】
用語「クローン性」は、すべて元々の単一細胞に由来し、ほかの細胞を含有しない、単一細胞から細胞の集団への増殖によって得られる細胞を指す。
【００１６】
用語「コロニーのその場での分化」は、コロニーが未分化の幹細胞株として増殖した培養容器からコロニーを取り出す又はバラバラにすることなく、その場での細胞（たとえば、ｈＥＳ、ｈＥＧ、ｈｉＰＳ、ｈＥＣ又はｈＥＤ）のコロニーの分化を指す。胚様体形成法又はたとえば、スピナー培養の使用のようなそのほかの凝集法が、それでもやはりコロニーのその場での分化の期間に付随するが、コロニーのその場での分化は胚様体を形成する中間工程を利用しない。
【００１７】
用語「細胞質泡状突起」は、未処理の又は事前透過化したがほかは未処理の、しかし、核を欠く原形質膜によって結合される細胞の細胞質を指す。
【００１８】
多能性幹細胞から本発明の方法によって作製された細胞を参照して使用される場合、用語「分化した細胞」は、親の多能性幹細胞と比較したとき、分化の低い能力を有する細胞を指す。本発明の分化した細胞は、さらに分化すればよい細胞を含む（すなわち、それらは最終的に分化していなくてもよい）。
【００１９】
用語「直接分化」は、未分化細胞株としてのｈＥＳ細胞のような単離した未分化幹細胞を増殖させる中間的な状態無しで直接、割球細胞、桑実胚細胞、ＩＣＭ細胞、ＥＤ細胞又は未分化状態に再プログラムされた体細胞（たとえば、ｉＰＳ細胞を作製する過程で、しかし、未分化状態でそのような細胞を精製する前に）を分化させる工程を指す。直接分化の非限定例は、培養された未処理のヒト胚盤胞の培養、及び記載された（Bongso et al, 1994. Human Reproduction 9:2110）ようなヒトＥＳ細胞株の生成なしでのＥＤ細胞の誘導である。
【００２０】
用語「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）は、未分化状態を維持しつつ（たとえば、その種のＥＳ細胞に特異的なＴＥＲＴ、ＯＣＴ４、及びＳＳＥＡ及びＴＲＡを発現している）細胞株として連続して継代されている胚盤胞の内部細胞塊、割球、又は桑実胚に由来する細胞を指す。ＥＳ細胞は、卵細胞の精子又はＤＮＡとの受精、核移植、単為生殖、又はＭＨＣ領域における半接合体又はホモ接合体によってｈＥＳを生成する手段に由来してもよい。ＥＳ細胞は、未着床の胚に移植される場合の生殖細胞系と同様にあらゆる種類の体細胞に分化することが可能である細胞として歴史的に定義されている一方で、ヒトを含む多数の種からの候補ＥＳ培養物は、培養にてさらに平坦な外見を有し、通常生殖細胞系の分化には寄与せず、従って「ＥＳ様細胞」と呼ばれる。ヒトＥＳ細胞は、実際には「ＥＳ様」ではあるが、本出願では、我々は、ＥＳ細胞株及びＥＳ様細胞株を指して用語ＥＳ細胞を使用する。
【００２１】
用語「組織特異的な培養物」は、たとえば、寒天の層上での体細胞の培養で生じるような、又はたとえば、コラーゲンゲル、スポンジ若しくは組織工学で一般に使用されるそのほかのポリマーにおける三次元で細胞が培養されるときに生じるような、凝集して、組織様の細胞密度で三次元構造を創る培養された細胞を指す。
【００２２】
用語「ヒト胚由来の」（「ｈＥＤ」）細胞は、正常なヒトの発生の最初の８週間の同等物に相関する分化の状態までの原始内胚葉、外胚葉、中胚葉、神経堤及びその誘導体を含む、早期胚の内部細胞塊、胎盾、又は胚盤葉上層、又は万能性若しくは多能性の幹細胞を含むが、細胞株として継代されているｈＥＳ細胞に由来する細胞（たとえば、Ｔｈｏｍｓｏｎへの米国特許第７，５８２，４７９号、同第７，２１７，５６９号、同第６，８８７，７０６号、同第６，６０２，７１１号、同第６，２８０，７１８号、及び同第５，８４３，７８０号を参照のこと）を除く、割球由来の細胞、桑実胚由来の細胞、胚盤胞由来の細胞を指す。ｈＥＤ細胞は、卵細胞の精子又はＤＮＡとの受精、核移植、又はクロマチン移植、単為生殖を介して単為生殖体を形成するように誘導される卵細胞、分析再プログラム技術、又はＨＬＡ領域における半接合体若しくはホモ接合体によるｈＥＳ細胞を生成する手段によって生成される着床前の胚に由来してもよい。用語「ヒト胚性生殖細胞」（ｈＥＧ細胞）は、生体で種々の組織に分化することができる、胚組織の原始生殖細胞又は成熟している若しくは成熟した、たとえば、卵母細胞及び精原細胞のような生殖細胞に由来する多能性幹細胞を指す。ｈＥＧ細胞はまた、雌性発生又は雄性発生の手段、すなわち、多能性細胞がオス又はメスの起源のＤＮＡのみを含有する卵母細胞に由来するので、すべてメス由来のＤＮＡ又はオス由来にＤＮＡを含む方法によって産生される多能性幹細胞に由来してもよい（たとえば、１９９９年１０月２８日に出願された米国特許出願第６０／１６１，９８７号、２０００年１０月２７日に出願された同第０９／６９７，２９７号、２００１年１１月２９日に出願された同第０９／９９５，６５９号、２００３年２月２７日に出願された同第１０／３７４，５１２号、２０００年１０月２７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／００／０９５５１を参照のこと；その開示はすべて参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００２３】
用語「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）は、ヒトのＥＳ細胞を指す。
【００２４】
用語「ヒトｉＰＳ細胞」は、免疫に欠陥のあるマウスに移植した場合、３つの胚葉すべてを形成する能力を含む、ｈＥＳ細胞に似た特性を持つ細胞を指し、その際、前記ｉＰＳ細胞は、脱分化因子、たとえば、ｈＥＳ細胞に特異的な転写因子の組み合わせ：ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ及びＯＣＴ４又はＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８への暴露後の種々の体細胞系列の細胞に由来する。脱分化因子の任意の好都合な組み合わせを用いてｉＰＳ細胞を生成してもよい。たとえば、当該技術で既知であるレトロウイルス、レンチウイルス若しくはアデノウイルスのベクターのようなベクターを介したこれら遺伝子の発現によって、又はたとえば、透過化若しくはほかの技術によるタンパク質のような因子の導入を介して前記ｉＰＳ細胞を産生してもよい。そのような例となる方法の記載については、２００６年８月３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０６３２；米国特許出願第１１／９８９，９８８；２０００年６月３０日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０１８０６３；２０００年１２月１５日に出願された米国特許出願第０９，７３６，２６８号；２００４年４月２３日に出願された米国特許出願第１０／８３１，５９９号；及び米国特許公開２００２０１４２３９７（「細胞の運命を変える方法」と題する出願番号１０／０１５，８２４）；米国特許公開２００５００１４２５８（「細胞の運命を変える方法」と題する出願番号１０／９１０，１５６）；米国特許公開２００３００４６７２２（「再プログラムしたドナーのクロマチン又はドナーの細胞を用いた哺乳類をクローニングする方法」題する出願番号１０／０３２，１９１）；米国特許公開２００６０２１２９５２（「再プログラムしたドナーのクロマチン又はドナーの細胞を用いた哺乳類をクローニングする方法」題する出願番号１１／４３９，７８８）を参照のこと。そのすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００２５】
用語「ＩＣＭ細胞」は、哺乳類胚の内部細胞塊の細胞、又は周辺の栄養外胚葉細胞の存在下若しくは非存在下にて試験管内で培養した内部細胞塊の細胞を指す。
【００２６】
用語「オリゴクローン性」は、同一培養物でそのほかの細胞とは異なる形態や分化マーカーの存在又は非存在のような類似の特徴を共有すると思われる通常２〜１０００細胞の小さな細胞集団を起源とする細胞の集団を指す。オリゴクローン性細胞は、これらの共通する特徴を共有しない細胞から単離され、増殖させて類似細胞の元々の集団に全体として本質的に由来する細胞集団を生成する。
【００２７】
用語「器官型培養」は、たとえば、寒天の層上での若干の細胞の培養で生じるような、動物における奇形腫として培養されるような、さもなければ、三次元培養系で増殖させるような組織様の細胞密度での三次元構造を凝集して創る培養細胞を指すが、前記凝集した細胞は、たとえば、非限定の例証として、表皮角化細胞と皮膚線維芽細胞の組み合わせ、又は相当する組織間質を伴った実質細胞、又は間葉細胞を伴った上皮細胞の組み合わせのような異なった細胞系列の細胞を含有する。
【００２８】
用語「多能性幹細胞」は、以下に定義されるような用語「原始幹細胞」と同義的に使用される。
【００２９】
用語「プールされたクローン性」は、２以上のクローン性集団を組み合わせて遺伝子発現マーカーのようなマーカーの均一性を持つ、クローン集団に類似する細胞の集団を生成することによって得られる細胞の集団を指すが、細胞すべてが同一の最初のクローンに由来する集団ではない。前記プールされたクローン性細胞株には、単一の遺伝子型又は混合された遺伝子型の細胞が含まれる。プールされたクローン性細胞株は、クローン性細胞株が相対的に早く分化する場合、又は望ましくない方法で早期に増殖寿命で変化を生じる場合、特に有用である。
【００３０】
用語「原始幹細胞」は、１を超える分化した細胞種に分化することが可能である動物細胞を指す。そのような細胞には、ｈＥＳ細胞、割球／桑実胚の細胞及びそれらに由来するｈＥＤ細胞、ｈｉＰＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｈＥＣ細胞、並びに間葉幹細胞、神経幹細胞及び骨髄由来幹細胞を含む成人由来細胞が挙げられる。原始幹細胞は非ヒト動物に由来してもよい。原始幹細胞は遺伝子操作されてもよいし、遺伝子操作されなくてもよい。遺伝子操作された細胞は、たとえば、蛍光タンパク質のようなマーカーを含んで試験管内又は生体内での特定を円滑にしてもよい。
【００３１】
詳細な説明
上記で要約したように、本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。
【００３２】
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されることはなく、従って当然変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００３３】
値の範囲が提供される場合、内容が明瞭に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在する値、その範囲の上限と下限の間及びその言及される範囲におけるそのほかの開始の値又は介在する値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのさらに小さな範囲の上限及び下限は独立してさらに小さな範囲に含まれてもよく、本発明の範囲内に包含され、開始範囲における特に排除される限界の対象となる。開始範囲が一方の限界又は双方の限界を含む場合、これらを含む限界のいずれか又は双方を排除する範囲も本発明に含まれる。
【００３４】
特定の範囲は、用語「約」が先行する数値によって本明細書では提示される。用語「約」は、それが先行する正確な数、同様にその用語が先行する数に近い又は近似する数に対して文字通りの支援を提供するために本明細書で使用される。数が特に言及される数に近い又は近似するかどうかを決定する場合、近い又は近似する言及されない数が、それが提示される文脈で、特に言及された数の実質的な同等物を提供する数であってもよい。
【００３５】
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で記載されるものと類似の又は同等の方法及び材料を本発明の実践又は試験でも使用することができるが、代表的な説明となる方法及び材料を今や記載する。
【００３６】
本明細書で引用される出版物及び特許はすべて、各個々の出版物又は特許が参照によって組み込まれるように特に且つ個々に指示されるかのように、及び言及される出版物と関連して方法及び／又は材料を開示し、記載するように参照によって本明細書に組み入れられるかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。出版物の引用は、出願日の前の開示についてであり、前の発明によってそのような出版物に先行するように本発明に権利を与えないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、独立して確認される必要があってもよい実際の出版の日付とは異なってもよい。
【００３７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明瞭に指示されていない限り、複数の参照を含むことが言及される。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を排除するように作成されてもよいことが言及される。従って、この文書は、特許請求の範囲の要素の言及又は「否定的な」限定の使用と併せてそのような排除的用語「単に」、「のみ」などの使用について先例を基準として役立つことが意図される。
【００３８】
本開示を読み取る際、当業者に明らかであるように、本明細書で記載され、説明される実施形態のそれぞれは、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、そのほかの幾つかの実施形態の特徴から容易に分離されてもよい、又はそれと容易に組み合わせられてもよい別個の成分及び特徴を有する。言及される方法は、言及される事象の順に、又は理論的に可能なほかの順に実施することができる。
【００３９】
胚性の軟骨形成性前駆細胞及び使用方法
本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。四肢及び関節の中心的調節因子と関連して間充組織の中心的調節因子を発現する多様なセットのクローン性細胞株、たとえば、関節特異的なマーカーＧＤＦ５を高レベルで発現する細胞株のサブセットを伴った、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、及びＳＯＸ９を発現する細胞株が記載されている（補完情報を含む、参照によって本明細書に組み入れられるWest et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308; 及びその全体が参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号を参照）。これらのクローン性に精製された細胞株は、健全であり、その遺伝子発現パターンを維持しつつ４０を超える継代について増殖させることができ、腫瘍形成性は示されておらず、遺伝子発現の胚性パターンを有する。従って、これらの細胞株は、研究及び治療で使用するための独特の分子組成を持った多様な軟骨の種類を産生するための組成物及び方法を提供する。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の未分化の胚性軟骨形成性前駆細胞又はその細胞株の遺伝子発現パターンは、適切な培養条件下では軟骨細胞になる可能性を有する兆候を提供しない。言い換えれば、細胞は、軟骨細胞の発生の可能性を示す遺伝子発現パターンを有さない。
【００４１】
本発明の特定の胚性前駆細胞株は、軟骨形成条件下で誘導されると、ＣＯＬ１０Ａ１遺伝子又はＩＨＨ遺伝子を発現することなく軟骨を生成することが可能であるが、双方は、そのような条件下でＭＳＣにて発現され、肥大軟骨細胞のマーカーである。肥大軟骨細胞は、後に骨芽細胞に侵襲されて骨を作る一時的なマトリクスを提供するので、特定の治療目的（たとえば、関節軟骨の外傷、関節炎の治療又は関連する使用のために組織を再生する尽力において関節に注入する場合、又はさもなければ、関節軟骨に移植する場合）には向いていない。従って、本発明の細胞株は、肥大軟骨細胞を発生させるそのほかの軟骨細胞の前駆細胞（たとえば、骨髄由来のＭＳＣ）との重要な治療上の差異を有する。
【００４２】
本発明に係る例となる胚性の軟骨形成性前駆細胞は、以下の遺伝子：ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２のいずれか１、２、３、４又はすべてについて陰性である。これら遺伝子のそれぞれは、間葉幹細胞（ＭＳＣ）に存在するマーカーであり、それは現在、軟骨置換療法（以下でさらに記載する）で使用されている。従って、本発明の軟骨形成性の胚性前駆細胞株は、そのほかの既知の軟骨形成性前駆細胞とは異なった遺伝子発現パターンを有する。特定の実施形態では、軟骨形成性の胚性前駆細胞株はさらにＨＯＸ遺伝子とＰＩＴＸ１の発現についても陰性である。
【００４３】
以下は、本発明の態様に係る例となるヒト胚性の軟骨形成性前駆細胞株及び当該の特定の遺伝子発現マーカー（陽性及び陰性のマーカー）のリストである。これらヒト胚性の軟骨形成性前駆細胞株は、ヒトＥＳ細胞又は類似のヒト原始幹細胞由来の細胞から単離された後、１８〜２１回の倍増クローン増殖を経験した場合、軟骨芽細胞、次いで通常の早期継代培養のヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）よりも高いレベルのＣＯＬ２Ａ１を発現する軟骨細胞に分化することが可能である。
【００４４】
Ｐ２２〜２８の範囲における細胞株ＭＥＬ２の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＰＩＰ、ＥＮＰＰ２、ＤＬＸ５、ＣＸＡＤＲ、ＮＰＴＸ２、ＣＬＤＮ２３、ＳＦＲＰ２、ＨＳＰＢ３、ＨＡＮＤ２、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＲＣＡＮ２、ＥＢＦ３、ＧＰＭ６Ｂ、ＲＮＦ１７５、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＲＧＳ１６、ＧＰＭ６Ｂ、ＳＯＸ１７、ＥＰＨＢ６及びＢＡＰＸ１が挙げられる。Ｐ２２〜２８の範囲における細胞株ＭＥＬ２で発現されるこれらのマーカーで最も特異的なのは、ＰＩＰ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０５１９）、ＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）、ＤＬＸ５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３３７０７６７）、ＧＰＭ６Ｂ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２６３０２７９）、ＲＧＳ１６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１０３０１０２）、ＥＰＨＢ６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７４０００１７）及びＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）であり、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）及びＨＯＸＢ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４６００９７）の発現が陰性であることである。
【００４５】
Ｐ１３〜１５の範囲における細胞株ＳＭ３０の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＹＳＦ、ＦＳＴ、ＩＴＧＢ４、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳＸ１、ＮＤＳＴ３、ＮＴＲＫ１及びＺＩＣ２が挙げられる。Ｐ１３〜１５の範囲での細胞株ＳＭ３０で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＮＴＲＫ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７０５０１１３）、ＮＤＳＴ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６７０５３７）、ＺＩＣ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５１０３６８）、ＩＴＧＢ４（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３９４０１３２）であり、ＰＩＰ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０５１９）、ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）及びＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）の発現が陰性であることである。
【００４６】
Ｐ１１〜１８の範囲における細胞株７ＳＭＯＯ３２の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＥＧＦＬ６、ＦＧＦ１３、ＢＥＸ２、ＣＨＲＮＡ３、ＮＣＡＭ２、ＢＢＯＸ１及びＤＬＫ１が挙げられる。７ＳＭＯＯ３２で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＥＧＦＬ６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６３３００７９）、ＦＧＦ１３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７３８０２３９）、ＣＨＲＮＡ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４２８０１８０）、ＢＢＯＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４００３８６）であり、遺伝子：ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＮＴＲＫ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７０５０１１３）、ＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）及びＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）の発現が陰性であることである。
【００４７】
Ｐ１２〜１７の範囲における細胞株ＳＫ１１の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＰＩＴＸ１、ＴＢＸ１５、ＮＣＡＭ１、ＣＯＬ２１Ａ１、ＣＹＹＲ１、ＬＡＭＰ３、ＭＥＧＦ１０、ＲＮＦ１６５及びＧＤＦ１０が挙げられる。ＳＫ１１で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＣＯＬ２１Ａ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４４０７４７）、ＧＤＦ１０（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５６９００９５）、ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）であり、遺伝子：ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）、ＦＯＸＦ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１６６０４７０）、ＦＯＸＧ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４２００４５８）、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＨＯＸＢ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４６００９７）及びＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）の発現が陰性であることである。
【００４８】
Ｐ１５〜２６の範囲における細胞株７ＰＥＮＤ２４の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＴＢＸ１５、ＣＡ９、ＳＰＡＧ１６、ＳＵＳＤ２、ＴＢＸＡＳ１、ＡＩＦ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＦＯＸＦ２、ＡＡＤＡＣ及びＦＯＸＧ１が挙げられる。７ＰＥＮＤ２４で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＡＡＤＡＣ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６２００６１９）、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＳＰＡＧ１６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４３９０５３７）、ＡＩＦ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３８０００４７）であり、遺伝子：ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）、ＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）及びＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）の発現が陰性であることである。
【００４９】
Ｐ１４〜１５の範囲における細胞株Ｅ１５の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＥＮＰＰ２、ＡＢＣＡ６、ＴＢＸ１５、ＢＡＩ３、ＣＮＴＮ３、ＴＳＰＹＬ５、ＧＡＰ４３、ＡＪＡＰ１、ＣＹＦＩＰ２、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＨＯＸＢ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４６００９７）及びＮＮＡＴが挙げられる。Ｅ１５で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１３００６４７）、ＢＡＩ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５６９０３０１）、ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＡＢＣＡ６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５８１０２０９）であり、遺伝子：ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）の発現が陰性であり、遺伝子発現マーカー：ＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）及びＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）が陰性であることである。
【００５０】
Ｐ１２〜１７の範囲における細胞株４Ｄ２０．８の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＬＨＸ８、ＨＡＰＬＮ１、ＬＩＮＧＯ２、ＦＧＦ１８、ＧＰＲ１２６、ＢＢＯＸ１、ＩＴＧＡ４、ＳＨＩＳＡ３及びＢＡＲＸ１が挙げられ、遺伝子発現マーカー：ＮＮＡＴ及びＨＡＮＤ２については陰性である。４Ｄ２０．８で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＳＨＩＳＡ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５６７０２８６）、ＬＨＸ８（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２９００３４３）、ＢＡＲＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６４５００４０）、ＬＩＮＧＯ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１１１０２９１）であり、遺伝子：ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）、ＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）及びＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）の発現が陰性であることである。
【００５１】
上記で言及したように、本発明の胚性の軟骨形成性前駆細胞は、試験管内又は生体内で軟骨を生成する方法での使用を見い出す（本明細書では軟骨細胞誘導法と呼ぶことがある）。治療上の使用に好適なものを含む好都合な軟骨細胞誘導法を使用してもよい（多数の例となる軟骨細胞誘導／軟骨生成の方法が以下及び実施例の項で記載される）。
【００５２】
従って、本発明の胚性の軟骨形成性前駆細胞は、軟骨組織の修復のための治療応用に使用されてもよく、たとえば、治療上許容できるキャリアにて対象者に投与されてもよい。前駆細胞が投与される対象者は、軟骨の置換／再生が治療上の利益を提供する状態、傷害又は疾病を有してもよい。たとえば、対象者が、特定の部位での軟骨の損傷、たとえば、関節軟骨の損傷を有するのであれば、軟骨の損傷部位に胚性前駆細胞株を投与してもよい。そのような治療のための薬学上許容できるキャリアには、細胞の移植に治療用キャリアとして使用が見い出される多種多様な足場、マトリクスなどのいずれかが挙げられる。非限定例には、以下の成分：ヘクステンド；ヒアルロナン及びそのポリマー；コンドロイチン硫酸；Ｉ型コラーゲン；ＩＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそのポリマー；アルギン酸；アガロース；ポロキサマー；フィブリン；キチン；及びキトサンのいずれか１つ又は組み合わせを含有するキャリアが挙げられる。軟骨細胞の分化及び治療法における例となる足場／マトリクス及びその使用は以下でさらに詳細に記載する。
【００５３】
特定の治療応用では、採用される軟骨胚性前駆細胞株は、対象者に投与するのに先立って、たとえば、移植の前に軟骨生成を誘導するために軟骨誘導条件下で培養されてもよい。たとえば、本発明の細胞株から生成される軟骨を含有する形態又はそのほかの構造体（たとえば、成形された構造体）が、たとえば、軟骨の喪失、傷害又は変性の部位にて対象者に移植されてもよい。そのような実施形態では、軟骨細胞培養条件；合成マトリクス又は生体吸収性不動化ビヒクルに胚性前駆細胞を含浸すること；及び成形された構造体に胚性前駆細胞を入れることのいずれか１つ又は組み合わせを含む好都合な軟骨産生条件を採用してもよい。
【００５４】
本発明に係る治療方法には、移植後１以上の時点で所望の部位での軟骨の生成率を測定すること（たとえば、損傷した軟骨の修復又は置換を測定すること）、並びに対象者において新しく形成された軟骨の性能に関しての情報を得ることが含まれる。測定されるパラメータには、患者における移植部位での生き残り、局在化及び存在する投与された細胞の数を挙げることができる。種々の走査技法、たとえば、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ又はＣＴ）走査、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）又はポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）走査を用いて細胞の生着又は再構築の程度を判定してもよい。本発明に係る移植された細胞の対象への機能的一体化は、損傷した又は冒された機能の回復、たとえば、関節の回復、又は機能の増強を調べることによって評価することができる。標的組織を取り出し、視覚的に又は顕微鏡でそれを調べることによって細胞移植の生着、局在化及び生き残りも評価することができる（たとえば、死後解析にて）。
【００５５】
組織を操作した(tissue engineered)軟骨
哺乳類には３種の軟骨が存在し、ガラス質軟骨、線維軟骨及び弾性軟骨が挙げられる。ガラス質軟骨は、フィルム状の弾性粘度を有する軟骨質の塊から成り、半透明であり、真珠のような青色である。ガラス質軟骨は、関節接合する関節の関節接合する表面に優勢に見い出される。それはまた、骨端板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨及び鼻軟骨にも見い出される。線維軟骨は、軟骨に張力強度を付加するＩ型コラーゲンの原線維を含有することを除いてガラス質軟骨と本質的同じである。コラーゲン性の原線維が束に配置され、軟骨細胞が束の間に局在する。線維軟骨は一般に椎間円板の線維輪、腱と靭帯の挿入、半月板、恥骨結合、及び関節包の挿入に一般に見られる。弾性軟骨も、エラスチンの線維を含有することを除いてガラス質軟骨に類似する。それはガラス質軟骨より不透明であり、さらに柔軟性で曲げ易い。これらの特徴は、軟骨マトリクスに埋め込まれた弾性線維によって部分的には規定される。通常、耳介、咽頭蓋、及び喉頭には弾性軟骨が存在する。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞が治療応用に採用されて、対象者（たとえば、哺乳類、たとえば、ヒト対象者）において軟骨組織（たとえば、損傷された軟骨）を修復し、置き換え、又は整備する。試験管内で軟骨が生成され、その後冒された部位に移植されてもよく、特定の実施形態では、軟骨細胞が（たとえば、マトリクス又は足場の中に）移植されて対象者における所望の部位で軟骨を生成してもよい。軟骨産生細胞（又は軟骨細胞）を用いる多数の治療法が記載されており、その２，３を以下で要約する。
【００５７】
特定の実施形態では、合成マトリクス又は生体吸収性の不動化媒体（「足場」又は「マトリクス」とも呼ぶことがある）に本発明の軟骨産生細胞を含浸させてもよい。種々の合成担体マトリクスが今日まで使用されており、それには、三次元コラーゲンゲル（米国特許第４，８４６，８３５号； Nishimoto (1990) Med. J. Kinki University 15; 75-86; Nixon et al. (1993) Am. J. Vet. Res. 54:349-356; Wakitani et al. (1989) J. Bone Joint Surg. 71B:74-80; Yasui (1989) J. Jpn. Ortho. Assoc. 63:529-538)；再構築フィブリン／トロンビンゲル（米国特許第４，６４２，１２０号；同第５，０５３，０５０号及び同第４，９０４，２５９号）；ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそのコポリマーを含有する合成ポリマーマトリクス（米国特許第５，０４１，１３８号）；並びにヒアルロン酸に基づいたポリマー（Robinson et al. (1990) Calcif. Tissue Int. 46:246-253）が挙げられる。Ｉ型コラーゲンマトリクス（たとえば、日本、東京の株式会社高研からのアテロコラーゲン）；Ｉ型とＩＩＩ型コラーゲンの二重層足場（たとえば、ドイツ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｖｅｒｉｇｅｎ）；コラーゲン足場（たとえば、ドイツ、Ｈｅｚｏｅｎｒａｔｈ、Ｍａｔｒｉｃｅｌのカバーした自己軟骨細胞移植（ＣＡＣＩ）及びマトリクス誘導の自己軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）方式（ＡＣＩ−Ｍａｉｘ（商標））；ブタのＩ型／ＩＩＩ型二重層（たとえば、ＣｈｏｎｄｒｏＧｉｄｅ（登録商標）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｗｏｌｈｕｓｅｎ、スイス）；３Ｄ−コラーゲン／ゲル／マトリクス（たとえば、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｔｒａsｅ，ＢｉｏＲｅｇｉｏＳＴＥＲＮからの及びＭＡ、ボストンのＫｉｎｅｔｉｃｓ社からのＣａＲｅＳ（登録商標）で使用されるような）；ヒアルロナン足場、たとえば、ヒアルロナンを基にした生分解性ポリマーのエステル化（ベンジルエステル）誘導体（たとえば、イタリア、Ａｂａｎｏ Ｔｅｒｍｅ、Ｆｉｄａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＨｙａｆｆ（登録商標）−１１）；ＰＧＡ／ＰＬＡコポリマー及びポリジオキサノン足場、たとえば、ゲル負荷多孔性生分解性フリース（たとえば、ドイツ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｂｉｏｔｉｓｓｕｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＢｉｏ−Ｓｅｅｄ−Ｃで採用されるような）；アガロース／アルギン酸マトリクスを伴った固形足場（たとえば、フランス、ＭＩＯＮＳ、ＴＢＦ Ｔｉｓｓｕｅ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇからのＣａｒｔｉｐａｔｃｈ（登録商標））；二相性の三次元コラーゲン／コンドロイチン表面足場（たとえば、ドイツ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、ＴＥＴＥＣからのＮＯＶＯＣＡＲＴ（商標）３Ｄ）を含む、これらの足場及びマトリクスの特定のものが治療用の軟骨修復に使用されている（又はそのために試されている）。
【００５８】
軟骨再構築の記載について、参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｎｔｈｏｎｙ Ａｔａｌａ及びＲｏｂｅｒｔ Ｐ．Ｌａｎｚａによって編集され、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ロンドン）によって出版されたＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００２）に記載されたように（１０２７〜１０３９頁を参照）、本発明の軟骨産生細胞を軟骨の再構築に採用してもよい。そこで記載されたように、軟骨産生細胞を成形された構造体（たとえば、射出成形によって）に入れ、動物に移植してもよい。時間が経てば、軟骨産生細胞によって生成された軟骨が成形された構造体を置き換え、それによって、形成された軟骨構造体を生成する（すなわち、当初の形成された構造体の形状にて）。形成された構造体のための例となる成形材料には、ヒドロゲル（たとえば、アルギン酸、アガロース、ポラクソマー（プルロニクス））及び天然の材料（たとえば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びフィブリン）が挙げられる。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞は、試験管内で培養されて合成軟骨（又は軟骨様の）材料を形成してもよい。得られた軟骨を続いて軟骨欠損の部位で対象者に埋め込んでもよい。この種のアプローチは、埋め込みの前に合成軟骨材料の成長がモニターされ得るという利点を有する。加えて、得られた軟骨は埋め込みに先立って生化学的に及び形態学的に性状分析され得る。試験管内で合成軟骨を増殖させるために２つの一般的な手順が開発されている。これらには、足場依存性の方法又は足場非依存性の方法のいずれかで軟骨産生細胞を増殖することが含まれる。
【００６０】
足場非依存性の方法では、軟骨産生細胞をアガロースゲルの中でコロニーとして培養してもよい。たとえば、Ｂｅｎｙａら、（１９８２）Ｃｅｌｌ、３０：２１５−２２４；Ａｙｄｌｏｔｔｅら、（１９９０）ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｈａｐｔｅｒ：２３：ｐｐ．９０−９２；Ａｕｌｔｈｏｕｓｅら（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：６５９−６６８；Ｄｅｌｂｒｕｃｋら、（１９８６）Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１５：１５５０−１７２；及びＢｏｈｍｅら、（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６：１０３５−１０４２を参照のこと。或いは、別の足場非依存性の方法では、軟骨産生細胞を浮遊培養にてコロニーとして培養してもよい。たとえば、Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔら、（１９８９）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：５−９；及びＢａｓｓｌｅｅｒら、（１９９０） ｉｎ 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４を参照のこと。
【００６１】
足場依存性の方法では、軟骨産生細胞の一次培養は細胞培養フラスコの表面に付着する単層として増殖させてもよい。たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＹｏｓｈｉｈａｓｈｉ（１９８３）Ｊ．Ｊｐｎ．Ｏｒｔｈｏ．Ａｓｓｏｃ．５８：６２９−６４１；及び米国特許第４，３５６，２６１号を参照のこと。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明の軟骨療法は、米国特許第５，７２３，３３１号及び同第５，７８６，２１７号（双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられる「哺乳類における関節軟骨欠陥の修復のための方法及び組成物」と題する）に記載されたものを含む。これらの特許は、軟骨の欠陥の修復のために合成軟骨パッチを試験管内で調製する方法を記載している。本発明の軟骨産生細胞を採用する場合、方法は、（１）細胞の接触を有する事前に成形されたウェル、細胞付着性の表面に本発明の軟骨産生細胞を播く工程と、（２）細胞が細胞外マトリクスを分泌できるのに十分な時間、ウェルにて本発明の軟骨産生細胞を培養し、それによって合成軟骨の三次元の多層細胞パッチを形成する工程を含む。得られた合成軟骨（たとえば、合成関節軟骨）は、内因的に産生され、分泌された細胞外マトリクスの中に分散された本発明の軟骨産生細胞を含有する。続いて、得られた合成軟骨パッチを対象者（たとえば、哺乳類）における軟骨の欠陥の修復（置き換え）に使用してもよい。
【００６３】
別の例として、本発明の軟骨形成性細胞を三次元マトリクス、たとえば、ヒドロゲルに被包してもよい。例となるヒドロゲル被包方法は、参照によって本明細書に組み入れられる、「三次元ヒドロゲル培養における胚性幹細胞の指向分化」、Ｎａｔｈａｎｉｅｌ Ｓ．Ｈｗａｎｇ，Ｓｈｙｎｉ Ｖａｒｇｈｅｓｅ及びＪｅｎｎｉｆｅｒ Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４０７：ｐ３５１ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙｓに見つけることができる。そこに記載された例となる方法を以下に要約する。
【００６４】
Ａ．ＰＥＧＤＡ又はＲＧＤで修飾したＰＥＧＤＡヒドロゲルにおける軟骨細胞前駆細胞の光被包
１）１０％（ｗ／ｖ）の濃度にて無菌ＰＢＳでマクロマーを混合することによってＰＥＧＤＡポリマー、ポリ（エチレングリコール）−ジアクリレート（ＰＲＧＤＡ：カタログ番号０１０１０Ｆ１２、米国、Ｎｅｋｔａｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）溶液又はＲＧＤで修飾したＰＥＧＤＡ溶液を調製する。ポリマー溶液を光から保護し、それは、−２０℃にて３ヵ月間保存することができる。
２）７０％のフィルター滅菌したエタノール１ｍＬに１００ｍｇの光開始剤、イグラキュア２９５９（製品番号１７０６６７３，Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を溶解する。
３）その使用まで、粉砕した氷上にＰＥＧＤＡ溶液と光開始剤溶液の双方を置く。
５）ＰＥＧＤＡ溶液に光開始剤を加え、十分に混合して最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）とする。開始剤がマクロマー溶液と非常に良く混合されていることを確認する（５μＬの光開始剤／ポリマー溶液のｍＬ）。
６）光開始剤を含有するＰＥＧＤＡ溶液を細胞ペレットに加え、ピペットを用いて泡を創らずに十分に混合することによって前駆体（光開始剤を伴ったポリマー）溶液の中で細胞（２０００〜３０００万個／ｍＬ）を浮遊させる。
７）１００＿Ｌの前駆細胞／ポリマー溶液を円筒状の金型に移し、４．４ｍＷ／ｃｍ２（Ｇｌｏｗｍａｒｋ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡ）にて長波３６５ｎｍの光に５分間暴露してゲル形成を完了させる。
８）「固化した」軟骨細胞前駆細胞を含むヒドロゲルをその金型から取り出し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−１を含有する軟骨形成性培地と共に１２穴プレートのそれらを移し、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートする。２〜３日ごとに培地を交換する。
【００６５】
Ｂ．アルギン酸ヒドロゲルにおける軟骨細胞前駆細胞の被包
１）軟骨形成性細胞を５０ｍｌの円錐管に回収し、１４５ｇにて５分間遠心する。上清を取り除き、アルギン酸ポリマー又はＲＧＤ修飾したアルギン酸ポリマーの溶液を加え、（Ｐ−１０００）ピペットマンを用いて細胞を穏やかに浮遊させる。液体中での泡立ちを回避する。
２）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養インサートトレーの１つを取り、１ｍＬの塩化カルシウム溶液でウェルを満たす。
３）ピペットマンを用いて、１００μｌの細胞浮遊液を組織培養インサートに加える。インサートをすべて満たした後、無菌のピンセットを用いて、塩化カルシウム溶液を含有するウェルにインサートを移す。５％ＣＯ２にて３７℃で２０分間それらをインキュベートする。
４）薄い曲がったヘラと共に穏やかなテコのような動きを用いてインサートから構築物を取り外す。各ウェルに構築物１つを入れ、５％ＣＯ２にて３７℃でインキュベートする。
【００６６】
ヒドロゲルに被包された軟骨細胞前駆細胞を試験管内で培養し、又は生体内で軟骨産生が望まれる部位に移植し、たとえば、損傷した又は失った軟骨を置き換えることができる。
【００６７】
Ｇｌｙｃｏｓａｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓもまた、培養、組織工学の足場及び細胞療法で使用を見い出す三次元細胞培養用のヒドロゲルを提供している。この会社はたとえば、試験管内及び生体内での細胞増殖及び分化で使用するためのヒアルロナン系、ＰＥＧ系及びコラーゲン系のヒドロゲルを提供している。
【００６８】
Ｇｌｙｃｏｓａｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの例となるヒドロゲル方式の１つは、３−Ｄ培養にて被包された細胞の穏やかで迅速な回収を可能にするＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳ（商標）である。ＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳは、少量の還元剤のみを用いたＨｙＳｔｅｍ−Ｃヒドロゲルの液化を可能にする新規の架橋剤、ＰＥＧＳＳＤＡを使用する。再構築されたＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳ（商標）は１５〜３７℃で液体のままである。架橋剤、ＰＥＧＳＳＤＡが、Ｇｌｙｃｏｓｉｌ（商標）（チオール修飾したヒアルロナン）とＧｅｌｉｎ−Ｓ（商標）（チオール修飾したゼラチン）の混合物に加えられるとヒドロゲルが形成される。３つの成分すべてが混合された後、約２０分間でゲル化が生じる。工程は低温又は低ｐＨに左右されない。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は細胞培養培地によって成分を希釈することはゲル化時間を増やすことができる。得られたヒドロゲルは、３７℃にて２時間未満で４０ｍｌのアセチル−Ｌ−システイン（還元剤）に溶解することができる。
【００６９】
製造元のプロトコールによれば、ＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳヒドロゲル（３×２．５ｍｌ＝７．５ｍｌ）は以下のように調製される。
【００７０】
ＨｙＳｔｅｍ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、ＰＥＧＳＳＤＡ及びＤＧ水のバイアルを室温にする。
【００７１】
無菌条件下でシリンジと針を用いて、１．０ｍｌのＤＧ水をＨｙＳｔｅｍのバイアルに加える。Ｇｅｌｉｎ−Ｓのバイアルについて繰り返す。
【００７２】
ロッカー又は振盪器の上で双方のバイアルを水平に置く。固形物が完全に溶解するのに＜３０分かかるであろう。３７℃以下に温めること及び／又は穏やかなボルテックス撹拌は溶解の速度を速める。溶液は透明であり、やや粘性である。
【００７３】
無菌条件下でシリンジと針を用いて、０．５ｍｌのＤＧ水をＰＥＧＳＳＤＡのバイアルに加える。数回反転して溶解する。
【００７４】
できるだけ速く、しかし、溶液を作製して２時間以内に、同容量のＨｙＳｔｅｍ ｔｏＧｅｌｉｎ−Ｓ（商標）を無菌的に混合する。混合するには、ピペットをゆっくり上下させ、気泡を捕捉するのを回避する。
【００７５】
２．０ｍＬのＨｙＳｔｅｍ＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓに細胞ペレットを再浮遊する。ピペットを上下させて混合する。
【００７６】
ヒドロゲルを形成するには、１：４の容量比ＰＥＧＳＳＤＡをＨｙＳｔｅｍ＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓミックスに加え（２．０ｍＬのＨｙＳｔｅｍ＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓに０．５ｍＬのＰＥＧＳＳＤＡ（商標））、ピペットによって混合する。
【００７７】
溶液を１０分間反応させ、ピペットで再び混合して細胞の均一な分布を確保する。約１０〜２０分以内にゲル化が生じる。
【００７８】
軟骨形成の応用で使用を見い出す別の例となる足場は、死体供給源、たとえば、ヒトの死体組織からの脱細胞化組織である。（たとえば、 Ｍｉｎｅｈａｒａら，「Ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｓｅｅｄｉｎｇ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｏｎｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ−ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２」Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ ２０１０ Ｊｕｎ １７．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｙａｎｇら「Ａ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ＥＣＭ−ｄｅｒｉｖｅｄ ３−Ｄ ｐｏｒｏｕｓ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＰＫＨ２６−ｌａｂｅｌｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００８ Ｍａｙ；２９（１５）：２３７８−８７；及びＳｔａｐｌｅｔｏｎら， 「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｍｅｄｉａｌ ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」 Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ． ２００８ Ａｐｒ；１４（４）：５０５−１８を参照のこと。これら各々は参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００７９】
たとえば、Ｍｉｎｅｈａｒａらは、死体からの溶媒で保存したヒト半月板と軟骨細胞走化性物質を用いた走化性細胞播種法を記載している。ＭｉｎｅｈａｒａはｒｈＢＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌで）が軟骨細胞を誘導して脱細胞化したヒト半月板に移動させることができることを明らかにしている。Ｍｉｎｅｈａｒａらは、３週間のインキュベートの後、３ｍｍの深さまでの半月板全体に移動した軟骨細胞によって新しく形成された軟骨様の細胞外マトリクスが合成されることを示した。
【００８０】
その場での軟骨形成を付与するための細胞の直接注入
たとえば、細胞株、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、７ＳＭＯＯ３２、ＳＭ３０、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４又はＥ１５又は同一の若しくは類似のマーカーを持つヒト若しくは動物の細胞、又は本発明のそのほかの細胞の直接注入は、成人骨髄由来のＭＳＣ（軟骨原）で以前報告されたものに類似する治療有用性でもある。患者は、半月板切除を受け、その後、ヒアルロン酸（ＨＡ）又は低用量（５０００万個の細胞）若しくは高用量（１５０００万個の細胞）のＭＳＣの単回注入を受ける。患者は、安全性及び追加の予備的な有効性、たとえば、疼痛、軟骨の損傷、及び組織の修復について２年間モニターされる。半月板と軟骨の状態を調べるのに非侵襲性のＭＲＩを用いる。手術の時点で変形性関節症（ＯＡ）のある患者では、１年で、対照、ＨＡの注入を受けた患者に対してＭＳＣの単回注入を受けた患者では、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）によって測定した場合、統計的に有意な２０ｍｍの疼痛低下が認められた（対照２８ｍｍに対してＭＳＣ４８ｍｍ、ｐ＝０．０５）。患者の関節でさらに重篤な変形性関節症がある場合、疼痛の低下は一層さらに３７ｍｍに増えた（ｐ＝０．００４、対照１９ｍｍに対してＭＳＣ５６ｍｍ）。因みに、ＨＡのようなＯＡに対する現在利用可能な治療は、プラセボに対する９〜２３ｍｍの改善に基づいて食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された。ＭＲＩによる容量解析法は、読み取り間に高レベルの変動性が見られるので、コンピュータによる解析には不適当であると思われた。その結果、半月板の再生の意味のある評価を行うことはできない。成人ＭＳＣの有益な効果は、関節状態の物理的対策でも見られた。軟骨下硬化症及び骨棘形成のような変形性関節症に伴う生体の変化は、対照を受け取った患者の２１％で報告されたが、ＭＳＣ治療を受けた患者ではたった６％だった。陽性の用量反応効果もあった。１年で、損傷した半月板を取り出す手術に先立ったベースラインに比べた疼痛の改善は、高用量のＭＳＣでは５６ｍｍ、低用量のＭＳＣでは２６ｍｍ、及び対照では１９ｍｍだった。関節のための細胞に基づいた治療法は、関節特異的な及び患者特異的な細胞、関節組織を再生する改善された能力を持つ細胞、規模拡大及び凍結保存の改善された能力を持つ細胞を生成する技術から恩恵を受ける。本発明は、産業的な規模拡大に好適なＳＯＸ９、ＭＳＸ１及びＭＳＸ２を発現する細胞株を提供する。
【００８１】
胚性前駆細胞株の産生方法
以下に記載する方法に加えて、本明細書で記載される細胞株の産生及び使用において使用を見い出す方法は、以下において見つけることができる：「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する米国特許公開第２００８００７０３０３号；「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０；「胚性前駆細胞株を用いた試験管内及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許仮出願、出願番号６１／２２６，２３７；「遺伝子発現の出生前パターンを持つ細胞の新規使用」と題する２００６年４月１１日に出願されたＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５１９、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００８２】
以下の方法は、ｈＥＳ細胞からの胚性前駆細胞株の産生を記載するが、たとえば、ヒト又は非ヒト動物からの原始幹細胞のようなそのほかの原始幹細胞を採用してもよい。
【００８３】
ｈＥＳ細胞の培養及び候補培養物の生成
使用したｈＥＳ細胞は、以前記載したＨ９（米国国立衛生研究所、ＷＡ０９として登録された）及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308）に由来する株（ＭＡ０３）だった。ｈＥＳ培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５５μＭのβ−メルカプトエタノール（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８％ノックアウト血清代替（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８％プラスマネート、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（ＭＡ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＭＡ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、５０単位／ｍｌのペニシリン／５０単位／ｍｌのストレプトマイシン（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にてｈＥＳ細胞を日常的に培養した。ｈＥＳ細胞は、マイトマイシン−Ｃ処理したマウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で１０％のＣＯ２と５％のＯ２の雰囲気にて３７℃で維持し、トリプシン処理又はコロニーの定期的な手動選抜によって継代した。クローン性胚性前駆細胞の産生については、ｈＥＳ細胞を１５ｍｌのディッシュ当たり５００〜１０，０００個の細胞を入れ、次いで、２工程プロトコールのもとで分化させ、第１の工程は、数々の条件下でｈＥＳ細胞を分化させ、「候補培養物」と呼ばれる細胞の多様な不均質培養物を得ることである。候補培養物の生成は、ＭＥＦ上で増殖する付着性のｈＥＳ細胞（その場での分化のコロニー）と共に、又はｈＥＳに由来する胚様体と共に実施した。その場での分化のコロニー実験については、ｈＥＳ細胞を集密まで増殖させ、種々の方法（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表Ｉに記載されたように）によって分化させた。非限定の例証として、１０％のＦＣＳを伴ったＤＭＥＭでのその場の分化でのコロニーの場合、マウスのフィーダー上のｈＥＳ細胞のコロニーの培養から培養培地を吸引し、分化のために、種々の時間後（分化培地における１，２，３，４，５，７及び９日目）、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＤ培地で培地を置き換えた。次いで０．２５％トリプシン（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞を剥離し、増殖のために１５０ｃｍ２のフラスコに入れた。１５０ｃｍ２のフラスコにおける各時点からの候補細胞を以下に記載するようにクローニングと増殖のために別のプレートに入れた。ＥＢの分化実験については、集密なｈＥＣ培養物を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（ＤＭＥＭ中、ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で１５分間処理し、コロニーを分離した。剥離した無傷のコロニーを擦り取り、遠心（１５０×ｇで５分間）によって回収し、補完表Ｉ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８）に記載された分化培地に再浮遊し、同一の分化培地を含有する６穴超低結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＰＡ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって流通）の単一ウェルに移した。実験に応じて４〜７日間、ＥＢを分化させ、分化したＥＢを０．２５％トリプシンで剥離し、種々の増殖培地を含有する６穴プレートに入れた。６穴プレートでの候補培養物を集密まで増殖させ、以下に記載するようにクローニングと増殖のために別のプレートに入れた。
【００８４】
クローン性細胞株の単離及び増殖
上述した部分的に分化した候補細胞培養物を０．２５％トリプシンで単一細胞に剥離し、補完表Ｉ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８）に示された種々の増殖培地にてさらなる分化と増殖のためにプレート当たりおよそ５００及び／又は１，０００及び／又は２，０００及び／又は５，０００個の細胞のクローニング密度で２つ組の１５ｃｍゼラチン被覆プレートに入れた。クローン性密度の細胞を増殖させ、１０〜１４日間そのままにし、発達しているコロニーを特定し、標準的な技法を用いてクローニングシリンダーとトリプシンによって回収した。クローニングしたコロニーを増殖のためにゼラチン被覆した２４穴プレートに移した。２４穴プレートでクローンが集密になるにつれて（しかし、２日を超えて細胞を集密のままにすることなく）、それらを順次１２穴、６穴、Ｔ−２５フラスコ、Ｔ−７５フラスコ、Ｔ−１５０フラスコ又はＴ−２２５フラスコ、及び最終的にローラーボトルに拡大した。ローラーボトルの段階まで増殖しているクローン性細胞株に独特にＡＣＴＣ特定番号を割り当て、写真撮影し、後の使用のためにアリコートで凍結保存した。細胞がいったん６穴ディッシュで集密に達すると、それらをＴ−２５フラスコに継代し、遺伝子発現の特性分析のためにゼラチン化６ｃｍディッシュに入れるために細胞の分画（５×１０５）を取り出した。或いは、一部の細胞を先ずＴ−２２５フラスコに継代し、次いで遺伝子発現の特性分析のためにゼラチン化６ｃｍディッシュに入れるために細胞の分画（５×１０５）を取り出した。従って、細胞が経験した集団の倍増は１８〜２１ＰＤであると判定された。クローニングプレートからの細胞クローンの取り出しに続いて、製造元の指示書当たり１００％エタノールにてクリスタルバイオレット染色（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ９１３２−ＩＬ）によって残りのコロニーを視覚化した。実験に利用した培養培地は以下を含み、平滑筋基礎培地（カタログ番号Ｃ−２２０６２Ｂ）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９２６７）、骨格筋基礎培地（カタログ番号Ｃ−２２０６０Ｂ）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９３６５）、内皮細胞基礎培地（カタログ番号Ｃ−２２２２１）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９２２１）、色素細胞基礎培地（カタログ番号Ｃ−２４０１０Ｂ）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９４１５）はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社（ドイツ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）から入手した。ＥｐｉＬｉｆｅ、カルシウム／フェノールを含まない培地（カタログ番号Ｍ−ＥＰＩｃｆ／ＰＲＦ−５００）と低血清増殖補完剤（カタログ番号Ｓ−００３−１０）は、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｏｒｅｇｏｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ）から購入した。Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ基本培地（カタログ番号０５０４１）と補完剤（カタログ番号５４０２）は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（カタログ番号１１９６０−０６９）とウシ胎児血清（カタログ番号ＳＨ３００７０−０３）はそれぞれ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。培地及び補完剤は製造元の指示書に従って組み合わせた。
【００８５】
クローン性胚性前駆細胞株の命名
別の記号表示を伴った本発明の細胞株は、バイオインフォマティクス解析の結果生じる名称の操作の結果生じる瑣末な改変を表す異名と共に表４に列記するが、それには、「．」について「−」の置換及びその逆、アラビア数字で細胞株の名称を開始する前の「ｘ」の包含、並びに並行する解析で同一細胞株の凍結アンプルが融解され、伝播され、使用される場合の例である同一細胞株の生物学的複製を示す、「ｂｉｏｌ１」又は「ｂｉｏｌ２」、及び所与の細胞株から単離されたＲＮＡが、融解することなく、又はさもなければ、細胞の新しい培養で開始することなく、反復する解析で２回目に利用される技術的複製を示す「Ｒｅｐ１」又は「Ｒｅｐ２」のような接尾辞が含まれる。細胞株の継代数（細胞がトリプシン処理され、再びプレートに入れられる回数）は普通、文字Ｐに続くアラビア数字で指定されるが、それに対して、集団の倍増数（１つの細胞からクローンで増殖する際、細胞株が経験する推定倍増の数を指す）は、文字「ＰＤ」に続くアラビア数字で指定される。継代におけるＰＤの数は、実験ごとに異なったが、一般に、それぞれのトリプシン処理と再プレート培養は、１：３〜１：４の比率（それぞれ１．５と２のＰＤの増加に相当する）だった。クローンの増殖では、クローニングシリンダーによって組織培養から元々のコロニーを取り出し、上述のように２４穴プレート、次いで１２穴プレート、そして６穴プレートに移した。第１の集密な２４穴プレートをＰ１と名付け、第１の集密な１２穴プレートをＰ２と名付け、第１の集密な６穴プレートをＰ３と名付け、次いで６穴培養物を第２の６穴プレート（Ｐ４）とＴ２５（Ｐ４）に分けた。Ｐ４での第２の６穴プレートをＲＮＡ抽出に利用し（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号を参照）、クローン性増殖のおよそ１８〜２１ＰＰＤを表す。典型的な、推定されるその後の継代とＰＤは、Ｔ７５フラスコへの以下の分割（１９．５〜２２．５ＰＤ）、Ｔ２２５フラスコへの細胞のＰ６継代（２１〜２４ＰＤ）、次いでローラーボトルへの細胞のＰ７継代（８５０ｃｍ２、２３〜２６ＰＤ）、及び４つのローラーボトルへのＰ８の分割（２５〜２８ＰＤ）である。括弧内に上記で示す範囲は、細胞の大きさ、付着効率及び計数誤差による細胞計数の推定範囲を表す。
【００８６】
クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株の増殖
本発明の態様は、単一細胞（クローン性）、又はクローニングした細胞株が遺伝子発現マーカーのような見分けがつかないマーカーを有し、培養での細胞数を増やす目的でそれらを組み合わせて単一の細胞培養にすることを意味する「プールされたクローン性」である、又は株が、少数の通常２〜１，０００個の類似細胞から生成され、細胞株として増殖させるオリゴクローン性、又は遺伝子発現のパターンのような見分けがつかないマーカーを有する２以上のオリゴクローン性細胞株を組み合わせることによって生成される株である「プールされたオリゴクローン性」株である、細胞株に由来する胚性前駆細胞株を特定し、分化させる方法を提供する。それらが付着する基材からの細胞の取り外しを介して、前記クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株を次いで試験管内で増殖させ、通常、元々の細胞数の１／３〜１／４に減らした密度で細胞を再びプレート培養してさらなる増殖を円滑にする。前記細胞株及び関連する細胞培養培地の例は、補完情報も含めて、双方共参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号及びＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８に開示されている。本発明の組成物及び方法は、クローン性増殖の２１を超える倍増を別にして、記載されたように培養された前記細胞株に関する。
【００８７】
遺伝子発現解析
６穴プレートで増殖させる際、細胞が集密に達する日に、細胞周期の人為性による遺伝子発現の変動を抑え、早期の遺伝子発現特性を把握するために、元々の血清濃度が＞５％である場合、血清濃度を０．５％に減らした培地に細胞を入れた。ほかのすべての場合では、血清及び／又はそのほかの増殖因子は、その元々の値の１０％に減らした。これらの静止条件を５日間課し、回収に先立って２日間培養物すべてを元どおり培養し、培養差による人為性を減らした。だから、例証として、元々の培地が１０％ＦＣＳを伴うＤＭＥＭ培地であれば、静止同期化培地は、０．５％ＦＣＳを伴うＤＭＥＭだった。全ＲＮＡは、製造元の指示書に従って、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、６穴プレート又は６ｃｍ組織培養プレートで増殖している細胞から直接抽出した。ＢｅｃｋｍａｎＤＵ５３０又はＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いてＲＮＡ濃度を測定し、変性アガロースゲル電気制動又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザによってＲＮＡの質を判定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）方式、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ−６ ｖ１及びＨｕｍａｎＲｅｆ−８ ｖ１ Ｂｅａｄｃｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ−６ ｖ２ Ｂｅａｄｃｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ２）を用いて全ゲノム発現解析を実施し、特定の遺伝子についてのＲＮＡレベルを定量ＰＣＲによって確認した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙｓについては、全ＲＮＡを線形に増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてビオチン標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザを用いてｃＲＮＡの質的制御を行った。ｃＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐｓとハイブリッド形成させ、処理し、製造元の指示書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎアレイリーダーを用いて読み取った。共通プローブセットによる細胞株すべての相対蛍光単位（ＲＦＵ）を標準化した。
【００８８】
上記の遺伝子発現解析のデータは、補完表すべてを含めて、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８の補完表に見い出すことができる。補完表ＩＩ〜ＩＶでは、（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最高ＲＦＵ値−平均ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比について遺伝子がランク順（最高−最低）で示されている。補完表Ｖでは、全細胞株についての（個々の細胞株で認められた最高ＲＦＵ値−平均ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比について上から４５の、分化して発現された遺伝子がランク順になっている。補完表ＶＩでは、認識されるＣＤ抗原に相当する遺伝子が、それぞれ、（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最高ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比及び（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最低ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比についてランク順（最高−最低）及びまた（最低−最高）で示されている。補完表ＶＩＩでは、分泌されたタンパク質に相当する遺伝子が、（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最高ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比についてランク順（最高−最低）で示されている。
【００８９】
軟骨細胞の分化を誘導する例となる条件
本明細書で記載される前駆細胞株を用いて軟骨形成（又は軟骨産生）を誘導する好都合な方法を研究又は治療のいずれかの目的に（生体内又は試験管内のいずれかで）採用してもよいので、この点での限定は意図されないことが言及される。従って、以下に記載されるアッセイは、軟骨形成のための条件の例となる非限定例を表す。
【００９０】
微細塊分化プロトコール１
以下の分化プロトコールは単に「ｄ１４ＭＭ」と呼ばれる（たとえば、本明細書に記載されるマイクロアレイ表にて）。
１）細胞を、ゼラチン（０．１％）被覆したＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理した培養器具で培養し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａ，Ｍｇを含まず）によって１：３に希釈された０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離する。剥離と増殖培地の添加の後、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタを用いて細胞を数え、実験に必要とされる適当な数の細胞（たとえば、１０×１０６個以上の細胞）を増殖培地中で２０×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度で再浮遊する。
２）塊又は「微細塊」として１０μｌのアリコートをＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理したポリスチレンプレート又はディッシュに播く。２５以上の微細塊アリコート（２００，０００個の細胞／１０μｌアリコート）を播く。
３）播いた微細塊を付着のために、５％Ｏ２及び１０％ＣＯ２にて３７℃の加湿インキュベータに９０分間〜２時間入れる。
４）増殖培地を加え、翌朝、吸引し、ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇを含まず）で洗浄した後、軟骨形成用完全培地（ペレット微細塊用に以下で記載するように調製される）で置き換える。たとえば、１０ｃｍディッシュ当たり６ｍｌの軟骨形成用完全培地を加える。５％Ｏ２及び１０％ＣＯ２にて３７℃の加湿インキュベータで細胞を維持し、２〜３日ごとに新しく調製した培地で軟骨形成用培地を置き換える。
５）軟骨形成用培地にて種々の時間の後、Ｑｉａｇｅｎハンドブックに記載されたようにＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を用いてＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの抽出に先立ってＱｉａｇｅｎのＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（カタログ番号７９６５４）を用いて、試料をホモジネートし、次いでＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙミニキットで提供される）によって微細塊を溶解することによってＲＮＡの収率を最大化する。
【００９１】
Ｌｏｎｚａ軟骨形成用培地の代替は、Ｍｅｄｉａ ＴｅｃｈからのＣｅｌｌＧｒｏ（カタログ番号１５−０１３−ＣＶ）である。各５００ｍｌに以下の補完剤を添加する：５．０ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０）、５．０ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０）、デキサメタゾン（ＭＯ、セントルイス、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ１７５６−１００）−０．１μＭの最終濃度で０．１ｍＭを５００μｌ；Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ４９７５２）−最終濃度０．３５ｍＭで０．３５Ｍを５００μｌ；アスコルビン酸−２−リン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７９２、Ｆｌｕｋａ）−最終濃度０．１７ｍＭで０．１７Ｍを５００μｌ；ＩＴＳプレミックス（ＮＪ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＢＤ、カタログ番号４７７４３−６２８）−最終濃度で１０００×を５００μｌ；６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌの血清アルブミン、５．３５μｇ／ｍｌのリノール酸。
【００９２】
上記構成成分の添加に続いて、５００ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ０．２ミクロンフィルターユニットを介して培地を濾過する。
【００９３】
微細塊の分化プロトコール２
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４ＭＭ」と呼ばれる。
【００９４】
上記で記載されたＬｏｎｚａＴＧＦβ３の代替として我々は、ＴＧＦβ３（ＭＮ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４３−Ｂ３−０１０）を使用する。それは、Ｌｏｎｚａから購入されたものと同様に調製され、等分され、保存され、使用される。
【００９５】
微細塊の分化プロトコール３
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４ＣＳ」と呼ばれる。
【００９６】
微細塊の分化プロトコール１の代替として、血清含有培地の存在下で微細塊を付着させるのではなく、細胞を軟骨形成用完全培地に直接入れてもよい。前記分化した微細塊は、本発明では、「軟骨播種」又は「ＣＳ」と名付けられる。
【００９７】
ペレット分化プロトコール
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４Ｐｅｌ」と呼ばれる。
【００９８】
１）細胞を、ゼラチン（０．１％）被覆したＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理した培養器具で培養し、ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇを含まず）によって１：３に希釈された０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ、Ｇｉｂｃｏ）で剥離する。剥離と増殖培地の添加の後、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタを用いて細胞を数え、実験に必要とされる適当な数の細胞（たとえば、１０×１０６個以上）を無菌のポリスチレン管に移し、室温にて１５０ｇで５分間遠心する。
２）上清を吸引し、捨てる。補完剤（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｐｏｉｅｔｉｃｓ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｑｕｏｔｓ，カタログ番号ＰＴ−４１２１）を添加するｈＭＳＣ Ｃｈｏｎｄｒｏ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ＰＴ−３９２５）から成る軟骨形成用不完全培地の添加によって細胞を洗浄する。補完剤：デキサメタゾン（ＰＴ−４１３０Ｇ）、アスコルビン酸塩（ＰＴ−４１３１Ｇ）、ＩＴＳ＋補完剤（４１１３Ｇ）、ピルビン酸塩（４１１４Ｇ）、プロリン（４１１５Ｇ）、ゲンタマイシン（４５０５Ｇ）、グルタミン（ＰＴ−４１４０Ｇ）を加えて軟骨形成用不完全培地を調製する。
３）細胞を室温にて１５０ｇで遠心し、上清を吸引し、７．５×１０５個の細胞当たり１．０ｍｌの軟骨形成用不完全培地に細胞を再浮遊し（もう一度）、１５０×ｇで５分間遠心する。上清を吸引し、捨てる。若干の改変と共に、Ｌｏｎｚａによって記載されたような軟骨形成培養プロトコールに従う（以下に記述するように）。
４）ｍｌ当たり５．０×１０５個の細胞の濃度に細胞ペレットを軟骨形成用不完全培地に再浮遊させる。軟骨形成用不完全培地はＬｏｎｚａ不完全培地＋ＴＧＦβ３（Ｌｏｎｚａ、ＰＴ−４１２４）から成る。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する無菌の４ｍＭのＨＣｌの添加によって、無菌の凍結乾燥したＴＧＦβ３を２０μｇ／ｍｌの濃度に再構築し、等分した後−８０℃で保存する。軟骨形成用不完全培地の各２ｍｌについて１μｌのＴＧＦβ３の添加（ＴＧＦβ３の最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌ）によって使用直前に軟骨形成用不完全培地を調製する。
５）細胞浮遊液の０．５ｍｌ（２．５×１０５個の細胞）のアリコートを無菌の１５ｍｌポリプロピレン培養チューブに入れる。室温にて１５０×ｇで５分間、細胞を遠心する。
６）遠心に続いてチューブのフタを半回転緩め、ガス交換を可能にする。１０％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて３７℃の加湿雰囲気にチューブを入れる。２４時間ペレットをかき回さない。
７）無菌の１〜２００μｌのピペットチップによって古い培地を吸引し、各チューブに０．５ｍｌの新しく調製した軟骨形成用完全培地を加えることによって各チューブの培地を完全に置き換えることにより、細胞ペレットに２〜３日ごとに養分を与える。
８）培地を置き換え、ペレットが自由に浮いていることを確認した後、フタを緩め、チューブをインキュベータに戻す。
９）軟骨形成用培地にて種々の時点の後、ペレットを回収し、中性の緩衝化ホルマリンによる固定によって組織学用に調製し、及び／又はペレットを合わせ、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＭＤ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号７４１０４）を用いたＲＮＡ抽出用に調製する。
【００９９】
ＲＮＡ抽出のプロトコールはＱｉａｇｅｎハンドブックによって記載されたように従う。ＲＮＡの抽出に先立って、ＱｉａｇｅｎのＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（カタログ番号７９６５４）を用いて、試料をホモジネートし、次いでＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙミニキットで提供される）によって細胞ペレットを溶解することによってＲＮＡの収率を最大化する。
【０１００】
アルギン酸ビーズ分化プロトコール
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４アルギン酸」と呼ばれる。
【０１０１】
本発明の細胞を低速で遠心することによってペレットにし、ＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で洗浄し、再び遠心し、ペレットを２０×１０６にて１．２％アルギン酸（Ｌｏｎｚａ）に再浮遊した。２２ｇの針を介して細胞浮遊液をシリンジに引き入れ、ＣａＣｌ２槽（１０２ｍＭ）に一滴ずつ分配した。ゲル化は即座である。ＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で３〜５回ビーズを洗浄し、次いで軟骨形成用培地（ＴＧＦなしで）で１回洗浄し、その後、軟骨形成用培地に浸漬した。６穴プレートの複数のウェルにビーズを入れ、１週間に３日、１４日間養分を与えた。次いでビーズをＮａＣｌで複数回洗浄し、その後クエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）に２０分間暴露して脱重合した。遠心の後、ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）によって細胞ペレットを溶解し、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒを用いて収率を改善する破砕工程に続いて、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。上記のようなｑＰＣＲによってＣＯＬ２Ａ１の発現を測定した。
【０１０２】
軟骨細胞分化の遺伝子発現マーカー
本明細書に記載されるようなマイクロアレイ又はｑＰＣＲによって軟骨細胞の遺伝子発現をアッセイしてもよい。ｑＰＣＲプライマー配列は当該技術で既知の手段で選択してもよく、非限定の例証として、以下であってもよい。
【０１０３】
【０１０４】
ｑＰＣＲプロトコールは様々であってもよく、当該技術で周知である。非限定の例証として、ｃＤＮＡのＲＮＡ同等物３０ｎｇ，プライマー当たり０．４μＭ、超純度蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、全反応容量２５μｌでＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを組み入れる１２．５μｌのＰｏｗｅｒＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒミックス（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６７６５９）で１：１に希釈した試験用試料を標準の光学９６穴反応プレート（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３０６７３７）にて調製する。ＳＤＳｖ１．２ソフトウエアを採用するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲ方式を用いてリアルタイムｑＰＣＲを実行する。増幅条件は、５０℃にて２分間（段階１）、９５℃で１０分間（段階２）、９５℃で１５秒間、次いで６０℃で１分間を４０サイクル（段階３）、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の解離段階（段階４）にて設定する。当該遺伝子の増幅産物のＣｔ値を３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤ、ＲＰＳ１０及びＧＵＳＢ）のＣｔ値の平均に対して標準化する。
【０１０５】
サフラニンＯ染色アッセイ
軟骨関連のプロテオグリカンの検出では、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片のサフラニンＯによる染色の周知の技法が一般に使用されるが、それは、ムチン、肥満細胞顆粒、及びおそらくそのほかの細胞種におけるそのほかの物質も染色するので、アッセイは軟骨に絶対に特異的であるわけではない。軟骨とムチンが橙色〜赤色に染色され、核が黒く染色され、背景が緑色に染色されるプロトコールの非限定例は、ホルマリン固定した細胞の微細塊、ペレット又は類似の凝集体を使用する。使用される試薬には、Ｗｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン溶液：その中では、９５％アルコール１００ｍｌ中の１グラムのヘマトキシリンから構成されるストック溶液Ａ；蒸留水９５ｍｌと濃塩酸１．０ｍｌで希釈した２９％塩化第二鉄水溶液４ｍｌで構成されるストック溶液Ｂ；等量のストック溶液ＡとＢで構成され、４週間以内に使用されるＷｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン使用液；１０００ｍｌの蒸留水中の０．０１グラムのＦａｓｔＧｒｅｅｎ、ＦＣＦ、Ｃ．Ｉ．４２０５３で構成される０．００１％ＦａｓｔＧｒｅｅｎ（ＦＣＦ）溶液；９９ｍｌの蒸留水中１．０ｍｌの氷酢酸で構成される１％酢酸溶液；及び１００ｍｌの蒸留水中０．１グラムのサフラニンＯ、Ｃ．Ｉ．５０２４０で構成される０．１％サフラニンＯ溶液が含まれる。試料を脱パラフィンし、蒸留水で水和する。Ｗｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン使用液でそれらを１０分間染色し、次いで流水で１０分間洗浄し、ＦａｓｔＧｒｅｅｎ（ＦＣＦ）溶液で５分間染色し、１０〜１５秒間以下で１％酢酸溶液にて迅速にすすぎ、０．１％サフラニンＯ溶液で５分間染色し、それぞれ２回交換し、それぞれ２分間、９５％エチルアルコール、無水アルコール及びキシレンで脱水し、透徹し、樹脂媒体を用いて標本にし、上述のような染色について画像解析する。軟骨関連のプロテオグリカンは暗赤色〜橙色に染まる。
【０１０６】
低処理能力スクリーニング及びｑＰＣＲ
１，２，３，４，５又は好ましくは１０を超える多様な分化条件にて、＜２１、又は好ましくは＞２１のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０の倍増（細胞のクローン性増殖の２９倍増前は、限定された量でしか利用できず、７０倍増を超えると細胞は一般に老化に近づくので）における本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を同時にスクリーニングする。分化条件には、「微細塊分化」、「ペレット分化」及び「アルギン酸ビーズ分化」として記載されるものが含まれてもよい。
【０１０７】
アッセイの読み取りは、「軟骨細胞分化の遺伝子発現マーカー」として上述されたものを含むが、これらに限定されない軟骨細胞分化のｍＲＮＡマーカーであることができ、マイクロアレイ又はｑＰＣＲを含むが、これらに限定されないアレイ化標的配列へのハイブリッド形成によって測定することができる。検出はまた、特異抗体の使用を介して、酵素アッセイ、質量分光分析、又は当該技術で周知のそのほかの類似の手段の使用を介して検出されてもよいペプチド又はタンパク質のレベルであることもできる。
【０１０８】
クローン性又はオリゴクローン性の胚性前駆細胞の運命期間の中程度処理能力のスクリーニング
１０、２０、３０、４０、５０又は好ましくは１００を超える多様な分化条件（たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載された分化条件を参照）にて、＜２１、又は好ましくは＞２１のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０の倍増（細胞のクローン性増殖の２９倍増前は、限定された量でしか利用できず、７０倍増を超えると細胞は一般に老化に近づくので）における本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を同時にスクリーニングする。前記分化条件にて、１〜６週間、最も好ましくは４週間、細胞を培養する。
【０１０９】
アッセイの読み取りは、「軟骨細胞分化の遺伝子発現マーカー」のような軟骨細胞分化のｍＲＮＡマーカーであることができ、マイクロアレイ又はＰＣＲを含むが、これらに限定されないアレイ化標的配列へのハイブリッド形成によって測定することができる。検出はまた、特異抗体の使用を介して、酵素アッセイ、質量分光分析、又は当該技術で周知のそのほかの類似の手段の使用を介して検出されてもよいペプチド又はタンパク質のレベルであることもできる。
【０１１０】
ｈＥＰ細胞分化の中程度処理能力のｑＰＣＲスクリーニング
＜２１、又は好ましくは＞２１のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０の倍増にて上述されたものを含むが、これらに限定されない本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を１２ウェル培養プレートに入れ、各ウェルは２５０，０００細胞の１０微細塊（すなわち、ウェル当たり２５０万個の細胞）を有する。或いは、ほかの培養条件（たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載されたような；表ＩＩＩで列記された培養培地の組み合わせに暴露された同一数の細胞を用いた表ＩＩ及びこれらの出願の表ＩＶで列記された補完された因子を参照）によって細胞を処理する。前記分化条件にて、１〜６週間、最も好ましくは４週間、細胞を培養する。
【０１１１】
製造元の指示書に従って、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞溶解物からＲＮＡを調製する。手短には、細胞培養物（微細塊）をＰＢＳですすぎ、次いで最小限の量のＲＬＮ溶解緩衝液で溶解する。氷上でインキュベートした後、細胞残渣を遠心で取り除き、溶解物をＲＬＴ緩衝液と混合し、その後、エタノールを混合物に加える。次いで合わせた混合物をＲＮｅａｓｙスピンカラムに負荷し、遠心する。次いで負荷したカラムを洗浄し、精製されたＲＮＡを最少限の量のＤＥＰＣ処理水（通常３０μｌ以下）と共にカラムから解放する。最終溶離液中のＲＮＡの濃度は２６０ｎｍでの吸収によって測定する。
【０１１２】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡキット（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡ合成を行う。手短には、ランダムヘキサマーの存在下で２．５μｇの精製ＲＮＡを熱変性する。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素とキットからの関連試薬を用いて第１鎖反応を完了する。製造元の指示書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、得られた産物をさらに精製する。手短には、第１鎖ｃＤＮＡ反応の産物にＰＢ緩衝液を加え、次いで混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに負荷し、遠心する。カラムをＰＥ緩衝液で洗浄し、最少容量の水（２０μｌ）を用いて精製ｃＤＮＡをカラムから溶出する。
【０１１３】
各標的遺伝子についてｑＰＣＲプライマー対を合成する。手短には、標的ｍＲＮＡ配列のみを増幅し、６５〜８０℃の範囲にある標的配列のためのアニーリング温度と１００〜５００ｂｐのサイズ範囲にある独特の増幅産物を最適に有するように標的遺伝子用のプライマー対を設計する。特注のｑＰＣＲオープンアレイプレートの作製のためにプライマー対を使用濃度（１０μＭ）でＢｉｏＴｒｏｖｅ社に供給する。オープンアレイプレートは５６〜３３６のプライマー対を収容するように設計され、乾燥させたプライマー対を伴った最終製造されたプレートがサービス会社に提供される。オープンアレイ自動負荷装置（ＢｉｏＴｒｏｖｅ）を用いてオープンアレイプレートの個々のウェルに精製ｃＤＮＡ反応産物（２．）とＳｙｂｅｒグリーンマスターミックスを負荷する。プレートを密封し、増幅のためにＮＴイメージャー／サイクラー装置（ＢｉｏＴｒｏｖｅ）にｑＰＣＲを負荷する。各試料のＣｔ値は、オープンアレイ応用ソフトウエアを用いて算出する。
【０１１４】
応用
動物の細胞及び組織の培養に関して開示される方法は、たとえば、変形性関節症のような関節炎、椎間組織の変性、一時的な下顎関節の疾患、鼻、外耳、下顎関節、気管、輪状軟骨、胸骨、又はそのほかの滑膜関節、たとえば、肩、肘、手首、指及び体重がかかる関節、たとえば、尻、膝、足首及び足指を含むが、これらに限定されない整形外科症状の治療に有用なヒト細胞及び細胞に由来する製剤を生成することに限定されない、哺乳類及びヒトの細胞療法において細胞又はその前駆細胞を生成することに有用である。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞が、細胞生物学、細胞に基づく創薬、及び細胞療法に関連する障害の研究及び治療に利用される。本発明の方法を用いて導かれる単一細胞由来の細胞集団は、分化経路に向かう必要なシグナルをすでに受け取っていてもよい。
【０１１６】
本発明の特定の実施形態では、単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、それらが治療上の有用性を示すために通常存在している組織に導入される。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞が、ほかの多能性幹細胞の分化の誘導に利用される。試験管内で増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団は、ほかの多能性幹細胞の分化を誘導することにおいて有用である。細胞と細胞の相互作用は、早期胚において分化を指向する一般的な手段である。脊髄ニューロン、心臓細胞、膵臓β細胞及び限定的な造血細胞を含む多数の医学的に有用である可能性がある細胞種は、正常な胚発生の間での誘導シグナルに影響される。試験管内で増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団を種々の試験管内、胚内、又は生体内での条件で培養してそのほかの多能性幹細胞が所望の細胞種又は組織種になる分化を誘導することができる。誘導細胞を標的細胞と並置する種々の方法にて誘導を行ってもよい。非限定の例証として、誘導細胞を組織培養にてプレート培養し、マイトマイシンＣ又は放射線で処理して細胞のさらなる複製を妨げる。次いで細胞分裂上不活化された誘導細胞の上で標的細胞をプレート培養する。或いは、細胞のさらに大きな培養又は元々の単一細胞由来のコロニーから取り外し可能な膜の上で単一細胞由来の誘導細胞を培養してもよく、標的細胞を誘導細胞の上でプレート培養してもよく、又は標的細胞で覆った別の膜を、直接接触にて２つの細胞層を挟むように並置してもよい。細胞の得られる二重層を試験管内で培養し、ＳＰＦの鳥類の卵に移し、血管支援を受けながら三次元への増殖を可能にする条件で培養してもよい（たとえば、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年７月２８日に公開された国際特許公開番号ＷＯ２００５０６８６１０を参照）。誘導細胞はまた、誘導細胞を任意で取り除くことができるように自殺構築物が導入されている、ｈＥＳ及びｈＥＤ細胞を含む多能性幹細胞の起源に由来してもよい。単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の誘導に有用な細胞種には、正常な胚発生で天然に生じることが当該技術で周知である誘導の場合が挙げられてもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、多能性幹細胞を含むそのほかの細胞種の増殖を支援する「フィーダー細胞」として使用される。本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞のフィーダー細胞としての使用は、そのほかの哺乳類起源のフィーダー細胞からの病原体の標的細胞への伝染のリスクの可能性を緩和する。フィーダー細胞は、たとえば、γ線照射によって又はマイトマイシンＣ処理によって不活化されて複製を限定され、多能性幹細胞と共培養されてもよい。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を用いてあまり分化しない細胞を支援してもよい（たとえば、Stojkovic et al., Stem Cells (2005) 23(3):306-14を参照）。通常フィーダー細胞を必要とする特定の細胞種は、マトリクス上でのフィーダーのない培養で支援される（Rosler et al., Dev Dyn. (2004) 229(2):259-74）。たとえば、ＳＴＯマウス線維芽細胞株（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５０３）又はヒト胎盤線維芽細胞のようなマトリクス形成細胞株を予備培養し、溶解することによってマトリクスを堆積させることができる（ＷＯ９９／２０７４１を参照）。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態では、単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の培養物の順化培地を回収し、プールし、濾過し、順化培地として保存してもよい。この順化培地を製剤化し、研究及び治療で使用してもよい。そのような順化培地は、あまり分化しない状態を維持し、多能性幹細胞のような細胞の増殖を可能にすることに寄与してもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の培養物の順化培地を用いて多能性幹細胞を含むそのほかの細胞種の分化を誘導することができる。単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の培養物の順化培地の使用は、ほかの哺乳類起源に由来する非ヒト動物病原体に培養細胞を暴露するリスクの可能性を下げる点で有利であってもよい（すなわち、異種を含まない）。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、既知の細胞培養条件下では上手く増殖しない細胞種を誘導して、細胞周期の阻害を克服する因子の調節された発現、たとえば、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原（Ｔａｇ）、又は調節されたＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ、又はパピローマウイルスＥ６及び／又はＥ７、又はＣＤＫ４の調節された発現を介して本発明の方法に従ってそれらをクローンで又はオリゴクローンで単離することができるように増殖させてもよい（たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７を参照）。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、細胞周期の停止に優先する因子を追加のタンパク質又はタンパク質ドメインに融合し、細胞に送達してもよい。たとえば、細胞周期の停止に優先する因子をタンパク質変換ドメイン（ＰＴＤ）に連結してもよい。細胞周期の停止に優先する因子に共有結合する又は非共有結合するタンパク質変換ドメインは、前記因子の細胞膜を横切った移動を可能にするので、タンパク質は最終的に核に達する。細胞周期の停止に優先する因子と融合されてもよいＰＴＤには、ＨＩＶトランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）（Ｔａｔ４７〜５７）のＰＴＤが挙げられる（Schwarze and Dowdy 2000 Trends Pharmacol. Sci. 21: 45-48; Krosl et al. 2003 Nature Medicine (9): 1428-1432）。ＨＩＶのＴＡＴタンパク質については、膜転移活性を付与するアミノ酸配列は残基４７〜５７に相当する（Ho et al., 2001, Cancer Research 61: 473-477; Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16010-16017）。これらの残基のみでタンパク質の転移活性を付与することができる。
【０１２１】
本発明の別の実施形態では、ＰＴＤと細胞周期停止因子はリンカーを介して結合してもよい。リンカーの正確な長さと配列及び連結される配列に対する方向付けは様々であってもよい。リンカーは、たとえば、２、１０、２０、３０以上のアミノ酸を含んでもよく、たとえば、溶解性、長さ、立体分離などのような所望の特性に基づいて選択されてもよい。特定の実施形態では、リンカーは、たとえば、融合タンパク質の精製、検出、又は修飾に有用な官能配列を含んでもよい。
【０１２２】
本発明の別の実施形態では、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年８月３日に出願された米国特許出願第６０／７０５，６２５号、２００５年１０月２０日に出願された同第６０／７２９，１７３号、２００６年７月５日に出願された同第６０／８１８，８１３号に記載されたように、新規の再プログラム技法を介して本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を未分化状態に再プログラムしてもよい。手短には、第１の核リモデリング工程、第２の細胞再構築工程、工程２から生じる細胞の得られるコロニーが再プログラムの程度及び核型と質の正常性について特徴付けられる第３の工程が関与する少なくとも２工程、好ましくは３工程の過程を用いて細胞を未分化状態に再プログラムしてもよい。特定の実施形態では、分化した細胞の核エンベロープとクロマチンを未分化細胞又は生殖系列細胞の分子組成にさらによく似るようにリモデリングすることによって再プログラム過程の第１の核リモデリング工程にて、本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を再プログラムしてもよい。再プログラム過程の第２の細胞再構築工程では、移した核と一緒に、たとえば、増殖可能なＥＳ様細胞又はＥＤ様細胞のような未分化幹細胞の集団を生成することが可能である必要な有糸分裂装置を含有する細胞質泡状突起と、工程１のリモデリングされたエンベロープを含有する核を次いで融合する。再プログラム過程の第３の工程では、工程２の結果生じる１又は多数の細胞から生じる細胞のコロニーを、再プログラムの程度と核型の正常性について特徴付け、高い品質のコロニーを選択する。この第３の工程は細胞を上手く再プログラムするのに必要とされず、応用の一部では必要ではない一方で、第３の品質管理工程の包含は、再プログラムされた細胞が、たとえば、ヒトでの移植のような特定の応用で使用される場合好まれる。最終的に、正常な核型を有するが、十分な程度のプログラムを有さない再プログラムされた細胞のコロニーは、工程１と２又は工程１〜３を繰り返すことによって再利用される。
【０１２３】
本発明の別の実施形態では、単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を用いてファージディスプレイ法を用いたリガンドを生成してもよい（たとえば、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年５月２７日に出願された米国特許出願第６０／６８５，７５８号及び２００６年５月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２０５５２を参照）。
【０１２４】
遺伝子発現レベルの測定は、マイクロアレイ遺伝子発現解析、ビーズアレイ遺伝子発現解析及びノーザン解析を含むが、これらに限定されない、当該技術で既知の方法によって実施してもよい。遺伝子発現のレベルは、ＡＤＰＲＴ（受入番号ＮＭ＿００１６１８．２）、ＣＡＰＤ（受入番号ＮＭ＿００２０４６．２）又は当該技術で既知のそのほかのハウスキーピング遺伝子に対して標準化された相対発現として表されてもよい。遺伝子発現のデータは中央値法の中央値によって標準化されてもよい。この方法では、各アレイは異なった総強度を与える。中央値を使用することは、実験にて細胞株（アレイ）を比較する堅実な方法である。一例として、中央値は各細胞株について見い出され、次いでそれら中央値の中央値が標準化のための値になった。各細胞株からのシグナルは、他の細胞株のそれぞれに対して相対的なものとなった。
【０１２５】
本発明の別の実施形態では、本発明の単一細胞由来の細胞又はオリゴクローン性細胞由来の細胞は、細胞表面の抗原であるＣＤ抗原遺伝子の発現の独特のパターンを表してもよい。細胞表面におけるＣＤ抗原の差次的発現は、たとえば、市販の抗体を用いて、ＤＣ抗原が細胞によって発現されることに基づいて細胞を選別するためのツールとして有用であり得る。本発明の一部の細胞のＣＤ抗原の発現特性は、補完情報を含めて、参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８に示されている。たとえば、ＥＳ細胞では発現されるが、本発明の相対的にさらに分化した細胞では発現されない（又は場合によって、低レベルでしか発現されない）ＣＤ抗原がある。これは、ＥＳ細胞を選択する、選別する、精製する及び／又は特徴付けるための非常に有用なツールであり得る。ＣＤ抗原は細胞表面に発現され、それに対する抗体は、一般的に言って市販されているので、抗体（又はそれらの特定の組み合わせ）を用いて細胞の不均質な混合物からＥＳ細胞又は本発明の細胞の純粋な集団を精製することができる。このことは、ＥＳ細胞又は本発明の細胞を増殖させる、又は種々の商業目的でこれらの細胞を調製する様々な戦略で有用であり得る。
【０１２６】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞をマウスに注射して分化抗原に対する抗体を生じてもよい。分化抗原に対する抗体は、細胞療法のために、細胞分化における研究のために集団の純度を記録するように細胞を特定するのに、同様に移植後の細胞の存在と運命を記録するのに有用である。一般に、抗体を生じるための技法は当該技術で周知である。
【０１２７】
本発明の方法によって産生される細胞を遺伝子操作して大量のＢＭＰ３ｂ又はＢＭＰファミリーのほかのメンバーを産生することができるので、この細胞は骨消耗性疾患にて骨を誘導するのに有用であり得る。下顎の間充組織のマーカーを持つ４Ｄ２０．８と称する本発明の細胞株の場合、たとえば、ＢＭＰ３ｂ又はＢＭＰファミリーのほかのメンバーのような因子の過剰発現は、骨壊死又は下顎のような骨の骨折の治療に有用である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態では、軟骨形成を経験することが可能である単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、非ヒト動物種から生成され、獣医疾患の治療に使用されてもよい。
【０１２９】
本発明の別の実施形態では、軟骨形成を経験することが可能である単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を実験的に用いて、ヒト及び非ヒトの生体における多様な軟骨種をもたらす転写調節ネットワークを含む軟骨細胞の分化における研究を実施してもよい。
【０１３０】
組み合わせ
明瞭性のために別々の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態における組み合わせにて提供されてもよいことが十分に理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴はまた別々に又は好適な下位の組み合わせで提供されてもよい。対象となる胚性軟骨細胞前駆細胞の遺伝子発現パターンに関する実施形態の組み合わせはすべて本発明によって包含され、それぞれ及びあらゆる組み合わせが個々に且つ明白に開示されたかのように本明細書で開示される。従って、記載されるマーカーを示す胚性軟骨細胞前駆細胞が本明細書で提供される。
【０１３１】
システム及びキット
本発明によって提供されるのはまた、本明細書で記載されるような種々の応用で使用するために設計されたシステム及びキットである。
【０１３２】
たとえば、本発明の態様に係るシステム及びキット（一般に以下のように「キット」と呼ばれる）には、本発明の１以上の胚性軟骨細胞前駆細胞株が含まれる。キットはさらに、使用のための指示書と同様に、研究及び／又は治療応用のための細胞の増殖及び使用のための試薬及び材料を含んでもよい。キットはまた、上記で名付けたプロトコール：微細塊分化プロトコール１、微細塊分化プロトコール２、微細塊分化プロトコール３、ペレット分化プロトコール及びアルギン酸ビーズ分化プロトコールに記載された材料のような、細胞の軟骨細胞への分化を誘導するのに本明細書で使用される試薬も含有してもよい。
【０１３３】
一部の実施形態では、キットは軟骨産生用に設計され、本明細書で記載される１以上の胚性軟骨細胞前駆細胞株と、細胞を増殖する及び／又は軟骨形成を誘導するのに使用される１以上の追加の成分を含む。そのようなキットで提供される胚性軟骨細胞前駆細胞株は、たとえば、細胞株：ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１及び７ＰＥＮＤ２４のそれのような、本発明の胚性前駆細胞の遺伝子発現マーカーを表示する。増殖及び／又は軟骨細胞分化のための成分には、マトリクス又は足場（又はマトリクス／足場を生成する、たとえば、ヒドロゲルを生成するための試薬）、水和剤（たとえば、生理学的に適合性の生理食塩水溶液、調製された細胞培養培地）、細胞培養上清（たとえば、培養ディッシュ、プレート、バイアル等）、細胞培養培地（液体形態であれ、粉末形態であれ）、抗生剤化合物、ホルモン、添加剤等を含む、そのような目的で本明細書に記載される任意の成分を挙げることができる。
【０１３４】
特定の実施形態では、キットはさらに、たとえば、実験動物への又はそれを必要とする患者、たとえば、軟骨修復療法／置換療法を必要とする患者への細胞集団の送達を円滑にするように設計された成分を含んでもよい。これら後者の実施形態では、キットの成分は、治療上の使用に好適な形態で提供されてもよい（たとえば、無菌／医療等級の成分として提供される）。送達成分には、細胞集団を被包する又は不動化するために設計されたもの（たとえば、足場又はマトリクス）、同様に、直接、又は、欠陥部位に単離した細胞を注入すること、好適な足場若しくはマトリクスと共に胚性前駆細胞を培養し、埋め込むこと、生体吸収性の足場と共にインキュベートすることを含む、そのほかの成分と関連して細胞を送達するために設計されたものが挙げられる。上記で詳述されたような生体吸収性、生体適合性の足場のような好都合な足場又はマトリクスを採用してもよく、治療用の軟骨修復／置換での使用のために多数が採用されており、又は試験されている。
【０１３５】
一部の実施形態では、キットは、送達された／移植された細胞集団が少なくとも１つの所望の部位、たとえば、軟骨損傷の部位に局在することを判定するのに使用するための成分を含む。そのような成分は、対象に送達された細胞の局在化及びさらに定量化の判定を可能にし得る。
【０１３６】
特定の実施形態では、キットにおける胚性軟骨細胞前駆細胞の株（単数）又は株（複数）を遺伝子操作する。たとえば、胚性軟骨細胞前駆細胞株を操作して外因性遺伝子、たとえば、細胞株に由来する細胞を後で特定するのに使用することができるマーカー遺伝子（たとえば、当該技術で周知のようなレポーター遺伝子）を発現させてもよい。レポーター遺伝子には、直接又は間接的に検出可能であるもの、たとえば、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素、細胞表面マーカーなどが挙げられる。特定の実施形態では、異なった細胞株を再操作して、互いに識別可能な外因性レポーター遺伝子、たとえば、異なった励起及び／又は放射の特徴を有する蛍光タンパク質を発現させる。
【０１３７】
特定の実施形態では、キットは、その用途に必要な成分のいずれか又はすべてを含むことができる。たとえば、本発明に係るキットは、多数のそのほかの好適な物品又は成分、たとえば、人工関節、チューブ、縫合糸、外科用メス、針、シリンジ、手術部位の用意のための消毒剤、整形外科用具等を含んでもよい。
【０１３８】
本発明の態様では、追加の種類のキットも提供される。
【０１３９】
たとえば、本発明に係る軟骨細胞前駆細胞の特定及び／又は単離のためにキットが提供される。そのようなキットには、本明細書で記載される遺伝子発現マーカーのいずれかを含む細胞マーカーの発現を検出するために設計された試薬が含まれる。そのような検出試薬が製剤化されてタンパク質レベル又は核酸（たとえば、ｍＲＮＡ）レベルのいずれかでこれら遺伝子の発現産物を検出してもよい。従って、試薬には、抗体又はその特異的結合部分（たとえば、検出可能に標識された抗体）、そのほかの特異的結合剤（たとえば、リガンド又は可溶性受容体）、ハイブリッド形成の解析、たとえば、ノーザンブロット解析、マイクロアレイ解析などで使用するための核酸プローブ、ＰＣＲアッセイ、たとえば、上記で詳述されたような定量ＰＣＲアッセイで使用するためのプライマー対、等が挙げられてもよい。
【０１４０】
上記で言及したように、本キットは通常さらに、本方法を実践する、たとえば、本方法の態様に従って変異法を実施するために核酸試料を調製するためのキットの成分を使用するための指示書を含む。本方法を実践するための指示書は一般に、好適な記録媒体に記録される。たとえば、指示書は、たとえば、紙又はプラスチック等のような基材に印刷されてもよい。従って、指示書は、キットの容器のラベル又はそのコメント等にて（すなわち、包装又は下位包装と関連して）添付文書としてキットに存在してもよい。ほかの実施形態では、指示書は、好適なコンピュータ読み取り保存媒体、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスク等に存在する電子保存データファイルとして存在する。さらにほかの実施形態では、実際の指示書は、キットには存在せず、たとえば、インターネットを介した遠隔供給源から指示書を入手する手段が提供される。この実施形態の例は、指示書を見ることができる及び／又は指示書をダウンロードすることができるＷｅｂアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を入手するためのこの手段は好適な基材に記録される。
【０１４１】
上記で言及した成分に加えて、キットはまた、１以上の対照試料及び試薬、たとえば、２以上の対照試料も含む。そのような対照試料は、任意の形態、たとえば、既知のマーカー特性を有する追加の細胞株、遺伝子発現データを解析するのに使用するための陰性及び陽性の対照試料、等の形態を取ってもよい。本キットでは、任意の対照試料を採用してもよい。
【０１４２】
生物寄託
本出願で記載される細胞株は、ブタペスト条約のもとでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」：米国、ＶＡ、２０１０８，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９）に寄託されている。細胞株４Ｄ２０．８（ＡＣＴＣ８４としても知られる）は、継代１１で２００９年７月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２３１を有する。細胞株ＳＭ３０（ＡＣＴＣ２５６としても知られる）は、継代１２で２００９年７月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２３２を有する。細胞株７ＳＭＯＯ３２（ＡＣＴＣ２７８としても知られる）は、継代１２で２００９年７月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２３３を有する。細胞株Ｅ１５（ＡＣＴＣ９８としても知られる）は、継代２０で２００９年９月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０３４１を有する。細胞株ＭＥＬ２（ＡＣＴＣ２６８としても知られる）は、継代２２で２０１０年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１１５０を有する。細胞株ＳＫ１１（ＡＣＴＣ２５０としても知られる）は、継代１３で２０１０年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１１５２を有する。細胞株７ＰＥＮＤ２４（ＡＣＴＣ２８３としても知られる）は、継代１１で２０１０年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１１４９を有する。
【０１４３】
実施例
以下の実施例は、本発明を如何に作製し、使用するかの完全な開示と記載を当業者に提供できるように提起されるものであって、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された実験すべて、又はそれのみであることを表すことを意図するものではない。使用された数（たとえば、量、温度等）について精度を確保するように尽力したが、一部の実験の誤差及び偏差は説明されるべきである。特に指示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれに近い。
【０１４４】
実施例１
軟骨形成分化条件の低処理能力選抜におけるヒトのクローン性胚性前駆細胞株のマイクロアレイ解析
細胞株、１０ＲＰＥ８、４Ｄ２０．８、４Ｄ２０．９、４ＳＫＥＬ２０、７ＰＥＮＤ１２、７ＰＥＮＤ２４、７ＰＥＮＤ３０、７ＰＥＮＤ９、７ＳＫＥＬ４、７ＳＫＥＬ７、７ＳＭＯＯ２５、７ＳＭＯＯ３２、７ＳＭＯＯ７、７ＳＭＯＯ９、Ｂ１６、Ｃ４．４、Ｃ４ＥＬＳ５．１、Ｃ４ＥＬＳ５．６、Ｃ４ＥＬＳＲ１０、Ｃ４ＥＬＳＲ２、ＣＭＯ２、Ｅ１０９、Ｅ１１１、Ｅ１２０、Ｅ１５、Ｅ１６４、Ｅ３３、Ｅ４４、Ｅ６８、Ｅ６９、Ｅ８５、ＥＮ１、ＥＮ１３、ＥＮ１６、ＥＮ１８、ＥＮ２、ＥＮ２２、ＥＮ２３、ＥＮ２６、ＥＮ２７、ＥＮ３１、ＥＮ４、ＥＮ４２、ＥＮ４７、ＥＮ５、ＥＮ５１、ＥＮ５５、ＥＮ７、ＥＮ８、Ｆ１５、Ｊ１６、ＭＥＬ２、ＭＥＬ２、ＭＷ１、ＲＡＤ２０．１６、ＲＡＤ２０．１９、ＲＡＤ２０．４、ＲＡＤ２０．５、ＲＡＤ２０．６、ＲＡＰＥＮＤ１０、ＲＡＰＥＮＤ１５、ＲＡＰＥＮＤ１８、ＲＡＳＫＥＬ８、ＲＡＳＭＯ１２、ＲＡＳＭＯ１９、ＳＫ１１、ＳＫ１７、ＳＫ１８、ＳＫ２５、ＳＫ３１、ＳＫ３５、ＳＫ４３、ＳＫ４４、ＳＫ４６、ＳＫ４７、ＳＫ４９、ＳＫ５０、ＳＫ５２、ＳＭ１７、ＳＭ２、ＳＭ２２、ＳＭ２８、ＳＭ２８、ＳＭ３０、ＳＭ３３、ＳＭ８、Ｔ１４、Ｔ２０、Ｔ３６、Ｔ４２、Ｔ４３、Ｔ４４、Ｔ７、Ｕ３１、Ｗ１０、Ｗ１１、Ｗ８、Ｚ１、Ｚ１１、Ｚ２及びＺ３を「微細塊分化プロトコール１」として上述のように選抜し、サブセットを「ペレット分化」及び「アルギン酸ビーズ分化」として分化させた。手短には、対照の細胞種：継代３のヒト骨髄間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ）、脂肪細胞幹細胞（ＡＳＣ）、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、包皮皮膚線維芽細胞（ＸｇｅｎｅＦＢ）、及び正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）を選抜に含めた。本明細書で記載されるように、同様にそれぞれ参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載されたように、選抜される細胞株並びに上述の対照の細胞種を５％の外気酸素を伴ったインキュベータにて、増殖停止又は微細塊及びペレットの軟骨形成条件にて同期化した。例証として、静止における同期化を誘導する条件については、通常製造元に推奨された濃度で補完剤を伴い、完全キットとして（カタログ番号Ｃ−２２０２２）として販売されているＰｒｏｍｏｃｅｌｌ内皮ＭＶ２培地にて細胞が集密に達するまで、細胞株７ＰＥＮＤ２４（ＡＣＴＣ２８３）を培養した。集密に達した際、培地を取り除き、元々の補完剤ミックスの１０％を伴った同一のＰｒｏｍｏｃｅｌｌ培地に置き換えた。３日後、培地を吸引し、さらに２日間（合計静止条件で５日間）、同一培地（すなわち、１０％の通常補完剤）で置き換えた。細胞株４Ｄ２０．８（ＡＣＴＣ８４）の場合、細胞が集密に達するまで、２０％ＦＣＳを補完したＤＭＥＭ培地で細胞を培養した。集密に達すると、培地を取り出し、元々の濃度の１０％（すなわち、２％ＦＣＳ）を伴った同一のＤＭＥＭ培地に置き換えた。３日後、培地を吸引し、同一の培地（すなわち、２％ＦＣＳを伴ったＤＭＥＭ）でさらに２日間（すなわち、合計で静止条件の５日間）、置き換え、又はペレット若しくは微細塊として軟骨形成条件にて１２日間若しくは１４日間分化させた。本明細書で記載されるようにＲＮＡを回収し、ｑＰＣＲによってアッセイし、本明細書で記載されるように遺伝子発現解析のためにＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアッセイとハイブリッド形成させた。骨髄の間葉幹細胞は、軟骨細胞遺伝子発現の顕著な上方調節と共にペレット及び微細塊双方の軟骨形成条件に反応した。軟骨細胞の分化マーカーの例には、軟骨に特異的ではないが、軟骨形成中に上方調節されるＭＧＰ及びＰＥＮＫ、軟骨の発生に相対的に特異的であるＣＯＬ２Ａ１、ＭＡＴＮ４、ＥＰＹＣ、ＣＯＬ９Ａ２及びＬＥＣＴ１が挙げられる。細胞株４Ｄ２０．８における未分化条件と１４日目の微細塊条件における遺伝子発現の比較は、＞４７９倍のＭＧＰの発現、＞１０倍のＭＡＴＮ４の発現、＞３６９倍のＰＥＮＫの発現、＞６０倍のＣＯＬ２Ａ１の発現、＞４２倍のＥＰＹＣの発現、＞２５倍のＣＯＬ９Ａ２の発現、＞２４倍のＬＥＣＴ１の発現を示し、同様に、ＭＳＣでは、分化は、５倍のＭＧＰの発現（４Ｄ２０．８とは異なって、未分化のＭＳＣは発現の相対的に高いベースレベルを示したが）、２０倍のＭＡＴＮ４の発現、６倍のＰＥＮＫの発現（再び、未分化の４Ｄ２０．８では未発現であるのに比べて未分化のＭＳＣでは相対的に高いレベル）、６１３倍のＣＯＬ２Ａ１の発現、４８倍のＥＰＹＣの発現、１１７倍のＣＯＬ９Ａ２の発現、３４倍のＬＥＣＴ１の発現の上方調節を示した。それに対して、皮膚線維芽細胞は、３７倍のＭＧＰの発現の上方調節を示したが、実験処理の前後でＣＯＬ２Ａ１、ＥＰＹＣ、ＬＥＣＴ１又はＣＯＬ９Ａ２の発現は示されなかった。従って、皮膚線維芽細胞とは異なって、４Ｄ２０．８は、ＭＳＣとは同一ではないが、ＭＳＣと類似の多様な軟骨特異的遺伝子を発現した。２４，５２６個の評価した遺伝子の中で、２６５個の遺伝子はＭＳＣの分化の間に発現の上昇を示し、１９１は４Ｄ２０．８の分化の間に発現の上昇を示したが、共通するのはたった４７個の遺伝子だった。従って、細胞株４Ｄ２０．８は、ＬＨＸ８の発現を示さないが、代わりにたとえば、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＣ８及びＨＯＸＤ１３のような尾部ＨＯＸ遺伝子、及び下肢に特徴的なＰＩＴＸ１の発現を示したＭＳＣとは異なって、口蓋及び下顎の部位特異的ＬＨＸ８ホメオボックス遺伝子の発現を伴い、ＨＯＸ又はＰＩＴＸ１を発現しないＭＳＣとは識別可能な細胞株を代表する。細胞株７ＰＲＮＤ２４も低レベルで軟骨形成の誘導を示した。
【０１４５】
ＭＳＣ及び正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）と共に軟骨形成条件の１４日の前後で細胞株のマイクロアッセイによってアッセイしたＣＯＬ２Ａ１の誘導レベルを「ＣＯＬ２Ａ１」と題するグラフで図２に示す。図２でも見ることができるように、軟骨の共通する成分であるＬＥＣＴ１の遺伝子も細胞株で誘導されるが、細胞株では差次的に発現される。永続軟骨（肥大軟骨細胞に対して）のマーカーとして元々特徴付けされた遺伝子であるＣＲＴＡＣ１は実際、ＮＨＡＣでは発現されるが、ＭＳＣでは発現されず、本発明の細胞株では様々な程度に発現される。肥大軟骨細胞で発現されるマーカーＩＨＨは、ＮＨＡＣでは発現されず、ＭＳＣで発現されるが、本発明の細胞では発現されないということは、それらがＭＳＣとは識別可能であり、安定な軟骨への前駆細胞である可能性があることに一致する。ＭＳＣのマーカーであるが、線維芽細胞のマーカーではないとして元々特徴付けされた遺伝子であるＣＤ７４は、脂肪細胞幹細胞（ＡＳＣ）、ＭＳＣで発現されるが、ＮＨＡＣ又は本発明の細胞では発現されない。最後に、下顎間充組織のマーカーであるＬＨＸ８は、ＮＨＡＣ、ＡＣＳでは発現されないが、下顎の神経堤に起源と一致する歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）では発現され、細胞株４Ｄ２０．８において発現される。
【０１４６】
微細塊の１４日後、及び記載されたようなこれら細胞株のペレットの軟骨形成条件のサブセットでは、細胞株、７ＰＥＮＤ２４、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、ＳＭ３０及びＥ１５が、分化の誘導の際、顕著に高いＣＯＬ２Ａ１の発現を示し、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、Ｅ１５及びＳＭ３０は、正常ヒト関節軟骨細胞よりも相対的に高いレベルの転写物を発現した。際立って、＞１，０００ほど高いＣＯＬ２Ａ１を発現している株ＳＭ３０。当該技術で周知のように、使用した細胞のロットや継代数で大きく変化することが認められているが、継代３の骨髄間葉幹細胞は、転写物があったにしてもほとんど発現しなかった。ＣＯＬ２Ａ１の発現は、ＡＳＣ、ＤＰＳＣ又はＸｇｅｎｅＦＢでは認められなかった。細胞株は、たとえば、中胚葉と神経堤のマーカーであるＴＢＸ５とＨＡＮＤ２のような種々のマーカーの組み合わせを発現するので、軟骨形成の多様な種類のモデル化及び臨床上の細胞に基づいた治療法にて有用である。加えて、それらは、生体にて軟骨の部位特異的な独特の機械的特性を生成する種々の部位特異的ホメオボックス遺伝子を示す。非限定の例証として、細胞株４Ｄ２０．８は、たとえば、二次口蓋を生成すること、下顎を再構築すること、又は口蓋裂、歯周病の修復、歯の神経堤の成分を形成することが可能である細胞を寄与させることによって歯芽を再構築すること、下顎領域の真皮、下顎領域の末梢神経若しくは色素細胞を再構築すること、又は歯肉萎縮を修復することを含むが、これらに限定されない神経堤下顎間充組織のそのほかの派生物を再構築することのような、口周囲間充組織のマーカーであるマーカー遺伝子ＬＨＸ８を強く発現する。
【０１４７】
実施例２
ｈＭＳＣで以前明らかにしたように、外因性細胞の投与を用いて、ヒツジにおける中央若しくは外側の半月板切除又はＡＣＬ切除の後の関節の軟骨及び半月板の傷害と修復を判定することができる（双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられるGhosh, et al., Clin. Orthop., Vol. 252, pgs. 101-113, 1990; Little, et al., J. Rheumatol., Vol. 11, pgs. 2199-2209, 1997）。ｈＥＳに由来する細胞に対するヒツジにおける寛容は、ｈＥＳ由来細胞の出生前移植によって達成される。ヘクステンド、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン又はそのほかの足場／マトリクス（たとえば、脱細胞化した半月板）を含む１以上の医薬キャリアと共に、たとえば、７ＰＥＮＤ２４、７ＳＭＯＯ３２、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８のようなｈＥＳ−、ｉＰＳ−に由来する胚性前駆細胞、並びにｈＭＳＣ及びＨＡの対照の漸増用量を寛容化したヒツジの関節に注入する。傷害の修復速度を漸増投与量に反応して時間をかけて測定する。ヒト成人ＭＳＣ及び媒体対照と比べた再注入、奇形腫の形成、及び効率について移植した細胞を組織学的に評価する。
【０１４８】
実施例３
長い継代にわたって胚性軟骨細胞前駆細胞の安定性をアッセイすること
我々が３０の倍増を超えて成人の骨髄ＭＳＣを継代するのは不可能だったが、我々は、４Ｄ２０．８と称する本発明の細胞株を３３回の継代を超えて培養した。我々は、ＣＯＬ２Ａ１の発現によって測定され、継代１２と継代３３にて本明細書で記載されるようなｑＰＣＲによってアッセイされる軟骨を誘導するその細胞の能力を比較した。長い継代での細胞は並行した実験におけるＭＳＣのそれとは異なって、匹敵するレベルのＣＯＬ２Ａ１を産生した。各継代が１．５の倍増である継代１２での使用細胞集合からさらなる継代２１以上に細胞を規模拡大する能力は、使用細胞集団よりおよそ５２倍増又は２５０多い細胞に相当する。従って、細胞は、多数の患者における同種移植について商業的に規模拡大されるその可能性において独特である。
【０１４９】
実施例４
本発明の選択された軟骨形成性細胞株におけるＣＤ抗原を認識する抗体のスクリーニング
本発明の軟骨形成性細胞株をＣＤ抗原に対する抗体のライブラリに対して中程度の処理能力法にてアッセイし、陽性細胞の比率を以下（表２）に示すが、それらは、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載された予測された抗原の一般的な有用性を明らかにしている。しかしながら、例外も特定することができる。特に、抗原ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）は細胞株４Ｄ２０．８の８０％に結合するが、調べたほかの細胞株の極一部しか結合しない。このことは、マイクロアレイのデータにおけるＮＣＡＭ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａプローブ、ＩＤ４０４０７２５）の相対的に高いレベルと一致する。従って、ＣＤ５６に対する抗体は、本明細書で記載される細胞株４Ｄ２０．８の遺伝子発現マーカーを持つ細胞のアフィニティ精製に有用である。
【０１５０】
【０１５１】
実施例５．
ＮＮＡＴ陽性軟骨形成性前駆細胞株の発見
元々クローン増殖させたのと同じ培地である２０％血清を補完したＤＭＥＭ培地にて連続継代を行うことにとって継代１７での細胞株Ｅ１５（ＡＣＴＣ９８としても知られる）を増殖させた（参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８かの補完表Ｉを参照）。継代１４と１７にて、細胞がいったん集密に達すると培地を取り除き、１０倍低下した血清（２％）を補完した新鮮なＤＭＥＭによって培地を置き換えることによって細胞を静止期に同期化した。３日後、培地を吸引し、２％のＦＣＳを補完した新鮮なＤＭＥＭでさらに２日間置き換えた。同一継代の細胞を微細塊条件及びペレット条件の双方でプレート培養し、本明細書で記載されるように軟骨形成を誘導した。微細塊培養の１４日後、同一条件下で培養した細胞株Ｅ１５と正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）対照を特異的マーカー（以下の実施例６を参照）の発現についてｑＰＣＲによってアッセイした。Ｅ１５は、ＮＨＡＣ対照よりも＞１０，０００多いＣＯＬ２Ａ１のｍＲＮＡを発現することが認められた。１４日目の微細塊を固定し、上述のようにサフラニンＯで染色した。試料は、軟骨プロテオグリカンを強く染色した。細胞をさらに特徴付けるために、本明細書で記載されるように、ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアッセイとハイブリッド形成させた。
【０１５２】
実施例６．
ｑＰＣＲによる軟骨形成性前駆細胞のスコア化のための低処理能力選抜
１０ＲＰＥ８、４Ｄ２０．８、４Ｄ２０．９、４ＳＫＥＬ２０、７ＰＥＮＤ１２、７ＰＥＮＤ２４、７ＰＥＮＤ３０、７ＰＥＮＤ９、７ＳＫＥＬ４、７ＳＫＥＬ７、７ＳＭＯＯ２５、７ＳＭＯＯ３２、７ＳＭＯＯ７、７ＳＭＯＯ９、Ｂ１６、Ｃ４．４、Ｃ４ＥＬＳ５．１、Ｃ４ＥＬＳ５．６、Ｃ４ＥＬＳＲ１０、Ｃ４ＥＬＳＲ２、ＣＭＯ２、Ｅ１０９、Ｅ１１１、Ｅ１２０、Ｅ１５、Ｅ１６４、Ｅ３３、Ｅ４４、Ｅ６８、Ｅ６９、Ｅ８５、ＥＮ１、ＥＮ１３、ＥＮ１６、ＥＮ１８、ＥＮ２、ＥＮ２２、ＥＮ２３、ＥＮ２６、ＥＮ２７、ＥＮ３１、ＥＮ４、ＥＮ４２、ＥＮ４７、ＥＮ５、ＥＮ５１、ＥＮ５５、ＥＮ７、ＥＮ８、Ｆ１５、Ｊ１６、ＭＥＬ２、ＭＥＬ２、ＭＷ１、ＲＡＤ２０．１６、ＲＡＤ２０．１９、ＲＡＤ２０．４、ＲＡＤ２０．５、ＲＡＤ２０．６、ＲＡＰＥＮＤ１０、ＲＡＰＥＮＤ１５、ＲＡＰＥＮＤ１８、ＲＡＳＫＥＬ８、ＲＡＳＭＯ１２、ＲＡＳＭＯ１９、ＳＫ１１、ＳＫ１７、ＳＫ１８、ＳＫ２５、ＳＫ３１、ＳＫ３５、ＳＫ４３、ＳＫ４４、ＳＫ４６、ＳＫ４７、ＳＫ４９、ＳＫ５０、ＳＫ５２、ＳＭ１７、ＳＭ２、ＳＭ２２、ＳＭ２８、ＳＭ２８、ＳＭ３０、ＳＭ３３、ＳＭ８、Ｔ１４、Ｔ２０、Ｔ３６、Ｔ４２、Ｔ４３、Ｔ４４、Ｔ７、Ｕ３１、Ｗ１０、Ｗ１１、Ｗ８、Ｚ１、Ｚ１１、Ｚ２及びＺ３と名付けられた本発明の細胞株は、ｈＥＳ由来の細胞から単離し、集密まで増殖させ、本明細書で記載されるような血清又はそのほかのマイトジェンを１０倍減らして補完した培地で培地を置き換えることによって静止期に同期化させたので、それらを試験管内で＞２１の倍増でクローン増殖させた。試験管内で軟骨形成が可能である細胞についての低処理能力選抜では、細胞を微細塊条件で培養し、本明細書で記載されるように１４日間、軟骨形成を誘導した。これら２つの条件のそれぞれからのＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次いで軟骨形成に一般に関連する遺伝子（すなわち、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＭＰ、ＣＩＬＰ、ＳＣＸ、ＣＲＴＬ１、ＳＯＸ９、ＢＡＲＸ２）の発現について調べた。遺伝子特異的なプライマー対プローブはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｃＤＮＡのＲＮＡ同等物３０ｎｇ，プライマー当たり０．４μＭ、超純度蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、全反応容量２５μｌでＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを組み入れる１２．５μｌのＰｏｗｅｒＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒミックス（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６７６５９）で１：１に希釈した試験用試料を標準の光学９６穴反応プレート（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３０６７３７）にて調製した。ＳＤＳｖ１．２ソフトウエアを採用するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲ方式を用いてリアルタイムｑＰＣＲを実行した。増幅条件は、５０℃にて２分間（段階１）、９５℃で１０分間（段階２）、９５℃で１５秒間、次いで６０℃で１分間を４０サイクル（段階３）、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の解離段階（段階４）にて設定した。当該遺伝子の増幅産物のＣｔ値を３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤ、ＲＰＳ１０及びＧＵＳＢ）のＣｔ値の平均に対して標準化し、早期継代の正常ヒト膝関節軟骨細胞（Ｌｏｎｚａ）及び培養されたヒト骨髄間葉幹細胞に対して遺伝子発現を解析した。
【０１５３】
関節形成遺伝子を検出するのに使用したプライマーセットは上述したものであり；選抜される細胞株について培養された早期継代の正常ヒト関節軟骨細胞と比較して倍数発現として表現されたＣＯＬ２Ａ１の発現を図１に示す。早期継代の正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）を１．０の値として設定する。ＮＨＡＣと比較して−倍誘導として定量化されるＣＯＬ２Ａ１の発現レベルは、細胞株の大半では顕著には上昇しなかったが、細胞株の小さなサブセットでは際立って上昇し、すなわち、７ＳＭＯＯ３２技術複製２（ＮＨＡＣの１５４倍の発現）、７ＳＭＯＯ３２生物複製２（ＮＨＡＣの１３７倍の発現）、４Ｄ２０．８生物複製２（ＮＨＡＣの１３０倍の発現）、ＳＭ３０（ＮＨＡＣの１２８７倍の発現）、ＳＭ３０生物複製２（ＮＨＡＣの１３，４９４倍の発現）、ＳＭ３０技術複製２（ＮＨＡＣの１１６８倍の発現）、Ｅ１５（ＮＨＡＣの１０，８０９倍の発現）、Ｅ１５技術複製２（ＮＨＡＣの９８１０倍の発現）、ＭＥＬ２（ＮＨＡＣの２２倍の発現）及びＳＫ１１（ＮＨＡＣの４倍の発現）。
【０１５４】
驚くべきことに、ＣＯＬ２Ａ１の誘導とＳＯＸ９のような関節形成間充組織の一般に使用されるマーカーとの相関はほとんどないか、少なかった。同様に、軟骨形成性間葉細胞のマーカーであると推測されているＡＱＰ１のようなマーカーは、微細塊軟骨形成条件でＣＯＬ２Ａ１を誘導しない包皮皮膚線維芽細胞のＲＦＵ値にて存在したが、分化前及び分化後の本発明の細胞株には存在しなかった。たとえば、分化に先立って、ＡＱＰ１の発現は、クローン増殖の１８〜２１の倍増にて、細胞株ＳＭ３０には存在せず（バックグランドであるＲＦＵ１３５）、ＳＫ１１には存在せず（１２６のＲＦＵ）、細胞株Ｅ１５には存在しなかった（ＲＦＵ１３９）（Ｗｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表ＩＩを参照）。どちらも、本発明の細胞株は軟骨形成が可能であるかどうかを予測することにおいて予測値の本発明の未分化細胞株におけるＳＯＸ９の発現レベルではなかった。実際、軟骨細胞になってそのような予後を予測するこれら細胞株の可能性と十分に相関する、分化に先立つ未分化の細胞株では遺伝子を見つけることができなかった。部位特異的なホメオボックス遺伝子発現を含むＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５の群の範囲内での遺伝子発現マーカーの多様性は、各細胞株が独特で且つ識別可能な軟骨形成性前駆細胞を代表することを示唆している。同様に驚くべきことは、たとえば、ＣＯＭＰ及びＣＩＬＰのような試験管内での軟骨形成のマーカーとして一般に使用される遺伝子の多くが、ＣＯＬ２Ａ１の発現によって及び軟骨形成の組織学的証拠を示すことによって証拠付けられるのと同一の条件下で皮膚線維芽細胞が、たとえば、本当の軟骨形成を経験することが可能であるかどうかにかかわりなく、培養された皮膚線維芽細胞を含む事実上任意の細胞種にて非特異的な方法での培養条件で誘導されることであった。加えて、細胞株ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５は、分化の前と後の双方での遺伝子発現マーカーに関して培養された骨髄ＭＳＣとは明瞭に識別可能だった。骨髄のＭＳＣは一般にＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）陽性として記載されるが、たとえば、ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５のような未分化状態での本発明の細胞株は、ＣＤ１６６の発現は細胞株ＳＭ３０では存在せず（バックグランドであるＲＦＵ１２５）、ＳＫ１１では存在しなかった（１６４のＲＦＵ）（Ｗｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表ＩＩを参照）。非限定の例証としてＭＳＣと比較した場合の本発明の細胞株の追加の差異は、実際には特異的ではない一般的に使用されるマーカーの多くよりもさらに正確なＭＳＣのマーカーであることが明らかにされているＣＤ７４の発現である（Ishii et al, 2005 BBRC 332:297-303）。表３に示されるように、未分化のＭＳＣは実際非常に高いレベルのＣＤ７４転写物を発現し、脂肪細胞幹細胞は低レベルで同様にＣＤ７４を発現し、歯髄幹細胞は検出の限界でＣＤ７４を発現したが、その転写物は、ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５を含むＣＯＬ２Ａ１を誘導可能な本発明の未分化細胞でも、培養された皮膚線維芽細胞でも非軟骨形成性の胚性前駆細胞株７ＳＭＯＯ７でも全く検出されなかった。細胞株の多様性及び本明細書で検討される成人幹細胞種での際立った差異を示す追加の非限定例は、細胞株Ｅ１５にて高レベルで発現されるが、たとえば、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、歯髄幹細胞又は皮膚線維芽細胞では発現されない発生遺伝子ＮＮＡＴ（ＮＭ＿１８１６８９．１）の発現である。当該技術における幹細胞種からＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能である本発明の細胞株の顕著な差異の別の非限定例は、ＭＳＣのマーカーとして知られる遺伝子ＫＣＮＫ２（ＮＭ＿００１０１７４２５．２）の発現を測定することによって理解することができる。表３に示されるように、ＫＣＮＫ２は、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞及び歯髄肝細胞にて高レベルで発現されるが、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２及びＳＫ１１のようなＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能である本発明の幾つかの細胞株では検出可能ではなかった。本発明の細胞株と骨髄由来のＭＳＣの際立った差異は、細胞種における重要な治療上の差異を示す遺伝子においても見られる。ＭＳＣは試験管内で分化すると肥大軟骨細胞への形質転換を受けることに悩まされる。肥大軟骨細胞は、血管形成を誘導するのに有用な遺伝子を発現し、後に骨芽細胞によって侵襲されて骨を作る一時的なマトリクスを提供する。従って、関節に注入する場合、又はさもなければ関節軟骨に移植する場合、関節軟骨の外傷、関節炎の治療、又は関連する用途で組織を再生する尽力においてＭＳＣは上手く機能しない。ＭＳＣが肥大軟骨細胞のマーカーであるＩＨＨを非常に高いレベルで発現する一方で、本発明の細胞株は本明細書の軟骨形成条件で誘導される場合、ほとんどＩＨＨを発現しないか、発現してもわずかである。同様に、細胞株４Ｄ２０．８は肥大軟骨細胞の別のマーカーであるＣＯＬ１０Ａ１を検出可能なレベルで発現しなかったが、ＭＳＣはその転写物を非常に高いレベルで発現した。従って、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＳＭ３０及びＥ１５のような本発明の細胞株は、関節軟骨の病理の修復のための永続軟骨に分化するその能力でＭＳＣより優れているマーカーを示す。培養されたヒト骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、及び成人歯髄幹細胞と比べた細胞株ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５における差異のさらなる非限定例は、表３に示される、又は表３におけるような本明細書で記載されるものと細胞の遺伝子発現マーカーを比較することによって理解することができる。従って、これらの結果は、この選抜で特定された細胞株は新規であり、ＭＳＣを特定するのに一般に使用されるマーカーはヒトの胚性前駆細胞株において軟骨形成能を予測せず、前記細胞株が、軟骨形成の真のマーカーを発現する軟骨形成刺激に応答する株の小さなサブセットであることを予測するマーカーは現在存在しないことを示唆している。証拠は、軟骨形成の組織学的証拠の実施例７で提供される。
【０１５５】
表３
ヒト脂肪細胞（ＡＣＳ）、ヒト骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト成人歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、培養されたヒト包皮線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ）、ＣＯＬ２Ａ１の誘導が可能ではないクローン性ｈＥＰ細胞株７ＳＭＯＯ７、並びにそれぞれＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能であるヒト胚性前駆細胞ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２及びＳＫ１１における遺伝子発現マーカーの比較。数字はＲＦＵ値である。陰性の発現は影付きボックスで示す（ＮＤ平均値はデータなし）。
【０１５６】
実施例７
軟骨形成の組織学的な及び免疫化学的な確認
たとえば、７ＰＥＮＤ２４、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＭ３０、Ｅ１５、ＳＫ１１及び４Ｄ２０．８のようなＣＯＬ２Ａ１の中程度から堅実な誘導を示すような上記実施例６における低処理能力選抜で発見されたもののような本発明の細胞株、並びにたとえば、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、及びそのほかの細胞株、たとえば、包皮皮膚線維芽細胞、Ｚ１１、歯髄幹細胞、７ＳＭＯＯ７、Ｅ４４などのような対照を、１、８、１４及び２１日間を含む様々な時間、本明細書で記載されるような微細塊及びペレットの軟骨形成条件を経験させ、及びＳＣＩＤマウスの腎臓被膜に移動させた場合の前記ペレットのサブセットを経験させて、長時間の分化を促進した。前記微細塊とペレットをホルマリンで固定し、Ｈ＆Ｅ染色、上述のようなプロテオグリカンを染色するサフラニンＯによって、及び特異抗体と対照としての非特異抗体を用いた免疫反応性ＣＯＬ２Ａ１について組織学的に解析した。サフラニンＯに対する強い反応性及び／又はＣＯＬ２Ａ１免疫反応性が細胞株４Ｄ２０．８の１４日目と２１日目のペレットで認められ、サフラニンＯの強い染色が細胞株Ｅ１５の１４日目の微細塊で認められた。驚くべきことに、細胞株ＲＡＤ２０．６は、１４日目のペレットでＣＯＬ２Ａ１に対する免疫反応性及びサフラニンＯ染色を示した。図２は、ペレットとしてすべて２１日目の分化にて継代６でのＭＳＣと比較した継代１４での細胞株４Ｄ２０．８と比較した脂肪組織幹細胞のサフラニンＯ染色及び細胞株４Ｄ２０．８とＭＳＣの１４日目ペレットにおけるアイソタイプ対照を伴った免疫染色の例を示す。
【０１５７】
実施例８
関節軟骨を修復する能力について以下のように本発明の細胞株を調べた：提供されたヒト関節組織を外植した。細胞株ＳＭ３０、Ｅ１５、及び４Ｄ２０．８の５×１０５個の細胞を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて１５ｍｌの円錐チューブ中で４００×ｇにて５分間遠心し、一晩インキュベートして細胞の凝集体を生成した。Ａｒｔｈｒｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｓｅ ＯＡＴＳシステム（Ｎａｐｌｅｓ、Ｆｌ）によって６ｍｍ径の円筒状片を関節外植片からくり抜いた。外科用掻爬器を用いて関節表面におよそ２ｍｍの大きさの部分的な厚み欠損を作った。ＳＭ３０、Ｅ１５、及び４Ｄ２０．８の細胞凝集体、又はヒト一次関節軟骨細胞、ｈＥＳ由来の軟骨細胞の塊培養、若しくは脂肪細胞由来の幹細胞（ｈＡＳＣ）から成る対照によって欠損を満たした。ＴＧＦβ３の存在下又は非存在下で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて関節外植片をインキュベートした。４週間後、外植片を固定し、パラフィン包埋し、切片にし、スコア化のためにサフラニンＯで染色した。クローン性の前駆細胞株ＳＭ３０、Ｅ１５、及び４Ｄ２０．８を用いた選択されたクローン性細胞株における遺伝子発現レベル及びマトリクスの染色は、不均質なｈＥＳＣ及びＡＳＣより高く、ｈＡＣで見られるレベルに近づいた。軟骨外植片では、修復組織は関節軟骨に類似し、周辺の宿主組織と上手く統合した。
【０１５８】
実施例９
人工的なマトリクスにて軟骨形成を経験する能力について、軟骨形成が可能である本発明の細胞株を調べた。細胞株４Ｄ２０．８及び７ＰＥＮＤ２４の細胞を増殖させ、低速での遠心によってペレットにし、ＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で洗浄し、再び遠心し、１．２％アルギン酸（Ｌｏｎｚａ）にて２０×１０６でペレットを再浮遊させた。２２ｇの針を介して細胞浮遊液を１ｍｌのシリンジに引き入れ、ＣａＣｌ２槽（１０２ｍＭ）に一滴ずつ分配した。ゲル化は即座である。ビーズをＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で３〜５回洗浄し、次いで軟骨形成用培地（ＴＧＦを含まず）で１回洗浄し、その後軟骨形成用培地に浸漬した。ビーズを６穴プレートの複数のウェルに入れ、１週間に３日、１４日間養分を与えた。次いでビーズをＮａＣｌで複数回洗浄し、その後クエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）に２０分間暴露することによって脱重合した。遠心の後、ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）によって細胞ペレットを溶解し、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒを用いた粉砕工程を行って収率を改善したのに続いて、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。上記のようにｑＰＣＲによってＣＯＬ２Ａ１の発現を測定した。細胞株４Ｄ２０．８の場合、正常な微細塊条件に比べてＣＯＬ２Ａ１の発現で５１倍の上昇があった。細胞株７ＳＭＯＯ３２の場合、正常な微細塊条件に比べてＲＧＤ−アルギン酸を用いたＣＯＬ２Ａ１の発現で２．８８倍の上昇があった。細胞株ＳＫ１１の場合、正常な微細塊条件に比べてアルギン酸を用いたＣＯＬ２Ａ１の発現で１７９倍の上昇があった。Ｌｏｎｚａアルギン酸に加えて、ＲＧＤ結合したアルギン酸（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ）ビーズも調製した。７ＰＥＮＤ２４の場合、微細塊条件ではＣＯＬ２Ａ１を弱くしか誘導しないが、アルギン酸ビーズでは、微細塊条件に比べて４５倍の上昇を示した。ＲＧＤ−アルギン酸複合体に被包された７ＰＥＮＤ２４は、微細塊条件上で高いＣＯＬ２Ａ１の発現を示さなかったが、正常なヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）に比べて１７倍高いＣＯＬ２Ａ１の発現を示した。同様に、微細塊条件で軟骨形成性が弱かった７ＳＭＯＯ３２は、ＲＧＤ−アルギン酸ビーズではＣＯＬ２Ａ１を堅実に発現した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａのプラットホームを用いて、ＲＧＤアルギン酸は細胞株４Ｄ２０．８にてＣＯＬ２Ａ１の印象的な４４９倍の上方調節を示した。
【０１５９】
実施例１０
試験管内の連続継代に対する細胞株の安定性を判定するために、未分化状態及び１４の微細塊及び上述のような（実施例９）アルギン酸ビーズにて、定期的にＲＮＡを単離しながら、細胞株４Ｄ２０．８、Ｅ１５、ＳＭ３０及びｈｂｍＭＳＣを連続継代した。アルギン酸ビーズにてＰ１２と比較した継代３３の細胞株４Ｄ２０．８はほぼ同一レベルのＣＯＬ２Ａ１を示したが、ｈｂｍＭＳＣは、老化のために匹敵する継代で比較することはできなかった。
【０１６０】
実施例１１
アルギン酸に被包された軟骨形成性ｈＥＰの生体内ｓ．ｃ．埋め込み
ｈＥＳ細胞前駆細胞株、４Ｄ２０．８、Ｅ１５、ＳＭ３０、７ＰＥＮＤ２４、ＭＥＬ２及び対照のヒト骨髄ＭＳＣ、及びｘ−遺伝子皮膚線維芽細胞を増やし、剥離し、ペレットにし、２０×１０６個の細胞／ｍｌでアルギン酸調製物（ＲＧＤペプチド結合アルギン酸を伴ったＬｏｎｚａ１．２％又はＮｏｖａＭａｔｒｉｘ１．５％）に再浮遊させた。ゲル化と細胞の被包のために、１ｍｌの無菌シリンジを用い、シリンジに負荷した後、アルギン酸浮遊液を２２Ｇの針を介して一滴ずつＣａＣｌ２（１０２ｍＭ）溶液に排出し、又は予めＣａＣｌ２で濡らした大腿形状のシリコーン金型に入れ、次いで完全で迅速なゲル化のために１０２ｍＭのＣａＣｌ２で覆った。
【０１６１】
大腿形状の構築物を金型から取り出し、アルギン酸ビーズ（直径約１〜２ｍｍ）と同じようにＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で洗浄し、その後、デキサメタゾン０．１μＭとヒト組換えＴＧＦβ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する軟骨形成用分化培地に浸漬した。月曜日、水曜日及び金曜日に構築物及びビーズに養分を与えた。１２日後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの肩にｓ．ｃ．で構築物を埋め込み、１４日目に同様にビーズを埋め込んだ。
【０１６２】
埋め込みの６週後、組織を摘出し、４％のパラホルムアルデヒドで２４時間固定し、次いで７０％アルコールに浸漬した。
【０１６３】
顕微鏡観察では、特定のｈＥＰＣ構築物が明らかであり、ビーズは、白っぽい外見を持つ皮膚の下にある正常な筋膜から容易に識別できた。４Ｄ２０．８のアルギン酸外植片について例となる外植片（図４Ａ）。
【０１６４】
組織学的な評価については、試料をパラフィン包埋し、約１００μｍ間隔で４μｍの切片に切り、スライド上に置き、次いでヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【０１６５】
図５は、細胞株４Ｄ２０．８及びＥ１５についてガラス質軟骨に類似する軟骨細胞様の外見を示す例となる組織像を示す。
【０１６６】
【０１６７】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的での説明及び例示のために少し詳しく記載してきたが、本発明の教示の観点から、添付の特許請求の範囲の精神と範囲から逸脱することなく、それに対する特定の変更及び改変を行ってもよいことが当業者に容易に明らかである。
【０１６８】
従って、先行は本発明の原理を単に説明している。本明細書で明白に記載されず、又は示されないが、本発明の原理を具体化し、その精神と範囲の中に含められる種々の取り決めを当業者が考案できることが十分に理解されるであろう。さらに、本明細書で言及される実施例及び条件付言語のすべては、本発明の原理及び本発明者らによって当該技術の推進に寄与させられる概念を理解する点で読者を助けることが原則として意図され、そのような具体的に言及される実施例や条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその具体例を言及する本明細書での記述すべては、その構造的な及び機能的な同等物双方を包含することが意図される。加えて、そのような同等物は、現在既知の同等物及び将来開発される同等物、すなわち、構造にかかわりなく、同一の機能を実行する開発される要素の双方を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書で示され、記載される例となる実施形態に限定されるように意図されるものではない。むしろ、本発明の範囲と精神は添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条のもとで、以下の仮特許出願：２００９年７月１６日に出願された「胚性前駆細胞株を用いた試験管内及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する出願番号第６１／２２６，２３７号、２００９年９月１８日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第６１／２４３，９３９号、２０１０年５月２７日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第６１／３４９，０８８号、及び２０１０年７月１６日に出願された「試験管内及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物」題する出願番号第６１／３６５，３０８号の利益を主張する。これら出願のそれぞれの全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨の限定された再生能力は、外傷又は変性疾患による損傷を回復する生体の自然の能力を限定する。たとえば、変形性関節症（ＯＡ）は、６５歳を超えた７０％の人々を苦しめている（２１００万人のアメリカ人）。半月板又は前十字靭帯への傷害は、患者を関節炎の高いリスクに置くことが多い。変形性関節症は、関節面での軟骨の進行性の喪失を特徴とし、軟骨下骨の痛みを伴う露出を招く。関節軟骨へのこの傷害の後、ヒトの組織はほとんど修復能を示さない。自然の修復応答の結果と思われる新生軟骨は一般に線維性の性質であり、従って修復には好適ではない。
【０００３】
軟骨に損傷を有する対象者を治療するために種々の治療計画が開発されている。これらの治療の例には、機械的な手段（たとえば、研磨及びマイクロフラクチャー術、たとえば、穿孔術、マイクロフラクチャー術、軟骨形成術、スポンジアリゼーション；レーザーによる治療、それらは、冒された軟骨の除去を軟骨再形成と組み合わせる）を用いて対象者における軟骨生成を誘発することを意図するもの、及び損傷部位への組織の移植（又は移植）（たとえば、骨膜移植、骨軟骨移植（モザイク形成）、及び関節軟骨ペースト移植）に頼る治療法が挙げられる。これらの治療法の成功率は様々であり、場合によっては、組織壊死、反応性滑膜炎、軟骨融解、及び関節軟骨変性の加速を含む有害な副作用を有する可能性がある。
【０００４】
自家軟骨細胞療法（ＡＣＴ）として知られる細胞に基づいた軟骨治療計画には、軟骨からの軟骨細胞の取り出し、試験管内での細胞の増殖、及び支持マトリクス（又はそのほかのタンパク質若しくはプロテオグリカン）の存在下又は非存在下でのこれら増殖させた細胞の患者への投与が含まれる。ＡＣＴ療法は、試験管内で培養される場合のヒト関節軟骨細胞の脱分化、並びにそれらが移植部位で豊富な軟骨マトリクスを産生するように細胞を再分化させることの困難さによって複雑なものとなっている。さらに、ヒトからはほんのわずかな数の軟骨細胞しか回収できないので、培養の開始にほんのわずかな数の軟骨細胞しか使用できない。従って、実際上、単離されたヒト軟骨細胞を移植療法に適用する困難さは継続する。
【０００５】
別の治療戦略は、骨髄由来の間葉幹細胞（ｈｂｍＭＳＣ）の利用である。単回用量のｈｂｍＭＳＣ（軟骨原）を利用した臨床試験は、ヒアルロン酸（ＨＡ）対照に比べて疼痛の減少を示す。しかしながら、間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、軟骨の再生における使用に関して２つのハードルを有する。第１に、同種移植としての細胞の使用は、成人ＭＳＣの限定された増殖能のために問題であり、細胞が特定の量に増殖することができるとしても、それらは、軟骨を形成する能力を相対的に急速に失うことが多い。第２のハードルは、骨髄由来のＭＳＣのようなＭＳＣは、高レベルのＣＯＬ１０Ａ１及びＩＨＨの発現を特徴とする肥大軟骨細胞を形成するということである。これらの軟骨細胞の発生における役割は、血管及び骨芽細胞を動員することであり、次いで死滅する。肥大軟骨細胞は、たとえば、長骨の成長板領域で認められる。それらはまた、それらが同様に骨形成で重要な役割を担う骨折部位でも認められる。従って、外傷や、たとえば、変形性関節症のような軟骨の変性疾患の治療でのＭＳＣの使用は、混合した結果をもたらしている。加えて、生体には多数の種類の軟骨が存在する。耳の弾性軟骨は、鼻、胸骨、気管及び体重を支える関節とは異なった分子組成を有する。
【０００６】
従って、再生医療の分野、特に軟骨の再生と修復の分野にいては、商業的な量の様々な種類の永続的で、肥大に対抗する軟骨細胞を生成する新規の細胞製剤のニーズが大きい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様には、軟骨形成に到ることが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物が含まれる。原始幹細胞に由来する多数の例となる軟骨形成性細胞株を開示する。本明細書で記載される軟骨形成性細胞株は、健全であり、４０継代を超えて増殖することができ、部位特異的な純度を有するので、研究及び治療に使用するための独特な分子組成をもつ多様な軟骨の種類を産生する組成物及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】軟骨形成性の微細塊状態の１４日目前後のｑＰＣＲによってアッセイされた細胞株におけるＣＯＬ２Ａ１の誘導のレベルを示す図である。
【図２】未分化及び分化の状態における本発明の細胞株と共にＭＳＣ対照にて示す軟骨関連遺伝子、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＲＴＡＣ１、ＣＤ７４（図２Ａ）、ＬＥＣＴ１、ＩＨＨ及びＬＨＸ８（図２Ｂ）の相対的な発現を示す図である。
【図３】４Ｄ２０．８株とＭＳＣの１４日目ペレットにおけるペレット及びアイソタイプ対照による免疫染色として、すべて分化の２１日目にて、継代６でのＭＳＣと比べた継代１４での株４Ｄ２０．８と比べた脂肪組織幹細胞のサフラニンＯ染色の例を示す図である。
【図４】４Ｄ２０．８ＲＧＤアルギン酸（図４Ａ）、Ｅ１５ＲＧＤアルギン酸及びＳＭ３０ＲＧＤアルギン酸（図４Ｂ）の生体内埋め込みの結果を示す図である。
【図５】細胞株４Ｄ２０．８及びＥ１５についてのガラス質軟骨に似た軟骨細胞様の外見を示す例となる組織像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
略号
ＡＦＰ：α−フェトタンパク質
ＢＭＰ：骨形成性タンパク質
ＢＲＬ：バファローラット肝臓
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＤ：クラスター指定
ｃＧＭＰ：適正製造基準工程
ＣＮＳ：中枢神経系
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＣ：胚性癌
ＥＣ Ｃｅｌｌｓ：胚性癌細胞、ｈＥＣ細胞は、ヒト胚性癌細胞である
ＥＣＭ：細胞外マトリクス
ＥＤ Ｃｅｌｌｓ：胚由来細胞；ｈＥＤ細胞はヒトＥＤ細胞である
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧ Ｃｅｌｌｓ：胚性生殖細胞；ｈＥＧ細胞はヒトＥＧ細胞である
ＥＰ Ｃｅｌｌｓ：胚性前駆細胞は、それらが、ヒトにおける場合、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０又はＴＲＡ−１−８１のようなマーカーの血清陽性をもはや示さないという点で原始幹細胞より分化しているが、完全に分化しているわけではない、原始幹細胞由来の細胞である。胚性前駆細胞は、発生の新生児段階ではなく胚段階に相当する。
ＥＳ Ｃｅｌｌｓ：胚性幹細胞；ｈＥＳ細胞はヒトＥＳ細胞である
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選別
ＥＢＳ：ウシ胎児血清
ＧＭＰ：製造管理及び品質管理に関する基準
ｈＥＤ Ｃｅｌｌｓ：ヒト胚由来細胞
ｈＥＧ Ｃｅｌｌｓ：ヒト胚性生殖細胞は胚組織の原始生殖細胞に由来する幹細胞である
ｈＥＰ Ｃｅｌｌｓ：ヒト胚性前駆細胞はヒト種からの胚性前駆細胞である。
ｈｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ：ヒトから誘導された多能性幹細胞は、たとえば、SOＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＭＹＣ又はＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＯＣＴ４及びＳＯＸのようなｈＥＳ特異的な転写因子に暴露した後の体細胞から得られるｈＥＳ細胞に類似する特性を持つ細胞である。
ＨＳＥ：ヒト皮膚同等物は、創傷修復の促進で試験目的又は治療適用にために製造される細胞と生物学的マトリクス又は合成マトリクスの混合物である。
ＩＣＭ：哺乳類の胚盤胞段階の胚の内部細胞塊
ｉＰＳ細胞：誘導された多能性幹細胞は、たとえば、SOＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＭＹＣ又はＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＯＣＴ４及びＳＯＸのようなｈＥＳ特異的な転写因子に暴露した後の体細胞から得られるｈＥＳ細胞に類似する特性を持つ細胞である。
ＬＯＨ：ヘテロ接合性の消失
ＭＥＭ：最少必須培地
ＮＴ：核移植
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＳ線維芽細胞：瘢痕化前の線維芽細胞は、早期妊娠の皮膚に由来する、又は瘢痕形成することなく皮膚創傷の迅速な治癒を促進するという点で遺伝子発現の出生前のパターンを示すＥＤ細胞に由来する線維芽細胞である。
ＲＡ：レチノイン酸
ＲＦＵ：相対的蛍光単位
ＳＣＮＴ：体細胞核移植
ＳＦＭ：無血清培地
ＳＰＦ：特定病原体未感染
ＳＶ４０：シミアンウイルス４０
Ｔａｇ：ラージＴ抗原
Ｔ−ＥＤＴＡ：トリプシンＥＤＴＡ
【００１０】
定義
用語「分析用再プログラム技術」は、体細胞の遺伝子発現のパターンをさらに多能性状態、たとえば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＥＤ細胞、ＥＣ細胞又はＥＧ細胞のそれに再プログラムする種々の方法を指し、その際、再プログラムは、複数の別個の工程で生じ、体細胞の卵母細胞への移植及びその卵母細胞の活性化に単純に頼らない（２００１年１１月２６出願の米国特許出願第６０／３３２，５１０号；２００２年１１月２６日出願の同第１０／２０４，０２０号；２００３年１１月２６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３７８９９；２００５年８月３日出願の米国特許出願第６０／７０５６２５号；２００５年８月２０日出願の同第６０／７２９１７３号；２００６年７月５日出願の同第６０／８１８８１３号；２００６年８月３日出願のＰＣＴ／ＵＳ０６／３０６３２を参照のこと。そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００１１】
用語「割球／桑実胚の細胞」は、哺乳類の胚における割球若しくは桑実胚の細胞、又はこれらの細胞の分化誘導体を含む追加の細胞の存在下又は非存在下で試験管内にて培養された割球若しくは桑実胚の細胞を指す。
【００１２】
用語「遺伝子Ｘを発現する細胞」「遺伝子Ｘが細胞（又は細胞集団）にて発現される」、又はその同等物は、特定のアッセイプラットホームを用いた細胞の解析が陽性の結果を提供したことを意味する。逆もまた真実である（すなわち、遺伝子Ｘを発現しない細胞又はその同等物によって、特定のアッセイプラットホームを用いた細胞の解析が陰性の結果を提供したことを意味する）。従って、本明細書で記載される遺伝子発現の結果は、示された遺伝子についてアッセイプラットホーム（又はプラットホーム）で採用される特異的なプローブ（単数）又はプローブ（複数）に結びつく。
【００１３】
用語「細胞株」は、試験管内で増える及び増殖することが可能である細胞の死すべき集団又は不死の集団を指す。
【００１４】
用語「細胞性の再構築」は、機能的な細胞を得ることができるように核クロマチンの細胞質への移植を指す。
【００１５】
用語「クローン性」は、すべて元々の単一細胞に由来し、ほかの細胞を含有しない、単一細胞から細胞の集団への増殖によって得られる細胞を指す。
【００１６】
用語「コロニーのその場での分化」は、コロニーが未分化の幹細胞株として増殖した培養容器からコロニーを取り出す又はバラバラにすることなく、その場での細胞（たとえば、ｈＥＳ、ｈＥＧ、ｈｉＰＳ、ｈＥＣ又はｈＥＤ）のコロニーの分化を指す。胚様体形成法又はたとえば、スピナー培養の使用のようなそのほかの凝集法が、それでもやはりコロニーのその場での分化の期間に付随するが、コロニーのその場での分化は胚様体を形成する中間工程を利用しない。
【００１７】
用語「細胞質泡状突起」は、未処理の又は事前透過化したがほかは未処理の、しかし、核を欠く原形質膜によって結合される細胞の細胞質を指す。
【００１８】
多能性幹細胞から本発明の方法によって作製された細胞を参照して使用される場合、用語「分化した細胞」は、親の多能性幹細胞と比較したとき、分化の低い能力を有する細胞を指す。本発明の分化した細胞は、さらに分化すればよい細胞を含む（すなわち、それらは最終的に分化していなくてもよい）。
【００１９】
用語「直接分化」は、未分化細胞株としてのｈＥＳ細胞のような単離した未分化幹細胞を増殖させる中間的な状態無しで直接、割球細胞、桑実胚細胞、ＩＣＭ細胞、ＥＤ細胞又は未分化状態に再プログラムされた体細胞（たとえば、ｉＰＳ細胞を作製する過程で、しかし、未分化状態でそのような細胞を精製する前に）を分化させる工程を指す。直接分化の非限定例は、培養された未処理のヒト胚盤胞の培養、及び記載された（Bongso et al, 1994. Human Reproduction 9:2110）ようなヒトＥＳ細胞株の生成なしでのＥＤ細胞の誘導である。
【００２０】
用語「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）は、未分化状態を維持しつつ（たとえば、その種のＥＳ細胞に特異的なＴＥＲＴ、ＯＣＴ４、及びＳＳＥＡ及びＴＲＡを発現している）細胞株として連続して継代されている胚盤胞の内部細胞塊、割球、又は桑実胚に由来する細胞を指す。ＥＳ細胞は、卵細胞の精子又はＤＮＡとの受精、核移植、単為生殖、又はＭＨＣ領域における半接合体又はホモ接合体によってｈＥＳを生成する手段に由来してもよい。ＥＳ細胞は、未着床の胚に移植される場合の生殖細胞系と同様にあらゆる種類の体細胞に分化することが可能である細胞として歴史的に定義されている一方で、ヒトを含む多数の種からの候補ＥＳ培養物は、培養にてさらに平坦な外見を有し、通常生殖細胞系の分化には寄与せず、従って「ＥＳ様細胞」と呼ばれる。ヒトＥＳ細胞は、実際には「ＥＳ様」ではあるが、本出願では、我々は、ＥＳ細胞株及びＥＳ様細胞株を指して用語ＥＳ細胞を使用する。
【００２１】
用語「組織特異的な培養物」は、たとえば、寒天の層上での体細胞の培養で生じるような、又はたとえば、コラーゲンゲル、スポンジ若しくは組織工学で一般に使用されるそのほかのポリマーにおける三次元で細胞が培養されるときに生じるような、凝集して、組織様の細胞密度で三次元構造を創る培養された細胞を指す。
【００２２】
用語「ヒト胚由来の」（「ｈＥＤ」）細胞は、正常なヒトの発生の最初の８週間の同等物に相関する分化の状態までの原始内胚葉、外胚葉、中胚葉、神経堤及びその誘導体を含む、早期胚の内部細胞塊、胎盾、又は胚盤葉上層、又は万能性若しくは多能性の幹細胞を含むが、細胞株として継代されているｈＥＳ細胞に由来する細胞（たとえば、Ｔｈｏｍｓｏｎへの米国特許第７，５８２，４７９号、同第７，２１７，５６９号、同第６，８８７，７０６号、同第６，６０２，７１１号、同第６，２８０，７１８号、及び同第５，８４３，７８０号を参照のこと）を除く、割球由来の細胞、桑実胚由来の細胞、胚盤胞由来の細胞を指す。ｈＥＤ細胞は、卵細胞の精子又はＤＮＡとの受精、核移植、又はクロマチン移植、単為生殖を介して単為生殖体を形成するように誘導される卵細胞、分析再プログラム技術、又はＨＬＡ領域における半接合体若しくはホモ接合体によるｈＥＳ細胞を生成する手段によって生成される着床前の胚に由来してもよい。用語「ヒト胚性生殖細胞」（ｈＥＧ細胞）は、生体で種々の組織に分化することができる、胚組織の原始生殖細胞又は成熟している若しくは成熟した、たとえば、卵母細胞及び精原細胞のような生殖細胞に由来する多能性幹細胞を指す。ｈＥＧ細胞はまた、雌性発生又は雄性発生の手段、すなわち、多能性細胞がオス又はメスの起源のＤＮＡのみを含有する卵母細胞に由来するので、すべてメス由来のＤＮＡ又はオス由来にＤＮＡを含む方法によって産生される多能性幹細胞に由来してもよい（たとえば、１９９９年１０月２８日に出願された米国特許出願第６０／１６１，９８７号、２０００年１０月２７日に出願された同第０９／６９７，２９７号、２００１年１１月２９日に出願された同第０９／９９５，６５９号、２００３年２月２７日に出願された同第１０／３７４，５１２号、２０００年１０月２７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／００／０９５５１を参照のこと；その開示はすべて参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００２３】
用語「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）は、ヒトのＥＳ細胞を指す。
【００２４】
用語「ヒトｉＰＳ細胞」は、免疫に欠陥のあるマウスに移植した場合、３つの胚葉すべてを形成する能力を含む、ｈＥＳ細胞に似た特性を持つ細胞を指し、その際、前記ｉＰＳ細胞は、脱分化因子、たとえば、ｈＥＳ細胞に特異的な転写因子の組み合わせ：ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ及びＯＣＴ４又はＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８への暴露後の種々の体細胞系列の細胞に由来する。脱分化因子の任意の好都合な組み合わせを用いてｉＰＳ細胞を生成してもよい。たとえば、当該技術で既知であるレトロウイルス、レンチウイルス若しくはアデノウイルスのベクターのようなベクターを介したこれら遺伝子の発現によって、又はたとえば、透過化若しくはほかの技術によるタンパク質のような因子の導入を介して前記ｉＰＳ細胞を産生してもよい。そのような例となる方法の記載については、２００６年８月３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０６３２；米国特許出願第１１／９８９，９８８；２０００年６月３０日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０１８０６３；２０００年１２月１５日に出願された米国特許出願第０９，７３６，２６８号；２００４年４月２３日に出願された米国特許出願第１０／８３１，５９９号；及び米国特許公開２００２０１４２３９７（「細胞の運命を変える方法」と題する出願番号１０／０１５，８２４）；米国特許公開２００５００１４２５８（「細胞の運命を変える方法」と題する出願番号１０／９１０，１５６）；米国特許公開２００３００４６７２２（「再プログラムしたドナーのクロマチン又はドナーの細胞を用いた哺乳類をクローニングする方法」題する出願番号１０／０３２，１９１）；米国特許公開２００６０２１２９５２（「再プログラムしたドナーのクロマチン又はドナーの細胞を用いた哺乳類をクローニングする方法」題する出願番号１１／４３９，７８８）を参照のこと。そのすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００２５】
用語「ＩＣＭ細胞」は、哺乳類胚の内部細胞塊の細胞、又は周辺の栄養外胚葉細胞の存在下若しくは非存在下にて試験管内で培養した内部細胞塊の細胞を指す。
【００２６】
用語「オリゴクローン性」は、同一培養物でそのほかの細胞とは異なる形態や分化マーカーの存在又は非存在のような類似の特徴を共有すると思われる通常２〜１０００細胞の小さな細胞集団を起源とする細胞の集団を指す。オリゴクローン性細胞は、これらの共通する特徴を共有しない細胞から単離され、増殖させて類似細胞の元々の集団に全体として本質的に由来する細胞集団を生成する。
【００２７】
用語「器官型培養」は、たとえば、寒天の層上での若干の細胞の培養で生じるような、動物における奇形腫として培養されるような、さもなければ、三次元培養系で増殖させるような組織様の細胞密度での三次元構造を凝集して創る培養細胞を指すが、前記凝集した細胞は、たとえば、非限定の例証として、表皮角化細胞と皮膚線維芽細胞の組み合わせ、又は相当する組織間質を伴った実質細胞、又は間葉細胞を伴った上皮細胞の組み合わせのような異なった細胞系列の細胞を含有する。
【００２８】
用語「多能性幹細胞」は、以下に定義されるような用語「原始幹細胞」と同義的に使用される。
【００２９】
用語「プールされたクローン性」は、２以上のクローン性集団を組み合わせて遺伝子発現マーカーのようなマーカーの均一性を持つ、クローン集団に類似する細胞の集団を生成することによって得られる細胞の集団を指すが、細胞すべてが同一の最初のクローンに由来する集団ではない。前記プールされたクローン性細胞株には、単一の遺伝子型又は混合された遺伝子型の細胞が含まれる。プールされたクローン性細胞株は、クローン性細胞株が相対的に早く分化する場合、又は望ましくない方法で早期に増殖寿命で変化を生じる場合、特に有用である。
【００３０】
用語「原始幹細胞」は、１を超える分化した細胞種に分化することが可能である動物細胞を指す。そのような細胞には、ｈＥＳ細胞、割球／桑実胚の細胞及びそれらに由来するｈＥＤ細胞、ｈｉＰＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｈＥＣ細胞、並びに間葉幹細胞、神経幹細胞及び骨髄由来幹細胞を含む成人由来細胞が挙げられる。原始幹細胞は非ヒト動物に由来してもよい。原始幹細胞は遺伝子操作されてもよいし、遺伝子操作されなくてもよい。遺伝子操作された細胞は、たとえば、蛍光タンパク質のようなマーカーを含んで試験管内又は生体内での特定を円滑にしてもよい。
【００３１】
詳細な説明
上記で要約したように、本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。
【００３２】
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されることはなく、従って当然変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００３３】
値の範囲が提供される場合、内容が明瞭に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在する値、その範囲の上限と下限の間及びその言及される範囲におけるそのほかの開始の値又は介在する値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのさらに小さな範囲の上限及び下限は独立してさらに小さな範囲に含まれてもよく、本発明の範囲内に包含され、開始範囲における特に排除される限界の対象となる。開始範囲が一方の限界又は双方の限界を含む場合、これらを含む限界のいずれか又は双方を排除する範囲も本発明に含まれる。
【００３４】
特定の範囲は、用語「約」が先行する数値によって本明細書では提示される。用語「約」は、それが先行する正確な数、同様にその用語が先行する数に近い又は近似する数に対して文字通りの支援を提供するために本明細書で使用される。数が特に言及される数に近い又は近似するかどうかを決定する場合、近い又は近似する言及されない数が、それが提示される文脈で、特に言及された数の実質的な同等物を提供する数であってもよい。
【００３５】
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で記載されるものと類似の又は同等の方法及び材料を本発明の実践又は試験でも使用することができるが、代表的な説明となる方法及び材料を今や記載する。
【００３６】
本明細書で引用される出版物及び特許はすべて、各個々の出版物又は特許が参照によって組み込まれるように特に且つ個々に指示されるかのように、及び言及される出版物と関連して方法及び／又は材料を開示し、記載するように参照によって本明細書に組み入れられるかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。出版物の引用は、出願日の前の開示についてであり、前の発明によってそのような出版物に先行するように本発明に権利を与えないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、独立して確認される必要があってもよい実際の出版の日付とは異なってもよい。
【００３７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明瞭に指示されていない限り、複数の参照を含むことが言及される。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を排除するように作成されてもよいことが言及される。従って、この文書は、特許請求の範囲の要素の言及又は「否定的な」限定の使用と併せてそのような排除的用語「単に」、「のみ」などの使用について先例を基準として役立つことが意図される。
【００３８】
本開示を読み取る際、当業者に明らかであるように、本明細書で記載され、説明される実施形態のそれぞれは、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、そのほかの幾つかの実施形態の特徴から容易に分離されてもよい、又はそれと容易に組み合わせられてもよい別個の成分及び特徴を有する。言及される方法は、言及される事象の順に、又は理論的に可能なほかの順に実施することができる。
【００３９】
胚性の軟骨形成性前駆細胞及び使用方法
本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。四肢及び関節の中心的調節因子と関連して間充組織の中心的調節因子を発現する多様なセットのクローン性細胞株、たとえば、関節特異的なマーカーＧＤＦ５を高レベルで発現する細胞株のサブセットを伴った、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、及びＳＯＸ９を発現する細胞株が記載されている（補完情報を含む、参照によって本明細書に組み入れられるWest et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308; 及びその全体が参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号を参照）。これらのクローン性に精製された細胞株は、健全であり、その遺伝子発現パターンを維持しつつ４０を超える継代について増殖させることができ、腫瘍形成性は示されておらず、遺伝子発現の胚性パターンを有する。従って、これらの細胞株は、研究及び治療で使用するための独特の分子組成を持った多様な軟骨の種類を産生するための組成物及び方法を提供する。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の未分化の胚性軟骨形成性前駆細胞又はその細胞株の遺伝子発現パターンは、適切な培養条件下では軟骨細胞になる可能性を有する兆候を提供しない。言い換えれば、細胞は、軟骨細胞の発生の可能性を示す遺伝子発現パターンを有さない。
【００４１】
本発明の特定の胚性前駆細胞株は、軟骨形成条件下で誘導されると、ＣＯＬ１０Ａ１遺伝子又はＩＨＨ遺伝子を発現することなく軟骨を生成することが可能であるが、双方は、そのような条件下でＭＳＣにて発現され、肥大軟骨細胞のマーカーである。肥大軟骨細胞は、後に骨芽細胞に侵襲されて骨を作る一時的なマトリクスを提供するので、特定の治療目的（たとえば、関節軟骨の外傷、関節炎の治療又は関連する使用のために組織を再生する尽力において関節に注入する場合、又はさもなければ、関節軟骨に移植する場合）には向いていない。従って、本発明の細胞株は、肥大軟骨細胞を発生させるそのほかの軟骨細胞の前駆細胞（たとえば、骨髄由来のＭＳＣ）との重要な治療上の差異を有する。
【００４２】
本発明に係る例となる胚性の軟骨形成性前駆細胞は、以下の遺伝子：ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２のいずれか１、２、３、４又はすべてについて陰性である。これら遺伝子のそれぞれは、間葉幹細胞（ＭＳＣ）に存在するマーカーであり、それは現在、軟骨置換療法（以下でさらに記載する）で使用されている。従って、本発明の軟骨形成性の胚性前駆細胞株は、そのほかの既知の軟骨形成性前駆細胞とは異なった遺伝子発現パターンを有する。特定の実施形態では、軟骨形成性の胚性前駆細胞株はさらにＨＯＸ遺伝子とＰＩＴＸ１の発現についても陰性である。
【００４３】
以下は、本発明の態様に係る例となるヒト胚性の軟骨形成性前駆細胞株及び当該の特定の遺伝子発現マーカー（陽性及び陰性のマーカー）のリストである。これらヒト胚性の軟骨形成性前駆細胞株は、ヒトＥＳ細胞又は類似のヒト原始幹細胞由来の細胞から単離された後、１８〜２１回の倍増クローン増殖を経験した場合、軟骨芽細胞、次いで通常の早期継代培養のヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）よりも高いレベルのＣＯＬ２Ａ１を発現する軟骨細胞に分化することが可能である。
【００４４】
Ｐ２２〜２８の範囲における細胞株ＭＥＬ２の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＰＩＰ、ＥＮＰＰ２、ＤＬＸ５、ＣＸＡＤＲ、ＮＰＴＸ２、ＣＬＤＮ２３、ＳＦＲＰ２、ＨＳＰＢ３、ＨＡＮＤ２、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＲＣＡＮ２、ＥＢＦ３、ＧＰＭ６Ｂ、ＲＮＦ１７５、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＲＧＳ１６、ＧＰＭ６Ｂ、ＳＯＸ１７、ＥＰＨＢ６及びＢＡＰＸ１が挙げられる。Ｐ２２〜２８の範囲における細胞株ＭＥＬ２で発現されるこれらのマーカーで最も特異的なのは、ＰＩＰ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０５１９）、ＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）、ＤＬＸ５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３３７０７６７）、ＧＰＭ６Ｂ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２６３０２７９）、ＲＧＳ１６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１０３０１０２）、ＥＰＨＢ６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７４０００１７）及びＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）であり、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）及びＨＯＸＢ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４６００９７）の発現が陰性であることである。
【００４５】
Ｐ１３〜１５の範囲における細胞株ＳＭ３０の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＹＳＦ、ＦＳＴ、ＩＴＧＢ４、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳＸ１、ＮＤＳＴ３、ＮＴＲＫ１及びＺＩＣ２が挙げられる。Ｐ１３〜１５の範囲での細胞株ＳＭ３０で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＮＴＲＫ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７０５０１１３）、ＮＤＳＴ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６７０５３７）、ＺＩＣ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５１０３６８）、ＩＴＧＢ４（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３９４０１３２）であり、ＰＩＰ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０５１９）、ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）及びＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）の発現が陰性であることである。
【００４６】
Ｐ１１〜１８の範囲における細胞株７ＳＭＯＯ３２の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＥＧＦＬ６、ＦＧＦ１３、ＢＥＸ２、ＣＨＲＮＡ３、ＮＣＡＭ２、ＢＢＯＸ１及びＤＬＫ１が挙げられる。７ＳＭＯＯ３２で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＥＧＦＬ６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６３３００７９）、ＦＧＦ１３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７３８０２３９）、ＣＨＲＮＡ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４２８０１８０）、ＢＢＯＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４００３８６）であり、遺伝子：ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＮＴＲＫ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ７０５０１１３）、ＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）及びＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）の発現が陰性であることである。
【００４７】
Ｐ１２〜１７の範囲における細胞株ＳＫ１１の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＰＩＴＸ１、ＴＢＸ１５、ＮＣＡＭ１、ＣＯＬ２１Ａ１、ＣＹＹＲ１、ＬＡＭＰ３、ＭＥＧＦ１０、ＲＮＦ１６５及びＧＤＦ１０が挙げられる。ＳＫ１１で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＣＯＬ２１Ａ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４４０７４７）、ＧＤＦ１０（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５６９００９５）、ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）であり、遺伝子：ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）、ＦＯＸＦ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１６６０４７０）、ＦＯＸＧ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４２００４５８）、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＨＯＸＢ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４６００９７）及びＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）の発現が陰性であることである。
【００４８】
Ｐ１５〜２６の範囲における細胞株７ＰＥＮＤ２４の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＴＢＸ１５、ＣＡ９、ＳＰＡＧ１６、ＳＵＳＤ２、ＴＢＸＡＳ１、ＡＩＦ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＦＯＸＦ２、ＡＡＤＡＣ及びＦＯＸＧ１が挙げられる。７ＰＥＮＤ２４で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＡＡＤＡＣ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６２００６１９）、ＴＢＸ１５（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６０６０１１３）、ＳＰＡＧ１６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４３９０５３７）、ＡＩＦ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３８０００４７）であり、遺伝子：ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）、ＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）及びＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）の発現が陰性であることである。
【００４９】
Ｐ１４〜１５の範囲における細胞株Ｅ１５の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＥＮＰＰ２、ＡＢＣＡ６、ＴＢＸ１５、ＢＡＩ３、ＣＮＴＮ３、ＴＳＰＹＬ５、ＧＡＰ４３、ＡＪＡＰ１、ＣＹＦＩＰ２、ＨＯＸＡ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０６０４７１）、ＨＯＸＢ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３４６００９７）及びＮＮＡＴが挙げられる。Ｅ１５で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１３００６４７）、ＢＡＩ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５６９０３０１）、ＮＮＡＴ（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４０１０７０９）、ＡＢＣＡ６（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５８１０２０９）であり、遺伝子：ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）の発現が陰性であり、遺伝子発現マーカー：ＨＡＮＤ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ４６４０５６３）及びＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）が陰性であることである。
【００５０】
Ｐ１２〜１７の範囲における細胞株４Ｄ２０．８の遺伝子発現パターンを、表１に示す未分化（対照又はＣｔｒｌ）の状態で細胞の遺伝子発現パターンを比較することによって決定することができる。細胞株によって発現される特定の遺伝子発現マーカーには、遺伝子：ＬＨＸ８、ＨＡＰＬＮ１、ＬＩＮＧＯ２、ＦＧＦ１８、ＧＰＲ１２６、ＢＢＯＸ１、ＩＴＧＡ４、ＳＨＩＳＡ３及びＢＡＲＸ１が挙げられ、遺伝子発現マーカー：ＮＮＡＴ及びＨＡＮＤ２については陰性である。４Ｄ２０．８で発現されるこれらの遺伝子発現マーカーで最も特異的なのは、ＳＨＩＳＡ３（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ５６７０２８６）、ＬＨＸ８（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２９００３４３）、ＢＡＲＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ６４５００４０）、ＬＩＮＧＯ２（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ１１１０２９１）であり、遺伝子：ＰＩＴＸ１（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ２０００３７３）、ＳＯＸ１７（ＩｌｌｕｍｉｎａプローブＩＤ３６１０１９３）及びＡＪＡＰ１（ＩｌｌｕｍｉｎａＩＤ１３００６４７）の発現が陰性であることである。
【００５１】
上記で言及したように、本発明の胚性の軟骨形成性前駆細胞は、試験管内又は生体内で軟骨を生成する方法での使用を見い出す（本明細書では軟骨細胞誘導法と呼ぶことがある）。治療上の使用に好適なものを含む好都合な軟骨細胞誘導法を使用してもよい（多数の例となる軟骨細胞誘導／軟骨生成の方法が以下及び実施例の項で記載される）。
【００５２】
従って、本発明の胚性の軟骨形成性前駆細胞は、軟骨組織の修復のための治療応用に使用されてもよく、たとえば、治療上許容できるキャリアにて対象者に投与されてもよい。前駆細胞が投与される対象者は、軟骨の置換／再生が治療上の利益を提供する状態、傷害又は疾病を有してもよい。たとえば、対象者が、特定の部位での軟骨の損傷、たとえば、関節軟骨の損傷を有するのであれば、軟骨の損傷部位に胚性前駆細胞株を投与してもよい。そのような治療のための薬学上許容できるキャリアには、細胞の移植に治療用キャリアとして使用が見い出される多種多様な足場、マトリクスなどのいずれかが挙げられる。非限定例には、以下の成分：ヘクステンド；ヒアルロナン及びそのポリマー；コンドロイチン硫酸；Ｉ型コラーゲン；ＩＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそのポリマー；アルギン酸；アガロース；ポロキサマー；フィブリン；キチン；及びキトサンのいずれか１つ又は組み合わせを含有するキャリアが挙げられる。軟骨細胞の分化及び治療法における例となる足場／マトリクス及びその使用は以下でさらに詳細に記載する。
【００５３】
特定の治療応用では、採用される軟骨胚性前駆細胞株は、対象者に投与するのに先立って、たとえば、移植の前に軟骨生成を誘導するために軟骨誘導条件下で培養されてもよい。たとえば、本発明の細胞株から生成される軟骨を含有する形態又はそのほかの構造体（たとえば、成形された構造体）が、たとえば、軟骨の喪失、傷害又は変性の部位にて対象者に移植されてもよい。そのような実施形態では、軟骨細胞培養条件；合成マトリクス又は生体吸収性不動化ビヒクルに胚性前駆細胞を含浸すること；及び成形された構造体に胚性前駆細胞を入れることのいずれか１つ又は組み合わせを含む好都合な軟骨産生条件を採用してもよい。
【００５４】
本発明に係る治療方法には、移植後１以上の時点で所望の部位での軟骨の生成率を測定すること（たとえば、損傷した軟骨の修復又は置換を測定すること）、並びに対象者において新しく形成された軟骨の性能に関しての情報を得ることが含まれる。測定されるパラメータには、患者における移植部位での生き残り、局在化及び存在する投与された細胞の数を挙げることができる。種々の走査技法、たとえば、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ又はＣＴ）走査、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）又はポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）走査を用いて細胞の生着又は再構築の程度を判定してもよい。本発明に係る移植された細胞の対象への機能的一体化は、損傷した又は冒された機能の回復、たとえば、関節の回復、又は機能の増強を調べることによって評価することができる。標的組織を取り出し、視覚的に又は顕微鏡でそれを調べることによって細胞移植の生着、局在化及び生き残りも評価することができる（たとえば、死後解析にて）。
【００５５】
組織を操作した(tissue engineered)軟骨
哺乳類には３種の軟骨が存在し、ガラス質軟骨、線維軟骨及び弾性軟骨が挙げられる。ガラス質軟骨は、フィルム状の弾性粘度を有する軟骨質の塊から成り、半透明であり、真珠のような青色である。ガラス質軟骨は、関節接合する関節の関節接合する表面に優勢に見い出される。それはまた、骨端板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨及び鼻軟骨にも見い出される。線維軟骨は、軟骨に張力強度を付加するＩ型コラーゲンの原線維を含有することを除いてガラス質軟骨と本質的同じである。コラーゲン性の原線維が束に配置され、軟骨細胞が束の間に局在する。線維軟骨は一般に椎間円板の線維輪、腱と靭帯の挿入、半月板、恥骨結合、及び関節包の挿入に一般に見られる。弾性軟骨も、エラスチンの線維を含有することを除いてガラス質軟骨に類似する。それはガラス質軟骨より不透明であり、さらに柔軟性で曲げ易い。これらの特徴は、軟骨マトリクスに埋め込まれた弾性線維によって部分的には規定される。通常、耳介、咽頭蓋、及び喉頭には弾性軟骨が存在する。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞が治療応用に採用されて、対象者（たとえば、哺乳類、たとえば、ヒト対象者）において軟骨組織（たとえば、損傷された軟骨）を修復し、置き換え、又は整備する。試験管内で軟骨が生成され、その後冒された部位に移植されてもよく、特定の実施形態では、軟骨細胞が（たとえば、マトリクス又は足場の中に）移植されて対象者における所望の部位で軟骨を生成してもよい。軟骨産生細胞（又は軟骨細胞）を用いる多数の治療法が記載されており、その２，３を以下で要約する。
【００５７】
特定の実施形態では、合成マトリクス又は生体吸収性の不動化媒体（「足場」又は「マトリクス」とも呼ぶことがある）に本発明の軟骨産生細胞を含浸させてもよい。種々の合成担体マトリクスが今日まで使用されており、それには、三次元コラーゲンゲル（米国特許第４，８４６，８３５号； Nishimoto (1990) Med. J. Kinki University 15; 75-86; Nixon et al. (1993) Am. J. Vet. Res. 54:349-356; Wakitani et al. (1989) J. Bone Joint Surg. 71B:74-80; Yasui (1989) J. Jpn. Ortho. Assoc. 63:529-538)；再構築フィブリン／トロンビンゲル（米国特許第４，６４２，１２０号；同第５，０５３，０５０号及び同第４，９０４，２５９号）；ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそのコポリマーを含有する合成ポリマーマトリクス（米国特許第５，０４１，１３８号）；並びにヒアルロン酸に基づいたポリマー（Robinson et al. (1990) Calcif. Tissue Int. 46:246-253）が挙げられる。Ｉ型コラーゲンマトリクス（たとえば、日本、東京の株式会社高研からのアテロコラーゲン）；Ｉ型とＩＩＩ型コラーゲンの二重層足場（たとえば、ドイツ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｖｅｒｉｇｅｎ）；コラーゲン足場（たとえば、ドイツ、Ｈｅｚｏｅｎｒａｔｈ、Ｍａｔｒｉｃｅｌのカバーした自己軟骨細胞移植（ＣＡＣＩ）及びマトリクス誘導の自己軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）方式（ＡＣＩ−Ｍａｉｘ（商標））；ブタのＩ型／ＩＩＩ型二重層（たとえば、ＣｈｏｎｄｒｏＧｉｄｅ（登録商標）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｗｏｌｈｕｓｅｎ、スイス）；３Ｄ−コラーゲン／ゲル／マトリクス（たとえば、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｔｒａsｅ，ＢｉｏＲｅｇｉｏＳＴＥＲＮからの及びＭＡ、ボストンのＫｉｎｅｔｉｃｓ社からのＣａＲｅＳ（登録商標）で使用されるような）；ヒアルロナン足場、たとえば、ヒアルロナンを基にした生分解性ポリマーのエステル化（ベンジルエステル）誘導体（たとえば、イタリア、Ａｂａｎｏ Ｔｅｒｍｅ、Ｆｉｄａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＨｙａｆｆ（登録商標）−１１）；ＰＧＡ／ＰＬＡコポリマー及びポリジオキサノン足場、たとえば、ゲル負荷多孔性生分解性フリース（たとえば、ドイツ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｂｉｏｔｉｓｓｕｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＢｉｏ−Ｓｅｅｄ−Ｃで採用されるような）；アガロース／アルギン酸マトリクスを伴った固形足場（たとえば、フランス、ＭＩＯＮＳ、ＴＢＦ Ｔｉｓｓｕｅ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇからのＣａｒｔｉｐａｔｃｈ（登録商標））；二相性の三次元コラーゲン／コンドロイチン表面足場（たとえば、ドイツ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、ＴＥＴＥＣからのＮＯＶＯＣＡＲＴ（商標）３Ｄ）を含む、これらの足場及びマトリクスの特定のものが治療用の軟骨修復に使用されている（又はそのために試されている）。
【００５８】
軟骨再構築の記載について、参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｎｔｈｏｎｙ Ａｔａｌａ及びＲｏｂｅｒｔ Ｐ．Ｌａｎｚａによって編集され、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ロンドン）によって出版されたＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００２）に記載されたように（１０２７〜１０３９頁を参照）、本発明の軟骨産生細胞を軟骨の再構築に採用してもよい。そこで記載されたように、軟骨産生細胞を成形された構造体（たとえば、射出成形によって）に入れ、動物に移植してもよい。時間が経てば、軟骨産生細胞によって生成された軟骨が成形された構造体を置き換え、それによって、形成された軟骨構造体を生成する（すなわち、当初の形成された構造体の形状にて）。形成された構造体のための例となる成形材料には、ヒドロゲル（たとえば、アルギン酸、アガロース、ポラクソマー（プルロニクス））及び天然の材料（たとえば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びフィブリン）が挙げられる。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞は、試験管内で培養されて合成軟骨（又は軟骨様の）材料を形成してもよい。得られた軟骨を続いて軟骨欠損の部位で対象者に埋め込んでもよい。この種のアプローチは、埋め込みの前に合成軟骨材料の成長がモニターされ得るという利点を有する。加えて、得られた軟骨は埋め込みに先立って生化学的に及び形態学的に性状分析され得る。試験管内で合成軟骨を増殖させるために２つの一般的な手順が開発されている。これらには、足場依存性の方法又は足場非依存性の方法のいずれかで軟骨産生細胞を増殖することが含まれる。
【００６０】
足場非依存性の方法では、軟骨産生細胞をアガロースゲルの中でコロニーとして培養してもよい。たとえば、Ｂｅｎｙａら、（１９８２）Ｃｅｌｌ、３０：２１５−２２４；Ａｙｄｌｏｔｔｅら、（１９９０）ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｈａｐｔｅｒ：２３：ｐｐ．９０−９２；Ａｕｌｔｈｏｕｓｅら（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：６５９−６６８；Ｄｅｌｂｒｕｃｋら、（１９８６）Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１５：１５５０−１７２；及びＢｏｈｍｅら、（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６：１０３５−１０４２を参照のこと。或いは、別の足場非依存性の方法では、軟骨産生細胞を浮遊培養にてコロニーとして培養してもよい。たとえば、Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔら、（１９８９）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：５−９；及びＢａｓｓｌｅｅｒら、（１９９０） ｉｎ 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４を参照のこと。
【００６１】
足場依存性の方法では、軟骨産生細胞の一次培養は細胞培養フラスコの表面に付着する単層として増殖させてもよい。たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＹｏｓｈｉｈａｓｈｉ（１９８３）Ｊ．Ｊｐｎ．Ｏｒｔｈｏ．Ａｓｓｏｃ．５８：６２９−６４１；及び米国特許第４，３５６，２６１号を参照のこと。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明の軟骨療法は、米国特許第５，７２３，３３１号及び同第５，７８６，２１７号（双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられる「哺乳類における関節軟骨欠陥の修復のための方法及び組成物」と題する）に記載されたものを含む。これらの特許は、軟骨の欠陥の修復のために合成軟骨パッチを試験管内で調製する方法を記載している。本発明の軟骨産生細胞を採用する場合、方法は、（１）細胞の接触を有する事前に成形されたウェル、細胞付着性の表面に本発明の軟骨産生細胞を播く工程と、（２）細胞が細胞外マトリクスを分泌できるのに十分な時間、ウェルにて本発明の軟骨産生細胞を培養し、それによって合成軟骨の三次元の多層細胞パッチを形成する工程を含む。得られた合成軟骨（たとえば、合成関節軟骨）は、内因的に産生され、分泌された細胞外マトリクスの中に分散された本発明の軟骨産生細胞を含有する。続いて、得られた合成軟骨パッチを対象者（たとえば、哺乳類）における軟骨の欠陥の修復（置き換え）に使用してもよい。
【００６３】
別の例として、本発明の軟骨形成性細胞を三次元マトリクス、たとえば、ヒドロゲルに被包してもよい。例となるヒドロゲル被包方法は、参照によって本明細書に組み入れられる、「三次元ヒドロゲル培養における胚性幹細胞の指向分化」、Ｎａｔｈａｎｉｅｌ Ｓ．Ｈｗａｎｇ，Ｓｈｙｎｉ Ｖａｒｇｈｅｓｅ及びＪｅｎｎｉｆｅｒ Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４０７：ｐ３５１ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙｓに見つけることができる。そこに記載された例となる方法を以下に要約する。
【００６４】
Ａ．ＰＥＧＤＡ又はＲＧＤで修飾したＰＥＧＤＡヒドロゲルにおける軟骨細胞前駆細胞の光被包
１）１０％（ｗ／ｖ）の濃度にて無菌ＰＢＳでマクロマーを混合することによってＰＥＧＤＡポリマー、ポリ（エチレングリコール）−ジアクリレート（ＰＲＧＤＡ：カタログ番号０１０１０Ｆ１２、米国、Ｎｅｋｔａｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）溶液又はＲＧＤで修飾したＰＥＧＤＡ溶液を調製する。ポリマー溶液を光から保護し、それは、−２０℃にて３ヵ月間保存することができる。
２）７０％のフィルター滅菌したエタノール１ｍＬに１００ｍｇの光開始剤、イグラキュア２９５９（製品番号１７０６６７３，Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を溶解する。
３）その使用まで、粉砕した氷上にＰＥＧＤＡ溶液と光開始剤溶液の双方を置く。
５）ＰＥＧＤＡ溶液に光開始剤を加え、十分に混合して最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）とする。開始剤がマクロマー溶液と非常に良く混合されていることを確認する（５μＬの光開始剤／ポリマー溶液のｍＬ）。
６）光開始剤を含有するＰＥＧＤＡ溶液を細胞ペレットに加え、ピペットを用いて泡を創らずに十分に混合することによって前駆体（光開始剤を伴ったポリマー）溶液の中で細胞（２０００〜３０００万個／ｍＬ）を浮遊させる。
７）１００＿Ｌの前駆細胞／ポリマー溶液を円筒状の金型に移し、４．４ｍＷ／ｃｍ２（Ｇｌｏｗｍａｒｋ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡ）にて長波３６５ｎｍの光に５分間暴露してゲル形成を完了させる。
８）「固化した」軟骨細胞前駆細胞を含むヒドロゲルをその金型から取り出し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−１を含有する軟骨形成性培地と共に１２穴プレートのそれらを移し、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートする。２〜３日ごとに培地を交換する。
【００６５】
Ｂ．アルギン酸ヒドロゲルにおける軟骨細胞前駆細胞の被包
１）軟骨形成性細胞を５０ｍｌの円錐管に回収し、１４５ｇにて５分間遠心する。上清を取り除き、アルギン酸ポリマー又はＲＧＤ修飾したアルギン酸ポリマーの溶液を加え、（Ｐ−１０００）ピペットマンを用いて細胞を穏やかに浮遊させる。液体中での泡立ちを回避する。
２）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養インサートトレーの１つを取り、１ｍＬの塩化カルシウム溶液でウェルを満たす。
３）ピペットマンを用いて、１００μｌの細胞浮遊液を組織培養インサートに加える。インサートをすべて満たした後、無菌のピンセットを用いて、塩化カルシウム溶液を含有するウェルにインサートを移す。５％ＣＯ２にて３７℃で２０分間それらをインキュベートする。
４）薄い曲がったヘラと共に穏やかなテコのような動きを用いてインサートから構築物を取り外す。各ウェルに構築物１つを入れ、５％ＣＯ２にて３７℃でインキュベートする。
【００６６】
ヒドロゲルに被包された軟骨細胞前駆細胞を試験管内で培養し、又は生体内で軟骨産生が望まれる部位に移植し、たとえば、損傷した又は失った軟骨を置き換えることができる。
【００６７】
Ｇｌｙｃｏｓａｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓもまた、培養、組織工学の足場及び細胞療法で使用を見い出す三次元細胞培養用のヒドロゲルを提供している。この会社はたとえば、試験管内及び生体内での細胞増殖及び分化で使用するためのヒアルロナン系、ＰＥＧ系及びコラーゲン系のヒドロゲルを提供している。
【００６８】
Ｇｌｙｃｏｓａｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの例となるヒドロゲル方式の１つは、３−Ｄ培養にて被包された細胞の穏やかで迅速な回収を可能にするＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳ（商標）である。ＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳは、少量の還元剤のみを用いたＨｙＳｔｅｍ−Ｃヒドロゲルの液化を可能にする新規の架橋剤、ＰＥＧＳＳＤＡを使用する。再構築されたＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳ（商標）は１５〜３７℃で液体のままである。架橋剤、ＰＥＧＳＳＤＡが、Ｇｌｙｃｏｓｉｌ（商標）（チオール修飾したヒアルロナン）とＧｅｌｉｎ−Ｓ（商標）（チオール修飾したゼラチン）の混合物に加えられるとヒドロゲルが形成される。３つの成分すべてが混合された後、約２０分間でゲル化が生じる。工程は低温又は低ｐＨに左右されない。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は細胞培養培地によって成分を希釈することはゲル化時間を増やすことができる。得られたヒドロゲルは、３７℃にて２時間未満で４０ｍｌのアセチル−Ｌ−システイン（還元剤）に溶解することができる。
【００６９】
製造元のプロトコールによれば、ＨｙＳｔｅｍ−ＣＳＳヒドロゲル（３×２．５ｍｌ＝７．５ｍｌ）は以下のように調製される。
【００７０】
ＨｙＳｔｅｍ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、ＰＥＧＳＳＤＡ及びＤＧ水のバイアルを室温にする。
【００７１】
無菌条件下でシリンジと針を用いて、１．０ｍｌのＤＧ水をＨｙＳｔｅｍのバイアルに加える。Ｇｅｌｉｎ−Ｓのバイアルについて繰り返す。
【００７２】
ロッカー又は振盪器の上で双方のバイアルを水平に置く。固形物が完全に溶解するのに＜３０分かかるであろう。３７℃以下に温めること及び／又は穏やかなボルテックス撹拌は溶解の速度を速める。溶液は透明であり、やや粘性である。
【００７３】
無菌条件下でシリンジと針を用いて、０．５ｍｌのＤＧ水をＰＥＧＳＳＤＡのバイアルに加える。数回反転して溶解する。
【００７４】
できるだけ速く、しかし、溶液を作製して２時間以内に、同容量のＨｙＳｔｅｍ ｔｏＧｅｌｉｎ−Ｓ（商標）を無菌的に混合する。混合するには、ピペットをゆっくり上下させ、気泡を捕捉するのを回避する。
【００７５】
２．０ｍＬのＨｙＳｔｅｍ＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓに細胞ペレットを再浮遊する。ピペットを上下させて混合する。
【００７６】
ヒドロゲルを形成するには、１：４の容量比ＰＥＧＳＳＤＡをＨｙＳｔｅｍ＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓミックスに加え（２．０ｍＬのＨｙＳｔｅｍ＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓに０．５ｍＬのＰＥＧＳＳＤＡ（商標））、ピペットによって混合する。
【００７７】
溶液を１０分間反応させ、ピペットで再び混合して細胞の均一な分布を確保する。約１０〜２０分以内にゲル化が生じる。
【００７８】
軟骨形成の応用で使用を見い出す別の例となる足場は、死体供給源、たとえば、ヒトの死体組織からの脱細胞化組織である。（たとえば、 Ｍｉｎｅｈａｒａら，「Ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｓｅｅｄｉｎｇ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｏｎｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ−ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２」Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ ２０１０ Ｊｕｎ １７．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｙａｎｇら「Ａ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ＥＣＭ−ｄｅｒｉｖｅｄ ３−Ｄ ｐｏｒｏｕｓ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＰＫＨ２６−ｌａｂｅｌｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００８ Ｍａｙ；２９（１５）：２３７８−８７；及びＳｔａｐｌｅｔｏｎら， 「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｍｅｄｉａｌ ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」 Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ． ２００８ Ａｐｒ；１４（４）：５０５−１８を参照のこと。これら各々は参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００７９】
たとえば、Ｍｉｎｅｈａｒａらは、死体からの溶媒で保存したヒト半月板と軟骨細胞走化性物質を用いた走化性細胞播種法を記載している。ＭｉｎｅｈａｒａはｒｈＢＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌで）が軟骨細胞を誘導して脱細胞化したヒト半月板に移動させることができることを明らかにしている。Ｍｉｎｅｈａｒａらは、３週間のインキュベートの後、３ｍｍの深さまでの半月板全体に移動した軟骨細胞によって新しく形成された軟骨様の細胞外マトリクスが合成されることを示した。
【００８０】
その場での軟骨形成を付与するための細胞の直接注入
たとえば、細胞株、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、７ＳＭＯＯ３２、ＳＭ３０、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４又はＥ１５又は同一の若しくは類似のマーカーを持つヒト若しくは動物の細胞、又は本発明のそのほかの細胞の直接注入は、成人骨髄由来のＭＳＣ（軟骨原）で以前報告されたものに類似する治療有用性でもある。患者は、半月板切除を受け、その後、ヒアルロン酸（ＨＡ）又は低用量（５０００万個の細胞）若しくは高用量（１５０００万個の細胞）のＭＳＣの単回注入を受ける。患者は、安全性及び追加の予備的な有効性、たとえば、疼痛、軟骨の損傷、及び組織の修復について２年間モニターされる。半月板と軟骨の状態を調べるのに非侵襲性のＭＲＩを用いる。手術の時点で変形性関節症（ＯＡ）のある患者では、１年で、対照、ＨＡの注入を受けた患者に対してＭＳＣの単回注入を受けた患者では、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）によって測定した場合、統計的に有意な２０ｍｍの疼痛低下が認められた（対照２８ｍｍに対してＭＳＣ４８ｍｍ、ｐ＝０．０５）。患者の関節でさらに重篤な変形性関節症がある場合、疼痛の低下は一層さらに３７ｍｍに増えた（ｐ＝０．００４、対照１９ｍｍに対してＭＳＣ５６ｍｍ）。因みに、ＨＡのようなＯＡに対する現在利用可能な治療は、プラセボに対する９〜２３ｍｍの改善に基づいて食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された。ＭＲＩによる容量解析法は、読み取り間に高レベルの変動性が見られるので、コンピュータによる解析には不適当であると思われた。その結果、半月板の再生の意味のある評価を行うことはできない。成人ＭＳＣの有益な効果は、関節状態の物理的対策でも見られた。軟骨下硬化症及び骨棘形成のような変形性関節症に伴う生体の変化は、対照を受け取った患者の２１％で報告されたが、ＭＳＣ治療を受けた患者ではたった６％だった。陽性の用量反応効果もあった。１年で、損傷した半月板を取り出す手術に先立ったベースラインに比べた疼痛の改善は、高用量のＭＳＣでは５６ｍｍ、低用量のＭＳＣでは２６ｍｍ、及び対照では１９ｍｍだった。関節のための細胞に基づいた治療法は、関節特異的な及び患者特異的な細胞、関節組織を再生する改善された能力を持つ細胞、規模拡大及び凍結保存の改善された能力を持つ細胞を生成する技術から恩恵を受ける。本発明は、産業的な規模拡大に好適なＳＯＸ９、ＭＳＸ１及びＭＳＸ２を発現する細胞株を提供する。
【００８１】
胚性前駆細胞株の産生方法
以下に記載する方法に加えて、本明細書で記載される細胞株の産生及び使用において使用を見い出す方法は、以下において見つけることができる：「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する米国特許公開第２００８００７０３０３号；「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０；「胚性前駆細胞株を用いた試験管内及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許仮出願、出願番号６１／２２６，２３７；「遺伝子発現の出生前パターンを持つ細胞の新規使用」と題する２００６年４月１１日に出願されたＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５１９、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００８２】
以下の方法は、ｈＥＳ細胞からの胚性前駆細胞株の産生を記載するが、たとえば、ヒト又は非ヒト動物からの原始幹細胞のようなそのほかの原始幹細胞を採用してもよい。
【００８３】
ｈＥＳ細胞の培養及び候補培養物の生成
使用したｈＥＳ細胞は、以前記載したＨ９（米国国立衛生研究所、ＷＡ０９として登録された）及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308）に由来する株（ＭＡ０３）だった。ｈＥＳ培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５５μＭのβ−メルカプトエタノール（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８％ノックアウト血清代替（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８％プラスマネート、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（ＭＡ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＭＡ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、５０単位／ｍｌのペニシリン／５０単位／ｍｌのストレプトマイシン（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にてｈＥＳ細胞を日常的に培養した。ｈＥＳ細胞は、マイトマイシン−Ｃ処理したマウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で１０％のＣＯ２と５％のＯ２の雰囲気にて３７℃で維持し、トリプシン処理又はコロニーの定期的な手動選抜によって継代した。クローン性胚性前駆細胞の産生については、ｈＥＳ細胞を１５ｍｌのディッシュ当たり５００〜１０，０００個の細胞を入れ、次いで、２工程プロトコールのもとで分化させ、第１の工程は、数々の条件下でｈＥＳ細胞を分化させ、「候補培養物」と呼ばれる細胞の多様な不均質培養物を得ることである。候補培養物の生成は、ＭＥＦ上で増殖する付着性のｈＥＳ細胞（その場での分化のコロニー）と共に、又はｈＥＳに由来する胚様体と共に実施した。その場での分化のコロニー実験については、ｈＥＳ細胞を集密まで増殖させ、種々の方法（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表Ｉに記載されたように）によって分化させた。非限定の例証として、１０％のＦＣＳを伴ったＤＭＥＭでのその場の分化でのコロニーの場合、マウスのフィーダー上のｈＥＳ細胞のコロニーの培養から培養培地を吸引し、分化のために、種々の時間後（分化培地における１，２，３，４，５，７及び９日目）、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＤ培地で培地を置き換えた。次いで０．２５％トリプシン（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞を剥離し、増殖のために１５０ｃｍ２のフラスコに入れた。１５０ｃｍ２のフラスコにおける各時点からの候補細胞を以下に記載するようにクローニングと増殖のために別のプレートに入れた。ＥＢの分化実験については、集密なｈＥＣ培養物を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（ＤＭＥＭ中、ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で１５分間処理し、コロニーを分離した。剥離した無傷のコロニーを擦り取り、遠心（１５０×ｇで５分間）によって回収し、補完表Ｉ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８）に記載された分化培地に再浮遊し、同一の分化培地を含有する６穴超低結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＰＡ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって流通）の単一ウェルに移した。実験に応じて４〜７日間、ＥＢを分化させ、分化したＥＢを０．２５％トリプシンで剥離し、種々の増殖培地を含有する６穴プレートに入れた。６穴プレートでの候補培養物を集密まで増殖させ、以下に記載するようにクローニングと増殖のために別のプレートに入れた。
【００８４】
クローン性細胞株の単離及び増殖
上述した部分的に分化した候補細胞培養物を０．２５％トリプシンで単一細胞に剥離し、補完表Ｉ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８）に示された種々の増殖培地にてさらなる分化と増殖のためにプレート当たりおよそ５００及び／又は１，０００及び／又は２，０００及び／又は５，０００個の細胞のクローニング密度で２つ組の１５ｃｍゼラチン被覆プレートに入れた。クローン性密度の細胞を増殖させ、１０〜１４日間そのままにし、発達しているコロニーを特定し、標準的な技法を用いてクローニングシリンダーとトリプシンによって回収した。クローニングしたコロニーを増殖のためにゼラチン被覆した２４穴プレートに移した。２４穴プレートでクローンが集密になるにつれて（しかし、２日を超えて細胞を集密のままにすることなく）、それらを順次１２穴、６穴、Ｔ−２５フラスコ、Ｔ−７５フラスコ、Ｔ−１５０フラスコ又はＴ−２２５フラスコ、及び最終的にローラーボトルに拡大した。ローラーボトルの段階まで増殖しているクローン性細胞株に独特にＡＣＴＣ特定番号を割り当て、写真撮影し、後の使用のためにアリコートで凍結保存した。細胞がいったん６穴ディッシュで集密に達すると、それらをＴ−２５フラスコに継代し、遺伝子発現の特性分析のためにゼラチン化６ｃｍディッシュに入れるために細胞の分画（５×１０５）を取り出した。或いは、一部の細胞を先ずＴ−２２５フラスコに継代し、次いで遺伝子発現の特性分析のためにゼラチン化６ｃｍディッシュに入れるために細胞の分画（５×１０５）を取り出した。従って、細胞が経験した集団の倍増は１８〜２１ＰＤであると判定された。クローニングプレートからの細胞クローンの取り出しに続いて、製造元の指示書当たり１００％エタノールにてクリスタルバイオレット染色（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ９１３２−ＩＬ）によって残りのコロニーを視覚化した。実験に利用した培養培地は以下を含み、平滑筋基礎培地（カタログ番号Ｃ−２２０６２Ｂ）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９２６７）、骨格筋基礎培地（カタログ番号Ｃ−２２０６０Ｂ）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９３６５）、内皮細胞基礎培地（カタログ番号Ｃ−２２２２１）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９２２１）、色素細胞基礎培地（カタログ番号Ｃ−２４０１０Ｂ）と増殖補完剤（カタログ番号Ｃ−３９４１５）はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社（ドイツ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）から入手した。ＥｐｉＬｉｆｅ、カルシウム／フェノールを含まない培地（カタログ番号Ｍ−ＥＰＩｃｆ／ＰＲＦ−５００）と低血清増殖補完剤（カタログ番号Ｓ−００３−１０）は、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｏｒｅｇｏｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ）から購入した。Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ基本培地（カタログ番号０５０４１）と補完剤（カタログ番号５４０２）は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（カタログ番号１１９６０−０６９）とウシ胎児血清（カタログ番号ＳＨ３００７０−０３）はそれぞれ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。培地及び補完剤は製造元の指示書に従って組み合わせた。
【００８５】
クローン性胚性前駆細胞株の命名
別の記号表示を伴った本発明の細胞株は、バイオインフォマティクス解析の結果生じる名称の操作の結果生じる瑣末な改変を表す異名と共に表４に列記するが、それには、「．」について「−」の置換及びその逆、アラビア数字で細胞株の名称を開始する前の「ｘ」の包含、並びに並行する解析で同一細胞株の凍結アンプルが融解され、伝播され、使用される場合の例である同一細胞株の生物学的複製を示す、「ｂｉｏｌ１」又は「ｂｉｏｌ２」、及び所与の細胞株から単離されたＲＮＡが、融解することなく、又はさもなければ、細胞の新しい培養で開始することなく、反復する解析で２回目に利用される技術的複製を示す「Ｒｅｐ１」又は「Ｒｅｐ２」のような接尾辞が含まれる。細胞株の継代数（細胞がトリプシン処理され、再びプレートに入れられる回数）は普通、文字Ｐに続くアラビア数字で指定されるが、それに対して、集団の倍増数（１つの細胞からクローンで増殖する際、細胞株が経験する推定倍増の数を指す）は、文字「ＰＤ」に続くアラビア数字で指定される。継代におけるＰＤの数は、実験ごとに異なったが、一般に、それぞれのトリプシン処理と再プレート培養は、１：３〜１：４の比率（それぞれ１．５と２のＰＤの増加に相当する）だった。クローンの増殖では、クローニングシリンダーによって組織培養から元々のコロニーを取り出し、上述のように２４穴プレート、次いで１２穴プレート、そして６穴プレートに移した。第１の集密な２４穴プレートをＰ１と名付け、第１の集密な１２穴プレートをＰ２と名付け、第１の集密な６穴プレートをＰ３と名付け、次いで６穴培養物を第２の６穴プレート（Ｐ４）とＴ２５（Ｐ４）に分けた。Ｐ４での第２の６穴プレートをＲＮＡ抽出に利用し（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号を参照）、クローン性増殖のおよそ１８〜２１ＰＰＤを表す。典型的な、推定されるその後の継代とＰＤは、Ｔ７５フラスコへの以下の分割（１９．５〜２２．５ＰＤ）、Ｔ２２５フラスコへの細胞のＰ６継代（２１〜２４ＰＤ）、次いでローラーボトルへの細胞のＰ７継代（８５０ｃｍ２、２３〜２６ＰＤ）、及び４つのローラーボトルへのＰ８の分割（２５〜２８ＰＤ）である。括弧内に上記で示す範囲は、細胞の大きさ、付着効率及び計数誤差による細胞計数の推定範囲を表す。
【００８６】
クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株の増殖
本発明の態様は、単一細胞（クローン性）、又はクローニングした細胞株が遺伝子発現マーカーのような見分けがつかないマーカーを有し、培養での細胞数を増やす目的でそれらを組み合わせて単一の細胞培養にすることを意味する「プールされたクローン性」である、又は株が、少数の通常２〜１，０００個の類似細胞から生成され、細胞株として増殖させるオリゴクローン性、又は遺伝子発現のパターンのような見分けがつかないマーカーを有する２以上のオリゴクローン性細胞株を組み合わせることによって生成される株である「プールされたオリゴクローン性」株である、細胞株に由来する胚性前駆細胞株を特定し、分化させる方法を提供する。それらが付着する基材からの細胞の取り外しを介して、前記クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株を次いで試験管内で増殖させ、通常、元々の細胞数の１／３〜１／４に減らした密度で細胞を再びプレート培養してさらなる増殖を円滑にする。前記細胞株及び関連する細胞培養培地の例は、補完情報も含めて、双方共参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号及びＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８に開示されている。本発明の組成物及び方法は、クローン性増殖の２１を超える倍増を別にして、記載されたように培養された前記細胞株に関する。
【００８７】
遺伝子発現解析
６穴プレートで増殖させる際、細胞が集密に達する日に、細胞周期の人為性による遺伝子発現の変動を抑え、早期の遺伝子発現特性を把握するために、元々の血清濃度が＞５％である場合、血清濃度を０．５％に減らした培地に細胞を入れた。ほかのすべての場合では、血清及び／又はそのほかの増殖因子は、その元々の値の１０％に減らした。これらの静止条件を５日間課し、回収に先立って２日間培養物すべてを元どおり培養し、培養差による人為性を減らした。だから、例証として、元々の培地が１０％ＦＣＳを伴うＤＭＥＭ培地であれば、静止同期化培地は、０．５％ＦＣＳを伴うＤＭＥＭだった。全ＲＮＡは、製造元の指示書に従って、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、６穴プレート又は６ｃｍ組織培養プレートで増殖している細胞から直接抽出した。ＢｅｃｋｍａｎＤＵ５３０又はＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いてＲＮＡ濃度を測定し、変性アガロースゲル電気制動又はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザによってＲＮＡの質を判定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）方式、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ−６ ｖ１及びＨｕｍａｎＲｅｆ−８ ｖ１ Ｂｅａｄｃｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ−６ ｖ２ Ｂｅａｄｃｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ２）を用いて全ゲノム発現解析を実施し、特定の遺伝子についてのＲＮＡレベルを定量ＰＣＲによって確認した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙｓについては、全ＲＮＡを線形に増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてビオチン標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザを用いてｃＲＮＡの質的制御を行った。ｃＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐｓとハイブリッド形成させ、処理し、製造元の指示書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎアレイリーダーを用いて読み取った。共通プローブセットによる細胞株すべての相対蛍光単位（ＲＦＵ）を標準化した。
【００８８】
上記の遺伝子発現解析のデータは、補完表すべてを含めて、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８の補完表に見い出すことができる。補完表ＩＩ〜ＩＶでは、（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最高ＲＦＵ値−平均ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比について遺伝子がランク順（最高−最低）で示されている。補完表Ｖでは、全細胞株についての（個々の細胞株で認められた最高ＲＦＵ値−平均ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比について上から４５の、分化して発現された遺伝子がランク順になっている。補完表ＶＩでは、認識されるＣＤ抗原に相当する遺伝子が、それぞれ、（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最高ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比及び（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最低ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比についてランク順（最高−最低）及びまた（最低−最高）で示されている。補完表ＶＩＩでは、分泌されたタンパク質に相当する遺伝子が、（細胞株の全体のセットでの遺伝子について認められた最高ＲＦＵ値）／平均ＲＦＵ値の比についてランク順（最高−最低）で示されている。
【００８９】
軟骨細胞の分化を誘導する例となる条件
本明細書で記載される前駆細胞株を用いて軟骨形成（又は軟骨産生）を誘導する好都合な方法を研究又は治療のいずれかの目的に（生体内又は試験管内のいずれかで）採用してもよいので、この点での限定は意図されないことが言及される。従って、以下に記載されるアッセイは、軟骨形成のための条件の例となる非限定例を表す。
【００９０】
微細塊分化プロトコール１
以下の分化プロトコールは単に「ｄ１４ＭＭ」と呼ばれる（たとえば、本明細書に記載されるマイクロアレイ表にて）。
１）細胞を、ゼラチン（０．１％）被覆したＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理した培養器具で培養し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａ，Ｍｇを含まず）によって１：３に希釈された０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離する。剥離と増殖培地の添加の後、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタを用いて細胞を数え、実験に必要とされる適当な数の細胞（たとえば、１０×１０６個以上の細胞）を増殖培地中で２０×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度で再浮遊する。
２）塊又は「微細塊」として１０μｌのアリコートをＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理したポリスチレンプレート又はディッシュに播く。２５以上の微細塊アリコート（２００，０００個の細胞／１０μｌアリコート）を播く。
３）播いた微細塊を付着のために、５％Ｏ２及び１０％ＣＯ２にて３７℃の加湿インキュベータに９０分間〜２時間入れる。
４）増殖培地を加え、翌朝、吸引し、ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇを含まず）で洗浄した後、軟骨形成用完全培地（ペレット微細塊用に以下で記載するように調製される）で置き換える。たとえば、１０ｃｍディッシュ当たり６ｍｌの軟骨形成用完全培地を加える。５％Ｏ２及び１０％ＣＯ２にて３７℃の加湿インキュベータで細胞を維持し、２〜３日ごとに新しく調製した培地で軟骨形成用培地を置き換える。
５）軟骨形成用培地にて種々の時間の後、Ｑｉａｇｅｎハンドブックに記載されたようにＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を用いてＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの抽出に先立ってＱｉａｇｅｎのＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（カタログ番号７９６５４）を用いて、試料をホモジネートし、次いでＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙミニキットで提供される）によって微細塊を溶解することによってＲＮＡの収率を最大化する。
【００９１】
Ｌｏｎｚａ軟骨形成用培地の代替は、Ｍｅｄｉａ ＴｅｃｈからのＣｅｌｌＧｒｏ（カタログ番号１５−０１３−ＣＶ）である。各５００ｍｌに以下の補完剤を添加する：５．０ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０）、５．０ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０）、デキサメタゾン（ＭＯ、セントルイス、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ１７５６−１００）−０．１μＭの最終濃度で０．１ｍＭを５００μｌ；Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ４９７５２）−最終濃度０．３５ｍＭで０．３５Ｍを５００μｌ；アスコルビン酸−２−リン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７９２、Ｆｌｕｋａ）−最終濃度０．１７ｍＭで０．１７Ｍを５００μｌ；ＩＴＳプレミックス（ＮＪ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＢＤ、カタログ番号４７７４３−６２８）−最終濃度で１０００×を５００μｌ；６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌの血清アルブミン、５．３５μｇ／ｍｌのリノール酸。
【００９２】
上記構成成分の添加に続いて、５００ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ０．２ミクロンフィルターユニットを介して培地を濾過する。
【００９３】
微細塊の分化プロトコール２
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４ＭＭ」と呼ばれる。
【００９４】
上記で記載されたＬｏｎｚａＴＧＦβ３の代替として我々は、ＴＧＦβ３（ＭＮ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４３−Ｂ３−０１０）を使用する。それは、Ｌｏｎｚａから購入されたものと同様に調製され、等分され、保存され、使用される。
【００９５】
微細塊の分化プロトコール３
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４ＣＳ」と呼ばれる。
【００９６】
微細塊の分化プロトコール１の代替として、血清含有培地の存在下で微細塊を付着させるのではなく、細胞を軟骨形成用完全培地に直接入れてもよい。前記分化した微細塊は、本発明では、「軟骨播種」又は「ＣＳ」と名付けられる。
【００９７】
ペレット分化プロトコール
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４Ｐｅｌ」と呼ばれる。
【００９８】
１）細胞を、ゼラチン（０．１％）被覆したＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理した培養器具で培養し、ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇを含まず）によって１：３に希釈された０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ、Ｇｉｂｃｏ）で剥離する。剥離と増殖培地の添加の後、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタを用いて細胞を数え、実験に必要とされる適当な数の細胞（たとえば、１０×１０６個以上）を無菌のポリスチレン管に移し、室温にて１５０ｇで５分間遠心する。
２）上清を吸引し、捨てる。補完剤（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｐｏｉｅｔｉｃｓ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｑｕｏｔｓ，カタログ番号ＰＴ−４１２１）を添加するｈＭＳＣ Ｃｈｏｎｄｒｏ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ＰＴ−３９２５）から成る軟骨形成用不完全培地の添加によって細胞を洗浄する。補完剤：デキサメタゾン（ＰＴ−４１３０Ｇ）、アスコルビン酸塩（ＰＴ−４１３１Ｇ）、ＩＴＳ＋補完剤（４１１３Ｇ）、ピルビン酸塩（４１１４Ｇ）、プロリン（４１１５Ｇ）、ゲンタマイシン（４５０５Ｇ）、グルタミン（ＰＴ−４１４０Ｇ）を加えて軟骨形成用不完全培地を調製する。
３）細胞を室温にて１５０ｇで遠心し、上清を吸引し、７．５×１０５個の細胞当たり１．０ｍｌの軟骨形成用不完全培地に細胞を再浮遊し（もう一度）、１５０×ｇで５分間遠心する。上清を吸引し、捨てる。若干の改変と共に、Ｌｏｎｚａによって記載されたような軟骨形成培養プロトコールに従う（以下に記述するように）。
４）ｍｌ当たり５．０×１０５個の細胞の濃度に細胞ペレットを軟骨形成用不完全培地に再浮遊させる。軟骨形成用不完全培地はＬｏｎｚａ不完全培地＋ＴＧＦβ３（Ｌｏｎｚａ、ＰＴ−４１２４）から成る。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する無菌の４ｍＭのＨＣｌの添加によって、無菌の凍結乾燥したＴＧＦβ３を２０μｇ／ｍｌの濃度に再構築し、等分した後−８０℃で保存する。軟骨形成用不完全培地の各２ｍｌについて１μｌのＴＧＦβ３の添加（ＴＧＦβ３の最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌ）によって使用直前に軟骨形成用不完全培地を調製する。
５）細胞浮遊液の０．５ｍｌ（２．５×１０５個の細胞）のアリコートを無菌の１５ｍｌポリプロピレン培養チューブに入れる。室温にて１５０×ｇで５分間、細胞を遠心する。
６）遠心に続いてチューブのフタを半回転緩め、ガス交換を可能にする。１０％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて３７℃の加湿雰囲気にチューブを入れる。２４時間ペレットをかき回さない。
７）無菌の１〜２００μｌのピペットチップによって古い培地を吸引し、各チューブに０．５ｍｌの新しく調製した軟骨形成用完全培地を加えることによって各チューブの培地を完全に置き換えることにより、細胞ペレットに２〜３日ごとに養分を与える。
８）培地を置き換え、ペレットが自由に浮いていることを確認した後、フタを緩め、チューブをインキュベータに戻す。
９）軟骨形成用培地にて種々の時点の後、ペレットを回収し、中性の緩衝化ホルマリンによる固定によって組織学用に調製し、及び／又はペレットを合わせ、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＭＤ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号７４１０４）を用いたＲＮＡ抽出用に調製する。
【００９９】
ＲＮＡ抽出のプロトコールはＱｉａｇｅｎハンドブックによって記載されたように従う。ＲＮＡの抽出に先立って、ＱｉａｇｅｎのＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（カタログ番号７９６５４）を用いて、試料をホモジネートし、次いでＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙミニキットで提供される）によって細胞ペレットを溶解することによってＲＮＡの収率を最大化する。
【０１００】
アルギン酸ビーズ分化プロトコール
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「ｄ１４アルギン酸」と呼ばれる。
【０１０１】
本発明の細胞を低速で遠心することによってペレットにし、ＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で洗浄し、再び遠心し、ペレットを２０×１０６にて１．２％アルギン酸（Ｌｏｎｚａ）に再浮遊した。２２ｇの針を介して細胞浮遊液をシリンジに引き入れ、ＣａＣｌ２槽（１０２ｍＭ）に一滴ずつ分配した。ゲル化は即座である。ＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で３〜５回ビーズを洗浄し、次いで軟骨形成用培地（ＴＧＦなしで）で１回洗浄し、その後、軟骨形成用培地に浸漬した。６穴プレートの複数のウェルにビーズを入れ、１週間に３日、１４日間養分を与えた。次いでビーズをＮａＣｌで複数回洗浄し、その後クエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）に２０分間暴露して脱重合した。遠心の後、ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）によって細胞ペレットを溶解し、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒを用いて収率を改善する破砕工程に続いて、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。上記のようなｑＰＣＲによってＣＯＬ２Ａ１の発現を測定した。
【０１０２】
軟骨細胞分化の遺伝子発現マーカー
本明細書に記載されるようなマイクロアレイ又はｑＰＣＲによって軟骨細胞の遺伝子発現をアッセイしてもよい。ｑＰＣＲプライマー配列は当該技術で既知の手段で選択してもよく、非限定の例証として、以下であってもよい。
【０１０３】
【０１０４】
ｑＰＣＲプロトコールは様々であってもよく、当該技術で周知である。非限定の例証として、ｃＤＮＡのＲＮＡ同等物３０ｎｇ，プライマー当たり０．４μＭ、超純度蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、全反応容量２５μｌでＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを組み入れる１２．５μｌのＰｏｗｅｒＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒミックス（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６７６５９）で１：１に希釈した試験用試料を標準の光学９６穴反応プレート（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３０６７３７）にて調製する。ＳＤＳｖ１．２ソフトウエアを採用するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲ方式を用いてリアルタイムｑＰＣＲを実行する。増幅条件は、５０℃にて２分間（段階１）、９５℃で１０分間（段階２）、９５℃で１５秒間、次いで６０℃で１分間を４０サイクル（段階３）、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の解離段階（段階４）にて設定する。当該遺伝子の増幅産物のＣｔ値を３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤ、ＲＰＳ１０及びＧＵＳＢ）のＣｔ値の平均に対して標準化する。
【０１０５】
サフラニンＯ染色アッセイ
軟骨関連のプロテオグリカンの検出では、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片のサフラニンＯによる染色の周知の技法が一般に使用されるが、それは、ムチン、肥満細胞顆粒、及びおそらくそのほかの細胞種におけるそのほかの物質も染色するので、アッセイは軟骨に絶対に特異的であるわけではない。軟骨とムチンが橙色〜赤色に染色され、核が黒く染色され、背景が緑色に染色されるプロトコールの非限定例は、ホルマリン固定した細胞の微細塊、ペレット又は類似の凝集体を使用する。使用される試薬には、Ｗｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン溶液：その中では、９５％アルコール１００ｍｌ中の１グラムのヘマトキシリンから構成されるストック溶液Ａ；蒸留水９５ｍｌと濃塩酸１．０ｍｌで希釈した２９％塩化第二鉄水溶液４ｍｌで構成されるストック溶液Ｂ；等量のストック溶液ＡとＢで構成され、４週間以内に使用されるＷｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン使用液；１０００ｍｌの蒸留水中の０．０１グラムのＦａｓｔＧｒｅｅｎ、ＦＣＦ、Ｃ．Ｉ．４２０５３で構成される０．００１％ＦａｓｔＧｒｅｅｎ（ＦＣＦ）溶液；９９ｍｌの蒸留水中１．０ｍｌの氷酢酸で構成される１％酢酸溶液；及び１００ｍｌの蒸留水中０．１グラムのサフラニンＯ、Ｃ．Ｉ．５０２４０で構成される０．１％サフラニンＯ溶液が含まれる。試料を脱パラフィンし、蒸留水で水和する。Ｗｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン使用液でそれらを１０分間染色し、次いで流水で１０分間洗浄し、ＦａｓｔＧｒｅｅｎ（ＦＣＦ）溶液で５分間染色し、１０〜１５秒間以下で１％酢酸溶液にて迅速にすすぎ、０．１％サフラニンＯ溶液で５分間染色し、それぞれ２回交換し、それぞれ２分間、９５％エチルアルコール、無水アルコール及びキシレンで脱水し、透徹し、樹脂媒体を用いて標本にし、上述のような染色について画像解析する。軟骨関連のプロテオグリカンは暗赤色〜橙色に染まる。
【０１０６】
低処理能力スクリーニング及びｑＰＣＲ
１，２，３，４，５又は好ましくは１０を超える多様な分化条件にて、＜２１、又は好ましくは＞２１のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０の倍増（細胞のクローン性増殖の２９倍増前は、限定された量でしか利用できず、７０倍増を超えると細胞は一般に老化に近づくので）における本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を同時にスクリーニングする。分化条件には、「微細塊分化」、「ペレット分化」及び「アルギン酸ビーズ分化」として記載されるものが含まれてもよい。
【０１０７】
アッセイの読み取りは、「軟骨細胞分化の遺伝子発現マーカー」として上述されたものを含むが、これらに限定されない軟骨細胞分化のｍＲＮＡマーカーであることができ、マイクロアレイ又はｑＰＣＲを含むが、これらに限定されないアレイ化標的配列へのハイブリッド形成によって測定することができる。検出はまた、特異抗体の使用を介して、酵素アッセイ、質量分光分析、又は当該技術で周知のそのほかの類似の手段の使用を介して検出されてもよいペプチド又はタンパク質のレベルであることもできる。
【０１０８】
クローン性又はオリゴクローン性の胚性前駆細胞の運命期間の中程度処理能力のスクリーニング
１０、２０、３０、４０、５０又は好ましくは１００を超える多様な分化条件（たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載された分化条件を参照）にて、＜２１、又は好ましくは＞２１のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０の倍増（細胞のクローン性増殖の２９倍増前は、限定された量でしか利用できず、７０倍増を超えると細胞は一般に老化に近づくので）における本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を同時にスクリーニングする。前記分化条件にて、１〜６週間、最も好ましくは４週間、細胞を培養する。
【０１０９】
アッセイの読み取りは、「軟骨細胞分化の遺伝子発現マーカー」のような軟骨細胞分化のｍＲＮＡマーカーであることができ、マイクロアレイ又はＰＣＲを含むが、これらに限定されないアレイ化標的配列へのハイブリッド形成によって測定することができる。検出はまた、特異抗体の使用を介して、酵素アッセイ、質量分光分析、又は当該技術で周知のそのほかの類似の手段の使用を介して検出されてもよいペプチド又はタンパク質のレベルであることもできる。
【０１１０】
ｈＥＰ細胞分化の中程度処理能力のｑＰＣＲスクリーニング
＜２１、又は好ましくは＞２１のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０の倍増にて上述されたものを含むが、これらに限定されない本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を１２ウェル培養プレートに入れ、各ウェルは２５０，０００細胞の１０微細塊（すなわち、ウェル当たり２５０万個の細胞）を有する。或いは、ほかの培養条件（たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載されたような；表ＩＩＩで列記された培養培地の組み合わせに暴露された同一数の細胞を用いた表ＩＩ及びこれらの出願の表ＩＶで列記された補完された因子を参照）によって細胞を処理する。前記分化条件にて、１〜６週間、最も好ましくは４週間、細胞を培養する。
【０１１１】
製造元の指示書に従って、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞溶解物からＲＮＡを調製する。手短には、細胞培養物（微細塊）をＰＢＳですすぎ、次いで最小限の量のＲＬＮ溶解緩衝液で溶解する。氷上でインキュベートした後、細胞残渣を遠心で取り除き、溶解物をＲＬＴ緩衝液と混合し、その後、エタノールを混合物に加える。次いで合わせた混合物をＲＮｅａｓｙスピンカラムに負荷し、遠心する。次いで負荷したカラムを洗浄し、精製されたＲＮＡを最少限の量のＤＥＰＣ処理水（通常３０μｌ以下）と共にカラムから解放する。最終溶離液中のＲＮＡの濃度は２６０ｎｍでの吸収によって測定する。
【０１１２】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡキット（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡ合成を行う。手短には、ランダムヘキサマーの存在下で２．５μｇの精製ＲＮＡを熱変性する。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素とキットからの関連試薬を用いて第１鎖反応を完了する。製造元の指示書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、得られた産物をさらに精製する。手短には、第１鎖ｃＤＮＡ反応の産物にＰＢ緩衝液を加え、次いで混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに負荷し、遠心する。カラムをＰＥ緩衝液で洗浄し、最少容量の水（２０μｌ）を用いて精製ｃＤＮＡをカラムから溶出する。
【０１１３】
各標的遺伝子についてｑＰＣＲプライマー対を合成する。手短には、標的ｍＲＮＡ配列のみを増幅し、６５〜８０℃の範囲にある標的配列のためのアニーリング温度と１００〜５００ｂｐのサイズ範囲にある独特の増幅産物を最適に有するように標的遺伝子用のプライマー対を設計する。特注のｑＰＣＲオープンアレイプレートの作製のためにプライマー対を使用濃度（１０μＭ）でＢｉｏＴｒｏｖｅ社に供給する。オープンアレイプレートは５６〜３３６のプライマー対を収容するように設計され、乾燥させたプライマー対を伴った最終製造されたプレートがサービス会社に提供される。オープンアレイ自動負荷装置（ＢｉｏＴｒｏｖｅ）を用いてオープンアレイプレートの個々のウェルに精製ｃＤＮＡ反応産物（２．）とＳｙｂｅｒグリーンマスターミックスを負荷する。プレートを密封し、増幅のためにＮＴイメージャー／サイクラー装置（ＢｉｏＴｒｏｖｅ）にｑＰＣＲを負荷する。各試料のＣｔ値は、オープンアレイ応用ソフトウエアを用いて算出する。
【０１１４】
応用
動物の細胞及び組織の培養に関して開示される方法は、たとえば、変形性関節症のような関節炎、椎間組織の変性、一時的な下顎関節の疾患、鼻、外耳、下顎関節、気管、輪状軟骨、胸骨、又はそのほかの滑膜関節、たとえば、肩、肘、手首、指及び体重がかかる関節、たとえば、尻、膝、足首及び足指を含むが、これらに限定されない整形外科症状の治療に有用なヒト細胞及び細胞に由来する製剤を生成することに限定されない、哺乳類及びヒトの細胞療法において細胞又はその前駆細胞を生成することに有用である。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞が、細胞生物学、細胞に基づく創薬、及び細胞療法に関連する障害の研究及び治療に利用される。本発明の方法を用いて導かれる単一細胞由来の細胞集団は、分化経路に向かう必要なシグナルをすでに受け取っていてもよい。
【０１１６】
本発明の特定の実施形態では、単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、それらが治療上の有用性を示すために通常存在している組織に導入される。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞が、ほかの多能性幹細胞の分化の誘導に利用される。試験管内で増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団は、ほかの多能性幹細胞の分化を誘導することにおいて有用である。細胞と細胞の相互作用は、早期胚において分化を指向する一般的な手段である。脊髄ニューロン、心臓細胞、膵臓β細胞及び限定的な造血細胞を含む多数の医学的に有用である可能性がある細胞種は、正常な胚発生の間での誘導シグナルに影響される。試験管内で増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団を種々の試験管内、胚内、又は生体内での条件で培養してそのほかの多能性幹細胞が所望の細胞種又は組織種になる分化を誘導することができる。誘導細胞を標的細胞と並置する種々の方法にて誘導を行ってもよい。非限定の例証として、誘導細胞を組織培養にてプレート培養し、マイトマイシンＣ又は放射線で処理して細胞のさらなる複製を妨げる。次いで細胞分裂上不活化された誘導細胞の上で標的細胞をプレート培養する。或いは、細胞のさらに大きな培養又は元々の単一細胞由来のコロニーから取り外し可能な膜の上で単一細胞由来の誘導細胞を培養してもよく、標的細胞を誘導細胞の上でプレート培養してもよく、又は標的細胞で覆った別の膜を、直接接触にて２つの細胞層を挟むように並置してもよい。細胞の得られる二重層を試験管内で培養し、ＳＰＦの鳥類の卵に移し、血管支援を受けながら三次元への増殖を可能にする条件で培養してもよい（たとえば、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年７月２８日に公開された国際特許公開番号ＷＯ２００５０６８６１０を参照）。誘導細胞はまた、誘導細胞を任意で取り除くことができるように自殺構築物が導入されている、ｈＥＳ及びｈＥＤ細胞を含む多能性幹細胞の起源に由来してもよい。単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の誘導に有用な細胞種には、正常な胚発生で天然に生じることが当該技術で周知である誘導の場合が挙げられてもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、多能性幹細胞を含むそのほかの細胞種の増殖を支援する「フィーダー細胞」として使用される。本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞のフィーダー細胞としての使用は、そのほかの哺乳類起源のフィーダー細胞からの病原体の標的細胞への伝染のリスクの可能性を緩和する。フィーダー細胞は、たとえば、γ線照射によって又はマイトマイシンＣ処理によって不活化されて複製を限定され、多能性幹細胞と共培養されてもよい。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を用いてあまり分化しない細胞を支援してもよい（たとえば、Stojkovic et al., Stem Cells (2005) 23(3):306-14を参照）。通常フィーダー細胞を必要とする特定の細胞種は、マトリクス上でのフィーダーのない培養で支援される（Rosler et al., Dev Dyn. (2004) 229(2):259-74）。たとえば、ＳＴＯマウス線維芽細胞株（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５０３）又はヒト胎盤線維芽細胞のようなマトリクス形成細胞株を予備培養し、溶解することによってマトリクスを堆積させることができる（ＷＯ９９／２０７４１を参照）。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態では、単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の培養物の順化培地を回収し、プールし、濾過し、順化培地として保存してもよい。この順化培地を製剤化し、研究及び治療で使用してもよい。そのような順化培地は、あまり分化しない状態を維持し、多能性幹細胞のような細胞の増殖を可能にすることに寄与してもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の培養物の順化培地を用いて多能性幹細胞を含むそのほかの細胞種の分化を誘導することができる。単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞の培養物の順化培地の使用は、ほかの哺乳類起源に由来する非ヒト動物病原体に培養細胞を暴露するリスクの可能性を下げる点で有利であってもよい（すなわち、異種を含まない）。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、既知の細胞培養条件下では上手く増殖しない細胞種を誘導して、細胞周期の阻害を克服する因子の調節された発現、たとえば、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原（Ｔａｇ）、又は調節されたＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ、又はパピローマウイルスＥ６及び／又はＥ７、又はＣＤＫ４の調節された発現を介して本発明の方法に従ってそれらをクローンで又はオリゴクローンで単離することができるように増殖させてもよい（たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７を参照）。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、細胞周期の停止に優先する因子を追加のタンパク質又はタンパク質ドメインに融合し、細胞に送達してもよい。たとえば、細胞周期の停止に優先する因子をタンパク質変換ドメイン（ＰＴＤ）に連結してもよい。細胞周期の停止に優先する因子に共有結合する又は非共有結合するタンパク質変換ドメインは、前記因子の細胞膜を横切った移動を可能にするので、タンパク質は最終的に核に達する。細胞周期の停止に優先する因子と融合されてもよいＰＴＤには、ＨＩＶトランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）（Ｔａｔ４７〜５７）のＰＴＤが挙げられる（Schwarze and Dowdy 2000 Trends Pharmacol. Sci. 21: 45-48; Krosl et al. 2003 Nature Medicine (9): 1428-1432）。ＨＩＶのＴＡＴタンパク質については、膜転移活性を付与するアミノ酸配列は残基４７〜５７に相当する（Ho et al., 2001, Cancer Research 61: 473-477; Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16010-16017）。これらの残基のみでタンパク質の転移活性を付与することができる。
【０１２１】
本発明の別の実施形態では、ＰＴＤと細胞周期停止因子はリンカーを介して結合してもよい。リンカーの正確な長さと配列及び連結される配列に対する方向付けは様々であってもよい。リンカーは、たとえば、２、１０、２０、３０以上のアミノ酸を含んでもよく、たとえば、溶解性、長さ、立体分離などのような所望の特性に基づいて選択されてもよい。特定の実施形態では、リンカーは、たとえば、融合タンパク質の精製、検出、又は修飾に有用な官能配列を含んでもよい。
【０１２２】
本発明の別の実施形態では、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年８月３日に出願された米国特許出願第６０／７０５，６２５号、２００５年１０月２０日に出願された同第６０／７２９，１７３号、２００６年７月５日に出願された同第６０／８１８，８１３号に記載されたように、新規の再プログラム技法を介して本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を未分化状態に再プログラムしてもよい。手短には、第１の核リモデリング工程、第２の細胞再構築工程、工程２から生じる細胞の得られるコロニーが再プログラムの程度及び核型と質の正常性について特徴付けられる第３の工程が関与する少なくとも２工程、好ましくは３工程の過程を用いて細胞を未分化状態に再プログラムしてもよい。特定の実施形態では、分化した細胞の核エンベロープとクロマチンを未分化細胞又は生殖系列細胞の分子組成にさらによく似るようにリモデリングすることによって再プログラム過程の第１の核リモデリング工程にて、本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を再プログラムしてもよい。再プログラム過程の第２の細胞再構築工程では、移した核と一緒に、たとえば、増殖可能なＥＳ様細胞又はＥＤ様細胞のような未分化幹細胞の集団を生成することが可能である必要な有糸分裂装置を含有する細胞質泡状突起と、工程１のリモデリングされたエンベロープを含有する核を次いで融合する。再プログラム過程の第３の工程では、工程２の結果生じる１又は多数の細胞から生じる細胞のコロニーを、再プログラムの程度と核型の正常性について特徴付け、高い品質のコロニーを選択する。この第３の工程は細胞を上手く再プログラムするのに必要とされず、応用の一部では必要ではない一方で、第３の品質管理工程の包含は、再プログラムされた細胞が、たとえば、ヒトでの移植のような特定の応用で使用される場合好まれる。最終的に、正常な核型を有するが、十分な程度のプログラムを有さない再プログラムされた細胞のコロニーは、工程１と２又は工程１〜３を繰り返すことによって再利用される。
【０１２３】
本発明の別の実施形態では、単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を用いてファージディスプレイ法を用いたリガンドを生成してもよい（たとえば、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年５月２７日に出願された米国特許出願第６０／６８５，７５８号及び２００６年５月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２０５５２を参照）。
【０１２４】
遺伝子発現レベルの測定は、マイクロアレイ遺伝子発現解析、ビーズアレイ遺伝子発現解析及びノーザン解析を含むが、これらに限定されない、当該技術で既知の方法によって実施してもよい。遺伝子発現のレベルは、ＡＤＰＲＴ（受入番号ＮＭ＿００１６１８．２）、ＣＡＰＤ（受入番号ＮＭ＿００２０４６．２）又は当該技術で既知のそのほかのハウスキーピング遺伝子に対して標準化された相対発現として表されてもよい。遺伝子発現のデータは中央値法の中央値によって標準化されてもよい。この方法では、各アレイは異なった総強度を与える。中央値を使用することは、実験にて細胞株（アレイ）を比較する堅実な方法である。一例として、中央値は各細胞株について見い出され、次いでそれら中央値の中央値が標準化のための値になった。各細胞株からのシグナルは、他の細胞株のそれぞれに対して相対的なものとなった。
【０１２５】
本発明の別の実施形態では、本発明の単一細胞由来の細胞又はオリゴクローン性細胞由来の細胞は、細胞表面の抗原であるＣＤ抗原遺伝子の発現の独特のパターンを表してもよい。細胞表面におけるＣＤ抗原の差次的発現は、たとえば、市販の抗体を用いて、ＤＣ抗原が細胞によって発現されることに基づいて細胞を選別するためのツールとして有用であり得る。本発明の一部の細胞のＣＤ抗原の発現特性は、補完情報を含めて、参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８に示されている。たとえば、ＥＳ細胞では発現されるが、本発明の相対的にさらに分化した細胞では発現されない（又は場合によって、低レベルでしか発現されない）ＣＤ抗原がある。これは、ＥＳ細胞を選択する、選別する、精製する及び／又は特徴付けるための非常に有用なツールであり得る。ＣＤ抗原は細胞表面に発現され、それに対する抗体は、一般的に言って市販されているので、抗体（又はそれらの特定の組み合わせ）を用いて細胞の不均質な混合物からＥＳ細胞又は本発明の細胞の純粋な集団を精製することができる。このことは、ＥＳ細胞又は本発明の細胞を増殖させる、又は種々の商業目的でこれらの細胞を調製する様々な戦略で有用であり得る。
【０１２６】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞をマウスに注射して分化抗原に対する抗体を生じてもよい。分化抗原に対する抗体は、細胞療法のために、細胞分化における研究のために集団の純度を記録するように細胞を特定するのに、同様に移植後の細胞の存在と運命を記録するのに有用である。一般に、抗体を生じるための技法は当該技術で周知である。
【０１２７】
本発明の方法によって産生される細胞を遺伝子操作して大量のＢＭＰ３ｂ又はＢＭＰファミリーのほかのメンバーを産生することができるので、この細胞は骨消耗性疾患にて骨を誘導するのに有用であり得る。下顎の間充組織のマーカーを持つ４Ｄ２０．８と称する本発明の細胞株の場合、たとえば、ＢＭＰ３ｂ又はＢＭＰファミリーのほかのメンバーのような因子の過剰発現は、骨壊死又は下顎のような骨の骨折の治療に有用である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態では、軟骨形成を経験することが可能である単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、非ヒト動物種から生成され、獣医疾患の治療に使用されてもよい。
【０１２９】
本発明の別の実施形態では、軟骨形成を経験することが可能である単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞を実験的に用いて、ヒト及び非ヒトの生体における多様な軟骨種をもたらす転写調節ネットワークを含む軟骨細胞の分化における研究を実施してもよい。
【０１３０】
組み合わせ
明瞭性のために別々の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態における組み合わせにて提供されてもよいことが十分に理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴はまた別々に又は好適な下位の組み合わせで提供されてもよい。対象となる胚性軟骨細胞前駆細胞の遺伝子発現パターンに関する実施形態の組み合わせはすべて本発明によって包含され、それぞれ及びあらゆる組み合わせが個々に且つ明白に開示されたかのように本明細書で開示される。従って、記載されるマーカーを示す胚性軟骨細胞前駆細胞が本明細書で提供される。
【０１３１】
システム及びキット
本発明によって提供されるのはまた、本明細書で記載されるような種々の応用で使用するために設計されたシステム及びキットである。
【０１３２】
たとえば、本発明の態様に係るシステム及びキット（一般に以下のように「キット」と呼ばれる）には、本発明の１以上の胚性軟骨細胞前駆細胞株が含まれる。キットはさらに、使用のための指示書と同様に、研究及び／又は治療応用のための細胞の増殖及び使用のための試薬及び材料を含んでもよい。キットはまた、上記で名付けたプロトコール：微細塊分化プロトコール１、微細塊分化プロトコール２、微細塊分化プロトコール３、ペレット分化プロトコール及びアルギン酸ビーズ分化プロトコールに記載された材料のような、細胞の軟骨細胞への分化を誘導するのに本明細書で使用される試薬も含有してもよい。
【０１３３】
一部の実施形態では、キットは軟骨産生用に設計され、本明細書で記載される１以上の胚性軟骨細胞前駆細胞株と、細胞を増殖する及び／又は軟骨形成を誘導するのに使用される１以上の追加の成分を含む。そのようなキットで提供される胚性軟骨細胞前駆細胞株は、たとえば、細胞株：ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１及び７ＰＥＮＤ２４のそれのような、本発明の胚性前駆細胞の遺伝子発現マーカーを表示する。増殖及び／又は軟骨細胞分化のための成分には、マトリクス又は足場（又はマトリクス／足場を生成する、たとえば、ヒドロゲルを生成するための試薬）、水和剤（たとえば、生理学的に適合性の生理食塩水溶液、調製された細胞培養培地）、細胞培養上清（たとえば、培養ディッシュ、プレート、バイアル等）、細胞培養培地（液体形態であれ、粉末形態であれ）、抗生剤化合物、ホルモン、添加剤等を含む、そのような目的で本明細書に記載される任意の成分を挙げることができる。
【０１３４】
特定の実施形態では、キットはさらに、たとえば、実験動物への又はそれを必要とする患者、たとえば、軟骨修復療法／置換療法を必要とする患者への細胞集団の送達を円滑にするように設計された成分を含んでもよい。これら後者の実施形態では、キットの成分は、治療上の使用に好適な形態で提供されてもよい（たとえば、無菌／医療等級の成分として提供される）。送達成分には、細胞集団を被包する又は不動化するために設計されたもの（たとえば、足場又はマトリクス）、同様に、直接、又は、欠陥部位に単離した細胞を注入すること、好適な足場若しくはマトリクスと共に胚性前駆細胞を培養し、埋め込むこと、生体吸収性の足場と共にインキュベートすることを含む、そのほかの成分と関連して細胞を送達するために設計されたものが挙げられる。上記で詳述されたような生体吸収性、生体適合性の足場のような好都合な足場又はマトリクスを採用してもよく、治療用の軟骨修復／置換での使用のために多数が採用されており、又は試験されている。
【０１３５】
一部の実施形態では、キットは、送達された／移植された細胞集団が少なくとも１つの所望の部位、たとえば、軟骨損傷の部位に局在することを判定するのに使用するための成分を含む。そのような成分は、対象に送達された細胞の局在化及びさらに定量化の判定を可能にし得る。
【０１３６】
特定の実施形態では、キットにおける胚性軟骨細胞前駆細胞の株（単数）又は株（複数）を遺伝子操作する。たとえば、胚性軟骨細胞前駆細胞株を操作して外因性遺伝子、たとえば、細胞株に由来する細胞を後で特定するのに使用することができるマーカー遺伝子（たとえば、当該技術で周知のようなレポーター遺伝子）を発現させてもよい。レポーター遺伝子には、直接又は間接的に検出可能であるもの、たとえば、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素、細胞表面マーカーなどが挙げられる。特定の実施形態では、異なった細胞株を再操作して、互いに識別可能な外因性レポーター遺伝子、たとえば、異なった励起及び／又は放射の特徴を有する蛍光タンパク質を発現させる。
【０１３７】
特定の実施形態では、キットは、その用途に必要な成分のいずれか又はすべてを含むことができる。たとえば、本発明に係るキットは、多数のそのほかの好適な物品又は成分、たとえば、人工関節、チューブ、縫合糸、外科用メス、針、シリンジ、手術部位の用意のための消毒剤、整形外科用具等を含んでもよい。
【０１３８】
本発明の態様では、追加の種類のキットも提供される。
【０１３９】
たとえば、本発明に係る軟骨細胞前駆細胞の特定及び／又は単離のためにキットが提供される。そのようなキットには、本明細書で記載される遺伝子発現マーカーのいずれかを含む細胞マーカーの発現を検出するために設計された試薬が含まれる。そのような検出試薬が製剤化されてタンパク質レベル又は核酸（たとえば、ｍＲＮＡ）レベルのいずれかでこれら遺伝子の発現産物を検出してもよい。従って、試薬には、抗体又はその特異的結合部分（たとえば、検出可能に標識された抗体）、そのほかの特異的結合剤（たとえば、リガンド又は可溶性受容体）、ハイブリッド形成の解析、たとえば、ノーザンブロット解析、マイクロアレイ解析などで使用するための核酸プローブ、ＰＣＲアッセイ、たとえば、上記で詳述されたような定量ＰＣＲアッセイで使用するためのプライマー対、等が挙げられてもよい。
【０１４０】
上記で言及したように、本キットは通常さらに、本方法を実践する、たとえば、本方法の態様に従って変異法を実施するために核酸試料を調製するためのキットの成分を使用するための指示書を含む。本方法を実践するための指示書は一般に、好適な記録媒体に記録される。たとえば、指示書は、たとえば、紙又はプラスチック等のような基材に印刷されてもよい。従って、指示書は、キットの容器のラベル又はそのコメント等にて（すなわち、包装又は下位包装と関連して）添付文書としてキットに存在してもよい。ほかの実施形態では、指示書は、好適なコンピュータ読み取り保存媒体、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスク等に存在する電子保存データファイルとして存在する。さらにほかの実施形態では、実際の指示書は、キットには存在せず、たとえば、インターネットを介した遠隔供給源から指示書を入手する手段が提供される。この実施形態の例は、指示書を見ることができる及び／又は指示書をダウンロードすることができるＷｅｂアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を入手するためのこの手段は好適な基材に記録される。
【０１４１】
上記で言及した成分に加えて、キットはまた、１以上の対照試料及び試薬、たとえば、２以上の対照試料も含む。そのような対照試料は、任意の形態、たとえば、既知のマーカー特性を有する追加の細胞株、遺伝子発現データを解析するのに使用するための陰性及び陽性の対照試料、等の形態を取ってもよい。本キットでは、任意の対照試料を採用してもよい。
【０１４２】
生物寄託
本出願で記載される細胞株は、ブタペスト条約のもとでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」：米国、ＶＡ、２０１０８，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９）に寄託されている。細胞株４Ｄ２０．８（ＡＣＴＣ８４としても知られる）は、継代１１で２００９年７月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２３１を有する。細胞株ＳＭ３０（ＡＣＴＣ２５６としても知られる）は、継代１２で２００９年７月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２３２を有する。細胞株７ＳＭＯＯ３２（ＡＣＴＣ２７８としても知られる）は、継代１２で２００９年７月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２３３を有する。細胞株Ｅ１５（ＡＣＴＣ９８としても知られる）は、継代２０で２００９年９月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０３４１を有する。細胞株ＭＥＬ２（ＡＣＴＣ２６８としても知られる）は、継代２２で２０１０年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１１５０を有する。細胞株ＳＫ１１（ＡＣＴＣ２５０としても知られる）は、継代１３で２０１０年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１１５２を有する。細胞株７ＰＥＮＤ２４（ＡＣＴＣ２８３としても知られる）は、継代１１で２０１０年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１１４９を有する。
【０１４３】
実施例
以下の実施例は、本発明を如何に作製し、使用するかの完全な開示と記載を当業者に提供できるように提起されるものであって、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された実験すべて、又はそれのみであることを表すことを意図するものではない。使用された数（たとえば、量、温度等）について精度を確保するように尽力したが、一部の実験の誤差及び偏差は説明されるべきである。特に指示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれに近い。
【０１４４】
実施例１
軟骨形成分化条件の低処理能力選抜におけるヒトのクローン性胚性前駆細胞株のマイクロアレイ解析
細胞株、１０ＲＰＥ８、４Ｄ２０．８、４Ｄ２０．９、４ＳＫＥＬ２０、７ＰＥＮＤ１２、７ＰＥＮＤ２４、７ＰＥＮＤ３０、７ＰＥＮＤ９、７ＳＫＥＬ４、７ＳＫＥＬ７、７ＳＭＯＯ２５、７ＳＭＯＯ３２、７ＳＭＯＯ７、７ＳＭＯＯ９、Ｂ１６、Ｃ４．４、Ｃ４ＥＬＳ５．１、Ｃ４ＥＬＳ５．６、Ｃ４ＥＬＳＲ１０、Ｃ４ＥＬＳＲ２、ＣＭＯ２、Ｅ１０９、Ｅ１１１、Ｅ１２０、Ｅ１５、Ｅ１６４、Ｅ３３、Ｅ４４、Ｅ６８、Ｅ６９、Ｅ８５、ＥＮ１、ＥＮ１３、ＥＮ１６、ＥＮ１８、ＥＮ２、ＥＮ２２、ＥＮ２３、ＥＮ２６、ＥＮ２７、ＥＮ３１、ＥＮ４、ＥＮ４２、ＥＮ４７、ＥＮ５、ＥＮ５１、ＥＮ５５、ＥＮ７、ＥＮ８、Ｆ１５、Ｊ１６、ＭＥＬ２、ＭＥＬ２、ＭＷ１、ＲＡＤ２０．１６、ＲＡＤ２０．１９、ＲＡＤ２０．４、ＲＡＤ２０．５、ＲＡＤ２０．６、ＲＡＰＥＮＤ１０、ＲＡＰＥＮＤ１５、ＲＡＰＥＮＤ１８、ＲＡＳＫＥＬ８、ＲＡＳＭＯ１２、ＲＡＳＭＯ１９、ＳＫ１１、ＳＫ１７、ＳＫ１８、ＳＫ２５、ＳＫ３１、ＳＫ３５、ＳＫ４３、ＳＫ４４、ＳＫ４６、ＳＫ４７、ＳＫ４９、ＳＫ５０、ＳＫ５２、ＳＭ１７、ＳＭ２、ＳＭ２２、ＳＭ２８、ＳＭ２８、ＳＭ３０、ＳＭ３３、ＳＭ８、Ｔ１４、Ｔ２０、Ｔ３６、Ｔ４２、Ｔ４３、Ｔ４４、Ｔ７、Ｕ３１、Ｗ１０、Ｗ１１、Ｗ８、Ｚ１、Ｚ１１、Ｚ２及びＺ３を「微細塊分化プロトコール１」として上述のように選抜し、サブセットを「ペレット分化」及び「アルギン酸ビーズ分化」として分化させた。手短には、対照の細胞種：継代３のヒト骨髄間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ）、脂肪細胞幹細胞（ＡＳＣ）、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、包皮皮膚線維芽細胞（ＸｇｅｎｅＦＢ）、及び正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）を選抜に含めた。本明細書で記載されるように、同様にそれぞれ参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載されたように、選抜される細胞株並びに上述の対照の細胞種を５％の外気酸素を伴ったインキュベータにて、増殖停止又は微細塊及びペレットの軟骨形成条件にて同期化した。例証として、静止における同期化を誘導する条件については、通常製造元に推奨された濃度で補完剤を伴い、完全キットとして（カタログ番号Ｃ−２２０２２）として販売されているＰｒｏｍｏｃｅｌｌ内皮ＭＶ２培地にて細胞が集密に達するまで、細胞株７ＰＥＮＤ２４（ＡＣＴＣ２８３）を培養した。集密に達した際、培地を取り除き、元々の補完剤ミックスの１０％を伴った同一のＰｒｏｍｏｃｅｌｌ培地に置き換えた。３日後、培地を吸引し、さらに２日間（合計静止条件で５日間）、同一培地（すなわち、１０％の通常補完剤）で置き換えた。細胞株４Ｄ２０．８（ＡＣＴＣ８４）の場合、細胞が集密に達するまで、２０％ＦＣＳを補完したＤＭＥＭ培地で細胞を培養した。集密に達すると、培地を取り出し、元々の濃度の１０％（すなわち、２％ＦＣＳ）を伴った同一のＤＭＥＭ培地に置き換えた。３日後、培地を吸引し、同一の培地（すなわち、２％ＦＣＳを伴ったＤＭＥＭ）でさらに２日間（すなわち、合計で静止条件の５日間）、置き換え、又はペレット若しくは微細塊として軟骨形成条件にて１２日間若しくは１４日間分化させた。本明細書で記載されるようにＲＮＡを回収し、ｑＰＣＲによってアッセイし、本明細書で記載されるように遺伝子発現解析のためにＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアッセイとハイブリッド形成させた。骨髄の間葉幹細胞は、軟骨細胞遺伝子発現の顕著な上方調節と共にペレット及び微細塊双方の軟骨形成条件に反応した。軟骨細胞の分化マーカーの例には、軟骨に特異的ではないが、軟骨形成中に上方調節されるＭＧＰ及びＰＥＮＫ、軟骨の発生に相対的に特異的であるＣＯＬ２Ａ１、ＭＡＴＮ４、ＥＰＹＣ、ＣＯＬ９Ａ２及びＬＥＣＴ１が挙げられる。細胞株４Ｄ２０．８における未分化条件と１４日目の微細塊条件における遺伝子発現の比較は、＞４７９倍のＭＧＰの発現、＞１０倍のＭＡＴＮ４の発現、＞３６９倍のＰＥＮＫの発現、＞６０倍のＣＯＬ２Ａ１の発現、＞４２倍のＥＰＹＣの発現、＞２５倍のＣＯＬ９Ａ２の発現、＞２４倍のＬＥＣＴ１の発現を示し、同様に、ＭＳＣでは、分化は、５倍のＭＧＰの発現（４Ｄ２０．８とは異なって、未分化のＭＳＣは発現の相対的に高いベースレベルを示したが）、２０倍のＭＡＴＮ４の発現、６倍のＰＥＮＫの発現（再び、未分化の４Ｄ２０．８では未発現であるのに比べて未分化のＭＳＣでは相対的に高いレベル）、６１３倍のＣＯＬ２Ａ１の発現、４８倍のＥＰＹＣの発現、１１７倍のＣＯＬ９Ａ２の発現、３４倍のＬＥＣＴ１の発現の上方調節を示した。それに対して、皮膚線維芽細胞は、３７倍のＭＧＰの発現の上方調節を示したが、実験処理の前後でＣＯＬ２Ａ１、ＥＰＹＣ、ＬＥＣＴ１又はＣＯＬ９Ａ２の発現は示されなかった。従って、皮膚線維芽細胞とは異なって、４Ｄ２０．８は、ＭＳＣとは同一ではないが、ＭＳＣと類似の多様な軟骨特異的遺伝子を発現した。２４，５２６個の評価した遺伝子の中で、２６５個の遺伝子はＭＳＣの分化の間に発現の上昇を示し、１９１は４Ｄ２０．８の分化の間に発現の上昇を示したが、共通するのはたった４７個の遺伝子だった。従って、細胞株４Ｄ２０．８は、ＬＨＸ８の発現を示さないが、代わりにたとえば、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＣ８及びＨＯＸＤ１３のような尾部ＨＯＸ遺伝子、及び下肢に特徴的なＰＩＴＸ１の発現を示したＭＳＣとは異なって、口蓋及び下顎の部位特異的ＬＨＸ８ホメオボックス遺伝子の発現を伴い、ＨＯＸ又はＰＩＴＸ１を発現しないＭＳＣとは識別可能な細胞株を代表する。細胞株７ＰＲＮＤ２４も低レベルで軟骨形成の誘導を示した。
【０１４５】
ＭＳＣ及び正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）と共に軟骨形成条件の１４日の前後で細胞株のマイクロアッセイによってアッセイしたＣＯＬ２Ａ１の誘導レベルを「ＣＯＬ２Ａ１」と題するグラフで図２に示す。図２でも見ることができるように、軟骨の共通する成分であるＬＥＣＴ１の遺伝子も細胞株で誘導されるが、細胞株では差次的に発現される。永続軟骨（肥大軟骨細胞に対して）のマーカーとして元々特徴付けされた遺伝子であるＣＲＴＡＣ１は実際、ＮＨＡＣでは発現されるが、ＭＳＣでは発現されず、本発明の細胞株では様々な程度に発現される。肥大軟骨細胞で発現されるマーカーＩＨＨは、ＮＨＡＣでは発現されず、ＭＳＣで発現されるが、本発明の細胞では発現されないということは、それらがＭＳＣとは識別可能であり、安定な軟骨への前駆細胞である可能性があることに一致する。ＭＳＣのマーカーであるが、線維芽細胞のマーカーではないとして元々特徴付けされた遺伝子であるＣＤ７４は、脂肪細胞幹細胞（ＡＳＣ）、ＭＳＣで発現されるが、ＮＨＡＣ又は本発明の細胞では発現されない。最後に、下顎間充組織のマーカーであるＬＨＸ８は、ＮＨＡＣ、ＡＣＳでは発現されないが、下顎の神経堤に起源と一致する歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）では発現され、細胞株４Ｄ２０．８において発現される。
【０１４６】
微細塊の１４日後、及び記載されたようなこれら細胞株のペレットの軟骨形成条件のサブセットでは、細胞株、７ＰＥＮＤ２４、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、ＳＭ３０及びＥ１５が、分化の誘導の際、顕著に高いＣＯＬ２Ａ１の発現を示し、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、Ｅ１５及びＳＭ３０は、正常ヒト関節軟骨細胞よりも相対的に高いレベルの転写物を発現した。際立って、＞１，０００ほど高いＣＯＬ２Ａ１を発現している株ＳＭ３０。当該技術で周知のように、使用した細胞のロットや継代数で大きく変化することが認められているが、継代３の骨髄間葉幹細胞は、転写物があったにしてもほとんど発現しなかった。ＣＯＬ２Ａ１の発現は、ＡＳＣ、ＤＰＳＣ又はＸｇｅｎｅＦＢでは認められなかった。細胞株は、たとえば、中胚葉と神経堤のマーカーであるＴＢＸ５とＨＡＮＤ２のような種々のマーカーの組み合わせを発現するので、軟骨形成の多様な種類のモデル化及び臨床上の細胞に基づいた治療法にて有用である。加えて、それらは、生体にて軟骨の部位特異的な独特の機械的特性を生成する種々の部位特異的ホメオボックス遺伝子を示す。非限定の例証として、細胞株４Ｄ２０．８は、たとえば、二次口蓋を生成すること、下顎を再構築すること、又は口蓋裂、歯周病の修復、歯の神経堤の成分を形成することが可能である細胞を寄与させることによって歯芽を再構築すること、下顎領域の真皮、下顎領域の末梢神経若しくは色素細胞を再構築すること、又は歯肉萎縮を修復することを含むが、これらに限定されない神経堤下顎間充組織のそのほかの派生物を再構築することのような、口周囲間充組織のマーカーであるマーカー遺伝子ＬＨＸ８を強く発現する。
【０１４７】
実施例２
ｈＭＳＣで以前明らかにしたように、外因性細胞の投与を用いて、ヒツジにおける中央若しくは外側の半月板切除又はＡＣＬ切除の後の関節の軟骨及び半月板の傷害と修復を判定することができる（双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられるGhosh, et al., Clin. Orthop., Vol. 252, pgs. 101-113, 1990; Little, et al., J. Rheumatol., Vol. 11, pgs. 2199-2209, 1997）。ｈＥＳに由来する細胞に対するヒツジにおける寛容は、ｈＥＳ由来細胞の出生前移植によって達成される。ヘクステンド、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン又はそのほかの足場／マトリクス（たとえば、脱細胞化した半月板）を含む１以上の医薬キャリアと共に、たとえば、７ＰＥＮＤ２４、７ＳＭＯＯ３２、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８のようなｈＥＳ−、ｉＰＳ−に由来する胚性前駆細胞、並びにｈＭＳＣ及びＨＡの対照の漸増用量を寛容化したヒツジの関節に注入する。傷害の修復速度を漸増投与量に反応して時間をかけて測定する。ヒト成人ＭＳＣ及び媒体対照と比べた再注入、奇形腫の形成、及び効率について移植した細胞を組織学的に評価する。
【０１４８】
実施例３
長い継代にわたって胚性軟骨細胞前駆細胞の安定性をアッセイすること
我々が３０の倍増を超えて成人の骨髄ＭＳＣを継代するのは不可能だったが、我々は、４Ｄ２０．８と称する本発明の細胞株を３３回の継代を超えて培養した。我々は、ＣＯＬ２Ａ１の発現によって測定され、継代１２と継代３３にて本明細書で記載されるようなｑＰＣＲによってアッセイされる軟骨を誘導するその細胞の能力を比較した。長い継代での細胞は並行した実験におけるＭＳＣのそれとは異なって、匹敵するレベルのＣＯＬ２Ａ１を産生した。各継代が１．５の倍増である継代１２での使用細胞集合からさらなる継代２１以上に細胞を規模拡大する能力は、使用細胞集団よりおよそ５２倍増又は２５０多い細胞に相当する。従って、細胞は、多数の患者における同種移植について商業的に規模拡大されるその可能性において独特である。
【０１４９】
実施例４
本発明の選択された軟骨形成性細胞株におけるＣＤ抗原を認識する抗体のスクリーニング
本発明の軟骨形成性細胞株をＣＤ抗原に対する抗体のライブラリに対して中程度の処理能力法にてアッセイし、陽性細胞の比率を以下（表２）に示すが、それらは、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００６年１１月２１日に出願された米国特許出願、出願番号１１／６０４，０４７；及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０に記載された予測された抗原の一般的な有用性を明らかにしている。しかしながら、例外も特定することができる。特に、抗原ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）は細胞株４Ｄ２０．８の８０％に結合するが、調べたほかの細胞株の極一部しか結合しない。このことは、マイクロアレイのデータにおけるＮＣＡＭ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａプローブ、ＩＤ４０４０７２５）の相対的に高いレベルと一致する。従って、ＣＤ５６に対する抗体は、本明細書で記載される細胞株４Ｄ２０．８の遺伝子発現マーカーを持つ細胞のアフィニティ精製に有用である。
【０１５０】
【０１５１】
実施例５．
ＮＮＡＴ陽性軟骨形成性前駆細胞株の発見
元々クローン増殖させたのと同じ培地である２０％血清を補完したＤＭＥＭ培地にて連続継代を行うことにとって継代１７での細胞株Ｅ１５（ＡＣＴＣ９８としても知られる）を増殖させた（参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８かの補完表Ｉを参照）。継代１４と１７にて、細胞がいったん集密に達すると培地を取り除き、１０倍低下した血清（２％）を補完した新鮮なＤＭＥＭによって培地を置き換えることによって細胞を静止期に同期化した。３日後、培地を吸引し、２％のＦＣＳを補完した新鮮なＤＭＥＭでさらに２日間置き換えた。同一継代の細胞を微細塊条件及びペレット条件の双方でプレート培養し、本明細書で記載されるように軟骨形成を誘導した。微細塊培養の１４日後、同一条件下で培養した細胞株Ｅ１５と正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）対照を特異的マーカー（以下の実施例６を参照）の発現についてｑＰＣＲによってアッセイした。Ｅ１５は、ＮＨＡＣ対照よりも＞１０，０００多いＣＯＬ２Ａ１のｍＲＮＡを発現することが認められた。１４日目の微細塊を固定し、上述のようにサフラニンＯで染色した。試料は、軟骨プロテオグリカンを強く染色した。細胞をさらに特徴付けるために、本明細書で記載されるように、ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアッセイとハイブリッド形成させた。
【０１５２】
実施例６．
ｑＰＣＲによる軟骨形成性前駆細胞のスコア化のための低処理能力選抜
１０ＲＰＥ８、４Ｄ２０．８、４Ｄ２０．９、４ＳＫＥＬ２０、７ＰＥＮＤ１２、７ＰＥＮＤ２４、７ＰＥＮＤ３０、７ＰＥＮＤ９、７ＳＫＥＬ４、７ＳＫＥＬ７、７ＳＭＯＯ２５、７ＳＭＯＯ３２、７ＳＭＯＯ７、７ＳＭＯＯ９、Ｂ１６、Ｃ４．４、Ｃ４ＥＬＳ５．１、Ｃ４ＥＬＳ５．６、Ｃ４ＥＬＳＲ１０、Ｃ４ＥＬＳＲ２、ＣＭＯ２、Ｅ１０９、Ｅ１１１、Ｅ１２０、Ｅ１５、Ｅ１６４、Ｅ３３、Ｅ４４、Ｅ６８、Ｅ６９、Ｅ８５、ＥＮ１、ＥＮ１３、ＥＮ１６、ＥＮ１８、ＥＮ２、ＥＮ２２、ＥＮ２３、ＥＮ２６、ＥＮ２７、ＥＮ３１、ＥＮ４、ＥＮ４２、ＥＮ４７、ＥＮ５、ＥＮ５１、ＥＮ５５、ＥＮ７、ＥＮ８、Ｆ１５、Ｊ１６、ＭＥＬ２、ＭＥＬ２、ＭＷ１、ＲＡＤ２０．１６、ＲＡＤ２０．１９、ＲＡＤ２０．４、ＲＡＤ２０．５、ＲＡＤ２０．６、ＲＡＰＥＮＤ１０、ＲＡＰＥＮＤ１５、ＲＡＰＥＮＤ１８、ＲＡＳＫＥＬ８、ＲＡＳＭＯ１２、ＲＡＳＭＯ１９、ＳＫ１１、ＳＫ１７、ＳＫ１８、ＳＫ２５、ＳＫ３１、ＳＫ３５、ＳＫ４３、ＳＫ４４、ＳＫ４６、ＳＫ４７、ＳＫ４９、ＳＫ５０、ＳＫ５２、ＳＭ１７、ＳＭ２、ＳＭ２２、ＳＭ２８、ＳＭ２８、ＳＭ３０、ＳＭ３３、ＳＭ８、Ｔ１４、Ｔ２０、Ｔ３６、Ｔ４２、Ｔ４３、Ｔ４４、Ｔ７、Ｕ３１、Ｗ１０、Ｗ１１、Ｗ８、Ｚ１、Ｚ１１、Ｚ２及びＺ３と名付けられた本発明の細胞株は、ｈＥＳ由来の細胞から単離し、集密まで増殖させ、本明細書で記載されるような血清又はそのほかのマイトジェンを１０倍減らして補完した培地で培地を置き換えることによって静止期に同期化させたので、それらを試験管内で＞２１の倍増でクローン増殖させた。試験管内で軟骨形成が可能である細胞についての低処理能力選抜では、細胞を微細塊条件で培養し、本明細書で記載されるように１４日間、軟骨形成を誘導した。これら２つの条件のそれぞれからのＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次いで軟骨形成に一般に関連する遺伝子（すなわち、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＭＰ、ＣＩＬＰ、ＳＣＸ、ＣＲＴＬ１、ＳＯＸ９、ＢＡＲＸ２）の発現について調べた。遺伝子特異的なプライマー対プローブはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｃＤＮＡのＲＮＡ同等物３０ｎｇ，プライマー当たり０．４μＭ、超純度蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、全反応容量２５μｌでＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを組み入れる１２．５μｌのＰｏｗｅｒＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒミックス（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６７６５９）で１：１に希釈した試験用試料を標準の光学９６穴反応プレート（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３０６７３７）にて調製した。ＳＤＳｖ１．２ソフトウエアを採用するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲ方式を用いてリアルタイムｑＰＣＲを実行した。増幅条件は、５０℃にて２分間（段階１）、９５℃で１０分間（段階２）、９５℃で１５秒間、次いで６０℃で１分間を４０サイクル（段階３）、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の解離段階（段階４）にて設定した。当該遺伝子の増幅産物のＣｔ値を３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤ、ＲＰＳ１０及びＧＵＳＢ）のＣｔ値の平均に対して標準化し、早期継代の正常ヒト膝関節軟骨細胞（Ｌｏｎｚａ）及び培養されたヒト骨髄間葉幹細胞に対して遺伝子発現を解析した。
【０１５３】
関節形成遺伝子を検出するのに使用したプライマーセットは上述したものであり；選抜される細胞株について培養された早期継代の正常ヒト関節軟骨細胞と比較して倍数発現として表現されたＣＯＬ２Ａ１の発現を図１に示す。早期継代の正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）を１．０の値として設定する。ＮＨＡＣと比較して−倍誘導として定量化されるＣＯＬ２Ａ１の発現レベルは、細胞株の大半では顕著には上昇しなかったが、細胞株の小さなサブセットでは際立って上昇し、すなわち、７ＳＭＯＯ３２技術複製２（ＮＨＡＣの１５４倍の発現）、７ＳＭＯＯ３２生物複製２（ＮＨＡＣの１３７倍の発現）、４Ｄ２０．８生物複製２（ＮＨＡＣの１３０倍の発現）、ＳＭ３０（ＮＨＡＣの１２８７倍の発現）、ＳＭ３０生物複製２（ＮＨＡＣの１３，４９４倍の発現）、ＳＭ３０技術複製２（ＮＨＡＣの１１６８倍の発現）、Ｅ１５（ＮＨＡＣの１０，８０９倍の発現）、Ｅ１５技術複製２（ＮＨＡＣの９８１０倍の発現）、ＭＥＬ２（ＮＨＡＣの２２倍の発現）及びＳＫ１１（ＮＨＡＣの４倍の発現）。
【０１５４】
驚くべきことに、ＣＯＬ２Ａ１の誘導とＳＯＸ９のような関節形成間充組織の一般に使用されるマーカーとの相関はほとんどないか、少なかった。同様に、軟骨形成性間葉細胞のマーカーであると推測されているＡＱＰ１のようなマーカーは、微細塊軟骨形成条件でＣＯＬ２Ａ１を誘導しない包皮皮膚線維芽細胞のＲＦＵ値にて存在したが、分化前及び分化後の本発明の細胞株には存在しなかった。たとえば、分化に先立って、ＡＱＰ１の発現は、クローン増殖の１８〜２１の倍増にて、細胞株ＳＭ３０には存在せず（バックグランドであるＲＦＵ１３５）、ＳＫ１１には存在せず（１２６のＲＦＵ）、細胞株Ｅ１５には存在しなかった（ＲＦＵ１３９）（Ｗｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表ＩＩを参照）。どちらも、本発明の細胞株は軟骨形成が可能であるかどうかを予測することにおいて予測値の本発明の未分化細胞株におけるＳＯＸ９の発現レベルではなかった。実際、軟骨細胞になってそのような予後を予測するこれら細胞株の可能性と十分に相関する、分化に先立つ未分化の細胞株では遺伝子を見つけることができなかった。部位特異的なホメオボックス遺伝子発現を含むＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５の群の範囲内での遺伝子発現マーカーの多様性は、各細胞株が独特で且つ識別可能な軟骨形成性前駆細胞を代表することを示唆している。同様に驚くべきことは、たとえば、ＣＯＭＰ及びＣＩＬＰのような試験管内での軟骨形成のマーカーとして一般に使用される遺伝子の多くが、ＣＯＬ２Ａ１の発現によって及び軟骨形成の組織学的証拠を示すことによって証拠付けられるのと同一の条件下で皮膚線維芽細胞が、たとえば、本当の軟骨形成を経験することが可能であるかどうかにかかわりなく、培養された皮膚線維芽細胞を含む事実上任意の細胞種にて非特異的な方法での培養条件で誘導されることであった。加えて、細胞株ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５は、分化の前と後の双方での遺伝子発現マーカーに関して培養された骨髄ＭＳＣとは明瞭に識別可能だった。骨髄のＭＳＣは一般にＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）陽性として記載されるが、たとえば、ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５のような未分化状態での本発明の細胞株は、ＣＤ１６６の発現は細胞株ＳＭ３０では存在せず（バックグランドであるＲＦＵ１２５）、ＳＫ１１では存在しなかった（１６４のＲＦＵ）（Ｗｅｓｔら、２００８，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表ＩＩを参照）。非限定の例証としてＭＳＣと比較した場合の本発明の細胞株の追加の差異は、実際には特異的ではない一般的に使用されるマーカーの多くよりもさらに正確なＭＳＣのマーカーであることが明らかにされているＣＤ７４の発現である（Ishii et al, 2005 BBRC 332:297-303）。表３に示されるように、未分化のＭＳＣは実際非常に高いレベルのＣＤ７４転写物を発現し、脂肪細胞幹細胞は低レベルで同様にＣＤ７４を発現し、歯髄幹細胞は検出の限界でＣＤ７４を発現したが、その転写物は、ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５を含むＣＯＬ２Ａ１を誘導可能な本発明の未分化細胞でも、培養された皮膚線維芽細胞でも非軟骨形成性の胚性前駆細胞株７ＳＭＯＯ７でも全く検出されなかった。細胞株の多様性及び本明細書で検討される成人幹細胞種での際立った差異を示す追加の非限定例は、細胞株Ｅ１５にて高レベルで発現されるが、たとえば、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、歯髄幹細胞又は皮膚線維芽細胞では発現されない発生遺伝子ＮＮＡＴ（ＮＭ＿１８１６８９．１）の発現である。当該技術における幹細胞種からＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能である本発明の細胞株の顕著な差異の別の非限定例は、ＭＳＣのマーカーとして知られる遺伝子ＫＣＮＫ２（ＮＭ＿００１０１７４２５．２）の発現を測定することによって理解することができる。表３に示されるように、ＫＣＮＫ２は、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞及び歯髄肝細胞にて高レベルで発現されるが、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２及びＳＫ１１のようなＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能である本発明の幾つかの細胞株では検出可能ではなかった。本発明の細胞株と骨髄由来のＭＳＣの際立った差異は、細胞種における重要な治療上の差異を示す遺伝子においても見られる。ＭＳＣは試験管内で分化すると肥大軟骨細胞への形質転換を受けることに悩まされる。肥大軟骨細胞は、血管形成を誘導するのに有用な遺伝子を発現し、後に骨芽細胞によって侵襲されて骨を作る一時的なマトリクスを提供する。従って、関節に注入する場合、又はさもなければ関節軟骨に移植する場合、関節軟骨の外傷、関節炎の治療、又は関連する用途で組織を再生する尽力においてＭＳＣは上手く機能しない。ＭＳＣが肥大軟骨細胞のマーカーであるＩＨＨを非常に高いレベルで発現する一方で、本発明の細胞株は本明細書の軟骨形成条件で誘導される場合、ほとんどＩＨＨを発現しないか、発現してもわずかである。同様に、細胞株４Ｄ２０．８は肥大軟骨細胞の別のマーカーであるＣＯＬ１０Ａ１を検出可能なレベルで発現しなかったが、ＭＳＣはその転写物を非常に高いレベルで発現した。従って、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＳＭ３０及びＥ１５のような本発明の細胞株は、関節軟骨の病理の修復のための永続軟骨に分化するその能力でＭＳＣより優れているマーカーを示す。培養されたヒト骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、及び成人歯髄幹細胞と比べた細胞株ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５における差異のさらなる非限定例は、表３に示される、又は表３におけるような本明細書で記載されるものと細胞の遺伝子発現マーカーを比較することによって理解することができる。従って、これらの結果は、この選抜で特定された細胞株は新規であり、ＭＳＣを特定するのに一般に使用されるマーカーはヒトの胚性前駆細胞株において軟骨形成能を予測せず、前記細胞株が、軟骨形成の真のマーカーを発現する軟骨形成刺激に応答する株の小さなサブセットであることを予測するマーカーは現在存在しないことを示唆している。証拠は、軟骨形成の組織学的証拠の実施例７で提供される。
【０１５５】
表３
ヒト脂肪細胞（ＡＣＳ）、ヒト骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト成人歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、培養されたヒト包皮線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ）、ＣＯＬ２Ａ１の誘導が可能ではないクローン性ｈＥＰ細胞株７ＳＭＯＯ７、並びにそれぞれＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能であるヒト胚性前駆細胞ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２及びＳＫ１１における遺伝子発現マーカーの比較。数字はＲＦＵ値である。陰性の発現は影付きボックスで示す（ＮＤ平均値はデータなし）。
【０１５６】
実施例７
軟骨形成の組織学的な及び免疫化学的な確認
たとえば、７ＰＥＮＤ２４、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＭ３０、Ｅ１５、ＳＫ１１及び４Ｄ２０．８のようなＣＯＬ２Ａ１の中程度から堅実な誘導を示すような上記実施例６における低処理能力選抜で発見されたもののような本発明の細胞株、並びにたとえば、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、及びそのほかの細胞株、たとえば、包皮皮膚線維芽細胞、Ｚ１１、歯髄幹細胞、７ＳＭＯＯ７、Ｅ４４などのような対照を、１、８、１４及び２１日間を含む様々な時間、本明細書で記載されるような微細塊及びペレットの軟骨形成条件を経験させ、及びＳＣＩＤマウスの腎臓被膜に移動させた場合の前記ペレットのサブセットを経験させて、長時間の分化を促進した。前記微細塊とペレットをホルマリンで固定し、Ｈ＆Ｅ染色、上述のようなプロテオグリカンを染色するサフラニンＯによって、及び特異抗体と対照としての非特異抗体を用いた免疫反応性ＣＯＬ２Ａ１について組織学的に解析した。サフラニンＯに対する強い反応性及び／又はＣＯＬ２Ａ１免疫反応性が細胞株４Ｄ２０．８の１４日目と２１日目のペレットで認められ、サフラニンＯの強い染色が細胞株Ｅ１５の１４日目の微細塊で認められた。驚くべきことに、細胞株ＲＡＤ２０．６は、１４日目のペレットでＣＯＬ２Ａ１に対する免疫反応性及びサフラニンＯ染色を示した。図２は、ペレットとしてすべて２１日目の分化にて継代６でのＭＳＣと比較した継代１４での細胞株４Ｄ２０．８と比較した脂肪組織幹細胞のサフラニンＯ染色及び細胞株４Ｄ２０．８とＭＳＣの１４日目ペレットにおけるアイソタイプ対照を伴った免疫染色の例を示す。
【０１５７】
実施例８
関節軟骨を修復する能力について以下のように本発明の細胞株を調べた：提供されたヒト関節組織を外植した。細胞株ＳＭ３０、Ｅ１５、及び４Ｄ２０．８の５×１０５個の細胞を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて１５ｍｌの円錐チューブ中で４００×ｇにて５分間遠心し、一晩インキュベートして細胞の凝集体を生成した。Ａｒｔｈｒｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｓｅ ＯＡＴＳシステム（Ｎａｐｌｅｓ、Ｆｌ）によって６ｍｍ径の円筒状片を関節外植片からくり抜いた。外科用掻爬器を用いて関節表面におよそ２ｍｍの大きさの部分的な厚み欠損を作った。ＳＭ３０、Ｅ１５、及び４Ｄ２０．８の細胞凝集体、又はヒト一次関節軟骨細胞、ｈＥＳ由来の軟骨細胞の塊培養、若しくは脂肪細胞由来の幹細胞（ｈＡＳＣ）から成る対照によって欠損を満たした。ＴＧＦβ３の存在下又は非存在下で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて関節外植片をインキュベートした。４週間後、外植片を固定し、パラフィン包埋し、切片にし、スコア化のためにサフラニンＯで染色した。クローン性の前駆細胞株ＳＭ３０、Ｅ１５、及び４Ｄ２０．８を用いた選択されたクローン性細胞株における遺伝子発現レベル及びマトリクスの染色は、不均質なｈＥＳＣ及びＡＳＣより高く、ｈＡＣで見られるレベルに近づいた。軟骨外植片では、修復組織は関節軟骨に類似し、周辺の宿主組織と上手く統合した。
【０１５８】
実施例９
人工的なマトリクスにて軟骨形成を経験する能力について、軟骨形成が可能である本発明の細胞株を調べた。細胞株４Ｄ２０．８及び７ＰＥＮＤ２４の細胞を増殖させ、低速での遠心によってペレットにし、ＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で洗浄し、再び遠心し、１．２％アルギン酸（Ｌｏｎｚａ）にて２０×１０６でペレットを再浮遊させた。２２ｇの針を介して細胞浮遊液を１ｍｌのシリンジに引き入れ、ＣａＣｌ２槽（１０２ｍＭ）に一滴ずつ分配した。ゲル化は即座である。ビーズをＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で３〜５回洗浄し、次いで軟骨形成用培地（ＴＧＦを含まず）で１回洗浄し、その後軟骨形成用培地に浸漬した。ビーズを６穴プレートの複数のウェルに入れ、１週間に３日、１４日間養分を与えた。次いでビーズをＮａＣｌで複数回洗浄し、その後クエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）に２０分間暴露することによって脱重合した。遠心の後、ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）によって細胞ペレットを溶解し、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒを用いた粉砕工程を行って収率を改善したのに続いて、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。上記のようにｑＰＣＲによってＣＯＬ２Ａ１の発現を測定した。細胞株４Ｄ２０．８の場合、正常な微細塊条件に比べてＣＯＬ２Ａ１の発現で５１倍の上昇があった。細胞株７ＳＭＯＯ３２の場合、正常な微細塊条件に比べてＲＧＤ−アルギン酸を用いたＣＯＬ２Ａ１の発現で２．８８倍の上昇があった。細胞株ＳＫ１１の場合、正常な微細塊条件に比べてアルギン酸を用いたＣＯＬ２Ａ１の発現で１７９倍の上昇があった。Ｌｏｎｚａアルギン酸に加えて、ＲＧＤ結合したアルギン酸（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ）ビーズも調製した。７ＰＥＮＤ２４の場合、微細塊条件ではＣＯＬ２Ａ１を弱くしか誘導しないが、アルギン酸ビーズでは、微細塊条件に比べて４５倍の上昇を示した。ＲＧＤ−アルギン酸複合体に被包された７ＰＥＮＤ２４は、微細塊条件上で高いＣＯＬ２Ａ１の発現を示さなかったが、正常なヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）に比べて１７倍高いＣＯＬ２Ａ１の発現を示した。同様に、微細塊条件で軟骨形成性が弱かった７ＳＭＯＯ３２は、ＲＧＤ−アルギン酸ビーズではＣＯＬ２Ａ１を堅実に発現した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａのプラットホームを用いて、ＲＧＤアルギン酸は細胞株４Ｄ２０．８にてＣＯＬ２Ａ１の印象的な４４９倍の上方調節を示した。
【０１５９】
実施例１０
試験管内の連続継代に対する細胞株の安定性を判定するために、未分化状態及び１４の微細塊及び上述のような（実施例９）アルギン酸ビーズにて、定期的にＲＮＡを単離しながら、細胞株４Ｄ２０．８、Ｅ１５、ＳＭ３０及びｈｂｍＭＳＣを連続継代した。アルギン酸ビーズにてＰ１２と比較した継代３３の細胞株４Ｄ２０．８はほぼ同一レベルのＣＯＬ２Ａ１を示したが、ｈｂｍＭＳＣは、老化のために匹敵する継代で比較することはできなかった。
【０１６０】
実施例１１
アルギン酸に被包された軟骨形成性ｈＥＰの生体内ｓ．ｃ．埋め込み
ｈＥＳ細胞前駆細胞株、４Ｄ２０．８、Ｅ１５、ＳＭ３０、７ＰＥＮＤ２４、ＭＥＬ２及び対照のヒト骨髄ＭＳＣ、及びｘ−遺伝子皮膚線維芽細胞を増やし、剥離し、ペレットにし、２０×１０６個の細胞／ｍｌでアルギン酸調製物（ＲＧＤペプチド結合アルギン酸を伴ったＬｏｎｚａ１．２％又はＮｏｖａＭａｔｒｉｘ１．５％）に再浮遊させた。ゲル化と細胞の被包のために、１ｍｌの無菌シリンジを用い、シリンジに負荷した後、アルギン酸浮遊液を２２Ｇの針を介して一滴ずつＣａＣｌ２（１０２ｍＭ）溶液に排出し、又は予めＣａＣｌ２で濡らした大腿形状のシリコーン金型に入れ、次いで完全で迅速なゲル化のために１０２ｍＭのＣａＣｌ２で覆った。
【０１６１】
大腿形状の構築物を金型から取り出し、アルギン酸ビーズ（直径約１〜２ｍｍ）と同じようにＮａＣｌ（１５５ｍＭ）で洗浄し、その後、デキサメタゾン０．１μＭとヒト組換えＴＧＦβ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する軟骨形成用分化培地に浸漬した。月曜日、水曜日及び金曜日に構築物及びビーズに養分を与えた。１２日後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの肩にｓ．ｃ．で構築物を埋め込み、１４日目に同様にビーズを埋め込んだ。
【０１６２】
埋め込みの６週後、組織を摘出し、４％のパラホルムアルデヒドで２４時間固定し、次いで７０％アルコールに浸漬した。
【０１６３】
顕微鏡観察では、特定のｈＥＰＣ構築物が明らかであり、ビーズは、白っぽい外見を持つ皮膚の下にある正常な筋膜から容易に識別できた。４Ｄ２０．８のアルギン酸外植片について例となる外植片（図４Ａ）。
【０１６４】
組織学的な評価については、試料をパラフィン包埋し、約１００μｍ間隔で４μｍの切片に切り、スライド上に置き、次いでヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【０１６５】
図５は、細胞株４Ｄ２０．８及びＥ１５についてガラス質軟骨に類似する軟骨細胞様の外見を示す例となる組織像を示す。
【０１６６】
【０１６７】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的での説明及び例示のために少し詳しく記載してきたが、本発明の教示の観点から、添付の特許請求の範囲の精神と範囲から逸脱することなく、それに対する特定の変更及び改変を行ってもよいことが当業者に容易に明らかである。
【０１６８】
従って、先行は本発明の原理を単に説明している。本明細書で明白に記載されず、又は示されないが、本発明の原理を具体化し、その精神と範囲の中に含められる種々の取り決めを当業者が考案できることが十分に理解されるであろう。さらに、本明細書で言及される実施例及び条件付言語のすべては、本発明の原理及び本発明者らによって当該技術の推進に寄与させられる概念を理解する点で読者を助けることが原則として意図され、そのような具体的に言及される実施例や条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその具体例を言及する本明細書での記述すべては、その構造的な及び機能的な同等物双方を包含することが意図される。加えて、そのような同等物は、現在既知の同等物及び将来開発される同等物、すなわち、構造にかかわりなく、同一の機能を実行する開発される要素の双方を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書で示され、記載される例となる実施形態に限定されるように意図されるものではない。むしろ、本発明の範囲と精神は添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者において軟骨を生成する方法であって、
（ａ）ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２、ＫＣＮＫ２及びそれらの組み合わせから成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と、
（ｂ）薬学上許容可能なキャリアを含む有効量の胚性前駆細胞株組成物を対象者に投与することを含む方法。
【請求項２】
胚性前駆細胞株がＣＤ７４の発現について陰性である請求項１の方法。
【請求項３】
胚性前駆細胞株がさらに、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項２の方法。
【請求項４】
胚性前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項１の方法。
【請求項５】
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１の方法。
【請求項６】
対象者が軟骨の損傷を有し、方法が、胚性前駆細胞株組成物を前記軟骨損傷の部位に投与することを含む請求項１の方法。
【請求項７】
軟骨の損傷が関節軟骨の損傷である請求項６の方法。
【請求項８】
薬学上許容可能なキャリアが、ヘタスターチ；ヒアルロナン及びそのポリマー；コンドロイチン硫酸；Ｉ型コラーゲン；ＩＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン；ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー；アルギン酸；アガロース；ポロキサマー；フィブリン；キチン；及びキトサン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される組成物を含む請求項１の方法。
【請求項９】
胚性前駆細胞株が、対象者への投与に先立って軟骨細胞を誘導する条件下で培養される請求項１の方法。
【請求項１０】
さらに、損傷された軟骨を時間とともに修復する速度を測定することを含む請求項１の方法。
【請求項１１】
軟骨を産生する方法であって、軟骨産生条件下にてＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である、クローン性に精製した胚性前駆細胞株を培養することを含む方法。
【請求項１２】
胚性前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項１１の方法。
【請求項１３】
胚性前駆細胞株がさらに、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項１２の方法。
【請求項１４】
胚性前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項１３の方法。
【請求項１５】
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１１の方法。
【請求項１６】
軟骨産生条件が、軟骨細胞培養条件；胚性前駆細胞株を合成マトリクス又は生体吸収性不動化媒体に含浸させること；及び胚性前駆細胞株を成形構造に入れることから成る群の１以上から選択される請求項１１の方法。
【請求項１７】
方法がさらに、胚性前駆細胞株によって産生された軟骨を対象者に移植することを含む請求項１１の方法。
【請求項１８】
キットであって、
（ａ）ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と
（ｂ）前記細胞株から軟骨産生を誘導する試薬
を含むキット。
【請求項１９】
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１８のキット。
【請求項２０】
軟骨産生を誘導する試薬が軟骨細胞培養試薬を含む請求項１８のキット。
【請求項２１】
組成物であって、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である軟骨細胞前駆細胞株と、薬学上許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項２２】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項２１の組成物。
【請求項２３】
前記軟骨細胞前駆細胞株が、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項２１の組成物。
【請求項２４】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項２１の組成物。
【請求項２５】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項２１の組成物。
【請求項２６】
ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である軟骨細胞前駆細胞株。
【請求項２７】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項２６の細胞株。
【請求項２８】
前記軟骨細胞前駆細胞株が、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項２６の細胞株。
【請求項２９】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項２６の細胞株。
【請求項３０】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７から成る群から選択される請求項２６の細胞株。
【請求項１】
対象者において軟骨を生成する方法であって、
（ａ）ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２、ＫＣＮＫ２及びそれらの組み合わせから成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と、
（ｂ）薬学上許容可能なキャリアを含む有効量の胚性前駆細胞株組成物を対象者に投与することを含む方法。
【請求項２】
胚性前駆細胞株がＣＤ７４の発現について陰性である請求項１の方法。
【請求項３】
胚性前駆細胞株がさらに、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項２の方法。
【請求項４】
胚性前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項１の方法。
【請求項５】
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１の方法。
【請求項６】
対象者が軟骨の損傷を有し、方法が、胚性前駆細胞株組成物を前記軟骨損傷の部位に投与することを含む請求項１の方法。
【請求項７】
軟骨の損傷が関節軟骨の損傷である請求項６の方法。
【請求項８】
薬学上許容可能なキャリアが、ヘタスターチ；ヒアルロナン及びそのポリマー；コンドロイチン硫酸；Ｉ型コラーゲン；ＩＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン；ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー；アルギン酸；アガロース；ポロキサマー；フィブリン；キチン；及びキトサン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される組成物を含む請求項１の方法。
【請求項９】
胚性前駆細胞株が、対象者への投与に先立って軟骨細胞を誘導する条件下で培養される請求項１の方法。
【請求項１０】
さらに、損傷された軟骨を時間とともに修復する速度を測定することを含む請求項１の方法。
【請求項１１】
軟骨を産生する方法であって、軟骨産生条件下にてＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である、クローン性に精製した胚性前駆細胞株を培養することを含む方法。
【請求項１２】
胚性前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項１１の方法。
【請求項１３】
胚性前駆細胞株がさらに、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項１２の方法。
【請求項１４】
胚性前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項１３の方法。
【請求項１５】
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１１の方法。
【請求項１６】
軟骨産生条件が、軟骨細胞培養条件；胚性前駆細胞株を合成マトリクス又は生体吸収性不動化媒体に含浸させること；及び胚性前駆細胞株を成形構造に入れることから成る群の１以上から選択される請求項１１の方法。
【請求項１７】
方法がさらに、胚性前駆細胞株によって産生された軟骨を対象者に移植することを含む請求項１１の方法。
【請求項１８】
キットであって、
（ａ）ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と
（ｂ）前記細胞株から軟骨産生を誘導する試薬
を含むキット。
【請求項１９】
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１８のキット。
【請求項２０】
軟骨産生を誘導する試薬が軟骨細胞培養試薬を含む請求項１８のキット。
【請求項２１】
組成物であって、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である軟骨細胞前駆細胞株と、薬学上許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項２２】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項２１の組成物。
【請求項２３】
前記軟骨細胞前駆細胞株が、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項２１の組成物。
【請求項２４】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項２１の組成物。
【請求項２５】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項２１の組成物。
【請求項２６】
ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である軟骨細胞前駆細胞株。
【請求項２７】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項２６の細胞株。
【請求項２８】
前記軟骨細胞前駆細胞株が、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項２６の細胞株。
【請求項２９】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項２６の細胞株。
【請求項３０】
軟骨細胞前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１、７ＰＥＮＤ２４及び７ＳＭＯＯ７から成る群から選択される請求項２６の細胞株。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５３３５７１（Ｐ２０１２−５３３５７１Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２０８３０（Ｐ２０１２−５２０８３０）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２３６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９１０６
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５１２０１２１８２）バイオタイム インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＩＭＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２３６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９１０６
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５１２０１２１８２）バイオタイム インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＩＭＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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