配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブ。このオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブは、遺伝子のメチル化状態の検出に有用である。このオリゴヌクレオチドには、癌の診断及び治療における用途が見出される。

【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の発現の検出に関する。より詳細には、本発明は、メチル化型又は非メチル化型のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を検出する方法及び関連するオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、プライマー対及びキットに関する。本発明の方法は、増幅技術、特に、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ法及びエンドポイントＰＣＲ法に関し、診断、予後及び治療的有用性を有する。
【発明の背景】
【０００２】
癌精巣（ＣＴ）抗原
【０００３】
癌精巣（ＣＴ）抗原は、通常は発現が精巣、卵巣内の生殖細胞又は栄養膜細胞に限定される一クラスの腫瘍関連抗原である。ＣＴ抗原は、成体体細胞組織では普通発現されていない（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、５（８）：６１５〜６２５（２００５）；Ｓｃａｎｌａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１８８：２２〜３２（２００２）；Ｓｃａｎｌａｎら、Ｃａｎｅ．Ｉｍｍｕｎ．、４：１〜１５（２００４））。
【０００４】
癌患者ではＣＴ抗原の遺伝子制御が損なわれ、多種多様な腫瘍におけるＣＴ抗原の異常発現を導く。同定される第１のＣＴ抗原であるＭＡＧＥ−１は、１９９０年代前半にＴ細胞のエピトープのクローニングによって同定された（参照により組み込まれている、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３；２５４（５０３８）：１６４３〜７；ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３〜１６４７；Ｔｒａｖｅｒｓａｈら、１９９２ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３５（３）：１４５〜１５２；及び米国特許第５，３４２，７７４号）。それ以来、血清学的な発現クローニング技術（ＳＥＲＥＸ）（Ｓａｈｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２（２５）：１１８１０〜１１８１３（１９９５）及び米国特許第５，６９８，３９６号）、酵母表面での組換え抗原発現（ＲＡＹＳ）（Ｍｉｓｃｈｏら、Ｃａｎｅ．Ｉｍｍｕｎ．、３：５〜１６（２００３））及び示差的なｍＲＮＡ発現解析（Ｇｕｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｅ、８５（５）：７２６〜７３２（２０００））により、さらに多くのＣＴ抗原が同定された。いくつかのＣＴ抗原は、癌患者において免疫原性があるため、腫瘍ワクチン開発のための絶好の標的となっている。
【０００５】
免疫系の細胞性エフェクター又は体液性エフェクターによって認識される腫瘍関連抗原の同定は、癌免疫療法に新たな展望を開いた。免疫療法の概念は、自己免疫系を利用した治療法において、腫瘍内で発現される抗原タンパク質を標的として使用できるという仮定に基づいている。抗原特異的癌免疫治療薬（Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＡＳＣＩ）は、標的化された治療を可能にする。ＡＳＣＩは、免疫応答を癌細胞に対して特異的に導くための「腫瘍抗原」と、抗腫瘍免疫応答を高めるために選択される免疫賦活化合物を含む「アジュバント系」との２つの主な要素を有する。
【０００６】
ＣＴＡＧ１Ｂ。癌免疫療法における使用に現在関心が持たれている癌精巣抗原（ｃａｎｃｅｒ ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ）は、ＣＴＡＧ１Ｂ遺伝子（遺伝子の別名ＮＹ−ＥＳＯ−１のもとでも知られている）によってコードされる癌／精巣抗原１Ｂである。この抗原は、９０年代後半にＬｕｄｗｉｇ癌研究所のＮｅｗ Ｙｏｒｋ支部で、食道扁平上皮癌でＳＥＲＥＸによって最初に同定された（参照により組み込まれている、Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９４（５）：１９１４〜１９１８（１９９７）；及び米国特許第５，８０４，３８１号）。ＣＴＡＧ１Ｂタンパク質は、長さが１８０アミノ酸であり、卵巣癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌を含むがこれらに限定されない多種多様な腫瘍内及び黒色腫内で見出されている。（Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｊら、Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．２００４年５月；１１（５）：１０６３〜７；Ｎｉｃｈｏｌａｏｕ Ｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６年６月；８４（３）：３０３〜１７；Ｓｕｇｉｔａ Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４年３月 １５；６４（６）：２１９９〜２０４；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ＥＦら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．２００７年７月 １２；７：１１及びＪｕｎｇｂｌｕｔｈら、２００１ 、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｅ、９２（６）：８５６〜８６０）。ＣＴＡＧ１Ｂ陽性腫瘍を有する患者における、この抗原に対する自発的な体液性免疫応答及び細胞性免疫応答が記載されており、いくつかのＨＬＡ（ヒト白血球抗原）のクラスＩ及びクラスｌｌの拘束性ペプチドが同定されている（Ｊａｇｅｒら、１９９８ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８７（２）：２６５〜２７０；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２００４ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．、１０（３）：８９０〜９６１；及びＤａｖｉｓら、２００４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（２９）：１０６９７〜１０７０２）。例示的な特許文献は、米国特許第６，１４０，０５０号；第６，２５１，６０３号；第６，２４２，０５２号；第６，２７４，１４５号；第６，３３８，９４７号；第６，４１７，１６５号；第６，５２５，１７７号；第６，６０５，７１１号；第６，６８９，７４２号；第６，７２３，８３２号；第６，７５６，０４４号；及び第６，８００，７３０号であり、全てが参照により組み込まれている。
【０００７】
臨床試験では、ＨＬＡ−Ａ２（１５７〜１６７、１５７〜１６５及び１５５〜１６３）に対する結合モチーフを有する、部分的に重なっている３種類のＣＴＡＧ１Ｂ由来のペプチドをワクチン中に使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する転移性の腫瘍を有する１２名の患者が治療されている。この試験により、合成ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、安全に投与することが可能であり、有益となり得るＴ細胞応答を引き起こす能力のあることが実証された（Ｊａｇｅｒら、２０００ ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９７（２２）：１２１９８〜１２２０３）。
【０００８】
ＣＴＡＧ１Ｂタンパク質中のいくつかのＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）のクラスＩ及びクラスＩＩのエピトープが、別々のグループによって同定されている。Ｎ末端にあるコラーゲン様領域は、本明細書中でＡ３１と称する少なくとも１個のＭＨＣクラスＩエピトープを含む。中央領域は、本明細書中でＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ４、ＤＲ７及びＤＰ４と称するいくつかのＭＨＣクラス２エピトープを含む。中央領域は、本明細書中でＢ３５、Ｂ５１、Ｃｗ３及びＣｗ６と称するいくつかのＭＨＣクラスＩエピトープも含む。Ｃ末端は、少なくとも２個のクラスＩＩエピトープ（ＤＲ４及びＤＰ４）及び１個のクラスＩエピトープ（Ａ２）を含むと考えられている。
【０００９】
ＣＴＡＧ２。ＣＴＡＧ１との配列類似性が高いために、免疫療法への関心が持たれ得るさらなる癌精巣抗原は、ＣＴＡＧ２（遺伝子の別名ＬＡＧＥ−１としても知られている）である。ＬＡＧＥ−ＩａとＬＡＧＥ−Ｉｂ、２種類のＣＴＡＧ２転写産物が記載されている。ＬＡＧＥ−Ｉｂは不完全にスプライシングを受けて約２１０アミノ酸残基の推定タンパク質をコードするが、ＬＡＧＥ−Ｉａ遺伝子の産物は１８０アミノ酸残基を含む（Ｓｕｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００６：５５：６４４〜６５２）。
【００１０】
ＬＡＧＥ−１とＮＹ−ＥＳＯ−１のタンパク質のＮ末端領域は、高度に保存されており、９７％を超える同一性を有すると考えられている。しかし、中央領域では、ＬＡＧＥ−１はＮＹ−ＥＳＯ−１とは異なり、６２％のみが同一である。ＮＹ−ＥＳＯ−１とＬＡＧＥ−ＩａのＣ末端は、高度に保存されている（９７％を超える同一性）。しかし、ＬＡＧＥ−ＩｂのＣ末端は、より長く、ＬＡＧＥ−１ａ／ＮＹ−ＥＳＯ−１の同領域と５０％未満の同一性を有すると考えられている。
【００１１】
これらの２種類のタンパク質に関する一般情報は、ＬＩＣＲウェブサイトから入手可能である（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ＣＴｄａｔａｂａｓｅを参照されたい）。
【００１２】
ＰＲＡＭＥ。選択的に発現される黒色腫の抗原であるＰＲＡＭＥは、黒色腫反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識されるヒトの黒色腫抗原をコードする遺伝子として最初に単離された。ＰＲＡＭＥは、その子宮内膜及び副腎を含むいくつかの正常成体組織における微量な発現のために、ＣＴ遺伝子とは呼ばれていない。しかし、ＰＲＡＭＥは、ＣＴ遺伝子の他の主要な特徴、すなわち、精巣内での強い発現及び黒色腫（９７％）、肉腫（８０％）、小細胞肺癌（７０％）、腎細胞癌（４０％）、及び頭頸部癌（２９％）を含む多様な腫瘍内での上方制御を示す。この遺伝子について、同一のタンパク質をコードする、５つの選択的スプライスによる転写バリアントが観察されている。その５０９アミノ酸の推定タンパク質は、ＨＬＡ＿Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２分子上に提示される、よく特徴付けされたエピトープを有する。
【００１３】
ＭａｇｅＡ３。ＭＡＧＥ遺伝子は、癌／精巣抗原のファミリーに属する。ＭＡＧＥファミリーの遺伝子は２０を超えるメンバーを含み、ＭＡＧＥ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ遺伝子からなる（Ｓｃａｎｌａｎら、（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１８８：２２〜３２；Ｃｈｏｍｅｚら、（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（１４）：５５４４〜５１）。これらの遺伝子は、Ｘ染色体上にクラスターを形成しており（Ｌｕｃａｓら、１９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８．７４３〜７５２；Ｌｕｃａｓら、１９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：４１００〜４１０３；Ｌｕｃａｓら、２０００ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８７：５５〜６０；Ｌｕｒｑｕｉｎら、１９９７ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：３９７〜４０８；Ｍｕｓｃａｔｅｌｌｉら、１９９５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：４９８７〜４９９１；Ｐｏｌｄら、１９９９ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５９：１６１〜１６７；Ｒｏｇｎｅｒら １９９５ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：７２５〜７３１）、依然として不明確な機能を有する（Ｏｈｍａｎら ２００１ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６５（２）：１８５〜９４）。ＭＡＧＥ遺伝子は相同性が高く、特に、ＭＡＧＥ−Ａファミリーのメンバーは、６０〜９８％の間の相同性を有する。
【００１４】
ヒトのＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子は、黒色腫（Ｆｕｒｕｔａら、２００４ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５、９６２〜９６８．）、膀胱癌、肝細胞癌（Ｑｉｕら、２００６．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９、２５９〜２６６）、胃癌（Ｈｏｎｄａら、２００４ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９０、８３８〜８４３）、大腸癌（Ｋｉｍら、２００６ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２、５６５１〜５６５７）及び肺癌（ＮＳＣＬＣ）（Ｓｃａｎｌａｎら ２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１８８：２２〜３２；Ｊａｎｇら ２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１、２１：７９５９〜７９６３）を含む、多様な種類の腫瘍において発現される。精巣生殖細胞又は胎盤のみを例外として、いずれの正常成体組織においても発現が観察されていない。（Ｈａａｓら、１９８８ Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８：４７〜５１；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３４７８〜３８２）。
【００１５】
免疫療法から恩恵を受けるであろう、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥを発現している患者を特異的に特定すること、用量の目的でＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥの発現のモニタリングを行うこと、臨床試験においてＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥを発現している試料を特定すること、又は単に癌を有する患者を早期に特定することができる、定量的な高処理アッセイがあることは重要である。いくつかの適用可能な診断法が記載されており、これらは、ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲを応用する（例えば、以下の中に：Ｏｄｕｎｓｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３、６０７６〜６０８３、２００３；Ｓｈａｒｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第３巻、１９ページ、２００３）。
【００１６】
既存のアッセイの最大に不利な点は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥの発現を評価するのにＲＮＡの単離を必要とすることである。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織は、臨床センター内で腫瘍組織を保存する通常の方法である。ホルマリン中での固定は、組織内のＲＮＡ分子の構造を変化させ、架橋、そして部分的な分解も引き起こす。この部分的な分解は、１００〜３００塩基対の間の、ＲＮＡのより小さな断片が生じることを導く。ＲＮＡに対するこうした構造的変化は、ＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡのＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、及び／又はＰＲＡＭＥの発現レベルを測定するための使用を制限する。
【００１７】
遺伝子メチル化
【００１８】
遺伝子メチル化は、遺伝子発現の重要な制御因子である。特に、特定の遺伝子のプロモーター領域中のＣｐＧジヌクレオチド対の中に見出されるシトシン残基におけるメチル化は、遺伝子発現の下方制御を通して多くの病態の原因となり得る。例えば、腫瘍抑制遺伝子の異常なメチル化は、それらの遺伝子の上方制御又は下方制御を導くことがあり、したがって、多くの癌の存在及び成長と関連している（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００５ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８３：２９６〜３２１）。異常な遺伝子メチル化のパターンは、由来する組織に特異的であることが多い。したがって、特定の遺伝子のメチル化状態の検出は、予後及び診断に有用である可能性があり、疾患の相対的段階の決定、さらには特定の種類の療法に対する反応性の予測の双方に使用することができる（Ｌａｉｒｄ．２００３ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：２５３〜２６６）。
【００１９】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、及び／又はＰＲＡＭＥのメチル化状態は、癌組織においてある程度まで研究されている。ＤＮＡメチル化は、慢性骨髄性白血病（ＣＬＭ）におけるＰＲＡＭＥ遺伝子の高発現の直接的な原因となる分子機構であることが示唆されている。ＰＲＡＭＥのプロモーター、エキソン１及びエキソン２の解析により、ＰＲＡＭＥは、以下の３つのＣｐＧアイランドを有することが明らかにされている：プロモーター内に位置する２０１ｂｐのアイランド、エキソン１内にある２０４ｂｐのアイランド及びエキソン２内にある３１０ｂｐのアイランド、このうちエキソン２にあるＣｐＧアイランドのみがエピジェネティック制御を示した（Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（２００７）１５２１〜１５２８）。ＤＮＡメチル化についてのＤＮＡ−トランケーション／トランスフェクション試験との組み合わせで、ＰＲＡＭＥの制御領域の規定の部分におけるメチル化パターンの変化は、通常はＰＲＡＭＥ遺伝子を発現していない細胞におけるＰＲＡＭＥの上方制御に十分であることも示されている。
【００２０】
ＬＡＧＥ−１のメチル化状態も研究されている（Ｄｅ Ｓｍｅｔら、（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：７３２７〜７３３５）。ＬＡＧＥ−１とＬＡＧＥ−２／ＮＹ−ＥＳＯ−１は配列類似性が高いので、これら２つの遺伝子のプロモーター配列のメチル化状態を識別するのは困難となっている。
【００２１】
ゲル上での結果の可視化を伴うメチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ、ＭＳＰ）（ゲルベースのＭＳＰアッセイ）は、他の技術を使用した定量的な試験が開発されているにもかかわらず（Ｌａｉｒｄ ＰＷ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００３；３：２５３〜６６；Ｅａｄｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００；２８：Ｅ３２；Ｍｉｋｅｓｋａ Ｔら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２００７）、遺伝子のエピジェネティックサイレンシングを決定するために広く使用されている（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：３２２５〜９．）。
【００２２】
蛍光に基づくいくつかの技術は、核酸増幅反応のリアルタイムモニタリングに利用できる。こうした技術の１つは、米国特許第６，０９０，５５２号及び欧州特許第０９１２５９７号に記載され、アンプリフルオル（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）（登録商標）として商業的に知られている。この方法は、核酸増幅反応のエンドポイントモニタリングにも適している。Ｖｌａｓｓｅｎｂｒｏｅｃｋら（Ｖｌａｓｓｅｎｂｒｏｅｃｋら、２００８．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎ．、第１０巻、第４号）は、アンプリフルオル（登録商標）技術を使用した、標準化された直接的なリアルタイムのＭＳＰアッセイを記載している。
【００２３】
本発明の一目的は、既存のアッセイの不利な点を排除した改良されたアッセイを提供することである。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、発現を測定する改良された方法及び／又はアッセイに関する。本発明はさらに、特定の種類の療法、特に、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、プライマー対、キット及び／又は方法を使用して、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を発現しているとして特定された患者の抗原特異的癌免疫治療薬（ＡＳＣＩ）に基づく治療に関する。ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３（タンパク質）の発現は、その遺伝子自体の発現レベルを測定するよりもむしろ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を決定することによって検出される。本発明者は、本発明者のメチル化試験のメチル化状態の結果は、ＮＳＣＬＣ、黒色腫及び乳癌の試料におけるＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥの発現について、ＲＴ−ＰＣＲアッセイで得られる結果と良く一致していることを示している。ｑＲＴ−ＰＣＲが困難であることが立証されている、例えば非小細胞肺癌からの細針生検などの試料の場合には、ＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を決定することによって検出されるタンパク質発現が有用な代替を提供する。したがって、該アッセイは、治療に（適する）患者を選出すること、患者の治療に成功する可能性を予測することに有用であり、アッセイを使用して患者の療法選択を補助することができる。
【００２５】
一態様において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、又は該配列から本質的になる、又は該配列からなるオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブを提供し、オリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブは、遺伝子のメチル化状態の検出に有用である。
【００２６】
オリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブは、好ましくは、５’から３’の順に、以下の連続した配列：
（ａ）約６〜３０ヌクレオチドの間の第１のヌクレオチド配列であって、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドが、分子エネルギー移動対のドナー部分及びアクセプター部分から選択される第１の部分で標識され、ドナー部分が、励起されると１種又は複数の特定の波長で蛍光を放出し、アクセプター部分が、ドナー部分によって放出される蛍光を吸収及び／又は消光する、第１のヌクレオチド配列、
（ｂ）約３〜２０の間のヌクレオチドを含む、該ヌクレオチドから本質的になる、又は該ヌクレオチドからなる第２の一本鎖ヌクレオチド配列、
（ｃ）約６〜３０の間のヌクレオチドを含む、該ヌクレオチドから本質的になる、又は該ヌクレオチドからなる第３のヌクレオチド配列であって、第３のヌクレオチド配列中のヌクレオチドが、ドナー部分及びアクセプター部分から選択される第２の部分で標識され、第２の部分が、前記群のうち第１のヌクレオチド配列を標識していない方であり、第３のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列と逆の順に相補的であることにより、第１のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列との二重鎖を形成することができ、それにより、第１の部分と第２の部分とが近接していることによって、ドナー部分が励起されて蛍光を放出すると、アクセプター部分がドナー部分によって放出される蛍光を吸収して消光する、第３のヌクレオチド配列、及び
（ｄ）プライマーの３’末端に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６２及び６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を３’末端に含む約８〜４０の間のヌクレオチドを含む、該ヌクレオチドから本質的になる、又は該ヌクレオチドからなる第４の一本鎖ヌクレオチド配列
を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなり、
二重鎖が形成されない場合、第１の部分と第２の部分とが、第１の部分と第２の部分との間の分子エネルギー移動を妨げる距離で分離される。
【００２７】
３’末端の特定のヌクレオチド配列は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を決定できるようにする。これらのプライマーは、（本明細書で述べている）適切な試薬での処理後に非メチル化型のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子に選択的に結合する。これらのオリゴヌクレオチドの性質については本明細書に述べており、その説明は準用される。この特異的ヌクレオチド配列は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３ファミリー遺伝子のメチル化されている又はメチル化されていないＤＮＡの一部を含む核酸鎖と相補的なヌクレオチド配列の、核酸ポリメラーゼによる合成を開始させることができる。
【００２８】
最も好ましくは、オリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１又は６１のヌクレオチド配列からなり、目的遺伝子の一部を増幅するために使用される。
【００２９】
さらに提供されるのは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、又は該配列から本質的になる、又は該配列からなるプライマーを含むプライマー対である。好適なプライマー対は、（本明細書で述べている）関連遺伝子の適切な部分の増幅を目的としたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーに基づき、当業者によって容易に決定され得る。本発明のプライマー対の例は、表１に記載されている。請求項６にも、適切なプライマー対が記載されている。
【００３０】
さらなる一態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、又は該配列から本質的になる、又は該配列からなる、少なくとも１種のプライマー、プライマー対又はプライマーセットを含むキットが提供される。キットは、遺伝子、特に、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３のような遺伝子のメチル化状態を検出するためのものである。
【００３１】
さらなる一態様において、本発明は、ＤＮＡ含有試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出する方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料を、検出可能な修飾残基を生成するためにＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾するが、メチル化されているシトシン残基は修飾しない試薬で接触／処理するステップと、
（ｂ）プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーがメチル化されている又はメチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合するように設計された、少なくとも１種のプライマー対を使用して、試薬での処理後に、それぞれメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであり、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうち（適切な）任意のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる、ステップと
を含む。
【００３２】
さらなる一態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む、癌又は癌素因を診断する方法が提供され、該方法において、試料中のメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在は、癌又は癌素因質を示す。
【００３３】
さらなる一態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３陽性の腫瘍の存在を決定する方法が提供され、該方法において、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３陽性の腫瘍の存在を示す。「ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３陽性の腫瘍」とは、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３抗原を発現する、（患者から単離された）あらゆる腫瘍又は腫瘍細胞を意味する。
【００３４】
本発明はさらに、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫療法を用いた治療に適する患者を特定及び／又は選出する方法を提供し、該方法において、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子がメチル化されていない場合は、対象が、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に特定及び／又は選出される（ことが好ましい）。したがって、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を有する患者は、該遺伝子がメチル化されている患者よりも好適である。
【００３５】
これに対して、遺伝子がメチル化されていないのではなければ、対象は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に特定及び／又は選出されないことが好ましい。
【００３６】
関連する一態様において、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む、癌の治療に成功する可能性を予測する方法が提供され、該方法において、遺伝子がメチル化されていない場合は、遺伝子がメチル化されている場合よりも、Ｃ ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に成功する可能性が高い。
【００３７】
これに対して、試料中にメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３がないことは、遺伝子がメチル化されていない場合よりも、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に対して抵抗性である可能性が高いことを示す。したがって、メチル化されているＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の検出は、免疫治療薬を用いた治療に成功する可能性が低いことを示す。
【００３８】
関連するさらなる一態様において、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む、癌の適切な治療レジメンを選択する方法が提供され、該方法において、遺伝子がメチル化されていない場合は、免疫治療薬が治療に選択される。
【００３９】
これに対して、遺伝子がメチル化されていないのではなければ、免疫治療薬を用いた治療は禁忌である。
【００４０】
さらに、免疫治療薬の投与を含む、対象において癌を治療する方法が提供され、該方法において、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて、対象が治療に選出されている。
【００４１】
本明細書に記載の種々の態様の全てについて、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の検出が、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３タンパク質のレベルの増加に相当していることが好ましい。
【００４２】
本発明は、本発明の方法のうちのいずれかによって、及び／又は本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することと、次いで、本明細書に記載のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物を患者に投与することとを含む、患者を治療する方法をさらに提供する。該組成物は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子がメチル化されていないことが見出された場合に投与されることが好ましい。
【００４３】
さらなる一態様において、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を発現する腫瘍を再発しやすい患者を治療する方法が提供され、患者が、腫瘍組織を除去するための治療を受けている。該方法は、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、腫瘍組織におけるＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することと、次いで、本明細書に記載のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物を患者に投与することとを、含む。組成物は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子がメチル化されていないことが見出された場合に投与されることが好ましい。
【００４４】
本発明のさらに他の一態様において、腫瘍を有する患者の治療用の医薬品の製造における、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物の使用が提供され、患者は、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて治療に選出されている。腫瘍を患っている患者の治療に使用するためのＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物も提供され、患者は、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて治療に選出されている。
【００４５】
さらに他の一実施形態において、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を発現する腫瘍を再発しやすい患者の治療用の医薬品の製造における、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物の使用が提供され、患者は、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて治療に選出されている。ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を発現する腫瘍を再発しやすい患者の治療に使用するためのＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物も提供され、患者は、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて、治療に選出されている。
【発明の詳細な説明】
【００４６】
本発明は、ＤＮＡ含有試料中のメチル化されている又はメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の存在及び／又は量を検出するためのアッセイを提供する。このアッセイを開発するために、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子内でメチル化されやすい領域を同定すること、及び非メチル化型とメチル化型のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子を識別できる特定のオリゴヌクレオチドを開発することが必要であった。
【００４７】
したがって、第１の態様において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、又は該配列から本質的になる、又は該配列からなるオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、目的遺伝子のメチル化状態の検出に有用である。オリゴヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブの役割を果たしてもよい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、非メチル化型の遺伝子を検出する。特定の実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載され、配列番号４３で代表されるヘアピン構造を含む。このような好ましいオリゴヌクレオチドは、非メチル化型の遺伝子を検出するために、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１又は６１によるヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる。
【００４８】
本発明の「遺伝子」又は「目的遺伝子」は、ＣＴＡＧ１Ｂ及び／又はＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子であることが好ましい。
【００４９】
「ＣＴＡＧ１Ｂ」は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会によって承認されている遺伝子記号である。該遺伝子はＸ染色体上；（部位：Ｘｑ２８）に位置し、その遺伝子配列は登録番号Ｕ８７４５９及びＮＭ００１３２７のもとで掲載されている。Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤはＥＮＳＧ０００００１８４０３３である。該遺伝子は、癌／精巣抗原１Ｂ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］をコードする。ＣＴＡＧ１Ｂは、互換可能に、よく「ＣＴＡＧ１Ｂ」又は「ＣＴＡＧ」又は「ＣＴＡＧ１」又は「ＮＹ−ＥＳＯ−１」又は「ＥＳＯ１」又は「ＬＡＧＥ−２」又は「ＬＡＧＥ２Ｂ」と呼ばれ、本明細書では全てを使用している。該遺伝子の低メチル化は、例えば黒色腫、肺癌（ＮＳＣＬＣを含む）、前立腺癌又は卵巣癌のような、癌の発生と関連し得る。
【００５０】
「ＣＴＡＧ２」は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会によって承認されている遺伝子記号である。該遺伝子はＸ染色体上；（部位：Ｘｑ２８）に位置し、その遺伝子配列は登録番号ＡＪ０１２８３３のもとで掲載されている。Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤはＥＮＳＧ０００００１２６８９０である。該遺伝子は、癌／精巣抗原２［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］をコードする。ＣＴＡＧ２は、互換可能に、よく「ＣＴＡＧ２」又は「ＣＡＭＥＬ」又は「ＥＳＯ２」又は「ＬＡＧＥ−１」又は「ＬＡＧＥ−２ｂ」又は「ＭＧＣ３８０３」又は「ＭＧＣ１３８７２４」と呼ばれ、本明細書では全てを使用している。該遺伝子の低メチル化は、例えば黒色腫、肺癌（ＮＳＣＬＣを含む）、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌又は肝細胞癌のような、癌の発生と関連し得る。
【００５１】
「ＰＲＡＭＥ」は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会によって承認されている遺伝子記号である。該遺伝子は２２番染色体上（部位：２２ｑ１１．２２）に位置し、その遺伝子配列は登録番号Ｕ６５０１１及びＮＭ２０６９５３のもとで掲載されている。Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤはＥＮＳＧ０００００１８５６８６である。該遺伝子は、黒色腫において選択的に発現される抗原をコードする［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。ＰＲＡＭＥは、互換可能に、よく「ＭＡＰＥ」又は「ＯＩＰ４」と呼ばれ、本明細書では全てを使用している。該遺伝子の低メチル化は、例えば子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌又は頭頸部扁平上皮癌のような、癌の発生と関連し得る。
【００５２】
ＭＡＧＥＡ３及びＭＡＧＥＡ６は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会によって承認されている遺伝子記号である。ＭＡＧＥＡ３遺伝子はＸ染色体上（部位ｑ２８）に位置し、その遺伝子配列は登録番号ＮＭ００５３６２及びＥＮＳＧ０００００１９７１７２のもとで掲載されている。ＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子は、黒色腫抗原ファミリーＡ、３をコードする。ＭＡＧＥＡ６遺伝子は、Ｘ染色体上（部位ｑ２８）に位置する。ＭＡＧＥ−Ａ３は、互換可能に、よくＭＡＧＥ−３又はＭＡＧＥＡ３と呼ばれる。同様に、ＭＡＧＥ−Ａ６は、互換可能に、よくＭＡＧＥ−６又はＭＡＧＥＡ６と呼ばれ、本明細書では全てを使用している。これらの遺伝子の低メチル化は、例えば黒色腫又は肺癌（ＮＳＣＬＣを含む）のような、癌の発生と関連し得る。
【００５３】
メチル化を受けやすいＣｐＧジヌクレオチドは、典型的には、ヒトの遺伝子のプロモーター及び／又はエキソン及び／又はイントロン領域に集中している。特定の実施形態において、遺伝子のメチル化状態は、遺伝子のプロモーター、イントロン、エキソン１及び／又はエキソン２領域におけるメチル化のレベルを決定することによって評価される。「プロモーター」は、転写開始点（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ Ｓｔａｒｔ Ｓｉｔｅ、ＴＳＳ）より上流の領域でありＴＳＳから約１０Ｋｂ、４Ｋｂ、３Ｋｂ、１Ｋｂ、５００ｂｐ又は１５０〜３００ｂｐの間に広がる。プロモーター領域におけるＣｐＧの分布が比較的まれな場合には、イントロン及び／又はエキソン領域においてメチル化のレベルを評価することもできる。評価のための領域は、イントロン配列及びエキソン配列の双方を含み、したがって双方の領域に重なっている領域であってもよい。
【００５４】
「メチル化状況」又は「メチル化状態」という用語は、ＤＮＡ配列中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の存在又は欠如を意味する。「高メチル化」は、メチル化のレベルにおける、正常レベルを超える上昇として定義される。したがって、高メチル化は、遺伝子内の特定のＣｐＧ部位における、シトシン（５−ｍＣｙｔ）の異常なメチル化に関し、プロモーター領域中に多い。正常レベルのメチル化は、例えば非癌性細胞におけるメチル化のレベルを決定することによって定めることができる。
【００５５】
「低メチル化」とは、（適切な対照試料中に見出される）「正常」ＤＮＡ配列中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見出される５−ｍＣｙｔの量に対して相対的な、（ＤＮＡ試験試料の）ＤＮＡ配列中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在する５−ｍＣｙｔの減少を指す。ここでも、「正常」レベルのメチル化は、例えば非癌性細胞におけるメチル化のレベルを決定することによって定めることができる。本発明において、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子（又は特定の態様におけるＭａｇｅＡ３）の低メチル化は、信頼できる癌の指標を提供する、この腫瘍関連抗原遺伝子の発現増加を示している。
【００５６】
本発明は、第２の態様において、ＤＮＡ含有試料を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む、ＤＮＡ含有試料中のメチル化されている又はメチル化されていない遺伝子の存在及び／又は量を検出する方法を提供する。該方法は、遺伝子がメチル化されている又はメチル化されていないかどうかを評価するさらなるステップを含むことが好ましい。これは、本明細書で述べているように、オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡに安定に結合するかどうかによって決まり得る。
【００５７】
メチル化状態を評価する技術は、別の方法に基づいている。本発明のオリゴヌクレオチドを利用する、任意の好適な技術を用いることができる。一実施形態において、メチル化されているＣｐＧジヌクレオチドモチーフを検出する方法は、ＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基を生成する試薬を使用する。試薬はメチル化されているシトシン残基を修飾しないため、好ましくは、核酸の増幅が関与する下流プロセスにおいて、メチル化されていない核酸分子とメチル化されている核酸分子とを識別することが可能になる。試薬は、一実施形態において、メチル化されていないシトシン残基を選択的に脱アミノ化するように作用してもよい。したがって、試薬に曝露した後に、メチル化されていないＤＮＡは、対応するメチル化されているＤＮＡのものとは異なるヌクレオチド配列を含む。シトシンの脱アミノ反応の結果、チミンと同様の塩基対形成特性を有し、したがって、シトシンの塩基対形成性質とは異なる、ウラシル残基が存在することになる。これにより、メチル化されているシトシンとメチル化されていないシトシンとの間の識別が可能になる。
【００５８】
配列の相違を評価するための有用な従来技術は、オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。プライマーを設計するための２つの方法が可能である。第１に、それ自身がＤＮＡメチル化され得るいずれの部位も包含しないように、プライマーを設計することができる。示差的なメチル化の部位における配列の相違は２つのプライマー結合部位の間にあり、配列の相違の可視化にはさらなるアッセイのステップが必要とされる。第２に、最初に処理した配列のメチル化型又は非メチル化型のいずれかと特異的にハイブリッド形成するプようにライマーを設計することができる。ハイブリッド形成後、増幅反応を行い、当技術分野において知られている任意の検出システムを使用して増幅産物をアッセイすることができる。増幅産物の存在は、プライマーがＤＮＡとハイブリッド形成したことを示す。プライマーの特異性は、ＤＮＡが修飾されているかいないかを示し、次にこれにより、ＤＮＡがメチル化されているかどうかを示す。標的に対して相補性の領域が十分である、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドがある場合には、プライマーは、ハイブリッド形成を阻害しないが他の操作に有用であり得る追加のヌクレオチド残基も含んでもよい。他のこうした残基の例は、制限酵素切断のための部位、リガンド結合のための部位、又は因子結合若しくはリンカー若しくはリピートのための部位、又は可視化のための残基であってもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化残基に特異的であるようなものであってもなくてもよい。プライマーとしての使用に好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１又は６１のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる。
【００５９】
修飾されている核酸と修飾されていない核酸とを識別するためのさらなる、かつ多くの場合、補足的な手段は、オリゴヌクレオチドプローブを使用することである。こうしたプローブは、修飾されている核酸又は、例えば増幅によって得られた産物のような、修飾された核酸のさらなる産物と直接ハイブリッド形成し得る。プローブに基づくアッセイは、特定の配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリッド形成法と、これに続くそのハイブリッドの検出とを利用するものである。増幅産物を検出する前に、さらなる精製ステップ、例えば、沈澱ステップがあってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野において知られている任意の検出システムを使用して標識することができる。こうしたシステムには、蛍光部分、放射性同位体標識部分、生物発光部分、発光部分、化学発光部分、酵素、基質、レセプター、又はリガンドが含まれるが、これらに限定されない。プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるものでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４及び６１から選択されるヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなることが好ましい。
【００６０】
本明細書では、「オリゴヌクレオチドプライマー」を互換可能に「プライマー」と称する。同様に、本明細書では、「オリゴヌクレオチドプローブ」を互換可能に「プローブ」と称する。
【００６１】
好ましい実施形態において、遺伝子（又はその一部、特に、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を使用して決定する。
【００６２】
ＭＳＰ技術は、当業者に知られているであろう。ＭＳＰ法では、亜硫酸水素ナトリウム処理の結果としての配列の相違を利用することにより、メチル化されているＤＮＡからメチル化されていないＤＮＡを識別するように設計されたプライマー対を使用して、ＤＮＡを増幅することができる（Ｈｅｒｍａｎ ＪＧら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９６年９月 ３；９３（１８）：９８２１〜６及び国際公開第９７／４６７０５号パンフレット）。リアルタイム定量ＭＳＰ（ＱＭＳＰ）は、ＭＳＰ技術の特定の例であり、リアルタイムでのメチル化ＤＮＡの信頼性の高い定量を可能にする。
【００６３】
リアルタイム法は、一般的に、増幅の進行の連続的な光学的モニタリングに基づくものであり、産物中の試薬の取り込みを定量化することができ、その定量化により鋳型中の配列のコピー数が示される、蛍光標識された試薬を利用する。このような標識された試薬は、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合し、二本鎖ＤＮＡの結合により蛍光が大きく増強される蛍光色素であってもよい。或いは、標識されたプライマー及び／又は標識されたプローブを使用することもできる。これらは、例えば、タックマン（ＴＡＱＭＡＮ）（登録商標）、モレキュラービーコン（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＥＡＣＯＮＳ）（登録商標）、アンプリフルオル（登録商標）及びスコーピオン（ＳＣＯＲＰＩＯＮ）（登録商標）ＤｚｙＮＡ（登録商標）などのような、よく知られており且つ商業的に入手可能なリアルタイム増幅技術の特定の用途を示すものである。これらのリアルタイム法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と共に使用されることが多い。
【００６４】
タックマンの技術では、蛍光色素及び消光色素を含む、直鎖状の加水分解オリゴヌクレオチドプローブが使用される。照射されると、励起された蛍光色素は、蛍光を放出するよりもむしろ、近くの消光色素分子にエネルギーを移動させる（ＦＲＥＴ原理）。タックマンプローブは、ＰＣＲ産物の内側の領域にアニーリングし、ポリメラーゼが鋳型を複製するときに、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により切断される。これにより、消光剤の活性が終わり、レポーター色素が蛍光を放出し始め、その蛍光はプローブ切断の速度と比例してサイクル毎に増加する。
【００６５】
モレキュラービーコンも蛍光色素及び消光色素を含むが、双方の色素を近づけて蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）が生じるように、溶液中で遊離している間はヘアピン構造を取るように設計されている。アニーリングステップ中にビーコンが標的とハイブリッド形成する場合には、ヘアピンが直線状になり、双方の色素（ドナー及びアクセプター／消光剤）が分離される。ドナーから検出される蛍光の増加は、得られるＰＣＲ産物の量と相関するであろう。
【００６６】
スコーピオンプローブでは、単一のオリゴヌクレオチドを使用して、配列特異的なプライミングとＰＣＲ産物の検出とを達成する。スコーピオンプローブは、ハイブリッド形成していない状態ではステムループ構造を維持しており、フルオロフォアと消光剤との間でＦＲＥＴが生じる。このステムの３’部分は、プライマーの伸長産物と相補的な配列も含む。この配列は、増幅不可能な単量体を介して特異的プライマーの５’末端に連結される。スコーピオンプライマーの伸長後、特異的なプローブ配列は、伸長されたアンプリコン中の相補配列に結合することができ、これにより、ヘアピンループが開かれ、フルオロフォアと消光剤とが分離されて、蛍光シグナルを発生する。
【００６７】
ヘビーメチル（Ｈｅａｖｙｍｅｔｈｙｌ）では、プライミングはメチル化特異的であるが、プライマー自体の代わりに、伸長不可能なオリゴヌクレオチドブロッカーがこの特異性を提供する。ブロッカーは亜硫酸水素処理されたＤＮＡにメチル化特異的な様式で結合し、その結合部位はプライマー結合部位と重複している。ブロッカーが結合すると、プライマーは結合することができず、したがって、アンプリコンは生成されない。ヘビーメチルは、リアルタイム検出と共に使用することができる。
【００６８】
プレクサー（Ｐｌｅｘｏｒ）（商標）ｑＰＣＲシステム及びｑＲＴ−ＰＣＲシステムは、２個の修飾ヌクレオチド間の特異的な相互作用を利用して、定量ＰＣＲ解析を達成するものである。ＰＣＲプライマーのうちの一方は、５’末端のイソ−ｄＣ残基に隣接する蛍光標識を含む。もう一方のＰＣＲプライマーは、標識されない。この反応混合物は、デオキシヌクレオチドと、消光剤であるダブシルで修飾されたイソ−ｄＧＴＰとを含む。ダブシル−イソ−ｄＧＴＰは、イソ−ｄＣ残基と相補的な部位に優先的に取り込まれる。この部位におけるダブシル−イソ−ｄＧＴＰの取り込みは、結果として相補鎖上での蛍光色素の消光及び蛍光の減少をもたらし、これにより、増幅中の定量が可能になる。これらの多重反応のために、それぞれの標的配列に対して、異なるフルオロフォアを有するプライマー対を使用する。
【００６９】
したがって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるオリゴヌクレオチドは、上記の方法において目的遺伝子のメチル化状態の検出用のプライマー又はプローブとして用いることもできる。
【００７０】
好ましい一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ含有試料中のメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の存在及び／又は量を検出するリアルタイム法を提供し、該方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料を、検出可能な修飾残基を生成するためにＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾するが、メチル化されているシトシン残基を修飾しない試薬で接触／処理するステップと、
（ｂ）プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーがメチル化されている又はメチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合するように設計された、少なくとも１種のプライマー対を使用して、試薬での処理後に、それぞれメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであり、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるステップと
を含む。
【００７１】
本発明の方法における目的遺伝子は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子であることが好ましい。好ましくは、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、増幅のないときには、アクセプター部分がドナー部分によって放出される蛍光を（励起と同時に）消光し、増幅中には、ステムループ構造が破壊され、ドナー部分とアクセプター部分とが十分に分離されて検出可能な蛍光シグナルを発生するように配置された、分子エネルギー移動対のドナー及びアクセプター部分を有するステムループ構造を含むプライマーである。このシグナルは、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の存在の指標を提供するために、リアルタイムで検出することができる。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるプライマー対のうちのプライマーは、ステムループ構造を有することが好ましい。
【００７２】
特定の実施形態において、メチル化されている又はメチル化されていない遺伝子の遺伝子コピー数が決定される。ここで、本明細書に記載の方法は、以下のさらなるステップ：
（ｃ）遺伝子コピー数を得るため、リアルタイム検出の結果を、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の標準曲線に対して定量するステップ
を含むことが好ましい。
【００７３】
好ましくは、ステップ（ｃ）は、サイクル閾値が４０以下の場合に増幅が有効であると考えられることをさらに特徴とする。
【００７４】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のような遺伝子の場合、非メチル化型の遺伝子の検出が主に関連するであろう。
【００７５】
本発明の方法は、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の存在を試料中でリアルタイムに検出することを可能にする。本発明の方法は定量的な方法であるので、反応の進行と並行してメチル化型又は非メチル化型の目的遺伝子の（相対）量も決定することができる。
【００７６】
しかし、リアルタイム法を利用しなくてはならないわけではない。試料中に標的ＤＮＡが存在するかしないかを知るためだけに、解析を行うこともできる。エンドポイントの増幅検出技術は、リアルタイムＰＣＲのために広く使用されるのと同様の方法を利用する。したがって、本発明の方法は、ＤＮＡ含有試料中のメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の存在及び／又は量を検出するエンドポイント法を包含し得る。
【００７７】
したがって、本発明は、ＤＮＡ含有試料中のメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の存在及び／又は量を検出する（エンドポイントの）方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料を、検出可能な修飾残基を生成するために、ＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾するが、メチル化されているシトシン残基を修飾しない試薬で接触及び／又は処理するステップと、
（ｂ）プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーがメチル化されている又はメチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合するように設計された、少なくとも１種のプライマー対を使用して、試薬での処理後にそれぞれメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであり、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるステップと、
を含む。
【００７８】
上述したように、本発明の方法における目的遺伝子は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥであることが好ましい。プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、本明細書に記載の特徴を有する分子エネルギー移動対のドナー及びアクセプター部分を有するステムループ構造を含むプライマーであることが好ましい。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるプライマー対のうちのプライマーは、ステムループ構造を有することが好ましい。
【００７９】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子の場合、非メチル化型の遺伝子の検出が主に関連するであろう。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１又は６１のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるプライマーは、試薬での処理後にメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥのＤＮＡを検出するために設計されている。
【００８０】
メチル化されていない遺伝子がないということは、メチル化されている遺伝子があることを示している。
【００８１】
メチル化されている又はメチル化されていない遺伝子の遺伝子コピー数が望まれる場合には、該方法は、以下のさらなるステップ：
（ｃ）遺伝子コピー数を得るため、検出の結果をメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の標準曲線に対して定量するステップ
を含んでもよい。
【００８２】
本発明の全ての実施形態は、本発明のエンドポイント態様に適用可能であり、したがって、それに準用する。エンドポイント分析には、増幅の終わりでの蛍光を決定するための蛍光プレートリーダー又は他の好適な装置の使用が想定され得る。
【００８３】
本発明の方法は、任意の好適な（ＤＮＡ含有）試験試料において行われるｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であることが最も好ましい。しかし、一実施形態では、方法は、試料を採取するステップも含んでもよい。試験試料は、ＤＮＡ含有試料であり、特に、目的遺伝子を含むＤＮＡ含有試料である。本発明の方法は、疾患の診断に、特に、目的遺伝子のメチル化が疾患の発生と関連している（ことが知られている）場合に、使用することができる。
【００８４】
ＤＮＡ含有試料は、任意の好適な組織試料又は体液を含んでもよい。好ましくは、試験試料は、ヒト対象から採取される。癌に適用する場合、試料は、癌性であると疑われる組織又は代表的な体液から採取された組織試料を含んでもよい。
【００８５】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子の低メチル化は、肺癌と関連づけられており、したがって、本発明を肺癌に適用することができる。したがって、一実施形態では、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子に関する本発明の方法において使用される試験試料は、肺細胞又は肺細胞からの核酸（分子）を含むことが好ましい。最も好ましくは、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。肺癌には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の２種類がある。これらの名称は、腫瘍内で見つかる細胞の種類を簡単に説明するものである。試験試料は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）からの細胞又は核酸を含むことが好ましい。ＮＳＣＬＣは、扁平上皮癌、腺癌、及び大細胞癌を含み、肺癌の約８０％を占めている。好ましい一実施形態において、癌がＮＳＣＬＣである場合、試料は、肺組織試料又は喀痰試料又は血清試料である。ＮＳＣＬＣは治癒が困難であり、利用可能な治療は、できる限り長く延命し、疾患の症状を緩和しようとするものになりがちである。ＮＳＣＬＣは最も一般的な種類の肺癌であり、不良転帰と関連する。
【００８６】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子の低メチル化は、黒色腫とも関連があり、したがって、本発明は黒色腫に適用することもできる。黒色腫は組織病理学的用語でよく定義されている、色素沈着した、アクセスしやすい病変である。初期の水平増殖期（Ｒａｄｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｈａｓｅ、ＲＧＰ）の黒色腫は、表皮及び真皮乳頭層に浸潤し得るが、転移能を有さない；この段階での切除は、ほぼ完全に治癒的である。その後の垂直増殖期（Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｈａｓｅ、ＶＧＰ）は、より攻撃的な段階への移行を意味し、転移能がある。したがって、ＲＧＰ／ＶＧＰ移行時に起こる遺伝子発現の変化は、非常に興味深い。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法において使用されるさらに好ましい試験試料は、黒色腫細胞又は黒色腫細胞からの核酸を含む。好ましくは、試験試料は、皮膚病変から採取される。
【００８７】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子の低メチル化は、乳癌とも関連があり、したがって、本発明を乳癌に適用することもできる。乳癌には、非侵襲性癌及び侵襲性癌の２種類の主なグループがある。非侵襲性癌には、上皮内小葉癌及び腺管上皮内癌が含まれる。都合の悪いことに、乳癌は基底膜を通して増殖することが多く、全乳癌のうちおよそ９５％は浸潤性又は侵襲性の癌である。最も一般的な種類の侵襲性乳癌（約７５％）は、侵襲性腺管癌であり、乳管内で発生し、管壁を通して広がる。侵襲性小葉癌は、乳腺内で発生し、侵襲性乳癌の１０〜１５％を占める。より一般的でない種類の侵襲性乳癌には、炎症性乳癌、乳頭のパジェット病、髄様癌、粘液癌、葉状腫瘍、及び管状癌が含まれる。まれに（約１％）、肉腫（結合組織の癌）が乳房内に発生する。個体は、侵襲性乳癌及び非侵襲性乳癌の一方か、他方、又はその組合せを発症し得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法において使用されるさらに好ましい試験試料は、乳房細胞又は乳房細胞からの核酸分子を含む。最も好ましくは、試験試料は、乳房組織から採取される。
【００８８】
本発明の方法において使用される他のＤＮＡ含有試料としては、診断、予後、又は個別化医療用のための試料が挙げられる。こうした試料は、例えば、生検若しくは細針吸引などの外科的試料から、パラフィン包埋組織から、凍結腫瘍組織試料から、新鮮な腫瘍組織試料から、又は新鮮な若しくは凍結された体液から採取することができる。非限定的な例としては、全血、骨髄、脳脊髄液、腹膜液、胸膜液、リンパ液、血清、血漿、尿、乳び、便、射精液、喀痰、乳頭吸引液、唾液、スワブ検体、結腸洗浄検体及びブラシ検体などが挙げられる。組織及び体液は、任意の好適な方法を使用して採取することができ、そうした多くの方法は、当技術分野でよく知られている。パラフィン包埋検体の評価は、直接又は組織切片上で行うことができる。
【００８９】
「試料」、「患者試料」及び「患者の試料」という用語は、上記のように、互換可能に使用され、患者からのＤＮＡ含有試料を意味することが意図される。
【００９０】
本発明の方法は、精製された又は未精製のＤＮＡ含有試料において行うことができる。しかし、好ましい一実施形態において、ＤＮＡは、ステップ（ａ）（試薬処理ステップ）の前に、又は予備的なステップとして、ＤＮＡ含有試料から単離／抽出／精製される。任意の好適なＤＮＡ単離技術を利用することができる。精製技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（特に、その中の付録８及び第５章を参照されたい）のような標準的な教科書中に見出すことができる。好ましい一実施形態において、精製は、ＤＮＡのアルコール沈殿に関するものである。好ましいアルコールとしては、エタノール及びイソプロパノールなどが挙げられる。好適な精製技術には、塩に基づく沈殿法も挙げられる。したがって、特定の一実施形態では、ＤＮＡ精製技術は、混在物を沈殿させるための高濃度の塩の使用を含む。塩は、例えば、酢酸カリウム及び／又は酢酸アンモニウムを含む、それらから本質的になる、又はそれらからなるものでもよい。該方法は、アルコール沈澱を通して沈澱させた混在物を除去し、それに続きＤＮＡを回収するステップをさらに含んでもよい。
【００９１】
一代替実施形態では、ＤＮＡ精製技術は、細胞溶解液から混在物を抽出するための有機溶媒の使用に基づく。したがって、一実施形態において、方法は、ＤＮＡを抽出するためのフェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの使用を含む。好適な条件を用いて、確実に、混在物が有機相中に分離され、ＤＮＡが水相に残るようにする。
さらなるキットでは、磁気ビーズ、シリカ膜などを使用する。そうしたキットは当技術分野でよく知られており、市販されている。本発明の方法では、ピュアジーン（ＰＵＲＥＧＥＮＥ）（登録商標）ＤＮＡ精製キットを使用することもできる。
【００９２】
こうした精製技術の好ましい実施形態では、抽出したＤＮＡを、エタノール沈澱又はイソプロパノール沈澱などのアルコール沈澱を通して回収する。
【００９３】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織は、臨床センター内で腫瘍組織を保存する通常の方法である。そうしたＦＦＰＥ包埋試料は、ＤＮＡ抽出の前に脱ろうステップを必要とする。好ましい一実施形態において、ＦＦＰＥ組織試料又はスライド上に固定した試料材料は、キシレン処理によって最初に脱ろうさせる。キシレンとの接触時間は、キシレンが試料と接触して相互作用できるようにするのに十分でなければならない。より好ましい一実施形態では、ＦＦＰＥ試料を、１００％キシレン中で約２時間脱パラフィン化する。完全な脱パラフィン化を確実にするために、このステップをもう一度繰り返すこともできる。キシレン処理の後に、試料は７０％エタノールを用いて再水和させる。
【００９４】
本発明の方法は、必要に応じて、（同様に、ステップ（ａ）の前に、又は予備的なステップとして）、試料中の単離／抽出／精製されたＤＮＡの定量も含んでもよい。試料中のＤＮＡの定量は、任意の好適な手段を使用して達成することができる。核酸の定量は、例えば、分光光度計、蛍光光度計又はＵＶトランスイルミネーターの使用に基づくものであってもよい。好適な技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（特に、その中の付録８を参照されたい）のような標準的な教科書に記載されている。好ましい一実施形態では、ＤＮＡを定量するために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キットのようなキットを用いることもできる。
【００９５】
本発明の方法は、検出可能な修飾残基を生成するためにＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾する試薬に依存していてもよい。試薬の作用機序については、既に説明した。好ましい一実施形態において、検出可能な修飾残基を生成するためにＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾するが、メチル化されているシトシン残基を修飾しない試薬は、亜硫酸水素塩試薬を含む、亜硫酸水素塩試薬から本質的になる、又は亜硫酸水素塩試薬からなる（Ｆｒｏｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２ ８９：１８２７〜１８３１，）。いくつかの亜硫酸水素塩含有試薬が当技術分野で知られており、脱アミノ化反応を行うための好適なキットが市販されている（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＥＺ ＤＮＡメチル化キットなど）。本発明の方法における使用のために特に好ましい試薬は、亜硫酸水素ナトリウムを含む、亜硫酸水素ナトリウムから本質的になる、又は亜硫酸水素ナトリウムからなる。
【００９６】
試料中のＤＮＡを試薬で処理すると、次は、試薬により引き起こされるヌクレオチド配列中の相違を検出する必要がある。この検出は、核酸増幅技術を用いて行う。既に述べたように、機能的に重要なメチル化は、プロモーター領域と最も一般的に関連している。特に、いわゆる「ＣｐＧアイランド」は、比較的高頻度のＣｐＧ残基を含み、遺伝子の転写開始点の近くに見出されることが多い。遺伝子の中には、例えばＭＡＧＥ−３のように、プロモーター領域におけるＣｐＧの分布が比較的まれなものもある。こうした場合には、遺伝子のイントロン領域及びエキソン領域をメチル化について評価することが適切な場合もある。目的遺伝子中のＣｐＧアイランドを特定することができる様々なソフトウェアプログラムが存在する。したがって、本発明の方法は、少なくとも１種のプライマー対を使用して、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の少なくとも一部を増幅することを含んでもよい。上述のように、メチル化状態を調べる目的残基は、典型的には、目的遺伝子の規定のＣｐＧアイランド及び／又はプロモーター領域及び／又はイントロン領域及び／又はエキソン領域中に見出されるため、プライマー対は、典型的には、遺伝子の全体よりもむしろ、（領域中の）一部のみを増幅するであろう。目的遺伝子の存在の信頼できる指標として増幅産物を検出可能であるならば、遺伝子の任意の好適な部分を本発明の方法に従って増幅することができる。特に容易に検出可能な増幅産物は、約５０〜２５０ｂｐの間である。さらにより好ましくは、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の増幅のための少なくとも１種のプライマー対を使用する増幅により、約１００〜２００ｂｐの間又は５０〜１００ｂｐの間の増幅産物が生成される。これは、組織試料、特に、典型的に得られるＤＮＡの質が限られ、より小さいアンプリコンが望まれることもあるパラフィン包埋試料では、特に重要である。好ましい一実施形態において、検出可能な増幅産物は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６２及び６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を少なくとも含む。好ましくは、（約）５０ｂｐ、５１ｂｐ、５２ｂｐ、５３ｂｐ、５４ｂｐ、５５ｂｐ、５６ｂｐ、５７ｂｐ、５８ｂｐ、５９ｂｐ、６０ｂｐ、６１ｂｐ、６２ｂｐ、６３ｂｐ、６４ｂｐ、６５ｂｐ、６６ｂｐ、６７ｂｐ、６８ｂｐ、６９ｂｐ、７０ｂｐ、７１ｂｐ、７２ｂｐ、７３ｂｐ、７４ｂｐ、７５ｂｐ、７６ｂｐ、７７ｂｐ、７８ｂｐ、７９ｂｐ、８０ｂｐ、８１ｂｐ、８２ｂｐ、８３ｂｐ、８４ｂｐ、８５ｂｐ、８６ｂｐ、８７ｂｐ、８８ｂｐ、８９ｂｐ、９０ｂｐ、９１ｂｐ、９２ｂｐ、９３ｂｐ、９４ｂｐ、９５ｂｐ、９６ｂｐ、９７ｂｐ、９８ｂｐ、９９ｂｐ、１００ｂｐ、１０１ｂｐ、１０２ｂｐ、１０３ｂｐ、１０４ｂｐ、１０５ｂｐ、１０６ｂｐ、１０７ｂｐ、１０８ｂｐ、１０９ｂｐ、１１０ｂｐ、１１１ｂｐ、１１２ｂｐ、１１３ｂｐ、１１４ｂｐ、１１５ｂｐ、１１６ｂｐ、１１７ｂｐ、１１８ｂｐ、１１９ｂｐ、１２０ｂｐ、１２１ｂｐ、１２２ｂｐ、１２３ｂｐ、１２４ｂｐ、１２５ｂｐ、１２６ｂｐ、１２７ｂｐ、１２８ｂｐ、１２９ｂｐ、１３０ｂｐ、１３１ｂｐ、１３２ｂｐ、１３３ｂｐ、１３４ｂｐ、１３５ｂｐ、１３６ｂｐ、１３７ｂｐ、１３８ｂｐ、１３９ｂｐ、１４０ｂｐ、１４１ｂｐ、１４２ｂｐ １４３ｂｐ、１４４ｂｐ、１４５ｂｐ、１４６ｂｐ、１４７ｂｐ、１４８ｂｐ、１４９ｂｐ、又は１５０ｂｐの増幅産物が生成される。
【００９７】
プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマー、及び好ましくは双方のプライマーは、試薬での処理後に、メチル化されている又はメチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合するように設計される。したがって、プライマーは、方法が行われる用途に応じて、（試薬での処理後に修飾されていないままである）メチル化型の遺伝子又は（試薬によって修飾される）非メチル化型の遺伝子のいずれかとのみ塩基対を形成することによって、メチル化されている遺伝子とメチル化されていない遺伝子とを識別する働きをする。したがって、プライマーは、目的遺伝子中の少なくとも１個のメチル化部位を包含しなければならない。好ましくは、プライマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のメチル化部位を含む遺伝子の領域に結合する。最も好ましくは、プライマーは、プライマー結合部位中のＣｐＧ対にある全シトシン残基がメチル化されている配列又はメチル化されていない配列−すなわち、「完全にメチル化されている」配列又は「完全にメチル化されていない」配列に結合するように設計される。しかし、１個又は数個のメチル化部位のみが機能的に重要性がある場合には、プライマーは、有効な結合が生じるよう、にこれらの残基のみがメチル化されている（シトシンとして残る）又はメチル化されていない（ウラシルに変換される）必要のある標的配列に結合するように設計することができる。他の（機能的に関連のない）潜在的なメチル化の部位を、適切なプライマー設計を通して完全に回避する、又は重要性のより少ないこれらの部位のメチル化状態とは無関係に結合するようにプライマーを設計することもできる（例えば、プライマー配列中の適切な位置にＧ残基とＡ残基とを混在させることによる）。したがって、最初のＤＮＡ含有試料中にメチル化型又は非メチル化型の目的遺伝子が存在する場合にのみ、増幅産物が予想される。これに加えて又はこれに代えて、例えば、遺伝子が、機能的に重要なメチル化されている部位と、別の機能的に重要なメチル化されていない部位とを含む場合のように、プライマー対のうちの少なくとも一方のプライマーが、試薬での処理後にメチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合し、他方のプライマーが、処理後にメチル化されているＤＮＡにのみ結合することが好適な場合もある。
【００９８】
好ましくは、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、分子エネルギー移動対のドナー及びアクセプター部分を有するステムループ構造又は「ヘアピン」構造を含むプライマーである。このプライマーは、所望により、メチル化されているＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡとを識別するプライマーであってもなくてもよい。プライマーは、増幅のないときには、アクセプター部分がドナー部分によって放出される蛍光を励起と同時に消光するように配置される。したがって、プライマーによって導かれる増幅の前には、又は増幅のないときには、ステムループ構造又は「ヘアピン」構造は完全なままである。ドナー部分によって放出される蛍光は、アクセプター部分によって効果的に受容され、蛍光の消光を導く。
【００９９】
増幅中には、プライマーのステムループ又はヘアピン構造の形状が変更される。特に、プライマーが増幅産物中に、特に二本鎖ＤＮＡ中に組み込まれると、（特に、２回目の増幅中に）ステムループ又はヘアピン構造が破壊される。構造におけるこの変化は、アクセプター部分が、ドナー部分によって放出される蛍光をもはや効果的に消光することができないほど十分にドナー部分とアクセプター部分とを分離する。したがって、ドナー部分は、検出可能な蛍光シグナルを生成する。このシグナルは、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の遺伝子コピー数の指標を得るために、リアルタイムで検出される。
【０１００】
したがって、本発明の方法は、分子エネルギー移動（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＭＥＴ）標識で検出可能に標識された核酸の増幅用のオリゴヌクレオチドを利用することができる。プライマーは、ＭＥＴ対のドナー及び／又はアクセプター部分を含み、増幅産物がＭＥＴ対のドナー及びアクセプター部分の双方を含むように、増幅反応の増幅産物中に組み込まれる。
【０１０１】
増幅産物が二本鎖である場合には、増幅産物中に組み込まれるＭＥＴ対は同一の鎖上にあってもよく、増幅が三重増幅である場合には、反対の鎖上にあってもよい。増幅で使用されるポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する特定の例では、このエキソヌクレアーゼ活性により、増幅産物集団のうちの少なくとも一部からＭＥＴ対部分のうちの１つが切断されてもよい。こうしたエキソヌクレアーゼ活性は、本発明の増幅法に対して有害ではない。
【０１０２】
本明細書で述べている本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、三重増幅、及び他の増幅システムを含む、核酸配列を増幅するための多くの方法に適合可能である。
【０１０３】
好ましい一実施形態において、ＭＥＴは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）であり、ここで、オリゴヌクレオチドは、ドナー部分によって放出される蛍光エネルギーがアクセプター部分によって吸収されるように、ドナー部分がフルオロフォアであり、アクセプター部分がフルオロフォアであってもよい、ドナー及びアクセプター部分で標識される。アクセプター部分は、消光剤であってもよい。したがって、増幅プライマーは、ドナー及びアクセプター部分の双方を含むヘアピンプライマーであり、アクセプター部分がドナー部分の蛍光を消光するように構成される。プライマーが増幅産物中に組み込まれると、その構造が変化して、消光が排除され、ドナー部分の蛍光を検出することができる。
【０１０４】
本発明の方法により、組み込まれなかったオリゴヌクレオチドを予め分離することなく増幅産物を検出することができる。さらに、これらの方法は、標識されたオリゴヌクレオチドを増幅産物中に組み込むことによって、増幅産物を直接検出することを可能にする。
【０１０５】
好ましい一実施形態において、本発明の方法は、参照遺伝子の発現を決定することも含む。参照遺伝子は、異なる試料間での比較を可能にするために重要である。比較する試料間で安定且つ信頼性の高い様式で発現されると考えられる適切な遺伝子を選択することにより、目的遺伝子と共に参照遺伝子の増幅を検出するで、最初に入れた材料の量、酵素の効率、試料の分解などのような試料間のばらつきが考慮される。参照遺伝子は、理想的には、信頼性の高い量の、最初に入れたＤＮＡの存在下で、試験する試料間で定常的に発現されているものでなければならない。したがって、目的遺伝子から得られる結果を、参照遺伝子の対応するコピー数に対して標準化することができる。本発明に好適な参照遺伝子としては、ベータアクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、１８ＳリボソームＲＮＡなどのリボソームＲＮＡ遺伝子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ遺伝子などが挙げられる（Ｒａｄｏｎｉｃ Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００４年１月 ２３；３１３（４）：８５６〜６２）。特に好ましい一実施形態では、参照遺伝子はベータアクチンである。
【０１０６】
したがって、本発明の方法は、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーが上記の特徴を有するステムループ構造を含むプライマーである、少なくとも１種のプライマー対を使用して、参照遺伝子の少なくとも一部を増幅することを、さらに特徴としてもよい。
【０１０７】
参照遺伝子の存在の信頼できる指標として増幅産物を検出可能であるならば、参照遺伝子の任意の好適な部分を本発明の方法に従って増幅することができる。特に容易に検出可能な増幅産物は、約５０〜２５０ｂｐの間である。さらにより好ましくは、参照遺伝子の増幅のための少なくとも１種のプライマー対を使用する増幅により、約５０ｂｐ〜１５０ｂｐの間の増幅産物が生成される。これは、組織試料、特に、典型的に得られるＤＮＡの質が限られるパラフィン包埋試料では、特に重要である。
【０１０８】
参照遺伝子が本発明の方法に含まれる実施形態において、該方法は、（リアルタイム）検出の結果をメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の標準曲線に対して定量することを含む該方法のステップが、参照遺伝子のリアルタイム検出の結果を参照遺伝子の標準曲線に対して定量して、それぞれの場合の遺伝子コピー数の出力を得ることも含み、任意でさらに、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の遺伝子コピー数を参照遺伝子の遺伝子コピー数で除算することによって、これらの結果を標準化することを含むことを、さらに特徴としていてもよい。
【０１０９】
ここでも、該方法は、サイクル閾値が４０以下の場合に増幅が有効であると考えられることを特徴付けられてもよい。
【０１１０】
参照遺伝子の少なくとも一部の増幅には、一般的に、少なくとも１種のプライマー対が利用される。好ましくは、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、分子エネルギー移動対のドナー及びアクセプター部分を有するステムループ構造を含む、目的遺伝子のためのプライマーである。増幅中のこうした構造の作用機序については、本明細書中で説明している。
【０１１１】
本発明の方法において使用される「ヘアピン」プライマーは、米国特許第６，０９０，５５２号及び欧州特許第０９１２５９７号に記載されているようなものであることが最も好ましく、これらの開示は、本明細書にその全体が組み込まれている。これらのプライマーは、アンプリフルオル（登録商標）プライマーとして商業的に知られている。したがって、特に好ましい一実施形態において、目的遺伝子及び／又は参照遺伝子の一部を増幅するために使用される、ステムループ構造を含むプライマーは、５’から３’の順に、以下の連続した配列：
（ａ）約６〜３０ヌクレオチドの間の第１のヌクレオチド配列であって、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドが、分子エネルギー移動対のドナー部分及びアクセプター部分から選択される第１の部分で標識され、ドナー部分が、励起されると１種又は複数の特定の波長で蛍光を放出し、アクセプター部分が、ドナー部分によって放出される蛍光を吸収及び／又は消光する、第１のヌクレオチド配列、
（ｂ）約３〜２０の間のヌクレオチドを含む、該ヌクレオチドから本質的になる、又は該ヌクレオチドからなる第２の一本鎖ヌクレオチド配列、
（ｃ）約６〜３０の間のヌクレオチドを含む、該ヌクレオチドから本質的になる、又は該ヌクレオチドからなる第３のヌクレオチド配列であって、第３のヌクレオチド配列中のヌクレオチドが、ドナー部分及びアクセプター部分から選択される第２の部分で標識され、第２の部分が、前記群のうち第１のヌクレオチド配列を標識していない方であり、第３のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列と逆の順に相補的であることにより、第１のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列との二重鎖を形成することができ、それにより、第１の部分と第２の部分とが近接していることによって、ドナー部分が励起されて蛍光を放出すると、アクセプター部分がドナー部分によって放出される蛍光を吸収して消光する、第３のヌクレオチド配列、及び
（ｄ）プライマーの３’末端に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６２及び６３のうちのいずれかの配列を３’末端に含む（したがって、核酸ポリメラーゼによる、遺伝子のメチル化されている又はメチル化されていないＤＮＡの部分を含む核酸鎖と相補的なヌクレオチド配列の合成を開始することができる）、約８〜４０の間のヌクレオチドを含む、該ヌクレオチドから本質的になる、又は該ヌクレオチドからなる第４の一本鎖ヌクレオチド配列、と
を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなり、二重鎖が形成されない場合、第１の部分と第２の部分とが、第１の部分と第２の部分との間の分子エネルギー移動を妨げる距離で分離される。
【０１１２】
特に好ましい一実施形態において、ドナー部分とアクセプター部分とは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成する。分子エネルギー移動（ＭＥＴ）は、それによってエネルギーがドナー分子とアクセプター分子との間で無放射的に受け渡されるプロセスである。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ＭＥＴの形態である。ＦＲＥＴは特定の化合物の特性から生じる；該化合物は、特定の波長の光への曝露によって励起されると、別の波長で光を放出する（すなわち、蛍光を発する）。こうした化合物は、フルオロフォアと呼ばれる。ＦＲＥＴにおいて、エネルギーは、フルオロフォアであるドナー分子と、アクセプター分子との間で長距離（１０〜１００Å）に渡って無放射的に受け渡される。ドナーは光子を吸収し、このエネルギーをアクセプターに無放射的に移動させる（Ｆｏｒｓｔｅｒ、１９４９、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．Ａ４：３２１〜３２７；Ｃｌｅｇｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３〜３８８）。励起スペクトルと放出スペクトルとが重複している２種類のフルオロフォアが近くにある場合には、１種のフルオロフォアの励起は、このフルオロフォアが、第２のフルオロフォアによって吸収されてそれを刺激するような波長で光を放出し、次いで、第２のフルオロフォアが蛍光を発することになる。換言すれば、第１の（ドナー）フルオロフォアの励起状態のエネルギーは、近くにある第２の（アクセプター）フルオロフォアとの共鳴誘導性双極子−双極子相互作用によって移動する。結果として、ドナー分子の寿命が減少してその蛍光は消光されるが、アクセプター分子の蛍光強度は増強されて偏光が解消される。ドナーの励起状態のエネルギーがフルオロフォアではないアクセプターに移動する場合には、その後アクセプターによる蛍光の放出なく、ドナーの蛍光は消光される。この場合、アクセプターは消光剤として機能する。本発明では、消光剤及びアクセプターの双方を使用することができる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与し得る分子対は、ＦＲＥＴ対と呼ばれる。エネルギー移動が起こるためには、ドナー分子とアクセプター分子とが、典型的には、近い位置になければならない（最長で７０〜１００Å）（Ｃｌｅｇｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３〜３８８；Ｓｅｌｖｉｎ、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４６：３００〜３３４）。エネルギー移動の効率は、ドナー分子とアクセプター分子との距離と共に急速に低下する。Ｆｏｒｓｔｅｒ（１９４９、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．Ａ４：３２１〜３２７）によれば、エネルギー移動の効率はＤ×１０^−６に比例し、ここで、Ｄはドナーとアクセプターとの間の距離である。事実上、これは、ＦＲＥＴが約７０Åまでの距離で最も効率よく起こり得ることを意味する。ＦＲＥＴに一般に使用される分子については、別の節で述べている。フルオロフォアがドナーであるか又はアクセプターであるかは、その励起スペクトル及び放出スペクトル、並びに共に対形成したフルオロフォアによって決まる。例えば、ＦＡＭは４８８ｎｍの波長を有する光によって最も効率よく励起され、５００〜６５０ｎｍのスペクトル、及び５２５ｎｍの発光極大を有する光を放出する。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸ（これらは全て５１４ｎｍの励起極大を有する）と共に使用するのに好適なドナーフルオロフォアである。
【０１１３】
特に好ましい一実施形態において、ドナー部分はフルオレセイン又はその誘導体であり、アクセプター部分はＤＡＢＣＹＬである。好ましくは、フルオレセイン誘導体は、６−カルボキシフルオレセインを含む、６−カルボキシフルオレセインから本質的になる、又は６−カルボキシフルオレセインからなる。
【０１１４】
ＭＥＴ標識を、プライマー中の任意の好適な位置に付加することができる。特に好ましい一実施形態において、ドナー及びアクセプター部分は、ステムループが完全である間には、これらの部分が互いに物理的に近くにあるように、ステムループ構造内の相補的なヌクレオチド上に配置される。しかし、本発明のプライマーは、増幅がないときにはそれぞれのドナーとアクセプターとの間でのＭＥＴ／ＦＲＥＴを可能にし、プライマーが増幅産物中に組み込まれるとドナーとアクセプターとの分離を可能にするのに有効な任意の位置に該部分で標識することができる。
【０１１５】
ステムループ又はヘアピン構造の配列は、標的遺伝子（目的遺伝子又は参照遺伝子）に結合しないため、標的遺伝子のヌクレオチド配列に依存しない。したがって、目的配列のリアルタイム検出を容易にする配列特異的プライマーとその後組み合わせることができる「ユニバーサル」なステムループ配列又はヘアピン配列を設計することもできる。配列の主な必要条件は、その配列が、増幅のないときに安定な（したがって、効率的な消光を確実にする）ステムループ／ヘアピン構造を形成することである。したがって、プライマーの配列特異的部分は、鋳型鎖に結合し、相補鎖の合成を導く。したがって、プライマーは、１回目の増幅で増幅産物の一部になる。相補鎖が合成されるときには、ステムループ／ヘアピン構造を通って増幅が起こる。これにより、フルオロフォア分子と消光剤分子とが分離され、したがって、増幅が進行するにつれて蛍光の発生が誘導される。
【０１１６】
ステムループ構造は、増幅に使用されるプライマーの配列特異的部分の５’末端に見出されることが好ましい。
【０１１７】
上記のように、この検出配列は、一般的には、ＦＲＥＴ対で標識される。好ましくは、ＦＲＥＴ対のうち一方の部分は、配列の５’末端の方向に、５’末端の近く、又は５’末端に見出され、もう一方の部分は、配列の３’末端の方向に、３’末端の近く、又は３’末端に見出され、これにより、ステムループ又はヘアピン構造が完全なままであるときには、２つの部分の間でＦＲＥＴが有効である。
【０１１８】
実験の節に詳述するように、本発明の方法の感度及び特異性を確実にするために、プライマーを注意深く選択しなければならない。したがって、遺伝子のメチル化状態を検出するのに使用される特に好ましいプライマーとしては、以下に記載のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるプライマーが挙げられる：
５’― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧ ―３’ （配列番号 １）
及び／または、
５’ ― ＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡ ― ３’ （配列番号 ２）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡ ― ３’ （配列番号 ３）
及び／または、
５’ ― ＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧ ― ３’ （配列番号 ４）
及び／または、
５’― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧ ― ３' （配列番号 ５）
及び／または、
５ '― ＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴ ― ３' （配列番号 ６）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴ ― ３’ （配列番号 ７）
及び／または、
５' ― ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧ ― ３'（配列番号 ８）
及び／または、
５' ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴ ― ３'（配列番号 ９）
及び／または、
５' ― ＣＴＴＡＡＣＣＣＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣ ― ３'（配列番号 １０）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＣＴＴＡＡＣＣＣＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣ ― ３’ （配列番号 １１）
及び／または、
５’ ― ＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴ ― ３’（配列番号 １２）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧ ― ３’ （配列番号 １３）
及び／または、
５' ― ＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＡＴＣＣＴ ― ３' （配列番号 １４）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＡＴＣＣＴ ― ３’（配列番号 １５）
及び／または、
５’ ― ＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧ ― ３’ （配列番号 １６）
及び／または、
５' ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴ ― ３' （配列番号 １７）
及び／または、
５’ ― ＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴ ― ３’（配列番号 １８）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴ ― ３’（配列番号 １９）
及び／または、
５’ ― ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴ ― ３’（配列番号 ２０）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＧＴＴＴ ― ３’（配列番号 ２１）
及び／または、
５’ ― ＴＣＣＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＴＣ ― ３’（配列番号 ２２）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＣＣＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＴＣ ― ３’（配列番号 ２３）
及び／または、
５’ ― ＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＧＴＴＴ ― ３’（配列番号 ２４）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴ ― ３’（配列番号 ２５）
及び／または、
５’ ― ＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＣＣ ― ３’（配列番号 ２６）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＣＣ ― ３’（配列番号 ２７）
及び／または、
５’ ― ＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴ ― ３’（配列番号 ２８）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧ ― ３’（配列番号 ２９）
及び／または、
５’ ― ＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＡＡＡＡ ― ３’（配列番号 ３０）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＡＡＡＡ ― ３’（配列番号 ３１）
及び／または、
５’ ― ＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧ ― ３’（配列番号 ３２）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＴＴ ― ３’（配列番号 ３３）
及び／または、
５’ ― ＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴ ― ３’（配列番号 ３４）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴ ― ３’（配列番号 ３５）
及び／または、
５’ ― ＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＴＴ ― ３’（配列番号 ３６）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＧ ― ３’（配列番号 ３７）
及び／または、
５’ ― ＣＡＣＣＣＴＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡ ― ３’（配列番号 ３８）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＣＡＣＣＣＴＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡ ― ３’（配列番号 ３９）
及び／または、
５’ ― ＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＧ ― ３’（配列番号 ４０）
及び／または、
５’ ― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴ ― ３’（配列番号 ４１）
及び／または、
５’ ― ＡＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＣＡＣ ― ３’（配列番号 ４２）
及び／または、
５’ ―ＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴ ― ３’（配列番号 ４４）
及び／または、
５ '― ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵＴＧＧＡＡＴＴＴＡＧＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＴ― ３' （配列番号 ６１）
及び／または、
５’ ― ＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡ ― ３’ （配列番号 ６２）
及び／または、
５’― ＴＧＧＡＡＴＴＴＡＧＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＴ ― ３' （配列番号 ６３）。
【０１１９】
配列番号４及び８は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂの配列と相補的なフォワードプライマー（センスプライマー）配列である。
【０１２０】
配列番号１２、１６及び２０は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＣＴＡＧ２の配列と相補的なフォワードプライマー（センスプライマー）配列である。
【０１２１】
配列番号２４、２８、３２、３６及び４０は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＰＲＡＭＥの配列と相補的なフォワードプライマー（センスプライマー）配列である。
【０１２２】
配列番号４３は、ヘアピン構造の配列である。
【０１２３】
配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、及び３７は、ヘアピン構造の配列と、それぞれ配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６及び４０の配列とを含む。
【０１２４】
配列番号２及び６は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂプロモーターの配列と相補的なリバースプライマー（アンチセンスプライマー）配列である。
【０１２５】
配列番号１０、１４及び１８は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＣＴＡＧ２プロモーターの配列と相補的なリバースプライマー配列である。
【０１２６】
配列番号２２、２６、３０、３４及び３８は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＰＲＡＭＥプロモーターの配列と相補的なリバースプライマー配列である。
【０１２７】
配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５及び３９は、ヘアピン構造の配列と、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４及び３８の配列とを含む。
【０１２８】
配列番号４２及び４４は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されているベータアクチン遺伝子の配列と相補的なフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列である；配列番号４１は、ヘアピン構造の配列と配列番号４４の配列とを含む。
【０１２９】
配列番号６３は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＭａｇｅＡ３の配列と相補的なフォワードプライマー（センスプライマー）配列である。
【０１３０】
配列番号６１は、ヘアピン構造の配列と配列番号６３の配列とを含む。
【０１３１】
配列番号６２は、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化されていないＭａｇｅＡ３の配列と相補的なリバースプライマー配列である。
【０１３２】
実験の節に詳述しているように、ＣＴＡＧ２の発現及びメチル化のレベルは、配列番号９〜１２及び配列番号２１〜２０のうちいずれのプライマーを組み込んだアッセイで最良の一致を示した。実験の節に詳述しているように、ＰＲＡＭＥの発現及びメチル化のレベルは、配列番号２１〜４０のうちいずれのプライマーを組み込んだアッセイで最良の一致を示した。
【０１３３】
したがって、別の実施形態において、ＣＴＡＧ２の領域に結合する好ましいプライマーは、配列番号９〜１２及び配列番号２１〜２０のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる。ＰＲＡＭＥの領域に結合する好ましいプライマーは、配列番号２１〜４０のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる。
【０１３４】
別の低メチル化アッセイで生成された増幅産物は、以下の配列を有していた：
ＣＴＡＧ１Ｂ＿１ （１２９ ｂｐ）
ＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴ （配列番号 ４５）
ＣＴＡＧ１Ｂ＿２ （１３０ ｂｐ）
ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧ（配列番号 ４６）
ＣＴＡＧ２ （１５０ ｂｐ）
ＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧ （配列番号 ４７）
ＣＴＡＧ２＿２ （８０ ｂｐ）
ＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＧＡＴＡＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴ（配列番号 ４８）
ＣＴＡＧ２＿３ （１２５ ｂｐ）
ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＡＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＧＡＴＡＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧ （配列番号 ４９）
ＰＲＡＭＥ＿１ （１２９ ｂｐ）
ＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧ （配列番号 ５０）
ＰＲＡＭＥ＿２ （１０６ ｂｐ）
ＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴ （配列番号 ５１）
ＰＲＡＭＥ＿３ （１２０ ｂｐ）
ＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＡＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧ （配列番号 ５２）
ＰＲＡＭＥ＿４ （５９ ｂｐ）
ＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＴＴＴＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧ （配列番号 ５３）
ＰＲＡＭＥ＿６ （５０ ｂｐ）
ＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＴＧ （配列番号 ５４）
ＰＲＡＭＥ＿７ （９８ ｂｐ）
ＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＧＧＧＴＧ （配列番号 ５５）
【０１３５】
これらの配列は、それぞれの遺伝子のＣｐＧリッチアイランド中に位置する。したがって、本発明はさらに、亜硫酸水素塩で変換された、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５として記載のヌクレオチド配列の一部からなる、又はそれと相補的な、オリゴヌクレオチド、プライマー及び／又はプローブに関する。
【０１３６】
亜硫酸水素塩で変換されたＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子の配列の一部からなる、又はそれと相補的な、プライマーの部分は、３０ｂｐ未満であることが好ましい；これは、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７ｂｐの長さであることが好ましい。したがって、こうした好ましいプライマーのＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥに特異的な部分は、好ましくは、２８〜１６ｂｐの間、又は２７〜１７ｂｐの間の長さである。したがって、プライマーは、亜硫酸水素塩で変換された配列からなる、又は該配列と相補的な、連続した２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７塩基の任意の配列を含んでもよい。
【０１３７】
上に詳述したように、（プライマー対のうちの）プライマーのいずれか一方又は双方は、好ましくは５’末端に、ドナー及びアクセプター部分を有する好適なステムループ又はヘアピン構造で標識される、又は該構造を組み込むように合成されていてもよい。好ましい一実施形態において、プライマー（１種又は複数）のうち一方又は双方は、好ましくは５’末端に、
５’−ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵ−３’（配列番号４３）
として記載のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるステムループ構造で標識される、又は該構造を組み込むように合成されていてもよい。
【０１３８】
この検出配列は、一般的には、ＦＲＥＴ対で標識される。好ましくは、ＦＲＥＴ対のうち一方の部分は、配列の５’末端の方向に、５’末端の近く、又は５’末端に見出され、もう一方の部分は、配列の３’末端の方向に、３’末端の近く、又は３’末端に見出され、これにより、ステムループ又はヘアピン構造が完全なままであるときには、２つの部分の間でＦＲＥＴが有効である。特に好ましい一実施形態において、ステムループ又はヘアピン構造、特に、配列番号１として記載の配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなる核酸は、５’末端にＦＡＭで標識され、３’末端にＤＡＢＣＹＬで標識される。他の好ましい組合せについては本明細書に述べており、その説明は変準用される。
【０１３９】
これらのプライマーは、本発明の別々の態様を形成する。これらのプライマーのさらなる特徴については、以下の詳細な説明（実験部分）にまとめている。オリゴヌクレオチド、プライマー及びプローブ（配列）の異型を本発明において利用してもよいことに留意されたい。特に、追加のフランキング配列を、必要に応じて、例えば、結合特異性又はステムループ形成を増進させるために、付加することもできる。異型配列は、配列番号：１〜４２並びに配列番号：４４、６０、６１及び６２に記載のプライマー及び／又はプローブのヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有することが好ましい。プライマー及びヘアピン構造は、必要に応じて合成ヌクレオチド類似体を組み込んでいてもよく、又は例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはＰＮＡに基づくもの、又はこれらの混合物であってもよい。同様に、別な蛍光ドナー及びアクセプター部分／ＦＲＥＴ対を、必要に応じて利用することもできる。本発明の方法におけるプライマー及び／又はステムループ／ヘアピン構造としての機能が損なわれないのであれば、プライマーは、蛍光のドナー及びアクセプター部分で標識されることに加えて、修飾されたオリゴヌクレオチド並びに他の付加基及び標識を含んでもよい。
【０１４０】
それぞれのプライマー対について、少なくとも１つのプライマーは分子エネルギー移動対のドナー及びアクセプター部分で標識される。分子エネルギー移動対のドナー及びアクセプター部分は、増幅のないときには、アクセプター部分がドナー部分によって放出される蛍光を（励起と同時に）消光し、増幅中には、ステムループ構造が破壊され、ドナー部分とアクセプター部分とが、遺伝子の遺伝子コピー数の指標を提供するためにリアルタイムで検出される検出可能な蛍光シグナルを発生するように十分に分離されるように、配置された。好ましくは、ドナー部分及びアクセプター部分は、ＦＲＥＴ対である。一実施形態において、ドナー部分及びアクセプター部分は、５−カルボキシフルオレセイン又は６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、マラカイトグリーン、リアクティブレッド４、ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン、ピレンブチレート、エオシンニトロチロシン、エチジウム、及びテキサスレッドから選択される。さらなる一実施形態において、ドナー部分は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン又は６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、マラカイトグリーン、及びリアクティブレッド４から選択され、アクセプター部分は、ＤＡＢＣＹＬ、ローダミン、テトラメチルローダミン、ピレンブチレート、エオシンニトロチロシン、エチジウム、及びテキサスレッドから選択される。好ましくは、ドナー部分はフルオレセイン又はその誘導体であり、アクセプター部分はＤＡＢＣＹＬであり、最も好ましくは、ドナー部分は６−カルボキシフルオレセインである。特に多重化の場合における、他の好ましい組合せについては本明細書に述べており、本発明のこうした態様ではこれらの組合せも想定される。
【０１４１】
また、本発明は、本発明の方法を行うために使用することができるキットも提供する。キットは、本明細書に記載の本発明の多様な方法（及び使用）に関連して言及した好ましい特徴のうちのいずれかを含んでもよい。したがって、本発明は、少なくとも１種の本発明のプライマー対を含む、ＤＮＡ含有試料中のメチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の存在及び／又は量を検出するためのキットを提供する。好ましくは、キットは、メチル化されていない及び／又はメチル化されているＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の存在及び／又は量を検出するための本発明のプライマー対、並びに参照遺伝子、特に、ベータアクチンの存在及び／又は量を検出するためのプライマー対を含む。したがって、キットは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６０、６１又は６２として記載のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるプライマーを含むプライマー対を含んでもよい。好ましくは、上述のように（その説明はここで準用される）、それぞれのプライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、リアルタイムでの検出を容易にするために、適切なステムループ又はヘアピン構造で標識される。最も好ましくは、それぞれのプライマー対のうちの少なくとも一つのプライマーは、配列番号４３として記載のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるステムループ又はヘアピン構造を含む。ステムループ構造は、本明細書で述べているように（その説明はここで準用される）、適切なドナー及びアクセプター部分で標識される。
【０１４２】
上述のように、本発明のプライマーのさらなる特徴については、以下の詳細な説明（実験部分）にまとめている。これらの配列の異型を、本発明において本明細書で述べているように利用することができる。本明細書で述べているように、別な蛍光ドナー及びアクセプター部分／ＦＲＥＴ対を必要に応じて使用することもできる。
【０１４３】
一実施形態において、本発明のキットは、本明細書で述べているように（保護されたメチル化されているシトシン残基に優先して）、メチル化されていないシトシンを修飾する試薬をさらに含む。こうした試薬は、メチル化されていないシトシン残基からメチル化されているシトシン残基を識別するのに有用である。好ましい一実施形態において、試薬は、亜硫酸水素塩、好ましくは、亜硫酸水素ナトリウムを含む。この試薬は、メチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換することができるが、メチル化されているシトシンは変換されないままである。残基におけるこの相違は、例えばシトシンとウラシルとを識別するプライマー（シトシンはグアニンと対になるが、ウラシルはアデニンと対になる）を使用するＰＣＲなどのような下流の過程において、メチル化されているとメチル化されていない核酸とを識別するのに利用することができる。
【０１４４】
本発明の方法に関して本明細書に述べているように、該方法の質的な対照として機能する好適な対照を利用することができる。したがって、一実施形態では、本発明のキットはさらに、メチル化状態の知られている１つ又は複数の対照核酸分子を含む、該分子から本質的になる、又は該分子からなる。これらの（１種又は複数の）対照核酸分子は、メチル化されていることが知られている、若しくはメチル化されるように処理された核酸、及び／又はメチル化されていないことが知られている、若しくはメチル化されないように処理された核酸分子の双方を含んでもよい。一般的にはメチル化されていないが、メチル化されるように処理されることができる好適な内部参照遺伝子の一例は、ベータアクチンである。
【０１４５】
本発明のキットは、本発明の特許請求された方法を行うのに好適な緩衝液及び他の試薬をさらに含んでいてもよい。したがって、本発明の方法に関して提供している説明は、本明細書では変更すべきところは変更して適用され、簡潔性のために繰り返さないものとする。一実施形態において、本発明のキットは、さらに、核酸増幅緩衝液を含む、核酸増幅緩衝液から本質的になる、又は核酸増幅緩衝液からなる。
【０１４６】
該キットは、さらに、核酸増幅を触媒する酵素を含む、該酵素から本質的になる、又は該酵素からなるものでもよい。したがって、該キットは、さらに、核酸増幅用の好適なポリメラーゼを含む、該ポリメラーゼから本質的になる、又は該ポリメラーゼからなるものでもよい。例としては、例えばＴａｑ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔのような、ファミリーＡ及びファミリーＢの双方の型のポリメラーゼに由来するものが挙げられる。
【０１４７】
キットの様々な構成要素は、個別の仕切りの中に別々に包装されていてもよく、又は例えば、必要に応じて、一緒に収納されていてもよい。
【０１４８】
キットは、例えば、別の用紙に印刷するか又はキットの包装内に組み込まれていてもよい、使用のための好適な説明書も含んでいてもよい。説明書は、適切なリアルタイム増幅装置又はエンドポイント検出装置、そのうちのいくつかは市販されている、を用いた本発明のキットを使用するのを容易にし得る。
【０１４９】
本発明のリアルタイム法の最後のステップは、リアルタイム検出の結果を、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子、及び任意選択で参照遺伝子（含まれる場合）、についての標準曲線に対して定量することを含む。標準曲線は、１組の標準を使用して作製することができる。それぞれの標準は、必要に応じて、既知のコピー数、又は濃度の目的遺伝子及び／又は参照遺伝子を含む。典型的には、蛍光のベースライン値は、バックグラウンドの蛍光に対して設定されることになる。例えば、一実施形態において、シーケンスディテクションシステム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＤＳ）ソフトウェアを使用する。このソフトウェアは、増幅産物を検出する前に、３〜１５サイクルの増幅反応のデフォルトベースラインの範囲を設定する。次いで、このベースラインより上の統計学的に有意な値で、蛍光の閾値を定める。典型的には、この閾値は、ベースラインの蛍光よりも１０標準偏差上に設定される。リアルタイム増幅反応を行うための装置と共に、適切なソフトウェアが提供される。該ソフトウェアは、反応のベースライン値及び閾値を自動的に算出する。次いで、各標準について、サイクル閾値（Ｃｔ）を決定することができる。これは、閾値の増幅レベルを達成するのに必要とされるサイクル数である。したがって、反応混合物中の遺伝子標準の初期濃度が高いほど、特定収量の増幅産物を得るのに必要とされるサイクル数は少なくなる。１組の標準ＤＮＡの既知の初期コピー数のｌｏｇ_１０に対するＣｔのプロットは、直線になる。これが標準曲線である。したがって、ＤＮＡ含有試料中のコピー数を決定するために、目的遺伝子及び参照遺伝子の増幅についてのＣｔ値を、利用する場合には、それぞれの標準曲線に対してそれぞれ補間することができる。したがって、該方法の結果として、目的遺伝子及び参照遺伝子のそれぞれの遺伝子コピー数が得られる。これらの結果は、メチル化されている又はメチル化されていない目的遺伝子の遺伝子コピー数を参照遺伝子の遺伝子コピー数で除算することによって標準化することができる。好ましい一実施形態では、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、本発明の方法を行う。好ましくは、個々の検出器用のベースライン値及び閾値を自動的に生成するためのオートシーティー（Ａｕｔｏ ＣＴ）アルゴリズムのような好適なアルゴリズムを含むことが好ましい、ＳＤＳソフトウェアを利用する。
【０１５０】
本発明の方法は、任意の好適な増幅技術と共に利用することができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅を行うことが最も好ましい。したがって、ＰＣＲが好ましい増幅法であるが、ネステッドＰＣＲなどの基本技術上の変形を含めるために、同等のものを本発明の範囲内に含めることもできる。例としては、限定されるものではないが、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ及び三重増幅のような等温増幅技術などが挙げられ、これらは全て当技術分野でよく知られており、好適な試薬が市販されている。他の好適な増幅法としては、限定されるものではないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０）、ＭＬＰＡ、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，４３７，９７５号）、インベーダー技術（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、鎖置換技術、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（国際公開第９０／０６９９５号パンフレット）及びニック置換増幅（国際公開第２００４／０６７７２６号パンフレット）などが挙げられる。
【０１５１】
本発明のリアルタイムＰＣＲ法は、一般的には、プライマーをアニーリングさせるために温度を低下させるステップ、プライマー伸長のために温度を上昇させるステップ、変性のために温度を上昇させるステップ及びデータ収集のために温度を低下させるステップを含む。特定の一実施形態において、データ収集のステップは、約５６℃〜６３℃、最も好ましくは約５７℃又は６２℃の間の温度で行われるが、実施例の節で述べているように、この温度で最も感度の高い特異的な結果が得られることが示されているからである。
【０１５２】
特定の一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応の温度プロファイリングは、以下のサイクルの４０〜５０回の間の反復、好ましくは約４５回の反復を含む：
（ａ）約５０℃で約２分間
（ｂ）約９５℃で約１０分間
（ｃ）約９５℃で約１５秒間
（ｄ）約５７℃で約１分間
本発明の方法において特異的且つ高感度の結果をもたらすことが示された好ましい反応スキームは、段階１：５０℃で２分間、段階２：９５℃で１０分間、段階３：９５℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、５７℃で３０秒間（＝プラトーデータ収集）を４５回反復するものである。
【０１５３】
本発明の方法は、同一の反応において２種類以上の目的遺伝子を検出するために使用することができる。特定の数セットのプライマーの使用を通して、同一の反応混合物中で数種類の核酸標的の増幅を行うことができる。これは、「多重化」と呼ばれることもある。好ましい一実施形態において、各標的用の一方又は双方のプライマーは、ＦＲＥＴ対を形成する蛍光部分と消光部分とで標識されたヘアピンプライマーであってもよい。いくつかの核酸標的の増幅には、異なる発光波長を有する、異なる蛍光ドナー及び／又はアクセプター部分が、各プライマーセットを標識するために使用される必要がある。増幅後の検出及び分析の間に、反応混合物は、反応に使用する各プライマーセットに特有の、それぞれの特定の波長において、照射され、読み取れる。したがって、混合物中のどの特定の標的ＤＮＡが増幅されて標識されたかを決定することができる。特定の一実施形態では、異なるそれぞれの標的配列の増幅用の２種類以上のプライマー対を使用する。したがって、一区画のメチル化されている／メチル化されていない目的遺伝子の存在及び／又は量を、単一のＤＮＡ含有試料中で検出することができる。
【０１５４】
多重化は、同一反応物中で目的遺伝子及び参照遺伝子の双方を検出する場合にも利用することができる。ここでも、識別可能な適切なドナー部分及び／又はアクセプター部分で標識されたプライマーにより、目的遺伝子及び参照遺伝子の増幅により生じたシグナルを、それぞれ識別することができる。
【０１５５】
一実施形態では、識別可能な発光波長極大をそれぞれ有する好適なフルオロフォアドナーと共に、ユニバーサル消光剤が利用される。特に好ましい消光剤は、ＤＡＢＣＹＬである。多重化を可能にするために、消光剤としてのＤＡＢＣＹＬと共に、以下のフルオロフォアをそれぞれ利用することもできる：クマリン（発光極大４７５ｎｍ）、ＥＤＡＮＳ（４９１ｎｍ）、フルオレセイン（５１５ｎｍ）、ルシファーイエロー（５２３ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（５２５ｎｍ）、エオシン（５４３ｎｍ）、テトラメチルローダミン（５７５ｎｍ）及びテキサスレッド（６１５ｎｍ）（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、１９９８年１月；４９〜５３）。他の好ましい組合せについては、本明細書に述べている。
【０１５６】
一代替実施形態において、直接比較可能な結果を得るために、ＤＮＡ含有試料を分割して、好適な一部の該試料について本発明の方法を行うことができる。したがって、目的遺伝子及び参照遺伝子の双方を検出する場合に、試料を一方の試料部分で目的遺伝子の増幅をリアルタイムで検出し、他方の試料部分で参照遺伝子の増幅をリアルタイムで検出することを可能にするために、２つに分割してもよい。必要に応じて、試料をさらに分割して、好適な対照反応を行うこともできる。このスキームの利点は、各プライマー対を標識するためにユニバーサルＦＲＥＴ対を使用することができ、様々な波長で発光を検出する必要性がなくなることである。しかし、この方法は、最初に試料を分割できるような好適な試料が得られるに依存する。任意の好適な反応量を用いることができるが、特定の一実施形態では、増幅ステップのための全反応量は約１０〜４０μｌの間であり、約１０〜３０μｌの間がより好ましく、約１２μｌが最も好ましい。
【０１５７】
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法は、癌又は癌素質を診断するのに使用され、ここで、該試料中のメチル化されていない（又は低メチル化された）ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在は、癌又は癌素質を示している。したがって、本発明は、癌又は癌素質を診断するためのキット、方法及びプライマーを提供する。
【０１５８】
本明細書では、「診断」とは、疾患又は疾患の前段階のスクリーニング、疾患又は疾患の前段階の特定、疾患の病期及び状態及び進行のモニタリング、治療後の疾患の再発の検査並びに特定の治療の成功のモニタリングを含むと定義する。その試験には予測値があってもよく、これは「診断」という用語の定義の範囲内に含まれる。この試験の予測値は、癌になりやすい可能性のマーカーとして、又は癌への進行のマーカーとして使用することができる。したがって、患者における確認可能な症状として、疾患がそれ自体を現す機会がある前に、危険性のある患者を特定することができる。好ましい一実施形態において、癌は、肺癌、黒色腫又は乳癌から選択される。好ましい一実施形態において、診断のための方法及びアッセイでは、ＣＴＡＧ１Ｂマーカー用に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列を構成する、該配列から本質的になる、又は該配列からなる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを使用する。診断のための方法及びアッセイでは、ＣＴＡＧ２マーカー用に、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列を構成する、該配列から本質的になる、又は該配列からなる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを使用する。診断のための方法及びアッセイでは、ＰＲＡＭＥマーカー用に、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列を構成する、該配列から本質的になる、又は該配列からなる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを使用する。好ましい一実施形態において、癌又は癌素質の診断では、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列を構成する、該配列から本質的になる、又は該配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子の非メチル化型を検出する。
【０１５９】
試験は、診断的に又は治療法と併せて行うことができる。ＮＳＣＬＣ、乳癌又は黒色腫におけるＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥの発現の予測値を確定するＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に適する患者の選出においてその用途が見出される。本発明者は、本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対又はキットを用いる、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を検出するために設計されたアッセイが、試料をＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の発現で確実に分類することができることを示している。低メチル化試験で得られるメチル化状態の結果は、ＲＮＡ試料に使用される、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥの検出についての既存のＲＴ−ＰＣＲ試験で得られる結果と良く一致する。
【０１６０】
ｑＲＴ−ＰＣＲが困難であることが立証されている、例えば非小肺癌からの細針生検などの試料を利用する場合には、ＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を決定することによって検出されるタンパク質発現が有用な代替を提供する。したがって、メチル化試験は、臨床的な用途を有する。このように、本発明の全ての方法は、細針生検試料に適用することができる。特定の実施形態において、ＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子のメチル化状態が決定される。上に示した試料は、（ＭＡＧＥ−Ａ３）発現を検出する代替法を実施するのに適していない。これらの試料には、少数の細胞しか含まれていないことがあり、結果として、低レベルのＤＮＡが含まれている。例えば、こうした試料は、各アッセイにつき、約７０〜１５０μｇの間のインプットＤＮＡの使用のみ許容することができる。実施例４に示すように、本発明の方法は、細針生検試料の使用に有効である。
【０１６１】
さらなる一態様において、本発明は、対象において癌の治療に成功する可能性を予測する方法であって、
（ａ）対象から得られたＤＮＡ含有試験試料を、ＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化されているシトシン残基は修飾しない試薬で接触／処理するステップと、
（ｂ）プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーが、メチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合するように設計された、少なくとも１種のプライマー対を使用して、試薬での処理後にメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥ各遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであり、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６０及び６１のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、又は該配列からなるステップと、
（ｃ）ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を決定するステップと
を含み、試料中のメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在は、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子が検出されない又はその検出レベルがより低い場合よりも、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に成功する可能性が高いことを示す方法を提供する。
【０１６２】
ステップ（ｃ）には、増幅産物が形成されたかどうかを識別することが含まれる。この増幅産物の識別（本明細書で述べているように、任意の好適な技術を使用する）は、試料中のメチル化されていない又は低メチル化されたＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在を示す。
【０１６３】
当然、逆の状況も適用可能であり、そのため、本発明の方法は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬に抵抗性である可能性、又は該免疫治療薬を使用した治療が成功しない可能性が高いかを決定するために、同様に利用することもできる―試料中にメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３がないことは、治療に対して抵抗性である可能性、及び／又はその治療が成功しない可能性が高いことを示している。特定の実施形態では、補完的な方法において、メチル化されているＤＮＡに特異的なプライマーを用いることもできる。
【０１６４】
また、本発明の方法は、患者に適した治療のコースを選択するために利用することもできる−メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を有益に投与することができることを示しており、これに対して、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３のないこと又はそのレベルが低いことは、免疫治療薬が禁忌であることを示している。本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法に関して提供している説明は、本態様に準用され、したがって、本発明のこの態様では、必要に応じて、全ての実施形態が想定される。
【０１６５】
「治療に成功する可能性」とは、挙げられた治療剤のうちのいずれかの１種又は複数、好ましくは、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬又はＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３を含む組成物を使用する癌の治療が成功するであろう確率を意味する。
【０１６６】
「抵抗性」とは、特定の免疫治療薬のうちのいずれかの１種を使用して癌の治療が成功するであろう可能性の低下及び／又は治療効果を達成するためにより高い用量が必要とされるであろうこととして定義される。
【０１６７】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の低メチル化は、特定の癌種と関連し得る。したがって、特定の一実施形態において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用して、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む試料において乳癌、ＮＳＣＬＣを含む肺癌、又は黒色腫の素質又は発生を検出する方法であって、試料におけるメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の検出は、癌、及び特に、黒色腫；非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌；又は乳癌の素質又は発生を示す方法を提供する。さらなる一実施形態において、該腫瘍又は癌は、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌；食道癌を含む頭頸部癌；子宮頸癌、大腸癌、扁平上皮癌；肝癌；多発性骨髄腫及び大腸癌から選択される。
【０１６８】
さらなる一態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用して、試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含むＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３陽性の腫瘍の存在を決定する方法であって、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の存在は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３陽性の腫瘍の存在を示す方法を提供する。
【０１６９】
試験は、診断的に又は治療法と併せて行うことができる。試験は、どのような治療法又は予防法を患者に用いるかを決定するために使用することもでき、治療法の有効性を調べるために使用することもできる。
【０１７０】
したがって、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用して、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含むＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に適する患者を特定及び／又は選出する方法であって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子がメチル化されていない場合は、対象が、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に特定及び／又は選出される方法をさらに提供する。
【０１７１】
これに対して、該遺伝子がメチル化されている場合は、対象は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に選出されないことが好ましい。
【０１７２】
関連する一態様において、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用して、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む癌の治療に成功する可能性を予測する方法であって、遺伝子がメチル化されていない場合は、遺伝子がメチル化されている場合よりも、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に成功する可能性が高い方法を提供する。
【０１７３】
これに対して、試料中にメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３がないことは、遺伝子がメチル化されていない場合よりも、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３免疫治療薬を用いた治療に対して抵抗性である可能性が高いことを示す。したがって、メチル化されているＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の検出（又は低メチル化されている遺伝子の検出がないこと）は、免疫治療薬を用いた治療に成功する可能性が低いことを示す。
【０１７４】
したがって、患者のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態に基づいて、治療に患者群を選出することができる。これにより、はるかに焦点が定められ、個別化された型の医療がもたらされ、したがって、有効である可能性の最も高い薬剤で患者が治療されるであろうために成功率の改善につながる。
【０１７５】
関連するさらなる一態様において、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用して、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を検出することを含む癌の適切な治療計画を選択する方法であって、遺伝子がメチル化されていない場合は、治療に免疫治療薬（特に、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３の免疫治療薬）が選択される方法を提供する。
【０１７６】
これに対して、該遺伝子がメチル化されている場合は、免疫治療薬を用いた治療は禁忌である。
【０１７７】
免疫治療薬の投与を含む対象において癌を治療する方法であって、本発明の方法のうちのいずれかによって、或いは本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、プライマー対、キット又は方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて、対象が治療に選出されている方法がさらに提供される。本明細書に記載の種々の態様の全てについて、メチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３遺伝子の検出が、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及び／又はＭａｇｅＡ３タンパク質のレベルの増加に相当していることが好ましい。
【０１７８】
本発明において有用な、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥ免疫治療薬としては、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥを主成分とした組成物を含む。ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む組成物の例としては、全長のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３又はＰＲＡＭＥ、ほぼ全長のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥ、及び例えばＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３又はＰＲＡＭＥのペプチドなどのＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３又はＰＲＡＭＥの断片を含む組成物などが挙げられる。
【０１７９】
本発明において使用できるペプチドの例としては、以下のＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドなどが挙げられる：
【０１８０】
【表１】

【０１８１】
ＭＡＧＥタンパク質は、全長のＭＡＧＥ−Ａ３であってもよく、又はほぼ全長のＭＡＧＥ３の断片、例えばＭＡＧＥ３（全３１２アミノ酸）のアミノ酸３〜３１４、若しくは１〜１０個の間のアミノ酸がＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質のＮ末端及び／若しくはＣ末端から欠失された他のＭＡＧＥ−Ａ３断片を含んでもよい。
【０１８２】
一実施形態において、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥのタンパク質、断片又はペプチドは、融合パートナータンパク質に連結されていてもよい。
【０１８３】
本発明において使用できる抗原の例としては、以下のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥ抗原を含む：
【０１８４】
例えば、ＣＴＡＧ１Ｂの好適なペプチドとしては、Ｊａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２２）：１２１９８〜１２２０３（２０００）に開示されている、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合モチーフを有するペプチド、例えばペプチド１５７〜１６７、１５７〜１６５及び１５５〜１６３を含む。ＣＴＡＧ１Ｂのペプチドは、例えば、Ａ３１、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＰ４、Ｂ３５、Ｂ５１、Ｃｗ３、Ｃｗ６及びＡ２として知られる、１個又は複数のＭＨＣクラス１又はクラス２のエピトープを含んでもよい（国際公開第２００８／０８９０７４号パンフレットを参照されたい）。
【０１８５】
例えば、ＰＲＡＭＥのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合モチーフを有するペプチド、例えばＬＹＶＤＳＬＦＦＬ、ＡＬＹＶＤＳＬＦＦＬ、ＶＬＤＧＬＤＶＬＬ、ＳＬＹＳＦＰＥＡ及びＳＬＬＱＨＩＬＧＬペプチドなどを含んでもよい（Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉら、Ｂｌｏｏｄ、１ ２００８年９月、第１１２巻、第５号、１８７６〜１８８５ページを参照されたい）。ＰＲＡＭＥのペプチドは、１個又は複数のＭＨＣクラス１又はクラス２のエピトープを含んでもよい。
【０１８６】
例えば、ＣＴＡＧ２のペプチドは、Ｓｕｎら Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ 第５５巻、第６号／２００６年６月に開示されているように、ＥＬＶＲＲＩＬＳＲ、ＭＬＭＡＱＥＡＬＡＦＬ、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、ＬＡＡＱＥＲＲＶＰＲを含んでもよい。
【０１８７】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥのタンパク質、断片又はペプチドと融合パートナータンパク質とは、化学的にコンジュゲートされていてもよく、又は組換え融合タンパク質として発現されてもよい。抗原とパートナーとが組換え融合タンパク質として発現させる一実施形態では、非融合タンパク質と比較して、発現系において産生されるレベルの増加を可能にし得る。したがって、融合パートナータンパク質は、ヘルパーＴエピトープ（免疫学的融合パートナータンパク質）、好ましくは、ヒトによって認識されるヘルパーＴエピトープを提供すること、及び／又は天然の組換えタンパク質よりも高収量でタンパク質（発現増強タンパク質）を発現することを補助し得る。一実施形態において、融合パートナータンパク質は、免疫学的融合パートナータンパク質及び発現増強パートナータンパク質の双方であってもよい。
【０１８８】
本発明の一実施形態において、使用することができる免疫学的融合パートナータンパク質は、グラム陰性菌ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤ（国際公開第９１／１８９２６号パンフレット）又はその誘導体から得られる。プロテインＤ誘導体は、該タンパク質の最初の１／３、又は該タンパク質の最初の約１／３を含んでもよい。一実施形態において、プロテインＤのＮ末端の最初の１０９残基は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥ−Ａ３及び／又はＰＲＡＭＥの抗原に付加的な外来性Ｔ細胞エピトープを提供し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現レベルを上昇させる（したがって、発現エンハンサーとしても働いている）ための融合パートナーとして使用することができる。一代替実施形態において、該プロテインＤ誘導体は、Ｎ末端の最初の１００〜１１０アミノ酸又はおよそＮ末端の最初の１００〜１１０アミノ酸を含んでもよい。一実施形態において、プロテインＤ又はその誘導体に脂質が付加されて、リポプロテインＤを使用することもできる：脂質テールにより、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にすることができる。一代替実施形態において、プロテインＤ又はその誘導体は脂質付加されない。プロテインＤの「分泌配列」又は「シグナル配列」とは、天然に存在するタンパク質の約１〜１６、１７、１８又は１９のアミノ酸を指す。一実施形態において、プロテインＤの分泌配列又はシグナル配列とは、プロテインＤのＮ末端の１９アミノ酸を指す。一実施形態において、分泌配列又はシグナル配列は、プロテインＤ融合パートナーのＮ末端に含まれる。本明細書で使用される場合、「最初の３分の１（１／３）」、「最初の１０９アミノ酸」及び「Ｎ末端の最初の１００〜１１０アミノ酸」とは、分泌配列又はシグナル配列の直後のプロテインＤ配列のアミノ酸を指す。シグナル配列のアミノ酸２−Ｋ及び３−Ｌは、任意でアミノ酸２−Ｍ及び３−Ｄで置換されてもよい。
【０１８９】
一実施形態において、免疫療法用の抗原は、以下の構築物の形態でプロテインＤと融合されていてもよい：プロテインＤ−ＣＴＡＧ１Ｂ−Ｈｉｓ、又はプロテインＤ−ＣＴＡＧ２−Ｈｉｓ、又はプロテインＤ−ＰＲＡＭＥ−Ｈｉｓ、又はプロテインＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓ。この融合タンパク質は、プロテインＤのシグナル配列、プロテインＤのアミノ酸１〜１０９、免疫療法用の抗原（全長の又は部分的なタンパク質配列であってもよい）、スペーサー及び製造過程中の融合タンパク質の精製を容易にすることができるポリヒスチジンテール（Ｈｉｓ）を含んでもよく、例えば以下のようなものである：
ｉ）プロテインＤの１８残基のシグナル配列及びＮ末端の最初の１０９残基；
ｉｉ）関連のない２残基（メチオニン及びアスパラギン酸）；
ｉｉｉ）免疫療法用の抗原；
ｉｖ）ヒンジ領域として機能している２個のグリシン残基；並びに
ｖ）７個のヒスチジン残基。
【０１９０】
利用されるプロテインＤの部分は、分泌配列又はシグナル配列を含んでいないことが好ましい。特定の実施形態では、融合パートナータンパク質は、融合タンパク質配列のＮ末端に又はＮ末端の中にアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを含み、プロテインＤの分泌配列又はシグナル配列を含まない。例えば、融合パートナータンパク質は、およそ又は正確に、プロテインＤのアミノ酸１７〜１２７、１８〜１２７、１９〜１２７又は２０〜１２７を含む、又はそれらからなるものでもよい。
【０１９１】
例えば、プロテインＤとの融合タンパク質に基づく好適なＰＲＡＭＥ抗原は、国際公開第２００８／０８７１０２号パンフレットに記載されており、その文書は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている。
【０１９２】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナータンパク質は、ＬｙｔＡとして知られるタンパク質又はそれから誘導されるタンパク質であってもよい。ＬｙｔＡは、ペプチドグリカン主鎖中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素であるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬｙｔＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によってコードされる（Ｇｅｎｅ、４３（１９８６）２６５〜２７２ページ））を合成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する。ＬｙｔＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリン、又はＤＥＡＥなどのいくつかのコリン類似体に対する親和性に重要である。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ−ＬｙｔＡ発現プラスミドの開発に利用されている。アミノ末端にＣ−ＬｙｔＡ断片を含むハイブリッドタンパク質の精製が記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：１０、（１９９２）７９５〜７９８ページ）。一実施形態において、この分子のＣ末端部分を使用することもできる。Ｃ末端に見出される残基１７８から始まるＬｙｔＡ分子のリピート部分を使用することもできる。一実施形態において、ＬｙｔＡ部分は、残基１８８〜３０５を組み込んでいてもよい。
【０１９３】
他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルスからの非構造タンパク質であるＮＳ１（血球凝集素）などが挙げられる。一実施形態では、ＮＳ１のＮ末端の８１個のアミノ酸を利用するが、ヘルパーＴエピトープを含むものであれば、別の断片を使用することもできる。
【０１９４】
本発明の一実施形態において、免疫療法において使用される抗原は、誘導体化された遊離チオールを含んでもよい。本発明の一実施形態において、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は、誘導体化された遊離チオールを含んでもよい。こうした抗原は、国際公開第９９／４０１８８号パンフレットに記載されている。特に、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化されている誘導体を使用することができる。
【０１９５】
免疫療法用の抗原は、融合の形態で又は混加物中で、他の免疫療法抗原と組み合わせて使用することができる。例えば、ＣＴＡＧ１Ｂは、ＣＴＡＧ２、又はその断片との融合物として用いることができ、国際公開第２００８／０８９０７４号パンフレットを参照されたく、その文書は参照により本明細書にその全体が組み込まれている。
【０１９６】
免疫治療薬の組合せとしては、融合タンパク質又は混加物のいずれかとして、例えば、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ又はＭＡＧＥ３のうち２種類以上の任意の組合せなどが挙げられるが、本発明はこれらの特定の抗原に限定されず、任意の免疫療法抗原を使用することができる。例えば、ＭＡＧＥ−３抗原は、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１と組み合わせて製剤化するのに好適であるとして記載されている；国際公開第２００５／１０５１３９号パンフレットを参照されたく、その文書は参照により本明細書にその全体が組み込まれている。
【０１９７】
さらなる一実施形態において、本発明で使用される免疫治療薬は、本明細書に記載の免疫療法のタンパク質、断片若しくはペプチド、又は融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでもよい。本発明の一実施形態において、その配列を好適な発現ベクター中に挿入して、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種に使用することができる。また、核酸を発現する微生物ベクターを、ベクター送達免疫治療薬として使用することもできる。
【０１９８】
好適なウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルス、アルファウイルス、カナリアポックスウイルスなどのポックスウイルス及びワクシニアウイルスに基づくシステムが挙げられる。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は、当業者に知られている。本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定に組み込むために、例えばレトロウイルスベクターを使用することができるが、こうした組換えは好ましくない。対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターは、エピソームの状態を維持し、したがって、一過性発現を可能にする。例えばサブユニットワクチンとしての使用又は免疫アッセイでの使用のために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を大量に産生させるために、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞、酵母又は細菌において発現を引き起こすことができるベクターを使用することができる。
【０１９９】
好ましい一実施形態において、生物ベクターとして使用されるアデノウイルスは、複製欠損サルアデノウイルスである。典型的には、これらのウイルスは、Ｅ１欠失を有しており、Ｅ１遺伝子で形質転換された細胞株において増殖させることができる。好ましいサルアデノウイルスは、チンパンジーから単離されたウイルスである。特に、Ｃ６８（Ｐａｎ９としても知られる）（米国特許第６，０８３，７１６号を参照されたい）並びにＰａｎ５、Ｐａｎ６及びＰａｎ７（国際公開第０３／０４６１２４号パンフレット）は、本発明における使用に好ましい。これらのベクターは、本発明の異種遺伝子を挿入し、その遺伝子産物を発現できるように操作されることができる。こうした組換えアデノウイルスベクターの使用、製剤及び製造は、国際公開第０３／０４６１４２号パンフレットに詳細に記載されている。
【０２００】
核酸配列を得るための従来の組換え技術、及び発現ベクターの作製については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８２〜１９８９に記載されている。
【０２０１】
タンパク質に基づく組成物の場合、本発明のタンパク質は、液体に可溶化された形態、又は凍結乾燥形態のいずれかで提供することができる。
【０２０２】
それぞれのヒトの用量は、１〜１０００μｇのタンパク質を含んでもよい。一実施形態において、該用量は、３０〜３００μｇのタンパク質を含んでもよい。
【０２０３】
本明細書に記載の免疫療法用の組成物は、ワクチンアジュバント、及び／又は免疫賦活性サイトカイン若しくはケモカインをさらに含んでもよい。したがって、本明細書に適用されている「免疫治療薬」という用語は、適切なアジュバントを含む、本明細書に記載の全ての免疫療法用の組成物を含み得る。
【０２０４】
本発明における使用に好適なワクチンアジュバントは、市販されており、例えば、不完全フロイントアジュバント及び完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオン又は陰イオンで誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡ及びクイルＡなどである。ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２、インターロイキン−７、若しくはインターロイキン−１２などのサイトカイン、及びケモカインもアジュバントとして使用することができる。
【０２０５】
一実施形態において、アジュバントは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）などのモノホスホリルリピドＡと、アルミニウム塩との組合せを含んでもよい。或いは、アジュバントは、国際公開第９８／５０３９９号パンフレット、国際公開第０１／３４６１７号パンフレット及び国際公開第０３／０６５８０６号パンフレットに開示されている、３Ｄ−ＭＰＬ、又はアミノアルキルグルコサミニドリン酸のような他のｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドを含んでもよい。
【０２０６】
使用可能なもう１種のアジュバントは、単独で又は他のアジュバントと組み合わせて使用することができる、サポニン、例えばＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）である。例えば、一実施形態において、例えば国際公開第９４／００１５３号パンフレットに記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せのような、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組合せ、又は国際公開第９６／３３７３９号パンフレットに記載されている、ＱＳ２１がコレステロールで消光された組成物が提供される。他の好適な製剤は、水中油型乳剤及びトコフェロールを含む。一実施形態において、アジュバントは、国際公開第９５／１７２１０号パンフレットに記載されているように、水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む。
【０２０７】
本発明において使用される他のアジュバントは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのようなＴＬＲ９アンタゴニストを含み得る。こうしたオリゴヌクレオチドは、よく知られており、例えば国際公開第９６／０２５５５号パンフレットに、記載されている。
【０２０８】
（この場合に）本発明における使用に好適なオリゴヌクレオチドは、以下を含んでもよい：
【０２０９】
【表２】

【０２１０】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはまた、単独で又は他のアジュバントと組み合わせて使用することができる。例えば、一実施形態において、アジュバントは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合せ、特に、国際公開第００／０９１５９号パンフレット及び国際公開第００／６２８００号パンフレットに開示されているＣｐＧとＱＳ２１との組合せを含む。
【０２１１】
したがって、本明細書に記載の免疫治療薬を含む組成物が提供され、ここで、アジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリエチレンエーテル又はエステルのうちの１つ又は複数、又はこれらのアジュバントの２種類以上の組合せを含む。特定の実施形態において、組成物中の免疫治療薬の成分は、水中油型若しくは油中水型乳化賦形剤中又はリポソーム製剤中で提示することができる。
【０２１２】
一実施形態において、アジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１及び免疫賦活性ＣｐＧオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数を含んでもよい。一実施形態において、３種類全てのアジュバント成分が存在する。該成分は、国際公開第９５／１７２１０号パンフレットに記載されているように、リポソーム製剤又は水中油型乳剤中のいずれでも提示することができる。
【０２１３】
別の実施形態において、３Ｄ ＭＰＬ−及びＱＳ２１は、水中油型乳剤中で、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの非存在下で提示される。
【０２１４】
使用される３Ｄ−ＭＰＬの量は、一般的に少量であるが、製剤によっては、用量あたり１〜１０００μｇ、好ましくは用量あたり１〜５００μｇ、より好ましくは用量あたり１〜１００μｇの間の範囲にあってもよい。
【０２１５】
本発明のアジュバント中のＣｐＧ又は免疫賦活性オリゴヌクレオチドの量は、一般的には少量であるが、製剤によっては、用量あたり１〜１０００μｇ、好ましくは用量あたり１〜５００μｇ、より好ましくは用量あたり１〜１００μｇの間の範囲にあってもよい。
【０２１６】
本発明のアジュバント中で使用されるサポニンの量は、用量あたり１〜１０００μｇ、好ましくは用量あたり１〜５００μｇ、より好ましくは用量あたり１〜２５０μｇ、最も好ましくは用量あたり１〜１００μｇの間の範囲にあってもよい。
【０２１７】
本明細書に記載のアジュバント製剤は、水中油型乳剤及び／又はトコフェロールをさらに含んでいてもよく、又はリポソーム組成物中に製剤化されていてもよい。
【０２１８】
他の好適なアジュバントとしては、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、リビ デトックス（Ｒｉｂｉ Ｄｅｔｏｘ）、ＲＣ−５２９（ＧＳＫ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）及び他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）などが挙げられる。
【０２１９】
一般的には、それぞれのヒトの用量は、０．１〜１０００μｇ、例えば、０．１〜５００μｇ、０．１〜１００μｇ、又は０．１〜５０μｇの抗原を含んでもよい。特定の免疫治療薬の最適量は、ワクチン接種した対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な治験によって確認することができる。初回ワクチン接種後に、対象は、適切に間隔を空けた１回又は数回の追加免疫を受けることもできる。
【０２２０】
或いは、本発明の方法において使用される組成物は、本明細書に記載の免疫治療薬を、薬学的に許容される添加剤と組み合わせて含む医薬組成物を含んでもよい。
【０２２１】
ここで、以下の非限定的な実施例に関して、本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】染色体上のＣＴＡＧ１Ｂアッセイの局在を示す図である。可能性のある１つの転写開始点（ＴＳＳ）を記載している。この遺伝子構造の始まりを以下のように表している：白い四角形は３００ｂｐのプロモーター領域を表し、可能性のあるＴＳＳを示している縦線がこれに続き、次いで、濃い四角形が第１エキソンを表す。各アッセイ部位を、各部位に該当する名称の前にあるそれぞれの白い四角形で示し、「（Ｕ）」は、非メチル化特異的アッセイ（すなわち、低メチル化に特異的なアッセイ）を示している。ＣｐＧカウントの数は、２０ｋｂの領域にわたってスポットされている。
【図２】染色体上のＣＴＡＧ２アッセイの局在を示す図である。可能性のある１つの転写開始点（ＴＳＳ）を記載している。この遺伝子構造の始まりを以下のように表している：白い四角形は３００ｂｐのプロモーター領域を表し、可能性のあるＴＳＳを示している縦線がこれに続き、次いで、濃い四角形が第１エキソンを表す。各アッセイ部位を、各部位に該当する名称の前にあるそれぞれの白い四角形で示し、「（Ｕ）」は、非メチル化特異的アッセイ（すなわち、低メチル化に特異的なアッセイ）を示している。ＣｐＧカウントの数は、２０ｋｂの領域にわたってスポットされている。ＣＴＡＧ２には、ＣＴＡＧ２＿１という名称もつけられている。
【図３】染色体上のＰＲＡＭＥアッセイの局在を示す図である。可能性のある１つの転写開始点（ＴＳＳ）を記載している。この遺伝子構造の始まりを以下のように表している：白い四角形は３００ｂｐのプロモーター領域を表し、可能性のあるＴＳＳを示している縦線がこれに続き、次いで、濃い四角形が第１エキソンを表す。各アッセイ部位を、各部位に該当する名称の前にあるそれぞれの白い四角形で示し、「（Ｕ）」は、非メチル化特異的アッセイ（すなわち、低メチル化に特異的なアッセイ）を示している。ＣｐＧカウントの数は、２０ｋｂの領域にわたってスポットされている。
【図４】染色体上のあるＭＡＧＥ−Ａ３アッセイ（ＭＡＧＥ−Ａ３ ＧＯ＿２Ｕアッセイ）の局在を示す図である。可能性のある１つの転写開始点（ＴＳＳ）を記載している。この遺伝子構造の始まりを以下のように表している：白い四角形は３００ｂｐのプロモーター領域を表し、可能性のあるＴＳＳを示している縦線がこれに続き、次いで、濃い四角形が第１エキソンを表す。アッセイ部位を、その部位に該当する名称の付いた白い四角形で示し、「（Ｕ）」は、非メチル化特異的アッセイ（すなわち、低メチル化に特異的なアッセイ）を示している。ＣｐＧカウントの数は、２０ｋｂの領域にわたってスポットされている。
【図５】アンプリフルオル（登録商標）技術を示す概要図である。プライマー対において少なくとも１種のプライマー（フォワードプライマー）は、分子エネルギー移動対のドナー部分（ＦＡＭ）及びアクセプター部分（ＤＡＢＣＹＬ）を有する「ヘアピン」構造を含む。この図は、標識したヘアピン構造に連結した、フォワードプライマー（ｆｏｒプライマー）とも呼ばれるセンスプライマーの場合について説明している。増幅のないときには、ドナー部分によって放出される蛍光は、アクセプター部分によって効果的に受容され、その結果、蛍光が消失される。増幅中には、プライマーは増幅産物中に組み込まれる。２回目の増幅中に、ステムループ又はヘアピン構造が破壊される。アクセプター部分は、ドナー部分によって放出される蛍光をもはや効果的に消光することができなくなる。したがって、ドナー部分は、検出可能な蛍光シグナルを産生する。
【図６】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＣＴＡＧ１Ｂ＿１Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ１Ｂ（遺伝子の別名、ＮＹ−ＥＳＯ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．３５。
【図７】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．８６；２つの技術間の一致は、８７．５％である。
【図８】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＣＴＡＧ２＿１＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．８８；２つの技術間の一致は、８７．５％である。
【図９】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＣＴＡＧ２＿２＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．４７；２つの技術間の一致は、６８．８％である。
【図１０】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＣＴＡＧ２＿３＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．５５；２つの技術間の一致は、６６．７％である。
【図１１】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＰＲＡＭＥ＿７＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．６２；２つの技術間の一致は、８３．３％である。
【図１２】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＰＲＡＭＥ＿１＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．３９；２つの技術間の一致は、６６．７％である。
【図１３】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＰＲＡＭＥ＿２＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．６４；２つの技術間の一致は、７９．２％である。
【図１４】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＰＲＡＭＥ＿３＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．７３；２つの技術間の一致は、８５．４％である。
【図１５】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の４８試料についてのＰＲＡＭＥ＿６＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．２４；２つの技術間の一致は、６６．７％である。
【図１６】黒色腫の３１試料についてのＣＴＡＧ１Ｂ＿１＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ１Ｂ（遺伝子の別名、ＮＹ−ＥＳＯ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である；濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している。
【図１７】黒色腫の３１試料についてのＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．６３；２つの技術間の一致は、７４．２％である。
【図１８】黒色腫の３１試料についてのＣＴＡＧ２＿１＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．６２；２つの技術間の一致は、７４．２％である。
【図１９】黒色腫の３１試料についてのＣＴＡＧ２＿２＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．３４；２つの技術間の一致は、５１．６％である。
【図２０】黒色腫の３１試料についてのＣＴＡＧ２＿３＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２（遺伝子の別名、ＬＡＧＥ−１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．５８；２つの技術間の一致は、７４．２％である。
【図２１】黒色腫の３１試料についてのＰＲＡＭＥ＿７＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．７０；２つの技術間の一致は、９０．３％である。
【図２２】黒色腫の３１試料についてのＰＲＡＭＥ＿１＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．２６；２つの技術間の一致は、９３．５％である。
【図２３】黒色腫の３１試料についてのＰＲＡＭＥ＿２＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．２９；２つの技術間の一致は、９０．３％である。
【図２４】黒色腫の３１試料についてのＰＲＡＭＥ＿３＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．４８；２つの技術間の一致は、９０．３％である。
【図２５】黒色腫の３１試料についてのＰＲＡＭＥ＿６＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＰＲＡＭＥリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．５１；２つの技術間の一致は、９０．３％である。
【図２６】乳癌の２８試料についてのＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．５６；２つの技術間の一致は、７１．４％である。
【図２７】乳癌の２８試料についてのＣＴＡＧ２＿３＿Ｓ脱メチル化アッセイで得られるリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ結果とＣＴＡＧ２リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現データとの間の一致を示す図である。濃く太い縦線は脱メチル化アッセイのカットオフを示し、太い横線は発現のカットオフを示している。線形回帰を黒線で表している；Ｒ＝０．３４；２つの技術間の一致は、７８．６％である。
【０２２３】
実験の節
【０２２４】
本発明者らは、疾患のスクリーニング、検出、病期分類、予後、予測及びモニタリング、治療の予測及びモニタリング（ワクチンの選択を含む）などの様々な目的のために、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫及び乳癌における種々のＣＴ遺伝子のメチル化状態を、非メチル化アッセイを用いて調査した。
【０２２５】
実施例１：ＣＴ抗原アッセイ：ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのプライマー設計
【０２２６】
ＣＴ抗原であるＣＴＡＧ１Ｂ（＝ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＣＴＡＧ２（＝ＬＡＧＥ−１）及びＰＲＡＭＥに対して、非メチル化型の遺伝子配列を標的とするように設計されたいくつかの低メチル化アッセイが開発された。
【０２２７】
ＭＳＰの必要条件に適合したＰｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｏｋｋｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｉｎｐｕｔ．ｈｔｍ）を、非メチル化型のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥを検出するためのフォワード（Ｆ）プライマー及びリバース（Ｒ）プライマーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ設計に使用した。条件は、以下の通りであった：アンプリコンサイズ：５０〜１２０；プライマーサイズ：１９〜２７；融解温度：５５〜６５；最大３’自己相補性＝０；ＴＳＳ周辺の４０００ｂｐの枠（返答する数（ｎｕｍｂｅｒ ｔｏ ｒｅｔｕｒｎ）＝２０００）。
【０２２８】
転写開始点（ＴＳＳ）に対するＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥのＵ−プライマーの位置をそれぞれ図１、図２及び図３に示している。調査した領域は、プロモーター領域を含み、第１エキソンまで及んでいた。
【０２２９】
フォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれかは、５’末端に、以下の配列を有する、ドナー及びアクセプター部分を有する適切なステムループ又はヘアピン構造を組み込むように合成した：５’ＡＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＵ ３’（配列番号４３。）
【０２３０】
下記の表１に、試験したような種々のプライマーの組合せを示している。アンプリフルオルプライマーを使用したＰＣＲの技術の原理については、図５に記載している。
【０２３１】
【表３−１】


【表３−２】

【０２３２】
実施例２：温度勾配及びアッセイの選択
【０２３３】
材料及び方法
【０２３４】
標準物質調製用の温度勾配：ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００サーモサイクラーを使用してＰＣＲを行った。サイクリング条件は、以下の通りであった：段階１、９５℃で５分間；段階２を３５回反復、９５℃で３０秒間、アニーリング温度で３０秒間、７２℃で３０秒間；段階３、７２℃で３０分間、４℃で保持。アニーリング温度は、機器の加熱ブロック全体に５７℃〜６２℃の勾配として設定した。
【０２３５】
クローニング：ＰＣＲ産物をトポ（ＴＯＰＯ）（登録商標）ＴＡベクター（トポ（登録商標）クローニングキット、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（登録商標））中に連結し、ワンショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。プラスミドはＱｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ製のキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）（登録商標）ｓｐｉｎ ｍｉｄｉｐｒｅｐキットを製造業者の手順書に従って使用して、単離された。クローニングしたＰＣＲ産物は、シーケンシングによって確認され、公開されているプロモーター配列と比較された。
【０２３６】
標準曲線物質の調製：制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化することによってプラスミドを線状にし、次いで、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ；製造業者の手順書に従って）を使用して精製した。ＰＣＲ又はプラスミドの調製物の濃度はＵＶ分光光度法を用いて決定された。２×１０^７コピー／５μｌのストック溶液を調製し、使用まで−８０℃で保存した。標準曲線の希釈物（２×１０^６〜２×１０^１コピー／５μｌ）は、試験ごとに新たに調製した。
【０２３７】
リアルタイムＭＳ−ＰＣＲ：リアルタイムＭＳＰアッセイにより、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ及びβ―アクチンの定量を行った。これらは、ＡＢＩプリズム（Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）７９００ＨＴ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）のいずれかを使用したアンプリフルオル（登録商標）アッセイフォーマットごとに特定のプライマーの組合せを使用する平行の増幅法／定量法からなっていた。サイクリング条件は：段階１：５０℃で２分間、段階２：９５℃で１５分間、段階３：９５℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、５７℃で３０秒間（プラトーデータ収集）を４５回反復であった。結果は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＳＤＳ２．２．２ソフトウェア又はＢｉｏＲａｄ製のｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ｖｅｒｓｉｏｎ３．１ソフトウェアのいずれかを使用して作製され、Ｃｔ値（ソフトウェアによって自動的に設定される、増幅曲線が閾値と交差するところのサイクル数）として出された。
【０２３８】
結果
【０２３９】
表１に記載している、プライマー対に対応しているプライマーを使用して、各アッセイ用のＰＣＲ産物を調製した。この目的のために、亜硫酸水素塩処理したシ−ピーゲノム（ＣｐＧｅｎｏｍｅ）（商標）ユニバーサル非メチル化ＤＮＡを鋳型物質として使用して、図１、図２及び図３に記載のようなＣＴＡＧ１Ｂ＿１、ＣＴＡＧ２＿１及びＰＲＡＭＥ＿７の短い領域を増幅した。単一のＰＣＲ産物を得るために、プライマー対ごとに、いくつかのアニーリング温度を試験した（５７℃〜６２℃）。これらのＰＣＲ産物を、精製して定量し、次いで、希釈して、各アッセイ用の標準物質を調製した。最初のリアルタイムＭＳ−ＰＣＲは、（各アッセイに特異的な）精製ＰＣＲ産物を鋳型として使用して、表１に記載のような種々のプライマー対の組合せを用いて調製した。最終的に、さらなる調査のために以下のアッセイが残った：ＣＴＡＧ１Ｂ＿１＿Ｓ＿ＡＭＰ、ＣＴＡＧ１Ｂ＿２＿ＡＳ＿ＡＭＰ、ＣＴＡＧ２＿１＿Ｓ＿ＡＭＰ、ＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ＿ＡＭＰ、ＣＴＡＧ２＿３＿Ｓ＿ＡＭＰ、ＰＲＡＭＥ＿１＿ＡＳ＿ＡＭＰ、ＰＲＡＭＥ＿２＿Ｓ＿ＡＭＰ、ＰＲＡＭＥ＿３＿ＡＳ＿ＡＭＰ、ＰＲＡＭＥ＿６＿ＡＳ＿ＡＭＰ及びＰＲＡＭＥ＿７＿Ｓ＿ＡＭＰ。それぞれの性能の例を表２に示している（６つのデータポイント全てを含む）。
【０２４０】
【表４】

【０２４１】
いくつかのアッセイでは、ＰＣＲ産物はプラスミド中にクローニングし、ＰＣＲ産物の代わりにその構築物が標準曲線調製用の物質として使用された。
【０２４２】
実施例３：ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥ遺伝子についての、リアルタイムＭＳ−ＰＣＲアッセイと定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果との間の一致
【０２４３】
材料及び方法：
【０２４４】
細胞株、肺試料、黒色腫試料及び乳房試料からのＲＮＡは、イソプロパノール沈澱をＲＮｅａｓｙ精製ステップ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に置き換えたことを除いて、Ｔｒｉｐｕｒｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して製造業者の説明書に従って抽出された。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの光学濃度の値から決定された。細胞株ＤＮＡは、「Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット」（Ｑｉａｇｅｎ ＃１５８７６７）又は「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ ＃５１３０４）のいずれかを使用して抽出された。
【０２４５】
ＧＳＫＢｉｏによって提供されたＲＮＡレーター（ＲＮＡ ｌａｔｅｒ）（登録商標）溶液中の、肺生検試料を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。かみそりの刃を使用して約１０ｍｇの肺組織を極めて小さな断片に薄切りして、フェノール抽出法に従って抽出を行った。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）乳房組織からのＤＮＡは、キシレン処理後に、同様のフェノール／クロロホルム法に従って抽出された。
【０２４６】
黒色腫生検試料からのＤＮＡは、「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉキット」（Ｑｉａｇｅｎ ＃５１３０４）又は「Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＢＡ精製キット」（Ｐｒｏｍｅｇｅ ＡＳ１０３０）のいずれかを使用して抽出された。
【０２４７】
キシレン処理の場合：ＦＦＰＥ組織を含むそれぞれのチューブを、７５０μｌのキシレン（Ｍｅｒｃｋ ＃１．０８６８１．１０００）と共に室温で２時間インキュベートして、パラフィンを溶解させた。パラフィンが全て溶解したときに、２５０μｌの７０％エタノールを添加して、混合後、チューブを最高速度で１５分間遠心した。上清を除去し、試料を室温で空気乾燥した。
【０２４８】
ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムを使用して試料から抽出された：簡単に説明すると、試料を、最初に、５０〜１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）及び最終濃度の１％ＳＤＳで、１１００ｒｐｍで振盪しながら、４８℃で一晩インキュベートした。１倍量の試料に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の１倍量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加して、混合物をＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。完全に混合した後に、チューブを遠心して、相を分離させ、核酸を含んでいる上部の水相を回収した。Ｐｈａｓｅ ｌｏｃｋ ｇｅｌチューブでの抽出をもう１回行った。ＤＮＡは、７５０μｌのＥｔＯＨ／ＮＨ４Ａｃ溶液及び２μｌのグリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ）を添加することにより沈殿させた。次いで、これを５０μｌのＬｏＴＥ（３ｍＭ ＴＲＩＳ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
【０２４９】
ＤＮＡは、ピコグリーン（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｐ７５８９）を使用して、製造業者の推奨に従って定量された。キットと共に提供されたλＤＮＡを使用して標準曲線を用意した。データは、ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して収集された。
【０２５０】
亜硫酸水素塩処理：ＬｏＴＥ中の１．５μｇまでのＤＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＥＺ ＤＮＡメチル化キット（＃Ｄ５００２）を使用して処理した。簡単に説明すると、４５μｌの一定分量を、５μｌのＭ−Ｄｉｌｕｔｉｏｎ緩衝液と混合し、１１００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、希釈した１００μｌのＣＴ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、試料を、暗所で１１００ｒｐｍで振盪しながら、７０℃で３時間インキュベートした。変換後、製造業者の説明書に従って、試料をさらに脱塩して、脱スルホン化し、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ Ｐｈ８．０で溶出を行った。
【０２５１】
１００ｎＭの最終濃度の各プライマー（表１に記載の特定の組合せ）及びＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ ＃２０４３４５）からの２×ミックスを含んでいる１２μｌの最終反応物中に、亜硫酸水素塩処理した２．４μｌのＤＮＡを使用した。陰性対照及び陽性対照として、シ−ピーゲノム（商標）ユニバーサルメチル化及び非メチル化ＤＮＡ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＣＡ、ＵＳＡ；カタログ＃ Ｓ７８２１及びカタログ＃ Ｓ７８２２）を各回のアッセイに含めた。反応物は３８４ウェルプレートに入れられた。アッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ７９００ＨＴ機器上で行われた。サイクリング条件は：段階１：５０℃で２分間、段階２：９５℃で１０分間、段階３（４５回反復）：９５℃で１５秒間、５７℃で３０秒間（又はβ−アクチンの場合には６２℃）、プラトーデータ収集に相当する５７℃で３０秒間（又はβ−アクチンの場合には６２℃）であった。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＳＤＳ２．２．２ソフトウェアを使用して結果を作製し、Ｃｔ値（ソフトウェアによって自動的に設定される、増幅曲線が閾値と交差するところのサイクル数）として出した。Ｃｔ値は、２０〜２×１０^６遺伝子コピー相当の標準曲線上にプロットされた値の線形回帰に基づいたコピー数の算出に使用された。目的遺伝子とｂ−アクチンとの間の比率を算出し、試験結果を作製した。
【０２５２】
２μｇの全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を、１×ファーストストランド緩衝液（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのジチオスレイトール、２０ＵのｒＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログＮ２５１１）、２μＭのオリゴ（ｄＴ）１５及び２００ＵのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ２８０２５−０１３）を含んでいる２０μｌ混合物中で、４２℃で１時間３０分行った。
【０２５３】
５０ｎｇの全ＲＮＡに相当するｃＤＮＡを、タックマン緩衝液、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＵＴＰ、０．２ｍＭの各ヌクレオチド、０．６２５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＵＮＧ、０．２μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー及び０．２μＭのタックマンＭＧＢプローブを含んでいる２５μｌの混合物中でＰＣＲによって増幅した。特定のオリゴヌクレオチドプライマー及びＭＧＢプローブを使用した。標的遺伝子及びベータアクチン遺伝子は、タックマンｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７９００システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した定量ＰＣＲで増幅した。増幅プロファイルは、５０℃で２分間を１サイクル、９５℃で１２分間を１サイクル及び９５℃で１５秒間並びに６０℃で１分間を４０サイクルであった。６０℃での全ての伸長ステップ中に、タックマンプローブの分解によって生じる蛍光シグナルをリアルタイムで検出した。リアルタイム配列検出ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）を使用して、生データを分析した。標的遺伝子とｂ−アクチンとの間の比率を算出し、試験結果を作製した。
【０２５４】
検定規定：
【０２５５】
リアルタイムＭＳ−ＰＣＲでは、以下の検定規定を標準曲線に適用した：二重試験で少なくとも４点；（二重試験の間の）ΔＣｔ＜１．５；ＰＣＲ効率＞８０％；Ｒ２＞０．９９；陽性対照は、陽性でなければならない；陰性対照は、陰性でなければならない。
【０２５６】
結果解釈の判定基準は、目的遺伝子の標準相当のコピー数とｂ−アクチンのコピー数とで算出した比率の値に基づいていた：比率＝（目的遺伝子コピー数／β−アクチンコピー数）×１０００。
【０２５７】
遺伝子発現については、検定規定は、ＮＴＣが３５を超えるＣｔを有し、陽性対照が陽性であり、標的遺伝子及びベータアクチンの二重試験のΔＣｔ＜２であった。
【０２５８】
遺伝子発現の結果はアクチン発現と比較して算出される。ＰＲＡＭＥ発現用のカットオフは１Ｅ−０４コピー／アクチンコピーに設定され、ＣＴＡＧ１Ｂ及びＣＴＡＧ２については、カットオフは１Ｅ−０５コピー／アクチンコピーに設定される。試料は、ベータアクチンＣｔが２３未満で、二重試験のΔＣｔ＜２であり、かつ標的遺伝子の二重試験のΔＣｔ＜２である場合、有効であった。
【０２５９】
【表５】

【０２６０】
結果
【０２６１】
細胞株
【０２６２】
代替の標準曲線物質を使用して、最適なリアルタイムＭＳ−ＰＣＲ条件を選択した後に、多様な細胞株を、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥの脱メチル化アッセイについてアッセイした。結果は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して得られたものと比較した。試験する遺伝子（ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＰＲＡＭＥ）ごとに１つのアッセイを示す。表４、表５及び表６を参照されたい。
【０２６３】
【表６】

【０２６４】
【表７】

【０２６５】
【表８】

【０２６６】
この試験の一目的は、癌試料において行うアッセイに好適な陽性細胞株及び陰性細胞株を発見することであった。リアルタイムＭＳ−ＰＣＲデータを発現データと比較すると、ＣＲＬ２５０５及びＣＲＬ５８０３は、最も高いＣＴＡＧ１Ｂ＿１＿Ｓ／ｂ−アクチン比率を示すことが認められ（表４）、したがって、ＣＴＡＧ１Ｂ＿１＿Ｓアッセイを使用する場合に、ＣＴＡＧ１Ｂ脱メチル化の陽性細胞株として使用できることができる。ＳＷ−４８０及びＨＬ−６０細胞株は、このアッセイの陰性細胞株として使用することができる。
【０２６７】
試験したＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥのアッセイの最良の陽性細胞株及び陰性細胞株を定めることもできた（表７及び表８）。
【０２６８】
【表９】

【０２６９】
【表１０】

【０２７０】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）
【０２７１】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、並びにこれらのメチル化状態をリアルタイムＭＳ−ＰＣＲによって調べるために、ＮＳＣＬＣの５１試料を使用した。３試料は少なくとも１つの技術で無効なことが見出され、したがって、４８試料のＮＳＣＬＣで得られた結果を比較した。結果の比較を視覚的に表した。ＣＴＡＧ１Ｂでは、ＣＴＡＧ１Ｂ＿１＿Ｓアッセイとの良好な一致は認められなかった（図６）。ＣＴＡＧ２の発現を、４つの脱メチル化アッセイで得られた結果と比較した場合には、ＣＴＡＧ２＿１Ｓ（図８）及びＣＴＡＧ２＿１ＡＳ（図７）のアッセイで最良の一致が得られ、両技術間で８７．５％の一致が示された。ＣＴＡＧ２＿２＿Ｓ（図９）及びＣＴＡＧ２＿３＿Ｓ（図１０）は、それぞれ６８．８％及び６６．７％でより低い一致が示される。ＰＲＡＭＥの発現については、アッセイによって６６．７％〜８５．４％の範囲の一致が認められる（図１１、図１２、図１３、図１４及び図１５）。発現データとの最良の一致は、ＰＲＡＭＥ＿３＿ＡＳ脱メチル化アッセイ（図１４）で得られ、８５．４％の一致が示された。表９は、ＮＳＣＬＣ試料における遺伝子発現と遺伝子メチル化とを比較する際に得られる全ての結果のまとめを示す。
【０２７２】
【表１１】

【０２７３】
黒色腫試料
【０２７４】
ＤＮＡ及びＲＮＡは、ＲＮＡレーター（登録商標）溶液中の黒色腫組織の３１試料から抽出された。ＮＳＣＬＣを調べた際に行ったことと同様に、これらの黒色腫試料は、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及びＰＲＡＭＥの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、並びにこれらのメチル化状態をリアルタイムＭＳ−ＰＣＲによって調べるために、使用された。ＮＳＣＬＣの場合と同様に、ＣＴＡＧ１Ｂ＿１＿Ｓ脱メチル化アッセイを使用した場合には、発現データとの良好な一致は認められなかった。ＣＴＡＧ２遺伝子の場合には、ＣＴＡＧ２＿１＿Ｓ（図１８）、ＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ（図１７）及びＣＴＡＧ２＿３Ｓ（図２０）アッセイの３アッセイで最良の一致が認められ、全てが両技術間で７４．２％の一致を示した。ＰＲＡＭＥ遺伝子の場合、全てのＰＲＡＭＥのアッセイ（図２１、図２２、図２３、図２４及び図２５）で良好な一致（９０．３％及び９３．５％）が示された。しかし、おそらくその中の陰性試料の数が少ない（２）ために、ＰＲＡＭＥ＿７＿Ｓ（表９）だけは、許容可能なＲピアソン相関係数を示した。表１０に、黒色腫試料で得られる一致及び関連性の結果をまとめている。
【０２７５】
【表１２】

【０２７６】
乳癌試料
【０２７７】
ＣＴＡＧ２の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、並びにＣＴＡＧ２のメチル化状態をリアルタイムＭＳ−ＰＣＲによって調べるために、乳癌の２９試料を使用した。１試料は少なくとも１つの技術で無効なことが見出され、したがって、乳癌の２８試料で得られた結果を比較した。ＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ及びＣＴＡＧ２＿３＿Ｓのアッセイで得られた結果は、それぞれ７１．４％（図２６）及び７８．６％の一致（図２７）であった。
【０２７８】
結論
【０２７９】
正常組織では精巣内でほぼ排他的に発現される癌／精巣（ＣＴ）抗原は、精巣以外の癌組織において発現されることがわかる。この試験で示されるように、ＣＴ遺伝子の発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調べることができるが、さらに、遺伝子プロモーター（又は近くの領域）のメチル化状態を調べることによって間接的にも調べることができる。実際に、異常な発現は、低メチル化と関連付けることができる。細胞株における試験により、ＣＴＡＧ１Ｂ脱メチル化アッセイを含めた全てのアッセイ用の陽性対照及び陰性対照の細胞株が得られた。ＮＳＣＬＣ、黒色腫及び乳癌の組織では、ＣＴＡＧ１Ｂアッセイを除き、遺伝子発現と遺伝子低メチル化状態との間でいくらかの一致を示すことができた。ＣＴＡＧ２発現についての最良の一致は、ＣＴＡＧ２＿１＿Ｓ及びＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳの脱メチル化アッセイで得られ、いずれもＮＳＣＬＣ試料では８７．５％、黒色腫試料では７４．２％の一致が示された。一方、ＣＴＡＧ２＿３＿Ｓアッセイでは、乳癌試料間で７８．６％の一致が示されていた。ＰＲＡＭＥについては、ＮＳＣＬＣにおけるＰＲＡＭＥ＿３＿ＡＳ脱メチル化アッセイ（８５．４％）及び黒色腫におけるＰＲＡＭＥ＿１＿ＡＳアッセイ（９３．５％）で最良の一致が得られた。２種類のアッセイを乳癌組織において行った：ＣＴＡＧ２＿１＿ＡＳ及びＣＴＡＧ２＿３＿Ｓでは、それぞれ７１．４％及び７８．６％の一致を示した。
【０２８０】
実施例４：ＭＡＧＥ−Ａ３低メチル化アッセイを用いた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断
【０２８１】
材料及び方法
【０２８２】
細針生検（ＦＮＢ）からのＤＮＡを抽出した。
【０２８３】
実施例３と同様に、ピコグリーン（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｐ７５８９）を製造業者の推奨に従って使用して、それぞれの試料及び細胞株のＤＮＡをＤＮＡ量についてアッセイした。ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、データを収集し、分析した。上記のように、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＥＺ ＤＮＡメチル化キット（詳細については実施例２を参照されたい）を使用して、１．５μｇまでのＤＮＡを処理し、２５μｌで溶出を行った。次いで、亜硫酸水素塩処理した２．４μｌのＤＮＡを、１００ｎＭの最終濃度の各プライマーを含んでいる１２μｌの全反応量中で、β−アクチン（実施例３と同様）及びＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＡＧＥ−Ａ３ ＧＯ＿２Ｕ）のリアルタイムＭＳＰアッセイを通して（表１）、処理した。使用するＰＣＲミックスは、ＢｉｏＲａｄ製のＲｏｘを有する「ｉＴａｑ ｓｕｐｅｒｍｉｘ」（＃１７２−５８５５）である。プラスミド構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のトポ（登録商標）クローニングベクター中にクローニングされたＰＣＲ産物）を使用して、標準を調製した。反応物は３８４ウェルプレートに入れられた。アッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ７９００ＨＴ機器上で行った。β−アクチンアッセイのサイクリング条件は、以下の通りであった：段階１、５０℃で２分間；段階２、９５℃で１０分間；段階３、９５℃で１５秒間、次いで、６２℃で１分間（プラトーデータ収集）を４５回反復。ＭＡＧＥ−Ａ３ ＧＯ＿２Ｕアッセイのサイクリング条件は、以下の通りであった：段階１、５０℃で２分間；段階２、９５℃で１０分間；段階３、９５℃で１５秒間、次いで、５９℃で１分間（プラトーデータ収集）を４５回反復。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＳＤＳ２．２．２ソフトウェアを使用して結果を作製し、Ｃｔ値（ソフトウェアによって自動的に設定される、増幅曲線が閾値と交差するところのサイクル数）として出した。Ｃｔ値は、２０〜２×１０^６遺伝子コピー相当の標準曲線上にプロットされた値の線形回帰に基づいてコピー数の算出に使用した。目的遺伝子とβ−アクチンとの間の比率を算出し、試験結果を作製した。
【０２８４】
結果
【０２８５】
ここでは、腫瘍の切除を受けておらず、進行した疾患を有し、発現データが得られていない、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者からの細針生検（ＦＮＢ）を用いて得られた結果が示される。
【０２８６】
ＤＮＡの抽出及び変換（亜硫酸水素塩処理）の後に、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＧＯ＿２Ｕ低メチル化アッセイ（表１）を通して３５試料のＦＮＢを処理した。実施例３（表３）と同様の結果解釈の判定基準を適用した。低メチル化試験をｑＲＴ−ＰＣＲと比較することは不可能であったので、低メチル化試験のカットオフは間接的に設定しなければならなかった。ＩＢ期及びＩＩ期のＮＳＣＬＣ患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織及び後のＲＮＡレーター溶液中の組織についての同様のアッセイで得られる結果に基づき、選択されるカットオフは１１２である。対応する結果を、表１１に示している。カットオフ値は、発現データにより良く対応するように調整され得ることに注意しなければならない。
【０２８７】
【表１３】

【０２８８】
カットオフ値を１１２に設定すると、ＭＡＧＥ−Ａ３の低メチル化を有する患者の百分率は４５．７％である。これらの患者は、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現している可能性がある。
【０２８９】
結論
【０２９０】
脱メチル化／低メチル化アッセイは、ｑＲＴ−ＰＣＲが困難であることが立証されている試料の種類の場合に特に関心が持たれるであろう。これは、細針生検（ＦＮＢ）の場合である。この技術は非侵襲性であるので、将来、他のＮＳＣＬＣ患者に応用されることが可能である。
【０２９１】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書に記載のものに加えて、本発明の多様な改変形態が、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。こうした改変形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。さらに、本明細書に記載の全ての実施形態は、必要に応じて、幅広く適用可能であり、整合する他の任意及び全ての実施形態と組み合わせることができるものとみなされる。
【０２９２】
本明細書には多様な刊行物を引用しており、これらの開示は参照によりその全体が組み込まれている。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、６１、６２又は６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、又は前記配列から本質的になる、又は前記配列からなる、遺伝子のメチル化状態の検出に有用なオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブ。
【請求項２】
配列番号９〜１２及び配列番号２１〜４０のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、前記配列から本質的になる、又は前記配列からなる、遺伝子のメチル化状態の検出に有用な、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブ。
【請求項３】
５’から３’の順に、以下の連続した配列：
（ａ）約６〜３０ヌクレオチドの間の第１のヌクレオチド配列であって、前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドが、分子エネルギー移動対のドナー部分及びアクセプター部分から選択される第１の部分で標識され、前記ドナー部分が、励起されると１種又は複数の特定の波長で蛍光を放出し、前記アクセプター部分が、前記ドナー部分によって放出される前記蛍光を吸収及び／又は消光する、第１のヌクレオチド配列、
（ｂ）約３〜２０の間のヌクレオチドを含む、前記ヌクレオチドから本質的になる、又は前記ヌクレオチドからなる第２の一本鎖ヌクレオチド配列、
（ｃ）約６〜３０の間のヌクレオチドを含む、前記ヌクレオチドから本質的になる、又は前記ヌクレオチドからなる第３のヌクレオチド配列であって、前記第３のヌクレオチド配列中のヌクレオチドが、前記ドナー部分及び前記アクセプター部分から選択される第２の部分で標識され、前記第２の部分が、前記群のうち前記第１のヌクレオチド配列を標識していない方であり、前記第３のヌクレオチド配列が前記第１のヌクレオチド配列と逆の順に相補的であることにより、前記第１のヌクレオチド配列と前記第３のヌクレオチド配列との二重鎖を形成することができ、それにより、前記第１の部分と前記第２の部分とが近接していることによって、前記ドナー部分が励起されて蛍光を放出すると、前記アクセプター部分が前記ドナー部分によって放出される前記蛍光を吸収して消光する、第３のヌクレオチド配列、及び
（ｄ）プライマーの３’末端に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６１又は６３のうちのいずれかの配列を３’末端に含む、前記配列から本質的になる、又は前記配列からなる（さらに、核酸ポリメラーゼによる、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化されていないＤＮＡの部分を含む核酸鎖と相補的なヌクレオチド配列の合成を開始することができる）、約８〜４０の間のヌクレオチドを含む、前記ヌクレオチドから本質的になる、又は前記ヌクレオチドからなる第４の一本鎖ヌクレオチド配列
を含む、又は前記配列から本質的になる、又は前記配列からなり、
前記二重鎖が形成されない場合、前記第１の部分と前記第２の部分とが、前記第１の部分と前記第２の部分との間の分子エネルギー移動を妨げる距離で分離される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブ。
【請求項４】
前記請求項のいずれか一項に記載のプライマーを含むプライマー対。
【請求項５】
請求項３に記載のプライマーを含む、請求項４に記載のプライマー対。
【請求項６】
配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号３０；配列番号３１及び配列番号３２；配列番号３３及び配列番号３４；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；又は配列番号６１及び６２のヌクレオチド配列を含む、又は前記配列から本質的になる、又は前記配列からなるプライマー対。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、又は請求項４〜６のいずれか一項に記載のプライマー対を含む、遺伝子のメチル化状態を検出するためのキット。
【請求項８】
前記遺伝子がＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、又は請求項４〜６のいずれか一項に記載のプライマー対、又は請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ＤＮＡ含有試料中のメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子の存在及び／又は量を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記ＤＮＡ含有試料を、検出可能な修飾残基を生成するためにＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾するが、メチル化されているシトシン残基は修飾しない試薬で接触／処理するステップと、
（ｂ）プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーが、メチル化されていないＤＮＡの配列にのみ結合するように設計された、少なくとも１種のプライマー対を使用して、前記試薬での処理後にメチル化されていない目的遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーが、配列番号１〜４０又は配列番号６１〜６３のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、前記配列から本質的になる、又は前記配列からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌又は癌素質を診断する方法であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のうち少なくとも１つのメチル化状態を検出するステップを含み、前記試料中のメチル化されていないＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥの存在が癌又は癌素質を示す方法。
【請求項１２】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ免疫治療薬を用いた治療に適する患者を特定及び／又は選出する方法であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を検出するステップを含み、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子がメチル化されていない場合は、対象が、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２ ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ免疫治療薬を用いた治療に特定及び／又は選出される方法。
【請求項１３】
癌の治療に成功する可能性を予測する方法であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を検出するステップを含み、前記遺伝子がメチル化されていない場合は、前記遺伝子がメチル化されている場合よりも、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ免疫治療薬を用いた治療に成功する可能性が高い方法。
【請求項１４】
癌の適切な治療計画を選択する方法であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、患者の試料中のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を検出するステップを含み、前記遺伝子がメチル化されていない場合は、治療に免疫治療薬が選択される方法。
【請求項１５】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む又はコードする組成物の投与を含む、対象において癌を治療する方法であって、前記対象は、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて、前記対象が治療に選出されている方法。
【請求項１６】
患者を治療する方法であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を測定するステップと、次いで、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む又はコードする組成物を前記患者に投与するステップとを含む方法。
【請求項１７】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを発現する腫瘍を再発しやすい患者を治療する方法であって、前記患者が、腫瘍組織を除去するための治療を受けており、前記方法が、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、前記腫瘍組織におけるＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を測定するステップと、次いで、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む又はコードする組成物を前記患者に投与するステップとを含む方法。
【請求項１８】
腫瘍を有する患者の治療用の医薬品の製造における、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む又はコードする組成物の使用であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて、前記患者が治療に選出されている使用。
【請求項１９】
ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを発現する腫瘍を再発しやすい患者の治療用の医薬品の製造における、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む又はコードする組成物の使用であって、請求項１〜３若しくは８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、プライマー若しくはプローブ、請求項４〜６若しくは８のいずれか一項に記載のプライマー対、請求項７若しくは８に記載のキット、又は請求項９若しくは１０に記載の方法を使用することによって、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ遺伝子のメチル化状態を測定することに基づいて、患者が治療に選出されている使用。
【請求項２０】
前記組成物が、全長のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ、ほぼ全長のＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥ、又は例えばＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥのペプチドなどのＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥの断片を含むＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭａｇｅＡ３及び／又はＰＲＡＭＥを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
ＣＴＡＧ１Ｂが、ペプチド１５７〜１６７、１５７〜１６５及び１５５〜１６３から選択される、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合モチーフを含む全長ＣＴＡＧ１Ｂの断片である、請求項２０に記載の方法又は使用。
【請求項２２】
ＣＴＡＧ１Ｂが、国際公開第２００８／０８９０７４号パンフレットに開示されているＡ３１、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＰ４、Ｂ３５、Ｂ５１、Ｃｗ３、Ｃｗ６及びＡ２から選択される１個又は複数のＭＨＣクラス１又はクラス２のエピトープを含む全長ＣＴＡＧ１Ｂの断片である、請求項２０に記載の方法又は使用。
【請求項２３】
前記ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥのタンパク質、断片又はペプチドが、融合パートナータンパク質に連結されている、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２４】
前記融合パートナータンパク質が、グラム陰性菌ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤ又はその誘導体である、請求項２３に記載の方法又は使用。
【請求項２５】
前記融合パートナータンパク質が、ＬｙｔＡである、或いはＣ末端に見出される残基１７８から始まるＬｙｔＡ分子のリピート部分を含む若しくは前記部分からなる、又は残基１８８〜３０５を含む、ＬｙｔＡの誘導体である、請求項２３に記載の方法又は使用。
【請求項２６】
前記融合パートナータンパク質が、ＮＳ１（血球凝集素）、又はＮＳ１のＮ末端の８１アミノ酸を含むその誘導体である、請求項２３に記載の方法又は使用。
【請求項２７】
前記組成物が、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥのタンパク質、断片若しくはペプチド、又はその融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２８】
前記核酸分子が発現ベクター中に備えられている、請求項２７に記載の方法又は使用。
【請求項２９】
前記ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＡＧ２及び／又はＰＲＡＭＥのタンパク質、断片又はペプチドを含む組成物、又は核酸を含む組成物が、アジュバント、免疫賦活性サイトカイン及びケモカインのうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項３０】
前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ又はその誘導体、サポニン又はその誘導体及びＴＬＲ９アンタゴニストのうちの１つ又は複数を含む、請求項２９に記載の方法又は使用。
【請求項３１】
前記ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法又は使用。
【請求項３２】
前記アジュバントが、水中油型乳剤又は油中水型乳剤中に製剤化されて任意選択でコレステロール及び／又はトコフェロールを含む、又はリポソーム組成物中に製剤化される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項３３】
前記遺伝子がＭａｇｅＡ３遺伝子であり、前記試料又は腫瘍組織が細針生検によって採取される、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【公表番号】特表２０１２−５２０６６３（Ｐ２０１２−５２０６６３Ａ）
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５００１４３（Ｐ２０１２−５００１４３）
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００１６７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０５８１５
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５０９１９４７０３）エムディーエックスヘルス　エスエー (3)
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン　バイオロジカルズ　ソシエテ　アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】