赤芽球の分類計数方法
【課題】経時変化を伴った抹消血液においても、精度よく、かつ安易、安価に赤芽球の測定を行うことができる方法を提供する。
【解決手段】(i)抹消血液に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、(ii)工程(i)で得られた試料中の赤血球を溶血し、(iii)工程(ii)で得られた試料のｐＨおよび浸透圧を調整し、(iv)赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色し、(v)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、(vi)これら蛍光強度差に基づいて、抹消血液に含まれる赤芽球を分類し、分類された赤芽球を計数することからなる赤芽球の分類計数方法。
【解決手段】(i)抹消血液に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、(ii)工程(i)で得られた試料中の赤血球を溶血し、(iii)工程(ii)で得られた試料のｐＨおよび浸透圧を調整し、(iv)赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色し、(v)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、(vi)これら蛍光強度差に基づいて、抹消血液に含まれる赤芽球を分類し、分類された赤芽球を計数することからなる赤芽球の分類計数方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤芽球の分類計数方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリを用いた赤芽球の分類計数方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野において、赤芽球を分類計数することは、疾患の診断及び疾患の経過の観察を行う上で極めて有用な情報を得ることができるため、有利である。つまり、赤芽球は有核赤血球ともよばれ、通常骨髄中に存在し、新生児を除いて、末梢血液中には存在しないため、末梢血液中に赤芽球が出現すれば、その患者は急性骨髄性白血病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、その他の非血液学的／腫瘍学的障害等の疾患である可能性を示している。よって、赤芽球の分類計数を行うことは、これらの疾患の診断及びこれらの疾患の経過の観察に非常に有用である。
【０００３】
従来、赤芽球の分類計数を行うには、血液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。しかし、このような方法では、観察のための煩雑な前処理が必要となるとともに、精度の良い結果を得るためには観察技師のかなりの熟練が必要となる。
【０００４】
一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されており、このような装置を利用した血液成分の分析方法が提案されている。
【０００５】
例えば、特開平４−２６８４５３号公報には、酸性低張処理を行うとともに、赤芽球の核を染色する蛍光色素で染色し、フローサイトメータで散乱光と蛍光とを検出し、赤芽球を分類計数する方法が記載されている。
【０００６】
また、特開平５−３４２５１号公報には、酸性低張処理後、蛍光色素であるアストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドとを含む４種類の色素で染色し、フローサイトメータで赤蛍光と緑蛍光とを測定して、赤芽球を測定する方法が記載されている。
【０００７】
さらに、特表平８−５０７１４７号公報には、特定量の非第４アンモニウム塩、脂肪族アルデヒド、非リン酸塩緩衝液と、特定のｐＨ、特定の浸透圧を有する試薬と、エチジウムホモダイマーのような核染料とを用いて、フローサイトメータで前方散乱光又は蛍光−側方散乱光を測定し、有核赤血球を測定する方法が記載されている。
【０００８】
また、米国特許第５５５９０３７号には、赤血球と赤芽球との細胞膜を溶解し、白血球は染色しないが赤芽球を染色できる生体核染料で染色し、フローサイトメータで２つの角度の散乱光と蛍光とを測定して赤芽球を計数する方法が記載されている。しかし、これらの方法では、採血後の血液学的試料の経時変化により、赤芽球のみならず、白血球の細胞膜も損傷されやすくなるため、赤芽球の染色の際に白血球の一部が色素により染色されてしまい、例えば、散乱光と蛍光とによる検出では赤芽球及び白血球の出現位置が重なって、赤芽球を正確に測定することができないという問題がある。特に、リンパ球系細胞が傷害された場合には、傷害されたリンパ球と赤芽球とを明瞭に弁別することはさらに困難であり、赤芽球の出現を正確に把握することができないという問題がある。
【０００９】
しかも、近年、医療経費の削減や医療機関の効率化のために、各医療機関で患者から採血した血液試料をある専門機関に集め、そこで集中的に検査することが行われるようになってきており、そのような場合には、採血から測定まで１日、あるいはそれ以上を要するものも稀ではない。
【００１０】
さらに、一部のリンパ芽球出現検体又は化学療法などによって、白血球系細胞の細胞膜が溶血剤による障害を受けやすくなった検体では、経時変化していない場合でも、正確に赤芽球を分類計数することは困難である。
【００１１】
また、特公平８−１４３４号公報には、チアゾールオレンジを試料に添加した後、２種の蛍光標識抗体である抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ７１を添加し、フローサイトメータで少なくとも３種の蛍光チャネル及び少なくとも２種の光散乱チャネルで信号を検出して、有核赤血球等を同定する方法が記載されている。この方法によれば、特定の抗体と色素とを組み合わせることによって、有核赤血球を測定することができる。しかし、この方法では、２種の抗体と１種の蛍光色素を使用するため、測定試薬が非常に高価になるという問題があるため、安価に赤芽球を分析することが求められている。
【００１２】
さらに、特開平２−７３１５７号公報には、２種の蛍光核酸染料と蛍光標識モノクロナール抗体とを用い、フローサイトメータで少なくとも３種の蛍光チャネル及び少なくとも２種の光散乱チャネルで信号を検出して有核赤血球を含む種々の細胞を分析する方法が記載されている。しかし、この方法では、赤芽球を白血球と区別するために、蛍光標識モノクロナール抗体で染色し、側方散乱光を測定しているが、血小板、デブリスと赤芽球とを区別する方法が記載されていないため、正確に赤芽球を計数することはできない。
【００１３】
また、日本特許第２６２０８１０号には、赤血球を溶解し、蛍光標識モノクロナール抗体を加え、固定剤を添加し、さらにＤＮＡに優先的に結合する核酸染料を添加し、フローサイトメータで蛍光と散乱光とを検出する方法が記載されている。しかし、この方法によれば、まずサンプル中の赤血球を溶解する処理を行うため、その直後には遠心洗浄操作を行わなければならず、絶対計数は困難となる。また、この操作は煩雑であるため、測定技師の熟練度により測定結果に顕著な差が生じるという問題もある。
【特許文献１】特開平４−２６８４５３号公報
【特許文献２】特開平５−３４２５１号公報
【特許文献３】特表平８−５０７１４７号公報
【特許文献４】米国特許第５５５９０３７号
【特許文献５】特公平８−１４３４号公報
【特許文献６】特開平２−７３１５７号公報
【特許文献７】日本特許第２６２０８１０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上のように、採血後長時間を経過した血液学的試料においても、精度よく、かつ安易、安価に赤芽球の測定を行い、さらに赤芽球を成熟度に応じて分類計数することができる方法が要求されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、(i)抹消血液に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、(ii)工程(i)で得られた試料と、２．０〜５．０のｐＨおよび１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ以下の浸透圧を有する第１液を混合して赤血球を溶血し、(iii)工程(ii)で得られた試料と、ｐＨ５．０〜１１．０のｐＨおよび３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの浸透圧を有する第２液を混合してｐＨおよび浸透圧を調整し、(iv)赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色し、(v)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、(vi)これら蛍光強度差に基づいて、抹消血液に含まれる赤芽球を分類し、分類された赤芽球を計数することからなる赤芽球の分類計数方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において、工程(i)で用いる試料は、末梢血液である。
【００１７】
また、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体における抗体とは、抗CD45抗体などが挙げられ、一般に市販されているものを使用することができる。
【００１８】
上記抗体を蛍光標識抗体とするための蛍光標識化合物としては、フィコエリスリン（phycoerythrin)、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate：ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（allophycocyanin)、テキサスレッド（Texas Red)、ＣＹ５、ペリジニンクロロフィルコンプレックス（peridinin chlorophyll complex)及びそれらのフィコエリスリン結合体などによる標識化合物が挙げられる。これら蛍光標識化合物は、後述する核酸蛍光色素とは異なる蛍光スペクトルを有していることが好ましい。なかでも、フィコエリスリン、フルオレセインイソチオシアネートが好ましい。
【００１９】
末梢血液と蛍光標識抗体との混合比は、用いる末梢血液の状態、蛍光標識抗体の種類等により適宜調整することができるが、例えば、１０：１〜２：１程度の容量比があげられる。この際の反応温度、反応時間は、適宜調整することができるが、例えば、室温で１５〜３０分間、アイスバスで３０〜４５分間程度が好ましい。
【００２０】
本発明の工程(ii)〜(iv)では、通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素の、赤芽球の細胞膜透過性を亢進させ、赤芽球を蛍光染色する。
【００２１】
核酸蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1等が挙げられる。なかでも、プロピジウムアイオダイドが好ましい。これら核酸蛍光色素は、上述したように、工程(ii)における白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体の蛍光標識化合物とは異なる蛍光スペクトルを有していることが好ましい。核酸蛍光色素の終濃度は、０．００３〜２００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは０．０３〜７０ｍｇ／Ｌ程度、より好ましくは０．３〜３５ｍｇ／Ｌである。ここで、終濃度とは、フローサイトメータに供される末梢血液、蛍光標識抗体及び核酸蛍光色素の混合物中の濃度、あるいは、後述するような他の試薬を用いる場合においても、フローサイトメータに供される混合物中の濃度を意味する。
【００２２】
上記核酸蛍光色素の赤芽球の細胞膜透過性を亢進させる方法としては、例えば、工程(i)で得られた末梢血液（少なくとも赤芽球及び白血球を含有する）に、ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる低浸透圧の第１液を添加、混合する（工程(ii)）。そして、得られた末梢血液及び第１液の混合液を中和し、溶液ｐＨを染色に適したｐＨにするための緩衝剤と白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸透圧調整剤とからなる第２液を添加、混合する（工程(iii)）方法が挙げられる。
【００２３】
工程(ii)における第１液は、赤血球を有効に溶血させるために、ｐＨが酸性域、例えば、２．０〜５．０程度、より好ましくは２．５〜４．０程度、さらに好ましくは、３．０〜３．５程度に保持されたものである。ｐＨが低すぎる場合には、赤血球のみならず、白血球、赤芽球及び白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体にも過度の傷害を与え、一方、ｐＨが高すぎる場合には、赤血球を断片化する作用が明らかに妨げられるため、好ましくない。
【００２４】
上記ｐＨを保持するための緩衝剤としては、酸解離定数ｐＫａが３．０±２．０程度の緩衝剤が挙げられる。具体的には、例えば、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、グッドの緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤の濃度は、第１液をｐＨ２．０〜５．０程度に維持するのに必要な濃度であれば特に限定されるものではなく、例えば、５〜５０ｍＭ／Ｌが挙げられる。
【００２５】
また、この緩衝液の浸透圧は、低浸透圧であることが必要であり、例えば、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度以下の浸透圧が挙げられ、より好ましくは１０〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度である。このような浸透圧に調整するために使用する浸透圧調整剤の種類は特に限定されないが、例えばアルカリ金属塩類、糖類等があげられる。具体的には、塩化ナトリウム、しょ糖等を０．１ｇ／Ｌ〜２．０ｇ／Ｌ程度の濃度で使用することができる。ただし、上述の緩衝剤のみで、上記浸透圧が補償される場合は、浸透圧調整剤を使用しなくてもよい。
【００２６】
末梢血液と第１液との反応時間は、赤血球の溶血を完了するのに十分な時間が必要であり、例えば５秒〜１２０秒間程度、好ましくは１０秒〜６０秒間程度、さらに好ましくは２０〜４０秒間程度である。末梢血液と第１液との混合比は特に限定されないが、フローサイトメータでの測定を考慮すると、１：５〜１：２００程度の容量比が好ましい。
【００２７】
工程(iii)における第２液は、末梢血液と第１液との混合液を中和し、溶液ｐＨを染色に適したｐＨにするための緩衝剤と白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸透圧調整剤とからなる。
【００２８】
第１液の酸を中和し、染色に適した第２液のｐＨは、例えば、５．０〜１１．０程度であり、好ましくは、７．５〜１０．０程度である。このｐＨに保持するために用いられる緩衝剤の種類は特に限定されないが、ｐＫａが９．０±２．０付近にある緩衝剤が好ましい。具体的には、リン酸、ＨＥＰＥＳ、トリシン等が挙げられる。緩衝剤の濃度は、第２液をｐＨ５．０〜１１．０程度に維持するのに必要な濃度であれば特に限定されないが、通常５〜１００ｍＭ／Ｌ程度が挙げられる。
【００２９】
白血球の形態を保持するのに好適な浸透圧の範囲は、例えば３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度、より好ましくは４００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度である。このような浸透圧に調整するために使用する浸透圧調整剤の種類は特に限定されないが、アルカリ金属塩類、糖類等があげられる。具体的には、塩化ナトリウム、しょ糖等を１０．０ｇ／Ｌ〜２０．０ｇ／Ｌ程度の濃度で使用することができる。
【００３０】
第１液と第２液との混合比は、先に使用した第１液のｐＨ、量、第１液の浸透圧調整剤の濃度、第２液のｐＨ、第２液の浸透圧調整剤の濃度等により適宜調整することができる。たとえば、第１液のｐＨが３．０、浸透圧が１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度、第２液のｐＨが７．５、浸透圧が４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度の場合、第１液と第２液との混合比は、１：１〜１：５程度が好ましい。
【００３１】
なお、本発明の工程(iii)において、末梢血液の白血球の形態を保持するためには、第１液及び第２液を混合した後の浸透圧が１００〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの範囲内にあることが好ましく、より好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの範囲である。第１液及び第２液を混合した後の浸透圧がこの範囲を外れる場合には、第２液に、さらに浸透圧補償剤を含むことが好ましい。浸透圧補償剤の種類は、特に限定されないが、アルカリ金属又は糖類等、通常、生物学的細胞を生理的浸透圧に保つための物質が好ましい。
【００３２】
本発明の工程(iv)では、赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色する。赤芽球の核を蛍光染色するとは、上記工程で処理された末梢血液を、核酸蛍光色素で染色する工程である。具体的には、予め第１液又は第２液に、核酸蛍光色素を添加しておき、核酸蛍光色素を含有する第１液又は第２液を、末梢血液と混合する方法が挙げられる。また、核酸蛍光色素を含む溶液を調製しておき、この溶液を添加してもよい。なかでも、核酸蛍光色素は第１液に予め添加しておくことが好ましい。この際の赤芽球の核の染色に要する時間は、末梢血液とすべての試薬を混合した後、１〜１２０分間程度であり、好ましくは３〜３０分間程度、より好ましくは５〜１０分間程度である。
【００３３】
本発明の工程(v)において使用するフローサイトメータは、特に限定されるものではなく、一般に市販されているものを用いることができる。このようなフローサイトメータにより、個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定する。この際の蛍光信号は、使用する蛍光標識抗体の標識化合物、核酸蛍光色素の種類により異なるが、例えば、赤蛍光と緑蛍光との組み合わせ、赤蛍光と橙蛍光の組み合わせ、橙蛍光と緑蛍光との組み合わせ等が挙げられる。なかでも、赤蛍光と緑蛍光との組み合わせが好ましい。
【００３４】
本発明の工程(vi)においては、赤芽球は上述した少なくとも２つの蛍光信号の強度差に基づいて、分類計数することができる。例えば、２つの蛍光信号を測定した場合には、２軸をそれぞれ白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光とし、２次元分布（たとえば、スキャッタグラム）を得ることが好ましい。この２次元分布から白血球及び赤芽球の分布領域を設定し、それぞれの領域の細胞数を計数し、赤芽球の細胞数を白血球の細胞数で除算することにより、白血球に対する赤芽球の比率を求めることができる。
【００３５】
また、薬剤投与の影響等で白血球膜が過度に傷害され、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光（実施例では緑蛍光）及び核酸蛍光色素に基づく蛍光（実施例では赤蛍光）を２軸とする２次元分布上で、赤芽球の弁別が明瞭でないときは、工程(iv)において、さらに、（ａ）同時に散乱光信号を測定し、散乱光信号（たとえば、側方散乱光、前方散乱光、好ましくは側方散乱光）と蛍光標識抗体に基づく蛍光信号とをそれぞれ２軸とする２次元分布を得て、その分布から白血球集団を特定し（図６）、（ｂ）核酸蛍光色素と蛍光標識抗体に基づく蛍光とをそれぞれ２軸とする２次元分布上で、対応する白血球集団の分布領域を特定し（図７）、（ｃ）（ｂ）の２次元分布上で白血球集団と赤芽球集団との境界（Ａ）を設定することにより、赤芽球をより精度よく弁別することができる。
【００３６】
さらに、工程(iv)において、核酸蛍光色素を０．００３ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲にした場合、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差によって、少なくとも２つの異なる成熟度の赤芽球に分類することが可能である。核酸蛍光色素の濃度は、より好ましくは０．０３ｍｇ／Ｌ〜３ｍｇ／Ｌの範囲である。
【００３７】
この場合には、工程(vi)において、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差から、成熟度の異なる赤芽球を分類計数することができる。つまり、２次元分布から赤芽球の分布領域を設定し、さらに核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差によって赤芽球の領域内に各成熟段階の赤芽球の領域を設定することにより、それぞれの領域の細胞数を計数することができる。さらに、各成熟段階の赤芽球の細胞数を全赤芽球数で除算することにより、全赤芽球に対する各成熟度段階の赤芽球の比率をも求めることができる。
【００３８】
赤芽球を成熟段階に応じて分類するとは、たとえば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球等を少なくとも２つの赤芽球グループに分類計数することをいう。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の赤芽球の分類計数方法の実施例を具体的に説明する。
実施例１まず、以下の組成の試薬を調製した。
蛍光標識抗体・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体第１液（ｐＨ３．０、浸透圧：１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 クエン酸一水和物 ２．１０ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ０．５６ｇ／Ｌ ・核酸蛍光色素 プロピジウムアイオダイド １００ｍｇ／Ｌ ・精製水第２液（ｐＨ７．５、浸透圧：４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 リン酸一ナトリウム二水和物 ０．９５ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ６．２４ｇ／Ｌ ・浸透圧調整剤 塩化ナトリウム １０．２ｇ／Ｌ ・精製水
【００４０】
まず、抗凝固剤処理した末梢血液に患者の血液５０μＬを加え、血液学的試料を調製した。なお、この際に用いた末梢血液及び患者の血液は採取後８時間経過したものであった。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体１０μＬを、得られた血液学的試料に加え、室温で約１５分間インキュベーションした。
【００４１】
その後、第１液を５００μＬ加え、室温で約３０秒間インキュベーションし、さらに第２液を１０００μＬ加え、室温で約５分間インキュベーションし、得られた血液学的試料に含有されている個々の細胞について、光源として４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイトメータで、５３０ｎｍ（緑）、６５０ｎｍ（赤）の波長の蛍光を測定した。
【００４２】
図１に緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを示す。図１では、白血球、赤蛍光染色白血球、赤芽球、ゴーストの４集団が認められた。解析は、図２に示したように、白血球及び赤蛍光染色白血球をウィンドウ（Ｗ１）によって囲み、白血球のみの数を計数し、全白血球数を計数した。
【００４３】
次に、すべての赤芽球をウィンドウ（Ｗ２）によって囲み、赤芽球のみの数を計数し、全赤芽球数を計数した。全赤芽球数を、上記で求めた全白血球で除算することにより、白血球に対する赤芽球の比率を求めた。
【００４４】
また、実施例１とは別に、実施例１と同様の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワルド−ギムザ染色、１０００カウント）により赤芽球を分類計数した。図３に、本実施例のフローサイトメータで測定した赤芽球数と、用手法で測定した赤芽球数との相関図を示す。
【００４５】
図３から、相関係数Ｒは０．９９１となり、実施例１の方法が赤芽球の分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【００４６】
実施例２実施例１と同様の方法により、末梢血液（採血後８時間後、２４時間後、４８時間後、血液は室温保存）及び２人の患者の血液を用い、白血球及び赤芽球の測定を行った。その結果を図４（ａ）〜（ｃ）及び５（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示す。
【００４７】
また、各検体について、実施例１と同様の方法によって全白血球に対する全赤芽球の比率を求めた。その結果を表１に示す。
【表１】
【００４８】
図４（ａ）〜（ｃ）、図５（ａ）〜（ｃ）及び表１から明らかなように、本実施例の方法によれば、時間の経過にかかわらず、ほぼ同様の測定結果が得られることが確認された。
【００４９】
実施例３まず、以下の組成の試薬を調製した。
蛍光標識抗体・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体第１液（ｐＨ３．０、浸透圧：１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 クエン酸一水和物 ２．１０ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ０．５６ｇ／Ｌ ・核酸蛍光色素 プロピジウムアイオダイド １ｍｇ／Ｌ ・精製水第２液（ｐＨ７．５、浸透圧：４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 リン酸一ナトリウム二水和物 ０．９５ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ６．２４ｇ／Ｌ ・浸透圧調整剤 塩化ナトリウム １０．２ｇ／Ｌ ・精製水
【００５０】
まず、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体１０μＬに、抗凝固剤処理した末梢血液に赤芽球が出現した患者の血液５０μＬを加え、室温で約１５分間インキュベーションした。その後、第１液を５００μＬ加え、室温で約３０秒間インキュベーションし、さらに第２液を１０００μＬ加え、室温で約５分間インキュベーションし、得られた血液学的試料に含有されている個々の細胞について、光源として４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイトメータで、５３０ｎｍ（緑）、６５０ｎｍ（赤）の波長の蛍光を測定した。
【００５１】
図８に緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを示す。図８では、白血球、赤蛍光染色白血球、成熟赤芽球、未成熟赤芽球１、未成熟赤芽球２、ゴーストの６集団が認められた。解析は、図９に示したように、白血球及び赤蛍光染色白血球をウィンドウ（Ｗ１）によって囲み、白血球のみの数を計数し、全白血球数を計数した。次に、すべての赤芽球をウィンドウ（Ｗ２）によって囲み、赤芽球のみの数を計数し、全赤芽球数を計数した。
【００５２】
さらに、ウィンドウ（Ｗ２）中の赤芽球をステージＩ、II、IIIとしてそれぞれウィンドウ（Ｗ３）、ウィンドウ（Ｗ４）及びウィンドウ（Ｗ５）によって囲み、それぞれの数を計数した。得られた各ウィンドウの赤芽球数を、全赤芽球数で除算することにより、全赤芽球に対する各ステージにおける赤芽球の比率を求めた。
【００５３】
また、実施例３とは別に、実施例３と同様の血液学的試料を用いて用手法（メイグリュンワルド−ギムザ染色）により、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球の赤芽球に分類計数した。
【００５４】
表２に、実施例３のフローサイトメータで測定した結果と、用手法で測定した結果を示す。なお、表２においては、ステージＩ、II及びIIIは、それぞれ図８における未成熟赤芽球２、未成熟赤芽球１及び成熟赤芽球に対応する。
【表２】
【００５５】
表２から、本方法と用手法との結果がほぼ一致しており、実施例３の方法が赤芽球の分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【００５６】
実施例４実施例３と同様の方法により、末梢血液（採血後８時間後、血液は室温保存）及び２４人の血液疾患患者の血液を用い、赤芽球の測定を行った。また、実施例４とは別に、実施例４と同様の血液学的試料を用いて用手法（メイグリュンワルド−ギムザ染色）により、赤芽球の測定を行った。
【００５７】
図１０及び図１１に、本実施例のフローサイトメータで測定した赤芽球数と、用手法で測定したステージII及びステージIIIにおける赤芽球数との相関図を示す。図１０及び図１１から、実施例４の方法が赤芽球の各ステージにおける分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の赤芽球の分類計数方法により測定されたスキャッタグラムである。
【図２】図１の模式図である。
【図３】本発明の方法と用手法とで測定された赤芽球数の相関関係を示す図である。
【図４】本発明の赤芽球の分類計数方法により、赤芽球測定の経時変化を示すスキャッタグタムである。
【図５】本発明の赤芽球の分類計数方法により、赤芽球測定の経時変化を示す別のサンプルによるスキャッタグラムである。
【図６】本発明の赤芽球の分類計数方法に散乱光信号を組み合わせた場合のスキャッタグラムである。
【図７】図６におけるＧｈｏ＋ＮＲＢＣをさらに赤芽球とゴーストに弁別した場合のスキャッタグラムである。
【図８】本発明の赤芽球の分類計数方法により、緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を示すスキャッタグラムである。
【図９】図１の模式図である。
【図１０】本発明の方法と用手法とで測定されたステージIIの赤芽球数の相関関係を示す図である。
【図１１】本発明の方法と用手法とで測定されたステージIIIの赤芽球数の相関関係を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
ＷＢＣ 全白血球
ＮＲＢＣ 赤芽球
ｌｅｕ 白血球
Ｇｈｏ ゴースト
Ｌｙ リンパ球
Ｍｏ 単球
Ｇｒａｎ 顆粒球
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤芽球の分類計数方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリを用いた赤芽球の分類計数方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野において、赤芽球を分類計数することは、疾患の診断及び疾患の経過の観察を行う上で極めて有用な情報を得ることができるため、有利である。つまり、赤芽球は有核赤血球ともよばれ、通常骨髄中に存在し、新生児を除いて、末梢血液中には存在しないため、末梢血液中に赤芽球が出現すれば、その患者は急性骨髄性白血病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、その他の非血液学的／腫瘍学的障害等の疾患である可能性を示している。よって、赤芽球の分類計数を行うことは、これらの疾患の診断及びこれらの疾患の経過の観察に非常に有用である。
【０００３】
従来、赤芽球の分類計数を行うには、血液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。しかし、このような方法では、観察のための煩雑な前処理が必要となるとともに、精度の良い結果を得るためには観察技師のかなりの熟練が必要となる。
【０００４】
一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されており、このような装置を利用した血液成分の分析方法が提案されている。
【０００５】
例えば、特開平４−２６８４５３号公報には、酸性低張処理を行うとともに、赤芽球の核を染色する蛍光色素で染色し、フローサイトメータで散乱光と蛍光とを検出し、赤芽球を分類計数する方法が記載されている。
【０００６】
また、特開平５−３４２５１号公報には、酸性低張処理後、蛍光色素であるアストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドとを含む４種類の色素で染色し、フローサイトメータで赤蛍光と緑蛍光とを測定して、赤芽球を測定する方法が記載されている。
【０００７】
さらに、特表平８−５０７１４７号公報には、特定量の非第４アンモニウム塩、脂肪族アルデヒド、非リン酸塩緩衝液と、特定のｐＨ、特定の浸透圧を有する試薬と、エチジウムホモダイマーのような核染料とを用いて、フローサイトメータで前方散乱光又は蛍光−側方散乱光を測定し、有核赤血球を測定する方法が記載されている。
【０００８】
また、米国特許第５５５９０３７号には、赤血球と赤芽球との細胞膜を溶解し、白血球は染色しないが赤芽球を染色できる生体核染料で染色し、フローサイトメータで２つの角度の散乱光と蛍光とを測定して赤芽球を計数する方法が記載されている。しかし、これらの方法では、採血後の血液学的試料の経時変化により、赤芽球のみならず、白血球の細胞膜も損傷されやすくなるため、赤芽球の染色の際に白血球の一部が色素により染色されてしまい、例えば、散乱光と蛍光とによる検出では赤芽球及び白血球の出現位置が重なって、赤芽球を正確に測定することができないという問題がある。特に、リンパ球系細胞が傷害された場合には、傷害されたリンパ球と赤芽球とを明瞭に弁別することはさらに困難であり、赤芽球の出現を正確に把握することができないという問題がある。
【０００９】
しかも、近年、医療経費の削減や医療機関の効率化のために、各医療機関で患者から採血した血液試料をある専門機関に集め、そこで集中的に検査することが行われるようになってきており、そのような場合には、採血から測定まで１日、あるいはそれ以上を要するものも稀ではない。
【００１０】
さらに、一部のリンパ芽球出現検体又は化学療法などによって、白血球系細胞の細胞膜が溶血剤による障害を受けやすくなった検体では、経時変化していない場合でも、正確に赤芽球を分類計数することは困難である。
【００１１】
また、特公平８−１４３４号公報には、チアゾールオレンジを試料に添加した後、２種の蛍光標識抗体である抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ７１を添加し、フローサイトメータで少なくとも３種の蛍光チャネル及び少なくとも２種の光散乱チャネルで信号を検出して、有核赤血球等を同定する方法が記載されている。この方法によれば、特定の抗体と色素とを組み合わせることによって、有核赤血球を測定することができる。しかし、この方法では、２種の抗体と１種の蛍光色素を使用するため、測定試薬が非常に高価になるという問題があるため、安価に赤芽球を分析することが求められている。
【００１２】
さらに、特開平２−７３１５７号公報には、２種の蛍光核酸染料と蛍光標識モノクロナール抗体とを用い、フローサイトメータで少なくとも３種の蛍光チャネル及び少なくとも２種の光散乱チャネルで信号を検出して有核赤血球を含む種々の細胞を分析する方法が記載されている。しかし、この方法では、赤芽球を白血球と区別するために、蛍光標識モノクロナール抗体で染色し、側方散乱光を測定しているが、血小板、デブリスと赤芽球とを区別する方法が記載されていないため、正確に赤芽球を計数することはできない。
【００１３】
また、日本特許第２６２０８１０号には、赤血球を溶解し、蛍光標識モノクロナール抗体を加え、固定剤を添加し、さらにＤＮＡに優先的に結合する核酸染料を添加し、フローサイトメータで蛍光と散乱光とを検出する方法が記載されている。しかし、この方法によれば、まずサンプル中の赤血球を溶解する処理を行うため、その直後には遠心洗浄操作を行わなければならず、絶対計数は困難となる。また、この操作は煩雑であるため、測定技師の熟練度により測定結果に顕著な差が生じるという問題もある。
【特許文献１】特開平４−２６８４５３号公報
【特許文献２】特開平５−３４２５１号公報
【特許文献３】特表平８−５０７１４７号公報
【特許文献４】米国特許第５５５９０３７号
【特許文献５】特公平８−１４３４号公報
【特許文献６】特開平２−７３１５７号公報
【特許文献７】日本特許第２６２０８１０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上のように、採血後長時間を経過した血液学的試料においても、精度よく、かつ安易、安価に赤芽球の測定を行い、さらに赤芽球を成熟度に応じて分類計数することができる方法が要求されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、(i)抹消血液に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、(ii)工程(i)で得られた試料と、２．０〜５．０のｐＨおよび１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ以下の浸透圧を有する第１液を混合して赤血球を溶血し、(iii)工程(ii)で得られた試料と、ｐＨ５．０〜１１．０のｐＨおよび３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの浸透圧を有する第２液を混合してｐＨおよび浸透圧を調整し、(iv)赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色し、(v)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、(vi)これら蛍光強度差に基づいて、抹消血液に含まれる赤芽球を分類し、分類された赤芽球を計数することからなる赤芽球の分類計数方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において、工程(i)で用いる試料は、末梢血液である。
【００１７】
また、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体における抗体とは、抗CD45抗体などが挙げられ、一般に市販されているものを使用することができる。
【００１８】
上記抗体を蛍光標識抗体とするための蛍光標識化合物としては、フィコエリスリン（phycoerythrin)、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate：ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（allophycocyanin)、テキサスレッド（Texas Red)、ＣＹ５、ペリジニンクロロフィルコンプレックス（peridinin chlorophyll complex)及びそれらのフィコエリスリン結合体などによる標識化合物が挙げられる。これら蛍光標識化合物は、後述する核酸蛍光色素とは異なる蛍光スペクトルを有していることが好ましい。なかでも、フィコエリスリン、フルオレセインイソチオシアネートが好ましい。
【００１９】
末梢血液と蛍光標識抗体との混合比は、用いる末梢血液の状態、蛍光標識抗体の種類等により適宜調整することができるが、例えば、１０：１〜２：１程度の容量比があげられる。この際の反応温度、反応時間は、適宜調整することができるが、例えば、室温で１５〜３０分間、アイスバスで３０〜４５分間程度が好ましい。
【００２０】
本発明の工程(ii)〜(iv)では、通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素の、赤芽球の細胞膜透過性を亢進させ、赤芽球を蛍光染色する。
【００２１】
核酸蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1等が挙げられる。なかでも、プロピジウムアイオダイドが好ましい。これら核酸蛍光色素は、上述したように、工程(ii)における白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体の蛍光標識化合物とは異なる蛍光スペクトルを有していることが好ましい。核酸蛍光色素の終濃度は、０．００３〜２００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは０．０３〜７０ｍｇ／Ｌ程度、より好ましくは０．３〜３５ｍｇ／Ｌである。ここで、終濃度とは、フローサイトメータに供される末梢血液、蛍光標識抗体及び核酸蛍光色素の混合物中の濃度、あるいは、後述するような他の試薬を用いる場合においても、フローサイトメータに供される混合物中の濃度を意味する。
【００２２】
上記核酸蛍光色素の赤芽球の細胞膜透過性を亢進させる方法としては、例えば、工程(i)で得られた末梢血液（少なくとも赤芽球及び白血球を含有する）に、ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる低浸透圧の第１液を添加、混合する（工程(ii)）。そして、得られた末梢血液及び第１液の混合液を中和し、溶液ｐＨを染色に適したｐＨにするための緩衝剤と白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸透圧調整剤とからなる第２液を添加、混合する（工程(iii)）方法が挙げられる。
【００２３】
工程(ii)における第１液は、赤血球を有効に溶血させるために、ｐＨが酸性域、例えば、２．０〜５．０程度、より好ましくは２．５〜４．０程度、さらに好ましくは、３．０〜３．５程度に保持されたものである。ｐＨが低すぎる場合には、赤血球のみならず、白血球、赤芽球及び白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体にも過度の傷害を与え、一方、ｐＨが高すぎる場合には、赤血球を断片化する作用が明らかに妨げられるため、好ましくない。
【００２４】
上記ｐＨを保持するための緩衝剤としては、酸解離定数ｐＫａが３．０±２．０程度の緩衝剤が挙げられる。具体的には、例えば、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、グッドの緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤の濃度は、第１液をｐＨ２．０〜５．０程度に維持するのに必要な濃度であれば特に限定されるものではなく、例えば、５〜５０ｍＭ／Ｌが挙げられる。
【００２５】
また、この緩衝液の浸透圧は、低浸透圧であることが必要であり、例えば、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度以下の浸透圧が挙げられ、より好ましくは１０〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度である。このような浸透圧に調整するために使用する浸透圧調整剤の種類は特に限定されないが、例えばアルカリ金属塩類、糖類等があげられる。具体的には、塩化ナトリウム、しょ糖等を０．１ｇ／Ｌ〜２．０ｇ／Ｌ程度の濃度で使用することができる。ただし、上述の緩衝剤のみで、上記浸透圧が補償される場合は、浸透圧調整剤を使用しなくてもよい。
【００２６】
末梢血液と第１液との反応時間は、赤血球の溶血を完了するのに十分な時間が必要であり、例えば５秒〜１２０秒間程度、好ましくは１０秒〜６０秒間程度、さらに好ましくは２０〜４０秒間程度である。末梢血液と第１液との混合比は特に限定されないが、フローサイトメータでの測定を考慮すると、１：５〜１：２００程度の容量比が好ましい。
【００２７】
工程(iii)における第２液は、末梢血液と第１液との混合液を中和し、溶液ｐＨを染色に適したｐＨにするための緩衝剤と白血球の形態を保持する浸透圧に調整するための浸透圧調整剤とからなる。
【００２８】
第１液の酸を中和し、染色に適した第２液のｐＨは、例えば、５．０〜１１．０程度であり、好ましくは、７．５〜１０．０程度である。このｐＨに保持するために用いられる緩衝剤の種類は特に限定されないが、ｐＫａが９．０±２．０付近にある緩衝剤が好ましい。具体的には、リン酸、ＨＥＰＥＳ、トリシン等が挙げられる。緩衝剤の濃度は、第２液をｐＨ５．０〜１１．０程度に維持するのに必要な濃度であれば特に限定されないが、通常５〜１００ｍＭ／Ｌ程度が挙げられる。
【００２９】
白血球の形態を保持するのに好適な浸透圧の範囲は、例えば３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度、より好ましくは４００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度である。このような浸透圧に調整するために使用する浸透圧調整剤の種類は特に限定されないが、アルカリ金属塩類、糖類等があげられる。具体的には、塩化ナトリウム、しょ糖等を１０．０ｇ／Ｌ〜２０．０ｇ／Ｌ程度の濃度で使用することができる。
【００３０】
第１液と第２液との混合比は、先に使用した第１液のｐＨ、量、第１液の浸透圧調整剤の濃度、第２液のｐＨ、第２液の浸透圧調整剤の濃度等により適宜調整することができる。たとえば、第１液のｐＨが３．０、浸透圧が１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度、第２液のｐＨが７．５、浸透圧が４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ程度の場合、第１液と第２液との混合比は、１：１〜１：５程度が好ましい。
【００３１】
なお、本発明の工程(iii)において、末梢血液の白血球の形態を保持するためには、第１液及び第２液を混合した後の浸透圧が１００〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの範囲内にあることが好ましく、より好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの範囲である。第１液及び第２液を混合した後の浸透圧がこの範囲を外れる場合には、第２液に、さらに浸透圧補償剤を含むことが好ましい。浸透圧補償剤の種類は、特に限定されないが、アルカリ金属又は糖類等、通常、生物学的細胞を生理的浸透圧に保つための物質が好ましい。
【００３２】
本発明の工程(iv)では、赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色する。赤芽球の核を蛍光染色するとは、上記工程で処理された末梢血液を、核酸蛍光色素で染色する工程である。具体的には、予め第１液又は第２液に、核酸蛍光色素を添加しておき、核酸蛍光色素を含有する第１液又は第２液を、末梢血液と混合する方法が挙げられる。また、核酸蛍光色素を含む溶液を調製しておき、この溶液を添加してもよい。なかでも、核酸蛍光色素は第１液に予め添加しておくことが好ましい。この際の赤芽球の核の染色に要する時間は、末梢血液とすべての試薬を混合した後、１〜１２０分間程度であり、好ましくは３〜３０分間程度、より好ましくは５〜１０分間程度である。
【００３３】
本発明の工程(v)において使用するフローサイトメータは、特に限定されるものではなく、一般に市販されているものを用いることができる。このようなフローサイトメータにより、個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定する。この際の蛍光信号は、使用する蛍光標識抗体の標識化合物、核酸蛍光色素の種類により異なるが、例えば、赤蛍光と緑蛍光との組み合わせ、赤蛍光と橙蛍光の組み合わせ、橙蛍光と緑蛍光との組み合わせ等が挙げられる。なかでも、赤蛍光と緑蛍光との組み合わせが好ましい。
【００３４】
本発明の工程(vi)においては、赤芽球は上述した少なくとも２つの蛍光信号の強度差に基づいて、分類計数することができる。例えば、２つの蛍光信号を測定した場合には、２軸をそれぞれ白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光とし、２次元分布（たとえば、スキャッタグラム）を得ることが好ましい。この２次元分布から白血球及び赤芽球の分布領域を設定し、それぞれの領域の細胞数を計数し、赤芽球の細胞数を白血球の細胞数で除算することにより、白血球に対する赤芽球の比率を求めることができる。
【００３５】
また、薬剤投与の影響等で白血球膜が過度に傷害され、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光（実施例では緑蛍光）及び核酸蛍光色素に基づく蛍光（実施例では赤蛍光）を２軸とする２次元分布上で、赤芽球の弁別が明瞭でないときは、工程(iv)において、さらに、（ａ）同時に散乱光信号を測定し、散乱光信号（たとえば、側方散乱光、前方散乱光、好ましくは側方散乱光）と蛍光標識抗体に基づく蛍光信号とをそれぞれ２軸とする２次元分布を得て、その分布から白血球集団を特定し（図６）、（ｂ）核酸蛍光色素と蛍光標識抗体に基づく蛍光とをそれぞれ２軸とする２次元分布上で、対応する白血球集団の分布領域を特定し（図７）、（ｃ）（ｂ）の２次元分布上で白血球集団と赤芽球集団との境界（Ａ）を設定することにより、赤芽球をより精度よく弁別することができる。
【００３６】
さらに、工程(iv)において、核酸蛍光色素を０．００３ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲にした場合、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差によって、少なくとも２つの異なる成熟度の赤芽球に分類することが可能である。核酸蛍光色素の濃度は、より好ましくは０．０３ｍｇ／Ｌ〜３ｍｇ／Ｌの範囲である。
【００３７】
この場合には、工程(vi)において、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差から、成熟度の異なる赤芽球を分類計数することができる。つまり、２次元分布から赤芽球の分布領域を設定し、さらに核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差によって赤芽球の領域内に各成熟段階の赤芽球の領域を設定することにより、それぞれの領域の細胞数を計数することができる。さらに、各成熟段階の赤芽球の細胞数を全赤芽球数で除算することにより、全赤芽球に対する各成熟度段階の赤芽球の比率をも求めることができる。
【００３８】
赤芽球を成熟段階に応じて分類するとは、たとえば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球等を少なくとも２つの赤芽球グループに分類計数することをいう。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の赤芽球の分類計数方法の実施例を具体的に説明する。
実施例１まず、以下の組成の試薬を調製した。
蛍光標識抗体・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体第１液（ｐＨ３．０、浸透圧：１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 クエン酸一水和物 ２．１０ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ０．５６ｇ／Ｌ ・核酸蛍光色素 プロピジウムアイオダイド １００ｍｇ／Ｌ ・精製水第２液（ｐＨ７．５、浸透圧：４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 リン酸一ナトリウム二水和物 ０．９５ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ６．２４ｇ／Ｌ ・浸透圧調整剤 塩化ナトリウム １０．２ｇ／Ｌ ・精製水
【００４０】
まず、抗凝固剤処理した末梢血液に患者の血液５０μＬを加え、血液学的試料を調製した。なお、この際に用いた末梢血液及び患者の血液は採取後８時間経過したものであった。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体１０μＬを、得られた血液学的試料に加え、室温で約１５分間インキュベーションした。
【００４１】
その後、第１液を５００μＬ加え、室温で約３０秒間インキュベーションし、さらに第２液を１０００μＬ加え、室温で約５分間インキュベーションし、得られた血液学的試料に含有されている個々の細胞について、光源として４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイトメータで、５３０ｎｍ（緑）、６５０ｎｍ（赤）の波長の蛍光を測定した。
【００４２】
図１に緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを示す。図１では、白血球、赤蛍光染色白血球、赤芽球、ゴーストの４集団が認められた。解析は、図２に示したように、白血球及び赤蛍光染色白血球をウィンドウ（Ｗ１）によって囲み、白血球のみの数を計数し、全白血球数を計数した。
【００４３】
次に、すべての赤芽球をウィンドウ（Ｗ２）によって囲み、赤芽球のみの数を計数し、全赤芽球数を計数した。全赤芽球数を、上記で求めた全白血球で除算することにより、白血球に対する赤芽球の比率を求めた。
【００４４】
また、実施例１とは別に、実施例１と同様の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワルド−ギムザ染色、１０００カウント）により赤芽球を分類計数した。図３に、本実施例のフローサイトメータで測定した赤芽球数と、用手法で測定した赤芽球数との相関図を示す。
【００４５】
図３から、相関係数Ｒは０．９９１となり、実施例１の方法が赤芽球の分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【００４６】
実施例２実施例１と同様の方法により、末梢血液（採血後８時間後、２４時間後、４８時間後、血液は室温保存）及び２人の患者の血液を用い、白血球及び赤芽球の測定を行った。その結果を図４（ａ）〜（ｃ）及び５（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示す。
【００４７】
また、各検体について、実施例１と同様の方法によって全白血球に対する全赤芽球の比率を求めた。その結果を表１に示す。
【表１】
【００４８】
図４（ａ）〜（ｃ）、図５（ａ）〜（ｃ）及び表１から明らかなように、本実施例の方法によれば、時間の経過にかかわらず、ほぼ同様の測定結果が得られることが確認された。
【００４９】
実施例３まず、以下の組成の試薬を調製した。
蛍光標識抗体・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体第１液（ｐＨ３．０、浸透圧：１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 クエン酸一水和物 ２．１０ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ０．５６ｇ／Ｌ ・核酸蛍光色素 プロピジウムアイオダイド １ｍｇ／Ｌ ・精製水第２液（ｐＨ７．５、浸透圧：４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）
・緩衝剤 リン酸一ナトリウム二水和物 ０．９５ｇ／Ｌ リン酸二ナトリウム ６．２４ｇ／Ｌ ・浸透圧調整剤 塩化ナトリウム １０．２ｇ／Ｌ ・精製水
【００５０】
まず、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体１０μＬに、抗凝固剤処理した末梢血液に赤芽球が出現した患者の血液５０μＬを加え、室温で約１５分間インキュベーションした。その後、第１液を５００μＬ加え、室温で約３０秒間インキュベーションし、さらに第２液を１０００μＬ加え、室温で約５分間インキュベーションし、得られた血液学的試料に含有されている個々の細胞について、光源として４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイトメータで、５３０ｎｍ（緑）、６５０ｎｍ（赤）の波長の蛍光を測定した。
【００５１】
図８に緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを示す。図８では、白血球、赤蛍光染色白血球、成熟赤芽球、未成熟赤芽球１、未成熟赤芽球２、ゴーストの６集団が認められた。解析は、図９に示したように、白血球及び赤蛍光染色白血球をウィンドウ（Ｗ１）によって囲み、白血球のみの数を計数し、全白血球数を計数した。次に、すべての赤芽球をウィンドウ（Ｗ２）によって囲み、赤芽球のみの数を計数し、全赤芽球数を計数した。
【００５２】
さらに、ウィンドウ（Ｗ２）中の赤芽球をステージＩ、II、IIIとしてそれぞれウィンドウ（Ｗ３）、ウィンドウ（Ｗ４）及びウィンドウ（Ｗ５）によって囲み、それぞれの数を計数した。得られた各ウィンドウの赤芽球数を、全赤芽球数で除算することにより、全赤芽球に対する各ステージにおける赤芽球の比率を求めた。
【００５３】
また、実施例３とは別に、実施例３と同様の血液学的試料を用いて用手法（メイグリュンワルド−ギムザ染色）により、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球の赤芽球に分類計数した。
【００５４】
表２に、実施例３のフローサイトメータで測定した結果と、用手法で測定した結果を示す。なお、表２においては、ステージＩ、II及びIIIは、それぞれ図８における未成熟赤芽球２、未成熟赤芽球１及び成熟赤芽球に対応する。
【表２】
【００５５】
表２から、本方法と用手法との結果がほぼ一致しており、実施例３の方法が赤芽球の分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【００５６】
実施例４実施例３と同様の方法により、末梢血液（採血後８時間後、血液は室温保存）及び２４人の血液疾患患者の血液を用い、赤芽球の測定を行った。また、実施例４とは別に、実施例４と同様の血液学的試料を用いて用手法（メイグリュンワルド−ギムザ染色）により、赤芽球の測定を行った。
【００５７】
図１０及び図１１に、本実施例のフローサイトメータで測定した赤芽球数と、用手法で測定したステージII及びステージIIIにおける赤芽球数との相関図を示す。図１０及び図１１から、実施例４の方法が赤芽球の各ステージにおける分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の赤芽球の分類計数方法により測定されたスキャッタグラムである。
【図２】図１の模式図である。
【図３】本発明の方法と用手法とで測定された赤芽球数の相関関係を示す図である。
【図４】本発明の赤芽球の分類計数方法により、赤芽球測定の経時変化を示すスキャッタグタムである。
【図５】本発明の赤芽球の分類計数方法により、赤芽球測定の経時変化を示す別のサンプルによるスキャッタグラムである。
【図６】本発明の赤芽球の分類計数方法に散乱光信号を組み合わせた場合のスキャッタグラムである。
【図７】図６におけるＧｈｏ＋ＮＲＢＣをさらに赤芽球とゴーストに弁別した場合のスキャッタグラムである。
【図８】本発明の赤芽球の分類計数方法により、緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を示すスキャッタグラムである。
【図９】図１の模式図である。
【図１０】本発明の方法と用手法とで測定されたステージIIの赤芽球数の相関関係を示す図である。
【図１１】本発明の方法と用手法とで測定されたステージIIIの赤芽球数の相関関係を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
ＷＢＣ 全白血球
ＮＲＢＣ 赤芽球
ｌｅｕ 白血球
Ｇｈｏ ゴースト
Ｌｙ リンパ球
Ｍｏ 単球
Ｇｒａｎ 顆粒球
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)抹消血液に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、
(ii)工程(i)で得られた試料と、２．０〜５．０のｐＨおよび１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ以下の浸透圧を有する第１液を混合して赤血球を溶血し、
(iii)工程(ii)で得られた試料と、ｐＨ５．０〜１１．０のｐＨおよび３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの浸透圧を有する第２液を混合してｐＨおよび浸透圧を調整し、
(iv)赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色し、
(v)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、
(vi)これら蛍光強度差に基づいて、抹消血液に含まれる赤芽球を分類し、分類された赤芽球を計数することからなる赤芽球の分類計数方法。
【請求項２】
工程(i)における白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体が、白血球表面に発現している抗原を認識し、その抗原に結合する蛍光標識抗体である請求項１記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項３】
工程(i)の蛍光標識抗体の蛍光標識化合物が、フィコエリスリン、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ＣＹ５、ペリジニンクロロフィルコンプレックス及びそれらのフィコエリスリン結合体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である請求項１又は２のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項４】
第１液または第２液が、核酸蛍光色素を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項５】
第１液の浸透圧が、１０〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏである、請求項１〜４のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項６】
第１液のｐＨが、７．５〜１０．０である、請求項１〜５のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項７】
第２液を混合した後の試料の浸透圧が、４００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏである、請求項１〜６のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項８】
分類された赤芽球を、核酸蛍光色素の蛍光強度に基づいて、少なくとも２つの異なる成熟度の赤芽球に分類する工程をさらに備える請求項１〜７のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項９】
工程(iv)の核酸蛍光色素が、プロピジウムアイオダイド、Ｎ−メチル−
４−（１−ピレン）ビニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1からなる群から選択される少なくとも１種類の色素である請求項１〜８のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１０】
測定された個々の細胞の蛍光信号から、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光をそれぞれ２軸として２次元分布を得ることからなる請求項１〜９のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１１】
２次元分布から赤芽球の分布領域を設定し、その領域の細胞数を計数する請求項１０に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１２】
２次元分布から白血球及び赤芽球の分布領域を設定し、それぞれの領域
の細胞数を計数し、赤芽球細胞数を白血球細胞数で除算することにより白血球に対する赤芽球の比率を求める請求項１０又は１１に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１３】
核酸蛍光色素を、０．００３ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲で使用する請求項１〜１２に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１４】
（１）測定された個々の細胞の蛍光信号から、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光をそれぞれ２軸として２次元分布を得、
（２）２次元分布において、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差で、赤芽球を少なくとも２つに分類する領域を設定し、各領域の細胞数を計数することによって、成熟度の異なる赤芽球を分類することからなる請求項８に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１５】
２次元分布において、全赤芽球及び少なくとも２つの成熟度の異なる赤芽球の各領域の細胞数を計数し、２つの成熟度の異なる赤芽球の細胞数を全赤芽球数でそれぞれ除算することにより全赤芽球に対する成熟度の異なる赤芽球の各比率を求める請求項１４に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１６】
工程(i)において使用される蛍光標識抗体が、１種類である請求項１〜１５に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１】
(i)抹消血液に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、
(ii)工程(i)で得られた試料と、２．０〜５．０のｐＨおよび１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ以下の浸透圧を有する第１液を混合して赤血球を溶血し、
(iii)工程(ii)で得られた試料と、ｐＨ５．０〜１１．０のｐＨおよび３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏの浸透圧を有する第２液を混合してｐＨおよび浸透圧を調整し、
(iv)赤芽球の核を、前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素で蛍光染色し、
(v)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、
(vi)これら蛍光強度差に基づいて、抹消血液に含まれる赤芽球を分類し、分類された赤芽球を計数することからなる赤芽球の分類計数方法。
【請求項２】
工程(i)における白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体が、白血球表面に発現している抗原を認識し、その抗原に結合する蛍光標識抗体である請求項１記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項３】
工程(i)の蛍光標識抗体の蛍光標識化合物が、フィコエリスリン、フルオレセインイソチオシアネート、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ＣＹ５、ペリジニンクロロフィルコンプレックス及びそれらのフィコエリスリン結合体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である請求項１又は２のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項４】
第１液または第２液が、核酸蛍光色素を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項５】
第１液の浸透圧が、１０〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏである、請求項１〜４のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項６】
第１液のｐＨが、７．５〜１０．０である、請求項１〜５のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項７】
第２液を混合した後の試料の浸透圧が、４００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏである、請求項１〜６のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項８】
分類された赤芽球を、核酸蛍光色素の蛍光強度に基づいて、少なくとも２つの異なる成熟度の赤芽球に分類する工程をさらに備える請求項１〜７のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項９】
工程(iv)の核酸蛍光色素が、プロピジウムアイオダイド、Ｎ−メチル−
４−（１−ピレン）ビニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1からなる群から選択される少なくとも１種類の色素である請求項１〜８のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１０】
測定された個々の細胞の蛍光信号から、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光をそれぞれ２軸として２次元分布を得ることからなる請求項１〜９のいずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１１】
２次元分布から赤芽球の分布領域を設定し、その領域の細胞数を計数する請求項１０に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１２】
２次元分布から白血球及び赤芽球の分布領域を設定し、それぞれの領域
の細胞数を計数し、赤芽球細胞数を白血球細胞数で除算することにより白血球に対する赤芽球の比率を求める請求項１０又は１１に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１３】
核酸蛍光色素を、０．００３ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲で使用する請求項１〜１２に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１４】
（１）測定された個々の細胞の蛍光信号から、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光をそれぞれ２軸として２次元分布を得、
（２）２次元分布において、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差で、赤芽球を少なくとも２つに分類する領域を設定し、各領域の細胞数を計数することによって、成熟度の異なる赤芽球を分類することからなる請求項８に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１５】
２次元分布において、全赤芽球及び少なくとも２つの成熟度の異なる赤芽球の各領域の細胞数を計数し、２つの成熟度の異なる赤芽球の細胞数を全赤芽球数でそれぞれ除算することにより全赤芽球に対する成熟度の異なる赤芽球の各比率を求める請求項１４に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１６】
工程(i)において使用される蛍光標識抗体が、１種類である請求項１〜１５に記載の赤芽球の分類計数方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−８０１２２（Ｐ２００９−８０１２２Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７８２６７（Ｐ２００８−２７８２６７）
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【分割の表示】特願平１１−１００１９３の分割
【原出願日】平成１１年４月７日（１９９９．４．７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【分割の表示】特願平１１−１００１９３の分割
【原出願日】平成１１年４月７日（１９９９．４．７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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