非アミノ有機酸の製造方法
炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウム、並びに一定範囲の濃度の１価カチオンを含む水性媒体中で、コリネ型細菌の菌体または該細菌の処理物を有機原料に反応させることにより、水性媒体の体積の増加を起こすことなく、ｐＨを一定の範囲に保った状態で、コハク酸、リンゴ酸又はフマル酸等の非アミノ有機酸を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌を用いた非アミノ有機酸の製造に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等の嫌気性細菌が用いられている（米国特許第５，１４２，８３４号公報、米国特許第５，５０４，００４号公報又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９９），ｖｏｌ．４９，ｐ２０７−２１６）。嫌気性細菌を用いた場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でなかった。
【０００３】
また、コリネ型細菌などの好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特開平１１−１１３５８８号公報、特開平１１−１９６８８８号公報）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、菌体当たりの生産速度の向上、または、製造プロセスの簡略化等について改善の余地があった。
【０００４】
さらに非アミノ有機酸を発酵生産する場合には、非アミノ有機酸の生成とともにｐＨが低下するため、中和によりｐＨを調整しながら反応させる必要があった。そこで、ｐＨの調整に炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが用いられてきたが、中和液の添加により反応液の体積が増加するという問題点があった。一方で、炭酸マグネシウムや水酸化マグネシウムは水に溶けにくい等の理由から、コリネ型細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産におけるｐＨ調整には用いられてこなかった。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、発酵法により、発酵液のｐＨを一定の範囲に調節しながら、非アミノ有機酸をより効率よく製造する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、水性媒体中で、該水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながらコリネ型細菌と有機原料とを反応させることにより、発酵中の水性媒体の体積の増加を防ぎ、かつ、該媒体のｐＨを一定の範囲に保った状態で非アミノ有機酸を製造できることを見出した。さらに、１価カチオンを水性媒体中に共存させることにより、有機原料の消費速度、有機酸の生産速度および、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
（２）１価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
（３）１価カチオンがアンモニウムイオンまたはナトリウムイオンである、（２）の方法。
（４）嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）有機原料がグルコース又はシュークロースである、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）非アミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（９）前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（１０）前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化し、さらにフマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかの方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プラスミドｐＫＭＢ１の構築手順と制限酵素地図を示す図。
【図２】プラスミドｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドｐＴＺ４の構築手順を示す図。
【図４】プラスミドｐＭＪＰＣ１の構築手順を示す図。
【図５】プラスミドｐＦＲＰＣ１．１の構築手順を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１０】
本発明の製造方法は、水性媒体中、コリネ型細菌の菌体または該細菌の処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、非アミノ有機酸の製造方法である。
【００１１】
本発明に使用されるコリネ型細菌（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、非アミノ有機酸の生産能を有すれば特に限定されないが、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。
【００１２】
上記微生物の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００１３】
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ，Ｗ．，Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｗ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖｏｌ．４１，ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムのＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムのＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
【００１４】
本発明の方法において用いられる上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
【００１５】
本発明の製造方法においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された変異株を用いることが好ましい。「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化する」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して菌体当たりのラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（Ｌ．Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，４２０２（１９６４））によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化された変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １４５（１９９４）６９−７３）等が挙げられる。
【００１６】
また、本発明の製造方法においては、フマル酸リダクターゼ（ＦＲＤ）および／またはピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）の活性が増強するように改変されたコリネ型細菌を用いることもできる。ここで、「増強」とは、非改変株と比較してこれらの酵素の菌体当たりの活性が増加している状態をいう。フマル酸リダクターゼについて、大腸菌のフマル酸リダクターゼはＴＣＡ回路の正回りで作用するコハク酸デヒドロゲナーゼの逆反応を担う酵素であるが、嫌気的条件下におけるフマル酸呼吸に関与しており、好気的条件下においては転写レベルでその遺伝子発現が抑制されていることが知られている（Ｊｏｎｅｓ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｕｎｓａｌｕｓ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８５，Ｖｏｌ．１６４，ｐ１１００−１１０９）。従って、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生育が悪くなることが考えられるため、本発明においては、フマル酸リダクターゼ活性は菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましい。
【００１７】
なお、ＰＣおよびＦＲＤの活性が増強されたことは、それぞれ後述するようなＮＡＤＨの減少またはＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６の減少を測定する方法により、これらの酵素活性を測定することによって確認することができる。フマル酸リダクターゼあるいはピルビン酸カルボキシラーゼの発現が増強されたコリネ型細菌は、フマル酸リダクターゼ（ＦＲＤ）遺伝子またはピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）遺伝子を、特開平１１−１９６８８８号公報に記載された方法と同様にして遺伝子組み換え技術を用い、コリネ型細菌中で高発現させることにより作製することができる。
【００１８】
ＰＣ活性を増強させるために用いるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、通常の方法によりＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。
【００１９】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これらの供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するための基本操作を、配列が既知である、コリネ型細菌由来のものを一例として述べれば次のとおりである。
【００２０】
ＰＣ遺伝子は、上記コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の染色体上に存在し（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４４（１９９８）９１５−９２７）、それらの配列が既知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）（配列番号１５）、ＰＣＲ法により、ＰＣ遺伝子を分離・取得することができる。
【００２１】
例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてコリネバクテリウム・グルタミカム由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、約３．７ｋｂからなるＰＣ遺伝子を増幅させることができる。このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの５’末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌に導入することができる。
【００２２】
また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、部分分解配列よりプローブまたはプライマーを合成し、通常用いられるハイブリダイゼーションの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとにプローブまたはプライマーを合成し、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法によりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
【００２３】
本明細書において、切断ＤＮＡ断片の大きさ及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φＸ１７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００２４】
上記ＰＣ遺伝子を含む本発明に用いるＤＮＡ断片は、コリネバクテリウム・グルタミカム染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。また、前記のようにコリネ型細菌染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号１５の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。例えば、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または配列番号１５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡであって、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２５】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（括弧内に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。得られた遺伝子は、後記実施例３作製のベクターのＴＺ４プロモーター下流に挿入することができる。挿入したプラスミドを実施例４（Ｃ）の方法に従って好気性コリネ型細菌を形質転換し、非アミノ有機酸の製造に使用することができる。
【００２６】
ヒト［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０２，１００９−１０１４，（１９９４）］
マウス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，１７６６−１７７９，（１９９３）］
ラット［ＧＥＮＥ，１６５，３３１−３３２，（１９９５）］
酵母；
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，３０７−３１５，（１９９１）］
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）
［ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．；Ｄ７８１７０］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
［ＧＥＮＥ，１９１，４７−５０，（１９９７）］
リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）
［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８，５９６０−５９７０，（１９９６）］
【００２７】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号１６）の確認は、該形質転換体から粗酵素液を抽出し、Ｍａｇａｓａｎｉｋの方法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８，５５−６２，（１９８４）］により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。
【００２８】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、実施例３に示すようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
【００２９】
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
【００３０】
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００３１】
ＰＣ遺伝子を好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、本発明で用いるＰＣ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、ＰＣ活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でＰＣ遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）等によって行うことができる。
【００３２】
本発明において使用するＦＲＤ活性が増強された細菌は、ＦＲＤ遺伝子を細菌に導入することによって得ることができる。用いることのできるＦＲＤ遺伝子はフマル酸リダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号１９に示す塩基配列を有する大腸菌由来の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子はＦＲＤを構成する４つのサブユニット（ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ及びｆｒｄＤ；配列番号２０〜２３）をコードする遺伝子（配列番号１９の４４０〜２２４５，２２４１〜２９７５，２９８６〜３３８１，及び３３９２〜３７５１）をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を細菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、このようなＦＲＤ遺伝子ホモログの中でも、ＦＲＤのＢサブユニット（ｆｒｄＢ）（配列番号２１）の１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンであるようなタンパク質をコードするものが好ましい。配列番号１９に示す塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログは、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法によって得ることができる。また、必要に応じて、ｆｒｄＢの１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンになるような突然変異を、公知の方法により導入することもできる。
【００３３】
また、大腸菌以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＦＲＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のＦＲＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基いてＦＲＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００３４】
得られたＦＲＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＦＲＤの発現増強が可能な組換えプラスミドを得ることができる。コリネ型細菌にＦＲＤ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されず、上述のｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１等を用いることができる。なお、ＦＲＤ活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でＦＲＤ遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。
【００３５】
前述したように、本発明においてフマル酸リダクターゼ活性は、菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましいため、適当なコピー数のプラスミドを選択するか、適当な発現強度のプロモーターを選択することにより、ＦＲＤ遺伝子の発現量を調節することが好ましい。ここで、ＦＲＤ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いるＦＲＤ遺伝子自身のプロモーターであってもよい。
【００３６】
本発明において、ＰＣ及びＦＲＤ活性が増強した細菌を用いる場合は、これらの遺伝子を個別に細菌に導入してもよいし、両遺伝子を含むベクターを用いて同時に導入してもよい。本発明においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化し、かつＰＣ及び／またはＦＲＤ活性が増強するように改変された細菌を用いることが特に好ましい。このような細菌は、例えば、ＬＤＨ遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を作製し、得られた細菌をＰＣ遺伝子及びＦＲＤ遺伝子を含む組換えベクターでそれぞれ形質転換することにより得ることができる。なお、これらの遺伝子を用いた改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
【００３７】
本発明の製造方法に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって非アミノ有機酸を製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む水溶液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
【００３８】
本発明においては菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体抽出物、例えば、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の製造方法において用いる有機原料は、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、シュークロース、フルクトース又はグリセロールが好ましく、特にグルコース又はシュークロースが好ましい。また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの有機原料は、単独でも組み合わせても使用できる。
【００４０】
上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
【００４１】
本発明の製造方法に用いる水性媒体としては特に限定されず、例えば、水、緩衝液、液体培地等が挙げられるが、既述したような液体培地が最も好ましい。また、本発明の水性媒体には、窒素源や無機塩などが含まれることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加するとよい。また、反応時の発泡を抑えるために、水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００４２】
本発明の製造方法の一形態においては、水性媒体を、炭酸マグネシウムを添加することによって中和しながら反応させる。炭酸マグネシウムは、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物として存在しており、比較的水に溶けにくい。水性媒体へ炭酸マグネシウムの添加は、粉末等の固体あるいは水等に溶かした溶液を加えることにより行うことができるが、溶液の添加による体積の増加を防ぐことが可能であるため、粉末等の固体のまま添加することが好ましい。粉末で添加した炭酸マグネシウムは、溶解度が低いため、過剰に添加しても、アルカリ性に傾きすぎることなく一定のｐＨを保つことが可能である。例えば、コリネ型細菌の菌体懸濁液に、炭酸マグネシウムを過剰に添加した場合の初期ｐＨは、ｐＨ８〜８．５程度であり、その後反応が進むにつれてｐＨは低下するが、反応後のｐＨは、ｐＨ６〜７程度に保持されている。これは、反応中、過剰に添加されて溶け残った炭酸マグネシウムが次第に溶解し、ｐＨが急激に下がることを防ぐためと考えられる。
【００４３】
本発明の製造方法の他の形態においては、水酸化マグネシウムを添加することによって、水性媒体を中和しながら反応させてもよい。水酸化マグネシウムの水性媒体への添加は、例えば粉体等の固体あるいは水等に溶かした溶液の状態で行うことができる。この場合、目的とする有機酸の生産量を増加させるため、炭酸ガスを供給しつつ反応を行うことが好ましい。
【００４４】
本発明の製造方法の他の形態においては、炭酸マグネシウム及び水酸化マグネシウムを添加することにより水性媒体を中和しながら反応させてもよい。炭酸マグネシウム及び水酸化マグネシウムの添加は、同時に行って中和してもよいし、炭酸マグネシウムを添加した後に水酸化マグネシウムを添加して中和してもよいし、また、水酸化マグネシウムを添加した後に炭酸マグネシウムを添加して中和してもよい。
【００４５】
本反応において、中和するとは、反応により生じた非アミノ有機酸を炭酸マグネシウム及び／または水酸化マグネシウムと反応させることにより、水性媒体のｐＨを一定の範囲、例えばｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５に保つことをいう。本発明においては、炭酸マグネシウム及び／または水酸化マグネシウムを最初に添加してもよいし、反応中も必要に応じてさらに加えてもよい。また、炭酸マグネシウム及び／または水酸化マグネシウムに加えて、他のｐＨ調節物質、例えばアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などを添加してもよい。
【００４６】
水性媒体には、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、好気的条件または嫌気的条件で反応させることが好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤として用いる炭酸マグネシウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加するとよい。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させるとよい。
【００４７】
また、本発明で用いる水性媒体に１価カチオンを添加することによりコハク酸等の有機酸の生成速度あるいは収率を上昇させることができる。１価カチオンとしては、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等が挙げられるが、アンモニウムイオンが好ましく用いられる。
１価カチオン添加の際は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム等、１価カチオンの水酸化物として添加することができるが、１価カチオンの塩として添加することが好ましく、アンモニウムイオンの塩としては、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等が、ナトリウムイオンの塩としては、炭酸水素ナトリウム等が、カリウムイオンの塩としては、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
１価カチオンの塩を添加する場合は、通常、粉末状態で添加するか、その懸濁液または水溶液として添加することが好ましい。また、水酸化アンモニウムを添加する場合は、アンモニア水として添加してもよいし、気体として反応液中に通気することにより添加することもできる。
１価カチオンの添加濃度としては、アンモニウムイオンとしては、０．００１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍであり、ナトリウムイオンとしては、０．００１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍであり、カリウムイオンとしては、０．００１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍである。
１価カチオンの添加時期としては、反応開始時に添加してもよいし、反応途中で連続的、逐次的あるいは間欠的に添加してもよい。連続的に反応液を使用する場合は、反応液に既に添加されている１価カチオンの量を考慮し、１価カチオンの反応液中の濃度が前記した好ましい濃度になるように添加することが好ましい。
【００４８】
本反応に用いる微生物の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００４９】
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、有機酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない、又は、通気を絞り酸素供給量を制限した嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここでいう嫌気的雰囲気下とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する、攪拌を少なくする等の方法を用いることができる。
【００５０】
有機酸の生成反応は、通常、培養液中のグルコース等の有機原料が消費された時点で反応終了とすることができる。このとき、反応液中には、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸等の有機酸が生成している。このうち、コハク酸が最も蓄積度が高く生産物としては好ましい。
【００５１】
上記の反応により、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸等の有機酸を得ることができる。この有機酸含有組成物自体も本発明の範囲内である。有機酸含有組成物としてはコハク酸の蓄積濃度が高いものが特に好ましい。また、反応液又は培養液中に蓄積した有機酸は常法に従って、分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。
【００５２】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法により非アミノ有機酸を製造した後に、得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非アミノ有機酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造される非アミノ有機酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。また、本発明の製造法により得られる非アミノ有機酸または該非アミノ有機酸を含有する組成物は、食品添加物や医薬品、化粧品として用いることができる。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１
【００５４】
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００５５】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００５６】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００５７】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００５８】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００５９】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
【００６０】
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
【００６１】
一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
【００６２】
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６３】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００６４】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した。
【００６５】
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００６６】
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
実施例２
【００６７】
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン１００μｇ、イーストエキストラクト１ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００６８】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００７０】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【００７１】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【００７２】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００７３】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
【００７４】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【００７５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）は、常法（Ｗｏｌｆ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，１５６（３）１１６５−１１７０、Ｋｕｒｕｓｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０，５４（２）４４３−７）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７６】
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
【００７７】
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【００７８】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）］で洗浄した。
【００７９】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００８０】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［Ｌ．Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，４２０２（１９６４）］。反応は、５０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
実施例３
【００８１】
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８２】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
【００８３】
増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８４】
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
【００８５】
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
【００８６】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
【００８７】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの組み立て
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２−９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。
【００８８】
ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８９】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
実施例４
【００９０】
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。
【００９１】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
【００９２】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００９３】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
【００９４】
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であること断定した。
【００９５】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した＜実施例３＞にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
【００９６】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００９７】
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【００９８】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／１０ｍＬビオチン、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭアデノシン３リン酸ナトリウム、０．３２ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は０．２Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。なお親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
実施例５
【００９９】
＜大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング＞
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【０１００】
（Ｂ）大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
【０１０１】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【０１０２】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。
【０１０３】
ｐＦＲＤ６．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１９、２０〜２３に記載する。
実施例６
【０１０４】
＜ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
実施例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号２４および配列番号２５）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した
【０１０５】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミドの構築
実施例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１０６】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化により５０５、２１３２、２６７５、３７７５、４１９３ｂｐの断片を生じたことから、図５に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＦＲＰＣ１．１と命名した。
【０１０７】
（Ｂ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、実施例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【０１０８】
（Ｃ）ＦＲＤ酵素活性測定
上記（Ｂ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は３３ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭコハク酸Ｎａ、２ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に２μｍｏｌのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は０．０２Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。なお親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は０．０１Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
実施例７
【０１０９】
＜炭酸マグネシウム中和による反応＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例６で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
【０１１０】
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２５ｍＬとあらかじめ滅菌した２４％グルコース溶液２５ｍＬを１００ｍＬの三角フラスコに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：４．２１５ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３０℃に保温し、毎分１２０回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後２０時間における糖消費速度は２．０８ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．６１ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７７％であった。なお、糖消費速度及びコハク酸生産速度は、反応開始時から反応終了時までの平均値で表している。
実施例８
【０１１１】
＜水酸化マグネシウム中和による反応（１）＞
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記実施例７と同様の方法により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２００になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した３０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れ、３５℃に保温した。ｐＨが６．８に保たれるように４Ｍ水酸化マグネシウム水溶液を断続的に添加し、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後４６時間における平均糖消費速度は３．２２ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．３８ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７２％であった。
【０１１２】
上記と同様に反応用懸濁液を調製し、３５℃に保温した。ｐＨが６．８に保たれるように４Ｍ水酸化マグネシウム水溶液を断続的に添加し、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後５０時間における平均糖消費速度は２．６０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は０．９０ｇ／Ｌ／ｈ、収率は５５％であった。
実施例９
【０１１３】
＜水酸化マグネシウム中和による反応（２）（ジャーファーメンター）＞
（Ａ）菌体の調製
実施例４で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を実施例７と同様にして種培養を行った。グルコース：１００ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：１４．３ｍＬ、硫酸アンモニウム：１．０ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３：日本油脂社製）：０．０５ｍＬを１Ｌ中に含む培地を１５０Ｌ作製し、ｐＨを１Ｎ ＫＯＨで６．５に調整した後、３００Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。冷却後、前述の種培養液を４５０ｍＬ接種して３０℃に保温した。通気は毎分１１３Ｌ、圧力は５０ｋＰａ、攪拌は毎分２８０回転で、ｐＨをアンモニアガスにて７．６に調整しながら２０時間前培養を行った。
【０１１４】
グルコース：１００ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇを１Ｌ中に含む糖溶液２６０Ｌ分に相当する量の各成分を計量し、５０Ｌに溶解して、１２０℃、２０分加熱滅菌した。また、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：２．９ｍＬ、硫酸アンモニウム：１．０ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３）：０．０５ｍＬを１Ｌ中に含む培地２６０Ｌ分に相当する量の各成分を計量し、１４０Ｌに溶解して、ｐＨを１Ｎ ＫＯＨで６．５に調整した後、１２０℃、２０分加熱滅菌した。滅菌した糖溶液と培地を５００Ｌのジャーファーメンターに入れ、冷却後、前述の前培養液を７０Ｌ加えて全量を２６０Ｌとした後、３０℃に保温した。通気は毎分１１３Ｌ、圧力は５０ｋＰａ、攪拌は毎分１４０回転で、ｐＨをアンモニアガスにて７．６に調整しながら２４時間培養を行い、コハク酸生産能を有する菌体を得た。ＭＦ膜（旭化成社製）により、約４倍に菌体液を濃縮し、乾燥菌体重が約６０ｇ／Ｌの菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は４℃にて保存した。
【０１１５】
（Ｂ）コハク酸の生産
菌体懸濁液を遠心分離してさらに濃縮し、乾燥菌体重が約１２０ｇ／Ｌとなるように遠心上清を用いて調製した。グルコース：１５０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇを蒸留水に溶解して３００ｍＬとし、１２０℃、２０分加熱滅菌した。また、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：２．９ｍＬ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３）：０．０５ｍＬを約３００ｍＬの蒸留水に溶解し、ｐＨを５Ｎの水酸化カリウム溶液で６．５に調整した後、蒸留水で４５０ｍＬにメスアップし、１２０℃、２０分加熱滅菌した。上記のグルコース溶液１２０ｍＬと培地１８０ｍＬを混合して１Ｌのジャーファーメンターに入れ、前述の乾燥菌体重が約１２０ｇ／Ｌの懸濁液を１００ｍＬ接種して３０℃に保温した。液上面より二酸化炭素を毎分２０ｍＬ通気し、攪拌は毎分４００回転で、ｐＨを２．５Ｍの水酸化マグネシウム溶液、５Ｍの水酸化ナトリウム溶液、５Ｍの水酸化カリウム溶液、または５Ｍのアンモニア水で、それぞれ７．３に調整しながら反応を行った。反応開始後１４時間目のコハク酸蓄積、コハク酸生産速度及び収率は以下の表のとおりであった。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水を用いた場合と比較して、水酸化マグネシウムを用いて中和しながら反応を行った場合、コハク酸蓄積、コハク酸生成速度及び収率が顕著に高いことが確かめられた。
実施例１０
【０１１８】
＜炭酸水素アンモニウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応＞
上記実施例７と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を０．０５、０．１、０．２、０．４、０．８ｍｏｌ／Ｌとなるように炭酸水素アンモニウムを添加して反応を行った。反応開始後２０時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表２の通りになった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニウムを適量添加することにより、糖消費速度及びコハク酸生産速度が大幅に上昇することが明らかになった。
【０１１９】
【表２】
実施例１１
【０１２０】
＜炭酸水素ナトリウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応（フラスコ）＞
上記実施例７と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を０．０５、０．１、０．２、０．４、０．８ｍｏｌ／Ｌとなるように炭酸水素ナトリウムを添加して反応を行った。反応開始後２０時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表３の通りになった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素ナトリウムを適量添加することにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が大幅に上昇することが明らかになった。
【０１２１】
【表３】
実施例１２
【０１２２】
＜炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記７と同様の方法により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２００になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した３０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：５８．２８４ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３５℃に保温し、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約１６時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は９．８０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は８．７８ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９６％であった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応によって、糖消費速度、コハク酸生産速度、収率が顕著に上昇することがジャー培養において確認された。
実施例１３
【０１２３】
＜炭酸水素アンモニウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
上記実施例１２と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように炭酸水素アンモニウムを添加して同様に反応を行った。反応開始後約１０時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は１５．２ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１２．６ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９２％であった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニウムを適量添加することにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が顕著に上昇することがジャー培養において確認された。
実施例１４
【０１２４】
＜シュークロースを有機原料とした炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記７と同様の方法により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した２０％シュークロース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：３８．８ｇ、炭酸水素アンモニウム３．２ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３５℃に保温し、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約２０時間でシュークロースがほぼ消費されていた。糖消費速度は５ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は４．６ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９１％であった。
【０１２５】
［比較例１］
＜炭酸アンモニウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例６（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
【０１２６】
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２００になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した３０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約１４時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は１１ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は５．３ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７２％であった。
【０１２７】
［比較例２］
＜炭酸ナトリウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
上記比較例１と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸ナトリウムを用いて７．６に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約１２時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は１３ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は７．２ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９５％であった。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明の方法によれば、発酵反応液の体積の増加をほとんど起こすことなく、水性媒体のｐＨを一定の範囲に保持したまま、非アミノ有機酸を製造することができる。さらに、水性媒体に１価カチオンを添加することにより非アミノ有機酸の生成速度あるいは収率を大幅に上げることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌を用いた非アミノ有機酸の製造に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等の嫌気性細菌が用いられている（米国特許第５，１４２，８３４号公報、米国特許第５，５０４，００４号公報又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９９），ｖｏｌ．４９，ｐ２０７−２１６）。嫌気性細菌を用いた場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でなかった。
【０００３】
また、コリネ型細菌などの好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特開平１１−１１３５８８号公報、特開平１１−１９６８８８号公報）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、菌体当たりの生産速度の向上、または、製造プロセスの簡略化等について改善の余地があった。
【０００４】
さらに非アミノ有機酸を発酵生産する場合には、非アミノ有機酸の生成とともにｐＨが低下するため、中和によりｐＨを調整しながら反応させる必要があった。そこで、ｐＨの調整に炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが用いられてきたが、中和液の添加により反応液の体積が増加するという問題点があった。一方で、炭酸マグネシウムや水酸化マグネシウムは水に溶けにくい等の理由から、コリネ型細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産におけるｐＨ調整には用いられてこなかった。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、発酵法により、発酵液のｐＨを一定の範囲に調節しながら、非アミノ有機酸をより効率よく製造する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、水性媒体中で、該水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながらコリネ型細菌と有機原料とを反応させることにより、発酵中の水性媒体の体積の増加を防ぎ、かつ、該媒体のｐＨを一定の範囲に保った状態で非アミノ有機酸を製造できることを見出した。さらに、１価カチオンを水性媒体中に共存させることにより、有機原料の消費速度、有機酸の生産速度および、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
（２）１価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
（３）１価カチオンがアンモニウムイオンまたはナトリウムイオンである、（２）の方法。
（４）嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）有機原料がグルコース又はシュークロースである、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）非アミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（９）前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（１０）前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化し、さらにフマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかの方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プラスミドｐＫＭＢ１の構築手順と制限酵素地図を示す図。
【図２】プラスミドｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドｐＴＺ４の構築手順を示す図。
【図４】プラスミドｐＭＪＰＣ１の構築手順を示す図。
【図５】プラスミドｐＦＲＰＣ１．１の構築手順を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１０】
本発明の製造方法は、水性媒体中、コリネ型細菌の菌体または該細菌の処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、非アミノ有機酸の製造方法である。
【００１１】
本発明に使用されるコリネ型細菌（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、非アミノ有機酸の生産能を有すれば特に限定されないが、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。
【００１２】
上記微生物の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００１３】
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ，Ｗ．，Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｗ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖｏｌ．４１，ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムのＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムのＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
【００１４】
本発明の方法において用いられる上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
【００１５】
本発明の製造方法においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された変異株を用いることが好ましい。「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化する」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して菌体当たりのラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（Ｌ．Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，４２０２（１９６４））によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化された変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １４５（１９９４）６９−７３）等が挙げられる。
【００１６】
また、本発明の製造方法においては、フマル酸リダクターゼ（ＦＲＤ）および／またはピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）の活性が増強するように改変されたコリネ型細菌を用いることもできる。ここで、「増強」とは、非改変株と比較してこれらの酵素の菌体当たりの活性が増加している状態をいう。フマル酸リダクターゼについて、大腸菌のフマル酸リダクターゼはＴＣＡ回路の正回りで作用するコハク酸デヒドロゲナーゼの逆反応を担う酵素であるが、嫌気的条件下におけるフマル酸呼吸に関与しており、好気的条件下においては転写レベルでその遺伝子発現が抑制されていることが知られている（Ｊｏｎｅｓ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｕｎｓａｌｕｓ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８５，Ｖｏｌ．１６４，ｐ１１００−１１０９）。従って、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生育が悪くなることが考えられるため、本発明においては、フマル酸リダクターゼ活性は菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましい。
【００１７】
なお、ＰＣおよびＦＲＤの活性が増強されたことは、それぞれ後述するようなＮＡＤＨの減少またはＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６の減少を測定する方法により、これらの酵素活性を測定することによって確認することができる。フマル酸リダクターゼあるいはピルビン酸カルボキシラーゼの発現が増強されたコリネ型細菌は、フマル酸リダクターゼ（ＦＲＤ）遺伝子またはピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）遺伝子を、特開平１１−１９６８８８号公報に記載された方法と同様にして遺伝子組み換え技術を用い、コリネ型細菌中で高発現させることにより作製することができる。
【００１８】
ＰＣ活性を増強させるために用いるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、通常の方法によりＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。
【００１９】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これらの供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するための基本操作を、配列が既知である、コリネ型細菌由来のものを一例として述べれば次のとおりである。
【００２０】
ＰＣ遺伝子は、上記コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の染色体上に存在し（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４４（１９９８）９１５−９２７）、それらの配列が既知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）（配列番号１５）、ＰＣＲ法により、ＰＣ遺伝子を分離・取得することができる。
【００２１】
例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてコリネバクテリウム・グルタミカム由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、約３．７ｋｂからなるＰＣ遺伝子を増幅させることができる。このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの５’末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌に導入することができる。
【００２２】
また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、部分分解配列よりプローブまたはプライマーを合成し、通常用いられるハイブリダイゼーションの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとにプローブまたはプライマーを合成し、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法によりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
【００２３】
本明細書において、切断ＤＮＡ断片の大きさ及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φＸ１７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００２４】
上記ＰＣ遺伝子を含む本発明に用いるＤＮＡ断片は、コリネバクテリウム・グルタミカム染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。また、前記のようにコリネ型細菌染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号１５の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。例えば、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または配列番号１５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡであって、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２５】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（括弧内に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。得られた遺伝子は、後記実施例３作製のベクターのＴＺ４プロモーター下流に挿入することができる。挿入したプラスミドを実施例４（Ｃ）の方法に従って好気性コリネ型細菌を形質転換し、非アミノ有機酸の製造に使用することができる。
【００２６】
ヒト［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０２，１００９−１０１４，（１９９４）］
マウス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，１７６６−１７７９，（１９９３）］
ラット［ＧＥＮＥ，１６５，３３１−３３２，（１９９５）］
酵母；
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，３０７−３１５，（１９９１）］
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）
［ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．；Ｄ７８１７０］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
［ＧＥＮＥ，１９１，４７−５０，（１９９７）］
リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）
［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８，５９６０−５９７０，（１９９６）］
【００２７】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号１６）の確認は、該形質転換体から粗酵素液を抽出し、Ｍａｇａｓａｎｉｋの方法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８，５５−６２，（１９８４）］により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。
【００２８】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、実施例３に示すようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
【００２９】
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
【００３０】
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００３１】
ＰＣ遺伝子を好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、本発明で用いるＰＣ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、ＰＣ活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でＰＣ遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）等によって行うことができる。
【００３２】
本発明において使用するＦＲＤ活性が増強された細菌は、ＦＲＤ遺伝子を細菌に導入することによって得ることができる。用いることのできるＦＲＤ遺伝子はフマル酸リダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号１９に示す塩基配列を有する大腸菌由来の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子はＦＲＤを構成する４つのサブユニット（ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ及びｆｒｄＤ；配列番号２０〜２３）をコードする遺伝子（配列番号１９の４４０〜２２４５，２２４１〜２９７５，２９８６〜３３８１，及び３３９２〜３７５１）をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を細菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、このようなＦＲＤ遺伝子ホモログの中でも、ＦＲＤのＢサブユニット（ｆｒｄＢ）（配列番号２１）の１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンであるようなタンパク質をコードするものが好ましい。配列番号１９に示す塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログは、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法によって得ることができる。また、必要に応じて、ｆｒｄＢの１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンになるような突然変異を、公知の方法により導入することもできる。
【００３３】
また、大腸菌以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＦＲＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のＦＲＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基いてＦＲＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００３４】
得られたＦＲＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＦＲＤの発現増強が可能な組換えプラスミドを得ることができる。コリネ型細菌にＦＲＤ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されず、上述のｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１等を用いることができる。なお、ＦＲＤ活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でＦＲＤ遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。
【００３５】
前述したように、本発明においてフマル酸リダクターゼ活性は、菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましいため、適当なコピー数のプラスミドを選択するか、適当な発現強度のプロモーターを選択することにより、ＦＲＤ遺伝子の発現量を調節することが好ましい。ここで、ＦＲＤ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いるＦＲＤ遺伝子自身のプロモーターであってもよい。
【００３６】
本発明において、ＰＣ及びＦＲＤ活性が増強した細菌を用いる場合は、これらの遺伝子を個別に細菌に導入してもよいし、両遺伝子を含むベクターを用いて同時に導入してもよい。本発明においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化し、かつＰＣ及び／またはＦＲＤ活性が増強するように改変された細菌を用いることが特に好ましい。このような細菌は、例えば、ＬＤＨ遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を作製し、得られた細菌をＰＣ遺伝子及びＦＲＤ遺伝子を含む組換えベクターでそれぞれ形質転換することにより得ることができる。なお、これらの遺伝子を用いた改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
【００３７】
本発明の製造方法に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって非アミノ有機酸を製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む水溶液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
【００３８】
本発明においては菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体抽出物、例えば、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の製造方法において用いる有機原料は、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、シュークロース、フルクトース又はグリセロールが好ましく、特にグルコース又はシュークロースが好ましい。また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの有機原料は、単独でも組み合わせても使用できる。
【００４０】
上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
【００４１】
本発明の製造方法に用いる水性媒体としては特に限定されず、例えば、水、緩衝液、液体培地等が挙げられるが、既述したような液体培地が最も好ましい。また、本発明の水性媒体には、窒素源や無機塩などが含まれることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加するとよい。また、反応時の発泡を抑えるために、水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００４２】
本発明の製造方法の一形態においては、水性媒体を、炭酸マグネシウムを添加することによって中和しながら反応させる。炭酸マグネシウムは、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物として存在しており、比較的水に溶けにくい。水性媒体へ炭酸マグネシウムの添加は、粉末等の固体あるいは水等に溶かした溶液を加えることにより行うことができるが、溶液の添加による体積の増加を防ぐことが可能であるため、粉末等の固体のまま添加することが好ましい。粉末で添加した炭酸マグネシウムは、溶解度が低いため、過剰に添加しても、アルカリ性に傾きすぎることなく一定のｐＨを保つことが可能である。例えば、コリネ型細菌の菌体懸濁液に、炭酸マグネシウムを過剰に添加した場合の初期ｐＨは、ｐＨ８〜８．５程度であり、その後反応が進むにつれてｐＨは低下するが、反応後のｐＨは、ｐＨ６〜７程度に保持されている。これは、反応中、過剰に添加されて溶け残った炭酸マグネシウムが次第に溶解し、ｐＨが急激に下がることを防ぐためと考えられる。
【００４３】
本発明の製造方法の他の形態においては、水酸化マグネシウムを添加することによって、水性媒体を中和しながら反応させてもよい。水酸化マグネシウムの水性媒体への添加は、例えば粉体等の固体あるいは水等に溶かした溶液の状態で行うことができる。この場合、目的とする有機酸の生産量を増加させるため、炭酸ガスを供給しつつ反応を行うことが好ましい。
【００４４】
本発明の製造方法の他の形態においては、炭酸マグネシウム及び水酸化マグネシウムを添加することにより水性媒体を中和しながら反応させてもよい。炭酸マグネシウム及び水酸化マグネシウムの添加は、同時に行って中和してもよいし、炭酸マグネシウムを添加した後に水酸化マグネシウムを添加して中和してもよいし、また、水酸化マグネシウムを添加した後に炭酸マグネシウムを添加して中和してもよい。
【００４５】
本反応において、中和するとは、反応により生じた非アミノ有機酸を炭酸マグネシウム及び／または水酸化マグネシウムと反応させることにより、水性媒体のｐＨを一定の範囲、例えばｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５に保つことをいう。本発明においては、炭酸マグネシウム及び／または水酸化マグネシウムを最初に添加してもよいし、反応中も必要に応じてさらに加えてもよい。また、炭酸マグネシウム及び／または水酸化マグネシウムに加えて、他のｐＨ調節物質、例えばアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などを添加してもよい。
【００４６】
水性媒体には、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、好気的条件または嫌気的条件で反応させることが好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤として用いる炭酸マグネシウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加するとよい。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させるとよい。
【００４７】
また、本発明で用いる水性媒体に１価カチオンを添加することによりコハク酸等の有機酸の生成速度あるいは収率を上昇させることができる。１価カチオンとしては、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等が挙げられるが、アンモニウムイオンが好ましく用いられる。
１価カチオン添加の際は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム等、１価カチオンの水酸化物として添加することができるが、１価カチオンの塩として添加することが好ましく、アンモニウムイオンの塩としては、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等が、ナトリウムイオンの塩としては、炭酸水素ナトリウム等が、カリウムイオンの塩としては、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
１価カチオンの塩を添加する場合は、通常、粉末状態で添加するか、その懸濁液または水溶液として添加することが好ましい。また、水酸化アンモニウムを添加する場合は、アンモニア水として添加してもよいし、気体として反応液中に通気することにより添加することもできる。
１価カチオンの添加濃度としては、アンモニウムイオンとしては、０．００１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍであり、ナトリウムイオンとしては、０．００１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍであり、カリウムイオンとしては、０．００１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍである。
１価カチオンの添加時期としては、反応開始時に添加してもよいし、反応途中で連続的、逐次的あるいは間欠的に添加してもよい。連続的に反応液を使用する場合は、反応液に既に添加されている１価カチオンの量を考慮し、１価カチオンの反応液中の濃度が前記した好ましい濃度になるように添加することが好ましい。
【００４８】
本反応に用いる微生物の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００４９】
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、有機酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない、又は、通気を絞り酸素供給量を制限した嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここでいう嫌気的雰囲気下とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する、攪拌を少なくする等の方法を用いることができる。
【００５０】
有機酸の生成反応は、通常、培養液中のグルコース等の有機原料が消費された時点で反応終了とすることができる。このとき、反応液中には、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸等の有機酸が生成している。このうち、コハク酸が最も蓄積度が高く生産物としては好ましい。
【００５１】
上記の反応により、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸等の有機酸を得ることができる。この有機酸含有組成物自体も本発明の範囲内である。有機酸含有組成物としてはコハク酸の蓄積濃度が高いものが特に好ましい。また、反応液又は培養液中に蓄積した有機酸は常法に従って、分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。
【００５２】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法により非アミノ有機酸を製造した後に、得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非アミノ有機酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造される非アミノ有機酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。また、本発明の製造法により得られる非アミノ有機酸または該非アミノ有機酸を含有する組成物は、食品添加物や医薬品、化粧品として用いることができる。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１
【００５４】
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００５５】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００５６】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００５７】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００５８】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００５９】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
【００６０】
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
【００６１】
一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
【００６２】
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６３】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００６４】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した。
【００６５】
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００６６】
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
実施例２
【００６７】
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン１００μｇ、イーストエキストラクト１ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００６８】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００７０】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【００７１】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【００７２】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００７３】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
【００７４】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【００７５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）は、常法（Ｗｏｌｆ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，１５６（３）１１６５−１１７０、Ｋｕｒｕｓｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０，５４（２）４４３−７）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７６】
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
【００７７】
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【００７８】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）］で洗浄した。
【００７９】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００８０】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［Ｌ．Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，４２０２（１９６４）］。反応は、５０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
実施例３
【００８１】
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８２】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
【００８３】
増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８４】
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
【００８５】
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
【００８６】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
【００８７】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの組み立て
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２−９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。
【００８８】
ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８９】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
実施例４
【００９０】
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。
【００９１】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
【００９２】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００９３】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
【００９４】
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であること断定した。
【００９５】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した＜実施例３＞にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
【００９６】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００９７】
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【００９８】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／１０ｍＬビオチン、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭアデノシン３リン酸ナトリウム、０．３２ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は０．２Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。なお親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
実施例５
【００９９】
＜大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング＞
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【０１００】
（Ｂ）大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
【０１０１】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【０１０２】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。
【０１０３】
ｐＦＲＤ６．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１９、２０〜２３に記載する。
実施例６
【０１０４】
＜ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
実施例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号２４および配列番号２５）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した
【０１０５】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミドの構築
実施例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１０６】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化により５０５、２１３２、２６７５、３７７５、４１９３ｂｐの断片を生じたことから、図５に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＦＲＰＣ１．１と命名した。
【０１０７】
（Ｂ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、実施例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【０１０８】
（Ｃ）ＦＲＤ酵素活性測定
上記（Ｂ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は３３ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭコハク酸Ｎａ、２ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に２μｍｏｌのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は０．０２Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。なお親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は０．０１Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
実施例７
【０１０９】
＜炭酸マグネシウム中和による反応＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例６で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
【０１１０】
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２５ｍＬとあらかじめ滅菌した２４％グルコース溶液２５ｍＬを１００ｍＬの三角フラスコに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：４．２１５ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３０℃に保温し、毎分１２０回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後２０時間における糖消費速度は２．０８ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．６１ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７７％であった。なお、糖消費速度及びコハク酸生産速度は、反応開始時から反応終了時までの平均値で表している。
実施例８
【０１１１】
＜水酸化マグネシウム中和による反応（１）＞
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記実施例７と同様の方法により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２００になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した３０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れ、３５℃に保温した。ｐＨが６．８に保たれるように４Ｍ水酸化マグネシウム水溶液を断続的に添加し、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後４６時間における平均糖消費速度は３．２２ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．３８ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７２％であった。
【０１１２】
上記と同様に反応用懸濁液を調製し、３５℃に保温した。ｐＨが６．８に保たれるように４Ｍ水酸化マグネシウム水溶液を断続的に添加し、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後５０時間における平均糖消費速度は２．６０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は０．９０ｇ／Ｌ／ｈ、収率は５５％であった。
実施例９
【０１１３】
＜水酸化マグネシウム中和による反応（２）（ジャーファーメンター）＞
（Ａ）菌体の調製
実施例４で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を実施例７と同様にして種培養を行った。グルコース：１００ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：１４．３ｍＬ、硫酸アンモニウム：１．０ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３：日本油脂社製）：０．０５ｍＬを１Ｌ中に含む培地を１５０Ｌ作製し、ｐＨを１Ｎ ＫＯＨで６．５に調整した後、３００Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。冷却後、前述の種培養液を４５０ｍＬ接種して３０℃に保温した。通気は毎分１１３Ｌ、圧力は５０ｋＰａ、攪拌は毎分２８０回転で、ｐＨをアンモニアガスにて７．６に調整しながら２０時間前培養を行った。
【０１１４】
グルコース：１００ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇを１Ｌ中に含む糖溶液２６０Ｌ分に相当する量の各成分を計量し、５０Ｌに溶解して、１２０℃、２０分加熱滅菌した。また、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：２．９ｍＬ、硫酸アンモニウム：１．０ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３）：０．０５ｍＬを１Ｌ中に含む培地２６０Ｌ分に相当する量の各成分を計量し、１４０Ｌに溶解して、ｐＨを１Ｎ ＫＯＨで６．５に調整した後、１２０℃、２０分加熱滅菌した。滅菌した糖溶液と培地を５００Ｌのジャーファーメンターに入れ、冷却後、前述の前培養液を７０Ｌ加えて全量を２６０Ｌとした後、３０℃に保温した。通気は毎分１１３Ｌ、圧力は５０ｋＰａ、攪拌は毎分１４０回転で、ｐＨをアンモニアガスにて７．６に調整しながら２４時間培養を行い、コハク酸生産能を有する菌体を得た。ＭＦ膜（旭化成社製）により、約４倍に菌体液を濃縮し、乾燥菌体重が約６０ｇ／Ｌの菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は４℃にて保存した。
【０１１５】
（Ｂ）コハク酸の生産
菌体懸濁液を遠心分離してさらに濃縮し、乾燥菌体重が約１２０ｇ／Ｌとなるように遠心上清を用いて調製した。グルコース：１５０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇを蒸留水に溶解して３００ｍＬとし、１２０℃、２０分加熱滅菌した。また、正リン酸：０．６５ｇ、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５ｇ／Ｌ）：２．９ｍＬ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１ｍｇ、塩酸チアミン：１ｍｇ及び消泡剤（ＧＤ−１１３）：０．０５ｍＬを約３００ｍＬの蒸留水に溶解し、ｐＨを５Ｎの水酸化カリウム溶液で６．５に調整した後、蒸留水で４５０ｍＬにメスアップし、１２０℃、２０分加熱滅菌した。上記のグルコース溶液１２０ｍＬと培地１８０ｍＬを混合して１Ｌのジャーファーメンターに入れ、前述の乾燥菌体重が約１２０ｇ／Ｌの懸濁液を１００ｍＬ接種して３０℃に保温した。液上面より二酸化炭素を毎分２０ｍＬ通気し、攪拌は毎分４００回転で、ｐＨを２．５Ｍの水酸化マグネシウム溶液、５Ｍの水酸化ナトリウム溶液、５Ｍの水酸化カリウム溶液、または５Ｍのアンモニア水で、それぞれ７．３に調整しながら反応を行った。反応開始後１４時間目のコハク酸蓄積、コハク酸生産速度及び収率は以下の表のとおりであった。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水を用いた場合と比較して、水酸化マグネシウムを用いて中和しながら反応を行った場合、コハク酸蓄積、コハク酸生成速度及び収率が顕著に高いことが確かめられた。
実施例１０
【０１１８】
＜炭酸水素アンモニウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応＞
上記実施例７と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を０．０５、０．１、０．２、０．４、０．８ｍｏｌ／Ｌとなるように炭酸水素アンモニウムを添加して反応を行った。反応開始後２０時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表２の通りになった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニウムを適量添加することにより、糖消費速度及びコハク酸生産速度が大幅に上昇することが明らかになった。
【０１１９】
【表２】
実施例１１
【０１２０】
＜炭酸水素ナトリウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応（フラスコ）＞
上記実施例７と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を０．０５、０．１、０．２、０．４、０．８ｍｏｌ／Ｌとなるように炭酸水素ナトリウムを添加して反応を行った。反応開始後２０時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表３の通りになった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素ナトリウムを適量添加することにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が大幅に上昇することが明らかになった。
【０１２１】
【表３】
実施例１２
【０１２２】
＜炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記７と同様の方法により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２００になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した３０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：５８．２８４ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３５℃に保温し、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約１６時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は９．８０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は８．７８ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９６％であった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応によって、糖消費速度、コハク酸生産速度、収率が顕著に上昇することがジャー培養において確認された。
実施例１３
【０１２３】
＜炭酸水素アンモニウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
上記実施例１２と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように炭酸水素アンモニウムを添加して同様に反応を行った。反応開始後約１０時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は１５．２ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１２．６ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９２％であった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニウムを適量添加することにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が顕著に上昇することがジャー培養において確認された。
実施例１４
【０１２４】
＜シュークロースを有機原料とした炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記７と同様の方法により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した２０％シュークロース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：３８．８ｇ、炭酸水素アンモニウム３．２ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３５℃に保温し、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約２０時間でシュークロースがほぼ消費されていた。糖消費速度は５ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は４．６ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９１％であった。
【０１２５】
［比較例１］
＜炭酸アンモニウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例６（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
【０１２６】
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２００になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した３０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約１４時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は１１ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は５．３ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７２％であった。
【０１２７】
［比較例２］
＜炭酸ナトリウム中和による反応（ジャーファーメンター）＞
上記比較例１と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸ナトリウムを用いて７．６に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約１２時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は１３ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は７．２ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９５％であった。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明の方法によれば、発酵反応液の体積の増加をほとんど起こすことなく、水性媒体のｐＨを一定の範囲に保持したまま、非アミノ有機酸を製造することができる。さらに、水性媒体に１価カチオンを添加することにより非アミノ有機酸の生成速度あるいは収率を大幅に上げることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を回収する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
１価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
【請求項３】
１価カチオンがアンモニウムイオンまたはナトリウムイオンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機原料がグルコース又はシュークロースである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
非アミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化し、さらに、フマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【請求項１】
水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を回収する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
１価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
【請求項３】
１価カチオンがアンモニウムイオンまたはナトリウムイオンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機原料がグルコース又はシュークロースである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
非アミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化し、さらに、フマル酸レダクターゼおよび／又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６３４９
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【発行日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３９８１（Ｐ２００５−５１３９８１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３６５８
【国際出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【発行日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３６５８
【国際出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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