選択的界面活性剤を用いたＨＤＬコレステロールセンサ
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料中の高密度リポタンパク質と選択的に反応する界面活性剤であって、スクロースエステル類及びマルトシド類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに高密度リポタンパク質中のコレステロール量を、例えば電気化学的技法を用いて、測定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含有する試料中の、高密度リポタンパク質に結合するコレステロール（ＨＤＬコレステロール）量を決定するための方法に関する。本発明はまた、そのような方法において使用するための組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの疫学的研究で、コレステロール又はａｐｏ ＡＩ含量のいずれかの観点で測定される高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性に対する強く、且つ非依存的な逆相関が証明されてきた。ＨＤＬコレステロールが１０ｍｇ／Ｌ低下するごとにＣＡＤの危険性が２〜３％増加するといわれている。従って、ＨＤＬコレステロール濃度がより高いほど、予防的であると考えられている。従って、ＣＡＤに対する危険性を明らかにする際、及び脂質異常症の治療を行う際のＨＤＬコレステロールの測定が、臨床検査室でますます一般的になってきた。
【０００３】
研究技法から適合された、ＨＤＬコレステロール測定のための初期の検査室的方法では、沈殿試薬を用いる手作業の分離段階の後、それに引き続いてたいていの場合には自動化学分析装置による、コレステロール含量の分析が必要とされた。典型的な分離段階は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びキロミクロン（ＣＭ）のアグリゲートを形成するために沈殿試薬をこれらの成分と反応させることを伴っていた。その後アグリゲートを、例えば遠心分離によって、反応容器から除去して、ＨＤＬ含有試料を分析できる状態にしておいた。沈殿物がＵＶ／Ｖｉｓ又は使用される比色分析技法を妨げないようにするため、沈殿物の分離が不可欠であった。
【０００４】
より最近になって、様々なリポタンパク質画分の分離を事前に必要としない、多くの技法が開発されてきた。これらの方法は、典型的には、単一の段階で、又は少なくとも沈殿を実施する必要なく測定を成し遂げることができるという利点を有する。従って、測定の自動化が可能である。そのようなアプローチのあるものでは、様々なリポタンパク質画分を異なる速度で分解するある種の界面活性剤が用いられる。例えばある界面活性剤は、最初にＨＤＬとより迅速に反応するかもしれず、そしてＬＤＬとの反応はより緩やかに起こるかもしれない。当該界面活性剤を加えた後、所定の時間にコレステロール含量を測定することによって、測定が、ＬＤＬコレステロール含量よりもＨＤＬコレステロール含量により大きく依存することが分かってきた。
【０００５】
しかしながら、このアプローチは、その結果に必要な精度及び信頼性を生じてきておらず、また、当該測定結果は、依然としてある程度の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量への依存性を残していた。従って、血液や血漿等の体液のＨＤＬコレステロール含量の測定のための簡単であるが信頼でき且つ正確な方法を提供する新たなアプローチが必要である。測定はまた、試験試料中の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合したコレステロール含量への依存が低いか、又はそれらと完全に独立していなくてはならない。更に、好ましい方法は、専門的な設備を用いないか、又は実施するために熟練の技術者を必要としないであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤であって、スクロースエステル類及びマルトシド類から選ばれる界面活性剤と接触させること、並びに該高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法を提供する。当該界面活性剤は好ましくは、低密度リポタンパク質の反応を弱めるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明で用いられる界面活性剤は、非常に高い選択性を、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対してもたらす。以前の界面活性剤は、他のリポタンパク質と比較して、異なる速度でＨＤＬと反応することが示されてきているが、本発明の界面活性剤は、ほぼ排他的にＨＤＬと反応し、他のリポタンパク質と反応しないか、又は実質的に反応しない。試料中のＨＤＬは、可溶化して反応に利用できるＨＤＬコレステロールを残すが、一方で他のリポタンパク質画分に結合したコレステロールは、リポタンパク質構造内に結合したままで、反応には利用可能ではないと考えられている。しかしながら、本発明は、この作用様式には縛られない。代替的な理論としては、当該界面活性剤は、ＬＤＬの反応を選択的に抑制し、ＨＤＬのみ反応するのを可能にするというものである。従って、本発明の界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応するのを選択的に可能にするものであるが、一方でＬＤＬコレステロールは実質的に反応できない。従って、その後の、試料のコレステロール含量の測定では、ＨＤＬ−コレステロール含量のみが反映され、他のリポタンパク質画分内に含有されるコレステロール量には、実質的に依存しない。従って、本発明の方法は、ＨＤＬに対して高度に選択的であり、ＨＤＬ−コレステロールについての正確で信頼できる試験を提供する。
【０００８】
本発明の方法は、先行技術の試験と比較して、改善された簡便性という更なる利点を有する。ＨＤＬコレステロールの測定結果は、試料を単一の試薬混合物と反応させ、且つコレステロール含量を１回測定することによって得ることができる。更に、結果は非常に短時間で得ることができ、典型的には試料を添加して１分又は数分以内に得ることができる。
【０００９】
ＨＤＬコレステロールの測定は、典型的には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼのいずれかと反応させることによって行う。従って、本発明はまた、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において用いるための試薬混合物であって、
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める、本明細書中に規定した通りの界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ
を含む、試薬混合物を提供する。
【００１０】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める、本明細書中に規定した通りの界面活性剤、（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段、を含む、キットも提供する。当該キットは、典型的には、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段が
− 作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極（counter electrode）を有する電気化学セル；
− 該セルに電位を印加するための電源；並びに
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、電気化学的装置である。
【００１１】
本発明はまた、本発明のキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び、電極と接触させること
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成した生成物量を電気化学的に検出すること
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、スクロースモノカプレートを界面活性剤として用いて、（ａ）ＨＤＬを含有する血清、（ｂ）ＬＤＬを含有する血清、及び（ｃ）脱脂血清に関して実施したコレステロール測定の結果についての、測定された電流（ｎＡ）対時間（秒）を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態による装置を示す。
【図３】図３は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図４】図４は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図５】図５は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図６】図６は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図７】図７は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図８】図８は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図９】図９は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図１０】図１０は、ＬｉＣｌを用いるか、若しくは用いていない、スクロースモノカプレートを含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。グラフＡ−Ｄは、５％ＳＭＣ及び０、２５０、５００若しくは７５０ｍＭ ＬｉＣｌのいずれかを含有するセンサについてのものである。ＨＤＬ及びＬＤＬの応答のグラジエントを、それぞれ黒及び白の記号で示す。
【図１１】図１１は、（ａ）界面活性剤なし;（ｂ）４０ｍＭスクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）；及び（ｃ）１００ｍＭスクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）について、２３８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。ＨＤＬは実線の値で、ＬＤＬは破線／白丸で示す。
【図１２】図１２は、界面活性剤なし、４０ｍＭ ＳＭＤあり及び１００ｍＭ ＳＭＤありのセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（differentiation）（％）を時間（秒）に対して示す。
【図１３】図１３は、２３８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。（ａ）界面活性剤なし；（ｂ）６０ｍＭスクロースモノカプレート（ＳＭＣ）；及び（ｃ）１００ｍＭ ＳＭＣについて、ＨＤＬを実線の値で示し、ＬＤＬを破線／白丸の値で示す。
【図１４】図１４は、界面活性剤なし、６０ｍＭ ＳＭＣあり及び１００ｍＭ ＳＭＣありのセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（％）を、時間（秒）に対して示す。
【図１５】図１５は、０％、５％、７．５％及び１０％ ＳＭＣを用いたセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（％）を、時間（秒）に対して示す。
【図１６】図１６は、（ａ）０％ＳＭＣ、（ｂ）５％ＳＭＣ、（ｃ）７．５％ＳＭＣ及び（ｄ）１０％ＳＭＣを用いたセンサについて、ＨＤＬ（黒）及びＬＤＬ（破線、白丸の点（outline points））についての、９８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。
【図１７】図１７は、０％、０．５％、１．０％及び１．５％ＳＭＤを用いたセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（％）を、時間（秒）に対して示す。
【図１８】図１８は、（ａ）０％ＳＭＤ、（ｂ）０．５％ＳＭＤ、（ｃ）１．０％ＳＭＤ及び（ｄ）１．５％ＳＭＤを用いるセンサについて、ＨＤＬ（黒）及びＬＤＬ（破線、白丸の点）についての、９８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、試料のＨＤＬ−コレステロール含量を選択的に決定する方法を提供するが、ここで当該試料は、ＨＤＬのみならず、コレステロールに結合する他のリポタンパク質を含有し得るものである。ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して高度に選択的な特異的界面活性剤と、試料を接触させることによって選択性が実現される。従って、当該界面活性剤により、ＨＤＬに結合するコレステロール及びコレステロールエステル類が測定のために利用可能となるが、一方でＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合するものはリポタンパク質の構造に結合したままであって、後のコレステロール含量の測定において実質的に反応しない。
【００１４】
コレステロール及びコレステロールエステル類は、主としてリポタンパク質粒子中で血液を運搬されることが知られている。酵素及び界面活性剤が、そのようなコレステロールをデヒドロゲナーゼによって酸化されるのに利用可能とする正確なメカニズムに関しては、議論がある。従って、本明細書の全範囲で、「分解する」又は「利用可能にした」又は「反応性を与える」等の用語はすべて、処理過程によって、分析に関する応答が任意の試料中のコレステロール（類）から得られるものである当該処理過程に関するものであることが理解される。しかしながら我々は、作用様式に関して、あらゆる特定の理論にも縛られることを望んでいない。
【００１５】
本発明で用いられる界面活性剤は、試料中の高密度リポタンパク質を選択的に分解するものである。これは、当該界面活性剤は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭと比較して、ＨＤＬと選択的に反応することを意味する。代替的には、当該界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいて、ＨＤＬコレステロールが反応すること（典型的には、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応すること）を選択的に可能にするものとして定義できる。本発明の文脈では、ＨＤＬを選択的に分解する界面活性剤、又はコレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応することを選択的に可能にする界面活性剤は、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００１６】
ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、式（ｉ）:
【００１７】
【数１】
【００１８】
（式中、ＧｘはＸに対する測定された応答のグラジエント（例、Ｘの既知の濃度に対する、測定された電流）である）に従って決定できる。測定される応答は、リポタンパク質濃度に関係する（又は対応する）（例えば、リポタンパク質濃度に比例する）任意の測定値であり得る。
【００１９】
従って、当業者は、選択した界面活性剤を用いて、ＨＤＬコレステロール含量が既知の試料のＨＤＬコレステロール含量を測定し、そして対応して同じ手順を用いて、ＬＤＬコレステロール含量が既知の試料のＬＤＬコレステロール含量を測定することによって、任意の所与の界面活性剤がＨＤＬを選択的に分解するものかどうかを、容易に決定できる。その結果からディファレンシエーションの値が計算できる。ＨＤＬコレステロール含量又はＬＤＬコレステロール含量を測定するための手順は、典型的には、選択した界面活性剤を用いる、下記の実施例１に記載したものである。
【００２０】
本発明において、ＨＤＬ濃度は典型的には、コレステロールのコレステノンへの電気化学的変換に際して、電極で生じる電流を決定することによって電気化学的に測定される。当該電流は、ＨＤＬコレステロール含量の測定値に関係するので、典型的には、測定電流値を、グラジエントを決定するために用いる。
【００２１】
ディファレンシエーションは、ＨＤＬコレステロール試験の間に用いる経過時間と同じの、試料への試薬の添加とコレステロール含量の測定との間の経過時間を用いて測定しなくてはならない。そのような経過時間は、典型的には、３分以下、好ましくは１２０秒以下、９０秒以下又は６０秒以下のオーダーである。本発明の文脈では、選択的な界面活性剤は、実施例１において記載した手順、及び、試料への試薬の添加と測定との間に６２秒の経過時間を用いてコレステロール含量を測定した場合、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明の選択的界面活性剤は、実質的にＬＤＬを分解しない。従って、本発明のコレステロール試験において、界面活性剤は、好ましくはＬＤＬの反応を弱める。本発明の選択的界面活性剤の正確な作用メカニズムは完全には理解されておらず、また、我々は、あらゆる特定の提案されるメカニズムに縛られることを望まない。
【００２３】
ＨＤＬ若しくはＬＤＬのいずれかに存在する遊離コレステロール又はコレステロールエステル類に起因するコレステロール応答は、速度論的に分離し、ＨＤＬ応答はＬＤＬ応答に先行し、ＨＤＬに対するディファレンシエーションを生じさせると考えられている。
【００２４】
当該応答の速度論的分離は、多くの理由に起因し得る：界面活性剤のＨＤＬに対する選択的な作用若しくはＬＤＬ応答を弱める選択的な作用、又は両メカニズムが一緒に機能してもよい。
【００２５】
ＨＤＬとＬＤＬとが異なる膜タンパク質を有することは公知である。ＨＤＬはＡｐｏＡ１を含有し、ＬＤＬはＡｐｏＢを含有する。当該界面活性剤は、これらのタンパク質の可溶化及びリポタンパク質粒子の崩壊に、選択的に作用し得る。当該界面活性剤が、種々のタイプのリポタンパク質粒子に選択的に取り込まれることができ、この能力がそれらの疎水性−脂溶性のバランス（ＨＬＢ）に関連していることも公知である。リポタンパク質粒子への界面活性剤の取り込みは、該リポタンパク質粒子のサイズの増大を惹起してその反応性に影響を及ぼし得る。
【００２６】
ＬＤＬ粒子の核は、概ね室温の転移温度以下で結晶的な挙動をすることも公知である。言い換えれば、ＬＤＬ粒子核中のトリグリセリド及びコレステロールエステルは秩序だって配置されており、ＬＤＬ粒子は結晶性を示すということができる。このことで、ＬＤＬ粒子核中のコレステロールの反応性に影響すると期待される。当該界面活性剤がＬＤＬ粒子核の秩序を崩壊させないこと、即ち、核中のコレステロールエステルが、リパーゼとの反応のために、表面膜の層から出てくるのが難しいということはあり得る。
【００２７】
ＬＤＬ応答の弱まりは、本発明の選択的界面活性剤の特定の構造によって惹起され得る。当該界面活性剤は、親水性部分（糖部分）及び疎水性部分（アルキル鎖）を有し、そしてアルキル鎖はリポタンパク質粒子の膜を貫通するが、一方糖部分は外側で結合したままのことがあり得る。当該界面活性剤が、そのような様式でＬＤＬ粒子中に組み込まれると、糖部分で外膜を覆うこととなり、酵素との距離の接近及び反応を妨げる。当該界面活性剤のＨＤＬ粒子中への組み込みにはこの効果はなく、酵素と容易に反応できる、より小さなミセルへのＨＤＬ粒子の急速な分解がもたらされ得る。
【００２８】
本発明の界面活性剤が、ＬＤＬ粒子への選択的結合を惹起し、それによってＬＤＬ粒子の反応性及びＬＤＬ粒子内に含有されるコレステロールのリパーゼ／デヒドロゲナーゼとの反応を低減又は完全に除去することができるということもあり得る。
【００２９】
界面活性剤の選択的作用は、リパーゼ／デヒドロゲナーゼ酵素をＨＤＬに対して活性化すること及び／又は当該酵素のＬＤＬへの作用を抑制することが可能ですらあり得る。
【００３０】
当業者は、選択した界面活性剤存在下で得られたグラジエントＧＬＤＬ（界面活性剤）（上に規定した通り）を、界面活性剤非存在下で得られたグラジエントＧＬＤＬ（ブランク）に対して比較することによって、当該選択した界面活性剤によりＬＤＬ応答が弱められるかどうかを決定できる。関係
【００３１】
【数２】
【００３２】
は、当該界面活性剤がＬＤＬ反応を弱める場合には、１未満である。典型的には、関係
【００３３】
【数３】
【００３４】
は、０．８未満、好ましくは０．５未満又は０．３未満である。
【００３５】
グラジエントＧＬＤＬは、ＬＤＬ濃度を決定するための任意の手段によって測定できる。典型的には、本発明においては、既知の濃度に対する電流のグラジエントを用いる。実施例１又は１２に示す通りの、グラジエントを決定するための方法を用いてもよい。
【００３６】
本発明の界面活性剤として使用するためのスクロースエステル類の例としては、１以上のＨＯ−基が独立してＲＣＯＯ−基（式中、Ｒは典型的には、最大１８個の炭素原子を有する、直鎖状、分枝状又は環状であり得るアルキル又はアルケニル基である）と置換される、スクロース部分が挙げられる。スクロースエステル類の例としては、式（Ｉ）:
【００３７】
【化１】
【００３８】
（Ｒは典型的には、最大１８個の炭素原子を有する、直鎖状、分枝状又は環状であり得るアルキル又はアルケニル基である）の化合物が挙げられる。典型的には、Ｒは少なくとも５個、例えば少なくとも７個の炭素原子を有する直鎖状アルキル基である。１つの実施形態においては、Ｒは、最大１５個、例えば最大１３個の炭素原子を有する。
【００３９】
スクロースエステル類の更なる例は、エステル部分が、スクロース部分における異なる位置に現れる式（Ｉ）の化合物の修飾物である。更なる例としては、ジ又はポリエステル類が挙げられる。ジ又はポリエステル類の場合は、２以上のＲ基は同じであっても異なっていてもよいが、典型的には同じである。２以上のスクロースエステル類の混合物を用いてもよい。
【００４０】
本発明の界面活性剤として用いるためのマルトシド類の例としては、式（ＩＩ）:
【００４１】
【化２】
【００４２】
（式中、Ｒは、例えば最大１８個の炭素原子を有する、アルキレン又はアルケニレン基であり、且つＡは、メチル基又は４〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基である）のマルトシド類が挙げられる。Ｒは直鎖状又は分枝状であり得る。例えば、Ｒは（ＣＨ２）ｙ（式中、ｙは１〜９である）であり得る。
【００４３】
１つの実施形態においては、Ａは、炭素原子４〜７個を有するシクロアルキル基であり、好ましくはシクロヘキシルである。そのような化合物の例としては、シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−１、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルエチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−２、シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルプロピル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−３、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルブチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−４、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルペンチルｌ−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−５、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルへキシル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−６、アナトレースから入手可能）及びシクロヘキシルヘプチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−７、アナトレースから入手可能）等のシクロヘキシルアルキルマルトシド類が挙げられる。
【００４４】
代替の実施形態においては、Ａはメチルであり、且つＲは、少なくとも５個（例、少なくとも７個）の炭素原子を有し、且つ最大１５個（例、最大１３個）の炭素原子を有するアルキレン又はアルケニレン基である。そのような化合物の例としては、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドが挙げられる。
【００４５】
上式ＩＩは、β−マルトシド類を示す。しかしながら、α−マルトシド類もまた、本発明における界面活性剤として用いられ得る。従って、界面活性剤の更なる例としては、上に列挙したマルトシド類のα相当物が挙げられる。
【００４６】
本発明で用いるための好ましい界面活性剤としては、スクロースモノカプレート、スクロースモノデカノエート、Ｃｙｍａｌ−１、Ｃｙｍａｌ−２、Ｃｙｍａｌ−３、Ｃｙｍａｌ−４、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６、Ｃｙｍａｌ−７、ｎ−ウンデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、特に、スクロースモノカプレート、スクロースモノデカノエート、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５が挙げられる。
【００４７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましい界面活性剤としては、スクロースモノカプレート（シグマ アルドリッチ株式会社）、Ｃｙｍａｌ−１、Ｃｙｍａｌ−２、Ｃｙｍａｌ−３、Ｃｙｍａｌ−４、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６及びＣｙｍａｌ−７が挙げられる。他の実施形態においては、好ましい界面活性剤としては、スクロースモノカプレート（シグマ アルドリッチ株式会社）、Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５が挙げられる。
【００４８】
界面活性剤は個々に用いてもよく、又は２以上の異なる界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。用いる界面活性剤の総量は、典型的には、試験される試料１ｍｌあたり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００４９】
所望により、試料を、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と錯体を形成する錯化剤と更に反応させてもよい。錯化剤の例としては、ポリアニオン類、ポリアニオン類と二価金属塩との組み合わせ、及びａｐｏＢ含有リポタンパク質に結合できる抗体が挙げられる。ポリアニオン類はホスホタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩から選ぶことができる。一度錯化した形態になると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質は反応に利用できなくなり、従ってコレステロール測定を妨げない。しかしながら、本発明においては特異的な界面活性剤を使用するため、錯化剤は必要でない。従って、試料を錯化剤と反応させないことが好ましい。
【００５０】
所望により、試料をイオン性塩と更に接触させてもよい。イオン性塩の添加でＨＤＬへの応答速度が速くなることが分かった。好適なイオン性塩としては、アルカリ金属（例、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）及び遷移金属（例、Ｃｒ３＋）塩が挙げられる。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及びＣｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３が適切な例である。一般的には、反応に悪影響（用いる測定条件下で酸化又は還元される等）を及ぼさない限り、任意のイオン性塩を用いてよい。
【００５１】
試料のＨＤＬ−コレステロール含量の測定を、コレステロールを測定するための任意の好適な技法によって行うことができる。好ましい技法は、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させることを伴う。１つの実施形態においては、コレステロールデヒドロゲナーゼが用いられる。従って本発明は、試料を界面活性剤及びコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させる方法を包含する。
【００５２】
ＨＤＬリポタンパク質中に含有されるコレステロールは、遊離コレステロール又はコレステロールエステル類の形態であり得る。従って、任意のコレステロールエステル類を遊離コレステロールに分解するためにコレステロールエステル加水分解試薬が典型的に用いられる。次いで、遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させ、そのような反応を受けたコレステロールの量を測定する。
【００５３】
コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステル類をコレステロールに加水分解できる、任意の試薬であり得る。試薬は、コレステロールのコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応、及びアッセイにおけるその後の任意の段階を妨げないものでなくてはならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は酵素であり、例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。リパーゼはとりわけ好ましい。好適なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）又はクロモバクテリウム・ビスコサム（chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。任意に安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有する市販の酵素（例、東洋紡又はアマノから入手可能なもの）を用いてもよい。コレステロールエステル加水分解試薬は、試料１ｍｌあたり０．１〜２５ｍｇ、例えば試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは、１ｍｌあたり０．５〜２５ｍｇ（１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇ等）の量で用いてもよい。
【００５４】
任意の市販形態の、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えばノカルディア（Nocardia）種由来である。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、試薬混合物１ｍｌあたり０．０１〜１００ｍｇの量で用いてもよい。１つの実施形態においては、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼは、試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜２５ｍｇの量で用いられる。
【００５５】
各酵素は、安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有し得る。更に、各酵素は、化学的に修飾されていてもよい。
【００５６】
界面活性剤は、試料に対して、他の試薬を加える前に加えてもよく、又は他の試薬を加えるのと同時に加えてもよい。好ましい実施形態においては、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ及び界面活性剤は、単一の段階で試料と混合される単一の試薬混合物中に存在する。特に好ましい実施形態においては、当該方法は、試料を試薬と接触させる単一の段階を伴い、その結果、単一の試薬混合物のみ提供される必要がある。
【００５７】
本発明による測定は、ＨＤＬ−コレステロールを含有する任意の好適な試料で実施できる。測定は、典型的には、全血又は血液成分（例えば血清又は血漿）で実施される。本発明の方法において使用する好ましい試料は、血清及び血漿である。測定を全血で実施する場合は、当該方法は、赤血球を除去するために血液を濾過する、更なる段階を含み得る。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール含量を測定するために、電気化学的技法を用いる。これは、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量を、電極で発生する電気化学的応答を測定することによって決定することを意味する。この実施形態においては、典型的には、試料を界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと相互作用できる補酵素、及び酸化又は還元されて電極で電気化学的に検出できる生成物を形成することができる酸化還元剤と反応させる。試料と試薬との混合物は、生じる酸化還元反応が検出できるように、電気化学セルの作用電極と接触させる。セルに電位を印加し、結果生じる電気化学的応答、典型的には電流を測定する。
【００５９】
この好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール量は、以下のアッセイ：
【００６０】
【化３】
【００６１】
（ここで、ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）に従って測定する。このアッセイにおいて、所望により、コレステロールデヒドロゲナーゼは、コレステロールオキシダーゼに置き換えることができる。当該アッセイによって生成した、還元された酸化還元試薬量を電気化学的に検出する。しかるべき場合には、更なる試薬もまた、このアッセイに含めてもよい。
【００６２】
典型的には、試料は、単一の段階で全ての試薬と接触する。従って、全ての必要な試薬を含有し、且つアッセイを実施するために容易に試料と接触できる試薬混合物を提供する。本発明の試薬混合物は、典型的には、界面活性剤を試料１ｍｌ当たり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ、例えば約５０ｍｇの量で含み、コレステロールエステル加水分解試薬を試料１ｍｌ当たり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇの量で含み、且つコレステロールデヒドロゲナーゼを、試料１ｍｌ当たり０．１〜３０ｍｇ、好ましくは０．５〜２５ｍｇの量で含む。
【００６３】
典型的には、補酵素はＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通する構造的特徴を有し、且つコレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても働く化合物である。ＮＡＤ＋のアナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオＮＡＤ）；ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は、典型的には、１〜２０ｍＭ、例えば３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭの量で、試薬混合物中に存在する。
【００６４】
典型的には、酸化還元剤は、上に示したアッセイに従って還元できるものでなくてはならない。この場合、酸化還元剤は補酵素から（又は後述のようなレダクターゼから）電子を受容でき、且つ電子を電極に伝達できるものでなくてはならない。酸化還元剤は分子又はイオン錯体であってもよい。酸化還元剤は、タンパク質等の天然に存在する電子受容体であってもよく、又は合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有するであろう。
【００６５】
好ましくは、酸化還元剤は無機錯体である。当該剤は金属イオンを含んでもよく、少なくとも２価を有することが好ましいであろう。特に、当該剤は、遷移金属イオンを含んでもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は帯電していてもよく、例えば、カチオン性又は代替的にはアニオン性であってもよい。好適なカチオン性の剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋等のルテニウム錯体であり、好適なアニオン性の剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−等のフェリシアン化錯体である。
【００６６】
用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）及び（エチレンジアミン等の）それらのキレートアミンリガンド誘導体類、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及び−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及びＣＯ２Ｈ等の、１以上の基が２つのシクロペンタジエニル環の一方又は両方へと置換されたその誘導体類が挙げられる。無機錯体は、好ましくはＦｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００６７】
酸化還元剤は、典型的には、１０〜２００ｍＭ、例えば２０〜１５０ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ又は最大８０ｍＭの量で試薬混合物中に存在する。
【００６８】
好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイにおいて用いられる試薬混合物は、レダクターゼを更に含む。レダクターゼは、典型的には、還元型ＮＡＤから２個の電子を伝達され、酸化還元剤へ２個の電子を伝達する。従って、レダクターゼの使用により、素早い電子の伝達がもたらされる。
【００６９】
用いることができるレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ並びにチトクロームＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のチトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェレドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸還元酵素、チトクロームｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシンレダクターゼ及び酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明で用いるための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００７０】
レダクターゼは組み換えタンパク質、又は精製若しくは単離した天然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、電子の伝達を行う速度又は基質特異性を最適化する等、その性能を向上するために変異されていてもよい。
【００７１】
レダクターゼは、典型的には、０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は２〜２０ｍｇ／ｍｌの量で試薬混合物中に存在する。
【００７２】
任意で試薬は乾燥でき、より好ましくは、試薬は凍結乾燥できる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイの大まかなスキームは、以下：
【００７４】
【化４】
【００７５】
（式中、
ＰｄＲはプチダレドキシンレダクターゼであり、
Ｄｉａはジアホラーゼであり、
ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）
の通りである。
【００７６】
試薬混合物は、任意に、１以上の更なる成分、例えば、賦形剤及び／又は緩衝液及び／又は安定化剤を含有する。混合物を安定化するため、並びに任意で、試薬混合物を本発明の装置上で乾燥する場合に、当該乾燥混合物に多孔性を提供するために、当該試薬混合物に賦形剤を含めることが好ましい。好適な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトース等の糖類、並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンもまた、賦形剤として用いることができる。至適酵素活性のために必要なｐＨを提供するために、緩衝液も含めてもよい。例えば、トリス緩衝液（ｐＨ９）を用いてもよい。例えば酵素の安定性を高めるために、安定化剤を加えてもよい。好適な安定化剤の例は、アミノ酸（例、グリシン及びエクトイン）である。
【００７７】
好ましい実施形態においては、本発明の電気化学的アッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解し、その上ＬＤＬでは弱まった作用を示す界面活性剤；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元剤を含む。より好ましい実施形態においては、試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋又はそのアナログ、ジアホラーゼ又はプチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含む。
【００７８】
本発明の試薬混合物は、典型的には、固形形態、例えば、乾燥形態、又はゲルとして提供される。代替的には、溶液又は懸濁液の形態であり得る。反応混合物中に存在する各成分量は、上にモル濃度又はｗ／ｖで表しているが、当業者には、存在する各成分の相対量が同じであるまま、これらの量を乾燥混合物又はゲルに好適な単位に適合させることができるであろう。
【００７９】
電気化学的測定が全血で実施される場合、得られる測定結果はヘマトクリット値に依存し得る。従って、測定結果は理想的には、少なくとも部分的に、この要因を説明するために調整するべきである。代替的には、アッセイを実施する前に、試料を濾過することによって赤血球を除去できる。
【００８０】
本発明はまた、ＨＤＬを含有する試料のＨＤＬコレステロール含量を選択的に決定するためのキットを提供する。当該キットには、必要な試薬（例、界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段）が含まれる。
【００８１】
好ましい実施形態においては、当該キットは、ＨＤＬ−コレステロール含量を電気化学的に決定するための装置を含む。この実施形態においては、反応したコレステロール量を決定するための手段は、作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；セルに電位を印加するための電源；及び結果生じる電気化学的応答、典型的にはセルを横断する電流、を測定するための測定機器を含む。
【００８２】
電気化学的な決定のための装置は、典型的には、上記した通りの試薬混合物を含む。当該試薬は個々に、又は１以上の試薬混合物の形態でキット中に存在し得る。単一の試薬混合物が好ましい。試薬混合物は装置中に、液体又は固体のいずれの形態でも存在し得るが、固体形態が好ましい。
【００８３】
典型的には、試薬混合物は、好適な液体（例、水又は緩衝液）中に懸濁／溶解させて装置中に挿入するか又は装置上に置き、次いで所定の位置で乾燥させる。装置中／上で物質を乾燥させるこの段階は、当該物質を望ましい場所に保持するのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）によって実施され得るが、凍結乾燥が好ましい。試薬混合物は、典型的には、試料が試薬混合物と接触したとき、電極との接触も起きるように、電極の付近に配置される。
【００８４】
当該装置には、任意に、試験する試料が、試薬混合物と接触する前に通過する膜が含まれ得る。当該膜は、例えば、赤血球（red blood cell）、赤血球（erythrocyte）及び／又はリンパ球等の成分を濾過で除去するために用いられ得る。血液濾過膜を含む好適な濾過膜は、当該技術において公知である。Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２， Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ， Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘが血液濾過膜の例である。繊維ガラスフィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は全血から血漿を分離でき、また全血検査試料が装置に供給され、且つ試験される試料が血漿である場合に好適に用いられる。
【００８５】
使用前に親水的又は疎水的処理を経てきたものを含む、代替的又は付加的な膜も用いてもよい。所望により、膜表面の他の特徴もまた、改変してもよい。例えば、所望の試料の膜を通る流れを促進するために、水中における膜の接触角を修正するための処理を用いてもよい。当該膜は１又は２以上の材料層を含んでもよく、各々は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、異なる膜材料の２層を有する従来の二重層膜を用い得る。
【００８６】
本発明において用いるための適切な装置には、ＷＯ ２００３／０５６３１９及びＷＯ ２００６／０００８２８に記載のものが含まれる。
【００８７】
本発明の１つの実施形態による装置を、図１８に記載する。この実施形態においては、作用電極５はミクロ電極である。本発明の目的のために、ミクロ電極は、５０μｍを超えない少なくとも１つの作業寸法を有する電極である。
【００８８】
セルは、底部１及び壁（単数又は複数）２を有するレセプタクル又は容器の形態である。典型的には、レセプタクルは、２５〜１０００μｍの深さ（即ち、上部から底部まで）を有するであろう。１つの実施形態においては、レセプタクルの深さは、５０〜５００μｍ、例えば、１００〜２５０μｍである。代替的な実施形態においては、レセプタクルの深さは５０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。レセプタクルの長さ及び幅（即ち、壁から壁まで）、又はレセプタクルが円筒状の場合はその直径は、典型的には、０．１〜５ｍｍ、例えば０．５〜１．５ｍｍ（１ｍｍ等）である。
【００８９】
レセプタクル３の開口端は、部分的に、不透過性材料で覆われてもよく、又は半透性若しくは透過性の膜等の、半透性若しくは透過性の材料で覆われてもよい。レセプタクルの開口端は、実質的に、半透性又は透過性の膜４で覆われるのが好ましい。膜４は、とりわけ、埃又は他の混入物質がレセプタクルに入ることを防ぐのに役立つ。
【００９０】
作用電極５は、レセプタクルの壁に位置する。作用電極は、例えば、レセプタクルの壁周囲の連続した帯の形態である。作用電極の厚みは、典型的には０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍであり、例えば０．１〜２０μｍである。より厚みのある作用電極、例えば、０．１〜５０μｍ、好ましくは５〜２０μｍの厚みを有する電極も想定している。作用電極の厚みは、レセプタクルをその底部に置く場合は、その垂直方向の寸法である。作用電極の厚みは、その有効作業寸法、即ち、試験する試料と接触する、電極の寸法である。作用電極は、例えば、導電性インクの形態の、炭素、パラジウム、金又は白金で形成するのが好ましい。当該導電性インクは、例えば、白金及び／又はグラファイト及び／又は白金炭素といった更なる材料を含有する改良インクであり得る。作用電極を形成するために２以上の層を用いてもよく、当該層は、同じか、又は異なった材料で形成される。
【００９１】
セルはまた、例えば、レセプタクルの底部、レセプタクルの壁（単数又は複数）中、又はレセプタクルの周囲又は付近の装置の領域中に存在し得る擬似参照電極（示さず）を含有する。擬似参照電極は、典型的には、Ａｇ／ＡｇＣｌから作られるが、他の材料も用いてもよい。擬似参照電極として用いるための好適な材料は、当業者に公知である。この実施形態においては、セルは、擬似参照電極が対向電極及び参照電極の両方として働く２電極システムである。セルが参照電極及び別個の対向電極を含む、代替の実施形態も想定できる。
【００９２】
擬似参照（又は参照）電極は、典型的には、作用電極５と同様のサイズの、又はそれより小さい、若しくは大きい（例えば相当大きい）表面積を有する。典型的には、擬似参照（又は参照）電極の表面積の、作用電極の表面積に対する比率は、少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１、又は少なくとも３：１である。好ましい比率は少なくとも４：１である。擬似参照（又は参照）電極は、例えば、マクロ電極であってもよい。好ましい擬似参照（又は参照）電極は、０．０１ｍｍ又はそれを上回る、例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法を有する。これは例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、直径であり得る。擬似参照（又は参照）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．１ｍｍ２〜６０ｍｍ２であり、例えば１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と擬似参照（又は参照）電極との間の最短距離は、例えば、５０〜１０００μｍである。
【００９３】
セルが機能できるためには、電極は各絶縁材料６によって分離されなければならない。絶縁材料は、典型的には、例えば、アクリレート、ポリウレタン、ＰＥＴ，ポリオレフィン、ポリエステルといったポリマー又は他の任意の安定な絶縁材料である。ポリカーボネート並びに他のプラスチック及びセラミックも、好適な絶縁材料である。絶縁層はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって形成することができる。塗布後硬化する液体、例えばワニスも、用いてもよい。代替的には、例えば、熱若しくはＵＶへの曝露によって、又は２成分の架橋可能なシステムの活性部分と混合することによって架橋される、架橋可能なポリマー溶液を用いてもよい。しかるべき場合には、絶縁層を形成するために、誘電性インクも用いてもよい。代替の実施形態においては、絶縁層は装置にラミネートされる（例えば熱で、ラミネートされる）。
【００９４】
電気化学セルの電極は、好適な任意の手段によって、必要な任意の測定機器に接続してよい。典型的には、電極は、導電性のトラック（track）に接続され、該導電性のトラックは、必要な測定機器にそれ自身接続されるか、又は接続され得る。
【００９５】
図１８中の７に示す通り、必要な試薬は、典型的にはレセプタクル内に含有させる。典型的には、単一の試薬混合物の形態の試薬は、液体の形態でレセプタクル内に挿入された後、組成物を固定するのに役立つよう乾燥させる。試薬混合物は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥、又はオーブン乾燥（加熱）されてもよく、最も好ましくは、凍結乾燥される。
【００９６】
本発明の装置は、試料を装置に提供し、且つ試料の試薬混合物への接触を可能にすることによって機能させる。血漿又は血液を溶解し、且つ混合物中の試薬と反応させるために十分な時間が割り当てられなければならないのは明らかである。血漿を凍結乾燥したセンサと共に用いる場合は、センサへの試料のアプライと、セルの印加電位の印加との間に概ね２０秒間が経過する。全血を用いる場合、血液細胞の除去を可能にするために、この遅延時間はより長くてもよく、例えば最大で５分間である。特定の試験においては、血漿を試薬と、電極から離して混合し、そしてセルに添加して即座に電位を印加する。典型的には、電位が印加され、測定結果を１０秒間、典型的には１〜４秒以内に読み取る。
【００９７】
この短い範囲内の時間を用いることで、ＨＤＬに結合したコレステロールのみを測定で検出することを確実にするのに役立つ。用いた界面活性剤がわずかにＬＤＬと反応する場合、そのような反応は無視され、測定がそのような短時間内でなされる場合には実質的に結果に影響しない。
【００９８】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極で検出すべき生成物の場合、セルに印加する電位は０．１Ｖ〜０．３Ｖである。０．１５Ｖが好ましい印加電位である。（本明細書中で述べる電圧はすべて、０．１Ｍ塩化物ありでの、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する値である。）好ましい実施形態においては、電位は最初の段階で、約１秒間、０．１５Ｖの正の印加電位にし、次の段階で、還元電流の測定を望む場合、負の印加電位を印加する。ＷＯ ０３／０９７８６０（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の通り、二重の電位段階を用いることで、電極汚染及び電極領域におけるばらつきを最小にする修正が可能になる。異なる酸化還元剤を用いる場合、酸化／還元ピークが発生する電位によって、印加電位を変えることができる。
【００９９】
従って、本発明の電気化学的試験で、ＨＤＬコレステロールの測定を、試料を装置にアプライしてから非常に短時間で、典型的には約５分以内で、好ましくは３分以内で、２分以内で、又は１分以内にでさえ、行うことが可能になる。状況によっては、試料を装置にアプライしてからわずか１５秒又は３０秒で結果を得ることができるかもしれない。
【実施例】
【０１００】
実施例
実施例１
緩衝溶液の調製（トリス緩衝液−５％グリシン ｐＨ９．０）
結晶化トリス及びトリスＨＣｌを含有するＴｒｉｚｍａ Ｐｒｅ−Ｓｅｔ Ｃｒｙｓｔａｌｓ（ｐＨ９．０、シグマ、Ｔ−１４４４）を９５０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶かし、ｐＨを記録した。続いて、グリシン（シグマ、Ｇ−７４０３）５０ｇを該トリス溶液に加え、ｐＨを記録した。次いで、１０Ｍの水酸化カリウム（シグマ、ｐ−５９５８）を用いてｐＨを８．８〜９．２内に調整し、ｄＨ２Ｏを用いて該溶液を１０００ｍｌとし、最終ｐＨを記録した（ｐＨ９．１）。該溶液は使用期限を１ヶ月とし、４℃にて保存した。
【０１０１】
界面活性剤溶液の調製
事前調製した緩衝液にスクロースモノカプレート（シグマ）を加え、１０％スクロースモノカプレート緩衝液とすることにより、界面活性剤溶液を調製した。
【０１０２】
ＬＤＬ試料及びＨＤＬ試料の調製
ＬＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３２−８）試料及びＨＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３３−８）試料は、脱脂血清（dilipidated serum）（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）を用いて、必要濃度の１０倍のものを作製した（最終テスト混合物中で１：１０希釈するため）。次いで、該試料を、スペースクリニカルアナライザー（Space clinical analyser）（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。ＬＤＬ及びＨＤＬのおおよその濃度は１０ｍＭであり、最終テスト混合物中で１ｍＭとした。
【０１０３】
酵素混合物の調製
事前調製した緩衝液に、以下を加えることにより、酵素混合物を調製した：
１６０ｍＭヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（アルファ・エイサー、１０５１１）
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（Ｓｏｒａｃｈｉｍ／東洋紡、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１０４】
テストプロトコル
該界面活性剤溶液９μｌを該酵素混合物９μｌと混合した。Ｔ＝−３０秒にて、試料２μｌ（１０倍濃度ＬＤＬ若しくは１０倍濃度ＨＤＬのいずれか、又は脱脂血清２μｌ）と、生成した界面活性剤：酵素混合物とを混合し、この結果生じた溶液の９μｌを、電極上に置いた。Ｔ＝０秒にて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。０．１５Ｖの酸化電位を印加し、続いて−０．４５Ｖの還元電位を印加した。酸化電位を印加している間、５つのタイムポイント（Ｔ＝０、３２、６４、９０及び１１８秒）にて電流を測定した。各試料とも、重複してテストを行った。
【０１０５】
結果
ＨＤＬ及びＬＤＬのテスト結果を、コントロールとしての脱脂試料と共に、図１に示す。図１から、とりわけ短い期間において、スクロースモノカプレートがＬＤＬよりもＨＤＬに対して選択的であることが明らかである。
【０１０６】
ディファレンシエーションの値を決定するために、測定したＨＤＬ電流を既知のＨＤＬ濃度に対してプロットし、各タイムポイントでのグラジエントを測定した。同様に、ＬＤＬの各測定結果に対するグラジエントを計算した。ディファレンシエーションの値の結果を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ここで、ＧＬＤＬ（Ａ）は、ＬＤＬコレステロール濃度Ａにおける、既知のＬＤＬコレステロール濃度に対するＩＬＤＬのグラジエントであり；ＧＨＤＬ（Ａ）は、ＨＤＬコレステロール濃度Ａにおける、既知のＨＤＬコレステロール濃度に対するＩＨＤＬのグラジエントである。
【０１０９】
従って、スクロースモノカプレートは、ＬＤＬよりもＨＤＬに対して選択性を示す。
【０１１０】
実施例２から８
緩衝溶液の調製
緩衝溶液は０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭメディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０１１１】
酵素及びＣｙｍａｌを、以下の最終濃度になるように上記緩衝液に加えた：
８．８５ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ
３．３５ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー
５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ界面活性剤
【０１１２】
用いたＣｙｍａｌは：
実施例２： Ｃｙｍａｌ１＝２−シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例３： Ｃｙｍａｌ２＝２−シクロヘキシルエチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例４： Ｃｙｍａｌ３＝シクロヘキシルプロピル−β−Ｄ−マルトシド
実施例５： Ｃｙｍａｌ４＝シクロヘキシルブチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例６： Ｃｙｍａｌ５＝シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例７： Ｃｙｍａｌ６＝シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド
実施例８： Ｃｙｍａｌ７＝シクロヘキシルヘプチル−β−Ｄ−マルトシド
【０１１３】
分注及び凍結乾燥
ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、各溶液０．４μｌ／ウェルをセンサ上へ分注した。次いで、分注したセンサシートを、凍結乾燥させた。
【０１１４】
試料
テストは、事前に凍結させた血漿試料を用いて行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。脱脂血清も試料として用いた。次いで、これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、クリニカルアナライザーを用いて解析した。
【０１１５】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１５μｌの血漿試料を加えて、ポテンショスタットに連結されたマルチプレクサを用いてクロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間に遅延時間はなかった。各血漿試料を重複してテストした。
【０１１６】
解析
電流トランジェントでの４秒間の値について、結果を解析した。各タイムポイントにおけるグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１１７】
結果を以下の通り、図３から９に示す。
【０１１８】
図３：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−１を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１１９】
図４：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−２を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２０】
図５：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−３を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２１】
図６：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−４を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２２】
図７：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−５を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２３】
図８：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−６を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２４】
図９：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−７を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２５】
Ｃｙｍａｌ界面活性剤を含有する酵素混合物のＨＤＬ及びＬＤＬへの応答を比較することにより、Ｃｙｍａｌ界面活性剤のいくつかは、ＨＤＬに対するディファレンシエーションの増加を示し、Ｃｙｍａｌ４及び５が最も顕著であったことが示される。
【０１２６】
実施例９
本実験の目的は、アルファ型若しくはベータ型のいずれかのｎ−ウンデシルＤ−マルトシド又は、不飽和アルキル鎖を有するアルキルマルトシドであるω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１２７】
緩衝溶液の調製
緩衝液は０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭメディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０１２８】
界面活性剤溶液
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液にマルトシドを加えて、以下の最終濃度にすることにより、２倍強度マルトシド溶液を作製した：
ｎ−ウンデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｕ３００ＨＡ）
２００ｍＭ（１８０μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７９ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（シグマ−アルドリッチ、９４２０６）
２００ｍＭ（１８０ｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７９）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｕ３１０）
２００ｍＭ（１７１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１６９ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１２９】
酵素混合物
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えて以下の最終濃度にすることにより、２倍強度で酵素混合物を作製した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー
この溶液をＣｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて混合した。
【０１３０】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びマルトシド溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。更に、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合することにより、ブランク混合物を調製した。ＷＯ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用い、０．４μｌ／ウェルの各溶液をセンサへ分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥させた。
【０１３１】
試料
テストは、事前に凍結させた血漿試料を用いて行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４００ｒｐｍで遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１３２】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１２〜１５ｕｌの血漿試料を加えて、クロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間に遅延時間はなかった。各血漿試料は重複してテストした。
【０１３３】
解析
電流トランジェントでの４秒間の値についてアウトプットを解析した。各タイムポイントにおける、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定値の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１３４】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを、以下の表に示す：
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
これらのマルトシドの任意のものを使用することにより、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。アルファ型とベータ型の両方のアルキルマルトシドが、ＨＤＬセンサにおいて、有効に差異を与える（differentiating）剤となり得ると結論づけられる。不飽和アルキル鎖を有するアルキルマルトシドがＨＤＬセンサにおいて有効に差異を与える剤となり得ることも、また結論づけられる。
【０１３７】
実施例１０
本実験の目的は、直鎖又は分岐アルキル鎖のいずれかを持つアルキル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１３８】
実施例９の方法を繰り返したが、２倍強度のマルトシド溶液としては以下を用いた：
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｏ３１０）
２００ｍＭ（２００μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８２ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、ＤＨ３２５）
２００ｍＭ（１８９μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７７ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｐ３１０）
２００ｍＭ（１９２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｄ３２２）
２００ｍＭ（１９１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８４ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１３９】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを、以下の表に示す：
【０１４０】
【表３】
【０１４１】
分岐アルキル基を有するアルキル−β−Ｄ−マルトシドが、ＨＤＬセンサにおいて差異を与える剤として作用しうると結論づけられる。
【０１４２】
実施例１１
本実施例の目的は、Ｃｙｍａｌ４又はＣｙｍａｌ−５（シクロヘキシル−ブチル−β−Ｄ−マルトシド、又は、シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド）を含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１４３】
実施例９の方法を繰り返したが、２倍強度のマルトシド溶液としては以下を用いた：
Ｃｙｍａｌ−４ （アナトレース， Ｃ３２４）
５０ｍＭ （２１７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．００５２ｇ）
Ｃｙｍａｌ−５ （アナトレース， Ｃ３２５）
５０ｍＭ （２０８μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．００５１ｇ）
【０１４４】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを以下の表に示す：
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
該ＨＤＬセンサにおいて、Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５の両方が、差異を与える剤として作用し得ると結論づけられる。
【０１４７】
実施例１２
本実施例の目的は、種々のアルキル鎖長を有するｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１４８】
以下の２倍強度マルトシド溶液を用いて、実施例９に従い、ＲｕＡｃａｃ溶液、マルトシド溶液及び酵素溶液を作製した：
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｏ３１０）
２００ｍＭ（２０１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８２ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｔ３２３ＬＡ）
２００ｍＭ（２０４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２１４ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｔ３１５）
２００ｍＭ（２００μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２１５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１４９】
分注及び凍結乾燥
実施例９に記載したように、酵素溶液を分注及び凍結乾燥した。実施例９と同様の方法で試料を調製した。
【０１５０】
テストプロトコル
電極あたり、血漿試料１２〜１５μｌを用いた。１２〜１５μｌの血漿を加えてクロノアンペロメトリーを開始した。酸化電流を０．１５Ｖで、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて測定し、還元電流を−０．４５Ｖで、最後のタイムポイント（４１６秒）にて測定した。各試料を重複してテストした。
【０１５１】
解析
各タイムポイントにおける、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定値の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１５２】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを以下の表に示す：
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドの使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。更に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少した。
【０１５５】
２５ｍＭ及び５０ｍＭにおいては、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシドは、ＨＤＬへの応答のグラジエントは増加させなかったが、ＬＤＬへの応答のグラジエントを減少させたので、ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションを増加させた。
【０１５６】
１００ｍＭでは、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドはＨＤＬとＬＤＬの両方への応答のグラジエントを減少させ、ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションの小さな増加を与えた。
【０１５７】
実施例１３：
本実施例の目的は、リパーゼ又はコレステロールエステラーゼのいずれかを用いて、スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）又はｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド（ＯＭＰ）を含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１５８】
緩衝溶液の調製
緩衝溶液は０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭメディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０１５９】
界面活性剤溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液を用いて、２倍強度の界面活性剤溶液を作製した。
スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（同仁堂、ＳＯ２１−１２）
２００ｍＭ（２１８μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２１７ｇ）
ｎ−オクチル マルトピラノシド（ＯＭＰ）（アナトレース、Ｏ３１０）
１００ｍＭ（２０９μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．００９５ｇ）
【０１６０】
酵素混合物
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えて、以下の最終濃度にすることにより、リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム）又はコレステロールエステラーゼ（ジェンザイム、シュードモナス・エスピー）のいずれかを有する酵素混合物を２倍強度で作製した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）又はコレステロールエステラーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１６１】
この溶液をＣｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて混合した。
【０１６２】
以下のリパーゼを用いて、更なる酵素混合物を４倍強度で作製した：
クロモバクテリウム・ビスコサム由来のリパーゼ（ジェンザイム、７０−１４６１−０１）
１００ｍＭ ＳＭＣ溶液 ８９ｕＬ中、０．００４８ｇ
シュードモナス・エスピー由来のリパーゼ（東洋紡、ＬＰＬ３１１）
ＲｕＡｃａｃ溶液 ９１ｕＬ中、０．００４９ｇ
【０１６３】
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えることにより、これらの酵素混合物を適宜希釈し、以下の最終濃度とした：
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
１３．５ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）又はリパーゼ（東洋紡）
２２．２ｇ／ｍＬ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１６４】
最終酵素混合物
等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及び２倍濃度マルトシド溶液を１：１で混合し、単倍濃度の酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。更に、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合することにより、ブランク混合物を調製した。
４倍濃度の酵素はＲｕＡｃａｃ溶液及び界面活性剤溶液で希釈し、上に示したような最終濃度を得た。
【０１６５】
分注及び凍結乾燥
ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用い、各溶液０．４μｌ／ウェルをセンサに分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥させた。
【０１６６】
試料
テストは、事前に凍結させた血漿試料を用いて行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４００ｒｐｍで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１６７】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１２〜１５ｕＬの血漿試料を加えて、クロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間に遅延時間はなかった。各血漿試料を重複してテストした。
【０１６８】
解析
各タイムポイントでのＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬの測定値及びＨＤＬの測定値から得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１６９】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１７０】
【表６】
【０１７１】
リパーゼ又はコレステロールエステラーゼのいずれかを、界面活性剤ＳＭＣ又はＯＭＰと共に用いることにより、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが増加した。これらの界面活性剤を含有する全ての混合物において、界面活性剤を加えていないセンサと比べて、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少した。
【０１７２】
実施例１４
本実施例の目的は、種々のアルキル鎖長を有するｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１７３】
実施例１２の方法を繰り返したが、２倍強度のマルトシド溶液としては、以下を用いた：
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｄ３１０）
２００ｍＭ（１９４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１９８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｄ３２２）
２００ｍＭ（１９７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１９０ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（シグマ−アルドリッチ、９４２０６）
２００ｍＭ（１７４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７３ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１７４】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１７５】
【表７】
【０１７６】
これらのｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドの使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。更に、これらのｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少した。
【０１７７】
実施例１５
本実験の目的は、スクロースミリステート又はスクロースカプレートを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。これらの界面活性剤は、モノ及びポリ置換スクロースエステルの混合物を含有する。これらの界面活性剤のＮＭＲ解析は、これらがスクロース分子あたり１．１アルキル鎖を含有することを示している。
【０１７８】
実施例１２の方法を繰り返したが、２倍強度マルトシド溶液の代わりに、以下の２倍強度界面活性剤溶液を用いた：
スクロースミリステート（同仁堂、Ｓ３３５）
１０％（２６０μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２６ｇ）
５％（１０％ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
２．５％（１０％ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
スクロースカプレート（同仁堂、Ｓ３３４）
１０％（２４８μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２４８ｇ）
５％（１０％ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
２．５％（１０％ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１７９】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１８０】
【表８】
【０１８１】
スクロースカプレート又はスクロースミリステートの使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。更に、スクロースカプレート又はスクロースミリステートの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少する。
【０１８２】
実施例１６
本実験の目的は、広範な濃度のＳＭＣ又はＵＭＰで調製したセンサのＨＤＬへの応答の依存性を調べることであった。
【０１８３】
実施例１２の方法を繰り返したが、２倍強度マルトシド溶液の代わりに以下の２倍強度界面活性剤溶液を用いた：
スクロースモノカプレート（同仁堂、Ｓ０２１−１２）
６００ｍＭ（２５２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０７５１ｇ）
ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（シグマ−アルドリッチ、９４２０６）
６００ｍＭ（２５１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０７４９ｇ）
【０１８４】
希釈 ６００ｍＭストックの量 ＲｕＡｃａｃ溶液の量
４００ｍＭ ６０μｌ ３０μｌ
２００ｍＭ ３０μｌ ６０μｌ
１００ｍＭ １５μｌ ７５μｌ
５０ｍＭ １０μｌ １１０μｌ
２０ｍＭ ３μｌ ８７μｌ
【０１８５】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１８６】
【表９】
【０１８７】
ＳＭＣの使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。更に、ＳＭＣの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少する。最も大きなＨＤＬの応答のグラジエントのためには、ＳＭＣの最適量は２５〜１００ｍＭである。
【０１８８】
界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、低濃度のＵＭＰにおいてＨＤＬへの応答のグラジエントは増加し、より高濃度のＵＭＰにおいては減少した。更に、ＵＭＰの濃度の全てにおいて、ＵＭＰの使用によって、ＬＤＬへの応答のグラジェントは減少する。ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションは、全体として、全ての濃度において、ＵＭＰの使用によって、有意に増加する。最も大きなＨＤＬの応答のグラジエントのためには、ＵＭＰの最適量は１０〜５０ｍＭである。
【０１８９】
実施例１７
本実験の目的は、５％ｗ／ｖ ＳＭＣ（スクロースモノカプレート）及び種々のイオン性塩を用いて調製したセンサでのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１９０】
緩衝溶液
１０％ β−ラクトース（シグマ、Ｌ３７５０）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＰＨ９．０,３０ｍＭ ＫＯＨを含有する緩衝溶液を調製した。これを、０．１ｇ ＳＭＣを２．０ｍｌ ラクトース緩衝液に溶解することにより、５％ｗ／ｖ ＳＭＣ（同仁堂 ＳＯ２１−１２）溶液にした。０．０６７０ｇ ＲｕＡｃａｃを４．０８３ｍｌのＳＭＣ溶液に溶解することにより、単倍強度のＲｕＡｃａｃ（Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］）溶液を作製した。この溶液を、アコースティックミキサーを用いて、混合した。
【０１９１】
２倍濃度酵素溶液
事前調製した３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えることにより、酵素溶液を２倍濃度で作製した。該酵素溶液は以下を含有していた：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、１４６１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１９２】
この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて、混合した。
【０１９３】
イオン性塩溶液
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液にイオン性塩を加えることにより、イオン性塩溶液を２倍濃度で以下の通りに調製した：
ＬｉＣｌ（アルドリッチ、２１、３２３−３）
１．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液：０．０３７９ｇをＲｕＡｃａｃ溶液５９５μＬに溶解した。
１Ｍ ＬｉＣｌ溶液：１．５ｍＭ ＬｉＣｌ溶液１００μＬをＲｕＡｃａｃ溶液５０μＬと混合した。
０．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液：１．５ｍＭ ＬｉＣｌ溶液５０μＬをＲｕＡｃａｃ溶液１００μＬと混合した。
ＮａＣｌ（シグマ、Ｓ−７６５３）
１Ｍ ＮａＣｌ溶液：０．０１１８グラムをＲｕＡｃａｃ溶液２０１．７μＬに溶解した。
１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液：１Ｍ ＮａＣｌ溶液及びＲｕＡｃａｃ溶液を１：９の量比で混合した。
ＭｇＣｌ２（シグマ、Ｃ−４９０１）
５６０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液：０．０４６１グラムをＲｕＡｃａｃ溶液４０３μＬに溶解した。
ＣａＣｌ２（シグマ、Ｍ２６７０）
５００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：０．０１１１グラムをＲｕＡｃａｃ溶液２００μＬに溶解した。
２５０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：５００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液及びＲｕＡｃａｃ溶液を１：１の量比で混合した。
Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）
１２０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：０．０２５３グラムをＲｕＡｃａｃ溶液８０９μＬに溶解した。
３０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３：１２０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液３７．５μＬをＲｕＡｃａｃ溶液１１２．５μＬと混合した。
【０１９４】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びイオン性塩溶液を１：１で混合し、酵素／イオン性塩の最終混合物を得た。更に、イオン性塩実験の各セットにつき、等量（約５０ｕｌ）ずつの２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用いて、０．４μｌ／ウェルの各溶液を、センサへ分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。
【０１９５】
試料
事前に凍結させた血漿試料を用いて、テストを行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４００ｒｐｍで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１９６】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１２〜１５ｕＬの血漿試料を加えて、クロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間の遅延時間はなかった。各血漿試料を重複してテストした。
【０１９７】
解析
各タイムポイントにおける、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１９８】
結果
酵素混合物中でイオン性塩を使用することで、センサ応答にかかる時間の量が減少し、ＨＤＬへの応答の最大のグラジエントとなることが分かった。センサ型がＨＤＬへの応答の最大のグラジエントを与えたタイムポイントを以下の表に示す：
【０１９９】
【表１０】
【０２００】
時間に対するＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを、ＬｉＣｌを用いて又は用いずに調製したセンサに関して、図１０に示す。
【０２０１】
イオン性塩の添加は、概しては、５％ ＳＭＣを用いて調製したＨＤＬセンサにおいて、より早いＨＤＬへの応答速度をもたらした。
【０２０２】
実施例１８
本実験の目的は、種々のアルキル鎖長を持つスクロースエステルを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０２０３】
緩衝溶液の調製
緩衝溶液は、０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭ メディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０２０４】
スクロースエステル溶液
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液にスクロースエステルを加えて以下の濃度にすることにより、２倍強度のスクロースエステル溶液を作製した：
スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（同仁堂、Ｓ０２１−１２）
２００ｍＭ（２０２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２０１ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−オクタノイルスクロース（ＳＭＯ）（カルビオケム、４９４４６６）
２００ｍＭ（２０１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−ドデカノイルスクロース（ＳＭＤ）（カルビオケム、３２４３７４）
２００ｍＭ（２０２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２０１ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０２０５】
酵素混合物
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えて以下の最終濃度にすることにより、酵素混合物を２倍強度で作製した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来））
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０２０６】
この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて混合し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ−ｓｅｒｉｅｓ ＳｏｎｏＬａｂ−Ｓ１ソフトウェア−プログラムＨＤＬ４℃を用いた。
【０２０７】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びスクロースエステル溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。更に、等量（約５０ｕｌ）ずつの２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用いて、０．４μｌ／ウェルの各溶液をセンサ上へ分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。
【０２０８】
血漿試料
血漿試料を３０分間解凍してから、２９００ＲＣＦで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０２０９】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに用いた。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、酸化電流を＋０．１５Ｖで測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、還元電位を−０．４５Ｖで測定した。各血漿試料を重複してテストした。
【０２１０】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０２１１】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは、以下の表の通りである：
【０２１２】
【表１１】
【０２１３】
スクロースエステルの使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。更に、スクロースエステルの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントは減少した。
【０２１４】
実施例１９
溶液の調製、分注及び凍結乾燥
基本の酵素混合物は同一であるが、異なる酵素混合物を用いて、最終の成分濃度が以下のようになるようにして、いくつかの溶液を調製した：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０
３０ｍＭ ＫＣｌ
１００ｍｇ／ｍｌ ラクトース
界面活性剤（界面活性剤なし（０ｍｇ／ｍｌ）、４０ｍＭ スクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）（２０ｍｇ／ｍｌ）、１００ｍＭ ＳＭＤ（５０ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍＭ スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（３０ｍｇ／ｍｌ）若しくは１００ｍＭ ＳＭＣ（５０ｍｇ／ｍｌ）
３０ｍＭ ルテニウムＡｃＡｃメディエーター（Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］）
６ｍｇ／ｍｌ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３ｍｇ／ｍｌ ジェンザイムリパーゼ（Ｇ．Ｌｉｐ）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ
【０２１５】
ＷＯ ０３５６３１９に記載の通りに、ウェルあたり０．４ｕｌの溶液を、センサ上に分注した。センサを凍結乾燥した。
【０２１６】
テストプロトコル
２０ｕｌの血漿を各電極に添加した。ｔ＝０秒にて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。３４秒の連続した時間間隔で４秒間、３４０秒の期間、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、続いて４秒間、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。酸化の間には３４秒の遅延があり、その結果、約０、３４、６８、１０２、１３６、１７０、２０４、２３８、２７２、３０６及び３４０秒における酸化であった。トランジェントでの４秒における電流値に関して、データを解析した。
【０２１７】
結果を図１１から１４並びに表１２及び１３に示す：
【０２１８】
【表１２】
【０２１９】
【表１３】
【０２２０】
実施例２０：
溶液の調製、分注及び凍結乾燥
基本の酵素混合物は同一であるが、異なる酵素混合物を用いて、最終の成分濃度が以下のようになるようにして、いくつかの溶液を調製した：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０
５０ｍｇ／ｍｌ （５％）グリシン
界面活性剤（０％ ＳＭＣ又は界面活性剤なし（０ｍｇ／ｍｌ）、５％ スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（５０ｍｇ／ｍｌ）、７．５％ ＳＭＣ（７５ｍｇ／ｍｌ）又は１０％（１００ｍｇ／ｍｌ））
８０ｍＭ 塩化ルテニウムヘキサアミン（Hexaamine）
６ｍｇ／ｍｌ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３ｍｇ／ｍｌ ジェンザイムリパーゼ
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ
【０２２１】
ＷＯ ２００３５６３１９に記載の通りに、ウェルあたり０．４ｕｌの溶液をセンサ上に分注した。センサを凍結乾燥した。
【０２２２】
テストプロトコル
脱脂血清中で調製した２０ｕｌのＳｃｉｐａｃ ＨＤＬ又はＬＤＬを各電極に添加した。Ａｕｔｏｌａｂ及びマルチプレクサーを用いて、クロノアンぺロメトリーにより、電極をテストした。ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリーはテストされた。１４秒の連続した時間間隔で１秒間、１４０秒の期間、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、続いて１秒間、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、その結果、約０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒における酸化であった。トランジェントでの１秒における電流値に関して、データを解析した。
【０２２３】
結果を図１５及び１６並びに表１４に示す。
【０２２４】
【表１４】
【０２２５】
実施例２１
溶液の調製、分注及び凍結乾燥
基本の酵素混合物は同一であるが、異なる酵素混合物を用いて、最終の成分濃度が以下のようになるようにして、いくつかの溶液を調製した：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０
５０ｍｇ／ｍｌ （５％）グリシン
界面活性剤（０％ ＳＭＤ又は界面活性剤なし（０ｍｇ／ｍｌ）、０．５％ スクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）（５ｍｇ／ｍｌ）、１．０％ ＳＭＤ（１０ｍｇ／ｍｌ）又は１．５％（１５ｍｇ／ｍｌ））
８０ｍＭ 塩化ルテニウムヘキサアミン（Hexaamine）
６ｍｇ／ｍｌ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３ｍｇ／ｍｌ ジェンザイムリパーゼ
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ
【０２２６】
ＷＯ ２００３５６３１９に記載の通りに、ウェルあたり０．４ｕｌの溶液をセンサ上に分注した。センサを凍結乾燥した。
【０２２７】
テストプロトコル
脱脂血清中で調製した２０ｕｌのＳｃｉｐａｃ ＨＤＬ又はＬＤＬを各電極に添加した。Ａｕｔｏｌａｂ及びマルチプレクサーを用いて、クロノアンペロメトリーにより電極をテストした。ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリーテスト（tested）を開始した。１４秒の連続した時間間隔で１秒間、１４０秒の期間、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、続いて１秒間、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、その結果、約０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒における酸化であった。トランジェントでの１秒における電流値に関して、データを解析した。
【０２２８】
結果を図１７及び１８並びに表１５に示す。
【０２２９】
【表１５】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含有する試料中の、高密度リポタンパク質に結合するコレステロール（ＨＤＬコレステロール）量を決定するための方法に関する。本発明はまた、そのような方法において使用するための組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの疫学的研究で、コレステロール又はａｐｏ ＡＩ含量のいずれかの観点で測定される高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性に対する強く、且つ非依存的な逆相関が証明されてきた。ＨＤＬコレステロールが１０ｍｇ／Ｌ低下するごとにＣＡＤの危険性が２〜３％増加するといわれている。従って、ＨＤＬコレステロール濃度がより高いほど、予防的であると考えられている。従って、ＣＡＤに対する危険性を明らかにする際、及び脂質異常症の治療を行う際のＨＤＬコレステロールの測定が、臨床検査室でますます一般的になってきた。
【０００３】
研究技法から適合された、ＨＤＬコレステロール測定のための初期の検査室的方法では、沈殿試薬を用いる手作業の分離段階の後、それに引き続いてたいていの場合には自動化学分析装置による、コレステロール含量の分析が必要とされた。典型的な分離段階は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びキロミクロン（ＣＭ）のアグリゲートを形成するために沈殿試薬をこれらの成分と反応させることを伴っていた。その後アグリゲートを、例えば遠心分離によって、反応容器から除去して、ＨＤＬ含有試料を分析できる状態にしておいた。沈殿物がＵＶ／Ｖｉｓ又は使用される比色分析技法を妨げないようにするため、沈殿物の分離が不可欠であった。
【０００４】
より最近になって、様々なリポタンパク質画分の分離を事前に必要としない、多くの技法が開発されてきた。これらの方法は、典型的には、単一の段階で、又は少なくとも沈殿を実施する必要なく測定を成し遂げることができるという利点を有する。従って、測定の自動化が可能である。そのようなアプローチのあるものでは、様々なリポタンパク質画分を異なる速度で分解するある種の界面活性剤が用いられる。例えばある界面活性剤は、最初にＨＤＬとより迅速に反応するかもしれず、そしてＬＤＬとの反応はより緩やかに起こるかもしれない。当該界面活性剤を加えた後、所定の時間にコレステロール含量を測定することによって、測定が、ＬＤＬコレステロール含量よりもＨＤＬコレステロール含量により大きく依存することが分かってきた。
【０００５】
しかしながら、このアプローチは、その結果に必要な精度及び信頼性を生じてきておらず、また、当該測定結果は、依然としてある程度の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量への依存性を残していた。従って、血液や血漿等の体液のＨＤＬコレステロール含量の測定のための簡単であるが信頼でき且つ正確な方法を提供する新たなアプローチが必要である。測定はまた、試験試料中の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合したコレステロール含量への依存が低いか、又はそれらと完全に独立していなくてはならない。更に、好ましい方法は、専門的な設備を用いないか、又は実施するために熟練の技術者を必要としないであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤であって、スクロースエステル類及びマルトシド類から選ばれる界面活性剤と接触させること、並びに該高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法を提供する。当該界面活性剤は好ましくは、低密度リポタンパク質の反応を弱めるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明で用いられる界面活性剤は、非常に高い選択性を、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対してもたらす。以前の界面活性剤は、他のリポタンパク質と比較して、異なる速度でＨＤＬと反応することが示されてきているが、本発明の界面活性剤は、ほぼ排他的にＨＤＬと反応し、他のリポタンパク質と反応しないか、又は実質的に反応しない。試料中のＨＤＬは、可溶化して反応に利用できるＨＤＬコレステロールを残すが、一方で他のリポタンパク質画分に結合したコレステロールは、リポタンパク質構造内に結合したままで、反応には利用可能ではないと考えられている。しかしながら、本発明は、この作用様式には縛られない。代替的な理論としては、当該界面活性剤は、ＬＤＬの反応を選択的に抑制し、ＨＤＬのみ反応するのを可能にするというものである。従って、本発明の界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応するのを選択的に可能にするものであるが、一方でＬＤＬコレステロールは実質的に反応できない。従って、その後の、試料のコレステロール含量の測定では、ＨＤＬ−コレステロール含量のみが反映され、他のリポタンパク質画分内に含有されるコレステロール量には、実質的に依存しない。従って、本発明の方法は、ＨＤＬに対して高度に選択的であり、ＨＤＬ−コレステロールについての正確で信頼できる試験を提供する。
【０００８】
本発明の方法は、先行技術の試験と比較して、改善された簡便性という更なる利点を有する。ＨＤＬコレステロールの測定結果は、試料を単一の試薬混合物と反応させ、且つコレステロール含量を１回測定することによって得ることができる。更に、結果は非常に短時間で得ることができ、典型的には試料を添加して１分又は数分以内に得ることができる。
【０００９】
ＨＤＬコレステロールの測定は、典型的には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼのいずれかと反応させることによって行う。従って、本発明はまた、高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において用いるための試薬混合物であって、
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める、本明細書中に規定した通りの界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ
を含む、試薬混合物を提供する。
【００１０】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める、本明細書中に規定した通りの界面活性剤、（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段、を含む、キットも提供する。当該キットは、典型的には、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段が
− 作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極（counter electrode）を有する電気化学セル；
− 該セルに電位を印加するための電源；並びに
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、電気化学的装置である。
【００１１】
本発明はまた、本発明のキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び、電極と接触させること
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成した生成物量を電気化学的に検出すること
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、スクロースモノカプレートを界面活性剤として用いて、（ａ）ＨＤＬを含有する血清、（ｂ）ＬＤＬを含有する血清、及び（ｃ）脱脂血清に関して実施したコレステロール測定の結果についての、測定された電流（ｎＡ）対時間（秒）を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態による装置を示す。
【図３】図３は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図４】図４は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図５】図５は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図６】図６は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図７】図７は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図８】図８は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図９】図９は、一連のＣｙｍａｌ界面活性剤を含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。ＨＤＬ応答グラジエントを実線で示し、ＬＤＬ応答グラジェントを点線で示す。
【図１０】図１０は、ＬｉＣｌを用いるか、若しくは用いていない、スクロースモノカプレートを含有するセンサについての応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）対時間（秒）を示す。グラフＡ−Ｄは、５％ＳＭＣ及び０、２５０、５００若しくは７５０ｍＭ ＬｉＣｌのいずれかを含有するセンサについてのものである。ＨＤＬ及びＬＤＬの応答のグラジエントを、それぞれ黒及び白の記号で示す。
【図１１】図１１は、（ａ）界面活性剤なし;（ｂ）４０ｍＭスクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）；及び（ｃ）１００ｍＭスクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）について、２３８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。ＨＤＬは実線の値で、ＬＤＬは破線／白丸で示す。
【図１２】図１２は、界面活性剤なし、４０ｍＭ ＳＭＤあり及び１００ｍＭ ＳＭＤありのセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（differentiation）（％）を時間（秒）に対して示す。
【図１３】図１３は、２３８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。（ａ）界面活性剤なし；（ｂ）６０ｍＭスクロースモノカプレート（ＳＭＣ）；及び（ｃ）１００ｍＭ ＳＭＣについて、ＨＤＬを実線の値で示し、ＬＤＬを破線／白丸の値で示す。
【図１４】図１４は、界面活性剤なし、６０ｍＭ ＳＭＣあり及び１００ｍＭ ＳＭＣありのセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（％）を、時間（秒）に対して示す。
【図１５】図１５は、０％、５％、７．５％及び１０％ ＳＭＣを用いたセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（％）を、時間（秒）に対して示す。
【図１６】図１６は、（ａ）０％ＳＭＣ、（ｂ）５％ＳＭＣ、（ｃ）７．５％ＳＭＣ及び（ｄ）１０％ＳＭＣを用いたセンサについて、ＨＤＬ（黒）及びＬＤＬ（破線、白丸の点（outline points））についての、９８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。
【図１７】図１７は、０％、０．５％、１．０％及び１．５％ＳＭＤを用いたセンサについて、ＨＤＬ対ＬＤＬのディファレンシエーション（％）を、時間（秒）に対して示す。
【図１８】図１８は、（ａ）０％ＳＭＤ、（ｂ）０．５％ＳＭＤ、（ｃ）１．０％ＳＭＤ及び（ｄ）１．５％ＳＭＤを用いるセンサについて、ＨＤＬ（黒）及びＬＤＬ（破線、白丸の点）についての、９８秒での電流Ｉｏｘ（ｎＡ）対リポタンパク質濃度（ｍＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、試料のＨＤＬ−コレステロール含量を選択的に決定する方法を提供するが、ここで当該試料は、ＨＤＬのみならず、コレステロールに結合する他のリポタンパク質を含有し得るものである。ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して高度に選択的な特異的界面活性剤と、試料を接触させることによって選択性が実現される。従って、当該界面活性剤により、ＨＤＬに結合するコレステロール及びコレステロールエステル類が測定のために利用可能となるが、一方でＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合するものはリポタンパク質の構造に結合したままであって、後のコレステロール含量の測定において実質的に反応しない。
【００１４】
コレステロール及びコレステロールエステル類は、主としてリポタンパク質粒子中で血液を運搬されることが知られている。酵素及び界面活性剤が、そのようなコレステロールをデヒドロゲナーゼによって酸化されるのに利用可能とする正確なメカニズムに関しては、議論がある。従って、本明細書の全範囲で、「分解する」又は「利用可能にした」又は「反応性を与える」等の用語はすべて、処理過程によって、分析に関する応答が任意の試料中のコレステロール（類）から得られるものである当該処理過程に関するものであることが理解される。しかしながら我々は、作用様式に関して、あらゆる特定の理論にも縛られることを望んでいない。
【００１５】
本発明で用いられる界面活性剤は、試料中の高密度リポタンパク質を選択的に分解するものである。これは、当該界面活性剤は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭと比較して、ＨＤＬと選択的に反応することを意味する。代替的には、当該界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいて、ＨＤＬコレステロールが反応すること（典型的には、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応すること）を選択的に可能にするものとして定義できる。本発明の文脈では、ＨＤＬを選択的に分解する界面活性剤、又はコレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応することを選択的に可能にする界面活性剤は、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００１６】
ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、式（ｉ）:
【００１７】
【数１】
【００１８】
（式中、ＧｘはＸに対する測定された応答のグラジエント（例、Ｘの既知の濃度に対する、測定された電流）である）に従って決定できる。測定される応答は、リポタンパク質濃度に関係する（又は対応する）（例えば、リポタンパク質濃度に比例する）任意の測定値であり得る。
【００１９】
従って、当業者は、選択した界面活性剤を用いて、ＨＤＬコレステロール含量が既知の試料のＨＤＬコレステロール含量を測定し、そして対応して同じ手順を用いて、ＬＤＬコレステロール含量が既知の試料のＬＤＬコレステロール含量を測定することによって、任意の所与の界面活性剤がＨＤＬを選択的に分解するものかどうかを、容易に決定できる。その結果からディファレンシエーションの値が計算できる。ＨＤＬコレステロール含量又はＬＤＬコレステロール含量を測定するための手順は、典型的には、選択した界面活性剤を用いる、下記の実施例１に記載したものである。
【００２０】
本発明において、ＨＤＬ濃度は典型的には、コレステロールのコレステノンへの電気化学的変換に際して、電極で生じる電流を決定することによって電気化学的に測定される。当該電流は、ＨＤＬコレステロール含量の測定値に関係するので、典型的には、測定電流値を、グラジエントを決定するために用いる。
【００２１】
ディファレンシエーションは、ＨＤＬコレステロール試験の間に用いる経過時間と同じの、試料への試薬の添加とコレステロール含量の測定との間の経過時間を用いて測定しなくてはならない。そのような経過時間は、典型的には、３分以下、好ましくは１２０秒以下、９０秒以下又は６０秒以下のオーダーである。本発明の文脈では、選択的な界面活性剤は、実施例１において記載した手順、及び、試料への試薬の添加と測定との間に６２秒の経過時間を用いてコレステロール含量を測定した場合、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明の選択的界面活性剤は、実質的にＬＤＬを分解しない。従って、本発明のコレステロール試験において、界面活性剤は、好ましくはＬＤＬの反応を弱める。本発明の選択的界面活性剤の正確な作用メカニズムは完全には理解されておらず、また、我々は、あらゆる特定の提案されるメカニズムに縛られることを望まない。
【００２３】
ＨＤＬ若しくはＬＤＬのいずれかに存在する遊離コレステロール又はコレステロールエステル類に起因するコレステロール応答は、速度論的に分離し、ＨＤＬ応答はＬＤＬ応答に先行し、ＨＤＬに対するディファレンシエーションを生じさせると考えられている。
【００２４】
当該応答の速度論的分離は、多くの理由に起因し得る：界面活性剤のＨＤＬに対する選択的な作用若しくはＬＤＬ応答を弱める選択的な作用、又は両メカニズムが一緒に機能してもよい。
【００２５】
ＨＤＬとＬＤＬとが異なる膜タンパク質を有することは公知である。ＨＤＬはＡｐｏＡ１を含有し、ＬＤＬはＡｐｏＢを含有する。当該界面活性剤は、これらのタンパク質の可溶化及びリポタンパク質粒子の崩壊に、選択的に作用し得る。当該界面活性剤が、種々のタイプのリポタンパク質粒子に選択的に取り込まれることができ、この能力がそれらの疎水性−脂溶性のバランス（ＨＬＢ）に関連していることも公知である。リポタンパク質粒子への界面活性剤の取り込みは、該リポタンパク質粒子のサイズの増大を惹起してその反応性に影響を及ぼし得る。
【００２６】
ＬＤＬ粒子の核は、概ね室温の転移温度以下で結晶的な挙動をすることも公知である。言い換えれば、ＬＤＬ粒子核中のトリグリセリド及びコレステロールエステルは秩序だって配置されており、ＬＤＬ粒子は結晶性を示すということができる。このことで、ＬＤＬ粒子核中のコレステロールの反応性に影響すると期待される。当該界面活性剤がＬＤＬ粒子核の秩序を崩壊させないこと、即ち、核中のコレステロールエステルが、リパーゼとの反応のために、表面膜の層から出てくるのが難しいということはあり得る。
【００２７】
ＬＤＬ応答の弱まりは、本発明の選択的界面活性剤の特定の構造によって惹起され得る。当該界面活性剤は、親水性部分（糖部分）及び疎水性部分（アルキル鎖）を有し、そしてアルキル鎖はリポタンパク質粒子の膜を貫通するが、一方糖部分は外側で結合したままのことがあり得る。当該界面活性剤が、そのような様式でＬＤＬ粒子中に組み込まれると、糖部分で外膜を覆うこととなり、酵素との距離の接近及び反応を妨げる。当該界面活性剤のＨＤＬ粒子中への組み込みにはこの効果はなく、酵素と容易に反応できる、より小さなミセルへのＨＤＬ粒子の急速な分解がもたらされ得る。
【００２８】
本発明の界面活性剤が、ＬＤＬ粒子への選択的結合を惹起し、それによってＬＤＬ粒子の反応性及びＬＤＬ粒子内に含有されるコレステロールのリパーゼ／デヒドロゲナーゼとの反応を低減又は完全に除去することができるということもあり得る。
【００２９】
界面活性剤の選択的作用は、リパーゼ／デヒドロゲナーゼ酵素をＨＤＬに対して活性化すること及び／又は当該酵素のＬＤＬへの作用を抑制することが可能ですらあり得る。
【００３０】
当業者は、選択した界面活性剤存在下で得られたグラジエントＧＬＤＬ（界面活性剤）（上に規定した通り）を、界面活性剤非存在下で得られたグラジエントＧＬＤＬ（ブランク）に対して比較することによって、当該選択した界面活性剤によりＬＤＬ応答が弱められるかどうかを決定できる。関係
【００３１】
【数２】
【００３２】
は、当該界面活性剤がＬＤＬ反応を弱める場合には、１未満である。典型的には、関係
【００３３】
【数３】
【００３４】
は、０．８未満、好ましくは０．５未満又は０．３未満である。
【００３５】
グラジエントＧＬＤＬは、ＬＤＬ濃度を決定するための任意の手段によって測定できる。典型的には、本発明においては、既知の濃度に対する電流のグラジエントを用いる。実施例１又は１２に示す通りの、グラジエントを決定するための方法を用いてもよい。
【００３６】
本発明の界面活性剤として使用するためのスクロースエステル類の例としては、１以上のＨＯ−基が独立してＲＣＯＯ−基（式中、Ｒは典型的には、最大１８個の炭素原子を有する、直鎖状、分枝状又は環状であり得るアルキル又はアルケニル基である）と置換される、スクロース部分が挙げられる。スクロースエステル類の例としては、式（Ｉ）:
【００３７】
【化１】
【００３８】
（Ｒは典型的には、最大１８個の炭素原子を有する、直鎖状、分枝状又は環状であり得るアルキル又はアルケニル基である）の化合物が挙げられる。典型的には、Ｒは少なくとも５個、例えば少なくとも７個の炭素原子を有する直鎖状アルキル基である。１つの実施形態においては、Ｒは、最大１５個、例えば最大１３個の炭素原子を有する。
【００３９】
スクロースエステル類の更なる例は、エステル部分が、スクロース部分における異なる位置に現れる式（Ｉ）の化合物の修飾物である。更なる例としては、ジ又はポリエステル類が挙げられる。ジ又はポリエステル類の場合は、２以上のＲ基は同じであっても異なっていてもよいが、典型的には同じである。２以上のスクロースエステル類の混合物を用いてもよい。
【００４０】
本発明の界面活性剤として用いるためのマルトシド類の例としては、式（ＩＩ）:
【００４１】
【化２】
【００４２】
（式中、Ｒは、例えば最大１８個の炭素原子を有する、アルキレン又はアルケニレン基であり、且つＡは、メチル基又は４〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基である）のマルトシド類が挙げられる。Ｒは直鎖状又は分枝状であり得る。例えば、Ｒは（ＣＨ２）ｙ（式中、ｙは１〜９である）であり得る。
【００４３】
１つの実施形態においては、Ａは、炭素原子４〜７個を有するシクロアルキル基であり、好ましくはシクロヘキシルである。そのような化合物の例としては、シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−１、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルエチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−２、シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルプロピル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−３、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルブチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−４、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルペンチルｌ−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−５、アナトレースから入手可能）、シクロヘキシルへキシル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−６、アナトレースから入手可能）及びシクロヘキシルヘプチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−７、アナトレースから入手可能）等のシクロヘキシルアルキルマルトシド類が挙げられる。
【００４４】
代替の実施形態においては、Ａはメチルであり、且つＲは、少なくとも５個（例、少なくとも７個）の炭素原子を有し、且つ最大１５個（例、最大１３個）の炭素原子を有するアルキレン又はアルケニレン基である。そのような化合物の例としては、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドが挙げられる。
【００４５】
上式ＩＩは、β−マルトシド類を示す。しかしながら、α−マルトシド類もまた、本発明における界面活性剤として用いられ得る。従って、界面活性剤の更なる例としては、上に列挙したマルトシド類のα相当物が挙げられる。
【００４６】
本発明で用いるための好ましい界面活性剤としては、スクロースモノカプレート、スクロースモノデカノエート、Ｃｙｍａｌ−１、Ｃｙｍａｌ−２、Ｃｙｍａｌ−３、Ｃｙｍａｌ−４、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６、Ｃｙｍａｌ−７、ｎ−ウンデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、特に、スクロースモノカプレート、スクロースモノデカノエート、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５が挙げられる。
【００４７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましい界面活性剤としては、スクロースモノカプレート（シグマ アルドリッチ株式会社）、Ｃｙｍａｌ−１、Ｃｙｍａｌ−２、Ｃｙｍａｌ−３、Ｃｙｍａｌ−４、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６及びＣｙｍａｌ−７が挙げられる。他の実施形態においては、好ましい界面活性剤としては、スクロースモノカプレート（シグマ アルドリッチ株式会社）、Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５が挙げられる。
【００４８】
界面活性剤は個々に用いてもよく、又は２以上の異なる界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。用いる界面活性剤の総量は、典型的には、試験される試料１ｍｌあたり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００４９】
所望により、試料を、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と錯体を形成する錯化剤と更に反応させてもよい。錯化剤の例としては、ポリアニオン類、ポリアニオン類と二価金属塩との組み合わせ、及びａｐｏＢ含有リポタンパク質に結合できる抗体が挙げられる。ポリアニオン類はホスホタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩から選ぶことができる。一度錯化した形態になると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質は反応に利用できなくなり、従ってコレステロール測定を妨げない。しかしながら、本発明においては特異的な界面活性剤を使用するため、錯化剤は必要でない。従って、試料を錯化剤と反応させないことが好ましい。
【００５０】
所望により、試料をイオン性塩と更に接触させてもよい。イオン性塩の添加でＨＤＬへの応答速度が速くなることが分かった。好適なイオン性塩としては、アルカリ金属（例、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）及び遷移金属（例、Ｃｒ３＋）塩が挙げられる。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及びＣｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３が適切な例である。一般的には、反応に悪影響（用いる測定条件下で酸化又は還元される等）を及ぼさない限り、任意のイオン性塩を用いてよい。
【００５１】
試料のＨＤＬ−コレステロール含量の測定を、コレステロールを測定するための任意の好適な技法によって行うことができる。好ましい技法は、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させることを伴う。１つの実施形態においては、コレステロールデヒドロゲナーゼが用いられる。従って本発明は、試料を界面活性剤及びコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させる方法を包含する。
【００５２】
ＨＤＬリポタンパク質中に含有されるコレステロールは、遊離コレステロール又はコレステロールエステル類の形態であり得る。従って、任意のコレステロールエステル類を遊離コレステロールに分解するためにコレステロールエステル加水分解試薬が典型的に用いられる。次いで、遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させ、そのような反応を受けたコレステロールの量を測定する。
【００５３】
コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステル類をコレステロールに加水分解できる、任意の試薬であり得る。試薬は、コレステロールのコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応、及びアッセイにおけるその後の任意の段階を妨げないものでなくてはならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は酵素であり、例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。リパーゼはとりわけ好ましい。好適なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）又はクロモバクテリウム・ビスコサム（chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。任意に安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有する市販の酵素（例、東洋紡又はアマノから入手可能なもの）を用いてもよい。コレステロールエステル加水分解試薬は、試料１ｍｌあたり０．１〜２５ｍｇ、例えば試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは、１ｍｌあたり０．５〜２５ｍｇ（１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇ等）の量で用いてもよい。
【００５４】
任意の市販形態の、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えばノカルディア（Nocardia）種由来である。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、試薬混合物１ｍｌあたり０．０１〜１００ｍｇの量で用いてもよい。１つの実施形態においては、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼは、試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜２５ｍｇの量で用いられる。
【００５５】
各酵素は、安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有し得る。更に、各酵素は、化学的に修飾されていてもよい。
【００５６】
界面活性剤は、試料に対して、他の試薬を加える前に加えてもよく、又は他の試薬を加えるのと同時に加えてもよい。好ましい実施形態においては、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ及び界面活性剤は、単一の段階で試料と混合される単一の試薬混合物中に存在する。特に好ましい実施形態においては、当該方法は、試料を試薬と接触させる単一の段階を伴い、その結果、単一の試薬混合物のみ提供される必要がある。
【００５７】
本発明による測定は、ＨＤＬ−コレステロールを含有する任意の好適な試料で実施できる。測定は、典型的には、全血又は血液成分（例えば血清又は血漿）で実施される。本発明の方法において使用する好ましい試料は、血清及び血漿である。測定を全血で実施する場合は、当該方法は、赤血球を除去するために血液を濾過する、更なる段階を含み得る。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール含量を測定するために、電気化学的技法を用いる。これは、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量を、電極で発生する電気化学的応答を測定することによって決定することを意味する。この実施形態においては、典型的には、試料を界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと相互作用できる補酵素、及び酸化又は還元されて電極で電気化学的に検出できる生成物を形成することができる酸化還元剤と反応させる。試料と試薬との混合物は、生じる酸化還元反応が検出できるように、電気化学セルの作用電極と接触させる。セルに電位を印加し、結果生じる電気化学的応答、典型的には電流を測定する。
【００５９】
この好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール量は、以下のアッセイ：
【００６０】
【化３】
【００６１】
（ここで、ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）に従って測定する。このアッセイにおいて、所望により、コレステロールデヒドロゲナーゼは、コレステロールオキシダーゼに置き換えることができる。当該アッセイによって生成した、還元された酸化還元試薬量を電気化学的に検出する。しかるべき場合には、更なる試薬もまた、このアッセイに含めてもよい。
【００６２】
典型的には、試料は、単一の段階で全ての試薬と接触する。従って、全ての必要な試薬を含有し、且つアッセイを実施するために容易に試料と接触できる試薬混合物を提供する。本発明の試薬混合物は、典型的には、界面活性剤を試料１ｍｌ当たり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ、例えば約５０ｍｇの量で含み、コレステロールエステル加水分解試薬を試料１ｍｌ当たり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇの量で含み、且つコレステロールデヒドロゲナーゼを、試料１ｍｌ当たり０．１〜３０ｍｇ、好ましくは０．５〜２５ｍｇの量で含む。
【００６３】
典型的には、補酵素はＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通する構造的特徴を有し、且つコレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても働く化合物である。ＮＡＤ＋のアナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオＮＡＤ）；ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は、典型的には、１〜２０ｍＭ、例えば３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭの量で、試薬混合物中に存在する。
【００６４】
典型的には、酸化還元剤は、上に示したアッセイに従って還元できるものでなくてはならない。この場合、酸化還元剤は補酵素から（又は後述のようなレダクターゼから）電子を受容でき、且つ電子を電極に伝達できるものでなくてはならない。酸化還元剤は分子又はイオン錯体であってもよい。酸化還元剤は、タンパク質等の天然に存在する電子受容体であってもよく、又は合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有するであろう。
【００６５】
好ましくは、酸化還元剤は無機錯体である。当該剤は金属イオンを含んでもよく、少なくとも２価を有することが好ましいであろう。特に、当該剤は、遷移金属イオンを含んでもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は帯電していてもよく、例えば、カチオン性又は代替的にはアニオン性であってもよい。好適なカチオン性の剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋等のルテニウム錯体であり、好適なアニオン性の剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−等のフェリシアン化錯体である。
【００６６】
用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）及び（エチレンジアミン等の）それらのキレートアミンリガンド誘導体類、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及び−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及びＣＯ２Ｈ等の、１以上の基が２つのシクロペンタジエニル環の一方又は両方へと置換されたその誘導体類が挙げられる。無機錯体は、好ましくはＦｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００６７】
酸化還元剤は、典型的には、１０〜２００ｍＭ、例えば２０〜１５０ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ又は最大８０ｍＭの量で試薬混合物中に存在する。
【００６８】
好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイにおいて用いられる試薬混合物は、レダクターゼを更に含む。レダクターゼは、典型的には、還元型ＮＡＤから２個の電子を伝達され、酸化還元剤へ２個の電子を伝達する。従って、レダクターゼの使用により、素早い電子の伝達がもたらされる。
【００６９】
用いることができるレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ並びにチトクロームＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のチトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェレドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸還元酵素、チトクロームｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシンレダクターゼ及び酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明で用いるための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００７０】
レダクターゼは組み換えタンパク質、又は精製若しくは単離した天然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、電子の伝達を行う速度又は基質特異性を最適化する等、その性能を向上するために変異されていてもよい。
【００７１】
レダクターゼは、典型的には、０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は２〜２０ｍｇ／ｍｌの量で試薬混合物中に存在する。
【００７２】
任意で試薬は乾燥でき、より好ましくは、試薬は凍結乾燥できる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイの大まかなスキームは、以下：
【００７４】
【化４】
【００７５】
（式中、
ＰｄＲはプチダレドキシンレダクターゼであり、
Ｄｉａはジアホラーゼであり、
ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）
の通りである。
【００７６】
試薬混合物は、任意に、１以上の更なる成分、例えば、賦形剤及び／又は緩衝液及び／又は安定化剤を含有する。混合物を安定化するため、並びに任意で、試薬混合物を本発明の装置上で乾燥する場合に、当該乾燥混合物に多孔性を提供するために、当該試薬混合物に賦形剤を含めることが好ましい。好適な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトース等の糖類、並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンもまた、賦形剤として用いることができる。至適酵素活性のために必要なｐＨを提供するために、緩衝液も含めてもよい。例えば、トリス緩衝液（ｐＨ９）を用いてもよい。例えば酵素の安定性を高めるために、安定化剤を加えてもよい。好適な安定化剤の例は、アミノ酸（例、グリシン及びエクトイン）である。
【００７７】
好ましい実施形態においては、本発明の電気化学的アッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解し、その上ＬＤＬでは弱まった作用を示す界面活性剤；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元剤を含む。より好ましい実施形態においては、試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋又はそのアナログ、ジアホラーゼ又はプチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含む。
【００７８】
本発明の試薬混合物は、典型的には、固形形態、例えば、乾燥形態、又はゲルとして提供される。代替的には、溶液又は懸濁液の形態であり得る。反応混合物中に存在する各成分量は、上にモル濃度又はｗ／ｖで表しているが、当業者には、存在する各成分の相対量が同じであるまま、これらの量を乾燥混合物又はゲルに好適な単位に適合させることができるであろう。
【００７９】
電気化学的測定が全血で実施される場合、得られる測定結果はヘマトクリット値に依存し得る。従って、測定結果は理想的には、少なくとも部分的に、この要因を説明するために調整するべきである。代替的には、アッセイを実施する前に、試料を濾過することによって赤血球を除去できる。
【００８０】
本発明はまた、ＨＤＬを含有する試料のＨＤＬコレステロール含量を選択的に決定するためのキットを提供する。当該キットには、必要な試薬（例、界面活性剤、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール量を測定するための手段）が含まれる。
【００８１】
好ましい実施形態においては、当該キットは、ＨＤＬ−コレステロール含量を電気化学的に決定するための装置を含む。この実施形態においては、反応したコレステロール量を決定するための手段は、作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；セルに電位を印加するための電源；及び結果生じる電気化学的応答、典型的にはセルを横断する電流、を測定するための測定機器を含む。
【００８２】
電気化学的な決定のための装置は、典型的には、上記した通りの試薬混合物を含む。当該試薬は個々に、又は１以上の試薬混合物の形態でキット中に存在し得る。単一の試薬混合物が好ましい。試薬混合物は装置中に、液体又は固体のいずれの形態でも存在し得るが、固体形態が好ましい。
【００８３】
典型的には、試薬混合物は、好適な液体（例、水又は緩衝液）中に懸濁／溶解させて装置中に挿入するか又は装置上に置き、次いで所定の位置で乾燥させる。装置中／上で物質を乾燥させるこの段階は、当該物質を望ましい場所に保持するのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）によって実施され得るが、凍結乾燥が好ましい。試薬混合物は、典型的には、試料が試薬混合物と接触したとき、電極との接触も起きるように、電極の付近に配置される。
【００８４】
当該装置には、任意に、試験する試料が、試薬混合物と接触する前に通過する膜が含まれ得る。当該膜は、例えば、赤血球（red blood cell）、赤血球（erythrocyte）及び／又はリンパ球等の成分を濾過で除去するために用いられ得る。血液濾過膜を含む好適な濾過膜は、当該技術において公知である。Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２， Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ， Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘが血液濾過膜の例である。繊維ガラスフィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は全血から血漿を分離でき、また全血検査試料が装置に供給され、且つ試験される試料が血漿である場合に好適に用いられる。
【００８５】
使用前に親水的又は疎水的処理を経てきたものを含む、代替的又は付加的な膜も用いてもよい。所望により、膜表面の他の特徴もまた、改変してもよい。例えば、所望の試料の膜を通る流れを促進するために、水中における膜の接触角を修正するための処理を用いてもよい。当該膜は１又は２以上の材料層を含んでもよく、各々は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、異なる膜材料の２層を有する従来の二重層膜を用い得る。
【００８６】
本発明において用いるための適切な装置には、ＷＯ ２００３／０５６３１９及びＷＯ ２００６／０００８２８に記載のものが含まれる。
【００８７】
本発明の１つの実施形態による装置を、図１８に記載する。この実施形態においては、作用電極５はミクロ電極である。本発明の目的のために、ミクロ電極は、５０μｍを超えない少なくとも１つの作業寸法を有する電極である。
【００８８】
セルは、底部１及び壁（単数又は複数）２を有するレセプタクル又は容器の形態である。典型的には、レセプタクルは、２５〜１０００μｍの深さ（即ち、上部から底部まで）を有するであろう。１つの実施形態においては、レセプタクルの深さは、５０〜５００μｍ、例えば、１００〜２５０μｍである。代替的な実施形態においては、レセプタクルの深さは５０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。レセプタクルの長さ及び幅（即ち、壁から壁まで）、又はレセプタクルが円筒状の場合はその直径は、典型的には、０．１〜５ｍｍ、例えば０．５〜１．５ｍｍ（１ｍｍ等）である。
【００８９】
レセプタクル３の開口端は、部分的に、不透過性材料で覆われてもよく、又は半透性若しくは透過性の膜等の、半透性若しくは透過性の材料で覆われてもよい。レセプタクルの開口端は、実質的に、半透性又は透過性の膜４で覆われるのが好ましい。膜４は、とりわけ、埃又は他の混入物質がレセプタクルに入ることを防ぐのに役立つ。
【００９０】
作用電極５は、レセプタクルの壁に位置する。作用電極は、例えば、レセプタクルの壁周囲の連続した帯の形態である。作用電極の厚みは、典型的には０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍであり、例えば０．１〜２０μｍである。より厚みのある作用電極、例えば、０．１〜５０μｍ、好ましくは５〜２０μｍの厚みを有する電極も想定している。作用電極の厚みは、レセプタクルをその底部に置く場合は、その垂直方向の寸法である。作用電極の厚みは、その有効作業寸法、即ち、試験する試料と接触する、電極の寸法である。作用電極は、例えば、導電性インクの形態の、炭素、パラジウム、金又は白金で形成するのが好ましい。当該導電性インクは、例えば、白金及び／又はグラファイト及び／又は白金炭素といった更なる材料を含有する改良インクであり得る。作用電極を形成するために２以上の層を用いてもよく、当該層は、同じか、又は異なった材料で形成される。
【００９１】
セルはまた、例えば、レセプタクルの底部、レセプタクルの壁（単数又は複数）中、又はレセプタクルの周囲又は付近の装置の領域中に存在し得る擬似参照電極（示さず）を含有する。擬似参照電極は、典型的には、Ａｇ／ＡｇＣｌから作られるが、他の材料も用いてもよい。擬似参照電極として用いるための好適な材料は、当業者に公知である。この実施形態においては、セルは、擬似参照電極が対向電極及び参照電極の両方として働く２電極システムである。セルが参照電極及び別個の対向電極を含む、代替の実施形態も想定できる。
【００９２】
擬似参照（又は参照）電極は、典型的には、作用電極５と同様のサイズの、又はそれより小さい、若しくは大きい（例えば相当大きい）表面積を有する。典型的には、擬似参照（又は参照）電極の表面積の、作用電極の表面積に対する比率は、少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１、又は少なくとも３：１である。好ましい比率は少なくとも４：１である。擬似参照（又は参照）電極は、例えば、マクロ電極であってもよい。好ましい擬似参照（又は参照）電極は、０．０１ｍｍ又はそれを上回る、例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法を有する。これは例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、直径であり得る。擬似参照（又は参照）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．１ｍｍ２〜６０ｍｍ２であり、例えば１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と擬似参照（又は参照）電極との間の最短距離は、例えば、５０〜１０００μｍである。
【００９３】
セルが機能できるためには、電極は各絶縁材料６によって分離されなければならない。絶縁材料は、典型的には、例えば、アクリレート、ポリウレタン、ＰＥＴ，ポリオレフィン、ポリエステルといったポリマー又は他の任意の安定な絶縁材料である。ポリカーボネート並びに他のプラスチック及びセラミックも、好適な絶縁材料である。絶縁層はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって形成することができる。塗布後硬化する液体、例えばワニスも、用いてもよい。代替的には、例えば、熱若しくはＵＶへの曝露によって、又は２成分の架橋可能なシステムの活性部分と混合することによって架橋される、架橋可能なポリマー溶液を用いてもよい。しかるべき場合には、絶縁層を形成するために、誘電性インクも用いてもよい。代替の実施形態においては、絶縁層は装置にラミネートされる（例えば熱で、ラミネートされる）。
【００９４】
電気化学セルの電極は、好適な任意の手段によって、必要な任意の測定機器に接続してよい。典型的には、電極は、導電性のトラック（track）に接続され、該導電性のトラックは、必要な測定機器にそれ自身接続されるか、又は接続され得る。
【００９５】
図１８中の７に示す通り、必要な試薬は、典型的にはレセプタクル内に含有させる。典型的には、単一の試薬混合物の形態の試薬は、液体の形態でレセプタクル内に挿入された後、組成物を固定するのに役立つよう乾燥させる。試薬混合物は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥、又はオーブン乾燥（加熱）されてもよく、最も好ましくは、凍結乾燥される。
【００９６】
本発明の装置は、試料を装置に提供し、且つ試料の試薬混合物への接触を可能にすることによって機能させる。血漿又は血液を溶解し、且つ混合物中の試薬と反応させるために十分な時間が割り当てられなければならないのは明らかである。血漿を凍結乾燥したセンサと共に用いる場合は、センサへの試料のアプライと、セルの印加電位の印加との間に概ね２０秒間が経過する。全血を用いる場合、血液細胞の除去を可能にするために、この遅延時間はより長くてもよく、例えば最大で５分間である。特定の試験においては、血漿を試薬と、電極から離して混合し、そしてセルに添加して即座に電位を印加する。典型的には、電位が印加され、測定結果を１０秒間、典型的には１〜４秒以内に読み取る。
【００９７】
この短い範囲内の時間を用いることで、ＨＤＬに結合したコレステロールのみを測定で検出することを確実にするのに役立つ。用いた界面活性剤がわずかにＬＤＬと反応する場合、そのような反応は無視され、測定がそのような短時間内でなされる場合には実質的に結果に影響しない。
【００９８】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極で検出すべき生成物の場合、セルに印加する電位は０．１Ｖ〜０．３Ｖである。０．１５Ｖが好ましい印加電位である。（本明細書中で述べる電圧はすべて、０．１Ｍ塩化物ありでの、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する値である。）好ましい実施形態においては、電位は最初の段階で、約１秒間、０．１５Ｖの正の印加電位にし、次の段階で、還元電流の測定を望む場合、負の印加電位を印加する。ＷＯ ０３／０９７８６０（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の通り、二重の電位段階を用いることで、電極汚染及び電極領域におけるばらつきを最小にする修正が可能になる。異なる酸化還元剤を用いる場合、酸化／還元ピークが発生する電位によって、印加電位を変えることができる。
【００９９】
従って、本発明の電気化学的試験で、ＨＤＬコレステロールの測定を、試料を装置にアプライしてから非常に短時間で、典型的には約５分以内で、好ましくは３分以内で、２分以内で、又は１分以内にでさえ、行うことが可能になる。状況によっては、試料を装置にアプライしてからわずか１５秒又は３０秒で結果を得ることができるかもしれない。
【実施例】
【０１００】
実施例
実施例１
緩衝溶液の調製（トリス緩衝液−５％グリシン ｐＨ９．０）
結晶化トリス及びトリスＨＣｌを含有するＴｒｉｚｍａ Ｐｒｅ−Ｓｅｔ Ｃｒｙｓｔａｌｓ（ｐＨ９．０、シグマ、Ｔ−１４４４）を９５０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶かし、ｐＨを記録した。続いて、グリシン（シグマ、Ｇ−７４０３）５０ｇを該トリス溶液に加え、ｐＨを記録した。次いで、１０Ｍの水酸化カリウム（シグマ、ｐ−５９５８）を用いてｐＨを８．８〜９．２内に調整し、ｄＨ２Ｏを用いて該溶液を１０００ｍｌとし、最終ｐＨを記録した（ｐＨ９．１）。該溶液は使用期限を１ヶ月とし、４℃にて保存した。
【０１０１】
界面活性剤溶液の調製
事前調製した緩衝液にスクロースモノカプレート（シグマ）を加え、１０％スクロースモノカプレート緩衝液とすることにより、界面活性剤溶液を調製した。
【０１０２】
ＬＤＬ試料及びＨＤＬ試料の調製
ＬＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３２−８）試料及びＨＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３３−８）試料は、脱脂血清（dilipidated serum）（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）を用いて、必要濃度の１０倍のものを作製した（最終テスト混合物中で１：１０希釈するため）。次いで、該試料を、スペースクリニカルアナライザー（Space clinical analyser）（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。ＬＤＬ及びＨＤＬのおおよその濃度は１０ｍＭであり、最終テスト混合物中で１ｍＭとした。
【０１０３】
酵素混合物の調製
事前調製した緩衝液に、以下を加えることにより、酵素混合物を調製した：
１６０ｍＭヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（アルファ・エイサー、１０５１１）
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（Ｓｏｒａｃｈｉｍ／東洋紡、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１０４】
テストプロトコル
該界面活性剤溶液９μｌを該酵素混合物９μｌと混合した。Ｔ＝−３０秒にて、試料２μｌ（１０倍濃度ＬＤＬ若しくは１０倍濃度ＨＤＬのいずれか、又は脱脂血清２μｌ）と、生成した界面活性剤：酵素混合物とを混合し、この結果生じた溶液の９μｌを、電極上に置いた。Ｔ＝０秒にて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。０．１５Ｖの酸化電位を印加し、続いて−０．４５Ｖの還元電位を印加した。酸化電位を印加している間、５つのタイムポイント（Ｔ＝０、３２、６４、９０及び１１８秒）にて電流を測定した。各試料とも、重複してテストを行った。
【０１０５】
結果
ＨＤＬ及びＬＤＬのテスト結果を、コントロールとしての脱脂試料と共に、図１に示す。図１から、とりわけ短い期間において、スクロースモノカプレートがＬＤＬよりもＨＤＬに対して選択的であることが明らかである。
【０１０６】
ディファレンシエーションの値を決定するために、測定したＨＤＬ電流を既知のＨＤＬ濃度に対してプロットし、各タイムポイントでのグラジエントを測定した。同様に、ＬＤＬの各測定結果に対するグラジエントを計算した。ディファレンシエーションの値の結果を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ここで、ＧＬＤＬ（Ａ）は、ＬＤＬコレステロール濃度Ａにおける、既知のＬＤＬコレステロール濃度に対するＩＬＤＬのグラジエントであり；ＧＨＤＬ（Ａ）は、ＨＤＬコレステロール濃度Ａにおける、既知のＨＤＬコレステロール濃度に対するＩＨＤＬのグラジエントである。
【０１０９】
従って、スクロースモノカプレートは、ＬＤＬよりもＨＤＬに対して選択性を示す。
【０１１０】
実施例２から８
緩衝溶液の調製
緩衝溶液は０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭメディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０１１１】
酵素及びＣｙｍａｌを、以下の最終濃度になるように上記緩衝液に加えた：
８．８５ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ
３．３５ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー
５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ界面活性剤
【０１１２】
用いたＣｙｍａｌは：
実施例２： Ｃｙｍａｌ１＝２−シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例３： Ｃｙｍａｌ２＝２−シクロヘキシルエチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例４： Ｃｙｍａｌ３＝シクロヘキシルプロピル−β−Ｄ−マルトシド
実施例５： Ｃｙｍａｌ４＝シクロヘキシルブチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例６： Ｃｙｍａｌ５＝シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド
実施例７： Ｃｙｍａｌ６＝シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド
実施例８： Ｃｙｍａｌ７＝シクロヘキシルヘプチル−β−Ｄ−マルトシド
【０１１３】
分注及び凍結乾燥
ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、各溶液０．４μｌ／ウェルをセンサ上へ分注した。次いで、分注したセンサシートを、凍結乾燥させた。
【０１１４】
試料
テストは、事前に凍結させた血漿試料を用いて行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。脱脂血清も試料として用いた。次いで、これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、クリニカルアナライザーを用いて解析した。
【０１１５】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１５μｌの血漿試料を加えて、ポテンショスタットに連結されたマルチプレクサを用いてクロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間に遅延時間はなかった。各血漿試料を重複してテストした。
【０１１６】
解析
電流トランジェントでの４秒間の値について、結果を解析した。各タイムポイントにおけるグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１１７】
結果を以下の通り、図３から９に示す。
【０１１８】
図３：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−１を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１１９】
図４：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−２を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２０】
図５：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−３を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２１】
図６：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−４を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２２】
図７：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−５を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２３】
図８：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−６を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２４】
図９：５０ｍＭ Ｃｙｍａｌ−７を含有するセンサの経時的な応答グラジエント（ｎＡ／ｍＭ）。ＨＤＬへの応答グラジエントを実線で、ＬＤＬへの応答グラジエントを点線で示している。
【０１２５】
Ｃｙｍａｌ界面活性剤を含有する酵素混合物のＨＤＬ及びＬＤＬへの応答を比較することにより、Ｃｙｍａｌ界面活性剤のいくつかは、ＨＤＬに対するディファレンシエーションの増加を示し、Ｃｙｍａｌ４及び５が最も顕著であったことが示される。
【０１２６】
実施例９
本実験の目的は、アルファ型若しくはベータ型のいずれかのｎ−ウンデシルＤ−マルトシド又は、不飽和アルキル鎖を有するアルキルマルトシドであるω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１２７】
緩衝溶液の調製
緩衝液は０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭメディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０１２８】
界面活性剤溶液
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液にマルトシドを加えて、以下の最終濃度にすることにより、２倍強度マルトシド溶液を作製した：
ｎ−ウンデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｕ３００ＨＡ）
２００ｍＭ（１８０μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７９ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（シグマ−アルドリッチ、９４２０６）
２００ｍＭ（１８０ｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７９）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ω−ウンデシレニル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｕ３１０）
２００ｍＭ（１７１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１６９ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１２９】
酵素混合物
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えて以下の最終濃度にすることにより、２倍強度で酵素混合物を作製した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー
この溶液をＣｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて混合した。
【０１３０】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びマルトシド溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。更に、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合することにより、ブランク混合物を調製した。ＷＯ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用い、０．４μｌ／ウェルの各溶液をセンサへ分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥させた。
【０１３１】
試料
テストは、事前に凍結させた血漿試料を用いて行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４００ｒｐｍで遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１３２】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１２〜１５ｕｌの血漿試料を加えて、クロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間に遅延時間はなかった。各血漿試料は重複してテストした。
【０１３３】
解析
電流トランジェントでの４秒間の値についてアウトプットを解析した。各タイムポイントにおける、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定値の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１３４】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを、以下の表に示す：
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
これらのマルトシドの任意のものを使用することにより、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。アルファ型とベータ型の両方のアルキルマルトシドが、ＨＤＬセンサにおいて、有効に差異を与える（differentiating）剤となり得ると結論づけられる。不飽和アルキル鎖を有するアルキルマルトシドがＨＤＬセンサにおいて有効に差異を与える剤となり得ることも、また結論づけられる。
【０１３７】
実施例１０
本実験の目的は、直鎖又は分岐アルキル鎖のいずれかを持つアルキル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１３８】
実施例９の方法を繰り返したが、２倍強度のマルトシド溶液としては以下を用いた：
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｏ３１０）
２００ｍＭ（２００μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８２ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、ＤＨ３２５）
２００ｍＭ（１８９μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７７ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｐ３１０）
２００ｍＭ（１９２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｄ３２２）
２００ｍＭ（１９１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８４ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１３９】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを、以下の表に示す：
【０１４０】
【表３】
【０１４１】
分岐アルキル基を有するアルキル−β−Ｄ−マルトシドが、ＨＤＬセンサにおいて差異を与える剤として作用しうると結論づけられる。
【０１４２】
実施例１１
本実施例の目的は、Ｃｙｍａｌ４又はＣｙｍａｌ−５（シクロヘキシル−ブチル−β−Ｄ−マルトシド、又は、シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド）を含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１４３】
実施例９の方法を繰り返したが、２倍強度のマルトシド溶液としては以下を用いた：
Ｃｙｍａｌ−４ （アナトレース， Ｃ３２４）
５０ｍＭ （２１７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．００５２ｇ）
Ｃｙｍａｌ−５ （アナトレース， Ｃ３２５）
５０ｍＭ （２０８μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．００５１ｇ）
【０１４４】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを以下の表に示す：
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
該ＨＤＬセンサにおいて、Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５の両方が、差異を与える剤として作用し得ると結論づけられる。
【０１４７】
実施例１２
本実施例の目的は、種々のアルキル鎖長を有するｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１４８】
以下の２倍強度マルトシド溶液を用いて、実施例９に従い、ＲｕＡｃａｃ溶液、マルトシド溶液及び酵素溶液を作製した：
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｏ３１０）
２００ｍＭ（２０１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８２ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｔ３２３ＬＡ）
２００ｍＭ（２０４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２１４ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｔ３１５）
２００ｍＭ（２００μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２１５ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１４９】
分注及び凍結乾燥
実施例９に記載したように、酵素溶液を分注及び凍結乾燥した。実施例９と同様の方法で試料を調製した。
【０１５０】
テストプロトコル
電極あたり、血漿試料１２〜１５μｌを用いた。１２〜１５μｌの血漿を加えてクロノアンペロメトリーを開始した。酸化電流を０．１５Ｖで、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて測定し、還元電流を−０．４５Ｖで、最後のタイムポイント（４１６秒）にて測定した。各試料を重複してテストした。
【０１５１】
解析
各タイムポイントにおける、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定値の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１５２】
結果
２２４秒における応答グラジエント及び％ディファレンシエーションを以下の表に示す：
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドの使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。更に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少した。
【０１５５】
２５ｍＭ及び５０ｍＭにおいては、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシドは、ＨＤＬへの応答のグラジエントは増加させなかったが、ＬＤＬへの応答のグラジエントを減少させたので、ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションを増加させた。
【０１５６】
１００ｍＭでは、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドはＨＤＬとＬＤＬの両方への応答のグラジエントを減少させ、ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションの小さな増加を与えた。
【０１５７】
実施例１３：
本実施例の目的は、リパーゼ又はコレステロールエステラーゼのいずれかを用いて、スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）又はｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド（ＯＭＰ）を含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１５８】
緩衝溶液の調製
緩衝溶液は０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭメディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０１５９】
界面活性剤溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液を用いて、２倍強度の界面活性剤溶液を作製した。
スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（同仁堂、ＳＯ２１−１２）
２００ｍＭ（２１８μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２１７ｇ）
ｎ−オクチル マルトピラノシド（ＯＭＰ）（アナトレース、Ｏ３１０）
１００ｍＭ（２０９μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．００９５ｇ）
【０１６０】
酵素混合物
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えて、以下の最終濃度にすることにより、リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム）又はコレステロールエステラーゼ（ジェンザイム、シュードモナス・エスピー）のいずれかを有する酵素混合物を２倍強度で作製した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）又はコレステロールエステラーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１６１】
この溶液をＣｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて混合した。
【０１６２】
以下のリパーゼを用いて、更なる酵素混合物を４倍強度で作製した：
クロモバクテリウム・ビスコサム由来のリパーゼ（ジェンザイム、７０−１４６１−０１）
１００ｍＭ ＳＭＣ溶液 ８９ｕＬ中、０．００４８ｇ
シュードモナス・エスピー由来のリパーゼ（東洋紡、ＬＰＬ３１１）
ＲｕＡｃａｃ溶液 ９１ｕＬ中、０．００４９ｇ
【０１６３】
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えることにより、これらの酵素混合物を適宜希釈し、以下の最終濃度とした：
８．８ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
４．２ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
１３．５ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム）又はリパーゼ（東洋紡）
２２．２ｇ／ｍＬ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１６４】
最終酵素混合物
等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及び２倍濃度マルトシド溶液を１：１で混合し、単倍濃度の酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。更に、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合することにより、ブランク混合物を調製した。
４倍濃度の酵素はＲｕＡｃａｃ溶液及び界面活性剤溶液で希釈し、上に示したような最終濃度を得た。
【０１６５】
分注及び凍結乾燥
ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用い、各溶液０．４μｌ／ウェルをセンサに分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥させた。
【０１６６】
試料
テストは、事前に凍結させた血漿試料を用いて行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４００ｒｐｍで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１６７】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１２〜１５ｕＬの血漿試料を加えて、クロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間に遅延時間はなかった。各血漿試料を重複してテストした。
【０１６８】
解析
各タイムポイントでのＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬの測定値及びＨＤＬの測定値から得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１６９】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１７０】
【表６】
【０１７１】
リパーゼ又はコレステロールエステラーゼのいずれかを、界面活性剤ＳＭＣ又はＯＭＰと共に用いることにより、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが増加した。これらの界面活性剤を含有する全ての混合物において、界面活性剤を加えていないセンサと比べて、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少した。
【０１７２】
実施例１４
本実施例の目的は、種々のアルキル鎖長を有するｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１７３】
実施例１２の方法を繰り返したが、２倍強度のマルトシド溶液としては、以下を用いた：
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｄ３１０）
２００ｍＭ（１９４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１９８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｄ３２２）
２００ｍＭ（１９７μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１９０ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（シグマ−アルドリッチ、９４２０６）
２００ｍＭ（１７４μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１７３ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１７４】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１７５】
【表７】
【０１７６】
これらのｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドの使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。更に、これらのｎ−アルキル−β−Ｄ−マルトシドの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少した。
【０１７７】
実施例１５
本実験の目的は、スクロースミリステート又はスクロースカプレートを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。これらの界面活性剤は、モノ及びポリ置換スクロースエステルの混合物を含有する。これらの界面活性剤のＮＭＲ解析は、これらがスクロース分子あたり１．１アルキル鎖を含有することを示している。
【０１７８】
実施例１２の方法を繰り返したが、２倍強度マルトシド溶液の代わりに、以下の２倍強度界面活性剤溶液を用いた：
スクロースミリステート（同仁堂、Ｓ３３５）
１０％（２６０μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２６ｇ）
５％（１０％ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
２．５％（１０％ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
スクロースカプレート（同仁堂、Ｓ３３４）
１０％（２４８μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２４８ｇ）
５％（１０％ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
２．５％（１０％ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０１７９】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１８０】
【表８】
【０１８１】
スクロースカプレート又はスクロースミリステートの使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。更に、スクロースカプレート又はスクロースミリステートの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少する。
【０１８２】
実施例１６
本実験の目的は、広範な濃度のＳＭＣ又はＵＭＰで調製したセンサのＨＤＬへの応答の依存性を調べることであった。
【０１８３】
実施例１２の方法を繰り返したが、２倍強度マルトシド溶液の代わりに以下の２倍強度界面活性剤溶液を用いた：
スクロースモノカプレート（同仁堂、Ｓ０２１−１２）
６００ｍＭ（２５２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０７５１ｇ）
ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（シグマ−アルドリッチ、９４２０６）
６００ｍＭ（２５１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０７４９ｇ）
【０１８４】
希釈 ６００ｍＭストックの量 ＲｕＡｃａｃ溶液の量
４００ｍＭ ６０μｌ ３０μｌ
２００ｍＭ ３０μｌ ６０μｌ
１００ｍＭ １５μｌ ７５μｌ
５０ｍＭ １０μｌ １１０μｌ
２０ｍＭ ３μｌ ８７μｌ
【０１８５】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは以下の表の通りである：
【０１８６】
【表９】
【０１８７】
ＳＭＣの使用により、界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加する。更に、ＳＭＣの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントが減少する。最も大きなＨＤＬの応答のグラジエントのためには、ＳＭＣの最適量は２５〜１００ｍＭである。
【０１８８】
界面活性剤を加えていないセンサの応答に比べ、低濃度のＵＭＰにおいてＨＤＬへの応答のグラジエントは増加し、より高濃度のＵＭＰにおいては減少した。更に、ＵＭＰの濃度の全てにおいて、ＵＭＰの使用によって、ＬＤＬへの応答のグラジェントは減少する。ＨＤＬに対する％ディファレンシエーションは、全体として、全ての濃度において、ＵＭＰの使用によって、有意に増加する。最も大きなＨＤＬの応答のグラジエントのためには、ＵＭＰの最適量は１０〜５０ｍＭである。
【０１８９】
実施例１７
本実験の目的は、５％ｗ／ｖ ＳＭＣ（スクロースモノカプレート）及び種々のイオン性塩を用いて調製したセンサでのＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０１９０】
緩衝溶液
１０％ β−ラクトース（シグマ、Ｌ３７５０）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＰＨ９．０,３０ｍＭ ＫＯＨを含有する緩衝溶液を調製した。これを、０．１ｇ ＳＭＣを２．０ｍｌ ラクトース緩衝液に溶解することにより、５％ｗ／ｖ ＳＭＣ（同仁堂 ＳＯ２１−１２）溶液にした。０．０６７０ｇ ＲｕＡｃａｃを４．０８３ｍｌのＳＭＣ溶液に溶解することにより、単倍強度のＲｕＡｃａｃ（Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］）溶液を作製した。この溶液を、アコースティックミキサーを用いて、混合した。
【０１９１】
２倍濃度酵素溶液
事前調製した３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えることにより、酵素溶液を２倍濃度で作製した。該酵素溶液は以下を含有していた：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、１４６１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１９２】
この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて、混合した。
【０１９３】
イオン性塩溶液
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液にイオン性塩を加えることにより、イオン性塩溶液を２倍濃度で以下の通りに調製した：
ＬｉＣｌ（アルドリッチ、２１、３２３−３）
１．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液：０．０３７９ｇをＲｕＡｃａｃ溶液５９５μＬに溶解した。
１Ｍ ＬｉＣｌ溶液：１．５ｍＭ ＬｉＣｌ溶液１００μＬをＲｕＡｃａｃ溶液５０μＬと混合した。
０．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液：１．５ｍＭ ＬｉＣｌ溶液５０μＬをＲｕＡｃａｃ溶液１００μＬと混合した。
ＮａＣｌ（シグマ、Ｓ−７６５３）
１Ｍ ＮａＣｌ溶液：０．０１１８グラムをＲｕＡｃａｃ溶液２０１．７μＬに溶解した。
１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液：１Ｍ ＮａＣｌ溶液及びＲｕＡｃａｃ溶液を１：９の量比で混合した。
ＭｇＣｌ２（シグマ、Ｃ−４９０１）
５６０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液：０．０４６１グラムをＲｕＡｃａｃ溶液４０３μＬに溶解した。
ＣａＣｌ２（シグマ、Ｍ２６７０）
５００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：０．０１１１グラムをＲｕＡｃａｃ溶液２００μＬに溶解した。
２５０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液：５００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液及びＲｕＡｃａｃ溶液を１：１の量比で混合した。
Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）
１２０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：０．０２５３グラムをＲｕＡｃａｃ溶液８０９μＬに溶解した。
３０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３：１２０ｍＭ Ｃｒ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液３７．５μＬをＲｕＡｃａｃ溶液１１２．５μＬと混合した。
【０１９４】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びイオン性塩溶液を１：１で混合し、酵素／イオン性塩の最終混合物を得た。更に、イオン性塩実験の各セットにつき、等量（約５０ｕｌ）ずつの２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用いて、０．４μｌ／ウェルの各溶液を、センサへ分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。
【０１９５】
試料
事前に凍結させた血漿試料を用いて、テストを行った。これらを最低３０分間解凍してから、１４００ｒｐｍで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。これらの試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１９６】
テストプロトコル
血漿試料を用いてセンサをテストした。該センサに１２〜１５ｕＬの血漿試料を加えて、クロノアンペロメトリーテストを行った。これにより、１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。トランジェントの長さは４秒間で、各酸化の間の遅延時間はなかった。各血漿試料を重複してテストした。
【０１９７】
解析
各タイムポイントにおける、ＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０１９８】
結果
酵素混合物中でイオン性塩を使用することで、センサ応答にかかる時間の量が減少し、ＨＤＬへの応答の最大のグラジエントとなることが分かった。センサ型がＨＤＬへの応答の最大のグラジエントを与えたタイムポイントを以下の表に示す：
【０１９９】
【表１０】
【０２００】
時間に対するＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを、ＬｉＣｌを用いて又は用いずに調製したセンサに関して、図１０に示す。
【０２０１】
イオン性塩の添加は、概しては、５％ ＳＭＣを用いて調製したＨＤＬセンサにおいて、より早いＨＤＬへの応答速度をもたらした。
【０２０２】
実施例１８
本実験の目的は、種々のアルキル鎖長を持つスクロースエステルを含有するセンサの、ＨＤＬへの応答を調べることであった。
【０２０３】
緩衝溶液の調製
緩衝溶液は、０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖ β−ラクトースを含有していた。１０％ ラクトース緩衝液を用いて、３０ｍＭ メディエーター（メディエーター＝Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２））溶液を作製した。この溶液をＣｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて混合したが、１０秒の１サイクルを強度０．５でバーストあたり５０サイクルで用い、そして６０秒の３サイクルを強度５でサイクルあたり１００バーストで用いた。
【０２０４】
スクロースエステル溶液
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液にスクロースエステルを加えて以下の濃度にすることにより、２倍強度のスクロースエステル溶液を作製した：
スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（同仁堂、Ｓ０２１−１２）
２００ｍＭ（２０２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２０１ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−オクタノイルスクロース（ＳＭＯ）（カルビオケム、４９４４６６）
２００ｍＭ（２０１μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０１８８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
ｎ−ドデカノイルスクロース（ＳＭＤ）（カルビオケム、３２４３７４）
２００ｍＭ（２０２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中、０．０２０１ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ ストック５０μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液５０μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ ストック２５μｌ＋ＲｕＡｃａｃ溶液７５μｌ）
【０２０５】
酵素混合物
事前調製したＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加えて以下の最終濃度にすることにより、酵素混合物を２倍強度で作製した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ リパーゼ（ジェンザイム、クロモバクテリウム・ビスコサム由来））
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０２０６】
この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを用いて混合し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ−ｓｅｒｉｅｓ ＳｏｎｏＬａｂ−Ｓ１ソフトウェア−プログラムＨＤＬ４℃を用いた。
【０２０７】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液につき、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びスクロースエステル溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。更に、等量（約５０ｕｌ）ずつの２倍濃度酵素溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を混合して、ブランク混合物を調製した。ＷＯ ０３０５６３１９に記載の通りに、電動ピペットを用いて、０．４μｌ／ウェルの各溶液をセンサ上へ分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。
【０２０８】
血漿試料
血漿試料を３０分間解凍してから、２９００ＲＣＦで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として用いた。試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０２０９】
テストプロトコル
１２〜１５μｌの血漿試料を電極ごとに用いた。血漿を加えて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、酸化電流を＋０．１５Ｖで測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、還元電位を−０．４５Ｖで測定した。各血漿試料を重複してテストした。
【０２１０】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ及びＬＤＬへの応答のグラジエントを用いて、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定結果の間で得られる％ディファレンシエーションを計算した。
【０２１１】
結果
２２４秒における応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションは、以下の表の通りである：
【０２１２】
【表１１】
【０２１３】
スクロースエステルの使用により、界面活性剤を加えていないセンサ応答に比べ、ＨＤＬへの応答のグラジエント及び％ディファレンシエーションが有意に増加した。更に、スクロースエステルの使用により、ＬＤＬへの応答のグラジエントは減少した。
【０２１４】
実施例１９
溶液の調製、分注及び凍結乾燥
基本の酵素混合物は同一であるが、異なる酵素混合物を用いて、最終の成分濃度が以下のようになるようにして、いくつかの溶液を調製した：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０
３０ｍＭ ＫＣｌ
１００ｍｇ／ｍｌ ラクトース
界面活性剤（界面活性剤なし（０ｍｇ／ｍｌ）、４０ｍＭ スクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）（２０ｍｇ／ｍｌ）、１００ｍＭ ＳＭＤ（５０ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍＭ スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（３０ｍｇ／ｍｌ）若しくは１００ｍＭ ＳＭＣ（５０ｍｇ／ｍｌ）
３０ｍＭ ルテニウムＡｃＡｃメディエーター（Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］）
６ｍｇ／ｍｌ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３ｍｇ／ｍｌ ジェンザイムリパーゼ（Ｇ．Ｌｉｐ）
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ
【０２１５】
ＷＯ ０３５６３１９に記載の通りに、ウェルあたり０．４ｕｌの溶液を、センサ上に分注した。センサを凍結乾燥した。
【０２１６】
テストプロトコル
２０ｕｌの血漿を各電極に添加した。ｔ＝０秒にて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。３４秒の連続した時間間隔で４秒間、３４０秒の期間、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、続いて４秒間、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。酸化の間には３４秒の遅延があり、その結果、約０、３４、６８、１０２、１３６、１７０、２０４、２３８、２７２、３０６及び３４０秒における酸化であった。トランジェントでの４秒における電流値に関して、データを解析した。
【０２１７】
結果を図１１から１４並びに表１２及び１３に示す：
【０２１８】
【表１２】
【０２１９】
【表１３】
【０２２０】
実施例２０：
溶液の調製、分注及び凍結乾燥
基本の酵素混合物は同一であるが、異なる酵素混合物を用いて、最終の成分濃度が以下のようになるようにして、いくつかの溶液を調製した：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０
５０ｍｇ／ｍｌ （５％）グリシン
界面活性剤（０％ ＳＭＣ又は界面活性剤なし（０ｍｇ／ｍｌ）、５％ スクロースモノカプレート（ＳＭＣ）（５０ｍｇ／ｍｌ）、７．５％ ＳＭＣ（７５ｍｇ／ｍｌ）又は１０％（１００ｍｇ／ｍｌ））
８０ｍＭ 塩化ルテニウムヘキサアミン（Hexaamine）
６ｍｇ／ｍｌ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３ｍｇ／ｍｌ ジェンザイムリパーゼ
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ
【０２２１】
ＷＯ ２００３５６３１９に記載の通りに、ウェルあたり０．４ｕｌの溶液をセンサ上に分注した。センサを凍結乾燥した。
【０２２２】
テストプロトコル
脱脂血清中で調製した２０ｕｌのＳｃｉｐａｃ ＨＤＬ又はＬＤＬを各電極に添加した。Ａｕｔｏｌａｂ及びマルチプレクサーを用いて、クロノアンぺロメトリーにより、電極をテストした。ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリーはテストされた。１４秒の連続した時間間隔で１秒間、１４０秒の期間、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、続いて１秒間、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、その結果、約０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒における酸化であった。トランジェントでの１秒における電流値に関して、データを解析した。
【０２２３】
結果を図１５及び１６並びに表１４に示す。
【０２２４】
【表１４】
【０２２５】
実施例２１
溶液の調製、分注及び凍結乾燥
基本の酵素混合物は同一であるが、異なる酵素混合物を用いて、最終の成分濃度が以下のようになるようにして、いくつかの溶液を調製した：
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０
５０ｍｇ／ｍｌ （５％）グリシン
界面活性剤（０％ ＳＭＤ又は界面活性剤なし（０ｍｇ／ｍｌ）、０．５％ スクロースモノドデカノエート（ＳＭＤ）（５ｍｇ／ｍｌ）、１．０％ ＳＭＤ（１０ｍｇ／ｍｌ）又は１．５％（１５ｍｇ／ｍｌ））
８０ｍＭ 塩化ルテニウムヘキサアミン（Hexaamine）
６ｍｇ／ｍｌ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３ｍｇ／ｍｌ ジェンザイムリパーゼ
２２．２ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ
【０２２６】
ＷＯ ２００３５６３１９に記載の通りに、ウェルあたり０．４ｕｌの溶液をセンサ上に分注した。センサを凍結乾燥した。
【０２２７】
テストプロトコル
脱脂血清中で調製した２０ｕｌのＳｃｉｐａｃ ＨＤＬ又はＬＤＬを各電極に添加した。Ａｕｔｏｌａｂ及びマルチプレクサーを用いて、クロノアンペロメトリーにより電極をテストした。ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリーテスト（tested）を開始した。１４秒の連続した時間間隔で１秒間、１４０秒の期間、＋０．１５Ｖで酸化電位を測定し、続いて１秒間、−０．４５Ｖで還元電位を測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、その結果、約０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒における酸化であった。トランジェントでの１秒における電流値に関して、データを解析した。
【０２２８】
結果を図１７及び１８並びに表１５に示す。
【０２２９】
【表１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤であって、スクロースエステル類及びマルトシド類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法。
【請求項２】
界面活性剤（ａ）が、少なくとも５０％を下回る、式（ｉ）：
【数１】
［式中、測定（ＨＤＬコレステロール）又は測定（ＬＤＬコレステロール）は、それぞれＨＤＬ又はＬＤＬコレステロール濃度に関係する測定値である］で与えられるＬＤＬに対するＨＤＬのディファレンシエーションを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤が（ｉ）１以上のＨＯ−基が独立してＲＣＯＯ−基［式中、Ｒは最大１８個の炭素原子を有するアルキル基又はアルケニル基である］で置換されているスクロース部分を含むスクロースエステルであるか、又は（ｉｉ）式（ＩＩ）
【化１】
［式中、Ｒは最大１８個の炭素原子を有するアルキレン基又はアルケニレン基であり、且つＡはメチル基又は４〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基である］のβ−マルトシドであるか、若しくは対応するα−マルトシドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が、スクロースモノカプレート、シクロヘキシルブチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−４）又はシクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−５）である、請求項１〜３のうちの１項に記載の方法。
【請求項５】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量が、試料を（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させること、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロール量を決定することによって測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量を、電気化学的技法によって測定する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料を
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ）補酵素；及び
（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；
と反応させること、
並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コレステロールエステル加水分解試薬がリパーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料を、更に（ｆ）レダクターゼと反応させる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
試料を、界面活性剤（ａ）、コレステロールエステル加水分解試薬（ｂ）及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ（ｃ）と同時に反応させる、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
高密度リポタンパク質を含有する試料が全血であり、且つ方法が、赤血球を除去するために、試料を濾過する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量の測定が、試料の界面活性剤との反応から３分以下の時間内で完了される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において使用するための試薬混合物であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定した通りの、高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤；
（ｂ）請求項７又は８において規定した通りのコレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含む、試薬混合物。
【請求項１４】
（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び任意に（ｆ）レダクターゼを更に含む、請求項１３に記載の試薬混合物。
【請求項１５】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定した通りの、高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤、（ｂ）請求項７又は８において規定した通りのコレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに任意に（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤、及び（ｆ）レダクターゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段のうちの１つ以上、を含む、キット。
【請求項１６】
コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段が
− 作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；
− セルに電位を印加するための電源；並びに
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上が、単一の試薬混合物の形態で存在する、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
試薬混合物が乾燥した形態である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項において規定した通りのキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上と、（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び電極と接触させること；
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成された生成物量を電気化学的に検出すること
を含む、方法。
【請求項２０】
段階（ｉｉｉ）が、試料を試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と接触させた時点から最大３分以内の時間で完了される、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、試料を（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤であって、スクロースエステル類及びマルトシド類から選ばれる界面活性剤と反応させること、並びに高密度リポタンパク質中のコレステロール量を測定することを含む、方法。
【請求項２】
界面活性剤（ａ）が、少なくとも５０％を下回る、式（ｉ）：
【数１】
［式中、測定（ＨＤＬコレステロール）又は測定（ＬＤＬコレステロール）は、それぞれＨＤＬ又はＬＤＬコレステロール濃度に関係する測定値である］で与えられるＬＤＬに対するＨＤＬのディファレンシエーションを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤が（ｉ）１以上のＨＯ−基が独立してＲＣＯＯ−基［式中、Ｒは最大１８個の炭素原子を有するアルキル基又はアルケニル基である］で置換されているスクロース部分を含むスクロースエステルであるか、又は（ｉｉ）式（ＩＩ）
【化１】
［式中、Ｒは最大１８個の炭素原子を有するアルキレン基又はアルケニレン基であり、且つＡはメチル基又は４〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基である］のβ−マルトシドであるか、若しくは対応するα−マルトシドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が、スクロースモノカプレート、シクロヘキシルブチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−４）又はシクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−５）である、請求項１〜３のうちの１項に記載の方法。
【請求項５】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量が、試料を（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させること、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロール量を決定することによって測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量を、電気化学的技法によって測定する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料を
（ａ）高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤；
（ｂ）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ）補酵素；及び
（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；
と反応させること、
並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コレステロールエステル加水分解試薬がリパーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料を、更に（ｆ）レダクターゼと反応させる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
試料を、界面活性剤（ａ）、コレステロールエステル加水分解試薬（ｂ）及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ（ｃ）と同時に反応させる、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
高密度リポタンパク質を含有する試料が全血であり、且つ方法が、赤血球を除去するために、試料を濾過する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高密度リポタンパク質中のコレステロール量の測定が、試料の界面活性剤との反応から３分以下の時間内で完了される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法において使用するための試薬混合物であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定した通りの、高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤；
（ｂ）請求項７又は８において規定した通りのコレステロールエステル加水分解試薬；及び
（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含む、試薬混合物。
【請求項１４】
（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び任意に（ｆ）レダクターゼを更に含む、請求項１３に記載の試薬混合物。
【請求項１５】
高密度リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、（ａ）請求項１〜４のいずれか１項において規定した通りの、高密度リポタンパク質を選択的に分解し、且つ任意に低密度リポタンパク質の反応を弱める界面活性剤、（ｂ）請求項７又は８において規定した通りのコレステロールエステル加水分解試薬、及び（ｃ）コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに任意に（ｄ）補酵素、（ｅ）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤、及び（ｆ）レダクターゼ、並びにコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段のうちの１つ以上、を含む、キット。
【請求項１６】
コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応するコレステロールの量を測定するための手段が
− 作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セル；
− セルに電位を印加するための電源；並びに
− 結果生じる電気化学的応答を測定するための測定機器
を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上が、単一の試薬混合物の形態で存在する、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
試薬混合物が乾燥した形態である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項において規定した通りのキットを使用する方法であって、
（ｉ）（１）試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意に（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうちの１つ以上と、（２）高密度リポタンパク質を含有する試料とを、互いに、及び電極と接触させること；
（ｉｉ）電気化学セルに電位を印加すること；及び
（ｉｉｉ）結果生じる電気化学的応答を測定することによって、形成された生成物量を電気化学的に検出すること
を含む、方法。
【請求項２０】
段階（ｉｉｉ）が、試料を試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と接触させた時点から最大３分以内の時間で完了される、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００９−５３７０１９（Ｐ２００９−５３７０１９Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１０５３４（Ｐ２００９−５１０５３４）
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１７６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２２２３
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００４７２３２７）オックスフォード バイオセンサーズ リミテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１７６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２２２３
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００４７２３２７）オックスフォード バイオセンサーズ リミテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
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