選択的界面活性剤を用いたＨＤＬコレステロールセンサ
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）試料中の高密度リポタンパク質と選択的に反応する界面活性剤であって、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに高密度リポタンパク質中のコレステロール量を、例えば電気化学的技法を用いて測定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含有する試料中の、高密度リポタンパク質に結合するコレステロール（ＨＤＬコレステロール）量を決定するための方法に関する。本発明はまた、そのような方法において使用するための組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの疫学的研究で、コレステロール又はａｐｏ Ａ１含量のいずれかの観点で測定される高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性に対する、強く、且つ非依存的な逆相関が証明されてきた。ＨＤＬコレステロールが１０ｍｇ／Ｌ低下するごとにＣＡＤの危険性が２〜３％増加するといわれている。従って、ＨＤＬコレステロール濃度がより高いほど、予防的であると考えられている。従って、ＣＡＤに対する危険性を明らかにする際、及び脂質異常症の治療を行う際のＨＤＬコレステロールの測定が、臨床検査室でますます一般的になってきた。
【０００３】
研究技法から適合された、ＨＤＬコレステロール測定のための初期の検査室的方法では、沈殿試薬を用いる手作業の分離段階、それに引き続いてたいていの場合には自動化学分析装置による、コレステロール含量の分析が必要とされた。典型的な分離段階は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びキロミクロン（ＣＭ）のアグリゲートを形成するために、沈殿試薬をこれらの成分と反応させることを伴っていた。その後アグリゲートを、例えば遠心分離によって、反応容器から除去して、ＨＤＬ含有試料を分析できる状態にしておいた。沈殿物がＵＶ／Ｖｉｓ又は使用される比色分析技法を妨げないようにするため、沈殿物の分離が不可欠であった。
【０００４】
より最近になって、様々なリポタンパク質画分の分離を事前に必要としない、多くの技法が開発されてきた。これらの方法は、典型的には、単一の段階で、又は少なくとも沈殿を実施する必要なく測定を成し遂げることができるという利点を有する。従って、測定の自動化が可能である。そのようなアプローチのあるものでは、様々なリポタンパク質画分を異なる速度で分解するある種の界面活性剤が用いられる。例えばある界面活性剤は、最初にＬＤＬとより迅速に反応するかもしれず、そしてＨＤＬとの反応はより緩やかに起こるかもしれない。当該界面活性剤を加えた後、所定の時間にコレステロール含量を測定することによって、測定が、ＬＤＬコレステロール含量よりもＨＤＬコレステロール含量により大きく依存することが分かってきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このアプローチは、その結果に必要な精度及び信頼性を生じてきておらず、また測定は、依然としてある程度の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量への依存性を残していた。従って、血液や血漿等の体液のＨＤＬコレステロール含量の測定のための簡単であるが信頼でき且つ正確な方法を提供する新たなアプローチが必要である。測定はまた、試験試料中の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合したコレステロール含量への依存が低いか、又はそれらと完全に独立していなくてはならない。更に、好ましい方法は、専門的な設備を用いないか、又は実施するために熟練の技術者を必要としないであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤であって、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに該高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法を提供する。
【０００７】
本発明で用いられる界面活性剤は、非常に高い選択性を、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して有する。以前の界面活性剤は、他のリポタンパク質と比較して、異なる速度でＨＤＬと反応することが示されてきているが、本発明の界面活性剤は、ほぼ排他的にＨＤＬと反応し、他のリポタンパク質と反応しないか、又は実質的に反応しない。試料中のＨＤＬは、可溶化して反応に利用できるＨＤＬコレステロールを残すが、一方で他のリポタンパク質画分に結合したコレステロールは、リポタンパク質構造内に結合したままで、反応には利用可能ではないと考えられている。しかしながら、本発明は、この作用様式には縛られない。代替的な理論としては、本発明の界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応するのを選択的に可能にするものであるが、一方でＬＤＬコレステロールは実質的に反応できないというものである。従って、その後の、試料のコレステロール含量の測定では、ＨＤＬ−コレステロール含量のみが反映され、他のリポタンパク質画分内に含有されるコレステロール量には実質的に依存しない。従って、本発明の方法は、ＨＤＬに対して高度に選択的であり、ＨＤＬ−コレステロールについての正確で信頼できる試験を提供する。
【０００８】
本発明の方法は、先行技術の試験と比較して、改善された簡便性という、更なる利点を有する。ＨＤＬコレステロールの測定結果は、試料を単一の試薬混合物と反応させ、且つコレステロール含量を１回測定することによって得ることができる。更に、結果は非常に短時間で得ることができ、典型的には試料を添加して１分又は数分以内に得ることができる。
【０００９】
ＨＤＬコレステロールの測定は、典型的には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼのいずれかと反応させることによって行う。従って、本発明はまた、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において用いるための試薬混合物であって、
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する、本明細書中に規定した通りの界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ
を含む、試薬混合物を提供する。
【００１０】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する、本明細書中に規定した通りの界面活性剤、（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段、を含む、キットも提供する。
当該キットは、典型的には、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段が
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極（counter electrode）を有する電気化学セル；
− 該セルに電位を印加するための電源；並びに
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、電気化学的装置である。
【００１１】
本発明はまた、本発明のキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び、電極と接触させること；
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成した生成物量を電気化学的に検出すること
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明で用いられる界面活性剤は、ＨＤＬコレステロールの決定の再現性を向上させるという特別な利点を有する。ある種のエステラーゼ若しくはリパーゼを単独で、又はＣＨＡＰｓ若しくはデオキシＢＩＧＣＨＡＰ等の界面活性剤とともに使用することによって、ＨＤＬと他のリポタンパク質との間に、ある程度の差別化を実現できることがわかってきた。しかしながら、患者試料での決定は、極めてばらつきやすいことがわかってきた。本発明に記載する界面活性剤を用いると、このばらつきを有意に低減することがわかった。これは、比較の基準の統計的測定（例えば、ＨＤＬ濃度が電極電流と関連する較正線の改善されたＲ２値）と関連して最もよく説明されるが、他の統計的手法、特に重回帰分析を用いても、示すことができる。
【００１３】
従って、本発明の界面活性剤が、多数の試験に特有のばらつきを低減するのは明らかである。ばらつきの低減で、アッセイにおける正確さ及び精度が改善する。ばらつきの低減で、本発明は、多数の異なる試験結果が比較される特定の用途（例、一人の患者のコレステロールレベルの長期にわたるモニタリング）の発見にもつながる。
【００１４】
従って、本発明はまた、本明細書中に規定する界面活性剤を、高密度リポタンパク質中のコレステロール量の決定方法の再現性を向上（例、ＨＤＬ濃度が電極電流に関係する較正線のＲ２値の改善）させるのに使用することを提供する。また、試料中のＨＤＬコレステロール量の決定の再現性の向上（例、ＨＤＬ濃度が電極電流と関連する較正線のＲ２値の改善）方法であって、試料を、（ａ）本明細書中に規定した通りの界面活性剤と反応させること、及び高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施形態による装置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、試料のＨＤＬ−コレステロール含量を選択的に決定する方法を提供するが、ここで試料は、ＨＤＬのみならず、コレステロールに結合する他のリポタンパク質を含有し得るものである。ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して高度に選択的な特異的界面活性剤と、試料を反応させることによって選択性が実現される。従って、当該界面活性剤により、ＨＤＬに結合するコレステロール及びコレステロールエステル類が測定のために利用可能となるが、一方でＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合するものはリポタンパク質の構造に結合したままであって、後のコレステロール含量の測定において実質的に反応しない。
【００１７】
コレステロール及びコレステロールエステル類は、主としてリポタンパク質粒子中で血液を運搬されることが知られている。酵素及び界面活性剤が、そのようなコレステロールをデヒドロゲナーゼによって酸化されるのに利用可能とする正確なメカニズムに関しては、議論がある。従って、本明細書の全範囲で、「分解する」又は「利用可能にする」又は「反応性を与える」等の用語はすべて、処理過程によって、分析に関する応答が任意の試料中のコレステロール類から得られるものである当該処理過程に関するものであることが理解される。しかしながら、我々は、作用様式に関してあらゆる特定の理論にも縛られることを望んでいない。従って、「高密度リポタンパク質を選択的に分解する」という界面活性剤は、例えば、高密度リポタンパク質において選択的にコレステロールの利用可能性を高めることによって、又は異なるメカニズムよって働き得る。
【００１８】
本発明で用いられる界面活性剤は、試料中の高密度リポタンパク質を選択的に分解するものである。これは、当該界面活性剤は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭと比較して、ＨＤＬと選択的に反応することを意味する。代替的には、当該界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいて、ＨＤＬコレステロールが反応すること（典型的には、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応すること）を選択的に可能にするものとして定義できる。本発明の文脈では、ＨＤＬを選択的に分解する界面活性剤、又はコレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応することを選択的に可能にする界面活性剤は、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００１９】
ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、式（ｉ）に従った回帰により、生理学的試料の範囲に渡ったデータから決定され得る：
【００２０】
【数１】
【００２１】
（式中、ＧｘはＸに対する、測定された応答のグラジエント（例、Ｘの既知の濃度に対する、測定された電流）である）。測定される応答は、リポタンパク質濃度に関係する（又は対応する）（例えば、リポタンパク質濃度に比例する）任意の測定値であり得る。
【００２２】
生理学的試料中には、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールの両方が存在する。この場合、多重回帰のための標準的な方法を、（ｉ）測定されたコレステロール濃度ＧＨＤＬ及びＧＬＤＬのそれぞれのグラジエントの値を見積もること、によって用いてもよい。
【００２３】
従って、当業者は、選択した界面活性剤を用いてＨＤＬコレステロール含量が既知の試料のＨＤＬコレステロール含量を測定し、そして対応して同じ手順を用いて、ＬＤＬコレステロール含量が既知の試料のＬＤＬコレステロール含量を測定することによって、任意の所与の界面活性剤がＨＤＬを選択的に分解するものかどうかを、容易に決定できる。その結果からディファレンシエーションの値が計算できる。ＨＤＬコレステロール含量又はＬＤＬコレステロール含量を測定するための手順は、典型的には、選択した界面活性剤を用いる、下記の実施例１に記載したものである。
【００２４】
本発明において、ＨＤＬ濃度は典型的には、コレステロールのコレステノンへの電気化学的変換に際して、電極で生じる電流を決定することによって電気化学的に測定される。従って、典型的には、測定電流値を、グラジエントを決定するために用いる。
【００２５】
好ましい実施形態においては、本発明の選択的界面活性剤は、実質的にＬＤＬを分解しない。従って、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、経時的に一定である。しかし、一部の界面活性剤は、非常に緩やかではあるが、依然としてＬＤＬを分解し得る。この場合、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、時間とともに変動し得る。ディファレンシエーションは、ＨＤＬコレステロール試験の間に用いる経過時間と同じの、試料への試薬の添加とコレステロール含量の測定との間の経過時間を用いて測定しなくてはならない。そのような経過時間は、典型的には、３分以下、好ましくは１２０秒以下、９０秒以下又は６０秒以下のオーダーである。本発明の文脈では、選択的な界面活性剤は、実施例１において記載した手順、及び、試料への試薬の添加と測定との間に６２秒の経過時間を用いてコレステロール含量を測定した場合、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーション（differentiation）を有する界面活性剤である。
【００２６】
ディファレンシエーションのばらつきは、生理学的試料ごとに見られる。これは、統計学的ばらつき、即ち、コレステロール濃度に対して測定された応答の較正線の周りでの散らばりとして容易に観察され、Ｒの平方値（Ｒ２）として、又は代替的には、標準誤差（例えば、ＨＤＬ及びＬＤＬ濃度に対する重回帰の残差の標準誤差（残差のＳＥ））の観点から、数値的に表され得る。
【００２７】
本発明の特別な利点は、このばらつきにおける改善の提供であり、例えば、Ｒ２値の増加として表される。従って、本発明の方法を、１つの試料に対して１回以上繰り返して、当該試料のＨＤＬ濃度に関係する複数の測定結果のデータセットを生じることができ、当該データセットにおける測定結果間のばらつきは小さい。典型的には、任意のそのようなデータセットについてのＲ２は少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．７又は少なくとも０．８である。データセットにおける測定結果は、ＨＤＬ濃度の測定結果であり得るが、より典型的には、ＨＤＬ濃度に関係する（例えば比例する）、異なるパラメータの測定結果である。典型的には、電気化学的測定において生じる電流の測定結果を用いる。
【００２８】
本技法は、例えば装置の較正において用いられ得るが、この場合に用いられる試料は既知のＨＤＬ濃度の試料である。この場合におけるＲ２は、較正モデルの適合度を示す。代替的には、データセットは未知のＨＤＬ濃度の試料の試験において（例えば、平均した最終結果を提供するために）生じ得るが、その場合、Ｒ２値は、異なる測定結果間で低減されたばらつきを示す。
【００２９】
本発明で用いられる界面活性剤としては、アルキル及び式（Ｉ）
【００３０】
【化１】
【００３１】
（式中、Ｒは、最大１２個の炭素原子を含有するアルキル基又はシクロアルキル−アルキル基である）のシクロアルキル−アルキルヒドロキシエチルグルカミドが挙げられる（include include）。そのような化合物としては、オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）６、ＨＥＧＡ−８、アナトレースより入手可能）、デカノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）８、ＨＥＧＡ−１０、アナトレースより入手可能）、ノナノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）７、ＨＥＧＡ−９）、シクロヘキシルプロパノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝Ｃ６Ｈ１１（ＣＨ２）２、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、アナトレースより入手可能）及びシクロへキシルブタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝Ｃ６Ｈ１１（ＣＨ２）３、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、アナトレースより入手可能）が挙げられる。
【００３２】
本発明の界面活性剤のさらなる例としては、式（ＩＩ）
【００３３】
【化２】
【００３４】
（式中、Ｒは、最大１２個の炭素原子を含有するアルキル基又はシクロアルキル−アルキル基、典型的にはアルキル基である）のＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類が挙げられる。Ｒ基の例は、式−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ３（式中、ｙは５〜１１（例、７、８又は９）である）の基である。該化合物の例としては、Ｎ−メチル−Ｎ−オクタノイル−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、Ｎ−メチル−Ｎ−ノナノイル−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）及びＮ−メチル−Ｎ−デカノイル−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）が挙げられる。
【００３５】
界面活性剤は個々に用いてもよく、又は２以上の異なる界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。用いる界面活性剤の総量は、典型的には、試験される試料１ｍｌあたり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ、例えば約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３６】
所望により、試料を、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と錯体を形成する錯化剤と更に反応させてもよい。錯化剤の例としては、ポリアニオン類、ポリアニオン類と二価金属塩との組み合わせ、及びａｐｏＢ含有リポタンパク質に結合できる抗体が挙げられる。ポリアニオン類は、ホスホタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩から選ぶことができる。一度錯化した形態になると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質は反応に利用できなくなり、従ってコレステロール測定を妨げない。しかしながら、本発明においては特異的な界面活性剤を使用するため、錯化剤は必要でない。従って、試料を錯化剤と反応させないことが好ましい。
【００３７】
イオン性塩を、選択的界面活性剤と組み合わせて用いてもよい。イオン性塩の例は、アルカリ金属（例、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）又は遷移金属（例、Ｃｒ３＋）の塩である。塩化物は好適な塩である。イオン性塩の使用により、反応速度を加速することができ、よって最大のＨＤＬのディファレンシエーションがより迅速に観察される。
【００３８】
試料のＨＤＬ−コレステロール含量の測定を、コレステロールを測定するための任意の好適な技法によって行うことができる。好ましい技法には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させることを伴う。１つの実施形態においては、コレステロールデヒドロゲナーゼが用いられる。従って本発明は、試料を界面活性剤及びコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させる方法を包含する。
【００３９】
ＨＤＬリポタンパク質中に含有されるコレステロールは、遊離コレステロール又はコレステロールエステル類の形態であり得る。従って、任意のコレステロールエステル類を遊離コレステロールに分解するために、コレステロールエステル加水分解試薬が典型的に用いられる。次いで、遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させ、そのような反応を受けたコレステロールの量を測定する。
【００４０】
コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステル類をコレステロールに加水分解できる、任意の試薬であり得る。試薬は、コレステロールのコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応、及びアッセイにおけるその後の任意の段階を妨げないものでなければはならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は酵素であり、例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。好適なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）又はクロモバクテリウム・ビスコサム（chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。任意に安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有する市販の酵素（例、東洋紡又はアマノから入手可能なもの）を用いてもよい。コレステロールエステル加水分解試薬は、試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇの量で用いてもよい。
【００４１】
任意の市販形態の、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えばノカルディア（Nocardia）種由来である。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、試薬混合物１ｍｌあたり０．０１〜１００ｍｇの量で用いてもよい。１つの実施形態においては、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼは、試料１ｍｌあたり０．１〜２５ｍｇ、例えば試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは、１ｍｌあたり０．５〜２５ｍｇの量（１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇ等）で用いられる。
【００４２】
各々の酵素は、安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有し得る。更に、各々の酵素は、化学的に修飾されていてもよい。
【００４３】
界面活性剤は、試料に対して、他の試薬を加える前に加えてもよく、又は他の試薬を加えるのと同時に加えてもよい。好ましい実施形態においては、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ及び界面活性剤は、単一の段階で試料と混合される単一の試薬混合物中に存在する。特に好ましい実施形態においては、当該方法は、試料を試薬と接触させる単一の段階を伴い、その結果、単一の試薬混合物のみ提供される必要がある。
【００４４】
本発明による測定は、ＨＤＬ−コレステロールを含有する任意の好適な試料で実施できる。測定は、典型的には、全血又は血液成分（例えば血清又は血漿）で実施される。本発明の方法において使用する好ましい試料は、血清及び血漿である。測定を全血で実施する場合は、当該方法は、赤血球を除去するために血液を濾過する、更なる段階を含み得る。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール含量を測定するために、電気化学的技法を用いる。これは、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量を、電極で発生する電気化学的応答を測定することによって決定することを意味する。この実施形態においては、典型的には、試料を界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと相互作用できる補酵素、及び酸化又は還元されて電極で電気化学的に検出できる生成物を形成することができる酸化還元剤と反応させる。試料と試薬との混合物は、生じる酸化還元反応が検出できるように、電気化学セルの作用電極と接触させる。セルに電位を印加し、結果生じる電気化学的応答、典型的には電流を測定する。
【００４６】
この好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール量は、以下のアッセイ：
【００４７】
【化３】
【００４８】
（ここで、ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）に従って測定する。このアッセイにおいて、所望により、コレステロールデヒドロゲナーゼは、コレステロールオキシダーゼに置き換えることができる。当該アッセイによって生成した、還元された酸化還元試薬量を電気化学的に検出する。しかるべき場合には、更なる試薬もまた、このアッセイに含めてもよい。
【００４９】
典型的には、試料は、単一の段階で全ての試薬と接触する。従って、全ての必要な試薬を含有し、且つアッセイを実施するために容易に試料と接触できる試薬混合物を提供する。本発明の試薬混合物は、典型的には、界面活性剤を試料１ｍｌ当たり最大５０ｍｇ、好ましくは最大２０ｍｇ、例えば約５ｍｇの量で含み、コレステロールエステル加水分解試薬を試料１ｍｌ当たり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇの量で含み、且つコレステロールデヒドロゲナーゼを、試料１ｍｌ当たり０．１〜３０ｍｇ、好ましくは０．５〜２５ｍｇの量で含む。
【００５０】
典型的には、補酵素はＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通する構造的特徴を有し、且つコレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても働く化合物である。ＮＡＤ＋のアナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオＮＡＤ）；ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は、典型的には、１〜２０ｍＭ、例えば３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭの量で、試薬混合物中に存在する。
【００５１】
典型的には、酸化還元剤は、上に示したアッセイに従って還元できるものでなくてはならない。この場合、酸化還元剤は補酵素から（又は後述のようなレダクターゼから）電子を受容でき、且つ電子を電極に伝達できるものでなくてはならない。酸化還元剤は分子又はイオン錯体であってもよい。酸化還元剤は、タンパク質等の天然に存在する電子受容体であってもよく、又は合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有するであろう。
【００５２】
好ましくは、酸化還元剤は無機錯体である。当該剤は金属イオンを含んでもよく、少なくとも２価を有することが好ましいであろう。特に、当該剤は、遷移金属イオンを含んでもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は帯電していてもよく、例えば、カチオン性又は代替的にはアニオン性であってもよい。好適なカチオン性の剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋等のルテニウム錯体であり、好適なアニオン性の剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−等のフェリシアン化錯体である。
【００５３】
用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）及び（エチレンジアミン等の）それらのキレートアミンリガンド誘導体類、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及び、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及びＣＯ２Ｈ等の、１以上の基が２つのシクロペンタジエニル環の一方又は両方へと置換されたその誘導体類が挙げられる。無機錯体は、好ましくはＦｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００５４】
酸化還元剤は、典型的には、１０〜２００ｍＭ、例えば２０〜１５０ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ（例、最大８０ｍＭ）の量で試薬混合物中に存在する。
【００５５】
好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイにおいて用いられる試薬混合物は、レダクターゼを更に含む。レダクターゼは、典型的には、還元型ＮＡＤから２個の電子を伝達され、酸化還元剤へ２個の電子を伝達する。従って、レダクターゼの使用により、素早い電子の伝達がもたらされる。
【００５６】
用いることができるレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ並びにチトクロームＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のチトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェレドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸還元酵素、チトクロームｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシンレダクターゼ及び酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明で用いるための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００５７】
レダクターゼは組み換えタンパク質、又は精製若しくは単離した天然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、電子の伝達を行う速度又は基質特異性を最適化する等、その性能を向上するために変異されていてもよい。
【００５８】
レダクターゼは、典型的には、０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は２〜２０ｍｇ／ｍｌの量で試薬混合物中に存在する。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイの大まかなスキームは、以下：
【００６０】
【化４】
【００６１】
（式中、
ＰｄＲはプチダレドキシンレダクターゼであり、
Ｄｉａはジアホラーゼであり、
ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）
の通りである。
【００６２】
試薬混合物は、任意に、１以上の更なる成分、例えば、賦形剤及び／又は緩衝液及び／又は安定化剤を含有する。至適酵素活性のために必要なｐＨを提供するために、緩衝液も含めてもよい。例えば、トリス緩衝液（ｐＨ９）を用いてもよい。例えば、酵素の安定性を高めるために、安定化剤を加えてもよい。好適な安定化剤の例は、アミノ酸（例、グリシン、及びエクトイン）である。
【００６３】
混合物を安定化するため、並びに任意で、試薬混合物を本発明の装置上で乾燥する場合に当該乾燥混合物に多孔性を提供するために、当該試薬混合物に賦形剤を含んでもよい。好適な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトース等の糖類、並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンもまた、賦形剤として用いることができる。本明細書中に記載する界面活性剤の特別な利点は、界面活性剤及び賦形剤としての、その複合作用である。従って、本発明の１つの実施形態においては、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体及び／又はＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体を、界面活性剤と賦形剤が合わさったものとして用いる。従って、本実施形態においては、個別の賦形剤は用いない。
【００６４】
好ましい実施形態においては、本発明の電気化学的アッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元剤を含む。より好ましい実施形態においては、試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋又はそのアナログ、ジアホラーゼ又はプチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含む。
【００６５】
本発明の試薬混合物は、典型的には、固形形態、例えば、乾燥形態、又はゲルとして提供される。代替的には、溶液又は懸濁液の形態であり得る。反応混合物中に存在する各々の成分量は、上にモル濃度又はｗ／ｖで表しているが、当業者には、存在する各々の成分の相対量が同じであるまま、これらの量を乾燥混合物又はゲルに好適な単位に適合させることができるであろう。
【００６６】
電気化学的測定が全血で実施される場合、得られる測定結果はヘマトクリット値に依存し得る。従って、測定結果は理想的には、少なくとも部分的に、この要因を説明するために調整するべきである。代替的には、アッセイを実施する前に、試料を濾過することによって赤血球を除去できる。
【００６７】
本発明はまた、ＨＤＬを含有する試料のＨＤＬコレステロール含量を選択的に決定するためのキットを提供する。当該キットには、必要な試薬（例、界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段）が含まれる。
【００６８】
好ましい実施形態においては、当該キットは、ＨＤＬ−コレステロール含量を電気化学的に決定するための装置を含む。この実施形態においては、反応したコレステロールの量を決定するための手段は、作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；セルに電位を印加するための電源；及び結果生じる電気化学的応答、典型的にはセルを横断する電流、を測定するための測定機器を含む。
【００６９】
電気化学的な決定のための装置は、典型的には、上記した通りの試薬混合物を含む。当該試薬は個々に、又は１以上の試薬混合物の形態でキット中に存在し得る。単一の試薬混合物が好ましい。試薬混合物は装置中に、液体又は固体のいずれの形態でも存在し得るが、固体形態が好ましい。
【００７０】
典型的には、試薬混合物は、好適な液体（例、水又は緩衝液）中に懸濁／溶解させて装置中に挿入するか又は装置上に置き、次いで所定の位置で乾燥させる。装置中／上で物質を乾燥させるこの段階は、当該物質を望ましい場所に保持するのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）によって実施され得るが、凍結乾燥が好ましい。試薬混合物は、典型的には、試料が試薬混合物と接触したとき、電極との接触も起きるように、電極の付近に配置される。
【００７１】
当該装置には、任意に、試験する試料が、試薬混合物と接触する前に通過する膜が含まれ得る。当該膜は、例えば、赤血球（red blood cell）、赤血球（erythrocyte）及び／又はリンパ球等の成分を濾過で除去するために用いてもよい。血液濾過膜を含む好適な濾過膜は、当該技術において公知である。Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２、Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘが血液濾過膜の例である。繊維ガラスフィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は全血から血漿を分離でき、また全血検査試料が装置に供給され、且つ試験される試料が血漿である場合に好適に用いられる。
【００７２】
使用前に親水的又は疎水的処理を経てきたものを含む、代替的又は付加的な膜も用いてもよい。所望により、膜表面のその他の特徴もまた、改変してもよい。例えば、所望の試料の膜を通る流れを促進するために、水中における膜の接触角を修正するための処理を用いてもよい。当該膜は１又は２以上の材料層を含んでもよく、各々は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、異なる膜材料の２層を有する、従来の二重層膜を用いてもよい。
【００７３】
本発明において用いるための適切な装置には、ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載のものが含まれる。
【００７４】
本発明の１つの実施形態による装置を、図４に記載する。この実施形態においては、作用電極５はミクロ電極である。本発明の目的のために、ミクロ電極は、５０μｍを超えない少なくとも１つの作業寸法を有する電極である。
【００７５】
セルは、底部１及び壁（単数又は複数）２を有するレセプタクル又は容器の形態である。典型的には、レセプタクルは、２５〜１０００μｍの深さ（即ち、上部から底部まで）を有するであろう。１つの実施形態においては、レセプタクルの深さは、５０〜５００μｍ、例えば、１００〜２５０μｍである。代替的な実施形態においては、レセプタクルの深さは５０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。レセプタクルの長さ及び幅（即ち、壁から壁まで）、又はレセプタクルが円筒状の場合はその直径は、典型的には、０．１〜５ｍｍ、例えば、０．５〜１．５ｍｍ（１ｍｍ等）である。
【００７６】
レセプタクル３の開口端は、部分的に、不透過性材料で覆われてもよく、又は半透性若しくは透過性の膜等の、半透性若しくは透過性の材料で覆われてもよい。レセプタクルの開口端は、実質的に、半透性又は透過性の膜４で覆われるのが好ましい。膜４は、とりわけ、埃又は他の混入物質がレセプタクルに入ることを防ぐのに役立つ。
【００７７】
作用電極５は、レセプタクルの壁に位置する。作用電極は、例えば、レセプタクルの壁周囲の連続した帯の形態である。作用電極の厚みは、典型的には０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍであり、例えば０．１〜２０μｍである。より厚みのある作用電極、例えば、０．１〜５０μｍ、好ましくは５〜２０μｍの厚みを有する電極も想定している。作用電極の厚みは、レセプタクルをその底部上に置く場合は、その垂直方向の寸法である。作用電極の厚みは、その有効作業寸法、即ち、試験する試料と接触する、電極の寸法である。作用電極は、例えば、導電性インクの形態の、炭素、パラジウム、金又は白金で形成するのが好ましい。当該導電性インクは、例えば、白金及び／又はグラファイト及び／又は白金炭素といった更なる材料を含有する改良インクであり得る。作用電極を形成するために２以上の層を用いてもよく、当該層は、同じか、又は異なった材料で形成される。
【００７８】
セルはまた、例えば、レセプタクルの底部、レセプタクルの壁（単数又は複数）中、又はレセプタクルの周囲若しくは付近の装置の領域中に存在し得る擬似参照電極（示さず）を含有する。擬似参照電極は、典型的には、Ａｇ／ＡｇＣｌから作られるが、他の材料も用いてもよい。擬似参照電極として用いるための好適な材料は、当業者に公知である。この実施形態においては、セルは、擬似参照電極が対向電極及び参照電極の両方として働く２電極システムである。セルが参照電極及び別個の対向電極を含む、代替の実施形態も想定できる。
【００７９】
擬似参照（又は参照）電極は、典型的には、作用電極５と同様のサイズの、若しくはそれより小さい、又は大きい（例えば相当大きい）表面積を有する。典型的には、擬似参照（又は参照）電極の表面積の、作用電極の表面積に対する比率は、少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１、又は少なくとも３：１である。好ましい比率は少なくとも４：１である。擬似参照（又は参照）電極は、例えば、マクロ電極であってもよい。好ましい擬似参照（又は参照）電極は、０．０１ｍｍ又はそれを上回る、例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法を有する。これは例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、直径であり得る。擬似参照（又は参照）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．１ｍｍ２〜６０ｍｍ２であり、例えば１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と擬似参照（又は参照）電極との間の最短距離は、例えば、５０〜１０００μｍである。セルが機能できるためには、電極は各々絶縁材料６によって分離されなければならない。絶縁材料は、典型的には、例えば、アクリレート、ポリウレタン、ＰＥＴ、ポリオレフィン、ポリエステルといったポリマー又は他の任意の安定な絶縁材料である。ポリカーボネート並びに他のプラスチック及びセラミックも、好適な絶縁材料である。絶縁層はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって形成することができる。塗布後硬化する液体、例えばワニスも、用いてもよい。代替的には、例えば、熱若しくはＵＶへの曝露によって、又は２成分の架橋可能なシステムの活性部分と混合することによって架橋される、架橋可能なポリマー溶液を用いてもよい。しかるべき場合には、絶縁層を形成するために、誘電性インクも用いてもよい。代替の実施形態においては、絶縁層は装置にラミネートされる（例えば熱でラミネートされる）。
【００８０】
電気化学セルの電極は、好適な任意の手段によって、必要な任意の測定機器に接続してもよい。典型的には、電極は、導電性のトラック（track）に接続され、該導電性のトラックは、必要な測定機器にそれ自身接続されるか、又は接続され得る。
【００８１】
図４中の７に示す通り、必要な試薬は、典型的にはレセプタクル内に含有させる。典型的には、単一の試薬混合物の形態の試薬は、液体の形態でレセプタクル内に挿入された後、組成物を固定するのに役立つよう乾燥させる。試薬混合物は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥、又はオーブン乾燥（加熱）されてもよく、最も好ましくは、凍結乾燥される。
【００８２】
本発明の装置は、試料を装置に提供し、且つ試料の試薬混合物への接触を可能にすることによって機能させる。血漿又は血液を溶解し、且つ混合物中の試薬と反応させるために十分な時間が割り当てられなければならないのは明らかである。凍結乾燥した試薬を含有するセンサに血漿を添加する場合は、センサへの試料のアプライと、セルの印加電位の印加との間に概ね２０秒間が経過する。全血が用いられる場合、血液細胞の除去を可能にするために、この遅延時間はより長くてもよく、例えば最大５分である（例えば、血液は、試薬と接触する前に濾過膜を通過し得る）。本発明の１つの実施形態においては、血漿は、電気化学セルとの接触前に試薬と混合され、セルに添加されて即座に電位が印加される。典型的には、電位が印加され、測定結果を１０秒、典型的には１〜４秒以内に読み取る。
【００８３】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極で検出すべき生成物の場合、セルに印加する電位は０．１Ｖ〜０．３Ｖである。０．１５Ｖが好ましい印加電位である。（本明細書中で述べる電圧はすべて、０．１Ｍ塩化物ありでの、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する値である。）好ましい実施形態においては、電位が、約１秒間、０．１５Ｖの正の印加電位であるのが最初の段階である。還元電流の測定を望む場合、次いで、−０．４〜−０．６Ｖの負の電位を印加する。二重の電位段階の使用は、ＷＯ０３／０９７８６０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。異なる酸化還元剤を用いる場合、酸化／還元ピークが生じる電位に従って、印加電位を変えることができる。
【００８４】
従って、本発明の電気化学的試験で、ＨＤＬコレステロールの測定を、試料を装置にアプライしてから非常に短時間で、典型的には約５分以内で、好ましくは３分以内で、２分以内で、又は１分以内にでさえ、行うことが可能になる。状況によっては、試料を装置にアプライしてからわずか１５秒又は３０秒で結果を得ることができるかもしれない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３を含むＨＥＧＡ−８
本実験の目的は、ＨＥＧＡ−８界面活性剤及びＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【００８６】
０．１Ｍ トリス緩衝液ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％β−ラクトースを含有するβ−ラクトース緩衝溶液を調製した。ラクトース緩衝溶液にＨＥＧＡ−８を加え、ＨＥＧＡ−８の最終濃度を５％にすることにより、ＨＥＧＡ−８溶液を作成した。
【００８７】
ＨＥＧＡ−８溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（アルファエイサー、１０５１１）
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより、酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【００８８】
分注及び凍結乾燥
電動ピペットを用いて０．４μＬ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。センサは、ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りであった。
【００８９】
血漿試料
血漿試料を３０分間解凍した後、２９００ＲＣＦで５分間遠心分離した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）をまた、試料として使用した。Ｓｐａｃｅクリニカルアナライザーを用いて、試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を解析した。
【００９０】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【００９１】
解析
これらのデータを、スペースアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬ濃度に対して相関させた。各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエント（既知の濃度に対する測定電流）を用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【００９２】
結果
６３秒において、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントは、それぞれ１３９．６ｎＡ／ｍＭ及び０．７５ｎＡ／ｍＭであった。ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションは９９．５％であった。
５％ＨＥＧＡ−８及び８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを含有するセンサを用いるとＨＤＬに対する高いディファレンシエーションが得られた。
【００９３】
実施例２：Ｃ−ＨＥＧＡ
本実験の目的は、様々なアルキル鎖長を有するＣ−ＨＥＧＡ界面活性剤を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【００９４】
０．１Ｍ トリス緩衝液ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％β−ラクトースを含有する、β−ラクトース緩衝溶液を調製した。１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ（Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］）溶液を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【００９５】
Ｃ−ＨＥＧＡ溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＣ−ＨＥＧＡを加え、以下の最終濃度：
Ｃ−ＨＥＧＡ−８（アナトレース、Ｃ４０８）
２００ｍＭ（２０７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【００９６】
Ｃ−ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｃ４０９）
２００ｍＭ（２０４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【００９７】
Ｃ−ＨＥＧＡ−１０（アナトレース、Ｃ４１０）
２００ｍＭ（１９３μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４６ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【００９８】
Ｃ−ＨＥＧＡ−１１（アナトレース、Ｃ４１１）
２００ｍＭ（１９７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１５５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ （２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
にすることにより、２倍強度のＣ−ＨＥＧＡ溶液を作成した。
【００９９】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１００】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及びＣ−ＨＥＧＡ溶液を１：１で混合して、最終の酵素／界面活性剤混合物を得た。加えて、それぞれ等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。電動ピペットを用いて、０．４μＬ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。使用したセンサは、ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りであった。
【０１０１】
血漿試料の調製、テスト及び解析は実施例１に記載の通りであった。
各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１０２】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションを次の表に示す：
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
これらのＣ−ＨＥＧＡ界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答と比較して、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。
【０１０５】
実施例３：ＨＥＧＡ：
本実験の目的は、様々なアルキル鎖長を有するＨＥＧＡ界面活性剤を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１０６】
ＲｕＡｃａｃ溶液を、実施例２に記載の通りに作成した。
【０１０７】
ＨＥＧＡ溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＨＥＧＡを加え、以下の最終濃度：
ＨＥＧＡ−８（アナトレース、Ｈ１０８）
２００ｍＭ（２１２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４９ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１０８】
ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
２００ｍＭ（１９６μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４３ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
にすることにより２倍強度のＨＥＧＡ溶液を作成した。
【０１０９】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合し、ＣｏｖａｒｉｓのＳ−シリーズＳｏｎｏＬａｂ−Ｓ１ソフトウェア−プログラムＨＤＬ４℃を使用した。
【０１１０】
分注、凍結乾燥、血漿試料の調製、テスト及び解析を、実施例２に記載の通りに行った。
【０１１１】
結果
９６秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
これらのＨＥＧＡ界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答と比較して、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。
【０１１４】
更に、１１８秒における応答とＨＤＬ及びＬＤＬ濃度との間の相関に関する重回帰による解析を、以下の表に示す。
【０１１５】
【表３】
【０１１６】
実施例４：グルカミドでの再現性
本実験の目的は、ＴＣ特異的界面活性剤又は界面活性剤なしと比較してグルカミド界面活性剤を使用した場合、測定された応答の血漿ＨＤＬ濃度に対する相関が改善されることを実証することであった。
【０１１７】
１０％β−ラクトース緩衝液は、実施例１に記載の通りであった。
【０１１８】
界面活性剤溶液
以下の通りに２倍強度の界面活性剤溶液を作成した：
１．９９６ｍｌ １０％ラクトース緩衝液中にＣＨＡＰＳ（シグマ−アルドリッチ社、Ｃ５０７０）１０％ ０．１９９６ｇ
１．７６３ｍｌ ＣＨＡＰＳ溶液中にデオキシｂｉｇＣＨＡＰＳ（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｓ１１５）１０％ ０．１７６３ｇ
１．７１９ｍｌ １０％ラクトース緩衝液中にＨｅｇａ９（アナトレース、Ｈ１０９）２００ｍＭ ０．１２５７ｇ
【０１１９】
次いで、緩衝溶液及び各界面活性剤溶液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、それぞれ３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃの最終濃度とした：
１．５１２ｍｌ １０％ラクトース緩衝液中に０．０２４８ｇ ＲｕＡｃａｃ＝ブランク（界面活性剤なし）
１．６２２ｍｌ １０％ ＣＨＡＰＳ／１０％ デオキシｂｉｇＣＨＡＰＳ溶液中に０．０２６６ｇ ＲｕＡｃａｃ
１．６２８ｍｌ ２００ｍＭ Ｈｅｇａ ９溶液中に０．０２６７ｇ ＲｕＡｃａｃ
【０１２０】
ＲｕＡｃａｃメディエーター＝Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、これらの溶液を混合した。
【０１２１】
酵素混合物
ブランクＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
２０．２ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１２２】
生成物の分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約１．４ｍｌ）の２倍濃度の酵素溶液及び界面活性剤溶液を１：１で混合して、最終の酵素／界面活性剤混合物を得た。加えて、等量（約１．４ｍｌ）ずつの２倍濃度の酵素溶液及びブランク３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合してブランク混合物を調製した。使用したセンサは、ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りであった。０．３５μｌ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注し、凍結乾燥した。
【０１２３】
血漿試料を実施例２に記載の通りに調製した。
【０１２４】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。８つのタイムポイント（０、５９、１１８、１７７、２３６、２９５、３５４及び４１３秒）にて０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４７２秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を８回テストした。
【０１２５】
解析
これらのデータを、スペースアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ濃度に対して相関させた。各タイムポイントにおけるＨＤＬへの応答に関する較正プロットを構築した。全てのセンサからのデータを総合した。
【０１２６】
結果
５９秒における各センサ型に関する較正プロットに関する相関係数を以下の表に示す：
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
界面活性剤を加えていない又はＣＨＡＰＳ／デオキシｂｉｇＣＨＡＰを有するセンサと比較して、ＨＥＧＡ−９を含有するセンサに関して測定されたセンサ応答とＨＤＬ濃度との間により高い相関が得られる。
【０１２９】
更に、１１８秒における応答とＨＤＬ及びＬＤＬ濃度との間の相関に関する重回帰による解析を以下の表に示す。
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
実施例５：ＨＥＧＡ−９及びイオン性塩：
本実験の目的は、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９及び様々なイオン性塩を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１３２】
１０％β−ラクトース緩衝液を実施例１に記載の通りに調製した。
１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃを作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１３３】
３．７２４ｍＬ ＲｕＡｃａｃ溶液に０．２６１２ｇ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）を加えることにより、ＨＥＧＡ−９溶液を作成した。
【０１３４】
イオン性塩溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液に塩を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍濃度のイオン性塩溶液を調製した：
【０１３５】
ＬｉＣｌ（アルドリッチ、２１、３２３−３）
１．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液：０．０１１３ｇを１７７μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
１Ｍ ＬｉＣｌ溶液：４０μｌの１．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液を２０μＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１３６】
ＮａＣｌ（シグマ、Ｓ−７６５３）
１Ｍ ＮａＣｌ溶液：０．００６６ｇを１１３μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
【０１３７】
ＭｇＣｌ２（シグマ、Ｃ−４９０１）
５００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液：０．０１０３ｇを１０１μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液：３０ｕＬの５００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を３０μＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１３８】
ＣａＣｌ２（シグマ、Ｍ２６７０）
５００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：０．００５８ｇを１０５μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
２５０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：３０ｕＬの５００ｍＭＣａＣｌ２溶液を３０ｕＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１３９】
Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（マンチェスターオーガニックス）
１２０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：０．００７５ｇを１２０μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
【０１４０】
Ｃｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（アルファエイサー、Ａ１５４７０）
１２０ｍＭ Ｃｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：０．００８２ｇを１２７μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
６０ｍＭ ＣｏＮＨ３）６Ｃｌ３：３０μＬの１２０ｍＭ Ｃｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液を３０μＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１４１】
酵素混合物
ＨＥＧＡ−９溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１４２】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約４０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及びイオン性塩溶液を１：１で混合して、最終の酵素／イオン性塩混合物を得た。加えて、等量（約４０ｕＬ）ずつの２倍濃度の酵素溶液及び３０ｍＭ ＨＥＧＡ−９溶液を混合してブランク混合物を調製した。ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りに電動ピペットを用いて０．４μＬ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注し、凍結乾燥した。
【０１４３】
血漿試料を実施例２に記載の通りに調製した。
【０１４４】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。８つのタイムポイント（０、５９、１１８、１７７、２３６、２９５、３５４及び４１３秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４７２秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【０１４５】
これらのデータを、スペースアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬ濃度に対して相関させた。各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１４６】
結果
ＨＤＬへの応答のグラジエントが最大値に達する時間は、酵素混合物の間で変化するように見えた。時間を以下の表に示す：
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を用いて調製したセンサに関して、イオン性塩の添加の結果、酵素混合物中にイオン性塩が存在するならば、ＨＤＬへの応答の最大グラジエントにより迅速に到達した。即ち、応答の速度はイオン性塩の存在により増加した。
【０１４９】
実施例６：ＨＥＧＡ−９滴定及び異なるリパーゼ又はＣｈＥ
本実験の目的は、広範囲の濃度のＨＥＧＡ−９で調製したセンサのＨＤＬへの応答の依存性を調べることであり、並びにまた、異なるリパーゼ又はコレステロールエステラーゼの効果を調べることであった。
【０１５０】
２つの別々の酵素混合物を同日に製造し、１つはＨＥＧＡ−９滴定のため、１つは東洋紡リパーゼ又はジェンザイムコレステロールエステラーゼの使用のためである。
【０１５１】
ＨＥＧＡ−９滴定のための酵素混合物：
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ緩衝液を実施例２記載の通りに作成した。
【０１５２】
ＨＥＧＡ−９溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＨＥＧＡ−９を加え、以下の最終濃度：
ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
６００ｍＭ（２５１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０５５０ｇ）
４００ｍＭ（６００ｍＭ ストック６０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液３０μｌ）
２００ｍＭ（６００ｍＭ ストック３０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ 溶液６０μｌ）
１００ｍＭ（６００ｍＭ ストック１５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
５００ｍＭ（６００ｍＭ ストック１０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液１１０μｌ）
２０ｍＭ（６００ｍＭ ストック３μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液８７μｌ）
にすることにより２倍強度のＨＥＧＡ−９溶液を作成した。
【０１５３】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１５４】
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及びＨＥＧＡ−９溶液を１：１で混合して、最終の酵素／界面活性剤混合物を得た。加えて、等量（約５０ｕＬ）ずつの２倍濃度の酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。
【０１５５】
東洋紡リパーゼ又はジェンザイムエステラーゼのための酵素混合物：
ラクトース緩衝溶液を実施例１に記載の通りに作成した。１．０１８ｍｌのラクトース緩衝溶液に０．０３７２ｇ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）を加えることにより１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９溶液を作成した。９６３ｕＬの１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９溶液に０．０１５８ｇ ＲｕＡｃａｃを加えることによりＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。
【０１５６】
酵素混合物
シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）（東洋紡）由来のリパーゼ又はシュードモナス・エスピー（ジェンザイム）由来のコレステロールエステラーゼのいずれかを用いて２つの別々の最終酵素混合物を調製した。
【０１５７】
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（東洋紡）又は３．３ｍｇ／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（ジェンザイム）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより単倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１５８】
分注、凍結乾燥、血漿試料調製、テスト及び解析は実施例２に記載の通りに行った。
【０１５９】
結果
１１８秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１６０】
【表７】
【０１６１】
ＨＥＧＡ−９界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答と比較して、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。ＨＤＬに対する最も高いディファレンシエーションのためのＨＥＧＡ−９の最適量は５０〜２００ｍＭである。
【０１６２】
界面活性剤を加えていないセンサ応答と比較して、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９及びジェンザイムリパーゼ、東洋紡リパーゼ又はジェンザイムエステラーゼのいずれかを有するセンサは、ＨＤＬに対して増加した応答のグラジエント及びディファレンシエーションを与える。
【０１６３】
実施例７：ＭＥＧＡ
本実験の目的は、様々なアルキル鎖長を有するＭＥＧＡ界面活性剤を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
実施例２をＭＥＧＡ−７及びＭＥＧＡ−８溶液を用いて繰り返した。
実施例２に記載の通りにＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。
【０１６４】
ＭＥＧＡ溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＭＥＧＡを加え、以下の最終濃度：
ＭＥＧＡ−７（ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）（シグマ Ｈ１６３９）
２００ｍＭ（２９０μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１７８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１６５】
ＭＥＧＡ−８（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｓ１１６）
２００ｍＭ（２９２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１８８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
にすることにより２倍強度のＭＥＧＡ溶液を作成した。
【０１６６】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１６７】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１６８】
【表８】
【０１６９】
これらのＭＥＧＡ界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答と比較して、ＨＤＬに対する応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。
【０１７０】
実施例８：ブランク及びＨＥＧＡ−９の変動性
本実験の目的は、界面活性剤を加えないか又は１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を用いるかのいずれかで調製したセンサの異なるバッチを用いて観察される血漿ＨＤＬへの応答における変動性を調べることであった。
【０１７１】
センサは数ヶ月の期間にわたって何度も調製された。ブランク及びＨＤＬ化学物質に関して最終製剤を以下に示す。
【０１７２】
添加される界面活性剤を含有しない最終酵素混合物
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）
３０ｍＭ ＫＯＨ
１０％ｗ／ｖ ラクトース
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１７３】
１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する最終酵素混合物
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）
３０ｍＭ ＫＯＨ
１０％ｗ／ｖ ラクトース
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ
１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１７４】
分注及び凍結乾燥は、実施例２に記載の通りであった。
【０１７５】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料をセンサごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェント時間は４秒だった。各試料を重複してテストした。
【０１７６】
８秒のトランジェント時間で較正を何度か行った。６つ又は８つのいずれかのタイムポイント（０、５９、１１８、１７７、２３６、２９５、（３５４）、（４１３）秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（３５４又は４７２秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【０１７７】
Ｓｐａｃｅクリニカルアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬ濃度と共に、これらのデータを解析した。多重線形回帰を行い、応答のＨＤＬ及びＬＤＬグラジエント及び各タイムポイントにおける切片を得た。応答のグラジエントを用いて、％ディファレンシエーションを各タイムポイントにおいて得た。
【０１７８】
結果
各較正について、電流対［ＨＤＬ］プロットについての相関係数（ｒ２値）が最も高いタイムポイントに関するｒ２値及び％ディファレンシエーションを以下に表にする。
【０１７９】
【表９−１】
【表９−２】
【０１８０】
ｒ２及び％ディファレンシエーションの平均値及び標準偏差をブランク及びＨＥＧＡ−９センサに関して示している。
【０１８１】
界面活性剤を加えていないセンサと比較して、平均ｒ２値及び％ディファレンシエーションは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を有するセンサに関して有意に高かった。加えて、界面活性剤を加えていないセンサと比較して、ｒ２値の標準偏差及び％ディファレンシエーションの値は、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を有するセンサに関してより低い。
【０１８２】
界面活性剤を加えていないセンサと比較して、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９の使用は血漿ＨＤＬ濃度に対するセンサの応答の相関を有意に増加させる。加えて、ＨＥＧＡ−９の使用により、血漿ＨＤＬに対するセンサ応答のバッチごとの再現性は、有意に向上する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含有する試料中の、高密度リポタンパク質に結合するコレステロール（ＨＤＬコレステロール）量を決定するための方法に関する。本発明はまた、そのような方法において使用するための組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの疫学的研究で、コレステロール又はａｐｏ Ａ１含量のいずれかの観点で測定される高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性に対する、強く、且つ非依存的な逆相関が証明されてきた。ＨＤＬコレステロールが１０ｍｇ／Ｌ低下するごとにＣＡＤの危険性が２〜３％増加するといわれている。従って、ＨＤＬコレステロール濃度がより高いほど、予防的であると考えられている。従って、ＣＡＤに対する危険性を明らかにする際、及び脂質異常症の治療を行う際のＨＤＬコレステロールの測定が、臨床検査室でますます一般的になってきた。
【０００３】
研究技法から適合された、ＨＤＬコレステロール測定のための初期の検査室的方法では、沈殿試薬を用いる手作業の分離段階、それに引き続いてたいていの場合には自動化学分析装置による、コレステロール含量の分析が必要とされた。典型的な分離段階は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びキロミクロン（ＣＭ）のアグリゲートを形成するために、沈殿試薬をこれらの成分と反応させることを伴っていた。その後アグリゲートを、例えば遠心分離によって、反応容器から除去して、ＨＤＬ含有試料を分析できる状態にしておいた。沈殿物がＵＶ／Ｖｉｓ又は使用される比色分析技法を妨げないようにするため、沈殿物の分離が不可欠であった。
【０００４】
より最近になって、様々なリポタンパク質画分の分離を事前に必要としない、多くの技法が開発されてきた。これらの方法は、典型的には、単一の段階で、又は少なくとも沈殿を実施する必要なく測定を成し遂げることができるという利点を有する。従って、測定の自動化が可能である。そのようなアプローチのあるものでは、様々なリポタンパク質画分を異なる速度で分解するある種の界面活性剤が用いられる。例えばある界面活性剤は、最初にＬＤＬとより迅速に反応するかもしれず、そしてＨＤＬとの反応はより緩やかに起こるかもしれない。当該界面活性剤を加えた後、所定の時間にコレステロール含量を測定することによって、測定が、ＬＤＬコレステロール含量よりもＨＤＬコレステロール含量により大きく依存することが分かってきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このアプローチは、その結果に必要な精度及び信頼性を生じてきておらず、また測定は、依然としてある程度の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量への依存性を残していた。従って、血液や血漿等の体液のＨＤＬコレステロール含量の測定のための簡単であるが信頼でき且つ正確な方法を提供する新たなアプローチが必要である。測定はまた、試験試料中の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合したコレステロール含量への依存が低いか、又はそれらと完全に独立していなくてはならない。更に、好ましい方法は、専門的な設備を用いないか、又は実施するために熟練の技術者を必要としないであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤であって、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに該高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法を提供する。
【０００７】
本発明で用いられる界面活性剤は、非常に高い選択性を、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して有する。以前の界面活性剤は、他のリポタンパク質と比較して、異なる速度でＨＤＬと反応することが示されてきているが、本発明の界面活性剤は、ほぼ排他的にＨＤＬと反応し、他のリポタンパク質と反応しないか、又は実質的に反応しない。試料中のＨＤＬは、可溶化して反応に利用できるＨＤＬコレステロールを残すが、一方で他のリポタンパク質画分に結合したコレステロールは、リポタンパク質構造内に結合したままで、反応には利用可能ではないと考えられている。しかしながら、本発明は、この作用様式には縛られない。代替的な理論としては、本発明の界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応するのを選択的に可能にするものであるが、一方でＬＤＬコレステロールは実質的に反応できないというものである。従って、その後の、試料のコレステロール含量の測定では、ＨＤＬ−コレステロール含量のみが反映され、他のリポタンパク質画分内に含有されるコレステロール量には実質的に依存しない。従って、本発明の方法は、ＨＤＬに対して高度に選択的であり、ＨＤＬ−コレステロールについての正確で信頼できる試験を提供する。
【０００８】
本発明の方法は、先行技術の試験と比較して、改善された簡便性という、更なる利点を有する。ＨＤＬコレステロールの測定結果は、試料を単一の試薬混合物と反応させ、且つコレステロール含量を１回測定することによって得ることができる。更に、結果は非常に短時間で得ることができ、典型的には試料を添加して１分又は数分以内に得ることができる。
【０００９】
ＨＤＬコレステロールの測定は、典型的には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼのいずれかと反応させることによって行う。従って、本発明はまた、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において用いるための試薬混合物であって、
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する、本明細書中に規定した通りの界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ
を含む、試薬混合物を提供する。
【００１０】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する、本明細書中に規定した通りの界面活性剤、（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段、を含む、キットも提供する。
当該キットは、典型的には、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段が
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極（counter electrode）を有する電気化学セル；
− 該セルに電位を印加するための電源；並びに
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、電気化学的装置である。
【００１１】
本発明はまた、本発明のキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び、電極と接触させること；
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成した生成物量を電気化学的に検出すること
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明で用いられる界面活性剤は、ＨＤＬコレステロールの決定の再現性を向上させるという特別な利点を有する。ある種のエステラーゼ若しくはリパーゼを単独で、又はＣＨＡＰｓ若しくはデオキシＢＩＧＣＨＡＰ等の界面活性剤とともに使用することによって、ＨＤＬと他のリポタンパク質との間に、ある程度の差別化を実現できることがわかってきた。しかしながら、患者試料での決定は、極めてばらつきやすいことがわかってきた。本発明に記載する界面活性剤を用いると、このばらつきを有意に低減することがわかった。これは、比較の基準の統計的測定（例えば、ＨＤＬ濃度が電極電流と関連する較正線の改善されたＲ２値）と関連して最もよく説明されるが、他の統計的手法、特に重回帰分析を用いても、示すことができる。
【００１３】
従って、本発明の界面活性剤が、多数の試験に特有のばらつきを低減するのは明らかである。ばらつきの低減で、アッセイにおける正確さ及び精度が改善する。ばらつきの低減で、本発明は、多数の異なる試験結果が比較される特定の用途（例、一人の患者のコレステロールレベルの長期にわたるモニタリング）の発見にもつながる。
【００１４】
従って、本発明はまた、本明細書中に規定する界面活性剤を、高密度リポタンパク質中のコレステロール量の決定方法の再現性を向上（例、ＨＤＬ濃度が電極電流に関係する較正線のＲ２値の改善）させるのに使用することを提供する。また、試料中のＨＤＬコレステロール量の決定の再現性の向上（例、ＨＤＬ濃度が電極電流と関連する較正線のＲ２値の改善）方法であって、試料を、（ａ）本明細書中に規定した通りの界面活性剤と反応させること、及び高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施形態による装置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、試料のＨＤＬ−コレステロール含量を選択的に決定する方法を提供するが、ここで試料は、ＨＤＬのみならず、コレステロールに結合する他のリポタンパク質を含有し得るものである。ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して高度に選択的な特異的界面活性剤と、試料を反応させることによって選択性が実現される。従って、当該界面活性剤により、ＨＤＬに結合するコレステロール及びコレステロールエステル類が測定のために利用可能となるが、一方でＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合するものはリポタンパク質の構造に結合したままであって、後のコレステロール含量の測定において実質的に反応しない。
【００１７】
コレステロール及びコレステロールエステル類は、主としてリポタンパク質粒子中で血液を運搬されることが知られている。酵素及び界面活性剤が、そのようなコレステロールをデヒドロゲナーゼによって酸化されるのに利用可能とする正確なメカニズムに関しては、議論がある。従って、本明細書の全範囲で、「分解する」又は「利用可能にする」又は「反応性を与える」等の用語はすべて、処理過程によって、分析に関する応答が任意の試料中のコレステロール類から得られるものである当該処理過程に関するものであることが理解される。しかしながら、我々は、作用様式に関してあらゆる特定の理論にも縛られることを望んでいない。従って、「高密度リポタンパク質を選択的に分解する」という界面活性剤は、例えば、高密度リポタンパク質において選択的にコレステロールの利用可能性を高めることによって、又は異なるメカニズムよって働き得る。
【００１８】
本発明で用いられる界面活性剤は、試料中の高密度リポタンパク質を選択的に分解するものである。これは、当該界面活性剤は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭと比較して、ＨＤＬと選択的に反応することを意味する。代替的には、当該界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいて、ＨＤＬコレステロールが反応すること（典型的には、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応すること）を選択的に可能にするものとして定義できる。本発明の文脈では、ＨＤＬを選択的に分解する界面活性剤、又はコレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応することを選択的に可能にする界面活性剤は、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００１９】
ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、式（ｉ）に従った回帰により、生理学的試料の範囲に渡ったデータから決定され得る：
【００２０】
【数１】
【００２１】
（式中、ＧｘはＸに対する、測定された応答のグラジエント（例、Ｘの既知の濃度に対する、測定された電流）である）。測定される応答は、リポタンパク質濃度に関係する（又は対応する）（例えば、リポタンパク質濃度に比例する）任意の測定値であり得る。
【００２２】
生理学的試料中には、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールの両方が存在する。この場合、多重回帰のための標準的な方法を、（ｉ）測定されたコレステロール濃度ＧＨＤＬ及びＧＬＤＬのそれぞれのグラジエントの値を見積もること、によって用いてもよい。
【００２３】
従って、当業者は、選択した界面活性剤を用いてＨＤＬコレステロール含量が既知の試料のＨＤＬコレステロール含量を測定し、そして対応して同じ手順を用いて、ＬＤＬコレステロール含量が既知の試料のＬＤＬコレステロール含量を測定することによって、任意の所与の界面活性剤がＨＤＬを選択的に分解するものかどうかを、容易に決定できる。その結果からディファレンシエーションの値が計算できる。ＨＤＬコレステロール含量又はＬＤＬコレステロール含量を測定するための手順は、典型的には、選択した界面活性剤を用いる、下記の実施例１に記載したものである。
【００２４】
本発明において、ＨＤＬ濃度は典型的には、コレステロールのコレステノンへの電気化学的変換に際して、電極で生じる電流を決定することによって電気化学的に測定される。従って、典型的には、測定電流値を、グラジエントを決定するために用いる。
【００２５】
好ましい実施形態においては、本発明の選択的界面活性剤は、実質的にＬＤＬを分解しない。従って、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、経時的に一定である。しかし、一部の界面活性剤は、非常に緩やかではあるが、依然としてＬＤＬを分解し得る。この場合、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、時間とともに変動し得る。ディファレンシエーションは、ＨＤＬコレステロール試験の間に用いる経過時間と同じの、試料への試薬の添加とコレステロール含量の測定との間の経過時間を用いて測定しなくてはならない。そのような経過時間は、典型的には、３分以下、好ましくは１２０秒以下、９０秒以下又は６０秒以下のオーダーである。本発明の文脈では、選択的な界面活性剤は、実施例１において記載した手順、及び、試料への試薬の添加と測定との間に６２秒の経過時間を用いてコレステロール含量を測定した場合、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーション（differentiation）を有する界面活性剤である。
【００２６】
ディファレンシエーションのばらつきは、生理学的試料ごとに見られる。これは、統計学的ばらつき、即ち、コレステロール濃度に対して測定された応答の較正線の周りでの散らばりとして容易に観察され、Ｒの平方値（Ｒ２）として、又は代替的には、標準誤差（例えば、ＨＤＬ及びＬＤＬ濃度に対する重回帰の残差の標準誤差（残差のＳＥ））の観点から、数値的に表され得る。
【００２７】
本発明の特別な利点は、このばらつきにおける改善の提供であり、例えば、Ｒ２値の増加として表される。従って、本発明の方法を、１つの試料に対して１回以上繰り返して、当該試料のＨＤＬ濃度に関係する複数の測定結果のデータセットを生じることができ、当該データセットにおける測定結果間のばらつきは小さい。典型的には、任意のそのようなデータセットについてのＲ２は少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．７又は少なくとも０．８である。データセットにおける測定結果は、ＨＤＬ濃度の測定結果であり得るが、より典型的には、ＨＤＬ濃度に関係する（例えば比例する）、異なるパラメータの測定結果である。典型的には、電気化学的測定において生じる電流の測定結果を用いる。
【００２８】
本技法は、例えば装置の較正において用いられ得るが、この場合に用いられる試料は既知のＨＤＬ濃度の試料である。この場合におけるＲ２は、較正モデルの適合度を示す。代替的には、データセットは未知のＨＤＬ濃度の試料の試験において（例えば、平均した最終結果を提供するために）生じ得るが、その場合、Ｒ２値は、異なる測定結果間で低減されたばらつきを示す。
【００２９】
本発明で用いられる界面活性剤としては、アルキル及び式（Ｉ）
【００３０】
【化１】
【００３１】
（式中、Ｒは、最大１２個の炭素原子を含有するアルキル基又はシクロアルキル−アルキル基である）のシクロアルキル−アルキルヒドロキシエチルグルカミドが挙げられる（include include）。そのような化合物としては、オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）６、ＨＥＧＡ−８、アナトレースより入手可能）、デカノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）８、ＨＥＧＡ−１０、アナトレースより入手可能）、ノナノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）７、ＨＥＧＡ−９）、シクロヘキシルプロパノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝Ｃ６Ｈ１１（ＣＨ２）２、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、アナトレースより入手可能）及びシクロへキシルブタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド（Ｒ＝Ｃ６Ｈ１１（ＣＨ２）３、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、アナトレースより入手可能）が挙げられる。
【００３２】
本発明の界面活性剤のさらなる例としては、式（ＩＩ）
【００３３】
【化２】
【００３４】
（式中、Ｒは、最大１２個の炭素原子を含有するアルキル基又はシクロアルキル−アルキル基、典型的にはアルキル基である）のＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類が挙げられる。Ｒ基の例は、式−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ３（式中、ｙは５〜１１（例、７、８又は９）である）の基である。該化合物の例としては、Ｎ−メチル−Ｎ−オクタノイル−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、Ｎ−メチル−Ｎ−ノナノイル−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）及びＮ−メチル−Ｎ−デカノイル−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）が挙げられる。
【００３５】
界面活性剤は個々に用いてもよく、又は２以上の異なる界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。用いる界面活性剤の総量は、典型的には、試験される試料１ｍｌあたり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ、例えば約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３６】
所望により、試料を、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と錯体を形成する錯化剤と更に反応させてもよい。錯化剤の例としては、ポリアニオン類、ポリアニオン類と二価金属塩との組み合わせ、及びａｐｏＢ含有リポタンパク質に結合できる抗体が挙げられる。ポリアニオン類は、ホスホタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩から選ぶことができる。一度錯化した形態になると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質は反応に利用できなくなり、従ってコレステロール測定を妨げない。しかしながら、本発明においては特異的な界面活性剤を使用するため、錯化剤は必要でない。従って、試料を錯化剤と反応させないことが好ましい。
【００３７】
イオン性塩を、選択的界面活性剤と組み合わせて用いてもよい。イオン性塩の例は、アルカリ金属（例、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）又は遷移金属（例、Ｃｒ３＋）の塩である。塩化物は好適な塩である。イオン性塩の使用により、反応速度を加速することができ、よって最大のＨＤＬのディファレンシエーションがより迅速に観察される。
【００３８】
試料のＨＤＬ−コレステロール含量の測定を、コレステロールを測定するための任意の好適な技法によって行うことができる。好ましい技法には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させることを伴う。１つの実施形態においては、コレステロールデヒドロゲナーゼが用いられる。従って本発明は、試料を界面活性剤及びコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させる方法を包含する。
【００３９】
ＨＤＬリポタンパク質中に含有されるコレステロールは、遊離コレステロール又はコレステロールエステル類の形態であり得る。従って、任意のコレステロールエステル類を遊離コレステロールに分解するために、コレステロールエステル加水分解試薬が典型的に用いられる。次いで、遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させ、そのような反応を受けたコレステロールの量を測定する。
【００４０】
コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステル類をコレステロールに加水分解できる、任意の試薬であり得る。試薬は、コレステロールのコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応、及びアッセイにおけるその後の任意の段階を妨げないものでなければはならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は酵素であり、例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。好適なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）又はクロモバクテリウム・ビスコサム（chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。任意に安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有する市販の酵素（例、東洋紡又はアマノから入手可能なもの）を用いてもよい。コレステロールエステル加水分解試薬は、試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇの量で用いてもよい。
【００４１】
任意の市販形態の、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えばノカルディア（Nocardia）種由来である。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、試薬混合物１ｍｌあたり０．０１〜１００ｍｇの量で用いてもよい。１つの実施形態においては、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼは、試料１ｍｌあたり０．１〜２５ｍｇ、例えば試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは、１ｍｌあたり０．５〜２５ｍｇの量（１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇ等）で用いられる。
【００４２】
各々の酵素は、安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有し得る。更に、各々の酵素は、化学的に修飾されていてもよい。
【００４３】
界面活性剤は、試料に対して、他の試薬を加える前に加えてもよく、又は他の試薬を加えるのと同時に加えてもよい。好ましい実施形態においては、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ及び界面活性剤は、単一の段階で試料と混合される単一の試薬混合物中に存在する。特に好ましい実施形態においては、当該方法は、試料を試薬と接触させる単一の段階を伴い、その結果、単一の試薬混合物のみ提供される必要がある。
【００４４】
本発明による測定は、ＨＤＬ−コレステロールを含有する任意の好適な試料で実施できる。測定は、典型的には、全血又は血液成分（例えば血清又は血漿）で実施される。本発明の方法において使用する好ましい試料は、血清及び血漿である。測定を全血で実施する場合は、当該方法は、赤血球を除去するために血液を濾過する、更なる段階を含み得る。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール含量を測定するために、電気化学的技法を用いる。これは、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量を、電極で発生する電気化学的応答を測定することによって決定することを意味する。この実施形態においては、典型的には、試料を界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと相互作用できる補酵素、及び酸化又は還元されて電極で電気化学的に検出できる生成物を形成することができる酸化還元剤と反応させる。試料と試薬との混合物は、生じる酸化還元反応が検出できるように、電気化学セルの作用電極と接触させる。セルに電位を印加し、結果生じる電気化学的応答、典型的には電流を測定する。
【００４６】
この好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール量は、以下のアッセイ：
【００４７】
【化３】
【００４８】
（ここで、ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）に従って測定する。このアッセイにおいて、所望により、コレステロールデヒドロゲナーゼは、コレステロールオキシダーゼに置き換えることができる。当該アッセイによって生成した、還元された酸化還元試薬量を電気化学的に検出する。しかるべき場合には、更なる試薬もまた、このアッセイに含めてもよい。
【００４９】
典型的には、試料は、単一の段階で全ての試薬と接触する。従って、全ての必要な試薬を含有し、且つアッセイを実施するために容易に試料と接触できる試薬混合物を提供する。本発明の試薬混合物は、典型的には、界面活性剤を試料１ｍｌ当たり最大５０ｍｇ、好ましくは最大２０ｍｇ、例えば約５ｍｇの量で含み、コレステロールエステル加水分解試薬を試料１ｍｌ当たり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇの量で含み、且つコレステロールデヒドロゲナーゼを、試料１ｍｌ当たり０．１〜３０ｍｇ、好ましくは０．５〜２５ｍｇの量で含む。
【００５０】
典型的には、補酵素はＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通する構造的特徴を有し、且つコレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても働く化合物である。ＮＡＤ＋のアナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオＮＡＤ）；ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は、典型的には、１〜２０ｍＭ、例えば３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭの量で、試薬混合物中に存在する。
【００５１】
典型的には、酸化還元剤は、上に示したアッセイに従って還元できるものでなくてはならない。この場合、酸化還元剤は補酵素から（又は後述のようなレダクターゼから）電子を受容でき、且つ電子を電極に伝達できるものでなくてはならない。酸化還元剤は分子又はイオン錯体であってもよい。酸化還元剤は、タンパク質等の天然に存在する電子受容体であってもよく、又は合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有するであろう。
【００５２】
好ましくは、酸化還元剤は無機錯体である。当該剤は金属イオンを含んでもよく、少なくとも２価を有することが好ましいであろう。特に、当該剤は、遷移金属イオンを含んでもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は帯電していてもよく、例えば、カチオン性又は代替的にはアニオン性であってもよい。好適なカチオン性の剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋等のルテニウム錯体であり、好適なアニオン性の剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−等のフェリシアン化錯体である。
【００５３】
用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）及び（エチレンジアミン等の）それらのキレートアミンリガンド誘導体類、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及び、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及びＣＯ２Ｈ等の、１以上の基が２つのシクロペンタジエニル環の一方又は両方へと置換されたその誘導体類が挙げられる。無機錯体は、好ましくはＦｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００５４】
酸化還元剤は、典型的には、１０〜２００ｍＭ、例えば２０〜１５０ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ（例、最大８０ｍＭ）の量で試薬混合物中に存在する。
【００５５】
好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイにおいて用いられる試薬混合物は、レダクターゼを更に含む。レダクターゼは、典型的には、還元型ＮＡＤから２個の電子を伝達され、酸化還元剤へ２個の電子を伝達する。従って、レダクターゼの使用により、素早い電子の伝達がもたらされる。
【００５６】
用いることができるレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ並びにチトクロームＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のチトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェレドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸還元酵素、チトクロームｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシンレダクターゼ及び酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明で用いるための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００５７】
レダクターゼは組み換えタンパク質、又は精製若しくは単離した天然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、電子の伝達を行う速度又は基質特異性を最適化する等、その性能を向上するために変異されていてもよい。
【００５８】
レダクターゼは、典型的には、０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は２〜２０ｍｇ／ｍｌの量で試薬混合物中に存在する。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイの大まかなスキームは、以下：
【００６０】
【化４】
【００６１】
（式中、
ＰｄＲはプチダレドキシンレダクターゼであり、
Ｄｉａはジアホラーゼであり、
ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）
の通りである。
【００６２】
試薬混合物は、任意に、１以上の更なる成分、例えば、賦形剤及び／又は緩衝液及び／又は安定化剤を含有する。至適酵素活性のために必要なｐＨを提供するために、緩衝液も含めてもよい。例えば、トリス緩衝液（ｐＨ９）を用いてもよい。例えば、酵素の安定性を高めるために、安定化剤を加えてもよい。好適な安定化剤の例は、アミノ酸（例、グリシン、及びエクトイン）である。
【００６３】
混合物を安定化するため、並びに任意で、試薬混合物を本発明の装置上で乾燥する場合に当該乾燥混合物に多孔性を提供するために、当該試薬混合物に賦形剤を含んでもよい。好適な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトース等の糖類、並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンもまた、賦形剤として用いることができる。本明細書中に記載する界面活性剤の特別な利点は、界面活性剤及び賦形剤としての、その複合作用である。従って、本発明の１つの実施形態においては、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体及び／又はＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体を、界面活性剤と賦形剤が合わさったものとして用いる。従って、本実施形態においては、個別の賦形剤は用いない。
【００６４】
好ましい実施形態においては、本発明の電気化学的アッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元剤を含む。より好ましい実施形態においては、試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋又はそのアナログ、ジアホラーゼ又はプチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含む。
【００６５】
本発明の試薬混合物は、典型的には、固形形態、例えば、乾燥形態、又はゲルとして提供される。代替的には、溶液又は懸濁液の形態であり得る。反応混合物中に存在する各々の成分量は、上にモル濃度又はｗ／ｖで表しているが、当業者には、存在する各々の成分の相対量が同じであるまま、これらの量を乾燥混合物又はゲルに好適な単位に適合させることができるであろう。
【００６６】
電気化学的測定が全血で実施される場合、得られる測定結果はヘマトクリット値に依存し得る。従って、測定結果は理想的には、少なくとも部分的に、この要因を説明するために調整するべきである。代替的には、アッセイを実施する前に、試料を濾過することによって赤血球を除去できる。
【００６７】
本発明はまた、ＨＤＬを含有する試料のＨＤＬコレステロール含量を選択的に決定するためのキットを提供する。当該キットには、必要な試薬（例、界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段）が含まれる。
【００６８】
好ましい実施形態においては、当該キットは、ＨＤＬ−コレステロール含量を電気化学的に決定するための装置を含む。この実施形態においては、反応したコレステロールの量を決定するための手段は、作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；セルに電位を印加するための電源；及び結果生じる電気化学的応答、典型的にはセルを横断する電流、を測定するための測定機器を含む。
【００６９】
電気化学的な決定のための装置は、典型的には、上記した通りの試薬混合物を含む。当該試薬は個々に、又は１以上の試薬混合物の形態でキット中に存在し得る。単一の試薬混合物が好ましい。試薬混合物は装置中に、液体又は固体のいずれの形態でも存在し得るが、固体形態が好ましい。
【００７０】
典型的には、試薬混合物は、好適な液体（例、水又は緩衝液）中に懸濁／溶解させて装置中に挿入するか又は装置上に置き、次いで所定の位置で乾燥させる。装置中／上で物質を乾燥させるこの段階は、当該物質を望ましい場所に保持するのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）によって実施され得るが、凍結乾燥が好ましい。試薬混合物は、典型的には、試料が試薬混合物と接触したとき、電極との接触も起きるように、電極の付近に配置される。
【００７１】
当該装置には、任意に、試験する試料が、試薬混合物と接触する前に通過する膜が含まれ得る。当該膜は、例えば、赤血球（red blood cell）、赤血球（erythrocyte）及び／又はリンパ球等の成分を濾過で除去するために用いてもよい。血液濾過膜を含む好適な濾過膜は、当該技術において公知である。Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２、Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘが血液濾過膜の例である。繊維ガラスフィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は全血から血漿を分離でき、また全血検査試料が装置に供給され、且つ試験される試料が血漿である場合に好適に用いられる。
【００７２】
使用前に親水的又は疎水的処理を経てきたものを含む、代替的又は付加的な膜も用いてもよい。所望により、膜表面のその他の特徴もまた、改変してもよい。例えば、所望の試料の膜を通る流れを促進するために、水中における膜の接触角を修正するための処理を用いてもよい。当該膜は１又は２以上の材料層を含んでもよく、各々は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、異なる膜材料の２層を有する、従来の二重層膜を用いてもよい。
【００７３】
本発明において用いるための適切な装置には、ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載のものが含まれる。
【００７４】
本発明の１つの実施形態による装置を、図４に記載する。この実施形態においては、作用電極５はミクロ電極である。本発明の目的のために、ミクロ電極は、５０μｍを超えない少なくとも１つの作業寸法を有する電極である。
【００７５】
セルは、底部１及び壁（単数又は複数）２を有するレセプタクル又は容器の形態である。典型的には、レセプタクルは、２５〜１０００μｍの深さ（即ち、上部から底部まで）を有するであろう。１つの実施形態においては、レセプタクルの深さは、５０〜５００μｍ、例えば、１００〜２５０μｍである。代替的な実施形態においては、レセプタクルの深さは５０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。レセプタクルの長さ及び幅（即ち、壁から壁まで）、又はレセプタクルが円筒状の場合はその直径は、典型的には、０．１〜５ｍｍ、例えば、０．５〜１．５ｍｍ（１ｍｍ等）である。
【００７６】
レセプタクル３の開口端は、部分的に、不透過性材料で覆われてもよく、又は半透性若しくは透過性の膜等の、半透性若しくは透過性の材料で覆われてもよい。レセプタクルの開口端は、実質的に、半透性又は透過性の膜４で覆われるのが好ましい。膜４は、とりわけ、埃又は他の混入物質がレセプタクルに入ることを防ぐのに役立つ。
【００７７】
作用電極５は、レセプタクルの壁に位置する。作用電極は、例えば、レセプタクルの壁周囲の連続した帯の形態である。作用電極の厚みは、典型的には０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍであり、例えば０．１〜２０μｍである。より厚みのある作用電極、例えば、０．１〜５０μｍ、好ましくは５〜２０μｍの厚みを有する電極も想定している。作用電極の厚みは、レセプタクルをその底部上に置く場合は、その垂直方向の寸法である。作用電極の厚みは、その有効作業寸法、即ち、試験する試料と接触する、電極の寸法である。作用電極は、例えば、導電性インクの形態の、炭素、パラジウム、金又は白金で形成するのが好ましい。当該導電性インクは、例えば、白金及び／又はグラファイト及び／又は白金炭素といった更なる材料を含有する改良インクであり得る。作用電極を形成するために２以上の層を用いてもよく、当該層は、同じか、又は異なった材料で形成される。
【００７８】
セルはまた、例えば、レセプタクルの底部、レセプタクルの壁（単数又は複数）中、又はレセプタクルの周囲若しくは付近の装置の領域中に存在し得る擬似参照電極（示さず）を含有する。擬似参照電極は、典型的には、Ａｇ／ＡｇＣｌから作られるが、他の材料も用いてもよい。擬似参照電極として用いるための好適な材料は、当業者に公知である。この実施形態においては、セルは、擬似参照電極が対向電極及び参照電極の両方として働く２電極システムである。セルが参照電極及び別個の対向電極を含む、代替の実施形態も想定できる。
【００７９】
擬似参照（又は参照）電極は、典型的には、作用電極５と同様のサイズの、若しくはそれより小さい、又は大きい（例えば相当大きい）表面積を有する。典型的には、擬似参照（又は参照）電極の表面積の、作用電極の表面積に対する比率は、少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１、又は少なくとも３：１である。好ましい比率は少なくとも４：１である。擬似参照（又は参照）電極は、例えば、マクロ電極であってもよい。好ましい擬似参照（又は参照）電極は、０．０１ｍｍ又はそれを上回る、例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法を有する。これは例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、直径であり得る。擬似参照（又は参照）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．１ｍｍ２〜６０ｍｍ２であり、例えば１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と擬似参照（又は参照）電極との間の最短距離は、例えば、５０〜１０００μｍである。セルが機能できるためには、電極は各々絶縁材料６によって分離されなければならない。絶縁材料は、典型的には、例えば、アクリレート、ポリウレタン、ＰＥＴ、ポリオレフィン、ポリエステルといったポリマー又は他の任意の安定な絶縁材料である。ポリカーボネート並びに他のプラスチック及びセラミックも、好適な絶縁材料である。絶縁層はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって形成することができる。塗布後硬化する液体、例えばワニスも、用いてもよい。代替的には、例えば、熱若しくはＵＶへの曝露によって、又は２成分の架橋可能なシステムの活性部分と混合することによって架橋される、架橋可能なポリマー溶液を用いてもよい。しかるべき場合には、絶縁層を形成するために、誘電性インクも用いてもよい。代替の実施形態においては、絶縁層は装置にラミネートされる（例えば熱でラミネートされる）。
【００８０】
電気化学セルの電極は、好適な任意の手段によって、必要な任意の測定機器に接続してもよい。典型的には、電極は、導電性のトラック（track）に接続され、該導電性のトラックは、必要な測定機器にそれ自身接続されるか、又は接続され得る。
【００８１】
図４中の７に示す通り、必要な試薬は、典型的にはレセプタクル内に含有させる。典型的には、単一の試薬混合物の形態の試薬は、液体の形態でレセプタクル内に挿入された後、組成物を固定するのに役立つよう乾燥させる。試薬混合物は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥、又はオーブン乾燥（加熱）されてもよく、最も好ましくは、凍結乾燥される。
【００８２】
本発明の装置は、試料を装置に提供し、且つ試料の試薬混合物への接触を可能にすることによって機能させる。血漿又は血液を溶解し、且つ混合物中の試薬と反応させるために十分な時間が割り当てられなければならないのは明らかである。凍結乾燥した試薬を含有するセンサに血漿を添加する場合は、センサへの試料のアプライと、セルの印加電位の印加との間に概ね２０秒間が経過する。全血が用いられる場合、血液細胞の除去を可能にするために、この遅延時間はより長くてもよく、例えば最大５分である（例えば、血液は、試薬と接触する前に濾過膜を通過し得る）。本発明の１つの実施形態においては、血漿は、電気化学セルとの接触前に試薬と混合され、セルに添加されて即座に電位が印加される。典型的には、電位が印加され、測定結果を１０秒、典型的には１〜４秒以内に読み取る。
【００８３】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極で検出すべき生成物の場合、セルに印加する電位は０．１Ｖ〜０．３Ｖである。０．１５Ｖが好ましい印加電位である。（本明細書中で述べる電圧はすべて、０．１Ｍ塩化物ありでの、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する値である。）好ましい実施形態においては、電位が、約１秒間、０．１５Ｖの正の印加電位であるのが最初の段階である。還元電流の測定を望む場合、次いで、−０．４〜−０．６Ｖの負の電位を印加する。二重の電位段階の使用は、ＷＯ０３／０９７８６０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。異なる酸化還元剤を用いる場合、酸化／還元ピークが生じる電位に従って、印加電位を変えることができる。
【００８４】
従って、本発明の電気化学的試験で、ＨＤＬコレステロールの測定を、試料を装置にアプライしてから非常に短時間で、典型的には約５分以内で、好ましくは３分以内で、２分以内で、又は１分以内にでさえ、行うことが可能になる。状況によっては、試料を装置にアプライしてからわずか１５秒又は３０秒で結果を得ることができるかもしれない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３を含むＨＥＧＡ−８
本実験の目的は、ＨＥＧＡ−８界面活性剤及びＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【００８６】
０．１Ｍ トリス緩衝液ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％β−ラクトースを含有するβ−ラクトース緩衝溶液を調製した。ラクトース緩衝溶液にＨＥＧＡ−８を加え、ＨＥＧＡ−８の最終濃度を５％にすることにより、ＨＥＧＡ−８溶液を作成した。
【００８７】
ＨＥＧＡ−８溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（アルファエイサー、１０５１１）
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより、酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【００８８】
分注及び凍結乾燥
電動ピペットを用いて０．４μＬ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。センサは、ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りであった。
【００８９】
血漿試料
血漿試料を３０分間解凍した後、２９００ＲＣＦで５分間遠心分離した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）をまた、試料として使用した。Ｓｐａｃｅクリニカルアナライザーを用いて、試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を解析した。
【００９０】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【００９１】
解析
これらのデータを、スペースアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬ濃度に対して相関させた。各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエント（既知の濃度に対する測定電流）を用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【００９２】
結果
６３秒において、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントは、それぞれ１３９．６ｎＡ／ｍＭ及び０．７５ｎＡ／ｍＭであった。ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションは９９．５％であった。
５％ＨＥＧＡ−８及び８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを含有するセンサを用いるとＨＤＬに対する高いディファレンシエーションが得られた。
【００９３】
実施例２：Ｃ−ＨＥＧＡ
本実験の目的は、様々なアルキル鎖長を有するＣ−ＨＥＧＡ界面活性剤を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【００９４】
０．１Ｍ トリス緩衝液ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％β−ラクトースを含有する、β−ラクトース緩衝溶液を調製した。１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ（Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］）溶液を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【００９５】
Ｃ−ＨＥＧＡ溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＣ−ＨＥＧＡを加え、以下の最終濃度：
Ｃ−ＨＥＧＡ−８（アナトレース、Ｃ４０８）
２００ｍＭ（２０７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【００９６】
Ｃ−ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｃ４０９）
２００ｍＭ（２０４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【００９７】
Ｃ−ＨＥＧＡ−１０（アナトレース、Ｃ４１０）
２００ｍＭ（１９３μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４６ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【００９８】
Ｃ−ＨＥＧＡ−１１（アナトレース、Ｃ４１１）
２００ｍＭ（１９７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１５５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ （２００ｍＭ ストック２５μｌ+ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
にすることにより、２倍強度のＣ−ＨＥＧＡ溶液を作成した。
【００９９】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１００】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及びＣ−ＨＥＧＡ溶液を１：１で混合して、最終の酵素／界面活性剤混合物を得た。加えて、それぞれ等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。電動ピペットを用いて、０．４μＬ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。使用したセンサは、ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りであった。
【０１０１】
血漿試料の調製、テスト及び解析は実施例１に記載の通りであった。
各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１０２】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションを次の表に示す：
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
これらのＣ−ＨＥＧＡ界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答と比較して、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。
【０１０５】
実施例３：ＨＥＧＡ：
本実験の目的は、様々なアルキル鎖長を有するＨＥＧＡ界面活性剤を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１０６】
ＲｕＡｃａｃ溶液を、実施例２に記載の通りに作成した。
【０１０７】
ＨＥＧＡ溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＨＥＧＡを加え、以下の最終濃度：
ＨＥＧＡ−８（アナトレース、Ｈ１０８）
２００ｍＭ（２１２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４９ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１０８】
ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
２００ｍＭ（１９６μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１４３ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
にすることにより２倍強度のＨＥＧＡ溶液を作成した。
【０１０９】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合し、ＣｏｖａｒｉｓのＳ−シリーズＳｏｎｏＬａｂ−Ｓ１ソフトウェア−プログラムＨＤＬ４℃を使用した。
【０１１０】
分注、凍結乾燥、血漿試料の調製、テスト及び解析を、実施例２に記載の通りに行った。
【０１１１】
結果
９６秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
これらのＨＥＧＡ界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答と比較して、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。
【０１１４】
更に、１１８秒における応答とＨＤＬ及びＬＤＬ濃度との間の相関に関する重回帰による解析を、以下の表に示す。
【０１１５】
【表３】
【０１１６】
実施例４：グルカミドでの再現性
本実験の目的は、ＴＣ特異的界面活性剤又は界面活性剤なしと比較してグルカミド界面活性剤を使用した場合、測定された応答の血漿ＨＤＬ濃度に対する相関が改善されることを実証することであった。
【０１１７】
１０％β−ラクトース緩衝液は、実施例１に記載の通りであった。
【０１１８】
界面活性剤溶液
以下の通りに２倍強度の界面活性剤溶液を作成した：
１．９９６ｍｌ １０％ラクトース緩衝液中にＣＨＡＰＳ（シグマ−アルドリッチ社、Ｃ５０７０）１０％ ０．１９９６ｇ
１．７６３ｍｌ ＣＨＡＰＳ溶液中にデオキシｂｉｇＣＨＡＰＳ（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｓ１１５）１０％ ０．１７６３ｇ
１．７１９ｍｌ １０％ラクトース緩衝液中にＨｅｇａ９（アナトレース、Ｈ１０９）２００ｍＭ ０．１２５７ｇ
【０１１９】
次いで、緩衝溶液及び各界面活性剤溶液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、それぞれ３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃの最終濃度とした：
１．５１２ｍｌ １０％ラクトース緩衝液中に０．０２４８ｇ ＲｕＡｃａｃ＝ブランク（界面活性剤なし）
１．６２２ｍｌ １０％ ＣＨＡＰＳ／１０％ デオキシｂｉｇＣＨＡＰＳ溶液中に０．０２６６ｇ ＲｕＡｃａｃ
１．６２８ｍｌ ２００ｍＭ Ｈｅｇａ ９溶液中に０．０２６７ｇ ＲｕＡｃａｃ
【０１２０】
ＲｕＡｃａｃメディエーター＝Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、これらの溶液を混合した。
【０１２１】
酵素混合物
ブランクＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
２０．２ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１２２】
生成物の分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約１．４ｍｌ）の２倍濃度の酵素溶液及び界面活性剤溶液を１：１で混合して、最終の酵素／界面活性剤混合物を得た。加えて、等量（約１．４ｍｌ）ずつの２倍濃度の酵素溶液及びブランク３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合してブランク混合物を調製した。使用したセンサは、ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りであった。０．３５μｌ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注し、凍結乾燥した。
【０１２３】
血漿試料を実施例２に記載の通りに調製した。
【０１２４】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。８つのタイムポイント（０、５９、１１８、１７７、２３６、２９５、３５４及び４１３秒）にて０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４７２秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を８回テストした。
【０１２５】
解析
これらのデータを、スペースアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ濃度に対して相関させた。各タイムポイントにおけるＨＤＬへの応答に関する較正プロットを構築した。全てのセンサからのデータを総合した。
【０１２６】
結果
５９秒における各センサ型に関する較正プロットに関する相関係数を以下の表に示す：
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
界面活性剤を加えていない又はＣＨＡＰＳ／デオキシｂｉｇＣＨＡＰを有するセンサと比較して、ＨＥＧＡ−９を含有するセンサに関して測定されたセンサ応答とＨＤＬ濃度との間により高い相関が得られる。
【０１２９】
更に、１１８秒における応答とＨＤＬ及びＬＤＬ濃度との間の相関に関する重回帰による解析を以下の表に示す。
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
実施例５：ＨＥＧＡ−９及びイオン性塩：
本実験の目的は、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９及び様々なイオン性塩を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１３２】
１０％β−ラクトース緩衝液を実施例１に記載の通りに調製した。
１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃを作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１３３】
３．７２４ｍＬ ＲｕＡｃａｃ溶液に０．２６１２ｇ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）を加えることにより、ＨＥＧＡ−９溶液を作成した。
【０１３４】
イオン性塩溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液に塩を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍濃度のイオン性塩溶液を調製した：
【０１３５】
ＬｉＣｌ（アルドリッチ、２１、３２３−３）
１．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液：０．０１１３ｇを１７７μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
１Ｍ ＬｉＣｌ溶液：４０μｌの１．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液を２０μＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１３６】
ＮａＣｌ（シグマ、Ｓ−７６５３）
１Ｍ ＮａＣｌ溶液：０．００６６ｇを１１３μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
【０１３７】
ＭｇＣｌ２（シグマ、Ｃ−４９０１）
５００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液：０．０１０３ｇを１０１μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液：３０ｕＬの５００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を３０μＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１３８】
ＣａＣｌ２（シグマ、Ｍ２６７０）
５００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：０．００５８ｇを１０５μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
２５０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：３０ｕＬの５００ｍＭＣａＣｌ２溶液を３０ｕＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１３９】
Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（マンチェスターオーガニックス）
１２０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：０．００７５ｇを１２０μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
【０１４０】
Ｃｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（アルファエイサー、Ａ１５４７０）
１２０ｍＭ Ｃｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：０．００８２ｇを１２７μＬのＨＥＧＡ−９溶液に溶解した。
６０ｍＭ ＣｏＮＨ３）６Ｃｌ３：３０μＬの１２０ｍＭ Ｃｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液を３０μＬのＨＥＧＡ−９溶液と混合した。
【０１４１】
酵素混合物
ＨＥＧＡ−９溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１４２】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約４０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及びイオン性塩溶液を１：１で混合して、最終の酵素／イオン性塩混合物を得た。加えて、等量（約４０ｕＬ）ずつの２倍濃度の酵素溶液及び３０ｍＭ ＨＥＧＡ−９溶液を混合してブランク混合物を調製した。ＷＯ２００３／０５６３１９に記載の通りに電動ピペットを用いて０．４μＬ／ウェルの各溶液をセンサ上に分注し、凍結乾燥した。
【０１４３】
血漿試料を実施例２に記載の通りに調製した。
【０１４４】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。８つのタイムポイント（０、５９、１１８、１７７、２３６、２９５、３５４及び４１３秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４７２秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【０１４５】
これらのデータを、スペースアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬ濃度に対して相関させた。各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１４６】
結果
ＨＤＬへの応答のグラジエントが最大値に達する時間は、酵素混合物の間で変化するように見えた。時間を以下の表に示す：
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を用いて調製したセンサに関して、イオン性塩の添加の結果、酵素混合物中にイオン性塩が存在するならば、ＨＤＬへの応答の最大グラジエントにより迅速に到達した。即ち、応答の速度はイオン性塩の存在により増加した。
【０１４９】
実施例６：ＨＥＧＡ−９滴定及び異なるリパーゼ又はＣｈＥ
本実験の目的は、広範囲の濃度のＨＥＧＡ−９で調製したセンサのＨＤＬへの応答の依存性を調べることであり、並びにまた、異なるリパーゼ又はコレステロールエステラーゼの効果を調べることであった。
【０１５０】
２つの別々の酵素混合物を同日に製造し、１つはＨＥＧＡ−９滴定のため、１つは東洋紡リパーゼ又はジェンザイムコレステロールエステラーゼの使用のためである。
【０１５１】
ＨＥＧＡ−９滴定のための酵素混合物：
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ緩衝液を実施例２記載の通りに作成した。
【０１５２】
ＨＥＧＡ−９溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＨＥＧＡ−９を加え、以下の最終濃度：
ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
６００ｍＭ（２５１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０５５０ｇ）
４００ｍＭ（６００ｍＭ ストック６０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液３０μｌ）
２００ｍＭ（６００ｍＭ ストック３０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ 溶液６０μｌ）
１００ｍＭ（６００ｍＭ ストック１５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
５００ｍＭ（６００ｍＭ ストック１０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液１１０μｌ）
２０ｍＭ（６００ｍＭ ストック３μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液８７μｌ）
にすることにより２倍強度のＨＥＧＡ−９溶液を作成した。
【０１５３】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１５４】
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度の酵素溶液及びＨＥＧＡ−９溶液を１：１で混合して、最終の酵素／界面活性剤混合物を得た。加えて、等量（約５０ｕＬ）ずつの２倍濃度の酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。
【０１５５】
東洋紡リパーゼ又はジェンザイムエステラーゼのための酵素混合物：
ラクトース緩衝溶液を実施例１に記載の通りに作成した。１．０１８ｍｌのラクトース緩衝溶液に０．０３７２ｇ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）を加えることにより１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９溶液を作成した。９６３ｕＬの１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９溶液に０．０１５８ｇ ＲｕＡｃａｃを加えることによりＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。
【０１５６】
酵素混合物
シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）（東洋紡）由来のリパーゼ又はシュードモナス・エスピー（ジェンザイム）由来のコレステロールエステラーゼのいずれかを用いて２つの別々の最終酵素混合物を調製した。
【０１５７】
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（東洋紡）又は３．３ｍｇ／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（ジェンザイム）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより単倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１５８】
分注、凍結乾燥、血漿試料調製、テスト及び解析は実施例２に記載の通りに行った。
【０１５９】
結果
１１８秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１６０】
【表７】
【０１６１】
ＨＥＧＡ−９界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答と比較して、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。ＨＤＬに対する最も高いディファレンシエーションのためのＨＥＧＡ−９の最適量は５０〜２００ｍＭである。
【０１６２】
界面活性剤を加えていないセンサ応答と比較して、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９及びジェンザイムリパーゼ、東洋紡リパーゼ又はジェンザイムエステラーゼのいずれかを有するセンサは、ＨＤＬに対して増加した応答のグラジエント及びディファレンシエーションを与える。
【０１６３】
実施例７：ＭＥＧＡ
本実験の目的は、様々なアルキル鎖長を有するＭＥＧＡ界面活性剤を含有するセンサのＨＤＬへの応答を調べることであった。
実施例２をＭＥＧＡ−７及びＭＥＧＡ−８溶液を用いて繰り返した。
実施例２に記載の通りにＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。
【０１６４】
ＭＥＧＡ溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液にＭＥＧＡを加え、以下の最終濃度：
ＭＥＧＡ−７（ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）（シグマ Ｈ１６３９）
２００ｍＭ（２９０μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１７８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１６５】
ＭＥＧＡ−８（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｓ１１６）
２００ｍＭ（２９２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に０．０１８８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
にすることにより２倍強度のＭＥＧＡ溶液を作成した。
【０１６６】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１６７】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１６８】
【表８】
【０１６９】
これらのＭＥＧＡ界面活性剤の使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答と比較して、ＨＤＬに対する応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。
【０１７０】
実施例８：ブランク及びＨＥＧＡ−９の変動性
本実験の目的は、界面活性剤を加えないか又は１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を用いるかのいずれかで調製したセンサの異なるバッチを用いて観察される血漿ＨＤＬへの応答における変動性を調べることであった。
【０１７１】
センサは数ヶ月の期間にわたって何度も調製された。ブランク及びＨＤＬ化学物質に関して最終製剤を以下に示す。
【０１７２】
添加される界面活性剤を含有しない最終酵素混合物
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）
３０ｍＭ ＫＯＨ
１０％ｗ／ｖ ラクトース
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１７３】
１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する最終酵素混合物
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）
３０ｍＭ ＫＯＨ
１０％ｗ／ｖ ラクトース
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ
１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
３．３ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１７４】
分注及び凍結乾燥は、実施例２に記載の通りであった。
【０１７５】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料をセンサごとに使用した。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェント時間は４秒だった。各試料を重複してテストした。
【０１７６】
８秒のトランジェント時間で較正を何度か行った。６つ又は８つのいずれかのタイムポイント（０、５９、１１８、１７７、２３６、２９５、（３５４）、（４１３）秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（３５４又は４７２秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【０１７７】
Ｓｐａｃｅクリニカルアナライザーからの血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬ濃度と共に、これらのデータを解析した。多重線形回帰を行い、応答のＨＤＬ及びＬＤＬグラジエント及び各タイムポイントにおける切片を得た。応答のグラジエントを用いて、％ディファレンシエーションを各タイムポイントにおいて得た。
【０１７８】
結果
各較正について、電流対［ＨＤＬ］プロットについての相関係数（ｒ２値）が最も高いタイムポイントに関するｒ２値及び％ディファレンシエーションを以下に表にする。
【０１７９】
【表９−１】
【表９−２】
【０１８０】
ｒ２及び％ディファレンシエーションの平均値及び標準偏差をブランク及びＨＥＧＡ−９センサに関して示している。
【０１８１】
界面活性剤を加えていないセンサと比較して、平均ｒ２値及び％ディファレンシエーションは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を有するセンサに関して有意に高かった。加えて、界面活性剤を加えていないセンサと比較して、ｒ２値の標準偏差及び％ディファレンシエーションの値は、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を有するセンサに関してより低い。
【０１８２】
界面活性剤を加えていないセンサと比較して、１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９の使用は血漿ＨＤＬ濃度に対するセンサの応答の相関を有意に増加させる。加えて、ＨＥＧＡ−９の使用により、血漿ＨＤＬに対するセンサ応答のバッチごとの再現性は、有意に向上する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤であって、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法。
【請求項２】
界面活性剤が、高密度リポタンパク質中の、コレステロール量の決定の再現性を向上させるためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤（ａ）が、少なくとも５０％を下回る、式（ｉ）：
【数１】
［式中、測定（ＨＤＬコレステロール）又は測定（ＬＤＬコレステロール）は、それぞれＨＤＬ又はＬＤＬ濃度に関係する測定値である］で与えられるＬＤＬに対するＨＤＬのディファレンシエーションを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤（ａ）が、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０及びＭＥＧＡ−１２から選ばれる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
当該方法が、所与の試料のＨＤＬ濃度に関する、複数回の測定のデータセットを提供するために、該試料について測定を１回以上繰り返すことを含み、且つ該データセットについてのＲ２が少なくとも０．６である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量が、試料を（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させること、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量を決定することによって測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量が、電気化学的技法によって測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
試料を
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ）補酵素；及び
（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；
と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料を、さらに（ｆ）レダクターゼと反応させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料を、界面活性剤（ａ）、コレステロールエステル加水分解試薬（ｂ）及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ（ｃ）と同時に反応させる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
高密度リポタンパク質を含有する試料が全血であり、且つ方法が、赤血球を除去するために、試料を濾過する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量の測定が、試料の界面活性剤との反応から３分以下の時間内で完了される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において使用するための試薬混合物であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定したとおりの高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ
を含む、試薬混合物。
【請求項１４】
（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び任意に（ｆ）レダクターゼを更に含む、請求項１３に記載の試薬混合物。
【請求項１５】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定したとおりの高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに任意に（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤、及び（ｆ）レダクターゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段のうちの１つ以上を含む、キット。
【請求項１６】
コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段が
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；
− セルに電位を印加するための電源；及び
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上が、単一の試薬混合物の形態で存在する、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
試薬混合物が乾燥した形態である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項において規定したとおりのキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上と、（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び、電極と接触させること；
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成された生成物の量を電気化学的に検出すること
を含む、方法。
【請求項２０】
段階（ｉｉｉ）が、試料を試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と接触させた時間から最大３分以内の時間で完了される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
高密度リポタンパク質中の、コレステロール量の決定の再現性の向上における、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤の使用。
【請求項１】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤であって、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法。
【請求項２】
界面活性剤が、高密度リポタンパク質中の、コレステロール量の決定の再現性を向上させるためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤（ａ）が、少なくとも５０％を下回る、式（ｉ）：
【数１】
［式中、測定（ＨＤＬコレステロール）又は測定（ＬＤＬコレステロール）は、それぞれＨＤＬ又はＬＤＬ濃度に関係する測定値である］で与えられるＬＤＬに対するＨＤＬのディファレンシエーションを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤（ａ）が、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０及びＭＥＧＡ−１２から選ばれる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
当該方法が、所与の試料のＨＤＬ濃度に関する、複数回の測定のデータセットを提供するために、該試料について測定を１回以上繰り返すことを含み、且つ該データセットについてのＲ２が少なくとも０．６である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量が、試料を（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させること、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量を決定することによって測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量が、電気化学的技法によって測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
試料を
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ）補酵素；及び
（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；
と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料を、さらに（ｆ）レダクターゼと反応させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料を、界面活性剤（ａ）、コレステロールエステル加水分解試薬（ｂ）及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ（ｃ）と同時に反応させる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
高密度リポタンパク質を含有する試料が全血であり、且つ方法が、赤血球を除去するために、試料を濾過する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量の測定が、試料の界面活性剤との反応から３分以下の時間内で完了される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において使用するための試薬混合物であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定したとおりの高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ
を含む、試薬混合物。
【請求項１４】
（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び任意に（ｆ）レダクターゼを更に含む、請求項１３に記載の試薬混合物。
【請求項１５】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定したとおりの高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに任意に（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤、及び（ｆ）レダクターゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段のうちの１つ以上を含む、キット。
【請求項１６】
コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段が
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；
− セルに電位を印加するための電源；及び
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上が、単一の試薬混合物の形態で存在する、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
試薬混合物が乾燥した形態である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項において規定したとおりのキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上と、（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び、電極と接触させること；
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成された生成物の量を電気化学的に検出すること
を含む、方法。
【請求項２０】
段階（ｉｉｉ）が、試料を試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と接触させた時間から最大３分以内の時間で完了される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
高密度リポタンパク質中の、コレステロール量の決定の再現性の向上における、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類から選ばれる界面活性剤の使用。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５３７０１８（Ｐ２００９−５３７０１８Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１０５３３（Ｐ２００９−５１０５３３）
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１７６４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２２２２
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００４７２３２７）オックスフォード バイオセンサーズ リミテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１７６４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２２２２
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００４７２３２７）オックスフォード バイオセンサーズ リミテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
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