長い生体内半減期を有する生理活性ポリペプチド結合体
【課題】 生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化しながらも、生体内半減期を延長させ、免疫反応を誘発しないタンパク質結合体の提供。
【解決手段】 ｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含む、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体は、免疫反応の誘発可能性を減らしながらも、向上した生体内安定性および延長された血中半減期を有するためポリペプチド薬物の開発に有用である。
【解決手段】 ｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含む、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体は、免疫反応の誘発可能性を減らしながらも、向上した生体内安定性および延長された血中半減期を有するためポリペプチド薬物の開発に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内半減期が延長された活性持続型タンパク質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは変性しやすいか、血液、肝または腎臓において酵素によって分解しやすい。このようなポリペプチドの低い安定性のため、活性成分の有効血中濃度を保持するためにはポリペプチド薬物を患者に持続的な頻度で投与する必要がある。さらに、ポリペプチド薬物は通常注射によって投与されるので、ポリペプチド薬物の頻繁な注射は患者に相当な不便をかけることになる。したがって、高い薬理学的効果を保持しながらも血中半減期が増加されたポリペプチド薬物を開発するために多くの研究が行われてきた。前記好ましいポリペプチド薬物はまた向上した血中安定性、高い活性、様々なポリペプチドへの適用可能性の要件を満たし、また、患者への投与時、好ましくない免疫反応を誘発してはならない。
【０００３】
タンパク質の安定性を改善するために最も広く用いられる方法の一つは、ポリペプチドのプロテアーゼとの接触を防止するポリエチレングリコール（polyethylene glycol; PEG）のような溶解度の高い高分子でポリペプチドを化学的に変形させるものである。ＰＥＧはポリペプチド薬物に特異的にまたは非特異的に結合してポリペプチド薬物の溶解度を増加させ、またその加水分解を防止することによって、ポリペプチド薬物の血中安定性を増加させ、低い抗原性のため如何なる免疫反応も起こさないと知られている（Sadaら、J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71: 137-139）。しかし、このようにＰＥＧが結合したタンパク質は、ＰＥＧの分子量が増加するほど活性成分の活性および生産収率が減少するという短所がある。二つの活性化されたＰＥＧと結合したインターフェロンだけでなく、異なる活性を有する２種のポリペプチドがＰＥＧスペーサーで連結された結合体が米国特許第５，７３８，８４６号および国際特許公開ＷＯ９２／１６２２１に各々開示されているが、これらは生体内で生理学的活性ポリペプチドの活性延長という点においては顕著な効果を示さない。
【０００４】
また、組合せヒト顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をヘテロ−二官能性ＰＥＧを通じてアルブミンに共有結合させることによってＧ−ＣＳＦの血中半減期を増加させ得ると報告されている（Kinstler et al., Pharmaceutical Research, 1995, 12(12): 1883-1888）。しかし、修飾されたＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンの安定性は、Ｇ−ＣＳＦ自体に比べてただ４倍に過ぎないため、これまで実用化されていない。
【０００５】
生理活性ポリペプチドの生体内安定性を向上させるための他の方法として、安定したタンパク質と融合した活性ポリペプチドを組合せ技術によって形質転換体で生産する。たとえば、アルブミンは、それに融合したポリペプチドの安定性を向上させるのに最も効果的なタンパク質の一つであると知られており、そのような融合タンパク質は多く報告されている（国際特許公開ＷＯ９３／１５１９９およびＷＯ９３／１５２００、およびヨーロッパ特許公開第４１３，６２２号）。しかし、アルブミンと結合した融合タンパク質は活性減少という問題を依然として有している。
【０００６】
米国特許第５，０４５，３１２号は、成長ホルモンの活性を向上させるために、カルボジイミド（carbodiimide）、グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）、酸クロリドなどのような架橋結合剤を用いて成長ホルモンをウシ血清アルブミン（bovine serum albumin; BSA）またはマウスの免疫グロブリンに結合させる方法を開示している。しかし、この方法は、ただ標的成長ホルモンの活性を向上させることのみを目的とする。また、架橋結合剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド、酸クロリドなどのような化学物質を用いることは強い毒性および反応の非特異性のため不利である。
【０００７】
免疫グロブリンは、抗体−依存性細胞毒性（Antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC）または補体−依存性細胞毒性（Complement dependent cytotoxicity, CDC）を示す抗体として作用でき、糖鎖はＡＤＣＣおよびＣＤＣの発揮に重要な役割を果すと報告されている（Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985）。糖鎖がなくても非糖鎖化免疫グロブリンは糖鎖化したものと同様な血中半減期を有するが、補体またはレセプターに対する結合力は糖鎖除去により１０倍〜１０００倍減少する（Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993, Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989）。
【０００８】
生理活性ポリペプチドを種々の高分子と結合させるための多くの試みが行われてきたが、これらはいずれも安定性と活性を同時に増加させることはできなかった。
活性ポリペプチドの安定性を向上させるとともに、生体内活性を保持するための改善された方法として、本発明は、生理活性ポリペプチド、非−ペプチド重合体および免疫グロブリンが共有結合で互いに連結されたタンパク質結合体を提供する。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，７３８，８４６号公報
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ９２／１６２２１号公報
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ９３／１５１９９号公報
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ９３／１５２００号公報
【特許文献５】ヨーロッパ特許公開第４１３，６２２号公報
【特許文献６】米国特許第５，０４５，３１２号公報
【非特許文献１】Sadaら著、J. Fermentation Bioengineering, 1991年発行、71: 137-139頁
【非特許文献２】Kinstlerら著、Pharmaceutical Research, 1995年発行、12(12): 1883-1888頁
【非特許文献３】Burton D. 著、Molec. Immun. 22, 161-206頁、1985年発行
【非特許文献４】Waldmann H.著、Eur. J. Immunol. 23, 403-411頁、1993年発行
【非特許文献５】Morrison S. 著、J. Immunol. 143, 2595-2601頁、1989年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の主な目的は、生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化しながらも、生体内半減期を延長させ、免疫反応を誘発しないタンパク質結合体を提供することである。
本発明の他の目的は、生理活性ポリペプチド、生体親和性非ペプチド性重合体および免疫グロブリンが共有結合で互いに連結されたタンパク質結合体の製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、生体内半減期が延長された前記生理活性ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、生理活性ポリペプチドの活性を減少させることなく、その生体内安定性を向上させ、血中半減期を増加させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一実施態様に従って、本発明では、共有結合で互いに連結されたｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体が提供される。
【００１３】
また、本発明の他の実施態様に従って、本発明では、（ａ）少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、および少なくとも一つの免疫グロブリンを両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体と共有結合で連結する段階；および
（ｂ）共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項１記載のタンパク質結合体の製造方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに他の実施態様に従って、本発明では、タンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体を含む、半減期が長くなった生理活性ポリペプチドの医薬組成物が提供される。
【００１５】
本発明のさらに他の実施態様に従って、本発明では、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと共有結合で連結することを含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書に用いられる用語「生理活性ポリペプチド」とは、ヒトを含む哺乳動物に投与された場合、有用な生物学的活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をいい、「生理活性タンパク質」、「活性タンパク質」、「活性ポリペプチド」または「ペプチド薬物」という用語と相互交換的に使用され得る。
【００１７】
本明細書に用いられる用語「タンパク質結合体」または「結合体」とは、本発明によって共有結合で互いに連結されている、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンを含む化合物をいう。
前記「結合体」という用語と区別される用語「連結体」は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンから選ばれた２種類の構成要素のみを含む化合物を意味する。
【００１８】
用語「非ペプチド性重合体」は、少なくとも二つ以上のモノマーを含み、このモノマーがペプチド結合ではなく、任意の共有結合を通じて連結された生体適合性重合体をいう。
本発明の一実施態様に従って、共有結合で互いに連結された、ｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体が提供される。
【００１９】
たとえば、本発明のタンパク質結合体は、［活性ポリペプチド／非ペプチド性重合体／免疫グロブリン］によって表わされる単位構造を少なくとも一つ含み得、ここですべての構成要素は共有結合によって線状で連結されている。非ペプチド性重合体は両末端に各々反応基を有し得るので、これを通じて生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと各々共有結合で連結される。好ましい具現例では、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体からなる連結体が一つの免疫グロブリンに共有結合で連結され得る。
【００２０】
生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンのモル比は１：１〜１０：１、好ましくは１：１〜４：１の範囲であり得る。
１種類の重合体だけではなく、異なる種類の重合体の組合せが非ペプチド性重合体として使用され得る。
【００２１】
本発明のタンパク質結合体において、免疫グロブリンの適当な結合部位としては免疫グロブリンの可変領域または不変領域にあるアミノ酸残基の遊離官能基を含み得る。非ペプチド性重合体または活性ポリペプチドと共有結合するのに適当な免疫グロブリンの部位は可変領域のアミノ末端、リジン残基またはヒスチジン残基のアミノ基、およびシステインの遊離−ＳＨ基を含み得、非ペプチド性重合体の適当な部位は末端反応基である。
【００２２】
免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組合せおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のようなＩｇＧのすべてのサブタイプからなる群から選ばれ得る。患者において免疫反応を誘発しないように、前記免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンであることが好ましい。
【００２３】
本発明のタンパク質結合体を構成する構成要素として、免疫グロブリンは血液から単離した天然型免疫グロブリンであるか、遺伝工学的に産生された組合せ免疫グロブリンであり得る。機能、構造および安定性において野生型と実質的に等しい限り、様々な部位でアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって修飾された任意の免疫グロブリンだけではなく、高糖鎖化、低糖鎖化および糖鎖が除去された誘導体も本発明に使用され得る。免疫グロブリンの糖鎖の増減または除去は、化学的方法、酵素学的方法および遺伝工学的方法のような通常の方法のいずれかを用いて行い得る。ＩｇＧの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２、３２７〜３３１番アミノ酸残基が修飾のための適当な部位として使用され得る。
【００２４】
適当な非ペプチド性重合体は、アルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる反応基を有する。スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル、およびスクシンイミジルカーボネートからなる群から選ばれ得る。両末端にアルデヒド基を有する非ペプチド性重合体は、非特異的カップリング反応を最小化して非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと各々結合するのに効果的である。アルデヒド基の還元に基づくアルキル化によって生成したタンパク質結合体はアミド結合を通じて連結されたものよりも遥かに安定である。
【００２５】
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は同一でも異なっていてもよい。たとえば、非ペプチド性重合体は一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはマレイミド基、アルデヒド基、またはプロピオンアルデヒド基を有し得る。ポリ（エチレングリコール）が非ペプチド性重合体として用いられる場合、本発明のタンパク質結合体の製造に市販の製品を用いるか、カップリング反応前に市販のＰＥＧの末端ヒドロキシ基を他の反応基にさらに転換させて用いられ得る。
【００２６】
前記非ペプチド性重合体は、前記免疫グロブリンのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基と前記生理活性ポリペプチドの反応基のいずれかを共有結合で連結するスペーサーの役割をする。
【００２７】
非ペプチド性重合体はポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ（乳酸−グリコール酸）、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組合せからなる群から選ばれ得る。当該分野に周知のこれらの誘導体もまた同じ目的で使用され得る。より好ましい非ペプチド性重合体はポリ（エチレングリコール）である。非ペプチド性重合体の分子量は５００〜１００，０００、好ましくは５００〜２０，０００の範囲である。
【００２８】
二つのポリペプチドを遺伝子クローニングによって結合させるための、オリゴペプチドのような従来報告されている架橋結合剤は、好ましくない免疫反応の可能性を増加させ、結合部位をポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のみに制限させる。したがって、非ペプチド性重合体の使用は、オリゴペプチドと比較する場合、毒性や免疫原性の減少という長所がある。他の長所は、結合部位の多様性による適用可能性の増加である。
【００２９】
架橋結合剤として用いられる場合、カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドのような低分子架橋剤はこれを通じて結合されたタンパク質を変性、または結合の制御および生成物の精製の困難をもたらすことがある。これに対し、非ペプチド性重合体を含む本発明のタンパク質結合体は、結合の調節および生成した結合体の精製が容易であり、非特異的カップリング反応を最小化できるというメリットがある。
【００３０】
本発明のタンパク質結合体は、ポリペプチド−ＰＥＧ連結体またはポリペプチド−ＰＥＧ−アルブミン結合体よりも遥かに優れた生体内半減期および活性を示す。薬物動力学分析（pharmacokinetic analysis）によれば、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の半減期は野生型ｈＧＨに比べて約１３倍さらに長い反面、ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体およびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体は各々野生型タンパク質に比べて約７倍および約５倍さらに長い半減期を示す（試験例２、表３参照）。ｈＧＨの代わりにＧ−ＣＳＦおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンまたはＥＰＯを用いた試験においても同様な結果が得られた。ＰＥＧのみでまたはＰＥＧ−アルブミン連結体で修飾された結合体に比べて、本発明のタンパク質結合体は前記通常の連結体よりも２倍〜７０倍高い、遥かに増加した平均滞留時間（mean residence time; MRT）および血中半減期を示す（試験例２、表４〜７参照）。また、本発明のＦａｂ’−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体、すなわち、ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＣ−末端近くの−ＳＨ基、またはＮ−末端に各々連結されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧおよびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体は、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて２倍〜３倍さらに長い血中半減期を示す（試験例３および図１２参照）。
【００３１】
さらに、非糖鎖化免疫グロブリンを用いて製造されたタンパク質結合体は糖鎖化された免疫グロブリンを含む相応するタンパク質結合体と同様な血中半減期と生体外活性を示す（表４、７および９、および図１０および１１参照）。
【００３２】
薬物動力学分析結果、ｈＧＨ、インターフェロン、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはその誘導体、および抗体断片を含む様々な生理活性ポリペプチドに適用された本発明のタンパク質結合体は、血中半減期およびＭＲＴの面で優れた特性を示すので、延長された生体内半減期を有するポリペプチド薬物製剤を製造するのに有用である。
【００３３】
さらに、動物モデルを用いた生体内試験によれば、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は非常に優れた生体内活性を示す。具体的に、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を野生型投与容量の１／３容量で６日に１回投与したとき、野生型を毎日投与したものと等しいかより優れた効果を示し、このような結果は、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性が野生型に比べて３倍以上高いことを意味する（図１４参照）。
【００３４】
本発明の１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体に比べて３倍以上高い生体内活性を示し、５日に１回投与したとき、同じ総投与量になるように毎日投与した野生型Ｇ−ＣＳＦよりも２倍以上高い好中球回復効果を示す（図１５参照）。しかも、本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は、ヘマトクリット数値において野生型ＥＰＯまたは高糖鎖化ＥＰＯの場合よりもさらに高くて速い増加率を誘導し、このような高い生体内活性を長期間保持する（図１６）。
【００３５】
このような結果は、本発明のタンパク質結合体が頻繁な投与を必要とする野生型ペプチドの問題を克服するとともに、生理活性タンパク質の血中半減期および生体内活性を著しく増加させることを示す。
【００３６】
生理活性ポリペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターなどのポリペプチド、およびこれらの変異体および他の類似体を例示することができる。
【００３７】
本発明のタンパク質結合体を製造するのに適当な生理活性ポリペプチドの具体的な例はヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類（例：インターフェロンα，βおよびγ）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例：インターロイキン−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７，−８，−９，−１０，−１１，−１２，−１３，−１４，−１５，−１６，−１７，−１８，−１９，−２０，−２１，−２２，−２３，−２４，−２５，−２６，−２７，−２８，−２９および−３０）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＦＳＨ放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類（例：ＮＦＲ（Ｐ７５）およびＴＮＦＲ（Ｐ５５））、レセプター拮抗物質（例：ＩＬ１−Ｒａ）、細胞表面抗原（例：ＣＤ２，３，４，５，７，１１ａ，１１ｂ，１８，１９，２０，２３，２５，３３，３８，４０，４５および６９）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片およびウイルス由来のワクチン抗原を含む。
【００３８】
抗体断片とは特定抗原に結合し得る抗体の断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびｓｃＦｖを示し、Ｆａｂ’が好ましい。Ｆａｂ断片は抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインと第１不変ドメイン（ＣＨ１）からなり；Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ−末端にヒンジ（hinge）領域からの一つ以上のシステイン残基を含む数個のアミノ酸残基がさらに付加されたものであり；Ｆ（ａｂ’）２断片は二つのＦａｂ’断片がジスルフィド結合或いは化学的反応で相互連結されたものであり；Ｆｄ断片は重鎖の可変領域と第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。ｓｃＦｖ断片は、ペプチドリンカーで互いに連結された軽鎖と重鎖の可変領域からなる単一ポリペプチド鎖である。
【００３９】
特に好ましいポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で投与される場合、他のものに比べてさらに頻繁な投与が要求されるということに照らし、ヒト成長ホルモン、インターフェロン類（インターフェロンα，βおよびγ）、顆粒球コロニー刺激因子および赤血球生成因子からなる群から選ばれたいずれかである。
【００４０】
本発明が適用され得る生理活性ポリペプチドの種類は前述のものに制限されず、野生型ポリペプチドと実質的に等しいかさらに優れた機能、構造、活性または安定性を有する変異体または誘導体も本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。
【００４１】
他の実施態様として、本発明は、
（ａ）少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、少なくとも一つの免疫グロブリン、および両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体を共有結合で連結する段階；および
（ｂ）共有結合で連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を単離する段階を含む、前記タンパク質結合体の製造方法を提供する。
【００４２】
前記方法の段階（ａ）において、生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体は２段階反応または同時反応によって共有結合で連結され得る。２段階反応、たとえば、非ペプチド性重合体を活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンと共有結合させた後、生成した連結体を活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンと共有結合させてこれらの結合体を製造し、ここで活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンは非ペプチド性ポリマーを用いて相互連結される方法が好ましくない副産物の生成を減少させるのに有利である。
【００４３】
したがって、前記方法の段階（ａ）は、
（ａ１）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結する段階；
（ａ２）反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階；および
（ａ３）連結体の非ペプチド性重合体の自由末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結して非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンを共有結合で互いに連結するタンパク質結合体を生産する段階；を含み得る。
【００４４】
前記段階（ａ１）において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体のモル比は好ましくは１：２．５〜１：５の範囲であり、免疫グロブリンと非ペプチド性重合体のモル比は１：５〜１：１０である。なお、段階（ａ３）において、段階（ａ２）で得られた連結体と生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンのモル比は１：０．５〜１：２０、好ましくは１：１〜１：５の範囲である。
【００４５】
段階（ａ１）および段階（ａ３）は、ナトリウムシアノボロハイドライド、ナトリウムボロハイドライド、ジメチルアミンボレートおよびピリジンボレートからなる群から選ばれる還元剤の存在下で行い得る。
【００４６】
段階（ａ２）および（ｂ）を行うための手続は、要求される純度、および生成した結合体の分子量および電荷量のような特性を考慮して、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどおよびこれらの組合せのような、タンパク質の分離に用いられる通常の方法で行い得る。
【００４７】
さらに他の実施態様として、本発明は、本発明のタンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体（賦形剤）を含む、修飾されていないポリペプチドに比べて延長された生体内半減期を有する生理活性ポリペプチドの医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉内投与を含む種々の経路を通じて投与され得、注射投与がより好ましい。本発明の医薬組成物は、患者に投与された後、活性成分の迅速、遅速または遅延放出を提供するために当業界で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、錠剤、丸剤、粉末、におい袋（sachet）、エリキシル（elixir）、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であり得る。適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラル油などを挙げることができる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００４９】
活性成分の実際投与量は治療する疾患、選択された投与経路、患者の年齢、性別および体重、および患者の症状を含む色々な関連因子、特に活性成分の種類によって決定される。本発明のタンパク質結合体の向上した安定性のため、本発明のタンパク質結合体を含むポリペプチド薬物剤形の総投与回数および頻度を著しく減らすことができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明の好ましい具現例を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００５１】
［実施例１］ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造Ｉ
（段階１）ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体の製造
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、分子量２２ｋＤａ）を５ｍｇ／ｍｌの濃度に１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解し、両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコール（ALD-PEG-ALD, Shearwater Inc.、米国）をｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０または１：２０になるように加えた。これに還元剤としてナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３、Sigma）を最終濃度２０ｍＭになるように加え、この混合物を４℃で３時間攪拌した。ＰＥＧがｈＧＨのアミノ末端部位に１：１のモル比で選択的に結合したｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を得るために、得られた反応混合物をスーパーデックス（Superdex（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、米国）サイズ排除（size exclusion）クロマトグラフィーを行った。溶離液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてｈＧＨ−ＰＥＧ連結体をカラムから溶離および精製し、修飾されていないｈＧＨ、未反応のＰＥＧおよび二分子のｈＧＨがＰＥＧの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最良の結果を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧの最適のモル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。
【００５２】
（段階２）ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体とＩｇＧとの間の結合体形成
分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、緑十字、韓国）を１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解した。段階１で精製されたＰＥＧ−ｈＧＨ連結体のアルデヒド基にＩｇＧを結合させるために、ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：ＩｇＧのモル比が１：１、１：２、１：４または１：８になるようにｈＧＨ−ＰＥＧ連結体をＩｇＧ−含有緩衝液に加えた。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加え、この混合物を４℃で２０時間徐々に攪拌した。結合反応後ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を汚染物から分離精製するために、反応混合物を用いて２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥカラム（Pharmacia、米国）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。移動相を緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５）から線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．５Ｍ）で緩衝液Ｂ（１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５）に変えた。溶離したｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体から少量の未反応のＩｇＧおよび修飾されていないｈＧＨを除去するために、溶離液として１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化したｐｏｌｙＣＡＴカラム（ＰｏｌｙＬＣ、米国）を用いた陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。移動相を緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）から線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．５Ｍ）で緩衝液Ｂ（１．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）に変えてｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を精製した（図１）。
最良の結果を得るためのｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：ＩｇＧの最適のモル比は１：４であることが確認された。
【００５３】
［実施例２］ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造II
（段階１）ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体の製造
ＩｇＧ（緑十字、韓国）を１００ｍＭリン酸塩緩衝液に１５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、生成した溶液に３．４ｋＤａのＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Shearwater Inc.、米国）をＩｇＧ：ＰＥＧのモル比が各々１：１、１：２．５、１：５、１：１０または１：２０になるように加えた。これに還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、この混合物を４℃で３時間攪拌した。ＰＥＧがＩｇＧのアミノ末端部位に１：１のモル比で選択的に結合したＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を分離するために、得られた反応混合物をスーパーデックス（Superdex（登録商標）、Pharmacia社製、米国）サイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶離液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を溶離および精製し、修飾されていないＩｇＧ、未反応のＰＥＧ、および二分子のＩｇＧがＰＥＧの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最良の結果を得るためのＩｇＧ：ＰＥＧの最適のモル比は１：５〜１：１０であることが確認された。
【００５４】
（段階２）ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体とｈＧＨとの結合体形成
前記段階１で精製されたＩｇＧ−ＰＥＧ連結体にｈＧＨ（分子量２２ｋＤａ）を結合させるために、１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解したｈＧＨをＩｇＧ−ＰＥＧ連結体と各々１：１、１：１．５、１：３または１：６のモル比で反応させた。これに還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加え、反応混合物を４℃で２０時間攪拌した。得られた反応混合物を実施例１の段階２と同様な精製方法を行って未反応物質および副産物を除去し、ＩｇＧ−ＰＥＧ−ｈＧＨ結合体を精製した。
【００５５】
［実施例３］ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造
ｈＧＨの代わりにインターフェロンアルファ２ｂ（ＩＦＮα２ｂ、分子量２０ｋＤａ）を用い、ＩＦＮα２ｂ：ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ）のモル比を１：５にしたことを除いては、実施例１と同様な方法でＩＦＮ−α−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５６】
［実施例４］ヒト顆粒球コロニー刺激因子−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造
ｈＧＨの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、分子量１８．７ｋＤａ）を用い、Ｇ−ＣＳＦ：ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ）のモル比を１：５にしたことを除いては、実施例１と同様な方法でＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
また、野生型Ｇ−ＣＳＦの１７番目のアミノ酸がセリンで置換されたＧ−ＣＳＦ誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）を用いて前記と同様な方法でＧ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５７】
［実施例５］ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造
ｈＧＨの代わりにヒト赤血球生成因子（Erythropoietin(EPO)、分子量３５ｋＤａ）を用い、ＥＰＯ：ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ）のモル比を１：５にしたことを除いては、実施例１と同様な方法でＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５８】
［実施例６］異なる反応基を有するＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
両末端にアルデヒド基以外の異なる反応基を有するＰＥＧを用いてｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を次のように製造した。１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解したｈＧＨ１０ｍｇを両末端にスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）基を有するＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ−ＳＰＡ、Shearwater Inc.、米国、分子量３．４ｋＤａ）とｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が各々１：１、１：２．５、１：５、１：１０または１：２０になるように反応させた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。ｈＧＨのリジン残基にＰＥＧが１：１のモル比で選択的に結合したｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を得るために、反応混合物をスーパーデックス（登録商標）（Pharmacia社製、米国）サイズ排除クロマトグラフィーを行って分離した。溶離液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を溶離および精製し、修飾されていないｈＧＨ、未反応のＰＥＧおよび二分子のｈＧＨがＰＥＧの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を用いて実施例１と同様な方法でｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造した。最良の結果を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧの最適のモル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。
両末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（N-hydroxysuccinimidyl；ＮＨＳ）基を有するＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；Shearwater Inc.、米国）を用いたことを除いては、前記と同様な方法を行って他のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５９】
［実施例７］分子量が異なるＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
分子量が１０，０００ダルトンであり、両末端にアルデヒド反応基を有するＰＥＧであるＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Shearwater Inc.、米国）を用いたことを除いては、実施例１の段階１と同様な方法でｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を製造および精製した。この際、最良の結果を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧの最適のモル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。濃縮されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を用いて実施例１の段階２と同様な方法でｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造した。
【００６０】
［実施例８］Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の製造（−ＳＨ基）
（段階１）Ｆａｂ’の発現および精製
抗−ＴＮＦ−αＦａｂ’を発現する大腸菌ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ（寄託番号：ＫＣＣＭ１０５１１）をＬＢ培地１００ｍｌに接種して一晩振盪培養した。培養したＬＢブロスを５ｌフェメンター（Marubishi）に移して温度３０℃、空気投入量２０ｖｖｍ、攪拌速度５００ｒｐｍの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長によって惹起されたエネルギー源の不足を補充するために適当量のブドウ糖（glucose）と酵母抽出液（yeast extract）を培養水に加えた。吸光度６００ｎｍで培養液の吸光度が８０に至ると、ＩＰＴＧを培養液に加えてタンパク質発現を誘導した。培養液の吸光度が６００ｎｍで１２０〜１４０になるまで４０〜４５時間培養を続けた。得られた発酵液を遠心分離（２０，０００ｘｇ、３０分）して上澄液を得た。
【００６１】
上澄液から次のような３段階のカラムクロマトグラフィーを行って抗−ＴＮＦ−αＦａｂ’を精製した。前記上澄液を２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ（５ｍｌ、Pharmacia社製、ドイツ）カラムに充填した後、１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で溶離した。溶離したＦａｂ’分画を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００（Pharmacia社製、ドイツ）カラムに加え、同じ緩衝液で溶離した。溶離したＦａｂ’分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０（PolyLC Inc.、米国）カラムに加え、１０ｍＭアセテート緩衝液（ｐＨ４．５）でＮａＣｌ線形濃度勾配法（０．１５Ｍ→０．４Ｍ）下に溶離して純粋な抗−ＴＮＦ−αＦａｂ’分画を得た。
【００６２】
（段階２）ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体の製造
免疫グロブリン（ＩｇＧ、分子量１５０ｋＤａ、緑十字、韓国）１５０ｍｇを１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、これにＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量３，４００ダルトン、Shearwater Inc.、米国）をＩｇＧ：ＰＥＧのモル比が１：１０になるように加えた。反応混合物を４℃で１２時間徐々に攪拌した。
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に取り替えて未反応のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを除去した。その後、この反応混合物をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に充填し、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）を用いて溶離してＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を得た。未反応のＩｇＧがＩｇＧ−ＰＥＧ連結体よりも遅く溶離され、除去された。
【００６３】
（段階３）Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体（−ＳＨ基）の製造
段階１で得られた精製されたＦａｂ’を１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）に２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、生成した溶液に段階２で製造されたＩｇＧ−ＰＥＧ連結体をＦａｂ’：連結体のモル比が１：５になるように加えた。反応混合物をタンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮し、４℃で２４時間徐々に攪拌した。
【００６４】
カップリング反応終了後、得られた反応混合物を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００カラム（Pharmacia社製、米国）に加え、同じ緩衝液で１ｍｌ／分の流速で溶離してＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体分画を得た。分子量が大きいＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体が先に溶離され、未反応のＩｇＧ−ＰＥＧ連結体およびＦａｂ’はその後で溶離、除去された。残っている未反応のＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を除去するために、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）を用いて溶離した。結果として、ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＣ−末端付近の−ＳＨ基に連結された純粋なＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体を含む分画を得た。
【００６５】
［実施例９］Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の製造（Ｎ−末端）
（段階１）Ｆａｂ’−ＰＥＧ連結体（Ｎ−末端）の製造
前記実施例８の段階１で得られた精製されたＦａｂ’ ４０ｍｇを１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した後、生成した溶液にＢｕｔｙｌ ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＢｕｔｙｌＡＬＤ（分子量３，４００Ｄａ、Shearwater Inc.、米国）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：５になるように加えた。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、反応混合物を４℃で２時間徐々に攪拌した。
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に取り替えた。緩衝液を取り替えた後、混合物をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に充填し、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ４．５）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）を用いて溶離してＦａｂ’−ＰＥＧ連結体を含む分画を得た。未反応のＦａｂ’が連結体よりも遅く溶離され、除去された。
【００６６】
（段階２）Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の製造（Ｎ−末端）
段階１で得られた精製されたＦａｂ’−ＰＥＧ連結体を１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、生成した溶液にＩｇＧ（分子量１５０ｋＤａ、緑十字、韓国）を連結体：ＩｇＧのモル比が１：５になるように加えた。反応混合物を最終タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、反応混合物を４℃で２４時間徐々に攪拌した。
【００６７】
カップリング反応終了後、反応液を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００カラム（Pharmacia社製）に加え、同じ緩衝液で１ｍｌ／分の流速で溶離してＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体を含む分画を得た。Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体は分子量が大きいため先に溶離され、未反応のＩｇＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧ連結体はその後で溶離、除去された。残っている未反応のＩｇＧを除去するために、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）を用いて溶離した。結果として、ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＮ−末端に連結された純粋なＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体を含む分画を得た。
【００６８】
［実施例１０］糖鎖除去されたＩｇＧ（ＡＧ ＩｇＧ）の製造
ＩｇＧ（緑十字、韓国）２００ｍｇを１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、これに３００Ｕ／ｍｇの脱糖鎖化酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆ（NEB Inc.、イギリス）を加えた。反応混合物を３７℃で２４時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応混合物をＳＰセファロースＦＦカラム（ファルマシア、ドイツ）に加え、１Ｍ ＮａＣｌを用いる線形濃度勾配法（０．１Ｍ→０．６Ｍ）を用いて１０ｍＭアセテート緩衝液（ｐＨ４．５）で溶離し、野生型ＩｇＧよりも遅く溶離した糖鎖除去されたＩｇＧの分画を得た。
【００６９】
［実施例１１］ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の製造
前記実施例３で製造されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体に前記実施例１０で製造された糖鎖除去されたＩｇＧ（ＡＧ ＩｇＧ）を結合することによって次のようにＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を製造した。
ＡＧ ＩｇＧ（分子量：約１４７ｋＤａ）を１０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解した。ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体をＡＧ ＩｇＧ−含有緩衝液にＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＡＧ ＩｇＧのモル比が各々１：１、１：２、１：４および１：８になるように加えた。生成した混合物を１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液の状態にし、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた。反応混合物を４℃で２０時間徐々に攪拌した。最良の結果を得るためのＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＡＧ ＩｇＧの最適のモル比は１：２であることが確認された。
【００７０】
結合反応後、汚染物からＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を精製するために、反応混合物を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。反応混合物をスーパーデックス（登録商標）（Pharmacia社製、ドイツ）カラムに加え、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）を用いて流速２．５ｍｌ／分で溶離してＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体分画を得、未反応のＡＧ ＩｇＧおよびＩＦＮα−ＰＥＧ連結体のような汚染物を除去した。このように得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の分画からさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて少量の未反応のＡＧ ＩｇＧおよびＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を除去した。前記分画を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化したＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、１．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液で線形濃度勾配法（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．６Ｍ）を用いて溶離してＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体分画を得た。このように得られた分画を用いてさらに陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。該分画を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化したＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．３Ｍ）を用いて溶離して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を得た。
【００７１】
［実施例１２］ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の製造
前記実施例５で精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ連結体と、前記実施例１０で製造された糖鎖が除去されたＩｇＧを用いて実施例１１と同様な方法でＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を得た。
【００７２】
［比較例１］ＰＥＧ−ｈＧＨ連結体の製造
ｈＧＨ５ｍｇを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して溶液５ｍｌを得、４０ｋＤａ ＰＥＧを有する活性化されたメトキシ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Shearwater社製、米国）をｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が１：４になるように前記溶液に加えた。これに還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、反応混合物を４℃で１８時間徐々に攪拌した。これにエタノールアミンを最終濃度が５０ｍＭになるように加えて未反応のＰＥＧを失活させた。
未反応のＰＥＧを除去するために、得られた反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム（Pharmacia社製）クロマトグラフィーで処理した。まず、カラムを２カラム体積（column volume；ＣＶ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化した後反応混合物を加えた。ＵＶ分光光度計を用いて２６０ｎｍで溶離分画の吸光度を分析した。分子量がさらに大きいＰＥＧ−修飾されたｈＧＨが先に溶離され、未反応のＰＥＧが後で溶離された。
【００７３】
前記溶離分画から次のようにＰＥＧ−修飾されたｈＧＨをさらに精製した。ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（Polywax Inc.、米国）３ｍｌで充填されたカラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化した。ＰＥＧ−修飾されたｈＧＨを含有する溶離分画を１ｍｌ／分の流速でカラム上に加えた後、１５ｍｌの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液を用いた塩濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度：０％→１００％）によって３０分間溶離し、トリ−、ジ−、モノ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨの分画を順次得た。
前記混合物からモノ−ＰＥＧ結合ｈＧＨ連結体をさらに精製するために、カラム溶離物を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。前記溶離液を濃縮して１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したスーパーデックス２００（Superdex 200、Pharmacia社製）に加え、同じ緩衝液で流速１ｍｌ／分で溶離した。トリ−、ジ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨ連結体はモノ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨ連結体よりも溶離時間が速いので、これを除去してモノ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨ連結体のみを純粋分離した。
同様な方法でＩＦＮαまたはＧ−ＣＳＦのアミノ末端に４０ｋＤａ ＰＥＧが各々結合したＰＥＧ−ＩＦＮ、ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体を製造した。
【００７４】
［比較例２］アルブミン−ｈＧＨ連結体の製造
実施例１で得られたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体にアルブミンを結合させるために、ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を１０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解したヒトアルブミン（ＨＡＳ、分子量約６７ｋＤａ）（緑十字、韓国）とｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：アルブミンのモル比が各々１：１、１：２、１：４または１：８になるようにして反応させた。得られた反応混合物を１００ｍＭリン酸塩緩衝液の状態で濃縮し、これに還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた。反応混合物を４℃で２０時間徐々に攪拌した。最良の結果を得るためのｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：アルブミンの最適のモル比は１：２であることが確認された。
【００７５】
結合反応後、反応混合物からスーパーデックスサイズ排除クロマトグラフィーを行って未反応の出発物質および副産物を除去した。反応混合物を濃縮した後、カラムに加え、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を流速２．５ｍｌ／分で溶離して精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体を得た。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体分画には不純物として少量の未反応のアルブミンおよびｈＧＨ二量体が混じっているので、これの除去のためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体分画を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液で平衡化したＳＰ５ＰＷ（Waters、米国）カラムに加え、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液を線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．５Ｍ）で流して分画を得ることによって純粋なｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体を得た。
同様な方法でＩＦＮα、Ｇ−ＣＳＦまたは１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体に各々アルブミンが結合したＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−アルブミン結合体を製造および精製した。
【００７６】
［比較例３］Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の製造
実施例８の段階１で得られた精製されたＦａｂ’を活性化緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．２ｍＭ ＤＴＴ）に１時間放置して遊離−ＳＨ基を活性化させた。緩衝液をＰＥＧ修飾緩衝（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５））に取り替えた。生成した溶液にマレイミド−ＰＥＧ（分子量４０ｋＤａ、Shearwater Inc.、米国）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：１０になるように添加した。この反応混合物を４℃で２４時間徐々に攪拌した。
【００７７】
反応終了後、得られた反応混合物を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００（Superdex 200、Pharmacia社製）カラムに加え、同じ緩衝液を１ｍｌ／分の流速で流してＦａｂ’−Ｓ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体を含む分画を溶離した。未反応のＦａｂ’は前記連結体よりも遅く溶離、除去された。残っている未反応のＦａｂ’を除去するため、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０（PolyLC Inc.、米国）カラムに加えた後、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ４．５）を線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）で流して溶離した。結果として、Ｆａｂ’のＣ−末端に隣接する−ＳＨ基に４０ＫＤａ ＰＥＧが連結された純粋なＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体を得た。
【００７８】
［試験例１］タンパク質結合体の確認および定量
（１）タンパク質結合体の確認
４〜２０％の濃度勾配を有するゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ法（R & D system、米国）を用いて前記実施例で製造したタンパク質結合体の修飾状態を分析した。
ｈＧＨ、ｈＧＨ−ＰＥＧ、ＩＦＮおよびＩＦＮ−ＰＥＧにＤＴＴ（Dithiothreitol）を各々５０ｍＭの量で添加した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩｇＧ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧおよびＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩｇＧはＤＴＴなしで展開した。
【００７９】
図２および図３は、各々ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧおよびＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。左の余白の数字は分子量マーカー（ｋＤａ）である。
図２から分かるように、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の見かけ分子量は約１７０ｋＤａである。しかし、ＩｇＧタンパク質結合体と野生型ＩｇＧの分子量差異はＳＤＳ−ＰＡＧＥで区別しにくいため、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体およびＩｇＧを各々ＤＴＴで処理して還元させて軽鎖および重鎖に分離し、その結合状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥで各々確認した（図４）。
【００８０】
ＩｇＧをＤＴＴで処理すると、分子量によってＩｇＧの軽鎖が先に分離され、ＩｇＧの重鎖が後で分離される。ＤＴＴで処理したｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のバンドは前記軽鎖および重鎖断片に各々ｈＧＨ−ＰＥＧ（３．４ｋＤａ）連結体の分子量を足すことによって計算された分子量に該当する位置に現れた。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の軽鎖は約８０ＫＤａの位置にバンドが現れたｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の重鎖よりも低い位置（さらに小さい分子量）にバンドを形成した。前記結果からｈＧＨは軽鎖と重鎖に同じ確率で結合し、ＩｇＧとｈＧＨが１：１のモル比で結合したことが分かる。
【００８１】
（２）タンパク質結合体の定量
前記実施例で製造した各タンパク質結合体の量はサイズ排除クロマトグラフィー（カラム：Superdex、溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））から観察された結合体のピーク面積をコントロールと比較して計算する方法で測定した。予め定量されたｈＧＨ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦ、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＩｇＧで各々サイズ排除クロマトグラフィーを行った後、ピーク面積の相対的感応（response）係数を測定した。各タンパク質結合体を一定量用いて同じ条件下でサイズ排除クロマトグラフィーを行い、ここから得られた各タンパク質結合体のピーク面積からＩｇＧに該当するピーク面積を引いた値を各タンパク質結合体に存在する生理活性タンパク質の定量値とした。
【００８２】
クロマトグラフィー法以外にＥＬＩＳＡ法（R&D system、米国）を並行して行った。ＩｇＧの一部がポリペプチドの生物学的活性部位に結合すると生物学的活性部位に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって得られる定量値はクロマトグラフィーによって計算される値よりも減少すると予測される。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の場合にはＥＬＩＳＡによって測定された値がクロマトグラフィーによって決定された値の約３０％に過ぎないことが確認された。
【００８３】
（３）タンパク質結合体の純度および質量確認
実施例３で得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の純度を分析するために、逆相カラム（２５９ＶＨＰ５４カラム、Ｖｙｄａｃ社、米国）を用いて逆相ＨＰＬＣを行った。結合体を０．５％ＴＦＡの存在下でアセトニトリル溶媒で線形濃度勾配法法（アセトニトリル濃度：４０％→１００％）を用いて溶離し、２８０ｎｍで検出した。図５から分かるように、結合体の純度は９５％以上である。
各々の実施例で得られたタンパク質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィーを行った後、２８０ｎｍで吸光度を分析した。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ、ＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩｇＧ、Ｇ−ＣＳＦおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧは各々１７０，０００〜１８０，０００ダルトンの分子量に該当する単一ピークを示した。ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧのピークは分子量２００，０００ダルトンに該当する位置から観察された。
【００８４】
各タンパク質結合体の正確な分子量を測定するために、精製された試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Voyager DE-STR、Applied Biosystems、ＵＳＡ）超高速質量分析器を用いて分析した。マトリックスとしてはシナピン酸（sinapinic acid）を用いた。各試料０．５μｌをスライドガラスに塗布し、空気中で乾燥した。同じ容積のマトリックス溶液をスライドガラス上に滴下した後、スライドガラスを空気中で乾燥し、イオン源（ion source）に導入した。検出はポジティブ方式でリニアー−モードＴＯＦ装置によって行い、イオンは遅延されたイオン抽出器を用いる分割抽出供給源で、遅延された抽出時間は７５０ｎｓｅｃ／１５００ｎｓｅｃで、約２．５ｋＶの全電位差を通じて加速化した。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の質量分析結果を下記表１および図６に示す。
【００８５】
【表１】
【００８６】
前記結果は、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の純度が９０％以上であり、測定された分子量が理論値とほとんど同じであることを示した。また、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体はＩｇＧがｈＧＨ−ＰＥＧ連結体に１：１のモル比で結合した形態であった。
また、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法で測定された実施例１０で製造したＡＧ ＩｇＧの分子量は野生型ＩｇＧよりも３，０００Ｄａが少ない１４７ｋＤａであった（図９）。減少した分子量３，０００Ｄａは糖鎖の理論的サイズに該当するので、ＩｇＧの糖鎖が完全に除去されたことを確認できた。
下記表２は前記実施例１１〜１２で製造したＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧおよびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の分子量を示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
［試験例２］薬物動力学分析Ｉ
前記実施例および比較例で製造したＩｇＧ−タンパク質結合体、ＰＥＧ−タンパク質連結体およびアルブミン−タンパク質結合体（試験群）の生体内安定性および薬物動力学係数を野生型生理活性タンパク質（対照群）と比較した。下記実験では、各群当り５匹のスプラーグ・ドーリー（ＳＤ）ラットを用いた。対照群、ＰＥＧ−連結体、アルブミン−タンパク質結合体およびＩｇＧ−タンパク質結合体を各々１００ｕｇ／ｋｇずつラットに皮下注射した。対照群から注射後０．５、１、２、４、６、１２、２４、３０、４８、７２および９６時間後に血液試料を得、試験群からは注射後１、６、１２、２４、３０、４８、７２、９６、１２０、２４０および３２０時間後に血液試料を得た。血液試料をヘパリンでコーティングされたチューブに集めて凝固を防止し、高速マイクロ遠心分離器で４℃、３０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞を除去した。血漿中のタンパク質濃度は各生理活性タンパク質に対する抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００８９】
野生型ｈＧＨ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯとこれらのタンパク質連結体および結合体の薬物動力学値を下記表２〜表６に示し、ここでＴｍａｘは最高薬物濃度に至る時間を、Ｔ１／２は薬物の血中半減期を、ＭＲＴ（mean residence time）は薬物の平均的な体内滞留時間を意味する。
【００９０】
【表３】
【００９１】
【表４】
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
前記表３および図７から分かるように、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧタンパク質結合体の血中半減期は１３．９時間であって、これは野生型ｈＧＨに比べて約１３倍増加したものであり、比較例１で製造したｈＧＨ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体（７．７時間）よりも約２倍増加したものである。ＰＥＧの一方の末端にアルブミンが結合したｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体の半減期は５．９時間であった。このような結果から、本発明のタンパク質結合体は遥かに優れた血中持続性を示すことが確認できる。
【００９６】
さらに、表４および図１０において、ＩＦＮαに対する結果もｈＧＨと同様な結果を示すが、本発明のタンパク質結合体が示す血中半減期の増加効果は遥かに大きかった。野生型ＩＦＮαの半減期は１．７時間であるが、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ＩＦＮα連結体の半減期は３５．８時間に増加し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体の半減期は１７．１時間に増加した。これに対し、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の半減期は７６．７時間と著しく増加した。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の半減期は５９．７時間であって、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体とほとんど等しかった。この結果から、糖鎖の不在が結合体の生体内安定性には影響を及ぼさないことが分かる。
【００９７】
表５および６から分かるように、Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体の血中持続性も前記ｈＧＨおよびＩＦＮのものと同様な傾向を示した。４０ｋＤａ ＰＥＧが修飾されたタンパク質連結体およびアルブミン結合体の半減期は野生型Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体よりもさらに長かった。しかし、本発明のタンパク質結合体は遥かに長い半減期を示した。タンパク質の血中薬物持続性を増加させるＩｇＧのこのような効果はアミノ酸が修飾された誘導体からもまた観察された。このような結果から、他のタンパク質に適用された本発明のタンパク質結合体はまた前述の好ましい効果を示すことが予想できる。
【００９８】
表７および図８と図１１から分かるように、糖鎖化された残基を有するＥＰＯに対しても本発明のタンパク質結合体の血中半減期の増加効果が明らかである。すなわち、野生型ＥＰＯの血中半減期は９．４時間であり、血中安定性が高い高糖鎖化ＥＰＯであるDarbepoetin−α（Aranesp、Amgen、ＵＳＡ）の半減期は１４．９時間であった。ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の場合は、血中半減期が６７．５時間に著しく増加し、ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の血中半減期も４７．８時間に増加した。
【００９９】
前記結果から分かるように、生理活性タンパク質が非ペプチド性重合体および免疫グロブリンと共有結合した本発明のタンパク質結合体は、野生型タンパク質に比べて数十倍以上増加した血中半減期を有する。また、タンパク質結合体の血中半減期増加効果は糖鎖除去された免疫グロブリンを用いても同様な水準に保持された。
【０１００】
特に、従来報告されたＰＥＧ剤形のうち血中持続性が最も高い、４０ｋＤａ ＰＥＧによって修飾されたタンパク質結合体と比較すると、本発明のＩｇＧタンパク質結合体は遥かに高い持続性を示す。また、ＩｇＧの代わりにアルブミンを結合させたタンパク質結合体に比べて、本発明のタンパク質結合体は著しく優れた持続性を示した。このような結果は、本発明のタンパク質結合体がタンパク質薬物の持続型製剤を製造するのに効果的に使用できることを意味する。本発明のタンパク質結合体が、点突然変異を有するＧ−ＣＳＦ誘導体を含む幅広いタンパク質であるのに対し、従来報告されたＰＥＧ結合タンパク質またはアルブミンタンパク質結合体よりも遥かに優れた血中安定性とさらに長いＭＲＴを示す本願の発見は、本発明のタンパク質結合体に対して確認された前記血中安定性および持続性増加効果が異なる生理活性ペプチドに対しても応用できることを強く暗示する。
【０１０１】
非ペプチド性重合体として１０ｋＤａ ＰＥＧを用いて製造したｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例７）の半減期を前記と同様な方法で測定したとき、半減期は９．５時間であり、分子量３．４ｋＤａであるＰＥＧを用いたｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（１３．９時間）よりも多少短かった。スクシンイミジルプロピオネート基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基およびブチルアルデヒド基のような他の反応基を有するＰＥＧを用いて製造された結合体の見かけ分子量と血中半減期はアルデヒド基を有するＰＥＧを用いて製造されたものと同様であった。
【０１０２】
［試験例３］薬物動力学分析II
実施例８および９で各々製造したＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体（−ＳＨ基、Ｎ−末端）、および比較例３で製造したＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の血中半減期を測定するために、Ｆａｂ’を対照群とし、前記結合体または連結体を用いて試験例２と同様な方法で薬物動力学分析を行った。その結果を図１２に示す。
図１２から分かるように、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体はＦａｂ’およびＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて２〜３倍延長された血中半減期を示した。
【０１０３】
［試験例４］試験管内活性測定
（１）ｈＧＨタンパク質結合体の試験管内活性比較
ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例１）、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ｈＧＨ連結体（比較例１）およびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体（比較例２）の試験管内活性をｈＧＨ依存性有糸分裂をする細胞であるラット結節リンパ腫（rat node lymphoma）細胞株Ｎｂ２（European Collection of Cell Cultures(ECACC) #97041101）を用いて次のように測定した。
【０１０４】
Ｎｂ２細胞をフィッシャー培地（Fisher's medium）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％ＮａＣＯ３、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭグルタミンを添加した培地で培養した。得られた細胞を１０％ウシ胎児血清を除いた同じ培地で２４時間さらに培養した。９６ウェルプレートに２ｘ１０４／ウェルの量の細胞を入れた後、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ｈＧＨおよびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン、および対照群である国際標準品（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）を多様に各ウェルに添加した後、３７℃、ＣＯ２培養器で４８時間培養した。その後、細胞の成長程度（各ｗｅｌｌの細胞数）を測定するために、２５μｌの細胞染色薬（cell titer 96 Aqueous One Solution(promega社製、米国））を各ウェルに入れた後、３７℃で４時間さらに培養した。４９０ｎｍで吸光度を測定して各試料の力価を計算し、計算された力価を表８に示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
表８から分かるように、試験に用いたすべての試料は試験管内活性を有した。また、ＰＥＧによって修飾されたｈＧＨの試験管内活性は修飾されていないｈＧＨに比べて低かった。インターフェロンの場合、ＩＦＮと１２ｋＤａ ＰＥＧおよび４０ｋＤａ ＰＥＧの連結体は各々野生型の約２５％および７％程度の試験管内活性を有すると報告されている（P.Bailonら、Bioconjugate Chem.2001. 12:195〜202）。修飾されたＰＥＧの分子量が増加するほどＰＥＧ連結体の試験管内活性は減少した。４０ｋＤａのＰＥＧが修飾されたｈＧＨ連結体の試験管内活性は野生型ｈＧＨの約７．６％に過ぎず、ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体もまた野生型対比約５．２％程度と低い試験管内活性を示した。しかし、ＩｇＧをｈＧＨ−ＰＥＧ連結体に結合させた場合は、その相対活性は野生型の３０％以上と著しく高くなった。このような結果は、本発明のタンパク質結合体が血中半減期の画期的な増加とともに高い生体内活性を有することを示す。本発明のＩｇＧタンパク質結合体の場合、レセプターに対する結合親和性を保存する役割をするＩｇＧとの結合によって高い血中安定性、および空間的余裕を提供する非ペプチド性重合体によってタンパク質の活性が増加したとみられる。このような効果は、他の生理活性タンパク質のＩｇＧタンパク質結合体でも起こることと期待される。
【０１０７】
（２）ＩＦＮαタンパク質結合体の試験管内活性比較
ＩＦＮαタンパク質結合体の試験管内活性を比較するために、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例３）、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ＩＦＮα連結体（比較例１）およびＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体（比較例２）の抗ウイルス活性を水胞性口炎ウイルスで飽和させたマディン−ダービ（Madin-Darby）ウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ、Madin Darby Bovine Kidney、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２）を用いる細胞培養生検法（cell cultrue biopsy method）で測定した。ＰＥＧで修飾されていないＩＦＮα ２ｂ（ＮＩＢＳＣ ＩＦＮ）を対照群として用いた。
【０１０８】
ＭＤＢＫ細胞を、ＭＥＭ（minimum essential medium:JBI）に１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加された培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。試料と標準物質（ＮＩＢＳＣインターフェロン）を同じ培地を用いて一定濃度に希釈して９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れた。前記で培養された細胞液を各ウェルに１００μｌずつ加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１時間培養した。１時間後、ウイルス濃度が５〜７ｘ１０３ＰＦＵであるＶＳＶ（Vesicular stomatitis virus）を５０μｌずつ各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１６〜２０時間さらに培養した。試料または標準物質を入れずに細胞とウイルスのみを入れたウェルを陰性対照群とし、ウイルス希釈溶液を入れずに細胞のみを入れたウェルを陽性対照群として各々用いた。
【０１０９】
培養液を除去し、生きている細胞を染色するために、ニュートラルレッド（neutral red）溶液１００μｌずつを各ウェルに加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間さらに培養した。吸出によって上澄液を除去した後、抽出溶液（１００％エタノールと１％酢酸との１：１混合物１００μｌ）を各ウェルに入れた。染色された細胞を振盪させながら抽出溶液に懸濁した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群の細胞成長に比べての陽性対照群の細胞成長を１００％とみなして最高細胞成長の５０％を示すＥＤ５０を計算した。
【０１１０】
【表９】
【０１１１】
表９から分かるように、ＰＥＧによって修飾されたＩＦＮαの活性は修飾されていないＩＦＮαに比べて低かった。特に、ＰＥＧ部分の分子量が増加するほど血中安定性は増加するが、相対活性は次第に減少した。４０ｋＤａのＰＥＧが修飾されたＩＦＮα連結体は野生型活性の約４．８％に該当する非常に低い活性を示した。前述のように、１２ｋＤａ ＰＥＧおよび４０ｋＤａ ＰＥＧによって修飾されたＩＦＮαは各々野生型の約２５％および７％程度の試験管内活性を示すと報告されている（P.Bailonら、Bioconjugate Chem. 2001. 12: 195〜202）。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加すれば血中半減期は長くなるが、その薬効が急激に減少するので、増加した薬剤学的活性および延長された半減期を有する物質の開発が要求されてきた。ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体もまた野生型対比約５．２％程度であって、低い試験管内活性を示した。しかし、ＩＦＮαをＩｇＧで修飾した場合（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体）、相対活性は野生型の１１．２％に増加した。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体は野生型の１０．２％に該当する試験管内活性を示すので、糖鎖の不在がタンパク質結合体の活性には別の影響を及ぼさないことを確認できた。
このような結果は、本発明のＩｇＧタンパク質結合体が延長された半減期とともに高い生体内活性を示すことを示す。
【０１１２】
（３）Ｇ−ＣＳＦタンパク質結合体の試験管内活性比較
野生型Ｇ−ＣＳＦ（Filgrastim）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体、２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体（Neulasta, USA）、４０ｋＤａ ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体連結体（比較例１）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−アルブミン結合体（比較例２）および１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例４）の試験管内活性を測定した。
【０１１３】
まず、ヒト骨髄起源の細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０、Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female）を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞の数を約２．２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。ＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide、culture grade/SIGMA）を１．２５％（ｖ／ｖ）になるように細胞に添加した。約２×１０４個の懸濁した細胞を含むＤＭＳＯ９０μｌで処理した培養液を９６ウェルプレート（Corning/low evaporation 96 well plate）の各ウェルに入れ、３７℃、５％ＣＯ２培養器で７２時間培養した。
【０１１４】
Ｇ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（R & D systems、米国）を用いて各試料の濃度を決定し、各試料を１０μｇ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０で適宜希釈した。生成した溶液をＲＰＭＩ１６４０で１／２ずつ連続希釈する過程を１９回繰り返した。
このようにして製造された試料１０μｌずつを培養中のＨＬ−６０細胞が入っている各ウェルに加え、最終濃度を１０００ｎｇ／ｍｌから連続的に半減させた。タンパク質試料で処理された細胞を３７℃培養器で７２時間さらに培養した。
培養後、細胞の成長程度を調査するために、CellTiter96（商標）（PROMEGA社、米国）を用いて６７０ｎｍで吸光度を測定することによって細胞数を決定した。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
表１０から分かるように、アミノ酸を変形させた１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体のＩｇＧタンパク質結合体も野生型のタンパク質結合体と同様な効果を示した。ＰＥＧで修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体は修飾されていないものに比べて血中半減期は増加するが、活性は低下することが既に確認されている（韓国特許出願第２００３−１７８６７号）。特に、ＰＥＧ部分の分子量が増加するほどＰＥＧによって修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の血中安定性は増加したが、その相対活性は次第に減少した。４０ｋＤａのＰＥＧで修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体連結体は、野生型の約１０％に該当する非常に低い試験管内活性を示した。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加するほど血中半減期は増加するが、その薬効は急激に減少するので、改善された薬剤学的活性および延長された半減期を有する物質の開発が要求されてきた。一方、アルブミンで修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体は野生型の約２３％に該当する相対的に低い試験管内活性を示した。しかし、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体をＩｇＧで修飾した場合（１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体）、その相対活性は野生型の６９％以上の水準に増加した。このような結果は、本発明のＩｇＧタンパク質結合体が延長された半減期とともに高い生体内活性を有することを示す。
【０１１７】
（４）ＥＰＯタンパク質結合体の試験管内活性比較
野生型ＥＰＯ（ＢＲＰ、ＵＫ）、高糖鎖化ＥＰＯ（Aranesp、ＵＳＡ）およびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の試験管内活性を測定した。
まず、ヒト骨髄起源の細胞株であるＴＦ−１細胞（ATCC CRL-2003、erythroleukemia）を１０％のＦＢＳ、１２ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した後、ＧＭ−ＣＳＦを除去した同じＲＰＭＩ１６４０培地で１日間培養した。約２×１０４個の細胞を有する培養液５０μｌずつを９６−ウェルプレート（Corning/low evaporation 96 well plate）の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２培養器で７２時間培養した。
【０１１８】
ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（R & D systems、米国）を用いて各試料の濃度を測定し、各試料をＲＰＭＩ１６４０で最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように適宜希釈した。生成した溶液をＲＰＭＩ１６４０で１／２ずつ連続希釈する過程を１９回繰り返した。
このように製造された試料を培養中のＴＦ−１細胞が入っている各ウェルに５０μｌずつ加え、最終濃度を５μｇ／ｍｌから連続的に半減させた。タンパク質試料で処理されたプレートを３７℃、５％ＣＯ２培養器で７２時間さらに培養した。
培養後、細胞の成長程度を調査するために、CellTiter96（商標）AQueous One（Cat. No. G3581、PROMEGA社製、米国）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定することによって細胞数を決定した。
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】
表１１から分かるように、試験に用いたすべての試料はヒト骨髄起源の細胞株の成長を促進させることによって立証されたように試験管内活性を有する。また、高糖鎖化されたＥＰＯとＰＥＧ−ＩｇＧ連結体によって修飾されたＥＰＯの試験管内活性は修飾されていないＥＰＯよりも低かった。しかし、本発明のＥＰＯタンパク質結合体の場合、著しく増加した血中半減期のため、修飾されていないＥＰＯに比べて優れた生体内活性を有すると期待される。本発明のＥＰＯタンパク質結合体の場合、レセプターに対する結合力を保存する役割をするＩｇＧとの結合による増加した血中安定性および空間的余裕を提供する非ペプチド性重合体によってタンパク質の活性が増加したものとみられる。
【０１２１】
（５）Ｆａｂ’タンパク質結合体の細胞毒性中和
実施例８および９で製造したＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧおよびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体、および比較例３で製造したＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体がマウス繊維芽細胞株Ｌ９２９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１４８）に対するＴＮＦ−αの細胞毒性を中和させる能力を測定することによって、これらの試験管内活性を調査した。
【０１２２】
各々のＦａｂ’結合体および連結体を２倍ずつ順次希釈し、希釈液各１００μｌずつを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ｒｈＴＮＦ−α（R & D systems）と、ＲＮＡ合成の阻害剤であるアクチノマイシン−Ｄ（Sigma）を各々１０ｎｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌの濃度になるように各ウェルに加えた。この反応混合物を３７℃、５％ＣＯ２の条件で３０分間反応させた後、分析用マイクロプレートに移した。Ｌ９２９細胞株培養液５０ｕｌずつを５ｘ１０４細胞／ウェルになるように各ウェルに加えて３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。ウェルの培養液を除去した後、ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶けているＭＴＴ（sigma）を５０μｌずつ各ウェルに入れた後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２培養器で４時間培養した。ＤＭＳＯ １５０μｌを各ウェルに加えて溶解した。５４０ｎｍで吸光度を測定して試験Ｆａｂ’結合体および連結体によるｒｈＴＮＦ−αの細胞毒性の中和程度を決定した。対照群としては実施例８の段階１で得られた精製されたＦａｂ’を用いた。
【０１２３】
図１３の結果から分かるように、すべてのタンパク質結合体および連結体はＦａｂ’と同様な吸光度を示した。このような結果は、ＩｇＧがＦａｂ’のＮ−末端またはＣ−末端近くの遊離システイン残基にＰＥＧスペーサーを通じて結合したＦａｂ’−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体がＦａｂ’の生物学的活性を保持することを示す。
【０１２４】
［試験例５］動物モデルにおける生体内活性測定
（１）ｈＧＨタンパク質結合体の生体内活性比較
各実験群当り１０匹ずつの脳下垂体が除去された雄スプラーグ・ドーリーラット（５週齢、ＳＬＣ社製、日本）を用いて体重増加試験を行ってｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体および野生型ｈＧＨの生体内活性を測定した。溶媒対照群、野生型ｈＧＨ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体、およびｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体を、下記表１２のような投与スケジュールおよび容量に従って、ラットの肩背部の皮下に２６Ｇ注射器（１ｍｌ、（株）韓国ワクチン）で各々投与した。投与前および投与１６時間後ラットの体重を測定した。最終投与から２４時間後、ラットをエーテル麻酔で致死させ、肉眼で脳下垂体の残存有無を検査して、脳下垂体の残存物が観察された個体は結果から除外した。
【０１２５】
【表１２】
【０１２６】
各試料の投与後の体重変化を図１４に示す。標準品（対照群）として用いられた野生型ｈＧＨは生体内活性を保持するために毎日投与しなければならないので、毎日１回ずつ１２日間投与したので、グループ２のラットは投与期間を通じて体重増加が観察された。ｈＧＨ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体を６日に１回投与したグループ３のラットは、投与後３日まで持続的に体重が増加し、３日以降は体重増加率が鈍化した。このような結果は、ｈＧＨ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体が野生型ｈＧＨに比べて遥かに長い半減期および高い試験管内活性を示した試験例１および２の結果からの予想と一致する。特に、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を野生型投与容量の１／３容量で６日に１回投与することによって得られる効果は野生型を毎日投与したものと等しいか、より良好であった。これは、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性が野生型よりも３倍以上高いことを意味する。
【０１２７】
（２）Ｇ−ＣＳＦ誘導体タンパク質結合体の生体内活性比較
１７番目のアミノ酸がセリンで置換された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦを用いて本発明のタンパク質結合体の効果を調査するために、野生型Ｇ−ＣＳＦ、市販中の２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体および１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を比較した。本発明の１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は溶媒（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１％グリシン、０．２５％マンニトール、ｐＨ７．０）に溶解した。比較群としては、野生型メチオニルＧ−ＣＳＦ連結体（Filgrastim、Amgen、ＵＳＡ）および２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＧ−ＣＳＦ（Neulasta、Amgen、ＵＳＡ）を前記と同じ溶媒に希釈して使用した。７週齢の雌ＩＣＲマウスをセムタコＢｉｏ（韓国）から購入して一週間の順化期間を経た後試験に用いた。試験開始時、ＩＣＲマウスの体重は３０〜３５ｇであった。順化期間および試験期間中には実験動物用飼料（三養社、韓国）および水を自由に摂取させ、温度２２±３℃、相対湿度５５±５％、換気回数１０〜１２回／時間、照度１５０〜２００ルクス（lux）および１２時間明／１２時間暗の明暗周期の条件下で檻に閉じ込めた。各実験群は５匹のマウスからなり、複合抗癌剤と各試料を下記表１３のような投与スケジュールおよび容量でマウスに投与した。好中球減少症（Neutropenia）動物モデルはシクロヘキサミド（ＣＰＡ；Sigma、米国）１３０ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；Sigma、米国）４．５ｍｇ／ｋｇおよびビンクリスチン（ＶＣＲ；Sigma、米国）１ｍｇ／ｋｇの混合物をＩＣＲマウスの腹腔内に単回投与して製造した。無処置群は抗癌剤を投与せず、好中球数の減少を示さない。溶媒対照群は抗癌剤を投与して好中球の数を低め、薬物の代わりに賦形剤のみを投与した群である。抗癌剤投与後１日目から５日目まで午前１０時頃に野生型Ｇ−ＣＳＦを１００μｇ／ｋｇ／日の容量で皮下注射した。１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体と２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体（Neulasta、Amgen、ＵＳＡ）は抗癌剤投与後１日目に１回のみ投与したが、投与容量は１０００μｇ／ｋｇ／日であって、野生型１日投与容量の２倍量で（２００μｇ／ｋｇ／日）５日分を一回に投与した。抗癌剤投与後１、２、３、４、５、６および８日目に０．３〜０．５ｍｌの血液をマウスの眼窩静脈層から採血した。採血時間は薬物投与６時間後である午後４時頃であった。自動血球測定器で白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）および血小板（Platelet）の数を測定した。また、血液塗抹標本を製作してギムザ（Giemsa）染色を行った。各血球を分別計数して得られた好中球（neutrophil）の比率を得、これに基づいて下記式１によって好中球の数を算出した。
【０１２８】
＜式１＞
好中球の数（細胞／ｍｍ３）＝総ＷＢＣの数（細胞／ｍｍ３）×好中球比率（％）×１／１００
無処置群、溶媒対照群、および１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ群から得られた値の統計的有意義性を検証するために、各群の血球数および体重に対してStudent’s t-testを用いて統計的分析を行った。
【０１２９】
【表１３】
【０１３０】
各試料の投与後の好中球回復効果を図１５に示す。標準品として用いた野生型Ｇ−ＣＳＦを５日間毎日投与したとき、投与期間中好中球の数が徐々に増加して５日目に最高値に達した。２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを１日投与容量の２倍容量で１回投与すると野生型Ｇ−ＣＳＦを毎日投与したときに観察されたものの２／３程度の生体内効力を示した反面、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体の生体内活性に比べて３倍以上高い活性を示した。また、本発明のタンパク質結合体はＧ−ＣＳＦを毎日投与した場合よりも２倍以上高い好中球回復効果を示したが、このような結果は、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体が野生型に比べて遥かに長い血中半減期と高い生体内活性を有するという結果と一致する。前記結果から、野生型タンパク質を用いた場合と同様に、アミノ酸を変形させた誘導体タンパク質からもＩｇＧおよびＰＥＧの共有結合による本発明のタンパク質結合体の効果を同様に示すことが分かる。したがって、本発明のタンパク質結合体は、頻繁な投与が要求される野生型Ｇ−ＣＳＦの短所を克服しながらＧ−ＣＳＦの血中半減期および生体内活性を著しく増加させる目的を同時に満たす持続型剤形として効果的に利用できる。
【０１３１】
（３）ＥＰＯタンパク質結合体の生体内活性比較
野生型ＥＰＯ、高糖鎖化ＥＰＯ（Aranesｐ、ＵＳＡ）、およびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を比較するために、前記試験試料を投与したラットにおける血液成分の変化を調査した。本実験は、文献〔J.C. Egrie and Browne, British Journal of Cancer (2001) B4 (Supplement 1), 3-10〕に記述された方法を若干変形して次のように行った。
【０１３２】
本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を溶媒（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１％グリシン、０．２５％マンニトール、ｐＨ７．０）に溶解した。比較群としては、野生型ＥＰＯおよび高糖鎖化ＥＰＯを前記と同じ溶媒に希釈して用いた。７週齢の雌ラットを大韓バイオリンク（株）（韓国）から購入して一週間の順化期間を経た後試験に用いた。試験開始時のラットの体重は２００〜２５０ｇであった。順化期間および試験期間中には実験動物用飼料（第一製糖（株）、韓国）および水を自由に摂取させ、温度２２±３℃、相対湿度５５±５％、換気回数１０〜１２回／時間、照度１５０〜２００ルクス（lux）および１２時間明／１２時間暗の明暗周期の条件下で檻に閉じ込めた。各実験群は５匹のラットからなり、前記のように準備された各試験試料を下記表１４のような投与容量およびスケジュールに従ってラットの肩背部の皮下に２６Ｇ注射器（１ｍｌ、（株）韓国ワクチン）で投与した。
【０１３３】
投与後、３日に一回ずつ一ヶ月間尻尾の静脈から血液凝固防止剤（ＥＤＴＡ）を含むチューブに全血試料を採取した。血球自動測定装備（Ｖｅｔ ＡＢＣ）を用いて血液試料のヘマトクリット（hematocrit）を測定した。
【０１３４】
【表１４】
【０１３５】
各試料の投与後のヘマトクリット回復効果を図１６に示す。標準品として用いた野生型ＥＰＯを５日間毎日投与したとき、投与期間中ヘマトクリットの数値が徐々に増加して９日目に最高値に達した。高糖鎖化ＥＰＯを投与したグループ３のラットでは、ヘマトクリット数値が注射後６日間は速く増加したが、以降は急速に減少した。これに対し、本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は、ヘマトクリット数値の初期増加速度が高糖鎖化ＥＰＯよりも速く、増加幅もさらに大きく、他の試験タンパク質に比べて高い生体内活性を２週間以上保持した。このような結果は、ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体が野生型ＥＰＯまたは高糖鎖化ＥＰＯに比べて遥かに長い血中半減期を示す試験例２の結果から期待されるものと一致する。したがって、本発明のタンパク質結合体は、過度に頻繁な投与が要求される野生型ＥＰＯの短所を克服するとともに、ＥＰＯの血中半減期および生体内活性を著しく増加させる目的を同時に満たす持続型剤形として効果的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のクロマトグラムである。
【図２】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図３】インターフェロン−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図４】ＤＤＴ処理前と後のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図５】ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の質量スペクトルである。
【図７】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体がＰＥＧ−ｈＧＨ連結体に比べて優れた血中安定性を有することを示す薬物動力学グラフである。
【図８】エリトロポイエチン−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体が自由エリトロポイエチンまたは高糖鎖化によって安定化されたエリトロポイエチンに比べて向上した血中半減期を有することを示す薬物動力学グラフである。
【図９】非糖鎖化ＩｇＧ（ＡＧ ＩｇＧ）の分子量スペクトルである。
【図１０】ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体が野生型ＩＦＮαに比べて向上した血中安定性を有し、糖鎖がないにもかかわらず活性を保持することを示す薬物動力学グラフである。
【図１１】ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体が野生型ＥＰＯに比べて向上した血中安定性を有し、糖鎖がないにもかかわらず活性を保持することを示す薬物動力学グラフである。
【図１２】Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体およびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体が野生型Ｆａｂ’およびＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて向上した血中半減期を有することを示す薬物動力学グラフである。
【図１３】Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体およびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示すグラフである。
【図１４】ビヒクル（３０μｇ／日；グループ１）、野生型ｈＧＨ（３０μｇ／日；グループ２）、ｈＧＨ−ＰＥＧ（３０μｇ／日；グループ３）、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（３０μｇ／日；グループ４）、およびｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（１０μｇ／日；グループ５）の投与後、ラット体重の経時変化に基づくｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示す。
【図１５】好中球（Neutrophil）数の経時変化に基づくＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示す：非処理（グループ１）、ビヒクルのみを注射（グループ２）、野生型Ｇ−ＣＳＦ処理（グループ３）、２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ処理（グループ４）、および１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体処理（グループ５）。
【図１６】ヘマトクリット（Hematocrit）数の経時変化に基づくＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示す：溶媒のみを注射（グループ１）、野生型ＥＰＯ処理（グループ２）、高糖鎖化ＥＰＯ処理（グループ３）、およびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体処理（グループ４）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内半減期が延長された活性持続型タンパク質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは変性しやすいか、血液、肝または腎臓において酵素によって分解しやすい。このようなポリペプチドの低い安定性のため、活性成分の有効血中濃度を保持するためにはポリペプチド薬物を患者に持続的な頻度で投与する必要がある。さらに、ポリペプチド薬物は通常注射によって投与されるので、ポリペプチド薬物の頻繁な注射は患者に相当な不便をかけることになる。したがって、高い薬理学的効果を保持しながらも血中半減期が増加されたポリペプチド薬物を開発するために多くの研究が行われてきた。前記好ましいポリペプチド薬物はまた向上した血中安定性、高い活性、様々なポリペプチドへの適用可能性の要件を満たし、また、患者への投与時、好ましくない免疫反応を誘発してはならない。
【０００３】
タンパク質の安定性を改善するために最も広く用いられる方法の一つは、ポリペプチドのプロテアーゼとの接触を防止するポリエチレングリコール（polyethylene glycol; PEG）のような溶解度の高い高分子でポリペプチドを化学的に変形させるものである。ＰＥＧはポリペプチド薬物に特異的にまたは非特異的に結合してポリペプチド薬物の溶解度を増加させ、またその加水分解を防止することによって、ポリペプチド薬物の血中安定性を増加させ、低い抗原性のため如何なる免疫反応も起こさないと知られている（Sadaら、J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71: 137-139）。しかし、このようにＰＥＧが結合したタンパク質は、ＰＥＧの分子量が増加するほど活性成分の活性および生産収率が減少するという短所がある。二つの活性化されたＰＥＧと結合したインターフェロンだけでなく、異なる活性を有する２種のポリペプチドがＰＥＧスペーサーで連結された結合体が米国特許第５，７３８，８４６号および国際特許公開ＷＯ９２／１６２２１に各々開示されているが、これらは生体内で生理学的活性ポリペプチドの活性延長という点においては顕著な効果を示さない。
【０００４】
また、組合せヒト顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をヘテロ−二官能性ＰＥＧを通じてアルブミンに共有結合させることによってＧ−ＣＳＦの血中半減期を増加させ得ると報告されている（Kinstler et al., Pharmaceutical Research, 1995, 12(12): 1883-1888）。しかし、修飾されたＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンの安定性は、Ｇ−ＣＳＦ自体に比べてただ４倍に過ぎないため、これまで実用化されていない。
【０００５】
生理活性ポリペプチドの生体内安定性を向上させるための他の方法として、安定したタンパク質と融合した活性ポリペプチドを組合せ技術によって形質転換体で生産する。たとえば、アルブミンは、それに融合したポリペプチドの安定性を向上させるのに最も効果的なタンパク質の一つであると知られており、そのような融合タンパク質は多く報告されている（国際特許公開ＷＯ９３／１５１９９およびＷＯ９３／１５２００、およびヨーロッパ特許公開第４１３，６２２号）。しかし、アルブミンと結合した融合タンパク質は活性減少という問題を依然として有している。
【０００６】
米国特許第５，０４５，３１２号は、成長ホルモンの活性を向上させるために、カルボジイミド（carbodiimide）、グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）、酸クロリドなどのような架橋結合剤を用いて成長ホルモンをウシ血清アルブミン（bovine serum albumin; BSA）またはマウスの免疫グロブリンに結合させる方法を開示している。しかし、この方法は、ただ標的成長ホルモンの活性を向上させることのみを目的とする。また、架橋結合剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド、酸クロリドなどのような化学物質を用いることは強い毒性および反応の非特異性のため不利である。
【０００７】
免疫グロブリンは、抗体−依存性細胞毒性（Antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC）または補体−依存性細胞毒性（Complement dependent cytotoxicity, CDC）を示す抗体として作用でき、糖鎖はＡＤＣＣおよびＣＤＣの発揮に重要な役割を果すと報告されている（Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985）。糖鎖がなくても非糖鎖化免疫グロブリンは糖鎖化したものと同様な血中半減期を有するが、補体またはレセプターに対する結合力は糖鎖除去により１０倍〜１０００倍減少する（Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993, Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989）。
【０００８】
生理活性ポリペプチドを種々の高分子と結合させるための多くの試みが行われてきたが、これらはいずれも安定性と活性を同時に増加させることはできなかった。
活性ポリペプチドの安定性を向上させるとともに、生体内活性を保持するための改善された方法として、本発明は、生理活性ポリペプチド、非−ペプチド重合体および免疫グロブリンが共有結合で互いに連結されたタンパク質結合体を提供する。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，７３８，８４６号公報
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ９２／１６２２１号公報
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ９３／１５１９９号公報
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ９３／１５２００号公報
【特許文献５】ヨーロッパ特許公開第４１３，６２２号公報
【特許文献６】米国特許第５，０４５，３１２号公報
【非特許文献１】Sadaら著、J. Fermentation Bioengineering, 1991年発行、71: 137-139頁
【非特許文献２】Kinstlerら著、Pharmaceutical Research, 1995年発行、12(12): 1883-1888頁
【非特許文献３】Burton D. 著、Molec. Immun. 22, 161-206頁、1985年発行
【非特許文献４】Waldmann H.著、Eur. J. Immunol. 23, 403-411頁、1993年発行
【非特許文献５】Morrison S. 著、J. Immunol. 143, 2595-2601頁、1989年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の主な目的は、生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化しながらも、生体内半減期を延長させ、免疫反応を誘発しないタンパク質結合体を提供することである。
本発明の他の目的は、生理活性ポリペプチド、生体親和性非ペプチド性重合体および免疫グロブリンが共有結合で互いに連結されたタンパク質結合体の製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、生体内半減期が延長された前記生理活性ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、生理活性ポリペプチドの活性を減少させることなく、その生体内安定性を向上させ、血中半減期を増加させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一実施態様に従って、本発明では、共有結合で互いに連結されたｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体が提供される。
【００１３】
また、本発明の他の実施態様に従って、本発明では、（ａ）少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、および少なくとも一つの免疫グロブリンを両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体と共有結合で連結する段階；および
（ｂ）共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項１記載のタンパク質結合体の製造方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに他の実施態様に従って、本発明では、タンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体を含む、半減期が長くなった生理活性ポリペプチドの医薬組成物が提供される。
【００１５】
本発明のさらに他の実施態様に従って、本発明では、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと共有結合で連結することを含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書に用いられる用語「生理活性ポリペプチド」とは、ヒトを含む哺乳動物に投与された場合、有用な生物学的活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をいい、「生理活性タンパク質」、「活性タンパク質」、「活性ポリペプチド」または「ペプチド薬物」という用語と相互交換的に使用され得る。
【００１７】
本明細書に用いられる用語「タンパク質結合体」または「結合体」とは、本発明によって共有結合で互いに連結されている、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンを含む化合物をいう。
前記「結合体」という用語と区別される用語「連結体」は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンから選ばれた２種類の構成要素のみを含む化合物を意味する。
【００１８】
用語「非ペプチド性重合体」は、少なくとも二つ以上のモノマーを含み、このモノマーがペプチド結合ではなく、任意の共有結合を通じて連結された生体適合性重合体をいう。
本発明の一実施態様に従って、共有結合で互いに連結された、ｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体が提供される。
【００１９】
たとえば、本発明のタンパク質結合体は、［活性ポリペプチド／非ペプチド性重合体／免疫グロブリン］によって表わされる単位構造を少なくとも一つ含み得、ここですべての構成要素は共有結合によって線状で連結されている。非ペプチド性重合体は両末端に各々反応基を有し得るので、これを通じて生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと各々共有結合で連結される。好ましい具現例では、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体からなる連結体が一つの免疫グロブリンに共有結合で連結され得る。
【００２０】
生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンのモル比は１：１〜１０：１、好ましくは１：１〜４：１の範囲であり得る。
１種類の重合体だけではなく、異なる種類の重合体の組合せが非ペプチド性重合体として使用され得る。
【００２１】
本発明のタンパク質結合体において、免疫グロブリンの適当な結合部位としては免疫グロブリンの可変領域または不変領域にあるアミノ酸残基の遊離官能基を含み得る。非ペプチド性重合体または活性ポリペプチドと共有結合するのに適当な免疫グロブリンの部位は可変領域のアミノ末端、リジン残基またはヒスチジン残基のアミノ基、およびシステインの遊離−ＳＨ基を含み得、非ペプチド性重合体の適当な部位は末端反応基である。
【００２２】
免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組合せおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のようなＩｇＧのすべてのサブタイプからなる群から選ばれ得る。患者において免疫反応を誘発しないように、前記免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンであることが好ましい。
【００２３】
本発明のタンパク質結合体を構成する構成要素として、免疫グロブリンは血液から単離した天然型免疫グロブリンであるか、遺伝工学的に産生された組合せ免疫グロブリンであり得る。機能、構造および安定性において野生型と実質的に等しい限り、様々な部位でアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって修飾された任意の免疫グロブリンだけではなく、高糖鎖化、低糖鎖化および糖鎖が除去された誘導体も本発明に使用され得る。免疫グロブリンの糖鎖の増減または除去は、化学的方法、酵素学的方法および遺伝工学的方法のような通常の方法のいずれかを用いて行い得る。ＩｇＧの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２、３２７〜３３１番アミノ酸残基が修飾のための適当な部位として使用され得る。
【００２４】
適当な非ペプチド性重合体は、アルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる反応基を有する。スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル、およびスクシンイミジルカーボネートからなる群から選ばれ得る。両末端にアルデヒド基を有する非ペプチド性重合体は、非特異的カップリング反応を最小化して非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと各々結合するのに効果的である。アルデヒド基の還元に基づくアルキル化によって生成したタンパク質結合体はアミド結合を通じて連結されたものよりも遥かに安定である。
【００２５】
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は同一でも異なっていてもよい。たとえば、非ペプチド性重合体は一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはマレイミド基、アルデヒド基、またはプロピオンアルデヒド基を有し得る。ポリ（エチレングリコール）が非ペプチド性重合体として用いられる場合、本発明のタンパク質結合体の製造に市販の製品を用いるか、カップリング反応前に市販のＰＥＧの末端ヒドロキシ基を他の反応基にさらに転換させて用いられ得る。
【００２６】
前記非ペプチド性重合体は、前記免疫グロブリンのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基と前記生理活性ポリペプチドの反応基のいずれかを共有結合で連結するスペーサーの役割をする。
【００２７】
非ペプチド性重合体はポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ（乳酸−グリコール酸）、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組合せからなる群から選ばれ得る。当該分野に周知のこれらの誘導体もまた同じ目的で使用され得る。より好ましい非ペプチド性重合体はポリ（エチレングリコール）である。非ペプチド性重合体の分子量は５００〜１００，０００、好ましくは５００〜２０，０００の範囲である。
【００２８】
二つのポリペプチドを遺伝子クローニングによって結合させるための、オリゴペプチドのような従来報告されている架橋結合剤は、好ましくない免疫反応の可能性を増加させ、結合部位をポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のみに制限させる。したがって、非ペプチド性重合体の使用は、オリゴペプチドと比較する場合、毒性や免疫原性の減少という長所がある。他の長所は、結合部位の多様性による適用可能性の増加である。
【００２９】
架橋結合剤として用いられる場合、カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドのような低分子架橋剤はこれを通じて結合されたタンパク質を変性、または結合の制御および生成物の精製の困難をもたらすことがある。これに対し、非ペプチド性重合体を含む本発明のタンパク質結合体は、結合の調節および生成した結合体の精製が容易であり、非特異的カップリング反応を最小化できるというメリットがある。
【００３０】
本発明のタンパク質結合体は、ポリペプチド−ＰＥＧ連結体またはポリペプチド−ＰＥＧ−アルブミン結合体よりも遥かに優れた生体内半減期および活性を示す。薬物動力学分析（pharmacokinetic analysis）によれば、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の半減期は野生型ｈＧＨに比べて約１３倍さらに長い反面、ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体およびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体は各々野生型タンパク質に比べて約７倍および約５倍さらに長い半減期を示す（試験例２、表３参照）。ｈＧＨの代わりにＧ−ＣＳＦおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンまたはＥＰＯを用いた試験においても同様な結果が得られた。ＰＥＧのみでまたはＰＥＧ−アルブミン連結体で修飾された結合体に比べて、本発明のタンパク質結合体は前記通常の連結体よりも２倍〜７０倍高い、遥かに増加した平均滞留時間（mean residence time; MRT）および血中半減期を示す（試験例２、表４〜７参照）。また、本発明のＦａｂ’−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体、すなわち、ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＣ−末端近くの−ＳＨ基、またはＮ−末端に各々連結されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧおよびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体は、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて２倍〜３倍さらに長い血中半減期を示す（試験例３および図１２参照）。
【００３１】
さらに、非糖鎖化免疫グロブリンを用いて製造されたタンパク質結合体は糖鎖化された免疫グロブリンを含む相応するタンパク質結合体と同様な血中半減期と生体外活性を示す（表４、７および９、および図１０および１１参照）。
【００３２】
薬物動力学分析結果、ｈＧＨ、インターフェロン、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはその誘導体、および抗体断片を含む様々な生理活性ポリペプチドに適用された本発明のタンパク質結合体は、血中半減期およびＭＲＴの面で優れた特性を示すので、延長された生体内半減期を有するポリペプチド薬物製剤を製造するのに有用である。
【００３３】
さらに、動物モデルを用いた生体内試験によれば、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は非常に優れた生体内活性を示す。具体的に、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を野生型投与容量の１／３容量で６日に１回投与したとき、野生型を毎日投与したものと等しいかより優れた効果を示し、このような結果は、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性が野生型に比べて３倍以上高いことを意味する（図１４参照）。
【００３４】
本発明の１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体に比べて３倍以上高い生体内活性を示し、５日に１回投与したとき、同じ総投与量になるように毎日投与した野生型Ｇ−ＣＳＦよりも２倍以上高い好中球回復効果を示す（図１５参照）。しかも、本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は、ヘマトクリット数値において野生型ＥＰＯまたは高糖鎖化ＥＰＯの場合よりもさらに高くて速い増加率を誘導し、このような高い生体内活性を長期間保持する（図１６）。
【００３５】
このような結果は、本発明のタンパク質結合体が頻繁な投与を必要とする野生型ペプチドの問題を克服するとともに、生理活性タンパク質の血中半減期および生体内活性を著しく増加させることを示す。
【００３６】
生理活性ポリペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターなどのポリペプチド、およびこれらの変異体および他の類似体を例示することができる。
【００３７】
本発明のタンパク質結合体を製造するのに適当な生理活性ポリペプチドの具体的な例はヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類（例：インターフェロンα，βおよびγ）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例：インターロイキン−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７，−８，−９，−１０，−１１，−１２，−１３，−１４，−１５，−１６，−１７，−１８，−１９，−２０，−２１，−２２，−２３，−２４，−２５，−２６，−２７，−２８，−２９および−３０）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＦＳＨ放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類（例：ＮＦＲ（Ｐ７５）およびＴＮＦＲ（Ｐ５５））、レセプター拮抗物質（例：ＩＬ１−Ｒａ）、細胞表面抗原（例：ＣＤ２，３，４，５，７，１１ａ，１１ｂ，１８，１９，２０，２３，２５，３３，３８，４０，４５および６９）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片およびウイルス由来のワクチン抗原を含む。
【００３８】
抗体断片とは特定抗原に結合し得る抗体の断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびｓｃＦｖを示し、Ｆａｂ’が好ましい。Ｆａｂ断片は抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインと第１不変ドメイン（ＣＨ１）からなり；Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ−末端にヒンジ（hinge）領域からの一つ以上のシステイン残基を含む数個のアミノ酸残基がさらに付加されたものであり；Ｆ（ａｂ’）２断片は二つのＦａｂ’断片がジスルフィド結合或いは化学的反応で相互連結されたものであり；Ｆｄ断片は重鎖の可変領域と第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。ｓｃＦｖ断片は、ペプチドリンカーで互いに連結された軽鎖と重鎖の可変領域からなる単一ポリペプチド鎖である。
【００３９】
特に好ましいポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で投与される場合、他のものに比べてさらに頻繁な投与が要求されるということに照らし、ヒト成長ホルモン、インターフェロン類（インターフェロンα，βおよびγ）、顆粒球コロニー刺激因子および赤血球生成因子からなる群から選ばれたいずれかである。
【００４０】
本発明が適用され得る生理活性ポリペプチドの種類は前述のものに制限されず、野生型ポリペプチドと実質的に等しいかさらに優れた機能、構造、活性または安定性を有する変異体または誘導体も本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。
【００４１】
他の実施態様として、本発明は、
（ａ）少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、少なくとも一つの免疫グロブリン、および両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体を共有結合で連結する段階；および
（ｂ）共有結合で連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を単離する段階を含む、前記タンパク質結合体の製造方法を提供する。
【００４２】
前記方法の段階（ａ）において、生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体は２段階反応または同時反応によって共有結合で連結され得る。２段階反応、たとえば、非ペプチド性重合体を活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンと共有結合させた後、生成した連結体を活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンと共有結合させてこれらの結合体を製造し、ここで活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンは非ペプチド性ポリマーを用いて相互連結される方法が好ましくない副産物の生成を減少させるのに有利である。
【００４３】
したがって、前記方法の段階（ａ）は、
（ａ１）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結する段階；
（ａ２）反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階；および
（ａ３）連結体の非ペプチド性重合体の自由末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結して非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンを共有結合で互いに連結するタンパク質結合体を生産する段階；を含み得る。
【００４４】
前記段階（ａ１）において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体のモル比は好ましくは１：２．５〜１：５の範囲であり、免疫グロブリンと非ペプチド性重合体のモル比は１：５〜１：１０である。なお、段階（ａ３）において、段階（ａ２）で得られた連結体と生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンのモル比は１：０．５〜１：２０、好ましくは１：１〜１：５の範囲である。
【００４５】
段階（ａ１）および段階（ａ３）は、ナトリウムシアノボロハイドライド、ナトリウムボロハイドライド、ジメチルアミンボレートおよびピリジンボレートからなる群から選ばれる還元剤の存在下で行い得る。
【００４６】
段階（ａ２）および（ｂ）を行うための手続は、要求される純度、および生成した結合体の分子量および電荷量のような特性を考慮して、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどおよびこれらの組合せのような、タンパク質の分離に用いられる通常の方法で行い得る。
【００４７】
さらに他の実施態様として、本発明は、本発明のタンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体（賦形剤）を含む、修飾されていないポリペプチドに比べて延長された生体内半減期を有する生理活性ポリペプチドの医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉内投与を含む種々の経路を通じて投与され得、注射投与がより好ましい。本発明の医薬組成物は、患者に投与された後、活性成分の迅速、遅速または遅延放出を提供するために当業界で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、錠剤、丸剤、粉末、におい袋（sachet）、エリキシル（elixir）、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であり得る。適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラル油などを挙げることができる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００４９】
活性成分の実際投与量は治療する疾患、選択された投与経路、患者の年齢、性別および体重、および患者の症状を含む色々な関連因子、特に活性成分の種類によって決定される。本発明のタンパク質結合体の向上した安定性のため、本発明のタンパク質結合体を含むポリペプチド薬物剤形の総投与回数および頻度を著しく減らすことができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明の好ましい具現例を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００５１】
［実施例１］ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造Ｉ
（段階１）ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体の製造
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、分子量２２ｋＤａ）を５ｍｇ／ｍｌの濃度に１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解し、両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコール（ALD-PEG-ALD, Shearwater Inc.、米国）をｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０または１：２０になるように加えた。これに還元剤としてナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３、Sigma）を最終濃度２０ｍＭになるように加え、この混合物を４℃で３時間攪拌した。ＰＥＧがｈＧＨのアミノ末端部位に１：１のモル比で選択的に結合したｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を得るために、得られた反応混合物をスーパーデックス（Superdex（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、米国）サイズ排除（size exclusion）クロマトグラフィーを行った。溶離液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてｈＧＨ−ＰＥＧ連結体をカラムから溶離および精製し、修飾されていないｈＧＨ、未反応のＰＥＧおよび二分子のｈＧＨがＰＥＧの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最良の結果を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧの最適のモル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。
【００５２】
（段階２）ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体とＩｇＧとの間の結合体形成
分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、緑十字、韓国）を１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解した。段階１で精製されたＰＥＧ−ｈＧＨ連結体のアルデヒド基にＩｇＧを結合させるために、ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：ＩｇＧのモル比が１：１、１：２、１：４または１：８になるようにｈＧＨ−ＰＥＧ連結体をＩｇＧ−含有緩衝液に加えた。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加え、この混合物を４℃で２０時間徐々に攪拌した。結合反応後ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を汚染物から分離精製するために、反応混合物を用いて２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥカラム（Pharmacia、米国）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。移動相を緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５）から線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．５Ｍ）で緩衝液Ｂ（１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５）に変えた。溶離したｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体から少量の未反応のＩｇＧおよび修飾されていないｈＧＨを除去するために、溶離液として１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化したｐｏｌｙＣＡＴカラム（ＰｏｌｙＬＣ、米国）を用いた陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。移動相を緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）から線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．５Ｍ）で緩衝液Ｂ（１．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）に変えてｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を精製した（図１）。
最良の結果を得るためのｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：ＩｇＧの最適のモル比は１：４であることが確認された。
【００５３】
［実施例２］ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造II
（段階１）ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体の製造
ＩｇＧ（緑十字、韓国）を１００ｍＭリン酸塩緩衝液に１５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、生成した溶液に３．４ｋＤａのＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Shearwater Inc.、米国）をＩｇＧ：ＰＥＧのモル比が各々１：１、１：２．５、１：５、１：１０または１：２０になるように加えた。これに還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、この混合物を４℃で３時間攪拌した。ＰＥＧがＩｇＧのアミノ末端部位に１：１のモル比で選択的に結合したＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を分離するために、得られた反応混合物をスーパーデックス（Superdex（登録商標）、Pharmacia社製、米国）サイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶離液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を溶離および精製し、修飾されていないＩｇＧ、未反応のＰＥＧ、および二分子のＩｇＧがＰＥＧの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最良の結果を得るためのＩｇＧ：ＰＥＧの最適のモル比は１：５〜１：１０であることが確認された。
【００５４】
（段階２）ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体とｈＧＨとの結合体形成
前記段階１で精製されたＩｇＧ−ＰＥＧ連結体にｈＧＨ（分子量２２ｋＤａ）を結合させるために、１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解したｈＧＨをＩｇＧ−ＰＥＧ連結体と各々１：１、１：１．５、１：３または１：６のモル比で反応させた。これに還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加え、反応混合物を４℃で２０時間攪拌した。得られた反応混合物を実施例１の段階２と同様な精製方法を行って未反応物質および副産物を除去し、ＩｇＧ−ＰＥＧ−ｈＧＨ結合体を精製した。
【００５５】
［実施例３］ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造
ｈＧＨの代わりにインターフェロンアルファ２ｂ（ＩＦＮα２ｂ、分子量２０ｋＤａ）を用い、ＩＦＮα２ｂ：ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ）のモル比を１：５にしたことを除いては、実施例１と同様な方法でＩＦＮ−α−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５６】
［実施例４］ヒト顆粒球コロニー刺激因子−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造
ｈＧＨの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、分子量１８．７ｋＤａ）を用い、Ｇ−ＣＳＦ：ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ）のモル比を１：５にしたことを除いては、実施例１と同様な方法でＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
また、野生型Ｇ−ＣＳＦの１７番目のアミノ酸がセリンで置換されたＧ−ＣＳＦ誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）を用いて前記と同様な方法でＧ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５７】
［実施例５］ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の製造
ｈＧＨの代わりにヒト赤血球生成因子（Erythropoietin(EPO)、分子量３５ｋＤａ）を用い、ＥＰＯ：ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ）のモル比を１：５にしたことを除いては、実施例１と同様な方法でＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５８】
［実施例６］異なる反応基を有するＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
両末端にアルデヒド基以外の異なる反応基を有するＰＥＧを用いてｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を次のように製造した。１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解したｈＧＨ１０ｍｇを両末端にスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）基を有するＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ−ＳＰＡ、Shearwater Inc.、米国、分子量３．４ｋＤａ）とｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が各々１：１、１：２．５、１：５、１：１０または１：２０になるように反応させた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。ｈＧＨのリジン残基にＰＥＧが１：１のモル比で選択的に結合したｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を得るために、反応混合物をスーパーデックス（登録商標）（Pharmacia社製、米国）サイズ排除クロマトグラフィーを行って分離した。溶離液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を溶離および精製し、修飾されていないｈＧＨ、未反応のＰＥＧおよび二分子のｈＧＨがＰＥＧの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を用いて実施例１と同様な方法でｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造した。最良の結果を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧの最適のモル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。
両末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（N-hydroxysuccinimidyl；ＮＨＳ）基を有するＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；Shearwater Inc.、米国）を用いたことを除いては、前記と同様な方法を行って他のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造および精製した。
【００５９】
［実施例７］分子量が異なるＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
分子量が１０，０００ダルトンであり、両末端にアルデヒド反応基を有するＰＥＧであるＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Shearwater Inc.、米国）を用いたことを除いては、実施例１の段階１と同様な方法でｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を製造および精製した。この際、最良の結果を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧの最適のモル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。濃縮されたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を用いて実施例１の段階２と同様な方法でｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を製造した。
【００６０】
［実施例８］Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の製造（−ＳＨ基）
（段階１）Ｆａｂ’の発現および精製
抗−ＴＮＦ−αＦａｂ’を発現する大腸菌ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ（寄託番号：ＫＣＣＭ１０５１１）をＬＢ培地１００ｍｌに接種して一晩振盪培養した。培養したＬＢブロスを５ｌフェメンター（Marubishi）に移して温度３０℃、空気投入量２０ｖｖｍ、攪拌速度５００ｒｐｍの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長によって惹起されたエネルギー源の不足を補充するために適当量のブドウ糖（glucose）と酵母抽出液（yeast extract）を培養水に加えた。吸光度６００ｎｍで培養液の吸光度が８０に至ると、ＩＰＴＧを培養液に加えてタンパク質発現を誘導した。培養液の吸光度が６００ｎｍで１２０〜１４０になるまで４０〜４５時間培養を続けた。得られた発酵液を遠心分離（２０，０００ｘｇ、３０分）して上澄液を得た。
【００６１】
上澄液から次のような３段階のカラムクロマトグラフィーを行って抗−ＴＮＦ−αＦａｂ’を精製した。前記上澄液を２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ（５ｍｌ、Pharmacia社製、ドイツ）カラムに充填した後、１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で溶離した。溶離したＦａｂ’分画を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００（Pharmacia社製、ドイツ）カラムに加え、同じ緩衝液で溶離した。溶離したＦａｂ’分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０（PolyLC Inc.、米国）カラムに加え、１０ｍＭアセテート緩衝液（ｐＨ４．５）でＮａＣｌ線形濃度勾配法（０．１５Ｍ→０．４Ｍ）下に溶離して純粋な抗−ＴＮＦ−αＦａｂ’分画を得た。
【００６２】
（段階２）ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体の製造
免疫グロブリン（ＩｇＧ、分子量１５０ｋＤａ、緑十字、韓国）１５０ｍｇを１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、これにＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量３，４００ダルトン、Shearwater Inc.、米国）をＩｇＧ：ＰＥＧのモル比が１：１０になるように加えた。反応混合物を４℃で１２時間徐々に攪拌した。
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に取り替えて未反応のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを除去した。その後、この反応混合物をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に充填し、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）を用いて溶離してＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を得た。未反応のＩｇＧがＩｇＧ−ＰＥＧ連結体よりも遅く溶離され、除去された。
【００６３】
（段階３）Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体（−ＳＨ基）の製造
段階１で得られた精製されたＦａｂ’を１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）に２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、生成した溶液に段階２で製造されたＩｇＧ−ＰＥＧ連結体をＦａｂ’：連結体のモル比が１：５になるように加えた。反応混合物をタンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮し、４℃で２４時間徐々に攪拌した。
【００６４】
カップリング反応終了後、得られた反応混合物を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００カラム（Pharmacia社製、米国）に加え、同じ緩衝液で１ｍｌ／分の流速で溶離してＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体分画を得た。分子量が大きいＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体が先に溶離され、未反応のＩｇＧ−ＰＥＧ連結体およびＦａｂ’はその後で溶離、除去された。残っている未反応のＩｇＧ−ＰＥＧ連結体を除去するために、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）を用いて溶離した。結果として、ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＣ−末端付近の−ＳＨ基に連結された純粋なＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体を含む分画を得た。
【００６５】
［実施例９］Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の製造（Ｎ−末端）
（段階１）Ｆａｂ’−ＰＥＧ連結体（Ｎ−末端）の製造
前記実施例８の段階１で得られた精製されたＦａｂ’ ４０ｍｇを１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した後、生成した溶液にＢｕｔｙｌ ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＢｕｔｙｌＡＬＤ（分子量３，４００Ｄａ、Shearwater Inc.、米国）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：５になるように加えた。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、反応混合物を４℃で２時間徐々に攪拌した。
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に取り替えた。緩衝液を取り替えた後、混合物をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に充填し、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ４．５）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）を用いて溶離してＦａｂ’−ＰＥＧ連結体を含む分画を得た。未反応のＦａｂ’が連結体よりも遅く溶離され、除去された。
【００６６】
（段階２）Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の製造（Ｎ−末端）
段階１で得られた精製されたＦａｂ’−ＰＥＧ連結体を１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、生成した溶液にＩｇＧ（分子量１５０ｋＤａ、緑十字、韓国）を連結体：ＩｇＧのモル比が１：５になるように加えた。反応混合物を最終タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、反応混合物を４℃で２４時間徐々に攪拌した。
【００６７】
カップリング反応終了後、反応液を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００カラム（Pharmacia社製）に加え、同じ緩衝液で１ｍｌ／分の流速で溶離してＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体を含む分画を得た。Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体は分子量が大きいため先に溶離され、未反応のＩｇＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧ連結体はその後で溶離、除去された。残っている未反応のＩｇＧを除去するために、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０カラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）を用いて溶離した。結果として、ＩｇＧ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＮ−末端に連結された純粋なＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体を含む分画を得た。
【００６８】
［実施例１０］糖鎖除去されたＩｇＧ（ＡＧ ＩｇＧ）の製造
ＩｇＧ（緑十字、韓国）２００ｍｇを１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、これに３００Ｕ／ｍｇの脱糖鎖化酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆ（NEB Inc.、イギリス）を加えた。反応混合物を３７℃で２４時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応混合物をＳＰセファロースＦＦカラム（ファルマシア、ドイツ）に加え、１Ｍ ＮａＣｌを用いる線形濃度勾配法（０．１Ｍ→０．６Ｍ）を用いて１０ｍＭアセテート緩衝液（ｐＨ４．５）で溶離し、野生型ＩｇＧよりも遅く溶離した糖鎖除去されたＩｇＧの分画を得た。
【００６９】
［実施例１１］ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の製造
前記実施例３で製造されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体に前記実施例１０で製造された糖鎖除去されたＩｇＧ（ＡＧ ＩｇＧ）を結合することによって次のようにＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を製造した。
ＡＧ ＩｇＧ（分子量：約１４７ｋＤａ）を１０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解した。ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体をＡＧ ＩｇＧ−含有緩衝液にＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＡＧ ＩｇＧのモル比が各々１：１、１：２、１：４および１：８になるように加えた。生成した混合物を１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液の状態にし、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた。反応混合物を４℃で２０時間徐々に攪拌した。最良の結果を得るためのＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＡＧ ＩｇＧの最適のモル比は１：２であることが確認された。
【００７０】
結合反応後、汚染物からＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を精製するために、反応混合物を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。反応混合物をスーパーデックス（登録商標）（Pharmacia社製、ドイツ）カラムに加え、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）を用いて流速２．５ｍｌ／分で溶離してＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体分画を得、未反応のＡＧ ＩｇＧおよびＩＦＮα−ＰＥＧ連結体のような汚染物を除去した。このように得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の分画からさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて少量の未反応のＡＧ ＩｇＧおよびＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を除去した。前記分画を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化したＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、１．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液で線形濃度勾配法（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．６Ｍ）を用いて溶離してＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体分画を得た。このように得られた分画を用いてさらに陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。該分画を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化したＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（PolyLC Inc.、米国）に加え、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．３Ｍ）を用いて溶離して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を得た。
【００７１】
［実施例１２］ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の製造
前記実施例５で精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ連結体と、前記実施例１０で製造された糖鎖が除去されたＩｇＧを用いて実施例１１と同様な方法でＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体を得た。
【００７２】
［比較例１］ＰＥＧ−ｈＧＨ連結体の製造
ｈＧＨ５ｍｇを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して溶液５ｍｌを得、４０ｋＤａ ＰＥＧを有する活性化されたメトキシ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Shearwater社製、米国）をｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が１：４になるように前記溶液に加えた。これに還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた後、反応混合物を４℃で１８時間徐々に攪拌した。これにエタノールアミンを最終濃度が５０ｍＭになるように加えて未反応のＰＥＧを失活させた。
未反応のＰＥＧを除去するために、得られた反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム（Pharmacia社製）クロマトグラフィーで処理した。まず、カラムを２カラム体積（column volume；ＣＶ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化した後反応混合物を加えた。ＵＶ分光光度計を用いて２６０ｎｍで溶離分画の吸光度を分析した。分子量がさらに大きいＰＥＧ−修飾されたｈＧＨが先に溶離され、未反応のＰＥＧが後で溶離された。
【００７３】
前記溶離分画から次のようにＰＥＧ−修飾されたｈＧＨをさらに精製した。ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（Polywax Inc.、米国）３ｍｌで充填されたカラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化した。ＰＥＧ−修飾されたｈＧＨを含有する溶離分画を１ｍｌ／分の流速でカラム上に加えた後、１５ｍｌの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液を用いた塩濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度：０％→１００％）によって３０分間溶離し、トリ−、ジ−、モノ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨの分画を順次得た。
前記混合物からモノ−ＰＥＧ結合ｈＧＨ連結体をさらに精製するために、カラム溶離物を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。前記溶離液を濃縮して１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したスーパーデックス２００（Superdex 200、Pharmacia社製）に加え、同じ緩衝液で流速１ｍｌ／分で溶離した。トリ−、ジ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨ連結体はモノ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨ連結体よりも溶離時間が速いので、これを除去してモノ−ＰＥＧが連結されたｈＧＨ連結体のみを純粋分離した。
同様な方法でＩＦＮαまたはＧ−ＣＳＦのアミノ末端に４０ｋＤａ ＰＥＧが各々結合したＰＥＧ−ＩＦＮ、ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体を製造した。
【００７４】
［比較例２］アルブミン−ｈＧＨ連結体の製造
実施例１で得られたｈＧＨ−ＰＥＧ連結体にアルブミンを結合させるために、ｈＧＨ−ＰＥＧ連結体を１０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解したヒトアルブミン（ＨＡＳ、分子量約６７ｋＤａ）（緑十字、韓国）とｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：アルブミンのモル比が各々１：１、１：２、１：４または１：８になるようにして反応させた。得られた反応混合物を１００ｍＭリン酸塩緩衝液の状態で濃縮し、これに還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭになるように加えた。反応混合物を４℃で２０時間徐々に攪拌した。最良の結果を得るためのｈＧＨ−ＰＥＧ連結体：アルブミンの最適のモル比は１：２であることが確認された。
【００７５】
結合反応後、反応混合物からスーパーデックスサイズ排除クロマトグラフィーを行って未反応の出発物質および副産物を除去した。反応混合物を濃縮した後、カラムに加え、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を流速２．５ｍｌ／分で溶離して精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体を得た。精製されたｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体分画には不純物として少量の未反応のアルブミンおよびｈＧＨ二量体が混じっているので、これの除去のためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体分画を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液で平衡化したＳＰ５ＰＷ（Waters、米国）カラムに加え、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液を線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０Ｍ→０．５Ｍ）で流して分画を得ることによって純粋なｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体を得た。
同様な方法でＩＦＮα、Ｇ−ＣＳＦまたは１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体に各々アルブミンが結合したＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−アルブミン結合体を製造および精製した。
【００７６】
［比較例３］Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の製造
実施例８の段階１で得られた精製されたＦａｂ’を活性化緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．２ｍＭ ＤＴＴ）に１時間放置して遊離−ＳＨ基を活性化させた。緩衝液をＰＥＧ修飾緩衝（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５））に取り替えた。生成した溶液にマレイミド−ＰＥＧ（分子量４０ｋＤａ、Shearwater Inc.、米国）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：１０になるように添加した。この反応混合物を４℃で２４時間徐々に攪拌した。
【００７７】
反応終了後、得られた反応混合物を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したスーパーデックス２００（Superdex 200、Pharmacia社製）カラムに加え、同じ緩衝液を１ｍｌ／分の流速で流してＦａｂ’−Ｓ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体を含む分画を溶離した。未反応のＦａｂ’は前記連結体よりも遅く溶離、除去された。残っている未反応のＦａｂ’を除去するため、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１ｘ２５０（PolyLC Inc.、米国）カラムに加えた後、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ４．５）を線形濃度勾配法（ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）で流して溶離した。結果として、Ｆａｂ’のＣ−末端に隣接する−ＳＨ基に４０ＫＤａ ＰＥＧが連結された純粋なＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体を得た。
【００７８】
［試験例１］タンパク質結合体の確認および定量
（１）タンパク質結合体の確認
４〜２０％の濃度勾配を有するゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ法（R & D system、米国）を用いて前記実施例で製造したタンパク質結合体の修飾状態を分析した。
ｈＧＨ、ｈＧＨ−ＰＥＧ、ＩＦＮおよびＩＦＮ−ＰＥＧにＤＴＴ（Dithiothreitol）を各々５０ｍＭの量で添加した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩｇＧ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧおよびＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩｇＧはＤＴＴなしで展開した。
【００７９】
図２および図３は、各々ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧおよびＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。左の余白の数字は分子量マーカー（ｋＤａ）である。
図２から分かるように、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の見かけ分子量は約１７０ｋＤａである。しかし、ＩｇＧタンパク質結合体と野生型ＩｇＧの分子量差異はＳＤＳ−ＰＡＧＥで区別しにくいため、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体およびＩｇＧを各々ＤＴＴで処理して還元させて軽鎖および重鎖に分離し、その結合状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥで各々確認した（図４）。
【００８０】
ＩｇＧをＤＴＴで処理すると、分子量によってＩｇＧの軽鎖が先に分離され、ＩｇＧの重鎖が後で分離される。ＤＴＴで処理したｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のバンドは前記軽鎖および重鎖断片に各々ｈＧＨ−ＰＥＧ（３．４ｋＤａ）連結体の分子量を足すことによって計算された分子量に該当する位置に現れた。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の軽鎖は約８０ＫＤａの位置にバンドが現れたｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の重鎖よりも低い位置（さらに小さい分子量）にバンドを形成した。前記結果からｈＧＨは軽鎖と重鎖に同じ確率で結合し、ＩｇＧとｈＧＨが１：１のモル比で結合したことが分かる。
【００８１】
（２）タンパク質結合体の定量
前記実施例で製造した各タンパク質結合体の量はサイズ排除クロマトグラフィー（カラム：Superdex、溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））から観察された結合体のピーク面積をコントロールと比較して計算する方法で測定した。予め定量されたｈＧＨ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦ、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＩｇＧで各々サイズ排除クロマトグラフィーを行った後、ピーク面積の相対的感応（response）係数を測定した。各タンパク質結合体を一定量用いて同じ条件下でサイズ排除クロマトグラフィーを行い、ここから得られた各タンパク質結合体のピーク面積からＩｇＧに該当するピーク面積を引いた値を各タンパク質結合体に存在する生理活性タンパク質の定量値とした。
【００８２】
クロマトグラフィー法以外にＥＬＩＳＡ法（R&D system、米国）を並行して行った。ＩｇＧの一部がポリペプチドの生物学的活性部位に結合すると生物学的活性部位に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって得られる定量値はクロマトグラフィーによって計算される値よりも減少すると予測される。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の場合にはＥＬＩＳＡによって測定された値がクロマトグラフィーによって決定された値の約３０％に過ぎないことが確認された。
【００８３】
（３）タンパク質結合体の純度および質量確認
実施例３で得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の純度を分析するために、逆相カラム（２５９ＶＨＰ５４カラム、Ｖｙｄａｃ社、米国）を用いて逆相ＨＰＬＣを行った。結合体を０．５％ＴＦＡの存在下でアセトニトリル溶媒で線形濃度勾配法法（アセトニトリル濃度：４０％→１００％）を用いて溶離し、２８０ｎｍで検出した。図５から分かるように、結合体の純度は９５％以上である。
各々の実施例で得られたタンパク質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィーを行った後、２８０ｎｍで吸光度を分析した。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ、ＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩｇＧ、Ｇ−ＣＳＦおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧは各々１７０，０００〜１８０，０００ダルトンの分子量に該当する単一ピークを示した。ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧのピークは分子量２００，０００ダルトンに該当する位置から観察された。
【００８４】
各タンパク質結合体の正確な分子量を測定するために、精製された試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Voyager DE-STR、Applied Biosystems、ＵＳＡ）超高速質量分析器を用いて分析した。マトリックスとしてはシナピン酸（sinapinic acid）を用いた。各試料０．５μｌをスライドガラスに塗布し、空気中で乾燥した。同じ容積のマトリックス溶液をスライドガラス上に滴下した後、スライドガラスを空気中で乾燥し、イオン源（ion source）に導入した。検出はポジティブ方式でリニアー−モードＴＯＦ装置によって行い、イオンは遅延されたイオン抽出器を用いる分割抽出供給源で、遅延された抽出時間は７５０ｎｓｅｃ／１５００ｎｓｅｃで、約２．５ｋＶの全電位差を通じて加速化した。ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の質量分析結果を下記表１および図６に示す。
【００８５】
【表１】
【００８６】
前記結果は、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の純度が９０％以上であり、測定された分子量が理論値とほとんど同じであることを示した。また、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体はＩｇＧがｈＧＨ−ＰＥＧ連結体に１：１のモル比で結合した形態であった。
また、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法で測定された実施例１０で製造したＡＧ ＩｇＧの分子量は野生型ＩｇＧよりも３，０００Ｄａが少ない１４７ｋＤａであった（図９）。減少した分子量３，０００Ｄａは糖鎖の理論的サイズに該当するので、ＩｇＧの糖鎖が完全に除去されたことを確認できた。
下記表２は前記実施例１１〜１２で製造したＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧおよびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の分子量を示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
［試験例２］薬物動力学分析Ｉ
前記実施例および比較例で製造したＩｇＧ−タンパク質結合体、ＰＥＧ−タンパク質連結体およびアルブミン−タンパク質結合体（試験群）の生体内安定性および薬物動力学係数を野生型生理活性タンパク質（対照群）と比較した。下記実験では、各群当り５匹のスプラーグ・ドーリー（ＳＤ）ラットを用いた。対照群、ＰＥＧ−連結体、アルブミン−タンパク質結合体およびＩｇＧ−タンパク質結合体を各々１００ｕｇ／ｋｇずつラットに皮下注射した。対照群から注射後０．５、１、２、４、６、１２、２４、３０、４８、７２および９６時間後に血液試料を得、試験群からは注射後１、６、１２、２４、３０、４８、７２、９６、１２０、２４０および３２０時間後に血液試料を得た。血液試料をヘパリンでコーティングされたチューブに集めて凝固を防止し、高速マイクロ遠心分離器で４℃、３０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞を除去した。血漿中のタンパク質濃度は各生理活性タンパク質に対する抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００８９】
野生型ｈＧＨ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯとこれらのタンパク質連結体および結合体の薬物動力学値を下記表２〜表６に示し、ここでＴｍａｘは最高薬物濃度に至る時間を、Ｔ１／２は薬物の血中半減期を、ＭＲＴ（mean residence time）は薬物の平均的な体内滞留時間を意味する。
【００９０】
【表３】
【００９１】
【表４】
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
前記表３および図７から分かるように、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧタンパク質結合体の血中半減期は１３．９時間であって、これは野生型ｈＧＨに比べて約１３倍増加したものであり、比較例１で製造したｈＧＨ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体（７．７時間）よりも約２倍増加したものである。ＰＥＧの一方の末端にアルブミンが結合したｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体の半減期は５．９時間であった。このような結果から、本発明のタンパク質結合体は遥かに優れた血中持続性を示すことが確認できる。
【００９６】
さらに、表４および図１０において、ＩＦＮαに対する結果もｈＧＨと同様な結果を示すが、本発明のタンパク質結合体が示す血中半減期の増加効果は遥かに大きかった。野生型ＩＦＮαの半減期は１．７時間であるが、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ＩＦＮα連結体の半減期は３５．８時間に増加し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体の半減期は１７．１時間に増加した。これに対し、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の半減期は７６．７時間と著しく増加した。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の半減期は５９．７時間であって、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体とほとんど等しかった。この結果から、糖鎖の不在が結合体の生体内安定性には影響を及ぼさないことが分かる。
【００９７】
表５および６から分かるように、Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体の血中持続性も前記ｈＧＨおよびＩＦＮのものと同様な傾向を示した。４０ｋＤａ ＰＥＧが修飾されたタンパク質連結体およびアルブミン結合体の半減期は野生型Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体よりもさらに長かった。しかし、本発明のタンパク質結合体は遥かに長い半減期を示した。タンパク質の血中薬物持続性を増加させるＩｇＧのこのような効果はアミノ酸が修飾された誘導体からもまた観察された。このような結果から、他のタンパク質に適用された本発明のタンパク質結合体はまた前述の好ましい効果を示すことが予想できる。
【００９８】
表７および図８と図１１から分かるように、糖鎖化された残基を有するＥＰＯに対しても本発明のタンパク質結合体の血中半減期の増加効果が明らかである。すなわち、野生型ＥＰＯの血中半減期は９．４時間であり、血中安定性が高い高糖鎖化ＥＰＯであるDarbepoetin−α（Aranesp、Amgen、ＵＳＡ）の半減期は１４．９時間であった。ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の場合は、血中半減期が６７．５時間に著しく増加し、ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体の血中半減期も４７．８時間に増加した。
【００９９】
前記結果から分かるように、生理活性タンパク質が非ペプチド性重合体および免疫グロブリンと共有結合した本発明のタンパク質結合体は、野生型タンパク質に比べて数十倍以上増加した血中半減期を有する。また、タンパク質結合体の血中半減期増加効果は糖鎖除去された免疫グロブリンを用いても同様な水準に保持された。
【０１００】
特に、従来報告されたＰＥＧ剤形のうち血中持続性が最も高い、４０ｋＤａ ＰＥＧによって修飾されたタンパク質結合体と比較すると、本発明のＩｇＧタンパク質結合体は遥かに高い持続性を示す。また、ＩｇＧの代わりにアルブミンを結合させたタンパク質結合体に比べて、本発明のタンパク質結合体は著しく優れた持続性を示した。このような結果は、本発明のタンパク質結合体がタンパク質薬物の持続型製剤を製造するのに効果的に使用できることを意味する。本発明のタンパク質結合体が、点突然変異を有するＧ−ＣＳＦ誘導体を含む幅広いタンパク質であるのに対し、従来報告されたＰＥＧ結合タンパク質またはアルブミンタンパク質結合体よりも遥かに優れた血中安定性とさらに長いＭＲＴを示す本願の発見は、本発明のタンパク質結合体に対して確認された前記血中安定性および持続性増加効果が異なる生理活性ペプチドに対しても応用できることを強く暗示する。
【０１０１】
非ペプチド性重合体として１０ｋＤａ ＰＥＧを用いて製造したｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例７）の半減期を前記と同様な方法で測定したとき、半減期は９．５時間であり、分子量３．４ｋＤａであるＰＥＧを用いたｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（１３．９時間）よりも多少短かった。スクシンイミジルプロピオネート基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基およびブチルアルデヒド基のような他の反応基を有するＰＥＧを用いて製造された結合体の見かけ分子量と血中半減期はアルデヒド基を有するＰＥＧを用いて製造されたものと同様であった。
【０１０２】
［試験例３］薬物動力学分析II
実施例８および９で各々製造したＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体（−ＳＨ基、Ｎ−末端）、および比較例３で製造したＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の血中半減期を測定するために、Ｆａｂ’を対照群とし、前記結合体または連結体を用いて試験例２と同様な方法で薬物動力学分析を行った。その結果を図１２に示す。
図１２から分かるように、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体はＦａｂ’およびＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて２〜３倍延長された血中半減期を示した。
【０１０３】
［試験例４］試験管内活性測定
（１）ｈＧＨタンパク質結合体の試験管内活性比較
ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例１）、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ｈＧＨ連結体（比較例１）およびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体（比較例２）の試験管内活性をｈＧＨ依存性有糸分裂をする細胞であるラット結節リンパ腫（rat node lymphoma）細胞株Ｎｂ２（European Collection of Cell Cultures(ECACC) #97041101）を用いて次のように測定した。
【０１０４】
Ｎｂ２細胞をフィッシャー培地（Fisher's medium）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％ＮａＣＯ３、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭグルタミンを添加した培地で培養した。得られた細胞を１０％ウシ胎児血清を除いた同じ培地で２４時間さらに培養した。９６ウェルプレートに２ｘ１０４／ウェルの量の細胞を入れた後、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ｈＧＨおよびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン、および対照群である国際標準品（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）を多様に各ウェルに添加した後、３７℃、ＣＯ２培養器で４８時間培養した。その後、細胞の成長程度（各ｗｅｌｌの細胞数）を測定するために、２５μｌの細胞染色薬（cell titer 96 Aqueous One Solution(promega社製、米国））を各ウェルに入れた後、３７℃で４時間さらに培養した。４９０ｎｍで吸光度を測定して各試料の力価を計算し、計算された力価を表８に示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
表８から分かるように、試験に用いたすべての試料は試験管内活性を有した。また、ＰＥＧによって修飾されたｈＧＨの試験管内活性は修飾されていないｈＧＨに比べて低かった。インターフェロンの場合、ＩＦＮと１２ｋＤａ ＰＥＧおよび４０ｋＤａ ＰＥＧの連結体は各々野生型の約２５％および７％程度の試験管内活性を有すると報告されている（P.Bailonら、Bioconjugate Chem.2001. 12:195〜202）。修飾されたＰＥＧの分子量が増加するほどＰＥＧ連結体の試験管内活性は減少した。４０ｋＤａのＰＥＧが修飾されたｈＧＨ連結体の試験管内活性は野生型ｈＧＨの約７．６％に過ぎず、ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体もまた野生型対比約５．２％程度と低い試験管内活性を示した。しかし、ＩｇＧをｈＧＨ−ＰＥＧ連結体に結合させた場合は、その相対活性は野生型の３０％以上と著しく高くなった。このような結果は、本発明のタンパク質結合体が血中半減期の画期的な増加とともに高い生体内活性を有することを示す。本発明のＩｇＧタンパク質結合体の場合、レセプターに対する結合親和性を保存する役割をするＩｇＧとの結合によって高い血中安定性、および空間的余裕を提供する非ペプチド性重合体によってタンパク質の活性が増加したとみられる。このような効果は、他の生理活性タンパク質のＩｇＧタンパク質結合体でも起こることと期待される。
【０１０７】
（２）ＩＦＮαタンパク質結合体の試験管内活性比較
ＩＦＮαタンパク質結合体の試験管内活性を比較するために、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例３）、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ＩＦＮα連結体（比較例１）およびＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体（比較例２）の抗ウイルス活性を水胞性口炎ウイルスで飽和させたマディン−ダービ（Madin-Darby）ウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ、Madin Darby Bovine Kidney、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２）を用いる細胞培養生検法（cell cultrue biopsy method）で測定した。ＰＥＧで修飾されていないＩＦＮα ２ｂ（ＮＩＢＳＣ ＩＦＮ）を対照群として用いた。
【０１０８】
ＭＤＢＫ細胞を、ＭＥＭ（minimum essential medium:JBI）に１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加された培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。試料と標準物質（ＮＩＢＳＣインターフェロン）を同じ培地を用いて一定濃度に希釈して９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れた。前記で培養された細胞液を各ウェルに１００μｌずつ加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１時間培養した。１時間後、ウイルス濃度が５〜７ｘ１０３ＰＦＵであるＶＳＶ（Vesicular stomatitis virus）を５０μｌずつ各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１６〜２０時間さらに培養した。試料または標準物質を入れずに細胞とウイルスのみを入れたウェルを陰性対照群とし、ウイルス希釈溶液を入れずに細胞のみを入れたウェルを陽性対照群として各々用いた。
【０１０９】
培養液を除去し、生きている細胞を染色するために、ニュートラルレッド（neutral red）溶液１００μｌずつを各ウェルに加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間さらに培養した。吸出によって上澄液を除去した後、抽出溶液（１００％エタノールと１％酢酸との１：１混合物１００μｌ）を各ウェルに入れた。染色された細胞を振盪させながら抽出溶液に懸濁した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群の細胞成長に比べての陽性対照群の細胞成長を１００％とみなして最高細胞成長の５０％を示すＥＤ５０を計算した。
【０１１０】
【表９】
【０１１１】
表９から分かるように、ＰＥＧによって修飾されたＩＦＮαの活性は修飾されていないＩＦＮαに比べて低かった。特に、ＰＥＧ部分の分子量が増加するほど血中安定性は増加するが、相対活性は次第に減少した。４０ｋＤａのＰＥＧが修飾されたＩＦＮα連結体は野生型活性の約４．８％に該当する非常に低い活性を示した。前述のように、１２ｋＤａ ＰＥＧおよび４０ｋＤａ ＰＥＧによって修飾されたＩＦＮαは各々野生型の約２５％および７％程度の試験管内活性を示すと報告されている（P.Bailonら、Bioconjugate Chem. 2001. 12: 195〜202）。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加すれば血中半減期は長くなるが、その薬効が急激に減少するので、増加した薬剤学的活性および延長された半減期を有する物質の開発が要求されてきた。ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体もまた野生型対比約５．２％程度であって、低い試験管内活性を示した。しかし、ＩＦＮαをＩｇＧで修飾した場合（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体）、相対活性は野生型の１１．２％に増加した。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体は野生型の１０．２％に該当する試験管内活性を示すので、糖鎖の不在がタンパク質結合体の活性には別の影響を及ぼさないことを確認できた。
このような結果は、本発明のＩｇＧタンパク質結合体が延長された半減期とともに高い生体内活性を示すことを示す。
【０１１２】
（３）Ｇ−ＣＳＦタンパク質結合体の試験管内活性比較
野生型Ｇ−ＣＳＦ（Filgrastim）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体、２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体（Neulasta, USA）、４０ｋＤａ ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体連結体（比較例１）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−アルブミン結合体（比較例２）および１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（実施例４）の試験管内活性を測定した。
【０１１３】
まず、ヒト骨髄起源の細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０、Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female）を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞の数を約２．２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。ＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide、culture grade/SIGMA）を１．２５％（ｖ／ｖ）になるように細胞に添加した。約２×１０４個の懸濁した細胞を含むＤＭＳＯ９０μｌで処理した培養液を９６ウェルプレート（Corning/low evaporation 96 well plate）の各ウェルに入れ、３７℃、５％ＣＯ２培養器で７２時間培養した。
【０１１４】
Ｇ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（R & D systems、米国）を用いて各試料の濃度を決定し、各試料を１０μｇ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０で適宜希釈した。生成した溶液をＲＰＭＩ１６４０で１／２ずつ連続希釈する過程を１９回繰り返した。
このようにして製造された試料１０μｌずつを培養中のＨＬ−６０細胞が入っている各ウェルに加え、最終濃度を１０００ｎｇ／ｍｌから連続的に半減させた。タンパク質試料で処理された細胞を３７℃培養器で７２時間さらに培養した。
培養後、細胞の成長程度を調査するために、CellTiter96（商標）（PROMEGA社、米国）を用いて６７０ｎｍで吸光度を測定することによって細胞数を決定した。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
表１０から分かるように、アミノ酸を変形させた１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体のＩｇＧタンパク質結合体も野生型のタンパク質結合体と同様な効果を示した。ＰＥＧで修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体は修飾されていないものに比べて血中半減期は増加するが、活性は低下することが既に確認されている（韓国特許出願第２００３−１７８６７号）。特に、ＰＥＧ部分の分子量が増加するほどＰＥＧによって修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の血中安定性は増加したが、その相対活性は次第に減少した。４０ｋＤａのＰＥＧで修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体連結体は、野生型の約１０％に該当する非常に低い試験管内活性を示した。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加するほど血中半減期は増加するが、その薬効は急激に減少するので、改善された薬剤学的活性および延長された半減期を有する物質の開発が要求されてきた。一方、アルブミンで修飾された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体は野生型の約２３％に該当する相対的に低い試験管内活性を示した。しかし、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体をＩｇＧで修飾した場合（１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体）、その相対活性は野生型の６９％以上の水準に増加した。このような結果は、本発明のＩｇＧタンパク質結合体が延長された半減期とともに高い生体内活性を有することを示す。
【０１１７】
（４）ＥＰＯタンパク質結合体の試験管内活性比較
野生型ＥＰＯ（ＢＲＰ、ＵＫ）、高糖鎖化ＥＰＯ（Aranesp、ＵＳＡ）およびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の試験管内活性を測定した。
まず、ヒト骨髄起源の細胞株であるＴＦ−１細胞（ATCC CRL-2003、erythroleukemia）を１０％のＦＢＳ、１２ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した後、ＧＭ−ＣＳＦを除去した同じＲＰＭＩ１６４０培地で１日間培養した。約２×１０４個の細胞を有する培養液５０μｌずつを９６−ウェルプレート（Corning/low evaporation 96 well plate）の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２培養器で７２時間培養した。
【０１１８】
ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（R & D systems、米国）を用いて各試料の濃度を測定し、各試料をＲＰＭＩ１６４０で最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように適宜希釈した。生成した溶液をＲＰＭＩ１６４０で１／２ずつ連続希釈する過程を１９回繰り返した。
このように製造された試料を培養中のＴＦ−１細胞が入っている各ウェルに５０μｌずつ加え、最終濃度を５μｇ／ｍｌから連続的に半減させた。タンパク質試料で処理されたプレートを３７℃、５％ＣＯ２培養器で７２時間さらに培養した。
培養後、細胞の成長程度を調査するために、CellTiter96（商標）AQueous One（Cat. No. G3581、PROMEGA社製、米国）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定することによって細胞数を決定した。
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】
表１１から分かるように、試験に用いたすべての試料はヒト骨髄起源の細胞株の成長を促進させることによって立証されたように試験管内活性を有する。また、高糖鎖化されたＥＰＯとＰＥＧ−ＩｇＧ連結体によって修飾されたＥＰＯの試験管内活性は修飾されていないＥＰＯよりも低かった。しかし、本発明のＥＰＯタンパク質結合体の場合、著しく増加した血中半減期のため、修飾されていないＥＰＯに比べて優れた生体内活性を有すると期待される。本発明のＥＰＯタンパク質結合体の場合、レセプターに対する結合力を保存する役割をするＩｇＧとの結合による増加した血中安定性および空間的余裕を提供する非ペプチド性重合体によってタンパク質の活性が増加したものとみられる。
【０１２１】
（５）Ｆａｂ’タンパク質結合体の細胞毒性中和
実施例８および９で製造したＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧおよびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体、および比較例３で製造したＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体がマウス繊維芽細胞株Ｌ９２９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１４８）に対するＴＮＦ−αの細胞毒性を中和させる能力を測定することによって、これらの試験管内活性を調査した。
【０１２２】
各々のＦａｂ’結合体および連結体を２倍ずつ順次希釈し、希釈液各１００μｌずつを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ｒｈＴＮＦ−α（R & D systems）と、ＲＮＡ合成の阻害剤であるアクチノマイシン−Ｄ（Sigma）を各々１０ｎｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌの濃度になるように各ウェルに加えた。この反応混合物を３７℃、５％ＣＯ２の条件で３０分間反応させた後、分析用マイクロプレートに移した。Ｌ９２９細胞株培養液５０ｕｌずつを５ｘ１０４細胞／ウェルになるように各ウェルに加えて３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。ウェルの培養液を除去した後、ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶けているＭＴＴ（sigma）を５０μｌずつ各ウェルに入れた後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２培養器で４時間培養した。ＤＭＳＯ １５０μｌを各ウェルに加えて溶解した。５４０ｎｍで吸光度を測定して試験Ｆａｂ’結合体および連結体によるｒｈＴＮＦ−αの細胞毒性の中和程度を決定した。対照群としては実施例８の段階１で得られた精製されたＦａｂ’を用いた。
【０１２３】
図１３の結果から分かるように、すべてのタンパク質結合体および連結体はＦａｂ’と同様な吸光度を示した。このような結果は、ＩｇＧがＦａｂ’のＮ−末端またはＣ−末端近くの遊離システイン残基にＰＥＧスペーサーを通じて結合したＦａｂ’−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体がＦａｂ’の生物学的活性を保持することを示す。
【０１２４】
［試験例５］動物モデルにおける生体内活性測定
（１）ｈＧＨタンパク質結合体の生体内活性比較
各実験群当り１０匹ずつの脳下垂体が除去された雄スプラーグ・ドーリーラット（５週齢、ＳＬＣ社製、日本）を用いて体重増加試験を行ってｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体および野生型ｈＧＨの生体内活性を測定した。溶媒対照群、野生型ｈＧＨ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体、およびｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体を、下記表１２のような投与スケジュールおよび容量に従って、ラットの肩背部の皮下に２６Ｇ注射器（１ｍｌ、（株）韓国ワクチン）で各々投与した。投与前および投与１６時間後ラットの体重を測定した。最終投与から２４時間後、ラットをエーテル麻酔で致死させ、肉眼で脳下垂体の残存有無を検査して、脳下垂体の残存物が観察された個体は結果から除外した。
【０１２５】
【表１２】
【０１２６】
各試料の投与後の体重変化を図１４に示す。標準品（対照群）として用いられた野生型ｈＧＨは生体内活性を保持するために毎日投与しなければならないので、毎日１回ずつ１２日間投与したので、グループ２のラットは投与期間を通じて体重増加が観察された。ｈＧＨ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体を６日に１回投与したグループ３のラットは、投与後３日まで持続的に体重が増加し、３日以降は体重増加率が鈍化した。このような結果は、ｈＧＨ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体が野生型ｈＧＨに比べて遥かに長い半減期および高い試験管内活性を示した試験例１および２の結果からの予想と一致する。特に、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を野生型投与容量の１／３容量で６日に１回投与することによって得られる効果は野生型を毎日投与したものと等しいか、より良好であった。これは、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性が野生型よりも３倍以上高いことを意味する。
【０１２７】
（２）Ｇ−ＣＳＦ誘導体タンパク質結合体の生体内活性比較
１７番目のアミノ酸がセリンで置換された１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦを用いて本発明のタンパク質結合体の効果を調査するために、野生型Ｇ−ＣＳＦ、市販中の２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体および１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を比較した。本発明の１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は溶媒（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１％グリシン、０．２５％マンニトール、ｐＨ７．０）に溶解した。比較群としては、野生型メチオニルＧ−ＣＳＦ連結体（Filgrastim、Amgen、ＵＳＡ）および２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＧ−ＣＳＦ（Neulasta、Amgen、ＵＳＡ）を前記と同じ溶媒に希釈して使用した。７週齢の雌ＩＣＲマウスをセムタコＢｉｏ（韓国）から購入して一週間の順化期間を経た後試験に用いた。試験開始時、ＩＣＲマウスの体重は３０〜３５ｇであった。順化期間および試験期間中には実験動物用飼料（三養社、韓国）および水を自由に摂取させ、温度２２±３℃、相対湿度５５±５％、換気回数１０〜１２回／時間、照度１５０〜２００ルクス（lux）および１２時間明／１２時間暗の明暗周期の条件下で檻に閉じ込めた。各実験群は５匹のマウスからなり、複合抗癌剤と各試料を下記表１３のような投与スケジュールおよび容量でマウスに投与した。好中球減少症（Neutropenia）動物モデルはシクロヘキサミド（ＣＰＡ；Sigma、米国）１３０ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；Sigma、米国）４．５ｍｇ／ｋｇおよびビンクリスチン（ＶＣＲ；Sigma、米国）１ｍｇ／ｋｇの混合物をＩＣＲマウスの腹腔内に単回投与して製造した。無処置群は抗癌剤を投与せず、好中球数の減少を示さない。溶媒対照群は抗癌剤を投与して好中球の数を低め、薬物の代わりに賦形剤のみを投与した群である。抗癌剤投与後１日目から５日目まで午前１０時頃に野生型Ｇ−ＣＳＦを１００μｇ／ｋｇ／日の容量で皮下注射した。１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体と２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体（Neulasta、Amgen、ＵＳＡ）は抗癌剤投与後１日目に１回のみ投与したが、投与容量は１０００μｇ／ｋｇ／日であって、野生型１日投与容量の２倍量で（２００μｇ／ｋｇ／日）５日分を一回に投与した。抗癌剤投与後１、２、３、４、５、６および８日目に０．３〜０．５ｍｌの血液をマウスの眼窩静脈層から採血した。採血時間は薬物投与６時間後である午後４時頃であった。自動血球測定器で白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）および血小板（Platelet）の数を測定した。また、血液塗抹標本を製作してギムザ（Giemsa）染色を行った。各血球を分別計数して得られた好中球（neutrophil）の比率を得、これに基づいて下記式１によって好中球の数を算出した。
【０１２８】
＜式１＞
好中球の数（細胞／ｍｍ３）＝総ＷＢＣの数（細胞／ｍｍ３）×好中球比率（％）×１／１００
無処置群、溶媒対照群、および１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ群から得られた値の統計的有意義性を検証するために、各群の血球数および体重に対してStudent’s t-testを用いて統計的分析を行った。
【０１２９】
【表１３】
【０１３０】
各試料の投与後の好中球回復効果を図１５に示す。標準品として用いた野生型Ｇ−ＣＳＦを５日間毎日投与したとき、投与期間中好中球の数が徐々に増加して５日目に最高値に達した。２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを１日投与容量の２倍容量で１回投与すると野生型Ｇ−ＣＳＦを毎日投与したときに観察されたものの２／３程度の生体内効力を示した反面、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ連結体の生体内活性に比べて３倍以上高い活性を示した。また、本発明のタンパク質結合体はＧ−ＣＳＦを毎日投与した場合よりも２倍以上高い好中球回復効果を示したが、このような結果は、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体が野生型に比べて遥かに長い血中半減期と高い生体内活性を有するという結果と一致する。前記結果から、野生型タンパク質を用いた場合と同様に、アミノ酸を変形させた誘導体タンパク質からもＩｇＧおよびＰＥＧの共有結合による本発明のタンパク質結合体の効果を同様に示すことが分かる。したがって、本発明のタンパク質結合体は、頻繁な投与が要求される野生型Ｇ−ＣＳＦの短所を克服しながらＧ−ＣＳＦの血中半減期および生体内活性を著しく増加させる目的を同時に満たす持続型剤形として効果的に利用できる。
【０１３１】
（３）ＥＰＯタンパク質結合体の生体内活性比較
野生型ＥＰＯ、高糖鎖化ＥＰＯ（Aranesｐ、ＵＳＡ）、およびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を比較するために、前記試験試料を投与したラットにおける血液成分の変化を調査した。本実験は、文献〔J.C. Egrie and Browne, British Journal of Cancer (2001) B4 (Supplement 1), 3-10〕に記述された方法を若干変形して次のように行った。
【０１３２】
本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体を溶媒（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１％グリシン、０．２５％マンニトール、ｐＨ７．０）に溶解した。比較群としては、野生型ＥＰＯおよび高糖鎖化ＥＰＯを前記と同じ溶媒に希釈して用いた。７週齢の雌ラットを大韓バイオリンク（株）（韓国）から購入して一週間の順化期間を経た後試験に用いた。試験開始時のラットの体重は２００〜２５０ｇであった。順化期間および試験期間中には実験動物用飼料（第一製糖（株）、韓国）および水を自由に摂取させ、温度２２±３℃、相対湿度５５±５％、換気回数１０〜１２回／時間、照度１５０〜２００ルクス（lux）および１２時間明／１２時間暗の明暗周期の条件下で檻に閉じ込めた。各実験群は５匹のラットからなり、前記のように準備された各試験試料を下記表１４のような投与容量およびスケジュールに従ってラットの肩背部の皮下に２６Ｇ注射器（１ｍｌ、（株）韓国ワクチン）で投与した。
【０１３３】
投与後、３日に一回ずつ一ヶ月間尻尾の静脈から血液凝固防止剤（ＥＤＴＡ）を含むチューブに全血試料を採取した。血球自動測定装備（Ｖｅｔ ＡＢＣ）を用いて血液試料のヘマトクリット（hematocrit）を測定した。
【０１３４】
【表１４】
【０１３５】
各試料の投与後のヘマトクリット回復効果を図１６に示す。標準品として用いた野生型ＥＰＯを５日間毎日投与したとき、投与期間中ヘマトクリットの数値が徐々に増加して９日目に最高値に達した。高糖鎖化ＥＰＯを投与したグループ３のラットでは、ヘマトクリット数値が注射後６日間は速く増加したが、以降は急速に減少した。これに対し、本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体は、ヘマトクリット数値の初期増加速度が高糖鎖化ＥＰＯよりも速く、増加幅もさらに大きく、他の試験タンパク質に比べて高い生体内活性を２週間以上保持した。このような結果は、ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体が野生型ＥＰＯまたは高糖鎖化ＥＰＯに比べて遥かに長い血中半減期を示す試験例２の結果から期待されるものと一致する。したがって、本発明のタンパク質結合体は、過度に頻繁な投与が要求される野生型ＥＰＯの短所を克服するとともに、ＥＰＯの血中半減期および生体内活性を著しく増加させる目的を同時に満たす持続型剤形として効果的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のクロマトグラムである。
【図２】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図３】インターフェロン−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図４】ＤＤＴ処理前と後のｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図５】ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の質量スペクトルである。
【図７】ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体がＰＥＧ−ｈＧＨ連結体に比べて優れた血中安定性を有することを示す薬物動力学グラフである。
【図８】エリトロポイエチン−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体が自由エリトロポイエチンまたは高糖鎖化によって安定化されたエリトロポイエチンに比べて向上した血中半減期を有することを示す薬物動力学グラフである。
【図９】非糖鎖化ＩｇＧ（ＡＧ ＩｇＧ）の分子量スペクトルである。
【図１０】ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体が野生型ＩＦＮαに比べて向上した血中安定性を有し、糖鎖がないにもかかわらず活性を保持することを示す薬物動力学グラフである。
【図１１】ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ ＩｇＧ結合体が野生型ＥＰＯに比べて向上した血中安定性を有し、糖鎖がないにもかかわらず活性を保持することを示す薬物動力学グラフである。
【図１２】Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体およびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体が野生型Ｆａｂ’およびＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて向上した血中半減期を有することを示す薬物動力学グラフである。
【図１３】Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体およびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示すグラフである。
【図１４】ビヒクル（３０μｇ／日；グループ１）、野生型ｈＧＨ（３０μｇ／日；グループ２）、ｈＧＨ−ＰＥＧ（３０μｇ／日；グループ３）、ｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（３０μｇ／日；グループ４）、およびｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体（１０μｇ／日；グループ５）の投与後、ラット体重の経時変化に基づくｈＧＨ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示す。
【図１５】好中球（Neutrophil）数の経時変化に基づくＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示す：非処理（グループ１）、ビヒクルのみを注射（グループ２）、野生型Ｇ−ＣＳＦ処理（グループ３）、２０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ処理（グループ４）、および１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体処理（グループ５）。
【図１６】ヘマトクリット（Hematocrit）数の経時変化に基づくＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体の生体内活性を示す：溶媒のみを注射（グループ１）、野生型ＥＰＯ処理（グループ２）、高糖鎖化ＥＰＯ処理（グループ３）、およびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＩｇＧ結合体処理（グループ４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合で互いに連結されたｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体。
【請求項２】
前記非ペプチド性重合体が両末端に各々反応基を有し、これらを通じて前記重合体が生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと共有結合で連結されている、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項３】
前記免疫グロブリンが、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体からなる連結体に共有結合で連結されている、請求項２記載のタンパク質結合体。
【請求項４】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項５】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項４記載のタンパク質結合体。
【請求項６】
前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項４記載のタンパク質結合体。
【請求項７】
前記免疫グロブリンが、野生型糖鎖を有する免疫グロブリン、増加または減少した糖鎖を有する免疫グロブリン、糖鎖が除去された免疫グロブリン、およびこれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンの糖鎖の増減または除去が、化学的方法、酵素的方法、遺伝工学的方法およびこれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって行われる、請求項７記載のタンパク質結合体。
【請求項９】
前記非ペプチド性重合体の反応基がアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる、請求項２記載のタンパク質結合体。
【請求項１０】
前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである、請求項９記載のタンパク質結合体。
【請求項１１】
前記非ペプチド性重合体が両末端に各々アルデヒド基を有する、請求項９記載のタンパク質結合体。
【請求項１２】
前記非ペプチド性重合体が、その両末端で前記免疫グロブリンのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基、および前記生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基と各々共有結合で連結される、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項１３】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ（乳酸−グリコール酸）、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項１４】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）である、請求項１３記載のタンパク質結合体。
【請求項１５】
前記生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターからなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項１６】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、グ
ルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＦＳＨ放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン 、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類、レセプター拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびｓｃＦｖを含む抗体断片、およびウイルス由来のワクチン抗原からなる群から選ばれる、請求項１５記載のタンパク質結合体。
【請求項１７】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、顆粒球コロニー刺激因子または赤血球生成因子である、請求項１６記載のタンパク質結合体。
【請求項１８】
（ａ）少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、および少なくとも一つの免疫グロブリンを両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体と共有結合で連結する段階；および
（ｂ）共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項１記載のタンパク質結合体の製造方法。
【請求項１９】
前記段階（ａ）が、
（ａ１）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結する段階；
（ａ２）生成した反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階；および
（ａ３）前記連結体の非ペプチド性重合体の自由末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結して、共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンを含むタンパク質結合体を生成する段階をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記段階（ａ１）において生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体のモル比が１：２．５〜１：５である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記段階（ａ１）において免疫グロブリンと非ペプチド性重合体のモル比が１：５〜１：１０である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記段階（ａ３）において、段階（ａ２）で得られた連結体と免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドのモル比が１：１〜１：３である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記段階（ａ１）および（ａ３）が各々還元剤の存在下で行われる請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記還元剤がナトリウムシアノボロハイドライド、ナトリウムボロハイドライド、ジメチルアミンボレートおよびピリジンボレートである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体を含む、半減期が延長された生理活性ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２６】
両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと共有結合で連結することを含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンが、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体からなる連結体に共有結合で連結されている請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫グロブリンが、野生型糖鎖を有する免疫グロブリン、増加または減少した糖鎖を有する免疫グロブリン、糖鎖が除去された免疫グロブリン、およびこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンの糖鎖の増減または除去が、化学的方法、酵素的方法、遺伝工学的方法およびこれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって行われる請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記非ペプチド性重合体の反応基がアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターからなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、グルコセレプロシダーゼ（glucocerebrosidase）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＦＳＨ放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類、レセプター拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびｓｃＦｖを含む抗体断片、およびウイルス由来のワクチン抗原からなる群から選ばれる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、顆粒球コロニー刺激因子、または赤血球生成因子である請求項３６記載の方法。
【請求項１】
共有結合で互いに連結されたｉ）生理活性ポリペプチド、ii）非ペプチド性重合体、およびiii）免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体。
【請求項２】
前記非ペプチド性重合体が両末端に各々反応基を有し、これらを通じて前記重合体が生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと共有結合で連結されている、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項３】
前記免疫グロブリンが、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体からなる連結体に共有結合で連結されている、請求項２記載のタンパク質結合体。
【請求項４】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項５】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項４記載のタンパク質結合体。
【請求項６】
前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項４記載のタンパク質結合体。
【請求項７】
前記免疫グロブリンが、野生型糖鎖を有する免疫グロブリン、増加または減少した糖鎖を有する免疫グロブリン、糖鎖が除去された免疫グロブリン、およびこれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンの糖鎖の増減または除去が、化学的方法、酵素的方法、遺伝工学的方法およびこれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって行われる、請求項７記載のタンパク質結合体。
【請求項９】
前記非ペプチド性重合体の反応基がアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる、請求項２記載のタンパク質結合体。
【請求項１０】
前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである、請求項９記載のタンパク質結合体。
【請求項１１】
前記非ペプチド性重合体が両末端に各々アルデヒド基を有する、請求項９記載のタンパク質結合体。
【請求項１２】
前記非ペプチド性重合体が、その両末端で前記免疫グロブリンのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基、および前記生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基と各々共有結合で連結される、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項１３】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ（乳酸−グリコール酸）、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項１４】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）である、請求項１３記載のタンパク質結合体。
【請求項１５】
前記生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターからなる群から選ばれる、請求項１記載のタンパク質結合体。
【請求項１６】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、グ
ルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＦＳＨ放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン 、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類、レセプター拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびｓｃＦｖを含む抗体断片、およびウイルス由来のワクチン抗原からなる群から選ばれる、請求項１５記載のタンパク質結合体。
【請求項１７】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、顆粒球コロニー刺激因子または赤血球生成因子である、請求項１６記載のタンパク質結合体。
【請求項１８】
（ａ）少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、および少なくとも一つの免疫グロブリンを両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体と共有結合で連結する段階；および
（ｂ）共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項１記載のタンパク質結合体の製造方法。
【請求項１９】
前記段階（ａ）が、
（ａ１）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結する段階；
（ａ２）生成した反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階；および
（ａ３）前記連結体の非ペプチド性重合体の自由末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結して、共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンを含むタンパク質結合体を生成する段階をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記段階（ａ１）において生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体のモル比が１：２．５〜１：５である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記段階（ａ１）において免疫グロブリンと非ペプチド性重合体のモル比が１：５〜１：１０である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記段階（ａ３）において、段階（ａ２）で得られた連結体と免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドのモル比が１：１〜１：３である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記段階（ａ１）および（ａ３）が各々還元剤の存在下で行われる請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記還元剤がナトリウムシアノボロハイドライド、ナトリウムボロハイドライド、ジメチルアミンボレートおよびピリジンボレートである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体を含む、半減期が延長された生理活性ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２６】
両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと共有結合で連結することを含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンが、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体からなる連結体に共有結合で連結されている請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫グロブリンが、野生型糖鎖を有する免疫グロブリン、増加または減少した糖鎖を有する免疫グロブリン、糖鎖が除去された免疫グロブリン、およびこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンの糖鎖の増減または除去が、化学的方法、酵素的方法、遺伝工学的方法およびこれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって行われる請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記非ペプチド性重合体の反応基がアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
前記非ペプチド性重合体がポリ（エチレングリコール）である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターからなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、グルコセレプロシダーゼ（glucocerebrosidase）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＦＳＨ放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類、レセプター拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびｓｃＦｖを含む抗体断片、およびウイルス由来のワクチン抗原からなる群から選ばれる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、顆粒球コロニー刺激因子、または赤血球生成因子である請求項３６記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００７−５２８３４６（Ｐ２００７−５２８３４６Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００６５９（Ｐ２００６−５００６５９）
【出願日】平成１６年３月１３日（２００４．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１０５３
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１３日（２００４．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１０５３
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
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