非誘導体化非代謝化ビタミンＤの質量分析法による決定
本発明は、非代謝化ビタミンＤの検出に関する。特定の態様では、本発明は、非誘導体化非代謝化ビタミンＤを質量分析法により検出するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非代謝化ビタミンＤの定量的測定に関する。特定の態様では、本発明は、非代謝化ビタミンＤのタンデム質量分析法により定量的に測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは、カルシウム（Ｃａ２＋）ホメオスタシスの正の調節において重要な生理学的役割を備える必須栄養素である。ビタミンＤは、太陽光を浴びることによって皮内で新しく（de novo）生成でき、又は飲食物から吸収することができる。ビタミンＤには２つの形態：ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）及びビタミンＤ３（コレカルシフェロール）がある。ビタミンＤ３は、動物によって新しく合成される形態である。ビタミンＤ３は、さらに米合衆国内で製造される乳製品及び特定の食品に添加される一般的補助食品である。食事性及び内因性で合成されるビタミンＤ３はどちらも、生物活性代謝産物を生成するためには代謝活性化を受けなければならない。ヒトにおいては、ビタミンＤ３活性化の初期工程は、主として肝臓内で発生し、中間代謝産物である２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（カルシフェジオール；２５ＯＨＤ３）を形成するためのヒドロキシル化を含んでいる。カルシフェジオールは、循環中のビタミンＤ３の主要な形態である。循環中２５ＯＨＤ３は、次に腎臓によって変換されて１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）を形成するが、これは一般にはビタミンＤ３の最高生物活性を備える代謝産物であると考えられている。
【０００３】
ビタミンＤ２は、真菌及び植物起源に由来する。多数の店頭販売栄養補助食品は、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）ではなくエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）を含有している。Ｄｒｉｓｄｏｌは、米合衆国内で入手できるビタミンＤの唯一の高力価処方薬であり、エルゴカルシフェロールを用いて製造される。ビタミンＤ２は、ヒトにおいてはビタミンＤ３と類似の代謝活性化経路を経て、代謝産物である２５ＯＨＤ２及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ２を形成する。ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、長年に渡りヒトにおいて生物学的に等価であると考えられてきた。しかし近年の報告は、これら２種の形態のビタミンＤの生物活性及びバイオアベイラビリティには差がある可能性を示唆している（Armas et. al., (2004) J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5387-5391）。
【０００４】
不活性ビタミンＤ前駆体であるビタミンＤの測定が臨床状況で行われることは希である。むしろ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、及び全２５−ヒドロキシビタミンＤ（「２５ＯＨＤ」）の血清中濃度が、ビタミンＤの栄養状態及び特定のビタミンＤアナログの有効性の有用な指標である。２５ＯＨＤの測定は、カルシウムの代謝障害の診断及び管理において一般に使用される。この点において、低濃度の２５ＯＨＤは、疾患、例えば低カルシウム血症、低リン血症、続発性甲状腺機能亢進症、アルカリホスファターゼ値上昇、成人における骨軟化症及び小児におけるくる病と関連するビタミンＤ欠乏症の徴候である。ビタミンＤ中毒が疑われる患者においては、２５ＯＨＤの濃度上昇は、この障害を高カルシウム血症を誘発する他の障害から識別する。
【０００５】
１，２５（ＯＨ）２Ｄの測定も臨床状況において使用される。特定の疾患状態は、１，２５（ＯＨ）２Ｄの循環中濃度によって反映される可能性があり、例えば腎疾患及び腎不全は結果として低濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄを生じさせることが多い。１，２５（ＯＨ）２Ｄの上昇した濃度は、過剰な副甲状腺ホルモンの徴候となることがあり、又は特定の疾患、例えばサルコイドーシス又は特定タイプのリンパ腫の徴候となることがある。
【０００６】
ビタミンＤ代謝産物の検出は、ラジオイムノアッセイによって２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３に対して共特異的な抗体を用いて実施されてきた。現行の免疫学に基づくアッセイでは２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を別個に分解（resolve）できないために、ビタミンＤのあらゆる栄養欠乏症の起源を他の試験に頼らずに決定することはできない。特異的ビタミンＤ代謝産物を検出するために質量分析法を使用する方法を開示する報告書が公開されている。一部の報告書では、ビタミンＤ代謝産物が質量分析法を受ける前に誘導体化されるが、他の報告書では誘導化されない。例えば、２００７年１２月２８日に出願されたHolmquist, et al.、米国特許出願第１１／９４６７６５号明細書、Yeung B, et al., J Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23、Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-94、Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43、Higashi T, et al., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55、Higashi T, et al., Anal. Biochanal Chem, 2008, 391: 229-38及びAronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30は、質量分析法の前に代謝産物を誘導体化することにより、様々なビタミンＤ代謝産物を検出する方法を開示している。非誘導体化ビタミンＤ代謝産物を検出するための方法は、Clarke, et al.により２００５年４月６日に出願された米国特許出願第１１／１０１，１６６号明細書及び２００６年３月２１日に出願された同第１１／３８６，２１５号明細書、並びにSingh, et al.により２００４年１０月２４日に出願された米国特許出願第１０／９７７，１２１号明細書の中に報告されている。クックソン型試薬、特に４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）及び４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱ−ＴＡＤ）を用いたビタミンＤ３の誘導体化を開示している報告書も公表されている。Aberhart, J, et al., J. Org. Chem. 1976, 41 (12): 2098-2102及びKamao, M, et al., J Chromatogr. B 2007, 859: 192-200を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１１／９４６７６５号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１１／１０１，１６６号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１１／３８６，２１５号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／９７７，１２１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Armas et. al., (2004) J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5387-5391
【非特許文献２】Yeung B, et al., J Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23
【非特許文献３】Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-94
【非特許文献４】Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43
【非特許文献５】Higashi T, et al., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55
【非特許文献６】Higashi T, et al., Anal. Biochanal Chem, 2008, 391: 229-38
【非特許文献７】Aronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30
【非特許文献８】Aberhart, J, et al., J. Org. Chem. 1976, 41 (12): 2098-2102
【非特許文献９】Kamao, M, et al., J Chromatogr. B 2007, 859: 192-200
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、サンプル中のビタミンＤの１つ又はそれ以上の（非代謝化）形態の量をタンデム質量分析法を含む質量分析法によって検出するための方法を提供する。１つの態様では、サンプル由来のビタミンＤは、質量分析法による分析の前に誘導体化される。第２態様では、サンプル由来のビタミンＤは、質量分析法による分析の前に誘導体化されない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１態様の一部の実施形態では、本方法は：（ｉ）サンプル中のクックソン型誘導体化ビタミンＤを質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、（ｉｉ）少なくとも１つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、（ｉｉｉ）該前駆体及びフラグメントイオンの１つ又はそれ以上の量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたイオンの量を該サンプル中のビタミンＤの量と関連付ける工程を含んでいる。これらの方法では、サンプルは、工程（ｉ）の前にクックソン型誘導体化ビタミンＤを生成するために十分な条件下でクックソン型誘導体化試薬に曝露される。一部の実施形態では、クックソン型誘導体化ビタミンＤは、イオン化の前に抽出カラム及び分析カラムにかけられる。関連する実施形態では、分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムであってよい。
【００１１】
第１態様の一部の実施形態では、本方法は：（ｉ）サンプルを乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）にかける工程、（ｉｉ）該サンプル由来のクックソン型誘導体化ビタミンＤを質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のイオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の該クックソン型誘導体化ビタミンＤイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたクックソン型誘導体化ビタミンＤイオンの量を該サンプル中のビタミンＤの量と関連付ける工程を含んでいる。これらの実施形態では、サンプルは、クックソン型誘導体化試薬に、工程（ｉ）の前に該サンプル中でクックソン型誘導体化ビタミンＤを生成するために十分な条件下で曝露される。一部の実施形態では、サンプルは、工程（ｉ）の後であるが工程（ｉｉ）の前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけられる。
【００１２】
一部の実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）である。これらの実施形態の一部では、１つ又はそれ以上の前駆体イオンは、５７２．４±０．５及び５６０．４±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。これらの実施形態の一部では、１つ又はそれ以上のフラグメントイオンは、２９８．１±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオンを含んでいる。
【００１３】
ビタミンＤがビタミンＤ２を含む実施形態では、１つ又はそれ以上のクックソン型誘導体化ビタミンＤイオンは、５７２．３±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備える前駆体イオン及び２９８．１±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるフラグメントイオンを含むことができる。ビタミンＤがビタミンＤ３を含む実施形態では、１つ又はそれ以上のクックソン型誘導体化ビタミンＤイオンは、５６０．３±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備える前駆体イオン及び２９８．１±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるフラグメントイオンを含むことができる。ビタミンＤがビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含む実施形態では、１つ又はそれ以上の前駆体イオンは５７２．４±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるビタミンＤ２前駆体イオン及び５６０．４±０．５のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンを含むことができ、及び１つ又はそれ以上のフラグメントイオンは、２９８．１±０．５のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２フラグメントイオン及び２９８．１±０．５のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３フラグメントイオンを含むことができる。
【００１４】
第２態様の一部の実施形態では、本発明は、サンプル中のビタミンＤの量をタンデム質量分析法によって誘導体化ビタミンＤのイオン化及び検出を行わずに決定する方法を提供する。一部の実施形態では、ビタミンＤは、ビタミンＤ２を含んでいる。これらの方法は：サンプル由来のビタミンＤ２を３９７．２±０．５又は３７９．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、少なくとも１つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ２イオンの存在を該サンプル中のビタミンＤ２の存在と関連付ける工程を含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、１５９．０±０．５、１４６．９±０．５、１３３．１±０．５及び１２１．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、２８３．２±０．５、１８７．３±０．５、１７５．２±０．５及び１５９．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ２は、イオン化の前に抽出カラム、例えば固相抽出（ＳＰＥ）カラム又は乱流液体クロマトグラフィー（ＴＨＬＣ）カラムにかけることができる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ２は、イオン化の前に分析カラム、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにさらにかけられる。
【００１５】
第２態様の他の実施形態では、ビタミンＤは、ビタミンＤ３を含んでいる。これらの方法は：（ｉ）サンプル由来のビタミンＤ３を３８５．２±０．５又は３６７．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、（ｉｉ）少なくとも１つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ３イオンの存在を該サンプル中のビタミンＤ３の存在と関連付ける工程を含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、１５９．０±０．５、１４７．０±０．５、１３３．１±０．５及び１０７．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。フラグメント化前駆体イオンが３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、１７２．２±０．５、１４５．０±０．５及び１１９．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ３は、イオン化の前に抽出カラム、例えば固相抽出（ＳＰＥ）カラム又は乱流液体クロマトグラフィー（ＴＨＬＣ）カラムへかけることができる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ３は、イオン化の前に分析カラム、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムへさらにかけられる。
【００１６】
本明細書に記載した方法では、質量分析法は、タンデム質量分析法であってよい。タンデム質量分析法を利用する実施形態では、タンデム質量分析法は、例えば、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング、又はプロダクトイオンスキャニングを含む当分野において公知の任意の方法によって実施することができる。
【００１７】
抽出カラムを利用する実施形態では、抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラム、例えば乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムであってよい。抽出カラム、分析カラム及びイオン化源の２つ又はそれ以上を利用する一部の実施形態では、利用される構成要素は、自動サンプル処理及び分析を可能にするオンライン方式で結合することができる。
【００１８】
特定の実施形態のために有用なクックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）及び４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）、並びに同位体で標識されたそれらの変種からなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）又は同位体で標識されたそれらの変種である。特定の好ましい実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）又は同位体で標識されたそれらの変種である。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ビタミンＤ」は、代謝化されていない任意の１つ又はそれ以上の天然型又は合成アナログのビタミンＤを意味する。これは、代謝中に発生する特異的化学修飾（例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）によって同定されるビタミンＤ代謝産物とは対照的である。非代謝化ビタミンＤは、さらに代謝化形態から識別するために「栄養的」ビタミンＤと言及することもできる。代謝化形を特定しないビタミンＤへの言及は、非代謝化形への言及である。
【００２０】
本明細書で使用する「誘導体化する工程」は、２つの分子を反応させて新規分子を形成する工程を意味する。従って、誘導体化剤は、他の物質と反応すると物質を誘導体化することのできる物質である。例えば、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）は、ビタミンＤと反応するとＰＴＡＤ−誘導体化ビタミンＤを形成することのできる誘導体化試薬である。
【００２１】
本明細書で使用するビタミンＤの誘導体化形の名称は、誘導体化の性質に関する表示を含んでいる。例えば、ビタミンＤ２のＰＴＡＤ誘導体は、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２（又はＰＴＡＤ−誘導体化ビタミンＤ２）と表示される。
【００２２】
本明細書で使用する「クックソン型誘導体化剤」は、４−置換１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン化合物である。典型的なクックソン型誘導体化剤には、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）及び４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）が含まれる。さらに、一部の実施形態においてはクックソン型誘導体化剤の同位体で標識された変種を使用できる。例えば、１３Ｃ６−ＰＴＡＤ同位体変種は、標準ＰＴＡＤより６質量単位重く、一部の実施形態において使用することができる。クックソン型試薬によるビタミンＤ代謝産物の誘導体化は、任意の適切な方法によって実施できる。例えば、２００７年１２月２８日に出願されたHolmquist, et al.による米国特許出願第１１／９４６７６５号明細書、Yeung B, et al., J Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23、Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-94、Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43、Higashi T, et al., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55、Higashi T, et al., Anal. Biochanal Chem, 2008, 391: 229-38及びAronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30を参照されたい。
【００２３】
ビタミンＤは、ビタミンＤの１つ又はそれ以上の形態、例えばビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３を意味することができる。サンプルがビタミンＤの複数の形態を含む実施形態では、ビタミンＤの複数の形態を同時にイオン化することができる。例えば、一部の実施形態では、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量は、同一サンプル内で決定される。これらの実施形態では、（誘導体化又は非誘導体化）ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、同時にイオン化することができる。
【００２４】
サンプル由来の２つ又はそれ以上の分析物の量を同時に検出するために適用される用語「同時の」は、同一サンプル注入から該サンプル中の２つ又はそれ以上の分析物の量を反映するデータを獲得することを意味する。各分析物についてのデータは、使用される器械技術に依存して、連続的又は並行して獲得できる。例えば、２つの分析物を含有する単一サンプルをＨＰＬＣカラム内に注入することができ、次にこれは各分析物を順々に溶出させ、結果として質量分析計内への分析物の連続的な導入を生じさせることができる。これら２つの分析物各々の量を決定する工程は、本明細書の目的のためには、両方の分析物がＨＰＬＣ内への同一サンプル注入の結果として生じるので、同時に行われる。
【００２５】
ビタミンＤは、動物の循環中に見いだすことができ、及び／又は生物有機体、例えば動物が生成することができる。従って、サンプルは、例えば患者、つまり生きている、男性又は女性の疾患又は状態の診断、予後診断、若しくは治療を受けるために医療環境にやってきたヒトから入手できる。好ましいサンプルは、生物学的サンプル、特に生物学的流体サンプル、例えば血清又は血漿であってよい。本明細書に提示した方法は、ヒトから採取された場合にサンプル中に存在するビタミンＤの量を決定するために使用できる。
【００２６】
本明細書に開示した方法の特定の好ましい実施形態では、質量分析法は正イオンモードで実施される。又は、質量分析法は、負イオンモードで実施される。例えば大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、レーザーダイオード熱脱離法（ＬＤＴＤ）又はエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む様々なイオン化源は、本発明の実施形態において使用できる。特定の好ましい実施形態では、ビタミンＤ代謝産物は、正イオンモードでＡＰＣＩ又はＬＤＴＤを用いて測定される。
【００２７】
好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上の別個に検出可能な内部標準がサンプル中に提供され、これらの量もサンプル中で決定される。これらの実施形態では、サンプル中に存在する対象の分析物及び内部標準の両方の全部又は一部分が、質量分析計において検出可能な複数のイオンを生成するためにイオン化され、各々から生成された１つ又はそれ以上のイオンが質量分析法によって検出される。好ましくは、内部標準は、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の内の１つ又はそれ以上である。
【００２８】
１つ又はそれ以上の別個に検出可能な内部標準は、クックソン型誘導体化剤を用いた処理（適合する場合）又は該サンプルからの分析物の任意の精製前にサンプル内に提供することができる。これらの実施形態では、１つ又はそれ以上の内部標準は、内因性ビタミンＤと共に誘導体化及び／又は精製を受けることができ、その場合には該誘導体化及び／又は精製された内部標準のイオンが質量分析法によって検出される。これらの実施形態では、対象の分析物から生成されたイオンの存在又は量を該サンプル中の対象の分析物の存在又は量と関連付けることができる。一部の実施形態では、内部標準はビタミンＤの同位体標識形、例えばビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６であってよい。
【００２９】
質量分析計において検出可能なイオンは、上記に列挙した典型的な内部標準の各々について生成することができる。数種の典型的な内部標準について生成された典型的スペクトルについては、実施例８及び９において考察し、図６から７、９から１０、１２から１３及び１５から１６に示す。
【００３０】
本明細書で使用する「同位体標識」は、質量分析法技術によって分析した場合に未標識分子と比較して標識分子内では質量シフトを生成する。適切な標識の例には、ジュウテリウム（２Ｈ）、１３Ｃ及び１５Ｎが含まれる。例えば、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３は、各々ビタミンＤ２及びビタミンＤ３より約３質量単位高い質量を有する。同位体標識は、該分子の１つ又はそれ以上の位置で組み込むことができ、及び１つ又はそれ以上の種類の同位体標識を同一の同位体で標識された分子上で使用できる。
【００３１】
他の実施形態では、ビタミンＤイオンの量は、１つ又はそれ以上の外部参照標準と比較することによって決定することができる。典型的な外部参照標準には、１つ又はそれ以上のビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６でスパイクされたブランク血漿又は血清が含まれる。外部標準は、通常は誘導体化ビタミンＤが検出される実施形態において質量分析法の前に１つ又はそれ以上のクックソン型試薬を用いた処理を含む、分析対象の任意の他のサンプルと同一の処理及び分析を受けることになる。
【００３２】
特定の実施形態では、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の定量下限（ＬＬＯＱ）は、１０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは２ｎｇ／ｍＬ未満である。
【００３３】
本明細書で使用するように、他に規定しない限り、単数形「１つの（a、an）」及び「その（the）」には複数形の言及が含まれる。従って、例えば「１つのタンパク質」という言及には複数のタンパク質分子が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用する用語「精製」又は「精製する工程」は、対象の分析物以外のサンプルから全物質を除去することを意味していない。その代りに、「精製」は、対象の分析物の検出を妨害する可能性があるサンプル中の他の成分と比較した１つ又はそれ以上の対象の分析物の量を濃縮する方法を意味する。様々な手段によるサンプルの精製は、１つ又はそれ以上の干渉物質、例えば質量分析法による選択された親又は娘イオンの検出を妨害する可能性がある、又は妨害しない可能性がある１つ又はそれ以上の物質の相対的減少を可能にする。この用語のような相対的減少は、精製すべき材料中の対象の分析物とともに存在する任意の物質が精製によって完全に除去されることを必要としない。
【００３５】
本明細書で使用する用語「固相抽出」若しくは「ＳＰＥ」は、その中若しくは周囲を溶液が通過させられる固体（即ち、固相）に対する化学的混合物が、溶液（即ち、移動相）中で溶解若しくは懸濁された成分の親和性の結果として成分に分離される方法を意味する。一部の例では、移動相が固相の中若しくは周囲を通過するにつれて、該移動相の望ましくない成分は、該固相によって保持され、該移動相内の分析物の精製を生じさせることができる。他の例では、分析物は固相によって保持することができ、移動相の望ましくない成分が該固相の中若しくは周囲を通過することを可能にする。これらの例では、次に第２移動相はそれ以上の加工処理又は分析のために保持された分析物を該固相から溶出させるために使用される。ＴＦＬＣを含むＳＰＥは、単一又は混合モード機序によって作動することができる。混合モード機序は、同一カラム内でのイオン交換及び疎水性滞留を利用する。例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は強アニオン交換及び疎水性滞留を示す可能性があり、又は強カチオン交換及び疎水性滞留を示す可能性がある。
【００３６】
本明細書で使用する用語「クロマトグラフィー」は、液体若しくは気体によって運ばれる化学的混合物が、それらが固定相液体若しくは固相の周囲若しくは上方を流れるにつれて化学実体の示差的分布の結果として複数の成分に分離される方法を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「液体クロマトグラフィー」若しくは「ＬＣ」は、流体が一様に微細物質のカラムを通して、又はキャピラリー路を通って浸透するに従う流体溶液の１つ又はそれ以上の成分の選択的遅滞の方法を意味する。遅滞は、１つ又はそれ以上の固定相とバルク液（即ち、移動相）との間の混合物の、この流体が固定相に対して移動するに従う成分の分布の結果として生じる。「液体クロマトグラフィー」の例には、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又は高スループット液体クロマトグラフィーとして公知であることもある）が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「高性能液体クロマトグラフィー」若しくは「ＨＰＬＣ」（「高圧液体クロマトグラフィー」として公知であることもある）は、移動相を圧力下で固定相、通常は高密度に充填されたカラムに通して推し進めることによって分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「乱流液体クロマトグラフィー」若しくは「ＴＦＬＣ」（高乱流液体クロマトグラフィー若しくは高スループット液体クロマトグラフィーとして公知であることもある）は、分離を実施するための基礎としてカラム充填を通して分析される物質の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を意味する。ＴＦＬＣは、質量分析法による分析に先行して２つの不特定の薬物を含有するサンプルの調製において適用されてきた。例えば、Zimmer et al., J Chromatogr A 854: 23-35 (1999)を参照されたい。さらに、ＴＦＬＣについて詳細に説明している米国特許第５，９６８，３６７号明細書、同第５，９１９，３６８号明細書、同第５，７９５，４６９号明細書及び同第５，７７２，８７４号明細書も参照されたい。当業者であれば、「乱流」を理解している。流体が緩徐及び平滑に流動する場合は、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通して低流速で移動する流体は層流である。層流では、流体の粒子の運動は、概して直線で移動する粒子に従順である。より高速では、水の慣性が流体の摩擦力に勝り、結果として乱流が生じる。不規則な境界と接触していない流体は、摩擦によって緩徐化される、又は不均一な表面によって偏向させられる流れを「追い越す」。流体が乱流として流動する場合は、流れが層流の場合よりも「抗力」を伴って、流体は渦巻きながら流動する。流体の流れが層流又は乱流であるかを決定する際に役立つ多数の参考文献を利用できる（例えば、Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction, P.S. Bernard & J.M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc.,(2000)、An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge University Press (2001)）。
【００４０】
本明細書で使用する用語「ガスクロマトグラフィー」若しくは「ＧＣ」は、サンプル混合物が気化させられ、液体若しくは粒子状固体から構成される固定層を含有するカラムを通って移動するキャリヤガス流（窒素又はヘリウムとして）内に注入され、固定相のための化合物の親和性に従ってその成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを意味する。
【００４１】
本明細書で使用する用語「大粒子カラム」若しくは「抽出カラム」は、約５０μｍより大きい平均粒径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「分析カラム」は、サンプル中で分析物の存在又は量の決定を可能にするために十分なカラムから溶出する材料の分離を実行するために十分なクロマトグラフィープレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。好ましい実施形態では、分析カラムは、直径が約５μｍの粒子を含有する。そのようなカラムは、その後の分析のために精製されたサンプルを得るために保持されていない物質から保持された物質を分離又は抽出するという一般的目的を有する「抽出カラム」とは識別されることが多い。
【００４３】
本明細書で使用する用語「オンライン」及び「インライン」、例えば「オンライン自動法」又は「オンライン抽出」で使用される用語は、オペレータが介入する必要を伴わずに実施される手順を意味する。これとは対照的に、本明細書で使用する用語「オフライン」は、オペレータの手作業による介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプルが沈殿させられ、次に上清がオートサンプラー内に手作業で充填される場合は、沈殿及び充填工程はその後の工程からオフラインである。本方法の様々な実施形態では、１つ又はそれ以上の工程は、オンライン自動法で実施することができる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「質量分析法」若しくは「ＭＳ」は、それらの質量によって化合物を同定するための分析技術を意味する。ＭＳは、濾過し、検出し、及びそれらの質量対電荷比若しくは「ｍ／ｚ」に基づいてイオンを測定する方法を意味する。ＭＳテクノロジーは、一般には（１）荷電化合物を形成するために化合物をイオン化する工程、及び（２）該荷電化合物の分子量を検出して質量対電荷比を計算する工程を含んでいる。化合物は、任意の適切な手段によってイオン化及び検出することができる。「質量分析計」は、一般にはイオン化装置及びイオン検出器を含んでいる。一般に、対象の１つ又はそれ以上の分子がイオン化され、該イオンは引き続いて質量分析器械内に導入され、そこで磁場と電場の組み合わせのために、該イオンは質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路を辿る。例えば、「Mass Spectrometry From Surfaces」と題する米国特許第６，２０４，５００号明細書、「Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry」と題する同第６，１０７，６２３号明細書、「DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry」と題する同第６，２６８，１４４号明細書、「Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes」と題する同第６，１２４，１３７号明細書、Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999, 2: 264-76及びMerchant and Weinberger, Electrophoresis 2000, 21: 1164-67を参照されたい。
【００４５】
本明細書で使用する用語「負のイオンモードで操作する」は、負のイオンが生成されて検出される質量分析法を意味する。本明細書で使用する用語「正のイオンモードで操作する」は、正のイオンが生成されて検出される質量分析法を意味する。
【００４６】
本明細書で使用する用語「イオン化」若しくは「イオン化する工程」は、１つ又はそれ以上の電子単位と同等の正味電荷を有する分析物イオンを生成する方法を意味する。負のイオンは、１つ又はそれ以上の電子単位の正味負電荷を有するイオンであり、一方、正のイオンは１つ又はそれ以上の電子単位の正味正電荷を有するイオンである。
【００４７】
本明細書で使用する用語「電子イオン化」若しくは「ＥＩ」は、気相若しくは蒸気相内の対象の分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と分析物との衝撃は、次に質量分析技術を受けさせることができる分析物イオンを生成する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「化学イオン化」若しくは「ＣＩ」は、試薬ガス（例えば、アンモニア）が電子衝撃に曝露され、分析物イオンが試薬ガスイオンと分析物分子との相互作用によって形成される方法を意味する。
【００４９】
本明細書で使用する用語「高速原子衝撃法」若しくは「ＦＡＢ」は、高エネルギー原子ビーム（Ｘｅ又はＡｒであることが多い）が、非揮発性サンプルに衝撃を与え、該サンプル中に含有される分子を脱離してイオン化する方法を意味する。試験サンプルは、様々な液体マトリックス、例えば、グリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミン中に溶解される。化合物又はサンプルにとって適切なマトリックスの選択は、経験に基づく方法である。
【００５０】
本明細書で使用する用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化法」若しくは「ＭＡＬＤＩ」は、非揮発性サンプルが、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路によって該サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩのためには、サンプルは、分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合される。
【００５１】
本明細書で使用する用語「表面増強レーザー脱離イオン化法」若しくは「ＳＥＬＤＩ」は、非揮発性サンプルが、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路によって該サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照射に曝露される又別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩのためには、サンプルは、通常は１つ又はそれ以上の対象の分析物を優先的に保持する表面に結合される。ＭＡＬＤＩにおけるものと同様に、この方法もイオン化を促進するためにエネルギー吸収材料を使用することができる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「エレクトロスプレーイオン化」若しくは「ＥＳＩ」は、溶液が長さの短いキャピラリーチューブに沿って通過させられ、その端部では正又は負の高電位が印加される方法を意味する。キャピラリーチューブの端部に達した溶液は、溶媒蒸気中の溶液の極めて小さな液滴のジェット又はスプレーに蒸気化（噴霧化）される。この液滴のミストは、凝縮を防止して溶媒を蒸発させるために僅かに加熱される蒸発チャンバを通って流動する。液滴がより小さくなるにつれて電気面電荷密度は、同電荷間の自然反発力がイオン並びに中性分子を遊離させるようになる時点まで増加する。
【００５３】
本明細書で使用する用語「大気圧化学イオン化」若しくは「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩに類似する質量分析法を意味するが、ＡＰＣＩは、大気圧下のプラズマ内で発生するイオン−分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の放電によって維持される。次にイオンは、通常は、１組の差動揚水スキマー段階の使用によって質量分析装置内へ抽出される。向流の乾性及び予熱Ｎ２ガスを使用すると、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、低極性種を分析するためにはＥＳＩより有効な可能性がある。
【００５４】
本明細書で使用する用語「大気圧光イオン化」若しくは「ＡＰＰＩ」は、分子Ｍのイオン化のための機序が分子イオンＭ＋を形成するための光子吸収及び電子放出であるイオン化の形態を意味する。吸収された光子のエネルギーは、通常はイオン化電位より僅かに高いために、分子イオンは解離されにくい。多くの場合に、クロマトグラフィーを必要とせずにサンプルを分析することが可能であるので、時間及び費用を大きく節約することができる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下では、分子イオンはＨを抽出してＭＨ＋を形成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に発生する傾向がある。これは、Ｍ＋及びＭＨ＋の合計が一定であるために、定量正確性に影響を及ぼさない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は通常はＭＨ＋であると観察されるが、非極性化合物、例えばナフタレン又はテストステロンは、通常はＭ＋を形成する。例えば、Robb et al., Anal. Chem. 2000, 72 (15): 3653-3659を参照されたい。
【００５５】
本明細書で使用する用語「誘導結合プラズマ」若しくは「ＩＣＰ」は、サンプルが、ほとんどの元素が霧化及びイオン化されるような十分に高温で不完全イオン化ガスと相互作用する方法を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「脱離」は、表面からの分析物の除去及び／又は分析物の気相内への進入を意味する。レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）は、分析物を含有するサンプルがレーザーパルスによって気相内へ熱により脱離される技術である。レーザーは、金属基板を備える特別製作された９６ウエルプレートの背部に衝突する。レーザーバルスは該基板を加熱し、この熱はサンプルが気相内へ移動するのを誘発する。次に気相サンプルは、イオン化源内へ引き入れられ、そこで気相サンプルは質量分析計内での分析の準備においてイオン化される。ＬＤＴＤを使用する場合は、気相サンプルのイオン化は、当分野において公知の任意の適切な技術、例えばコロナ放電を用いる（例えば、ＡＰＣＩによる）イオン化によって実施することができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「電場脱離」は、非揮発性試験サンプルがイオン化面に配置され、強電場が分析物イオンを生成させるために使用される方法を意味する。
【００５８】
本明細書で使用する用語「選択的イオンモニタリング法」は、比較的に狭い質量範囲内、通常は約１質量単位のイオンだけが検出される質量分析器械のための検出モードである。
【００５９】
本明細書で使用する用語「多重反応モード」は、「選択された反応モニタリング」として公知でありこともあり、前駆体イオン及び１つ又はそれ以上のフラグメントイオンが選択的に検出される質量分析器械のための検出モードである。
【００６０】
本明細書で使用する用語「定量下限（lower limit of quantification、lower limit of quantitation）」若しくは「ＬＬＯＱ」は、測定値が定量的に有意となるポイントを意味する。このＬＯＱでの分析物反応は、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ（％））及び８０％から１２０％の正確性で同定可能であり、個別的及び再現性である。
【００６１】
本明細書で使用する用語「検出限界」若しくは「ＬＯＤ」は、測定値がそれと関連する不確実性より大きいポイントである。ＬＯＤは数値がその測定値と関連する不確実性を超えているポイントであり、ゼロ濃度での平均値のＲＳＤの３倍であると規定されている。
【００６２】
本明細書で使用する、体液サンプル中の分析物の「量」は、一般にサンプルの容積中で検出可能な分析物の質量を反映している絶対値を意味する。しかし、量は、さらに別の分析物の量と比較した相対量も企図している。例えば、サンプル中の分析物の量は、該サンプル中に通常存在する該分析物のコントロール若しくは正常レベルより大きい量であってよい。
【００６３】
本明細書でイオンの質量の測定値を含まない量的測定値と関連して使用する用語「約」は、指示された数値±１０％を意味する。質量分析器械は、特定の分析物の質量を決定する際に僅かに変動することがある。イオンの質量又はイオンの質量／電荷比の状況における用語「約」は、±０．５０原子質量単位を意味する。
【００６４】
上記で記載した本発明の概要は非限定的であり、本発明の他の特徴及び利点は、以下の本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１ＡからＣは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３（内部標準）各々の典型的なクロマトグラムを示した図である。詳細については、実施例３で考察する。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例３において記載した方法によって決定した、血清サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３についての典型的な検量線を示した図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例３において記載した方法によって決定した、血清サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３についての典型的な検量線を示した図である。
【図３】図３は、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３についての変動係数対濃度のプロットを示した図である。詳細については、実施例５で考察する。
【図４】図４は、様々なサンプルマトリックス内でのビタミンＤ３の分析の比較試験の結果を示した図である。詳細については、実施例１１で考察する。
【図５Ａ】図５Ａは、ビタミンＤ２のイオン化についての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、約３９７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、約３７９．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図６Ａ】図６Ａは、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、約４００．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、約３８２．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図７Ａ】図７Ａは、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、約４０３．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、約３８５．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図８Ａ】図８Ａは、ビタミンＤ３のイオン化についての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、約３８５．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、約３６７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図９Ａ】図９Ａは、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、約３８８．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、約３７０．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、約３９１．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、約３７３．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、約５７２．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、約５７５．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、約５７８．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、約５６０．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、約５６３．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、約５６６．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
サンプル中のビタミンＤを測定するための方法について記載する。より詳細には、サンプル中のビタミンＤを検出及び定量するための質量分析法について記載する。本方法は、クックソン型試薬、例えばＰＴＡＤを使用して誘導体化ビタミンＤを生成することができる。しかし一部の方法では誘導体化剤が使用されず、非誘導体化ビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３が質量分析法によって検出される。
【００６７】
本方法は、非誘導体化若しくは誘導体化ビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３の精製を実施するために抽出クロマトグラフィー技術、例えば、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）を質量分析（ＭＳ）の方法と組み合わせて使用することができ、それによってサンプル中のビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３を検出及び定量するための高スループットアッセイシステムを提供する。又は、一部の方法では、抽出クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーがサンプル分析のために必要とされない。これらの方法では、非誘導体化又は誘導体化ビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３は、ＬＤＴＤを用いてイオン化される。好ましい実施形態は、自動ビタミンＤ定量のための大規模臨床研究室において適用するために特に良好に適合する。
【００６８】
本発明の方法において使用するための適切な試験サンプルには、対象の分析物を含有する可能性がある任意の試験サンプルが含まれる。一部の好ましい実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル、即ち、任意の生物学的起源、例えば動物、細胞培養、臓器培養などから得られるサンプルである。特定の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどから入手される。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくはヒトの男性又は女性である。好ましいサンプルは、体液、例えば血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液若しくは組織サンプル、好ましくは血漿（ＥＤＴＡ及びヘパリン血漿を含む）及び血清、最も好ましくは血清を含んでいる。そのようなサンプルは、例えば、患者、つまり生きている、男性又は女性の、疾患又は状態の診断、予後診断、若しくは治療を受けるために医療環境に現れたヒトから入手できる。
【００６９】
本発明は、ビタミンＤ定量アッセイのためのキットも企図している。ビタミンＤ定量アッセイのためのキットは、本明細書に提供した組成物を含むキットを含むことができる。例えば、キットは、充填材料及び測定量のクックソン型試薬及び同位体標識された内部標準を少なくとも１回のアッセイのために十分量で含むことができる。通常は、本キットは、さらにビタミンＤ定量アッセイにおいて使用するための包装された試薬を使用するための（例えば、紙又は電子媒体に含有される）有形で記録された取扱説明書も含むことになる。
【００７０】
本発明の実施形態において使用するための較正及びＱＣプールは、好ましくは予定されるサンプルマトリックスに類似するマトリックスを使用して調製される。
【００７１】
質量分析法による分析のためのサンプル調製
質量分析法による分析のための調製において、ビタミンＤは、サンプル（例えば、タンパク質）中の１つ又はそれ以上の他の成分と比較して、例えば、液体クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和性分離を含む親和性分離法、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のいずれかの組み合わせなどを含む当分野において公知の様々な方法によって濃縮することができる。
【００７２】
タンパク質沈殿法は、試験サンプル、特に生物学的試験サンプル、例えば血清又は血漿を調製する１つの方法である。タンパク質精製法は、当分野において周知であり、例えば、Polson et al., Journal of Chromatography B 2003, 785: 263-275は、本発明の方法において使用するために適切なタンパク質沈殿法について記載している。タンパク質沈殿法は、サンプルから大部分のタンパク質を除去して上清中にビタミンＤを残すために使用できる。サンプルは、遠心して液体上清を沈殿したタンパク質から分離することができる。又は、サンプルは、濾過して沈殿したタンパク質を除去することができる。次に、残っている上清若しくは濾液は、質量分析法による分析に直接に、又は、液体クロマトグラフィー及びその後の質量分析法による分析にかけることができる。特定の実施形態では、サンプル、例えば血漿若しくは血清は、ハイブリッドタンパク質沈殿／液−液抽出法によって精製することができる。これらの実施形態では、サンプルは、メタノール、酢酸エチル及び水と混合し、生じた混合液はボルテックスミキサーにかけて遠心させる。生じた上清は取り出し、完全に乾燥させ、アセトニトリル中で再構成される。次に、精製されたビタミンＤは、任意のクックソン型試薬、好ましくはＰＴＡＤ又はその同位体標識された変種を用いて誘導体化することができる。
【００７３】
質量分析法の前に使用できるサンプル精製の又別の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的緩徐な層流技術に依存している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム充填に依存しており、このとき該カラムを通るサンプルの層流が該サンプルから対象の分析物を分離するための基礎である。当業者であれば、そのようなカラム内での分離が拡散方法であることを理解し、ＨＰＬＣを含むＬＣ、誘導体化ビタミンＤと共に使用するために適する器械及びカラムを選択することができる。クロマトグラフィーカラムは、通常は、化学成分の分離（即ち、分別）を促進するための媒質（即ち、充填材料）を含んでいる。媒質は微細粒子を含むことができ、又は多孔性チャネルを備えるモノリシック材料を含むことができる。媒質の表面は、通常は、化学成分の分離を促進するために様々な化学成分と相互作用する接合面を含んでいる。１つの適切な接合面は、疎水性接合面、例えばアルキル接合面、シアノ接合面、又は高純度シリカ表面である。アルキル接合面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２、又はＣ−１８接合アルキル基を含むことができる。好ましい実施形態では、カラムは高純度シリカカラム（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ａｑカラム）である。クロマトグラフィーカラムは、サンプルを受け入れるための入口ポート及び分別されたサンプルを含む流出物を放出するための出口ポートを含んでいる。サンプルは、入口ポートへ直接に、又は抽出カラム、例えばオンラインＳＰＥカートリッジ若しくはＴＦＬＣ抽出カラムから供給することができる。
【００７４】
１つの実施形態では、サンプルは入口ポートでＬＣカラムへ提供し、溶媒若しくは溶媒混合液と共に溶出させ、出口ポートで放出することができる。対象の分析物を溶出するために様々な溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード又は多型的（即ち、混合型）モードを用いて実施することができる。クロマトグラフィー中、材料の分離は変量、例えば溶離液（「移動相」としても公知である）、溶出モード、勾配条件、温度などの選択によって実施できる。
【００７５】
特定の実施形態では、分析物は、サンプルをカラムへ、対象の分析物がカラム充填材料によって可逆的に保持されるが１つ又はそれ以上の材料が保持されない条件下で適用することによって精製できる。これらの実施形態では、対象の分析物がカラムによって保持される第１移動相条件を使用することができ、引き続いて、保持されなかった材料が洗い流されると保持された材料をカラムから除去するために第２移動層条件を使用することができる。又は、分析物は、サンプルをカラムへ、対象の分析物が１つ又はそれ以上の他の材料と比較して示差的速度で溶出する移動相条件下で適用することによって精製できる。そのような手順は、対象の１つ又はそれ以上の分析物の量を該サンプルの１つ又はそれ以上の他の成分と比較して濃縮することができる。
【００７６】
１つの好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、アルキル接合分析カラムクロマトグラフィーシステムを用いて実施される。特定の好ましい実施形態では、高純度シリカカラム（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ａｑカラム）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＬＣ及び／又はＴＦＬＣは、移動相ＡとしてＨＰＬＣグレードの水及び移動相ＢとしてＨＰＬＣグレードのエタノールを使用して実施される。
【００７７】
バルブ及び連結配管を注意深く選択することによって、２つ又はそれ以上のクロマトグラフィーカラムを材料がいかなる手作業の工程も全く必要とせずに１つのカラムから次のカラムへ通過するように必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態では、バルブ及び配管の選択は、必要な工程を実施するために前もってプログラムされたコンピュータによって制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムは、さらにオンライン方式で検出システム、例えばＭＳシステムへ接続される。従って、オペレータは、サンプルのトレイをオートサンプラーへ配置することができ、残りの作業はコンピュータ制御下で実施され、結果として選択された全サンプルの精製及び分析が行われる。
【００７８】
一部の実施形態では、抽出カラムは、質量分析法の前にビタミンＤ代謝産物を精製するために使用できる。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉する抽出カラムを用いて抽出し、次にイオン化の前に第２抽出カラム上又は分析用ＨＰＬＣカラム上で溶出させてクロマトグラフィーにかけることができる。例えば、ＴＦＬＣ抽出カラムを用いたサンプル抽出は、粒径の大きな（５０μｍ）充填カラムを用いて実施することができる。このカラムから溶出されたサンプルは、次に質量分析法の前にさらに精製するためにＨＰＬＣ分析カラムへ移すことができる。これらのクロマトグラフィー法に含まれる工程は自動方式で連結することができるので、分析物の精製中にオペレータが関与する要件は最小限に抑えることができる。この特徴は、時間及び費用の節約を生じさせ、オペレータが操作を間違える可能性を排除することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、タンパク質沈殿法は、メタノールタンパク質沈殿法及び血清からの酢酸エチル／水による抽出を含む複合型タンパク質沈降法／液−液抽出法を用いて実施される。結果として生じるビタミンＤ代謝産物は、抽出カラムにかける前に誘導体化することができる。好ましくは、複合型タンパク質沈殿法／液−液抽出法及び抽出カラムはオンライン方式で接続される。好ましい実施形態では、抽出カラムは、Ｃ−８抽出カラム、例えばＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃ８ＸＬオンライン抽出カラム（粒径：５０μｍ、０．５×５０ｍｍ）又は同等物である。次に抽出カラムからの溶離液は、質量分析法による分析の前に、分析用ＬＣカラム、例えばＨＰＬＣカラムへオンライン方式で適用することができる。これらのクロマトグラフィー法に含まれる工程は自動方式で連結することができるので、分析物の精製中にオペレータが関与する要件は最小限に抑えることができる。この特徴は、時間及び費用の節約を生じさせ、オペレータが操作を間違える可能性を排除することができる。
【００８０】
質量分析法による検出及び定量
様々な実施形態では、誘導体化ビタミンＤは、当業者には公知の任意の方法によってイオン化することができる。質量分析法は、分別されたサンプルをイオン化し、その後の分析のために荷電分子を作り出すためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電場イオン化、電場脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）及び粒子ビームイオン化によって実施することができる。当業者であれば、イオン化法の選択は、測定対象の分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、正対負のモードの選択などに基づいて決定することができることを理解する。
【００８１】
誘導体化ビタミンＤは、正又は負のモードでイオン化できる。好ましい実施形態では、誘導体化ビタミンＤは、正イオンモードでＡＰＣＩ又はＬＤＴＤを用いてイオン化される。
【００８２】
質量分析法の技術では、一般に、サンプルがイオン化された後、それにより作り出された正又は負の荷電イオンを分析して質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比を決定するために適するアナライザーには、四重極アナライザー、イオントラップアナライザー及び飛行時間アナライザーが含まれる。典型的なイオントラップ法は、Bartolucci, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14: 967-73に記載されている。
【００８３】
イオンは、幾つかの検出モードを使用して検出することができる。例えば、選択されたイオンは、即ち選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を使用して検出でき、又は衝突誘起解離若しくは自然損失の結果として生じた質量変化は、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）によって監視することができる。好ましくは、質量対電荷比は、四重極アナライザーを使用して決定される。例えば、「四重極」若しくは「四重極イオントラップ」機器では、振動無線周波数電磁場内のイオンは電極間に印加されたＤＣ電位に比例する力、ＲＦ信号の振幅及び質量／電荷比を経験する。電圧及び振幅は、特定質量／電荷比を有するイオンだけが四重極の全長を移動し、他の全てのイオンは偏向させられるように選択することができる。従って、四重極機器は、該機器内に注入されたイオンにとっての「質量フィルター」及び「質量検出器」の両方として機能できる。
【００８４】
ＭＳ技術の解像度は、「タンデム質量分析法」若しくは「ＭＳ／ＭＳ」を使用することによって強化することができる。この技術では、対象の分子から生成された前駆体イオン（親イオンとも呼ばれる）はＭＳ機器内で濾過することができ、該前駆体イオンは引き続いて第２ＭＳ法において分析される１つ又はそれ以上のフラグメントイオン（娘イオン又は生成物イオンとも呼ばれる）を産生するためにフラグメント化される。前駆体イオンの注意深い選択によって、特定の分析物によって生成されたイオンだけがフラグメント化チャンバへ通過させられ、そこでの不活性ガスの原子との衝突がフラグメントイオンを生成する。前駆体イオン及びフラグメントイオンはどちらも所定セットのイオン化／フラグメント化条件下で反復方法により生成されるので、ＭＳ／ＭＳ技術は極めて強力な分析用ツールを提供することができる。例えば、濾過／フラグメント化の組み合わせは、干渉物質を排除するために使用することができ、複雑なサンプル中、例えば生物学的サンプル中で特に有用な可能性がある。
【００８５】
タンデム質量分析器械を操作する又別のモードには、生成物イオンスキャニング及び前駆体イオンスキャニングが含まれる。これらの操作モードの説明については、例えば、E. Michael Thurman, et al., Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination of Pesticide Residues, Chapter 8 (Amadeo R. Fernandez-Alba, ed., Elsevier 2005) (387)を参照されたい。
【００８６】
分析物アッセイの結果は、当分野において公知の数多くの方法によって、原サンプル中の該分析物の量と関連付けることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメータが注意深く制御されていることを前提にすると、所定のイオンの相対存在量は、相対存在量を原分子の絶対量へ変換する表と比較することができる。又は、サンプルと共に外部標準をランし、それらの標準から生成されたイオンに基づいて標準曲線を構築することができる。そのような標準曲線を使用すると、所定のイオンの相対存在量を原分子の絶対量へ変換することができる。特定の好ましい実施形態では、内部標準を使用して、ビタミンＤの量を計算するための標準曲線を作成する。そのような標準曲線を作成及び使用する方法は当分野において周知であり、当業者であれば適切な内部標準を選択することができる。例えば、好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上の同位体標識されたビタミンＤ（例えば、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３）を内部標準として使用できる。イオンの量を原分子の量へ関連付けるための他の数多くの方法は、当業者には周知である。
【００８７】
本方法の１つ又はそれ以上の工程は、自動機械を使用して実施することができる。特定の実施形態では、１つ又はそれ以上の精製工程はオンラインで実施され、より好ましくは精製及び質量分析法工程の全部をオンライン方式で実施することができる。
【００８８】
特定の実施形態、例えばＭＳ／ＭＳでは、前駆体イオンがその後のフラグメント化のために単離され、衝突活性化解離（ＣＡＤ）がその後の検出のためのフラグメントイオンを生成するために使用されることが多い。ＣＡＤでは、前駆体イオンは不活性ガスとの衝突を通してエネルギーを獲得し、引き続いて「単分子分解」と呼ばれる方法によってフラグメント化する。前駆体イオン内には、該イオン内の特定の結合を増加した振動エネルギーに起因して崩壊できるように十分なエネルギーが堆積させられなければならない。
【００８９】
一部の好ましい実施形態では、サンプル中のビタミンＤは、以下のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出及び／又は定量される。サンプルは、最初にタンパク質沈殿法又は複合型タンパク質沈殿／液−液抽出法によって精製される。次に、精製されたサンプル中のビタミンＤは、場合によりクックソン型試薬、例えばＰＴＡＤを用いて誘導体化される。次に、精製されたサンプルは、液体クロマトグラフィーに、好ましくは抽出カラム（例えば、ＴＦＬＣカラム）、次の分析カラム（例えば、ＨＰＬＣカラム）上でかけられる。クロマトグラフィーカラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーのネブライザー界面に進入し、及び溶媒／分析物混合液は、界面の加熱荷電チュービング内で蒸気に変換られる。溶媒中に含有される分析物（例えば、誘導体化又は非誘導体化ビタミンＤ）は、溶媒／分析物混合液へ大きな電圧を印加することによってイオン化される。分析物が界面の荷電チュービングから出て行くにつれて、溶媒／分析物混合液は霧状になり、溶媒は蒸発し、分析物イオンが残る。分析物イオン、例えば前駆体イオンは、器械の開口部を通過して第１四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてイオンの選択（即ち、Ｑ１及びＱ３における「前駆体」イオン及び「フラグメント」イオン各々の選択）を可能にする。四重極２（Ｑ２）は、イオンがフラグメント化される衝突セルである。質量分析計の第１四重極（Ｑ１）は、対象の質量対電荷比を備えるイオンを選択する。正しい質量／電荷比を備える前駆体イオンは衝突チャンバ（Ｑ２）を通過させられるが、一方、任意の他の質量／電荷比を備える望ましくないイオンは該四重極の側面に衝突し、排除される。Ｑ２に進入する前駆体イオンは中性アルゴンガス分子及びフラグメントと衝突する。生成されたフラグメントイオンは四重極３（Ｑ３）内に通過させられ、そこで誘導体化又は非誘導体化ビタミンＤフラグメントイオンが選択され、その他のイオンが排除される。
【００９０】
本方法は、正又は負いずれかのイオンモード、好ましくは正のイオンモードで実施されるＭＳ／ＭＳを含むことができる。当分野において周知の標準方法を用いると、当業者であれば、四重極３（Ｑ３）において選択するために使用できる誘導体化ビタミンＤの特定前駆体イオンの１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを同定することができる。
【００９１】
イオンが検出器と衝突するにつれて、イオンはデジタル信号に変換される電子パルスを生成する。獲得されたデータは、コンピュータへ中継され、コンピュータは収集されたイオン対時間の計数をプロットする。結果として生じる質量クロマトグラムは、伝統的ＨＰＬＣ−ＭＳ法において生成されたクロマトグラムに類似する。特定イオンに対応するピーク下の面積、又はそのようなピークの振幅を測定し、対象の分析物の量に関連付けることができる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆体イオンについての曲線下面積、又はピークの振幅は、ビタミンＤの量を決定するために測定される。上述したように、所定のイオンの相対存在量は、内部分子標準の１つ又はそれ以上のイオンのピークに基づいて標準検量線を使用して原分析物の絶対量に変換することができる。
[実施例］
【実施例１】
【００９２】
複合型タンパク質沈殿法／液−液抽出法及びクックソン型誘導体化
以下の自動複合型タンパク質沈殿法／液−液抽出法は、患者血清サンプルを対象に実施した。ゲル−バリヤ血清（即ち、血清分離剤チューブ内に収集された血清）並びにＥＤＴＡ血漿及びヘパリン血漿も、このアッセイのために許容されることが確定されている。
【００９３】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製Ｊａｎｕｓ ロボット及びＴｏｍＴｅｃ社製Ｑｕａｄｒａ Ｔｏｗｅｒ ロボットを使用して以下の手順を自動化した。各サンプルについて、５０μＬの血清を９６ウエルプレートのウエルに加えた。次に２５μＬの内部標準カクテル（同位体標識されたビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を含有する）を各ウエルに加え、プレートをボルテックスミキサーにかけた。次に７５μＬのメタノールを加え、さらに追加してボルテックスミキサーにかけた。次に３００μＬの酢酸エチル及び７５μＬの水を加え、追加してボルテックスミキサーにかけ、遠心し、生じた上清を新しい９６ウエルプレートに移した。
【００９４】
第２の９６ウエルプレート内に移した液体は、流動する窒素ガスマニホールド下で完全に乾燥させた。誘導体化は、各ウエルにアセトニトリル中のクックソン型誘導体化剤ＰＴＡＤの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１００μＬを加えることによって実施した。誘導体化反応をおよそ１時間に渡り進行させ、反応混合液に水１００μＬを加えることによってクエンチさせた。
【実施例２】
【００９５】
液体クロマトグラフィーを用いたビタミンＤの抽出
サンプル注入は、Ａｒｉａ ＯＳ Ｖ１．５．１若しくはそれ以降のソフトウエアを使用してＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｒｉａ ＴＸ−４ ＴＦＬＣシステムを用いて実施した。
【００９６】
ＴＦＬＣシステムは、上記で調製したサンプルのアリコートを大粒子が充填されたＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃ８ＸＬオンライン抽出カラム（粒径：５０μｍ、００５×５０ｍｍ、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内へ自動的に注入した。サンプルは、抽出カラム内で乱流を作り出すために高流速で装填した。この乱流は、カラム内での誘導体化ビタミンＤの大粒子への最適な結合並びに廃棄するための過剰な誘導体化試薬及び破片の通過を保証した。
【００９７】
装填後、サンプルは、水／エタノール溶出勾配を用いて、分析カラムＴｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ａｑ分析カラム（粒径：５μｍ、５０×２．１ｍｍ）へ溶出させた。ビタミンＤをサンプル中に含有される他の分析物から分離するために、ＨＰＬＣ勾配を分析カラムへ適用した。移動相Ａは水であり、移動相Ｂはエタノールであった。ＨＰＬＣ勾配は、３５％有機勾配で開始し、およそ６５秒間で９９％へ増加させた。
【実施例３】
【００９８】
誘導体化ビタミンＤのＭＳ／ＭＳによる検出及び定量
ＭＳ／ＭＳは、上記で生成されたサンプルを対象にＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を使用して実施した。全部がＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製である以下のソフトウエアプログラムを本明細書に記載した実施例において使用した：Ｑｕａｎｔｕｍ Ｔｕｎｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｖ１．５又はそれ以降、Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｖ２．０７又はそれ以降、ＬＣＱｕａｎ Ｖ２．５６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社）又はそれ以降及びＡＲＩＡ ＯＳ ｖ１．５．１（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はそれ以降。分析カラムから出た液体溶媒／分析物はＭＳ／ＭＳアナライザーのネブライザー界面へ流動した。溶媒／分析物混合液は、界面のチュービング内で蒸気に変換された。噴霧化された溶媒の分析物は、ＡＰＣＩによってイオン化された。
【００９９】
イオンは、質量対電荷比５７２．３±０．５のｍ／ｚ及び５６０．３±０．５のｍ／ｚを各々備えるビタミンＤ２及びビタミンＤ３前駆体イオンを選択する第１四重極（Ｑ１）を通過した。四重極２（Ｑ２）に進入したイオンはアルゴンガスと衝突してイオンフラグメントを生成し、これらのイオンフラグメントはその後の選択のために四重極３（Ｑ３）へ通過させられた。質量分析計の設定は表１に示す。同時に、同位体希釈質量分析法を用いる同一方法を内部標準であるビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を用いて実施した。正極性及び指示された衝突エネルギーでのバリデーション中の検出及び定量のために使用した質量変化は表２に示す。
【表１】
【表２】
【０１００】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３（内部標準）の典型的なクロマトグラムは、各々図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す。
【０１０１】
血清試料中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３の決定についての典型的な検量線は、各々図２Ａ及び２Ｂに示す。
【実施例４】
【０１０２】
ＭＳ／ＭＳによる誘導体化ビタミンＤ検出についての反応の直線性
直線性は、実施例１から３の方法によって、ビタミンＤ２又はビタミンＤ３いずれかの高内因性濃度を備える血清の４つのプールを希釈し、７５％、５０％及び２５％の希釈液を２回ずつ分析することによって決定した。試料を平均回収率１０２％で１：４で希釈すると、８５％から１１５％ＣＶの精度限界内で２から２４０ｎｇ／ｍＬの臨床報告可能範囲（ＣＲＲ）が可能になる。これらの試験からの測定値及び回収率は表３に示す。
【表３】
【実施例５】
【０１０３】
分析感度：定量下限（ＬＬＯＱ）及び検出限界（ＬＯＤ）
定量下限（ＬＬＯＱ）は、測定値が定量的に有意となるポイントである。このＬＬＯＱでの分析物の反応は、２０％より大きい精度（即ち、変動係数（ＣＶ）)及び８０％から１２０％の正確性を備えて同定可能、個別的及び再現性である。ＬＬＯＱは、公知の分析物濃度（２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ及び６０ｎｇ／ｍＬ）を備えるサンプルを実施例１から３の方法によって４例ずつ５回アッセイし、再現性を評価することによって決定した。収集されたデータの分析は、２ｎｇ／ｍＬ未満の濃度を備えるサンプルが両方の分析物について２０％未満のＣＶを産生することを示している。従って、各分析物のＬＬＯＱは、＜２ｎｇ／ｍＬであると決定された。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３のＬＬＯＱを決定するために生成されたデータは、各々表４及び５に示す。両方の分析物に対するＣＶ対濃度のグラフ表示は図３に示す。
【表４】
【表５】
【０１０４】
検出限界（ＬＯＤ）は、測定値がそれに関連する不確定性より大きく、ゼロ濃度から４標準偏差（ＳＤ）として適宜に規定されているポイントである。選択性は、分析法がサンプル中の他の成分の存在下で分析物を識別して定量する能力である。ブランクは、実施例１から３の方法に従って２０回ずつ分析され、結果として生じた面積比を統計学的に分析してビタミンＤ２及びビタミンＤ３の両方についてのＬＯＤが０．４ｎｇ／ｍＬであると決定された。各分析物についてのＬＯＤを決定するために収集したデータは表６に示す。
【表６】
【実施例６】
【０１０５】
検出の特異性
数例のサンプルはビタミンＤ２、ビタミンＤ３及びスパイク量の潜在的干渉種（ビタミンＤ代謝産物及び関連化合物を含む）を用いて調製し、実施例１から３の方法に従って分析した。干渉可能性について試験された化合物は表７に列挙する。試験された化合物はいずれも、実施例１から３の方法に従うと、ビタミンＤ２又はビタミンＤ３の検出との交差反応性を示さなかった。
【表７】
【実施例７】
【０１０６】
ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の定量の再現性
アッセイ間変動はアッセイ内のサンプルの再現性であると規定されており、実施例１から３の方法に従って３つのＱＣプール各々からのサンプルを２０回ずつアッセイすることによって決定した。これらの分析から収集したデータは、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３各々について表８及び９に示す。ＱＣプール内の分析物の濃度は、ビタミンＤ２については６．６ｎｇ／ｍＬ、２０．６ｎｇ／ｍＬ及び５２．６ｎｇ／ｍＬ、ビタミンＤ３については４．９ｎｇ／ｍＬ、２０．５ｎｇ／ｍＬ及び４８．６ｎｇ／ｍＬであると決定された。結果について実施した統計学的検定は、３つのＱＣプールに関してビタミンＤ２については５．１％、４．６％及び３．９％、並びにビタミンＤ３については６．４％、４．０％及び４．５％の再現性を生じた。
【表８】
【表９】
【０１０７】
アッセイ間変動は、アッセイ間のサンプルの再現性（ＣＶ）であると規定されている。実施例１から３の方法に従って５回のアッセイに渡って評価したアッセイの報告可能範囲に及ぶ３つのＱＣプールを使用して、これらのプールについてのアッセイ間変動（ＣＶ）をビタミンＤ２及びビタミンＤ３について決定した。ビタミンＤ２については、ＣＶは各々６．５ｎｇ／ｍＬ、２１．１ｎｇ／ｍＬ及び５０．５ｎｇ／ｍＬの平均濃度を用いて６．７％、５．６％及び４．０％であると決定された。ビタミンＤ３については、ＣＶは各々４．７ｎｇ／ｍＬ、２０．８ｎｇ／ｍＬ及び４６．８ｎｇ／ｍＬの平均濃度を用いて６．５％、５．９％及び４．２％であると決定された。これらの分析から収集したデータは、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３について各々表１０及び１１に示す。全プールは、≦１５％ ＣＶの許容される再現性要件を満たした。
【表１０】
【表１１】
【実施例８】
【０１０８】
ビタミンＤ２を定量するための方法相関試験
実施例１から３の方法に従ってビタミンＤ２を定量するための方法相関試験は、本明細書に記載した広範囲に及ぶオフライン抽出を用いるタンデム質量分析法に従って分析した２０例の分割サンプルを比較し、その後に紫外線検出を用いるＨＰＬＣを行うことによって実施した。試料は、各方法について１回ずつ分析した。データは、線形及びデミング回帰によって分析した。相関分析は表１２に要約する。
【表１２】
【実施例９】
【０１０９】
干渉試験
溶血干渉：実施例１から３に記載したアッセイにおける溶血の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にヘモグロビンをスパイクすることによって評価した。新鮮血液サンプルを遠心して濃縮赤血球を産生した。血球を脱イオン水中で再構成し、細胞溶解を達成するために冷凍した。次にこの粗ヘモグロビン溶液をプール内へスパイクすると、軽度（１００ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（５００ｍｇ／ｄＬ）に溶血したサンプルが生成された。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、コントロールプールの結果と比較し、相違率（％）を計算した。データは、ヘモグロビンスパイクがいずれも、いずれの分析物に対してもコントロールと１５％を超えて相違しなかったことを証明している。このため、軽度から中等度の溶血試料は許容される。生データについては表１３を参照されたい（相違率（％）＝（スパイク−非スパイク）／非スパイク×１００％）。
【表１３】
【０１１０】
黄疸干渉：実施例１から３に記載したアッセイにおける黄疸の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にビリルビンをスパイクすることによって評価した。次にビリルビンの濃縮溶液をプール内へスパイクして、軽度（１０ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（５０ｍｇ／ｄＬ）の黄疸性サンプルを生成した。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、結果を非黄疸性プールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も黄疸による影響を受けないことを証明している（全数値が８５から１１５％の許容される正確性範囲内にある）。このため、黄疸性試料は許容される。生データについては表１４を参照されたい（相違率（％）＝（スパイク−非スパイク）／非スパイク×１００％）。
【表１４】
【０１１１】
脂血症干渉：実施例１から３に記載したアッセイにおける脂血症の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にブタ脳抽出物をスパイクすることによって評価した。粉末状脂質サンプル（Ａｖａｎｔｉ社製極性脂質）を各プール内に溶解させ、軽度（４００ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（２０００ｍｇ／ｄＬ）の脂血症試料を生成した。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、結果をコントロールプールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も脂血症による影響を受けないことを証明している（全数値が８５から１１５％の許容される正確性範囲内にある）。生データについては表１５を参照されたい（相違率（％）＝（スパイク−非スパイク）／非スパイク×１００％）。
【表１５】
【０１１２】
実施例１から３に記載したアッセイにおける脂血症の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄエマルジョンをスパイクすることによって評価した。血清プールに、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（２０％エマルジョン）を加えて、軽度（４００ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（２０００ｍｇ／ｄＬ）脂血症試料を生成した。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、結果をコントロールプールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も脂血症による影響を受けないことを証明している（全数値が８５から１１５％の許容される正確性範囲内にある）。生データについては表１６を参照されたい。
【表１６】
【０１１３】
ブタ脳抽出物及びＩｎｔｒａｌｉｐｉｄを使用した２つの脂血症実験に基づいて、脂血症試料は許容される。
【実施例１０】
【０１１４】
試料タイプの試験
試料は、１０種の起源から４つの異なるＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）容器内に収集した。使用したＶａｃｕｔａｉｎｅｒは、Ｒｅｄ−Ｔｏｐ（シリコンコーティング血清用チューブ）、ＳＳＴ（ゲル−バリヤ血清を生じさせる血清分離剤チューブ）、ＥＤＴＡチューブ及びヘパリンナトリウムチューブであった。
【０１１５】
これらの４０例のサンプルは、実施例１から３の方法に従って栄養的ビタミンＤ３について分析した。比較結果は、図４に提示する。データは、全４種のサンプルタイプが分析のために適合することを証明している。
【実施例１１】
【０１１６】
ビタミンＤ３についてのルーチン範囲の証明
患者１４０例由来の血清試料は、ビタミンＤ３を定量するために実施例１から３に記載した方法に従って分析した。結果の範囲は＜２ｎｇ／ｍＬから約６３ｎｇ／ｍＬのビタミンＤ３に及び、結果の９５％は＜２ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれた。これらの分析の結果は表１７に提示する。
【表１７】
【実施例１２】
【０１１７】
回収試験
混合回収率試験は、自然に上昇したレベルの２５−ヒドロキシビタミンＤ２若しくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３を備える試料の分析によって実施したので、一部の内因性循環中ビタミンＤ２又はビタミンＤ３も有していた。本試験のためには、６対の試料を選択した。各対の試料（一般的には試料Ａ及び試料Ｂと呼ぶ）から、５例のサンプルを調製し、実施例１から３の方法に従って４回ずつ分析した。これらのサンプルは、１００％ Ａ、８０％ Ａ−２０％ Ｂ、５０％ Ａ−５０％ Ｂ、２０％ Ａ−８０％ Ｂ、及び１００％ Ｂに対応した。回収率試験の結果は表１８及び１９に提示する。
【表１８】
【表１９】
【実施例１３】
【０１１８】
ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のＭＳ／ＭＳ分析からの典型的なスペクトル
ビタミンＤ２、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のタンデム質量分析法による分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図５Ａ、６Ａ及び７Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。分析物は、上述したようにＡＰＣＩによってイオン化した。スペクトルは、約３００から４５０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１１９】
ビタミンＤ２、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々についての２つの異なる前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図５ＢからＣ、６ＢからＣ及び７ＢからＣに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２０に示す。
【０１２０】
ビタミンＤ２を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３９７．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３７９．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５８．９のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約４００．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１４７．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３８２．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約３１２．２のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約４０３．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．１のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３８５．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図５ＢからＣ、６ＢからＣ及び７ＢからＣにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図５ＢからＣ、６ＢからＣ及び７ＢからＣに示されたイオンから選択することができる。例えば、約３９７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約１４６．９、１３３．１及び１２１．０のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。約３７９．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化によって生成された典型的な追加の生成物イオンには、約２８３．２、１８７．３及び１７５．２のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２０】
【０１２１】
ビタミンＤ３、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のタンデム質量分析法による分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図８Ａ、９Ａ及び１０Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物の導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。スペクトルは、約３００から４５０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１２２】
ビタミンＤ３、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々についての２つの異なる前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図８ＢからＣ、９ＢからＣ及び１０ＢからＣに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２１に示す。
【０１２３】
ビタミンＤ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３８５．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１４７．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３６７．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３８８．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１４７．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３７０．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１６２．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３９１．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．１のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３７３．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図８ＢからＣ、９ＢからＣ及び１０ＢからＣにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図８ＢからＣ、９ＢからＣ及び１０ＢからＣに示されたイオンから選択することができる。例えば、約３８５．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約１５９．０、１３３．１及び１０７．１のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。約３６７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化によって生成された典型的な追加の生成物イオンには、約１７２．９、１４５．０及び１１９．１のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２１】
【実施例１４】
【０１２４】
ＰＴＡＤ誘導体化ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のＭＳ／ＭＳ分析からの典型的なスペクトル
ビタミンＤ２、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のＰＴＡＤ誘導体は、各分析物のストック溶液のアリコートをアセトニトリル中のＰＴＡＤで処理することによって調製した。誘導体化反応はおよそ１時間に渡り進行させ、反応混合液に水を加えることによってクエンチさせた。次に誘導体化分析物は、上記の実施例２から３で説明した手順に従って分析した。
【０１２５】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を含有するサンプルの分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図１１Ａ、１２Ａ及び１３Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ（商標）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。分析物は、上述したようにＡＰＣＩによってイオン化した。スペクトルは、約５００から６２０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１２６】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々について前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図１１Ｂ、１２Ｂ及び１３Ｂに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２２に示す。
【０１２７】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５７２．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９７．９のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５７５．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約３０１．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５７８．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９７．９のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図１１Ｂ、１２Ｂ及び１３Ｂにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図１１Ｂ、１２Ｂ及び１３Ｂに示されたイオンから選択することができる。例えば、約５７２．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約２８０．１のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２２】
【０１２８】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を含有するサンプルの分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図１４Ａ、１５Ａ及び１６Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。スペクトルは、約５００から６２０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１２９】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々についての前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図１４Ｂ、１５Ｂ及び１６Ｂに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２３に示す。
【０１３０】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５６０．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９８．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５６３．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約３０１．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５６６．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９８．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図１４Ｂ、１５Ｂ及び１６Ｂにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図１４Ｂ、１５Ｂ及び１６Ｂに示されたイオンから選択することができる。例えば、約５６０．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約２８０．０のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２３】
【０１３１】
本明細書で言及又は引用した論文、特許及び特許出願、並びに他の全ての文献及び電子的に入手できる情報の内容は、各個別刊行物が参照により組み入れられると特別及び個別に指示された場合と同程度まで全体として参照により組み入れられる。出願人らは、いずれかのそのような論文、特許、特許出願、又は他の物理的及び電子的文献からのありとあらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み入れる権利を留保する。
【０１３２】
本明細書に具体的に記載した方法は、本明細書に特別にではなく開示したいずれかの要素、限度の非存在下で適切に実施することができる。従って例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、拡張的に、及び制限なく読まれるべきである。さらに、本明細書で使用した用語及び表現は、制限するためではなく説明の用語として使用されていて、そのような用語及び表現の使用においては図示及び記載した特徴又はそれらの部分のあらゆる同等物を排除することは意図されていない。様々な修飾が本明細書で要求した本発明の範囲内において可能であることが認識されている。従って、本発明を好ましい実施形態及び任意の特徴によって詳細に開示してきたが、本明細書で開示したその中で実施される本発明の修飾及び変形は当業者であれば用いることができること、及びそのような修飾及び変形は本発明の範囲内に含まれると見なされることを理解されたい。
【０１３３】
本発明を本明細書において幅広く一般的に記載してきた。一般的開示に含まれるより狭い種及び亜属分類の各々も本方法の一部を形成する。これには、切除材料が本明細書に特異的に列挙されているか否かとは無関係に、属からいずれかの主題を取り除く条件又は消極的限定を備える本方法の一般的説明が含まれる。
【０１３４】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本方法の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合は、当業者であれば、本発明がマーカッシュ群の任意の個別構成員又は構成員の部分群によっても記載されることを理解する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非代謝化ビタミンＤの定量的測定に関する。特定の態様では、本発明は、非代謝化ビタミンＤのタンデム質量分析法により定量的に測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは、カルシウム（Ｃａ２＋）ホメオスタシスの正の調節において重要な生理学的役割を備える必須栄養素である。ビタミンＤは、太陽光を浴びることによって皮内で新しく（de novo）生成でき、又は飲食物から吸収することができる。ビタミンＤには２つの形態：ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）及びビタミンＤ３（コレカルシフェロール）がある。ビタミンＤ３は、動物によって新しく合成される形態である。ビタミンＤ３は、さらに米合衆国内で製造される乳製品及び特定の食品に添加される一般的補助食品である。食事性及び内因性で合成されるビタミンＤ３はどちらも、生物活性代謝産物を生成するためには代謝活性化を受けなければならない。ヒトにおいては、ビタミンＤ３活性化の初期工程は、主として肝臓内で発生し、中間代謝産物である２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（カルシフェジオール；２５ＯＨＤ３）を形成するためのヒドロキシル化を含んでいる。カルシフェジオールは、循環中のビタミンＤ３の主要な形態である。循環中２５ＯＨＤ３は、次に腎臓によって変換されて１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）を形成するが、これは一般にはビタミンＤ３の最高生物活性を備える代謝産物であると考えられている。
【０００３】
ビタミンＤ２は、真菌及び植物起源に由来する。多数の店頭販売栄養補助食品は、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）ではなくエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）を含有している。Ｄｒｉｓｄｏｌは、米合衆国内で入手できるビタミンＤの唯一の高力価処方薬であり、エルゴカルシフェロールを用いて製造される。ビタミンＤ２は、ヒトにおいてはビタミンＤ３と類似の代謝活性化経路を経て、代謝産物である２５ＯＨＤ２及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ２を形成する。ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、長年に渡りヒトにおいて生物学的に等価であると考えられてきた。しかし近年の報告は、これら２種の形態のビタミンＤの生物活性及びバイオアベイラビリティには差がある可能性を示唆している（Armas et. al., (2004) J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5387-5391）。
【０００４】
不活性ビタミンＤ前駆体であるビタミンＤの測定が臨床状況で行われることは希である。むしろ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、及び全２５−ヒドロキシビタミンＤ（「２５ＯＨＤ」）の血清中濃度が、ビタミンＤの栄養状態及び特定のビタミンＤアナログの有効性の有用な指標である。２５ＯＨＤの測定は、カルシウムの代謝障害の診断及び管理において一般に使用される。この点において、低濃度の２５ＯＨＤは、疾患、例えば低カルシウム血症、低リン血症、続発性甲状腺機能亢進症、アルカリホスファターゼ値上昇、成人における骨軟化症及び小児におけるくる病と関連するビタミンＤ欠乏症の徴候である。ビタミンＤ中毒が疑われる患者においては、２５ＯＨＤの濃度上昇は、この障害を高カルシウム血症を誘発する他の障害から識別する。
【０００５】
１，２５（ＯＨ）２Ｄの測定も臨床状況において使用される。特定の疾患状態は、１，２５（ＯＨ）２Ｄの循環中濃度によって反映される可能性があり、例えば腎疾患及び腎不全は結果として低濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄを生じさせることが多い。１，２５（ＯＨ）２Ｄの上昇した濃度は、過剰な副甲状腺ホルモンの徴候となることがあり、又は特定の疾患、例えばサルコイドーシス又は特定タイプのリンパ腫の徴候となることがある。
【０００６】
ビタミンＤ代謝産物の検出は、ラジオイムノアッセイによって２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３に対して共特異的な抗体を用いて実施されてきた。現行の免疫学に基づくアッセイでは２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を別個に分解（resolve）できないために、ビタミンＤのあらゆる栄養欠乏症の起源を他の試験に頼らずに決定することはできない。特異的ビタミンＤ代謝産物を検出するために質量分析法を使用する方法を開示する報告書が公開されている。一部の報告書では、ビタミンＤ代謝産物が質量分析法を受ける前に誘導体化されるが、他の報告書では誘導化されない。例えば、２００７年１２月２８日に出願されたHolmquist, et al.、米国特許出願第１１／９４６７６５号明細書、Yeung B, et al., J Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23、Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-94、Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43、Higashi T, et al., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55、Higashi T, et al., Anal. Biochanal Chem, 2008, 391: 229-38及びAronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30は、質量分析法の前に代謝産物を誘導体化することにより、様々なビタミンＤ代謝産物を検出する方法を開示している。非誘導体化ビタミンＤ代謝産物を検出するための方法は、Clarke, et al.により２００５年４月６日に出願された米国特許出願第１１／１０１，１６６号明細書及び２００６年３月２１日に出願された同第１１／３８６，２１５号明細書、並びにSingh, et al.により２００４年１０月２４日に出願された米国特許出願第１０／９７７，１２１号明細書の中に報告されている。クックソン型試薬、特に４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）及び４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱ−ＴＡＤ）を用いたビタミンＤ３の誘導体化を開示している報告書も公表されている。Aberhart, J, et al., J. Org. Chem. 1976, 41 (12): 2098-2102及びKamao, M, et al., J Chromatogr. B 2007, 859: 192-200を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１１／９４６７６５号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１１／１０１，１６６号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１１／３８６，２１５号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／９７７，１２１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Armas et. al., (2004) J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5387-5391
【非特許文献２】Yeung B, et al., J Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23
【非特許文献３】Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-94
【非特許文献４】Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43
【非特許文献５】Higashi T, et al., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55
【非特許文献６】Higashi T, et al., Anal. Biochanal Chem, 2008, 391: 229-38
【非特許文献７】Aronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30
【非特許文献８】Aberhart, J, et al., J. Org. Chem. 1976, 41 (12): 2098-2102
【非特許文献９】Kamao, M, et al., J Chromatogr. B 2007, 859: 192-200
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、サンプル中のビタミンＤの１つ又はそれ以上の（非代謝化）形態の量をタンデム質量分析法を含む質量分析法によって検出するための方法を提供する。１つの態様では、サンプル由来のビタミンＤは、質量分析法による分析の前に誘導体化される。第２態様では、サンプル由来のビタミンＤは、質量分析法による分析の前に誘導体化されない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１態様の一部の実施形態では、本方法は：（ｉ）サンプル中のクックソン型誘導体化ビタミンＤを質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、（ｉｉ）少なくとも１つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、（ｉｉｉ）該前駆体及びフラグメントイオンの１つ又はそれ以上の量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたイオンの量を該サンプル中のビタミンＤの量と関連付ける工程を含んでいる。これらの方法では、サンプルは、工程（ｉ）の前にクックソン型誘導体化ビタミンＤを生成するために十分な条件下でクックソン型誘導体化試薬に曝露される。一部の実施形態では、クックソン型誘導体化ビタミンＤは、イオン化の前に抽出カラム及び分析カラムにかけられる。関連する実施形態では、分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムであってよい。
【００１１】
第１態様の一部の実施形態では、本方法は：（ｉ）サンプルを乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）にかける工程、（ｉｉ）該サンプル由来のクックソン型誘導体化ビタミンＤを質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のイオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の該クックソン型誘導体化ビタミンＤイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたクックソン型誘導体化ビタミンＤイオンの量を該サンプル中のビタミンＤの量と関連付ける工程を含んでいる。これらの実施形態では、サンプルは、クックソン型誘導体化試薬に、工程（ｉ）の前に該サンプル中でクックソン型誘導体化ビタミンＤを生成するために十分な条件下で曝露される。一部の実施形態では、サンプルは、工程（ｉ）の後であるが工程（ｉｉ）の前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけられる。
【００１２】
一部の実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）である。これらの実施形態の一部では、１つ又はそれ以上の前駆体イオンは、５７２．４±０．５及び５６０．４±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。これらの実施形態の一部では、１つ又はそれ以上のフラグメントイオンは、２９８．１±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオンを含んでいる。
【００１３】
ビタミンＤがビタミンＤ２を含む実施形態では、１つ又はそれ以上のクックソン型誘導体化ビタミンＤイオンは、５７２．３±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備える前駆体イオン及び２９８．１±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるフラグメントイオンを含むことができる。ビタミンＤがビタミンＤ３を含む実施形態では、１つ又はそれ以上のクックソン型誘導体化ビタミンＤイオンは、５６０．３±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備える前駆体イオン及び２９８．１±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるフラグメントイオンを含むことができる。ビタミンＤがビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含む実施形態では、１つ又はそれ以上の前駆体イオンは５７２．４±０．５の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を備えるビタミンＤ２前駆体イオン及び５６０．４±０．５のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンを含むことができ、及び１つ又はそれ以上のフラグメントイオンは、２９８．１±０．５のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２フラグメントイオン及び２９８．１±０．５のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３フラグメントイオンを含むことができる。
【００１４】
第２態様の一部の実施形態では、本発明は、サンプル中のビタミンＤの量をタンデム質量分析法によって誘導体化ビタミンＤのイオン化及び検出を行わずに決定する方法を提供する。一部の実施形態では、ビタミンＤは、ビタミンＤ２を含んでいる。これらの方法は：サンプル由来のビタミンＤ２を３９７．２±０．５又は３７９．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、少なくとも１つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ２イオンの存在を該サンプル中のビタミンＤ２の存在と関連付ける工程を含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、１５９．０±０．５、１４６．９±０．５、１３３．１±０．５及び１２１．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、２８３．２±０．５、１８７．３±０．５、１７５．２±０．５及び１５９．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ２は、イオン化の前に抽出カラム、例えば固相抽出（ＳＰＥ）カラム又は乱流液体クロマトグラフィー（ＴＨＬＣ）カラムにかけることができる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ２は、イオン化の前に分析カラム、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにさらにかけられる。
【００１５】
第２態様の他の実施形態では、ビタミンＤは、ビタミンＤ３を含んでいる。これらの方法は：（ｉ）サンプル由来のビタミンＤ３を３８５．２±０．５又は３６７．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、（ｉｉ）少なくとも１つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ３イオンの存在を該サンプル中のビタミンＤ３の存在と関連付ける工程を含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、１５９．０±０．５、１４７．０±０．５、１３３．１±０．５及び１０７．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。フラグメント化前駆体イオンが３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、１７２．２±０．５、１４５．０±０．５及び１１９．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ３は、イオン化の前に抽出カラム、例えば固相抽出（ＳＰＥ）カラム又は乱流液体クロマトグラフィー（ＴＨＬＣ）カラムへかけることができる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンＤ３は、イオン化の前に分析カラム、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムへさらにかけられる。
【００１６】
本明細書に記載した方法では、質量分析法は、タンデム質量分析法であってよい。タンデム質量分析法を利用する実施形態では、タンデム質量分析法は、例えば、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング、又はプロダクトイオンスキャニングを含む当分野において公知の任意の方法によって実施することができる。
【００１７】
抽出カラムを利用する実施形態では、抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラム、例えば乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムであってよい。抽出カラム、分析カラム及びイオン化源の２つ又はそれ以上を利用する一部の実施形態では、利用される構成要素は、自動サンプル処理及び分析を可能にするオンライン方式で結合することができる。
【００１８】
特定の実施形態のために有用なクックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）及び４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）、並びに同位体で標識されたそれらの変種からなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）又は同位体で標識されたそれらの変種である。特定の好ましい実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）又は同位体で標識されたそれらの変種である。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ビタミンＤ」は、代謝化されていない任意の１つ又はそれ以上の天然型又は合成アナログのビタミンＤを意味する。これは、代謝中に発生する特異的化学修飾（例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）によって同定されるビタミンＤ代謝産物とは対照的である。非代謝化ビタミンＤは、さらに代謝化形態から識別するために「栄養的」ビタミンＤと言及することもできる。代謝化形を特定しないビタミンＤへの言及は、非代謝化形への言及である。
【００２０】
本明細書で使用する「誘導体化する工程」は、２つの分子を反応させて新規分子を形成する工程を意味する。従って、誘導体化剤は、他の物質と反応すると物質を誘導体化することのできる物質である。例えば、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）は、ビタミンＤと反応するとＰＴＡＤ−誘導体化ビタミンＤを形成することのできる誘導体化試薬である。
【００２１】
本明細書で使用するビタミンＤの誘導体化形の名称は、誘導体化の性質に関する表示を含んでいる。例えば、ビタミンＤ２のＰＴＡＤ誘導体は、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２（又はＰＴＡＤ−誘導体化ビタミンＤ２）と表示される。
【００２２】
本明細書で使用する「クックソン型誘導体化剤」は、４−置換１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン化合物である。典型的なクックソン型誘導体化剤には、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）及び４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）が含まれる。さらに、一部の実施形態においてはクックソン型誘導体化剤の同位体で標識された変種を使用できる。例えば、１３Ｃ６−ＰＴＡＤ同位体変種は、標準ＰＴＡＤより６質量単位重く、一部の実施形態において使用することができる。クックソン型試薬によるビタミンＤ代謝産物の誘導体化は、任意の適切な方法によって実施できる。例えば、２００７年１２月２８日に出願されたHolmquist, et al.による米国特許出願第１１／９４６７６５号明細書、Yeung B, et al., J Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23、Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-94、Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43、Higashi T, et al., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55、Higashi T, et al., Anal. Biochanal Chem, 2008, 391: 229-38及びAronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30を参照されたい。
【００２３】
ビタミンＤは、ビタミンＤの１つ又はそれ以上の形態、例えばビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３を意味することができる。サンプルがビタミンＤの複数の形態を含む実施形態では、ビタミンＤの複数の形態を同時にイオン化することができる。例えば、一部の実施形態では、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量は、同一サンプル内で決定される。これらの実施形態では、（誘導体化又は非誘導体化）ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、同時にイオン化することができる。
【００２４】
サンプル由来の２つ又はそれ以上の分析物の量を同時に検出するために適用される用語「同時の」は、同一サンプル注入から該サンプル中の２つ又はそれ以上の分析物の量を反映するデータを獲得することを意味する。各分析物についてのデータは、使用される器械技術に依存して、連続的又は並行して獲得できる。例えば、２つの分析物を含有する単一サンプルをＨＰＬＣカラム内に注入することができ、次にこれは各分析物を順々に溶出させ、結果として質量分析計内への分析物の連続的な導入を生じさせることができる。これら２つの分析物各々の量を決定する工程は、本明細書の目的のためには、両方の分析物がＨＰＬＣ内への同一サンプル注入の結果として生じるので、同時に行われる。
【００２５】
ビタミンＤは、動物の循環中に見いだすことができ、及び／又は生物有機体、例えば動物が生成することができる。従って、サンプルは、例えば患者、つまり生きている、男性又は女性の疾患又は状態の診断、予後診断、若しくは治療を受けるために医療環境にやってきたヒトから入手できる。好ましいサンプルは、生物学的サンプル、特に生物学的流体サンプル、例えば血清又は血漿であってよい。本明細書に提示した方法は、ヒトから採取された場合にサンプル中に存在するビタミンＤの量を決定するために使用できる。
【００２６】
本明細書に開示した方法の特定の好ましい実施形態では、質量分析法は正イオンモードで実施される。又は、質量分析法は、負イオンモードで実施される。例えば大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、レーザーダイオード熱脱離法（ＬＤＴＤ）又はエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む様々なイオン化源は、本発明の実施形態において使用できる。特定の好ましい実施形態では、ビタミンＤ代謝産物は、正イオンモードでＡＰＣＩ又はＬＤＴＤを用いて測定される。
【００２７】
好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上の別個に検出可能な内部標準がサンプル中に提供され、これらの量もサンプル中で決定される。これらの実施形態では、サンプル中に存在する対象の分析物及び内部標準の両方の全部又は一部分が、質量分析計において検出可能な複数のイオンを生成するためにイオン化され、各々から生成された１つ又はそれ以上のイオンが質量分析法によって検出される。好ましくは、内部標準は、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の内の１つ又はそれ以上である。
【００２８】
１つ又はそれ以上の別個に検出可能な内部標準は、クックソン型誘導体化剤を用いた処理（適合する場合）又は該サンプルからの分析物の任意の精製前にサンプル内に提供することができる。これらの実施形態では、１つ又はそれ以上の内部標準は、内因性ビタミンＤと共に誘導体化及び／又は精製を受けることができ、その場合には該誘導体化及び／又は精製された内部標準のイオンが質量分析法によって検出される。これらの実施形態では、対象の分析物から生成されたイオンの存在又は量を該サンプル中の対象の分析物の存在又は量と関連付けることができる。一部の実施形態では、内部標準はビタミンＤの同位体標識形、例えばビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６であってよい。
【００２９】
質量分析計において検出可能なイオンは、上記に列挙した典型的な内部標準の各々について生成することができる。数種の典型的な内部標準について生成された典型的スペクトルについては、実施例８及び９において考察し、図６から７、９から１０、１２から１３及び１５から１６に示す。
【００３０】
本明細書で使用する「同位体標識」は、質量分析法技術によって分析した場合に未標識分子と比較して標識分子内では質量シフトを生成する。適切な標識の例には、ジュウテリウム（２Ｈ）、１３Ｃ及び１５Ｎが含まれる。例えば、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３は、各々ビタミンＤ２及びビタミンＤ３より約３質量単位高い質量を有する。同位体標識は、該分子の１つ又はそれ以上の位置で組み込むことができ、及び１つ又はそれ以上の種類の同位体標識を同一の同位体で標識された分子上で使用できる。
【００３１】
他の実施形態では、ビタミンＤイオンの量は、１つ又はそれ以上の外部参照標準と比較することによって決定することができる。典型的な外部参照標準には、１つ又はそれ以上のビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６でスパイクされたブランク血漿又は血清が含まれる。外部標準は、通常は誘導体化ビタミンＤが検出される実施形態において質量分析法の前に１つ又はそれ以上のクックソン型試薬を用いた処理を含む、分析対象の任意の他のサンプルと同一の処理及び分析を受けることになる。
【００３２】
特定の実施形態では、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の定量下限（ＬＬＯＱ）は、１０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは２ｎｇ／ｍＬ未満である。
【００３３】
本明細書で使用するように、他に規定しない限り、単数形「１つの（a、an）」及び「その（the）」には複数形の言及が含まれる。従って、例えば「１つのタンパク質」という言及には複数のタンパク質分子が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用する用語「精製」又は「精製する工程」は、対象の分析物以外のサンプルから全物質を除去することを意味していない。その代りに、「精製」は、対象の分析物の検出を妨害する可能性があるサンプル中の他の成分と比較した１つ又はそれ以上の対象の分析物の量を濃縮する方法を意味する。様々な手段によるサンプルの精製は、１つ又はそれ以上の干渉物質、例えば質量分析法による選択された親又は娘イオンの検出を妨害する可能性がある、又は妨害しない可能性がある１つ又はそれ以上の物質の相対的減少を可能にする。この用語のような相対的減少は、精製すべき材料中の対象の分析物とともに存在する任意の物質が精製によって完全に除去されることを必要としない。
【００３５】
本明細書で使用する用語「固相抽出」若しくは「ＳＰＥ」は、その中若しくは周囲を溶液が通過させられる固体（即ち、固相）に対する化学的混合物が、溶液（即ち、移動相）中で溶解若しくは懸濁された成分の親和性の結果として成分に分離される方法を意味する。一部の例では、移動相が固相の中若しくは周囲を通過するにつれて、該移動相の望ましくない成分は、該固相によって保持され、該移動相内の分析物の精製を生じさせることができる。他の例では、分析物は固相によって保持することができ、移動相の望ましくない成分が該固相の中若しくは周囲を通過することを可能にする。これらの例では、次に第２移動相はそれ以上の加工処理又は分析のために保持された分析物を該固相から溶出させるために使用される。ＴＦＬＣを含むＳＰＥは、単一又は混合モード機序によって作動することができる。混合モード機序は、同一カラム内でのイオン交換及び疎水性滞留を利用する。例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は強アニオン交換及び疎水性滞留を示す可能性があり、又は強カチオン交換及び疎水性滞留を示す可能性がある。
【００３６】
本明細書で使用する用語「クロマトグラフィー」は、液体若しくは気体によって運ばれる化学的混合物が、それらが固定相液体若しくは固相の周囲若しくは上方を流れるにつれて化学実体の示差的分布の結果として複数の成分に分離される方法を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「液体クロマトグラフィー」若しくは「ＬＣ」は、流体が一様に微細物質のカラムを通して、又はキャピラリー路を通って浸透するに従う流体溶液の１つ又はそれ以上の成分の選択的遅滞の方法を意味する。遅滞は、１つ又はそれ以上の固定相とバルク液（即ち、移動相）との間の混合物の、この流体が固定相に対して移動するに従う成分の分布の結果として生じる。「液体クロマトグラフィー」の例には、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又は高スループット液体クロマトグラフィーとして公知であることもある）が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「高性能液体クロマトグラフィー」若しくは「ＨＰＬＣ」（「高圧液体クロマトグラフィー」として公知であることもある）は、移動相を圧力下で固定相、通常は高密度に充填されたカラムに通して推し進めることによって分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「乱流液体クロマトグラフィー」若しくは「ＴＦＬＣ」（高乱流液体クロマトグラフィー若しくは高スループット液体クロマトグラフィーとして公知であることもある）は、分離を実施するための基礎としてカラム充填を通して分析される物質の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を意味する。ＴＦＬＣは、質量分析法による分析に先行して２つの不特定の薬物を含有するサンプルの調製において適用されてきた。例えば、Zimmer et al., J Chromatogr A 854: 23-35 (1999)を参照されたい。さらに、ＴＦＬＣについて詳細に説明している米国特許第５，９６８，３６７号明細書、同第５，９１９，３６８号明細書、同第５，７９５，４６９号明細書及び同第５，７７２，８７４号明細書も参照されたい。当業者であれば、「乱流」を理解している。流体が緩徐及び平滑に流動する場合は、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通して低流速で移動する流体は層流である。層流では、流体の粒子の運動は、概して直線で移動する粒子に従順である。より高速では、水の慣性が流体の摩擦力に勝り、結果として乱流が生じる。不規則な境界と接触していない流体は、摩擦によって緩徐化される、又は不均一な表面によって偏向させられる流れを「追い越す」。流体が乱流として流動する場合は、流れが層流の場合よりも「抗力」を伴って、流体は渦巻きながら流動する。流体の流れが層流又は乱流であるかを決定する際に役立つ多数の参考文献を利用できる（例えば、Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction, P.S. Bernard & J.M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc.,(2000)、An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge University Press (2001)）。
【００４０】
本明細書で使用する用語「ガスクロマトグラフィー」若しくは「ＧＣ」は、サンプル混合物が気化させられ、液体若しくは粒子状固体から構成される固定層を含有するカラムを通って移動するキャリヤガス流（窒素又はヘリウムとして）内に注入され、固定相のための化合物の親和性に従ってその成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを意味する。
【００４１】
本明細書で使用する用語「大粒子カラム」若しくは「抽出カラム」は、約５０μｍより大きい平均粒径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「分析カラム」は、サンプル中で分析物の存在又は量の決定を可能にするために十分なカラムから溶出する材料の分離を実行するために十分なクロマトグラフィープレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。好ましい実施形態では、分析カラムは、直径が約５μｍの粒子を含有する。そのようなカラムは、その後の分析のために精製されたサンプルを得るために保持されていない物質から保持された物質を分離又は抽出するという一般的目的を有する「抽出カラム」とは識別されることが多い。
【００４３】
本明細書で使用する用語「オンライン」及び「インライン」、例えば「オンライン自動法」又は「オンライン抽出」で使用される用語は、オペレータが介入する必要を伴わずに実施される手順を意味する。これとは対照的に、本明細書で使用する用語「オフライン」は、オペレータの手作業による介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプルが沈殿させられ、次に上清がオートサンプラー内に手作業で充填される場合は、沈殿及び充填工程はその後の工程からオフラインである。本方法の様々な実施形態では、１つ又はそれ以上の工程は、オンライン自動法で実施することができる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「質量分析法」若しくは「ＭＳ」は、それらの質量によって化合物を同定するための分析技術を意味する。ＭＳは、濾過し、検出し、及びそれらの質量対電荷比若しくは「ｍ／ｚ」に基づいてイオンを測定する方法を意味する。ＭＳテクノロジーは、一般には（１）荷電化合物を形成するために化合物をイオン化する工程、及び（２）該荷電化合物の分子量を検出して質量対電荷比を計算する工程を含んでいる。化合物は、任意の適切な手段によってイオン化及び検出することができる。「質量分析計」は、一般にはイオン化装置及びイオン検出器を含んでいる。一般に、対象の１つ又はそれ以上の分子がイオン化され、該イオンは引き続いて質量分析器械内に導入され、そこで磁場と電場の組み合わせのために、該イオンは質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路を辿る。例えば、「Mass Spectrometry From Surfaces」と題する米国特許第６，２０４，５００号明細書、「Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry」と題する同第６，１０７，６２３号明細書、「DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry」と題する同第６，２６８，１４４号明細書、「Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes」と題する同第６，１２４，１３７号明細書、Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999, 2: 264-76及びMerchant and Weinberger, Electrophoresis 2000, 21: 1164-67を参照されたい。
【００４５】
本明細書で使用する用語「負のイオンモードで操作する」は、負のイオンが生成されて検出される質量分析法を意味する。本明細書で使用する用語「正のイオンモードで操作する」は、正のイオンが生成されて検出される質量分析法を意味する。
【００４６】
本明細書で使用する用語「イオン化」若しくは「イオン化する工程」は、１つ又はそれ以上の電子単位と同等の正味電荷を有する分析物イオンを生成する方法を意味する。負のイオンは、１つ又はそれ以上の電子単位の正味負電荷を有するイオンであり、一方、正のイオンは１つ又はそれ以上の電子単位の正味正電荷を有するイオンである。
【００４７】
本明細書で使用する用語「電子イオン化」若しくは「ＥＩ」は、気相若しくは蒸気相内の対象の分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と分析物との衝撃は、次に質量分析技術を受けさせることができる分析物イオンを生成する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「化学イオン化」若しくは「ＣＩ」は、試薬ガス（例えば、アンモニア）が電子衝撃に曝露され、分析物イオンが試薬ガスイオンと分析物分子との相互作用によって形成される方法を意味する。
【００４９】
本明細書で使用する用語「高速原子衝撃法」若しくは「ＦＡＢ」は、高エネルギー原子ビーム（Ｘｅ又はＡｒであることが多い）が、非揮発性サンプルに衝撃を与え、該サンプル中に含有される分子を脱離してイオン化する方法を意味する。試験サンプルは、様々な液体マトリックス、例えば、グリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミン中に溶解される。化合物又はサンプルにとって適切なマトリックスの選択は、経験に基づく方法である。
【００５０】
本明細書で使用する用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化法」若しくは「ＭＡＬＤＩ」は、非揮発性サンプルが、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路によって該サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩのためには、サンプルは、分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合される。
【００５１】
本明細書で使用する用語「表面増強レーザー脱離イオン化法」若しくは「ＳＥＬＤＩ」は、非揮発性サンプルが、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路によって該サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照射に曝露される又別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩのためには、サンプルは、通常は１つ又はそれ以上の対象の分析物を優先的に保持する表面に結合される。ＭＡＬＤＩにおけるものと同様に、この方法もイオン化を促進するためにエネルギー吸収材料を使用することができる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「エレクトロスプレーイオン化」若しくは「ＥＳＩ」は、溶液が長さの短いキャピラリーチューブに沿って通過させられ、その端部では正又は負の高電位が印加される方法を意味する。キャピラリーチューブの端部に達した溶液は、溶媒蒸気中の溶液の極めて小さな液滴のジェット又はスプレーに蒸気化（噴霧化）される。この液滴のミストは、凝縮を防止して溶媒を蒸発させるために僅かに加熱される蒸発チャンバを通って流動する。液滴がより小さくなるにつれて電気面電荷密度は、同電荷間の自然反発力がイオン並びに中性分子を遊離させるようになる時点まで増加する。
【００５３】
本明細書で使用する用語「大気圧化学イオン化」若しくは「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩに類似する質量分析法を意味するが、ＡＰＣＩは、大気圧下のプラズマ内で発生するイオン−分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の放電によって維持される。次にイオンは、通常は、１組の差動揚水スキマー段階の使用によって質量分析装置内へ抽出される。向流の乾性及び予熱Ｎ２ガスを使用すると、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、低極性種を分析するためにはＥＳＩより有効な可能性がある。
【００５４】
本明細書で使用する用語「大気圧光イオン化」若しくは「ＡＰＰＩ」は、分子Ｍのイオン化のための機序が分子イオンＭ＋を形成するための光子吸収及び電子放出であるイオン化の形態を意味する。吸収された光子のエネルギーは、通常はイオン化電位より僅かに高いために、分子イオンは解離されにくい。多くの場合に、クロマトグラフィーを必要とせずにサンプルを分析することが可能であるので、時間及び費用を大きく節約することができる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下では、分子イオンはＨを抽出してＭＨ＋を形成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に発生する傾向がある。これは、Ｍ＋及びＭＨ＋の合計が一定であるために、定量正確性に影響を及ぼさない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は通常はＭＨ＋であると観察されるが、非極性化合物、例えばナフタレン又はテストステロンは、通常はＭ＋を形成する。例えば、Robb et al., Anal. Chem. 2000, 72 (15): 3653-3659を参照されたい。
【００５５】
本明細書で使用する用語「誘導結合プラズマ」若しくは「ＩＣＰ」は、サンプルが、ほとんどの元素が霧化及びイオン化されるような十分に高温で不完全イオン化ガスと相互作用する方法を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「脱離」は、表面からの分析物の除去及び／又は分析物の気相内への進入を意味する。レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）は、分析物を含有するサンプルがレーザーパルスによって気相内へ熱により脱離される技術である。レーザーは、金属基板を備える特別製作された９６ウエルプレートの背部に衝突する。レーザーバルスは該基板を加熱し、この熱はサンプルが気相内へ移動するのを誘発する。次に気相サンプルは、イオン化源内へ引き入れられ、そこで気相サンプルは質量分析計内での分析の準備においてイオン化される。ＬＤＴＤを使用する場合は、気相サンプルのイオン化は、当分野において公知の任意の適切な技術、例えばコロナ放電を用いる（例えば、ＡＰＣＩによる）イオン化によって実施することができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「電場脱離」は、非揮発性試験サンプルがイオン化面に配置され、強電場が分析物イオンを生成させるために使用される方法を意味する。
【００５８】
本明細書で使用する用語「選択的イオンモニタリング法」は、比較的に狭い質量範囲内、通常は約１質量単位のイオンだけが検出される質量分析器械のための検出モードである。
【００５９】
本明細書で使用する用語「多重反応モード」は、「選択された反応モニタリング」として公知でありこともあり、前駆体イオン及び１つ又はそれ以上のフラグメントイオンが選択的に検出される質量分析器械のための検出モードである。
【００６０】
本明細書で使用する用語「定量下限（lower limit of quantification、lower limit of quantitation）」若しくは「ＬＬＯＱ」は、測定値が定量的に有意となるポイントを意味する。このＬＯＱでの分析物反応は、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ（％））及び８０％から１２０％の正確性で同定可能であり、個別的及び再現性である。
【００６１】
本明細書で使用する用語「検出限界」若しくは「ＬＯＤ」は、測定値がそれと関連する不確実性より大きいポイントである。ＬＯＤは数値がその測定値と関連する不確実性を超えているポイントであり、ゼロ濃度での平均値のＲＳＤの３倍であると規定されている。
【００６２】
本明細書で使用する、体液サンプル中の分析物の「量」は、一般にサンプルの容積中で検出可能な分析物の質量を反映している絶対値を意味する。しかし、量は、さらに別の分析物の量と比較した相対量も企図している。例えば、サンプル中の分析物の量は、該サンプル中に通常存在する該分析物のコントロール若しくは正常レベルより大きい量であってよい。
【００６３】
本明細書でイオンの質量の測定値を含まない量的測定値と関連して使用する用語「約」は、指示された数値±１０％を意味する。質量分析器械は、特定の分析物の質量を決定する際に僅かに変動することがある。イオンの質量又はイオンの質量／電荷比の状況における用語「約」は、±０．５０原子質量単位を意味する。
【００６４】
上記で記載した本発明の概要は非限定的であり、本発明の他の特徴及び利点は、以下の本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１ＡからＣは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３（内部標準）各々の典型的なクロマトグラムを示した図である。詳細については、実施例３で考察する。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例３において記載した方法によって決定した、血清サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３についての典型的な検量線を示した図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例３において記載した方法によって決定した、血清サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３についての典型的な検量線を示した図である。
【図３】図３は、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３についての変動係数対濃度のプロットを示した図である。詳細については、実施例５で考察する。
【図４】図４は、様々なサンプルマトリックス内でのビタミンＤ３の分析の比較試験の結果を示した図である。詳細については、実施例１１で考察する。
【図５Ａ】図５Ａは、ビタミンＤ２のイオン化についての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、約３９７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、約３７９．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図６Ａ】図６Ａは、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、約４００．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、約３８２．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図７Ａ】図７Ａは、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、約４０３．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、約３８５．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図８Ａ】図８Ａは、ビタミンＤ３のイオン化についての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、約３８５．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、約３６７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図９Ａ】図９Ａは、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、約３８８．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、約３７０．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約３００から４５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、約３９１．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、約３７３．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約１００から４００のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１４で考察する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、約５７２．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、約５７５．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、約５７８．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、約５６０．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、約５６３．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６イオンについての典型的なＱ１スキャンスペクトル（約５００から６２０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、約５６６．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６前駆体イオンのフラグメント化についての典型的な生成物イオンスペクトル（約２５０から３５０のｍ／ｚ範囲をカバーする）を示した図である。詳細については、実施例１５で考察する。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
サンプル中のビタミンＤを測定するための方法について記載する。より詳細には、サンプル中のビタミンＤを検出及び定量するための質量分析法について記載する。本方法は、クックソン型試薬、例えばＰＴＡＤを使用して誘導体化ビタミンＤを生成することができる。しかし一部の方法では誘導体化剤が使用されず、非誘導体化ビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３が質量分析法によって検出される。
【００６７】
本方法は、非誘導体化若しくは誘導体化ビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３の精製を実施するために抽出クロマトグラフィー技術、例えば、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）を質量分析（ＭＳ）の方法と組み合わせて使用することができ、それによってサンプル中のビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３を検出及び定量するための高スループットアッセイシステムを提供する。又は、一部の方法では、抽出クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーがサンプル分析のために必要とされない。これらの方法では、非誘導体化又は誘導体化ビタミンＤ２及び／又はビタミンＤ３は、ＬＤＴＤを用いてイオン化される。好ましい実施形態は、自動ビタミンＤ定量のための大規模臨床研究室において適用するために特に良好に適合する。
【００６８】
本発明の方法において使用するための適切な試験サンプルには、対象の分析物を含有する可能性がある任意の試験サンプルが含まれる。一部の好ましい実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル、即ち、任意の生物学的起源、例えば動物、細胞培養、臓器培養などから得られるサンプルである。特定の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどから入手される。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくはヒトの男性又は女性である。好ましいサンプルは、体液、例えば血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液若しくは組織サンプル、好ましくは血漿（ＥＤＴＡ及びヘパリン血漿を含む）及び血清、最も好ましくは血清を含んでいる。そのようなサンプルは、例えば、患者、つまり生きている、男性又は女性の、疾患又は状態の診断、予後診断、若しくは治療を受けるために医療環境に現れたヒトから入手できる。
【００６９】
本発明は、ビタミンＤ定量アッセイのためのキットも企図している。ビタミンＤ定量アッセイのためのキットは、本明細書に提供した組成物を含むキットを含むことができる。例えば、キットは、充填材料及び測定量のクックソン型試薬及び同位体標識された内部標準を少なくとも１回のアッセイのために十分量で含むことができる。通常は、本キットは、さらにビタミンＤ定量アッセイにおいて使用するための包装された試薬を使用するための（例えば、紙又は電子媒体に含有される）有形で記録された取扱説明書も含むことになる。
【００７０】
本発明の実施形態において使用するための較正及びＱＣプールは、好ましくは予定されるサンプルマトリックスに類似するマトリックスを使用して調製される。
【００７１】
質量分析法による分析のためのサンプル調製
質量分析法による分析のための調製において、ビタミンＤは、サンプル（例えば、タンパク質）中の１つ又はそれ以上の他の成分と比較して、例えば、液体クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和性分離を含む親和性分離法、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のいずれかの組み合わせなどを含む当分野において公知の様々な方法によって濃縮することができる。
【００７２】
タンパク質沈殿法は、試験サンプル、特に生物学的試験サンプル、例えば血清又は血漿を調製する１つの方法である。タンパク質精製法は、当分野において周知であり、例えば、Polson et al., Journal of Chromatography B 2003, 785: 263-275は、本発明の方法において使用するために適切なタンパク質沈殿法について記載している。タンパク質沈殿法は、サンプルから大部分のタンパク質を除去して上清中にビタミンＤを残すために使用できる。サンプルは、遠心して液体上清を沈殿したタンパク質から分離することができる。又は、サンプルは、濾過して沈殿したタンパク質を除去することができる。次に、残っている上清若しくは濾液は、質量分析法による分析に直接に、又は、液体クロマトグラフィー及びその後の質量分析法による分析にかけることができる。特定の実施形態では、サンプル、例えば血漿若しくは血清は、ハイブリッドタンパク質沈殿／液−液抽出法によって精製することができる。これらの実施形態では、サンプルは、メタノール、酢酸エチル及び水と混合し、生じた混合液はボルテックスミキサーにかけて遠心させる。生じた上清は取り出し、完全に乾燥させ、アセトニトリル中で再構成される。次に、精製されたビタミンＤは、任意のクックソン型試薬、好ましくはＰＴＡＤ又はその同位体標識された変種を用いて誘導体化することができる。
【００７３】
質量分析法の前に使用できるサンプル精製の又別の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的緩徐な層流技術に依存している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム充填に依存しており、このとき該カラムを通るサンプルの層流が該サンプルから対象の分析物を分離するための基礎である。当業者であれば、そのようなカラム内での分離が拡散方法であることを理解し、ＨＰＬＣを含むＬＣ、誘導体化ビタミンＤと共に使用するために適する器械及びカラムを選択することができる。クロマトグラフィーカラムは、通常は、化学成分の分離（即ち、分別）を促進するための媒質（即ち、充填材料）を含んでいる。媒質は微細粒子を含むことができ、又は多孔性チャネルを備えるモノリシック材料を含むことができる。媒質の表面は、通常は、化学成分の分離を促進するために様々な化学成分と相互作用する接合面を含んでいる。１つの適切な接合面は、疎水性接合面、例えばアルキル接合面、シアノ接合面、又は高純度シリカ表面である。アルキル接合面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２、又はＣ−１８接合アルキル基を含むことができる。好ましい実施形態では、カラムは高純度シリカカラム（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ａｑカラム）である。クロマトグラフィーカラムは、サンプルを受け入れるための入口ポート及び分別されたサンプルを含む流出物を放出するための出口ポートを含んでいる。サンプルは、入口ポートへ直接に、又は抽出カラム、例えばオンラインＳＰＥカートリッジ若しくはＴＦＬＣ抽出カラムから供給することができる。
【００７４】
１つの実施形態では、サンプルは入口ポートでＬＣカラムへ提供し、溶媒若しくは溶媒混合液と共に溶出させ、出口ポートで放出することができる。対象の分析物を溶出するために様々な溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード又は多型的（即ち、混合型）モードを用いて実施することができる。クロマトグラフィー中、材料の分離は変量、例えば溶離液（「移動相」としても公知である）、溶出モード、勾配条件、温度などの選択によって実施できる。
【００７５】
特定の実施形態では、分析物は、サンプルをカラムへ、対象の分析物がカラム充填材料によって可逆的に保持されるが１つ又はそれ以上の材料が保持されない条件下で適用することによって精製できる。これらの実施形態では、対象の分析物がカラムによって保持される第１移動相条件を使用することができ、引き続いて、保持されなかった材料が洗い流されると保持された材料をカラムから除去するために第２移動層条件を使用することができる。又は、分析物は、サンプルをカラムへ、対象の分析物が１つ又はそれ以上の他の材料と比較して示差的速度で溶出する移動相条件下で適用することによって精製できる。そのような手順は、対象の１つ又はそれ以上の分析物の量を該サンプルの１つ又はそれ以上の他の成分と比較して濃縮することができる。
【００７６】
１つの好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、アルキル接合分析カラムクロマトグラフィーシステムを用いて実施される。特定の好ましい実施形態では、高純度シリカカラム（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ａｑカラム）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＬＣ及び／又はＴＦＬＣは、移動相ＡとしてＨＰＬＣグレードの水及び移動相ＢとしてＨＰＬＣグレードのエタノールを使用して実施される。
【００７７】
バルブ及び連結配管を注意深く選択することによって、２つ又はそれ以上のクロマトグラフィーカラムを材料がいかなる手作業の工程も全く必要とせずに１つのカラムから次のカラムへ通過するように必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態では、バルブ及び配管の選択は、必要な工程を実施するために前もってプログラムされたコンピュータによって制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムは、さらにオンライン方式で検出システム、例えばＭＳシステムへ接続される。従って、オペレータは、サンプルのトレイをオートサンプラーへ配置することができ、残りの作業はコンピュータ制御下で実施され、結果として選択された全サンプルの精製及び分析が行われる。
【００７８】
一部の実施形態では、抽出カラムは、質量分析法の前にビタミンＤ代謝産物を精製するために使用できる。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉する抽出カラムを用いて抽出し、次にイオン化の前に第２抽出カラム上又は分析用ＨＰＬＣカラム上で溶出させてクロマトグラフィーにかけることができる。例えば、ＴＦＬＣ抽出カラムを用いたサンプル抽出は、粒径の大きな（５０μｍ）充填カラムを用いて実施することができる。このカラムから溶出されたサンプルは、次に質量分析法の前にさらに精製するためにＨＰＬＣ分析カラムへ移すことができる。これらのクロマトグラフィー法に含まれる工程は自動方式で連結することができるので、分析物の精製中にオペレータが関与する要件は最小限に抑えることができる。この特徴は、時間及び費用の節約を生じさせ、オペレータが操作を間違える可能性を排除することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、タンパク質沈殿法は、メタノールタンパク質沈殿法及び血清からの酢酸エチル／水による抽出を含む複合型タンパク質沈降法／液−液抽出法を用いて実施される。結果として生じるビタミンＤ代謝産物は、抽出カラムにかける前に誘導体化することができる。好ましくは、複合型タンパク質沈殿法／液−液抽出法及び抽出カラムはオンライン方式で接続される。好ましい実施形態では、抽出カラムは、Ｃ−８抽出カラム、例えばＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃ８ＸＬオンライン抽出カラム（粒径：５０μｍ、０．５×５０ｍｍ）又は同等物である。次に抽出カラムからの溶離液は、質量分析法による分析の前に、分析用ＬＣカラム、例えばＨＰＬＣカラムへオンライン方式で適用することができる。これらのクロマトグラフィー法に含まれる工程は自動方式で連結することができるので、分析物の精製中にオペレータが関与する要件は最小限に抑えることができる。この特徴は、時間及び費用の節約を生じさせ、オペレータが操作を間違える可能性を排除することができる。
【００８０】
質量分析法による検出及び定量
様々な実施形態では、誘導体化ビタミンＤは、当業者には公知の任意の方法によってイオン化することができる。質量分析法は、分別されたサンプルをイオン化し、その後の分析のために荷電分子を作り出すためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電場イオン化、電場脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）及び粒子ビームイオン化によって実施することができる。当業者であれば、イオン化法の選択は、測定対象の分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、正対負のモードの選択などに基づいて決定することができることを理解する。
【００８１】
誘導体化ビタミンＤは、正又は負のモードでイオン化できる。好ましい実施形態では、誘導体化ビタミンＤは、正イオンモードでＡＰＣＩ又はＬＤＴＤを用いてイオン化される。
【００８２】
質量分析法の技術では、一般に、サンプルがイオン化された後、それにより作り出された正又は負の荷電イオンを分析して質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比を決定するために適するアナライザーには、四重極アナライザー、イオントラップアナライザー及び飛行時間アナライザーが含まれる。典型的なイオントラップ法は、Bartolucci, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14: 967-73に記載されている。
【００８３】
イオンは、幾つかの検出モードを使用して検出することができる。例えば、選択されたイオンは、即ち選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を使用して検出でき、又は衝突誘起解離若しくは自然損失の結果として生じた質量変化は、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）によって監視することができる。好ましくは、質量対電荷比は、四重極アナライザーを使用して決定される。例えば、「四重極」若しくは「四重極イオントラップ」機器では、振動無線周波数電磁場内のイオンは電極間に印加されたＤＣ電位に比例する力、ＲＦ信号の振幅及び質量／電荷比を経験する。電圧及び振幅は、特定質量／電荷比を有するイオンだけが四重極の全長を移動し、他の全てのイオンは偏向させられるように選択することができる。従って、四重極機器は、該機器内に注入されたイオンにとっての「質量フィルター」及び「質量検出器」の両方として機能できる。
【００８４】
ＭＳ技術の解像度は、「タンデム質量分析法」若しくは「ＭＳ／ＭＳ」を使用することによって強化することができる。この技術では、対象の分子から生成された前駆体イオン（親イオンとも呼ばれる）はＭＳ機器内で濾過することができ、該前駆体イオンは引き続いて第２ＭＳ法において分析される１つ又はそれ以上のフラグメントイオン（娘イオン又は生成物イオンとも呼ばれる）を産生するためにフラグメント化される。前駆体イオンの注意深い選択によって、特定の分析物によって生成されたイオンだけがフラグメント化チャンバへ通過させられ、そこでの不活性ガスの原子との衝突がフラグメントイオンを生成する。前駆体イオン及びフラグメントイオンはどちらも所定セットのイオン化／フラグメント化条件下で反復方法により生成されるので、ＭＳ／ＭＳ技術は極めて強力な分析用ツールを提供することができる。例えば、濾過／フラグメント化の組み合わせは、干渉物質を排除するために使用することができ、複雑なサンプル中、例えば生物学的サンプル中で特に有用な可能性がある。
【００８５】
タンデム質量分析器械を操作する又別のモードには、生成物イオンスキャニング及び前駆体イオンスキャニングが含まれる。これらの操作モードの説明については、例えば、E. Michael Thurman, et al., Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination of Pesticide Residues, Chapter 8 (Amadeo R. Fernandez-Alba, ed., Elsevier 2005) (387)を参照されたい。
【００８６】
分析物アッセイの結果は、当分野において公知の数多くの方法によって、原サンプル中の該分析物の量と関連付けることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメータが注意深く制御されていることを前提にすると、所定のイオンの相対存在量は、相対存在量を原分子の絶対量へ変換する表と比較することができる。又は、サンプルと共に外部標準をランし、それらの標準から生成されたイオンに基づいて標準曲線を構築することができる。そのような標準曲線を使用すると、所定のイオンの相対存在量を原分子の絶対量へ変換することができる。特定の好ましい実施形態では、内部標準を使用して、ビタミンＤの量を計算するための標準曲線を作成する。そのような標準曲線を作成及び使用する方法は当分野において周知であり、当業者であれば適切な内部標準を選択することができる。例えば、好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上の同位体標識されたビタミンＤ（例えば、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３）を内部標準として使用できる。イオンの量を原分子の量へ関連付けるための他の数多くの方法は、当業者には周知である。
【００８７】
本方法の１つ又はそれ以上の工程は、自動機械を使用して実施することができる。特定の実施形態では、１つ又はそれ以上の精製工程はオンラインで実施され、より好ましくは精製及び質量分析法工程の全部をオンライン方式で実施することができる。
【００８８】
特定の実施形態、例えばＭＳ／ＭＳでは、前駆体イオンがその後のフラグメント化のために単離され、衝突活性化解離（ＣＡＤ）がその後の検出のためのフラグメントイオンを生成するために使用されることが多い。ＣＡＤでは、前駆体イオンは不活性ガスとの衝突を通してエネルギーを獲得し、引き続いて「単分子分解」と呼ばれる方法によってフラグメント化する。前駆体イオン内には、該イオン内の特定の結合を増加した振動エネルギーに起因して崩壊できるように十分なエネルギーが堆積させられなければならない。
【００８９】
一部の好ましい実施形態では、サンプル中のビタミンＤは、以下のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出及び／又は定量される。サンプルは、最初にタンパク質沈殿法又は複合型タンパク質沈殿／液−液抽出法によって精製される。次に、精製されたサンプル中のビタミンＤは、場合によりクックソン型試薬、例えばＰＴＡＤを用いて誘導体化される。次に、精製されたサンプルは、液体クロマトグラフィーに、好ましくは抽出カラム（例えば、ＴＦＬＣカラム）、次の分析カラム（例えば、ＨＰＬＣカラム）上でかけられる。クロマトグラフィーカラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーのネブライザー界面に進入し、及び溶媒／分析物混合液は、界面の加熱荷電チュービング内で蒸気に変換られる。溶媒中に含有される分析物（例えば、誘導体化又は非誘導体化ビタミンＤ）は、溶媒／分析物混合液へ大きな電圧を印加することによってイオン化される。分析物が界面の荷電チュービングから出て行くにつれて、溶媒／分析物混合液は霧状になり、溶媒は蒸発し、分析物イオンが残る。分析物イオン、例えば前駆体イオンは、器械の開口部を通過して第１四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてイオンの選択（即ち、Ｑ１及びＱ３における「前駆体」イオン及び「フラグメント」イオン各々の選択）を可能にする。四重極２（Ｑ２）は、イオンがフラグメント化される衝突セルである。質量分析計の第１四重極（Ｑ１）は、対象の質量対電荷比を備えるイオンを選択する。正しい質量／電荷比を備える前駆体イオンは衝突チャンバ（Ｑ２）を通過させられるが、一方、任意の他の質量／電荷比を備える望ましくないイオンは該四重極の側面に衝突し、排除される。Ｑ２に進入する前駆体イオンは中性アルゴンガス分子及びフラグメントと衝突する。生成されたフラグメントイオンは四重極３（Ｑ３）内に通過させられ、そこで誘導体化又は非誘導体化ビタミンＤフラグメントイオンが選択され、その他のイオンが排除される。
【００９０】
本方法は、正又は負いずれかのイオンモード、好ましくは正のイオンモードで実施されるＭＳ／ＭＳを含むことができる。当分野において周知の標準方法を用いると、当業者であれば、四重極３（Ｑ３）において選択するために使用できる誘導体化ビタミンＤの特定前駆体イオンの１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを同定することができる。
【００９１】
イオンが検出器と衝突するにつれて、イオンはデジタル信号に変換される電子パルスを生成する。獲得されたデータは、コンピュータへ中継され、コンピュータは収集されたイオン対時間の計数をプロットする。結果として生じる質量クロマトグラムは、伝統的ＨＰＬＣ−ＭＳ法において生成されたクロマトグラムに類似する。特定イオンに対応するピーク下の面積、又はそのようなピークの振幅を測定し、対象の分析物の量に関連付けることができる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆体イオンについての曲線下面積、又はピークの振幅は、ビタミンＤの量を決定するために測定される。上述したように、所定のイオンの相対存在量は、内部分子標準の１つ又はそれ以上のイオンのピークに基づいて標準検量線を使用して原分析物の絶対量に変換することができる。
[実施例］
【実施例１】
【００９２】
複合型タンパク質沈殿法／液−液抽出法及びクックソン型誘導体化
以下の自動複合型タンパク質沈殿法／液−液抽出法は、患者血清サンプルを対象に実施した。ゲル−バリヤ血清（即ち、血清分離剤チューブ内に収集された血清）並びにＥＤＴＡ血漿及びヘパリン血漿も、このアッセイのために許容されることが確定されている。
【００９３】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製Ｊａｎｕｓ ロボット及びＴｏｍＴｅｃ社製Ｑｕａｄｒａ Ｔｏｗｅｒ ロボットを使用して以下の手順を自動化した。各サンプルについて、５０μＬの血清を９６ウエルプレートのウエルに加えた。次に２５μＬの内部標準カクテル（同位体標識されたビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を含有する）を各ウエルに加え、プレートをボルテックスミキサーにかけた。次に７５μＬのメタノールを加え、さらに追加してボルテックスミキサーにかけた。次に３００μＬの酢酸エチル及び７５μＬの水を加え、追加してボルテックスミキサーにかけ、遠心し、生じた上清を新しい９６ウエルプレートに移した。
【００９４】
第２の９６ウエルプレート内に移した液体は、流動する窒素ガスマニホールド下で完全に乾燥させた。誘導体化は、各ウエルにアセトニトリル中のクックソン型誘導体化剤ＰＴＡＤの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１００μＬを加えることによって実施した。誘導体化反応をおよそ１時間に渡り進行させ、反応混合液に水１００μＬを加えることによってクエンチさせた。
【実施例２】
【００９５】
液体クロマトグラフィーを用いたビタミンＤの抽出
サンプル注入は、Ａｒｉａ ＯＳ Ｖ１．５．１若しくはそれ以降のソフトウエアを使用してＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｒｉａ ＴＸ−４ ＴＦＬＣシステムを用いて実施した。
【００９６】
ＴＦＬＣシステムは、上記で調製したサンプルのアリコートを大粒子が充填されたＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃ８ＸＬオンライン抽出カラム（粒径：５０μｍ、００５×５０ｍｍ、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内へ自動的に注入した。サンプルは、抽出カラム内で乱流を作り出すために高流速で装填した。この乱流は、カラム内での誘導体化ビタミンＤの大粒子への最適な結合並びに廃棄するための過剰な誘導体化試薬及び破片の通過を保証した。
【００９７】
装填後、サンプルは、水／エタノール溶出勾配を用いて、分析カラムＴｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ａｑ分析カラム（粒径：５μｍ、５０×２．１ｍｍ）へ溶出させた。ビタミンＤをサンプル中に含有される他の分析物から分離するために、ＨＰＬＣ勾配を分析カラムへ適用した。移動相Ａは水であり、移動相Ｂはエタノールであった。ＨＰＬＣ勾配は、３５％有機勾配で開始し、およそ６５秒間で９９％へ増加させた。
【実施例３】
【００９８】
誘導体化ビタミンＤのＭＳ／ＭＳによる検出及び定量
ＭＳ／ＭＳは、上記で生成されたサンプルを対象にＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を使用して実施した。全部がＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製である以下のソフトウエアプログラムを本明細書に記載した実施例において使用した：Ｑｕａｎｔｕｍ Ｔｕｎｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｖ１．５又はそれ以降、Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｖ２．０７又はそれ以降、ＬＣＱｕａｎ Ｖ２．５６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社）又はそれ以降及びＡＲＩＡ ＯＳ ｖ１．５．１（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はそれ以降。分析カラムから出た液体溶媒／分析物はＭＳ／ＭＳアナライザーのネブライザー界面へ流動した。溶媒／分析物混合液は、界面のチュービング内で蒸気に変換された。噴霧化された溶媒の分析物は、ＡＰＣＩによってイオン化された。
【００９９】
イオンは、質量対電荷比５７２．３±０．５のｍ／ｚ及び５６０．３±０．５のｍ／ｚを各々備えるビタミンＤ２及びビタミンＤ３前駆体イオンを選択する第１四重極（Ｑ１）を通過した。四重極２（Ｑ２）に進入したイオンはアルゴンガスと衝突してイオンフラグメントを生成し、これらのイオンフラグメントはその後の選択のために四重極３（Ｑ３）へ通過させられた。質量分析計の設定は表１に示す。同時に、同位体希釈質量分析法を用いる同一方法を内部標準であるビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を用いて実施した。正極性及び指示された衝突エネルギーでのバリデーション中の検出及び定量のために使用した質量変化は表２に示す。
【表１】
【表２】
【０１００】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３（内部標準）の典型的なクロマトグラムは、各々図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す。
【０１０１】
血清試料中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３の決定についての典型的な検量線は、各々図２Ａ及び２Ｂに示す。
【実施例４】
【０１０２】
ＭＳ／ＭＳによる誘導体化ビタミンＤ検出についての反応の直線性
直線性は、実施例１から３の方法によって、ビタミンＤ２又はビタミンＤ３いずれかの高内因性濃度を備える血清の４つのプールを希釈し、７５％、５０％及び２５％の希釈液を２回ずつ分析することによって決定した。試料を平均回収率１０２％で１：４で希釈すると、８５％から１１５％ＣＶの精度限界内で２から２４０ｎｇ／ｍＬの臨床報告可能範囲（ＣＲＲ）が可能になる。これらの試験からの測定値及び回収率は表３に示す。
【表３】
【実施例５】
【０１０３】
分析感度：定量下限（ＬＬＯＱ）及び検出限界（ＬＯＤ）
定量下限（ＬＬＯＱ）は、測定値が定量的に有意となるポイントである。このＬＬＯＱでの分析物の反応は、２０％より大きい精度（即ち、変動係数（ＣＶ）)及び８０％から１２０％の正確性を備えて同定可能、個別的及び再現性である。ＬＬＯＱは、公知の分析物濃度（２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ及び６０ｎｇ／ｍＬ）を備えるサンプルを実施例１から３の方法によって４例ずつ５回アッセイし、再現性を評価することによって決定した。収集されたデータの分析は、２ｎｇ／ｍＬ未満の濃度を備えるサンプルが両方の分析物について２０％未満のＣＶを産生することを示している。従って、各分析物のＬＬＯＱは、＜２ｎｇ／ｍＬであると決定された。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３のＬＬＯＱを決定するために生成されたデータは、各々表４及び５に示す。両方の分析物に対するＣＶ対濃度のグラフ表示は図３に示す。
【表４】
【表５】
【０１０４】
検出限界（ＬＯＤ）は、測定値がそれに関連する不確定性より大きく、ゼロ濃度から４標準偏差（ＳＤ）として適宜に規定されているポイントである。選択性は、分析法がサンプル中の他の成分の存在下で分析物を識別して定量する能力である。ブランクは、実施例１から３の方法に従って２０回ずつ分析され、結果として生じた面積比を統計学的に分析してビタミンＤ２及びビタミンＤ３の両方についてのＬＯＤが０．４ｎｇ／ｍＬであると決定された。各分析物についてのＬＯＤを決定するために収集したデータは表６に示す。
【表６】
【実施例６】
【０１０５】
検出の特異性
数例のサンプルはビタミンＤ２、ビタミンＤ３及びスパイク量の潜在的干渉種（ビタミンＤ代謝産物及び関連化合物を含む）を用いて調製し、実施例１から３の方法に従って分析した。干渉可能性について試験された化合物は表７に列挙する。試験された化合物はいずれも、実施例１から３の方法に従うと、ビタミンＤ２又はビタミンＤ３の検出との交差反応性を示さなかった。
【表７】
【実施例７】
【０１０６】
ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の定量の再現性
アッセイ間変動はアッセイ内のサンプルの再現性であると規定されており、実施例１から３の方法に従って３つのＱＣプール各々からのサンプルを２０回ずつアッセイすることによって決定した。これらの分析から収集したデータは、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３各々について表８及び９に示す。ＱＣプール内の分析物の濃度は、ビタミンＤ２については６．６ｎｇ／ｍＬ、２０．６ｎｇ／ｍＬ及び５２．６ｎｇ／ｍＬ、ビタミンＤ３については４．９ｎｇ／ｍＬ、２０．５ｎｇ／ｍＬ及び４８．６ｎｇ／ｍＬであると決定された。結果について実施した統計学的検定は、３つのＱＣプールに関してビタミンＤ２については５．１％、４．６％及び３．９％、並びにビタミンＤ３については６．４％、４．０％及び４．５％の再現性を生じた。
【表８】
【表９】
【０１０７】
アッセイ間変動は、アッセイ間のサンプルの再現性（ＣＶ）であると規定されている。実施例１から３の方法に従って５回のアッセイに渡って評価したアッセイの報告可能範囲に及ぶ３つのＱＣプールを使用して、これらのプールについてのアッセイ間変動（ＣＶ）をビタミンＤ２及びビタミンＤ３について決定した。ビタミンＤ２については、ＣＶは各々６．５ｎｇ／ｍＬ、２１．１ｎｇ／ｍＬ及び５０．５ｎｇ／ｍＬの平均濃度を用いて６．７％、５．６％及び４．０％であると決定された。ビタミンＤ３については、ＣＶは各々４．７ｎｇ／ｍＬ、２０．８ｎｇ／ｍＬ及び４６．８ｎｇ／ｍＬの平均濃度を用いて６．５％、５．９％及び４．２％であると決定された。これらの分析から収集したデータは、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３について各々表１０及び１１に示す。全プールは、≦１５％ ＣＶの許容される再現性要件を満たした。
【表１０】
【表１１】
【実施例８】
【０１０８】
ビタミンＤ２を定量するための方法相関試験
実施例１から３の方法に従ってビタミンＤ２を定量するための方法相関試験は、本明細書に記載した広範囲に及ぶオフライン抽出を用いるタンデム質量分析法に従って分析した２０例の分割サンプルを比較し、その後に紫外線検出を用いるＨＰＬＣを行うことによって実施した。試料は、各方法について１回ずつ分析した。データは、線形及びデミング回帰によって分析した。相関分析は表１２に要約する。
【表１２】
【実施例９】
【０１０９】
干渉試験
溶血干渉：実施例１から３に記載したアッセイにおける溶血の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にヘモグロビンをスパイクすることによって評価した。新鮮血液サンプルを遠心して濃縮赤血球を産生した。血球を脱イオン水中で再構成し、細胞溶解を達成するために冷凍した。次にこの粗ヘモグロビン溶液をプール内へスパイクすると、軽度（１００ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（５００ｍｇ／ｄＬ）に溶血したサンプルが生成された。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、コントロールプールの結果と比較し、相違率（％）を計算した。データは、ヘモグロビンスパイクがいずれも、いずれの分析物に対してもコントロールと１５％を超えて相違しなかったことを証明している。このため、軽度から中等度の溶血試料は許容される。生データについては表１３を参照されたい（相違率（％）＝（スパイク−非スパイク）／非スパイク×１００％）。
【表１３】
【０１１０】
黄疸干渉：実施例１から３に記載したアッセイにおける黄疸の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にビリルビンをスパイクすることによって評価した。次にビリルビンの濃縮溶液をプール内へスパイクして、軽度（１０ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（５０ｍｇ／ｄＬ）の黄疸性サンプルを生成した。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、結果を非黄疸性プールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も黄疸による影響を受けないことを証明している（全数値が８５から１１５％の許容される正確性範囲内にある）。このため、黄疸性試料は許容される。生データについては表１４を参照されたい（相違率（％）＝（スパイク−非スパイク）／非スパイク×１００％）。
【表１４】
【０１１１】
脂血症干渉：実施例１から３に記載したアッセイにおける脂血症の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にブタ脳抽出物をスパイクすることによって評価した。粉末状脂質サンプル（Ａｖａｎｔｉ社製極性脂質）を各プール内に溶解させ、軽度（４００ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（２０００ｍｇ／ｄＬ）の脂血症試料を生成した。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、結果をコントロールプールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も脂血症による影響を受けないことを証明している（全数値が８５から１１５％の許容される正確性範囲内にある）。生データについては表１５を参照されたい（相違率（％）＝（スパイク−非スパイク）／非スパイク×１００％）。
【表１５】
【０１１２】
実施例１から３に記載したアッセイにおける脂血症の作用は、上昇したビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含有する血清プール中にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄエマルジョンをスパイクすることによって評価した。血清プールに、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（２０％エマルジョン）を加えて、軽度（４００ｍｇ／ｄＬ）及び中等度（２０００ｍｇ／ｄＬ）脂血症試料を生成した。試料は、実施例１から３の方法に従って２回ずつ分析し、結果をコントロールプールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も脂血症による影響を受けないことを証明している（全数値が８５から１１５％の許容される正確性範囲内にある）。生データについては表１６を参照されたい。
【表１６】
【０１１３】
ブタ脳抽出物及びＩｎｔｒａｌｉｐｉｄを使用した２つの脂血症実験に基づいて、脂血症試料は許容される。
【実施例１０】
【０１１４】
試料タイプの試験
試料は、１０種の起源から４つの異なるＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）容器内に収集した。使用したＶａｃｕｔａｉｎｅｒは、Ｒｅｄ−Ｔｏｐ（シリコンコーティング血清用チューブ）、ＳＳＴ（ゲル−バリヤ血清を生じさせる血清分離剤チューブ）、ＥＤＴＡチューブ及びヘパリンナトリウムチューブであった。
【０１１５】
これらの４０例のサンプルは、実施例１から３の方法に従って栄養的ビタミンＤ３について分析した。比較結果は、図４に提示する。データは、全４種のサンプルタイプが分析のために適合することを証明している。
【実施例１１】
【０１１６】
ビタミンＤ３についてのルーチン範囲の証明
患者１４０例由来の血清試料は、ビタミンＤ３を定量するために実施例１から３に記載した方法に従って分析した。結果の範囲は＜２ｎｇ／ｍＬから約６３ｎｇ／ｍＬのビタミンＤ３に及び、結果の９５％は＜２ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの範囲内に含まれた。これらの分析の結果は表１７に提示する。
【表１７】
【実施例１２】
【０１１７】
回収試験
混合回収率試験は、自然に上昇したレベルの２５−ヒドロキシビタミンＤ２若しくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３を備える試料の分析によって実施したので、一部の内因性循環中ビタミンＤ２又はビタミンＤ３も有していた。本試験のためには、６対の試料を選択した。各対の試料（一般的には試料Ａ及び試料Ｂと呼ぶ）から、５例のサンプルを調製し、実施例１から３の方法に従って４回ずつ分析した。これらのサンプルは、１００％ Ａ、８０％ Ａ−２０％ Ｂ、５０％ Ａ−５０％ Ｂ、２０％ Ａ−８０％ Ｂ、及び１００％ Ｂに対応した。回収率試験の結果は表１８及び１９に提示する。
【表１８】
【表１９】
【実施例１３】
【０１１８】
ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のＭＳ／ＭＳ分析からの典型的なスペクトル
ビタミンＤ２、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のタンデム質量分析法による分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図５Ａ、６Ａ及び７Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。分析物は、上述したようにＡＰＣＩによってイオン化した。スペクトルは、約３００から４５０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１１９】
ビタミンＤ２、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々についての２つの異なる前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図５ＢからＣ、６ＢからＣ及び７ＢからＣに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２０に示す。
【０１２０】
ビタミンＤ２を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３９７．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３７９．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５８．９のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約４００．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１４７．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３８２．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約３１２．２のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約４０３．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．１のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３８５．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図５ＢからＣ、６ＢからＣ及び７ＢからＣにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図５ＢからＣ、６ＢからＣ及び７ＢからＣに示されたイオンから選択することができる。例えば、約３９７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約１４６．９、１３３．１及び１２１．０のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。約３７９．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化によって生成された典型的な追加の生成物イオンには、約２８３．２、１８７．３及び１７５．２のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２０】
【０１２１】
ビタミンＤ３、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のタンデム質量分析法による分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図８Ａ、９Ａ及び１０Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物の導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。スペクトルは、約３００から４５０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１２２】
ビタミンＤ３、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々についての２つの異なる前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図８ＢからＣ、９ＢからＣ及び１０ＢからＣに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２１に示す。
【０１２３】
ビタミンＤ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３８５．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１４７．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３６７．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３８８．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１４７．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３７０．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１６２．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約３９１．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．１のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約３７３．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約１５９．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図８ＢからＣ、９ＢからＣ及び１０ＢからＣにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図８ＢからＣ、９ＢからＣ及び１０ＢからＣに示されたイオンから選択することができる。例えば、約３８５．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約１５９．０、１３３．１及び１０７．１のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。約３６７．２のｍ／ｚを備えるビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化によって生成された典型的な追加の生成物イオンには、約１７２．９、１４５．０及び１１９．１のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２１】
【実施例１４】
【０１２４】
ＰＴＡＤ誘導体化ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のＭＳ／ＭＳ分析からの典型的なスペクトル
ビタミンＤ２、ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、ビタミンＤ３、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のＰＴＡＤ誘導体は、各分析物のストック溶液のアリコートをアセトニトリル中のＰＴＡＤで処理することによって調製した。誘導体化反応はおよそ１時間に渡り進行させ、反応混合液に水を加えることによってクエンチさせた。次に誘導体化分析物は、上記の実施例２から３で説明した手順に従って分析した。
【０１２５】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を含有するサンプルの分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図１１Ａ、１２Ａ及び１３Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ（商標）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。分析物は、上述したようにＡＰＣＩによってイオン化した。スペクトルは、約５００から６２０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１２６】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々について前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図１１Ｂ、１２Ｂ及び１３Ｂに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２２に示す。
【０１２７】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５７２．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９７．９のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５７５．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約３０１．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５７８．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９７．９のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図１１Ｂ、１２Ｂ及び１３Ｂにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図１１Ｂ、１２Ｂ及び１３Ｂに示されたイオンから選択することができる。例えば、約５７２．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約２８０．１のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２２】
【０１２８】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を含有するサンプルの分析からの典型的なＱ１スキャンスペクトルは、各々図１４Ａ、１５Ａ及び１６Ａに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、８００μＬ／分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％の水を分析物導入の上流でＨＰＬＣカラムに通過させることによってシミュレーションした。スペクトルは、約５００から６２０のｍ／ｚ範囲に渡ってＱ１をスキャンすることによって収集した。
【０１２９】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の各々についての前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図１４Ｂ、１５Ｂ及び１６Ｂに示す。Ｑ１において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表２３に示す。
【０１３０】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５６０．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９８．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５６３．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約３０１．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６を定量するための典型的なＭＲＭ変化には、約５６６．２のｍ／ｚを備える前駆体イオンから約２９８．０のｍ／ｚを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図１４Ｂ、１５Ｂ及び１６Ｂにおける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又は増強するために、図１４Ｂ、１５Ｂ及び１６Ｂに示されたイオンから選択することができる。例えば、約５６０．２のｍ／ｚを備えるＰＴＡＤ−ビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約２８０．０のｍ／ｚを備えるイオンが含まれる。
【表２３】
【０１３１】
本明細書で言及又は引用した論文、特許及び特許出願、並びに他の全ての文献及び電子的に入手できる情報の内容は、各個別刊行物が参照により組み入れられると特別及び個別に指示された場合と同程度まで全体として参照により組み入れられる。出願人らは、いずれかのそのような論文、特許、特許出願、又は他の物理的及び電子的文献からのありとあらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み入れる権利を留保する。
【０１３２】
本明細書に具体的に記載した方法は、本明細書に特別にではなく開示したいずれかの要素、限度の非存在下で適切に実施することができる。従って例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、拡張的に、及び制限なく読まれるべきである。さらに、本明細書で使用した用語及び表現は、制限するためではなく説明の用語として使用されていて、そのような用語及び表現の使用においては図示及び記載した特徴又はそれらの部分のあらゆる同等物を排除することは意図されていない。様々な修飾が本明細書で要求した本発明の範囲内において可能であることが認識されている。従って、本発明を好ましい実施形態及び任意の特徴によって詳細に開示してきたが、本明細書で開示したその中で実施される本発明の修飾及び変形は当業者であれば用いることができること、及びそのような修飾及び変形は本発明の範囲内に含まれると見なされることを理解されたい。
【０１３３】
本発明を本明細書において幅広く一般的に記載してきた。一般的開示に含まれるより狭い種及び亜属分類の各々も本方法の一部を形成する。これには、切除材料が本明細書に特異的に列挙されているか否かとは無関係に、属からいずれかの主題を取り除く条件又は消極的限定を備える本方法の一般的説明が含まれる。
【０１３４】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本方法の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合は、当業者であれば、本発明がマーカッシュ群の任意の個別構成員又は構成員の部分群によっても記載されることを理解する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のビタミンＤ２の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
（ｉ）サンプル由来のビタミンＤ２を３９７．２±０．５又は３７９．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上の前記イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ２イオンの存在を前記サンプル中のビタミンＤ２の存在と関連付ける工程
を含み、
ここで、前記フラグメント化前駆体イオンが３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが１５９．０±０．５、１４６．９±０．５、１３３．１±０．５及び１２１．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化前駆体イオンが３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが２８３．２±０．５、１８７．３±０．５、１７５．２±０．５及び１５９．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む方法。
【請求項２】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出及び分析カラム並びに工程（ｉ）の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン化源は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプル中でビタミンＤ３を検出する工程をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、同時にイオン化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは、生物学的サンプルを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定されたビタミンＤ２の量は前記ヒトから採取された場合は前記サンプル中に存在する量である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルは、血清又は血漿を含む、請求項１４から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のビタミンＤ３の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
（ｉ）サンプル由来のビタミンＤ３を３８５．２±０．５又は３６７．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上の前記イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ３イオンの存在を前記サンプル中のビタミンＤ３の存在と関連付ける工程
を含み、
ここで、前記フラグメント化前駆体イオンが３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが１５９．０±０．５、１４７．０±０．５、１３３．１±０．５及び１０７．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化前駆体イオンが３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが１７２．２±０．５、１４５．０±０．５及び１１９．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む方法。
【請求項１８】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抽出及び分析カラム並びに工程（ｉ）の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項２３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記イオン化源は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源である、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル中でビタミンＤ２を検出する工程をさらに含む、請求項１７から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、同時にイオン化される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルは、生物学的サンプルを含む、請求項１７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定されたビタミンＤ３の量は前記ヒトから採取された場合に前記サンプル中に存在する量である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルは、血清又は血漿を含む、請求項３０から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
（ｉ）前記サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３を３９７．２±０．５及び３７９．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオンの群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ２前駆体イオン、並びに３８５．２±０．５及び３６７．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオンの群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ３前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記ビタミンＤ２前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ２フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンが３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ２フラグメントイオンが１５９．０±０．５、１４６．９±０．５、１３３．１±０．５及び１２１．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンが３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ２フラグメントイオンが２８３．２±０．５、１８７．３±０．５、１７５．２±０．５及び１５９．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの前記ビタミンＤ３前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ３フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンが３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ３フラグメントイオンは、１５９．０±０．５、１４７．０±０．５、１３３．１±０．５及び１０７．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンが３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ３フラグメントイオンは、１７２．２±０．５、１４５．０±０．５及び１１９．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
（ｉｖ）工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上の前記ビタミンＤ２及びビタミンＤ３イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
（ｖ）工程（ｖｉ）で決定されたビタミンＤ２及びビタミンＤ３イオンの量を前記サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量と関連付ける工程
を含む方法。
【請求項３４】
前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンは、３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンは、３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンは、３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンは、３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抽出及び分析カラム並びに工程（ｉ）の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記イオン化源は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源である、請求項３３から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルは、生物学的サンプルを含む、請求項３３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定されたビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量は前記ヒトから採取された場合に前記サンプル中に存在する量である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプルは、血清又は血漿を含む、請求項４６から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
サンプル中のビタミンＤ２の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
（ｉ）サンプル由来のビタミンＤ２を３９７．２±０．５又は３７９．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上の前記イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ２イオンの存在を前記サンプル中のビタミンＤ２の存在と関連付ける工程
を含み、
ここで、前記フラグメント化前駆体イオンが３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが１５９．０±０．５、１４６．９±０．５、１３３．１±０．５及び１２１．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化前駆体イオンが３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが２８３．２±０．５、１８７．３±０．５、１７５．２±０．５及び１５９．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む方法。
【請求項２】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出及び分析カラム並びに工程（ｉ）の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン化源は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプル中でビタミンＤ３を検出する工程をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、同時にイオン化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは、生物学的サンプルを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定されたビタミンＤ２の量は前記ヒトから採取された場合は前記サンプル中に存在する量である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルは、血清又は血漿を含む、請求項１４から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のビタミンＤ３の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
（ｉ）サンプル由来のビタミンＤ３を３８５．２±０．５又は３６７．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオン（複数）からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上の前記イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において決定されたビタミンＤ３イオンの存在を前記サンプル中のビタミンＤ３の存在と関連付ける工程
を含み、
ここで、前記フラグメント化前駆体イオンが３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが１５９．０±０．５、１４７．０±０．５、１３３．１±０．５及び１０７．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化前駆体イオンが３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記フラグメントイオンが１７２．２±０．５、１４５．０±０．５及び１１９．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む方法。
【請求項１８】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラグメント化前駆体イオンは、３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抽出及び分析カラム並びに工程（ｉ）の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項２３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記イオン化源は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源である、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル中でビタミンＤ２を検出する工程をさらに含む、請求項１７から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ビタミンＤ２及びビタミンＤ３は、同時にイオン化される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルは、生物学的サンプルを含む、請求項１７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定されたビタミンＤ３の量は前記ヒトから採取された場合に前記サンプル中に存在する量である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルは、血清又は血漿を含む、請求項３０から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
（ｉ）前記サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３を３９７．２±０．５及び３７９．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオンの群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ２前駆体イオン、並びに３８５．２±０．５及び３６７．２±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を備えるイオンの群から選択される質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ３前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記ビタミンＤ２前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ２フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンが３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ２フラグメントイオンが１５９．０±０．５、１４６．９±０．５、１３３．１±０．５及び１２１．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンが３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ２フラグメントイオンが２８３．２±０．５、１８７．３±０．５、１７５．２±０．５及び１５９．０±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの前記ビタミンＤ３前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な１つ又はそれ以上のビタミンＤ３フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンが３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ３フラグメントイオンは、１５９．０±０．５、１４７．０±０．５、１３３．１±０．５及び１０７．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含み、及び前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンが３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンを含む場合は、前記ビタミンＤ３フラグメントイオンは、１７２．２±０．５、１４５．０±０．５及び１１９．１±０．５のｍ／ｚを備えるイオン（複数）からなる群から選択される１つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
（ｉｖ）工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）において生成された１つ又はそれ以上の前記ビタミンＤ２及びビタミンＤ３イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
（ｖ）工程（ｖｉ）で決定されたビタミンＤ２及びビタミンＤ３イオンの量を前記サンプル中のビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量と関連付ける工程
を含む方法。
【請求項３４】
前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンは、３９７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フラグメント化ビタミンＤ２前駆体イオンは、３７９．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンは、３８５．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記フラグメント化ビタミンＤ３前駆体イオンは、３６７．２±０．５のｍ／ｚを備えるイオンである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抽出カラムは、固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抽出及び分析カラム並びに工程（ｉ）の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記イオン化源は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源である、請求項３３から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルは、生物学的サンプルを含む、請求項３３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定されたビタミンＤ２及びビタミンＤ３の量は前記ヒトから採取された場合に前記サンプル中に存在する量である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプルは、血清又は血漿を含む、請求項４６から４７のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５１３８０２（Ｐ２０１３−５１３８０２Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４３２９０（Ｐ２０１２−５４３２９０）
【出願日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５９７６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７２１６３
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５０５０６３０５０）クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５９７６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７２１６３
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５０５０６３０５０）クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
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