酵母株および乳酸の製造方法
【課題】
乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化された酵母株と、その固定化された酵母株を用いることにより、高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】
乳酸合成酵素が導入された酵母株であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠した酵母株を固定化された酵母株と、その酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取乳酸の製造方法である。
乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化された酵母株と、その固定化された酵母株を用いることにより、高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】
乳酸合成酵素が導入された酵母株であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠した酵母株を固定化された酵母株と、その酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取乳酸の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醗酵や食品など様々な応用微生物工業で利用される固定化された酵母株と、その酵母株を用いて高い対糖収率で乳酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料生産が盛んに行われている。その中で生物由来材料である乳酸を用いたポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
【０００３】
乳酸の生産は、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程および精製工程に多大なコストを要している。
【０００４】
一方、酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造法についても複数、提案されている（特許文献１〜３および非特許文献１、２参照。）。本来、乳酸生成能を持たない酵母に乳酸生成酵素遺伝子を導入し、乳酸を生産させることにより中和操作を軽減し、低コストな乳酸製造工程を構築することが可能である。
酵母は、その生理機能を巧みに利用して、多数の有用物質を工業生産する微生物として利用されている。酵母を生体触媒として工業的に利用する場合には、その機能を最大限発揮させることが重要であり、そのため種々の固定化法が現在までに開発され、実際に工業生産に応用されている。現在、工業的に開発、応用されている酵母の代表的な固定化法には、アルギン酸カルシウムやｋ−カラギーナンなどによるゲル包括法が知られており、エタノール生産などに利用されている（非特許文献３参照。）。固定化酵母を用いたエタノール生産の利点は、効率および生産性の向上があることである。しかしながら、固定化酵母を用いた乳酸の製造方法は知られていない。
また、固定化微生物を用いた乳酸生産として、リゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｉｚａｅ）の胞子をコットンシートに吸着固定し、コットンシート上で増殖させた固定化菌糸体を用いた生産が報告されている（非特許文献４参照。）。この報告内容においては、胞子を吸着固定したコットンシートをさらにステンレス製の支持体に固定して、乳酸生産に用いている。この方法では、菌糸体の増殖のばらつきから生産の不安定性および菌糸体の遊離が考えられ、連続的な生産プロセスとしては課題が残る。また、スケールに応じて、ステンレス製支持体の改良が必要でありコストを要する。それに対し、ゲル包括法は、ゲルに増殖した微生物を包括することにより大きな増殖を押さえ、安定した細胞の維持が可能であり、また、固定化菌体の再利用が可能である。ゲル包括法は、用いられるゲル材料を選択することにより、固定化菌体作製のコストを抑えられ、培養装置の改良も必要はない。リゾパス・オリゼは、菌糸体を形成して生長するために、ゲル包括法を用いた固定化を行うことはできない。また、報告によると、リゾパス・オリゼは、低ｐＨ域での生産性に問題が生じている。これに対しても、酸性条件下で生育が可能であるという酵母の特性から解決可能であり、乳酸生産能を持つ酵母株をゲル包括固定し、乳酸生産を行うことは非常に有用な技術である。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、４４、１９（１９８２）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（バイオテクノロジー アンド バイオエンジニアリング）、８０、１（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化酵母株と、その固定化酵母株を用いることにより高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、乳酸合成酵素遺伝子を導入した酵母株を作出し、さらにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させた酵母株を固定化材料に抱埋し、該固定化乳酸生成酵母株を用いることにより安定な乳酸製造方法を発明した。該酵母株を用いることにより、エタノール生成を抑制し、高い収率で乳酸が得られ、上記課題を解決するに至った。
すなわち、本発明によれば、下記の（１）〜（５）に記載の構成にかかる発明を提供することができる。
（１）乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
（２）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる前記（１）記載の酵母株。
（３）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる前記（１）または（２）記載の酵母株。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
（５）酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする前記（４）記載の乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、乳酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換酵母株であって、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を必要に応じて施した酵母株を固定化し、該固定化酵母株を糖質存在下で培養することにより、エタノール合成を抑制し、高い対糖収率で乳酸を製造をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の酵母株は、乳酸合成酵素遺伝子が導入され、さらに固定化材料に抱埋されてなる固定化された酵母株であり、より好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株である。さらに必要に応じ、前記酵母株に対して、変異処理によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させてなる酵母株である。
【０００９】
また、本発明の乳酸の製造方法は、前記の固定化された酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物中から該乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法である。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる酵母株（微生物）は、乳酸脱水素酵素を発現する能力をもつ、乳酸合成酵素遺伝子が導入された酵母株であり、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、より好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株などを挙げることができる。
【００１０】
上記サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株としては、サッカロマイセス・セレビシエなどを挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、配列番号１で表されるデオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと略す。）が変異した染色体ＤＮＡを有するサッカロマイセス・セレビシエを挙げることができる。
アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株とは、遺伝子配列に偶発的もしくは人為的に変異を誘発してなる変異を持つ酵母株であり、その結果、ＡＤＨ活性が、親株の好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下のＡＤＨ活性であることを特徴とする酵母株である。
ＡＤＨ活性は、酵母株の無細胞抽出液を調製し、該抽出液にエタノールおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を添加し、添加したエタノールがアセトアルデヒドに変換する過程において生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の生成量により測定することが出来る。
【００１１】
ＡＤＨ活性が低下した酵母株は、ＡＤＨタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ＡＤＨ１遺伝子に変異が生じているために、当該遺伝子がコードするタンパク質を生産しない、もしくは非活性型または活性が低下した形で生産する酵母株であればいずれの酵母株でもよく、該変異としては、例えば、ＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡの全部もしくは一部が欠損している変異、および該タンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失または置換された変異などを挙げることができる。
本発明において、ＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡの全部もしくは一部が欠損しているとは、該染色体ＤＮＡの塩基配列において、少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失した変異を有するＤＮＡを挙げることができる。ＡＤＨ１タンパク質のアミノ酸配列において、少なくとも１以上のアミノ酸が欠失した変異とは、ＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡに対し、部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失した変異をいう。
【００１２】
部位特異的変異の導入は、「モレキュラークローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））、「カレント プロトコールズ イン モレキュラーバイオロジー」（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））および「メソッズ イン エンザイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）等に記載の方法に準じて行うことができる。部位特異的変異の導入は、具体的には、変異を挿入しようとするＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、該クローン化ＤＮＡに対して変異処理を施すことにより行うことができる。例えば、変異を入れようとする箇所にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドに対して塩基置換を施し、該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ反応により変異ＤＮＡを合成することによる変異導入方法が挙げられるが、本発明における変異導入方法はこれに限定されるものではない
上記したＡＤＨ１遺伝子の全部もしくは一部が欠損した変異を有する酵母株の該ＤＮＡが、野生型株のＡＤＨ１遺伝子の全部もしくは一部を欠損しているか否かは、該酵母株と親株のＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡ領域をポリメラーゼ チェイン リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、ＰＣＲと略す。）により増幅させ、その増幅サイズを比較することにより確認することができる。上記親株とは、上記変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株および遺伝子組み換え技術を用いて造成した組み換え株であってもよい。
【００１３】
導入される乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、酵母株において生産されうる酵素をコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、該酵素の活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡが好ましい。酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡとしては、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる該酵素活性が強い乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡや、強力なプロモーターの支配下に該酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどを挙げることができる。具体的な乳酸脱水素酵素としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ｌｄｈ―ｈと略す。）またはボス・トウラス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。
【００１４】
図１は、本発明で用いられるｌｄｈ−ｂ発現用プラスミドｐＴＲＳ１１の構造を示す構築図である。
【００１５】
Ｌ−ｌｄｈ−ｈ遺伝子の発現様式としては、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、染色体への導入による発現、またはプラスミドによる発現など特に限定されないが、プラスミドによる発現を微生物としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いる場合は、例えば、Ｌ−ｌｄｈ―ｈ遺伝子をｐＴＲＳ１１（図１）に連結したマルチコピー発現プラスミドｐＴＲＳ４８を挙げることができる。
【００１６】
ｐＴＲＳ４８を有する形質転換酵母株の培養は、乳酸脱水素酵素が発現する培養法であれば特に限定されないが、ｐＴＲＳ４８を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合は、例えば、ＳＣ−Ｕｒａ培地［２０ｇ／ｌ グルコース、６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒａｃｉｌ（シグマ社製）］を前培養の培地として用いて一晩培養後、得られた培養液を終濃度が１％になるように、ＳＣ−Ｕｒａ培地に接種して培養する方法を挙げることができる。
【００１７】
酵母株の固定化に用いられる固定化材料（担体）としては、酵母細胞を包括できるものであればいずれの担体でもよいが、例えば、アルギン酸カルシウムゲル、ｋ−カラギーナン、ポリアクリルアミド、低メトキシペクチンゲル、寒天ゲルおよびシリカゾルなどが挙げられる。
【００１８】
アルギン酸カルシウムゲルへの酵母細胞を包埋する方法としては、上記の酵母株を所定の菌体量になるまで培養した培養液から、菌体を遠心分離やろ過などの分離法により回収し、１％アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁し、懸濁液をＣａＣｌ２を含む水溶液中に滴下することにより、酵母細胞を包埋することができる。得られた固定化酵母株をＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、一定時間培養したときの培養液中の乳酸生産量を測定する。
【００１９】
培養液中の乳酸濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法で定量することができ、例えば、培養液を遠心分離して培養液上清を調整し、該培養液上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することで培養液の、例えば、乳酸やピルビン酸等の有機酸濃度を定量することができる。
【００２０】
ＡＤＨ１タンパク質をコードする遺伝子が変異を有する酵母株の製造方法としては、［１］相同組み換え法などを用いて、ＡＤＨ１タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部が欠損した酵母株を製造する方法や、［２］相同組み換え法などを用いて、ＡＤＨ１タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは挿入等の変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体上に有する微生物を製造する方法などが挙げられる。
【００２１】
上記［１］の方法としては、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株を用いる方法を挙げることができる。直鎖ＤＮＡとしては、例えば、ＬＥＵ２遺伝子の両端にＡＤＨ１遺伝子の内部または近傍の配列と相同性を有するＤＮＡを配置した直鎖ＤＮＡを挙げることができる。
【００２２】
該直鎖ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株に常法により導入し、ロイシン要求性回復株を選択することにより、ＡＤＨ１遺伝子欠損または部分欠損酵母株を取得することができる。
【００２３】
上記［２］の方法としては、ＡＤＨ１遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより、該遺伝子がコードするアミノ酸配列において、少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする変異型遺伝子を取得し、相同組み換え法を用いることにより、染色体ＤＮＡ上にある野生型ＡＤＨ１遺伝子が変異型ＡＤＨ１遺伝子に置換された染色体ＤＮＡを有する酵母株を作出する方法などを挙げることができる。
本発明で用いられる酵母株は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入した酵母株に、上記方法によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を施すことにより製造することができるが、該酵母株がすでに目的とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性が野生株より明らかに低下している場合は、必ずしも変異処理を施す必要はない。
【００２４】
また、本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素）をコードする遺伝子を組み込んだ固定化酵母株であり、かつ必要に応じＡＤＨ１をコードするDNAの全部もしくは一部が欠損、欠失、置換または挿入等の変異を有する染色体DNAを保持する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い酵母株を固定化し、該固定化された酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸脱水素酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から該乳酸を採取する乳酸の製造方法である。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株の培養は、下記した通常の方法に従って行うことができる。本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株を培養する培地は、該固定化酵母株が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該酵母株が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
生成した乳酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする乳酸を単離し、精製することができる。例えば、特開２００１−２０４４６４公報および特開平９−１３５６９８などに公開されているような方法により精製することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
【００２６】
（実施例１） 固定化酵母株を用いた乳酸の生産
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＢＲＣ１０５０５株のゲノムＤＮＡ上に存在するピルビン酸脱炭酸酵素（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）１遺伝子（以下、ＰＤＣ１遺伝子と略す。）をＴＲＰ１をコードする遺伝子と置換した遺伝子組み換え株（以下、Δｐｄｃ１株と略す。）を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δｐｄｃ１株は、次のようにして作出した。ｐＲＳ４２４プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号２および配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＴＲＰ１遺伝子の５’上流に配列番号４で示した配列、３’下流に配列番号５で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用いて、鋳型とするプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液ＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃の温度で１０分間保温後、９４℃の温度で３０秒間、５５℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で１分３０秒間のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃の温度で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片はＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＰＣＲ Ｋｌｅｅｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて精製した。該ＤＮＡ１μｇを用いて、ＮＢＲＣ１０５０５株を形質転換した。形質転換はＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするＮＢＲＣ１０５０５株は、トリプトファン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入されたΔｐｄｃ１株を選択することができる。次に、Δｐｄｃ１株をプラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択することができる。
【００２７】
作製した組み換え株、Δｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株を１０ｍｌＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を回収し、湿重量５ｇの菌体を１％アルギン酸ナトリウム溶液１０ｍｌに懸濁した。該懸濁液を次の組成からなる溶液（以下、Ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌ．と略す。）
［Ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌ．の組成］
・Ｇｌｕｃｏｓｅ １００ｇ／Ｌ
・ＣａＣｌ２ ９０ｍＭ
・ＫＨ２ＰＯ４ １５ｍＭ
に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を、５０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地［１００ｇ／ｌ グルコース、６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒａｃｉｌ（シグマ社製）］に接種し、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始１４時間後に培養液を１ｍｌ採取し、該培養液中の乳酸濃度をＨＰＬＣを用いて、またエタノール濃度をＧＣを用いて測定した。ＨＰＬＣおよびＧＣの分析条件を以下に示す。
【００２８】
［ＨＰＬＣ分析条件］
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・カラム温度：４５℃
［ＧＣ分析条件］
・カラム：ＴＣ−１
・キャリアガス：ヘリウム
・流速：７ｍｌ／ｍｉｎ．
・オーブン温度：１００℃
・インジェクション温度：２００℃
・検出器温度：２００℃
・検出器：ＦＩＤ（Ｆｒａｍｅ Ｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｅｒ）
その結果、乳酸が１２．０ｇ／ｌ、エタノールが３７．７ｇ／ｌ生産された。乳酸の対糖収率は１２．１％であった。また、乳酸の生産速度は０．８７ｇ／ｌ／ｈと算出された。
【００２９】
次に、固定化酵母株の再利用を検討した。
【００３０】
上記のように、Δｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株を培養し、得られた菌体を上記のようにアルギン酸カルシウムゲルに固定化した。固定化したΔｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株を４０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始６時間後に培養液中の乳酸濃度を測定し（１）、該培養液を新しい４０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に交換し、再度３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。１２時間後に乳酸濃度を測定し（２）、再び培養液を新しい４０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に交換し、さらに６時間、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した後、乳酸濃度を測定した（３）。（１）〜（３）のそれぞれの培養液中の乳酸濃度を測定したところ、（１）８．５ｇ／Ｌ、（２）１１．０ｇ／Ｌ、（３）７．８ｇ／Ｌであり、生産速度は、（１）１．４ｇ／Ｌ／ｈ、（２）０．９２ｇ／Ｌ／ｈ、（３）１．３ｇ／Ｌ／ｈと算出され、包括固定した酵母株を用いることにより、繰り返し安定した乳酸生産が行うことができる。各培養液は１００倍希釈し、乳酸濃度を測定した。乳酸濃度の測定は、Ｆ−キット（Ｌ−乳酸）（ＪＫインターナショナル社製）を用いて行った。
【００３１】
（実施例２） 固定化アルコールデヒドロゲナーゼ活性低下形質転換酵母株を用いた乳酸の生産
Δｐｄｃ１株のゲノムＤＮＡ上に存在するＡｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １（以下、ＡＤＨ１遺伝子と略す。）遺伝子座を欠失した遺伝子組み換え株（以下、Δａｄｈ１株と略す）を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δａｄｈ１株は、次のようにして作出した。ｐＲＳ４０５プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号６および配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子の５’上流に配列番号８で示した配列、３’下流に配列番号９で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲおよび増幅したＤＮＡ断片の精製は、上記記載の方法に準じた。該ＤＮＡ１μｇを用いて、Δｐｄｃ１株を形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株は、ロイシン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＬＥＵ２遺伝子の働きにより、ロイシン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入されたΔａｄｈ１株を選択することができる。次に、Δａｄｈ１株をプラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は、上記（実施例１）記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択することができる。
【００３２】
作製した組み換え株、Δａｄｈ１（ｐＴＲＳ４８）株を１０ｍｌＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で４８時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で４８時間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を回収し、１％アルギン酸ナトリウム溶液１０ｍｌに懸濁した。該懸濁液をＧｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌ．に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を５０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始１４時間後に培養液を１ｍｌ採取し、該培養液中の乳酸濃度をＨＰＬＣ、エタノール濃度をＧＣを用いて測定した。分析条件は、上記記載の条件に準じた。その結果、乳酸が１１．３ｇ／ｌ、エタノールが２．１ｇ／ｌ生産された。乳酸の対糖収率は６５％であった。また、乳酸の生産速度は０．８１ｇ／ｌ／ｈであり、親株と同等の生産速度を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、高い収率で乳酸を生産することができる。また、本発明によれば、乳酸脱水素酵素が導入された酵母株に対して、さらにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させた酵母株を固定化することにより、アルコール生成量を減少させるとともに、親株と同等の生産速度を維持しつつ、高い対糖収率で乳酸を生産することが可能であり、コスト低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明で用いられるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【配列表フリーテキスト】
【００３５】
配列番号２―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醗酵や食品など様々な応用微生物工業で利用される固定化された酵母株と、その酵母株を用いて高い対糖収率で乳酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料生産が盛んに行われている。その中で生物由来材料である乳酸を用いたポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
【０００３】
乳酸の生産は、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程および精製工程に多大なコストを要している。
【０００４】
一方、酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造法についても複数、提案されている（特許文献１〜３および非特許文献１、２参照。）。本来、乳酸生成能を持たない酵母に乳酸生成酵素遺伝子を導入し、乳酸を生産させることにより中和操作を軽減し、低コストな乳酸製造工程を構築することが可能である。
酵母は、その生理機能を巧みに利用して、多数の有用物質を工業生産する微生物として利用されている。酵母を生体触媒として工業的に利用する場合には、その機能を最大限発揮させることが重要であり、そのため種々の固定化法が現在までに開発され、実際に工業生産に応用されている。現在、工業的に開発、応用されている酵母の代表的な固定化法には、アルギン酸カルシウムやｋ−カラギーナンなどによるゲル包括法が知られており、エタノール生産などに利用されている（非特許文献３参照。）。固定化酵母を用いたエタノール生産の利点は、効率および生産性の向上があることである。しかしながら、固定化酵母を用いた乳酸の製造方法は知られていない。
また、固定化微生物を用いた乳酸生産として、リゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｉｚａｅ）の胞子をコットンシートに吸着固定し、コットンシート上で増殖させた固定化菌糸体を用いた生産が報告されている（非特許文献４参照。）。この報告内容においては、胞子を吸着固定したコットンシートをさらにステンレス製の支持体に固定して、乳酸生産に用いている。この方法では、菌糸体の増殖のばらつきから生産の不安定性および菌糸体の遊離が考えられ、連続的な生産プロセスとしては課題が残る。また、スケールに応じて、ステンレス製支持体の改良が必要でありコストを要する。それに対し、ゲル包括法は、ゲルに増殖した微生物を包括することにより大きな増殖を押さえ、安定した細胞の維持が可能であり、また、固定化菌体の再利用が可能である。ゲル包括法は、用いられるゲル材料を選択することにより、固定化菌体作製のコストを抑えられ、培養装置の改良も必要はない。リゾパス・オリゼは、菌糸体を形成して生長するために、ゲル包括法を用いた固定化を行うことはできない。また、報告によると、リゾパス・オリゼは、低ｐＨ域での生産性に問題が生じている。これに対しても、酸性条件下で生育が可能であるという酵母の特性から解決可能であり、乳酸生産能を持つ酵母株をゲル包括固定し、乳酸生産を行うことは非常に有用な技術である。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、４４、１９（１９８２）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（バイオテクノロジー アンド バイオエンジニアリング）、８０、１（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化酵母株と、その固定化酵母株を用いることにより高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、乳酸合成酵素遺伝子を導入した酵母株を作出し、さらにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させた酵母株を固定化材料に抱埋し、該固定化乳酸生成酵母株を用いることにより安定な乳酸製造方法を発明した。該酵母株を用いることにより、エタノール生成を抑制し、高い収率で乳酸が得られ、上記課題を解決するに至った。
すなわち、本発明によれば、下記の（１）〜（５）に記載の構成にかかる発明を提供することができる。
（１）乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
（２）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる前記（１）記載の酵母株。
（３）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる前記（１）または（２）記載の酵母株。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
（５）酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする前記（４）記載の乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、乳酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換酵母株であって、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を必要に応じて施した酵母株を固定化し、該固定化酵母株を糖質存在下で培養することにより、エタノール合成を抑制し、高い対糖収率で乳酸を製造をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の酵母株は、乳酸合成酵素遺伝子が導入され、さらに固定化材料に抱埋されてなる固定化された酵母株であり、より好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株である。さらに必要に応じ、前記酵母株に対して、変異処理によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させてなる酵母株である。
【０００９】
また、本発明の乳酸の製造方法は、前記の固定化された酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物中から該乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法である。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる酵母株（微生物）は、乳酸脱水素酵素を発現する能力をもつ、乳酸合成酵素遺伝子が導入された酵母株であり、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、より好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株などを挙げることができる。
【００１０】
上記サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株としては、サッカロマイセス・セレビシエなどを挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、配列番号１で表されるデオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと略す。）が変異した染色体ＤＮＡを有するサッカロマイセス・セレビシエを挙げることができる。
アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株とは、遺伝子配列に偶発的もしくは人為的に変異を誘発してなる変異を持つ酵母株であり、その結果、ＡＤＨ活性が、親株の好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下のＡＤＨ活性であることを特徴とする酵母株である。
ＡＤＨ活性は、酵母株の無細胞抽出液を調製し、該抽出液にエタノールおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を添加し、添加したエタノールがアセトアルデヒドに変換する過程において生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の生成量により測定することが出来る。
【００１１】
ＡＤＨ活性が低下した酵母株は、ＡＤＨタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ＡＤＨ１遺伝子に変異が生じているために、当該遺伝子がコードするタンパク質を生産しない、もしくは非活性型または活性が低下した形で生産する酵母株であればいずれの酵母株でもよく、該変異としては、例えば、ＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡの全部もしくは一部が欠損している変異、および該タンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失または置換された変異などを挙げることができる。
本発明において、ＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡの全部もしくは一部が欠損しているとは、該染色体ＤＮＡの塩基配列において、少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失した変異を有するＤＮＡを挙げることができる。ＡＤＨ１タンパク質のアミノ酸配列において、少なくとも１以上のアミノ酸が欠失した変異とは、ＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡに対し、部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失した変異をいう。
【００１２】
部位特異的変異の導入は、「モレキュラークローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））、「カレント プロトコールズ イン モレキュラーバイオロジー」（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））および「メソッズ イン エンザイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）等に記載の方法に準じて行うことができる。部位特異的変異の導入は、具体的には、変異を挿入しようとするＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、該クローン化ＤＮＡに対して変異処理を施すことにより行うことができる。例えば、変異を入れようとする箇所にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドに対して塩基置換を施し、該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ反応により変異ＤＮＡを合成することによる変異導入方法が挙げられるが、本発明における変異導入方法はこれに限定されるものではない
上記したＡＤＨ１遺伝子の全部もしくは一部が欠損した変異を有する酵母株の該ＤＮＡが、野生型株のＡＤＨ１遺伝子の全部もしくは一部を欠損しているか否かは、該酵母株と親株のＡＤＨ１タンパク質をコードするＤＮＡ領域をポリメラーゼ チェイン リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、ＰＣＲと略す。）により増幅させ、その増幅サイズを比較することにより確認することができる。上記親株とは、上記変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株および遺伝子組み換え技術を用いて造成した組み換え株であってもよい。
【００１３】
導入される乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、酵母株において生産されうる酵素をコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、該酵素の活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡが好ましい。酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡとしては、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる該酵素活性が強い乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡや、強力なプロモーターの支配下に該酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどを挙げることができる。具体的な乳酸脱水素酵素としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ｌｄｈ―ｈと略す。）またはボス・トウラス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。
【００１４】
図１は、本発明で用いられるｌｄｈ−ｂ発現用プラスミドｐＴＲＳ１１の構造を示す構築図である。
【００１５】
Ｌ−ｌｄｈ−ｈ遺伝子の発現様式としては、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、染色体への導入による発現、またはプラスミドによる発現など特に限定されないが、プラスミドによる発現を微生物としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いる場合は、例えば、Ｌ−ｌｄｈ―ｈ遺伝子をｐＴＲＳ１１（図１）に連結したマルチコピー発現プラスミドｐＴＲＳ４８を挙げることができる。
【００１６】
ｐＴＲＳ４８を有する形質転換酵母株の培養は、乳酸脱水素酵素が発現する培養法であれば特に限定されないが、ｐＴＲＳ４８を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合は、例えば、ＳＣ−Ｕｒａ培地［２０ｇ／ｌ グルコース、６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒａｃｉｌ（シグマ社製）］を前培養の培地として用いて一晩培養後、得られた培養液を終濃度が１％になるように、ＳＣ−Ｕｒａ培地に接種して培養する方法を挙げることができる。
【００１７】
酵母株の固定化に用いられる固定化材料（担体）としては、酵母細胞を包括できるものであればいずれの担体でもよいが、例えば、アルギン酸カルシウムゲル、ｋ−カラギーナン、ポリアクリルアミド、低メトキシペクチンゲル、寒天ゲルおよびシリカゾルなどが挙げられる。
【００１８】
アルギン酸カルシウムゲルへの酵母細胞を包埋する方法としては、上記の酵母株を所定の菌体量になるまで培養した培養液から、菌体を遠心分離やろ過などの分離法により回収し、１％アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁し、懸濁液をＣａＣｌ２を含む水溶液中に滴下することにより、酵母細胞を包埋することができる。得られた固定化酵母株をＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、一定時間培養したときの培養液中の乳酸生産量を測定する。
【００１９】
培養液中の乳酸濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法で定量することができ、例えば、培養液を遠心分離して培養液上清を調整し、該培養液上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することで培養液の、例えば、乳酸やピルビン酸等の有機酸濃度を定量することができる。
【００２０】
ＡＤＨ１タンパク質をコードする遺伝子が変異を有する酵母株の製造方法としては、［１］相同組み換え法などを用いて、ＡＤＨ１タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部が欠損した酵母株を製造する方法や、［２］相同組み換え法などを用いて、ＡＤＨ１タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは挿入等の変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体上に有する微生物を製造する方法などが挙げられる。
【００２１】
上記［１］の方法としては、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株を用いる方法を挙げることができる。直鎖ＤＮＡとしては、例えば、ＬＥＵ２遺伝子の両端にＡＤＨ１遺伝子の内部または近傍の配列と相同性を有するＤＮＡを配置した直鎖ＤＮＡを挙げることができる。
【００２２】
該直鎖ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株に常法により導入し、ロイシン要求性回復株を選択することにより、ＡＤＨ１遺伝子欠損または部分欠損酵母株を取得することができる。
【００２３】
上記［２］の方法としては、ＡＤＨ１遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより、該遺伝子がコードするアミノ酸配列において、少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする変異型遺伝子を取得し、相同組み換え法を用いることにより、染色体ＤＮＡ上にある野生型ＡＤＨ１遺伝子が変異型ＡＤＨ１遺伝子に置換された染色体ＤＮＡを有する酵母株を作出する方法などを挙げることができる。
本発明で用いられる酵母株は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入した酵母株に、上記方法によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を施すことにより製造することができるが、該酵母株がすでに目的とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性が野生株より明らかに低下している場合は、必ずしも変異処理を施す必要はない。
【００２４】
また、本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素）をコードする遺伝子を組み込んだ固定化酵母株であり、かつ必要に応じＡＤＨ１をコードするDNAの全部もしくは一部が欠損、欠失、置換または挿入等の変異を有する染色体DNAを保持する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い酵母株を固定化し、該固定化された酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸脱水素酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から該乳酸を採取する乳酸の製造方法である。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株の培養は、下記した通常の方法に従って行うことができる。本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株を培養する培地は、該固定化酵母株が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該酵母株が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
生成した乳酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする乳酸を単離し、精製することができる。例えば、特開２００１−２０４４６４公報および特開平９−１３５６９８などに公開されているような方法により精製することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
【００２６】
（実施例１） 固定化酵母株を用いた乳酸の生産
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＢＲＣ１０５０５株のゲノムＤＮＡ上に存在するピルビン酸脱炭酸酵素（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）１遺伝子（以下、ＰＤＣ１遺伝子と略す。）をＴＲＰ１をコードする遺伝子と置換した遺伝子組み換え株（以下、Δｐｄｃ１株と略す。）を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δｐｄｃ１株は、次のようにして作出した。ｐＲＳ４２４プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号２および配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＴＲＰ１遺伝子の５’上流に配列番号４で示した配列、３’下流に配列番号５で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用いて、鋳型とするプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液ＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃の温度で１０分間保温後、９４℃の温度で３０秒間、５５℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で１分３０秒間のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃の温度で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片はＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＰＣＲ Ｋｌｅｅｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて精製した。該ＤＮＡ１μｇを用いて、ＮＢＲＣ１０５０５株を形質転換した。形質転換はＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするＮＢＲＣ１０５０５株は、トリプトファン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入されたΔｐｄｃ１株を選択することができる。次に、Δｐｄｃ１株をプラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択することができる。
【００２７】
作製した組み換え株、Δｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株を１０ｍｌＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を回収し、湿重量５ｇの菌体を１％アルギン酸ナトリウム溶液１０ｍｌに懸濁した。該懸濁液を次の組成からなる溶液（以下、Ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌ．と略す。）
［Ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌ．の組成］
・Ｇｌｕｃｏｓｅ １００ｇ／Ｌ
・ＣａＣｌ２ ９０ｍＭ
・ＫＨ２ＰＯ４ １５ｍＭ
に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を、５０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地［１００ｇ／ｌ グルコース、６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒａｃｉｌ（シグマ社製）］に接種し、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始１４時間後に培養液を１ｍｌ採取し、該培養液中の乳酸濃度をＨＰＬＣを用いて、またエタノール濃度をＧＣを用いて測定した。ＨＰＬＣおよびＧＣの分析条件を以下に示す。
【００２８】
［ＨＰＬＣ分析条件］
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・カラム温度：４５℃
［ＧＣ分析条件］
・カラム：ＴＣ−１
・キャリアガス：ヘリウム
・流速：７ｍｌ／ｍｉｎ．
・オーブン温度：１００℃
・インジェクション温度：２００℃
・検出器温度：２００℃
・検出器：ＦＩＤ（Ｆｒａｍｅ Ｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｅｒ）
その結果、乳酸が１２．０ｇ／ｌ、エタノールが３７．７ｇ／ｌ生産された。乳酸の対糖収率は１２．１％であった。また、乳酸の生産速度は０．８７ｇ／ｌ／ｈと算出された。
【００２９】
次に、固定化酵母株の再利用を検討した。
【００３０】
上記のように、Δｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株を培養し、得られた菌体を上記のようにアルギン酸カルシウムゲルに固定化した。固定化したΔｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株を４０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始６時間後に培養液中の乳酸濃度を測定し（１）、該培養液を新しい４０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に交換し、再度３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。１２時間後に乳酸濃度を測定し（２）、再び培養液を新しい４０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に交換し、さらに６時間、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した後、乳酸濃度を測定した（３）。（１）〜（３）のそれぞれの培養液中の乳酸濃度を測定したところ、（１）８．５ｇ／Ｌ、（２）１１．０ｇ／Ｌ、（３）７．８ｇ／Ｌであり、生産速度は、（１）１．４ｇ／Ｌ／ｈ、（２）０．９２ｇ／Ｌ／ｈ、（３）１．３ｇ／Ｌ／ｈと算出され、包括固定した酵母株を用いることにより、繰り返し安定した乳酸生産が行うことができる。各培養液は１００倍希釈し、乳酸濃度を測定した。乳酸濃度の測定は、Ｆ−キット（Ｌ−乳酸）（ＪＫインターナショナル社製）を用いて行った。
【００３１】
（実施例２） 固定化アルコールデヒドロゲナーゼ活性低下形質転換酵母株を用いた乳酸の生産
Δｐｄｃ１株のゲノムＤＮＡ上に存在するＡｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １（以下、ＡＤＨ１遺伝子と略す。）遺伝子座を欠失した遺伝子組み換え株（以下、Δａｄｈ１株と略す）を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δａｄｈ１株は、次のようにして作出した。ｐＲＳ４０５プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号６および配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子の５’上流に配列番号８で示した配列、３’下流に配列番号９で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲおよび増幅したＤＮＡ断片の精製は、上記記載の方法に準じた。該ＤＮＡ１μｇを用いて、Δｐｄｃ１株を形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株は、ロイシン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＬＥＵ２遺伝子の働きにより、ロイシン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入されたΔａｄｈ１株を選択することができる。次に、Δａｄｈ１株をプラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は、上記（実施例１）記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択することができる。
【００３２】
作製した組み換え株、Δａｄｈ１（ｐＴＲＳ４８）株を１０ｍｌＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で４８時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で４８時間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を回収し、１％アルギン酸ナトリウム溶液１０ｍｌに懸濁した。該懸濁液をＧｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌ．に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を５０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始１４時間後に培養液を１ｍｌ採取し、該培養液中の乳酸濃度をＨＰＬＣ、エタノール濃度をＧＣを用いて測定した。分析条件は、上記記載の条件に準じた。その結果、乳酸が１１．３ｇ／ｌ、エタノールが２．１ｇ／ｌ生産された。乳酸の対糖収率は６５％であった。また、乳酸の生産速度は０．８１ｇ／ｌ／ｈであり、親株と同等の生産速度を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、高い収率で乳酸を生産することができる。また、本発明によれば、乳酸脱水素酵素が導入された酵母株に対して、さらにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させた酵母株を固定化することにより、アルコール生成量を減少させるとともに、親株と同等の生産速度を維持しつつ、高い対糖収率で乳酸を生産することが可能であり、コスト低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明で用いられるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【配列表フリーテキスト】
【００３５】
配列番号２―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
【請求項２】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる請求項１記載の酵母株。
【請求項３】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる請求項１または２記載の酵母株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項５】
酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする請求項４記載の乳酸の製造方法。
【請求項１】
乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
【請求項２】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる請求項１記載の酵母株。
【請求項３】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる請求項１または２記載の酵母株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項５】
酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする請求項４記載の乳酸の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１７４９４７（Ｐ２００７−１７４９４７Ａ）
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７５６２７（Ｐ２００５−３７５６２７）
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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