間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法
【課題】 間葉系幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた増殖促進方法および製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明の増殖促進剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。このように、本発明によれば、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
【解決手段】 本発明の増殖促進剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。このように、本発明によれば、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞等の間葉系細胞への分化能を持つ多能性幹細胞であり、骨髄液および脂肪組織等に存在する。この多能性から、前記間葉系幹細胞を、骨、血管、心筋に再構築し、再生医療に利用することが試みられている。組織の再構築には、多数の前記間葉系幹細胞を要するが、前記骨髄液等の生体試料から得られる前記間葉系幹細胞はわずかである。このため、前記間葉系幹細胞の増殖方法の開発が期待されている。前記増殖方法として、例えば、抗菌ペプチドを含む培地を用いる方法（特許文献１）、ウイルスベクターを用いて転写因子遺伝子を導入する方法（特許文献２）等が報告されている。しかしながら、これらの方法は、細胞の増殖効率および安全性が十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３７４２６号公報
【特許文献２】特開２００９−１１２５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、間葉系幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた増殖促進方法および製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の増殖促進剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明の増殖促進方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、前記本発明の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明の製造方法は、間葉系幹細胞の製造方法であって、前記本発明の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、前述のように、例えば、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、凝固臍帯血の液性成分を用いることで、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞を増殖できる。このように、本発明によれば、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜増殖促進剤＞
本発明の増殖促進剤は、前述のように、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。
【００１０】
臍帯血は、胎盤および臍帯に含まれる血液である。前記臍帯血は、通常、病院において、娩出時および娩出後に、胎盤および臍帯に針を刺し、前記針からチューブを介して、採血バックに採取される。前記チューブおよび前記採血バックから、臍帯血を得られる。
【００１１】
本発明において、凝固していない臍帯血を「未処理臍帯血」または「非凝固臍帯血」という。前記未処理臍帯血は、特に制限されず、血小板を含んでいればよい。前記未処理臍帯血は、例えば、臍帯血そのものでもよいし、血小板を含む臍帯血液性成分でもよい。前記血小板を含む臍帯血液性成分は、例えば、前記血小板を含む血漿が好ましい。前記血小板を含む血漿は、例えば、いわゆる多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｒｉｃｈ−Ｐｌａｓｍａ）等があげられる。「血漿」は、一般に、血液から、血球（赤血球、白血球および血小板）を除いた液体画分を意味し、「血清」は、一般に、血液から、血球（赤血球、白血球および血小板）と数種の血液凝固因子とを除いた液体画分を意味し、前記血液凝固因子は、例えば、フィブリノゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）等である。本発明において、前記未処理臍帯血として血漿を使用する場合、血小板を含む血漿であればよい。
【００１２】
本発明において、前記未処理臍帯血または前記非凝固臍帯血に凝固処理を施したものを「凝固臍帯血」という。前記凝固臍帯血は、例えば、臍帯血そのものに凝固処理を施したものでもよいし、前記血小板を含む臍帯血液性成分に凝固処理を施したものでもよい。前記凝固処理の方法は、何ら制限されず、従来公知の方法があげられる。本発明において、「凝固」は、例えば、血小板の凝集の意味でもよく、「凝固処理」は、血小板の凝固処理でもよい。
【００１３】
臍帯血そのものを凝固処理する場合、例えば、以下のようにして、前記凝固臍帯血を得ることができる。
【００１４】
前記未処理臍帯血が、凝固していない臍帯血そのものである場合は、例えば、抗凝固剤を含む非凝固臍帯血と、抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血とがあげられる。前述のように、体内から臍帯血を採取する際、例えば、抗凝固剤を含む採血バックを使用することで、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血が得られる。前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血に対する凝固処理は、特に制限されない。前記凝固処理は、例えば、前記抗凝固剤に対する中和剤の存在下で行うことが好ましい。前記抗凝固剤は、例えば、クエン酸、へパリン等があげられる。前記中和剤は、特に制限されず、前記抗凝固剤の種類に応じて適宜設定でき、例えば、カルシウム、プロタミン等があげられる。前記抗凝固剤がクエン酸の場合、前記中和剤は、例えば、塩化カルシウム液等のカルシウム液が好ましく、前記抗凝固剤がヘパリンの場合、前記中和剤は、例えば、プロタミン等が好ましい。前記凝固処理は、例えば、物理的な処理でもよいし、化学的な処理でもよい。前記物理的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前記非凝固臍帯血を異物と接触させる方法があげられる。前記異物は、例えば、ビーズ等の後述する血液凝固剤、バック、遠沈管等の容器等があげられる。前記化学的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、例えば、血液凝固反応を促進する血液凝固剤を添加する方法があげられる。前記血液凝固剤は、例えば、血小板凝集を促進する物質があげられ、具体例としては、例えば、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、コラーゲン、トロンビン、ビタミンＫ等があげられる。
【００１５】
他方、前記抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血の場合、凝固処理は、例えば、物理的な処理があげられ、具体的には、前記非凝固臍帯血を前記異物と接触させる方法があげられる。前述のように、体内から臍帯血を採取する際、例えば、前記抗凝固剤を含まない採血チューブおよび採血バックを使用することで、体内からの臍帯血が、前記採血チューブおよび採血バックと接触し、血液凝固反応が起こる。このため、前記採血チューブおよび前記採血バック内の臍帯血を、そのまま凝固臍帯血として使用できる。
【００１６】
このように臍帯血そのものを凝固処理した場合、前記凝固臍帯血の液性成分は、例えば、前記凝固臍帯血に含まれた状態でもよいし、前記凝固臍帯血から回収された状態でもよい。後者の場合、例えば、前記凝固臍帯血から液体画分を回収することにより、前記凝固臍帯血の液性成分を得ることができる。前記液性成分は、例えば、血清でもよいし、血漿でもよい。
【００１７】
前記凝固臍帯血からの液性成分の回収方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、遠心分離処理、沈殿処理、膜分離処理、ろ過処理、吸着処理等があげられる。前記膜分離処理は、例えば、各種フィルターにより、血球成分等を除去し、前記液性成分を回収する方法があげられる。中でも、遠心分離処理が好ましい。前記遠心分離処理の条件は、特に制限されず、例えば、２２８３４ｍ／ｓ２、４℃、１０分間の条件が例示できる。また、前記液性成分として、前記凝固臍帯血から血清を得る場合、例えば、前記凝固臍帯血に加熱処理を施した後、前記回収処理を行うことが好ましい。
【００１８】
つぎに、凝固していない血小板を含む臍帯血液性成分（以下、「非凝固臍帯血の液性成分」ともいう）を凝固処理する場合、例えば、以下のようにして、前記凝固臍帯血を得ることができる。
【００１９】
前記非凝固臍帯血の液性成分は、例えば、前述と同様の方法によって、臍帯血から回収できる。前記臍帯血は、例えば、抗凝固剤を含む臍帯血があげられ、これから前記非凝固臍帯血の液性成分を回収できる。前記非凝固臍帯血の液性成分は、血小板を含んでいればよく、例えば、血小板を含む血漿があげられ、中でも、好ましくは多血小板血漿である。前記非凝固臍帯血の液性成分の凝固処理は、特に制限されず、前述した前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血そのものの凝固処理と同様に行うことができる。具体的には、例えば、前記抗凝固剤に対する中和剤の存在下で行うことが好ましい。前記凝固処理は、例えば、物理的な処理でもよいし、化学的な処理でもよい。前記物理的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前記非凝固臍帯血の液性成分を、前述した異物と接触させる方法があげられる。前記化学的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前述した血液凝固剤を添加する方法があげられる。
【００２０】
前記血小板を含む非凝固臍帯血の液性成分を凝固処理した場合、例えば、前記凝固処理した前記非凝固臍帯血の液性成分を、本発明の増殖促進剤として使用できる。前記非凝固臍帯血の液性成分が血漿の場合、例えば、前記凝固処理の後、さらに、凝固画分を除去し、液性成分として血清を回収し、これを、本発明の増殖促進剤として使用してもよい。前記凝固画分を除去する場合、例えば、前記凝固処理した前記非凝固臍帯血の液性成分に加熱処理を施した後、前記凝固画分の除去を行うことが好ましい。
【００２１】
前記臍帯血の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、および、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等があげられる。
【００２２】
（第１の形態）
一例として、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血から多血小板血漿を回収し、前記多血小板血漿に凝固処理を施し、前記凝固臍帯血の液性成分を回収する方法を説明する。本発明は、これには制限されない。
【００２３】
まず、前記非凝固臍帯血に、赤血球を分離するための赤血球沈降剤を添加する。前記赤血球沈降剤は、例えば、ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｒｃｈ）等があげられる。前記赤血球沈降剤の前記非凝固臍帯血への添加量は、特に制限されず、例えば、１〜５０ｍｇ／ｍＬが好ましい。前記赤血球沈降剤を添加した前記非凝固臍帯血の静置によって、前記非凝固臍帯血は、赤血球を含む画分と、造血幹細胞を含む上清画分とに分離される。前記分離の条件は、特に制限されず、例えば、温度１５〜２５℃である。前記非凝固臍帯血が、例えば、予め前記赤血球沈降剤を含む場合、前記赤血球沈降剤を添加しなくてもよい（以下、同様）。
【００２４】
つぎに、前記上清画分を、造血幹細胞を含む沈降画分と、血小板を含む液体画分とに分離する。前記液体画分は、例えば、血小板含有の液性成分を含む画分である。前記液体画分は、例えば、血漿を含む画分（血漿画分）であり、より好ましくは、多血小板血漿である。前記血小板を含む液体画分の分離条件は、特に制限されず、例えば、従来公知の多血小板血漿の回収方法に従って行える。前記回収方法は、例えば、遠心分離があげられ、前記遠心分離の条件は、特に制限されず、例えば、遠心加速度２９４０〜１１７６０ｍ／ｓ２（３００〜１２００×ｇ）、温度１〜２０℃、時間３〜６分である。
【００２５】
つぎに、前記血小板を含む液体画分に、前記血液凝固剤を接触させる。
【００２６】
前記血液凝固剤は、例えば、血液の凝固を促進するものであり、具体的には、例えば、血小板および血液凝固因子等の被活性化因子を活性化する。前記血液凝固剤は、特に制限されず、例えば、特許第３７８８４７９号等に記載されているものが使用できる。前記血液凝固剤は、例えば、前記臍帯血に不溶であり、固体であることが好ましい。前記血液凝固剤の形態は、例えば、粒状、顆粒状、塊状が好ましい。前記血液凝固剤の形状は、略球状、正球状等の球状が好ましい。前記血液凝固剤の大きさは、特に制限されず、前記形状が球状の場合、例えば、直径は、１〜１０ｍｍが好ましく、より好ましくは３〜５ｍｍである。前記血液凝固剤は、例えば、多孔質構造でもよい。前記多孔質構造の前記血液凝固剤は、単位体積あたりの表面積を大きく設計でき、効率良く血小板等の活性化を行える。
【００２７】
前記血液凝固剤の材質は、特に制限されず、例えば、その表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されていることが好ましい。前記二酸化ケイ素は、例えば、ガラス、シリカ、珪藻土、カオリン等があげられる。前記血液凝固剤は、好ましくは、ガラスビーズである。さらに、前記血液凝固剤は、その芯体が、例えば、磁性物質を含んでもよい。このように前記血液凝固剤が磁性物質を含む場合、例えば、磁界を作用させることにより、前記液体画分の攪拌および前記血液凝固剤の回収を、容易かつ迅速に行える。
【００２８】
この接触処理は、例えば、前記血液凝固剤を入れた遠心管等のチューブまたはバックに、前記液体画分を注入することで行える。
【００２９】
前記液体画分に対する前記血液凝固剤の割合は、特に制限されず、例えば、前記血液凝固剤の表面積が、前記液体画分１ｍＬに対して、０．１ｍｍ２〜２５ｍｍ２の範囲であることが好ましい。
【００３０】
前記接触処理の条件は、特に制限されず、例えば、温度は、４〜３７℃が好ましく、より好ましくは１５〜２５℃であり、時間は、１０〜９０分が好ましく、より好ましくは２０〜３０分である。前記接触処理は、例えば、振とう条件下で行うことが好ましい。
【００３１】
このように、前記液体画分に前記血液凝固剤を添加することによって、前記凝固臍帯血の液性成分が得られる。前記凝固臍帯血の液性成分は、そのまま、本発明の増殖促進剤として使用してもよいし、例えば、希釈、濃縮したものを、本発明の増殖促進剤として使用することもできる。
【００３２】
前記血液凝固剤を含む液体画分がフィブリノゲン等の血液凝固因子を含む場合、例えば、さらに、前記液体画分から前記血液凝固因子を除去して、前記凝固臍帯血の液性成分として使用することもできる。具体的には、前記血液凝固剤を含む液体画分が、例えば、前記血液凝固因子を含む血漿画分である場合、前記血液凝固因子を除去して、血清を回収し、これを前記凝固臍帯血の液性成分として使用することが好ましい。
【００３３】
前記血液凝固因子の除去は、例えば、前記血液凝固剤による接触処理の後に行うことが好ましい。前記血液凝固因子の除去方法は、特に制限されず、例えば、フィブリノゲン等の血液凝固因子を変性させ、不溶性画分として除去する方法があげられる。具体的には、例えば、フィブリノゲンの変性によりフィブリンを形成させて、不溶性画分として除去する方法があげられる。前記変性方法は、特に制限されず、例えば、熱変性があげられ、具体的には、例えば、前記血液凝固剤を含む液体画分に加熱処理を施す方法があげられる。前記加熱処理の条件は、特に制限されず、例えば、温度は、５０〜６０℃が好ましく、時間は、１０〜１２０分が好ましく、より好ましくは３０〜６０分である。前記不溶性画分の除去は、例えば、前記加熱処理後の前記血液凝固剤を含む液体画分を、静置、遠心またはフィルターろ過等することによって行える。そして、例えば、静置後の上清画分、遠心後の上清画分、または、フィルターろ過後のろ液を回収することで、前記凝固臍帯血の液性成分が得られる。前記静置、遠心またはフィルターろ過等の条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。また、前記血液凝固剤を含む液体画分からの前記血液凝固因子の除去方法は、この他に、例えば、前記血液凝固剤を含む液体画分に対する、塩化カルシウム、トロンビン等の凝固因子の添加等、血液凝固系の活性化機構を利用した方法があげられる。前記方法の具体的な条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。
【００３４】
以上のようにして調製した前記凝固臍帯血の液性成分は、例えば、そのまま、本発明の増殖促進剤として使用してもよいし、例えば、希釈、濃縮したものを、本発明の増殖促進剤として使用することもできる。
【００３５】
（第２の形態）
一例として、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血に凝固処理を施し、前記凝固臍帯血の液性成分を回収する方法を説明する。本発明は、これには制限されない。
【００３６】
まず、前記非凝固臍帯血に、前記血液凝固剤を接触させる。前記血液凝固剤は、例えば、前述の通りであり、同様にして使用できる。このように、前記非凝固臍帯血に前記血液凝固剤を添加することによって、凝固臍帯血を得ることができる。
【００３７】
つぎに、前記凝固臍帯血を、沈降画分と液体画分とに分離する。この液体画分を、本発明の凝固臍帯血の液性成分として使用することができる。前記分離方法は、特に制限されず、例えば、前記第１の形態と同様に、遠心分離処理が好ましい。また、分離の前に、前述と同様に、加熱処理等の変性処理を施してもよい。
【００３８】
＜増殖促進剤の製造方法＞
本発明の製造方法は、凝固臍帯血の液性成分を回収する工程を含むことを特徴とする。本発明において、前記凝固臍帯血および前記液性成分等は、前述の通りである。
【００３９】
本発明は、さらに、前記未処理臍帯血を凝固させる工程を含んでもよく、例えば、前記未処理臍帯血を血液凝固剤と接触させることで凝固させることができる。
【００４０】
＜増殖促進方法＞
本発明の増殖促進方法は、前述のように、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、本発明の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明において、増殖促進目的とする間葉系幹細胞の種類は、特に制限されず、例えば、骨髄間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞等があげられる。前記間葉系幹細胞の採取方法は、特に制限されず、従来公知の方法に基づいて行える。
【００４２】
前記間葉系幹細胞の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、および、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等があげられる。また、本発明の増殖促進剤における前記凝固臍帯血の液性成分と、増殖対象となる前記間葉系幹細胞とは、同一の個体由来であることが好ましい。
【００４３】
本発明において、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程は、前述のように、前記本発明の増殖促進剤を含む培地に前記間葉系幹細胞を播種することで行える。以下に、その具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。
【００４４】
前記培地は、前記本発明の増殖促進剤を含有すればよく、その他の構成や条件は、何ら制限されない。前記培地は、例えば、前記間葉系幹細胞の培養に使用可能な培地があげられ、具体的には、例えば、α−Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地（αＭＥＭ培地）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ培地（ＤＭＥＭ培地）等が使用できる。前記培地における前記本発明の増殖促進剤の濃度は、特に制限されず、例えば、前記凝固臍帯血の液性成分の濃度が、０．０１〜２０ｖ／ｖ％であり、好ましくは１〜１５ｖ／ｖ％であり、より好ましくは５〜１０ｖ／ｖ％である。前記培地１ｍＬあたりの前記間葉系幹細胞数は、例えば、１０００〜１０万個である。前記培地は、さらに、添加物を含んでもよく、前記添加物は、例えば、サイトカイン、抗生物質、塩類、ビタミン等があげられる。
【００４５】
前記培養条件は、特に制限されず、温度は、例えば、３７℃であり、時間は、例えば、２〜１０日である。また、前記培地は、例えば、１〜５日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましい。前記培地の取換え方法は、何ら制限されず、例えば、所定時間ごとに培地交換する方法、新たな培地を連続的または断続的に供給する方法等があげられる。後者の場合、例えば、前記新たな培地の供給にあわせて、古い培地の一部を連続的または断続的に廃棄することが好ましい。
【００４６】
＜間葉系幹細胞の製造方法＞
つぎに、本発明の製造方法は、前述のように、間葉系幹細胞の製造方法であって、本発明の間葉系幹細胞の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞の増殖促進に、本発明の増殖促進方法を使用することが特徴であり、その他の条件および構成は何ら制限されない。本発明の製造方法は、特に示さない限り、本発明の増殖促進方法と同様に行える。
【００４８】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
本例では、前記血液凝固剤としてガラスビーズを使用し、前記凝固臍帯血の血清を調製して、前記間葉系幹細胞の増殖への影響を確認した。
【００５０】
（１）血清の調製
ガラスビーズ（粒径４ｍｍ、ブライト標識工業社製）２個を含む５×１０ｃｍの大きさのＰＶＣ製バッグに、抗凝固剤を含むヒト臍帯血２０ｍＬを入れた（ｎ＝８）。前記バッグを、２０℃で３０分間インキュベートして凝固処理を行った後、遠心分離（２２８３４ｍ／ｓ２、４℃、１０分間）して、上清を採取した。この上清を、５６℃で３０分間加熱処理した後、孔径０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）を用いてろ過し、前記血清を得た。これを前記凝固臍帯血の血清として使用した。
【００５１】
（２）間葉系幹細胞の培養
α−ＭＥＭ培地（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンおよび０．０２ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン含有、Ｇｉｂｃｏ社製）に、前記凝固臍帯血の血清を１０ｖ／ｖ％となるように添加し、前記血清の添加培地を調製した。ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を前記血清の添加培地に懸濁し、１ウェルあたり３×１０３細胞となるように播種し、３７℃で７日間培養した。コントロールとして、前記凝固臍帯血の血清に代えて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０ｖ／ｖ％となるように添加したコントロール培地を調製し、同様にして前記ヒト間葉系幹細胞を培養した。
【００５２】
（３）細胞数の測定
培養後、各血清添加培地毎に細胞を回収し、細胞数をそれぞれカウントした。細胞数のカウントには、コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を使用した。下記式に各細胞数を代入し、前記コントロール培地での細胞数に対する、前記凝固臍帯血の血清の添加培地での細胞数の増幅率を算出した。
増幅率＝Ａ／Ｂ
Ａ：前記凝固臍帯血の血清の添加培地を用いた細胞数
Ｂ：前記コントロール培地を用いた細胞数
【００５３】
［比較例１］
本例では、臍帯血に代えて末梢血を使用し、前記ＰＶＣ製バッグに代えて遠沈管（容量５０ｍＬ）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、血清を調製し、前記実施例１と同様にして、培養後の細胞数の増幅率を算出した（ｎ＝８）。前記遠沈管のインキュベートは、振盪装置（商品名：マルチシェーカーＭＭＳ−３００、東京理科器械社製）を使用して行った。
【００５４】
下記表１に、実施例１および比較例１の増幅率の結果を示す。下記表１において、「＋」は、前記ガラスビーズ処理したことを示す。下記表１に示すように、前記ガラスビーズで処理した臍帯血血漿から得た血清を使用した実施例１は、前記ガラスビーズで処理した末梢血血漿から得た血清を使用した比較例１よりも、優れた間葉系幹細胞の増幅が見られた。また、実施例１および比較例１の平均細胞数について、ｔ−検定を行った結果、有意差が認められた。この結果から、血液凝固剤で処理した臍帯血血漿から得た血清によれば、間葉系幹細胞の増殖が可能とわかった。また、多血小板血漿を血小板凝固処理して得られた血清についても、前記実施例１と同様の結果が得られた。
【００５５】
【表１】
【００５６】
［実施例２］
抗体アレイキットを用いて、前記実施例１と同様にして調製した前記凝固臍帯血の血清（ｎ＝２）および前記比較例１と同様にして調製した末梢血の血清（ｎ＝２）中のサイトカインを測定した。前記抗体アレイキットは、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｃ ｓｅｒｉｅｓ ２０００（Ｃａｔ ＃ＡＡＨ−ＣＹＴ−２０００、レイ・バイオテック社）のＲａｙ Ｈｕｍａｎ（登録商標） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ６（商品名、レイ・バイオテック社）、Ｒａｙ Ｈｕｍａｎ（登録商標） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ７（商品名、レイ・バイオテック社）、Ｒａｙ Ｈｕｍａｎ（登録商標） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ８（商品名、レイ・バイオテック社）を使用した。そして、ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ（商品名、富士フィルム社製）を用いて、前記キットのメンブレンにおいて、発色した各スポットの濃淡を数値化し、各サイトカインレベルの平均値（ｎ＝２）を算出した。前記サイトカインレベルの平均値を、ポジティブコントロール（ビオチン結合ＩｇＧ）の平均値（ｎ＝１８）により補正した。そして、下記式を用いて、各サイトカインについて、前記凝固臍帯血の血清と前記末梢血の血清とのサイトカイン比を算出した。前記サイトカインは、前記３種類の抗体アレイキットで解析できる１７４種類を測定対象とした。
サイトカイン比＝Ｃ／Ｄ
Ｃ＝前記凝固臍帯血の血清のサイトカインレベルの補正値
Ｄ＝前記末梢血の血清のサイトカインレベルの補正値
【００５７】
下記表２に、前記凝固臍帯血の血清において、前記末梢血の血清に対して２倍以上のサイトカイン比（Ｃ／Ｄ）を示した２０種類のサイトカインを示す。また、下記表３に、前記凝固臍帯血の血清において発現が認められ、且つ、前記末梢血の血清において発現が認められなかった１９種類のサイトカインを示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
［実施例３］
本例では、抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血から、前記血液凝固剤を使用せずに、前記凝固臍帯血の血清を調製して、前記間葉系幹細胞の増殖への影響を確認した。
【００６１】
（１）血清の調製
臍帯血は、臍帯表面の血管に針を刺し、前記針に連結されたチューブを介して、採血バック（ＰＶＣ製）に回収される。前記チューブには、抗凝固剤が添加されていないため、採血後、前記チューブ内に残存する臍帯血は、血液本来の凝固系によって凝固する。そこで、前記チューブ内の残存ヒト臍帯血を採取し、血清の調製に使用した。具体的には、臍帯血を採取後、その内部に臍帯血を有する前記チューブを、５〜１０℃で２４時間保存した。前記チューブから、凝固臍帯血６ｍＬを、抗凝固剤を含まない遠沈管（１５ｍＬ）に回収した。そして、前記ヒト臍帯血について、前記実施例１の（１）と同様にして、遠心分離、加熱処理、ろ過を行い、前記血清（２ロット）を得た。この前記凝固臍帯血の血清を、実施例の血清として使用した。前記血清のフィブリノゲン量を、全自動血液凝固測定装置（ＣＡ−５３０、シスメックス社製）で測定した結果、測定限界値未満であった。また、前記血清の血小板数を、多項目自動血球分析装置（ＸＴ−１８００ｉ、シスメックス社製）で測定した結果、各ロットの測定値（×１０４／μＬ）は、それぞれ１．９および１．５であった。
【００６２】
他方、以下の方法により、凝固末梢血の血清を、比較例２の血清として調製した。まず、ヒト末梢血６ｍＬを、抗凝固剤を含まない遠沈管（１５ｍＬ）に採取した。前記遠沈管を室温（約２５℃）に６時間放置した後、前記実施例１の（１）と同様にして、遠心分離、加熱処理、ろ過を行い、前記血清（２ロット）を得た。前記血清のフィブリノゲン量は、測定限界値未満であった。また、前記血清の血小板数を前記多項目自動血球分析装置で測定したところ、各ロットの測定値（×１０４／μＬ）は、それぞれ１．３および０．９であった。以上の結果から、前記臍帯血および前記末梢血が同程度に凝固したことを、確認した。
【００６３】
（２）間葉系幹細胞の培養
血清として、前記凝固臍帯血の血清（２ロット）および前記凝固末梢血の血清（２ロット）を使用し、１ウェルあたりの播種細胞数を５×１０３細胞とし、培養日数を６日間とした以外は、前記実施例１の（２）と同様にして、ヒト間葉系幹細胞を培養した。
【００６４】
（３）細胞数の測定
培養後、各血清添加培地毎に細胞を回収し、細胞数をそれぞれカウントし、細胞数の平均値を算出した。前記血清の各ロットについて、測定数（ｎ）は３とした。細胞数のカウントには、コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を使用した。そして、前記凝固末梢血の血清の添加培地を用いた平均細胞数（比較例２）と、前記凝固臍帯血の血清の添加培地を用いた平均細胞数（実施例３）を算出した。
【００６５】
その結果、前記実施例３の平均細胞数は、１２．２８７８３×１０４個であり、前記比較例２の平均細胞数は、９．５８１８３３×１０４個であった。前記比較例２の平均細胞数に対して、前記実施例３の平均細胞数は、約１．３倍であった。この結果から、凝固臍帯血の血清によれば、例えば、凝固末梢血の血清と比較して、ヒト間葉系幹細胞を効率良く増殖できることがわかった。また、血液凝固剤による凝固臍帯血に限らず、血液本来の凝固系により凝固させた臍帯血であっても、その血清により、間葉系幹細胞を増殖できることがわかった。このことから、血液凝固のメカニズムに影響されることなく、凝固臍帯血の血清であれば、間葉系幹細胞を増殖できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
このように、本発明によれば、例えば、前述のように、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、前記凝固臍帯血の液性成分を用いることで、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞を増殖できる。このように、本発明によれば、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞等の間葉系細胞への分化能を持つ多能性幹細胞であり、骨髄液および脂肪組織等に存在する。この多能性から、前記間葉系幹細胞を、骨、血管、心筋に再構築し、再生医療に利用することが試みられている。組織の再構築には、多数の前記間葉系幹細胞を要するが、前記骨髄液等の生体試料から得られる前記間葉系幹細胞はわずかである。このため、前記間葉系幹細胞の増殖方法の開発が期待されている。前記増殖方法として、例えば、抗菌ペプチドを含む培地を用いる方法（特許文献１）、ウイルスベクターを用いて転写因子遺伝子を導入する方法（特許文献２）等が報告されている。しかしながら、これらの方法は、細胞の増殖効率および安全性が十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３７４２６号公報
【特許文献２】特開２００９−１１２５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、間葉系幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた増殖促進方法および製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の増殖促進剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明の増殖促進方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、前記本発明の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明の製造方法は、間葉系幹細胞の製造方法であって、前記本発明の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、前述のように、例えば、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、凝固臍帯血の液性成分を用いることで、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞を増殖できる。このように、本発明によれば、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜増殖促進剤＞
本発明の増殖促進剤は、前述のように、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。
【００１０】
臍帯血は、胎盤および臍帯に含まれる血液である。前記臍帯血は、通常、病院において、娩出時および娩出後に、胎盤および臍帯に針を刺し、前記針からチューブを介して、採血バックに採取される。前記チューブおよび前記採血バックから、臍帯血を得られる。
【００１１】
本発明において、凝固していない臍帯血を「未処理臍帯血」または「非凝固臍帯血」という。前記未処理臍帯血は、特に制限されず、血小板を含んでいればよい。前記未処理臍帯血は、例えば、臍帯血そのものでもよいし、血小板を含む臍帯血液性成分でもよい。前記血小板を含む臍帯血液性成分は、例えば、前記血小板を含む血漿が好ましい。前記血小板を含む血漿は、例えば、いわゆる多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｒｉｃｈ−Ｐｌａｓｍａ）等があげられる。「血漿」は、一般に、血液から、血球（赤血球、白血球および血小板）を除いた液体画分を意味し、「血清」は、一般に、血液から、血球（赤血球、白血球および血小板）と数種の血液凝固因子とを除いた液体画分を意味し、前記血液凝固因子は、例えば、フィブリノゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）等である。本発明において、前記未処理臍帯血として血漿を使用する場合、血小板を含む血漿であればよい。
【００１２】
本発明において、前記未処理臍帯血または前記非凝固臍帯血に凝固処理を施したものを「凝固臍帯血」という。前記凝固臍帯血は、例えば、臍帯血そのものに凝固処理を施したものでもよいし、前記血小板を含む臍帯血液性成分に凝固処理を施したものでもよい。前記凝固処理の方法は、何ら制限されず、従来公知の方法があげられる。本発明において、「凝固」は、例えば、血小板の凝集の意味でもよく、「凝固処理」は、血小板の凝固処理でもよい。
【００１３】
臍帯血そのものを凝固処理する場合、例えば、以下のようにして、前記凝固臍帯血を得ることができる。
【００１４】
前記未処理臍帯血が、凝固していない臍帯血そのものである場合は、例えば、抗凝固剤を含む非凝固臍帯血と、抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血とがあげられる。前述のように、体内から臍帯血を採取する際、例えば、抗凝固剤を含む採血バックを使用することで、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血が得られる。前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血に対する凝固処理は、特に制限されない。前記凝固処理は、例えば、前記抗凝固剤に対する中和剤の存在下で行うことが好ましい。前記抗凝固剤は、例えば、クエン酸、へパリン等があげられる。前記中和剤は、特に制限されず、前記抗凝固剤の種類に応じて適宜設定でき、例えば、カルシウム、プロタミン等があげられる。前記抗凝固剤がクエン酸の場合、前記中和剤は、例えば、塩化カルシウム液等のカルシウム液が好ましく、前記抗凝固剤がヘパリンの場合、前記中和剤は、例えば、プロタミン等が好ましい。前記凝固処理は、例えば、物理的な処理でもよいし、化学的な処理でもよい。前記物理的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前記非凝固臍帯血を異物と接触させる方法があげられる。前記異物は、例えば、ビーズ等の後述する血液凝固剤、バック、遠沈管等の容器等があげられる。前記化学的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、例えば、血液凝固反応を促進する血液凝固剤を添加する方法があげられる。前記血液凝固剤は、例えば、血小板凝集を促進する物質があげられ、具体例としては、例えば、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、コラーゲン、トロンビン、ビタミンＫ等があげられる。
【００１５】
他方、前記抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血の場合、凝固処理は、例えば、物理的な処理があげられ、具体的には、前記非凝固臍帯血を前記異物と接触させる方法があげられる。前述のように、体内から臍帯血を採取する際、例えば、前記抗凝固剤を含まない採血チューブおよび採血バックを使用することで、体内からの臍帯血が、前記採血チューブおよび採血バックと接触し、血液凝固反応が起こる。このため、前記採血チューブおよび前記採血バック内の臍帯血を、そのまま凝固臍帯血として使用できる。
【００１６】
このように臍帯血そのものを凝固処理した場合、前記凝固臍帯血の液性成分は、例えば、前記凝固臍帯血に含まれた状態でもよいし、前記凝固臍帯血から回収された状態でもよい。後者の場合、例えば、前記凝固臍帯血から液体画分を回収することにより、前記凝固臍帯血の液性成分を得ることができる。前記液性成分は、例えば、血清でもよいし、血漿でもよい。
【００１７】
前記凝固臍帯血からの液性成分の回収方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、遠心分離処理、沈殿処理、膜分離処理、ろ過処理、吸着処理等があげられる。前記膜分離処理は、例えば、各種フィルターにより、血球成分等を除去し、前記液性成分を回収する方法があげられる。中でも、遠心分離処理が好ましい。前記遠心分離処理の条件は、特に制限されず、例えば、２２８３４ｍ／ｓ２、４℃、１０分間の条件が例示できる。また、前記液性成分として、前記凝固臍帯血から血清を得る場合、例えば、前記凝固臍帯血に加熱処理を施した後、前記回収処理を行うことが好ましい。
【００１８】
つぎに、凝固していない血小板を含む臍帯血液性成分（以下、「非凝固臍帯血の液性成分」ともいう）を凝固処理する場合、例えば、以下のようにして、前記凝固臍帯血を得ることができる。
【００１９】
前記非凝固臍帯血の液性成分は、例えば、前述と同様の方法によって、臍帯血から回収できる。前記臍帯血は、例えば、抗凝固剤を含む臍帯血があげられ、これから前記非凝固臍帯血の液性成分を回収できる。前記非凝固臍帯血の液性成分は、血小板を含んでいればよく、例えば、血小板を含む血漿があげられ、中でも、好ましくは多血小板血漿である。前記非凝固臍帯血の液性成分の凝固処理は、特に制限されず、前述した前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血そのものの凝固処理と同様に行うことができる。具体的には、例えば、前記抗凝固剤に対する中和剤の存在下で行うことが好ましい。前記凝固処理は、例えば、物理的な処理でもよいし、化学的な処理でもよい。前記物理的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前記非凝固臍帯血の液性成分を、前述した異物と接触させる方法があげられる。前記化学的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前述した血液凝固剤を添加する方法があげられる。
【００２０】
前記血小板を含む非凝固臍帯血の液性成分を凝固処理した場合、例えば、前記凝固処理した前記非凝固臍帯血の液性成分を、本発明の増殖促進剤として使用できる。前記非凝固臍帯血の液性成分が血漿の場合、例えば、前記凝固処理の後、さらに、凝固画分を除去し、液性成分として血清を回収し、これを、本発明の増殖促進剤として使用してもよい。前記凝固画分を除去する場合、例えば、前記凝固処理した前記非凝固臍帯血の液性成分に加熱処理を施した後、前記凝固画分の除去を行うことが好ましい。
【００２１】
前記臍帯血の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、および、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等があげられる。
【００２２】
（第１の形態）
一例として、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血から多血小板血漿を回収し、前記多血小板血漿に凝固処理を施し、前記凝固臍帯血の液性成分を回収する方法を説明する。本発明は、これには制限されない。
【００２３】
まず、前記非凝固臍帯血に、赤血球を分離するための赤血球沈降剤を添加する。前記赤血球沈降剤は、例えば、ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｒｃｈ）等があげられる。前記赤血球沈降剤の前記非凝固臍帯血への添加量は、特に制限されず、例えば、１〜５０ｍｇ／ｍＬが好ましい。前記赤血球沈降剤を添加した前記非凝固臍帯血の静置によって、前記非凝固臍帯血は、赤血球を含む画分と、造血幹細胞を含む上清画分とに分離される。前記分離の条件は、特に制限されず、例えば、温度１５〜２５℃である。前記非凝固臍帯血が、例えば、予め前記赤血球沈降剤を含む場合、前記赤血球沈降剤を添加しなくてもよい（以下、同様）。
【００２４】
つぎに、前記上清画分を、造血幹細胞を含む沈降画分と、血小板を含む液体画分とに分離する。前記液体画分は、例えば、血小板含有の液性成分を含む画分である。前記液体画分は、例えば、血漿を含む画分（血漿画分）であり、より好ましくは、多血小板血漿である。前記血小板を含む液体画分の分離条件は、特に制限されず、例えば、従来公知の多血小板血漿の回収方法に従って行える。前記回収方法は、例えば、遠心分離があげられ、前記遠心分離の条件は、特に制限されず、例えば、遠心加速度２９４０〜１１７６０ｍ／ｓ２（３００〜１２００×ｇ）、温度１〜２０℃、時間３〜６分である。
【００２５】
つぎに、前記血小板を含む液体画分に、前記血液凝固剤を接触させる。
【００２６】
前記血液凝固剤は、例えば、血液の凝固を促進するものであり、具体的には、例えば、血小板および血液凝固因子等の被活性化因子を活性化する。前記血液凝固剤は、特に制限されず、例えば、特許第３７８８４７９号等に記載されているものが使用できる。前記血液凝固剤は、例えば、前記臍帯血に不溶であり、固体であることが好ましい。前記血液凝固剤の形態は、例えば、粒状、顆粒状、塊状が好ましい。前記血液凝固剤の形状は、略球状、正球状等の球状が好ましい。前記血液凝固剤の大きさは、特に制限されず、前記形状が球状の場合、例えば、直径は、１〜１０ｍｍが好ましく、より好ましくは３〜５ｍｍである。前記血液凝固剤は、例えば、多孔質構造でもよい。前記多孔質構造の前記血液凝固剤は、単位体積あたりの表面積を大きく設計でき、効率良く血小板等の活性化を行える。
【００２７】
前記血液凝固剤の材質は、特に制限されず、例えば、その表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されていることが好ましい。前記二酸化ケイ素は、例えば、ガラス、シリカ、珪藻土、カオリン等があげられる。前記血液凝固剤は、好ましくは、ガラスビーズである。さらに、前記血液凝固剤は、その芯体が、例えば、磁性物質を含んでもよい。このように前記血液凝固剤が磁性物質を含む場合、例えば、磁界を作用させることにより、前記液体画分の攪拌および前記血液凝固剤の回収を、容易かつ迅速に行える。
【００２８】
この接触処理は、例えば、前記血液凝固剤を入れた遠心管等のチューブまたはバックに、前記液体画分を注入することで行える。
【００２９】
前記液体画分に対する前記血液凝固剤の割合は、特に制限されず、例えば、前記血液凝固剤の表面積が、前記液体画分１ｍＬに対して、０．１ｍｍ２〜２５ｍｍ２の範囲であることが好ましい。
【００３０】
前記接触処理の条件は、特に制限されず、例えば、温度は、４〜３７℃が好ましく、より好ましくは１５〜２５℃であり、時間は、１０〜９０分が好ましく、より好ましくは２０〜３０分である。前記接触処理は、例えば、振とう条件下で行うことが好ましい。
【００３１】
このように、前記液体画分に前記血液凝固剤を添加することによって、前記凝固臍帯血の液性成分が得られる。前記凝固臍帯血の液性成分は、そのまま、本発明の増殖促進剤として使用してもよいし、例えば、希釈、濃縮したものを、本発明の増殖促進剤として使用することもできる。
【００３２】
前記血液凝固剤を含む液体画分がフィブリノゲン等の血液凝固因子を含む場合、例えば、さらに、前記液体画分から前記血液凝固因子を除去して、前記凝固臍帯血の液性成分として使用することもできる。具体的には、前記血液凝固剤を含む液体画分が、例えば、前記血液凝固因子を含む血漿画分である場合、前記血液凝固因子を除去して、血清を回収し、これを前記凝固臍帯血の液性成分として使用することが好ましい。
【００３３】
前記血液凝固因子の除去は、例えば、前記血液凝固剤による接触処理の後に行うことが好ましい。前記血液凝固因子の除去方法は、特に制限されず、例えば、フィブリノゲン等の血液凝固因子を変性させ、不溶性画分として除去する方法があげられる。具体的には、例えば、フィブリノゲンの変性によりフィブリンを形成させて、不溶性画分として除去する方法があげられる。前記変性方法は、特に制限されず、例えば、熱変性があげられ、具体的には、例えば、前記血液凝固剤を含む液体画分に加熱処理を施す方法があげられる。前記加熱処理の条件は、特に制限されず、例えば、温度は、５０〜６０℃が好ましく、時間は、１０〜１２０分が好ましく、より好ましくは３０〜６０分である。前記不溶性画分の除去は、例えば、前記加熱処理後の前記血液凝固剤を含む液体画分を、静置、遠心またはフィルターろ過等することによって行える。そして、例えば、静置後の上清画分、遠心後の上清画分、または、フィルターろ過後のろ液を回収することで、前記凝固臍帯血の液性成分が得られる。前記静置、遠心またはフィルターろ過等の条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。また、前記血液凝固剤を含む液体画分からの前記血液凝固因子の除去方法は、この他に、例えば、前記血液凝固剤を含む液体画分に対する、塩化カルシウム、トロンビン等の凝固因子の添加等、血液凝固系の活性化機構を利用した方法があげられる。前記方法の具体的な条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。
【００３４】
以上のようにして調製した前記凝固臍帯血の液性成分は、例えば、そのまま、本発明の増殖促進剤として使用してもよいし、例えば、希釈、濃縮したものを、本発明の増殖促進剤として使用することもできる。
【００３５】
（第２の形態）
一例として、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血に凝固処理を施し、前記凝固臍帯血の液性成分を回収する方法を説明する。本発明は、これには制限されない。
【００３６】
まず、前記非凝固臍帯血に、前記血液凝固剤を接触させる。前記血液凝固剤は、例えば、前述の通りであり、同様にして使用できる。このように、前記非凝固臍帯血に前記血液凝固剤を添加することによって、凝固臍帯血を得ることができる。
【００３７】
つぎに、前記凝固臍帯血を、沈降画分と液体画分とに分離する。この液体画分を、本発明の凝固臍帯血の液性成分として使用することができる。前記分離方法は、特に制限されず、例えば、前記第１の形態と同様に、遠心分離処理が好ましい。また、分離の前に、前述と同様に、加熱処理等の変性処理を施してもよい。
【００３８】
＜増殖促進剤の製造方法＞
本発明の製造方法は、凝固臍帯血の液性成分を回収する工程を含むことを特徴とする。本発明において、前記凝固臍帯血および前記液性成分等は、前述の通りである。
【００３９】
本発明は、さらに、前記未処理臍帯血を凝固させる工程を含んでもよく、例えば、前記未処理臍帯血を血液凝固剤と接触させることで凝固させることができる。
【００４０】
＜増殖促進方法＞
本発明の増殖促進方法は、前述のように、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、本発明の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明において、増殖促進目的とする間葉系幹細胞の種類は、特に制限されず、例えば、骨髄間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞等があげられる。前記間葉系幹細胞の採取方法は、特に制限されず、従来公知の方法に基づいて行える。
【００４２】
前記間葉系幹細胞の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、および、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等があげられる。また、本発明の増殖促進剤における前記凝固臍帯血の液性成分と、増殖対象となる前記間葉系幹細胞とは、同一の個体由来であることが好ましい。
【００４３】
本発明において、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程は、前述のように、前記本発明の増殖促進剤を含む培地に前記間葉系幹細胞を播種することで行える。以下に、その具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。
【００４４】
前記培地は、前記本発明の増殖促進剤を含有すればよく、その他の構成や条件は、何ら制限されない。前記培地は、例えば、前記間葉系幹細胞の培養に使用可能な培地があげられ、具体的には、例えば、α−Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地（αＭＥＭ培地）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ培地（ＤＭＥＭ培地）等が使用できる。前記培地における前記本発明の増殖促進剤の濃度は、特に制限されず、例えば、前記凝固臍帯血の液性成分の濃度が、０．０１〜２０ｖ／ｖ％であり、好ましくは１〜１５ｖ／ｖ％であり、より好ましくは５〜１０ｖ／ｖ％である。前記培地１ｍＬあたりの前記間葉系幹細胞数は、例えば、１０００〜１０万個である。前記培地は、さらに、添加物を含んでもよく、前記添加物は、例えば、サイトカイン、抗生物質、塩類、ビタミン等があげられる。
【００４５】
前記培養条件は、特に制限されず、温度は、例えば、３７℃であり、時間は、例えば、２〜１０日である。また、前記培地は、例えば、１〜５日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましい。前記培地の取換え方法は、何ら制限されず、例えば、所定時間ごとに培地交換する方法、新たな培地を連続的または断続的に供給する方法等があげられる。後者の場合、例えば、前記新たな培地の供給にあわせて、古い培地の一部を連続的または断続的に廃棄することが好ましい。
【００４６】
＜間葉系幹細胞の製造方法＞
つぎに、本発明の製造方法は、前述のように、間葉系幹細胞の製造方法であって、本発明の間葉系幹細胞の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞の増殖促進に、本発明の増殖促進方法を使用することが特徴であり、その他の条件および構成は何ら制限されない。本発明の製造方法は、特に示さない限り、本発明の増殖促進方法と同様に行える。
【００４８】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
本例では、前記血液凝固剤としてガラスビーズを使用し、前記凝固臍帯血の血清を調製して、前記間葉系幹細胞の増殖への影響を確認した。
【００５０】
（１）血清の調製
ガラスビーズ（粒径４ｍｍ、ブライト標識工業社製）２個を含む５×１０ｃｍの大きさのＰＶＣ製バッグに、抗凝固剤を含むヒト臍帯血２０ｍＬを入れた（ｎ＝８）。前記バッグを、２０℃で３０分間インキュベートして凝固処理を行った後、遠心分離（２２８３４ｍ／ｓ２、４℃、１０分間）して、上清を採取した。この上清を、５６℃で３０分間加熱処理した後、孔径０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）を用いてろ過し、前記血清を得た。これを前記凝固臍帯血の血清として使用した。
【００５１】
（２）間葉系幹細胞の培養
α−ＭＥＭ培地（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンおよび０．０２ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン含有、Ｇｉｂｃｏ社製）に、前記凝固臍帯血の血清を１０ｖ／ｖ％となるように添加し、前記血清の添加培地を調製した。ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を前記血清の添加培地に懸濁し、１ウェルあたり３×１０３細胞となるように播種し、３７℃で７日間培養した。コントロールとして、前記凝固臍帯血の血清に代えて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０ｖ／ｖ％となるように添加したコントロール培地を調製し、同様にして前記ヒト間葉系幹細胞を培養した。
【００５２】
（３）細胞数の測定
培養後、各血清添加培地毎に細胞を回収し、細胞数をそれぞれカウントした。細胞数のカウントには、コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を使用した。下記式に各細胞数を代入し、前記コントロール培地での細胞数に対する、前記凝固臍帯血の血清の添加培地での細胞数の増幅率を算出した。
増幅率＝Ａ／Ｂ
Ａ：前記凝固臍帯血の血清の添加培地を用いた細胞数
Ｂ：前記コントロール培地を用いた細胞数
【００５３】
［比較例１］
本例では、臍帯血に代えて末梢血を使用し、前記ＰＶＣ製バッグに代えて遠沈管（容量５０ｍＬ）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、血清を調製し、前記実施例１と同様にして、培養後の細胞数の増幅率を算出した（ｎ＝８）。前記遠沈管のインキュベートは、振盪装置（商品名：マルチシェーカーＭＭＳ−３００、東京理科器械社製）を使用して行った。
【００５４】
下記表１に、実施例１および比較例１の増幅率の結果を示す。下記表１において、「＋」は、前記ガラスビーズ処理したことを示す。下記表１に示すように、前記ガラスビーズで処理した臍帯血血漿から得た血清を使用した実施例１は、前記ガラスビーズで処理した末梢血血漿から得た血清を使用した比較例１よりも、優れた間葉系幹細胞の増幅が見られた。また、実施例１および比較例１の平均細胞数について、ｔ−検定を行った結果、有意差が認められた。この結果から、血液凝固剤で処理した臍帯血血漿から得た血清によれば、間葉系幹細胞の増殖が可能とわかった。また、多血小板血漿を血小板凝固処理して得られた血清についても、前記実施例１と同様の結果が得られた。
【００５５】
【表１】
【００５６】
［実施例２］
抗体アレイキットを用いて、前記実施例１と同様にして調製した前記凝固臍帯血の血清（ｎ＝２）および前記比較例１と同様にして調製した末梢血の血清（ｎ＝２）中のサイトカインを測定した。前記抗体アレイキットは、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｃ ｓｅｒｉｅｓ ２０００（Ｃａｔ ＃ＡＡＨ−ＣＹＴ−２０００、レイ・バイオテック社）のＲａｙ Ｈｕｍａｎ（登録商標） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ６（商品名、レイ・バイオテック社）、Ｒａｙ Ｈｕｍａｎ（登録商標） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ７（商品名、レイ・バイオテック社）、Ｒａｙ Ｈｕｍａｎ（登録商標） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ８（商品名、レイ・バイオテック社）を使用した。そして、ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ（商品名、富士フィルム社製）を用いて、前記キットのメンブレンにおいて、発色した各スポットの濃淡を数値化し、各サイトカインレベルの平均値（ｎ＝２）を算出した。前記サイトカインレベルの平均値を、ポジティブコントロール（ビオチン結合ＩｇＧ）の平均値（ｎ＝１８）により補正した。そして、下記式を用いて、各サイトカインについて、前記凝固臍帯血の血清と前記末梢血の血清とのサイトカイン比を算出した。前記サイトカインは、前記３種類の抗体アレイキットで解析できる１７４種類を測定対象とした。
サイトカイン比＝Ｃ／Ｄ
Ｃ＝前記凝固臍帯血の血清のサイトカインレベルの補正値
Ｄ＝前記末梢血の血清のサイトカインレベルの補正値
【００５７】
下記表２に、前記凝固臍帯血の血清において、前記末梢血の血清に対して２倍以上のサイトカイン比（Ｃ／Ｄ）を示した２０種類のサイトカインを示す。また、下記表３に、前記凝固臍帯血の血清において発現が認められ、且つ、前記末梢血の血清において発現が認められなかった１９種類のサイトカインを示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
［実施例３］
本例では、抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血から、前記血液凝固剤を使用せずに、前記凝固臍帯血の血清を調製して、前記間葉系幹細胞の増殖への影響を確認した。
【００６１】
（１）血清の調製
臍帯血は、臍帯表面の血管に針を刺し、前記針に連結されたチューブを介して、採血バック（ＰＶＣ製）に回収される。前記チューブには、抗凝固剤が添加されていないため、採血後、前記チューブ内に残存する臍帯血は、血液本来の凝固系によって凝固する。そこで、前記チューブ内の残存ヒト臍帯血を採取し、血清の調製に使用した。具体的には、臍帯血を採取後、その内部に臍帯血を有する前記チューブを、５〜１０℃で２４時間保存した。前記チューブから、凝固臍帯血６ｍＬを、抗凝固剤を含まない遠沈管（１５ｍＬ）に回収した。そして、前記ヒト臍帯血について、前記実施例１の（１）と同様にして、遠心分離、加熱処理、ろ過を行い、前記血清（２ロット）を得た。この前記凝固臍帯血の血清を、実施例の血清として使用した。前記血清のフィブリノゲン量を、全自動血液凝固測定装置（ＣＡ−５３０、シスメックス社製）で測定した結果、測定限界値未満であった。また、前記血清の血小板数を、多項目自動血球分析装置（ＸＴ−１８００ｉ、シスメックス社製）で測定した結果、各ロットの測定値（×１０４／μＬ）は、それぞれ１．９および１．５であった。
【００６２】
他方、以下の方法により、凝固末梢血の血清を、比較例２の血清として調製した。まず、ヒト末梢血６ｍＬを、抗凝固剤を含まない遠沈管（１５ｍＬ）に採取した。前記遠沈管を室温（約２５℃）に６時間放置した後、前記実施例１の（１）と同様にして、遠心分離、加熱処理、ろ過を行い、前記血清（２ロット）を得た。前記血清のフィブリノゲン量は、測定限界値未満であった。また、前記血清の血小板数を前記多項目自動血球分析装置で測定したところ、各ロットの測定値（×１０４／μＬ）は、それぞれ１．３および０．９であった。以上の結果から、前記臍帯血および前記末梢血が同程度に凝固したことを、確認した。
【００６３】
（２）間葉系幹細胞の培養
血清として、前記凝固臍帯血の血清（２ロット）および前記凝固末梢血の血清（２ロット）を使用し、１ウェルあたりの播種細胞数を５×１０３細胞とし、培養日数を６日間とした以外は、前記実施例１の（２）と同様にして、ヒト間葉系幹細胞を培養した。
【００６４】
（３）細胞数の測定
培養後、各血清添加培地毎に細胞を回収し、細胞数をそれぞれカウントし、細胞数の平均値を算出した。前記血清の各ロットについて、測定数（ｎ）は３とした。細胞数のカウントには、コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を使用した。そして、前記凝固末梢血の血清の添加培地を用いた平均細胞数（比較例２）と、前記凝固臍帯血の血清の添加培地を用いた平均細胞数（実施例３）を算出した。
【００６５】
その結果、前記実施例３の平均細胞数は、１２．２８７８３×１０４個であり、前記比較例２の平均細胞数は、９．５８１８３３×１０４個であった。前記比較例２の平均細胞数に対して、前記実施例３の平均細胞数は、約１．３倍であった。この結果から、凝固臍帯血の血清によれば、例えば、凝固末梢血の血清と比較して、ヒト間葉系幹細胞を効率良く増殖できることがわかった。また、血液凝固剤による凝固臍帯血に限らず、血液本来の凝固系により凝固させた臍帯血であっても、その血清により、間葉系幹細胞を増殖できることがわかった。このことから、血液凝固のメカニズムに影響されることなく、凝固臍帯血の血清であれば、間葉系幹細胞を増殖できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
このように、本発明によれば、例えば、前述のように、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、前記凝固臍帯血の液性成分を用いることで、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞を増殖できる。このように、本発明によれば、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、
凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする増殖促進剤。
【請求項２】
前記凝固臍帯血が、血液凝固剤と接触させた臍帯血である、請求項１記載の増殖促進剤。
【請求項３】
前記血液凝固剤が、血小板の活性化剤である、請求項２記載の増殖促進剤。
【請求項４】
前記血液凝固剤が、臍帯血の液性成分に不溶である、請求項２または３記載の増殖促進剤。
【請求項５】
前記血液凝固剤が、粒状体である、請求項２から４のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項６】
前記血液凝固剤の表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されている、請求項２から５のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項７】
前記血液凝固剤が、ガラスビーズである、請求項２から６のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項８】
前記血液凝固剤の表面積が、臍帯血１ｍＬに対して、０．１ｍｍ２〜２５ｍｍ２の範囲である、請求項２から７のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項９】
前記臍帯血が、血小板を含む臍帯血血漿である、請求項１から８のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項１０】
間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、
請求項１から９のいずれか一項に記載の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする増殖促進方法。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞および前記増殖促進剤における前記液性成分が、同一個体由来である、請求項１０記載の増殖促進方法。
【請求項１２】
前記個体が、哺乳類である、請求項１１記載の増殖促進方法。
【請求項１３】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項１２記載の増殖促進方法。
【請求項１４】
間葉系幹細胞の製造方法であって、
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
凝固臍帯血の液性成分を回収する工程を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の増殖促進剤の製造方法。
【請求項１６】
さらに、臍帯血を凝固させる工程を含む、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
臍帯血を血液凝固剤と接触させ、凝固させる、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１】
間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、
凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする増殖促進剤。
【請求項２】
前記凝固臍帯血が、血液凝固剤と接触させた臍帯血である、請求項１記載の増殖促進剤。
【請求項３】
前記血液凝固剤が、血小板の活性化剤である、請求項２記載の増殖促進剤。
【請求項４】
前記血液凝固剤が、臍帯血の液性成分に不溶である、請求項２または３記載の増殖促進剤。
【請求項５】
前記血液凝固剤が、粒状体である、請求項２から４のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項６】
前記血液凝固剤の表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されている、請求項２から５のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項７】
前記血液凝固剤が、ガラスビーズである、請求項２から６のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項８】
前記血液凝固剤の表面積が、臍帯血１ｍＬに対して、０．１ｍｍ２〜２５ｍｍ２の範囲である、請求項２から７のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項９】
前記臍帯血が、血小板を含む臍帯血血漿である、請求項１から８のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項１０】
間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、
請求項１から９のいずれか一項に記載の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする増殖促進方法。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞および前記増殖促進剤における前記液性成分が、同一個体由来である、請求項１０記載の増殖促進方法。
【請求項１２】
前記個体が、哺乳類である、請求項１１記載の増殖促進方法。
【請求項１３】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項１２記載の増殖促進方法。
【請求項１４】
間葉系幹細胞の製造方法であって、
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
凝固臍帯血の液性成分を回収する工程を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の増殖促進剤の製造方法。
【請求項１６】
さらに、臍帯血を凝固させる工程を含む、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
臍帯血を血液凝固剤と接触させ、凝固させる、請求項１６記載の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−１６０７９９（Ｐ２０１１−１６０７９９Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６４５９（Ｐ２０１１−６４５９）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（０００１５３０３０）株式会社ジェイ・エム・エス (452)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（０００１５３０３０）株式会社ジェイ・エム・エス (452)
【Ｆターム（参考）】
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