軟骨生成促進剤
【課題】骨の伸長の促進、関節炎等の治療、改善に有用な軟骨生成促進剤の提供。
【解決手段】II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分を含有する、就寝直前〜４時間前に投与するための軟骨生成促進剤。
【解決手段】II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分を含有する、就寝直前〜４時間前に投与するための軟骨生成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷、骨折などの軟骨及び骨疾患の治療及び／又は改善に有用な軟骨生成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の伸長は、成長板軟骨の細胞増殖、細胞外マトリックス合成、石灰化を経て起こる。また関節の健康又は再生には、関節軟骨のマトリックス合成が必要である。これら軟骨の細胞外マトリックス（extracellular matrix, ECM）の主成分は、II型コラーゲンとアグリカン（プロテオグリカン）であり、軟骨細胞によりII型コラーゲンとアグリカンコア蛋白遺伝子の発現、翻訳後修飾を経て大量に生合成され分泌される。かかる観点から、関節炎等の症状改善の目的で、これら軟骨の細胞外マトリックスの材料となる成分、例えばコンドロイチン硫酸やマンノーサミンを配合した健康食品や薬剤等が用いられている。
【非特許文献１】Nature, 195：82-83, 1962
【非特許文献２】Nature, 202：906-907, 1964
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の軟骨の生成を促進するための関節炎治療剤の有効性は低く、より有効な薬剤又は食品の開発が望まれている。
従って、本発明の目的は、骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷、骨折などの軟骨及び骨疾患の治療及び／又は改善に有用な軟骨生成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、サーカディアンリズム（概日リズム）、すなわち、ほとんどの生物が有する地球の自転周期にほぼ等しい内因性の約２４時間のリズムに着目した。血圧、体温、ホルモンなど多くの生体機能に日内変動が認められており、その遺伝子レベルでの解明が進みつつある。軟骨においても、コラーゲン合成、プロテオグリカン合成及び細胞分裂に概日リズムがあることが示唆されている（非特許文献１及び２）が、組織学的検討あるいは前駆体の取り込み実験が中心であり、定量的な評価が困難であり、さらに遺伝子レベルでの解析はなされておらず、しかも研究（論文）ごとに実験条件／動物が異なるために、コラーゲン合成、プロテオグリカン合成及び細胞分裂の概日リズムの位相を比較することができなかった。
そこで、本発明者は、同一条件で飼育したラットを用いて、軟骨成長板でコラーゲン合成、プロテオグリカン合成及び細胞分裂に関与する全遺伝子を含む概日リズム遺伝子を網羅的にかつ同時に解析した。その結果、軟骨成長板では、他の組織とは異なる独自の末梢時計系をもっており、II型コラーゲン及びその関連遺伝子、プロテオグリカン及びその関連遺伝子が概日リズムを有し、それらは同時間帯に遺伝子発現がピークとなることを見出した。そしてさらに検討したところ、II型コラーゲン関連遺伝子及びプロテオグリカン関連遺伝子の発現がピークになる時間帯に、II型コラーゲン及びプロテオグリカンの生合成原料となる成分が十分に高い血中濃度になるようにこれらの材料を投与すれば、軟骨の生成が顕著に促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分を含有する、就寝直前〜４時間前に投与するための軟骨生成促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の軟骨生成促進剤を就寝直前〜４時間前に投与すれば、II型コラーゲン生合成原料とプロテオグリカン生成分原料との両方が就寝後２時間後には十分に血中濃度が高くなっているため、軟骨のサーカディアンリズムにより、II型コラーゲンの生合成とプロテオグリカンの生合成が同時期に効率的に行なわれる結果、軟骨の生成が顕著に促進される。従って、本発明の軟骨生成促進剤によれば、骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷、骨折などの軟骨及び／又は骨疾患の症状を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の軟骨生成促進剤は、II型コラーゲン生合成原料成分とプロテオグリカン生合成原料成分とを含有するものである。軟骨を構成する細胞外マトリックスの主要成分は、II型コラーゲンとプロテオグリカンであり、これらの両者の生成が促進されてはじめて十分に軟骨の生成が促進される。そして、後記実施例に示すように、軟骨成長板におけるII型コラーゲン、プロリン水酸化酵素、リシルオキシダーゼ（コラーゲンの架橋に必要）とプロテオグリカンの遺伝子の発現のサーカディアンリズムは同調（同位相を示す）しているからである。さらに本発明は、成長板でのII型コラーゲンとアグリカン合成のリズムがこれまでの報告であったヒトで夜に成長する骨伸長のリズムとも合致していること、石灰化に関与する遺伝子であり、リン酸輸送体であるPit1とアンキローシス遺伝子もやや遅れた概日リズムをもつことから、カルシウムとリン酸をも同時に配合することにより、軟骨形成以後の石灰化をも支持できることを見出した。
【０００８】
II型コラーゲン生合成原料成分としては、グリシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸及び必須アミノ酸から選ばれるアミノ酸、ビタミンＣ又はその誘導体、鉄又は鉄化合物、α−ケトグルタル酸、コラーゲン並びにゼラチンから選ばれる成分が挙げられる。
【０００９】
このうち、前記アミノ酸はII型コラーゲンの主要構成アミノ酸であることから特に重要である。ここで必須アミノ酸には、バリン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンがある。ビタミンＣは、プロリンのヒドロキシル化に必要な還元剤である。ビタミンＣの誘導体としては、ビタミンＣのＣ1−Ｃ24脂肪酸エステル、ビタミンＣのリン酸エステル、ビタミンＣの金属塩等が挙げられる。鉄化合物としては、フマル酸第一鉄、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム等の二価鉄化合物が好ましい。鉄と、α−ケトグルタル酸はプロリンとリシンの水酸化に必要な化合物である。ゼラチンはコラーゲンの変成物質である。
【００１０】
これらのII型コラーゲン生合成原料成分のうち、プロリン及びビタミンＣ又はその誘導体を配合するのがより好ましく、さらにプロリン、ビタミンＣ又はその誘導体、ダルタミン酸及びアルギニンを配合するのが好ましく、特にプロリン、ビタミンＣ又はその誘導体、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン及び鉄化合物を配合するのが好ましい。
【００１１】
II型コラーゲン生合成原料成分は、合計量で本発明軟骨生成促進剤中に１〜８０質量％、特に１〜５０質量％含有するのが好ましい。
【００１２】
プロテオグリカン生合成原料成分としては、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、グルクロン酸、マンノース、マンノーサミン、キシロース及び硫酸化合物から選ばれる成分が挙げられる。ここで硫酸化合物としては、硫酸マグネシウム等の金属硫酸塩が挙げられる。
【００１３】
これらのプロテオグリカン生合成原料のうち、グルコサミンを配合するのが好ましく、さらにグルコサミン、グルクロン酸及びマンノーサミンを配合するのが好ましく、特にグルコサミン、グルクロン酸、マンノーサミン、キシロース、コンドロイチン硫酸及びグルコースを配合するのが好ましい。
【００１４】
プロテオグリカン生合成原料成分は、合計量で本発明軟骨生成促進剤中に１〜８０質量％、特に１〜５０質量％含有するのが好ましい。
【００１５】
本発明者の研究から、骨成長板のコラーゲン合成とプロテオグリカン合成は、骨成長の概日リズムとも同調しているので、骨成長に必要なカルシウム化合物、リン酸化合物、ビタミンＤ又はその誘導体、その他のビタミンを同時に配合してもよい。ここでカルシウム化合物としては、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等、またカキ殻、貝類等由来の貝カルシウム、甲殻類、藻類、哺乳動物の骨や卵の殻などを原料としたものが挙げられる。リン酸化合物としては、リン酸、リン酸塩などが挙げられる。ビタミンＤ誘導体としては、セオカルシトール、カルシポトリオール、カルシトリオール、タカルシトール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ファレカルシトール、活性型ビタミンＤ3等が挙げられる。その他のビタミンとしては、ビタミンＫが挙げられる。これらの成分のうち、カルシウム化合物は本発明軟骨生成促進剤中に１〜５０質量％、特に１〜２０質量％含有するのが好ましい。リン酸化合物は０．１〜２０質量％、特に０．１〜１０質量％含有するのが好ましい。ビタミンＤ又はその誘導体は、０．００００１〜１質量％、さらに０．００００１〜０．１質量％含有するのが好ましい。
【００１６】
また本発明軟骨生成促進剤中には、軟骨の生成促進に関与する成分、例えばヒアルロン酸、あるいは他の多糖類、タンパク質を含有させることができる。さらに、マグネシウム、銅、ヨウ素、マンガン、セレン、亜鉛、クロム、モリブデンなど他のミネラル、その他のビタミン、クエン酸、砂糖、麦芽糖、イノシトール、ソルビトール、ポリフェノール類、カフェイン、香味料、果汁などを配合することができる。
【００１７】
後記実施例に示すように、軟骨成長板においては、II型コラーゲン及びプロテオグリカンの生合成遺伝子のサーカディアンリズムが同調しており、ラットにおいては明るくなってから２時間後にピークになる。ラットは、夜行性であるから、ヒトにおけるこのピークは、就寝２時間後に相当する。従って、本発明軟骨生成促進剤は、軟骨成長板におけるII型コラーゲン及びプロテオグリカン遺伝子の発現に関するサーカディアンリズムがピークになる就寝２時間後に、II型コラーゲン生合成原料成分及びアグリカン生合成原料成分の血中濃度が十分高くなっているように投与される。就寝２時間後にこれらの成分の血中濃度が十分高くなっているには、本発明軟骨促進剤は、就寝直前〜４時間前に投与するのが望ましい。この投与スケジュールは、従来の通常の投与スケジュールである、食後３０分以内とは必ずしも一致しない。
【００１８】
本発明軟骨生成促進剤は、経口投与用剤、注射用剤、坐剤、外用剤でもよいが、経口投与用剤が好ましい。経口投与用剤としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤の他に、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤等の液体製剤を挙げることができる。
【００１９】
また、本発明軟骨生成促進剤の投与形態は、前記有効成分の両者が一つの製剤に含まれていてもよいし、２種の有効成分が同時期に高い血中濃度になればよいのであるから、各有効成分が各々別の製剤に含まれていてもよい。例えばII型コラーゲン生合成原料成分を含む錠剤と、アグリカン生合成原料成分を含有する錠剤との組み合せでもよい。
【００２０】
本発明軟骨生成促進剤は、医薬品として用いてもよく、健康食品、機能性食品、医薬部外品として用いてもよい。
【００２１】
本発明の軟骨生成促進剤は、前記有効成分に薬学的に許容される担体を配合し、前記各種製剤とすることができる。用いられる薬学的に許容される担体としては、例えば、結合剤、崩壊剤、溶解促進剤、滑沢剤、充填剤、賦形剤等を必要に応じて選択して用いることができる。
【００２２】
本発明軟骨生成促進剤は、II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分の合計量として、成人１日あたり０．１〜１５０ｇ、さらに０．３〜５０ｇを前記投与時期に投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら何ら限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
６週齢雄SDラットを明暗条件下（LD、明：１２時間、暗：１２時間）で２週間飼育後、LDあるいは恒暗 (DD) 条件下で連続４８時間、４時間おきにラット３匹を屠殺して肋軟骨成長板を採取し、トータルRNAを抽出した。次に、採取した全てのポイント(２４ポイント)の成長板RNAサンプルをDNAマイクロアレー(GeneChip Rat Expression Array 230A/B:Affymetrix) にかけ解析を行い概日リズムを示す遺伝子を網羅的に同定した。概日リズムの有無はLD、DD条件における各遺伝子のmRNAレベルでのコサインカーブとの一致率及びLD、DDでのリズムの一致率に基づいて判定した。
【００２５】
その結果、概日リズムをもつ遺伝子が２６４遺伝子同定され、そのうち既知の遺伝子が１０９、マウスやヒトとのホモロジーから同定されたものが７４、未知遺伝子が８１に分類された。これらの中には、時計遺伝子であるBmal1、Per2、Dec2などのほか、転写因子、成長因子、細胞周期、細胞外基質、細胞内伝達などに関連した遺伝子が概日リズムを示した。また、これらのリズム遺伝子をピークタイムにより分類すると、ZT14、つまり暗くなってから２時間が経過した時間帯に最も多くの遺伝子がピークを示した。この時間は夜行性のラットにとり行動を開始し始めた時間を示している。一方、DNAマイクロアレーにより同定された軟骨基質関連遺伝子であるProlyl-4-hydroxylase 1 (P4ha1), Lysyl oxidase (Lox), MT-MMP1はZT2（就寝開始時）に発現のピークを示した（図1）。ZT2は、安静時（ヒトでは夜、ラットで昼）を意味しており、骨が安静時に成長するという観察と一致している。
【００２６】
また、これらの遺伝子のなかで、分子時計系のコアフィードバックループを形成している数種類の時計遺伝子は、軟骨でも概日リズムを示した（図２）。しかし時計遺伝子以外では、軟骨の概日リズム遺伝子は、視交叉上核や肝臓の概日リズム遺伝子とはほとんど重複しなかった。つまり分子時計系は、各組織に共通であるものの、時計からのアウトプット遺伝子は組織特異的であることが示され、成長板では成長板独自の遺伝子が概日リズム発現していることが判明した。
【００２７】
（実施例２）
実施例１において同定された２６４個の概日リズム遺伝子のなかで、既知遺伝子であり、かつリアルタイムPCR (Q-PCR)のプライマーとプローブ情報があるものに対して、Taq Man Low Density Custom Arrays もしくはTaq Man Gene expression assays (Applied Biosystems) を用いて定量的リアルタイムPCRでリズムの再確認を行った。同時に、DNAマイクロアレーでは概日リズムがあるとは判定されなかったけれど、LDもしくはDDで日内変動を示しかつ軟骨の増殖、分化において重要な役割を果たしている遺伝子の概日リズムも定量的リアルタイムPCRで検討を行った。
【００２８】
その結果、DNAマイクロアレーの結果がリアルタイムPCRでも確認され、今回得られたDNAマイクロアレーの結果が信頼の高いものであることが示された（図２及び図３）。
【００２９】
さらにリアルタイムPCRにより軟骨特異的な遺伝子であるAggrecan, Collagen type II にもZT2をピークとする概日リズムをもつことが判明した（図４及び表１）。また、実施例１で前述したProlyl-4-hydroxylase 1 (P4ha1)、Lysyl oxidase (Lox)、MT-MMP1もリアルタイムPCRにおいてDNAマイクロアレーの結果同様ZT2をピークとする概日リズムが確認された。よって、これらの結果から、軟骨マトリックス合成の概日リズムは転写／転写後の段階で制禦されていることが明らかになるとともに、これらの軟骨基質合成系関連遺伝子のmRNAのピークがZT2に集中していることが判明した。
一方、Aggrecan、Collagen type IIの分解作用をもつTimp3（図５）、Timp4も概日リズムを示したが、これらはZT14にピークを示したことから、軟骨基質の合成系及び分解系のピークの位相は約１２時間のズレが生じていることが判明した。
【００３０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】DNAマイクロアレーによる、軟骨基質関連遺伝子（Prolyl-4-hydroxylase 1、Lysyl oxidase及びMT-MMP1）のリズム発現を示す図である。
【図２】成長板における時計遺伝子（Per2、DEC2、DBP、Cry1、Per3、DEC2、Rev-erbβ、Bmal1）のリズム発現を示す図である。
【図３】時計遺伝子を除く他の遺伝子（Gilz、PSD-Zip10、TEF、Thrd、lgfbp5、Tgfα、Slc39a1、Gadd45α）のリズム発現を示す図である。
【図４】軟骨基質関連遺伝子（Collagen typeII、Aggrecan、Prolyl-4-hydroxylase 1、Lysyl oxdase、MT-MMP1）のリアルタイムPCRにおけるリズム発現を示す図である。
【図５】Timp3のリズム発現を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷、骨折などの軟骨及び骨疾患の治療及び／又は改善に有用な軟骨生成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の伸長は、成長板軟骨の細胞増殖、細胞外マトリックス合成、石灰化を経て起こる。また関節の健康又は再生には、関節軟骨のマトリックス合成が必要である。これら軟骨の細胞外マトリックス（extracellular matrix, ECM）の主成分は、II型コラーゲンとアグリカン（プロテオグリカン）であり、軟骨細胞によりII型コラーゲンとアグリカンコア蛋白遺伝子の発現、翻訳後修飾を経て大量に生合成され分泌される。かかる観点から、関節炎等の症状改善の目的で、これら軟骨の細胞外マトリックスの材料となる成分、例えばコンドロイチン硫酸やマンノーサミンを配合した健康食品や薬剤等が用いられている。
【非特許文献１】Nature, 195：82-83, 1962
【非特許文献２】Nature, 202：906-907, 1964
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の軟骨の生成を促進するための関節炎治療剤の有効性は低く、より有効な薬剤又は食品の開発が望まれている。
従って、本発明の目的は、骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷、骨折などの軟骨及び骨疾患の治療及び／又は改善に有用な軟骨生成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、サーカディアンリズム（概日リズム）、すなわち、ほとんどの生物が有する地球の自転周期にほぼ等しい内因性の約２４時間のリズムに着目した。血圧、体温、ホルモンなど多くの生体機能に日内変動が認められており、その遺伝子レベルでの解明が進みつつある。軟骨においても、コラーゲン合成、プロテオグリカン合成及び細胞分裂に概日リズムがあることが示唆されている（非特許文献１及び２）が、組織学的検討あるいは前駆体の取り込み実験が中心であり、定量的な評価が困難であり、さらに遺伝子レベルでの解析はなされておらず、しかも研究（論文）ごとに実験条件／動物が異なるために、コラーゲン合成、プロテオグリカン合成及び細胞分裂の概日リズムの位相を比較することができなかった。
そこで、本発明者は、同一条件で飼育したラットを用いて、軟骨成長板でコラーゲン合成、プロテオグリカン合成及び細胞分裂に関与する全遺伝子を含む概日リズム遺伝子を網羅的にかつ同時に解析した。その結果、軟骨成長板では、他の組織とは異なる独自の末梢時計系をもっており、II型コラーゲン及びその関連遺伝子、プロテオグリカン及びその関連遺伝子が概日リズムを有し、それらは同時間帯に遺伝子発現がピークとなることを見出した。そしてさらに検討したところ、II型コラーゲン関連遺伝子及びプロテオグリカン関連遺伝子の発現がピークになる時間帯に、II型コラーゲン及びプロテオグリカンの生合成原料となる成分が十分に高い血中濃度になるようにこれらの材料を投与すれば、軟骨の生成が顕著に促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分を含有する、就寝直前〜４時間前に投与するための軟骨生成促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の軟骨生成促進剤を就寝直前〜４時間前に投与すれば、II型コラーゲン生合成原料とプロテオグリカン生成分原料との両方が就寝後２時間後には十分に血中濃度が高くなっているため、軟骨のサーカディアンリズムにより、II型コラーゲンの生合成とプロテオグリカンの生合成が同時期に効率的に行なわれる結果、軟骨の生成が顕著に促進される。従って、本発明の軟骨生成促進剤によれば、骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷、骨折などの軟骨及び／又は骨疾患の症状を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の軟骨生成促進剤は、II型コラーゲン生合成原料成分とプロテオグリカン生合成原料成分とを含有するものである。軟骨を構成する細胞外マトリックスの主要成分は、II型コラーゲンとプロテオグリカンであり、これらの両者の生成が促進されてはじめて十分に軟骨の生成が促進される。そして、後記実施例に示すように、軟骨成長板におけるII型コラーゲン、プロリン水酸化酵素、リシルオキシダーゼ（コラーゲンの架橋に必要）とプロテオグリカンの遺伝子の発現のサーカディアンリズムは同調（同位相を示す）しているからである。さらに本発明は、成長板でのII型コラーゲンとアグリカン合成のリズムがこれまでの報告であったヒトで夜に成長する骨伸長のリズムとも合致していること、石灰化に関与する遺伝子であり、リン酸輸送体であるPit1とアンキローシス遺伝子もやや遅れた概日リズムをもつことから、カルシウムとリン酸をも同時に配合することにより、軟骨形成以後の石灰化をも支持できることを見出した。
【０００８】
II型コラーゲン生合成原料成分としては、グリシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸及び必須アミノ酸から選ばれるアミノ酸、ビタミンＣ又はその誘導体、鉄又は鉄化合物、α−ケトグルタル酸、コラーゲン並びにゼラチンから選ばれる成分が挙げられる。
【０００９】
このうち、前記アミノ酸はII型コラーゲンの主要構成アミノ酸であることから特に重要である。ここで必須アミノ酸には、バリン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンがある。ビタミンＣは、プロリンのヒドロキシル化に必要な還元剤である。ビタミンＣの誘導体としては、ビタミンＣのＣ1−Ｃ24脂肪酸エステル、ビタミンＣのリン酸エステル、ビタミンＣの金属塩等が挙げられる。鉄化合物としては、フマル酸第一鉄、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム等の二価鉄化合物が好ましい。鉄と、α−ケトグルタル酸はプロリンとリシンの水酸化に必要な化合物である。ゼラチンはコラーゲンの変成物質である。
【００１０】
これらのII型コラーゲン生合成原料成分のうち、プロリン及びビタミンＣ又はその誘導体を配合するのがより好ましく、さらにプロリン、ビタミンＣ又はその誘導体、ダルタミン酸及びアルギニンを配合するのが好ましく、特にプロリン、ビタミンＣ又はその誘導体、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン及び鉄化合物を配合するのが好ましい。
【００１１】
II型コラーゲン生合成原料成分は、合計量で本発明軟骨生成促進剤中に１〜８０質量％、特に１〜５０質量％含有するのが好ましい。
【００１２】
プロテオグリカン生合成原料成分としては、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、グルクロン酸、マンノース、マンノーサミン、キシロース及び硫酸化合物から選ばれる成分が挙げられる。ここで硫酸化合物としては、硫酸マグネシウム等の金属硫酸塩が挙げられる。
【００１３】
これらのプロテオグリカン生合成原料のうち、グルコサミンを配合するのが好ましく、さらにグルコサミン、グルクロン酸及びマンノーサミンを配合するのが好ましく、特にグルコサミン、グルクロン酸、マンノーサミン、キシロース、コンドロイチン硫酸及びグルコースを配合するのが好ましい。
【００１４】
プロテオグリカン生合成原料成分は、合計量で本発明軟骨生成促進剤中に１〜８０質量％、特に１〜５０質量％含有するのが好ましい。
【００１５】
本発明者の研究から、骨成長板のコラーゲン合成とプロテオグリカン合成は、骨成長の概日リズムとも同調しているので、骨成長に必要なカルシウム化合物、リン酸化合物、ビタミンＤ又はその誘導体、その他のビタミンを同時に配合してもよい。ここでカルシウム化合物としては、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等、またカキ殻、貝類等由来の貝カルシウム、甲殻類、藻類、哺乳動物の骨や卵の殻などを原料としたものが挙げられる。リン酸化合物としては、リン酸、リン酸塩などが挙げられる。ビタミンＤ誘導体としては、セオカルシトール、カルシポトリオール、カルシトリオール、タカルシトール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ファレカルシトール、活性型ビタミンＤ3等が挙げられる。その他のビタミンとしては、ビタミンＫが挙げられる。これらの成分のうち、カルシウム化合物は本発明軟骨生成促進剤中に１〜５０質量％、特に１〜２０質量％含有するのが好ましい。リン酸化合物は０．１〜２０質量％、特に０．１〜１０質量％含有するのが好ましい。ビタミンＤ又はその誘導体は、０．００００１〜１質量％、さらに０．００００１〜０．１質量％含有するのが好ましい。
【００１６】
また本発明軟骨生成促進剤中には、軟骨の生成促進に関与する成分、例えばヒアルロン酸、あるいは他の多糖類、タンパク質を含有させることができる。さらに、マグネシウム、銅、ヨウ素、マンガン、セレン、亜鉛、クロム、モリブデンなど他のミネラル、その他のビタミン、クエン酸、砂糖、麦芽糖、イノシトール、ソルビトール、ポリフェノール類、カフェイン、香味料、果汁などを配合することができる。
【００１７】
後記実施例に示すように、軟骨成長板においては、II型コラーゲン及びプロテオグリカンの生合成遺伝子のサーカディアンリズムが同調しており、ラットにおいては明るくなってから２時間後にピークになる。ラットは、夜行性であるから、ヒトにおけるこのピークは、就寝２時間後に相当する。従って、本発明軟骨生成促進剤は、軟骨成長板におけるII型コラーゲン及びプロテオグリカン遺伝子の発現に関するサーカディアンリズムがピークになる就寝２時間後に、II型コラーゲン生合成原料成分及びアグリカン生合成原料成分の血中濃度が十分高くなっているように投与される。就寝２時間後にこれらの成分の血中濃度が十分高くなっているには、本発明軟骨促進剤は、就寝直前〜４時間前に投与するのが望ましい。この投与スケジュールは、従来の通常の投与スケジュールである、食後３０分以内とは必ずしも一致しない。
【００１８】
本発明軟骨生成促進剤は、経口投与用剤、注射用剤、坐剤、外用剤でもよいが、経口投与用剤が好ましい。経口投与用剤としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤の他に、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤等の液体製剤を挙げることができる。
【００１９】
また、本発明軟骨生成促進剤の投与形態は、前記有効成分の両者が一つの製剤に含まれていてもよいし、２種の有効成分が同時期に高い血中濃度になればよいのであるから、各有効成分が各々別の製剤に含まれていてもよい。例えばII型コラーゲン生合成原料成分を含む錠剤と、アグリカン生合成原料成分を含有する錠剤との組み合せでもよい。
【００２０】
本発明軟骨生成促進剤は、医薬品として用いてもよく、健康食品、機能性食品、医薬部外品として用いてもよい。
【００２１】
本発明の軟骨生成促進剤は、前記有効成分に薬学的に許容される担体を配合し、前記各種製剤とすることができる。用いられる薬学的に許容される担体としては、例えば、結合剤、崩壊剤、溶解促進剤、滑沢剤、充填剤、賦形剤等を必要に応じて選択して用いることができる。
【００２２】
本発明軟骨生成促進剤は、II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分の合計量として、成人１日あたり０．１〜１５０ｇ、さらに０．３〜５０ｇを前記投与時期に投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら何ら限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
６週齢雄SDラットを明暗条件下（LD、明：１２時間、暗：１２時間）で２週間飼育後、LDあるいは恒暗 (DD) 条件下で連続４８時間、４時間おきにラット３匹を屠殺して肋軟骨成長板を採取し、トータルRNAを抽出した。次に、採取した全てのポイント(２４ポイント)の成長板RNAサンプルをDNAマイクロアレー(GeneChip Rat Expression Array 230A/B:Affymetrix) にかけ解析を行い概日リズムを示す遺伝子を網羅的に同定した。概日リズムの有無はLD、DD条件における各遺伝子のmRNAレベルでのコサインカーブとの一致率及びLD、DDでのリズムの一致率に基づいて判定した。
【００２５】
その結果、概日リズムをもつ遺伝子が２６４遺伝子同定され、そのうち既知の遺伝子が１０９、マウスやヒトとのホモロジーから同定されたものが７４、未知遺伝子が８１に分類された。これらの中には、時計遺伝子であるBmal1、Per2、Dec2などのほか、転写因子、成長因子、細胞周期、細胞外基質、細胞内伝達などに関連した遺伝子が概日リズムを示した。また、これらのリズム遺伝子をピークタイムにより分類すると、ZT14、つまり暗くなってから２時間が経過した時間帯に最も多くの遺伝子がピークを示した。この時間は夜行性のラットにとり行動を開始し始めた時間を示している。一方、DNAマイクロアレーにより同定された軟骨基質関連遺伝子であるProlyl-4-hydroxylase 1 (P4ha1), Lysyl oxidase (Lox), MT-MMP1はZT2（就寝開始時）に発現のピークを示した（図1）。ZT2は、安静時（ヒトでは夜、ラットで昼）を意味しており、骨が安静時に成長するという観察と一致している。
【００２６】
また、これらの遺伝子のなかで、分子時計系のコアフィードバックループを形成している数種類の時計遺伝子は、軟骨でも概日リズムを示した（図２）。しかし時計遺伝子以外では、軟骨の概日リズム遺伝子は、視交叉上核や肝臓の概日リズム遺伝子とはほとんど重複しなかった。つまり分子時計系は、各組織に共通であるものの、時計からのアウトプット遺伝子は組織特異的であることが示され、成長板では成長板独自の遺伝子が概日リズム発現していることが判明した。
【００２７】
（実施例２）
実施例１において同定された２６４個の概日リズム遺伝子のなかで、既知遺伝子であり、かつリアルタイムPCR (Q-PCR)のプライマーとプローブ情報があるものに対して、Taq Man Low Density Custom Arrays もしくはTaq Man Gene expression assays (Applied Biosystems) を用いて定量的リアルタイムPCRでリズムの再確認を行った。同時に、DNAマイクロアレーでは概日リズムがあるとは判定されなかったけれど、LDもしくはDDで日内変動を示しかつ軟骨の増殖、分化において重要な役割を果たしている遺伝子の概日リズムも定量的リアルタイムPCRで検討を行った。
【００２８】
その結果、DNAマイクロアレーの結果がリアルタイムPCRでも確認され、今回得られたDNAマイクロアレーの結果が信頼の高いものであることが示された（図２及び図３）。
【００２９】
さらにリアルタイムPCRにより軟骨特異的な遺伝子であるAggrecan, Collagen type II にもZT2をピークとする概日リズムをもつことが判明した（図４及び表１）。また、実施例１で前述したProlyl-4-hydroxylase 1 (P4ha1)、Lysyl oxidase (Lox)、MT-MMP1もリアルタイムPCRにおいてDNAマイクロアレーの結果同様ZT2をピークとする概日リズムが確認された。よって、これらの結果から、軟骨マトリックス合成の概日リズムは転写／転写後の段階で制禦されていることが明らかになるとともに、これらの軟骨基質合成系関連遺伝子のmRNAのピークがZT2に集中していることが判明した。
一方、Aggrecan、Collagen type IIの分解作用をもつTimp3（図５）、Timp4も概日リズムを示したが、これらはZT14にピークを示したことから、軟骨基質の合成系及び分解系のピークの位相は約１２時間のズレが生じていることが判明した。
【００３０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】DNAマイクロアレーによる、軟骨基質関連遺伝子（Prolyl-4-hydroxylase 1、Lysyl oxidase及びMT-MMP1）のリズム発現を示す図である。
【図２】成長板における時計遺伝子（Per2、DEC2、DBP、Cry1、Per3、DEC2、Rev-erbβ、Bmal1）のリズム発現を示す図である。
【図３】時計遺伝子を除く他の遺伝子（Gilz、PSD-Zip10、TEF、Thrd、lgfbp5、Tgfα、Slc39a1、Gadd45α）のリズム発現を示す図である。
【図４】軟骨基質関連遺伝子（Collagen typeII、Aggrecan、Prolyl-4-hydroxylase 1、Lysyl oxdase、MT-MMP1）のリアルタイムPCRにおけるリズム発現を示す図である。
【図５】Timp3のリズム発現を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分を含有する、就寝直前〜４時間前に投与するための軟骨生成促進剤。
【請求項２】
II型コラーゲン生合成原料成分が、グリシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸及び必須アミノ酸から選ばれるアミノ酸、ビタミンＣ又はその誘導体、鉄又は鉄化合物、α−ケトグルタル酸、コラーゲン、並びにゼラチンから選ばれる成分である請求項１記載の軟骨生成促進剤。
【請求項３】
プロテオグリカン生合成原料成分が、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、グルクロン酸、マンノース、マンノーサミン、キシロース及び硫酸化合物から選ばれる成分である請求項１又は２記載の軟骨生成促進剤。
【請求項４】
さらに、リン酸化合物、カルシウム化合物、ビタミンＤ及びその誘導体から選ばれる成分を含有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の軟骨生成促進剤。
【請求項５】
経口投与用剤である請求項１〜４のいずれか１項記載の軟骨生成促進剤。
【請求項６】
骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷及び骨折から選ばれる軟骨及び／又は骨疾患の症状を改善するためのものである請求項１〜５のいずれか１項記載の軟骨生成促進剤。
【請求項１】
II型コラーゲン生合成原料成分及びプロテオグリカン生合成原料成分を含有する、就寝直前〜４時間前に投与するための軟骨生成促進剤。
【請求項２】
II型コラーゲン生合成原料成分が、グリシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸及び必須アミノ酸から選ばれるアミノ酸、ビタミンＣ又はその誘導体、鉄又は鉄化合物、α−ケトグルタル酸、コラーゲン、並びにゼラチンから選ばれる成分である請求項１記載の軟骨生成促進剤。
【請求項３】
プロテオグリカン生合成原料成分が、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、グルクロン酸、マンノース、マンノーサミン、キシロース及び硫酸化合物から選ばれる成分である請求項１又は２記載の軟骨生成促進剤。
【請求項４】
さらに、リン酸化合物、カルシウム化合物、ビタミンＤ及びその誘導体から選ばれる成分を含有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の軟骨生成促進剤。
【請求項５】
経口投与用剤である請求項１〜４のいずれか１項記載の軟骨生成促進剤。
【請求項６】
骨の伸長障害、関節症、関節炎、軟骨外傷及び骨折から選ばれる軟骨及び／又は骨疾患の症状を改善するためのものである請求項１〜５のいずれか１項記載の軟骨生成促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−１６１６８８（Ｐ２００７−１６１６８８Ａ）
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６３７９３（Ｐ２００５−３６３７９３）
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年６月２０日 日本骨代謝学会事務局発行の「第２３回日本骨代謝学会学術集会プログラム抄録集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１１月２５日 第２８回日本分子生物学会年会組織委員会発行の「第２８回日本分子生物学会年会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０３３２８１９３）株式会社ツーセル (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年６月２０日 日本骨代謝学会事務局発行の「第２３回日本骨代謝学会学術集会プログラム抄録集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１１月２５日 第２８回日本分子生物学会年会組織委員会発行の「第２８回日本分子生物学会年会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０３３２８１９３）株式会社ツーセル (24)
【Ｆターム（参考）】
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