超音波照射装置
【課題】各サンプルに均一に超音波を照射する超音波照射装置を提供する。
【解決手段】超音波照射装置１０は、処理槽１２と、超音波振動子１４と、互いに分離した状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器Ｗを有するプレートＰを処理槽１２内で移動させる移動部１６とを備え、超音波振動子１４が超音波を発生させるときに移動部１６はプレートＰを移動させる。
【解決手段】超音波照射装置１０は、処理槽１２と、超音波振動子１４と、互いに分離した状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器Ｗを有するプレートＰを処理槽１２内で移動させる移動部１６とを備え、超音波振動子１４が超音波を発生させるときに移動部１６はプレートＰを移動させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は超音波照射装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波はさまざまな用途で用いられる。例えば、超音波は、細胞の破砕、混合物の懸濁化、固体の微粒子化、固体の溶解および反応の促進などに用いられる。また、超音波を用いて、アミロイド線維の形成の促進、および、アミロイド線維の分断および微細化が行われることも知られている。
【０００３】
例えば、許文献１には、処理槽の外側に超音波振動子を設けた超音波発生装置が記載されている。特許文献１の超音波発生装置では、超音波の照射および中断が自動的に制御される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２１１８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明者らは、プレートに保持される複数のサンプル（溶液）に対して単純に超音波の照射を行う場合、サンプルの位置に応じて超音波のサンプルに対する影響にばらつきが生じ、このばらつきは超音波の不均一な照射に起因することを見出した。
【０００６】
本発明は上記課題を鑑みてなされたものであり、その目的は、各サンプルにほぼ均一に超音波を照射可能な超音波照射装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による超音波照射装置は、処理槽と、超音波振動子と、互いに分離した状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器を有するプレートを前記処理槽内で移動させる移動部とを備える。
【０００８】
ある実施形態において、前記超音波振動子が超音波を発生させるときに前記移動部は前記プレートを移動させる。
【０００９】
ある実施形態において、前記移動部は、前記プレートを平面方向に移動させる。
【００１０】
ある実施形態において、前記移動部は、スライド部と、前記プレートを載せた状態で前記スライド部に沿って移動可能な支持部とを有する。
【００１１】
ある実施形態において、前記移動部は、前記プレートを垂直方向に移動させる。
【００１２】
ある実施形態において、前記複数の容器のそれぞれは、遮光領域および透過領域を有する。
【００１３】
ある実施形態において、前記複数の容器のそれぞれは、前記遮光領域の設けられた側部と、前記透過領域の設けられた底部とを有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、各サンプルにほぼ均一に超音波を照射可能な超音波照射装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明による超音波照射装置の実施形態の模式図である。
【図２】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図３】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図４】本実施形態の超音波照射装置を備えた超音波処理装置の模式図である。
【図５】図４に示した超音波処理装置における測定部の一例を示す模式図である。
【図６】図５に示した測定部の一例を示す模式図である。
【図７】本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図８】本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液のラグタイムを表したプレートの模式図である。
【図９】プレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図１０】プレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液のラグタイムを表したプレートの模式図である。
【図１１】プレートの移動の有無に応じたラグタイムの分布を示すグラフである。
【図１２】図４に示した超音波処理装置における測定部の一例を示す模式図である。
【図１３】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置に用いられるプレートの模式図であり、（ｂ）はプレート内のサンプルの位置と菌体破砕量との関係を示すグラフである。
【図１４】プレートの移動の有無に応じた菌体破砕量の分布を示すグラフである。
【図１５】本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液の菌体破砕率を示す模式図である。
【図１６】プレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液の菌体破砕率を示す模式図である。
【図１７】プレートの移動の有無に応じた破砕率の分布を示すグラフである。
【図１８】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液の濁度増加率を示す模式図であり、（ｂ）は濁度増加率の分布を示す円グラフである。
【図１９】（ａ）はプレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液の濁度増加率を示す模式図であり、（ｂ）は濁度増加率の分布を示す円グラフである。
【図２０】プレートの移動の有無に応じた濁度増加率の分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明による超音波照射装置の実施形態を説明する。
【００１７】
図１に、本実施形態の超音波照射装置１０の模式図を示す。超音波照射装置１０は、処理槽１２と、超音波振動子１４と、互いに分離された状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器（微小容器）Ｗを有するプレートＰを処理槽１２内で移動させる移動部１６とを備える。処理槽１２には液体（例えば、水）が溜められる。例えば、プレートＰは複数の容器Ｗ（ウェル、穴または窪み）が固定して設けられた、いわゆるマイクロプレートであってもよい。または、プレートＰは互いに分離可能な複数の容器（管状部材）Ｗを保持するように構成されてもよい。
【００１８】
本実施形態の超音波照射装置１０では、超音波振動子１４がプレートＰに向けて超音波を照射している間に移動部１６はプレートＰを移動させる。例えば、移動部１６はプレートＰを所定の点を中心に回転させ、これにより、プレートＰは回転移動してもよい。例えば、プレートＰの回転速度は０．５ｒｐｍ以上１１ｒｐｍ以下の範囲内であることが好ましく、プレートＰの回転速度は約６ｒｐｍであることがさらに好ましい。あるいは、移動部１６により、プレートＰは周回移動してもよいし、平行移動してもよい。
【００１９】
本実施形態の超音波照射装置１０では、移動部１６が処理槽１２内においてプレートＰが移動することにより、プレートＰの各容器Ｗの溶液にほぼ均一に超音波を照射することができる。プレートＰの容器Ｗに成分の若干異なる溶液を入れた場合、超音波照射装置１０は、プレートＰの各容器Ｗの溶液にほぼ均一に超音波を照射するため、成分の違いに応じた超音波照射による影響を簡便に調べることができる。超音波照射装置１０は、細胞の破砕、混合物の懸濁化、固体の微粒子化、固体の溶解または反応の促進などに利用してもよい。また、超音波照射装置１０は、アミロイド線維の形成促進、分断および微細化に利用してもよい。
【００２０】
以下、図２を参照して超音波照射装置１０の一例を説明する。図２に示した超音波照射装置１０では、移動部１６は、スライド部１６ｓ１と、スライド部１６ｓ１に沿って移動可能に取り付けられた支持部１６ｔ１と、支持部１６ｔ１に固定されたスライド部１６ｓ２と、スライド部１６ｓ２に沿って移動可能に取り付けられた支持部１６ｔ２とを有している。支持部１６ｔ２の先端にはプレートＰが載せられる。スライド部１６ｓ１に沿って支持部１６ｔ１はｙ方向に移動し、これに伴い、プレートＰも処理槽１２内をｙ方向に移動する。また、スライド部１６ｓ２に沿って支持部１６ｔ２はｘ方向に移動し、これに伴い、プレートＰも処理槽１２内をｘ方向に移動する。このように、移動部１６により、プレートＰは処理槽１２内を平面方向に移動させることができる。なお、本明細書の以下の説明において、スライド部１６ｓ１、１６ｓ２を第１スライド部１６ｓ１、第２スライド部１６ｓ２と呼び、支持部１６ｔ１、１６ｔ２を第１支持部１６ｔ１、第２支持部１６ｔ２と呼ぶことがある。また、図２に示すように、処理槽１２ａの内側に、超音波振動子１４の取り付けられた振動板１４ａが配置されてもよい。例えば、超音波照射装置１０の処理槽１２および超音波振動子１４として、エレコン科学株式会社製のＥＬＥＳＴＥＩＮが好適に用いられる。
【００２１】
なお、図２を参照して説明した超音波照射装置１０では、移動部１６は、プレートＰをｘ方向およびｙ方向のそれぞれに沿って移動させることができるが、本発明はこれに限定されない。移動部１６は、プレートＰをｘ方向およびｙ方向の一方のみに沿って移動可能であってもよい。例えば、図２を参照して説明した超音波照射装置１０から、第１スライド部１６ｓ１および第１支持部１６ｔ１を省略してもよい。または、図２を参照して説明した超音波照射装置１０から、第２スライド部１６ｓ２および第２支持部１６ｔ２を省略し、プレートＰは支持部１６ｔ１に載せられてもよい。
【００２２】
なお、図２を参照して説明した移動部１６はプレートＰを処理槽１２内で平面方向に移動させたが、本発明はこれに限定されない。移動部１６はプレートＰを垂直方向に移動させてもよい。
【００２３】
以下、図３を参照して超音波照射装置１０の別の構成を説明する。図３に示した超音波照射装置１０において、移動部１６は、支持部１６ｔ２に取り付けられた昇降部１６ｕと、プレートＰの載せられる支持部１６ｖとをさらに備える点を除いて、図２を参照して上述した移動部１６と同様の構成を有しており、冗長を避けるために重複する説明を省略する。
【００２４】
支持部１６ｖは昇降部１６ｕに取り付けられており、昇降部１６ｕは支持部１６ｖをｚ方向に移動させる。これに伴い、プレートＰは処理槽１２内から処理槽１２の外に、または、処理槽１２の外部から処理槽１２内に移動する。このため、スライド部１６ｓ１、１６ｓ２および昇降部１６ｕにより、プレートＰを互いに直交する３つの方向に移動させることができる。例えば、昇降部１６ｕにより、プレートＰを処理槽１２内から処理槽１２の外に移動させた後、プレートＰの容器Ｗ内の溶液を測定してもよい。
【００２５】
図４に、超音波照射装置１０を備えた超音波処理装置１００の模式図を示す。超音波処理装置１００は、プレートＰの容器Ｗ内の溶液に超音波を照射する超音波照射装置１０と、プレートＰの容器Ｗ内の溶液の特性を測定する測定部２０とを備えている。
【００２６】
超音波照射装置１０は、処理槽１２および超音波振動子１４に加えて、処理槽１２内の液体の循環に用いられる循環槽１２ａと、超音波振動子１４を制御する制御部１４ｓと、超音波振動子１４を駆動する駆動部１４ｔとを有している。なお、各容器Ｗ内の溶液への超音波照射の均一性をさらに改善するために、超音波振動子１４の数はできるだけ多いことが好ましい。なお、超音波処理装置１００において図３に示した超音波照射装置１０を用いる場合、移動部１６は、超音波の照射が終了した後、プレートＰを測定部２０まで移動させてもよい。
【００２７】
例えば、超音波照射装置１０は、アミロイド線維の誘導に用いられる。アミロイドの形成は、物質の結晶形成に似た現象であり、原因物質が危険レベルを超えていても、アミロイド形成のエネルギー障壁が高いため、過飽和状態に保たれている場合が多い。このような状況では、アミロイドやそのオリゴマーは形成されず、アミロイドーシスも発症せず、潜伏状態にある。原因タンパク質がアミロイドを形成する反応は遅く、一般に、アミロイド形成には、数日から数ヶ月の長時間が必要となる。しかしながら、タンパク質に超音波を照射することにより、アミロイド形成のエネルギー障壁を下げて、アミロイド線維の形成を促進することができる。
【００２８】
タンパク質からアミロイドが誘導される場合、アミロイドはアミロイド特異性蛍光色素と結合することによって蛍光を発する。アミロイドが誘導されたプレートＰの複数の容器Ｗ内にアミロイド特異性蛍光色素が存在することにより、蛍光が発せられ、測定部２０はこの蛍光を検出することによって溶液内のアミロイドを検出することができる。例えば、測定部２０としてプレートリーダーが用いられ、特異性蛍光色素としてチオフラビンＴが用いられる。プレートリーダー２０として、コロナ電気株式会社製のＭＴＰ−８１０またはＳＨ−９０００が好適に用いられる。
【００２９】
なお、溶液をプレートＰの容器Ｗに入れた後、蒸発等を防ぐために容器Ｗを封止することが好ましく、封止部材として自家蛍光の少ないものを用いることが好ましい。また、水温を測定するために、超音波振動子１４の取り付けられた処理槽１２にセンサを取り付ける場合、センサが音波に起因して破損することがある。このため、水温を測定するセンサを循環槽１２ａに取り付け、循環槽１２ａの温度を測定することが好ましい。
【００３０】
図５に、本実施形態の超音波処理装置１００におけるプレートリーダー２０の模式図を示す。プレートリーダー２０は、光源２２と、入力光学系Ｏａと、出力光学系Ｏｂと、受光部２４とを備えている。受光部２４として、例えば、光電子増倍管が用いられる。
【００３１】
光源２２から出射された光は、入力光学系Ｏａを介してプレートＰの各容器内の溶液に照射される。溶液内から蛍光が発せられる場合、蛍光は出力光学系Ｏｂを介して受光部２４にて検出される。
【００３２】
図６を参照して、入力光学系Ｏａおよび出力光学系Ｏｂの一例を説明する。図６に、プレートリーダー２０の模式図を示す。入力光学系Ｏａは、レンズＬ１〜Ｌ４と、スリットＳ１〜Ｓ３と、カラーフィルタＣ１と、グレーティングＧ１、Ｇ２と、ハーフミラーＨ１とを有している。出力光学系Ｏｂは、スリットＳ４〜Ｓ６と、カラーフィルタＣ２と、グレーティングＧ３、Ｇ４と、ハーフミラーＨ２とを有している。
【００３３】
例えば、光源２２から出射された光は、レンズＬ１、Ｌ２、カラーフィルタＣ１およびスリットＳ１を介してグレーティングＧ１において反射される。例えば、レンズＬ１、Ｌ２のｆ値は６０である。また。カラーフィルタＣ１により、特定の波長以外の波長の光が遮断される。反射された光はスリットＳ２を介してグレーティングＧ２において反射される。その後、光は、スリットＳ３、ハーフミラーＨ１、レンズＬ３、Ｌ４を通過し、最後に、ハーフミラーＨ２を介してプレートＰの各容器内の溶液に照射される。なお、ハーフミラーＨ１によって進行方向の変更した光の強度を光検出器ＰＤで検出してもよい。この強度に基づいて、プレートＰの各容器内の溶液に照射される光の強度の調整を簡便に行うことができる。
【００３４】
プレートＰにおける容器Ｗの溶液内から蛍光が発せられる場合、蛍光はハーフミラーＨ２を介して進行方向が曲げられ、スリットＳ４を介してグレーティングＧ３において反射され、反射された光はスリットＳ５を介してグレーティングＧ４において反射される。その後、光は、カラーフィルタＣ２およびスリットＳ６を介して、最終的に受光部２４に入射する。
【００３５】
なお、図４を参照して上述した超音波処理装置１００では、処理槽１２の外部に移動したプレートＰに対して蛍光強度の測定を行ったが、本発明はこれに限定されない。プレートＰが処理槽１２内にある状態でプレートＰの容器Ｗ内の溶液からの蛍光を検出してもよい。例えば、光ファイバーは、その先端が固定されたプレートＰの主面に対して２次元方向に動作可能なように構成されていてもよい。
【００３６】
以下、図７〜図１１を参照して超音波照射装置１０を用いたアミロイド線維の誘導について説明する。タンパク質に超音波を照射することにより、アミロイド線維の誘導時間を短縮するとともに、誘導時間のバラツキを抑制できる。ここでは、超音波照射によってβ２ミクログロブリンからアミロイド線維を形成する。
【００３７】
まず、複数の容器Ｗを有するプレートＰを用意する。ここでは、プレートＰとして、例えば、ハーフエリア黒タイプの９６個の容器（ウェル）Ｗを有するマイクロプレートが用いられる。プレートＰの各容器Ｗに、０．３ｍｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリン溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５μＭチオフラビンＴを含む、ｐＨ２．５）を２００μＬ入れる。例えば、プレートＰは温度３７℃に設定される。
【００３８】
超音波照射装置１０では、超音波を照射する際にプレートＰを移動させている。ここでは、移動部１６はプレートＰを回転させており、回転速度は約６ｒｐｍである。超音波照射装置１０は、１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返す。上述したように、アミロイド線維が誘導されると、アミロイドはチオフラビンＴと結合して蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、アミロイドを検出することができる。
【００３９】
図７に、プレートＰを移動させながら超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化を示す。ここでは、超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間に着目する。超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間が最も短いものは約５０分であり、最も長いものは約１００分である。なお、本明細書の以下の説明において超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間をラグタイムと呼ぶことがある。
【００４０】
図８に、プレートＰを移動させながら超音波を照射した場合のラグタイムを表したプレートＰの模式図を示す。図８において、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示している。図８から理解されるように、ほとんどの容器内の溶液のラグタイムは７０分〜８０分程度である。
【００４１】
参考のために、図９に、プレートＰを移動させないで同様に超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化を示す。プレートＰを移動させないで超音波の照射を行う場合、ラグタイムは、最短で約６０分であり、最長で約２７０分である。
【００４２】
図１０に、超音波を照射する際にプレートＰの移動を行わない場合のラグタイムを表したプレートＰの模式図を示す。図１０でも、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示している。図１０から理解されるように、プレートＰにおいて中央付近のほとんどの容器Ｗ内の溶液のラグタイムは１００分程度であり、端部近傍の容器Ｗ内の溶液のラグタイムは１２０分程度である。このように、端部の容器Ｗ内の溶液のラグタイムは中央付近の容器Ｗ内の溶液のラグタイムよりも長い。また、図７、図８と図９、図１０との比較から理解されるように、超音波を照射する際のプレートＰの移動により、ラグタイムの平均を短縮するとともに、ラグタイムのバラツキを抑制することができる。
【００４３】
図１１に、ラグタイムの分布を示す。図１１には、プレートＰの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも９６である。表１に、移動の有無に応じた平均ラグタイムおよび標準偏差を示す。
【表１】
【００４４】
図１１および表１からも、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、ラグタイムの平均時間を短縮するとともに分布のバラツキを抑制することが理解される。
【００４５】
なお、上述した説明ではプレートＰの各容器Ｗに同一の溶液を入れたが、プレートＰの各容器Ｗには異なる溶液を入れてもよい。この場合、プレートＰの各容器Ｗにほぼ均一な超音波が照射されると、アミロイドーシス発症のリスクの比較的高い被験者の溶液には所定量のアミロイドが形成される一方、アミロイドーシス発症のリスクの比較的低い被験者の溶液には所定量のアミロイドは形成されない。このため、超音波の照射をアミロイドーシス発症のリスクの閾値となるように設定し、被験者の陽性および陰性を判定することができる。
【００４６】
なお、タンパク質が不定形に凝集した場合、濁度が増加する一方、アミロイド線維特異性蛍光色素とは反応しないため、蛍光が発せられないことがある。この場合、濁度を測定することにより、溶液内のタンパク質の凝集状態を調べることができる。
【００４７】
以下、図１２を参照して、溶液の濁度を測定する測定部２０の一例を説明する。図１２に測定部２０の模式図を示す。上述したように、プレートＰは複数の容器Ｗを有しているが、ここでは、図面が過度に複雑になることを避けるために、１つの容器Ｗのみを示している。
【００４８】
測定部２０は、光源２２と、受光部２４ａ、２４ｂとを備える。光源２２から出射された光は、プレートＰの容器Ｗの下方から入射する。例えば、光源２２としてレーザを用いてもよい。光源２２としてレーザを用いることにより、容器Ｗよりも小さい径のビームスポットの形成を簡便に行うことができる。例えば、光源２２として波長６３５ｎｍの光を出射するレーザを用いてもよく、波長４０５ｎｍの光を出射するレーザを用いてもよい。
【００４９】
光源２２とプレートＰの容器Ｗとの間に、減光フィルタＮＤおよびピンホールＰｈが配置されてもよく、光源２２から出射された光は、ミラーＭ１、Ｍ２において反射された後で、プレートＰの容器Ｗの下方から入射してもよい。また、必要に応じて、レンズを用いて集光してもよく、また、プレートＰの容器Ｗの下方から入射する前に、コリメータレンズを用いて平行光線を形成してもよい。
【００５０】
プレートＰの容器Ｗの下方から入射された光は、容器Ｗの上方から出射される。なお、容器Ｗ内の溶液における散乱の程度から、濁度を測定することができる。受光部２４ａは、光源２２から出射されて容器Ｗを透過した光を検出し、受光部２４ｂは、光源２２から出射されて容器Ｗ内の溶液において散乱された光を検出する。また、この測定部２０を用いて吸光度を測定することもできる。
【００５１】
なお、ここでは、光源２２からの光はプレートＰの容器Ｗに下方から入射し、上方から出射したが、本発明はこれに限定されない。光源２２からの光はプレートＰの容器Ｗに上方から入射し、下方から出射されてもよい。
【００５２】
また、アミロイドの溶解した溶液は、蛍光および濁度の両方を測定することが好ましい。このため、測定部２０は、溶液から発せられた蛍光の検出、および、濁度の測定の両方を行うことが好ましい。蛍光だけでなく濁度を測定することにより、溶液内のタンパク質の凝集状態をより詳細に調べることができる。この場合、プレートＰは、蛍光の測定だけでなく濁度の測定にも適していることが好ましい。例えば、プレートＰはポリスチレンから形成されることが好ましい。また、プレートＰの各容器Ｗは、遮光領域の設けられた側部と、透過領域の設けられた底部とを有することが好ましい。例えば、容器Ｗの側面は黒であり、容器Ｗの底面は透明である。
【００５３】
なお、上述した説明では、超音波照射装置１０はアミロイドの形成の促進に用いられたが、本発明はこれに限定されない。超音波照射装置１０を細菌の破砕に用いてもよい。
【００５４】
以下、図１３〜図１７を参照して超音波照射装置１０を用いた大腸菌の破砕について説明する。本実施形態の超音波照射装置１０は、プレートＰの各容器Ｗの溶液内の大腸菌の粉砕をほぼ均一に行うことができる。例えば、大腸菌の破砕の程度は、超音波の照射前後の菌体の重量差（破砕量）から調べられる。
【００５５】
図１３（ａ）に、プレートＰの模式図を示す。ここでは、プレートＰは、容器Ｗとして互いに分離可能な複数のプラスチックチューブを保持するように構成されている。プレートＰの各プラスチックチューブＷには同様の溶液（サンプル）が入れられる。図１３（ａ）には、各プラスチックチューブＷの番号（サンプルの位置番号）が付されている。
【００５６】
例えば、容量１．５ｍｌのプラスチックチューブＷに大腸菌を集菌、沈殿させて重量を測定した後に、５０ｍＭで１．０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁させる。その後、超音波照射装置１０はプレートＰが移動している状態で超音波を照射する。例えば、プレートＰは回転し、その回転速度は６ｒｐｍであり、超音波の照射時間は１０分である。その後、しばらく間隔を空けて再びプレートＰの移動および超音波の照射を行う。このようにして、１０分の超音波照射を３回行い、合計３０分間超音波照射を行う。例えば、プレートＰの温度は７℃に設定されている。超音波照射装置１０が超音波を照射することにより、大腸菌は破砕され、菌体量が減少する。破砕量は、各プラスチックチューブＷの初期集菌量から、超音波を照射した後に破砕されずに残ったものを差し引くことによって計算される。
【００５７】
図１３（ｂ）に、サンプル位置番号に対する菌体破砕量を示す。例えば、超音波を照射した後に、各プラスチックチューブＷにから集菌した大腸菌の平均重量は９．０ｍｇである。
【００５８】
参考のために、図１３（ｂ）には、プレートＰを移動させないで同様に超音波を照射した場合の菌体破砕量を併せて示している。超音波を照射する際にプレートＰを移動させることなく同様の条件を行う場合、超音波を照射した後に、各プラスチックチューブＷから集菌した大腸菌の平均重量は９．２ｍｇである。
【００５９】
図１４に、菌体破砕量の分布を示す。図１４には、プレートＰの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも２４である。表２に、移動の有無に応じた平均菌体破砕量および標準偏差を示す。
【表２】
【００６０】
図１４および表２から理解されるように、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、菌体破砕量の平均が増加するとともに分布のバラツキが抑制される。
【００６１】
なお、図１３および図１４を参照して上述した説明では、菌体の破砕を、菌体の重量に基づいて調べたが、別の方法で菌体の破砕を調べることもできる。例えば、溶液の濁度に基づいて菌体の破砕を調べてもよい。
【００６２】
以下、図１５〜図１７を参照して超音波照射装置１０を用いて大腸菌の破砕について説明する。ここでは、溶液の濁度に基づいて大腸菌の破砕を調べる。超音波によって大腸菌が破砕されると、溶液は白濁から透明に変化していき、溶液の濁度は減少する。
【００６３】
例えば、プレートＰとして９６個の容器Ｗを有するマイクロプレートを用意し、プレートＰの各容器Ｗに、大腸菌試料２００μｌを入れる。集菌した菌体を５０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、溶液の濁度を平均３．１（１０ｍｍセルに換算した値）に調製する。例えば、濁度の測定は、波長６００ｎｍの光で、コロナ電気株式会社製のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−９０００を用いて行われる。
【００６４】
その後、超音波照射装置１０はプレートＰが移動している状態で超音波を照射する。例えば、プレートＰは回転し、その回転速度は６ｒｐｍであり、超音波の照射時間は１０分である。その後、しばらく間隔を空けて再びプレートＰの移動および超音波の照射を行う。このようにして、１０分の超音波照射を３回行い、合計３０分間超音波照射を行う。例えば、プレートＰの温度は７℃に設定されている。
【００６５】
このように、合計３０分の超音波照射を行った後に、再び、溶液の濁度を測定する。その後、超音波の照射前後における濁度を比較し、濁度の変化量を求める。変化量は、超音波照射前の各容器内の溶液の濁度値を１として変化量を規格化する。濁度の減少率は菌体破砕率に対応している。
【００６６】
図１５に、超音波を照射する際にプレートＰの移動を行った場合の各容器Ｗの菌体破砕率（濁度減少率）を表したプレートＰの模式図を示す。プレートＰの複数の容器Ｗのうち端部を除く大部分の容器Ｗでは菌体破砕率は２０％を超えている。
【００６７】
参考のために、図１６に、プレートを移動させないで同様に超音波を照射した場合の各容器Ｗの菌体破砕率（濁度減少率）を表したプレートＰの模式図を示す。図１６に示されるように、プレートＰを移動させることなく超音波の照射を行う場合、プレートＰの各容器Ｗにおける菌体破砕率のバラツキが比較的大きく、特に、プレートＰの比較的端部に位置する容器Ｗ内の溶液の菌体破砕率が比較的低い。これに対して、プレートＰを移動させながら超音波を照射する場合、プレートＰの各容器内の溶液の菌体破砕率の均一化を図ることができる。
【００６８】
図１７に、菌体破砕率の分布を示す。図１７には、プレートＰの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも９６である。表２に、移動の有無に応じた平均菌体破砕率および標準偏差を示す。
【表３】
【００６９】
図１７および表３から、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、平均菌体破砕率が増加するとともに分布のバラツキが抑制されることが理解される。
【００７０】
なお、超音波照射装置１０はタンパク質の凝集に用いてもよい。タンパク質に超音波を照射することにより、タンパク質の凝集が促進される。以下、図１８〜図２０を参照して超音波照射装置１０を用いたタンパク質の凝集について説明する。ここでは、タンパク質として卵白を用いる、卵白に超音波を照射すると、凝集が促進されて濁度が増加する。
【００７１】
ここでは、プレートＰとして９６個の容器Ｗを有するマイクロプレートを用い、プレートＰに各容器Ｗに２００μｌの卵白を入れる。卵白は同一の卵から得られたものであり、超音波照射前の白濁を防ぐために希釈していない。その後、各容器内の卵白の濁度を測定する。例えば、濁度の測定は、波長６００ｎｍの光を用いて測定部２０で行われる。測定部２０としてコロナ電気株式会社製のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−９０００が好適に用いられる。ここでは、濁度の平均は、１．２（１０ｍｍセルに換算した値）である。
【００７２】
その後、超音波照射装置１０は、超音波を照射している間にプレートＰを移動させる。例えば、プレートＰは回転し、その回転速度は６ｒｐｍである。ここでは、超音波照射装置１０は、２分間の超音波の照射を５回（合計１０分間）行う。温度は４０℃に設定されている。このように超音波を照射した後、測定部２０を用いて各容器内の濁度を同様に測定し、超音波照射の前後の濁度の変化量を求める。
【００７３】
図１８（ａ）に、超音波照射装置１０を用いて得られた濁度の変化量を示す。図１８（ａ）では、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示しており、第１行および第１２行の容器に卵白試料を入れていない。濁度の変化量は、超音波を照射する前の濁度を１として規格化した濁度変化量を示している。
【００７４】
また 図１８（ｂ）に、図１８（ａ）の変化量の割合を表した円グラフで示している。複数の容器のうちの半分以上の容器内の濁度変化量が２以上に増加していることが理解される。
【００７５】
参考のために、図１９を参照して、超音波照射装置１０において超音波を照射している際に、プレートＰを移動させない点を除いて、上述したのと同様に超音波照射前および後の濁度を測定した結果を説明する。図１９（ａ）に、プレートＰを移動させないで得られた濁度の変化量を示す。図１９（ａ）でも、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示しており、第１行および第１２行の容器に卵白試料を入れていない。図１９（ｂ）に、図１９（ａ）の変化量の割合を表した円グラフで示している。複数の容器のうちの半分以上の容器内の濁度変化量は２未満であることが理解される。
【００７６】
図１８（ａ）、図１８（ｂ）と図１９（ａ）、図１９（ｂ）との比較から理解されるように、超音波照射装置１０が超音波を照射する際にプレートＰを移動させることにより、タンパク質の凝集効果を促進するとともにタンパク質の凝集の程度のばらつきを抑制することができる。
【００７７】
図２０に、プレートＰの移動の有無に応じた濁度分布を示す。試料数はいずれも８０である。表４に、移動の有無に応じた平均濁度増加率および標準偏差を示す。
【表４】
【００７８】
図２０および表４からも、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、濁度増加率の平均が増加するとともに分布のバラツキが抑制されることが理解される。このように、超音波照射装置１０が超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、タンパク質の凝集を促進させて濁度を増加させるとともに濁度のばらつきを抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、プレートの各サンプルにほぼ均一に超音波を照射することができる。例えば、本発明の超音波照射装置は、サンプル（溶液）の成分の違いに応じた超音波照射による影響を簡便に調べることができる。本発明の超音波照射装置は、細胞の破砕、混合物の懸濁化、固体の微粒子化、固体の溶解または反応の促進、アミロイド線維の形成促進、分断および微細化に好適に用いられる。
【符号の説明】
【００８０】
１０ 超音波照射装置
１２ 処理槽
１４ 超音波振動子
１６ 移動部
【技術分野】
【０００１】
本発明は超音波照射装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波はさまざまな用途で用いられる。例えば、超音波は、細胞の破砕、混合物の懸濁化、固体の微粒子化、固体の溶解および反応の促進などに用いられる。また、超音波を用いて、アミロイド線維の形成の促進、および、アミロイド線維の分断および微細化が行われることも知られている。
【０００３】
例えば、許文献１には、処理槽の外側に超音波振動子を設けた超音波発生装置が記載されている。特許文献１の超音波発生装置では、超音波の照射および中断が自動的に制御される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２１１８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明者らは、プレートに保持される複数のサンプル（溶液）に対して単純に超音波の照射を行う場合、サンプルの位置に応じて超音波のサンプルに対する影響にばらつきが生じ、このばらつきは超音波の不均一な照射に起因することを見出した。
【０００６】
本発明は上記課題を鑑みてなされたものであり、その目的は、各サンプルにほぼ均一に超音波を照射可能な超音波照射装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による超音波照射装置は、処理槽と、超音波振動子と、互いに分離した状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器を有するプレートを前記処理槽内で移動させる移動部とを備える。
【０００８】
ある実施形態において、前記超音波振動子が超音波を発生させるときに前記移動部は前記プレートを移動させる。
【０００９】
ある実施形態において、前記移動部は、前記プレートを平面方向に移動させる。
【００１０】
ある実施形態において、前記移動部は、スライド部と、前記プレートを載せた状態で前記スライド部に沿って移動可能な支持部とを有する。
【００１１】
ある実施形態において、前記移動部は、前記プレートを垂直方向に移動させる。
【００１２】
ある実施形態において、前記複数の容器のそれぞれは、遮光領域および透過領域を有する。
【００１３】
ある実施形態において、前記複数の容器のそれぞれは、前記遮光領域の設けられた側部と、前記透過領域の設けられた底部とを有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、各サンプルにほぼ均一に超音波を照射可能な超音波照射装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明による超音波照射装置の実施形態の模式図である。
【図２】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図３】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図４】本実施形態の超音波照射装置を備えた超音波処理装置の模式図である。
【図５】図４に示した超音波処理装置における測定部の一例を示す模式図である。
【図６】図５に示した測定部の一例を示す模式図である。
【図７】本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図８】本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液のラグタイムを表したプレートの模式図である。
【図９】プレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図１０】プレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液のラグタイムを表したプレートの模式図である。
【図１１】プレートの移動の有無に応じたラグタイムの分布を示すグラフである。
【図１２】図４に示した超音波処理装置における測定部の一例を示す模式図である。
【図１３】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置に用いられるプレートの模式図であり、（ｂ）はプレート内のサンプルの位置と菌体破砕量との関係を示すグラフである。
【図１４】プレートの移動の有無に応じた菌体破砕量の分布を示すグラフである。
【図１５】本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液の菌体破砕率を示す模式図である。
【図１６】プレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液の菌体破砕率を示す模式図である。
【図１７】プレートの移動の有無に応じた破砕率の分布を示すグラフである。
【図１８】（ａ）は本実施形態の超音波照射装置を用いた場合の各容器内の溶液の濁度増加率を示す模式図であり、（ｂ）は濁度増加率の分布を示す円グラフである。
【図１９】（ａ）はプレートの移動を行わない場合の各容器内の溶液の濁度増加率を示す模式図であり、（ｂ）は濁度増加率の分布を示す円グラフである。
【図２０】プレートの移動の有無に応じた濁度増加率の分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明による超音波照射装置の実施形態を説明する。
【００１７】
図１に、本実施形態の超音波照射装置１０の模式図を示す。超音波照射装置１０は、処理槽１２と、超音波振動子１４と、互いに分離された状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器（微小容器）Ｗを有するプレートＰを処理槽１２内で移動させる移動部１６とを備える。処理槽１２には液体（例えば、水）が溜められる。例えば、プレートＰは複数の容器Ｗ（ウェル、穴または窪み）が固定して設けられた、いわゆるマイクロプレートであってもよい。または、プレートＰは互いに分離可能な複数の容器（管状部材）Ｗを保持するように構成されてもよい。
【００１８】
本実施形態の超音波照射装置１０では、超音波振動子１４がプレートＰに向けて超音波を照射している間に移動部１６はプレートＰを移動させる。例えば、移動部１６はプレートＰを所定の点を中心に回転させ、これにより、プレートＰは回転移動してもよい。例えば、プレートＰの回転速度は０．５ｒｐｍ以上１１ｒｐｍ以下の範囲内であることが好ましく、プレートＰの回転速度は約６ｒｐｍであることがさらに好ましい。あるいは、移動部１６により、プレートＰは周回移動してもよいし、平行移動してもよい。
【００１９】
本実施形態の超音波照射装置１０では、移動部１６が処理槽１２内においてプレートＰが移動することにより、プレートＰの各容器Ｗの溶液にほぼ均一に超音波を照射することができる。プレートＰの容器Ｗに成分の若干異なる溶液を入れた場合、超音波照射装置１０は、プレートＰの各容器Ｗの溶液にほぼ均一に超音波を照射するため、成分の違いに応じた超音波照射による影響を簡便に調べることができる。超音波照射装置１０は、細胞の破砕、混合物の懸濁化、固体の微粒子化、固体の溶解または反応の促進などに利用してもよい。また、超音波照射装置１０は、アミロイド線維の形成促進、分断および微細化に利用してもよい。
【００２０】
以下、図２を参照して超音波照射装置１０の一例を説明する。図２に示した超音波照射装置１０では、移動部１６は、スライド部１６ｓ１と、スライド部１６ｓ１に沿って移動可能に取り付けられた支持部１６ｔ１と、支持部１６ｔ１に固定されたスライド部１６ｓ２と、スライド部１６ｓ２に沿って移動可能に取り付けられた支持部１６ｔ２とを有している。支持部１６ｔ２の先端にはプレートＰが載せられる。スライド部１６ｓ１に沿って支持部１６ｔ１はｙ方向に移動し、これに伴い、プレートＰも処理槽１２内をｙ方向に移動する。また、スライド部１６ｓ２に沿って支持部１６ｔ２はｘ方向に移動し、これに伴い、プレートＰも処理槽１２内をｘ方向に移動する。このように、移動部１６により、プレートＰは処理槽１２内を平面方向に移動させることができる。なお、本明細書の以下の説明において、スライド部１６ｓ１、１６ｓ２を第１スライド部１６ｓ１、第２スライド部１６ｓ２と呼び、支持部１６ｔ１、１６ｔ２を第１支持部１６ｔ１、第２支持部１６ｔ２と呼ぶことがある。また、図２に示すように、処理槽１２ａの内側に、超音波振動子１４の取り付けられた振動板１４ａが配置されてもよい。例えば、超音波照射装置１０の処理槽１２および超音波振動子１４として、エレコン科学株式会社製のＥＬＥＳＴＥＩＮが好適に用いられる。
【００２１】
なお、図２を参照して説明した超音波照射装置１０では、移動部１６は、プレートＰをｘ方向およびｙ方向のそれぞれに沿って移動させることができるが、本発明はこれに限定されない。移動部１６は、プレートＰをｘ方向およびｙ方向の一方のみに沿って移動可能であってもよい。例えば、図２を参照して説明した超音波照射装置１０から、第１スライド部１６ｓ１および第１支持部１６ｔ１を省略してもよい。または、図２を参照して説明した超音波照射装置１０から、第２スライド部１６ｓ２および第２支持部１６ｔ２を省略し、プレートＰは支持部１６ｔ１に載せられてもよい。
【００２２】
なお、図２を参照して説明した移動部１６はプレートＰを処理槽１２内で平面方向に移動させたが、本発明はこれに限定されない。移動部１６はプレートＰを垂直方向に移動させてもよい。
【００２３】
以下、図３を参照して超音波照射装置１０の別の構成を説明する。図３に示した超音波照射装置１０において、移動部１６は、支持部１６ｔ２に取り付けられた昇降部１６ｕと、プレートＰの載せられる支持部１６ｖとをさらに備える点を除いて、図２を参照して上述した移動部１６と同様の構成を有しており、冗長を避けるために重複する説明を省略する。
【００２４】
支持部１６ｖは昇降部１６ｕに取り付けられており、昇降部１６ｕは支持部１６ｖをｚ方向に移動させる。これに伴い、プレートＰは処理槽１２内から処理槽１２の外に、または、処理槽１２の外部から処理槽１２内に移動する。このため、スライド部１６ｓ１、１６ｓ２および昇降部１６ｕにより、プレートＰを互いに直交する３つの方向に移動させることができる。例えば、昇降部１６ｕにより、プレートＰを処理槽１２内から処理槽１２の外に移動させた後、プレートＰの容器Ｗ内の溶液を測定してもよい。
【００２５】
図４に、超音波照射装置１０を備えた超音波処理装置１００の模式図を示す。超音波処理装置１００は、プレートＰの容器Ｗ内の溶液に超音波を照射する超音波照射装置１０と、プレートＰの容器Ｗ内の溶液の特性を測定する測定部２０とを備えている。
【００２６】
超音波照射装置１０は、処理槽１２および超音波振動子１４に加えて、処理槽１２内の液体の循環に用いられる循環槽１２ａと、超音波振動子１４を制御する制御部１４ｓと、超音波振動子１４を駆動する駆動部１４ｔとを有している。なお、各容器Ｗ内の溶液への超音波照射の均一性をさらに改善するために、超音波振動子１４の数はできるだけ多いことが好ましい。なお、超音波処理装置１００において図３に示した超音波照射装置１０を用いる場合、移動部１６は、超音波の照射が終了した後、プレートＰを測定部２０まで移動させてもよい。
【００２７】
例えば、超音波照射装置１０は、アミロイド線維の誘導に用いられる。アミロイドの形成は、物質の結晶形成に似た現象であり、原因物質が危険レベルを超えていても、アミロイド形成のエネルギー障壁が高いため、過飽和状態に保たれている場合が多い。このような状況では、アミロイドやそのオリゴマーは形成されず、アミロイドーシスも発症せず、潜伏状態にある。原因タンパク質がアミロイドを形成する反応は遅く、一般に、アミロイド形成には、数日から数ヶ月の長時間が必要となる。しかしながら、タンパク質に超音波を照射することにより、アミロイド形成のエネルギー障壁を下げて、アミロイド線維の形成を促進することができる。
【００２８】
タンパク質からアミロイドが誘導される場合、アミロイドはアミロイド特異性蛍光色素と結合することによって蛍光を発する。アミロイドが誘導されたプレートＰの複数の容器Ｗ内にアミロイド特異性蛍光色素が存在することにより、蛍光が発せられ、測定部２０はこの蛍光を検出することによって溶液内のアミロイドを検出することができる。例えば、測定部２０としてプレートリーダーが用いられ、特異性蛍光色素としてチオフラビンＴが用いられる。プレートリーダー２０として、コロナ電気株式会社製のＭＴＰ−８１０またはＳＨ−９０００が好適に用いられる。
【００２９】
なお、溶液をプレートＰの容器Ｗに入れた後、蒸発等を防ぐために容器Ｗを封止することが好ましく、封止部材として自家蛍光の少ないものを用いることが好ましい。また、水温を測定するために、超音波振動子１４の取り付けられた処理槽１２にセンサを取り付ける場合、センサが音波に起因して破損することがある。このため、水温を測定するセンサを循環槽１２ａに取り付け、循環槽１２ａの温度を測定することが好ましい。
【００３０】
図５に、本実施形態の超音波処理装置１００におけるプレートリーダー２０の模式図を示す。プレートリーダー２０は、光源２２と、入力光学系Ｏａと、出力光学系Ｏｂと、受光部２４とを備えている。受光部２４として、例えば、光電子増倍管が用いられる。
【００３１】
光源２２から出射された光は、入力光学系Ｏａを介してプレートＰの各容器内の溶液に照射される。溶液内から蛍光が発せられる場合、蛍光は出力光学系Ｏｂを介して受光部２４にて検出される。
【００３２】
図６を参照して、入力光学系Ｏａおよび出力光学系Ｏｂの一例を説明する。図６に、プレートリーダー２０の模式図を示す。入力光学系Ｏａは、レンズＬ１〜Ｌ４と、スリットＳ１〜Ｓ３と、カラーフィルタＣ１と、グレーティングＧ１、Ｇ２と、ハーフミラーＨ１とを有している。出力光学系Ｏｂは、スリットＳ４〜Ｓ６と、カラーフィルタＣ２と、グレーティングＧ３、Ｇ４と、ハーフミラーＨ２とを有している。
【００３３】
例えば、光源２２から出射された光は、レンズＬ１、Ｌ２、カラーフィルタＣ１およびスリットＳ１を介してグレーティングＧ１において反射される。例えば、レンズＬ１、Ｌ２のｆ値は６０である。また。カラーフィルタＣ１により、特定の波長以外の波長の光が遮断される。反射された光はスリットＳ２を介してグレーティングＧ２において反射される。その後、光は、スリットＳ３、ハーフミラーＨ１、レンズＬ３、Ｌ４を通過し、最後に、ハーフミラーＨ２を介してプレートＰの各容器内の溶液に照射される。なお、ハーフミラーＨ１によって進行方向の変更した光の強度を光検出器ＰＤで検出してもよい。この強度に基づいて、プレートＰの各容器内の溶液に照射される光の強度の調整を簡便に行うことができる。
【００３４】
プレートＰにおける容器Ｗの溶液内から蛍光が発せられる場合、蛍光はハーフミラーＨ２を介して進行方向が曲げられ、スリットＳ４を介してグレーティングＧ３において反射され、反射された光はスリットＳ５を介してグレーティングＧ４において反射される。その後、光は、カラーフィルタＣ２およびスリットＳ６を介して、最終的に受光部２４に入射する。
【００３５】
なお、図４を参照して上述した超音波処理装置１００では、処理槽１２の外部に移動したプレートＰに対して蛍光強度の測定を行ったが、本発明はこれに限定されない。プレートＰが処理槽１２内にある状態でプレートＰの容器Ｗ内の溶液からの蛍光を検出してもよい。例えば、光ファイバーは、その先端が固定されたプレートＰの主面に対して２次元方向に動作可能なように構成されていてもよい。
【００３６】
以下、図７〜図１１を参照して超音波照射装置１０を用いたアミロイド線維の誘導について説明する。タンパク質に超音波を照射することにより、アミロイド線維の誘導時間を短縮するとともに、誘導時間のバラツキを抑制できる。ここでは、超音波照射によってβ２ミクログロブリンからアミロイド線維を形成する。
【００３７】
まず、複数の容器Ｗを有するプレートＰを用意する。ここでは、プレートＰとして、例えば、ハーフエリア黒タイプの９６個の容器（ウェル）Ｗを有するマイクロプレートが用いられる。プレートＰの各容器Ｗに、０．３ｍｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリン溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５μＭチオフラビンＴを含む、ｐＨ２．５）を２００μＬ入れる。例えば、プレートＰは温度３７℃に設定される。
【００３８】
超音波照射装置１０では、超音波を照射する際にプレートＰを移動させている。ここでは、移動部１６はプレートＰを回転させており、回転速度は約６ｒｐｍである。超音波照射装置１０は、１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返す。上述したように、アミロイド線維が誘導されると、アミロイドはチオフラビンＴと結合して蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、アミロイドを検出することができる。
【００３９】
図７に、プレートＰを移動させながら超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化を示す。ここでは、超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間に着目する。超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間が最も短いものは約５０分であり、最も長いものは約１００分である。なお、本明細書の以下の説明において超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間をラグタイムと呼ぶことがある。
【００４０】
図８に、プレートＰを移動させながら超音波を照射した場合のラグタイムを表したプレートＰの模式図を示す。図８において、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示している。図８から理解されるように、ほとんどの容器内の溶液のラグタイムは７０分〜８０分程度である。
【００４１】
参考のために、図９に、プレートＰを移動させないで同様に超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化を示す。プレートＰを移動させないで超音波の照射を行う場合、ラグタイムは、最短で約６０分であり、最長で約２７０分である。
【００４２】
図１０に、超音波を照射する際にプレートＰの移動を行わない場合のラグタイムを表したプレートＰの模式図を示す。図１０でも、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示している。図１０から理解されるように、プレートＰにおいて中央付近のほとんどの容器Ｗ内の溶液のラグタイムは１００分程度であり、端部近傍の容器Ｗ内の溶液のラグタイムは１２０分程度である。このように、端部の容器Ｗ内の溶液のラグタイムは中央付近の容器Ｗ内の溶液のラグタイムよりも長い。また、図７、図８と図９、図１０との比較から理解されるように、超音波を照射する際のプレートＰの移動により、ラグタイムの平均を短縮するとともに、ラグタイムのバラツキを抑制することができる。
【００４３】
図１１に、ラグタイムの分布を示す。図１１には、プレートＰの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも９６である。表１に、移動の有無に応じた平均ラグタイムおよび標準偏差を示す。
【表１】
【００４４】
図１１および表１からも、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、ラグタイムの平均時間を短縮するとともに分布のバラツキを抑制することが理解される。
【００４５】
なお、上述した説明ではプレートＰの各容器Ｗに同一の溶液を入れたが、プレートＰの各容器Ｗには異なる溶液を入れてもよい。この場合、プレートＰの各容器Ｗにほぼ均一な超音波が照射されると、アミロイドーシス発症のリスクの比較的高い被験者の溶液には所定量のアミロイドが形成される一方、アミロイドーシス発症のリスクの比較的低い被験者の溶液には所定量のアミロイドは形成されない。このため、超音波の照射をアミロイドーシス発症のリスクの閾値となるように設定し、被験者の陽性および陰性を判定することができる。
【００４６】
なお、タンパク質が不定形に凝集した場合、濁度が増加する一方、アミロイド線維特異性蛍光色素とは反応しないため、蛍光が発せられないことがある。この場合、濁度を測定することにより、溶液内のタンパク質の凝集状態を調べることができる。
【００４７】
以下、図１２を参照して、溶液の濁度を測定する測定部２０の一例を説明する。図１２に測定部２０の模式図を示す。上述したように、プレートＰは複数の容器Ｗを有しているが、ここでは、図面が過度に複雑になることを避けるために、１つの容器Ｗのみを示している。
【００４８】
測定部２０は、光源２２と、受光部２４ａ、２４ｂとを備える。光源２２から出射された光は、プレートＰの容器Ｗの下方から入射する。例えば、光源２２としてレーザを用いてもよい。光源２２としてレーザを用いることにより、容器Ｗよりも小さい径のビームスポットの形成を簡便に行うことができる。例えば、光源２２として波長６３５ｎｍの光を出射するレーザを用いてもよく、波長４０５ｎｍの光を出射するレーザを用いてもよい。
【００４９】
光源２２とプレートＰの容器Ｗとの間に、減光フィルタＮＤおよびピンホールＰｈが配置されてもよく、光源２２から出射された光は、ミラーＭ１、Ｍ２において反射された後で、プレートＰの容器Ｗの下方から入射してもよい。また、必要に応じて、レンズを用いて集光してもよく、また、プレートＰの容器Ｗの下方から入射する前に、コリメータレンズを用いて平行光線を形成してもよい。
【００５０】
プレートＰの容器Ｗの下方から入射された光は、容器Ｗの上方から出射される。なお、容器Ｗ内の溶液における散乱の程度から、濁度を測定することができる。受光部２４ａは、光源２２から出射されて容器Ｗを透過した光を検出し、受光部２４ｂは、光源２２から出射されて容器Ｗ内の溶液において散乱された光を検出する。また、この測定部２０を用いて吸光度を測定することもできる。
【００５１】
なお、ここでは、光源２２からの光はプレートＰの容器Ｗに下方から入射し、上方から出射したが、本発明はこれに限定されない。光源２２からの光はプレートＰの容器Ｗに上方から入射し、下方から出射されてもよい。
【００５２】
また、アミロイドの溶解した溶液は、蛍光および濁度の両方を測定することが好ましい。このため、測定部２０は、溶液から発せられた蛍光の検出、および、濁度の測定の両方を行うことが好ましい。蛍光だけでなく濁度を測定することにより、溶液内のタンパク質の凝集状態をより詳細に調べることができる。この場合、プレートＰは、蛍光の測定だけでなく濁度の測定にも適していることが好ましい。例えば、プレートＰはポリスチレンから形成されることが好ましい。また、プレートＰの各容器Ｗは、遮光領域の設けられた側部と、透過領域の設けられた底部とを有することが好ましい。例えば、容器Ｗの側面は黒であり、容器Ｗの底面は透明である。
【００５３】
なお、上述した説明では、超音波照射装置１０はアミロイドの形成の促進に用いられたが、本発明はこれに限定されない。超音波照射装置１０を細菌の破砕に用いてもよい。
【００５４】
以下、図１３〜図１７を参照して超音波照射装置１０を用いた大腸菌の破砕について説明する。本実施形態の超音波照射装置１０は、プレートＰの各容器Ｗの溶液内の大腸菌の粉砕をほぼ均一に行うことができる。例えば、大腸菌の破砕の程度は、超音波の照射前後の菌体の重量差（破砕量）から調べられる。
【００５５】
図１３（ａ）に、プレートＰの模式図を示す。ここでは、プレートＰは、容器Ｗとして互いに分離可能な複数のプラスチックチューブを保持するように構成されている。プレートＰの各プラスチックチューブＷには同様の溶液（サンプル）が入れられる。図１３（ａ）には、各プラスチックチューブＷの番号（サンプルの位置番号）が付されている。
【００５６】
例えば、容量１．５ｍｌのプラスチックチューブＷに大腸菌を集菌、沈殿させて重量を測定した後に、５０ｍＭで１．０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁させる。その後、超音波照射装置１０はプレートＰが移動している状態で超音波を照射する。例えば、プレートＰは回転し、その回転速度は６ｒｐｍであり、超音波の照射時間は１０分である。その後、しばらく間隔を空けて再びプレートＰの移動および超音波の照射を行う。このようにして、１０分の超音波照射を３回行い、合計３０分間超音波照射を行う。例えば、プレートＰの温度は７℃に設定されている。超音波照射装置１０が超音波を照射することにより、大腸菌は破砕され、菌体量が減少する。破砕量は、各プラスチックチューブＷの初期集菌量から、超音波を照射した後に破砕されずに残ったものを差し引くことによって計算される。
【００５７】
図１３（ｂ）に、サンプル位置番号に対する菌体破砕量を示す。例えば、超音波を照射した後に、各プラスチックチューブＷにから集菌した大腸菌の平均重量は９．０ｍｇである。
【００５８】
参考のために、図１３（ｂ）には、プレートＰを移動させないで同様に超音波を照射した場合の菌体破砕量を併せて示している。超音波を照射する際にプレートＰを移動させることなく同様の条件を行う場合、超音波を照射した後に、各プラスチックチューブＷから集菌した大腸菌の平均重量は９．２ｍｇである。
【００５９】
図１４に、菌体破砕量の分布を示す。図１４には、プレートＰの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも２４である。表２に、移動の有無に応じた平均菌体破砕量および標準偏差を示す。
【表２】
【００６０】
図１４および表２から理解されるように、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、菌体破砕量の平均が増加するとともに分布のバラツキが抑制される。
【００６１】
なお、図１３および図１４を参照して上述した説明では、菌体の破砕を、菌体の重量に基づいて調べたが、別の方法で菌体の破砕を調べることもできる。例えば、溶液の濁度に基づいて菌体の破砕を調べてもよい。
【００６２】
以下、図１５〜図１７を参照して超音波照射装置１０を用いて大腸菌の破砕について説明する。ここでは、溶液の濁度に基づいて大腸菌の破砕を調べる。超音波によって大腸菌が破砕されると、溶液は白濁から透明に変化していき、溶液の濁度は減少する。
【００６３】
例えば、プレートＰとして９６個の容器Ｗを有するマイクロプレートを用意し、プレートＰの各容器Ｗに、大腸菌試料２００μｌを入れる。集菌した菌体を５０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、溶液の濁度を平均３．１（１０ｍｍセルに換算した値）に調製する。例えば、濁度の測定は、波長６００ｎｍの光で、コロナ電気株式会社製のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−９０００を用いて行われる。
【００６４】
その後、超音波照射装置１０はプレートＰが移動している状態で超音波を照射する。例えば、プレートＰは回転し、その回転速度は６ｒｐｍであり、超音波の照射時間は１０分である。その後、しばらく間隔を空けて再びプレートＰの移動および超音波の照射を行う。このようにして、１０分の超音波照射を３回行い、合計３０分間超音波照射を行う。例えば、プレートＰの温度は７℃に設定されている。
【００６５】
このように、合計３０分の超音波照射を行った後に、再び、溶液の濁度を測定する。その後、超音波の照射前後における濁度を比較し、濁度の変化量を求める。変化量は、超音波照射前の各容器内の溶液の濁度値を１として変化量を規格化する。濁度の減少率は菌体破砕率に対応している。
【００６６】
図１５に、超音波を照射する際にプレートＰの移動を行った場合の各容器Ｗの菌体破砕率（濁度減少率）を表したプレートＰの模式図を示す。プレートＰの複数の容器Ｗのうち端部を除く大部分の容器Ｗでは菌体破砕率は２０％を超えている。
【００６７】
参考のために、図１６に、プレートを移動させないで同様に超音波を照射した場合の各容器Ｗの菌体破砕率（濁度減少率）を表したプレートＰの模式図を示す。図１６に示されるように、プレートＰを移動させることなく超音波の照射を行う場合、プレートＰの各容器Ｗにおける菌体破砕率のバラツキが比較的大きく、特に、プレートＰの比較的端部に位置する容器Ｗ内の溶液の菌体破砕率が比較的低い。これに対して、プレートＰを移動させながら超音波を照射する場合、プレートＰの各容器内の溶液の菌体破砕率の均一化を図ることができる。
【００６８】
図１７に、菌体破砕率の分布を示す。図１７には、プレートＰの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも９６である。表２に、移動の有無に応じた平均菌体破砕率および標準偏差を示す。
【表３】
【００６９】
図１７および表３から、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、平均菌体破砕率が増加するとともに分布のバラツキが抑制されることが理解される。
【００７０】
なお、超音波照射装置１０はタンパク質の凝集に用いてもよい。タンパク質に超音波を照射することにより、タンパク質の凝集が促進される。以下、図１８〜図２０を参照して超音波照射装置１０を用いたタンパク質の凝集について説明する。ここでは、タンパク質として卵白を用いる、卵白に超音波を照射すると、凝集が促進されて濁度が増加する。
【００７１】
ここでは、プレートＰとして９６個の容器Ｗを有するマイクロプレートを用い、プレートＰに各容器Ｗに２００μｌの卵白を入れる。卵白は同一の卵から得られたものであり、超音波照射前の白濁を防ぐために希釈していない。その後、各容器内の卵白の濁度を測定する。例えば、濁度の測定は、波長６００ｎｍの光を用いて測定部２０で行われる。測定部２０としてコロナ電気株式会社製のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−９０００が好適に用いられる。ここでは、濁度の平均は、１．２（１０ｍｍセルに換算した値）である。
【００７２】
その後、超音波照射装置１０は、超音波を照射している間にプレートＰを移動させる。例えば、プレートＰは回転し、その回転速度は６ｒｐｍである。ここでは、超音波照射装置１０は、２分間の超音波の照射を５回（合計１０分間）行う。温度は４０℃に設定されている。このように超音波を照射した後、測定部２０を用いて各容器内の濁度を同様に測定し、超音波照射の前後の濁度の変化量を求める。
【００７３】
図１８（ａ）に、超音波照射装置１０を用いて得られた濁度の変化量を示す。図１８（ａ）では、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示しており、第１行および第１２行の容器に卵白試料を入れていない。濁度の変化量は、超音波を照射する前の濁度を１として規格化した濁度変化量を示している。
【００７４】
また 図１８（ｂ）に、図１８（ａ）の変化量の割合を表した円グラフで示している。複数の容器のうちの半分以上の容器内の濁度変化量が２以上に増加していることが理解される。
【００７５】
参考のために、図１９を参照して、超音波照射装置１０において超音波を照射している際に、プレートＰを移動させない点を除いて、上述したのと同様に超音波照射前および後の濁度を測定した結果を説明する。図１９（ａ）に、プレートＰを移動させないで得られた濁度の変化量を示す。図１９（ａ）でも、第１行〜第１２行の容器をそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列の容器をそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示しており、第１行および第１２行の容器に卵白試料を入れていない。図１９（ｂ）に、図１９（ａ）の変化量の割合を表した円グラフで示している。複数の容器のうちの半分以上の容器内の濁度変化量は２未満であることが理解される。
【００７６】
図１８（ａ）、図１８（ｂ）と図１９（ａ）、図１９（ｂ）との比較から理解されるように、超音波照射装置１０が超音波を照射する際にプレートＰを移動させることにより、タンパク質の凝集効果を促進するとともにタンパク質の凝集の程度のばらつきを抑制することができる。
【００７７】
図２０に、プレートＰの移動の有無に応じた濁度分布を示す。試料数はいずれも８０である。表４に、移動の有無に応じた平均濁度増加率および標準偏差を示す。
【表４】
【００７８】
図２０および表４からも、超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、濁度増加率の平均が増加するとともに分布のバラツキが抑制されることが理解される。このように、超音波照射装置１０が超音波照射時にプレートＰを移動させることにより、タンパク質の凝集を促進させて濁度を増加させるとともに濁度のばらつきを抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、プレートの各サンプルにほぼ均一に超音波を照射することができる。例えば、本発明の超音波照射装置は、サンプル（溶液）の成分の違いに応じた超音波照射による影響を簡便に調べることができる。本発明の超音波照射装置は、細胞の破砕、混合物の懸濁化、固体の微粒子化、固体の溶解または反応の促進、アミロイド線維の形成促進、分断および微細化に好適に用いられる。
【符号の説明】
【００８０】
１０ 超音波照射装置
１２ 処理槽
１４ 超音波振動子
１６ 移動部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理槽と、
超音波振動子と、
互いに分離した状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器を有するプレートを前記処理槽内で移動させる移動部と
を備える、超音波照射装置。
【請求項２】
前記超音波振動子が超音波を発生させるときに前記移動部は前記プレートを移動させる、請求項１に記載の超音波照射装置。
【請求項３】
前記移動部は、前記プレートを平面方向に移動させる、請求項１または２に記載の超音波照射装置。
【請求項４】
前記移動部は、
スライド部と、
前記プレートを載せた状態で前記スライド部に沿って移動可能な支持部と
を有する、請求項１から３のいずれかに記載の超音波照射装置。
【請求項５】
前記移動部は、前記プレートを垂直方向に移動させる、請求項１から４のいずれかに記載の超音波照射装置。
【請求項６】
前記複数の容器のそれぞれは、遮光領域および透過領域を有する、請求項１から５のいずれかに記載の超音波照射装置。
【請求項７】
前記複数の容器のそれぞれは、前記遮光領域の設けられた側部と、前記透過領域の設けられた底部とを有する、請求項６に記載の超音波照射装置。
【請求項１】
処理槽と、
超音波振動子と、
互いに分離した状態で溶液を溜めることの可能な複数の容器を有するプレートを前記処理槽内で移動させる移動部と
を備える、超音波照射装置。
【請求項２】
前記超音波振動子が超音波を発生させるときに前記移動部は前記プレートを移動させる、請求項１に記載の超音波照射装置。
【請求項３】
前記移動部は、前記プレートを平面方向に移動させる、請求項１または２に記載の超音波照射装置。
【請求項４】
前記移動部は、
スライド部と、
前記プレートを載せた状態で前記スライド部に沿って移動可能な支持部と
を有する、請求項１から３のいずれかに記載の超音波照射装置。
【請求項５】
前記移動部は、前記プレートを垂直方向に移動させる、請求項１から４のいずれかに記載の超音波照射装置。
【請求項６】
前記複数の容器のそれぞれは、遮光領域および透過領域を有する、請求項１から５のいずれかに記載の超音波照射装置。
【請求項７】
前記複数の容器のそれぞれは、前記遮光領域の設けられた側部と、前記透過領域の設けられた底部とを有する、請求項６に記載の超音波照射装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１３−６０６（Ｐ２０１３−６０６Ａ）
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３０６２３（Ｐ２０１１−１３０６２３）
【出願日】平成２３年６月１０日（２０１１．６．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、近畿経済産業局、平成２２年度地域イノベーション創出研究開発事業「疾患に関わる蛋白質異常凝集体の高速誘導検出装置の研究開発」にかかる委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（３０２０５１０８３）エレコン科学株式会社 (6)
【出願人】（５９１０８４８２７）コロナ電気株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１０日（２０１１．６．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、近畿経済産業局、平成２２年度地域イノベーション創出研究開発事業「疾患に関わる蛋白質異常凝集体の高速誘導検出装置の研究開発」にかかる委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（３０２０５１０８３）エレコン科学株式会社 (6)
【出願人】（５９１０８４８２７）コロナ電気株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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