金属タンパク質の活性を阻害するために有用な抗体および該抗体を含有する医薬組成物
本発明は、一般式（Ｉ）を有する化合物（式中、ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；およびＲは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、ただし：ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；およびＲ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される）および上記化合物に特異的に結合することができる抗原認識領域を含む抗体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属タンパク質（例えば、メタロプロテアーゼ）の活性を阻害するために使用することができるハプテン分子および該ハプテン分子に対する抗体、ならびに、金属タンパク質の異常な活性に関連する疾患（例えば、転移性ガン）を処置するために該抗体を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス金属タンパク質（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングに関与する重要な酵素である。これらの酵素は関節軟骨または基底膜の様々な結合組織成分を破壊することができる。
【０００３】
ヒトＭＭＰ遺伝子ファミリーは、少なくとも２８の構造的に関連したタンパク質（図１参照）からなり、これらのタンパク質は、類似した全体的な球状トポロジーを共有する（図２およびＢｏｒｋａｋｏｔｉ（１９９８））。それぞれのＭＭＰが不活性な潜在型プロ酵素として分泌される。触媒作用の亜鉛ドメインが約１８０個のアミノ酸から構成され、これらのアミノ酸において、その高度に保存された配列（ＨＥ−ＧＨ−ＬＧＬ−Ｈ）により、金属Ｚｎ（２＋）イオンに結合する３つのヒスチジン（すなわち、Ｈ）残基が提供される。プロ酵素における触媒作用亜鉛イオンの第４の結合部位がシステイン残基に結合しており（Ｍｏｒｇｕｎｏｖａ他、１９９９）、このシステイン残基は、酵素が活性化されたとき、活性部位から解離する（Ｖａｎ ＷａｒｔおよびＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ、１９９０）。その結果、活性化されたＭＭＰにおける第４の結合部位が、保存されたグルタミン酸残基に対しても水素結合する水分子によって占められる。このプロセスにより、活性化された水分子による標的基質のペプチド結合の加水分解が促進される。
【０００４】
メタロプロテアーゼによる結合組織の制御されない分解は、過度なＭＭＰ活性から生じるか、または、生来的なＭＭＰ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）とＭＭＰとの間におけるバランスの崩れた比率から生じるとおそらくは考えられる多くの病理学的状態の特徴の１つである。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの活性な結合部位との化学量論的な複合体を形成することによってＭＭＰを阻害する（Ｇｏｍｅｚ他、１９９７；Ｈｅｎｒｉｅｔ他、１９９９；Ｂｏｄｅ他、１９９９；Ｗｉｌｌ他、１９９６）。ＴＩＭＰのレベルが不十分であるとき、ＥＣＭの進行性のゆっくりした分解により、軟骨マトリックスの喪失がリウマチ様関節炎（Ｗａｌａｋｏｖｉｔｓ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、３５：３５〜４２、１９９２）および変形性関節炎（Ｄｅａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８４：６７８〜６８５、１９８９）において引き起こされ得るか、または、骨マトリックスの分解が骨粗鬆症（Ｈｉｌｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３０８：１６７〜１７５、１９９５）において引き起こされ得る。他の状況において、例えば、うっ血性心不全では、心臓のＥＣＭの急速な分解が生じ得る（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ他、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０：２１４〜２２０、１９９４）。
【０００５】
加えて、ＭＭＰが、下記のようなサイトカインおよびケモカインの成熟化において役割を果たすことが知られている：例えば、ガレクチン−３（Ｏｃｈｉｅｎｇ Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３（４７）：１４１０９〜１４）、プラスミノーゲン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ＢＣ．、ＪＢＣ、１９９７、２７２（４６）：２８８２３〜５）、インターロイキン−８、結合組織活性化ペプチドＩＩＩ、血小板因子−４（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎ、２０００、Ｂｌｏｏｄ、２０００（Ｏｃｔ １５）、９６（８）：２６７３〜８１）、プロ−インターロイキン−１β（Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ、１９９８）、インターロイキン−２受容体α鎖［Ｓｈｅｕ，Ｂ．Ｃ、Ｈｓｕ，Ｓ．Ｍ．、Ｈｏ，Ｈ．、Ｌｉｅｎ，Ｈ．Ｃ．、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｉｎ，Ｒ．Ｈ．、Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）、６１、２３７〜２４２］、およびプロ−トランスフォーミング増殖因子−β［ＴＧＦ−β、Ｙｕ，Ｑ．、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（２０００）、１４、１６３〜１７６］など。
【０００６】
ＭＭＰの調節されない活性にも関係づけられる他の病理学的状態には、転移性腫瘍細胞によるＥＣＭの急速なリモデリングが含まれる。そのような状態では、活性化された様々なＭＭＰが、ガン細胞によって、または、その周りの組織によってそのどちらかで発現される。様々なＭＭＰが腫瘍の成長および拡大に関与しているという注目すべき証拠がある（例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２５８〜２６１、１９９７、および、それにおける参考文献を参照のこと）。腫瘍転移のプロセスにおいて、様々なＭＭＰが、ＥＣＭを分解するために使用され、このことが、原発性腫瘍のガン細胞が付近の血管に侵入することを許し、血管を介して、ガン細胞は異なる器官に運ばれ、二次的腫瘍を確立する。これらの二次的部位での侵襲的成長が、組織を分解するＭＭＰによって媒介される。加えて、ＭＭＰ活性は、腫瘍が特定のサイズを超えて成長するために要求される新しい血管の侵襲的な、内部に向かう成長（これは腫瘍起因性血管形成とも呼ばれる）に寄与している。ＭＭＰファミリーのメンバーの中で、分泌型のヒトＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢとしても知られている）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の異化においてだけでなく、神経学的疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））での関連があるタンパク質基質のプロセシングにおいてもまた重要な役割を有することが示されている（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ、２００３）。近年の研究では、ＭＭＰ−９が、プレプロセシングされたＩＩ型コラーゲンを切断することによって自己免疫疾患を促進させることにおいて非常に重要な役割を有することが示された（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎ、２００４）。その生成物が、様々な自己免疫疾患を生じさせると考えられるレムナントエピトープであるＩＩ型コラーゲンフラグメントである。
【０００７】
ヒトの生理学および病理学における様々なＭＭＰの幅広い役割を考えた場合、数多くの努力がこれまで、ＭＭＰの過度な活性を阻害する薬物を設計するために行われていることは驚くことではない。
【０００８】
薬物発見の様々な努力が、亜鉛イオンに配位し、それにより、標的ＭＭＰを不活性化する官能基を含有する阻害剤クラスに集中している。１つのそのような阻害剤クラスが、繊維状コラーゲンの小ペプチドアナログであるヒドロキサム酸系阻害剤であり、ヒドロキサム酸系阻害剤は触媒作用部位内の亜鉛イオンとヒドロキサム酸基のヒドロキシル酸素およびカルボニル酸素を介して二座様式で特異的に相互作用する［Ｇｒａｍｓ他（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１４０１２〜１４０２０；Ｂｏｄｅ他（１９９４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：１２６３〜１２６９］。
【０００９】
ヒドロキサム酸に基づくＭＭＰ阻害剤は通常、炭素骨格（ＷＯ９５／２９８９２、ＷＯ９７／２４１１７、ＷＯ９７／４９６７９およびＥＰ０７８０３８６）、ペプチジル骨格（ＷＯ９０／０５７１９、ＷＯ９３／２００４７、ＷＯ９５／０９８４１およびＷＯ９６／０６０７４）またはペプチドミメティック骨格［Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、Ｐｒｏｇｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２９：２７１〜３３４（１９９２）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７５：６９〜７５（１９９７）；Ｄｅｎｉｓ他、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、１５：１７５〜１８５（１９９７）］のいずれかから構成される。代替として、ヒドロキサム酸に基づくＭＭＰ阻害剤は、一方の側でフェニル環に結合するスルホンアミドスルホニル基と、１個〜４個の炭素原子の鎖を介してヒドロキサム酸基に結合するスルホンアミド窒素とを含有する（ＥＰ０７５７９８４Ａ１）。
【００１０】
ペプチドに基づく他のＭＭＰ阻害剤として、コラゲナーゼ阻害活性を示すチオールアミド（米国特許第４５９５７００号）、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２およびコラゲナーゼを阻害する、ビフェニルエチルグリシン部分を含有するＮ−カルボキシアルキル誘導体（Ｄｕｒｅｔｔｅ他、ＷＯ−９５２９６８９）、各種ＭＭＰ、ＴＮＦ−αおよびアグリカーゼを阻害するラクタム誘導体（米国特許第６４９５６９９号を参照のこと）、ならびに、三環スルホンアミド化合物（米国特許第６４９２４２２号を参照のこと）がある。
【００１１】
ペプチドに基づくＭＭＰ阻害剤は明らかな治療的可能性を有するが、臨床治療におけるそれらの使用は制限される。ペプチドに基づくヒドロキサム酸系薬剤は、製造に費用がかかり、また、低い代謝安定性および経口での低い生物学的利用能を有する［例えば、バチマスタット（ＢＢ−９４）］。これらの化合物は迅速なグルクロン酸抱合を受け、カルボン酸に酸化され、胆汁に排出される［Ｓｉｎｇｈ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：３３７〜３４２、１９９５；Ｈｏｄｇｓｏｎ、「Ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ＭＭＰＩｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５５４〜５５７、１９９５］。加えて、ペプチドに基づくＭＭＰ阻害剤は、多くの場合、ＭＭＰ酵素のそれぞれに対して同じまたは類似する阻害作用を示す。例えば、バチマスタットは、約１ｎＭ〜約２０ｎＭのＩＣ５０値を、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９のそれぞれに対して示すことが報告される［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７５（１）：６９〜７５（１９９７）］。さらに、いくつかのヒドロキサム酸系阻害剤の使用には、重篤な副作用が伴った：例えば、マリマスタット（ＢＢ−２５１６）による筋骨格問題；ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）による広範囲に及ぶ斑丘疹性発疹［Ｌｅｖｉｔｔ他、２００１、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：１９１２〜１９２２］；ＢＡＹ１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ）による肝臓異常、貧血、肩部痛および背痛、血小板減少症、吐き気、疲労、下痢、ならびに、深部静脈血栓症［Ｈｅａｔｈ他、２００１、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：２６９〜２７４］。そのうえ、マリマスタット、プリノマスタット（ＡＧ３３４０、Ａｇｏｕｒｏｎ）およびＢａｙ１２−９５６６を用いた進行ガン患者に対する第ＩＩＩ相臨床試験では、転移を阻害することにおける臨床的効力がないことが明らかにされた（Ｚｕｃｋｅｒ他、２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９：６６４２〜５０）。
【００１２】
他のＭＭＰ阻害剤として、いくつかのＭＭＰの発現をインビトロで阻止することが示された化学的に修飾された非微生物性テトラサイクリン系化合物（ＣＭＴ）がある。しかしながら、これらの化合物のインビボ効力は、限定されることが見出された。例えば、ＣＭＴ阻害剤のドキシサイクリンは、ヒト患者において、アテローム硬化性頸動脈プラークにおけるＭＭＰ−１の組織レベルを低下させたが、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３またはＭＭＰ−９の組織レベルは低下させなかった（Ａｘｉｓａ他、２００２、Ｓｔｒｏｋｅ、３３：２８５８〜２８６４）。
【００１３】
近年、機構に基づいたＭＭＰ阻害剤のＳＢ−３ＣＴがＭＭＰの活性部位のＸ線結晶学情報に従って設計された（Ｂｒｏｗｎ他、２０００）。Ｘ線吸収研究では、この分子が触媒作用の亜鉛に結合することにより、活性部位の金属イオンの周りの立体配座環境が再構築されて、プロ酵素の立体配座環境に戻ることが解明された［Ｋｌｅｉｆｅｌｄ他、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７１２５〜３１］。しかしながら、この薬剤を用いて得られる治療効力は今後、明らかにされなければならない。
【００１４】
別のクラスの天然の阻害剤がモノクローナル抗体である。いくつかの抗体が、ＭＭＰ−１の触媒作用ドメインに含まれる特定のペプチド配列に対して惹起されている（Ｇａｌｖｅｚ他、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：３７４９１〜３７５００）。しかしながら、これらの抗体はＭＭＰのインビトロ活性を阻害することができたが、そのような抗体のインビボ有効性を明らかにする結果はこれまで明らかにされていない。
【００１５】
本明細書において上記されるように、ＭＭＰの触媒作用部位は、酵素活性化の後で基質結合のために利用可能になる配位した金属イオンを含む（図２ａ〜ｃを参照のこと）。従って、酵素の一次アミノ酸配列に向けられた従来の抗体は、酵素の活性型形態と不活性型形態とを区別せず、従って、そのような酵素の強力な阻害剤として役立たないことが考えられる。
【００１６】
本発明者らは、ＭＭＰの触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基の両方を認識する抗体がその強力な阻害剤であり、また、そのようなものとして、バランスの崩れたＭＭＰ活性に関連する疾患を処置するために使用できることを以前に示している（ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０８７０４２を参照のこと）。
【００１７】
従って、金属タンパク質の触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基を模倣する特異的なハプテン化合物、ならびに、そのようなハプテン化合物に対して向けられる特異的な抗体が必要であることが広く認識されており、また、そのようなハプテン化合物、ならびに、そのような特異的な抗体を有することは非常に望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の１つの態様によれば、一般式（Ｉ）を有する化合物が提供される：
式中、
ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；
Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；
Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；および
Ｒは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、
ただし：
ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；および
Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される。
【００１９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、化合物は式（ＩＩ）を有する：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、式（ＩＩ）を有する化合物が提供される：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【００２１】
本発明のさらに別の態様によれば、上記化合物と特異的に結合することができる抗原認識領域を含む抗体が提供される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗原認識領域は、配列番号７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択されるＣＤＲアミノ酸配列を含む。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体は金属タンパク質の活性を阻害することができる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、金属タンパク質はマトリックスメタロプロテアーゼである。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、マトリックスメタロプロテアーゼはゼラチナーゼである。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ゼラチナーゼは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様によれば、金属タンパク質阻害剤を製造する方法が提供され、該方法は、上記化合物に向けられた抗体を作製し、それにより、金属タンパク質阻害剤を製造することを含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体はモノクローナル抗体である。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体と医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患をその処置の必要性のある対象において処置する方法が提供され、該方法は、請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つの治療有効量を対象に投与し、それにより、金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患を対象において処置することを含む。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は炎症性腸疾患である。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害する方法が提供され、該方法は、細胞を請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つと接触させ、それにより、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害することを含む。
【００３５】
本発明は、金属タンパク質の触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基の両方を認識する抗体を作製するために使用されることができる新規なハプテン組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００３６】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３７】
本明細書では本発明を単に例示し添付図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、Ｃｏ／ＺｎＴＣＰＰ、すなわち、［メソ−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリナト］コバルト／亜鉛（ＩＩ）（図１Ａ〜Ｂ）、Ｉｍｉｓｄｐ、すなわち、［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタン）、および、ＭＭＰにおける触媒作用亜鉛部位での保存された亜鉛−タンパク質結合の分子構造の概略表示である。図１Ｅ〜図１Ｈは、図１Ａ〜ｄに示される構造の三次元スキームである。ＺｎＴＣＰＰは平面の立体配座を保持し、一方、ＣｏＴＣＰＰは、ひずみのあるミクロサイクル立体配座を示すことに留意すること。注目すべきことに、ｍｉｓｄｐの構造は、図１Ｇにおいて明らかにされるようにＭＭＰ−９における触媒作用亜鉛イオンの最隣接環境と非常に類似している。
【図２】図２Ａは、Ｉｍｉｓｄｐの三次元での計算された構造（緑色の炭素原子）と、ＭＭＰ−９の活性部位での３つの保存されたヒスチジン（ＰＤＢコード：１ＧＫＣ、灰色の炭素原子）との間における構造的重なりである。触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球として示され、水分子が青色の球として示され、窒素が青色で着色され、酸素が赤色で着色される。図２Ｂは、ＺｎＴＣＰＰのポルフィリン環（ＣＳＤコード：ＡＫＩＣＯＭ）（緑色の炭素原子）と、ＭＭＰ−９の活性部位での３つの保存されたヒスチジン（灰色の炭素原子、ＰＤＢコード：１ＧＫＣ）との間における構造的重なりである。触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球として示され、窒素が青色で着色される。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、マウスＩｇＧ−アガロースに固定化されたｍＡｂが溶液から組換えＭＭＰ−２触媒作用ドメイン（ＭＭＰ−２ｃａｔ）またはＰｒｏ−ＭＭＰ−２およびＰｒｏ−ＭＭＰ−９を捕らえることができることを示すウエスタンブロット画像である。それぞれの実験のために使用された抗体は、６Ｃ６、１３Ｅ１１および１３Ｅ１５である。図３Ａ：ＭＭＰ−２ｃａｔ（２μｇ）を、抗マウスＩｇＧ−アガロース（コントロール、レーン１）、または、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂ（１０μｇ）−抗マウスＩｇＧ−アガロース、抗ＺｎＴＣＰＰ ｍＡｂ（１０μｇ）−抗マウスＩｇＧ−アガロースおよび抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂ（１０μｇ）−抗マウスＩｇＧ−アガロースと２０℃で２時間インキュベーションし、免疫沈殿物（レーン２、３、５）を遠心分離し、３回洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。図３Ｂ：Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９を、Ａの場合と同じ様式でｍＡｂ−抗マウスＩｇＧ−アガロースとインキュベーションした。免疫沈殿物（レーン２、レーン４、レーン６の左側、および、レーン１、レーン３、レーン５の右側）および非結合画分（レーン１、レーン３、レーン５の左側、および、レーン２、レーン４、レーン６の右側）をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。図３Ｃ：ＡＰＭＡによる活性化を受けたＨＴ１０８０細胞（左）、または、活性化を受けなかったＨＴ１０８０細胞（右）の馴化培地を、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂにより免疫沈殿し、ＭＭＰ−２に対する特異的抗体によるウエスタンブロットによって分析した。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、ＭＭＰ−２（Ａ）およびＭＭＰ−９（Ｂ）の抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂ阻害のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。速度の単位はμｍｏｌ／ｓｅｃ−１であり、基質の単位はμＭ−１である。図４Ａ：ｍＡｂの濃度が、６μＭ（黒三角）、１８μＭ（黒四角）、２４μＭ（白丸）および０μＭ（白四角）であった。ＭＭＰ−２ｃａｔの濃度が２００ｎＭであった。図４Ｂ：全長のＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−９の阻害、ｍＡｂの濃度が、６μＭ（白四角）、１２μＭ（黒三角）、２４μＭ（白四角）および０μＭ（黒四角）であった。ＭＭＰ−９の濃度が２０ｎＭであった。阻害パターンは、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の競合的阻害剤として挙動することを示している。
【図５】抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂによるＭＭＰ−２阻害およびＭＭＰ−９阻害を示すプロットである。ＭＭＰ−９の触媒作用ドメイン（２０ｎＭ）（黒丸）または全長のＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−２（黒三角、５ｎＭ）を、増大する濃度のｍＡｂを含有する緩衝液Ｒにおける蛍光発生基質ＯＣＡｃＰＬＧＬＡ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（１０μＭ）の混合物に加えた。曲線は、プログラムＯｒｉｇｉｎを使用する、式：ｖｉ／ｖｏ＝（Ｋｍ＋［Ｓ］）／（Ｋｍ（１＋［Ｉ］／Ｋｉ）＋［Ｓ］）への非線形最小二乗適合を表す。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、ＭＭＰ−２ｃａｔの活性型形態および抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂによる阻害型形態の亜鉛ｋ端スペクトルを示す。活性型（点線）およびＭＭＰ−２ｃａｔ−ｍＡｂ複合体（実線）の亜鉛Ｋ端領域の正規化された生ＸＡＳデータが示される。図６Ｂは、ＭＭＰ−２ｃａｔ−ｍＡｂ複合体（実線）の端位置が、活性型ＭＭＰ−２ｃａｔ（点線）と比較して高エネルギー側にシフトすることを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＥＸＡＦＳの結果をＭＭＰ−２ｃａｔの活性型形態（黒色）および阻害型形態（緑色）について示す。結果がＲ空間で示され、ｋ空間に逆変換される。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂが細胞表面ゼラチナーゼ活性を阻害することができることを示す写真である。１ｕＭの１３Ｅ１１ ｍＡｂの存在下または不在下における、ＱＤ−ゼラチンで被覆されたカバースリップに置かれたＨＴ１０８０細胞の代表的な蛍光顕微鏡写真。細胞表面ゼラチン分解活性が、分解されたゼラチンによって放出される蛍光の大きさとしてアッセイされた。非処理の細胞は著しい細胞表面ゼラチナーゼ活性を示し、この細胞表面ゼラチナーゼ活性は１ｕＭの抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂの存在下で著しく阻害された。４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（青色）は細胞の核の所在位置を示している。
【図８】図８は、様々なＭＭＰ活性部位（Ｓ１ポケット）の立体配置を示すスキームである。
【図９】図９は、Ｉｍｉｓｄｐの合成スキームである。
【図１０】図１０は、ＣＤＲ領域が強調して示される本発明の抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、６Ｃ６がＭＭＰ９およびＭＭＰ２の活性型立体配座とだけ結合することを示す写真およびモデルである。図１１Ａ：マウスの腹水から６Ｃ６と同時精製された活性型ＭＭＰ９の検出。ＭＭＰ９を含有するマウス腹水から精製されたｍＡｂ（１０μｇ）を、市販の抗ＭＭＰ９抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）分析に供した。同じ様式で精製されている非関連のＩｇＧ ｍＡｂが陰性コントロール（ＭＡｂコントロール）として役立った。Ｈｉｌｌａトランスフェクション細胞から精製されたヒトＰｒｏＭＭＰ９が、活性な化学種を識別するための分子量マーカーとして役立った。精製を、その定常ドメインを介してｍＡｂと結合し、それにより、抗原結合部位を、抗原と相互作用するために自由にしたままにするプロテインＧビーズを使用してアフィニティクロマトグラフィによって行った。図１１Ｂ、Ｃ：プロテインＡビーズに固定化された６Ｃ６ ｍＡｂを、ＰｒｏＭＭＰ２、ＰｒｏＭＭＰ９、または、（ヘモペキシンドメインおよびプロドメインを欠く）ＭＭＰ２触媒作用フラグメントを溶液から捕らえるその能力について分析した。プロテインＡセファロースビーズに固定化されたｍＡｂ ６Ｃ６（１０μｇ）を、ＭＭＰ２触媒作用フラグメント（１μｇ）（図１１Ｂ）、ＰｒｏＭＭＰ９（図１１Ｃ、上段）、または、ＰｒｏＭＭＰ２（２μｇ）（図１１Ｃ、下段）と２０℃で２時間インキュベーションした。ビーズに結合したｍＡｂ複合体を遠心分離によって分離し、３回洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。免疫沈殿物（６Ｃ６）および非結合画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。非特異的吸着のための陰性コントロールとして、酵素だけをプロテインＡセファロースビーズとインキュベーションした。図１１Ｄ：ヘモペキシンドメインを欠き、プロドメインを有するＭＭＰ２の三次元構造（下段）、および、ヘモペキシンドメインを欠き、プロドメインを有しないＭＭＰ２の三次元構造（上段）が表面表示で示される（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＫ７）。触媒作用ドメインおよびフィブロネクチンドメインがシアン色で示され、プロペプチドが赤色で示される。触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球体として示され、黄色の棒状体として示される３つの保存されたヒスチジンに結合する。示されるように、プロペプチドドメインにより、活性部位が立体的に阻止される。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂ６Ｃ６ ｍＡｂによるＭＭＰ−９の阻害機構に関連するグラフおよびデータである。図１２Ａ：ＭＭＰ−９組換え体の触媒作用フラグメント（ヘモペキシンドメインおよびプロドメインを有しない）を様々な量のｍＡｂとプレインキュベーションした。残存酵素活性を、蛍光発生ペプチド基質（１０μＭ）を加えた後で測定した。Ｋｉを、競合的阻害の式に適合化することによって評価した（ｖｉ／ｖｏ＝Ｋｍ＋［Ｓ］／（Ｋｍ（１＋Ｉ／Ｋｉ）＋［Ｓ］）Ｋｍ＝９．１４±０．８）（挿入図）。活性型ＭＭＰ−９（２ｎＭの固定された濃度で）を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）において、ｍＡｂの不在下（黒丸）、あるいは、０．７μＭのｍＡｂの存在下（黒四角）または２μＭのｍＡｂの存在下（白丸）、３７℃で６０分間プレインキュベーションした。その後、蛍光発生ペプチド基質（Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２）を、０μＭ〜３０μＭの範囲で示される最終濃度（Ｓ）を達成するために加え、基質加水分解の初速度を、増大した蛍光の測定によって求めた。見かけのＫｍおよびＶｍａｘの値を、実験データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に対して適合化することによって得た。得られた値を、両軸逆数のＬｉｎｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを再構築するために使用した（交点が６Ｃ６によるＭＭＰ−９の競合的阻害を示す）。図１２Ｂ：種々のＭＭＰを様々な量のｍＡｂとプレインキュベーションした。残存酵素活性を、蛍光発生ペプチド基質（１０μＭ）を加えた後で測定した。Ｋｉを、競合的阻害の式に適合化することによって評価した（ｖｉ／ｖｏ＝Ｋｍ＋［Ｓ］／（Ｋｍ（１＋Ｉ／Ｋｉ）＋［Ｓ］）、Ｈｉｌａ細胞から精製された全長のＭＭＰ２についてはＫｍ＝２．４６±０．３４、ＭＴ１−ＭＭＰの触媒作用ドメインについてはＫｍ＝１６±１）。６Ｃ６の効果的な阻害がまた、全長のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を使用して検出された（データは示されず）。
【図１３】図１３は、変化がほとんどの場合に周辺ループに存在する活性部位の保存された全体的トポロジーを示す種々のＭＭＰの構造的重なりである。ＭＭＰ９（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）−シアン色、ＭＭＰ２（ＰＤＢ：１Ｑ１Ｂ）−マゼンタ色、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＰＤＢ：１ＢＵＶ）−オレンジ色、ＭＭＰ７（ＰＤＢ：１ＭＮＱ）−赤色、ＴＡＣＥ（ＰＤＢ：２Ｉ４７）−黄色。保存されたヒスチジンが棒状体として示され、触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球として示される。注目すべきことに、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の周辺ループの全体的トポロジーは類似している。このことから、試験された酵素群において、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対する６Ｃ６の選択性を説明することができる。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、６Ｃ６が細胞表面ゼラチナーゼ活性を阻害することを示す蛍光顕微鏡写真である。阻害剤の不在下（図１４Ａ）、５μＭのｍＡｂの存在下（図１４Ｂ）、または、１５μＭのＳＢ−３ＣＴ（機構に基づいたナノモル濃度のゼラチナーゼ阻害剤）の存在下（図１４Ｃ）における、ＤＱ−ゼラチンで被覆されたカバースリップに置かれたＨＴ１０８０細胞の（インサイチュザイモグラフィアッセイによって得られる）代表的な蛍光顕微鏡写真。細胞表面ゼラチン分解活性が、ゼラチンを分解することによって放出される蛍光の大きさとしてアッセイされた。非処理の細胞は著しい細胞表面ゼラチナーゼ活性を示し（緑色）、この活性はｍＡｂの存在下で著しく阻害された。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける急性ＤＳＳ大腸炎の様々な症状発現に対する６Ｃ６処置の影響を例示するグラフである。疾患を５日間の２％ＤＳＳによって誘導した。６Ｃ６による処置（５または１．５ｍｇ／ｋｇマウス）を、０日目から開始して毎日のｉ．ｐ．注射によって施した。図１５Ａ：臨床スコアを、ＤＡＩ（これは、０〜４のスケールでの、体重、直腸出血および便の硬さの総合スコアである）を毎日モニターすることによって評価した。データが、６日目から１０日目までのそれぞれの動物について平均のドット分布として表される。図１５Ｂ：結腸の長さ。図１５Ｃ：死亡率。示されるデータは２つの実験の総合結果である（合計で群あたり１５匹のマウス）。＊、大腸炎非処置マウスを上回る有意な効果（ｐ＜０．０５）。
【図１６】図１６は、活性型ＭＭＰ９（黒色）および阻害されたＭＭＰ９−６Ｃ６複合体（赤色）の亜鉛Ｋ端におけるＸ線吸収分光法から得られる結果のグラフである。結果が亜鉛イオンからの動径分布の形態で表される。ＭＭＰ−９触媒作用ドメイン−ｍＡｂ複合体（赤色）の端位置が、活性型ＭＭＰ−９に対して高エネルギー側にシフトする（挿入図）。このことは、触媒作用亜鉛イオンへの結合を示している。Ｘ線分光法データの構造的分析は、６Ｃ６が亜鉛イオンと直接に結合し、五配位の亜鉛−タンパク質複合体を形成することを示している。注目すべきことに、この結合モードは、ＭＭＰの活性部位におけるＴＩＭＰの結合と類似している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、金属タンパク質の活性を阻害するために使用されることができる抗体およびそのフラグメントの発明である。特に、本発明の抗体は、バランスの崩れたマトリックスメタロプロテアーゼ活性に関連する疾患（例えば、多発性硬化症、自己免疫疾患、および転移性ガン）を処置するために使用されることができる。
【００４０】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００４２】
様々なマトリックスメタロプロテアーゼが、細胞増殖、分化、および、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングから、脈管形成および細胞遊走にまで及ぶ多くの生物学的プロセスに関与する。これらのプロセスでは、これらのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の様々な機能と、それらの生来的組織阻害剤（ＴＩＭＰ）との間における精巧なバランスが要求される。このバランスの喪失が、転移性腫瘍、神経変性疾患および変形性関節炎をはじめとする数多くの病理学的状態の顕著な特徴である。
【００４３】
数多くのＭＭＰ阻害剤がこの技術分野では知られており、これらには、小ペプチド阻害剤（例えば、ヒドロキサマート）、非微生物性テトラサイクリン類およびモノクローナル抗体が含まれる。前者は、製造費用が高いこと、分解性が高いこと、経口での生物学的利用能が低いこと、および、特異性がないことによって制限される一方で、後者はどれも、インビボでの治療効力が明らかにされていない。
【００４４】
本発明者らは、金属酵素の触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基の両方を認識する抗体がその強力な阻害剤として使用できることを以前に発見している。金属酵素の金属結合した触媒作用部位を模倣するハプテンを免疫原として使用することにより、高まった金属タンパク質の活性によって特徴づけられる臨床状態を処置するために使用することができる非常に効率的な治療用抗体を作製することができた（本発明者らのＷＯ２００４／０８７０４２を参照のこと）。
【００４５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＭＭＰにおける反応性亜鉛部位の局所的構造および立体配座をよく模倣する新規なハプテン化合物を設計した。この化合物は、Ｉｍｉｓｄｐと名づけられた［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタン（図１を参照のこと）であり、配位した３つのヒスチジンのアレイおよび水での亜鉛イオンによって誘導される四配位の幾何構造および類似する力場を模倣することができる。四面体に近い立体配座が、３つのイミダゾール塩基と、第４の配位子としての水分子とによって形成される。図２Ａは、亜鉛配位子の四面体型幾何構造を表すために改変されている、ＭＭＰ−９（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）の触媒作用部位とのＩｍｉｓｄｐ化合物の構築された３Ｄモデルの重なりを示す。改変には、Ｘ線構造において存在する配位子（ヒドロキサム酸系阻害剤）を水分子で置換すること、および、酵素全体を多層ＱＭ／ＭＮ法によって局所的極小にまで最適化することが含まれる（材料および方法を参照のこと）。高い類似性が、ＭＭＰ−９およびＩｍｉｓｄｐにおける計算されたヒスチジン亜鉛モチーフの間において、亜鉛イオンからのヒスチジンのε−窒素の距離（それぞれ、２．０４±０．０６および２．０２）に関して、また、金属に向かう３つのヒスチジンの相対的配向に関して存在する。
【００４６】
本明細書中以下において、および、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、マウスをＩｍｉｓｄｐで免疫化し、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９との交差反応性を有するＭＭＰ抗体についてスクリーニングしている。その抗体は６Ｃ６と名づけられた（図１０、および、下記の実施例の節の実施例１〜実施例２を参照のこと）。６Ｃ６は、ＭＭＰ−２／９と結合し、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２の活性を競合的に阻害すること（Ｋｉの範囲、１μＭ〜５μＭ）、および、ＭＴ１−ＭＭＰの活性を競合的に阻害すること（１５μＭのＫｉ）が見出された（下記の表４を参照のこと）。ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の結合および阻害が様々な生化学的および生物物理学的ツールによってインビトロおよびインサイチュにおいて明らかにされた（実施例４〜７および９を参照のこと）。重要なことに、６Ｃ６はＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の活性化形態とだけ結合する（実施例３および実施例８を参照のこと）。この酵素形態は、その酵素部分内に存在する触媒作用の亜鉛錯体を遮蔽するプロドメインを欠いている。本発明者らは、本発明の方法に従って作製された抗体がＭＭＰ−９にインビボにおいて結合できることを示した（図１１Ａ）。さらに、本発明者らは、本発明の抗体が、炎症性腸疾患を処置するための治療的可能性を含んだことを示した（実施例１０）。
【００４７】
まとめると、本発明の知見は、Ｉｍｉｓｄｐが、金属タンパク質の阻害剤を製造するための重要な試薬（プラットフォーム）として使用されること、また、６Ｃ６、ならびに、誘導されたペプチドおよびペプチド模倣体が有益な治療用ツールとして使用されることを裏付けている。
【００４８】
これらの結果により、これらの抗体を、個々のＭＭＰについての選択的なペプチド阻害剤をｍＡｂまたはそのフラグメントのファージディスプレイおよび点変異によって設計するためのプラットフォームとして使用することにおける可能性が明らかにされる。
【００４９】
従って、本発明の１つの態様によれば、一般式（Ｉ）を有する化合物が提供される：
式中、
ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；
Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；
Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；および
Ｒは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、
ただし：
ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；および
Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される。
【００５０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、化合物は、Ｉｍｉｓｄｐと名づけられた［２−（２−アミノエチルカルボモイル）−エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタンであり、一般式（ＩＩ）を有する：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【００５１】
Ｉｍｉｓｄｐの合成が下記の実施例の節の実施例７に記載される。
【００５２】
Ｉｍｉｓｄｐは、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２における反応性亜鉛部位の局所的構造および過渡的立体配座を模倣するので、金属タンパク質阻害剤を製造するために使用することができる。
【００５３】
従って、本発明の１つの態様によれば、金属タンパク質阻害剤を製造する方法が提供される。
【００５４】
本発明の方法は、上記化合物（すなわち、Ｉｍｉｓｄｐ）に向けられた抗体または抗体フラグメントを作製することによって行われる。下記の実施例の節の実施例１〜２ならびに「材料および方法」の節を参照のこと。
【００５５】
本発明の「金属タンパク質」は、金属結合部位が酵素の触媒作用ドメインの一部を形成し、ただし、この金属結合部位がＩｍｉｓｄｐの金属結合部位と電子的および構造的の両方で類似する、金属が結合したタンパク質を示す。
【００５６】
本発明のこの態様の金属タンパク質は好ましくは、メタロプロテアーゼ、すなわち、ＭＭＰ（例えば、ゼラチナーゼ、例えば、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）である。
【００５７】
ＭＭＰファミリーのすべてのメンバーは、活性化されたとき、活性部位における金属イオンが基質結合のために利用可能である活性型酵素に変換される潜在型酵素として翻訳されることが理解される。例えば、「システインスイッチモデル」が、ＭＭＰのインビトロ活性化を説明するために以前に提案されている。このシステインスイッチモデルでは、活性化されたとき、隠れている亜鉛結合部位が、チオール（Ｃｙｓ）保有プロペプチドの亜鉛原子からの解離によって触媒作用の亜鉛結合部位に変換されることが提案される。プロペプチドの切断は酵素のプロドメイン構造の分解をもたらし、触媒作用亜鉛イオンの遮蔽がなくなる。結果として、金属イオンおよび活性部位ポケットが基質の結合および加水分解のために利用可能となる［Ｖａｎ ＷａｒｔおよびＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、５５７８〜５５８２］。
【００５８】
本発明の教示に従って作製される抗体および抗体フラグメントは、触媒作用亜鉛部位内の金属イオンおよび配位しているアミノ酸の両方と結合することができ、それにより、上記のような病理学的プロセスに直接に関与するこれらの酵素の活性型立体配座を特異的に阻害することができるために、ＭＭＰの強力な阻害剤として役立つ。
【００５９】
本明細書で使用される用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味し、表現「抗体フラグメント」はその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを意味する。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（ｉｉ）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（ｉｉｉ）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（ｉｖ）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（ｖ）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；そして（ｖｉ）ペプチドは単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする。
【００６０】
抗体（即ちモノクローナルおよびポリクローナル抗体）を作製する方法は当該技術分野では周知である。抗体は当該技術分野で知られたいくつかの方法のいずれか一つを介して作製されることができ、これらの方法（Ｏｒｌａｎｄｉ Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９）に開示されるように抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリーまたは極めて特異的に結合する試薬のパネルのスクリーニングを用いることができるかまたは培養中の連続細胞系によるモノクローナル抗体分子の生成を用いることができる。これらはハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ−Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，Ｋｏｚｂｏｒ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２，Ｃｏｔｅ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０，Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）を含むがこれらに限定されない。
【００６１】
本発明の化合物が小さすぎて、強い免疫原応答を誘発することができない場合、そのような抗原（ハプテン）は、抗原的に中性な担体（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミン［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］などの担体）にカップリングすることができる（米国特許第５１８９１７８号および同第５２３９０７８号、ならびに、実施例の節の実施例２を参照のこと）。担体へのカップリングを、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングを行うことができ、必要に応じて、その後、形成されたイミノ連結の還元を行うことができる。代替では、担体を、縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤）を使用してカップリングすることができる。リンカー化合物もまた、そのようなカップリングを行うために使用することができる；ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの両方が、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手可能である。得られる免疫原性複合体を、その後、好適な哺乳動物被験体（例えば、マウス、ウサギなど）に注射することができる。好適なプロトコルでは、血清における抗体の産生を増強させるスケジュールに従ったアジュバントの存在下における免疫原の繰り返される注射が伴う。免疫血清の力価を、この技術分野では広く知られている様々な免疫アッセイ手法を使用して容易に測定することができる。
【００６２】
得られた抗血清はそのまま使用することができ、または、モノクローナル抗体を、本明細書において上記されるように得ることができる。
【００６３】
抗体フラグメントを、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して得ることができる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８を参照のこと。これは参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、本発明による抗体フラグメントを抗体のタンパク質分解的加水分解によって調製することができ、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。
【００６４】
あるいは、抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５６も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
【００６５】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
【００６６】
ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【００６７】
ヒトの治療または診断のためにはヒト化された抗体を用いることが好ましいことは理解されるであろう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【００６８】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【００６９】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【００７０】
いったん抗体が得られると、それらは、金属タンパク質阻害活性について試験されることができる。金属タンパク質阻害活性についての適切なアッセイ条件は、Ｋｎｉｇｈｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９６（３）：２６３−２６６（１９９２）、Ｃａｗｓｔｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９９：３４０−３４５（１９７９）、Ｃａｗｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８０：７７１（以下参照）（１９８１）；Ｃａｗｓｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９５：１５９−１６５（１９８１）、Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３９：１１８４−１１８７（１９８４）、ならびに米国特許第４７４３５８７号および同第５２４０９５８号に記載される。
【００７１】
述べられたように、上記の方法論を使用して、本発明者らは、６Ｃ６と名づけられた、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９についてのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害性抗体を作製することができた。その配列が配列番号１において提供される。ＣＤＲ配列が、配列番号７、８、９、１０、１１および１２において提供される。
【００７２】
従って、本発明は、その金属タンパク質阻害活性（金属タンパク質の触媒活性の特異的な阻害）が保持される限り、上記ＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む任意の（ポリ）ペプチド配列、ならびに、そのホモログおよびフラグメントを提供する。そのようなポリペプチドの一例が抗体である（上記参照）。
【００７３】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【００７４】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００７５】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００７６】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、Ｔｉｃ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、フェニルイソセリン、トレオニノール、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００７７】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００７８】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００７９】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば、合成アミノ酸、表２）が示される。
【００８０】
【００８１】
目的のメタロプロテアーゼに対する改良された親和性または高められた生物学的活性を有するペプチドは、ファージディスプレイおよびコンピュータを利用した生命工学を含む当該分野において周知の方法によって作製されることができる。
【００８２】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成されることができる。固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に、および、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９７３）「Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出されうる。古典的な溶液合成の概括については、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｇ．およびＬｕｐｋｅ，Ｋ．（１９６５）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００８３】
上記ポリペプチド配列をコードする核酸配列もまた意図される（配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８を参照のこと）。
【００８４】
本明細書において上記のように、本発明の抗体のための１つの具体的な使用は、金属タンパク質（例えば、メタロプロテアーゼ）のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患の防止または処置である。
【００８５】
そのような疾患の例には、関節炎疾患、例えば、変形性関節炎（ＯＡ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、化膿性関節炎、軟部組織リウマチ、多発性軟骨炎および腱炎；転移性腫瘍、歯周疾患；角膜潰瘍、例えば、アルカリ熱傷または他の熱傷によって誘導される角膜潰瘍、放射線によって誘導される角膜潰瘍、ビタミンＥ欠乏症またはレチノイド欠乏症によって誘導される角膜潰瘍；腎糸球体疾患、例えば、タンパク尿、栄養障害性表皮水疱症；骨再吸収疾患、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症およびコレステリン腫；排卵または着床を防止することによる産児制限；腫瘍成長に関連するか、または、糖尿病網膜症もしくは黄斑変性に伴う血管新生に関連する血管形成；アテローム性動脈硬化プラークの破裂に伴う冠状動脈血栓症；肺気腫、創傷治癒およびＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
実施例１０において例示されるように、本発明者らは、本発明の抗体が、過敏性腸疾患を処置するために使用され得ることを示している。
【００８７】
過敏性腸疾患（ＩＢＤ）は、頻度が増大し、患者を無能力化することがある腸の炎症および組織リモデリングによって特徴づけられる重篤な胃腸障害である。ＩＢＤの主要の形態、すなわち、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病は、腹部の痛み、下痢、直腸出血および発熱によって臨床的に特徴づけられる慢性の再発する状態である。
【００８８】
従って、本発明の別の態様によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ活性をその必要性のある対象において阻害する方法が提供される。
【００８９】
本発明による好ましい個体対象は、動物、例えば、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類）であり、好ましくはヒトである。
【００９０】
本発明の方法は、対象に本発明のＭＭＰ阻害剤（すなわち、本明細書において上記される抗体または抗体フラグメント）の治療有効量を与えることを含む。
【００９１】
本明細書において以下でさらに詳述されるように、ＭＭＰ阻害剤を直接的な投与（例えば、経口投与または注射）によって与えることができ、または、ＭＭＰ阻害剤を、個体の標的細胞に投与されるポリヌクレオチド構築物から発現させることができる。
【００９２】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、それ自体で、または、医薬的に許容され得る担体と混合される医薬組成物の一部として個体に与えることができる。
【００９３】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００９４】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができる抗体調製物を示す。
【００９５】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。医薬的に許容され得る担体に含まれる成分の１つは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができ、これは有機媒体および水性媒体の両方における広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーである（Ｍｕｔｔｅｒ他（１９７９））。
【００９６】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９７】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９８】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【００９９】
あるいは、例えば、患者の身体の組織領域に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与することができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１０１】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１０２】
注射の場合、本発明の医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１０３】
経口投与の場合、化合物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、本発明の化合物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１０４】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０１０５】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１０６】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１０７】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１０８】
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１０９】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１１０】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１１１】
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１１２】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０１１３】
治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１４】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１１５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
【０１１６】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１１７】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１１８】
適合可能な医薬的担体中に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、調製され、適切な容器に入れられ、示される状態の処置についてラベル書きされることができる。
【０１１９】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。
【０１２０】
本明細書において上記のように、本発明の抗体阻害剤を核酸構築物から発現させることができる。
【０１２１】
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは好ましくは、目的とする細胞内局在化または細胞外局在化への抗体の分泌または輸送を可能にするシグナルペプチドをさらにコードすることが理解される。例えば、標的の金属タンパク質がＭＭＰであるとき、分泌シグナルペプチドが好ましくは、抗体セグメントをコードするポリヌクレオチドに対して読み枠を合わせてコンジュゲートされる。
【０１２２】
完全な抗体分子と比較した場合、そのそれほど複雑でない構造のために、組換え単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメントが好ましくは発現され得ることがさらに理解される。本明細書において上記のように、ＳｃＦｖは、ＶＬのカルボキシル末端がＶＨのアミノ末端にペプチド架橋によって連結される１つの鎖として合成されるＶＬおよびＶＨの抗体ポリペプチド鎖からなるタンパク質である。これらのペプチドを組換え製造するための様々な方法がこの技術分野では広く知られている［Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；およびｄｅ Ｋｒｕｉｆ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７〜１０５（１９９５）を参照のこと］。本発明のこの態様の実施形態によれば、本発明の化合物による免疫化の後、脾臓のｍＲＮＡが免疫化動物から集められ、ＳｃＦｖフラグメントを呈示するバクテリオファージにおけるｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される。その後、ファージ粒子が、目的の金属タンパク質の活性化形態と特異的かつ好ましくは相互作用するファージ粒子を明らかにするためにスクリーニングされる。ＳｃＦｖセグメントがこれらのファージ粒子から回収され、発現構築物にクローン化される（米国特許第５８００８１４号を参照のこと）。
【０１２３】
本発明のこの態様の核酸構築物は個体対象の標的細胞に投与することができる（すなわち、インビボ遺伝子治療）。
【０１２４】
代替として、核酸構築物は、必要に応じて適切な遺伝子送達ビヒクル／遺伝子送達方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、個体に戻される（すなわち、エキソビボ遺伝子治療）。
【０１２５】
本発明の抗体または抗体フラグメントの細胞発現を可能にするために、本発明の核酸構築物はさらに、少なくとも１つのシス作用する調節エレメントを含む。本明細書で使用される表現「シス作用する調節エレメント」は、トランス作用する調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列（好ましくは、プロモータ）を示す。
【０１２６】
利用可能なプロモータはどれも、本発明の方法論によって使用することができる。本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物によって利用されるプロモータは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞タイプ特異的および／または組織特異的なプロモータの例には、肝臓特異的であるアルブミン［Ｐｉｎｋｅｒｔ他（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７］、リンパ系特異的プロモータ［Ｃａｌａｍｅ他（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５］、具体的には、Ｔ細胞受容体のプロモータ［Ｗｉｎｏｔｏ他（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９〜７３３］および免疫グロブリンのプロモータ［Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３７２９〜７４０］、ニューロン特異的プロモータ（例えば、神経フィラメントプロモータ［Ｂｙｒｎｅ他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３〜５４７７］）、膵臓特異的プロモータ［Ｅｄｌｕｎｃｈ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６］または乳腺特異的プロモータ（例えば、乳清プロモータ（米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願公開第２６４１６６号））などのプロモータが含まれる。本発明の核酸構築物はさらにエンハンサを含むことができ、エンハンサは、プロモータ配列に隣接して、または、プロモータ配列から遠位に存在することができ、プロモータからの転写をアップレギュレーションすることにおいて機能することができる。
【０１２７】
本発明の方法論の構築物は好ましくは、適切な選択マーカーおよび／または複製起点をさらに含む。好ましくは、利用される構築物はシャトルベクターであり、シャトルベクターは、大腸菌においてともに増殖することができ（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）、また、細胞における増殖、または、選ばれた遺伝子および組織における組み込みのための適合性を有する。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が可能である。
【０１２８】
現時点で好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物によるトランスフェクション、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩ型ウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）によるトランスフェクション、および、脂質に基づくシステムによるトランスフェクションが含まれる。遺伝子の脂質媒介移入のための有用な脂質が、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好まれる構築物がウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物）は、少なくとも１つの転写プロモータ／エンハンサまたは位置規定エレメント、あるいは、他の手段（例えば、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾）によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在する場合を除いて、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されるウイルスに対して適切である正鎖プライマー結合部位および負鎖プライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は典型的には、ペプチドまたは抗体を、構築物が置かれている宿主細胞から分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列である。必要な場合には、構築物はまた、ポリアデニル化を行わせるシグナル、同様にまた、１つまたは複数の制限部位および翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部を含む。非ウイルス性である他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマー）。
【０１２９】
遺伝子治療プロトコルを実行するための好ましい方法が、ＳｏｍｉａおよびＶｅｒｍａ［（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１：９１〜９９］、Ｉｓｎｅｒ（２００２）、Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ、４１５：２３４〜２３９；Ｈｉｇｈ（２００１）Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：２００１年展望、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ７：２３〜２７；ＨａｍｍｏｎｄおよびＭｃＫｉｒｎａｎ（２００１）Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．４９：５６１〜５６７において提供される。
【０１３０】
本発明の抗体は金属タンパク質の活性化形態を示差的に認識することができるので（実施例の節の実施例３を参照のこと）、本発明の抗体は、例えば、ＭＭＰ活性を生物学的サンプル［すなわち、任意の身体サンプル、例えば、血液（血清または血漿）、喀痰、腹水、胸膜滲出液、尿、生検試料、単離された細胞および／または細胞膜調製物］においてモニターすることなどによって強力な診断ツールおよび予後ツールとして使用することができる。このことは、ＭＭＰのバランスの崩れた活性化が腫瘍の侵入を促進させるガン細胞の転移特徴を評価するとき、特に重要である。同様に、本発明の抗体は、ＭＭＰ阻害剤の治療的投薬をモニターする際に使用することができる。そのような適用のために、本発明の抗体は好ましくは、この技術分野における標準的使用である何らかの、放射性、蛍光性、生物学的または酵素的なタグまたは標識のそれぞれにより標識される。そのような標識の使用に関する米国特許には、米国特許第３８１７８３７号、同第３８５０７５２号、同第３９３９３５０号、同第３９９６３４５号、同第４２７７４３７号、同第４２７５１４９号および同第４３６６２４１号が含まれる。
【０１３１】
そのような検出方法はまた、新規なＭＭＰのハイスループットスクリーニングのために使用できることが理解される。簡単に記載すると、多数の生物学的サンプルを本発明の抗体と接触させることができ、この場合、活性化されたＭＭＰが本発明の抗体に結合することができる。様々な対策が、活性化されたＭＭＰ（例えば、腫瘍細胞株に由来する活性化されたＭＭＰ）を含む生物学的サンプルを使用するために取られる。典型的には、放射性標識が、アッセイ体積を少なくするために使用される。
【０１３２】
代替では、本発明の抗体は、活性な金属酵素を生物学的サンプルから精製するために使用することができる。
【０１３３】
数多くのタンパク質精製方法がこの技術分野では知られている。例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントは、金属酵素を単離するためにアフィニティクロマトグラフィにおいて使用することができる。様々なカラムを調製することができる。この場合、抗体が固体の基体（例えば、粒子、例えば、アガロースおよびＳｅｐｈａｄｅｘ）に連結され、生物学的サンプル（例えば、細胞溶解物）をカラムに通すことができ、カラムを洗浄した後、穏和な変性剤の濃度を増大させ、それにより、精製された金属酵素が放出される。
【０１３４】
本発明の教示に従って作製された抗体またはそのフラグメントは診断キットまたは治療キットに含めることができる。抗体または抗体フラグメントは、適切な緩衝液および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰めることができ、診断のために、または、治療的処置を導くために使用することができる。
【０１３５】
従って、抗体またはそのフラグメントは、それぞれを１つの容器において混合することができ、または、個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は様々な材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）から形成され得る。
【０１３６】
加えて、他の添加剤（例えば、安定剤、緩衝剤およびブロッキング剤など）を加えることもできる。そのようなキットの抗体はまた、固体の支持体（例えば、ビーズおよびアレイ基体（例えば、チップ）など）に結合させることができ、診断目的のために使用することができる。キットはまた、試験された対象が、目的とするＭＭＰの発現に関連する状態、障害または疾患に罹患しているか、あるいは、目的とするＭＭＰの発現に関連する状態、障害または疾患を発症する危険性があるかを明らかにするための説明書を含むこともできる。
【０１３７】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１３８】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なお、これら実施例によって本発明は限定されない。
【０１３９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が広く含まれている。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，バルチモア，メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用されるものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４０】
材料および方法
組換え酵素。ＭＭＰ−２の触媒作用ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３２６３６．１のアミノ酸１１０〜４６７）をＢＬ−２１細胞においてＴ７プロモータのもとで発現させた。細胞を１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより５時間誘導した。細胞ペレットを、緩衝液対初発培養体積の１：２５の比率で、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロールおよび１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００に再懸濁した。懸濁物を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロールおよび０．２％のＳａｒｋｏｓｙｌに溶解し、その後、氷上で３０分間インキュベーションした。上清画分を、事前に平衡化された５ｍｌのゼラチン−セファロースカラム（事前に充填されたもの、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、透析緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０２％ Ｂｒｉｊ）により洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２、０．０２％のＢｒｉｊおよび１５％のＭｅ２ＳＯにより溶出し［Ｒｏｓｅｎ，Ｏ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＭＰｓ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２００１］、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してアッセイし、その触媒活性を蛍光発生ペプチドの分解によって測定した［Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．Ｇ．、Ｆ．ＷｉｌｌｅｎｂｒｏｃｋおよびＧ．Ｍｕｒｐｈｙ、Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｓｓａｙｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９２、２９６（３）：ｐ．２６３〜６］。
【０１４１】
Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９［これはヒンジ領域およびヘモペキシンドメインを欠く。Ａｌａ１〜Ｇｌｙ４２４｜Ｐ１４７８０｜ＭＭＰ９＿ＨＵＭＡＮマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体（ＭＭＰ−９）（ＥＣ３．４．２４．３５）］を、以前に記載されたようにｐＴＷＩＮ発現ベクターで大腸菌ＥＲ２５６６において発現させ、封入体から均一に精製した［Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｍ．、Ｐ．ＨｅｉｋｋｉｌａおよびＥ．Ｋｏｖｉｖｕｎｅｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｂｌｏｃｋｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（２８）：ｐ．２９５８９〜９７］。Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９を、２００ｍＭのＴｒｉｓに溶解された１ｍＭの酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、米国）により３０分間、３７℃で活性化した。
【０１４２】
ヒトの組換えｐｒｏ−ＭＭＰ−２および組換えｐｒｏ−ＭＭＰ−９を、以前に記載されたように、対応する組換えワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ Ｓ３細胞において発現させ、均一に精製した［Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｗ．、Ｇｅｒｖａｓｉ，Ｄ．Ｃ．、Ｍｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．およびＦｒｉｄｍａｎ，Ｒ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２９９７５〜２９９８３；Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｒ．、Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．、Ｈｏｙｈｔｙａ，Ｍ．、Ｏｅｌｋｕｃｔ，Ｔ．Ｍ．、Ｋｒａｕｓ，Ｓ．、Ｋｏｍａｒｅｋ，Ｄ．、Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．、Ｂｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＳｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１５３９８〜１５４０５］。
【０１４３】
テトラ−カルボキシフェニルポルフィリンＣｏ（ＩＩ）／Ｚｎ（ＩＩ）（ＣｏＴＣＰＰ／ＺｎＴＣＰＰ）。ＺｎＴＣＰＰを、記載のように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、ＺｎＣｌ２とＴＣＰＰとの反応によって合成した［Ｈａｒａｄａ，Ａ．他、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ ｂｙ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、１９９９、７０（３）：ｐ．２９８〜３０２］。ＣｏＴＣＰＰを、記載のように、ＤＭＦ中、Ｃｏ（ＯＡｃ）２・４Ｈ２ＯとＴＣＰＰとの反応によって合成し［Ｈａｒａｄａ，Ａ．他、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ ｂｙ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、１９９９、７０（３）：ｐ．２９８〜３０２］、精製した。
【０１４４】
Ｉｍｉｓｄｐの合成。以下の実施例７に記載される。
【０１４５】
タンパク質へのハプテンのコンジュゲート化。ハプテン（４ｍｇ）を、ＤＭＦ中１，１’−カルボニルジイミダゾールを（１：１のモル比で）加え、１時間インキュベーションすることによってコンジュゲート化のために活性化した。１〜５０μモルの活性化ハプテンを０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ８）中２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に加えた。溶液を室温で３時間撹拌し、その後、ＰＢＳに対して徹底的に透析した。
【０１４６】
免疫化および融合。アジュバント（ＫＬＨ）コンジュゲート化ＣｏＴＣＰＰ、アジュバント（ＫＬＨ）コンジュゲート化ＺｎＴＣＰＰまたはアジュバント（ＫＬＨ）コンジュゲート化Ｉｍｉｓｄｐのそれぞれを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。免疫化およびＮＳＯミエローマ細胞株へのその後の融合を標準的なプロトコルに従って行った［Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．１、１９９８］。
【０１４７】
抗体スクリーニング
ＥＬＩＳＡ。成長中のハイブリドーマの上清を、それぞれのハプテン−ＢＳＡ（ＰＢＳにおいて３μｇ／ｍｌ）がＮｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに被覆された直接的ＥＬＩＳＡを使用して、ＺｎＴＣＰＰ、ＣｏＴＣＰＰまたはＩｍｉｓｄｐとの反応性を有する抗体についてスクリーニングした。被覆を４℃で一晩行い、抗体とのインキュベーションを２０℃で１時間行った。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用し、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸、ＡＢＴＳ、Ｓｉｇｍａ）を基質として使用した。０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を洗浄試薬として使用した。希釈緩衝液はＰＢＳであった。Ａ６０２を、ＳＰＥＣＴＲＡＦｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ分光計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）におけるマイクロプレートリーダーによって記録した。コントロールとして、上清を同じ様式でＢＳＡ被覆プレートとインキュベーションした。０．５ミリ光学濃度を超える吸光度値を陽性と見なした。
【０１４８】
競合的ＥＬＩＳＡ。異なる希釈度のハイブリドーマ上清を、以前に記載された工程に従ってハプテン−ＢＳＡ被覆プレートとインキュベーションした。力価測定曲線をプロットし、力価希釈度を５０％の結合において求めた。力価濃度に希釈された上清を、以前に記載された工程に従って、可溶性のＺｎＴＣＰＰ化合物、ＣｏＴＣＰＰ化合物またはＩｍｉｓｄｐ化合物と３０分間プレインキュベーションし、その後、ハプテン被覆マイクロタイタープレートに移した。推定された解離定数は、５０％の結合を達成するために要求される可溶性ハプテンの濃度であった。
【０１４９】
産生および精製。選択されたハイブリドーマを限界希釈によって２回サブクローン化し、その後、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）により抗原刺激された腹水腫瘍が注入されたＢＡＬＢ／ｃマウスによる大規模産生を行った。ｍＡｂを、プロテインＧセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのアフィニティクロマトグラフィによって精製した。腹水を１２０００ｇで１５分間遠心分離して、不溶物粒子および脂質を除いた。１ｍＬの腹水をＰＢＳにより５倍の体積に希釈し、その後、５ｍＬのカラム体積のプロテインＧセファロースに負荷した。溶出ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１５０】
アイソタイプ決定。培養フラスコにおいて成長させたクローン化ハイブリドーマから得られた培養上清をｍＡｂの供給源として使用した。それぞれの抗体を、Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ＨｙＣｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂ．ｖ．、オランダ）によってアイソタイプ決定した。
【０１５１】
精製された抗体の免疫ブロット分析。精製された抗体を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＮＣ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、続いて、抗ＭＭＰ９抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用する免疫ブロット分析に供した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用した。シグナルを、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。
【０１５２】
精製されたタンパク質を使用する結合アッセイ。ｍＡｂ（１０μｇ）を抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とＰＢＳにおいて４℃で一晩インキュベーションした。非結合抗体を洗浄した後、精製されたＰｒｏ−ＭＭＰ−２、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２触媒作用ドメイン、ＭＴ１触媒作用ドメインまたはＴＡＣＥ（２μｇ）を加え、その後、ＲＴでの２時間のインキュベーションを行った。ビーズを遠心分離によって集め、ＰＢＳにより３回洗浄した。ビーズに結合したままであるタンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液により溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、クーマシーブルーによる染色によって検出した。
【０１５３】
免疫沈殿およびウエスタンブロット。ＨＴ１０８０細胞をペトリディッシュに播種した。８０％のコンフルエンスに達した後、培地（１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムおよびＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭ）を（ＦＣＳを含まない）無血清培地に変えた。さらに２４時間のインキュベーションの後、馴化培地（ＣＭ）を接着性細胞から集め、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して濃縮した。濃縮された上清を免疫沈殿のために使用した。ＣＭを抗−１（ＣｏＴＣＰＰ）ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）と４℃で一晩インキュベーションした。プロテインＡセファロース（ＣＬ−４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ）をサンプルに加え、ＲＴで２時間混合した。ビーズをＰＢＳにより３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液に懸濁し、９５℃に３分間加熱した。免疫沈殿物を遠心分離によって回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥに供した。分離後、タンパク質をニトロセルロース（ＮＣ）膜に転写し、抗ＭＭＰ−２抗体によりプローブ探査した。
【０１５４】
ＨＴ１０８０細胞によって産生されたＰｒｏＭＭＰ−２を活性化するために、１ｍＭの酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を濃縮ＣＭに加え、その後、３７℃での６時間のインキュベーションを行った。活性化の後、ＣＭを４℃でＰＢＳに対して（３回）透析して、ＡＰＭＡを除いた。活性化された培地による免疫沈殿を上記のように行った。
【０１５５】
直接的ＥＬＩＳＡを使用する活性型ＭＭＰ−９への結合。ＭＭＰ−９の触媒作用ドメイン（２μｇ／ｍｌ）をマイクロタイターのウエルにおいて固定化した。ｍＡｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡスクリーニングについて記載されたのと同じ手順に従ってウエルに加えた。抗ＭＭＰ−９抗体（Ｓｉｇｍａ）が陽性コントロールとして役立ち、腹水からアフィニティ精製された関係のないマウスＩｇＧが陰性コントロールとして役立った。
【０１５６】
速度論的アッセイ。ＭＭＰの酵素活性を以前に記載されるように測定した［Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他、Ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅｉｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６４６〜５４］。ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２およびＭＴ１−ＭＭＰの活性を、Ｋｎｉｇｈｔ他［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９２、２９６（３）：ｐ．２６３〜６］によって記載されるように、蛍光発生ペプチド（Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧから購入）の分解をλｅｘ＝３４０ｎｍおよびλｅｍ＝３９０ｎｍでモニターすることによって測定した。標準的なアッセイ混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０μＭ ＺｎＣｌ２および０．０５％Ｂｒｉｊを含有した。ＴＡＣＥの酵素活性を、蛍光発生ペプチドＱＦ−４５（Ｍｃａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ジニトロフェニル）−ＮＨ２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧから購入）の分解をモニターすることによって測定した。
【０１５７】
インサイチュザイモグラフィ。ＭＭＰの正味のゼラチン分解活性の所在をインサイチュザイモグラフィによって突き止めるために、分子内で消光されるフルオレセインイソチオシアネート標識のＤＱゼラチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）をゼラチナーゼによる分解のための基質として使用した。ゼラチナーゼによるタンパク質分解により、切断されたフルオレセインイソチオシアネート−ゼラチンペプチドが生じ、この蛍光の所在を突き止めることにより、正味のゼラチン分解活性の部位が示される。簡単に記載すると、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞（これは、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＴ１−ＭＭＰを産生する）を１２ｍｍのカバースリップに置床した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を１ｕＭの１３Ｅ１１ ｍＡｂにより３７℃で３０分間処理した。非処理の細胞がこの実験のための陰性コントロールとして役立った。細胞をＰＢＳにより洗浄し、その後、６０ｕｇ／ｍのＤＱゼラチンを含有するザイモグラフィ用反応緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２および０．２ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．６；高濃度のアジ化物は、ゼラチンが食作用されることを防止し、従って、細胞表面ゼラチン分解活性が生じることを可能にした）と３７℃で一晩インキュベーションした。ザイモグラフィ用反応緩衝液は、処理された細胞については１ｕＭのＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂを含有した。インキュベーション期間が終了したとき、固定処理またはさらなる洗浄を行うことなく、ＭＭＰのゼラチン分解活性の所在を突き止め、蛍光顕微鏡観察によって写真撮影し、画像をＳｐｏｔデジタルカメラによって取得した。
【０１５８】
実施例１
小さい有機金属化合物による亜鉛活性部位の立体配座模倣
ＭＭＰの活性部位における亜鉛イオンには、３つの保存されたヒスチジン残基が均一に配位する。チモーゲンの活性化および基質のタンパク質分解の間、亜鉛の配位が、触媒作用を有しない段階における四配位の四面体幾何構造から、触媒作用を有する段階における五配位の三角両錘型［Ａｕｌｄ，Ｄ．Ｓ．、Ｚｉｎｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ．Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ、２００１．１４（３−４）；ｐ．２７１〜３１３］に変化する。従って、保存されたヒスチジンは亜鉛イオンに関して様々な異なる幾何構造を取ることができる。これらの立体配座の見本を作製するために、２つの化合物を、亜鉛の環境を模倣するためのモデルとして選択した（ＩｍｉｓｄｐおよびＣｏ／ＺｎＴＣＰＰ、図１）。Ｉｍｉｓｄｐ化合物（合成が以下の実施例７に示される）は四配位の幾何構造を模倣することができる。この場合、四面体に近い立体配座が、３つのイミダゾール塩基と、第４の配位子としての水分子とによって形成される。
【０１５９】
図２Ａは、亜鉛配位子の四面体型幾何構造を表すために改変されている、ＭＭＰ−９（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）の触媒作用部位［Ｒｏｗｓｅｌｌ，Ｓ．他、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＭＰ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００２．３１９（１）：ｐ．１７３〜８１］とのＩｍｉｓｄｐ分子の構築された３Ｄモデルの重なりを示す。改変には、Ｘ線構造において存在する配位子（ヒドロキサム酸系阻害剤）を水分子で置換すること、および、酵素全体を多層ＱＭ／ＭＮ法によって局所的極小にまで最適化することが含まれる（材料および方法を参照のこと）。高い類似性が、ＭＭＰ−９およびＩｍｉｓｄｐにおける計算されたヒスチジン亜鉛モチーフの間において、亜鉛イオンからのヒスチジンのε−窒素の距離（それぞれ、２．０４±０．０６および２．０２）に関して、また、金属に向かう３つのヒスチジンの相対的配向に関して存在する。第２の分子、すなわち、Ｚｎ／ＣｏＴＣＰＰは、亜鉛またはその類似金属のコバルトと配位している４つのイミダゾール塩基が金属イオンに関して同一平面の立体配座にある［Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｅ．Ｄ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ．１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ（ｍｅｓｏ−Ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏ）ｃｏｂａｌｔ （ＩＩ）．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ＳＯＣ、１９８１、１０３（１７）：ｐ．５０８７〜５０９５］。この立体配置は、金属が、錐体の底面を形成する２つのヒスチジンとほとんど同一平面である五配位の三角両錘型幾何構造における３つのヒスチジンのうちの２つの立体配座を模倣する。図２Ｂは、亜鉛に５つの配位子（２つのさらなる配位子がヒドロキサム酸系阻害剤によって与えられる）が配位するＭＭＰ−９の結晶構造（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）を示す。錐体の底面における２つのヒスチジンの配向、および、亜鉛イオンからのそれらの距離（ＭＭＰ−９、ＺｎＴＣＰＰおよびＣｏＴＣＰについてそれぞれ、２．２±０．０２、２．０３±０．０４および１．９５）が、Ｃｏ／ＺｎＴＣＰＰ分子と匹敵する。
【０１６０】
実施例２
モノクローナル抗体の作製および選抜
ＣｏＴＣＰＰ、ＺｎＴＣＰＰおよびＩｍｉｓｄｐ（図１）に対するモノクローナル抗体を、マウスの免疫化、および、それぞれの化合物を被覆抗原とするＥＬＩＳＡスクリーニングによる特異的な抗体の選抜によって作製した。３つの抗体を広範囲にわたる研究のために選択した。注目すべきことに、これらのクローンは、競合的ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいて、最も良い親和性をそれらの免疫化用ハプテンに対してそれぞれ示したために選ばれた。それらの結合定数は０．０１μＭ〜０．０９μＭの範囲にあり（表３、下記）、高親和性ｍＡｂに特徴的である。ｍＡｂをマウスにおける腹水として増殖させ、プロテインＧビーズにより精製した。
【０１６１】
【０１６２】
実施例３
モノクローナル抗体はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と交差反応する
ＭＭＰの触媒作用部位における亜鉛ヒスチジンの立体配座を模倣する合成化合物に対して惹起されたｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性部位内の露出した亜鉛ヒスチジンモチーフと交差反応するかどうかを明らかにするために、モノクローナル抗体を最初に、直接的ＥＬＩＳＡを使用してＭＭＰ−９と結合することについてスクリーニングした。
【０１６３】
３つのｍＡｂが、マイクロタイタープレートのウエルに直接に吸着させたＭＭＰ−９の触媒作用ドメインと結合した（市販の抗ＭＭＰ−９抗体が陽性コントロールとして役立ち、関連性のないＩｇＧが陰性コントロールとして役立った）。興味深いことに、腹水としてマウスにおいて増殖させられているｍＡｂが、マウスの腹水に存在する活性型ＭＭＰ−９と同時に精製された。抗ＭＭＰ−９抗体を一次抗体として用いた精製抗体だけのウエスタンブロット分析は、活性型ＭＭＰ−９についての約８２ＫＤａの予想される分子量に対応する明瞭なバンドを示した。従って、ｍＡｂは天然型酵素とインビボで複合体を形成した。
【０１６４】
次に、モノクローナル抗体を、免疫親和性に基づくアッセイを使用してＭＭＰ−２と結合することについてスクリーニングした。抗体をＭＭＰ−２の触媒作用ドメイン（ＭＭＰ−２ｃａｔ）とインビトロでインキュベーションし、その後、抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズにより捕らえた。図３Ａが示すように、すべてのｍＡｂがＭＭＰ−２ｃａｔと結合した。
【０１６５】
結合が活性部位との直接的な相互作用を介して生じることを明らかにするために、ｍＡｂを、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２およびＰｒｏ−ＭＭＰ−９と結合するその能力について分析した。潜在型酵素では、プロドメイン構造により、触媒作用裂溝が隠される。従って、ｍＡｂが活性部位内のヒスチジン亜鉛モチーフを認識するならば、活性部位をプロドメイン構造によって阻止することは、ｍＡｂが結合することを妨げるにちがいない。同じ条件下で、プロ酵素への結合が検出されなかった（図３Ｂ）。活性型ＭＭＰ−２に結合し、しかし、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２には結合しないこの様式を、全長の天然型ＭＭＰ−２がヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）の細胞培養物によって分泌されるインビボの同様な環境でさらに検討した。抗ＣｏＴＣＰＰ抗体とのＨＴ１０８０馴化培地の免疫沈殿、それに続く、ウエスタンブロット分析では、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２に対してではなく、活性型ＭＭＰ−２に対する結合が示された（図３Ｃ）。これらの結果は、３つの抗体のすべてがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と交差反応することを明らかにする。活性部位裂溝の露出が抗体結合のために不可欠であり、このことから、ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性部位と直接に相互作用することが確認される。
【０１６６】
実施例４
抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂおよび抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂはＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９をインビトロにおいて阻害する
抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍａｂおよび抗ＣｏＴＣＰＰ ｍａｂが、マイクロモル濃度の範囲でＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のタンパク質分解活性を阻害した（図５）。ｍＡｂによるＭＭＰの阻害の速度論的分析を、消光された蛍光性ペプチド基質を用いた連続蛍光測定アッセイで行った。驚くべきことに、抗ＺｎＴＣＰＰ ｍＡｂは阻害作用を示さなかった。
【０１６７】
抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂによる阻害の本質を明らかにするために、実験を、酵素を異なる濃度の蛍光性ペプチド基質とともにｍＡｂの存在下または不在下で使用して行った。図４Ａ〜Ｂに示されるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにおいて示されるデータは競合的阻害プロフィルに特徴的であり、Ｋｉ値が、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２についてそれぞれ、１３μＭおよび２４μＭである。この競合的阻害プロフィルは、ｍＡｂがペプチド基質と同じ部位に結合したことを示していた。この阻害様式は、活性部位との直接的な相互作用のさらなる証明である。注目すべきことに、抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対する濃度依存的な阻害作用を示し、競合的阻害を仮定すると、計算されたＫｉは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対してそれぞれ、５．８μＭおよび３μＭである（図５）。ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の結合部位を認識するので、ｍＡｂとＭＭＰとの間における境界相補性のさらなる最適化が、構造的および静電的の両方で、親和性成熟法（Ｐａｕｌ Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．６、２００６、３４３〜３５７）によって達成可能である。この方法を使用することにより、活性部位の内側または外側のどちらかに存在する特異性特徴を利用する非常に特異的な阻害剤がもたらされ得る。
【０１６８】
実施例５
インサイチュザイモグラフィ
抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂの阻害活性を細胞レベルで確認するために、この抗体の影響を、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を構成的に分泌するヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞のゼラチン分解活性についてインサイチュザイモグラフィによって調べた。ＭＭＰのゼラチン分解活性の所在をインサイチュザイモグラフィによって突き止めるために、分子内で消光されるフルオレセインイソチオシアネート標識ゼラチン（ＤＱ−ゼラチン）を基質として使用した。ゼラチナーゼによるタンパク質分解により、切断されたフルオレセインイソチオシアネート−ゼラチンペプチドが生じ、この蛍光の所在を突き止めることにより、正味のゼラチン分解活性の部位が示される。
【０１６９】
非処理のヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞（図７Ａ）は著しい細胞表面ゼラチン分解活性を示した。１μＭのｍＡｂの存在下において（図７Ｂ）、ゼラチナーゼ活性が、コントロール細胞において観測されるゼラチナーゼ活性と比較して低下した。これらの結果は、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を細胞レベルで阻害したことを明らかにする。
【０１７０】
実施例６
本発明のｍＡｂの選択性
抗体の選択性を、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）およびＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）（関連したＡＤＡＭ（ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ファミリーに属する亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ−１７））に対する抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂおよび抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂの結合作用および阻害作用を調べることによって試験した。ＭＴ１−ＭＭＰおよびＴＡＣＥに対する阻害作用を適切なペプチド基質によるインビトロ蛍光酵素活性アッセイによって試験した。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂは、ＭＴ１−ＭＭＰまたはＴＡＣＥに対する阻害作用を全く示さなかった。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂが、結果としての阻害を伴うことなく、ＴＡＣＥおよびＭＴ１−ＭＭＰと結合するかどうかを明らかにするために、免疫親和性に基づく実験を、精製された酵素を用いて行った。しかしながら、結合が検出されなかった。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂとは対照的に、抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂはＭＴ１−ＭＭＰを阻害し、Ｋｉ値が１０μＭであり、しかし、ＴＡＣＥに対する阻害作用を示さなかった。結果が下記の表４に示される。
【０１７１】
【０１７２】
活性部位における高い構造的類似性がＭＭＰファミリーのメンバーおよびＴＡＣＥの間に存在する。具体的には、亜鉛結合部位を取り囲む三次元での構造的要素が、基質のペプチド骨格を受け入れる必要があるために、また、保存された亜鉛結合モチーフ（ＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ）が存在することのためにほぼ同一である［Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他、Ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅｉｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６４６〜５４；Ｌｉｋａｃｏｖａ，Ｖ．他、Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ：、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２００５、４８（７）：ｐ．２３６１〜７９］。従って、ＭＭＰの間におけるｍＡｂ選択性は、保存されたヒスチジン亜鉛モチーフの認識にだけ基づいて予想されない。しかしながら、小さい分子量の合成阻害剤とは異なり、大きいタンパク質分子である抗体は、タンパク質の骨組中に埋もれる活性部位裂溝への進入が制限されているにちがいない。特に、ｍＡｂは、触媒作用亜鉛イオンと特異的に相互作用することが示されたので、亜鉛イオンが溶液に露出する程度が、抗体結合のために非常に重要であるにちがいない。ＭＴ１−ＭＭＰ、および、より大きな程度ではあるがＴＡＣＥは、それらの結晶構造によって示されるように、比較的埋もれた触媒作用の亜鉛イオンと相関づけられる深いＳ１ポケットによって区別される。活性部位の深さにおけるこの差により、抗体がＴＡＣＥに対する阻害作用を有しないことが説明されるかもしれない。これらの結果は、選択性が、触媒作用亜鉛イオンの露出の程度に基づいて達成され得ることを示唆する。ＭＭＰおよびＴＡＣＥを比較するときに考慮しなければならない別の重要な要因は、化学的性質（例えば、疎水性および極性）に関しての活性部位ポケットにおける違いである（図８を参照のこと）。例えば、ＴＡＣＥの活性部位は、極性がほとんどのＭＭＰの活性部位よりも著しく大きい。Ｓｏｌｏｍｏｎ他は、活性部位の極性におけるそのような変化が、触媒作用亜鉛イオンに対する活性部位のヒスチジンイミダゾール環の配向に直接に影響することを明らかにした［Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他、Ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅｉｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６４６〜５４］。
【０１７３】
抗ＣｏＴＣＰＰおよび抗Ｉｍｉｓｄｐの選択性を、関連性のない亜鉛依存性酵素、すなわち、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）およびブロッキイ（ｂｒｏｃｋｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＴｂＡＤＨ）とのそれらの交差反応性を試験することによってさらに検討した。活性型ＭＭＰと同様に、ＣＡは、３つのヒスチジン残基および１つの水分子に四面体型で配位する亜鉛イオンを含有し、ＴｂＡＤＨは、４つの異なるアミノ酸残基（ヒスチジン、システイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸）に四面体型で配位する触媒作用亜鉛イオンを含有する。適切なインビトロ機能的阻害実験、ならびに、免疫親和性に基づく類似する実験を、これらの酵素との交差反応性を調べるために行った。しかしながら、結合または阻害が検出されなかった。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂもまた、関連した様々な生理学的ポルフィリン（例えば、ミオグロビンおよびヘモグロビンおよびビタミンに含まれるヘム基）とのその交差反応性について試験した。交差が、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、同様にまた、免疫親和性アッセイにおいて検出されなかった。
【０１７４】
カルボニックアンヒドラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼはすべてが、かなり埋もれた活性部位を有しており、同様に、ミオグロビンおよびヘモグロビンにおけるポルフィリン部分は露出していない。ビタミンＢ１２は金属を平面状イミダゾール構造の中心に含有しており、それにもかかわらず、軸方向の配位子がｍＡｂの結合を妨害しているかもしれない。まとめると、これらの結果は、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂが、軸方向の金属配位残基を妨害することなく、比較的露出した金属−イミダゾール立体配置を認識することを裏付けている。
【０１７５】
実施例７
［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタン亜鉛（ＩＩ）（３）の合成、図９
（ｉ）テトラ（２−ペンタクロロ−フェノキシカルボニル−エトキシメチル）メタンの合成：ペンタクロロフェノール置換テトラ−活性エステルの合成を、Ｈａｉｍ Ｗｅｉｚｍａｎｎ他（ＪＡＣＳ、１９９６、１１８、１２３６８〜１２３７５）の手法の場合と同様に行った。
【０１７６】
（ａ）モノ置換されたトリ活性エステルの調製：テトラ活性エステル（１）（１ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）およびＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（１００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。溶液を、トリエチルアミンにより約８のｐＨを維持しながら一晩撹拌した。溶液を濃縮し、ＣＨＣｌ３：酢酸エチル（９０：１０）によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、以下のものを得た（１５２ｍｇ、１５％の収率）。
【０１７７】
（ｂ）トリス（イミダゾール）の調製：モノ置換されたトリ活性エステル（１５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（３３μｌ、０．３９ｍｍｏｌ）を（２０ｍｌの）乾燥ＴＨＦに溶解し、室温で一晩撹拌した。白色の溶液を濃縮し、（０．０６３〜０．２００ｍｍ）のシリカをＣＨＣｌ３：メタノール（５０％〜９０％）とともに使用するカラムクロマトグラフィによって精製して、以下のものを得た（４５ｍｇ、４４％の収率）。
【０１７８】
（ｃ）遊離アミンを有するトリス（イミダゾール）（２）の調製：トリス（イミダゾール）（４０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）をジクロロメタンおよびトリフルオロ酢酸の（２：１）混合物６ｍｌに溶解し、１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、四塩化炭素とともに数回蒸発させ、高真空下で乾燥して、ＴＦＡを混合物から除いて、以下のものを得た（３０ｍｇ、８５％の収率、ｂ）。
【０１７９】
３．トリス（イミダゾール）−Ｚｎ（ＩＩ）錯体（３）の調製：化合物２（３０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を１ｍｌのメタノールに溶解した。これに、２滴〜３滴の１Ｎ ＮａＯＨ溶液およびＺｎＣｌ２（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を加え、半時間撹拌した。白色の沈殿物をろ過して、以下のものを得た（１２ｍｇ、３７％の収率）。
【０１８０】
［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル）メタン
【０１８１】
実施例８
６Ｃ６はゼラチナーゼの触媒作用部位と交差反応した
ある量の６Ｃ６が腹水から活性型ＭＭＰ９と同時に精製されていたことが発見された。検出可能な量のＭＭＰ９が、ｍＡｂを殖やすためにマウスにおいて誘導された腹水腫瘍に存在することが、ウエスタンブロットおよびゼラチンザイモグラフィによって明らかにされた（データは示されず）。ＭＭＰ９−抗体複合体を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィを使用してマウスの腹水から精製した（プロテインＧは抗体の定常ドメインに結合し、これにより、可変ドメインを、抗原と相互作用するために自由な状態にする）。図１１Ａに示されるように、同時精製されたＭＭＰ９が、精製６Ｃ６−ＭＭＰ９複合体を、市販されている抗ＭＭＰ９抗体を使用してウエスタンブロッティングすることによって検出された。プロドメインを欠く活性型ＭＭＰ９に対応する、約８２ｋＤａの分子量を有するバンドが特定された。このバンドは、同じ様式で精製および分析された関連性のないマウスｍＡｂコントロールでは検出されなかった。これらの結果は、６Ｃ６が内因性の活性なマウスＭＭＰ９との特異的なインビボ複合体を形成したことを示した。
【０１８２】
非常に相同的なＭＭＰ２酵素の活性型形態に対する結合についてさらに調べるために、類似した免疫沈殿実験をインビトロで行った。６Ｃ６を、精製されたＭＭＰ２触媒作用フラグメントと３：１のモル比でインキュベーションした。プロテインＡセファロースの免疫沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、活性なＭＭＰ２触媒作用フラグメントとの６Ｃ６の特異的な複合体の形成が明らかにされた（図１１Ｂ）。プロテインＡビーズは単独ではＭＭＰ２を免疫沈殿しなかった。次に、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の不活性なチモーゲン型（潜在型）形態に対する結合を試験した。すべてのＭＭＰが不活性型チモーゲンとして産生されるので、ＭＭＰは、活性部位を阻止するおよそ８０〜９０のアミノ酸のＮ末端プロペプチドを有する［Ｂｏｄｅ，Ｗ．およびＫ．Ｍａｓｋｏｓ、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００３．３８４（６）：ｐ．８６３〜７２］（図１１Ｄ）。ｐｒｏ−ＭＭＰ２およびｐｒｏ−ＭＭＰ９との免疫沈殿実験を類似した様式で行った。重要なことに、この抗体は潜在型酵素に結合しなかった（図１１Ｃ）。際立ったことに、６Ｃ６は、活性部位の亜鉛タンパク質複合体が溶液に露出する活性型酵素立体配座にだけ結合した。
【０１８３】
これらの結果から、６Ｃ６抗体（活性部位を模倣する生物無機化学ハプテンに対して惹起およびスクリーニングされた抗体）がＭＭＰ２およびＭＭＰ９のタンパク質活性部位と交差反応することが確認された。明らかに、この亜鉛トリポッドハプテンは、天然型タンパク質におけるそれぞれの亜鉛−ヒスチジンエピトープの三次元構造を模倣することができた。注目すべきことに、この最小の金属−タンパク質構造的エピトープの認識は、天然型酵素との交差反応性を誘発するために十分であった。活性化された酵素にだけ結合し、プロドメインが触媒作用の亜鉛タンパク質エピトープへの進入を阻止したその潜在型形態には結合しないこと（図１１Ｄ）は、６Ｃ６と亜鉛触媒作用部位との直接的な相互作用を示していた。注目すべきことに、６Ｃ６は天然型ＭＭＰ９とインビボで結合した。このことは、この抗体が複雑なタンパク質環境において酵素との特異的な複合体を形成できることを明らかにする。
【０１８４】
活性化された酵素種を潜在型形態から識別することは、６Ｃ６の特有かつ有益な機能的性質である。この活性は、ＭＭＰ９に対して惹起された他の抗体とは対照的に、６Ｃ６に特有である。これは、タンパク質による免疫化は典型的には、表面ループに向けられたエピトープをもたらし、一方、触媒作用アミノ酸はほとんどが酵素の表面において裂溝の内部に埋もれるからである。分子のこの部分は、免疫原性が低いと見なされる。従って、従来の方法によって（天然型タンパク質またはタンパク質フラグメントに対して）惹起された中和モノクローナル抗体は一般に、活性部位の触媒作用残基とではなく、活性部位に連続または隣接する領域と相互作用し、立体的障害の機構によって阻害する。そのような抗体は典型的には、活性型形態と同様に、不活性な前駆体に結合する。本発明の特有の活性部位模倣ハプテン免疫化法は、従来のタンパク質免疫化法によって達成することができない、ＭＭＰにおける触媒作用の金属タンパク質残基を認識する抗体の産生を可能にし得る。
【０１８５】
実施例９
６Ｃ６はインビトロおよびインサイチュにおいてゼラチナーゼを選択的に阻害する
ＭＭＰ９およびＭＭＰ２に対する６Ｃ６の酵素阻害能力を明らかにするために、阻害アッセイを、ゼラチナーゼの活性部位裂溝に広がる小さい蛍光発生ペプチド基質（７アミノ酸）を使用して行った。初反応速度をいくつかの濃度のｍＡｂについて測定した。６Ｃ６は両方の酵素の触媒活性を阻害した（図１２Ａ〜Ｂ）。阻害の競合的機構が、ＭＭＰ９の活性を基質濃度の関数として様々な濃度の阻害性抗体の存在下で分析することによって決定された。両軸逆数のＬｉｎｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットの形態で図１２Ａに示されるデータにより、競合的阻害プロフィルが明らかにされる。阻害データを競合的阻害系の式に適合化することにより、ＫｉがＭＭＰ９およびＭＭＰ２についてそれぞれ１±０．１μＭおよび１．４±０．１６μＭであることが得られた。６Ｃ６が高濃度（３０μＭ）のＭＭＰ９との一晩のインキュベーションの後でＭＭＰ−９によって切断されなかったこともまた明らかにされた。このことは、６Ｃ６によるＭＭＰ９の観測された阻害が競合剤基質の切断のためではなかったことを明らかにする。６Ｃ６は、異なるＭＭＰにおいて同じエピトープを認識するように設計されたので、ＭＭＰ９の速度論的解析を、６Ｃ６による阻害機構の代表例とした。阻害作用は、ゼラチナーゼの全長型酵素形態と同様に、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の触媒作用フラグメント種について一貫していた。具体的には、触媒作用ドメインならびにフィブロネクチンドメインを含有し、しかし、ヘモペキシンドメインを含有しない組換えのＭＭＰ９触媒作用フラグメントおよびＭＭＰ２触媒作用フラグメント；また、触媒作用ドメインのみを含有し、フィブロネクチンドメインおよびヘモペキシンドメインの両方を欠くＭＭＰ９組換え最小触媒作用ユニットはすべてが、以前に記載されたようにヒトのｐｒｏ−ＭＭＰ２およびｐｒｏ−ＭＭＰ９の全長ｃＤＮＡをコードする組換えワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ Ｓ３細胞の培地から精製された全長の（酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）活性化）ゼラチナーゼと同様に阻害された［Ｏｌｓｅｎ，Ｗ．Ｍ．他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０００．２７５（４）：ｐ．２６６１〜８］。これらの結果により、阻害が触媒作用ドメインとの直接的な相互作用によって媒介され、ヘモペキシンドメインまたはフィブロネクチンドメインのどちらかとの相互作用に依存していないことが確認された。この競合的阻害プロフィルでは、触媒作用亜鉛部位との直接的な相互作用がさらに示された。類似した様式で調製された関連性のないｍＡｂは酵素の光分解活性を妨害しなかった。従って、観測された阻害は、微量の同時精製された混入物のためではなかった。これらの実験のための抗体は組織培養から精製され、検出可能な量の活性型ＭＭＰ９を精製抗体画分に含有しなかった。
【０１８６】
６Ｃ６の選択性を詳しく検討するために、その反応性を、マトリライシン（ＭＭＰ７）、膜型ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ）および関連したジスインテグリン（ＡＤＡＭｓ）腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）を含む種々のマトリックスメタロプロテイナーゼサブグループに対して試験した。これらの酵素のコア構造は非常に類似しており、ほとんどが周辺ループの内部で変化している。具体的には、亜鉛−ヒスチジンの足場がよく保存されており、この足場は、触媒作用亜鉛イオンに配位する３つのヒスチジン残基のための足場として役立つループが続くコンセンサスヘリックスを示す（図１３）。
【０１８７】
類似する阻害アッセイを、適切な蛍光発生ペプチド基質を用いて行った。興味深いことに、ＭＭＰ−７またはＴＡＣＥはどちらも、６Ｃ６と３０μＭまでの濃度でインキュベーションされたとき、何ら測定可能な程度に阻害されなかった。このことは、ゼラチナーゼに対する相当なレベルの選択性を示している。ＭＴ１−ＭＭＰが６Ｃ６によって阻害されたが、それほど強力でなく、Ｋｉが１４．４±０．７５μＭであった。興味深いことに、この選択性の起原は、特に活性部位におけるコア構造が非常に類似しているので、保存された亜鉛−ヒスチジン足場を認識させる抗体の設計にもっぱら基づいて解明することはできない。配列の変化（ほとんどが周辺ループの内部に存在する）により、亜鉛−ヒスチジンモチーフの露出度合いにおける差、活性部位の形状における差が決定され、その表面静電により、この選択的阻害パターンを説明することができる。
【０１８８】
６Ｃ６を、異なる亜鉛依存性メタロプロテアーゼ（カルボニックアンヒドラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ）との交差反応性についても試験した。ＭＭＰと類似して、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）は、３つのヒスチジン配位子および１つの水分子に四面体型で配位する触媒作用亜鉛イオンを有する。その結果、（スルホニル化アミノ酸ヒドロキサマートタイプの）いくつかの強力な小分子ＭＭＰ阻害剤は、効率的なＣＡ阻害剤としても作用し、逆も然りである。ＣＡ阻害剤として以前に研究された一部のＮ−ヒドロキシスルホンアミド類もまた、ＭＭＰに対する阻害特性を示す［Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ，Ａ．およびＣ．Ｔ．Ｓｕｐｕｒａｎ、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２０００．４３（２０）：ｐ．３６７７〜８７］。好熱性細菌から得られたアルコールデヒドロゲナーゼ（ＴｂＡＤＨ）の活性部位は、亜鉛が、裂け目の内部に位置するヒスチジン、システイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸に結合する異なる亜鉛−タンパク質部分を含む。３０μＭまでのｍＡｂ濃度の存在下における適切な機能的阻害実験は阻害作用を両方の酵素に対して何ら示さなかった。注目すべきことに、１０本鎖のねじれたβ−シートの中心領域に位置するＣＡの活性部位は、四面体型Ｚｎ２＋イオンが裂溝の底に存在する深さ１５Åの錐体形状の裂溝から構成される。小分子阻害剤とは異なり、亜鉛イオンは、抗体との相互作用のためにはあまりにも深く埋もれているにちがいない。重要なことに、これらの実験では、６Ｃ６の選択的阻害プロフィルがさらに明らかにされる。
【０１８９】
細胞環境において、ゼラチナーゼに対する６Ｃ６の阻害作用を、インサイチュザイモグラフィによって、ゼラチナーゼの天然基質（すなわち、ゼラチン）を使用してさらに試験した。膜結合型ＭＴ１−ＭＭＰを発現し、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を分泌する培養で成長させたヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０細胞）［Ｇｉａｍｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｔ．Ａ．他、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ、１９９８．１６（８）：ｐ．４８３〜９６］に、フルオレセインコンジュゲート化ゼラチン（ＤＱゼラチン）を重ねた。図１４Ａ〜Ｃに示されるように、非処理のＨＴ１０８０細胞は著しい細胞表面ゼラチン分解活性を示した。５μＭのｍＡｂによる処理は、機構に基づいたゼラチナーゼ阻害剤（ＳＢ−３ＣＴ）を用いて観測される阻害と同様に、表面ゼラチン分解活性を著しく低下させた。ＳＢ−３ＣＴは、ゼラチナーゼおよびＭＴ１−ＭＭＰの両方を阻害するとき、類似する阻害プロフィルを有する（Ｋｉ値が、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびＭＴ１−ＭＭＰについてそれぞれ、２８ｎＭ、４００ｎｍおよび１１０ｎＭである）。
【０１９０】
まとめると、６Ｃ６はインビトロでの合成ペプチドの切断およびインサイチュでの天然高分子基質の両方を阻害した。６Ｃ６は、ＴＩＭＰの阻害機構と類似する、ＭＭＰ９に対する競合的様式の阻害を示した。競合的阻害プロフィルは、触媒作用亜鉛部分との直接的な相互作用をさらに示す。重要なことに、６Ｃ６は、ゼラチナーゼに対する選択的阻害プロフィルを示した。この選択性の起原は、保存された亜鉛−ヒスチジンモチーフの抗体標的化によって説明することができない。これらの結果は、抗体が、観測された特異性を説明する酵素表面上のさらなる決定基と相互作用することを示唆する。
【０１９１】
実施例１０
マウスにおけるＤＳＳ誘導大腸炎に対する６Ｃ６ ｍＡｂ処置の影響
ＭＭＰが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含めて、いくつかの炎症性状態に関連する組織のリモデリングおよび破壊に関わるという証拠が増大している［Ｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｄ．他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９９．１１７（４）；ｐ．８１４〜２２；Ｈｅｕｓｃｈｋｅｌ，Ｒ．Ｂ．他、Ｇｕｔ、２０００．４７（１）：ｐ．５７〜６２；ｖｏｎ Ｌａｍｐｅ，Ｂ．他、Ｇｕｔ、２０００．４７（１）：ｐ．６３〜７３；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ，Ｔ．他、Ｇｕｔ、２００４．５３（５）：ｐ．７０１〜９］。
【０１９２】
従って、本発明者らは、炎症性腸疾患のマウス実験モデルにおいてインビボでの６Ｃ６の抗ゼラチナーゼ阻害作用を調べた。
【０１９３】
６Ｃ６の阻害活性を検討するために、ｍＡｂ処置がＤＳＳ誘導の急性大腸炎を改善する能力を調べた。具体的には、２％ＤＳＳを高感受性マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６に５日間与えた。６Ｃ６処置を、誘導日から開始して１．５または５ｍｇ／ｋｇマウスの腹腔内注射によって毎日施した。２％ＤＳＳにさらされたマウスは、下痢、直腸出血および重度の体重減少とともに、急性大腸炎の症状を発症した。
【０１９４】
毎日モニターされた疾患活性指数（ＤＡＩ）（体重、出血および便の硬さの総合スコア）に対するｍＡｂ処置の影響が図１５Ａに示される。ｍＡｂ処置マウスは、コントロールと比較して、疾患活性を低下させていた（６日目から顕著であった）。ＤＳＳ誘導大腸炎のさらなる巨視的発現は結腸の長さの減少である（図１５Ｂ）。例えば、結腸の長さの３０％の低下が、ＤＳＳ誘導後１１日で、実験未使用マウスとの比較で非処置マウスにおいて見出された。対照的に、平均してほんの２２％または１６％の低下が、１．５および５ｍｇ／ｋｇマウスが投薬される６Ｃ６処置マウスにおいてそれぞれ得られた。６Ｃ６の保護作用がまた、疾患からの死亡率によって確認された。６０％の死亡率が誘導後１１日で非処置マウスにおいて見出され、一方、ほんの３３％の死亡率が６Ｃ６処置マウスにおいて観測された（図１５Ｃ）。従って、６Ｃ６によるＣ５７ＢＬ／６マウスの処置は、ＤＳＳ誘導大腸炎の低下した発現に加えて、改善された生存率をもたらした。
【０１９５】
全体として、これらの結果により、ゼラチナーゼ阻害剤としての６Ｃ６の治療的可能性が明らかにされた。
【０１９６】
実施例１１
Ｘ線吸収分光法によるＭＭＰ９−６Ｃ６ ｍＡｂ複合体の特徴づけ
活性型ＭＭＰ９と阻害型ＭＭＰ９−６Ｃ６複合体との違いをさらに研究するために、Ｘ線吸収分光法を行った。図１６は、集められた蛍光ＸＡＳデータを示す。データは、ＭＭＰ９における触媒作用亜鉛イオンの第１および第２配位殻内の様々な原子の動径分布を提供するためにフーリエ変換（ＦＴ）スペクトルの形態で示される。遊離酵素および阻害型酵素の動径分布スペクトルにおける明瞭な変化を、ノイズレベルを超えて観測することができる。これらのスペクトル変化は、６Ｃ６に結合したとき、触媒作用亜鉛イオンの局所的環境が構造的変化を受けることを示している。活性型酵素と阻害型酵素との間におけるＦＴスペクトル特徴の空間分布およびピーク強度の両方における観測されたずれは、触媒作用亜鉛の局所的構造がｍＡｂとの複合体形成のときに変化することを明白に示している。
【０１９７】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１９８】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許または特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０１９９】
【配列表フリーテキスト】
【０２００】
配列番号１は、６Ｃ６ ｍＡｂ軽鎖の配列である。
配列番号２は、１５Ｅ１２ ｍＡｂ軽鎖の配列である。
配列番号３は、１３Ｅ１１ ｍＡｂ軽鎖の配列である。
配列番号４は、１３Ｅ１１ ｍＡｂ重鎖の配列である。
配列番号５は、１５Ｅ１２ ｍＡｂ重鎖の配列である。
配列番号６は、６Ｃ６ ｍＡｂ重鎖の配列である。
配列番号７は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ１の配列である。
配列番号８は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ２の配列である。
配列番号９は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ３の配列である。
配列番号１０は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ１の配列である。
配列番号１１は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ２の配列である。
配列番号１２は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ３の配列である。
配列番号１３は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ１のコード配列である。
配列番号１４は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ２のコード配列である。
配列番号１５は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ３のコード配列である。
配列番号１６は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ１のコード配列である。
配列番号１７は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ２のコード配列である。
配列番号１８は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ３のコード配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属タンパク質（例えば、メタロプロテアーゼ）の活性を阻害するために使用することができるハプテン分子および該ハプテン分子に対する抗体、ならびに、金属タンパク質の異常な活性に関連する疾患（例えば、転移性ガン）を処置するために該抗体を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス金属タンパク質（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングに関与する重要な酵素である。これらの酵素は関節軟骨または基底膜の様々な結合組織成分を破壊することができる。
【０００３】
ヒトＭＭＰ遺伝子ファミリーは、少なくとも２８の構造的に関連したタンパク質（図１参照）からなり、これらのタンパク質は、類似した全体的な球状トポロジーを共有する（図２およびＢｏｒｋａｋｏｔｉ（１９９８））。それぞれのＭＭＰが不活性な潜在型プロ酵素として分泌される。触媒作用の亜鉛ドメインが約１８０個のアミノ酸から構成され、これらのアミノ酸において、その高度に保存された配列（ＨＥ−ＧＨ−ＬＧＬ−Ｈ）により、金属Ｚｎ（２＋）イオンに結合する３つのヒスチジン（すなわち、Ｈ）残基が提供される。プロ酵素における触媒作用亜鉛イオンの第４の結合部位がシステイン残基に結合しており（Ｍｏｒｇｕｎｏｖａ他、１９９９）、このシステイン残基は、酵素が活性化されたとき、活性部位から解離する（Ｖａｎ ＷａｒｔおよびＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ、１９９０）。その結果、活性化されたＭＭＰにおける第４の結合部位が、保存されたグルタミン酸残基に対しても水素結合する水分子によって占められる。このプロセスにより、活性化された水分子による標的基質のペプチド結合の加水分解が促進される。
【０００４】
メタロプロテアーゼによる結合組織の制御されない分解は、過度なＭＭＰ活性から生じるか、または、生来的なＭＭＰ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）とＭＭＰとの間におけるバランスの崩れた比率から生じるとおそらくは考えられる多くの病理学的状態の特徴の１つである。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの活性な結合部位との化学量論的な複合体を形成することによってＭＭＰを阻害する（Ｇｏｍｅｚ他、１９９７；Ｈｅｎｒｉｅｔ他、１９９９；Ｂｏｄｅ他、１９９９；Ｗｉｌｌ他、１９９６）。ＴＩＭＰのレベルが不十分であるとき、ＥＣＭの進行性のゆっくりした分解により、軟骨マトリックスの喪失がリウマチ様関節炎（Ｗａｌａｋｏｖｉｔｓ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、３５：３５〜４２、１９９２）および変形性関節炎（Ｄｅａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８４：６７８〜６８５、１９８９）において引き起こされ得るか、または、骨マトリックスの分解が骨粗鬆症（Ｈｉｌｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３０８：１６７〜１７５、１９９５）において引き起こされ得る。他の状況において、例えば、うっ血性心不全では、心臓のＥＣＭの急速な分解が生じ得る（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ他、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０：２１４〜２２０、１９９４）。
【０００５】
加えて、ＭＭＰが、下記のようなサイトカインおよびケモカインの成熟化において役割を果たすことが知られている：例えば、ガレクチン−３（Ｏｃｈｉｅｎｇ Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３（４７）：１４１０９〜１４）、プラスミノーゲン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ＢＣ．、ＪＢＣ、１９９７、２７２（４６）：２８８２３〜５）、インターロイキン−８、結合組織活性化ペプチドＩＩＩ、血小板因子−４（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎ、２０００、Ｂｌｏｏｄ、２０００（Ｏｃｔ １５）、９６（８）：２６７３〜８１）、プロ−インターロイキン−１β（Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ、１９９８）、インターロイキン−２受容体α鎖［Ｓｈｅｕ，Ｂ．Ｃ、Ｈｓｕ，Ｓ．Ｍ．、Ｈｏ，Ｈ．、Ｌｉｅｎ，Ｈ．Ｃ．、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｉｎ，Ｒ．Ｈ．、Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）、６１、２３７〜２４２］、およびプロ−トランスフォーミング増殖因子−β［ＴＧＦ−β、Ｙｕ，Ｑ．、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（２０００）、１４、１６３〜１７６］など。
【０００６】
ＭＭＰの調節されない活性にも関係づけられる他の病理学的状態には、転移性腫瘍細胞によるＥＣＭの急速なリモデリングが含まれる。そのような状態では、活性化された様々なＭＭＰが、ガン細胞によって、または、その周りの組織によってそのどちらかで発現される。様々なＭＭＰが腫瘍の成長および拡大に関与しているという注目すべき証拠がある（例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２５８〜２６１、１９９７、および、それにおける参考文献を参照のこと）。腫瘍転移のプロセスにおいて、様々なＭＭＰが、ＥＣＭを分解するために使用され、このことが、原発性腫瘍のガン細胞が付近の血管に侵入することを許し、血管を介して、ガン細胞は異なる器官に運ばれ、二次的腫瘍を確立する。これらの二次的部位での侵襲的成長が、組織を分解するＭＭＰによって媒介される。加えて、ＭＭＰ活性は、腫瘍が特定のサイズを超えて成長するために要求される新しい血管の侵襲的な、内部に向かう成長（これは腫瘍起因性血管形成とも呼ばれる）に寄与している。ＭＭＰファミリーのメンバーの中で、分泌型のヒトＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢとしても知られている）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の異化においてだけでなく、神経学的疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））での関連があるタンパク質基質のプロセシングにおいてもまた重要な役割を有することが示されている（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ、２００３）。近年の研究では、ＭＭＰ−９が、プレプロセシングされたＩＩ型コラーゲンを切断することによって自己免疫疾患を促進させることにおいて非常に重要な役割を有することが示された（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎ、２００４）。その生成物が、様々な自己免疫疾患を生じさせると考えられるレムナントエピトープであるＩＩ型コラーゲンフラグメントである。
【０００７】
ヒトの生理学および病理学における様々なＭＭＰの幅広い役割を考えた場合、数多くの努力がこれまで、ＭＭＰの過度な活性を阻害する薬物を設計するために行われていることは驚くことではない。
【０００８】
薬物発見の様々な努力が、亜鉛イオンに配位し、それにより、標的ＭＭＰを不活性化する官能基を含有する阻害剤クラスに集中している。１つのそのような阻害剤クラスが、繊維状コラーゲンの小ペプチドアナログであるヒドロキサム酸系阻害剤であり、ヒドロキサム酸系阻害剤は触媒作用部位内の亜鉛イオンとヒドロキサム酸基のヒドロキシル酸素およびカルボニル酸素を介して二座様式で特異的に相互作用する［Ｇｒａｍｓ他（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１４０１２〜１４０２０；Ｂｏｄｅ他（１９９４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：１２６３〜１２６９］。
【０００９】
ヒドロキサム酸に基づくＭＭＰ阻害剤は通常、炭素骨格（ＷＯ９５／２９８９２、ＷＯ９７／２４１１７、ＷＯ９７／４９６７９およびＥＰ０７８０３８６）、ペプチジル骨格（ＷＯ９０／０５７１９、ＷＯ９３／２００４７、ＷＯ９５／０９８４１およびＷＯ９６／０６０７４）またはペプチドミメティック骨格［Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、Ｐｒｏｇｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２９：２７１〜３３４（１９９２）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７５：６９〜７５（１９９７）；Ｄｅｎｉｓ他、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、１５：１７５〜１８５（１９９７）］のいずれかから構成される。代替として、ヒドロキサム酸に基づくＭＭＰ阻害剤は、一方の側でフェニル環に結合するスルホンアミドスルホニル基と、１個〜４個の炭素原子の鎖を介してヒドロキサム酸基に結合するスルホンアミド窒素とを含有する（ＥＰ０７５７９８４Ａ１）。
【００１０】
ペプチドに基づく他のＭＭＰ阻害剤として、コラゲナーゼ阻害活性を示すチオールアミド（米国特許第４５９５７００号）、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２およびコラゲナーゼを阻害する、ビフェニルエチルグリシン部分を含有するＮ−カルボキシアルキル誘導体（Ｄｕｒｅｔｔｅ他、ＷＯ−９５２９６８９）、各種ＭＭＰ、ＴＮＦ−αおよびアグリカーゼを阻害するラクタム誘導体（米国特許第６４９５６９９号を参照のこと）、ならびに、三環スルホンアミド化合物（米国特許第６４９２４２２号を参照のこと）がある。
【００１１】
ペプチドに基づくＭＭＰ阻害剤は明らかな治療的可能性を有するが、臨床治療におけるそれらの使用は制限される。ペプチドに基づくヒドロキサム酸系薬剤は、製造に費用がかかり、また、低い代謝安定性および経口での低い生物学的利用能を有する［例えば、バチマスタット（ＢＢ−９４）］。これらの化合物は迅速なグルクロン酸抱合を受け、カルボン酸に酸化され、胆汁に排出される［Ｓｉｎｇｈ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：３３７〜３４２、１９９５；Ｈｏｄｇｓｏｎ、「Ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ＭＭＰＩｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５５４〜５５７、１９９５］。加えて、ペプチドに基づくＭＭＰ阻害剤は、多くの場合、ＭＭＰ酵素のそれぞれに対して同じまたは類似する阻害作用を示す。例えば、バチマスタットは、約１ｎＭ〜約２０ｎＭのＩＣ５０値を、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９のそれぞれに対して示すことが報告される［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７５（１）：６９〜７５（１９９７）］。さらに、いくつかのヒドロキサム酸系阻害剤の使用には、重篤な副作用が伴った：例えば、マリマスタット（ＢＢ−２５１６）による筋骨格問題；ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）による広範囲に及ぶ斑丘疹性発疹［Ｌｅｖｉｔｔ他、２００１、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：１９１２〜１９２２］；ＢＡＹ１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ）による肝臓異常、貧血、肩部痛および背痛、血小板減少症、吐き気、疲労、下痢、ならびに、深部静脈血栓症［Ｈｅａｔｈ他、２００１、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：２６９〜２７４］。そのうえ、マリマスタット、プリノマスタット（ＡＧ３３４０、Ａｇｏｕｒｏｎ）およびＢａｙ１２−９５６６を用いた進行ガン患者に対する第ＩＩＩ相臨床試験では、転移を阻害することにおける臨床的効力がないことが明らかにされた（Ｚｕｃｋｅｒ他、２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９：６６４２〜５０）。
【００１２】
他のＭＭＰ阻害剤として、いくつかのＭＭＰの発現をインビトロで阻止することが示された化学的に修飾された非微生物性テトラサイクリン系化合物（ＣＭＴ）がある。しかしながら、これらの化合物のインビボ効力は、限定されることが見出された。例えば、ＣＭＴ阻害剤のドキシサイクリンは、ヒト患者において、アテローム硬化性頸動脈プラークにおけるＭＭＰ−１の組織レベルを低下させたが、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３またはＭＭＰ−９の組織レベルは低下させなかった（Ａｘｉｓａ他、２００２、Ｓｔｒｏｋｅ、３３：２８５８〜２８６４）。
【００１３】
近年、機構に基づいたＭＭＰ阻害剤のＳＢ−３ＣＴがＭＭＰの活性部位のＸ線結晶学情報に従って設計された（Ｂｒｏｗｎ他、２０００）。Ｘ線吸収研究では、この分子が触媒作用の亜鉛に結合することにより、活性部位の金属イオンの周りの立体配座環境が再構築されて、プロ酵素の立体配座環境に戻ることが解明された［Ｋｌｅｉｆｅｌｄ他、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７１２５〜３１］。しかしながら、この薬剤を用いて得られる治療効力は今後、明らかにされなければならない。
【００１４】
別のクラスの天然の阻害剤がモノクローナル抗体である。いくつかの抗体が、ＭＭＰ−１の触媒作用ドメインに含まれる特定のペプチド配列に対して惹起されている（Ｇａｌｖｅｚ他、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：３７４９１〜３７５００）。しかしながら、これらの抗体はＭＭＰのインビトロ活性を阻害することができたが、そのような抗体のインビボ有効性を明らかにする結果はこれまで明らかにされていない。
【００１５】
本明細書において上記されるように、ＭＭＰの触媒作用部位は、酵素活性化の後で基質結合のために利用可能になる配位した金属イオンを含む（図２ａ〜ｃを参照のこと）。従って、酵素の一次アミノ酸配列に向けられた従来の抗体は、酵素の活性型形態と不活性型形態とを区別せず、従って、そのような酵素の強力な阻害剤として役立たないことが考えられる。
【００１６】
本発明者らは、ＭＭＰの触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基の両方を認識する抗体がその強力な阻害剤であり、また、そのようなものとして、バランスの崩れたＭＭＰ活性に関連する疾患を処置するために使用できることを以前に示している（ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０８７０４２を参照のこと）。
【００１７】
従って、金属タンパク質の触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基を模倣する特異的なハプテン化合物、ならびに、そのようなハプテン化合物に対して向けられる特異的な抗体が必要であることが広く認識されており、また、そのようなハプテン化合物、ならびに、そのような特異的な抗体を有することは非常に望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の１つの態様によれば、一般式（Ｉ）を有する化合物が提供される：
式中、
ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；
Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；
Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；および
Ｒは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、
ただし：
ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；および
Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される。
【００１９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、化合物は式（ＩＩ）を有する：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、式（ＩＩ）を有する化合物が提供される：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【００２１】
本発明のさらに別の態様によれば、上記化合物と特異的に結合することができる抗原認識領域を含む抗体が提供される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗原認識領域は、配列番号７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択されるＣＤＲアミノ酸配列を含む。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体は金属タンパク質の活性を阻害することができる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、金属タンパク質はマトリックスメタロプロテアーゼである。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、マトリックスメタロプロテアーゼはゼラチナーゼである。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ゼラチナーゼは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様によれば、金属タンパク質阻害剤を製造する方法が提供され、該方法は、上記化合物に向けられた抗体を作製し、それにより、金属タンパク質阻害剤を製造することを含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体はモノクローナル抗体である。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体と医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患をその処置の必要性のある対象において処置する方法が提供され、該方法は、請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つの治療有効量を対象に投与し、それにより、金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患を対象において処置することを含む。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は炎症性腸疾患である。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害する方法が提供され、該方法は、細胞を請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つと接触させ、それにより、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害することを含む。
【００３５】
本発明は、金属タンパク質の触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基の両方を認識する抗体を作製するために使用されることができる新規なハプテン組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００３６】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３７】
本明細書では本発明を単に例示し添付図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、Ｃｏ／ＺｎＴＣＰＰ、すなわち、［メソ−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリナト］コバルト／亜鉛（ＩＩ）（図１Ａ〜Ｂ）、Ｉｍｉｓｄｐ、すなわち、［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタン）、および、ＭＭＰにおける触媒作用亜鉛部位での保存された亜鉛−タンパク質結合の分子構造の概略表示である。図１Ｅ〜図１Ｈは、図１Ａ〜ｄに示される構造の三次元スキームである。ＺｎＴＣＰＰは平面の立体配座を保持し、一方、ＣｏＴＣＰＰは、ひずみのあるミクロサイクル立体配座を示すことに留意すること。注目すべきことに、ｍｉｓｄｐの構造は、図１Ｇにおいて明らかにされるようにＭＭＰ−９における触媒作用亜鉛イオンの最隣接環境と非常に類似している。
【図２】図２Ａは、Ｉｍｉｓｄｐの三次元での計算された構造（緑色の炭素原子）と、ＭＭＰ−９の活性部位での３つの保存されたヒスチジン（ＰＤＢコード：１ＧＫＣ、灰色の炭素原子）との間における構造的重なりである。触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球として示され、水分子が青色の球として示され、窒素が青色で着色され、酸素が赤色で着色される。図２Ｂは、ＺｎＴＣＰＰのポルフィリン環（ＣＳＤコード：ＡＫＩＣＯＭ）（緑色の炭素原子）と、ＭＭＰ−９の活性部位での３つの保存されたヒスチジン（灰色の炭素原子、ＰＤＢコード：１ＧＫＣ）との間における構造的重なりである。触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球として示され、窒素が青色で着色される。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、マウスＩｇＧ−アガロースに固定化されたｍＡｂが溶液から組換えＭＭＰ−２触媒作用ドメイン（ＭＭＰ−２ｃａｔ）またはＰｒｏ−ＭＭＰ−２およびＰｒｏ−ＭＭＰ−９を捕らえることができることを示すウエスタンブロット画像である。それぞれの実験のために使用された抗体は、６Ｃ６、１３Ｅ１１および１３Ｅ１５である。図３Ａ：ＭＭＰ−２ｃａｔ（２μｇ）を、抗マウスＩｇＧ−アガロース（コントロール、レーン１）、または、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂ（１０μｇ）−抗マウスＩｇＧ−アガロース、抗ＺｎＴＣＰＰ ｍＡｂ（１０μｇ）−抗マウスＩｇＧ−アガロースおよび抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂ（１０μｇ）−抗マウスＩｇＧ−アガロースと２０℃で２時間インキュベーションし、免疫沈殿物（レーン２、３、５）を遠心分離し、３回洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。図３Ｂ：Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９を、Ａの場合と同じ様式でｍＡｂ−抗マウスＩｇＧ−アガロースとインキュベーションした。免疫沈殿物（レーン２、レーン４、レーン６の左側、および、レーン１、レーン３、レーン５の右側）および非結合画分（レーン１、レーン３、レーン５の左側、および、レーン２、レーン４、レーン６の右側）をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。図３Ｃ：ＡＰＭＡによる活性化を受けたＨＴ１０８０細胞（左）、または、活性化を受けなかったＨＴ１０８０細胞（右）の馴化培地を、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂにより免疫沈殿し、ＭＭＰ−２に対する特異的抗体によるウエスタンブロットによって分析した。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、ＭＭＰ−２（Ａ）およびＭＭＰ−９（Ｂ）の抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂ阻害のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。速度の単位はμｍｏｌ／ｓｅｃ−１であり、基質の単位はμＭ−１である。図４Ａ：ｍＡｂの濃度が、６μＭ（黒三角）、１８μＭ（黒四角）、２４μＭ（白丸）および０μＭ（白四角）であった。ＭＭＰ−２ｃａｔの濃度が２００ｎＭであった。図４Ｂ：全長のＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−９の阻害、ｍＡｂの濃度が、６μＭ（白四角）、１２μＭ（黒三角）、２４μＭ（白四角）および０μＭ（黒四角）であった。ＭＭＰ−９の濃度が２０ｎＭであった。阻害パターンは、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の競合的阻害剤として挙動することを示している。
【図５】抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂによるＭＭＰ−２阻害およびＭＭＰ−９阻害を示すプロットである。ＭＭＰ−９の触媒作用ドメイン（２０ｎＭ）（黒丸）または全長のＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−２（黒三角、５ｎＭ）を、増大する濃度のｍＡｂを含有する緩衝液Ｒにおける蛍光発生基質ＯＣＡｃＰＬＧＬＡ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（１０μＭ）の混合物に加えた。曲線は、プログラムＯｒｉｇｉｎを使用する、式：ｖｉ／ｖｏ＝（Ｋｍ＋［Ｓ］）／（Ｋｍ（１＋［Ｉ］／Ｋｉ）＋［Ｓ］）への非線形最小二乗適合を表す。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、ＭＭＰ−２ｃａｔの活性型形態および抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂによる阻害型形態の亜鉛ｋ端スペクトルを示す。活性型（点線）およびＭＭＰ−２ｃａｔ−ｍＡｂ複合体（実線）の亜鉛Ｋ端領域の正規化された生ＸＡＳデータが示される。図６Ｂは、ＭＭＰ−２ｃａｔ−ｍＡｂ複合体（実線）の端位置が、活性型ＭＭＰ−２ｃａｔ（点線）と比較して高エネルギー側にシフトすることを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＥＸＡＦＳの結果をＭＭＰ−２ｃａｔの活性型形態（黒色）および阻害型形態（緑色）について示す。結果がＲ空間で示され、ｋ空間に逆変換される。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂが細胞表面ゼラチナーゼ活性を阻害することができることを示す写真である。１ｕＭの１３Ｅ１１ ｍＡｂの存在下または不在下における、ＱＤ−ゼラチンで被覆されたカバースリップに置かれたＨＴ１０８０細胞の代表的な蛍光顕微鏡写真。細胞表面ゼラチン分解活性が、分解されたゼラチンによって放出される蛍光の大きさとしてアッセイされた。非処理の細胞は著しい細胞表面ゼラチナーゼ活性を示し、この細胞表面ゼラチナーゼ活性は１ｕＭの抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂの存在下で著しく阻害された。４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（青色）は細胞の核の所在位置を示している。
【図８】図８は、様々なＭＭＰ活性部位（Ｓ１ポケット）の立体配置を示すスキームである。
【図９】図９は、Ｉｍｉｓｄｐの合成スキームである。
【図１０】図１０は、ＣＤＲ領域が強調して示される本発明の抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、６Ｃ６がＭＭＰ９およびＭＭＰ２の活性型立体配座とだけ結合することを示す写真およびモデルである。図１１Ａ：マウスの腹水から６Ｃ６と同時精製された活性型ＭＭＰ９の検出。ＭＭＰ９を含有するマウス腹水から精製されたｍＡｂ（１０μｇ）を、市販の抗ＭＭＰ９抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）分析に供した。同じ様式で精製されている非関連のＩｇＧ ｍＡｂが陰性コントロール（ＭＡｂコントロール）として役立った。Ｈｉｌｌａトランスフェクション細胞から精製されたヒトＰｒｏＭＭＰ９が、活性な化学種を識別するための分子量マーカーとして役立った。精製を、その定常ドメインを介してｍＡｂと結合し、それにより、抗原結合部位を、抗原と相互作用するために自由にしたままにするプロテインＧビーズを使用してアフィニティクロマトグラフィによって行った。図１１Ｂ、Ｃ：プロテインＡビーズに固定化された６Ｃ６ ｍＡｂを、ＰｒｏＭＭＰ２、ＰｒｏＭＭＰ９、または、（ヘモペキシンドメインおよびプロドメインを欠く）ＭＭＰ２触媒作用フラグメントを溶液から捕らえるその能力について分析した。プロテインＡセファロースビーズに固定化されたｍＡｂ ６Ｃ６（１０μｇ）を、ＭＭＰ２触媒作用フラグメント（１μｇ）（図１１Ｂ）、ＰｒｏＭＭＰ９（図１１Ｃ、上段）、または、ＰｒｏＭＭＰ２（２μｇ）（図１１Ｃ、下段）と２０℃で２時間インキュベーションした。ビーズに結合したｍＡｂ複合体を遠心分離によって分離し、３回洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。免疫沈殿物（６Ｃ６）および非結合画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシー染色によって可視化した。非特異的吸着のための陰性コントロールとして、酵素だけをプロテインＡセファロースビーズとインキュベーションした。図１１Ｄ：ヘモペキシンドメインを欠き、プロドメインを有するＭＭＰ２の三次元構造（下段）、および、ヘモペキシンドメインを欠き、プロドメインを有しないＭＭＰ２の三次元構造（上段）が表面表示で示される（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＫ７）。触媒作用ドメインおよびフィブロネクチンドメインがシアン色で示され、プロペプチドが赤色で示される。触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球体として示され、黄色の棒状体として示される３つの保存されたヒスチジンに結合する。示されるように、プロペプチドドメインにより、活性部位が立体的に阻止される。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂ６Ｃ６ ｍＡｂによるＭＭＰ−９の阻害機構に関連するグラフおよびデータである。図１２Ａ：ＭＭＰ−９組換え体の触媒作用フラグメント（ヘモペキシンドメインおよびプロドメインを有しない）を様々な量のｍＡｂとプレインキュベーションした。残存酵素活性を、蛍光発生ペプチド基質（１０μＭ）を加えた後で測定した。Ｋｉを、競合的阻害の式に適合化することによって評価した（ｖｉ／ｖｏ＝Ｋｍ＋［Ｓ］／（Ｋｍ（１＋Ｉ／Ｋｉ）＋［Ｓ］）Ｋｍ＝９．１４±０．８）（挿入図）。活性型ＭＭＰ−９（２ｎＭの固定された濃度で）を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）において、ｍＡｂの不在下（黒丸）、あるいは、０．７μＭのｍＡｂの存在下（黒四角）または２μＭのｍＡｂの存在下（白丸）、３７℃で６０分間プレインキュベーションした。その後、蛍光発生ペプチド基質（Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２）を、０μＭ〜３０μＭの範囲で示される最終濃度（Ｓ）を達成するために加え、基質加水分解の初速度を、増大した蛍光の測定によって求めた。見かけのＫｍおよびＶｍａｘの値を、実験データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に対して適合化することによって得た。得られた値を、両軸逆数のＬｉｎｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを再構築するために使用した（交点が６Ｃ６によるＭＭＰ−９の競合的阻害を示す）。図１２Ｂ：種々のＭＭＰを様々な量のｍＡｂとプレインキュベーションした。残存酵素活性を、蛍光発生ペプチド基質（１０μＭ）を加えた後で測定した。Ｋｉを、競合的阻害の式に適合化することによって評価した（ｖｉ／ｖｏ＝Ｋｍ＋［Ｓ］／（Ｋｍ（１＋Ｉ／Ｋｉ）＋［Ｓ］）、Ｈｉｌａ細胞から精製された全長のＭＭＰ２についてはＫｍ＝２．４６±０．３４、ＭＴ１−ＭＭＰの触媒作用ドメインについてはＫｍ＝１６±１）。６Ｃ６の効果的な阻害がまた、全長のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を使用して検出された（データは示されず）。
【図１３】図１３は、変化がほとんどの場合に周辺ループに存在する活性部位の保存された全体的トポロジーを示す種々のＭＭＰの構造的重なりである。ＭＭＰ９（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）−シアン色、ＭＭＰ２（ＰＤＢ：１Ｑ１Ｂ）−マゼンタ色、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＰＤＢ：１ＢＵＶ）−オレンジ色、ＭＭＰ７（ＰＤＢ：１ＭＮＱ）−赤色、ＴＡＣＥ（ＰＤＢ：２Ｉ４７）−黄色。保存されたヒスチジンが棒状体として示され、触媒作用亜鉛イオンがオレンジ色の球として示される。注目すべきことに、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の周辺ループの全体的トポロジーは類似している。このことから、試験された酵素群において、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対する６Ｃ６の選択性を説明することができる。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、６Ｃ６が細胞表面ゼラチナーゼ活性を阻害することを示す蛍光顕微鏡写真である。阻害剤の不在下（図１４Ａ）、５μＭのｍＡｂの存在下（図１４Ｂ）、または、１５μＭのＳＢ−３ＣＴ（機構に基づいたナノモル濃度のゼラチナーゼ阻害剤）の存在下（図１４Ｃ）における、ＤＱ−ゼラチンで被覆されたカバースリップに置かれたＨＴ１０８０細胞の（インサイチュザイモグラフィアッセイによって得られる）代表的な蛍光顕微鏡写真。細胞表面ゼラチン分解活性が、ゼラチンを分解することによって放出される蛍光の大きさとしてアッセイされた。非処理の細胞は著しい細胞表面ゼラチナーゼ活性を示し（緑色）、この活性はｍＡｂの存在下で著しく阻害された。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける急性ＤＳＳ大腸炎の様々な症状発現に対する６Ｃ６処置の影響を例示するグラフである。疾患を５日間の２％ＤＳＳによって誘導した。６Ｃ６による処置（５または１．５ｍｇ／ｋｇマウス）を、０日目から開始して毎日のｉ．ｐ．注射によって施した。図１５Ａ：臨床スコアを、ＤＡＩ（これは、０〜４のスケールでの、体重、直腸出血および便の硬さの総合スコアである）を毎日モニターすることによって評価した。データが、６日目から１０日目までのそれぞれの動物について平均のドット分布として表される。図１５Ｂ：結腸の長さ。図１５Ｃ：死亡率。示されるデータは２つの実験の総合結果である（合計で群あたり１５匹のマウス）。＊、大腸炎非処置マウスを上回る有意な効果（ｐ＜０．０５）。
【図１６】図１６は、活性型ＭＭＰ９（黒色）および阻害されたＭＭＰ９−６Ｃ６複合体（赤色）の亜鉛Ｋ端におけるＸ線吸収分光法から得られる結果のグラフである。結果が亜鉛イオンからの動径分布の形態で表される。ＭＭＰ−９触媒作用ドメイン−ｍＡｂ複合体（赤色）の端位置が、活性型ＭＭＰ−９に対して高エネルギー側にシフトする（挿入図）。このことは、触媒作用亜鉛イオンへの結合を示している。Ｘ線分光法データの構造的分析は、６Ｃ６が亜鉛イオンと直接に結合し、五配位の亜鉛−タンパク質複合体を形成することを示している。注目すべきことに、この結合モードは、ＭＭＰの活性部位におけるＴＩＭＰの結合と類似している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、金属タンパク質の活性を阻害するために使用されることができる抗体およびそのフラグメントの発明である。特に、本発明の抗体は、バランスの崩れたマトリックスメタロプロテアーゼ活性に関連する疾患（例えば、多発性硬化症、自己免疫疾患、および転移性ガン）を処置するために使用されることができる。
【００４０】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００４２】
様々なマトリックスメタロプロテアーゼが、細胞増殖、分化、および、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングから、脈管形成および細胞遊走にまで及ぶ多くの生物学的プロセスに関与する。これらのプロセスでは、これらのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の様々な機能と、それらの生来的組織阻害剤（ＴＩＭＰ）との間における精巧なバランスが要求される。このバランスの喪失が、転移性腫瘍、神経変性疾患および変形性関節炎をはじめとする数多くの病理学的状態の顕著な特徴である。
【００４３】
数多くのＭＭＰ阻害剤がこの技術分野では知られており、これらには、小ペプチド阻害剤（例えば、ヒドロキサマート）、非微生物性テトラサイクリン類およびモノクローナル抗体が含まれる。前者は、製造費用が高いこと、分解性が高いこと、経口での生物学的利用能が低いこと、および、特異性がないことによって制限される一方で、後者はどれも、インビボでの治療効力が明らかにされていない。
【００４４】
本発明者らは、金属酵素の触媒作用部位の電子的決定基および構造的決定基の両方を認識する抗体がその強力な阻害剤として使用できることを以前に発見している。金属酵素の金属結合した触媒作用部位を模倣するハプテンを免疫原として使用することにより、高まった金属タンパク質の活性によって特徴づけられる臨床状態を処置するために使用することができる非常に効率的な治療用抗体を作製することができた（本発明者らのＷＯ２００４／０８７０４２を参照のこと）。
【００４５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＭＭＰにおける反応性亜鉛部位の局所的構造および立体配座をよく模倣する新規なハプテン化合物を設計した。この化合物は、Ｉｍｉｓｄｐと名づけられた［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタン（図１を参照のこと）であり、配位した３つのヒスチジンのアレイおよび水での亜鉛イオンによって誘導される四配位の幾何構造および類似する力場を模倣することができる。四面体に近い立体配座が、３つのイミダゾール塩基と、第４の配位子としての水分子とによって形成される。図２Ａは、亜鉛配位子の四面体型幾何構造を表すために改変されている、ＭＭＰ−９（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）の触媒作用部位とのＩｍｉｓｄｐ化合物の構築された３Ｄモデルの重なりを示す。改変には、Ｘ線構造において存在する配位子（ヒドロキサム酸系阻害剤）を水分子で置換すること、および、酵素全体を多層ＱＭ／ＭＮ法によって局所的極小にまで最適化することが含まれる（材料および方法を参照のこと）。高い類似性が、ＭＭＰ−９およびＩｍｉｓｄｐにおける計算されたヒスチジン亜鉛モチーフの間において、亜鉛イオンからのヒスチジンのε−窒素の距離（それぞれ、２．０４±０．０６および２．０２）に関して、また、金属に向かう３つのヒスチジンの相対的配向に関して存在する。
【００４６】
本明細書中以下において、および、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、マウスをＩｍｉｓｄｐで免疫化し、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９との交差反応性を有するＭＭＰ抗体についてスクリーニングしている。その抗体は６Ｃ６と名づけられた（図１０、および、下記の実施例の節の実施例１〜実施例２を参照のこと）。６Ｃ６は、ＭＭＰ−２／９と結合し、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２の活性を競合的に阻害すること（Ｋｉの範囲、１μＭ〜５μＭ）、および、ＭＴ１−ＭＭＰの活性を競合的に阻害すること（１５μＭのＫｉ）が見出された（下記の表４を参照のこと）。ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の結合および阻害が様々な生化学的および生物物理学的ツールによってインビトロおよびインサイチュにおいて明らかにされた（実施例４〜７および９を参照のこと）。重要なことに、６Ｃ６はＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の活性化形態とだけ結合する（実施例３および実施例８を参照のこと）。この酵素形態は、その酵素部分内に存在する触媒作用の亜鉛錯体を遮蔽するプロドメインを欠いている。本発明者らは、本発明の方法に従って作製された抗体がＭＭＰ−９にインビボにおいて結合できることを示した（図１１Ａ）。さらに、本発明者らは、本発明の抗体が、炎症性腸疾患を処置するための治療的可能性を含んだことを示した（実施例１０）。
【００４７】
まとめると、本発明の知見は、Ｉｍｉｓｄｐが、金属タンパク質の阻害剤を製造するための重要な試薬（プラットフォーム）として使用されること、また、６Ｃ６、ならびに、誘導されたペプチドおよびペプチド模倣体が有益な治療用ツールとして使用されることを裏付けている。
【００４８】
これらの結果により、これらの抗体を、個々のＭＭＰについての選択的なペプチド阻害剤をｍＡｂまたはそのフラグメントのファージディスプレイおよび点変異によって設計するためのプラットフォームとして使用することにおける可能性が明らかにされる。
【００４９】
従って、本発明の１つの態様によれば、一般式（Ｉ）を有する化合物が提供される：
式中、
ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；
Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；
Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；および
Ｒは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、
ただし：
ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；および
Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される。
【００５０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、化合物は、Ｉｍｉｓｄｐと名づけられた［２−（２−アミノエチルカルボモイル）−エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタンであり、一般式（ＩＩ）を有する：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【００５１】
Ｉｍｉｓｄｐの合成が下記の実施例の節の実施例７に記載される。
【００５２】
Ｉｍｉｓｄｐは、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２における反応性亜鉛部位の局所的構造および過渡的立体配座を模倣するので、金属タンパク質阻害剤を製造するために使用することができる。
【００５３】
従って、本発明の１つの態様によれば、金属タンパク質阻害剤を製造する方法が提供される。
【００５４】
本発明の方法は、上記化合物（すなわち、Ｉｍｉｓｄｐ）に向けられた抗体または抗体フラグメントを作製することによって行われる。下記の実施例の節の実施例１〜２ならびに「材料および方法」の節を参照のこと。
【００５５】
本発明の「金属タンパク質」は、金属結合部位が酵素の触媒作用ドメインの一部を形成し、ただし、この金属結合部位がＩｍｉｓｄｐの金属結合部位と電子的および構造的の両方で類似する、金属が結合したタンパク質を示す。
【００５６】
本発明のこの態様の金属タンパク質は好ましくは、メタロプロテアーゼ、すなわち、ＭＭＰ（例えば、ゼラチナーゼ、例えば、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）である。
【００５７】
ＭＭＰファミリーのすべてのメンバーは、活性化されたとき、活性部位における金属イオンが基質結合のために利用可能である活性型酵素に変換される潜在型酵素として翻訳されることが理解される。例えば、「システインスイッチモデル」が、ＭＭＰのインビトロ活性化を説明するために以前に提案されている。このシステインスイッチモデルでは、活性化されたとき、隠れている亜鉛結合部位が、チオール（Ｃｙｓ）保有プロペプチドの亜鉛原子からの解離によって触媒作用の亜鉛結合部位に変換されることが提案される。プロペプチドの切断は酵素のプロドメイン構造の分解をもたらし、触媒作用亜鉛イオンの遮蔽がなくなる。結果として、金属イオンおよび活性部位ポケットが基質の結合および加水分解のために利用可能となる［Ｖａｎ ＷａｒｔおよびＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、５５７８〜５５８２］。
【００５８】
本発明の教示に従って作製される抗体および抗体フラグメントは、触媒作用亜鉛部位内の金属イオンおよび配位しているアミノ酸の両方と結合することができ、それにより、上記のような病理学的プロセスに直接に関与するこれらの酵素の活性型立体配座を特異的に阻害することができるために、ＭＭＰの強力な阻害剤として役立つ。
【００５９】
本明細書で使用される用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味し、表現「抗体フラグメント」はその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを意味する。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（ｉｉ）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（ｉｉｉ）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（ｉｖ）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（ｖ）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；そして（ｖｉ）ペプチドは単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする。
【００６０】
抗体（即ちモノクローナルおよびポリクローナル抗体）を作製する方法は当該技術分野では周知である。抗体は当該技術分野で知られたいくつかの方法のいずれか一つを介して作製されることができ、これらの方法（Ｏｒｌａｎｄｉ Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９）に開示されるように抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリーまたは極めて特異的に結合する試薬のパネルのスクリーニングを用いることができるかまたは培養中の連続細胞系によるモノクローナル抗体分子の生成を用いることができる。これらはハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ−Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，Ｋｏｚｂｏｒ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２，Ｃｏｔｅ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０，Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）を含むがこれらに限定されない。
【００６１】
本発明の化合物が小さすぎて、強い免疫原応答を誘発することができない場合、そのような抗原（ハプテン）は、抗原的に中性な担体（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミン［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］などの担体）にカップリングすることができる（米国特許第５１８９１７８号および同第５２３９０７８号、ならびに、実施例の節の実施例２を参照のこと）。担体へのカップリングを、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングを行うことができ、必要に応じて、その後、形成されたイミノ連結の還元を行うことができる。代替では、担体を、縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤）を使用してカップリングすることができる。リンカー化合物もまた、そのようなカップリングを行うために使用することができる；ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの両方が、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手可能である。得られる免疫原性複合体を、その後、好適な哺乳動物被験体（例えば、マウス、ウサギなど）に注射することができる。好適なプロトコルでは、血清における抗体の産生を増強させるスケジュールに従ったアジュバントの存在下における免疫原の繰り返される注射が伴う。免疫血清の力価を、この技術分野では広く知られている様々な免疫アッセイ手法を使用して容易に測定することができる。
【００６２】
得られた抗血清はそのまま使用することができ、または、モノクローナル抗体を、本明細書において上記されるように得ることができる。
【００６３】
抗体フラグメントを、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して得ることができる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８を参照のこと。これは参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、本発明による抗体フラグメントを抗体のタンパク質分解的加水分解によって調製することができ、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。
【００６４】
あるいは、抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５６も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
【００６５】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
【００６６】
ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【００６７】
ヒトの治療または診断のためにはヒト化された抗体を用いることが好ましいことは理解されるであろう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【００６８】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【００６９】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【００７０】
いったん抗体が得られると、それらは、金属タンパク質阻害活性について試験されることができる。金属タンパク質阻害活性についての適切なアッセイ条件は、Ｋｎｉｇｈｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９６（３）：２６３−２６６（１９９２）、Ｃａｗｓｔｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９９：３４０−３４５（１９７９）、Ｃａｗｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８０：７７１（以下参照）（１９８１）；Ｃａｗｓｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９５：１５９−１６５（１９８１）、Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３９：１１８４−１１８７（１９８４）、ならびに米国特許第４７４３５８７号および同第５２４０９５８号に記載される。
【００７１】
述べられたように、上記の方法論を使用して、本発明者らは、６Ｃ６と名づけられた、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９についてのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害性抗体を作製することができた。その配列が配列番号１において提供される。ＣＤＲ配列が、配列番号７、８、９、１０、１１および１２において提供される。
【００７２】
従って、本発明は、その金属タンパク質阻害活性（金属タンパク質の触媒活性の特異的な阻害）が保持される限り、上記ＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む任意の（ポリ）ペプチド配列、ならびに、そのホモログおよびフラグメントを提供する。そのようなポリペプチドの一例が抗体である（上記参照）。
【００７３】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【００７４】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００７５】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００７６】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、Ｔｉｃ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、フェニルイソセリン、トレオニノール、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００７７】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００７８】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００７９】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば、合成アミノ酸、表２）が示される。
【００８０】
【００８１】
目的のメタロプロテアーゼに対する改良された親和性または高められた生物学的活性を有するペプチドは、ファージディスプレイおよびコンピュータを利用した生命工学を含む当該分野において周知の方法によって作製されることができる。
【００８２】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成されることができる。固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に、および、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９７３）「Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出されうる。古典的な溶液合成の概括については、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｇ．およびＬｕｐｋｅ，Ｋ．（１９６５）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００８３】
上記ポリペプチド配列をコードする核酸配列もまた意図される（配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８を参照のこと）。
【００８４】
本明細書において上記のように、本発明の抗体のための１つの具体的な使用は、金属タンパク質（例えば、メタロプロテアーゼ）のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患の防止または処置である。
【００８５】
そのような疾患の例には、関節炎疾患、例えば、変形性関節炎（ＯＡ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、化膿性関節炎、軟部組織リウマチ、多発性軟骨炎および腱炎；転移性腫瘍、歯周疾患；角膜潰瘍、例えば、アルカリ熱傷または他の熱傷によって誘導される角膜潰瘍、放射線によって誘導される角膜潰瘍、ビタミンＥ欠乏症またはレチノイド欠乏症によって誘導される角膜潰瘍；腎糸球体疾患、例えば、タンパク尿、栄養障害性表皮水疱症；骨再吸収疾患、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症およびコレステリン腫；排卵または着床を防止することによる産児制限；腫瘍成長に関連するか、または、糖尿病網膜症もしくは黄斑変性に伴う血管新生に関連する血管形成；アテローム性動脈硬化プラークの破裂に伴う冠状動脈血栓症；肺気腫、創傷治癒およびＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
実施例１０において例示されるように、本発明者らは、本発明の抗体が、過敏性腸疾患を処置するために使用され得ることを示している。
【００８７】
過敏性腸疾患（ＩＢＤ）は、頻度が増大し、患者を無能力化することがある腸の炎症および組織リモデリングによって特徴づけられる重篤な胃腸障害である。ＩＢＤの主要の形態、すなわち、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病は、腹部の痛み、下痢、直腸出血および発熱によって臨床的に特徴づけられる慢性の再発する状態である。
【００８８】
従って、本発明の別の態様によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ活性をその必要性のある対象において阻害する方法が提供される。
【００８９】
本発明による好ましい個体対象は、動物、例えば、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類）であり、好ましくはヒトである。
【００９０】
本発明の方法は、対象に本発明のＭＭＰ阻害剤（すなわち、本明細書において上記される抗体または抗体フラグメント）の治療有効量を与えることを含む。
【００９１】
本明細書において以下でさらに詳述されるように、ＭＭＰ阻害剤を直接的な投与（例えば、経口投与または注射）によって与えることができ、または、ＭＭＰ阻害剤を、個体の標的細胞に投与されるポリヌクレオチド構築物から発現させることができる。
【００９２】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、それ自体で、または、医薬的に許容され得る担体と混合される医薬組成物の一部として個体に与えることができる。
【００９３】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００９４】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができる抗体調製物を示す。
【００９５】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。医薬的に許容され得る担体に含まれる成分の１つは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができ、これは有機媒体および水性媒体の両方における広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーである（Ｍｕｔｔｅｒ他（１９７９））。
【００９６】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９７】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９８】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【００９９】
あるいは、例えば、患者の身体の組織領域に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与することができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１０１】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１０２】
注射の場合、本発明の医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１０３】
経口投与の場合、化合物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、本発明の化合物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１０４】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０１０５】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１０６】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１０７】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１０８】
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１０９】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１１０】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１１１】
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１１２】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０１１３】
治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１４】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１１５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
【０１１６】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１１７】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１１８】
適合可能な医薬的担体中に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、調製され、適切な容器に入れられ、示される状態の処置についてラベル書きされることができる。
【０１１９】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。
【０１２０】
本明細書において上記のように、本発明の抗体阻害剤を核酸構築物から発現させることができる。
【０１２１】
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは好ましくは、目的とする細胞内局在化または細胞外局在化への抗体の分泌または輸送を可能にするシグナルペプチドをさらにコードすることが理解される。例えば、標的の金属タンパク質がＭＭＰであるとき、分泌シグナルペプチドが好ましくは、抗体セグメントをコードするポリヌクレオチドに対して読み枠を合わせてコンジュゲートされる。
【０１２２】
完全な抗体分子と比較した場合、そのそれほど複雑でない構造のために、組換え単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメントが好ましくは発現され得ることがさらに理解される。本明細書において上記のように、ＳｃＦｖは、ＶＬのカルボキシル末端がＶＨのアミノ末端にペプチド架橋によって連結される１つの鎖として合成されるＶＬおよびＶＨの抗体ポリペプチド鎖からなるタンパク質である。これらのペプチドを組換え製造するための様々な方法がこの技術分野では広く知られている［Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；およびｄｅ Ｋｒｕｉｆ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７〜１０５（１９９５）を参照のこと］。本発明のこの態様の実施形態によれば、本発明の化合物による免疫化の後、脾臓のｍＲＮＡが免疫化動物から集められ、ＳｃＦｖフラグメントを呈示するバクテリオファージにおけるｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される。その後、ファージ粒子が、目的の金属タンパク質の活性化形態と特異的かつ好ましくは相互作用するファージ粒子を明らかにするためにスクリーニングされる。ＳｃＦｖセグメントがこれらのファージ粒子から回収され、発現構築物にクローン化される（米国特許第５８００８１４号を参照のこと）。
【０１２３】
本発明のこの態様の核酸構築物は個体対象の標的細胞に投与することができる（すなわち、インビボ遺伝子治療）。
【０１２４】
代替として、核酸構築物は、必要に応じて適切な遺伝子送達ビヒクル／遺伝子送達方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、個体に戻される（すなわち、エキソビボ遺伝子治療）。
【０１２５】
本発明の抗体または抗体フラグメントの細胞発現を可能にするために、本発明の核酸構築物はさらに、少なくとも１つのシス作用する調節エレメントを含む。本明細書で使用される表現「シス作用する調節エレメント」は、トランス作用する調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列（好ましくは、プロモータ）を示す。
【０１２６】
利用可能なプロモータはどれも、本発明の方法論によって使用することができる。本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物によって利用されるプロモータは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞タイプ特異的および／または組織特異的なプロモータの例には、肝臓特異的であるアルブミン［Ｐｉｎｋｅｒｔ他（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７］、リンパ系特異的プロモータ［Ｃａｌａｍｅ他（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５］、具体的には、Ｔ細胞受容体のプロモータ［Ｗｉｎｏｔｏ他（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９〜７３３］および免疫グロブリンのプロモータ［Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３７２９〜７４０］、ニューロン特異的プロモータ（例えば、神経フィラメントプロモータ［Ｂｙｒｎｅ他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３〜５４７７］）、膵臓特異的プロモータ［Ｅｄｌｕｎｃｈ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６］または乳腺特異的プロモータ（例えば、乳清プロモータ（米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願公開第２６４１６６号））などのプロモータが含まれる。本発明の核酸構築物はさらにエンハンサを含むことができ、エンハンサは、プロモータ配列に隣接して、または、プロモータ配列から遠位に存在することができ、プロモータからの転写をアップレギュレーションすることにおいて機能することができる。
【０１２７】
本発明の方法論の構築物は好ましくは、適切な選択マーカーおよび／または複製起点をさらに含む。好ましくは、利用される構築物はシャトルベクターであり、シャトルベクターは、大腸菌においてともに増殖することができ（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）、また、細胞における増殖、または、選ばれた遺伝子および組織における組み込みのための適合性を有する。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が可能である。
【０１２８】
現時点で好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物によるトランスフェクション、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩ型ウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）によるトランスフェクション、および、脂質に基づくシステムによるトランスフェクションが含まれる。遺伝子の脂質媒介移入のための有用な脂質が、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好まれる構築物がウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物）は、少なくとも１つの転写プロモータ／エンハンサまたは位置規定エレメント、あるいは、他の手段（例えば、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾）によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在する場合を除いて、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されるウイルスに対して適切である正鎖プライマー結合部位および負鎖プライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は典型的には、ペプチドまたは抗体を、構築物が置かれている宿主細胞から分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列である。必要な場合には、構築物はまた、ポリアデニル化を行わせるシグナル、同様にまた、１つまたは複数の制限部位および翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部を含む。非ウイルス性である他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマー）。
【０１２９】
遺伝子治療プロトコルを実行するための好ましい方法が、ＳｏｍｉａおよびＶｅｒｍａ［（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１：９１〜９９］、Ｉｓｎｅｒ（２００２）、Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ、４１５：２３４〜２３９；Ｈｉｇｈ（２００１）Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：２００１年展望、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ７：２３〜２７；ＨａｍｍｏｎｄおよびＭｃＫｉｒｎａｎ（２００１）Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．４９：５６１〜５６７において提供される。
【０１３０】
本発明の抗体は金属タンパク質の活性化形態を示差的に認識することができるので（実施例の節の実施例３を参照のこと）、本発明の抗体は、例えば、ＭＭＰ活性を生物学的サンプル［すなわち、任意の身体サンプル、例えば、血液（血清または血漿）、喀痰、腹水、胸膜滲出液、尿、生検試料、単離された細胞および／または細胞膜調製物］においてモニターすることなどによって強力な診断ツールおよび予後ツールとして使用することができる。このことは、ＭＭＰのバランスの崩れた活性化が腫瘍の侵入を促進させるガン細胞の転移特徴を評価するとき、特に重要である。同様に、本発明の抗体は、ＭＭＰ阻害剤の治療的投薬をモニターする際に使用することができる。そのような適用のために、本発明の抗体は好ましくは、この技術分野における標準的使用である何らかの、放射性、蛍光性、生物学的または酵素的なタグまたは標識のそれぞれにより標識される。そのような標識の使用に関する米国特許には、米国特許第３８１７８３７号、同第３８５０７５２号、同第３９３９３５０号、同第３９９６３４５号、同第４２７７４３７号、同第４２７５１４９号および同第４３６６２４１号が含まれる。
【０１３１】
そのような検出方法はまた、新規なＭＭＰのハイスループットスクリーニングのために使用できることが理解される。簡単に記載すると、多数の生物学的サンプルを本発明の抗体と接触させることができ、この場合、活性化されたＭＭＰが本発明の抗体に結合することができる。様々な対策が、活性化されたＭＭＰ（例えば、腫瘍細胞株に由来する活性化されたＭＭＰ）を含む生物学的サンプルを使用するために取られる。典型的には、放射性標識が、アッセイ体積を少なくするために使用される。
【０１３２】
代替では、本発明の抗体は、活性な金属酵素を生物学的サンプルから精製するために使用することができる。
【０１３３】
数多くのタンパク質精製方法がこの技術分野では知られている。例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントは、金属酵素を単離するためにアフィニティクロマトグラフィにおいて使用することができる。様々なカラムを調製することができる。この場合、抗体が固体の基体（例えば、粒子、例えば、アガロースおよびＳｅｐｈａｄｅｘ）に連結され、生物学的サンプル（例えば、細胞溶解物）をカラムに通すことができ、カラムを洗浄した後、穏和な変性剤の濃度を増大させ、それにより、精製された金属酵素が放出される。
【０１３４】
本発明の教示に従って作製された抗体またはそのフラグメントは診断キットまたは治療キットに含めることができる。抗体または抗体フラグメントは、適切な緩衝液および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰めることができ、診断のために、または、治療的処置を導くために使用することができる。
【０１３５】
従って、抗体またはそのフラグメントは、それぞれを１つの容器において混合することができ、または、個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は様々な材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）から形成され得る。
【０１３６】
加えて、他の添加剤（例えば、安定剤、緩衝剤およびブロッキング剤など）を加えることもできる。そのようなキットの抗体はまた、固体の支持体（例えば、ビーズおよびアレイ基体（例えば、チップ）など）に結合させることができ、診断目的のために使用することができる。キットはまた、試験された対象が、目的とするＭＭＰの発現に関連する状態、障害または疾患に罹患しているか、あるいは、目的とするＭＭＰの発現に関連する状態、障害または疾患を発症する危険性があるかを明らかにするための説明書を含むこともできる。
【０１３７】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１３８】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なお、これら実施例によって本発明は限定されない。
【０１３９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が広く含まれている。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，バルチモア，メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用されるものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４０】
材料および方法
組換え酵素。ＭＭＰ−２の触媒作用ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３２６３６．１のアミノ酸１１０〜４６７）をＢＬ−２１細胞においてＴ７プロモータのもとで発現させた。細胞を１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより５時間誘導した。細胞ペレットを、緩衝液対初発培養体積の１：２５の比率で、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロールおよび１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００に再懸濁した。懸濁物を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロールおよび０．２％のＳａｒｋｏｓｙｌに溶解し、その後、氷上で３０分間インキュベーションした。上清画分を、事前に平衡化された５ｍｌのゼラチン−セファロースカラム（事前に充填されたもの、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、透析緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０２％ Ｂｒｉｊ）により洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２、０．０２％のＢｒｉｊおよび１５％のＭｅ２ＳＯにより溶出し［Ｒｏｓｅｎ，Ｏ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＭＰｓ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２００１］、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してアッセイし、その触媒活性を蛍光発生ペプチドの分解によって測定した［Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．Ｇ．、Ｆ．ＷｉｌｌｅｎｂｒｏｃｋおよびＧ．Ｍｕｒｐｈｙ、Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｓｓａｙｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９２、２９６（３）：ｐ．２６３〜６］。
【０１４１】
Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９［これはヒンジ領域およびヘモペキシンドメインを欠く。Ａｌａ１〜Ｇｌｙ４２４｜Ｐ１４７８０｜ＭＭＰ９＿ＨＵＭＡＮマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体（ＭＭＰ−９）（ＥＣ３．４．２４．３５）］を、以前に記載されたようにｐＴＷＩＮ発現ベクターで大腸菌ＥＲ２５６６において発現させ、封入体から均一に精製した［Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｍ．、Ｐ．ＨｅｉｋｋｉｌａおよびＥ．Ｋｏｖｉｖｕｎｅｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｂｌｏｃｋｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（２８）：ｐ．２９５８９〜９７］。Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９を、２００ｍＭのＴｒｉｓに溶解された１ｍＭの酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、米国）により３０分間、３７℃で活性化した。
【０１４２】
ヒトの組換えｐｒｏ−ＭＭＰ−２および組換えｐｒｏ−ＭＭＰ−９を、以前に記載されたように、対応する組換えワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ Ｓ３細胞において発現させ、均一に精製した［Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｗ．、Ｇｅｒｖａｓｉ，Ｄ．Ｃ．、Ｍｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．およびＦｒｉｄｍａｎ，Ｒ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２９９７５〜２９９８３；Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｒ．、Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．、Ｈｏｙｈｔｙａ，Ｍ．、Ｏｅｌｋｕｃｔ，Ｔ．Ｍ．、Ｋｒａｕｓ，Ｓ．、Ｋｏｍａｒｅｋ，Ｄ．、Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．、Ｂｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＳｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１５３９８〜１５４０５］。
【０１４３】
テトラ−カルボキシフェニルポルフィリンＣｏ（ＩＩ）／Ｚｎ（ＩＩ）（ＣｏＴＣＰＰ／ＺｎＴＣＰＰ）。ＺｎＴＣＰＰを、記載のように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、ＺｎＣｌ２とＴＣＰＰとの反応によって合成した［Ｈａｒａｄａ，Ａ．他、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ ｂｙ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、１９９９、７０（３）：ｐ．２９８〜３０２］。ＣｏＴＣＰＰを、記載のように、ＤＭＦ中、Ｃｏ（ＯＡｃ）２・４Ｈ２ＯとＴＣＰＰとの反応によって合成し［Ｈａｒａｄａ，Ａ．他、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ ｂｙ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｚｉｎｃ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、１９９９、７０（３）：ｐ．２９８〜３０２］、精製した。
【０１４４】
Ｉｍｉｓｄｐの合成。以下の実施例７に記載される。
【０１４５】
タンパク質へのハプテンのコンジュゲート化。ハプテン（４ｍｇ）を、ＤＭＦ中１，１’−カルボニルジイミダゾールを（１：１のモル比で）加え、１時間インキュベーションすることによってコンジュゲート化のために活性化した。１〜５０μモルの活性化ハプテンを０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ８）中２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に加えた。溶液を室温で３時間撹拌し、その後、ＰＢＳに対して徹底的に透析した。
【０１４６】
免疫化および融合。アジュバント（ＫＬＨ）コンジュゲート化ＣｏＴＣＰＰ、アジュバント（ＫＬＨ）コンジュゲート化ＺｎＴＣＰＰまたはアジュバント（ＫＬＨ）コンジュゲート化Ｉｍｉｓｄｐのそれぞれを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。免疫化およびＮＳＯミエローマ細胞株へのその後の融合を標準的なプロトコルに従って行った［Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．１、１９９８］。
【０１４７】
抗体スクリーニング
ＥＬＩＳＡ。成長中のハイブリドーマの上清を、それぞれのハプテン−ＢＳＡ（ＰＢＳにおいて３μｇ／ｍｌ）がＮｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに被覆された直接的ＥＬＩＳＡを使用して、ＺｎＴＣＰＰ、ＣｏＴＣＰＰまたはＩｍｉｓｄｐとの反応性を有する抗体についてスクリーニングした。被覆を４℃で一晩行い、抗体とのインキュベーションを２０℃で１時間行った。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用し、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸、ＡＢＴＳ、Ｓｉｇｍａ）を基質として使用した。０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を洗浄試薬として使用した。希釈緩衝液はＰＢＳであった。Ａ６０２を、ＳＰＥＣＴＲＡＦｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ分光計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）におけるマイクロプレートリーダーによって記録した。コントロールとして、上清を同じ様式でＢＳＡ被覆プレートとインキュベーションした。０．５ミリ光学濃度を超える吸光度値を陽性と見なした。
【０１４８】
競合的ＥＬＩＳＡ。異なる希釈度のハイブリドーマ上清を、以前に記載された工程に従ってハプテン−ＢＳＡ被覆プレートとインキュベーションした。力価測定曲線をプロットし、力価希釈度を５０％の結合において求めた。力価濃度に希釈された上清を、以前に記載された工程に従って、可溶性のＺｎＴＣＰＰ化合物、ＣｏＴＣＰＰ化合物またはＩｍｉｓｄｐ化合物と３０分間プレインキュベーションし、その後、ハプテン被覆マイクロタイタープレートに移した。推定された解離定数は、５０％の結合を達成するために要求される可溶性ハプテンの濃度であった。
【０１４９】
産生および精製。選択されたハイブリドーマを限界希釈によって２回サブクローン化し、その後、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）により抗原刺激された腹水腫瘍が注入されたＢＡＬＢ／ｃマウスによる大規模産生を行った。ｍＡｂを、プロテインＧセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのアフィニティクロマトグラフィによって精製した。腹水を１２０００ｇで１５分間遠心分離して、不溶物粒子および脂質を除いた。１ｍＬの腹水をＰＢＳにより５倍の体積に希釈し、その後、５ｍＬのカラム体積のプロテインＧセファロースに負荷した。溶出ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１５０】
アイソタイプ決定。培養フラスコにおいて成長させたクローン化ハイブリドーマから得られた培養上清をｍＡｂの供給源として使用した。それぞれの抗体を、Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ＨｙＣｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂ．ｖ．、オランダ）によってアイソタイプ決定した。
【０１５１】
精製された抗体の免疫ブロット分析。精製された抗体を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＮＣ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、続いて、抗ＭＭＰ９抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用する免疫ブロット分析に供した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用した。シグナルを、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。
【０１５２】
精製されたタンパク質を使用する結合アッセイ。ｍＡｂ（１０μｇ）を抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とＰＢＳにおいて４℃で一晩インキュベーションした。非結合抗体を洗浄した後、精製されたＰｒｏ−ＭＭＰ−２、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２触媒作用ドメイン、ＭＴ１触媒作用ドメインまたはＴＡＣＥ（２μｇ）を加え、その後、ＲＴでの２時間のインキュベーションを行った。ビーズを遠心分離によって集め、ＰＢＳにより３回洗浄した。ビーズに結合したままであるタンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液により溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、クーマシーブルーによる染色によって検出した。
【０１５３】
免疫沈殿およびウエスタンブロット。ＨＴ１０８０細胞をペトリディッシュに播種した。８０％のコンフルエンスに達した後、培地（１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムおよびＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭ）を（ＦＣＳを含まない）無血清培地に変えた。さらに２４時間のインキュベーションの後、馴化培地（ＣＭ）を接着性細胞から集め、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して濃縮した。濃縮された上清を免疫沈殿のために使用した。ＣＭを抗−１（ＣｏＴＣＰＰ）ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）と４℃で一晩インキュベーションした。プロテインＡセファロース（ＣＬ−４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ）をサンプルに加え、ＲＴで２時間混合した。ビーズをＰＢＳにより３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液に懸濁し、９５℃に３分間加熱した。免疫沈殿物を遠心分離によって回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥに供した。分離後、タンパク質をニトロセルロース（ＮＣ）膜に転写し、抗ＭＭＰ−２抗体によりプローブ探査した。
【０１５４】
ＨＴ１０８０細胞によって産生されたＰｒｏＭＭＰ−２を活性化するために、１ｍＭの酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を濃縮ＣＭに加え、その後、３７℃での６時間のインキュベーションを行った。活性化の後、ＣＭを４℃でＰＢＳに対して（３回）透析して、ＡＰＭＡを除いた。活性化された培地による免疫沈殿を上記のように行った。
【０１５５】
直接的ＥＬＩＳＡを使用する活性型ＭＭＰ−９への結合。ＭＭＰ−９の触媒作用ドメイン（２μｇ／ｍｌ）をマイクロタイターのウエルにおいて固定化した。ｍＡｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡスクリーニングについて記載されたのと同じ手順に従ってウエルに加えた。抗ＭＭＰ−９抗体（Ｓｉｇｍａ）が陽性コントロールとして役立ち、腹水からアフィニティ精製された関係のないマウスＩｇＧが陰性コントロールとして役立った。
【０１５６】
速度論的アッセイ。ＭＭＰの酵素活性を以前に記載されるように測定した［Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他、Ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅｉｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６４６〜５４］。ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２およびＭＴ１−ＭＭＰの活性を、Ｋｎｉｇｈｔ他［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９２、２９６（３）：ｐ．２６３〜６］によって記載されるように、蛍光発生ペプチド（Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧから購入）の分解をλｅｘ＝３４０ｎｍおよびλｅｍ＝３９０ｎｍでモニターすることによって測定した。標準的なアッセイ混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０μＭ ＺｎＣｌ２および０．０５％Ｂｒｉｊを含有した。ＴＡＣＥの酵素活性を、蛍光発生ペプチドＱＦ−４５（Ｍｃａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ジニトロフェニル）−ＮＨ２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧから購入）の分解をモニターすることによって測定した。
【０１５７】
インサイチュザイモグラフィ。ＭＭＰの正味のゼラチン分解活性の所在をインサイチュザイモグラフィによって突き止めるために、分子内で消光されるフルオレセインイソチオシアネート標識のＤＱゼラチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）をゼラチナーゼによる分解のための基質として使用した。ゼラチナーゼによるタンパク質分解により、切断されたフルオレセインイソチオシアネート−ゼラチンペプチドが生じ、この蛍光の所在を突き止めることにより、正味のゼラチン分解活性の部位が示される。簡単に記載すると、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞（これは、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＴ１−ＭＭＰを産生する）を１２ｍｍのカバースリップに置床した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を１ｕＭの１３Ｅ１１ ｍＡｂにより３７℃で３０分間処理した。非処理の細胞がこの実験のための陰性コントロールとして役立った。細胞をＰＢＳにより洗浄し、その後、６０ｕｇ／ｍのＤＱゼラチンを含有するザイモグラフィ用反応緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２および０．２ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．６；高濃度のアジ化物は、ゼラチンが食作用されることを防止し、従って、細胞表面ゼラチン分解活性が生じることを可能にした）と３７℃で一晩インキュベーションした。ザイモグラフィ用反応緩衝液は、処理された細胞については１ｕＭのＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂを含有した。インキュベーション期間が終了したとき、固定処理またはさらなる洗浄を行うことなく、ＭＭＰのゼラチン分解活性の所在を突き止め、蛍光顕微鏡観察によって写真撮影し、画像をＳｐｏｔデジタルカメラによって取得した。
【０１５８】
実施例１
小さい有機金属化合物による亜鉛活性部位の立体配座模倣
ＭＭＰの活性部位における亜鉛イオンには、３つの保存されたヒスチジン残基が均一に配位する。チモーゲンの活性化および基質のタンパク質分解の間、亜鉛の配位が、触媒作用を有しない段階における四配位の四面体幾何構造から、触媒作用を有する段階における五配位の三角両錘型［Ａｕｌｄ，Ｄ．Ｓ．、Ｚｉｎｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ．Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ、２００１．１４（３−４）；ｐ．２７１〜３１３］に変化する。従って、保存されたヒスチジンは亜鉛イオンに関して様々な異なる幾何構造を取ることができる。これらの立体配座の見本を作製するために、２つの化合物を、亜鉛の環境を模倣するためのモデルとして選択した（ＩｍｉｓｄｐおよびＣｏ／ＺｎＴＣＰＰ、図１）。Ｉｍｉｓｄｐ化合物（合成が以下の実施例７に示される）は四配位の幾何構造を模倣することができる。この場合、四面体に近い立体配座が、３つのイミダゾール塩基と、第４の配位子としての水分子とによって形成される。
【０１５９】
図２Ａは、亜鉛配位子の四面体型幾何構造を表すために改変されている、ＭＭＰ−９（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）の触媒作用部位［Ｒｏｗｓｅｌｌ，Ｓ．他、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＭＰ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００２．３１９（１）：ｐ．１７３〜８１］とのＩｍｉｓｄｐ分子の構築された３Ｄモデルの重なりを示す。改変には、Ｘ線構造において存在する配位子（ヒドロキサム酸系阻害剤）を水分子で置換すること、および、酵素全体を多層ＱＭ／ＭＮ法によって局所的極小にまで最適化することが含まれる（材料および方法を参照のこと）。高い類似性が、ＭＭＰ−９およびＩｍｉｓｄｐにおける計算されたヒスチジン亜鉛モチーフの間において、亜鉛イオンからのヒスチジンのε−窒素の距離（それぞれ、２．０４±０．０６および２．０２）に関して、また、金属に向かう３つのヒスチジンの相対的配向に関して存在する。第２の分子、すなわち、Ｚｎ／ＣｏＴＣＰＰは、亜鉛またはその類似金属のコバルトと配位している４つのイミダゾール塩基が金属イオンに関して同一平面の立体配座にある［Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｅ．Ｄ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ．１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ（ｍｅｓｏ−Ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏ）ｃｏｂａｌｔ （ＩＩ）．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ＳＯＣ、１９８１、１０３（１７）：ｐ．５０８７〜５０９５］。この立体配置は、金属が、錐体の底面を形成する２つのヒスチジンとほとんど同一平面である五配位の三角両錘型幾何構造における３つのヒスチジンのうちの２つの立体配座を模倣する。図２Ｂは、亜鉛に５つの配位子（２つのさらなる配位子がヒドロキサム酸系阻害剤によって与えられる）が配位するＭＭＰ−９の結晶構造（ＰＤＢ：１ＧＫＣ）を示す。錐体の底面における２つのヒスチジンの配向、および、亜鉛イオンからのそれらの距離（ＭＭＰ−９、ＺｎＴＣＰＰおよびＣｏＴＣＰについてそれぞれ、２．２±０．０２、２．０３±０．０４および１．９５）が、Ｃｏ／ＺｎＴＣＰＰ分子と匹敵する。
【０１６０】
実施例２
モノクローナル抗体の作製および選抜
ＣｏＴＣＰＰ、ＺｎＴＣＰＰおよびＩｍｉｓｄｐ（図１）に対するモノクローナル抗体を、マウスの免疫化、および、それぞれの化合物を被覆抗原とするＥＬＩＳＡスクリーニングによる特異的な抗体の選抜によって作製した。３つの抗体を広範囲にわたる研究のために選択した。注目すべきことに、これらのクローンは、競合的ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいて、最も良い親和性をそれらの免疫化用ハプテンに対してそれぞれ示したために選ばれた。それらの結合定数は０．０１μＭ〜０．０９μＭの範囲にあり（表３、下記）、高親和性ｍＡｂに特徴的である。ｍＡｂをマウスにおける腹水として増殖させ、プロテインＧビーズにより精製した。
【０１６１】
【０１６２】
実施例３
モノクローナル抗体はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と交差反応する
ＭＭＰの触媒作用部位における亜鉛ヒスチジンの立体配座を模倣する合成化合物に対して惹起されたｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性部位内の露出した亜鉛ヒスチジンモチーフと交差反応するかどうかを明らかにするために、モノクローナル抗体を最初に、直接的ＥＬＩＳＡを使用してＭＭＰ−９と結合することについてスクリーニングした。
【０１６３】
３つのｍＡｂが、マイクロタイタープレートのウエルに直接に吸着させたＭＭＰ−９の触媒作用ドメインと結合した（市販の抗ＭＭＰ−９抗体が陽性コントロールとして役立ち、関連性のないＩｇＧが陰性コントロールとして役立った）。興味深いことに、腹水としてマウスにおいて増殖させられているｍＡｂが、マウスの腹水に存在する活性型ＭＭＰ−９と同時に精製された。抗ＭＭＰ−９抗体を一次抗体として用いた精製抗体だけのウエスタンブロット分析は、活性型ＭＭＰ−９についての約８２ＫＤａの予想される分子量に対応する明瞭なバンドを示した。従って、ｍＡｂは天然型酵素とインビボで複合体を形成した。
【０１６４】
次に、モノクローナル抗体を、免疫親和性に基づくアッセイを使用してＭＭＰ−２と結合することについてスクリーニングした。抗体をＭＭＰ−２の触媒作用ドメイン（ＭＭＰ−２ｃａｔ）とインビトロでインキュベーションし、その後、抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズにより捕らえた。図３Ａが示すように、すべてのｍＡｂがＭＭＰ−２ｃａｔと結合した。
【０１６５】
結合が活性部位との直接的な相互作用を介して生じることを明らかにするために、ｍＡｂを、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２およびＰｒｏ−ＭＭＰ−９と結合するその能力について分析した。潜在型酵素では、プロドメイン構造により、触媒作用裂溝が隠される。従って、ｍＡｂが活性部位内のヒスチジン亜鉛モチーフを認識するならば、活性部位をプロドメイン構造によって阻止することは、ｍＡｂが結合することを妨げるにちがいない。同じ条件下で、プロ酵素への結合が検出されなかった（図３Ｂ）。活性型ＭＭＰ−２に結合し、しかし、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２には結合しないこの様式を、全長の天然型ＭＭＰ−２がヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）の細胞培養物によって分泌されるインビボの同様な環境でさらに検討した。抗ＣｏＴＣＰＰ抗体とのＨＴ１０８０馴化培地の免疫沈殿、それに続く、ウエスタンブロット分析では、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２に対してではなく、活性型ＭＭＰ−２に対する結合が示された（図３Ｃ）。これらの結果は、３つの抗体のすべてがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と交差反応することを明らかにする。活性部位裂溝の露出が抗体結合のために不可欠であり、このことから、ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性部位と直接に相互作用することが確認される。
【０１６６】
実施例４
抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂおよび抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂはＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９をインビトロにおいて阻害する
抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍａｂおよび抗ＣｏＴＣＰＰ ｍａｂが、マイクロモル濃度の範囲でＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のタンパク質分解活性を阻害した（図５）。ｍＡｂによるＭＭＰの阻害の速度論的分析を、消光された蛍光性ペプチド基質を用いた連続蛍光測定アッセイで行った。驚くべきことに、抗ＺｎＴＣＰＰ ｍＡｂは阻害作用を示さなかった。
【０１６７】
抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂによる阻害の本質を明らかにするために、実験を、酵素を異なる濃度の蛍光性ペプチド基質とともにｍＡｂの存在下または不在下で使用して行った。図４Ａ〜Ｂに示されるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにおいて示されるデータは競合的阻害プロフィルに特徴的であり、Ｋｉ値が、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２についてそれぞれ、１３μＭおよび２４μＭである。この競合的阻害プロフィルは、ｍＡｂがペプチド基質と同じ部位に結合したことを示していた。この阻害様式は、活性部位との直接的な相互作用のさらなる証明である。注目すべきことに、抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対する濃度依存的な阻害作用を示し、競合的阻害を仮定すると、計算されたＫｉは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対してそれぞれ、５．８μＭおよび３μＭである（図５）。ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の結合部位を認識するので、ｍＡｂとＭＭＰとの間における境界相補性のさらなる最適化が、構造的および静電的の両方で、親和性成熟法（Ｐａｕｌ Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．６、２００６、３４３〜３５７）によって達成可能である。この方法を使用することにより、活性部位の内側または外側のどちらかに存在する特異性特徴を利用する非常に特異的な阻害剤がもたらされ得る。
【０１６８】
実施例５
インサイチュザイモグラフィ
抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂの阻害活性を細胞レベルで確認するために、この抗体の影響を、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を構成的に分泌するヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞のゼラチン分解活性についてインサイチュザイモグラフィによって調べた。ＭＭＰのゼラチン分解活性の所在をインサイチュザイモグラフィによって突き止めるために、分子内で消光されるフルオレセインイソチオシアネート標識ゼラチン（ＤＱ−ゼラチン）を基質として使用した。ゼラチナーゼによるタンパク質分解により、切断されたフルオレセインイソチオシアネート−ゼラチンペプチドが生じ、この蛍光の所在を突き止めることにより、正味のゼラチン分解活性の部位が示される。
【０１６９】
非処理のヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞（図７Ａ）は著しい細胞表面ゼラチン分解活性を示した。１μＭのｍＡｂの存在下において（図７Ｂ）、ゼラチナーゼ活性が、コントロール細胞において観測されるゼラチナーゼ活性と比較して低下した。これらの結果は、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂがＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を細胞レベルで阻害したことを明らかにする。
【０１７０】
実施例６
本発明のｍＡｂの選択性
抗体の選択性を、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）およびＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）（関連したＡＤＡＭ（ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ファミリーに属する亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ−１７））に対する抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂおよび抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂの結合作用および阻害作用を調べることによって試験した。ＭＴ１−ＭＭＰおよびＴＡＣＥに対する阻害作用を適切なペプチド基質によるインビトロ蛍光酵素活性アッセイによって試験した。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂは、ＭＴ１−ＭＭＰまたはＴＡＣＥに対する阻害作用を全く示さなかった。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂが、結果としての阻害を伴うことなく、ＴＡＣＥおよびＭＴ１−ＭＭＰと結合するかどうかを明らかにするために、免疫親和性に基づく実験を、精製された酵素を用いて行った。しかしながら、結合が検出されなかった。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂとは対照的に、抗Ｉｍｉｓｄｐ ｍＡｂはＭＴ１−ＭＭＰを阻害し、Ｋｉ値が１０μＭであり、しかし、ＴＡＣＥに対する阻害作用を示さなかった。結果が下記の表４に示される。
【０１７１】
【０１７２】
活性部位における高い構造的類似性がＭＭＰファミリーのメンバーおよびＴＡＣＥの間に存在する。具体的には、亜鉛結合部位を取り囲む三次元での構造的要素が、基質のペプチド骨格を受け入れる必要があるために、また、保存された亜鉛結合モチーフ（ＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ）が存在することのためにほぼ同一である［Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他、Ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅｉｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６４６〜５４；Ｌｉｋａｃｏｖａ，Ｖ．他、Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ：、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２００５、４８（７）：ｐ．２３６１〜７９］。従って、ＭＭＰの間におけるｍＡｂ選択性は、保存されたヒスチジン亜鉛モチーフの認識にだけ基づいて予想されない。しかしながら、小さい分子量の合成阻害剤とは異なり、大きいタンパク質分子である抗体は、タンパク質の骨組中に埋もれる活性部位裂溝への進入が制限されているにちがいない。特に、ｍＡｂは、触媒作用亜鉛イオンと特異的に相互作用することが示されたので、亜鉛イオンが溶液に露出する程度が、抗体結合のために非常に重要であるにちがいない。ＭＴ１−ＭＭＰ、および、より大きな程度ではあるがＴＡＣＥは、それらの結晶構造によって示されるように、比較的埋もれた触媒作用の亜鉛イオンと相関づけられる深いＳ１ポケットによって区別される。活性部位の深さにおけるこの差により、抗体がＴＡＣＥに対する阻害作用を有しないことが説明されるかもしれない。これらの結果は、選択性が、触媒作用亜鉛イオンの露出の程度に基づいて達成され得ることを示唆する。ＭＭＰおよびＴＡＣＥを比較するときに考慮しなければならない別の重要な要因は、化学的性質（例えば、疎水性および極性）に関しての活性部位ポケットにおける違いである（図８を参照のこと）。例えば、ＴＡＣＥの活性部位は、極性がほとんどのＭＭＰの活性部位よりも著しく大きい。Ｓｏｌｏｍｏｎ他は、活性部位の極性におけるそのような変化が、触媒作用亜鉛イオンに対する活性部位のヒスチジンイミダゾール環の配向に直接に影響することを明らかにした［Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他、Ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅｉｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６４６〜５４］。
【０１７３】
抗ＣｏＴＣＰＰおよび抗Ｉｍｉｓｄｐの選択性を、関連性のない亜鉛依存性酵素、すなわち、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）およびブロッキイ（ｂｒｏｃｋｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＴｂＡＤＨ）とのそれらの交差反応性を試験することによってさらに検討した。活性型ＭＭＰと同様に、ＣＡは、３つのヒスチジン残基および１つの水分子に四面体型で配位する亜鉛イオンを含有し、ＴｂＡＤＨは、４つの異なるアミノ酸残基（ヒスチジン、システイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸）に四面体型で配位する触媒作用亜鉛イオンを含有する。適切なインビトロ機能的阻害実験、ならびに、免疫親和性に基づく類似する実験を、これらの酵素との交差反応性を調べるために行った。しかしながら、結合または阻害が検出されなかった。抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂもまた、関連した様々な生理学的ポルフィリン（例えば、ミオグロビンおよびヘモグロビンおよびビタミンに含まれるヘム基）とのその交差反応性について試験した。交差が、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、同様にまた、免疫親和性アッセイにおいて検出されなかった。
【０１７４】
カルボニックアンヒドラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼはすべてが、かなり埋もれた活性部位を有しており、同様に、ミオグロビンおよびヘモグロビンにおけるポルフィリン部分は露出していない。ビタミンＢ１２は金属を平面状イミダゾール構造の中心に含有しており、それにもかかわらず、軸方向の配位子がｍＡｂの結合を妨害しているかもしれない。まとめると、これらの結果は、抗ＣｏＴＣＰＰ ｍＡｂが、軸方向の金属配位残基を妨害することなく、比較的露出した金属−イミダゾール立体配置を認識することを裏付けている。
【０１７５】
実施例７
［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル］メタン亜鉛（ＩＩ）（３）の合成、図９
（ｉ）テトラ（２−ペンタクロロ−フェノキシカルボニル−エトキシメチル）メタンの合成：ペンタクロロフェノール置換テトラ−活性エステルの合成を、Ｈａｉｍ Ｗｅｉｚｍａｎｎ他（ＪＡＣＳ、１９９６、１１８、１２３６８〜１２３７５）の手法の場合と同様に行った。
【０１７６】
（ａ）モノ置換されたトリ活性エステルの調製：テトラ活性エステル（１）（１ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）およびＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（１００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解した。溶液を、トリエチルアミンにより約８のｐＨを維持しながら一晩撹拌した。溶液を濃縮し、ＣＨＣｌ３：酢酸エチル（９０：１０）によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、以下のものを得た（１５２ｍｇ、１５％の収率）。
【０１７７】
（ｂ）トリス（イミダゾール）の調製：モノ置換されたトリ活性エステル（１５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（３３μｌ、０．３９ｍｍｏｌ）を（２０ｍｌの）乾燥ＴＨＦに溶解し、室温で一晩撹拌した。白色の溶液を濃縮し、（０．０６３〜０．２００ｍｍ）のシリカをＣＨＣｌ３：メタノール（５０％〜９０％）とともに使用するカラムクロマトグラフィによって精製して、以下のものを得た（４５ｍｇ、４４％の収率）。
【０１７８】
（ｃ）遊離アミンを有するトリス（イミダゾール）（２）の調製：トリス（イミダゾール）（４０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）をジクロロメタンおよびトリフルオロ酢酸の（２：１）混合物６ｍｌに溶解し、１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、四塩化炭素とともに数回蒸発させ、高真空下で乾燥して、ＴＦＡを混合物から除いて、以下のものを得た（３０ｍｇ、８５％の収率、ｂ）。
【０１７９】
３．トリス（イミダゾール）−Ｚｎ（ＩＩ）錯体（３）の調製：化合物２（３０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を１ｍｌのメタノールに溶解した。これに、２滴〜３滴の１Ｎ ＮａＯＨ溶液およびＺｎＣｌ２（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を加え、半時間撹拌した。白色の沈殿物をろ過して、以下のものを得た（１２ｍｇ、３７％の収率）。
【０１８０】
［２−（２−アミノエチルカルボモイル）エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））エトキシメチル）メタン
【０１８１】
実施例８
６Ｃ６はゼラチナーゼの触媒作用部位と交差反応した
ある量の６Ｃ６が腹水から活性型ＭＭＰ９と同時に精製されていたことが発見された。検出可能な量のＭＭＰ９が、ｍＡｂを殖やすためにマウスにおいて誘導された腹水腫瘍に存在することが、ウエスタンブロットおよびゼラチンザイモグラフィによって明らかにされた（データは示されず）。ＭＭＰ９−抗体複合体を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィを使用してマウスの腹水から精製した（プロテインＧは抗体の定常ドメインに結合し、これにより、可変ドメインを、抗原と相互作用するために自由な状態にする）。図１１Ａに示されるように、同時精製されたＭＭＰ９が、精製６Ｃ６−ＭＭＰ９複合体を、市販されている抗ＭＭＰ９抗体を使用してウエスタンブロッティングすることによって検出された。プロドメインを欠く活性型ＭＭＰ９に対応する、約８２ｋＤａの分子量を有するバンドが特定された。このバンドは、同じ様式で精製および分析された関連性のないマウスｍＡｂコントロールでは検出されなかった。これらの結果は、６Ｃ６が内因性の活性なマウスＭＭＰ９との特異的なインビボ複合体を形成したことを示した。
【０１８２】
非常に相同的なＭＭＰ２酵素の活性型形態に対する結合についてさらに調べるために、類似した免疫沈殿実験をインビトロで行った。６Ｃ６を、精製されたＭＭＰ２触媒作用フラグメントと３：１のモル比でインキュベーションした。プロテインＡセファロースの免疫沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、活性なＭＭＰ２触媒作用フラグメントとの６Ｃ６の特異的な複合体の形成が明らかにされた（図１１Ｂ）。プロテインＡビーズは単独ではＭＭＰ２を免疫沈殿しなかった。次に、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の不活性なチモーゲン型（潜在型）形態に対する結合を試験した。すべてのＭＭＰが不活性型チモーゲンとして産生されるので、ＭＭＰは、活性部位を阻止するおよそ８０〜９０のアミノ酸のＮ末端プロペプチドを有する［Ｂｏｄｅ，Ｗ．およびＫ．Ｍａｓｋｏｓ、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００３．３８４（６）：ｐ．８６３〜７２］（図１１Ｄ）。ｐｒｏ−ＭＭＰ２およびｐｒｏ−ＭＭＰ９との免疫沈殿実験を類似した様式で行った。重要なことに、この抗体は潜在型酵素に結合しなかった（図１１Ｃ）。際立ったことに、６Ｃ６は、活性部位の亜鉛タンパク質複合体が溶液に露出する活性型酵素立体配座にだけ結合した。
【０１８３】
これらの結果から、６Ｃ６抗体（活性部位を模倣する生物無機化学ハプテンに対して惹起およびスクリーニングされた抗体）がＭＭＰ２およびＭＭＰ９のタンパク質活性部位と交差反応することが確認された。明らかに、この亜鉛トリポッドハプテンは、天然型タンパク質におけるそれぞれの亜鉛−ヒスチジンエピトープの三次元構造を模倣することができた。注目すべきことに、この最小の金属−タンパク質構造的エピトープの認識は、天然型酵素との交差反応性を誘発するために十分であった。活性化された酵素にだけ結合し、プロドメインが触媒作用の亜鉛タンパク質エピトープへの進入を阻止したその潜在型形態には結合しないこと（図１１Ｄ）は、６Ｃ６と亜鉛触媒作用部位との直接的な相互作用を示していた。注目すべきことに、６Ｃ６は天然型ＭＭＰ９とインビボで結合した。このことは、この抗体が複雑なタンパク質環境において酵素との特異的な複合体を形成できることを明らかにする。
【０１８４】
活性化された酵素種を潜在型形態から識別することは、６Ｃ６の特有かつ有益な機能的性質である。この活性は、ＭＭＰ９に対して惹起された他の抗体とは対照的に、６Ｃ６に特有である。これは、タンパク質による免疫化は典型的には、表面ループに向けられたエピトープをもたらし、一方、触媒作用アミノ酸はほとんどが酵素の表面において裂溝の内部に埋もれるからである。分子のこの部分は、免疫原性が低いと見なされる。従って、従来の方法によって（天然型タンパク質またはタンパク質フラグメントに対して）惹起された中和モノクローナル抗体は一般に、活性部位の触媒作用残基とではなく、活性部位に連続または隣接する領域と相互作用し、立体的障害の機構によって阻害する。そのような抗体は典型的には、活性型形態と同様に、不活性な前駆体に結合する。本発明の特有の活性部位模倣ハプテン免疫化法は、従来のタンパク質免疫化法によって達成することができない、ＭＭＰにおける触媒作用の金属タンパク質残基を認識する抗体の産生を可能にし得る。
【０１８５】
実施例９
６Ｃ６はインビトロおよびインサイチュにおいてゼラチナーゼを選択的に阻害する
ＭＭＰ９およびＭＭＰ２に対する６Ｃ６の酵素阻害能力を明らかにするために、阻害アッセイを、ゼラチナーゼの活性部位裂溝に広がる小さい蛍光発生ペプチド基質（７アミノ酸）を使用して行った。初反応速度をいくつかの濃度のｍＡｂについて測定した。６Ｃ６は両方の酵素の触媒活性を阻害した（図１２Ａ〜Ｂ）。阻害の競合的機構が、ＭＭＰ９の活性を基質濃度の関数として様々な濃度の阻害性抗体の存在下で分析することによって決定された。両軸逆数のＬｉｎｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットの形態で図１２Ａに示されるデータにより、競合的阻害プロフィルが明らかにされる。阻害データを競合的阻害系の式に適合化することにより、ＫｉがＭＭＰ９およびＭＭＰ２についてそれぞれ１±０．１μＭおよび１．４±０．１６μＭであることが得られた。６Ｃ６が高濃度（３０μＭ）のＭＭＰ９との一晩のインキュベーションの後でＭＭＰ−９によって切断されなかったこともまた明らかにされた。このことは、６Ｃ６によるＭＭＰ９の観測された阻害が競合剤基質の切断のためではなかったことを明らかにする。６Ｃ６は、異なるＭＭＰにおいて同じエピトープを認識するように設計されたので、ＭＭＰ９の速度論的解析を、６Ｃ６による阻害機構の代表例とした。阻害作用は、ゼラチナーゼの全長型酵素形態と同様に、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の触媒作用フラグメント種について一貫していた。具体的には、触媒作用ドメインならびにフィブロネクチンドメインを含有し、しかし、ヘモペキシンドメインを含有しない組換えのＭＭＰ９触媒作用フラグメントおよびＭＭＰ２触媒作用フラグメント；また、触媒作用ドメインのみを含有し、フィブロネクチンドメインおよびヘモペキシンドメインの両方を欠くＭＭＰ９組換え最小触媒作用ユニットはすべてが、以前に記載されたようにヒトのｐｒｏ−ＭＭＰ２およびｐｒｏ−ＭＭＰ９の全長ｃＤＮＡをコードする組換えワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ Ｓ３細胞の培地から精製された全長の（酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）活性化）ゼラチナーゼと同様に阻害された［Ｏｌｓｅｎ，Ｗ．Ｍ．他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０００．２７５（４）：ｐ．２６６１〜８］。これらの結果により、阻害が触媒作用ドメインとの直接的な相互作用によって媒介され、ヘモペキシンドメインまたはフィブロネクチンドメインのどちらかとの相互作用に依存していないことが確認された。この競合的阻害プロフィルでは、触媒作用亜鉛部位との直接的な相互作用がさらに示された。類似した様式で調製された関連性のないｍＡｂは酵素の光分解活性を妨害しなかった。従って、観測された阻害は、微量の同時精製された混入物のためではなかった。これらの実験のための抗体は組織培養から精製され、検出可能な量の活性型ＭＭＰ９を精製抗体画分に含有しなかった。
【０１８６】
６Ｃ６の選択性を詳しく検討するために、その反応性を、マトリライシン（ＭＭＰ７）、膜型ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ）および関連したジスインテグリン（ＡＤＡＭｓ）腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）を含む種々のマトリックスメタロプロテイナーゼサブグループに対して試験した。これらの酵素のコア構造は非常に類似しており、ほとんどが周辺ループの内部で変化している。具体的には、亜鉛−ヒスチジンの足場がよく保存されており、この足場は、触媒作用亜鉛イオンに配位する３つのヒスチジン残基のための足場として役立つループが続くコンセンサスヘリックスを示す（図１３）。
【０１８７】
類似する阻害アッセイを、適切な蛍光発生ペプチド基質を用いて行った。興味深いことに、ＭＭＰ−７またはＴＡＣＥはどちらも、６Ｃ６と３０μＭまでの濃度でインキュベーションされたとき、何ら測定可能な程度に阻害されなかった。このことは、ゼラチナーゼに対する相当なレベルの選択性を示している。ＭＴ１−ＭＭＰが６Ｃ６によって阻害されたが、それほど強力でなく、Ｋｉが１４．４±０．７５μＭであった。興味深いことに、この選択性の起原は、特に活性部位におけるコア構造が非常に類似しているので、保存された亜鉛−ヒスチジン足場を認識させる抗体の設計にもっぱら基づいて解明することはできない。配列の変化（ほとんどが周辺ループの内部に存在する）により、亜鉛−ヒスチジンモチーフの露出度合いにおける差、活性部位の形状における差が決定され、その表面静電により、この選択的阻害パターンを説明することができる。
【０１８８】
６Ｃ６を、異なる亜鉛依存性メタロプロテアーゼ（カルボニックアンヒドラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ）との交差反応性についても試験した。ＭＭＰと類似して、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）は、３つのヒスチジン配位子および１つの水分子に四面体型で配位する触媒作用亜鉛イオンを有する。その結果、（スルホニル化アミノ酸ヒドロキサマートタイプの）いくつかの強力な小分子ＭＭＰ阻害剤は、効率的なＣＡ阻害剤としても作用し、逆も然りである。ＣＡ阻害剤として以前に研究された一部のＮ−ヒドロキシスルホンアミド類もまた、ＭＭＰに対する阻害特性を示す［Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ，Ａ．およびＣ．Ｔ．Ｓｕｐｕｒａｎ、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２０００．４３（２０）：ｐ．３６７７〜８７］。好熱性細菌から得られたアルコールデヒドロゲナーゼ（ＴｂＡＤＨ）の活性部位は、亜鉛が、裂け目の内部に位置するヒスチジン、システイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸に結合する異なる亜鉛−タンパク質部分を含む。３０μＭまでのｍＡｂ濃度の存在下における適切な機能的阻害実験は阻害作用を両方の酵素に対して何ら示さなかった。注目すべきことに、１０本鎖のねじれたβ−シートの中心領域に位置するＣＡの活性部位は、四面体型Ｚｎ２＋イオンが裂溝の底に存在する深さ１５Åの錐体形状の裂溝から構成される。小分子阻害剤とは異なり、亜鉛イオンは、抗体との相互作用のためにはあまりにも深く埋もれているにちがいない。重要なことに、これらの実験では、６Ｃ６の選択的阻害プロフィルがさらに明らかにされる。
【０１８９】
細胞環境において、ゼラチナーゼに対する６Ｃ６の阻害作用を、インサイチュザイモグラフィによって、ゼラチナーゼの天然基質（すなわち、ゼラチン）を使用してさらに試験した。膜結合型ＭＴ１−ＭＭＰを発現し、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を分泌する培養で成長させたヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０細胞）［Ｇｉａｍｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｔ．Ａ．他、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ、１９９８．１６（８）：ｐ．４８３〜９６］に、フルオレセインコンジュゲート化ゼラチン（ＤＱゼラチン）を重ねた。図１４Ａ〜Ｃに示されるように、非処理のＨＴ１０８０細胞は著しい細胞表面ゼラチン分解活性を示した。５μＭのｍＡｂによる処理は、機構に基づいたゼラチナーゼ阻害剤（ＳＢ−３ＣＴ）を用いて観測される阻害と同様に、表面ゼラチン分解活性を著しく低下させた。ＳＢ−３ＣＴは、ゼラチナーゼおよびＭＴ１−ＭＭＰの両方を阻害するとき、類似する阻害プロフィルを有する（Ｋｉ値が、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびＭＴ１−ＭＭＰについてそれぞれ、２８ｎＭ、４００ｎｍおよび１１０ｎＭである）。
【０１９０】
まとめると、６Ｃ６はインビトロでの合成ペプチドの切断およびインサイチュでの天然高分子基質の両方を阻害した。６Ｃ６は、ＴＩＭＰの阻害機構と類似する、ＭＭＰ９に対する競合的様式の阻害を示した。競合的阻害プロフィルは、触媒作用亜鉛部分との直接的な相互作用をさらに示す。重要なことに、６Ｃ６は、ゼラチナーゼに対する選択的阻害プロフィルを示した。この選択性の起原は、保存された亜鉛−ヒスチジンモチーフの抗体標的化によって説明することができない。これらの結果は、抗体が、観測された特異性を説明する酵素表面上のさらなる決定基と相互作用することを示唆する。
【０１９１】
実施例１０
マウスにおけるＤＳＳ誘導大腸炎に対する６Ｃ６ ｍＡｂ処置の影響
ＭＭＰが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含めて、いくつかの炎症性状態に関連する組織のリモデリングおよび破壊に関わるという証拠が増大している［Ｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｄ．他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９９．１１７（４）；ｐ．８１４〜２２；Ｈｅｕｓｃｈｋｅｌ，Ｒ．Ｂ．他、Ｇｕｔ、２０００．４７（１）：ｐ．５７〜６２；ｖｏｎ Ｌａｍｐｅ，Ｂ．他、Ｇｕｔ、２０００．４７（１）：ｐ．６３〜７３；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ，Ｔ．他、Ｇｕｔ、２００４．５３（５）：ｐ．７０１〜９］。
【０１９２】
従って、本発明者らは、炎症性腸疾患のマウス実験モデルにおいてインビボでの６Ｃ６の抗ゼラチナーゼ阻害作用を調べた。
【０１９３】
６Ｃ６の阻害活性を検討するために、ｍＡｂ処置がＤＳＳ誘導の急性大腸炎を改善する能力を調べた。具体的には、２％ＤＳＳを高感受性マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６に５日間与えた。６Ｃ６処置を、誘導日から開始して１．５または５ｍｇ／ｋｇマウスの腹腔内注射によって毎日施した。２％ＤＳＳにさらされたマウスは、下痢、直腸出血および重度の体重減少とともに、急性大腸炎の症状を発症した。
【０１９４】
毎日モニターされた疾患活性指数（ＤＡＩ）（体重、出血および便の硬さの総合スコア）に対するｍＡｂ処置の影響が図１５Ａに示される。ｍＡｂ処置マウスは、コントロールと比較して、疾患活性を低下させていた（６日目から顕著であった）。ＤＳＳ誘導大腸炎のさらなる巨視的発現は結腸の長さの減少である（図１５Ｂ）。例えば、結腸の長さの３０％の低下が、ＤＳＳ誘導後１１日で、実験未使用マウスとの比較で非処置マウスにおいて見出された。対照的に、平均してほんの２２％または１６％の低下が、１．５および５ｍｇ／ｋｇマウスが投薬される６Ｃ６処置マウスにおいてそれぞれ得られた。６Ｃ６の保護作用がまた、疾患からの死亡率によって確認された。６０％の死亡率が誘導後１１日で非処置マウスにおいて見出され、一方、ほんの３３％の死亡率が６Ｃ６処置マウスにおいて観測された（図１５Ｃ）。従って、６Ｃ６によるＣ５７ＢＬ／６マウスの処置は、ＤＳＳ誘導大腸炎の低下した発現に加えて、改善された生存率をもたらした。
【０１９５】
全体として、これらの結果により、ゼラチナーゼ阻害剤としての６Ｃ６の治療的可能性が明らかにされた。
【０１９６】
実施例１１
Ｘ線吸収分光法によるＭＭＰ９−６Ｃ６ ｍＡｂ複合体の特徴づけ
活性型ＭＭＰ９と阻害型ＭＭＰ９−６Ｃ６複合体との違いをさらに研究するために、Ｘ線吸収分光法を行った。図１６は、集められた蛍光ＸＡＳデータを示す。データは、ＭＭＰ９における触媒作用亜鉛イオンの第１および第２配位殻内の様々な原子の動径分布を提供するためにフーリエ変換（ＦＴ）スペクトルの形態で示される。遊離酵素および阻害型酵素の動径分布スペクトルにおける明瞭な変化を、ノイズレベルを超えて観測することができる。これらのスペクトル変化は、６Ｃ６に結合したとき、触媒作用亜鉛イオンの局所的環境が構造的変化を受けることを示している。活性型酵素と阻害型酵素との間におけるＦＴスペクトル特徴の空間分布およびピーク強度の両方における観測されたずれは、触媒作用亜鉛の局所的構造がｍＡｂとの複合体形成のときに変化することを明白に示している。
【０１９７】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１９８】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許または特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０１９９】
【配列表フリーテキスト】
【０２００】
配列番号１は、６Ｃ６ ｍＡｂ軽鎖の配列である。
配列番号２は、１５Ｅ１２ ｍＡｂ軽鎖の配列である。
配列番号３は、１３Ｅ１１ ｍＡｂ軽鎖の配列である。
配列番号４は、１３Ｅ１１ ｍＡｂ重鎖の配列である。
配列番号５は、１５Ｅ１２ ｍＡｂ重鎖の配列である。
配列番号６は、６Ｃ６ ｍＡｂ重鎖の配列である。
配列番号７は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ１の配列である。
配列番号８は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ２の配列である。
配列番号９は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ３の配列である。
配列番号１０は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ１の配列である。
配列番号１１は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ２の配列である。
配列番号１２は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ３の配列である。
配列番号１３は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ１のコード配列である。
配列番号１４は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ２のコード配列である。
配列番号１５は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｌ３のコード配列である。
配列番号１６は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ１のコード配列である。
配列番号１７は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ２のコード配列である。
配列番号１８は、６Ｃ６ ＣＤＲ Ｈ３のコード配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）を有する化合物：
式中、
ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；
Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；
Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；および
Ｒは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、
ただし：
ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；および
Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される。
【請求項２】
式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【請求項３】
式（ＩＩ）を有する化合物：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【請求項４】
請求項１、２、または３に記載の化合物と特異的に結合することができる抗原認識領域を含む抗体。
【請求項５】
配列番号７、８、９、１０、１１および１２に規定されるＣＤＲアミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む抗体。
【請求項６】
前記ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
金属タンパク質の活性を阻害することができる、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
前記金属タンパク質はマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記マトリックスメタロプロテアーゼはゼラチナーゼである、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ゼラチナーゼは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
金属タンパク質阻害剤を製造する方法であって、請求項１、２、または３に記載の化合物に向けられた抗体を作製し、それにより、金属タンパク質阻害剤を製造することを含む方法。
【請求項１２】
前記抗体はポリクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の抗体と医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患をその処置の必要性のある対象において処置する方法であって、請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つの治療有効量を対象に投与し、それにより、金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患を対象において処置することを含む方法。
【請求項１６】
疾患は炎症性腸疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害する方法であって、細胞を請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つと接触させ、それにより、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害することを含む方法。
【請求項１】
一般式（Ｉ）を有する化合物：
式中、
ｍおよびｎはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；
Ｘ１〜Ｘ３およびＹ１〜Ｙ３はそれぞれが独立して、ＯまたはＳである；
Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される；および
Ｒは（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−（ＣＨ２）ｙ−ＮＲ’Ｒ”であり、
ただし：
ｘおよびｙはそれぞれが独立して、１〜６の整数である；および
Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキルおよびシクロアルキルからなる群から選択される。
【請求項２】
式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【請求項３】
式（ＩＩ）を有する化合物：
式中、Ｒ＝−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２。
【請求項４】
請求項１、２、または３に記載の化合物と特異的に結合することができる抗原認識領域を含む抗体。
【請求項５】
配列番号７、８、９、１０、１１および１２に規定されるＣＤＲアミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む抗体。
【請求項６】
前記ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
金属タンパク質の活性を阻害することができる、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
前記金属タンパク質はマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記マトリックスメタロプロテアーゼはゼラチナーゼである、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ゼラチナーゼは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
金属タンパク質阻害剤を製造する方法であって、請求項１、２、または３に記載の化合物に向けられた抗体を作製し、それにより、金属タンパク質阻害剤を製造することを含む方法。
【請求項１２】
前記抗体はポリクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の抗体と医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患をその処置の必要性のある対象において処置する方法であって、請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つの治療有効量を対象に投与し、それにより、金属タンパク質のバランスの崩れた活性または異常な活性に関連する疾患を対象において処置することを含む方法。
【請求項１６】
疾患は炎症性腸疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害する方法であって、細胞を請求項４〜１０に記載される抗体のいずれか１つと接触させ、それにより、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を細胞において阻害することを含む方法。
【図５】
【図６Ａ−Ｂ】
【図９】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図６Ａ−Ｂ】
【図９】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５１９２８９（Ｐ２０１０−５１９２８９Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５０７７３（Ｐ２００９−５５０７７３）
【出願日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００８／０００２３０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０２３５９
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０２３７９１４７）イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００８／０００２３０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０２３５９
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０２３７９１４７）イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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