造血系疾患の治療用製剤
本発明は、滑膜細胞蛋白質として単離が報告されているシノビリオンおよびその遺伝子を有効成分とした造血系疾患の治療用製剤および当該蛋白質またはポリヌクレオチドを投与することを含む治療方法等を提供する。さらには、本発明は、シノビオリンをホモで欠損した動物および該動物由来の細胞を造血系疾患のモデルとして提供するとともに、本モデルを用いた造血系疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、滑膜細胞蛋白質として単離されたシノビリオンおよびその遺伝子の利用に関し、具体的には造血系疾患の治療用製剤および治療方法等への利用に関する。
【背景技術】
小胞体（ＥＲ）における蛋白質の品質管理、および核における蛋白質量の転写調節は、細胞の恒常性を維持する重要な過程である（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｙ．２００２．ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：４７６−４８２．）。真核細胞では、新たに合成される蛋白質はＥＲに輸送され、そこで正しくフォールディングされる。しかし、大量の蛋白質がＥＲに流入するなどの様々な環境条件により、この問題を克服するため、蛋白質のアンフォールディング応答（ＵＲＰ）と称される細胞応答が引き起こされる（Ｗｅｌｉｈｉｎｄａ，Ａ．Ａ．，Ｔｉｒａｓｏｐｈｏｎ，Ｗ．，ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．１９９９．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．７：２９３−３００．）。ＵＲＰ応答中は、真核生物開始因子（ｅＩＦ）２αの不活化により新たな蛋白質の合成が全体的に阻害されて、ＥＲではミスフォールディングした蛋白質のさらなる蓄積が減少し、またＢｉｐ／Ｇｒｐ７８およびＧｒｐ９４を含むＥＲシャペロン蛋白質をコードする遺伝子が上方制御されて、ミスフォールディングした蛋白質が正しくリフォールディングされる（Ｒｏｎ，Ｄ．２００２．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１３８３−１３８８．）。ＵＲＰにもかかわらず、ミスフォールディングした蛋白質の量が蛋白質のフォールディング能力を超える場合には、ミスフォールディングした蛋白質は、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）として知られるユビキチンおよびプロテアソーム依存性分解過程により除去されなければならない（前掲Ｈａｍｐｔｏｎ，２００２）。ＥＲ内のミスフォールディングした蛋白質はサイトゾルに移行し、そこでユビキチンリガーゼ酵素により２６Ｓプロテアソームの標的とされる。哺乳動物細胞のＥＲＡＤ系においては、ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０のＣ末端相互作用蛋白質）（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｈｕ，Ｚ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｙｉｎ，Ｌ．Ｙ．，ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．１９９９．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＨＩＰ，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：４５３５−４５４５．；Ｍｅａｃｈａｍ，Ｇ．Ｃ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｙｏｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｃｙｒ，Ｄ．Ｍ．２００１．Ｔｈｅ Ｈｓｃ７０ ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＣＨＩＰ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｍｍａｔｕｒｅ ＣＦＴＲ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：１００−１０５．；Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｎ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．２００１．Ａｎ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｗｈｉｃｈ Ｃａｎ Ｌｅａｄ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｔｒｅｓｓ，Ｉｓ ａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎ．Ｃｅｌｌ １０５：８９１−９０２）、パーキン（Ｉｍ Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｓ．，Ａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｈａｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．Ｉ．，ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．２００２．ＣＨＩＰ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎ，ａ ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｔｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：５５−６７）、ｇｐ７８／ＡＭＦＲ（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．，Ｔａｎｉ，Ｍ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｎａｇａｍａｃｈｉ，Ｙ．，Ｎｉｉｎａｋａ，Ｙ．，Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｏｈｗａｄａ，Ｓ．，Ｒａｚ，Ａ．，ａｎｄ Ｙｏｋｏｔａ，Ｊ．１９９９．Ｔｈｅ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５６：２９５−３００．；Ｆａｎｇ，Ｓ．，Ｆｅｒｒｏｎｅ，Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｔｉｗａｒｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ａ．Ｍ．２００１．Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｇｐ７８，ｉｓ ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４４２２−１４４２７）、およびＦｂｘ２／ＦＢＧ１／ＮＦＢ４２（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｃｈｉｂａ，Ｔ．，Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｆ．，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｉｗａｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔａｉ，Ｔ．２００２．Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４１８：４３８−４４２）を含む様々なユビキチンリガーゼが報告されており、ＥＲにおいてＥＲＡＤ系を制御する正確な機構を決定するため現在詳細な研究が行われている。
ＥＲＡＤ系は、産生されるミスフォールディングした蛋白質の量を除去するため、細胞増殖中、恒常的に機能することが報告されている （Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｐａｔｉｌ，Ｃ．Ｋ．，Ｗｏｄｉｃｋａ，Ｌ．，Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．２０００．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １０１：２４９−２５８．）。最近の研究により、ＵＰＲおよび／またはＥＲＡＤ系の機能破壊が、ＥＲにおける適切な蛋白質フォールディングを妨げることが知られている（Ｌｅｅ，Ａ．Ｓ．２００１．Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：５０４−５１０．）あるＥＲストレス誘導性化学物質で処理した細胞のカスパーゼ依存性アポトーシスを亢進し得ることが示された（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．，Ｚｈｕ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｅ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ Ｙｕａｎ，Ｊ．２０００．Ｃａｓｐａｓｅ−１２ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ−ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ．Ｎａｔｕｒｅ ４０３：９８−１０３．）。これらの結果は、ＥＲＡＤ系の破壊に起因するある種のヒト疾患の分子論的病原機構を説明し得る。例えば、伸長したポリグルタミンの産生によりある遺伝性神経変性障害が生じ（Ｊａｎａ，Ｎ．Ｒ．，Ｚｅｍｓｋｏｖ，Ｅ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．ｈ．，ａｎｄ Ｎｕｋｉｎａ，Ｎ．２００１．Ａｌｔｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｅｘｐａｎｄｅｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｃａｓｐａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１０４９−１０５９．；Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．，Ｓａｍｐａｔ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｋｏｐｉｔｏ，Ｒ．Ｒ．２００１．Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５５２−１５５５．；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．， Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｎａｋａｄａｔｅ，Ｋ．，Ｏｈｓａｗａ，Ｙ．，Ｋａｍｅｉ，Ｙ．，Ｐｏｐｉｅｌ，Ａ．Ｈ．，Ｓｉｎｏｈａｒａ，Ａ．，Ｉｗａｍａｔｓｕ，Ａ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｈｏｒｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋａｋｉｚｕｋａ，Ａ．２００１．ＶＣＰ／ｐ９７ ｉｎ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．８：９７７−９８４．）、またはＥＲＡＤ系の有名なユビキチンリガーゼ蛋白質であるパーキン遺伝子の変異は、常染色体劣性若年性パーキンソニズム（ＡＲ−ＪＰ）を有する患者において黒質の神経細胞死を生じると考えられている（Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．２０００．Ｐａｒｋｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３５６６１−３５６６４．）。これらの知見は、生理的および病的状態での細胞生存におけるＥＲＡＤ系の重要性を強調するものである。
最近、我々は、抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングにより、ＲＩＮＧ−Ｈ２モチーフを有するＥＲ常在性膜蛋白質である酵母ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｌ３（Ｂａｙｓ，Ｎ．Ｗ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｅｅｌｉｇ，Ｌ．Ｐ．，Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｙ．２００１．Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｒ３ｐ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２４−２９．）のヒト相同体であるシノビオリン／ＨＲＤ１（以下、略して「シノビオリン」という）をクローニングした。
上述の通り抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングから得られたということは、シノビオリンが関節リウマチ（以下、「ＲＡ」と略す）の発症に深く関与することを示唆するものである。また、実際に変形性関節症患者の滑膜組織ではシノビオリンはほとんど発現していないにもかかわらず、ＲＡ患者の滑膜組織では強く発現していることが明らかとなっている。また、このシノビオリン遺伝子を過剰発現させたマウスでは滑膜増生、骨・軟骨破壊を伴うリウマチ様症状を呈することも報告されており、シノビオリンとＲＡの関与を裏付ける結果となっている。
一方、シノビオリンのｙｅａｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇのＨｒｄ１ｐは、虚血、低酸素、熱ショック、アミノ酸飢餓、ウイルス感染、小胞体内腔のカルシウム濃度低下などといったストレスにより小胞体内で生じ蓄積した異常構造蛋白質を除去し、小胞体の破綻を回避する分子の１つとして知られている。この小胞体ストレス応答機構としては、▲１▼小胞体内シャペロン分子やフォールディング酵素の転写誘導、▲２▼蛋白質の翻訳抑制、▲３▼ユビキチン・プロテアソーム系による異常蛋白質の積極的分解の３つがあり、通常▲１▼▲２▼をあわせてＵＰＲ（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、▲３▼をＥＲＡＤ（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）と呼び、ｙｅａｓｔ Ｈｒｄ１ｐは▲３▼のＥＲＡＤに関与する。このような危機管理機構であるＵＰＲやＥＲＡＤをもっても対処できない過度のストレスを受けると、細胞は自らアポトーシスを選ぶこととなり、またＥＲＡＤの破綻も同様にしてアポトーシスを誘導する結果となる。
同様にシノビオリンは、Ｅ３活性を持つこと、また細胞内においてはＥＲで発現がみられることから、ｙｅａｓｔ Ｈｒｄ１ｐと同様にＥＲＡＤに関与し小胞体ストレス応答機構の一端を担っている。
【発明の開示】
本願発明者らは上述のように小胞体ストレス応答機構のうちＥＲＡＤに関与し、品質管理リガーゼとして機能していると考えられているシノビオリンのノックアウトマウスを作成し、その生体内における機能を解明することを試みた。
解析の結果、シノビオリンノックアウトマウスはＥ１２．５−Ｅ１３．５で胎生致死となった。この原因を探るために胎仔の組織を詳細に調べたところ、肝臓でのアポトーシスが亢進し、これにより細胞密度低下が起こっていることが明らかとなった。数多く存在するユビキチンリガーゼの１つであるシノビオリンの機能を欠損させることが、マウスの発生段階における致死性をもたらしたことは非常に驚くべきことであり、このことはこれまでに予期することのなかった全く新しい知見となった。そこで、このシノビオリンノックアウトマウスについてさらなる検討を進めた結果、このマウスでは造血系において異常が認められ、またマクロファージが活性化され血球貪食が増加していることが明らかとなった。つまり、シノビオリンノックアウトマウスで亢進したアポトーシスは、その結果の１つとして赤芽球分化異常をもたらし、これにより増加した異常な赤芽球を排除するためにマクロファージが活性化され、血球数の減少により貧血を引き起こし、この時期に致死となることが証明された。またこのアポトーシスの亢進は胎仔由来の線維芽細胞（以下「ＭＥＦｓ」と略す）を用いた検討から、予測した通り小胞体ストレスによって誘導されたものであることも明らかとなっている。この結果は、換言すればマウスの発生において小胞体ストレスが二次造血の場で強く負荷されていることを示唆するものであり、またＥＲＡＤの破綻がマウスへの致死性をもたらすというこれまでにない全く新しい知見となっている。また先に述べたように、ＥＲＡＤにおいてはユビキチンリガーゼのなかでもこのシノビオリンという因子が特に重要な役割を果たすことが本研究によりはじめて明らかとなった。
これまでに我々はＲＡの発症にシノビオリンが関与するという報告もしており、ＥＲＡＤにおいて主要な役割を担っているシノビオリンの機能を標的とすることで、この疾患への治療が可能になるものと考えられる。また造血系疾患およびＲＡのみならず、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスに関連した疾患への治療などといった効果も予測され、本研究が新たな創薬開発への足がかりとなることが期待される。
上記知見に基づき本発明は、以下に示す造血系疾患の治療用薬剤および治療方法、さらには造血系疾患の治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。
［１］以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
［２］造血系疾患が、赤芽球の分化異常に起因する疾患である上記［１］に記載の方法。
［３］前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクターを、造血幹細胞に導入する工程を含む、上記［１］に記載の方法。
［４］造血幹細胞において、以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質を発現させる工程を含む、赤芽球を分化させるための方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
［５］以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、造血系疾患の治療用医薬製剤。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
［６］前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持した造血幹細胞である、上記［５］に記載の医薬製剤。
［７］配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
［８］配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を有効成分として含有する、造血系疾患の治療剤。
［９］シノビオリン遺伝子機能が欠損している、造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１０］非ヒト動物がげっ歯目動物である、上記［９］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１１］げっ歯目動物がマウスである、上記［１０］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１２］１３．５日齢以前の胎仔である、上記［１１］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１３］造血系疾患が赤芽球の分化異常に起因する疾患である、上記［９］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物。
［１４］上記［９］から［１３］のいずれかに記載の造血系疾患モデル動物胎仔由来の造血系疾患モデル細胞。
［１５］線維芽細胞である、上記［１４］記載の造血系疾患モデル細胞。
［１６］シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔に被験物質を投与し、該非ヒト動物胎仔における赤芽球の状態を評価する、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
［１７］以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または当該胎仔由来細胞にＥＲストレス誘導剤を投与または接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる工程、
（ｃ）前記非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
［１８］以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ＥＲストレス除去剤のスクリーニング方法。
（ａ）内在シノビオリン遺伝子機能が欠損している細胞にＥＲストレス誘導剤を作用させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｃ）前記細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する
本発明は第一に、シノビオリン蛋白質またはそれをコードしたポリヌクレオチドを利用した造血系疾患の治療方法を提供する。シノビオリンノックアウトマウスを用いた研究からシノビオリンが造血、特に赤芽球の分化過程に関与することが示されている。そのため本発明の方法は、造血系疾患、特に赤芽球の分化過程の異常が原因となる疾患、例えば、貧血の有効な治療方法となり得る。
本発明の方法に用いることができるシノビオリン蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を先ず挙げることができる。この蛋白質は、配列番号：１に示す塩基配列の蛋白質コード領域にコードされる。シノビオリンをコードするポリヌクレオチドは、公知の方法によりクローニングすることができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００，１９８８）。シノビオリンはＲＡ患者の滑膜細胞において強く発現していることを本願発明者が見出していることから、ＲＡ患者の関節炎を発症した組織に由来する滑膜細胞から抽出したｍＲＮＡをもとに得られたｃＤＮＡライブラリーから（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，７５８３，１９８８）、配列番号：１に示した塩基配列に基づいて設定したプローブを用いて、ハイブリダイズするクローンをスクリーニングすることによってシノビオリン遺伝子を単離することができる。シノビオリン蛋白質は、ＲＡ患者の滑膜細胞からシノビオリン抗体やリガンド（ＳＬ（Ｓ１−５）など）などのシノビオリンと親和性を有する物質（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１２０−１２８，１９９５；Ｈｅｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４，１９３−１９８，１９９６；Ｉｋｅｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５，５９０−５９２，１９９６；Ｋａｔｓａｎｉｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０６，６６−７２，２０００；Ｇｉｌｔａｙ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１８，４６９−４８０，１９９９；Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，１９９−２０２，１９９９）を用いて単離・精製してもよく、また、配列番号１記載の塩基配列を発現ベクターなどに接続し、適当な宿主細胞内で発現させることにより合成してもよい。
また、本発明では上述した配列番号２に記載の配列からなるシノビリオン蛋白質に限定されず、これと機能的に同等な蛋白質も含まれる。シノビオリン蛋白質の機能として、本発明ではＥＲストレスによる造血系細胞のアポトーシスを回避させ得る機能を有していればよい。
シノビオリンと機能的に同等な蛋白質としては、（１）上述した配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質、（２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされた蛋白質、（３）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされた蛋白質、が挙げられる。
これらシノビオリンと機能的に同等な蛋白質と配列番号２に記載のシノビオリン蛋白質との間の非相同なアミノ酸の数は、一般的には５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であると考えられる。
シノビオリンと機能的に同等な蛋白質を得るためにアミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとの蛋白質の活性が維持されやすいと考えられる。保存的置換は、蛋白質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換により蛋白質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型蛋白質などを含む）または下降させることも考えられる。活性が低下しても造血系細胞におけるアポトーシスをレスキューし得る活性を有する限り、機能的に同等な蛋白質に含まれる。
シノビオリンと機能的に同等な蛋白質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：１に示すような本発明によるシノビオリンをコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離する。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離される蛋白質にはシノビオリンと機能的に同等な蛋白質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば７０％以上、望ましくは９０％以上の同一性を示すことができる。
上記ストリンジェントな条件とは、具体的には例えば６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、５５℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるシノビオリンのホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ウサギ、ブタ、あるいはヤギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするシノビオリンのホモログは、本発明における機能的に同等な蛋白質を構成する。
実際に本発明者らは、本発明のシノビオリン遺伝子を複数の個体からクローニングし、その塩基配列を決定することによって、１アミノ酸を欠失したクローンを得ている。このようなアミノ酸配列に変異を含む蛋白質、並びにそれをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明にシノビオリンと機能的に同等な蛋白質またはこれをコードしたポリヌクレオチドに含まれる。なお、本発明者らが確認した１アミノ酸を欠失したクローンの塩基配列を配列番号：３に、そしてこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：４に示した。配列番号：３の塩基配列は、配列番号：１における１２９３−１２９５に相当するｇｃａを欠損している。その結果、配列番号：４に記載のアミノ酸配列は、配列番号：２における４１２位のＡｌａを欠損している。
ヒトシノビオリン（配列番号：２）に変異を導入して得た蛋白質や、上記のようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、通常、ヒトシノビオリン（配列番号：２）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のウェブサイトの相同性検索（Ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）のページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ］。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えばＮＣＢＩのホームページのウェブサイトのＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．＆ Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９６，２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３３８９−３４０２）］。
例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ２．１におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムにｂｌａｓｔｐを用い、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０、Ｆｉｌｔｅｒは全てＯＦＦにして、ＭａｔｒｉｘにＢＬＯＳＵＭ６２を用い、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ、およびＬａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１、０．８５（デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の値（％）を得ることができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）。
上述したシノビオリンと機能的に同等な蛋白質が、実際にシノビオリンと同等な機能を有するかを確認する方法としては、本願実施例に示す相補実験が挙げられる。具体的には、シノビオリンホモノックアウト胎仔由来のＭＥＦｓをＥＲストレス剤で処理し、上述した機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを投与し、ＥＲストレス剤によるアポトーシス誘導が抑制されるかを指標として、機能的に同等であるかを確認することができる。
本発明の造血系疾患の治療方法では、シノビオリンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを用いることができる。ポリヌクレオチドは、その由来を問わない。すなわち、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのほか、合成によって得ることもできる。上記ポリヌクレオチドを治療に用いる場合、遺伝子治療用ベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどに組み込んでもよい。
これらの蛋白質またはポリヌクレオチドを用いて造血系疾患の治療を行う場合、上記蛋白質またはポリヌクレオチドを直接患者に投与しもよいが、好ましくはポリヌクレオチドを造血幹細胞へ導入し、ポリヌクレオチドを安定に保持した造血幹細胞を選択して患者に移植することである。造血幹細胞へのポリヌクレオチドの導入の際、ポリヌクレオチドは上述のように遺伝子治療用ベクターなどに保持させてもよい。
また、これら蛋白質またはポリヌクレオチドを用いて造血系疾患の治療を行う場合、上記蛋白質またはポリヌクレオチドをそのまま用いる他、公知の製剤学的方法により製剤化して医薬製剤として用いもよい。
医薬製剤化の際、上述したポリヌクレオチドや蛋白質などの有効成分以外に適宜他の溶質や溶媒と組み合わせることができる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。化合物の含有率は適宜決定すればよい。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、経口投与、関節内注入、その他の当業者に公知の方法により行いうる。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の有効血中濃度や代謝時間により異なるが、１日の維持量として約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。投与は１回から数回に分けて行うことができる。
また、上述したシノビオリンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードしたポリヌクレオチドが導入された造血幹細胞を医薬製剤としてもよい。造血幹細胞を得るには、骨髄または他の造血源から多能性のヒト幹細胞を単離することが必要である。まず、骨髄細胞は骨髄源、例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔（ｂｏｎｅ ｃａｖｉｔｙ）から得ることができる。造血幹細胞の他の入手源は胚卵黄包、胎児肝臓、胎児及び成人の脾臓、成人末梢血液及び臍帯血をはじめとする血液を包含する。
これらの組織からの造血幹細胞の取得は、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．「Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ」，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．１９９７に従い実施することができる。すなわち、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３８抗体などを用いて免疫学的に染色し、セルソーターを用いてこれらの抗体の染色性により分離することができる。
造血幹細胞が単離されたら、それらは次のようにして増殖させることができる。すなわち、骨髄細胞、胎仔胸腺または胎仔肝臓から得られるストローマ細胞との共存培養により幹細胞維持と関連する成長因子が提供され、造血幹細胞を増殖させることができる。
造血幹細胞または造血前駆細胞に治療用遺伝子を導入するには、通常動物細胞の遺伝子導入に用いられる方法、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター等のウイルス由来の遺伝子治療に用いられる動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。
上記医療方法または医療製剤によれば、患者の体内にシノビオリンは補足され、これによりＥＲストレス誘導性アポトーシスが抑制され赤芽球の分化異常などが解消または低減されることになる。その結果、造血過程の異常、例えば赤芽球の分化異常が起因した疾患の治療が期待される。
本発明はまた、シノビオリンの活性を増強し得る物質を利用した造血系疾患の治療方法および治療用製剤に関する。本願発明者らにより天然シオノビオリンリガンド（ＳＬ）が単離されている。ＳＬは、Ｓ１−５と呼ばれる公知の遺伝子（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２０−１２８，１９９５）と、ＤＮＡの部分配列のみならず遺伝子の大きさ、発現産物の分子量などがほぼ同じであり、同一の蛋白質である可能性が高い。他のＳＬとしてはａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＡ６５５９０（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｕ０３８７７）、Ｉ３８４４９、ＮＰ＿０６１４８９（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿０１８８９４）、ＮＰ＿００４０９６（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿００４１０５）、またはそれらに類似したタンパク質であってヒトシノビオリンタンパク質（配列番号：２）に結合する活性を有するタンパク質を用いることができる（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１２０−１２８，１９９５；Ｈｅｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４，１９３−１９８，１９９６；Ｉｋｅｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５，５９０−５９２，１９９６；Ｋａｔｓａｎｉｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０６，６６−７２，２０００；Ｇｉｌｔａｙ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１８，４６９−４８０，１９９９；Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，１９９−２０２，１９９９）。
このようなシノビオリンリガンドまたはこれをコードしたポリヌクレオチドなどのシノビオリンの活性を刺激し得るシノビオリン活性増強剤は、シノビオリンの低下した機能に起因した造血系疾患の治療方法に利用し得る。
こうしたシノビオリンリガンドを医薬製剤とする場合、ＳＬ蛋白質やこれをコードするポリヌクレオチドなどもまた、上述のように有効成分以外に適宜他の溶質や溶媒と組み合わせることができる。また、ＳＬをコードしたポリヌクレオチドが導入された造血幹細胞を医薬製剤としてもよい。
上記発明によれば、シノビオリンリガンドの投与により、シノビオリンの発現または活性の向上が図られる。その結果、シノビオリンの発現または活性低下が関与する造血系疾患の治療が期待される。
本発明は、シノビオリンを利用した赤芽球を分化させるための方法に関する。上述したようにシノビオリンをホモで欠損した胎仔では赤芽球の分化異常が観察されている。そのため、シノビオリンならびにこれと機能的に同等な蛋白質およびこれらをコードしたポリヌクレオチドは赤芽球を分化させるための試薬および方法に利用し得る。
赤芽球を分化させるための方法は、造血幹細胞に上述したシノビリオンまたはこれと機能的に同等な蛋白質を投与するか、細胞内で発現させることにより実施し得る。シノビリオンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを発現ベクターに担持させ、これを造血幹細胞に導入する。造血幹細胞の単離、使用し得る発現ベクターの種類、導入方法などは上述したとおりである。シノビリオン等をコードしたポリヌクレオチドを導入した後、細胞を培養し、形態を観察して赤芽球に分化した細胞を採取する。また、シノビオリンとともに他の赤芽球を分化誘導し得る物質を組み合わせて用いてもよい。例えばエリスロポエチンを赤芽球分化誘導剤として単独で用いた場合ＣＦＵ−Ｅに分化することが知られており、エリスロポエチンにＳＣＦを組合せて用いるとＢＦＵ−Ｅに分化することが知られている。このように他の誘導剤と組合せることにより単独で用いた場合と異なる細胞を分化誘導し得る可能性がある。
上述したように上記シノビリオンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはこれを担持した発現ベクターは赤芽球の分化誘導剤など試薬として応用し得る。
本発明はシノビオリン遺伝子機能が欠損した、造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔に関する。シノビリオンの機能解析のためにノックアウトマウスの作成を試みたが、シノビオリンをホモで欠損させると１３．５日齢程度で胎生致死となる。致死に至る以前の胎仔を用いた解析では、アポトーシスが亢進し、赤芽球の分化異常が観察され、この異常細胞によりマクロファージが活性化、血球貪食も観察された。したがって、シノビオリンホモノックアウト胎仔は、造血系疾患、とりわけ赤芽球の分化異常が起因する疾患のモデル胎仔となり得る。また、この赤芽球の分化異常は、ＥＲストレス誘導性アポトーシスが主要因と考えられることから、シノビオリンホモノックアウト胎仔はＥＲストレス誘導性アポトーシスが起因した疾患のモデルにもなり得る。
本発明のモデル非ヒト動物としては、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ならびにウシ等）が好ましく、特にげっ歯類、例えばマウスまたはラットなどを用いることが好適である。
シノビオリン遺伝子機能が欠損した非ヒト動物は、例えば、ジーンターゲティングにより製造することができる。このようなモデル非ヒト動物を作製するには、例えば本発明のＤＮＡの一部または全部を置換、欠失、付加および／または挿入等により欠損させたターゲティングベクターを胚性幹（ＥＳ）細胞に導入し、染色体ＤＮＡと相同組み換えを起した細胞を選択する。相同組み換え体の選択のためには公知のポジティブ・ネガティブ選択を行うことができる。ポジティブ選択用マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ネガティブ選択用マーカーとしては、ジフテリア毒素（ＤＴ）−Ａ遺伝子やＨＳＶ−ｔｋ遺伝子などが挙げられる。サザンブロッティングやＰＣＲ等により、正しく組み換えられた細胞を選択することができる。得られた細胞は、８細胞期程度の受精卵または胚盤胞の胚盤胞腔などに注入し、輸精管結紮雄と交配させて作製した偽妊娠メス個体の子宮内に移植する。産仔のゲノムＤＮＡ解析は後述する実施例に基づいて実施することができる。産仔より血液または組織などの試料を得、この取り出した試料を基にＤＮＡ解析を行う。このＤＮＡ解析から、ヘテロノックアウトマウスであるか否かを同定し得る。
ホモノックアウトマウスを得るためには、ヘテロノックアウトマウス同士を交配させる。上記と同様に交配の結果として得られた胎仔のＤＮＡ解析を行い、ホモノックアウトマウスを同定する。なお、マウスの場合には、ホモノックアウト型は１３．５日齢頃に致死となった。そのため、生存しているマウス胎仔を得るためには、それ以前に子宮より摘出する。
シノビオリン機能欠損動物の創生は、シノビオリン遺伝子をノックアウトするだけでなく、このノックアウトと共に他の遺伝子をノックインすることもできる。ノックインする遺伝子に特に制限はない。例えばｌａｃＺ遺伝子等のマーカー遺伝子が挙げられる。
また、シノビリオンの機能を欠損させる手段としては、ジーンターゲッティンの他にも、アンチセンス法、リボザイム法またはｉＲＮＡ法などにより、染色体ＤＮＡ上のシノビオリン遺伝子を改変させずに、転写後の発現を阻害することで機能をオフさせる手段を用いてもよい。アンチセンス法においては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの転写産物に相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを、また、リボザイム法においては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの転写産物を切断するＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを、上記と同様に哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、これを哺乳動物の胚に注入し、該胚から個体を得ればよい。
また、ｉＲＮＡ法は、シノビリオン蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１に記載の配列からなる転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡおよびこのアンチセンスＲＮＡと相補するセンスＲＮＡとが対合した二重鎖ＲＮＡを発現するベクターを、上記と同様に哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、これを哺乳動物の胚に注入し、該胚から個体を得ればよい。
上記の通り、シノビリオンの機能を欠損した胎仔は、赤芽球の分化異常という性質を呈する。このような性質の発現は、１０．５日齢以降である。そのため、１０．５日齢以降であって致死に至る１３．５日齢以前の胎仔は、造血系疾患、とりわけ赤芽球の分化異常に起因した疾患のモデルとなる。また、胎仔そのものだけではなく、胎仔由来の細胞もまた、モデル細胞として利用し得る。胎仔由来の細胞として好適な例は、ＭＥＦｓなどである。これらモデル動物胎仔やこれに由来する細胞は、造血系疾患、特に赤芽球分化異常に起因した疾患に対する医薬候補化合物を含む種々の化合物の試験またはスクリーニングを行うことができる。本発明のモデル動物胎仔を利用した試験またはスクリーニングの方法としては、以下の方法が挙げられる。
本発明の造血系疾患用治療剤のスクリーニング方法は、シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔もしくは母体に被験物質を投与し、該非ヒト動物胎仔における赤芽球の状態を評価する。赤芽球が野生型と比較して同等程度に正常に分化しているか、あるいはホモノックアウト胎仔と比較して分化異常を示す数が低減している場合に、被検物質は造血系疾患の治療剤の候補となる。
また、別の態様のスクリーニング方法としては、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、スクリーニング方法が挙げられる。
（ａ）シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または当該胎仔由来細胞にＥＲストレス誘導剤を投与または接触させる工程
（ｂ）上記（ａ）工程の前もしくは後又は同時に前記シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる工程
（ｃ）前記非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
上記スクリーニング方法における造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔は、上述したシノビリオンの機能を欠損させたモデル胎仔を用いることができる。胎仔由来の細胞は、モデル胎仔から採取した細胞、好適には、ＭＥＦｓを用いることができる。
これらモデル胎仔または胎児由来の細胞に作用させるＥＲストレス剤は、例えば、ツニカマイシン、タプシガルギン、その他のＥＲストレスを誘導し得る薬剤を用いることができる。これらＥＲストレス剤により胎仔または胎仔由来の細胞にＥＲストレスを加える。
ＥＲストレス剤によりストレス誘導は、胎仔に直接投与するか、胎仔を生育しているカルチャー内に投与することにより実施し得る。また、胎仔由来の細胞へのストレス誘導は、細胞を培養しているカルチャー内にＥＲストレス剤を添加することにより実施し得る。
上記ＥＲストレス誘導工程の前もしくは後又は同時に、前記モデル胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる。この被験物質投与・接触方法は、被験物質の種類などにより、適宜選択することができる。胎仔への投与は、例えば胎仔を生育させるカルチャー内に添加してもよく、直接、体内に注入してもよい。細胞の場合には、被験化合物は例えば培地中に添加される。または、マイクロインジェクション等により細胞内に注入されてもよい。被験物質が遺伝子である場合は、ｎａｋｅｄ ＤＮＡとして、所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて、あるいは公知の発現ベクターに組み込んで細胞に遺伝子を導入することができる。
上記被験物質を作用させた後、非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する。アポトーシス細胞の測定は、実施例に示したＴＵＮＥＬアッセイにより行うことができる。ＴＵＮＥＬアッセイは市販のキットなどを用いて実施し得る。アポトーシス細胞の測定後、被験物質を作用させた群と、作用させていない群とのアポトーシス細胞数を比較する。ここで被験物質を作用させた群において、アポトーシス細胞数の有意な減少が見られたとき、当該被験物質はＥＲストレス誘導を抑制する活性を有し、赤芽球の正常な分化を誘導し得るものと判定される。
なお、上記スクリーニングに用いる被験化合物は特に制限はなく、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成低分子化合物、天然または合成高分子化合物、組織または細胞抽出液、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子ライブラリーの発現産物または発現ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、シノビオリン遺伝子の標的破壊を示す図および写真である。図１（Ａ）は、シノビオリン野生型アレル、ターゲティングベクター、ターゲティングされたアレルの構造、およびターゲティング前後の遺伝子の部分的な制限酵素地図を示す図である。遺伝子のエキソンは黒四角で示し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴ）、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＢＳＫ）は白四角で示した。用いた制限酵素部位を以下のように示す：Ｂ、ＢｇｌＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｎ、ＮｃｏＩ。図１（Ｂ）は、ターゲティングしたＥＳクローンおよびヘテロノックアウト（以下「ｓｙｎｏ＋／−」と表示する）マウス同士の交配により生じた胎児クローンのサザンブロット解析を示す写真である。野生型（以下、「ｓｙｎｏ＋／＋」と表示する）ＴＴ２ ＥＳ細胞（ＷＴ）および相同的ターゲティングされたＥＳクローン（クローン−１、クローン−２）のゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、外側プローブでハイブリダイズした。ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ＋／−アレルでは、それぞれ７．４−ｋｂおよび１１．７−ｋｂ断片を生じた。また、ｓｙｎｏ＋／−マウスの交配により生じたＥ１３．０胎仔から単離した染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、上記と同じプローブでハイブリダイズした。図１（Ｃ）は、ノーザンブロット解析を示す写真である。ｓｙｎｏ＋／−を用いた交配により生じたＥ１３．０胎仔から単離した２０μｇのトータルＲＮＡを、シノビオリンプローブまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブでハイブリダイゼーションした。図１（Ｄ）は、Ｅ１３．０胎仔から蛋白質を単離し、ＳＥＳ−ＰＡＧＥで分離した（５０μｇ蛋白質／レーン）結果を示す写真である。蛋白質をメンブレンにトランスファーした後、抗シノビオリン抗体と反応させた。
図２は、Ｅ１３．５ホモノックアウト（以下「ｓｙｎｏ−／−と表示する）胎仔の表現型を示す写真である。図２（Ａ）は、ｓｙｎｏ＋／＋、ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−Ｅ１３．５マウス胎仔の外観を示す。変異胎仔はｓｙｎｏ＋／＋と比較して同じ大きさであり、正常な発達を示す。図２（Ｂ）は、ヘマトキシリン・エオシンで染色したｓｙｎｏ＋／＋ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−Ｅ１３．５マウス胎仔の組織切片を示す写真である（×１０）。
図３は、Ｅ１３．５胎仔より採取した肝臓の組織像を示す写真である。ｓｙｎｏ＋／＋、ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−Ｅ１３．５の肝臓切片の詳細を示す（×４００）。ｓｙｎｏ−／−胎仔における細胞密度が低いことが観察された。
図４は、ｓｙｎｏ−／−胎仔由来肝臓細胞におけるアポトーシス細胞割合を解析した結果を示す写真である。（Ａ）ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−胎児由来の肝臓組織のＴＵＮＥＬ解析結果を示す（×２００）。ＴＵＮＥＬ陽性率はｓｙｎｏ＋／＋では１％であったのに対し、ｓｙｎｏ−／−では２５％と高値を示した。このように肝臓で観察された違いはｓｙｎｏ−／−全身にわたって観察された。（Ｂ）ｓｙｎｏ＋／＋およびホモノックアウトｓｙｎｏ−／−胎仔におけるヘマトキシン・エオシン染色結果を示す（×２００）。
図５は、Ｅ１０．５ｓｙｎｏ−／−胎仔の造血を示す写真である。メイグリュンワルド・ギムザで染色した、Ｅ１０．５ｓｙｎｏ＋／＋ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−胎仔から単離した末梢血のサイトスピン標本を示す。ｓｙｎｏ−／−胎仔は、赤芽球形成の減少およびアポトーシスの亢進を示した（矢印）。
図６は、Ｅ１２．５ｓｙｎｏ−／−胎仔の造血を示す写真である。上段は生存Ｅ１２．５胎仔の末梢血のサイトスピン標本解析結果を示す。ｓｙｎｏ＋／＋胎仔と比較して、ｓｙｎｏ−／−胎仔では異常な赤芽球、核の断片化、およびハウエル・ジョリー小体が増加していた（矢印）。下段はメイグリュンワルド・ギムザで染色したＥ１２．５ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−胎仔の肝臓サイトスピン標本の解析結果を示す。ｓｙｎｏ−／−胎仔において、血球貪食が明らかに増加していた（矢印）。
図７は、１２．５日齢のｓｙｎｏ＋／＋およびホモノックアウト型ｓｙｎｏ−／−胎仔由来の肝臓におけるβグロビンの発現を免疫組織染色（×２００）により解析した結果を示す写真である。βグロビンの発現はｓｙｎｏ−／−胎仔では、ｓｙｎｏ＋／＋に比して減少していることが示されている（ｓｙｎｏ＋／＋：４．６０％，ｓｙｎｏ−／−：０．９０％、矢印で示す）。
図８は、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓはＥＲストレスに対する感受性の増加を示す写真およびグラフである。図８（Ａ）は、ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−マウス由来のＭＥＦｓを、低濃度の血清（１％ＦＣＳ）培地中で、抗Ｆａｓモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌで４８時間）、Ｘ線照射（６Ｇｙで７２時間）、タプシガルギン（１μＭで４８時間）、およびツニカマイシン（１０ｎｇ／ｍｌで４８時間）を含む様々なアポトーシス刺激で処理するか、または未処理（−）のままにした結果を示す写真である。ＴＵＮＥＬ解析によりアポトーシス細胞を検出した。図８（Ｂ）は、ｓｙｎｏ＋／＋よびｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓを、示した用量の刺激で処理した結果を示すグラフである。細胞死検出ＥＬＩＳＡ法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてＤＮＡの断片化を定量することにより、アポトーシスを測定した。＊Ｐ＜０．０１。アポトーシスｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓの数は、タプシガルギンおよびツニカマイシンで処理したものにおいて、それぞれのｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓと比較して高かった。図８（Ｃ）は、ＬａｃＺ（−）またはシノビオリン遺伝子（＋）を有するアデノウイルスベクター（１００ｍｏｉ）をｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓに感染させた後、前述と同じ薬剤で処理した結果を示すグラフである。ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいて、ＥＲストレスに誘導されるアポトーシスはシノビオリンの発現によりレスキューされた。
図９は、シノビオリンはＥＲＡＤ系を介して抗アポトーシス蛋白質として作用することを示す図である。シノビオリンの「機能喪失」は、ＥＲＡＤ系の破綻を介して全身性のアポトーシスもたらす。この過程により、細胞密度の低下および造血の異常が生じ、ひいては胎仔が死亡する。一方、シノビオリンの「機能獲得」は、シノビオリンの抗アポトーシス効果を介して関節症の自然発症をもたらす。さらに、ｓｙｎｏ＋／−マウスは、関節炎に関連する実験で頻繁に用いられるモデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に耐性である。まとめて考えると、シノビオリンはＥＲＡＤ系を介して「細胞機能の維持」において重要な役割を担う。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本願発明をより詳細に説明するが、本願発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］ シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスの作製
マウスシノビオリン遺伝子を破壊するため、ターゲティングベクターを構築した（図１）。ベクター構築のため、Ｃ５７ＢＬ／６ゲノムライブラリーよりシノビオリンｃＤＮＡをクローニングした。遺伝子の翻訳開始コドンの位置にＮｃｏＩ部位を作出した後、遺伝子のＮｃｏＩ／ＢａｎＨＩ断片をＬａｃＺカセットで置換した（Ｓａｇａ，Ｙ．，Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｔ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９２．Ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｎｏｒｍａｌｌｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｅｎａｓｃｉｎ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：１８２１−１８３１．）。ｐＭＣ１ｎｅｏ由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）遺伝子カセット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）をＬａｃＺ遺伝子の下流に配置した。シノビオリン遺伝子の１．８５−ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ断片および８．５−ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ断片を、これらのカセットのそれぞれ上流および下流に含めた。ＤＴ−Ａカセットでの負の選択は、以前に記載されている（Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｎａｄａ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔａｍｅｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｎ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９３．Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：７７−８６）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡマウスのＦ１胎仔由来のＴＴ２ ＥＳ細胞を、以前に記載されているようにフィーダー細胞上で培養した（Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．，Ｎａｄａ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｔｓｕｋａｄａ，Ｔ．，Ｓａｇａ，Ｙ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｎ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９３．Ａ ｎｏｖｅｌ ＥＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＴＴ２，ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｇｅｒｍｌｉｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：７０−７６．）。このＴＴ２ ＥＳ細胞に上記ターゲティングベクターをエレクトロポレーションにより導入した。導入後、ベクターと内在のシノビオリン座位との間で相同的組換えが生じた場合、シノビオリン座位にはＡＴＧ翻訳開始部位にインフレームのｌａｃＺレポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子が挿入される。ｌａｃＺカセットはポリ（Ａ）付加配列を含むため、シノビオリン融合蛋白質の翻訳は妨げられると考えられる。
エレクトロポレーション後、薬剤Ｇ４１８で選択し、ｎｅｏ耐性ＴＴ２ ＥＳクローンを単離した。単離されたクローンから染色体ＤＮＡを回収し、制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した。この制限酵素消化産物を電気泳動で分離後、図１Ａに示されたプローブを用いてサザンブロット解析を行い、遺伝子型を同定した。上記相同組換体は、サザンブロット解析により確認した（図１Ｂ左）。
２つの独立したｓｙｎｏ＋／−ＥＳクローンをＩＣＲの８細胞期胚に注入した（Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｎａｄａ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔａｍｅｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｎ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９３．Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：７７−８６．）。８０％を超えるアグーチ色の毛色を有するキメラ雄をＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ１雌と交配し、尾部由来および卵黄嚢（ｙｏｌｋ ｓａｃ）由来ゲノムＤＮＡをサザンブロット解析またはＰＣＲ解析することにより、変異アレルのジャームライントランスミッションを同定した（図１Ｂ左）。遺伝子型同定には、以下のプライマーを用いた；
これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、９６℃２分間、９６℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３分間のサイクルを３５サイクル、最終サイクルの後の７２℃１０分間の伸長反応、その後４℃で冷却という条件で行った。このＰＣＲ解析により、変異および野生型アレルからそれぞれ６．９ｋｂおよび２．６ｋｂのフラグメントが生成される。
上記２つの独立したｓｙｎｏ＋／−ＥＳクローンをＩＣＲ−８細胞期に注入した結果、ジェームライントランスミッションを起こした（図１Ｂ左）。変異に関してヘテロ接合性であるｓｙｎｏ＋／−Ｆ１マウスは生存可能、繁殖可能であり、明らかな表現型の異常は認められなかった（データは示さず）。ｓｙｎｏ−／−マウスを作出するためにｓｙｎｏ＋／−マウスを交配させ、新生子孫の遺伝子型を同定したが、ｓｙｎｏ−／−マウスは同定されなかった。このことからシノビオリンの欠損は胎生致死をもたらす可能性が考えられた。そこで様々な発生段階での胎仔の解析を行ったところ、およそ１３．５日齢までに致死となっていることが明らかとなった（表１）。
このターゲティングされたシノビオリン変異体の性質を判定するため、いずれも１３日齢のｓｙｎｏ＋／＋胎仔、ｓｙｎｏ＋／−胎仔およびｓｙｎｏ−／−胎仔からゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡおよび蛋白質を調製し、それぞれサザンブロッティング、ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングにより解析した。
なお、ＲＮＡ単離はチオシアン酸グアニンジンフェノールクロロホルム抽出法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．１９８７．Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９．）に基づくＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を用いて実施し、Ｅ１３．０胎仔からトータルＲＮＡを単離した。次に２０μｇのトータルＲＮＡをグリオキサールで変性させ、電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。クローニングしたシノビオリンｃＤＮＡフラグメントにおける１２３５−３０２８塩基に相当するＤＮＡプローブでメンブレンをハイブリダイズした。
図１Ｂ右、ＣおよびＤに示すように、ｓｙｎｏ−／−胎仔ではシノビオリン遺伝子が欠損し、またシノビオリンｍＲＮＡも蛋白質も検出されなかった。したがって、ｓｙｎｏ−／−胎仔はシノビオリン転写産物も蛋白質も発現していないことが確認された。
［実施例２］ ｓｙｎｏ−／−胎仔におけるアポトーシス細胞死
シノビオリン変異が致死となる胎仔発生の段階を同定するため、Ｅ１０．５〜Ｅ１８．５の胎仔を解析した。解析のため、子宮から胎仔を摘出した。遺伝子型同定のために卵黄嚢を回収した。次に胎仔の組織学的解析を行うために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド中で胎仔を一晩固定してパラフィンに包埋し、４μｍ切片を切り出しヘマトキシリン・エオシンで染色し、何枚かの切片はＴＵＮＥＬアッセイに使用した。サイトスピン標本のために、５０％ＦＣＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に末梢血を回収した。Ｅ１２．５胎仔の胎仔肝を同じ培地１ｍｌ中で２５ゲージ針を用いて破壊し、約７μｌを２００μｌの培地に希釈し、サイトスピンした。末梢血および胎仔肝のスライドをメイグリュンワルド・ギムザで染色した。
Ｅ１１．５ではｓｙｎｏ−／−胎仔の大多数（８８．９％）が生存可能であったが、Ｅ１３．５ではごくわずかなｓｙｎｏ−／−胎仔しか生存していることが認められなかった（表１）。Ｅ１３．５の胎仔を形態学的に解析したところ、ｓｙｎｏ−／−胎仔、ｓｙｎｏ＋／−胎仔およびｓｙｎｏ＋／＋同腹仔の間に外見上の顕著な変異は認められなかった（図２Ａ）。また、また組織学的な検討からもｓｙｎｏ−／−胎仔において、主要な臓器が欠失しているなどといった重篤な変異は認められなかった（図２Ｂ）。
しかし、ｓｙｎｏ−／−胎仔の肝臓組織像を狭画にて検討した結果、ｓｙｎｏ＋／＋胎仔やｓｙｎｏ＋／−胎仔に比べｓｙｎｏ−／−胎仔では全身で細胞密度が低下していることが確認された（図３）。我々は、細胞密度の低さはｓｙｎｏ−／−胎仔でのアポトーシス細胞死の亢進によるものと想定した。
シノビオリンの喪失によって誘導されるアポトーシス細胞死の程度を測定するため、各段階の胎仔でＴＵＮＥＬ解析を実施した。詳細には、肝臓組織および切片は上述の方法で調製した。これら標本をＴＵＮＥＬ解析に供した。ＴＵＮＥＬ解析は製造業者（ＭＥＢＳＴＡＩＮアポトーシスキットＩＩ、Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）．により提供されたプロトコールにしたがって実施した。異なる３領域における細胞１０００個当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数をカウントし、ＴＵＮＥＬ陽性細胞割合を算出した。
Ｅ１２．５ではアポトーシス細胞死はとりわけ肝臓において顕著に検出された。またアポトーシス細胞の数はｓｙｎｏ＋／＋胎仔（１％）と比較してｓｙｎｏ−／−胎仔（２５％）において有意に増加していた（図４Ａ）。この段階の胎仔では、シノビオリンは造血細胞を含めて偏在的に発現されている（データは示さず）。
［実施例３］ ｓｙｎｏ−／−胎仔の造血における異常なアポトーシス
マウス胎仔の正常な発生過程では、造血の主要器官はＥ１１．５〜Ｅ１２．５頃に卵黄嚢から胎仔肝に移行する（Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．１９９５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ ８６：２８７６−２８９１．）。Ｎｕｌｌ突然変異マウスの様々な遺伝子の解析に基づくいくつかの研究から、造血機能障害はこの発生段階での致死と関連する場合が多いと結論づけられている（Ｎｕｅｚ，Ｂ．，Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｃｈ，Ｄ．，Ｂｙｇｒａｖｅ，Ａ．，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．１９９５．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＫＬＦ ｇｅｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３１６−３１８．；Ｏｋｕｄａ，Ｔ．，ｖａｎＤｅｕｒｓｅｎ，Ｊ．，Ｈｉｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｇ．，ａｎｄ Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．１９９６．ＡＭＬ１，ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ ８４：３２１−３３０，；Ｋｉｅｒａｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ａ．Ｃ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．１９９６．Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：９１２６−９１３１．；Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｓｔａｃｙ，Ｔ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｆ．，Ｇｕ，Ｔ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，Ｂｕｓｈｗｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｂｏｒｉｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｙａｎ，Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．，Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ，Ａ．，Ｂｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｍａｒｉｎ−Ｐａｄｉｌｌａ，Ｍ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ，，ａｎｄ Ｓｐｅｃｋ，Ｎ．Ａ．１９９６．Ｔｈｅ ＣＢＦｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＣＢＦａｌｐｈａ２（ＡＭＬ１）ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ ８７：６９７−７０８．；Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｓｕｄｏ，Ｔ．，Ｓｅｎｆｔｌｅｂｅｎ，Ｕ．，Ｄａｄａｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｋａｒｉｎ，Ｍ．２０００．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐ３８ａｌｐｈａ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １０２：２２１−２３１．；Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｐｈａｒｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｌａｖｅｎｂｕｒｇ，Ｋ．Ｒ．，Ｊａｃｋｅｒｓ，Ｐ．，Ｐａｐａｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｏｇａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．２０００．Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ｉｍｐａｉｒｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ，ａｎｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｌｉ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：５６４３−５６５２．；Ｋａｗａｎｅ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｏｎｄｏｈ，Ｇ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｊ．，Ｏｈｓａｗａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．２００１．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮａｓｅ ＩＩ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５４６−１５４９．）。そこで、ｓｙｎｏ−／−胎仔における造血の状態を検討するため、Ｅ１０．５、Ｅ１２．５の末梢血およびＥ１２．５の胎仔肝のサイトスピン標本を調べた。
先ず、一次造血の状態を解析するために、Ｅ１０．５から得られた末梢血試料を染色し、ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ＋／−の同腹仔の赤芽球形成（３．０±０．６６×１０５細胞）を比較した（図５）。ｓｙｎｏ−／−胎仔では、ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ＋／−胎仔と比較して、その減少（８．３±０．４６×１０５細胞）が示された。さらに、ｓｙｎｏ＋／＋赤芽球ではアポトーシスは観察されなかったのに対して、ｓｙｎｏ−／−赤血球ではアポトーシスが認められた（図示せず）。
次に、二次造血が行われている１２．５日齢の末梢血のギムザ染色を行った。ここでは先程の一次造血によって形成された赤芽球よりもさらに分化の段階が進んだ赤芽球が観察され、また脱核が起こった成熟赤血球も認められる。Ｅ１２．５の末梢血試料の染色では、ｓｙｎｏ＋／＋（４．０±０．１８×１０５細胞）と比較してｓｙｎｏ−／−胎仔では赤芽球数の減少（１８．０±０．１９×１０５細胞）が示された（図６）。さらに、ｓｙｎｏ−／−胎仔では、ハウエル・ジョリー小体、核の断片化を起こしている赤芽球、二分葉の核を持つ赤芽球等の異常な赤芽球の比率が、ｓｙｎｏ＋／＋同腹仔では１．８％であるのに対して１０．５％と顕著に高かった（表２、異常な赤芽球を図６上段矢印で示す）。
上記観察において、ｓｙｎｏ−／−胎仔で一次造血の際に認められた赤芽球でのアポトーシスは、Ｅ１２．５の時点ではほとんど認められなかった。この理由を検討するために肝臓のギムザ染色を行った。ギムザ染色の結果（図６下段）、マクロファージによる赤芽球の貪食、すなわちｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓの像（図６下段矢印で示す）は、ｓｙｎｏ＋／＋やｓｙｎｏ＋／−ではほとんど見られないのに対し、ｓｙｎｏ−／−では１００マクロファージ細胞中２２個と有意に増加していることが確認された（表３）。このことから、１０．５日齢で見られたようなアポトーシスを起こした赤芽球は造血の場である肝臓においてマクロファージにより貪食・排除され、その結果、Ｅ１２．５由来の末梢血ではアポトーシスを起こした赤芽球が認められないということが予測される。
この現象は、ｓｙｎｏ−／−胎仔肝の組織学的切片においても認められた（図３）。これらの結果から、マクロファージが活性化され、異常な赤芽球を貪食したことが示唆された。総合して考えると、これらの知見から、シノビオリンの欠如はアポトーシスの亢進に起因する異常な赤血球分化に関連することが示唆され、ｓｙｎｏ−／−胎仔は循環する赤芽球数が減少した結果として貧血で死ぬと考えられる。
さらに本願発明者らは、シノビオリンの造血への関与を研究するために、二次造血のマーカーであるβ−グロビンの発現を免疫組織染色法により検討した。
免疫組織染色は以前に報告されている通りの手法で実施した（Ｋａｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。切片は抗β−グロビン抗体で一晩インキュベートした。抗原−抗体の特異的な反応はジアミノベンジン基質クロモジェンシステム（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用い、添付のマニュアルに従って実施した。異なる３つの領域中の細胞を１０００個数え、陽性細胞率を計算した。
その結果、β−グロビンの発現がｓｙｎｏ−／−ではｓｙｎｏ＋／＋マウスに比べ顕著に減少していることが明らかとなった（図７）。この結果は造血、とりわけ二次造血においてシノビオリンが重要な役割を果たしていることを示している。
［実施例４］ ｓｙｎｏ−／−マウス胎仔線維芽細胞は、ＥＲストレスに選択的に影響を受けやすい
アポトーシスは、いくつかの経路を介して誘導され得る。シノビオリンの関与を説明するアポトーシス経路を同定するため、ｓｙｎｏ−／−およびｓｙｎｏ＋／＋胎仔からＭＥＦｓを単離した。ＭＥＦｓは、１０．５日齢のｓｙｎｏ−／−およびｓｙｎｏ＋／＋胎仔の頭部および臓器を除去した後、これらの胎仔をトリプシン消化することにより単離した。単離した細胞を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地で培養した。このＭＥＦｓに対して以下の４つのアポトーシス刺激をインビトロで加えた；モノクローナル抗Ｆａｓ抗体（Ａｂ），γ照射、ツニカマイシン（Ｎ−グリコシル化阻害剤）、およびタプシガルギン（Ｃａ２−ＡＴＰａｓｅ阻害剤）。
対照条件下では、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓアポトーシス細胞の比率はｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓ（６±２％）よりも高かった（１６±４％、図８Ａ）。Ｆａｓ刺激またはγ照射では、アポトーシスｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓおよびｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓの数は変化しなかった（Ｆａｓ：ｓｙｎｏ−／−、４５±２％、ｓｙｎｏ＋／＋４３±４％；γ照射：ｓｙｎｏ−／−３４±６％、ｓｙｎｏ＋／＋３１±２％、図８Ａ）。一方、ＥＲストレス誘導剤であるツニカマイシンおよびタプシガルギンでは、ＴＵＮＥＬ陽性ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓの数がｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓと比較してそれぞれ１．７倍および２．４倍に増加した（３３±７％に対して５６±３％；３８±７％に対して９０±１％、図８Ａ）。さらに、ＥＲストレス誘導剤に対する感受性は、用量依存的な様式で増加した（図８Ｂ）。
上記ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓに与えられたアポトーシス刺激による影響が外来からシノビオリン遺伝子を導入することにより低減または消失するかを検討した。Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）発現系により、製造業者の説明に従い（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．カリフォルニア州、パロアルト）、Ｆｌａｇタグ化シノビオリンまたはＬａｃＺの遺伝子を含むアデノウイルスベクターを調製した。ＨＥＫ２９３細胞でｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎアッセイを行うことにより、ウイルス調製物の力価を測定した。細胞当たりのウイルス粒子数（プラーク形成単位：ＰＦＵで測定される）を、ｍｏｉとして表した。感染ＭＥＦｓに標的遺伝子を４８時間発現させた後、表示の試薬で処理した。
ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいて、Ｆａｓを介したアポトーシスおよびγ照射によって誘導されたアポトーシスは、アデノウイルスを用いたシノビオリンの発現によりレスキューされなかったのに対し、ＥＲストレスによって誘導されたアポトーシスはレスキューされた（図８Ｃ）。総合して考えると、これらの結果から、シノビオリンはＥＲストレスにより誘導されるアポトーシスからＭＥＦｓをレスキューするが、Ｆａｓまたはγ照射により誘導されるアポトーシスからは救出されないことが示唆される。さらに、ＣＨＯＰ／Ｇａｄｄ１５３、ＡＴＦ−６、カスパーゼ−１２等のＥＲストレス誘導性蛋白質の発現をウェスタンブロッティングにより解析したが、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいてこれらの蛋白質は誘導されていることが認められた（データは示さず）。
上記ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいて、データには示さないがＣＨＯＰ／Ｇａｄｄ１５３およびＡＴＦ−６を含むＥＲストレス誘導性蛋白質の発現が誘導された。これらの蛋白質は、ＥＲストレスに対抗するＵＲＰに関与すると考えられている。したがって、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓでは、アポトーシスは、ＥＲストレスに応答したＵＰＲ系を介してではなく、ＥＲＡＤ系の破綻によって誘導されるように思われる。すなわち、ＥＲＡＤ系は蛋白質の品質管理に主に関与しているようであり、それは同時に特に胎仔形成過程における「生命の維持」に不可欠である。ＣＨＩＰ、ｇｐ７８／ＡＭＦＲ、パーキン、およびＦｂｘ２／ＦＢＧ１／ＮＦＢ４２等のいくつかのユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が、ＥＲＡＤ系に関与することが報告されている。しかし、シノビオリンの「機能喪失」は、代替機能がないことから、胎仔形成過程において致死となるのであろう。我々の研究は、他のユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の中でも特にシノビオリンが、ＥＲＡＤ系において極めて重要な役割を果たすことを明らかに示唆するものである。
産業上の利用の可能性
ＥＲＡＤ系のユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の中で中心的役割を担うと考えられている酵母Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｌ３（Ｂａｙｓ，Ｎ．Ｗ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｅｅｌｉｇ，Ｌ．Ｐ．，Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｙ．２００１．Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｒ３ｐ ｉｓ ａｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２４−２９．）のヒト相同体であるシノビオリンの機能を解析するため、本研究において我々は、インビボでのＥＲＡＤ系の機能を明らかにする手段としてＥＳ細胞を用いてシノビオリンを欠損したマウスを作製した。
上記において詳述した通り、ｓｙｎｏ−／−マウスはＥ１２．５〜Ｅ１３．５までに子宮内で死亡した。ｓｙｎｏ−／−胎仔では、過度のアポトーシスによりいくつかの器官で明らかに低い細胞密度を示し、造血系においてもアポトーシスの異常が認められた。このことから、ｓｙｎｏ−／−胎仔は造血系疾患、とりわけ、ＥＲストレス誘導性アポトーシスが起因した赤芽球の分化異常に関わる疾患の研究あるいは治療剤開発のためのモデルとして利用し得る。このように１３．５日齢付近で胎生致死となるＫＯマウスは他にも報告されているが（表４）、本願発明のモデルはこれら報告されているものとは別個の遺伝子であるシノビオリンがノックアウトされている。したがって、本発明のモデルは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などを欠損したモデルでは解析できない造血系疾患のモデルとして、さらには造血系疾患治療薬の探索に役立つことが期待される。
本願発明者らはまた、ｓｙｎｏ−／−胎仔における造血系細胞の低下を裏付けた実験としてｓｙｎｏ−／−胎仔由来のＭＥＦｓを用いた実験を示した。ここではインビトロでＥＲストレスに対して高く選択的な感受性を示し、ｓｙｎｏ−／−胎仔におけるアポトーシス細胞死はＥＲストレスによって誘導され得ると考えられる。この実験より、ｓｙｎｏ−／−胎仔由来のＭＥＦｓが、ＥＲストレス誘導性アポトーシスを研究するためのモデル細胞となること、さらには、このアポトーシスを回避または抑制するための薬剤のスクリーニング用の細胞として利用し得ることを示している。
また、本発明のシノビオリン等を有効成分とする造血系疾患の医薬製剤は、遺伝的な要因でまたは後発的な環境的要因からシノビオリンの機能低下または発現低下が起因して造血系疾患を発症している患者の治療剤として有効になると期待される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、滑膜細胞蛋白質として単離されたシノビリオンおよびその遺伝子の利用に関し、具体的には造血系疾患の治療用製剤および治療方法等への利用に関する。
【背景技術】
小胞体（ＥＲ）における蛋白質の品質管理、および核における蛋白質量の転写調節は、細胞の恒常性を維持する重要な過程である（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｙ．２００２．ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：４７６−４８２．）。真核細胞では、新たに合成される蛋白質はＥＲに輸送され、そこで正しくフォールディングされる。しかし、大量の蛋白質がＥＲに流入するなどの様々な環境条件により、この問題を克服するため、蛋白質のアンフォールディング応答（ＵＲＰ）と称される細胞応答が引き起こされる（Ｗｅｌｉｈｉｎｄａ，Ａ．Ａ．，Ｔｉｒａｓｏｐｈｏｎ，Ｗ．，ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．１９９９．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．７：２９３−３００．）。ＵＲＰ応答中は、真核生物開始因子（ｅＩＦ）２αの不活化により新たな蛋白質の合成が全体的に阻害されて、ＥＲではミスフォールディングした蛋白質のさらなる蓄積が減少し、またＢｉｐ／Ｇｒｐ７８およびＧｒｐ９４を含むＥＲシャペロン蛋白質をコードする遺伝子が上方制御されて、ミスフォールディングした蛋白質が正しくリフォールディングされる（Ｒｏｎ，Ｄ．２００２．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１３８３−１３８８．）。ＵＲＰにもかかわらず、ミスフォールディングした蛋白質の量が蛋白質のフォールディング能力を超える場合には、ミスフォールディングした蛋白質は、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）として知られるユビキチンおよびプロテアソーム依存性分解過程により除去されなければならない（前掲Ｈａｍｐｔｏｎ，２００２）。ＥＲ内のミスフォールディングした蛋白質はサイトゾルに移行し、そこでユビキチンリガーゼ酵素により２６Ｓプロテアソームの標的とされる。哺乳動物細胞のＥＲＡＤ系においては、ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０のＣ末端相互作用蛋白質）（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｈｕ，Ｚ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｙｉｎ，Ｌ．Ｙ．，ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．１９９９．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＨＩＰ，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：４５３５−４５４５．；Ｍｅａｃｈａｍ，Ｇ．Ｃ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｙｏｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｃｙｒ，Ｄ．Ｍ．２００１．Ｔｈｅ Ｈｓｃ７０ ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＣＨＩＰ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｍｍａｔｕｒｅ ＣＦＴＲ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：１００−１０５．；Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｎ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．２００１．Ａｎ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｗｈｉｃｈ Ｃａｎ Ｌｅａｄ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｔｒｅｓｓ，Ｉｓ ａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎ．Ｃｅｌｌ １０５：８９１−９０２）、パーキン（Ｉｍ Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｓ．，Ａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｈａｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．Ｉ．，ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．２００２．ＣＨＩＰ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎ，ａ ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｔｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：５５−６７）、ｇｐ７８／ＡＭＦＲ（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．，Ｔａｎｉ，Ｍ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｎａｇａｍａｃｈｉ，Ｙ．，Ｎｉｉｎａｋａ，Ｙ．，Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｏｈｗａｄａ，Ｓ．，Ｒａｚ，Ａ．，ａｎｄ Ｙｏｋｏｔａ，Ｊ．１９９９．Ｔｈｅ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５６：２９５−３００．；Ｆａｎｇ，Ｓ．，Ｆｅｒｒｏｎｅ，Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｔｉｗａｒｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ａ．Ｍ．２００１．Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｇｐ７８，ｉｓ ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４４２２−１４４２７）、およびＦｂｘ２／ＦＢＧ１／ＮＦＢ４２（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｃｈｉｂａ，Ｔ．，Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｆ．，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｉｗａｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔａｉ，Ｔ．２００２．Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４１８：４３８−４４２）を含む様々なユビキチンリガーゼが報告されており、ＥＲにおいてＥＲＡＤ系を制御する正確な機構を決定するため現在詳細な研究が行われている。
ＥＲＡＤ系は、産生されるミスフォールディングした蛋白質の量を除去するため、細胞増殖中、恒常的に機能することが報告されている （Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｐａｔｉｌ，Ｃ．Ｋ．，Ｗｏｄｉｃｋａ，Ｌ．，Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．２０００．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １０１：２４９−２５８．）。最近の研究により、ＵＰＲおよび／またはＥＲＡＤ系の機能破壊が、ＥＲにおける適切な蛋白質フォールディングを妨げることが知られている（Ｌｅｅ，Ａ．Ｓ．２００１．Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：５０４−５１０．）あるＥＲストレス誘導性化学物質で処理した細胞のカスパーゼ依存性アポトーシスを亢進し得ることが示された（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．，Ｚｈｕ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｅ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ Ｙｕａｎ，Ｊ．２０００．Ｃａｓｐａｓｅ−１２ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ−ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ．Ｎａｔｕｒｅ ４０３：９８−１０３．）。これらの結果は、ＥＲＡＤ系の破壊に起因するある種のヒト疾患の分子論的病原機構を説明し得る。例えば、伸長したポリグルタミンの産生によりある遺伝性神経変性障害が生じ（Ｊａｎａ，Ｎ．Ｒ．，Ｚｅｍｓｋｏｖ，Ｅ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．ｈ．，ａｎｄ Ｎｕｋｉｎａ，Ｎ．２００１．Ａｌｔｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｅｘｐａｎｄｅｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｃａｓｐａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１０４９−１０５９．；Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．，Ｓａｍｐａｔ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｋｏｐｉｔｏ，Ｒ．Ｒ．２００１．Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５５２−１５５５．；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．， Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｎａｋａｄａｔｅ，Ｋ．，Ｏｈｓａｗａ，Ｙ．，Ｋａｍｅｉ，Ｙ．，Ｐｏｐｉｅｌ，Ａ．Ｈ．，Ｓｉｎｏｈａｒａ，Ａ．，Ｉｗａｍａｔｓｕ，Ａ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｈｏｒｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋａｋｉｚｕｋａ，Ａ．２００１．ＶＣＰ／ｐ９７ ｉｎ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．８：９７７−９８４．）、またはＥＲＡＤ系の有名なユビキチンリガーゼ蛋白質であるパーキン遺伝子の変異は、常染色体劣性若年性パーキンソニズム（ＡＲ−ＪＰ）を有する患者において黒質の神経細胞死を生じると考えられている（Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．２０００．Ｐａｒｋｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３５６６１−３５６６４．）。これらの知見は、生理的および病的状態での細胞生存におけるＥＲＡＤ系の重要性を強調するものである。
最近、我々は、抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングにより、ＲＩＮＧ−Ｈ２モチーフを有するＥＲ常在性膜蛋白質である酵母ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｌ３（Ｂａｙｓ，Ｎ．Ｗ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｅｅｌｉｇ，Ｌ．Ｐ．，Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｙ．２００１．Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｒ３ｐ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２４−２９．）のヒト相同体であるシノビオリン／ＨＲＤ１（以下、略して「シノビオリン」という）をクローニングした。
上述の通り抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングから得られたということは、シノビオリンが関節リウマチ（以下、「ＲＡ」と略す）の発症に深く関与することを示唆するものである。また、実際に変形性関節症患者の滑膜組織ではシノビオリンはほとんど発現していないにもかかわらず、ＲＡ患者の滑膜組織では強く発現していることが明らかとなっている。また、このシノビオリン遺伝子を過剰発現させたマウスでは滑膜増生、骨・軟骨破壊を伴うリウマチ様症状を呈することも報告されており、シノビオリンとＲＡの関与を裏付ける結果となっている。
一方、シノビオリンのｙｅａｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇのＨｒｄ１ｐは、虚血、低酸素、熱ショック、アミノ酸飢餓、ウイルス感染、小胞体内腔のカルシウム濃度低下などといったストレスにより小胞体内で生じ蓄積した異常構造蛋白質を除去し、小胞体の破綻を回避する分子の１つとして知られている。この小胞体ストレス応答機構としては、▲１▼小胞体内シャペロン分子やフォールディング酵素の転写誘導、▲２▼蛋白質の翻訳抑制、▲３▼ユビキチン・プロテアソーム系による異常蛋白質の積極的分解の３つがあり、通常▲１▼▲２▼をあわせてＵＰＲ（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、▲３▼をＥＲＡＤ（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）と呼び、ｙｅａｓｔ Ｈｒｄ１ｐは▲３▼のＥＲＡＤに関与する。このような危機管理機構であるＵＰＲやＥＲＡＤをもっても対処できない過度のストレスを受けると、細胞は自らアポトーシスを選ぶこととなり、またＥＲＡＤの破綻も同様にしてアポトーシスを誘導する結果となる。
同様にシノビオリンは、Ｅ３活性を持つこと、また細胞内においてはＥＲで発現がみられることから、ｙｅａｓｔ Ｈｒｄ１ｐと同様にＥＲＡＤに関与し小胞体ストレス応答機構の一端を担っている。
【発明の開示】
本願発明者らは上述のように小胞体ストレス応答機構のうちＥＲＡＤに関与し、品質管理リガーゼとして機能していると考えられているシノビオリンのノックアウトマウスを作成し、その生体内における機能を解明することを試みた。
解析の結果、シノビオリンノックアウトマウスはＥ１２．５−Ｅ１３．５で胎生致死となった。この原因を探るために胎仔の組織を詳細に調べたところ、肝臓でのアポトーシスが亢進し、これにより細胞密度低下が起こっていることが明らかとなった。数多く存在するユビキチンリガーゼの１つであるシノビオリンの機能を欠損させることが、マウスの発生段階における致死性をもたらしたことは非常に驚くべきことであり、このことはこれまでに予期することのなかった全く新しい知見となった。そこで、このシノビオリンノックアウトマウスについてさらなる検討を進めた結果、このマウスでは造血系において異常が認められ、またマクロファージが活性化され血球貪食が増加していることが明らかとなった。つまり、シノビオリンノックアウトマウスで亢進したアポトーシスは、その結果の１つとして赤芽球分化異常をもたらし、これにより増加した異常な赤芽球を排除するためにマクロファージが活性化され、血球数の減少により貧血を引き起こし、この時期に致死となることが証明された。またこのアポトーシスの亢進は胎仔由来の線維芽細胞（以下「ＭＥＦｓ」と略す）を用いた検討から、予測した通り小胞体ストレスによって誘導されたものであることも明らかとなっている。この結果は、換言すればマウスの発生において小胞体ストレスが二次造血の場で強く負荷されていることを示唆するものであり、またＥＲＡＤの破綻がマウスへの致死性をもたらすというこれまでにない全く新しい知見となっている。また先に述べたように、ＥＲＡＤにおいてはユビキチンリガーゼのなかでもこのシノビオリンという因子が特に重要な役割を果たすことが本研究によりはじめて明らかとなった。
これまでに我々はＲＡの発症にシノビオリンが関与するという報告もしており、ＥＲＡＤにおいて主要な役割を担っているシノビオリンの機能を標的とすることで、この疾患への治療が可能になるものと考えられる。また造血系疾患およびＲＡのみならず、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスに関連した疾患への治療などといった効果も予測され、本研究が新たな創薬開発への足がかりとなることが期待される。
上記知見に基づき本発明は、以下に示す造血系疾患の治療用薬剤および治療方法、さらには造血系疾患の治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。
［１］以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
［２］造血系疾患が、赤芽球の分化異常に起因する疾患である上記［１］に記載の方法。
［３］前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクターを、造血幹細胞に導入する工程を含む、上記［１］に記載の方法。
［４］造血幹細胞において、以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質を発現させる工程を含む、赤芽球を分化させるための方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
［５］以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、造血系疾患の治療用医薬製剤。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
［６］前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持した造血幹細胞である、上記［５］に記載の医薬製剤。
［７］配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
［８］配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を有効成分として含有する、造血系疾患の治療剤。
［９］シノビオリン遺伝子機能が欠損している、造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１０］非ヒト動物がげっ歯目動物である、上記［９］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１１］げっ歯目動物がマウスである、上記［１０］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１２］１３．５日齢以前の胎仔である、上記［１１］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
［１３］造血系疾患が赤芽球の分化異常に起因する疾患である、上記［９］記載の造血系疾患モデル非ヒト動物。
［１４］上記［９］から［１３］のいずれかに記載の造血系疾患モデル動物胎仔由来の造血系疾患モデル細胞。
［１５］線維芽細胞である、上記［１４］記載の造血系疾患モデル細胞。
［１６］シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔に被験物質を投与し、該非ヒト動物胎仔における赤芽球の状態を評価する、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
［１７］以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または当該胎仔由来細胞にＥＲストレス誘導剤を投与または接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる工程、
（ｃ）前記非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
［１８］以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ＥＲストレス除去剤のスクリーニング方法。
（ａ）内在シノビオリン遺伝子機能が欠損している細胞にＥＲストレス誘導剤を作用させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｃ）前記細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する
本発明は第一に、シノビオリン蛋白質またはそれをコードしたポリヌクレオチドを利用した造血系疾患の治療方法を提供する。シノビオリンノックアウトマウスを用いた研究からシノビオリンが造血、特に赤芽球の分化過程に関与することが示されている。そのため本発明の方法は、造血系疾患、特に赤芽球の分化過程の異常が原因となる疾患、例えば、貧血の有効な治療方法となり得る。
本発明の方法に用いることができるシノビオリン蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を先ず挙げることができる。この蛋白質は、配列番号：１に示す塩基配列の蛋白質コード領域にコードされる。シノビオリンをコードするポリヌクレオチドは、公知の方法によりクローニングすることができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００，１９８８）。シノビオリンはＲＡ患者の滑膜細胞において強く発現していることを本願発明者が見出していることから、ＲＡ患者の関節炎を発症した組織に由来する滑膜細胞から抽出したｍＲＮＡをもとに得られたｃＤＮＡライブラリーから（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，７５８３，１９８８）、配列番号：１に示した塩基配列に基づいて設定したプローブを用いて、ハイブリダイズするクローンをスクリーニングすることによってシノビオリン遺伝子を単離することができる。シノビオリン蛋白質は、ＲＡ患者の滑膜細胞からシノビオリン抗体やリガンド（ＳＬ（Ｓ１−５）など）などのシノビオリンと親和性を有する物質（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１２０−１２８，１９９５；Ｈｅｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４，１９３−１９８，１９９６；Ｉｋｅｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５，５９０−５９２，１９９６；Ｋａｔｓａｎｉｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０６，６６−７２，２０００；Ｇｉｌｔａｙ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１８，４６９−４８０，１９９９；Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，１９９−２０２，１９９９）を用いて単離・精製してもよく、また、配列番号１記載の塩基配列を発現ベクターなどに接続し、適当な宿主細胞内で発現させることにより合成してもよい。
また、本発明では上述した配列番号２に記載の配列からなるシノビリオン蛋白質に限定されず、これと機能的に同等な蛋白質も含まれる。シノビオリン蛋白質の機能として、本発明ではＥＲストレスによる造血系細胞のアポトーシスを回避させ得る機能を有していればよい。
シノビオリンと機能的に同等な蛋白質としては、（１）上述した配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質、（２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされた蛋白質、（３）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされた蛋白質、が挙げられる。
これらシノビオリンと機能的に同等な蛋白質と配列番号２に記載のシノビオリン蛋白質との間の非相同なアミノ酸の数は、一般的には５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であると考えられる。
シノビオリンと機能的に同等な蛋白質を得るためにアミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとの蛋白質の活性が維持されやすいと考えられる。保存的置換は、蛋白質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換により蛋白質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型蛋白質などを含む）または下降させることも考えられる。活性が低下しても造血系細胞におけるアポトーシスをレスキューし得る活性を有する限り、機能的に同等な蛋白質に含まれる。
シノビオリンと機能的に同等な蛋白質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：１に示すような本発明によるシノビオリンをコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離する。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離される蛋白質にはシノビオリンと機能的に同等な蛋白質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば７０％以上、望ましくは９０％以上の同一性を示すことができる。
上記ストリンジェントな条件とは、具体的には例えば６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、５５℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるシノビオリンのホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ウサギ、ブタ、あるいはヤギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするシノビオリンのホモログは、本発明における機能的に同等な蛋白質を構成する。
実際に本発明者らは、本発明のシノビオリン遺伝子を複数の個体からクローニングし、その塩基配列を決定することによって、１アミノ酸を欠失したクローンを得ている。このようなアミノ酸配列に変異を含む蛋白質、並びにそれをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明にシノビオリンと機能的に同等な蛋白質またはこれをコードしたポリヌクレオチドに含まれる。なお、本発明者らが確認した１アミノ酸を欠失したクローンの塩基配列を配列番号：３に、そしてこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：４に示した。配列番号：３の塩基配列は、配列番号：１における１２９３−１２９５に相当するｇｃａを欠損している。その結果、配列番号：４に記載のアミノ酸配列は、配列番号：２における４１２位のＡｌａを欠損している。
ヒトシノビオリン（配列番号：２）に変異を導入して得た蛋白質や、上記のようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、通常、ヒトシノビオリン（配列番号：２）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のウェブサイトの相同性検索（Ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）のページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ］。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えばＮＣＢＩのホームページのウェブサイトのＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．＆ Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９６，２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３３８９−３４０２）］。
例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ２．１におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムにｂｌａｓｔｐを用い、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０、Ｆｉｌｔｅｒは全てＯＦＦにして、ＭａｔｒｉｘにＢＬＯＳＵＭ６２を用い、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ、およびＬａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１、０．８５（デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の値（％）を得ることができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）。
上述したシノビオリンと機能的に同等な蛋白質が、実際にシノビオリンと同等な機能を有するかを確認する方法としては、本願実施例に示す相補実験が挙げられる。具体的には、シノビオリンホモノックアウト胎仔由来のＭＥＦｓをＥＲストレス剤で処理し、上述した機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを投与し、ＥＲストレス剤によるアポトーシス誘導が抑制されるかを指標として、機能的に同等であるかを確認することができる。
本発明の造血系疾患の治療方法では、シノビオリンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを用いることができる。ポリヌクレオチドは、その由来を問わない。すなわち、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのほか、合成によって得ることもできる。上記ポリヌクレオチドを治療に用いる場合、遺伝子治療用ベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどに組み込んでもよい。
これらの蛋白質またはポリヌクレオチドを用いて造血系疾患の治療を行う場合、上記蛋白質またはポリヌクレオチドを直接患者に投与しもよいが、好ましくはポリヌクレオチドを造血幹細胞へ導入し、ポリヌクレオチドを安定に保持した造血幹細胞を選択して患者に移植することである。造血幹細胞へのポリヌクレオチドの導入の際、ポリヌクレオチドは上述のように遺伝子治療用ベクターなどに保持させてもよい。
また、これら蛋白質またはポリヌクレオチドを用いて造血系疾患の治療を行う場合、上記蛋白質またはポリヌクレオチドをそのまま用いる他、公知の製剤学的方法により製剤化して医薬製剤として用いもよい。
医薬製剤化の際、上述したポリヌクレオチドや蛋白質などの有効成分以外に適宜他の溶質や溶媒と組み合わせることができる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。化合物の含有率は適宜決定すればよい。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、経口投与、関節内注入、その他の当業者に公知の方法により行いうる。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の有効血中濃度や代謝時間により異なるが、１日の維持量として約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。投与は１回から数回に分けて行うことができる。
また、上述したシノビオリンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードしたポリヌクレオチドが導入された造血幹細胞を医薬製剤としてもよい。造血幹細胞を得るには、骨髄または他の造血源から多能性のヒト幹細胞を単離することが必要である。まず、骨髄細胞は骨髄源、例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔（ｂｏｎｅ ｃａｖｉｔｙ）から得ることができる。造血幹細胞の他の入手源は胚卵黄包、胎児肝臓、胎児及び成人の脾臓、成人末梢血液及び臍帯血をはじめとする血液を包含する。
これらの組織からの造血幹細胞の取得は、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．「Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ」，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．１９９７に従い実施することができる。すなわち、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３８抗体などを用いて免疫学的に染色し、セルソーターを用いてこれらの抗体の染色性により分離することができる。
造血幹細胞が単離されたら、それらは次のようにして増殖させることができる。すなわち、骨髄細胞、胎仔胸腺または胎仔肝臓から得られるストローマ細胞との共存培養により幹細胞維持と関連する成長因子が提供され、造血幹細胞を増殖させることができる。
造血幹細胞または造血前駆細胞に治療用遺伝子を導入するには、通常動物細胞の遺伝子導入に用いられる方法、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター等のウイルス由来の遺伝子治療に用いられる動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。
上記医療方法または医療製剤によれば、患者の体内にシノビオリンは補足され、これによりＥＲストレス誘導性アポトーシスが抑制され赤芽球の分化異常などが解消または低減されることになる。その結果、造血過程の異常、例えば赤芽球の分化異常が起因した疾患の治療が期待される。
本発明はまた、シノビオリンの活性を増強し得る物質を利用した造血系疾患の治療方法および治療用製剤に関する。本願発明者らにより天然シオノビオリンリガンド（ＳＬ）が単離されている。ＳＬは、Ｓ１−５と呼ばれる公知の遺伝子（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２０−１２８，１９９５）と、ＤＮＡの部分配列のみならず遺伝子の大きさ、発現産物の分子量などがほぼ同じであり、同一の蛋白質である可能性が高い。他のＳＬとしてはａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＡ６５５９０（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｕ０３８７７）、Ｉ３８４４９、ＮＰ＿０６１４８９（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿０１８８９４）、ＮＰ＿００４０９６（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿００４１０５）、またはそれらに類似したタンパク質であってヒトシノビオリンタンパク質（配列番号：２）に結合する活性を有するタンパク質を用いることができる（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１２０−１２８，１９９５；Ｈｅｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４，１９３−１９８，１９９６；Ｉｋｅｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５，５９０−５９２，１９９６；Ｋａｔｓａｎｉｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０６，６６−７２，２０００；Ｇｉｌｔａｙ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１８，４６９−４８０，１９９９；Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，１９９−２０２，１９９９）。
このようなシノビオリンリガンドまたはこれをコードしたポリヌクレオチドなどのシノビオリンの活性を刺激し得るシノビオリン活性増強剤は、シノビオリンの低下した機能に起因した造血系疾患の治療方法に利用し得る。
こうしたシノビオリンリガンドを医薬製剤とする場合、ＳＬ蛋白質やこれをコードするポリヌクレオチドなどもまた、上述のように有効成分以外に適宜他の溶質や溶媒と組み合わせることができる。また、ＳＬをコードしたポリヌクレオチドが導入された造血幹細胞を医薬製剤としてもよい。
上記発明によれば、シノビオリンリガンドの投与により、シノビオリンの発現または活性の向上が図られる。その結果、シノビオリンの発現または活性低下が関与する造血系疾患の治療が期待される。
本発明は、シノビオリンを利用した赤芽球を分化させるための方法に関する。上述したようにシノビオリンをホモで欠損した胎仔では赤芽球の分化異常が観察されている。そのため、シノビオリンならびにこれと機能的に同等な蛋白質およびこれらをコードしたポリヌクレオチドは赤芽球を分化させるための試薬および方法に利用し得る。
赤芽球を分化させるための方法は、造血幹細胞に上述したシノビリオンまたはこれと機能的に同等な蛋白質を投与するか、細胞内で発現させることにより実施し得る。シノビリオンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを発現ベクターに担持させ、これを造血幹細胞に導入する。造血幹細胞の単離、使用し得る発現ベクターの種類、導入方法などは上述したとおりである。シノビリオン等をコードしたポリヌクレオチドを導入した後、細胞を培養し、形態を観察して赤芽球に分化した細胞を採取する。また、シノビオリンとともに他の赤芽球を分化誘導し得る物質を組み合わせて用いてもよい。例えばエリスロポエチンを赤芽球分化誘導剤として単独で用いた場合ＣＦＵ−Ｅに分化することが知られており、エリスロポエチンにＳＣＦを組合せて用いるとＢＦＵ−Ｅに分化することが知られている。このように他の誘導剤と組合せることにより単独で用いた場合と異なる細胞を分化誘導し得る可能性がある。
上述したように上記シノビリオンまたはこれと機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはこれを担持した発現ベクターは赤芽球の分化誘導剤など試薬として応用し得る。
本発明はシノビオリン遺伝子機能が欠損した、造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔に関する。シノビリオンの機能解析のためにノックアウトマウスの作成を試みたが、シノビオリンをホモで欠損させると１３．５日齢程度で胎生致死となる。致死に至る以前の胎仔を用いた解析では、アポトーシスが亢進し、赤芽球の分化異常が観察され、この異常細胞によりマクロファージが活性化、血球貪食も観察された。したがって、シノビオリンホモノックアウト胎仔は、造血系疾患、とりわけ赤芽球の分化異常が起因する疾患のモデル胎仔となり得る。また、この赤芽球の分化異常は、ＥＲストレス誘導性アポトーシスが主要因と考えられることから、シノビオリンホモノックアウト胎仔はＥＲストレス誘導性アポトーシスが起因した疾患のモデルにもなり得る。
本発明のモデル非ヒト動物としては、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ならびにウシ等）が好ましく、特にげっ歯類、例えばマウスまたはラットなどを用いることが好適である。
シノビオリン遺伝子機能が欠損した非ヒト動物は、例えば、ジーンターゲティングにより製造することができる。このようなモデル非ヒト動物を作製するには、例えば本発明のＤＮＡの一部または全部を置換、欠失、付加および／または挿入等により欠損させたターゲティングベクターを胚性幹（ＥＳ）細胞に導入し、染色体ＤＮＡと相同組み換えを起した細胞を選択する。相同組み換え体の選択のためには公知のポジティブ・ネガティブ選択を行うことができる。ポジティブ選択用マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ネガティブ選択用マーカーとしては、ジフテリア毒素（ＤＴ）−Ａ遺伝子やＨＳＶ−ｔｋ遺伝子などが挙げられる。サザンブロッティングやＰＣＲ等により、正しく組み換えられた細胞を選択することができる。得られた細胞は、８細胞期程度の受精卵または胚盤胞の胚盤胞腔などに注入し、輸精管結紮雄と交配させて作製した偽妊娠メス個体の子宮内に移植する。産仔のゲノムＤＮＡ解析は後述する実施例に基づいて実施することができる。産仔より血液または組織などの試料を得、この取り出した試料を基にＤＮＡ解析を行う。このＤＮＡ解析から、ヘテロノックアウトマウスであるか否かを同定し得る。
ホモノックアウトマウスを得るためには、ヘテロノックアウトマウス同士を交配させる。上記と同様に交配の結果として得られた胎仔のＤＮＡ解析を行い、ホモノックアウトマウスを同定する。なお、マウスの場合には、ホモノックアウト型は１３．５日齢頃に致死となった。そのため、生存しているマウス胎仔を得るためには、それ以前に子宮より摘出する。
シノビオリン機能欠損動物の創生は、シノビオリン遺伝子をノックアウトするだけでなく、このノックアウトと共に他の遺伝子をノックインすることもできる。ノックインする遺伝子に特に制限はない。例えばｌａｃＺ遺伝子等のマーカー遺伝子が挙げられる。
また、シノビリオンの機能を欠損させる手段としては、ジーンターゲッティンの他にも、アンチセンス法、リボザイム法またはｉＲＮＡ法などにより、染色体ＤＮＡ上のシノビオリン遺伝子を改変させずに、転写後の発現を阻害することで機能をオフさせる手段を用いてもよい。アンチセンス法においては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの転写産物に相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを、また、リボザイム法においては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの転写産物を切断するＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを、上記と同様に哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、これを哺乳動物の胚に注入し、該胚から個体を得ればよい。
また、ｉＲＮＡ法は、シノビリオン蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１に記載の配列からなる転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡおよびこのアンチセンスＲＮＡと相補するセンスＲＮＡとが対合した二重鎖ＲＮＡを発現するベクターを、上記と同様に哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、これを哺乳動物の胚に注入し、該胚から個体を得ればよい。
上記の通り、シノビリオンの機能を欠損した胎仔は、赤芽球の分化異常という性質を呈する。このような性質の発現は、１０．５日齢以降である。そのため、１０．５日齢以降であって致死に至る１３．５日齢以前の胎仔は、造血系疾患、とりわけ赤芽球の分化異常に起因した疾患のモデルとなる。また、胎仔そのものだけではなく、胎仔由来の細胞もまた、モデル細胞として利用し得る。胎仔由来の細胞として好適な例は、ＭＥＦｓなどである。これらモデル動物胎仔やこれに由来する細胞は、造血系疾患、特に赤芽球分化異常に起因した疾患に対する医薬候補化合物を含む種々の化合物の試験またはスクリーニングを行うことができる。本発明のモデル動物胎仔を利用した試験またはスクリーニングの方法としては、以下の方法が挙げられる。
本発明の造血系疾患用治療剤のスクリーニング方法は、シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔もしくは母体に被験物質を投与し、該非ヒト動物胎仔における赤芽球の状態を評価する。赤芽球が野生型と比較して同等程度に正常に分化しているか、あるいはホモノックアウト胎仔と比較して分化異常を示す数が低減している場合に、被検物質は造血系疾患の治療剤の候補となる。
また、別の態様のスクリーニング方法としては、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、スクリーニング方法が挙げられる。
（ａ）シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または当該胎仔由来細胞にＥＲストレス誘導剤を投与または接触させる工程
（ｂ）上記（ａ）工程の前もしくは後又は同時に前記シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる工程
（ｃ）前記非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
上記スクリーニング方法における造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔は、上述したシノビリオンの機能を欠損させたモデル胎仔を用いることができる。胎仔由来の細胞は、モデル胎仔から採取した細胞、好適には、ＭＥＦｓを用いることができる。
これらモデル胎仔または胎児由来の細胞に作用させるＥＲストレス剤は、例えば、ツニカマイシン、タプシガルギン、その他のＥＲストレスを誘導し得る薬剤を用いることができる。これらＥＲストレス剤により胎仔または胎仔由来の細胞にＥＲストレスを加える。
ＥＲストレス剤によりストレス誘導は、胎仔に直接投与するか、胎仔を生育しているカルチャー内に投与することにより実施し得る。また、胎仔由来の細胞へのストレス誘導は、細胞を培養しているカルチャー内にＥＲストレス剤を添加することにより実施し得る。
上記ＥＲストレス誘導工程の前もしくは後又は同時に、前記モデル胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる。この被験物質投与・接触方法は、被験物質の種類などにより、適宜選択することができる。胎仔への投与は、例えば胎仔を生育させるカルチャー内に添加してもよく、直接、体内に注入してもよい。細胞の場合には、被験化合物は例えば培地中に添加される。または、マイクロインジェクション等により細胞内に注入されてもよい。被験物質が遺伝子である場合は、ｎａｋｅｄ ＤＮＡとして、所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて、あるいは公知の発現ベクターに組み込んで細胞に遺伝子を導入することができる。
上記被験物質を作用させた後、非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する。アポトーシス細胞の測定は、実施例に示したＴＵＮＥＬアッセイにより行うことができる。ＴＵＮＥＬアッセイは市販のキットなどを用いて実施し得る。アポトーシス細胞の測定後、被験物質を作用させた群と、作用させていない群とのアポトーシス細胞数を比較する。ここで被験物質を作用させた群において、アポトーシス細胞数の有意な減少が見られたとき、当該被験物質はＥＲストレス誘導を抑制する活性を有し、赤芽球の正常な分化を誘導し得るものと判定される。
なお、上記スクリーニングに用いる被験化合物は特に制限はなく、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成低分子化合物、天然または合成高分子化合物、組織または細胞抽出液、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子ライブラリーの発現産物または発現ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、シノビオリン遺伝子の標的破壊を示す図および写真である。図１（Ａ）は、シノビオリン野生型アレル、ターゲティングベクター、ターゲティングされたアレルの構造、およびターゲティング前後の遺伝子の部分的な制限酵素地図を示す図である。遺伝子のエキソンは黒四角で示し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴ）、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＢＳＫ）は白四角で示した。用いた制限酵素部位を以下のように示す：Ｂ、ＢｇｌＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｎ、ＮｃｏＩ。図１（Ｂ）は、ターゲティングしたＥＳクローンおよびヘテロノックアウト（以下「ｓｙｎｏ＋／−」と表示する）マウス同士の交配により生じた胎児クローンのサザンブロット解析を示す写真である。野生型（以下、「ｓｙｎｏ＋／＋」と表示する）ＴＴ２ ＥＳ細胞（ＷＴ）および相同的ターゲティングされたＥＳクローン（クローン−１、クローン−２）のゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、外側プローブでハイブリダイズした。ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ＋／−アレルでは、それぞれ７．４−ｋｂおよび１１．７−ｋｂ断片を生じた。また、ｓｙｎｏ＋／−マウスの交配により生じたＥ１３．０胎仔から単離した染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、上記と同じプローブでハイブリダイズした。図１（Ｃ）は、ノーザンブロット解析を示す写真である。ｓｙｎｏ＋／−を用いた交配により生じたＥ１３．０胎仔から単離した２０μｇのトータルＲＮＡを、シノビオリンプローブまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブでハイブリダイゼーションした。図１（Ｄ）は、Ｅ１３．０胎仔から蛋白質を単離し、ＳＥＳ−ＰＡＧＥで分離した（５０μｇ蛋白質／レーン）結果を示す写真である。蛋白質をメンブレンにトランスファーした後、抗シノビオリン抗体と反応させた。
図２は、Ｅ１３．５ホモノックアウト（以下「ｓｙｎｏ−／−と表示する）胎仔の表現型を示す写真である。図２（Ａ）は、ｓｙｎｏ＋／＋、ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−Ｅ１３．５マウス胎仔の外観を示す。変異胎仔はｓｙｎｏ＋／＋と比較して同じ大きさであり、正常な発達を示す。図２（Ｂ）は、ヘマトキシリン・エオシンで染色したｓｙｎｏ＋／＋ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−Ｅ１３．５マウス胎仔の組織切片を示す写真である（×１０）。
図３は、Ｅ１３．５胎仔より採取した肝臓の組織像を示す写真である。ｓｙｎｏ＋／＋、ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−Ｅ１３．５の肝臓切片の詳細を示す（×４００）。ｓｙｎｏ−／−胎仔における細胞密度が低いことが観察された。
図４は、ｓｙｎｏ−／−胎仔由来肝臓細胞におけるアポトーシス細胞割合を解析した結果を示す写真である。（Ａ）ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−胎児由来の肝臓組織のＴＵＮＥＬ解析結果を示す（×２００）。ＴＵＮＥＬ陽性率はｓｙｎｏ＋／＋では１％であったのに対し、ｓｙｎｏ−／−では２５％と高値を示した。このように肝臓で観察された違いはｓｙｎｏ−／−全身にわたって観察された。（Ｂ）ｓｙｎｏ＋／＋およびホモノックアウトｓｙｎｏ−／−胎仔におけるヘマトキシン・エオシン染色結果を示す（×２００）。
図５は、Ｅ１０．５ｓｙｎｏ−／−胎仔の造血を示す写真である。メイグリュンワルド・ギムザで染色した、Ｅ１０．５ｓｙｎｏ＋／＋ｓｙｎｏ＋／−およびｓｙｎｏ−／−胎仔から単離した末梢血のサイトスピン標本を示す。ｓｙｎｏ−／−胎仔は、赤芽球形成の減少およびアポトーシスの亢進を示した（矢印）。
図６は、Ｅ１２．５ｓｙｎｏ−／−胎仔の造血を示す写真である。上段は生存Ｅ１２．５胎仔の末梢血のサイトスピン標本解析結果を示す。ｓｙｎｏ＋／＋胎仔と比較して、ｓｙｎｏ−／−胎仔では異常な赤芽球、核の断片化、およびハウエル・ジョリー小体が増加していた（矢印）。下段はメイグリュンワルド・ギムザで染色したＥ１２．５ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−胎仔の肝臓サイトスピン標本の解析結果を示す。ｓｙｎｏ−／−胎仔において、血球貪食が明らかに増加していた（矢印）。
図７は、１２．５日齢のｓｙｎｏ＋／＋およびホモノックアウト型ｓｙｎｏ−／−胎仔由来の肝臓におけるβグロビンの発現を免疫組織染色（×２００）により解析した結果を示す写真である。βグロビンの発現はｓｙｎｏ−／−胎仔では、ｓｙｎｏ＋／＋に比して減少していることが示されている（ｓｙｎｏ＋／＋：４．６０％，ｓｙｎｏ−／−：０．９０％、矢印で示す）。
図８は、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓはＥＲストレスに対する感受性の増加を示す写真およびグラフである。図８（Ａ）は、ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−マウス由来のＭＥＦｓを、低濃度の血清（１％ＦＣＳ）培地中で、抗Ｆａｓモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌで４８時間）、Ｘ線照射（６Ｇｙで７２時間）、タプシガルギン（１μＭで４８時間）、およびツニカマイシン（１０ｎｇ／ｍｌで４８時間）を含む様々なアポトーシス刺激で処理するか、または未処理（−）のままにした結果を示す写真である。ＴＵＮＥＬ解析によりアポトーシス細胞を検出した。図８（Ｂ）は、ｓｙｎｏ＋／＋よびｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓを、示した用量の刺激で処理した結果を示すグラフである。細胞死検出ＥＬＩＳＡ法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてＤＮＡの断片化を定量することにより、アポトーシスを測定した。＊Ｐ＜０．０１。アポトーシスｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓの数は、タプシガルギンおよびツニカマイシンで処理したものにおいて、それぞれのｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓと比較して高かった。図８（Ｃ）は、ＬａｃＺ（−）またはシノビオリン遺伝子（＋）を有するアデノウイルスベクター（１００ｍｏｉ）をｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓに感染させた後、前述と同じ薬剤で処理した結果を示すグラフである。ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいて、ＥＲストレスに誘導されるアポトーシスはシノビオリンの発現によりレスキューされた。
図９は、シノビオリンはＥＲＡＤ系を介して抗アポトーシス蛋白質として作用することを示す図である。シノビオリンの「機能喪失」は、ＥＲＡＤ系の破綻を介して全身性のアポトーシスもたらす。この過程により、細胞密度の低下および造血の異常が生じ、ひいては胎仔が死亡する。一方、シノビオリンの「機能獲得」は、シノビオリンの抗アポトーシス効果を介して関節症の自然発症をもたらす。さらに、ｓｙｎｏ＋／−マウスは、関節炎に関連する実験で頻繁に用いられるモデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に耐性である。まとめて考えると、シノビオリンはＥＲＡＤ系を介して「細胞機能の維持」において重要な役割を担う。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本願発明をより詳細に説明するが、本願発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］ シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスの作製
マウスシノビオリン遺伝子を破壊するため、ターゲティングベクターを構築した（図１）。ベクター構築のため、Ｃ５７ＢＬ／６ゲノムライブラリーよりシノビオリンｃＤＮＡをクローニングした。遺伝子の翻訳開始コドンの位置にＮｃｏＩ部位を作出した後、遺伝子のＮｃｏＩ／ＢａｎＨＩ断片をＬａｃＺカセットで置換した（Ｓａｇａ，Ｙ．，Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｔ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９２．Ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｎｏｒｍａｌｌｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｅｎａｓｃｉｎ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：１８２１−１８３１．）。ｐＭＣ１ｎｅｏ由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）遺伝子カセット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）をＬａｃＺ遺伝子の下流に配置した。シノビオリン遺伝子の１．８５−ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ断片および８．５−ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ断片を、これらのカセットのそれぞれ上流および下流に含めた。ＤＴ−Ａカセットでの負の選択は、以前に記載されている（Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｎａｄａ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔａｍｅｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｎ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９３．Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：７７−８６）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡマウスのＦ１胎仔由来のＴＴ２ ＥＳ細胞を、以前に記載されているようにフィーダー細胞上で培養した（Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．，Ｎａｄａ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｔｓｕｋａｄａ，Ｔ．，Ｓａｇａ，Ｙ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｎ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９３．Ａ ｎｏｖｅｌ ＥＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＴＴ２，ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｇｅｒｍｌｉｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：７０−７６．）。このＴＴ２ ＥＳ細胞に上記ターゲティングベクターをエレクトロポレーションにより導入した。導入後、ベクターと内在のシノビオリン座位との間で相同的組換えが生じた場合、シノビオリン座位にはＡＴＧ翻訳開始部位にインフレームのｌａｃＺレポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子が挿入される。ｌａｃＺカセットはポリ（Ａ）付加配列を含むため、シノビオリン融合蛋白質の翻訳は妨げられると考えられる。
エレクトロポレーション後、薬剤Ｇ４１８で選択し、ｎｅｏ耐性ＴＴ２ ＥＳクローンを単離した。単離されたクローンから染色体ＤＮＡを回収し、制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した。この制限酵素消化産物を電気泳動で分離後、図１Ａに示されたプローブを用いてサザンブロット解析を行い、遺伝子型を同定した。上記相同組換体は、サザンブロット解析により確認した（図１Ｂ左）。
２つの独立したｓｙｎｏ＋／−ＥＳクローンをＩＣＲの８細胞期胚に注入した（Ｙａｇｉ，Ｔ．，Ｎａｄａ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔａｍｅｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｎ．，Ｉｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ Ａｉｚａｗａ，Ｓ．１９９３．Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：７７−８６．）。８０％を超えるアグーチ色の毛色を有するキメラ雄をＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ１雌と交配し、尾部由来および卵黄嚢（ｙｏｌｋ ｓａｃ）由来ゲノムＤＮＡをサザンブロット解析またはＰＣＲ解析することにより、変異アレルのジャームライントランスミッションを同定した（図１Ｂ左）。遺伝子型同定には、以下のプライマーを用いた；
これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、９６℃２分間、９６℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３分間のサイクルを３５サイクル、最終サイクルの後の７２℃１０分間の伸長反応、その後４℃で冷却という条件で行った。このＰＣＲ解析により、変異および野生型アレルからそれぞれ６．９ｋｂおよび２．６ｋｂのフラグメントが生成される。
上記２つの独立したｓｙｎｏ＋／−ＥＳクローンをＩＣＲ−８細胞期に注入した結果、ジェームライントランスミッションを起こした（図１Ｂ左）。変異に関してヘテロ接合性であるｓｙｎｏ＋／−Ｆ１マウスは生存可能、繁殖可能であり、明らかな表現型の異常は認められなかった（データは示さず）。ｓｙｎｏ−／−マウスを作出するためにｓｙｎｏ＋／−マウスを交配させ、新生子孫の遺伝子型を同定したが、ｓｙｎｏ−／−マウスは同定されなかった。このことからシノビオリンの欠損は胎生致死をもたらす可能性が考えられた。そこで様々な発生段階での胎仔の解析を行ったところ、およそ１３．５日齢までに致死となっていることが明らかとなった（表１）。
このターゲティングされたシノビオリン変異体の性質を判定するため、いずれも１３日齢のｓｙｎｏ＋／＋胎仔、ｓｙｎｏ＋／−胎仔およびｓｙｎｏ−／−胎仔からゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡおよび蛋白質を調製し、それぞれサザンブロッティング、ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングにより解析した。
なお、ＲＮＡ単離はチオシアン酸グアニンジンフェノールクロロホルム抽出法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．１９８７．Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９．）に基づくＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を用いて実施し、Ｅ１３．０胎仔からトータルＲＮＡを単離した。次に２０μｇのトータルＲＮＡをグリオキサールで変性させ、電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。クローニングしたシノビオリンｃＤＮＡフラグメントにおける１２３５−３０２８塩基に相当するＤＮＡプローブでメンブレンをハイブリダイズした。
図１Ｂ右、ＣおよびＤに示すように、ｓｙｎｏ−／−胎仔ではシノビオリン遺伝子が欠損し、またシノビオリンｍＲＮＡも蛋白質も検出されなかった。したがって、ｓｙｎｏ−／−胎仔はシノビオリン転写産物も蛋白質も発現していないことが確認された。
［実施例２］ ｓｙｎｏ−／−胎仔におけるアポトーシス細胞死
シノビオリン変異が致死となる胎仔発生の段階を同定するため、Ｅ１０．５〜Ｅ１８．５の胎仔を解析した。解析のため、子宮から胎仔を摘出した。遺伝子型同定のために卵黄嚢を回収した。次に胎仔の組織学的解析を行うために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド中で胎仔を一晩固定してパラフィンに包埋し、４μｍ切片を切り出しヘマトキシリン・エオシンで染色し、何枚かの切片はＴＵＮＥＬアッセイに使用した。サイトスピン標本のために、５０％ＦＣＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に末梢血を回収した。Ｅ１２．５胎仔の胎仔肝を同じ培地１ｍｌ中で２５ゲージ針を用いて破壊し、約７μｌを２００μｌの培地に希釈し、サイトスピンした。末梢血および胎仔肝のスライドをメイグリュンワルド・ギムザで染色した。
Ｅ１１．５ではｓｙｎｏ−／−胎仔の大多数（８８．９％）が生存可能であったが、Ｅ１３．５ではごくわずかなｓｙｎｏ−／−胎仔しか生存していることが認められなかった（表１）。Ｅ１３．５の胎仔を形態学的に解析したところ、ｓｙｎｏ−／−胎仔、ｓｙｎｏ＋／−胎仔およびｓｙｎｏ＋／＋同腹仔の間に外見上の顕著な変異は認められなかった（図２Ａ）。また、また組織学的な検討からもｓｙｎｏ−／−胎仔において、主要な臓器が欠失しているなどといった重篤な変異は認められなかった（図２Ｂ）。
しかし、ｓｙｎｏ−／−胎仔の肝臓組織像を狭画にて検討した結果、ｓｙｎｏ＋／＋胎仔やｓｙｎｏ＋／−胎仔に比べｓｙｎｏ−／−胎仔では全身で細胞密度が低下していることが確認された（図３）。我々は、細胞密度の低さはｓｙｎｏ−／−胎仔でのアポトーシス細胞死の亢進によるものと想定した。
シノビオリンの喪失によって誘導されるアポトーシス細胞死の程度を測定するため、各段階の胎仔でＴＵＮＥＬ解析を実施した。詳細には、肝臓組織および切片は上述の方法で調製した。これら標本をＴＵＮＥＬ解析に供した。ＴＵＮＥＬ解析は製造業者（ＭＥＢＳＴＡＩＮアポトーシスキットＩＩ、Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）．により提供されたプロトコールにしたがって実施した。異なる３領域における細胞１０００個当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数をカウントし、ＴＵＮＥＬ陽性細胞割合を算出した。
Ｅ１２．５ではアポトーシス細胞死はとりわけ肝臓において顕著に検出された。またアポトーシス細胞の数はｓｙｎｏ＋／＋胎仔（１％）と比較してｓｙｎｏ−／−胎仔（２５％）において有意に増加していた（図４Ａ）。この段階の胎仔では、シノビオリンは造血細胞を含めて偏在的に発現されている（データは示さず）。
［実施例３］ ｓｙｎｏ−／−胎仔の造血における異常なアポトーシス
マウス胎仔の正常な発生過程では、造血の主要器官はＥ１１．５〜Ｅ１２．５頃に卵黄嚢から胎仔肝に移行する（Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．１９９５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ ８６：２８７６−２８９１．）。Ｎｕｌｌ突然変異マウスの様々な遺伝子の解析に基づくいくつかの研究から、造血機能障害はこの発生段階での致死と関連する場合が多いと結論づけられている（Ｎｕｅｚ，Ｂ．，Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｃｈ，Ｄ．，Ｂｙｇｒａｖｅ，Ａ．，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．１９９５．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＫＬＦ ｇｅｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３１６−３１８．；Ｏｋｕｄａ，Ｔ．，ｖａｎＤｅｕｒｓｅｎ，Ｊ．，Ｈｉｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｇ．，ａｎｄ Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．１９９６．ＡＭＬ１，ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ ８４：３２１−３３０，；Ｋｉｅｒａｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ａ．Ｃ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．１９９６．Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：９１２６−９１３１．；Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｓｔａｃｙ，Ｔ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｆ．，Ｇｕ，Ｔ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，Ｂｕｓｈｗｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｂｏｒｉｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｙａｎ，Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．，Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ，Ａ．，Ｂｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｍａｒｉｎ−Ｐａｄｉｌｌａ，Ｍ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ，，ａｎｄ Ｓｐｅｃｋ，Ｎ．Ａ．１９９６．Ｔｈｅ ＣＢＦｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＣＢＦａｌｐｈａ２（ＡＭＬ１）ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ ８７：６９７−７０８．；Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｓｕｄｏ，Ｔ．，Ｓｅｎｆｔｌｅｂｅｎ，Ｕ．，Ｄａｄａｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｋａｒｉｎ，Ｍ．２０００．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐ３８ａｌｐｈａ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １０２：２２１−２３１．；Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｐｈａｒｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｌａｖｅｎｂｕｒｇ，Ｋ．Ｒ．，Ｊａｃｋｅｒｓ，Ｐ．，Ｐａｐａｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｏｇａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．２０００．Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ｉｍｐａｉｒｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ，ａｎｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｌｉ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：５６４３−５６５２．；Ｋａｗａｎｅ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｏｎｄｏｈ，Ｇ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｊ．，Ｏｈｓａｗａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．２００１．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮａｓｅ ＩＩ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５４６−１５４９．）。そこで、ｓｙｎｏ−／−胎仔における造血の状態を検討するため、Ｅ１０．５、Ｅ１２．５の末梢血およびＥ１２．５の胎仔肝のサイトスピン標本を調べた。
先ず、一次造血の状態を解析するために、Ｅ１０．５から得られた末梢血試料を染色し、ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ＋／−の同腹仔の赤芽球形成（３．０±０．６６×１０５細胞）を比較した（図５）。ｓｙｎｏ−／−胎仔では、ｓｙｎｏ＋／＋およびｓｙｎｏ＋／−胎仔と比較して、その減少（８．３±０．４６×１０５細胞）が示された。さらに、ｓｙｎｏ＋／＋赤芽球ではアポトーシスは観察されなかったのに対して、ｓｙｎｏ−／−赤血球ではアポトーシスが認められた（図示せず）。
次に、二次造血が行われている１２．５日齢の末梢血のギムザ染色を行った。ここでは先程の一次造血によって形成された赤芽球よりもさらに分化の段階が進んだ赤芽球が観察され、また脱核が起こった成熟赤血球も認められる。Ｅ１２．５の末梢血試料の染色では、ｓｙｎｏ＋／＋（４．０±０．１８×１０５細胞）と比較してｓｙｎｏ−／−胎仔では赤芽球数の減少（１８．０±０．１９×１０５細胞）が示された（図６）。さらに、ｓｙｎｏ−／−胎仔では、ハウエル・ジョリー小体、核の断片化を起こしている赤芽球、二分葉の核を持つ赤芽球等の異常な赤芽球の比率が、ｓｙｎｏ＋／＋同腹仔では１．８％であるのに対して１０．５％と顕著に高かった（表２、異常な赤芽球を図６上段矢印で示す）。
上記観察において、ｓｙｎｏ−／−胎仔で一次造血の際に認められた赤芽球でのアポトーシスは、Ｅ１２．５の時点ではほとんど認められなかった。この理由を検討するために肝臓のギムザ染色を行った。ギムザ染色の結果（図６下段）、マクロファージによる赤芽球の貪食、すなわちｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓの像（図６下段矢印で示す）は、ｓｙｎｏ＋／＋やｓｙｎｏ＋／−ではほとんど見られないのに対し、ｓｙｎｏ−／−では１００マクロファージ細胞中２２個と有意に増加していることが確認された（表３）。このことから、１０．５日齢で見られたようなアポトーシスを起こした赤芽球は造血の場である肝臓においてマクロファージにより貪食・排除され、その結果、Ｅ１２．５由来の末梢血ではアポトーシスを起こした赤芽球が認められないということが予測される。
この現象は、ｓｙｎｏ−／−胎仔肝の組織学的切片においても認められた（図３）。これらの結果から、マクロファージが活性化され、異常な赤芽球を貪食したことが示唆された。総合して考えると、これらの知見から、シノビオリンの欠如はアポトーシスの亢進に起因する異常な赤血球分化に関連することが示唆され、ｓｙｎｏ−／−胎仔は循環する赤芽球数が減少した結果として貧血で死ぬと考えられる。
さらに本願発明者らは、シノビオリンの造血への関与を研究するために、二次造血のマーカーであるβ−グロビンの発現を免疫組織染色法により検討した。
免疫組織染色は以前に報告されている通りの手法で実施した（Ｋａｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。切片は抗β−グロビン抗体で一晩インキュベートした。抗原−抗体の特異的な反応はジアミノベンジン基質クロモジェンシステム（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用い、添付のマニュアルに従って実施した。異なる３つの領域中の細胞を１０００個数え、陽性細胞率を計算した。
その結果、β−グロビンの発現がｓｙｎｏ−／−ではｓｙｎｏ＋／＋マウスに比べ顕著に減少していることが明らかとなった（図７）。この結果は造血、とりわけ二次造血においてシノビオリンが重要な役割を果たしていることを示している。
［実施例４］ ｓｙｎｏ−／−マウス胎仔線維芽細胞は、ＥＲストレスに選択的に影響を受けやすい
アポトーシスは、いくつかの経路を介して誘導され得る。シノビオリンの関与を説明するアポトーシス経路を同定するため、ｓｙｎｏ−／−およびｓｙｎｏ＋／＋胎仔からＭＥＦｓを単離した。ＭＥＦｓは、１０．５日齢のｓｙｎｏ−／−およびｓｙｎｏ＋／＋胎仔の頭部および臓器を除去した後、これらの胎仔をトリプシン消化することにより単離した。単離した細胞を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地で培養した。このＭＥＦｓに対して以下の４つのアポトーシス刺激をインビトロで加えた；モノクローナル抗Ｆａｓ抗体（Ａｂ），γ照射、ツニカマイシン（Ｎ−グリコシル化阻害剤）、およびタプシガルギン（Ｃａ２−ＡＴＰａｓｅ阻害剤）。
対照条件下では、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓアポトーシス細胞の比率はｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓ（６±２％）よりも高かった（１６±４％、図８Ａ）。Ｆａｓ刺激またはγ照射では、アポトーシスｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓおよびｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓの数は変化しなかった（Ｆａｓ：ｓｙｎｏ−／−、４５±２％、ｓｙｎｏ＋／＋４３±４％；γ照射：ｓｙｎｏ−／−３４±６％、ｓｙｎｏ＋／＋３１±２％、図８Ａ）。一方、ＥＲストレス誘導剤であるツニカマイシンおよびタプシガルギンでは、ＴＵＮＥＬ陽性ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓの数がｓｙｎｏ＋／＋ＭＥＦｓと比較してそれぞれ１．７倍および２．４倍に増加した（３３±７％に対して５６±３％；３８±７％に対して９０±１％、図８Ａ）。さらに、ＥＲストレス誘導剤に対する感受性は、用量依存的な様式で増加した（図８Ｂ）。
上記ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓに与えられたアポトーシス刺激による影響が外来からシノビオリン遺伝子を導入することにより低減または消失するかを検討した。Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）発現系により、製造業者の説明に従い（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．カリフォルニア州、パロアルト）、Ｆｌａｇタグ化シノビオリンまたはＬａｃＺの遺伝子を含むアデノウイルスベクターを調製した。ＨＥＫ２９３細胞でｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎアッセイを行うことにより、ウイルス調製物の力価を測定した。細胞当たりのウイルス粒子数（プラーク形成単位：ＰＦＵで測定される）を、ｍｏｉとして表した。感染ＭＥＦｓに標的遺伝子を４８時間発現させた後、表示の試薬で処理した。
ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいて、Ｆａｓを介したアポトーシスおよびγ照射によって誘導されたアポトーシスは、アデノウイルスを用いたシノビオリンの発現によりレスキューされなかったのに対し、ＥＲストレスによって誘導されたアポトーシスはレスキューされた（図８Ｃ）。総合して考えると、これらの結果から、シノビオリンはＥＲストレスにより誘導されるアポトーシスからＭＥＦｓをレスキューするが、Ｆａｓまたはγ照射により誘導されるアポトーシスからは救出されないことが示唆される。さらに、ＣＨＯＰ／Ｇａｄｄ１５３、ＡＴＦ−６、カスパーゼ−１２等のＥＲストレス誘導性蛋白質の発現をウェスタンブロッティングにより解析したが、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいてこれらの蛋白質は誘導されていることが認められた（データは示さず）。
上記ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓにおいて、データには示さないがＣＨＯＰ／Ｇａｄｄ１５３およびＡＴＦ−６を含むＥＲストレス誘導性蛋白質の発現が誘導された。これらの蛋白質は、ＥＲストレスに対抗するＵＲＰに関与すると考えられている。したがって、ｓｙｎｏ−／−ＭＥＦｓでは、アポトーシスは、ＥＲストレスに応答したＵＰＲ系を介してではなく、ＥＲＡＤ系の破綻によって誘導されるように思われる。すなわち、ＥＲＡＤ系は蛋白質の品質管理に主に関与しているようであり、それは同時に特に胎仔形成過程における「生命の維持」に不可欠である。ＣＨＩＰ、ｇｐ７８／ＡＭＦＲ、パーキン、およびＦｂｘ２／ＦＢＧ１／ＮＦＢ４２等のいくつかのユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が、ＥＲＡＤ系に関与することが報告されている。しかし、シノビオリンの「機能喪失」は、代替機能がないことから、胎仔形成過程において致死となるのであろう。我々の研究は、他のユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の中でも特にシノビオリンが、ＥＲＡＤ系において極めて重要な役割を果たすことを明らかに示唆するものである。
産業上の利用の可能性
ＥＲＡＤ系のユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の中で中心的役割を担うと考えられている酵母Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｌ３（Ｂａｙｓ，Ｎ．Ｗ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｅｅｌｉｇ，Ｌ．Ｐ．，Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｙ．２００１．Ｈｒｄ１ｐ／Ｄｅｒ３ｐ ｉｓ ａｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２４−２９．）のヒト相同体であるシノビオリンの機能を解析するため、本研究において我々は、インビボでのＥＲＡＤ系の機能を明らかにする手段としてＥＳ細胞を用いてシノビオリンを欠損したマウスを作製した。
上記において詳述した通り、ｓｙｎｏ−／−マウスはＥ１２．５〜Ｅ１３．５までに子宮内で死亡した。ｓｙｎｏ−／−胎仔では、過度のアポトーシスによりいくつかの器官で明らかに低い細胞密度を示し、造血系においてもアポトーシスの異常が認められた。このことから、ｓｙｎｏ−／−胎仔は造血系疾患、とりわけ、ＥＲストレス誘導性アポトーシスが起因した赤芽球の分化異常に関わる疾患の研究あるいは治療剤開発のためのモデルとして利用し得る。このように１３．５日齢付近で胎生致死となるＫＯマウスは他にも報告されているが（表４）、本願発明のモデルはこれら報告されているものとは別個の遺伝子であるシノビオリンがノックアウトされている。したがって、本発明のモデルは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などを欠損したモデルでは解析できない造血系疾患のモデルとして、さらには造血系疾患治療薬の探索に役立つことが期待される。
本願発明者らはまた、ｓｙｎｏ−／−胎仔における造血系細胞の低下を裏付けた実験としてｓｙｎｏ−／−胎仔由来のＭＥＦｓを用いた実験を示した。ここではインビトロでＥＲストレスに対して高く選択的な感受性を示し、ｓｙｎｏ−／−胎仔におけるアポトーシス細胞死はＥＲストレスによって誘導され得ると考えられる。この実験より、ｓｙｎｏ−／−胎仔由来のＭＥＦｓが、ＥＲストレス誘導性アポトーシスを研究するためのモデル細胞となること、さらには、このアポトーシスを回避または抑制するための薬剤のスクリーニング用の細胞として利用し得ることを示している。
また、本発明のシノビオリン等を有効成分とする造血系疾患の医薬製剤は、遺伝的な要因でまたは後発的な環境的要因からシノビオリンの機能低下または発現低下が起因して造血系疾患を発症している患者の治療剤として有効になると期待される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項２】
造血系疾患が、赤芽球の分化異常に起因する疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクターを、造血幹細胞に導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
造血幹細胞において、以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質を発現させる工程を含む、赤芽球を分化させるための方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項５】
以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、造血系疾患の治療用医薬製剤。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持した造血幹細胞である、請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
【請求項８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を有効成分として含有する、造血系疾患の治療剤。
【請求項９】
シノビオリン遺伝子機能が欠損している、造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１０】
非ヒト動物がげっ歯目動物である、請求項９記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１１】
げっ歯目動物がマウスである、請求項１０記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１２】
１３．５日齢以前の胎仔である、請求項１１記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１３】
造血系疾患が赤芽球の分化異常に起因する疾患である、請求項９記載の造血系疾患モデル非ヒト動物。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれかに記載の造血系疾患モデル動物胎仔由来の造血系疾患モデル細胞。
【請求項１５】
線維芽細胞である、請求項１４記載の造血系疾患モデル細胞。
【請求項１６】
シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔に被験物質を投与し、該非ヒト動物胎仔における赤芽球の状態を評価する、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または当該胎仔由来細胞にＥＲストレス誘導剤を投与または接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる工程、
（ｃ）前記非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
【請求項１８】
以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ＥＲストレス除去剤のスクリーニング方法。
（ａ）内在シノビオリン遺伝子機能が欠損している細胞にＥＲストレス誘導剤を作用させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｃ）前記細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
【請求項１】
以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項２】
造血系疾患が、赤芽球の分化異常に起因する疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクターを、造血幹細胞に導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
造血幹細胞において、以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質を発現させる工程を含む、赤芽球を分化させるための方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項５】
以下の（ａ）−（ｄ）からなる群から選択されるいずれかの蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、造血系疾患の治療用医薬製剤。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持した造血幹細胞である、請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を投与する工程を含む、造血系疾患の治療方法。
【請求項８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の活性増強剤を有効成分として含有する、造血系疾患の治療剤。
【請求項９】
シノビオリン遺伝子機能が欠損している、造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１０】
非ヒト動物がげっ歯目動物である、請求項９記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１１】
げっ歯目動物がマウスである、請求項１０記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１２】
１３．５日齢以前の胎仔である、請求項１１記載の造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔。
【請求項１３】
造血系疾患が赤芽球の分化異常に起因する疾患である、請求項９記載の造血系疾患モデル非ヒト動物。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれかに記載の造血系疾患モデル動物胎仔由来の造血系疾患モデル細胞。
【請求項１５】
線維芽細胞である、請求項１４記載の造血系疾患モデル細胞。
【請求項１６】
シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔に被験物質を投与し、該非ヒト動物胎仔における赤芽球の状態を評価する、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、造血系疾患の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または当該胎仔由来細胞にＥＲストレス誘導剤を投与または接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記シノビオリン遺伝子機能が欠損している造血系疾患モデル非ヒト動物胎仔または前記胎仔由来細胞に被験物質を投与または接触させる工程、
（ｃ）前記非ヒト動物胎仔または胎仔由来細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
【請求項１８】
以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ＥＲストレス除去剤のスクリーニング方法。
（ａ）内在シノビオリン遺伝子機能が欠損している細胞にＥＲストレス誘導剤を作用させる工程、
（ｂ）上記（ａ）工程の前後又は同時に前記細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｃ）前記細胞におけるアポトーシスが誘導された細胞を測定する工程
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６３６７
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【発行日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３２１８（Ｐ２００５−５１３２１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９５１
【国際出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【出願人】（３０１０５０９０２）株式会社ロコモジェン (15)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【発行日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９５１
【国際出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【出願人】（３０１０５０９０２）株式会社ロコモジェン (15)
【Ｆターム（参考）】
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