質量分析による改変ペプチドの同定
種々の局面で、分析器のフィールドフリー領域で形成される準安定イオンに由来するマススペクトルシグナルを少なくとも部分的に使用して、改変ペプチドの存在を同定するための方法が提供される。例えば、上記改変ペプチドがリンペプチドである種々の実施形態において、このような準安定イオンは、前駆イオンのｍ／ｚ値よりもおよそ９５ｕ低いようであり得る（ペプチドがリン酸基を含む場合に前駆イオンから準安定イオンが形成される）。種々の実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにおけるこのような準安定イオンの検出は、改変ペプチドを同定し得る。種々の局面で、改変ペプチド、脱改変ペプチドおよび非改変ペプチドの２つ以上に由来するＭＳ／ＭＳデータを少なくとも部分的に使用して、これら３つの形態のペプチドの２つ以上の配列情報および／または改変部位情報を比較することにより、改変ペプチドの存在を同定するための方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９４年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／５６１，９３８号の利益を主張する。上記の仮特許出願の全内容は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（緒言）
質量分析（ＭＳ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含む）は、生物学的研究の多くの分野で広範に使用される分析プラットホームである。生体分子サンプル（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物）は、多くの場合、質量分析器による分析の間に解離を受けやすい不安定な化学結合によってその生体分子に結合された分子を含む。このような部分は、多くの場合、その生体分子の特性および研究中の生物学的システムとのその生体分子の関連性を理解する上で重要で意味のあるものである。例えば、リン酸結合（−ＰＯ４）を含むタンパク質および／またはペプチドは、「リンタンパク質、リンペプチド、またはホスホリル化ペプチドもしくはホスホリル化タンパク質」と称される。これらのペプチドおよびタンパク質は、ＭＳ分析の間にそのリン酸基の解離を受けやすい生体分子の主要な例である。タンパク質におけるリン酸基の付加または除去は、生物学的システムによって、細胞過程の調節のための化学的シグナルまたは誘発因子として広範に使用される。そしてそのようなものとして、リンタンパク質の同定は、プロテオミクス研究の多くの分野における重大な関心の一例である。同様に、ペプチドの他の翻訳後改変（例えば、グリコシル化）は、重要な生物学的影響を有し、そのような改変を含むペプチドはまた、そのグリコシル化部分の解離を受け得る。この点について、タンパク質の酵素的消化または化学的消化によって調製されたペプチドフラグメントにおけるこのような基の改変（例えば、リン酸化およびグリコシル化）の存在を迅速に同定する方法、およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）技術によるさらなる分析のためにこれらのペプチドを選択する方法が非常に望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
本教示は、質量分析（例えば、軸マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）質量分析）によって分析した場合に、ペプチドの混合物から改変ペプチドを同定するための方法に関する。
【０００４】
本教示の種々の局面にしたがって、質量分析器（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器）によって分析される場合に、不安定な生体分子（例えば、リン酸結合または糖結合を有するペプチド）の準安定挙動を使用するための方法が提供され、この方法は、不安定な生体分子（例えば、リンペプチドおよび糖ペプチド）を検出および同定する手段として行われ得る。種々の実施形態において、上記方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器のフィールドフリー領域においてポストソース分解を受けやすい、リンペプチド（および／または糖ペプチドおよび／または他の改変ペプチド）に由来する準安定イオンを同定する工程を包含する。
【０００５】
種々の局面において、不安定な生体分子（例えば、リンペプチドおよび糖ペプチド）を検出および同定する方法は、その不安定な生体分子のＭＳ／ＭＳスペクトルを生成することによって提供される。種々の実施形態において、その方法は、タンデム質量分析を使用して改変ペプチドの配列のすべてもしくは一部を決定し、その改変ペプチドの配列からの情報を使用してデータベースを検索することに基づいて改変部位を決定する工程、その改変ペプチドに対応する脱改変ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを生成する工程、およびその脱改変ペプチドの配列のすべてもしくは一部を決定し、その脱改変ペプチドの配列からの情報を使用してデータベースを検索することに基づいて改変部位を決定する工程を包含する。脱改変ペプチドについて決定された配列および改変部位に対して、改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が比較されて、改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が、脱改変ペプチドについて決定された配列および改変部位と実質的に一致する場合に、改変ペプチドがペプチド混合物中に存在すると同定され得る。
【０００６】
本教示の種々の局面の種々の実施形態において、改変ペプチド（例えば、翻訳後改変ペプチド）の存在を同定する方法は、ＭＳ機器ソフトウェアによって自動化され得、ＭＳ作動で収集されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにおける準安定イオンを検索および検出するコンピュータアルゴリズムによって容易にされ得る。一旦同定されると、実験的に導き出された質量単位値が検出された準安定イオンに加えられて、潜在的な改変ペプチド（例えば、翻訳後改変ペプチド）が同定され得る。種々の実施形態において、推定改変ペプチドの確認は、タンデム質量分析技術によって行われ得る。したがって、種々の局面において、本教示は、本教示の１以上の方法の機能性が、コンピュータ読み取り可能媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、またはＤＶＤ−ＲＯＭが挙げられるが、これらに限定されない）におけるコンピュータ読み取り可能な命令として具現化された製造物品を提供する。
【０００７】
本教示のこれらの特徴および他の特徴は、本明細書に示されている。
【０００８】
当業者は、以下に記載される図面が、図示目的のみであることを理解する。これらの図面は、いかなる様式でも本教示の範囲を限定することを意図されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（種々の実施形態の説明）
本教示は、生物学的システムにおいて改変された種々のクラス生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質）の存在を同定する方法を提供する。例えば、生体分子を改変する種々の構成成分または部分は、その生体分子の状態、およびその生体分子が関係する生物学的システムの機能的安定性に対する重大な関連性を有し得る。ペプチド同定についての種々の実施形態において、このような部分の多くが、ＭＳによって（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で）分析される場合に、ポストソース分解を受けやすい不安定な化学結合によってペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基に連結されている。本教示の方法は、軸ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（例えば、ＶｏｙａｇｅｒＴＭワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））または軸ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ ＭＳ計器システム（例えば、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））とともに使用され得る。
【００１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析に関する種々の実施形態において、目的の生物学的サンプル（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物など）は、固相マトリックスへの分析サンプルの導入によって調製され得る。ＭＡＬＤＩ質量分析計機器は、ＭＡＬＤＩソース領域と呼ばれる真空領域中でサンプルをイオン化するために特別に調整されたレーザーを使用し得る。遊離した分析物イオン（ここではガス相にある）は、電位の適用によって加速されて、フィールドフリー領域に入り得る。このフィールドフリー領域で分析物イオンはそれらの質量電荷比の関数として分離され、それゆえ、このパラメータによって検出および分類され得る。不安定な化学結合を有するいくつかのイオンに共通する現象は、「ポストソース分解」として一般に公知であるプロセスにおいて、質量分析計のフィールドフリー領域でより小さいイオンに解離することである。本明細書中で使用される場合、フィールドフリー領域で解離されるイオンは、準安定イオンと称される。フィールドフリー領域におけるこれらの準安定イオンは、それらが形成される前駆イオンと同じ速度を有するが、それらのより小さい質量に起因してより低い運動エネルギーを有する。代表的なＭＳ機器収集パラメータは、最大感度およびその機器のイオン源領域で形成されるイオンの分解のために特別に調整される。結果として、これらイオンは、イオン源領域で生成されるイオンと同じ程度には集束されない。このような準安定イオンの集束の欠如は、例えば、ＴＯＦ分析器を用いて検出した場合、インタクトなイオン（またはイオン源領域で解離するイオン）の分解と比較して、より小さい質量分解を生じる。準安定イオンフラグメトに関するより小さく測定される解離の別の理由は、準安定イオン形成の間に放出される化学エネルギーのいくらかがそのフラグメトイオンの運動エネルギーに変換されることである。このように増大された運動エネルギーは、典型的に、飛行時間検出における平均エネルギーに変化しないが、そのフラグメトイオンのエネルギーの広がりを増大し得る。また、これらのフラグメントはイオン源領域の外側で形成されるので、例えば、米国特許第５，６２７，３６９号に記載されるように遅延引き出し技術（これは速度集束特性を与え得る）の適用は、このようなフラグメントイオンに影響を与えない。このような準安定イオンは、通常は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルで検出され、そのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルは、それらの分析機器のリフレクターモードの作動で収集される。
【００１１】
種々の実施形態において、本教示の方法は、リンペプチドの存在を同定し得る。種々の実施形態において、これらの方法は、リンペプチド結合の化学的不安定性を利用し、このリンペプチド結合の化学的不安定性は、リンペプチド結合の解離を生じ、リン酸およびその元々のリン酸基を有さないより低質量のペプチドを形成する。この解離は、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計の、レーザー脱離／イオン化後のイオン源領域またはフィールドフリー領域のいずれかで起こり得る。本明細書中で使用される場合、脱リン酸化ペプチドイオンという用語は、ＭＡＬＤＩイオン源領域で解離するイオンを指す。フィールドフリー領域で生成される準安定イオンは、イオン光学によってイオン源領域で生成されるイオンと同程度には集束されず、その結果、ＴＯＦ分離およびイオン検出におけるこれらのイオンのより低い質量分解を生じる。種々の実施形態において、本発明者らは、準安定イオンが、その準安定イオンが生成された前駆イオンについてのｍ／ｚ値よりもおよそ９５質量単位（ｕ）低いピークによって検出され得ることを観測している。タンパク質消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦリフレクターＭＳスペクトル中のこの準安定イオン応答の同定は、推定リン酸化ペプチドの存在（すなわち、準安定イオンよりも約９５ｕ高く、準安定イオンよりも実質的に高い質量分解を有するピークとして）を同定するために使用され得る。インタクトなリン酸化ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルに含まれる他のペプチドの平均分解と実質的に同じ分解を有し得る。しかし、準安定イオンは、代表的に、所定の質量範囲にわたる平均質量分解の準安定イオンの約５０％またはそれよりも低い分解を有し得る。この観測された質量差（すなわち、約９５ｕ）は直感的ではない。なぜなら、そのリン酸基を失ったペプチドの質量は、理論的には、そのリン酸化された対応物よりも９８ｕ低いはずであるからであり、実際に、これが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計のイオン源領域で分解するリンペプチドについて観測される質量差（−９８ｕ）である。
【００１２】
準安定イオンと推定リンペプチド（または他の改変ペプチド）との間の質量差の値は、実験的に導き出され得、機器の配置に依存し得る。例えば、ＬＣ ＭＡＬＤＩ研究（４０個のリン酸化ペプチドが本教示の方法によって同定された）から４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで収集されたリフレクターＭＳスペクトルからの分析は、質量差が平均９５ｕ±１ｕであることが見出された。Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥＴＭ ＳＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）機器が使用された場合と対照的に、実験的に導き出された質量差は、名目上、９４ｕであることが見出された（図６を参照のこと）。
【００１３】
本発明者らは、その前駆リン酸ペプチドイオンと比較して準安定イオンについて期待されるｍ／ｚ比の差が、イオンミラー（リフレクター）構成を備えるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ機器の設計に関して説明され得ることを発見した。この説明のために、リフレクター ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器は、３つの別々の領域（ソース領域、フィールドフリー領域、およびミラー領域）を有すると考えられ得る。Ｄｓ（ソース領域の長さ）、Ｄｆ（フィールドフリー領域の長さ）およびＤｍ（ミラー領域の長さ）を使用すると、各領域における飛行時間は、以下によって決定され得る：
【００１４】
【数３】
ここで、ｔｓは、ソース領域内の飛行時間を表し、ｔｆは、フィールドフリー領域内の飛行時間を表し、ｔｍは、ミラー領域内の飛行時間を表し、αは、定数を表し、ｍは、前駆ペプチドイオンの質量を表し、そしてＶｓは、イオン源電圧を表す。
【００１５】
例えば、フィールドフリー領域において前駆ペプチドから質量の損失（Δｍ（リンペプチドについては９８ｕ））を伴って生成される準安定イオンを考える。準安定イオンは、それらの準安定イオンがミラー領域に到達するまで、それらの準安定イオンとともに実質的に同じ速度で飛行する。それゆえ、準安定イオンと前駆イオンとの間の飛行時間の差は、ミラー領域で生じる。
【００１６】
ミラーまで、準安定イオンは、同じ初速度を有するが、その前駆イオンとは異なる質量を有する。準安定イオンがミラー領域を通って飛行するのにかかる時間は、以下：
【００１７】
【数４】
によって、与えられ得、ここで、
【００１８】
【数５】
は、準安定イオンがミラー領域を通って飛行するのにかかる時間を表す。
【００１９】
時間ｔと質量ｍとの関係は、代表的には、前駆ペプチドイオンの関係によって決定される：
【００２０】
【数６】
。
【００２１】
準安定イオンの飛行時間は、
【００２２】
【数７】
として表され得る。次いで、等式（６）に従って、準安定イオンについての観測質量ｍｍは、
【００２３】
【数８】
によって与えられ得る。
【００２４】
再整理および代入することで、以下の関係：
【００２５】
【数９】
が得られる。
【００２６】
それゆえ、前駆ペプチドイオンとその対応物の準安定イオンとの間で観測される質量差は、
【００２７】
【数１０】
によって与えられ得る。
【００２８】
Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９８，９，８９２−９１１（「Ｖｅｓｔａｌ」）（これは、本明細書中において参考として援用される）においてＶｅｓｔａｌら、によって記載されるように、単段（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｇｅ）のソースおよびミラーを備えるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器について、集束条件は、以下の条件：
【００２９】
【数１１】
によって与えられ得る。それゆえ、このような機器について、
【００３０】
【数１２】
である。
【００３１】
Ｖｅｓｔａｌによって教示されるように、高質量分解は、
【００３２】
【数１３】
が０．９８〜１の範囲にある（これは、βが０．４９〜０．５の範囲にあるのに対応する）場合に達成され得る。しかし、ＤｆおよびＤｓに関してＤｍを書くと、β≡０．５に対する値は、非常に小さいソース領域に対応し得、それゆえ、物理的に非現実的な値であり得る。
【００３３】
種々の実施形態において、合理的な寸法は、ソース領域５ｍｍ長、フィールフリー領域１０００ｍｍ長、そして等式（１０）に従って計算されたミラー長である。このイオン光学構成は、０．４９５のβを有する。
【００３４】
リンペプチドについて、Δｍ＝９８ｕである。準安定イオンの質量（ｍｍ）とその前駆イオンの質量（ｍ）との間の実験的に観測された質量は、等式（１０）を用いて導き出され得る：例えば、１０００〜２５００ｕの質量範囲において、ｍ−ｍｍ＝９５．３±０．７ｕ。
【００３５】
この導き出された値（以前は、実験的に導き出された質量差と称されていた）は、所定の質量範囲にわたる平均観測質量差を表し、実験的に観測される結果と実質的に一致する。本発明者らは、この導き出された値を、本明細書中で調整質量差（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｍａｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）と称する。
【００３６】
異なる型の機器（例えば、ドリフト管長に対して異なるミラー長が使用され得る）について、βが異なり得、結果として観測される準安定イオン質量が異なる。例えば、βが０．４９である場合、観測される質量の差分（デルタ）は、例えば、１０００〜２５００ｕの質量範囲において、ｍ−ｍｍ＝９４．４±０．７ｕである。
【００３７】
本教示にしたがって実行され得る代表的なワークフローを表す種々の実施形態において、ペプチドＭＡＬＤＩサンプルは、サンプルをＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、溶液中のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、次いで、その溶液をＭＡＬＤＩプレート（ＭＡＬＤＩ標的）にスポットすることによって調製され得る。その溶液が乾燥した後、ＭＡＬＤＩプレートは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計のイオン源領域にロードされ得る。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ機器は、一定範囲の質量電荷値にわたってペプチドイオンに対応する複数のピークを有するペプチド混合物のマススペクトルを生成するために、ＭＳオンリーモードで実行され得る。代表的なデータ収集は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ機器がこのモードで作動される場合のより高い分解およびより高い質量精度測定に起因して、サンプル中の成分の質量（または成分の質量電荷比）を同定するためにリフレクターモードの作動で行われ得る。当業者に公知の技術を使用して、質量電荷値の範囲内の各ピークの分解は、そのピークにおける質量をそのピークの幅（そのピーク強度の５０％のところで測定した幅）で除算した値を決定することによって計算され得る。個々の分解から、所定の質量範囲にわたるそのペプチドに対する平均質量分解が決定され得る。同定されたピークの平均分解よりも実質的に分解能が低いマススペクトル中の１以上のピーク（例えば、図２、図５および図６を参照のこと）は、インタクトなペプチド前駆イオンの推定準安定イオンとして選択され得る。調整質量差（例えば、リン酸化ペプチドについてのこの例では９５ｕ）が、選択された推定準安定ピークの質量電荷値に加えられて、新たに計算された質量電荷値においてスペクトル中にピークが存在するかどうかが決定され得る。そのようなピークが存在する場合、そのピークはリンペプチド前駆イオンとして同定され得る。上記のワークフローは、スペクトルに存在する他の推定リンペプチドの存在を同定するために繰り返され得る。ＭＳ分析によって対処される問題にしたがって、ＭＳスペクトルの収集から導き出されたデータが、ペプチド質量フィンガープリント法（ＰＭＦ）のタンパク質データベース検索によるタンパク質同定のために使用され得るか、あるいはそのデータは、さらなる実験（例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用してタンパク質を同定するかまたは本教示に従って同定したリンペプチドが実際にリンペプチドであることを確認するための実験）のための、前駆イオンの選択のために使用され得る。種々の実施形態において、ＭＳ／ＭＳ分析を行うための機器は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒであるが、他のタンデムＭＳ機器も使用され得る。
【００３８】
種々の実施形態において、本明細書中に記載される本教示の方法の１つ以上の機能性は、汎用コンピュータ上のコンピュータ読み取り可能な命令として実行される。そのコンピュータは、質量分析システムから分離され得、取り外し可能であり得、または質量分析システムに組み込まれ得る。このコンピュータ読み取り可能な命令は、多数の高級言語（例えば、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋、またはＢＡＳＩＣ）のうちのいずれか１種で書かれ得る。コンピュータ読み取り可能な命令は、市販のソフトウェア（例えば、ＥＸＣＥＬまたはＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣ）で具現化されたスクリプト、マクロ、または機能で書かれ得る。コンピュータ読み取り可能な命令は、コンピュータ上のマイクロプロセッサレジデントを対象とするアセンブリ言語で実行され得る。例えば、コンピュータ読み取り可能な命令は、ＩＢＭ ＰＣまたはＰＣクローンで実行されるように構成された場合、Ｉｎｔｅｌ ８０×８６アセンブリ言語で実行され得る。
【００３９】
種々の実施形態において、コンピュータ読み取り可能な命令は、製造物品に組み込まれ得、その製造物品としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭのようなコンピュータ読み取り可能なプログラム媒体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「アルゴリズム」および「コンピュータアルゴリズム」とは、コンピュータ読み取り可能な命令を指す。
【００４０】
種々の実施形態において、本教示の方法は、本教示の１以上の方法を実行して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によって分析される場合に容易に切断される官能基で改変されたペプチドピークを検出し同定するコンピュータアルゴリズムを用いる、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ機器ソフトウェアによって行われ得る。例えば、種々の実施形態において、アルゴリズムは、タンパク質同定およびタンパク質の特徴付けを容易にするためのプロテオミクス実験において、複合混合物中の翻訳後リン酸改変されたペプチド（例えば、タンパク質の混合物が、例えば、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジンエンドペプチダーゼ、ＡＲＧ−Ｃ、ＡＳＰ−Ｎ、Ｖ８または当業者に公知の他の酵素）、化学試薬（例えば、臭化シアンなど）、あるいはこれらの組み合わせで消化された場合に生成されるペプチド）の存在を規定する準安定イオンを同定するために以下のストラテジーを用いる本教示の方法を実行する。（例えば、線形モード、リフレクターモードなどで生成される）マススペクトルにおけるピークの質量分解は、一部の質量範囲または全質量範囲にわたって、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ機器ソフトウェアによって決定され得る。代表的なペプチド応答について測定された値よりも小さい分解のピークは、リンペプチドの潜在的な誘導体として同定され、メモリに記憶される。例えば、アルゴリズムは、機器のチューニング条件に依存して、ピークを３，０００〜６，０００の範囲にわたる分解を伴う推定準安定イオンとして同定するように設定され得る。その後、上記工程で記憶された低分解の検出イオンよりも９５ｕ大きいｍ／ｚ値を有し、またＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析されたペプチドについての質量分解と一致する分解（代表的には、１０，０００よりも大きい）も有するイオンが同定され、潜在的なリンペプチドを断定するものとして記憶される。このアプローチによって選択されるイオンシグナルは、分析された混合物中の推定リンペプチドを表す。この予測のさらなる確認は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による推定リンペプチドのさらなる分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ−ＭＳ分析であるが、これらに限定されない）によって達成され得る。
【００４１】
種々の実施形態において、本教示の方法は、以下に詳細に記載されるような広範なワークフローとともに使用され得る。例えば、本教示の種々の実施形態はまた、タンパク質ベースのワークフローまたはペプチドベースのワークフローのいずれかとともに使用され得る。
【００４２】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され得る。タンパク質混合物のゲル電気泳動分離に由来するバンドが切り取られ得、そのバンド中に含まれるタンパク質がインゲル（インサイチュ）酵素消化もしくは化学消化ストラテジーによって消化され得る。このような消化から生じるペプチド混合物は、そのペプチド混合物をマトリックス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸（ｓｉｎｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）など）と混合し、乾燥させ、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析することによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４３】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され得る。タンパク質混合物のゲル電気泳動分離に由来するバンドが切り取られ得、そしてそのバンド中に含まれるタンパク質がインゲル（インサイチュ）酵素消化もしくは化学消化ストラテジーによって消化され得る。遊離したペプチド混合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（例えば、一次元逆相、多次元（２以上の分離の直交次元がこのようなペプチドの複合混合物を分離するように連結され得る）およびこれらの組み合わせ）によってさらに分離され得る。最終的に、分離されたペプチド混合物は、ＭＡＬＤＩマトリックスとともにＭＡＬＤＩプレート上に共沈着されるか、またはＭＡＬＤＩマトリックスと直接混合されてＭＡＬＤＩプレート上に沈着される。得られたサンプルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４４】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され得る。得られたゲルは、分子スキャナーアプローチを用いて精査され得る。このアプローチによって、タンパク質は、酵素（例えば、トリプシンなど）が含浸した膜を通して電子ブロットされる。タンパク質がその酵素膜を横断すると、タンパク質はペプチドに消化され、そのペプチドはその後、ペプチド捕捉膜に捕捉される。その後、ペプチド捕捉膜は、ＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸など）とともに噴霧され、乾燥され、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４５】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、包括的なプロテオミクス実験の間に行われるように、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジンエンドペプチダーゼ、ＡＲＧ−Ｃ、ＡＳＰ−Ｎ、Ｖ８または当業者に公知の他の酵素）、あるいは化学試薬（例えば、臭化シアンなど）で消化され得る。遊離ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（例えば、一次元逆相、多次元（２以上の分離の直交次元がこのようなペプチドの複合混合物を分離するように連結され得る）およびこれらの組み合わせ）を用いて分離され得る。最終的に、分離されたペプチド混合物は、ＭＡＬＤＩマトリックスとともにＭＡＬＤＩプレート上に共沈着されるか、またはＬＣ ＭＡＬＤＩの分野で実行されているように、ＭＡＬＤＩマトリックスと直接混合されて、ＭＡＬＤＩプレート上に沈着される。得られたサンプルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４６】
種々の実施形態において、リンペプチド同定の信頼度は、ペプチドの３つの形態（すなわち、非改変型（ｎｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、リン酸化型（改変型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ））、および脱リン酸化型（脱改変型（ｄｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）））のすべてが同じアミノ酸配列を有するが、改変（例えば、リン酸化）程度に関しては異なるということを考慮することによって増大され得る。それゆえ、リンペプチド同定の信頼度は、これら３つのペプチド形態のうちの２つ以上に対応するＭＳピークについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得して、そのように分析される各ペプチド形態の少なくとも一部分の配列を提供し、そしてこれらの配列を用いてデータベース検索を行い、可能性のあるリン酸化部位を考慮に入れることによって増大され得る。そのような検索を行うために使用され得る市販のデータベースは、ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．）である。
【００４７】
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によるペプチドの配列決定は、代表的に、第一の質量分析計（多くの場合、質量分析の一次元目と称される）を用いてペプチドの分子イオン（多くの場合、「前駆イオン」または「親イオン」と称される）を選択し、そしてその前駆イオンをイオンフラグメンター（例えば、衝突セル（前駆イオンが不活性ガスと衝突する））に誘導することによって達成される。前駆イオンは、衝突セル中で一連のフラグメトイオン（多くの場合、「娘イオン」と称される）にフラグメント化される。この一連のフラグメトイオンの中に、順に数が減少するアミノ酸を有するイオンがある。代表的に、２つの顕著なイオンのセットが生成される。一方は、ペプチドのＣ末端からのアミノ酸欠失を有する配列ラダーである。別のものは、Ｎ末端からのアミノ酸欠失を有するラダーである。次いで、フラグメントイオンが、代表的に、第二の質量分析計（多くの場合、質量分析の二次元目と称される）に誘導されて、前駆イオンのフラグメント化パターン（すなわち、選択されたペプチド）が決定される。
【００４８】
例えば、多くのデータベース検索アプローチは、第一に、検討中の前駆体の質量と一致する質量を有するデータベースペプチドを同定する。次の工程は、前駆体のＭＳ／ＭＳスペクトルをデータベースペプチドの理論的なＭＳ／ＭＳスペクトルと一致させることである。一般的に、最も一致するものが、勝者と宣言される。ペプチドに対する改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、硫酸化など）は、そのような改変が一般的に起こるペプチドに対する改変部位の予想質量の付加によって、データベース検索に考慮に入れられ得る。リン酸化は、一般的に、セリン、スレオニンおよびチロシンで起こり、推定のマッチするもの（ヒット）を同定する前に、データベースペプチドの質量にリン酸化の予想質量（８０ｕ）を付加することによって考慮に入れられ得る。次いで、複数の潜在的にマッチするものが、各々のヒットについて、理論的なスペクトルを形成する前に、セリン部位、スレオニン部位、およびチロシン部位の各々をリン酸化することによって形成され得る。
【００４９】
このプロセスは、脱リン酸ペプチド前駆体にマッチするものを探索する場合に繰り返され得る。データベースペプチドにリン酸化質量（８０ｕ）を加える代わりに、喪失した水分子の質量（１８ｕ）が、非改変ペプチドの質量から減算される。リン酸化に関連する探索と同様に、セリン部位、スレオニン部位およびチロシン部位の各々は、理論的なスペクトルを形成する前に脱リン酸化され得る。同様に、データベース検索は、非改変ペプチドに対応するピークについて、その前駆体で行われ得る。種々の実施形態において、３つすべての検索により同一のアミノ酸配列を得た場合、その検索結果の信頼度は、有意に増大し得る。
【００５０】
図７は、本教示の種々の実施形態のフローチャートを示す。７０５において、ＭＳスキャンが実行される。次いで、このスキャンは、リン酸化または他のペプチド改変（例えば、グリコシル化および硫酸化）に対応するピークの関係について探索され得る。リン酸化は、例えば、現在のピークよりも１８ｕ小さいピークおよび８０ｕ高いピークが存在する場合に存在し得る。このようにして、脱リン酸（脱改変）ペプチド、その対応する非改変ペプチドおよびその対応するリン酸化（改変）ペプチドに対応するピークの群が形成され得る（７１０）。このプロセスは、脱リン酸ペプチド前駆体についてのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得し、水分子の喪失を考慮に入れてデータベースを検索することによって進められ得る（７２０）。同様の取得および検索が、リン酸化ペプチドに対応する前駆体について行われ得る（７３０）。そして、取得および検索が、非改変ペプチドについて行われ得る（７４０）。最後に、２つ以上の検索結果が比較されて、共通のペプチドが同定される（７５０）。付加的な制御論理が、リストの複数の群を加工するために追加され得る（７０２、７１５、７６０）。
【００５１】
当業者は、３つの取得／検索工程のうちのいずれか２つが使用され得ること、および取得／検索工程の順序は、一般的に、重要ではないことを想到する。その上、データベース検索アルゴリズムの正確な型は、一般的に、そのアルゴリズムの型が種々の改変を考慮に入れることを許容する限り、重要ではない。いくつかの実施形態は、各工程における検索結果のランク付けの相違を明らかにすることによって、結果の信頼度を計算する。例えば、３つの検索のうちの２つが高いスコアを有する共通ペプチドを生じ、第三の検索におけるそのペプチドが低いスコアを有する場合、結果の最終的な信頼度は、３つすべての検索によって高いスコアを有する共通ペプチドが得られた場合よりも低くなり得る。
【００５２】
図８は、約１６７ｕの正式な残基質量を有するリン酸化セリンペプチド８０２（改変ペプチド）の解離を模式的に示す。光（ｈν）が照射された場合、この光は、フラグメント化をもたらし、以下を生じ得る：（ｉ）約６９ｕの正式な残基質量およびＨ３ＰＯ４部分（約９８ｕの予想質量）を有する脱リン酸セリン８０４（改変ペプチドに対応する脱改変ペプチド）、および／または（ｉｉ）約８７ｕの正式な残基質量およびＨＰＯ３部分（約８０ｕの予想質量）セリン８０６（改変ペプチドに対応する非改変ペプチド）。
【００５３】
本教示の局面は、以下の実施例に照らしてさらに理解され得る。以下の実施例は、いかなる様式においても本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例１：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計内での準安定イオンの形成）
図１に示される概略図は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計における準安定イオンの形成の説明を示す。ここで、分析計のフィールドフリー領域で形成されたより小さい破線の円で表されたイオンが、準安定イオンである。そうであるとして、このイオンは、（実線の円で表されような）イオン源領域で形成されたイオンと同程度には集束されない。さらに、フィールドフリー領域で形成されたイオンは、化学結合に由来する増大された運動エネルギーの広がりを有するが、運動エネルギーの増加平均は、ゼロである。両方の特性は、このイオン集団のより小さい見かけ上の分解を生じるように組み合わされ得、この見かけ上の分解は、このような準安定イオンを同定することを補助し、最終的には、本教示の種々の実施形態において、準安定イオンが生成されたペプチドを同定することを補助し得る。
【００５５】
（実施例２：リフレクターモード作動のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した場合の、リンペプチドの混合物中の準安定イオンの検出）
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ＬＱＲＱＰＳｐＳＰＧＰＴＰＲ（配列番号１）、ＲＹＰＲＰＶｐＳＶＰＰＳＰＳＬＳＲ（配列番号２）、ＧＴＳＦＭＭｐＴＰＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号３）およびＣＴＮＦＭＭｐＴＰｐＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号４）を含むサンプルの、リフレクターモードの作動で収集されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルが、図２に示される。そのスペクトルは、１スペクトルあたり合計１０００レーザーショットについての２０個のサブスペクトルの平均である。質量範囲（９００−２５００）にわたって見られるように、ほとんどのペプチドに関して観測される分解は、１０，０００よりも大きい。しかし、特定のイオンの質量分解は、非常に低い（例えば、１４０５．３のｍ／ｚ値におけるイオン（２０１）は、３４５８の分解を伴って測定され、１７７９．７のｍ／ｚ値におけるイオン（２０２）は、４２１３の分解を伴って測定された）。これらの不完全に分解されたピークは、準安定イオンを表す。これらの準安定イオン関連ピークの両方は、それら自体よりも約９５ｕ大きい対応する改変ペプチドのピークを有し、そういうものとして、これらの準安定イオンのピークを、リン酸化ペプチドから潜在的に起こるものとして同定した。本実施例において、ｍ／ｚ＝１５００．６で検出されたピーク（２０３）を、ｍ／ｚ＝１４０５．３で検出された準安定イオンに対応するリンペプチドであると予測し、ｍ／ｚ＝１８７４．９で検出されたピークは、ｍ／ｚ＝１７７９．７で検出された準安定イオンに対応するリンペプチドであると予測した。
【００５６】
（実施例３：ｍ／ｚ＝１５００．６のペプチドがリンペプチドであることの確認）
ｍ／ｚ＝１５００．６で検出されたイオンについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを、高エネルギー（１Ｋｅｖ）衝突誘起解離を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで１スペクトルあたり合計２５００個のレーザーショットについての２５個のサブスペクトルの平均で収集し、そのスペクトルを図３に示す。このスペクトルは、前駆イオンからの典型的な９８ｕの喪失およびこのスペクトルで同定されるｙシリーズイオンおよびｂシリーズイオンの多くを示す。このｍ／ｚ＝１５００．６のタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルによって、このペプチドがリンペプチドであることの確認がもたらされた。
【００５７】
（実施例４：ｍ／ｚ＝１８７４．８のペプチドがリンペプチドであることの確認）
ｍ／ｚ＝１８７４．８で検出されたイオンについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを、高エネルギー衝突誘起解離を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで収集し、このスペクトルは、１スペクトルあたり合計２５００個のレーザーショットについての２５個のサブスペクトルの平均であった。このスペクトルを図４に示す。このスペクトルは、前駆イオンからの典型的な９８ｕの喪失およびこのスペクトルで同定されるｙシリーズイオンおよびｂシリーズイオンの多くを示す。このｍ／ｚ＝１８７４．８のタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルによって、このペプチドがリンペプチドであることの確認がもたらされた。
【００５８】
（実施例５：リフレクターモード作動のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した場合の、α−カゼインのトリプシン消化物中の準安定イオンの検出）
リン酸化タンパク質であるα−カゼインを、酵素（ウシトリプシン）によってフラグメントに切断した。これらのフラグメントは、トリプシンペプチドであり、このことは、すべてのペプチドがそのＣ末端にリジンまたはアルギニンのいずれかを有することを意味する。これらのフラグメントは、非リン酸化ペプチドまたはリン酸化ペプチドのいずれかである。このサンプルを、ＭＡＬＤＩマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、乾式液滴（ｄｒｙ−ｄｒｏｐｌｅｔ）法を用いてＭＡＬＤＩプレートにスポットした。このタンパク質の溶液中トリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦリフレクターＭＳスペクトルを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで１スペクトルあたり合計１０００個のレーザーショットについての２０個のサブスペクトルの平均で収集し、そのスペクトルを図５に示す。準安定イオンシグナル（ここでは、リン酸化ペプチドの準安定イオンシグナル）を用いて改変ペプチドを同定する方法（ここで、９５ｕの調整質量差を準安定イオンの質量電荷値に加えた）を、α−カゼインのトリプシン消化物の分析に適用した。本実施例において、実行した方法によって、３つの潜在的なリンペプチド（ＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ（配列番号６）、ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ（配列番号７）、ＫＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ（配列番号８））が、首尾よく決定されたのに対して、ペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）実験では、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索において切断部位が１つ失われ、２つのリンペプチド（ＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ、ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ）のみが同定された。例は、この方法により、１９５２．０におけるピーク（５０１）がリンペプチドとして同定され、その配列が、ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲであることである。このペプチド配列は、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索を用いるペプチド質量フィンガープリントによって確認した。
【００５９】
（実施例６：リフレクターモード作動のＶｏｙａｇｅｒ ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した場合の、準安定イオンの検出）
調整質量差を用いる本教示の方法を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの別の型のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ ＳＴＲ）における、リン酸化ペプチド前駆イオンＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ（配列番号５）の分析に適用した。改変ペプチドを同定するために準安定イオンシグナルを用いるその方法において、９４ｕの調整質量差を準安定イオンの質量電荷値に加えた。このリンペプチドのスペクトルを、１スペクトルあたり２００個のレーザーショットの平均で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥＴＭ ＳＴＲにおいて収集し、このスペクトルを図６に示す。本実施例において、アルゴリズムによって実行された方法によって、２１９１．７５４４（６０１）においてリンペプチドの存在が決定され、２０９７．８１９６（６０２）におけるイオンが、準安定イオンである。
【００６０】
（実施例７：リンペプチド中の準安定イオンの検出の継続）
リン酸化タンパク質であるα−カゼインを、酵素（ウシトリプシン）によってフラグメントに切断し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いる質量分析の分析に供して、図９に示されるスペクトルを得た。改変ペプチドを同定するために準安定イオンシグナル（ここでは、リン酸化ペプチドの準安定イオンシグナル）を用いる方法（ここで、９５ｕの調整質量差を準安定イオンの質量電荷値に加えた）によって、１９５２．０ｕ（９０１）において推定リンペプチドを、１８５４．０ｕ（９０２）においてその脱リン酸ペプチドを、そして１８７２．０ｕ（９０３）において非改変ペプチドを同定した。これらの知見を確認するために、ＭＳ／ＭＳスペクトル（図１０）を、フラグメント化された前駆イオンとして推定リンペプチド（１９５２．０ｕ）を用いて取得した。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを、セリン、スレオニンおよびチロシンの可変リン酸化を用いるＭＡＳＣＯＴデータベース検索に供した。ＭＡＳＣＯＴ検索からのペプチドイオンスコアは５０であり、その同定の信頼度は９９．７％であった。別のＭＡＳＣＯＴデータベース検索を、脱リン酸ペプチド（１８５４．０ｕ）のＭＳ／ＭＳスペクトルについて行ったが、このときはセリン、スレオニンおよびチロシンの可変改変として脱Ｈ２Ｏを使用した。その結果を図１１に示す。この例において、ペプチドイオンスコアは８５であり、その同定の信頼度は１００％であった。両方のデータベース検索で見出されたペプチド配列は同じであり、それゆえ、本実施例は、１９５２．０ｕにおいて見出された前駆リンペプチドがリン酸化ペプチドであることを確認したことを示す。
【００６１】
本出願に引用されるすべての文献および類似物（特許、特許出願、記事、書籍、学術論文、およびウェブページが挙げられるが、これらに限定されない）は、そのような文献および類似物の形式にかかわらず、明示的に、その全体が参考として援用される。援用された１つ以上の文献および類似物が本出願とことなるかまたは矛盾する場合（定義された用語、用語の用法、記載された技術などが挙げられるが、これらに限定されない）、本出願が支配する。
【００６２】
本明細書中で使用される節の見出しは、構成上の目的のためのみであり、いかなる様式においても記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。
【００６３】
本教示は、種々の実施形態に関して記載されているが、本教示がそのような実施形態または実施例に限定されることは意図されない。一方で、本教示は、当業者が想到するように、種々の変更、改変、および等価物を包含する。
【００６４】
特許請求の範囲は、その効果が述べられていない限り、記載される順序または要素に限定されるように読まれるべきではない。形式および詳細の種々の変更が添付の特許請求の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。それゆえ、特許請求の範囲の範囲および精神にあるすべての実施形態およびそれらに対する等価物が権利主張される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計における準安定イオン形成を強調する概略を示す。
【図２】図２は、純粋な合成リンペプチドであるＬＱＲＱＰＳｐＳＰＧＰＴＰＲ（配列番号１）、ＲＹＰＲＰＶｐＳＶＰＰＳＰＳＬＳＲ（配列番号２）、ＧＴＳＦＭＭｐＴＰＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号３）およびＣＴＮＦＭＭｐＴＰｐＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号４）の混合物についての、リフレクター作動モードでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す（注：アミノ酸残基の左側の「ｐ」は、その「ｐ」のすぐ右側の残基としてのリン酸化部位を識別する）。
【図３】図３は、ｍ／ｚ １５００．６（図２に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ １４０５．３における準安定イオンの検出によって同定される推定リンペプチド）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図４】図４は、ｍ／ｚ １８７４．８（図２に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ １７７９．７における準安定イオンの検出によって同定される推定リンペプチド）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図５】図５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析器のリフレクター作動モードで収集された、タンパク質の溶液中トリプシン消化物であるα−カゼインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。上のパネルは、リンペプチド前駆イオンを同定するために使用された準安定イオンを可視化する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルの拡大図である。
【図６】図６は、純粋な合成リンペプチドＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ（配列番号５）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図７】図７は、検出されたペプチドの信頼度を高めるために使用され得る、本教示の種々の実施形態のフローチャートを示す。
【図８】図８は、リン酸化セリン（改変ペプチド）、ならびにリン酸化セリンの脱リン酸セリン（脱改変ペプチド）およびセリン（非改変ペプチド）への解離を模式的に示す。
【図９】図９は、リンタンパク質の代表的な消化物であるα−カゼインのマススペクトルである。
【図１０】図１０は、図９のマススペクトルにおける種々のピークのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図１１】図１１は、図９のマススペクトルにおける種々のピークのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９４年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／５６１，９３８号の利益を主張する。上記の仮特許出願の全内容は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（緒言）
質量分析（ＭＳ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含む）は、生物学的研究の多くの分野で広範に使用される分析プラットホームである。生体分子サンプル（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物）は、多くの場合、質量分析器による分析の間に解離を受けやすい不安定な化学結合によってその生体分子に結合された分子を含む。このような部分は、多くの場合、その生体分子の特性および研究中の生物学的システムとのその生体分子の関連性を理解する上で重要で意味のあるものである。例えば、リン酸結合（−ＰＯ４）を含むタンパク質および／またはペプチドは、「リンタンパク質、リンペプチド、またはホスホリル化ペプチドもしくはホスホリル化タンパク質」と称される。これらのペプチドおよびタンパク質は、ＭＳ分析の間にそのリン酸基の解離を受けやすい生体分子の主要な例である。タンパク質におけるリン酸基の付加または除去は、生物学的システムによって、細胞過程の調節のための化学的シグナルまたは誘発因子として広範に使用される。そしてそのようなものとして、リンタンパク質の同定は、プロテオミクス研究の多くの分野における重大な関心の一例である。同様に、ペプチドの他の翻訳後改変（例えば、グリコシル化）は、重要な生物学的影響を有し、そのような改変を含むペプチドはまた、そのグリコシル化部分の解離を受け得る。この点について、タンパク質の酵素的消化または化学的消化によって調製されたペプチドフラグメントにおけるこのような基の改変（例えば、リン酸化およびグリコシル化）の存在を迅速に同定する方法、およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）技術によるさらなる分析のためにこれらのペプチドを選択する方法が非常に望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
本教示は、質量分析（例えば、軸マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）質量分析）によって分析した場合に、ペプチドの混合物から改変ペプチドを同定するための方法に関する。
【０００４】
本教示の種々の局面にしたがって、質量分析器（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器）によって分析される場合に、不安定な生体分子（例えば、リン酸結合または糖結合を有するペプチド）の準安定挙動を使用するための方法が提供され、この方法は、不安定な生体分子（例えば、リンペプチドおよび糖ペプチド）を検出および同定する手段として行われ得る。種々の実施形態において、上記方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器のフィールドフリー領域においてポストソース分解を受けやすい、リンペプチド（および／または糖ペプチドおよび／または他の改変ペプチド）に由来する準安定イオンを同定する工程を包含する。
【０００５】
種々の局面において、不安定な生体分子（例えば、リンペプチドおよび糖ペプチド）を検出および同定する方法は、その不安定な生体分子のＭＳ／ＭＳスペクトルを生成することによって提供される。種々の実施形態において、その方法は、タンデム質量分析を使用して改変ペプチドの配列のすべてもしくは一部を決定し、その改変ペプチドの配列からの情報を使用してデータベースを検索することに基づいて改変部位を決定する工程、その改変ペプチドに対応する脱改変ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを生成する工程、およびその脱改変ペプチドの配列のすべてもしくは一部を決定し、その脱改変ペプチドの配列からの情報を使用してデータベースを検索することに基づいて改変部位を決定する工程を包含する。脱改変ペプチドについて決定された配列および改変部位に対して、改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が比較されて、改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が、脱改変ペプチドについて決定された配列および改変部位と実質的に一致する場合に、改変ペプチドがペプチド混合物中に存在すると同定され得る。
【０００６】
本教示の種々の局面の種々の実施形態において、改変ペプチド（例えば、翻訳後改変ペプチド）の存在を同定する方法は、ＭＳ機器ソフトウェアによって自動化され得、ＭＳ作動で収集されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにおける準安定イオンを検索および検出するコンピュータアルゴリズムによって容易にされ得る。一旦同定されると、実験的に導き出された質量単位値が検出された準安定イオンに加えられて、潜在的な改変ペプチド（例えば、翻訳後改変ペプチド）が同定され得る。種々の実施形態において、推定改変ペプチドの確認は、タンデム質量分析技術によって行われ得る。したがって、種々の局面において、本教示は、本教示の１以上の方法の機能性が、コンピュータ読み取り可能媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、またはＤＶＤ−ＲＯＭが挙げられるが、これらに限定されない）におけるコンピュータ読み取り可能な命令として具現化された製造物品を提供する。
【０００７】
本教示のこれらの特徴および他の特徴は、本明細書に示されている。
【０００８】
当業者は、以下に記載される図面が、図示目的のみであることを理解する。これらの図面は、いかなる様式でも本教示の範囲を限定することを意図されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（種々の実施形態の説明）
本教示は、生物学的システムにおいて改変された種々のクラス生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質）の存在を同定する方法を提供する。例えば、生体分子を改変する種々の構成成分または部分は、その生体分子の状態、およびその生体分子が関係する生物学的システムの機能的安定性に対する重大な関連性を有し得る。ペプチド同定についての種々の実施形態において、このような部分の多くが、ＭＳによって（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で）分析される場合に、ポストソース分解を受けやすい不安定な化学結合によってペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基に連結されている。本教示の方法は、軸ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（例えば、ＶｏｙａｇｅｒＴＭワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））または軸ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ ＭＳ計器システム（例えば、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））とともに使用され得る。
【００１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析に関する種々の実施形態において、目的の生物学的サンプル（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物など）は、固相マトリックスへの分析サンプルの導入によって調製され得る。ＭＡＬＤＩ質量分析計機器は、ＭＡＬＤＩソース領域と呼ばれる真空領域中でサンプルをイオン化するために特別に調整されたレーザーを使用し得る。遊離した分析物イオン（ここではガス相にある）は、電位の適用によって加速されて、フィールドフリー領域に入り得る。このフィールドフリー領域で分析物イオンはそれらの質量電荷比の関数として分離され、それゆえ、このパラメータによって検出および分類され得る。不安定な化学結合を有するいくつかのイオンに共通する現象は、「ポストソース分解」として一般に公知であるプロセスにおいて、質量分析計のフィールドフリー領域でより小さいイオンに解離することである。本明細書中で使用される場合、フィールドフリー領域で解離されるイオンは、準安定イオンと称される。フィールドフリー領域におけるこれらの準安定イオンは、それらが形成される前駆イオンと同じ速度を有するが、それらのより小さい質量に起因してより低い運動エネルギーを有する。代表的なＭＳ機器収集パラメータは、最大感度およびその機器のイオン源領域で形成されるイオンの分解のために特別に調整される。結果として、これらイオンは、イオン源領域で生成されるイオンと同じ程度には集束されない。このような準安定イオンの集束の欠如は、例えば、ＴＯＦ分析器を用いて検出した場合、インタクトなイオン（またはイオン源領域で解離するイオン）の分解と比較して、より小さい質量分解を生じる。準安定イオンフラグメトに関するより小さく測定される解離の別の理由は、準安定イオン形成の間に放出される化学エネルギーのいくらかがそのフラグメトイオンの運動エネルギーに変換されることである。このように増大された運動エネルギーは、典型的に、飛行時間検出における平均エネルギーに変化しないが、そのフラグメトイオンのエネルギーの広がりを増大し得る。また、これらのフラグメントはイオン源領域の外側で形成されるので、例えば、米国特許第５，６２７，３６９号に記載されるように遅延引き出し技術（これは速度集束特性を与え得る）の適用は、このようなフラグメントイオンに影響を与えない。このような準安定イオンは、通常は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルで検出され、そのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルは、それらの分析機器のリフレクターモードの作動で収集される。
【００１１】
種々の実施形態において、本教示の方法は、リンペプチドの存在を同定し得る。種々の実施形態において、これらの方法は、リンペプチド結合の化学的不安定性を利用し、このリンペプチド結合の化学的不安定性は、リンペプチド結合の解離を生じ、リン酸およびその元々のリン酸基を有さないより低質量のペプチドを形成する。この解離は、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計の、レーザー脱離／イオン化後のイオン源領域またはフィールドフリー領域のいずれかで起こり得る。本明細書中で使用される場合、脱リン酸化ペプチドイオンという用語は、ＭＡＬＤＩイオン源領域で解離するイオンを指す。フィールドフリー領域で生成される準安定イオンは、イオン光学によってイオン源領域で生成されるイオンと同程度には集束されず、その結果、ＴＯＦ分離およびイオン検出におけるこれらのイオンのより低い質量分解を生じる。種々の実施形態において、本発明者らは、準安定イオンが、その準安定イオンが生成された前駆イオンについてのｍ／ｚ値よりもおよそ９５質量単位（ｕ）低いピークによって検出され得ることを観測している。タンパク質消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦリフレクターＭＳスペクトル中のこの準安定イオン応答の同定は、推定リン酸化ペプチドの存在（すなわち、準安定イオンよりも約９５ｕ高く、準安定イオンよりも実質的に高い質量分解を有するピークとして）を同定するために使用され得る。インタクトなリン酸化ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルに含まれる他のペプチドの平均分解と実質的に同じ分解を有し得る。しかし、準安定イオンは、代表的に、所定の質量範囲にわたる平均質量分解の準安定イオンの約５０％またはそれよりも低い分解を有し得る。この観測された質量差（すなわち、約９５ｕ）は直感的ではない。なぜなら、そのリン酸基を失ったペプチドの質量は、理論的には、そのリン酸化された対応物よりも９８ｕ低いはずであるからであり、実際に、これが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計のイオン源領域で分解するリンペプチドについて観測される質量差（−９８ｕ）である。
【００１２】
準安定イオンと推定リンペプチド（または他の改変ペプチド）との間の質量差の値は、実験的に導き出され得、機器の配置に依存し得る。例えば、ＬＣ ＭＡＬＤＩ研究（４０個のリン酸化ペプチドが本教示の方法によって同定された）から４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで収集されたリフレクターＭＳスペクトルからの分析は、質量差が平均９５ｕ±１ｕであることが見出された。Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥＴＭ ＳＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）機器が使用された場合と対照的に、実験的に導き出された質量差は、名目上、９４ｕであることが見出された（図６を参照のこと）。
【００１３】
本発明者らは、その前駆リン酸ペプチドイオンと比較して準安定イオンについて期待されるｍ／ｚ比の差が、イオンミラー（リフレクター）構成を備えるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ機器の設計に関して説明され得ることを発見した。この説明のために、リフレクター ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器は、３つの別々の領域（ソース領域、フィールドフリー領域、およびミラー領域）を有すると考えられ得る。Ｄｓ（ソース領域の長さ）、Ｄｆ（フィールドフリー領域の長さ）およびＤｍ（ミラー領域の長さ）を使用すると、各領域における飛行時間は、以下によって決定され得る：
【００１４】
【数３】
ここで、ｔｓは、ソース領域内の飛行時間を表し、ｔｆは、フィールドフリー領域内の飛行時間を表し、ｔｍは、ミラー領域内の飛行時間を表し、αは、定数を表し、ｍは、前駆ペプチドイオンの質量を表し、そしてＶｓは、イオン源電圧を表す。
【００１５】
例えば、フィールドフリー領域において前駆ペプチドから質量の損失（Δｍ（リンペプチドについては９８ｕ））を伴って生成される準安定イオンを考える。準安定イオンは、それらの準安定イオンがミラー領域に到達するまで、それらの準安定イオンとともに実質的に同じ速度で飛行する。それゆえ、準安定イオンと前駆イオンとの間の飛行時間の差は、ミラー領域で生じる。
【００１６】
ミラーまで、準安定イオンは、同じ初速度を有するが、その前駆イオンとは異なる質量を有する。準安定イオンがミラー領域を通って飛行するのにかかる時間は、以下：
【００１７】
【数４】
によって、与えられ得、ここで、
【００１８】
【数５】
は、準安定イオンがミラー領域を通って飛行するのにかかる時間を表す。
【００１９】
時間ｔと質量ｍとの関係は、代表的には、前駆ペプチドイオンの関係によって決定される：
【００２０】
【数６】
。
【００２１】
準安定イオンの飛行時間は、
【００２２】
【数７】
として表され得る。次いで、等式（６）に従って、準安定イオンについての観測質量ｍｍは、
【００２３】
【数８】
によって与えられ得る。
【００２４】
再整理および代入することで、以下の関係：
【００２５】
【数９】
が得られる。
【００２６】
それゆえ、前駆ペプチドイオンとその対応物の準安定イオンとの間で観測される質量差は、
【００２７】
【数１０】
によって与えられ得る。
【００２８】
Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９８，９，８９２−９１１（「Ｖｅｓｔａｌ」）（これは、本明細書中において参考として援用される）においてＶｅｓｔａｌら、によって記載されるように、単段（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｇｅ）のソースおよびミラーを備えるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器について、集束条件は、以下の条件：
【００２９】
【数１１】
によって与えられ得る。それゆえ、このような機器について、
【００３０】
【数１２】
である。
【００３１】
Ｖｅｓｔａｌによって教示されるように、高質量分解は、
【００３２】
【数１３】
が０．９８〜１の範囲にある（これは、βが０．４９〜０．５の範囲にあるのに対応する）場合に達成され得る。しかし、ＤｆおよびＤｓに関してＤｍを書くと、β≡０．５に対する値は、非常に小さいソース領域に対応し得、それゆえ、物理的に非現実的な値であり得る。
【００３３】
種々の実施形態において、合理的な寸法は、ソース領域５ｍｍ長、フィールフリー領域１０００ｍｍ長、そして等式（１０）に従って計算されたミラー長である。このイオン光学構成は、０．４９５のβを有する。
【００３４】
リンペプチドについて、Δｍ＝９８ｕである。準安定イオンの質量（ｍｍ）とその前駆イオンの質量（ｍ）との間の実験的に観測された質量は、等式（１０）を用いて導き出され得る：例えば、１０００〜２５００ｕの質量範囲において、ｍ−ｍｍ＝９５．３±０．７ｕ。
【００３５】
この導き出された値（以前は、実験的に導き出された質量差と称されていた）は、所定の質量範囲にわたる平均観測質量差を表し、実験的に観測される結果と実質的に一致する。本発明者らは、この導き出された値を、本明細書中で調整質量差（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｍａｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）と称する。
【００３６】
異なる型の機器（例えば、ドリフト管長に対して異なるミラー長が使用され得る）について、βが異なり得、結果として観測される準安定イオン質量が異なる。例えば、βが０．４９である場合、観測される質量の差分（デルタ）は、例えば、１０００〜２５００ｕの質量範囲において、ｍ−ｍｍ＝９４．４±０．７ｕである。
【００３７】
本教示にしたがって実行され得る代表的なワークフローを表す種々の実施形態において、ペプチドＭＡＬＤＩサンプルは、サンプルをＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、溶液中のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、次いで、その溶液をＭＡＬＤＩプレート（ＭＡＬＤＩ標的）にスポットすることによって調製され得る。その溶液が乾燥した後、ＭＡＬＤＩプレートは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計のイオン源領域にロードされ得る。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ機器は、一定範囲の質量電荷値にわたってペプチドイオンに対応する複数のピークを有するペプチド混合物のマススペクトルを生成するために、ＭＳオンリーモードで実行され得る。代表的なデータ収集は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ機器がこのモードで作動される場合のより高い分解およびより高い質量精度測定に起因して、サンプル中の成分の質量（または成分の質量電荷比）を同定するためにリフレクターモードの作動で行われ得る。当業者に公知の技術を使用して、質量電荷値の範囲内の各ピークの分解は、そのピークにおける質量をそのピークの幅（そのピーク強度の５０％のところで測定した幅）で除算した値を決定することによって計算され得る。個々の分解から、所定の質量範囲にわたるそのペプチドに対する平均質量分解が決定され得る。同定されたピークの平均分解よりも実質的に分解能が低いマススペクトル中の１以上のピーク（例えば、図２、図５および図６を参照のこと）は、インタクトなペプチド前駆イオンの推定準安定イオンとして選択され得る。調整質量差（例えば、リン酸化ペプチドについてのこの例では９５ｕ）が、選択された推定準安定ピークの質量電荷値に加えられて、新たに計算された質量電荷値においてスペクトル中にピークが存在するかどうかが決定され得る。そのようなピークが存在する場合、そのピークはリンペプチド前駆イオンとして同定され得る。上記のワークフローは、スペクトルに存在する他の推定リンペプチドの存在を同定するために繰り返され得る。ＭＳ分析によって対処される問題にしたがって、ＭＳスペクトルの収集から導き出されたデータが、ペプチド質量フィンガープリント法（ＰＭＦ）のタンパク質データベース検索によるタンパク質同定のために使用され得るか、あるいはそのデータは、さらなる実験（例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用してタンパク質を同定するかまたは本教示に従って同定したリンペプチドが実際にリンペプチドであることを確認するための実験）のための、前駆イオンの選択のために使用され得る。種々の実施形態において、ＭＳ／ＭＳ分析を行うための機器は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒであるが、他のタンデムＭＳ機器も使用され得る。
【００３８】
種々の実施形態において、本明細書中に記載される本教示の方法の１つ以上の機能性は、汎用コンピュータ上のコンピュータ読み取り可能な命令として実行される。そのコンピュータは、質量分析システムから分離され得、取り外し可能であり得、または質量分析システムに組み込まれ得る。このコンピュータ読み取り可能な命令は、多数の高級言語（例えば、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋、またはＢＡＳＩＣ）のうちのいずれか１種で書かれ得る。コンピュータ読み取り可能な命令は、市販のソフトウェア（例えば、ＥＸＣＥＬまたはＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣ）で具現化されたスクリプト、マクロ、または機能で書かれ得る。コンピュータ読み取り可能な命令は、コンピュータ上のマイクロプロセッサレジデントを対象とするアセンブリ言語で実行され得る。例えば、コンピュータ読み取り可能な命令は、ＩＢＭ ＰＣまたはＰＣクローンで実行されるように構成された場合、Ｉｎｔｅｌ ８０×８６アセンブリ言語で実行され得る。
【００３９】
種々の実施形態において、コンピュータ読み取り可能な命令は、製造物品に組み込まれ得、その製造物品としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭのようなコンピュータ読み取り可能なプログラム媒体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「アルゴリズム」および「コンピュータアルゴリズム」とは、コンピュータ読み取り可能な命令を指す。
【００４０】
種々の実施形態において、本教示の方法は、本教示の１以上の方法を実行して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によって分析される場合に容易に切断される官能基で改変されたペプチドピークを検出し同定するコンピュータアルゴリズムを用いる、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ機器ソフトウェアによって行われ得る。例えば、種々の実施形態において、アルゴリズムは、タンパク質同定およびタンパク質の特徴付けを容易にするためのプロテオミクス実験において、複合混合物中の翻訳後リン酸改変されたペプチド（例えば、タンパク質の混合物が、例えば、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジンエンドペプチダーゼ、ＡＲＧ−Ｃ、ＡＳＰ−Ｎ、Ｖ８または当業者に公知の他の酵素）、化学試薬（例えば、臭化シアンなど）、あるいはこれらの組み合わせで消化された場合に生成されるペプチド）の存在を規定する準安定イオンを同定するために以下のストラテジーを用いる本教示の方法を実行する。（例えば、線形モード、リフレクターモードなどで生成される）マススペクトルにおけるピークの質量分解は、一部の質量範囲または全質量範囲にわたって、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ機器ソフトウェアによって決定され得る。代表的なペプチド応答について測定された値よりも小さい分解のピークは、リンペプチドの潜在的な誘導体として同定され、メモリに記憶される。例えば、アルゴリズムは、機器のチューニング条件に依存して、ピークを３，０００〜６，０００の範囲にわたる分解を伴う推定準安定イオンとして同定するように設定され得る。その後、上記工程で記憶された低分解の検出イオンよりも９５ｕ大きいｍ／ｚ値を有し、またＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析されたペプチドについての質量分解と一致する分解（代表的には、１０，０００よりも大きい）も有するイオンが同定され、潜在的なリンペプチドを断定するものとして記憶される。このアプローチによって選択されるイオンシグナルは、分析された混合物中の推定リンペプチドを表す。この予測のさらなる確認は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による推定リンペプチドのさらなる分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ−ＭＳ分析であるが、これらに限定されない）によって達成され得る。
【００４１】
種々の実施形態において、本教示の方法は、以下に詳細に記載されるような広範なワークフローとともに使用され得る。例えば、本教示の種々の実施形態はまた、タンパク質ベースのワークフローまたはペプチドベースのワークフローのいずれかとともに使用され得る。
【００４２】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され得る。タンパク質混合物のゲル電気泳動分離に由来するバンドが切り取られ得、そのバンド中に含まれるタンパク質がインゲル（インサイチュ）酵素消化もしくは化学消化ストラテジーによって消化され得る。このような消化から生じるペプチド混合物は、そのペプチド混合物をマトリックス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸（ｓｉｎｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）など）と混合し、乾燥させ、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析することによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４３】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され得る。タンパク質混合物のゲル電気泳動分離に由来するバンドが切り取られ得、そしてそのバンド中に含まれるタンパク質がインゲル（インサイチュ）酵素消化もしくは化学消化ストラテジーによって消化され得る。遊離したペプチド混合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（例えば、一次元逆相、多次元（２以上の分離の直交次元がこのようなペプチドの複合混合物を分離するように連結され得る）およびこれらの組み合わせ）によってさらに分離され得る。最終的に、分離されたペプチド混合物は、ＭＡＬＤＩマトリックスとともにＭＡＬＤＩプレート上に共沈着されるか、またはＭＡＬＤＩマトリックスと直接混合されてＭＡＬＤＩプレート上に沈着される。得られたサンプルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４４】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され得る。得られたゲルは、分子スキャナーアプローチを用いて精査され得る。このアプローチによって、タンパク質は、酵素（例えば、トリプシンなど）が含浸した膜を通して電子ブロットされる。タンパク質がその酵素膜を横断すると、タンパク質はペプチドに消化され、そのペプチドはその後、ペプチド捕捉膜に捕捉される。その後、ペプチド捕捉膜は、ＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸など）とともに噴霧され、乾燥され、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４５】
種々の実施形態において、リンタンパク質を含むタンパク質混合物は、包括的なプロテオミクス実験の間に行われるように、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジンエンドペプチダーゼ、ＡＲＧ−Ｃ、ＡＳＰ−Ｎ、Ｖ８または当業者に公知の他の酵素）、あるいは化学試薬（例えば、臭化シアンなど）で消化され得る。遊離ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（例えば、一次元逆相、多次元（２以上の分離の直交次元がこのようなペプチドの複合混合物を分離するように連結され得る）およびこれらの組み合わせ）を用いて分離され得る。最終的に、分離されたペプチド混合物は、ＭＡＬＤＩマトリックスとともにＭＡＬＤＩプレート上に共沈着されるか、またはＬＣ ＭＡＬＤＩの分野で実行されているように、ＭＡＬＤＩマトリックスと直接混合されて、ＭＡＬＤＩプレート上に沈着される。得られたサンプルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。次いで、本教示の１以上の方法が適用されて、推定リンペプチドが同定される。
【００４６】
種々の実施形態において、リンペプチド同定の信頼度は、ペプチドの３つの形態（すなわち、非改変型（ｎｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、リン酸化型（改変型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ））、および脱リン酸化型（脱改変型（ｄｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）））のすべてが同じアミノ酸配列を有するが、改変（例えば、リン酸化）程度に関しては異なるということを考慮することによって増大され得る。それゆえ、リンペプチド同定の信頼度は、これら３つのペプチド形態のうちの２つ以上に対応するＭＳピークについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得して、そのように分析される各ペプチド形態の少なくとも一部分の配列を提供し、そしてこれらの配列を用いてデータベース検索を行い、可能性のあるリン酸化部位を考慮に入れることによって増大され得る。そのような検索を行うために使用され得る市販のデータベースは、ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．）である。
【００４７】
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によるペプチドの配列決定は、代表的に、第一の質量分析計（多くの場合、質量分析の一次元目と称される）を用いてペプチドの分子イオン（多くの場合、「前駆イオン」または「親イオン」と称される）を選択し、そしてその前駆イオンをイオンフラグメンター（例えば、衝突セル（前駆イオンが不活性ガスと衝突する））に誘導することによって達成される。前駆イオンは、衝突セル中で一連のフラグメトイオン（多くの場合、「娘イオン」と称される）にフラグメント化される。この一連のフラグメトイオンの中に、順に数が減少するアミノ酸を有するイオンがある。代表的に、２つの顕著なイオンのセットが生成される。一方は、ペプチドのＣ末端からのアミノ酸欠失を有する配列ラダーである。別のものは、Ｎ末端からのアミノ酸欠失を有するラダーである。次いで、フラグメントイオンが、代表的に、第二の質量分析計（多くの場合、質量分析の二次元目と称される）に誘導されて、前駆イオンのフラグメント化パターン（すなわち、選択されたペプチド）が決定される。
【００４８】
例えば、多くのデータベース検索アプローチは、第一に、検討中の前駆体の質量と一致する質量を有するデータベースペプチドを同定する。次の工程は、前駆体のＭＳ／ＭＳスペクトルをデータベースペプチドの理論的なＭＳ／ＭＳスペクトルと一致させることである。一般的に、最も一致するものが、勝者と宣言される。ペプチドに対する改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、硫酸化など）は、そのような改変が一般的に起こるペプチドに対する改変部位の予想質量の付加によって、データベース検索に考慮に入れられ得る。リン酸化は、一般的に、セリン、スレオニンおよびチロシンで起こり、推定のマッチするもの（ヒット）を同定する前に、データベースペプチドの質量にリン酸化の予想質量（８０ｕ）を付加することによって考慮に入れられ得る。次いで、複数の潜在的にマッチするものが、各々のヒットについて、理論的なスペクトルを形成する前に、セリン部位、スレオニン部位、およびチロシン部位の各々をリン酸化することによって形成され得る。
【００４９】
このプロセスは、脱リン酸ペプチド前駆体にマッチするものを探索する場合に繰り返され得る。データベースペプチドにリン酸化質量（８０ｕ）を加える代わりに、喪失した水分子の質量（１８ｕ）が、非改変ペプチドの質量から減算される。リン酸化に関連する探索と同様に、セリン部位、スレオニン部位およびチロシン部位の各々は、理論的なスペクトルを形成する前に脱リン酸化され得る。同様に、データベース検索は、非改変ペプチドに対応するピークについて、その前駆体で行われ得る。種々の実施形態において、３つすべての検索により同一のアミノ酸配列を得た場合、その検索結果の信頼度は、有意に増大し得る。
【００５０】
図７は、本教示の種々の実施形態のフローチャートを示す。７０５において、ＭＳスキャンが実行される。次いで、このスキャンは、リン酸化または他のペプチド改変（例えば、グリコシル化および硫酸化）に対応するピークの関係について探索され得る。リン酸化は、例えば、現在のピークよりも１８ｕ小さいピークおよび８０ｕ高いピークが存在する場合に存在し得る。このようにして、脱リン酸（脱改変）ペプチド、その対応する非改変ペプチドおよびその対応するリン酸化（改変）ペプチドに対応するピークの群が形成され得る（７１０）。このプロセスは、脱リン酸ペプチド前駆体についてのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得し、水分子の喪失を考慮に入れてデータベースを検索することによって進められ得る（７２０）。同様の取得および検索が、リン酸化ペプチドに対応する前駆体について行われ得る（７３０）。そして、取得および検索が、非改変ペプチドについて行われ得る（７４０）。最後に、２つ以上の検索結果が比較されて、共通のペプチドが同定される（７５０）。付加的な制御論理が、リストの複数の群を加工するために追加され得る（７０２、７１５、７６０）。
【００５１】
当業者は、３つの取得／検索工程のうちのいずれか２つが使用され得ること、および取得／検索工程の順序は、一般的に、重要ではないことを想到する。その上、データベース検索アルゴリズムの正確な型は、一般的に、そのアルゴリズムの型が種々の改変を考慮に入れることを許容する限り、重要ではない。いくつかの実施形態は、各工程における検索結果のランク付けの相違を明らかにすることによって、結果の信頼度を計算する。例えば、３つの検索のうちの２つが高いスコアを有する共通ペプチドを生じ、第三の検索におけるそのペプチドが低いスコアを有する場合、結果の最終的な信頼度は、３つすべての検索によって高いスコアを有する共通ペプチドが得られた場合よりも低くなり得る。
【００５２】
図８は、約１６７ｕの正式な残基質量を有するリン酸化セリンペプチド８０２（改変ペプチド）の解離を模式的に示す。光（ｈν）が照射された場合、この光は、フラグメント化をもたらし、以下を生じ得る：（ｉ）約６９ｕの正式な残基質量およびＨ３ＰＯ４部分（約９８ｕの予想質量）を有する脱リン酸セリン８０４（改変ペプチドに対応する脱改変ペプチド）、および／または（ｉｉ）約８７ｕの正式な残基質量およびＨＰＯ３部分（約８０ｕの予想質量）セリン８０６（改変ペプチドに対応する非改変ペプチド）。
【００５３】
本教示の局面は、以下の実施例に照らしてさらに理解され得る。以下の実施例は、いかなる様式においても本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例１：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計内での準安定イオンの形成）
図１に示される概略図は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計における準安定イオンの形成の説明を示す。ここで、分析計のフィールドフリー領域で形成されたより小さい破線の円で表されたイオンが、準安定イオンである。そうであるとして、このイオンは、（実線の円で表されような）イオン源領域で形成されたイオンと同程度には集束されない。さらに、フィールドフリー領域で形成されたイオンは、化学結合に由来する増大された運動エネルギーの広がりを有するが、運動エネルギーの増加平均は、ゼロである。両方の特性は、このイオン集団のより小さい見かけ上の分解を生じるように組み合わされ得、この見かけ上の分解は、このような準安定イオンを同定することを補助し、最終的には、本教示の種々の実施形態において、準安定イオンが生成されたペプチドを同定することを補助し得る。
【００５５】
（実施例２：リフレクターモード作動のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した場合の、リンペプチドの混合物中の準安定イオンの検出）
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ＬＱＲＱＰＳｐＳＰＧＰＴＰＲ（配列番号１）、ＲＹＰＲＰＶｐＳＶＰＰＳＰＳＬＳＲ（配列番号２）、ＧＴＳＦＭＭｐＴＰＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号３）およびＣＴＮＦＭＭｐＴＰｐＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号４）を含むサンプルの、リフレクターモードの作動で収集されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルが、図２に示される。そのスペクトルは、１スペクトルあたり合計１０００レーザーショットについての２０個のサブスペクトルの平均である。質量範囲（９００−２５００）にわたって見られるように、ほとんどのペプチドに関して観測される分解は、１０，０００よりも大きい。しかし、特定のイオンの質量分解は、非常に低い（例えば、１４０５．３のｍ／ｚ値におけるイオン（２０１）は、３４５８の分解を伴って測定され、１７７９．７のｍ／ｚ値におけるイオン（２０２）は、４２１３の分解を伴って測定された）。これらの不完全に分解されたピークは、準安定イオンを表す。これらの準安定イオン関連ピークの両方は、それら自体よりも約９５ｕ大きい対応する改変ペプチドのピークを有し、そういうものとして、これらの準安定イオンのピークを、リン酸化ペプチドから潜在的に起こるものとして同定した。本実施例において、ｍ／ｚ＝１５００．６で検出されたピーク（２０３）を、ｍ／ｚ＝１４０５．３で検出された準安定イオンに対応するリンペプチドであると予測し、ｍ／ｚ＝１８７４．９で検出されたピークは、ｍ／ｚ＝１７７９．７で検出された準安定イオンに対応するリンペプチドであると予測した。
【００５６】
（実施例３：ｍ／ｚ＝１５００．６のペプチドがリンペプチドであることの確認）
ｍ／ｚ＝１５００．６で検出されたイオンについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを、高エネルギー（１Ｋｅｖ）衝突誘起解離を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで１スペクトルあたり合計２５００個のレーザーショットについての２５個のサブスペクトルの平均で収集し、そのスペクトルを図３に示す。このスペクトルは、前駆イオンからの典型的な９８ｕの喪失およびこのスペクトルで同定されるｙシリーズイオンおよびｂシリーズイオンの多くを示す。このｍ／ｚ＝１５００．６のタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルによって、このペプチドがリンペプチドであることの確認がもたらされた。
【００５７】
（実施例４：ｍ／ｚ＝１８７４．８のペプチドがリンペプチドであることの確認）
ｍ／ｚ＝１８７４．８で検出されたイオンについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを、高エネルギー衝突誘起解離を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで収集し、このスペクトルは、１スペクトルあたり合計２５００個のレーザーショットについての２５個のサブスペクトルの平均であった。このスペクトルを図４に示す。このスペクトルは、前駆イオンからの典型的な９８ｕの喪失およびこのスペクトルで同定されるｙシリーズイオンおよびｂシリーズイオンの多くを示す。このｍ／ｚ＝１８７４．８のタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルによって、このペプチドがリンペプチドであることの確認がもたらされた。
【００５８】
（実施例５：リフレクターモード作動のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した場合の、α−カゼインのトリプシン消化物中の準安定イオンの検出）
リン酸化タンパク質であるα−カゼインを、酵素（ウシトリプシン）によってフラグメントに切断した。これらのフラグメントは、トリプシンペプチドであり、このことは、すべてのペプチドがそのＣ末端にリジンまたはアルギニンのいずれかを有することを意味する。これらのフラグメントは、非リン酸化ペプチドまたはリン酸化ペプチドのいずれかである。このサンプルを、ＭＡＬＤＩマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、乾式液滴（ｄｒｙ−ｄｒｏｐｌｅｔ）法を用いてＭＡＬＤＩプレートにスポットした。このタンパク質の溶液中トリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦリフレクターＭＳスペクトルを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒで１スペクトルあたり合計１０００個のレーザーショットについての２０個のサブスペクトルの平均で収集し、そのスペクトルを図５に示す。準安定イオンシグナル（ここでは、リン酸化ペプチドの準安定イオンシグナル）を用いて改変ペプチドを同定する方法（ここで、９５ｕの調整質量差を準安定イオンの質量電荷値に加えた）を、α−カゼインのトリプシン消化物の分析に適用した。本実施例において、実行した方法によって、３つの潜在的なリンペプチド（ＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ（配列番号６）、ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ（配列番号７）、ＫＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ（配列番号８））が、首尾よく決定されたのに対して、ペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）実験では、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索において切断部位が１つ失われ、２つのリンペプチド（ＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ、ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲ）のみが同定された。例は、この方法により、１９５２．０におけるピーク（５０１）がリンペプチドとして同定され、その配列が、ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮｐＳＡＥＥＲであることである。このペプチド配列は、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索を用いるペプチド質量フィンガープリントによって確認した。
【００５９】
（実施例６：リフレクターモード作動のＶｏｙａｇｅｒ ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した場合の、準安定イオンの検出）
調整質量差を用いる本教示の方法を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの別の型のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ ＳＴＲ）における、リン酸化ペプチド前駆イオンＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ（配列番号５）の分析に適用した。改変ペプチドを同定するために準安定イオンシグナルを用いるその方法において、９４ｕの調整質量差を準安定イオンの質量電荷値に加えた。このリンペプチドのスペクトルを、１スペクトルあたり２００個のレーザーショットの平均で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥＴＭ ＳＴＲにおいて収集し、このスペクトルを図６に示す。本実施例において、アルゴリズムによって実行された方法によって、２１９１．７５４４（６０１）においてリンペプチドの存在が決定され、２０９７．８１９６（６０２）におけるイオンが、準安定イオンである。
【００６０】
（実施例７：リンペプチド中の準安定イオンの検出の継続）
リン酸化タンパク質であるα−カゼインを、酵素（ウシトリプシン）によってフラグメントに切断し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いる質量分析の分析に供して、図９に示されるスペクトルを得た。改変ペプチドを同定するために準安定イオンシグナル（ここでは、リン酸化ペプチドの準安定イオンシグナル）を用いる方法（ここで、９５ｕの調整質量差を準安定イオンの質量電荷値に加えた）によって、１９５２．０ｕ（９０１）において推定リンペプチドを、１８５４．０ｕ（９０２）においてその脱リン酸ペプチドを、そして１８７２．０ｕ（９０３）において非改変ペプチドを同定した。これらの知見を確認するために、ＭＳ／ＭＳスペクトル（図１０）を、フラグメント化された前駆イオンとして推定リンペプチド（１９５２．０ｕ）を用いて取得した。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを、セリン、スレオニンおよびチロシンの可変リン酸化を用いるＭＡＳＣＯＴデータベース検索に供した。ＭＡＳＣＯＴ検索からのペプチドイオンスコアは５０であり、その同定の信頼度は９９．７％であった。別のＭＡＳＣＯＴデータベース検索を、脱リン酸ペプチド（１８５４．０ｕ）のＭＳ／ＭＳスペクトルについて行ったが、このときはセリン、スレオニンおよびチロシンの可変改変として脱Ｈ２Ｏを使用した。その結果を図１１に示す。この例において、ペプチドイオンスコアは８５であり、その同定の信頼度は１００％であった。両方のデータベース検索で見出されたペプチド配列は同じであり、それゆえ、本実施例は、１９５２．０ｕにおいて見出された前駆リンペプチドがリン酸化ペプチドであることを確認したことを示す。
【００６１】
本出願に引用されるすべての文献および類似物（特許、特許出願、記事、書籍、学術論文、およびウェブページが挙げられるが、これらに限定されない）は、そのような文献および類似物の形式にかかわらず、明示的に、その全体が参考として援用される。援用された１つ以上の文献および類似物が本出願とことなるかまたは矛盾する場合（定義された用語、用語の用法、記載された技術などが挙げられるが、これらに限定されない）、本出願が支配する。
【００６２】
本明細書中で使用される節の見出しは、構成上の目的のためのみであり、いかなる様式においても記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。
【００６３】
本教示は、種々の実施形態に関して記載されているが、本教示がそのような実施形態または実施例に限定されることは意図されない。一方で、本教示は、当業者が想到するように、種々の変更、改変、および等価物を包含する。
【００６４】
特許請求の範囲は、その効果が述べられていない限り、記載される順序または要素に限定されるように読まれるべきではない。形式および詳細の種々の変更が添付の特許請求の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。それゆえ、特許請求の範囲の範囲および精神にあるすべての実施形態およびそれらに対する等価物が権利主張される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計における準安定イオン形成を強調する概略を示す。
【図２】図２は、純粋な合成リンペプチドであるＬＱＲＱＰＳｐＳＰＧＰＴＰＲ（配列番号１）、ＲＹＰＲＰＶｐＳＶＰＰＳＰＳＬＳＲ（配列番号２）、ＧＴＳＦＭＭｐＴＰＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号３）およびＣＴＮＦＭＭｐＴＰｐＹＶＶＴＲＹＹＲ（配列番号４）の混合物についての、リフレクター作動モードでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す（注：アミノ酸残基の左側の「ｐ」は、その「ｐ」のすぐ右側の残基としてのリン酸化部位を識別する）。
【図３】図３は、ｍ／ｚ １５００．６（図２に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ １４０５．３における準安定イオンの検出によって同定される推定リンペプチド）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図４】図４は、ｍ／ｚ １８７４．８（図２に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ １７７９．７における準安定イオンの検出によって同定される推定リンペプチド）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図５】図５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析器のリフレクター作動モードで収集された、タンパク質の溶液中トリプシン消化物であるα−カゼインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。上のパネルは、リンペプチド前駆イオンを同定するために使用された準安定イオンを可視化する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルの拡大図である。
【図６】図６は、純粋な合成リンペプチドＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ（配列番号５）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図７】図７は、検出されたペプチドの信頼度を高めるために使用され得る、本教示の種々の実施形態のフローチャートを示す。
【図８】図８は、リン酸化セリン（改変ペプチド）、ならびにリン酸化セリンの脱リン酸セリン（脱改変ペプチド）およびセリン（非改変ペプチド）への解離を模式的に示す。
【図９】図９は、リンタンパク質の代表的な消化物であるα−カゼインのマススペクトルである。
【図１０】図１０は、図９のマススペクトルにおける種々のピークのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図１１】図１１は、図９のマススペクトルにおける種々のピークのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析器によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する方法であって、該方法は、
ペプチドの混合物のマススペクトルを生成する工程であって、該マススペクトルは、質量電荷値の範囲にわたって複数のピークを含む、工程；
該質量電荷値の範囲内のピークの少なくとも一部分について、分解値を決定する工程；
少なくとも該決定された分解値に基づいてペプチド分解値を設定する工程；
該ペプチド分解値よりも分解能が低い１以上のピークを、改変ペプチドの推定準安定イオンとして選択する工程；
改変ペプチドと、該改変ペプチドのイオンからある部分が解離することに由来する準安定イオンとの間の調整質量差を決定する工程；
該推定準安定イオンに対応する選択されたピークの質量電荷値に、およそ該調整質量差を加えて、該改変ペプチドの前駆イオンについての経験的な質量電荷値を導き出す工程；および
該経験的な質量電荷値において該マススペクトル中にピークが存在する場合に、改変ペプチドがペプチドの混合物中に存在することを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記改変ペプチドがホスホリル化ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変ペプチドが、１つ以上のグリコシル化ペプチドおよびスルホン化ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記部分がＨ３ＰＯ４である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項６】
質量分析によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する方法であって、該方法は、
ペプチドの混合物中の改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの探索に基づいて、少なくとも該改変ペプチドの配列の一部および改変部位を決定する工程；
該ペプチドの混合物中の該改変ペプチドに対応する脱改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該脱改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの探索に基づいて、少なくとも該脱改変ペプチドの配列の一部および改変部位を決定する工程；
該改変ペプチドについて決定された該少なくとも配列の一部および改変部位と、該脱改変ペプチドについて決定された該少なくとも配列の一部および改変部位とを比較する工程；ならびに
該改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が、該脱該改変ペプチドについて決定された配列および改変部位と実質的に一致する場合に、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在することを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程の前に、
ペプチドの混合物のマススペクトルを生成する工程であって、該マススペクトルは、質量電荷値の範囲にわたって複数のピークを含む、工程；および
１以上の改変ペプチドに関連するマススペクトル中の質量電荷値を同定する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項８】
１以上の改変ペプチドに関連するマススペクトル中の質量電荷値を同定する工程が、
前記質量電荷値の範囲内のピークの少なくとも一部について分解値を決定する工程；
少なくとも該決定された分解値に基づいてペプチド分解値を設定する工程；
該ペプチド分解値よりも分解能が低い１以上のピークを改変ペプチドの推定準安定イオンとして選択する工程；
改変ペプチドと、該改変ペプチドのイオンからある部分が解離することに由来する準安定イオンとの間の調整質量差を決定する工程；
該推定準安定イオンに対応する該選択されたピークの質量電荷値に該調整質量差を加えて、該改変ペプチドのイオンについての経験的な質量電荷値を導き出す工程；および
該経験的な質量電荷値において該マススペクトル中にピークが存在する場合に、１以上の改変ペプチドに関連するマススペクトル中の質量電荷値を、該経験的な質量電荷値として同定する工程
を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変ペプチドがホスホリル化ペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変ペプチドが、１つ以上のグリコシル化ペプチドおよびスルホン化ペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記部分がＨ３ＰＯ４である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法であって、
前記ペプチド混合物中の前記改変ペプチドに対応する非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの検索に基づいて、少なくとも該非改変ペプチドの配列の一部を決定する工程；
前記改変ペプチド、前記脱改変ペプチド、および該非改変ペプチドについて決定された配列の少なくとも一部を互いに比較する工程；
をさらに包含し、そして
改変ペプチドがペプチドの混合物中に存在することを同定する工程が、
該改変ペプチド、該脱改変ペプチド、および該非改変ペプチドについて決定された配列が互いに実質的に一致し、かつ該改変ペプチドについて決定された改変部位が該脱改変ペプチドについて決定された改変部位と実質的に一致する場合、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在すると同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項１５】
質量分析器によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する工程であって、該方法は、
ペプチド混合物のマススペクトルを生成する工程であって、該マススペクトルは、質量電荷値の範囲にわたって、複数のピークを含む、工程；
該質量電荷値の範囲内の該ピークの少なくとも一部について分解値を決定する工程；
少なくとも該決定された分解値に基づいて、ペプチド分解値を設定する工程；
該ペプチド分解値よりも分解能が低い１以上のピークを、改変ペプチドの推定準安定イオンとして選択する工程；
改変ペプチドと、該改変ペプチドのイオンからある部分が解離することに由来する準安定イオンとの間の調整質量差を決定する工程であって、該調整質量差は、
【数１】
によって与えられ、ここで、ｍは、前駆ペプチドイオンの質量を表し、ｍｍは、準安定イオンについての観測質量を表し、βは、該機器の配置に依存する定数である、工程；
該推定準安定イオンに対応する選択されたピークの質量電荷値に該調整質量差を加えて、該改変ペプチドの前駆イオンについて経験的な質量電荷値を導き出す工程；および
該経験的な質量電荷値においてマススペクトル中にピークが存在する場合に、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在すると同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記調整質量差が、
【数２】
によって得られ、ここで、ｍは、前記前駆ペプチドイオンの質量を表し、ｍｍは、前記準安定イオンについての観測質量を表し、βは、前記機器の配置に依存する定数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記改変ペプチドがホスホリル化ペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記改変ペプチドが、１つ以上のグリコシル化ペプチドおよびスルホン化ペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記部分がＨ３ＰＯ４である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
質量分析によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する方法であって、該方法は、
ペプチドの混合物中の改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの検索に基づいて、少なくとも該改変ペプチドの配列の一部および改変部位を決定する工程；
該ペプチド混合物中の該改変ペプチドに対応する非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの検索に基づいて、少なくとも該非改変ペプチドの配列の一部を決定する工程；
該改変ペプチドについて決定された配列の少なくとも一部および改変部位を、該非改変ペプチドについて決定された配列の少なくとも一部と比較する工程；ならびに
該改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が、該非改変ペプチドについて決定された配列と実質的に一致する場合に、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在すると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項１】
質量分析器によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する方法であって、該方法は、
ペプチドの混合物のマススペクトルを生成する工程であって、該マススペクトルは、質量電荷値の範囲にわたって複数のピークを含む、工程；
該質量電荷値の範囲内のピークの少なくとも一部分について、分解値を決定する工程；
少なくとも該決定された分解値に基づいてペプチド分解値を設定する工程；
該ペプチド分解値よりも分解能が低い１以上のピークを、改変ペプチドの推定準安定イオンとして選択する工程；
改変ペプチドと、該改変ペプチドのイオンからある部分が解離することに由来する準安定イオンとの間の調整質量差を決定する工程；
該推定準安定イオンに対応する選択されたピークの質量電荷値に、およそ該調整質量差を加えて、該改変ペプチドの前駆イオンについての経験的な質量電荷値を導き出す工程；および
該経験的な質量電荷値において該マススペクトル中にピークが存在する場合に、改変ペプチドがペプチドの混合物中に存在することを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記改変ペプチドがホスホリル化ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変ペプチドが、１つ以上のグリコシル化ペプチドおよびスルホン化ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記部分がＨ３ＰＯ４である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項６】
質量分析によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する方法であって、該方法は、
ペプチドの混合物中の改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの探索に基づいて、少なくとも該改変ペプチドの配列の一部および改変部位を決定する工程；
該ペプチドの混合物中の該改変ペプチドに対応する脱改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該脱改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの探索に基づいて、少なくとも該脱改変ペプチドの配列の一部および改変部位を決定する工程；
該改変ペプチドについて決定された該少なくとも配列の一部および改変部位と、該脱改変ペプチドについて決定された該少なくとも配列の一部および改変部位とを比較する工程；ならびに
該改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が、該脱該改変ペプチドについて決定された配列および改変部位と実質的に一致する場合に、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在することを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程の前に、
ペプチドの混合物のマススペクトルを生成する工程であって、該マススペクトルは、質量電荷値の範囲にわたって複数のピークを含む、工程；および
１以上の改変ペプチドに関連するマススペクトル中の質量電荷値を同定する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項８】
１以上の改変ペプチドに関連するマススペクトル中の質量電荷値を同定する工程が、
前記質量電荷値の範囲内のピークの少なくとも一部について分解値を決定する工程；
少なくとも該決定された分解値に基づいてペプチド分解値を設定する工程；
該ペプチド分解値よりも分解能が低い１以上のピークを改変ペプチドの推定準安定イオンとして選択する工程；
改変ペプチドと、該改変ペプチドのイオンからある部分が解離することに由来する準安定イオンとの間の調整質量差を決定する工程；
該推定準安定イオンに対応する該選択されたピークの質量電荷値に該調整質量差を加えて、該改変ペプチドのイオンについての経験的な質量電荷値を導き出す工程；および
該経験的な質量電荷値において該マススペクトル中にピークが存在する場合に、１以上の改変ペプチドに関連するマススペクトル中の質量電荷値を、該経験的な質量電荷値として同定する工程
を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変ペプチドがホスホリル化ペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変ペプチドが、１つ以上のグリコシル化ペプチドおよびスルホン化ペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記部分がＨ３ＰＯ４である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法であって、
前記ペプチド混合物中の前記改変ペプチドに対応する非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの検索に基づいて、少なくとも該非改変ペプチドの配列の一部を決定する工程；
前記改変ペプチド、前記脱改変ペプチド、および該非改変ペプチドについて決定された配列の少なくとも一部を互いに比較する工程；
をさらに包含し、そして
改変ペプチドがペプチドの混合物中に存在することを同定する工程が、
該改変ペプチド、該脱改変ペプチド、および該非改変ペプチドについて決定された配列が互いに実質的に一致し、かつ該改変ペプチドについて決定された改変部位が該脱改変ペプチドについて決定された改変部位と実質的に一致する場合、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在すると同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【請求項１５】
質量分析器によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する工程であって、該方法は、
ペプチド混合物のマススペクトルを生成する工程であって、該マススペクトルは、質量電荷値の範囲にわたって、複数のピークを含む、工程；
該質量電荷値の範囲内の該ピークの少なくとも一部について分解値を決定する工程；
少なくとも該決定された分解値に基づいて、ペプチド分解値を設定する工程；
該ペプチド分解値よりも分解能が低い１以上のピークを、改変ペプチドの推定準安定イオンとして選択する工程；
改変ペプチドと、該改変ペプチドのイオンからある部分が解離することに由来する準安定イオンとの間の調整質量差を決定する工程であって、該調整質量差は、
【数１】
によって与えられ、ここで、ｍは、前駆ペプチドイオンの質量を表し、ｍｍは、準安定イオンについての観測質量を表し、βは、該機器の配置に依存する定数である、工程；
該推定準安定イオンに対応する選択されたピークの質量電荷値に該調整質量差を加えて、該改変ペプチドの前駆イオンについて経験的な質量電荷値を導き出す工程；および
該経験的な質量電荷値においてマススペクトル中にピークが存在する場合に、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在すると同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記調整質量差が、
【数２】
によって得られ、ここで、ｍは、前記前駆ペプチドイオンの質量を表し、ｍｍは、前記準安定イオンについての観測質量を表し、βは、前記機器の配置に依存する定数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記改変ペプチドがホスホリル化ペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記改変ペプチドが、１つ以上のグリコシル化ペプチドおよびスルホン化ペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記部分がＨ３ＰＯ４である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
質量分析によってペプチドの混合物における改変ペプチドの存在を同定する方法であって、該方法は、
ペプチドの混合物中の改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの検索に基づいて、少なくとも該改変ペプチドの配列の一部および改変部位を決定する工程；
該ペプチド混合物中の該改変ペプチドに対応する非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルを生成する工程；
少なくとも該非改変ペプチドのＭＳ／ＭＳマススペクトルからの情報を用いるデータベースの検索に基づいて、少なくとも該非改変ペプチドの配列の一部を決定する工程；
該改変ペプチドについて決定された配列の少なくとも一部および改変部位を、該非改変ペプチドについて決定された配列の少なくとも一部と比較する工程；ならびに
該改変ペプチドについて決定された配列および改変部位が、該非改変ペプチドについて決定された配列と実質的に一致する場合に、改変ペプチドが該ペプチドの混合物中に存在すると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法を実行するために具現化されたコンピュータ読み取り可能な命令を備えるコンピュータ読み取り可能媒体を備える、製造物品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００７−５３２９１１（Ｐ２００７−５３２９１１Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０８４６７（Ｐ２００７−５０８４６７）
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１２３４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０６９２３
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０５３１０５４１）アプレラ コーポレイション (12)
【出願人】（５０６１８３１３３）エムディーエス インコーポレーテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１２３４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０６９２３
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０５３１０５４１）アプレラ コーポレイション (12)
【出願人】（５０６１８３１３３）エムディーエス インコーポレーテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]