骨吸収上昇の治療のための植物抽出物
本発明は、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療又は予防におけるγ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの使用に関し、破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害し、この最小有効量は約２ｍＭである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨吸収阻害活性を有する植物由来物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も一般的な代謝性骨疾患は骨粗しょう症である。骨粗しょう症は一般に、どちらの場合もこの結果は骨格組織の量の減少である、骨形成の低下又は骨吸収の促進のいずれかからの、骨の量の減少と定義することができる。成人における骨量は年齢と共に減少し、骨折の危険度上昇を導く。骨粗しょう症性骨折は、患者に苦痛を生じさせることに加えて、骨粗しょう症及び関連骨折についての直接支出が米国だけで年間約１７０億ドルに上るので、保健医療にとって大きな負担となっている（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｌ．Ｊ．；Ｈｅａｎｅｙ，Ｒ．Ｐ．Ｔｏｏ ｍｕｃｈ ｍｅｄｉｃｉｎｅ？Ｏｒ ｔｏｏ ｌｉｔｔｌｅ？Ｂｏｎｅ ２００３，３２，３２７−３３１）。
【０００３】
破骨細胞（骨吸収細胞）は、吸収過程における骨の一部の掘削の役割を担う。吸収後、骨芽細胞（骨形成細胞）が出現し、吸収された部分を新しい骨で再び満たす。
【０００４】
若年健常成人では、破骨細胞と骨芽細胞が形成されて機能する速度は、骨吸収と骨形成の間でバランスを維持する。しかし、加齢の正常な結果として、このリモデリング過程に不均衡が発現し、骨の減少を生じさせる。不均衡が長期にわたって継続すると、骨量の減少、従って骨強度の低下が骨折を導く。
【０００５】
骨粗しょう症の治療のための多くの組成物及び方法が医学文献において記述されている。例えばエストロゲン、カルシトニン及びビスホスホネートは骨吸収の有効な阻害剤であることが知られている。
【０００６】
この目標を達成するための栄養的アプローチは安価な手段である。しかし、今日推奨されている栄養戦略の効果はかなり控えめである。実際に、股関節骨折の相対的危険度への乳中のカルシウムの効果でさえも、カルシウムの摂取量が最も低い女性母集団の１０％に限定されると思われる（Ｋａｎｉｓ，Ｊ．Ａ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｂｏｎｅ １９９９，２４，２７９−２９０）。従って、骨量減少を予防する新規栄養戦略が求められている。
【０００７】
欧州特許第９８０２５０号は、中でも特に、ａｌｌｉｕｍ（ネギ・ニンニク属）の植物抽出物又は濃縮物を含有する栄養組成物、例えば獣医用組成物、又は医薬組成物、例えば動物薬、及びパジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は特に骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療又は予防のためのこれらの使用を開示する。欧州特許第９８０２５０号の対象は参照により本出願に組み込まれる。
【０００８】
ラットの食餌への７％のタマネギの添加は、発育中のラットにおいて骨吸収を低下させ、骨ミネラル含量を上昇させる（Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｆ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ １９９９，４０１，３４３−３４４）。この作用はタマネギの塩基過剰とは無関係である（Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｏｚａｎｏ，Ａ．；Ｒｅｉｎｌｉ，Ａ．Ｏｎｉｏｎ ａｎｄ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，ｓａｌａｄｓ ａｎｄ ｈｅｒｂｓ ａｆｆｅｃｔ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｂａｓｅ ｅｘｃｅｓｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００２，１７，１２３０−１２３６）。
【０００９】
さらに、タマネギからのエタノール抽出物は、骨粗しょう症モデルにおいて骨量減少を予防し、インビトロで破骨細胞の吸収作用を阻害した（Ｉｎｇｏｌｄ，Ｐ．；Ｋｎｅｉｓｓｅｌ，Ｍ．；Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｇａｓｓｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｏｎｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｉｂｉａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｎｄ ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｅｔ ｉｎ ａｇｅｄ ｒｅｔｉｒｅｄ ｂｒｅｅｄｅｒ ｒａｔｓ．Ｂｏｎｅ １９９８，２３，Ｓ３８７，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．Ｗ３８８；及びＭｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｆ．；Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｃｏｍｍｏｎ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎｓ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｏｎｅ １９９８，２３，Ｓ３８７，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．Ｗ３９１）。これは、骨吸収へのタマネギの阻害活性が薬理活性化合物によるものであり得ることを示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
エタノール抽出物の最初の分画はインビボでフラボノイド含有画分の活性を示さなかったが、代わりに、より極性の高い化合物の溶出で活性を示した。これは、タマネギ中に豊富なフラボノイドを試験するという容易なアプローチを陳腐化した。前記極性物質は破骨細胞の吸収活性も阻害したので、このインビトロ培養系はバイオアッセイとして使用することができ、骨吸収を阻害するタマネギ中の未知の化合物の単離と特定に着手することを本発明者らに促した。
【００１１】
しかし、骨吸収阻害作用に関与するａｌｌｉｕｍの活性成分はこれまで記述されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
骨吸収阻害作用に関与するａｌｌｉｕｍの活性成分は、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａなどのａｌｌｉｕｍの親水性エタノール抽出物中に見出し得る。骨吸収への潜在的阻害作用を有する活性成分は、γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドと特定された。
【００１３】
ここで使用する、ａｌｌｉｕｍという用語は、ａｌｌｉｕｍ属（ニンニクのラテン名、タマネギ科の成員）を指し、例えば植物種、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ（リーキ／無臭ニンニク）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ（チャイブ）、Ａｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック）、Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ニンニク）又はＡｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ（ネギ）の成員を含む。好ましい種は、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）及びＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック、ｂｅａｒ ｐａｗ ｇａｒｌｉｃとしても知られる）、特に最後の２つであり、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａが特に好ましい。
【００１４】
本発明の有効成分は、ａｌｌｉｕｍ、例えばＡｌｌｉｕｍ ｃｅｐａから、例えばこの植物の全食用部分から、分画によって、例えばインビトロバイオアッセイ誘導分画によって、例えば以下で述べるように単離し得る。又は、本発明の有効成分、特にこのシス形態は、例えば当業者に容易に公知のように、完全又は半化学合成によって入手し得る。
【００１５】
γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを、以下本発明の有効成分と称する。本発明によれば、本発明の有効成分は濃縮物形態であり得る。
【００１６】
従って、１つの態様では、本発明は、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための薬剤又は栄養製剤、例えば動物薬又は獣医用組成物、の製造における、例えば濃縮物形態の、γ−グルタミル−ペプチド、例えば濃縮物形態の、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの使用に関する。さらなる態様では、本発明は、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分及び場合により：
（ａ）許容される担体；
（ｂ）カルシウム源；
（ｃ）炭水化物、脂肪及び窒素源から成る群より選択される少なくとも１つのエネルギー源；
（ｄ）ビタミンＤ；又はこれらの何らかの組合せ
を含有する、栄養組成物、例えば獣医用組成物、又は医薬組成物、例えば動物薬、に関する。
【００１７】
本発明の１つの態様では、薬剤又は栄養製剤のγ−グルタミル−ペプチドは、破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する。
【００１８】
本発明のもう１つの態様では、薬剤又は栄養製剤は、少なくとも２ｍＭのγ−グルタミル−ペプチドの用量を有する。
【００１９】
本発明はさらに、骨吸収を抑制するために有効な量の、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する薬剤又は栄養製剤を、ヒト又は動物、例えば哺乳動物に投与することを含む、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための方法を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、この必要のあるヒト又は動物、例えば哺乳動物に、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の有効量を投与することを含む、骨吸収を抑制する方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、骨吸収上昇の食事療法における、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の使用を提供する。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｃ）例えば、
（ｃ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｃ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｃ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｃ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、順相中圧液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物の分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｃ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、
（ｅ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｅ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｅ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｅ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、ＮＰ−ＭＰＬＣを使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
（ｆ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物のインビトロバイオアッセイ誘導分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００２４】
画分Ａ１−４Ｃの化合物を、例えばＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置を使用する、例えば四重極イオントラップ（ＱＩＴ）を備えたＭＳを使用する、質量分析によって分析し得る。フラグメンテーションは、例えば３５％の衝突エネルギーを使用して、正に荷電したイオン化分子をヘリウムガスと衝突させることによって達成し得る。
【００２５】
画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造を、酸加水分解後ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによってさらに確認し得る。
【００２６】
さらに、画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、例えばＤ２Ｏを溶媒として使用し、トリメチルシリル−プロパンスルホン酸を外部標準として使用する、例えば１Ｈ−ＮＮＭＲ、１ＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲ、１Ｈ−Ｈ−ＣＯＳＹ、及び／又はｎＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲによって確認し得るか、又は画分Ａ１−４Ｃの化合物の分析のための他の手法は当業者に容易に公知である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
長期にわたる徹底的な試験後、今や意外にも、骨吸収阻害作用の役割を担う活性成分がＡｌｌｉｕｍ ｃｅｐａなどのａｌｌｉｕｍ親水性エタノール抽出物中に見出し得ることが発見された。骨吸収への潜在的阻害作用を有する活性成分は、γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドと特定された。
【００２８】
γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを、以下本発明の有効成分と称する。本発明によれば、本発明の有効成分は濃縮物形態であり得る。
【００２９】
従って、１つの態様では、本発明は、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための薬剤又は栄養製剤、例えば動物薬又は獣医用組成物、の製造における、例えば濃縮物形態の、γ−グルタミル−ペプチド、例えば濃縮物形態の、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの使用に関する。さらなる態様では、本発明は、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する、栄養組成物、例えば獣医用組成物、又は医薬組成物、例えば動物薬、に関する。
【００３０】
本発明はさらに、骨吸収を抑制するために有効な量の、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する薬剤又は栄養製剤を、ヒト又は動物、例えば哺乳動物に投与することを含む、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための方法を提供する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、この必要のあるヒト又は動物、例えば哺乳動物に、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の有効量を投与することを含む、骨吸収を抑制する方法を提供する。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、骨吸収上昇の食事療法における、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の使用を提供する。
【００３３】
ここで使用する骨粗しょう症は、ホルモン欠乏（例えば閉経後の）及び老年期によって誘導される骨粗しょう症、並びにステロイド治療に続発する又は神経性食欲不振によって引き起こされる栄養失調に起因する骨粗しょう症などの二次性骨粗しょう症を包含する。
【００３４】
本発明の有効成分は、ａｌｌｉｕｍ、例えばＡｌｌｉｕｍ ｃｅｐａから、例えばこの植物の全食用部分から、分画によって、例えばインビトロバイオアッセイ誘導分画によって、例えば以下で述べるように単離し得る。又は、本発明の有効成分、特にこのシス形態は、例えば当業者に容易に公知のように、完全又は半化学合成によって入手し得る。
【００３５】
１つの態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｃ）例えば、
（ｃ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｃ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｃ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｃ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、順相中圧液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物の分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｃ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、
（ｅ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｅ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｅ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｅ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、ＮＰ−ＭＰＬＣを使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
（ｆ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物のインビトロバイオアッセイ誘導分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００３７】
破骨細胞ピットアッセイは十分に確立された骨吸収のインビトロモデルであり、当業者に容易に公知であることは認識される。簡単に述べると、試験する試料、例えば３０ｍｇ又はそれ以下の凍結乾燥親水性画分Ａ／ｍｌを含む培地を、象牙片上に置いた新生仔ラットの破骨細胞に添加する。２４時間のインキュベーション後、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性多核細胞、すなわち破骨細胞を計数する。続いて、吸収孔の数を判定する。活性を破骨細胞当りの吸収孔の割合として算定し、陰性対照、例えば１０％ウシ胎仔血清を含む培地、及び陽性対照、例えば１０−１２Ｍカルシトニンと比較する。統計的有意性の解析のために、処置群の割合±これらのそれぞれのＳＥＭを、陰性対照のＳＥＭの９５％信頼区間と比較する。
【００３８】
画分Ａ１−４Ｃの化合物を、例えばＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置を使用する、例えば四重極イオントラップ（ＱＩＴ）を備えたＭＳを使用する、質量分析によって分析し得る。フラグメンテーションは、例えば３５％の衝突エネルギーを使用して、正に荷電したイオン化分子をヘリウムガスと衝突させることによって達成し得る。
【００３９】
画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造を、酸加水分解後ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによってさらに確認し得る。
【００４０】
さらに、画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、例えばＤ２Ｏを溶媒として使用し、トリメチルシリル−プロパンスルホン酸を外部標準として使用する、例えば１Ｈ−ＮＮＭＲ、１ＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲ、１Ｈ−Ｈ−ＣＯＳＹ、及び／又はｎＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲによって確認し得る。
【００４１】
画分Ａ１−４Ｃの化合物の分析のためのこのような手法が当業者に容易に公知であることは認識される。
【００４２】
ここで使用する、ａｌｌｉｕｍという用語は、ａｌｌｉｕｍ属（ニンニクのラテン名、タマネギ科の成員）を指し、例えば植物種、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ（リーキ／無臭ニンニク）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ（チャイブ）、Ａｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック）、Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ニンニク）又はＡｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ（ネギ）の成員を含む。好ましい種は、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）及びＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック、ｂｅａｒ ｐａｗ ｇａｒｌｉｃとしても知られる）、特に最後の２つであり、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａが特に好ましい。Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ種の成員の例は、一般的なタマネギ（赤色又は白色又は黄色外皮）又はエシャロットであり、赤色又は白色の一般的なタマネギが好ましい。
【００４３】
本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを含有する抽出物は、液体形態、例えば水性形態で、又は固体形態、例えば顆粒又は粉末形態で使用し得る。又は、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドは、それ自体で、例えば固体で、例えば粉末又は顆粒形態で使用し得るか、又は液体、例えば水性液体中に溶解又は分散し得る。
【００４４】
供給する本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの量は、中でも特に所望する治療、治療する被験者、例えばヒト又は動物、又は被験者の必要に依存して、広い範囲内で変化し得る。そこで、治療する被験者が成人（典型的には約６０から７５ｋｇ体重）である場合、骨吸収への満足し得る阻害作用は、一般に、例えば無溶媒ベースで、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド約２０から約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約４０から約８０ｍｇ／ｋｇの１日投与量を与えるように製剤された組成物で得られ得る。
【００４５】
本発明によれば、「栄養組成物」という用語は、ヒト又は動物、例えば哺乳動物に適した、栄養製剤及び栄養製品を指す。本発明に従った栄養組成物は、例えば、動物栄養補助飼料、機能性食品、飲料製品、調理済み食品又は食品添加物などの、栄養補助食品、完全調整食、栄養又は健康補助食品の形態であり得る。
【００４６】
本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを含有する適切な栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、本発明のさらなる目的である。従って、１つの態様では、本発明は、
（ａ）本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド、
（ｂ）カルシウム源、及び
（ｃ）炭水化物、脂肪及び窒素源から成る群より選択される少なくとも１つのエネルギー源、及び場合により
（ｄ）ビタミンＤ
を含有する栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料を提供する。
【００４７】
成分（ａ）に関しては、γ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドについての上記の定義、選択及び量が適用される。本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、好都合には、約２０から約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約４０から約８０ｍｇ／ｋｇの１日投与量を与える量の成分（ａ）を含有する。
【００４８】
カルシウム源（ｂ）は、カルシウムを含む生理学的に許容される無機又は有機化合物を含み得る。例は、無機カルシウム塩、例えば塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム又は炭酸カルシウム、又は全脂粉乳又は脱脂粉乳のような有機カルシウム成分、カゼインカルシウム、又はクエン酸カルシウム、マレイン酸カルシウムなどの有機酸のカルシウム塩、又はこれらの混合物である。カルシウム源（ｂ）としての、有機カルシウム化合物、特に脱脂粉乳、カゼインカルシウム又はこれらの混合物の使用は好ましい。供給するカルシウム成分の量は広い範囲内で変化し得る。一般に、本発明の組成物は、１単位投与量中に約１００ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは２００ｍｇから７００ｍｇ、最も好ましくは３００から６００ｍｇのカルシウムを含む（元素ベースで）。
【００４９】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、好都合には、例えば約１から６０重量％、好ましくは約５から５０重量％、最も好ましくは約１０から４０重量％のカルシウム成分（ｂ）を含む。
【００５０】
適切な炭水化物源は、例えばマルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット及び／又はソルビットを含む。これらの形態では、炭水化物はエネルギー供給源及び甘味料の両方である。本発明の組成物は、１又はそれ以上の異なる炭水化物源を含み得る。
【００５１】
適切な脂肪源は、ω−６多不飽和脂肪酸源、ω−３多不飽和脂肪酸源、単不飽和脂肪酸源、中鎖脂肪酸源（すなわちＣ６−Ｃ１２−脂肪酸）、又はこれらの混合物を含む。上記脂肪酸は、各々の場合に、遊離酸の形態、モノ、ジ又は特にトリグリセリド形態、又は薬理的に又は栄養上許容される自然源の形態で使用し得る。
【００５２】
ω−６多不飽和脂肪酸の適切な自然源は、紅花油、ヒマワリ油、ダイズ油、綿実油及びトウモロコシ油などの植物油を含む。ω−３多不飽和脂肪酸の適切な自然源は、亜麻仁油、及びニシン油、サケ油、サバ油、マグロ油、肝油及びアンチョビー油などの魚油を含む。
【００５３】
単不飽和脂肪酸源の適切な自然源は、特にω−９単不飽和脂肪酸、例えばオリーブ、カノーラ、紅花（ハイブリッド）及びヒマワリ（ハイブリッド）である。
【００５４】
好ましい脂肪源は、所望量のω−６多不飽和脂肪酸及びω−３多不飽和脂肪酸を供給し、中鎖脂肪酸残基（すなわちＣ６−Ｃ１２−脂肪酸の残基）及び／又は単不飽和脂肪酸残基に富む、トリグリセリド油を含む。本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料は、１又はそれ以上の異なる脂肪源を含み得る。
【００５５】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の適切な窒素源の例は、ダイズ由来タンパク質、乳清タンパク質又はカゼイン塩などの乳タンパク質、及び／又はタンパク質加水分解産物、及び／又は遊離アミノ酸形態又は塩形態の必須アミノ酸混合物、及び／又は遊離アミノ酸形態又は塩形態の、アルギニン、アルギニン前駆体、オルニチン等のようなポリアミドの合成に関連する化合物などの、栄養的に許容されるタンパク質を含むソースを包含する。
【００５６】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の好ましい窒素源は、
（ｉ）ダイズの形態又は何らかの適切なダイズ抽出物又は濃縮物の形態、例えばダイズ粉、乾燥モヤシ、豆乳の形態、又はダイズからの乾燥水抽出物として使用し得る、ダイズ由来タンパク質；又は
（ｉｉ）乳タンパク質、例えば、乳清粉末、カゼインカルシウムなどのカゼイン塩及び／又は全脂粉乳又は好ましくは脱脂粉乳の形態で使用し得る、乳清由来タンパク質又はカゼイン塩、及び／又は
（ｉｉｉ）必須アミノ酸混合物、及び／又は
（ｉｖ）窒素源としてのアルギニン
である。
【００５７】
乳清粉末、カゼイン塩、特にカゼインカルシウム、及び／又は脱脂粉乳などの乳タンパク質は、特許請求する栄養組成物のもう１つの特に好ましい窒素源である。本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料は、１又はそれ以上の異なる窒素源を含み得る。
【００５８】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、例えば約０．１重量％から９８．９重量％、好ましくは約１から約９５重量％、最も好ましくは１０から９０重量％のエネルギー源成分（ｃ）を含む。
【００５９】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の熱量への窒素源、炭水化物源及び脂肪源の寄与は、広い範囲内で変化し得る。例えば炭水化物源は、総エネルギー供給量の３０から７０％、窒素源は５から４０％、及び脂肪源は０．１から１５％を提供する。本発明の好ましい組成物では、炭水化物源は、組成物の総エネルギー供給量の４０から６０％、窒素源は２０から３５％、及び脂肪源は３から１２％を提供する。
【００６０】
本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料の好ましいエネルギー源（ｃ）は、総エネルギー供給量の３０から７０％の、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット及びソルビットから成る群より選択される１又はそれ以上の炭水化物源；
総エネルギー供給量の５から４５％の、ダイズ由来タンパク質、乳タンパク質、必須アミノ酸の混合物及びアルギニンから成る群より選択される１又はそれ以上の窒素源；
総エネルギー供給量の０．１から１５％の、ω−３及びω−６多不飽和脂肪酸を含む１又はそれ以上の脂肪源
を含む。
【００６１】
本発明の組成物の特に好ましいエネルギー源（ｃ）は、総エネルギー供給量の４０から６０％の、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット及びソルビットから成る群より選択される１又はそれ以上の炭水化物源；
総エネルギー供給量の２０から３５％の、ダイズ由来タンパク質、脱脂粉乳及びカゼイン塩から成る群より選択される１又はそれ以上の窒素源；
総エネルギー供給量の３から１２％の、ω−３及びω−６多不飽和脂肪酸を含む１又はそれ以上の脂肪源を含む。
【００６２】
供給するビタミンＤ（場合により含まれる成分（ｄ））の量は広い範囲内で変化し得る。一般に、本発明の組成物は、１単位投与量中に約４００ＩＵから１０００ＩＵ、好ましくは約５００ＩＵを含む。
【００６３】
本発明の栄養製剤、例えば動物栄養補助飼料は、ビタミン、ミネラル、微量元素、繊維（好ましくは可溶性繊維）、香味料、防腐剤、着色料、甘味料及び乳化剤等のような他の栄養上許容される成分を含み得る。
【００６４】
本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料中に組み込むのに適するビタミンの例は、製薬又は栄養上許容される形態のビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、葉酸、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、ビオチン及びパントテン酸を含む。
【００６５】
本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料中に組み込むのに適するミネラル元素及び微量元素の例は、製薬又は栄養上許容される形態のナトリウム、カリウム、リン、マグネシウム、銅、亜鉛、鉄、セレン、クロム及びモリブデンを含む。
【００６６】
ここで使用する可溶性繊維という用語は、結腸内で実質的に発酵を受けて短鎖脂肪酸を生成する繊維を指す。適切な可溶性繊維の例は、寒天、アルギン酸塩、カルビン、カラゲナン、アラビアゴム、グアーガム、カラヤゴム、ローカストビーンゴム、トラガカント又はキサンタンガムを含む。これらは加水分解されていてもよく又は加水分解されていなくてもよい。
【００６７】
適切な香味料は、天然又は人工香味料、例えばバナナ、オレンジ、ピーチ、パイナップル又はラズベリーなどの果物香味料；又はバニラ、ココア、チョコレート、コーヒー等を含む。
【００６８】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の好ましい成分は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）に加えて、β−カロテン（ビタミンＡ）、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チアミン、ビタミンＢ１、Ｂ６及び／又はＢ１２、カリウム、マグネシウム、セレン、亜鉛、リン及び製薬又は栄養上許容される形態の可溶性繊維を含む。
【００６９】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、約０．１重量％から１５重量％、好ましくは約０．２から約１０重量％、最も好ましくは０．５から５重量％の、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び場合により（ｄ）以外のこれらの付加的な成分を含み得る。
【００７０】
本発明の栄養製剤、例えば動物栄養補助飼料は、経腸投与、例えば経口投与又は経管栄養法、例えば経鼻投与に適する何らかの形態に製剤し、投与し得る。製剤は、好都合には水性液体の形態で投与される。腸内適用に適する製剤は、従って、好ましくは水性形態又は粉末又は顆粒形態であり、前記粉末又は顆粒は、好都合には使用前に水に添加される。経管栄養法としての使用に関しては、添加する水の量は、中でも特に、患者の液体必要量及び状態に依存する。
【００７１】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、単独栄養源として使用するとき、基本的に１日当りのカロリー、窒素、脂肪酸、ビタミン、ミネラル及び微量元素必要量の全てを満たすような、完全調整食（液体又は粉末形態）の形態であり得る。一般に、成人に供給すべき１日量は、７５０から３５００ｋｃａｌ／日、特に１０００から２０００ｋｃａｌ／日の範囲内である。しかし、本発明の栄養組成物は、好ましくは栄養補助食品としての使用を意図する。補助食品によって供給されるエネルギーの量は、不必要に患者の食欲を抑制しないために、あまりに過剰であってはいけない。補助食品は、好都合には５０から１５００ｋｃａｌ／日、好ましくは１００から９００ｋｃａｌ／日、最も好ましくは１５０から７００ｋｃａｌ／日を供給する量のエネルギー源を含む。
【００７２】
液体形態、例えば飲料形態、又は固体形態、例えば顆粒又は粉末形態の、本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、それ自体公知のように、例えば成分を混合し、場合により水を添加することによって入手し得る。
【００７３】
本発明はさらに、
（ａ）本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド、
（ｂ）医薬として許容される担体、例えば動物によって生理学的に良好に耐容される担体
を含有する個別単位用量形態の医薬組成物、例えば動物薬又は獣医用組成物に関する。
【００７４】
これらの医薬組成物、例えば獣医用組成物は、経口、経鼻又は直腸投与などの経腸投与用の組成物である。適切な医薬組成物は、液体形態又は固体形態であり得、例えば約０．００１重量％から１００重量％、さらなる例として約０．１重量％から約５０重量％の有効成分（ａ）を含有する。
【００７５】
経腸投与用の医薬組成物、例えば獣医用組成物は、例えば糖衣丸、錠剤、カプセル、小袋などの個別単位用量形態のものである。これらは、それ自体公知のように、例えば従来の混合、造粒、調合、溶解又は凍結乾燥工程によって、製造される。
【００７６】
例えば経口投与用の医薬組成物は、有効成分を固体担体と組み合わせること、場合により生じた混合物を造粒し、所望に応じて又は必要に応じて適切な賦形剤の添加後、混合物又は顆粒を加工して錠剤又は糖衣丸コアを形成することによって入手できる。
【００７７】
適切な担体は、特に、糖類、例えばラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビット、セルロース製剤及び／又はリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウムなどの充填剤、及びまた、例えばトウモロコシ、小麦、コメ又はジャガイモデンプンを使用するデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドンなどの結合剤、及び所望する場合は、上述したデンプン及びまたカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムのようなこの塩などの崩壊剤である。賦形剤は、特に流動調整剤及び潤滑剤、例えばケイ酸、滑石、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム又はカルシウムのようなこの塩、及び／又はポリエチレングリコールである。糖衣丸コアは、適切な、場合により腸溶性の、剤皮で提供され、中でも特に、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、又は適切な有機溶媒又は溶媒混合物中の剤皮溶液、又は腸溶剤皮の製造のための、フタル酸アセチルセルロース又はフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース製剤の溶液が使用される。例えば特定のため又は有効成分の異なる用量を指示するために、錠剤又は糖衣丸コアに染料又は色素を添加してもよい。
【００７８】
他の経口投与用医薬組成物は、硬ゼラチンカプセル及びまたゼラチンとグリセロール又はソルビットなどの可塑剤から成る軟密閉カプセルである。硬ゼラチンカプセルは、顆粒の形態の有効成分を、例えばラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又は滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの流動促進剤、及び所望に応じて安定剤と混合して含み得る。軟カプセルでは、有効成分は、好ましくは脂肪油、パラフィン油又は液状ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解又は懸濁され、さらに安定剤を添加することも可能である。
【００７９】
適切な直腸投与用医薬組成物は、例えば有効成分と坐薬基剤物質の組合せから成る坐薬である。適切な坐薬基剤物質は、例えば天然又は合成トリグリセリド、パラフィン系炭化水素、ポリエチレングリコール又は高級アルカノールである。有効成分と基剤物質の組合せを含有するゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。適切な基剤物質は、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール又はパラフィン系炭化水素である。
【００８０】
骨吸収への本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの阻害作用は、例えば上記で述べたように、新鮮単離破骨細胞をこの上に置いた象牙片を、試験する抽出物又は濃縮物を含む培地と共にインキュベートするインビトロアッセイによって評価し得る。象牙片上の破骨細胞吸収孔を計数することによって破骨細胞への阻害作用を評価する。
【００８１】
以下の実施例は本発明を例示する。
【実施例１】
【００８２】
バイオアッセイ誘導分画
１．１ 親水性タマネギ画分、画分Ａを得るために、吸着カラムクロマトグラフィーを使用する。８５％エタノール水溶液を使用してカラムにスラリー充填する。充填後、固定相（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４）をエタノール４００ｍｌ、８５％エタノール水溶液５００ｍｌ、水２５００ｍｌ及び８５％エタノール水溶液５００ｍｌで段階的に洗浄する。洗浄後、固定相を、分離のために使用する第一溶媒、すなわち１５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）で予備処理する。
【００８３】
乾燥タマネギ粉末３８．１０ｇを１５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）６００ｍｌに溶解し、一定攪拌下で３０分間加熱する（６０℃）。室温に冷却した後、混濁溶液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を分画に供する。残留物を廃棄する。
【００８４】
フラボノイド、例えばケルセチンを含まないプールした１５％水性分画、及びフラボノイドを含む８５％水性エタノール画分を真空下に４０℃で還元して、凍結乾燥する。水画分を廃棄する。
【００８５】
１．２ 画分Ａの活性成分からフルクトース、グルコース及びスクロースなどのサッカリドを分離するため、５％メタノール水溶液を移動相として使用する、予備逆相高性能薄層クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＴＬＣ）実験を実施した。前記方法を逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）カラムでアップスケールし、画分Ａの１．０ｇ試料を分離に供する。検出のためにアニスアルデヒド試薬を使用して、ＴＬＣによって分画モニタリングを実施する。できるだけ多くの出発物質を回収するため、各々の実施後、カラムをメタノールで十分に洗浄する。
【００８６】
親水性タマネギ画分、画分Ａの骨吸収阻害化合物を単離するため、バイオアッセイ誘導分画を実施する。骨吸収阻害活性をインビトロで評価するため、破骨細胞ピットアッセイを使用する。３０ｍｇ又はそれ以下の凍結乾燥親水性画分／ｍｌを含む培地を、象牙片上に置いた新生仔ラットの破骨細胞に添加する。２４時間のインキュベーション後、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性多核細胞、すなわち破骨細胞を計数する。続いて、吸収孔の数を判定する。活性を破骨細胞当りの吸収孔の割合として算定し、陰性対照、すなわち１０％ウシ胎仔血清を含む培地、及び陽性対照、すなわち１０−１２Ｍカルシトニンと比較する。統計的有意性の解析のために、処置群の割合±これらのそれぞれのＳＥＭを、陰性対照のＳＥＭの９５％信頼区間と比較する。
【００８７】
ａ）ＲＰ−ＭＰＬＣ分画のＴＬＣスクリーニング及び収量
サッカリドを含む画分を「画分Ａ２」と称し、サッカリドを含まない画分を「画分Ａ１」と称する。
【００８８】
【表１】
【００８９】
ｂ）ＲＰ−ＭＰＬＣ分画の生物学的結果
用量をｍｇ／ｍｌで示し、結果を吸収孔／酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性（ＴＲＡＰ＋）多核細胞±ＳＥＭとして示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】
ｃ）考察及び結論
１倍比例量（１２ｍｇ／ｍｌ）で試験した画分Ａ１は、破骨細胞活性を有意に阻害しない。しかし、２倍用量（２４ｍｇ／ｍｌ）は、破骨細胞活性を０．１４４の吸収孔／細胞比に有意に低下させ（１２ｍｇ／ｍｌに比して−４０％）、３０ｍｇ／ｍｌではより一層強力な破骨活性の阻害、すなわち０．０１５及び０．０２０吸収孔／細胞（１２ｍｇ／ｍｌに比して−９０％）が測定できる。画分Ａ１は破骨細胞活性を阻害する化合物を含むと結論される。
【００９２】
画分Ａ２によるわずかな破骨細胞活性の阻害は、少量の画分Ａ１の化合物の存在によって説明し得る。
【００９３】
バイオアッセイ誘導分画を継続するために画分Ａ１を選択し、画分Ａ２を廃棄する。骨吸収阻害性化合物がまだサッカリドで溶出したので、活性化合物からサッカリドを分離するためにさらなる分画を実施する。
【００９４】
１．３ 次の分取分離のために適切な方法を選択するため、極性化合物又は糖類のＮＰ−ＴＬＣのための４つの異なる移動相を試験する。系の分離効率を評価するため、画分Ａ１とサッカリド、フルクトース、グルコース及びスクロースを試料として使用する：
（ａ）メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、６：５：３（ｖ／ｖ）、
（ｂ）アセトン−水−塩酸３７％、９ｍｌ：１ｍｌ：１滴、
（ｃ）ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、９：６：３：１（ｖ／ｖ）、
（ｄ）クロロホルム−メタノール−水、６．４：５：１。
【００９５】
全てのＴＬＣをＮＰ−ＴＬＣで実施し、視覚化のためにアニスアルデヒド試薬を噴霧する。使用した移動相の間に著明な定性的相違は存在しない。次の分取分離工程を実施するために移動相（ｄ）を選択した。
【００９６】
上述したＮＰ−ＴＬＣ計をＮＰ−ＭＰＬＣカラムにアップスケールし、画分Ａ１の４００ｍｇ試料を分画に供する。再びＮＰ−ＴＬＣによって分画モニタリングを実施する。ＴＬＣでもはやそれ以上スポットが認められないとき、系を７０％メタノール水溶液（ｖ／ｖ）で十分に洗浄する。
【００９７】
ａ）ＮＰ−ＭＰＬＣ分画のＴＬＣスクリーニング及び収量
【００９８】
【表３】
【００９９】
ｂ）ＮＰ−ＭＰＬＣ分画の生物学的結果
用量をｍｇ／ｍｌで示し、結果を吸収孔／酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性（ＴＲＡＰ＋）多核細胞±ＳＥＭとして示す。分画の間の損失を相殺するため、画分Ａ１−２を除き、全ての画分を、画分Ａと比較してそれぞれの収量の１倍、２倍及び３倍比例量で試験する。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
ｃ）考察及び結論
画分Ａ１−１、Ａ１−２及びＡ１−３において阻害は測定されない。これら全ての画分の吸収孔／細胞比は、陰性対照のＳＥＭの９５％信頼区間内に位置する。全く糖類を含まない画分Ａ１−４は、３倍用量で有意の破骨細胞活性阻害を示す。１倍及び２倍用量での細胞活性の見かけ上の刺激は、細胞数の低下によるものである。画分Ａ１−４をさらなる分画のために選択する。
【０１０２】
１．４ セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）による画分Ａ１−４の分画
０．００６２５％ギ酸で緩衝した無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用して、画分Ａ１−４をＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣで４つの画分、Ａ１−４Ａ、Ａ１−４Ｂ、Ａ１−４Ｃ及びＡ１−４Ｄにさらに分画する。画分Ａ１−４Ｂは画分Ａ１−４の２つの少量の化合物を含み、画分Ａ１−４Ｃは画分Ａ１−４の最も主要な化合物から成り、画分Ａ１−４Ａ及びＡ１−４Ｄは前留出と後留出（ｐｒｅｒｕｎ ａｎｄ ａｆｔｅｒｒｕｎ）である。画分Ａ１−４ＡとＡ１−４Ｄをさらなる試験のために一緒にプールする。全体として、各ランの実施時に０．１２５ｍｇを適用し、各画分をプールする、６５回の単一ＨＰＬＣの実施により、画分Ａ１−４ ８．１２５ｍｇを分離する。分画は、ＨＰＬＣ装置の出口でタップを切り替えることによって手動で実施する。
【０１０３】
ａ）ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分画の収量
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
ｂ）ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分画の生物学的結果
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
ｃ）考察及び結論
画分Ａ１に相当する３倍比例量の画分Ａ１−４及び画分Ａ１−４Ｃは骨吸収を有意に（ｐ＜０．５）阻害する。画分Ａ１−４ＣはＡ１−４と同様に破骨活性を阻害し、Ａ１−４Ｃが画分Ａ１−４の唯一の活性化合物であることを示す。構造解明実験に十分な量を回収するためにＡ１−４Ｃの単離を反復する。
【０１０８】
要約：エタノール鱗茎抽出物を、４つの異なるクロマトグラフィー系−Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４抽出；ＲＰ−ＭＰＬＣ；ＮＰ−ＭＰＬＣ；及びセミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣの連続使用によって精製する。生じる画分Ａ１−４Ｃは、破骨活性を阻害する唯一の化合物から成る。
【０１０９】
以下のグラフは、画分Ａ１−４Ｃを導くバイオアッセイ誘導単離の概要を示す：
【０１１０】
【化１】
【実施例２】
【０１１１】
構造解明実験
２．１ Ａ１−４ＣのＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ２
Ａ１−４Ｃの構造に関する第一構造情報を得るためにＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置を用いて質量分析を実施する。前記ＭＳは四重極イオントラップを備える。フラグメンテーションは、３５％の衝突エネルギーを使用して、正に荷電したイオン化分子をヘリウムガスと衝突させることによって達成される。
【０１１２】
Ａ１−４Ｃの正電荷を有する親イオンは３０７ｍ／ｚ［ｍ＋Ｈ］＋である。文献検索により、同一質量のタマネギ化合物、すなわちγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ｇ−ＧＰｅＣＳＯ）の存在が明らかにされた。生じるフラグメンテーションパターンがこの化合物と一致し得るかどうかを調べるためにさらなるフラグメンテーションを実施する。
【０１１３】
２．２ 酸加水分解後のＡ１−４ＣのＥＳＩ−ＭＳ
ＥＳＩ−ＭＳによって得た結果は、画分Ａ１−４Ｃがｇ−ＧＰｅＣＳＯであるという推定をさらに裏づけ、先のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ実験結果と矛盾しない。
【０１１４】
２．３ Ａ１−４Ｃの核磁気共鳴実験
トリメチルシリル−プロパンスルホン酸を外部標準として使用して、Ｄ２Ｏ中で測定を実施する。
【０１１５】
画分Ａ１−４Ｃの化合物は、ＮＭＲ質量分析によってγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ｇ−ＧＰｅＣＳＯ）と特定することができ、先のＨＰＬＣ−ＭＳ実験を確認する。
【実施例３】
【０１１６】
バイオアッセイ誘導分画−スケールアップ単離
３．１ 抽出。タマネギの乾燥薄片（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ，Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）を粉砕し、４００ｇを、６０℃で１時間、エタノール水溶液（８５％ｖ／ｖ）２０００ｍＬで２回抽出し、ろ過した。エタノールの蒸発後、水性残留物を凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１１７】
３．２ バイオアッセイ誘導分画。画分Ａ及びＢ。タマネギ抽出物約３８ｇを１５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）６００ｍＬに再溶解し、一定攪拌下に６０℃で３０分間加熱した。室温に冷却した後、前記混合物を７０００ｒ．ｐ．ｍ．で２０分間遠心分離し、上清を吸着カラムクロマトグラフィーによる分画に供した（残留物は廃棄した）。画分Ａ及び画分Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を固定相として使用し、（１）１５％エタノール水溶液１２８０ｍＬ、（２）水１２８０ｍＬ及び（３）８５％エタノール水溶液１４００ｍＬを用いて１０ｍＬ／分の流速で溶出することによって生じた。クロロホルム−メタノール−水 ６．４：５：１（ｖ／ｖ）を移動相とし、ジフェニルホウ酸−β−エチルアミノエートの１％メタノール溶液、次いでポリエチレングリコール４０００の５％エタノール溶液で視覚化する、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４プレート１０×１０ｃｍ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、完全にフラボノイドを欠く親水性画分Ａを示し、一方親油性画分Ｂはフラボノイドを含んだ。画分Ａ及びＢを、次に、破骨細胞ピットアッセイ及び以下でさらに説明する［３Ｈ］−テトラサイクリン尿中排泄ラットモデルをそれぞれ使用することによってインビトロ及びインビボで試験した。画分Ａは骨吸収阻害作用を示し、一方画分Ｂは不活性であり、従って廃棄した。
【０１１８】
画分Ａ１及びＡ２．移動相５ｍＬに溶解した画分Ａの１ｇアリコートを、Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８、１５−２５μｍ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４６×２．５ｃｍと１３×１ｃｍのプレカラムでの中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ；６８１ポンプ、６８４自動分取装置、どちらもＢｕｅｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに分離した；溶出は、（１）５％メタノール水溶液３４０ｍＬ及び（２）メタノール３００ｍＬにより４ｍＬ／分の流速で実施した。６０の４ｍＬ画分のモニタリングを、水−メタノール １９：１を移動相とし、視覚化のためにアニスアルデヒド試薬（アニスアルデヒドの５％酢酸溶液、次に１２０℃で加熱）を用いて、ＲＰ−１８ Ｆ２５４１０×１０ｃｍプレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって実施した。画分Ａ１は主としてサッカリド（グルコース、フルクトース、スクロース）を含み、インビトロで活性であり、画分Ａ２はサッカリドを含まず、ほとんど不活性であり、従って廃棄した。
【０１１９】
画分Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ１−３、Ａ１−４。画分Ａ１の４００ｍｇアリコートを、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０、１５−４０μｍ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２２×２．５ｃｍと１３×１ｃｍのプレカラムでのＭＰＬＣによってさらに分離した；溶出は、（１）クロロホルム−メタノール−水 ６．４：５：１ １２０８ｍＬ及び（２）メタノール３００ｍＬにより４ｍＬ／分の流速で実施した。１２０の８ｍＬ画分のモニタリングを、ｎ−ブタノール−ｎ−プロパノール−酢酸−水 ３：１：１：１を移動相とし、視覚化のためにアニスアルデヒド試薬を用いて、Ｓｉｌｉｃａｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４１０×１０ｃｍプレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＴＬＣによって実施した。サッカリド不含画分Ａ１−４は有意のインビトロ活性を示し、サッカリド含有画分Ａ１−１、Ａ１−２及びＡ１−３は破骨細胞ピットアッセイにおいて活性ではなく、従ってさらなる試験は行わなかった。
【０１２０】
画分Ａ１−４Ａ、Ａ１−４Ｂ、Ａ１−４Ｃ、Ａ１−４Ｄ。画分Ａ１−４の０．１２５ｍｇのアリコートを、最後に、４０℃で、内径２５０×１０ｍｍのＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ５μｍカラムでのセミ分取無勾配高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＤＡＤ）を備えたＨＰ １０９０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。移動相は、１．５ｍＬ／分の流速の０．００６２５％ギ酸を含む水−アセトニトリル１：１であった。検出は１９５ｎｍであった。等しい画分をプールし、蒸発させて、凍結乾燥し、インビトロで試験した。主要ＨＰＬＣピークに対応し、クロマトグラフ的に純粋な画分Ａ１−４Ｃは、画分Ａ１−４とほぼ同様に強さで破骨細胞活性を阻害し、他の全ての画分は不活性であった。
【０１２１】
３．３ Ａ１−４Ｃのスケールアップ単離。より大量のＡ１−４Ｃ（ＧＰＣＳ）の製造のために、水に溶解した画分Ａの１０．８ｇアリコートを、最初に、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を満たした４３×３ｃｍカラムでの陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分離した。非陽イオン画分を水９７５ｍＬで溶出し、陽イオン画分を１５−２０ｍＬ／分の流速の０．７５Ｍアンモニア １４２５ｍＬで溶出した。ｎ−ブタノール−ｎ−プロパノール−酢酸−水 ３：１：１：１を移動相とし、視覚化のためにアセトアルデヒド及びニンヒドリン試薬を用いたＳｉｌｉｃａｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４でのＴＬＣを画分のモニタリングのために使用した。加えて、１２５×４ｍｍのＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ３μｍカラム、移動相として０．７ｍＬ／分の流速で０．０５％リン酸を含む、水−アセトニトリル １：３、１９５ｎｍでの検出を使用して、ＨＰＬＣ−ＤＡＤによって画分を調べた。非陽イオン画分は主としてサッカリドを含み、一方陽イオン画分では、ペプチド及びアミノ酸の濃縮が認められた。従って、凍結乾燥陽イオン画分の７００ｍｇアリコートを、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を満たした４００×２６ｍｍカラムでの陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによってさらに分離した。０．１Ｍ酢酸２３７．５ｍＬ、０．５Ｍ酢酸１２５０ｍＬ及び２Ｍ酢酸１０００ｍＬを溶出のために使用し、ペリ環状ポンプＭｉｎｉｐｕｌｓ ３（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｖｉｌｌｉｅｒｓ−ｌｅ−Ｂｅｌ，Ｆｒａｎｃｅ）によって９５ｍＬ／分の流速を維持して、７０００ Ｕｌｔｒｏｒａｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって画分を収集し、ＴＬＣによってモニターした（上記参照）。等しい画分をプールし、凍結乾燥した後、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ及びＨＰＬＣ−ＤＡＤによって最終的に検査した。
【０１２２】
３．４ 化合物Ａ１−４Ｃの構造解明。ＨＰＬＣ−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）。使用機器は、ＬＣＱ ＥＳＩ質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した、ＤＡＤを備えるＨＰ １１００液体クロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から成った。分離は、０．７ｍＬ／分の流速で０．０５％ギ酸を含む水−アセトニトリル １：４を用いてＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ３μｍカラム、１２５×４ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において４０℃で無勾配的に実施した。衝突ガスはヘリウムであり、エネルギー３５％であった。測定は正及び負イオン化モードの両方で実施した。
【０１２３】
ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによって得た結果の確認のため、Ａ１−４Ｃを、７０％ギ酸による酸加水分解（１００℃で２２時間）後直接注入ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによってさらに分析した。使用機器は、ナノエレクトロスプレーイオンソースを備えたハイブリッド四重極飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳである、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ Ｑｓｔａｒ Ｐｕｌｓａｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）であった。
【０１２４】
３．５ 核磁気共鳴質量分光法（ＮＭＲ）。Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ５００装置（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＮＭＲ実験を実施した。実験は、１Ｈについては５００ＭＨｚ及び１３Ｃについては１２５ＭＨｚで実施した。Ｄ２ＯはＥｕｒｉｓｏ−Ｔｏｐ（Ｇｉｆ−ｓｕｒ−Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入し、外部標準としてのトリメチルシリル−プロピオン酸（Ｎａ塩）（Ｗｉｌｍａｄ Ｃｏｒｐ．，Ｂｕｅｎａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）に比して化学シフトを報告した。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
全てのＨＰＬＣ実験についての溶媒はＬｉｃｈｒｏｓｏｌｖ（登録商標）勾配グレード品質であり、ＭＰＬＣ及びカラムクロマトグラフィーのための化学物質及び溶媒並びにＴＬＣ検出試薬はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのｐ．ａ．品質であった。
【０１２７】
３．６ ＨＰＬＣによるタマネギ中のＧＰＣＳの定量的測定。タマネギ中のＧＰＣＳを、１９５ｎｍに設定したＤＡＤを備えるＨＰ １０９０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量した。分析は、０．７ｍＬ／分の流速で０．０５％ギ酸を含む水−アセトニトリル １：４を用いてＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ３μｍカラム、１２５×４ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において４０℃で無勾配的に実施した。ＧＰＣＳを、Ｍｕｅｔｓｃｈ−Ｅｃｋｎｅｒ，Ｍ．；Ｓｔｉｃｈｅｒ，Ｏ．；Ｍｅｉｅｒ，Ｂ．Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｓ−ａｌｋ（ｅｎ）ｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ（＋）−Ｓ−ａｌｌｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ，ｇ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｓ−ａｌｌｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｇ−Ｌ−ａｌｕｔａｍｙｌ−Ｓ−（ｔｒａｎｓ−１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ）−ｃｙｓｔｅｉｎｅ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ １９９２，６２５，１８３−１９０に述べられている方法に従って、室温でメタノール−水（５０：５０；ｖ／ｖ）を用いて乾燥粉末化タマネギから抽出した。この方法は、親水性溶媒を使用し、同時にメタノールの添加によってグルタミルペプチダーゼ及びアリイナーゼなどの切断酵素を阻害する、極性化合物の効率的な抽出を可能にした。ろ過後に残存する残留物を２回再抽出して、ＧＰＣＳを十分に抽出した。最後に、真空中でろ液からメタノールを除去した後、凍結乾燥及びＨＰＬＣ分析を実施した。
【０１２８】
この化合物の構造を、高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析法、飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量分析法、及び核磁気共鳴分光法で解明した。
【０１２９】
単一ピークがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドと特定され、約３０６μの分子量を有する。
【０１３０】
３．７ 生物学的試験。動物。Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎｌｂｍラット（ＲＣＣ Ｌｔｄ．，Ｆｕｅｌｌｉｎｓｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を飼育し、スイス及び米国国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに適合する標準動物施設に保持した。実施した実験は、国立動物実験管理委員会によって承認された。実験の完了時にラットを二酸化炭素で安楽死させた。
【０１３１】
骨吸収のインビボ評価。広く有効性確認された方法である、慢性的に前標識したラットからの３Ｈ−標識テトラサイクリン（［３Ｈ］−Ｔｃ）の尿排泄量を用いて骨吸収を評価した（３；４；８−１１）。本実験のために、各々１２匹の３日齢雄性仔を有する３匹のＷｉｓｔａｒ Ｈａｎｌｂｍ母ラットを購入した。３６匹の仔に、Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｆｌｅｉｓｃｈ，Ｈ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｔｉｎｕａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｉｕｒｎａｌ ｒｈｙｔｈｍ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９０，２５９，Ｒ６７９−Ｒ６８９に述べられている方法に従って、出生後第１週から週に２回６週間にわたって漸増量の［３Ｈ］−Ｔｃを注射した。［３Ｈ］−Ｔｃは骨内に沈着し、骨が再吸収されるときに放出される（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９０，２５９，Ｒ６７９−Ｒ６８９）。標識の停止後、ラットを代謝ケージに移した。１０日間の順化後、毎日の尿中［３Ｈ］排泄を測定することによって基線骨吸収を観測した。１０日間の基線測定後、群に均一に割り当てたラットにおいて１０日間の食餌介入を開始した、すなわち、全ラットの基線［３Ｈ］尿排泄量を等級付け、各群当りの動物数に達するまで（対照群についてはｎ＝６；処置群については各々ｎ＝５）、同様の等級を有する１匹の動物を各々の処置群に割り当てた。このプロトコールを使用すると、食餌介入の開始時には全ての群について平均［３Ｈ］排泄は同様であった。液体シンチレーション計数によって尿中の３Ｈを定量した。尿１ｍＬのアリコートをＩｒｇａ−Ｓａｆｅ Ｐｌｕｓ（商標）シンチレーター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１０ｍＬ中で計数し、結果（ｄｐｍ）に２４時間の尿量を乗じた。
【０１３２】
給餌及び食餌。ラットを代謝ケージに収容した時点から、脱塩水をラットに摂取させた。食餌は、ケージ内のこぼれを最小限に抑えるためステンレススチール製るつぼ中で水分を含む湿潤食として与えた；従って、食品ボールを形成することができる練り粉様の稠度を与えるために脱イオン水を食品粉末のバッチに添加した。代謝ケージでの１０日間の順化期間中及び１０日間の基線尿収集の間、ラットには、以下で述べる「半精製」食において使用される同様の高いＣａ及びＰ濃度（１００ｇ当りＣａ １．１ｇ及びＰ １．２ｇ）を有する規格「通常」食２１３４（Ｋｌｉｂａ−Ｍｕｈｌｅｎ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を与えた。順化期間中、ラットを、２３グラムの湿潤食／日（乾燥物質１３．１ｇ）を消費するように慣れさせた；反復して全１日量を食べなかったラットはこの期間中に除外した。食餌介入のために乾燥添加物を「半精製」食（Ｊ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）と混合した。検討する項目の適切な量を、５匹のラットに１０日間給餌するために十分な湿潤食のバッチに添加した。これらの食餌を、次に、１日分ずつの分割量に分け、使用時まで−２０℃で凍結保存した。前記食餌のカルシウム及びリン濃度を、１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌに溶解した３つの灰化試料において確認した。カルシウムは原子吸光分析によって、リンは高度測定法によって測定した（８；１３）。製造者が示す数値を確認した。
【０１３３】
バイオアッセイ（破骨活性のインビトロ評価）。破骨細胞を２日齢のラットの大腿骨及び脛骨から単離し、鉱化基質として使用した４×４ｍｍの象牙片上に４０分間置いた。非接着細胞を洗い流した後、個々の切片を４８穴培養プレートに移し、５％ＣＯ２／空気雰囲気下に試験物質と共に又は試験物質なしで１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地中、３７℃で２４時間インキュベートした。１２Ｍ ＨＣｌの添加によってＭＥＭイーグル培地中の炭酸水素濃度を１５ｍＭに低下させた。各々の実験において、カルシトニン（サケカルシトニン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０−１１Ｍ又は１０−１２Ｍの濃度で陽性対照として加えた。１つの実験では、骨吸収を刺激するため、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ；ウシ１−３４、Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０−８Ｍの濃度で添加した。各々の試験物質について８つの切片を使用し、未処置対照に関しては２×８切片を使用した。固定後、破骨細胞を酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（キット３８６−Ａ、Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に関して染色し、ＴＲＡＰ陽性（ＴＲＡＰ＋）多核（２個以上の核）細胞（ＭＮＣ）としてブラインド計数した。細胞を除去した後、切片を金でスパッター被覆し、吸収孔を、Ｖｉｔｔｅ，Ｃ．；Ｆｌｅｉｓｃｈ．Ｈ．：Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９６，１３７，２３２４−２３３３に述べられている工程でブラインド計数した。破骨細胞吸収活性を吸収孔／ＴＲＡＰ＋ＭＮＣの比として算定した。
【０１３４】
３．８ 結果及び考察。インビボ及びインビトロで活性なエタノール抽出物の非イオン性高分子逆相及び順相カラムでの連続的バイオアッセイ誘導クロマトグラフィー分画は、それぞれ画分Ａ（５１．５２％（ｗ／ｗ）、前の画分に対応する平均収率）、Ａ１（３６．４８％）及びＡ１−４（７．３４％）を生じた。画分Ａ１−４ １０．５ｍｇをセミ分取ＲＰ−１８ ＨＰＬＣによって精製し、画分Ａ１−４Ｃ（ＧＰＣＳ）１．６ｍｇ（１５．２０％）を得た。
【０１３５】
タマネギからの骨吸収阻害活性は極性画分Ａに関連する（図１）。これに対し、フラボノイドを含む画分Ｂは、インビボで乾燥タマネギ１ｇに相当する用量で試験したとき活性を持たない。これは、タマネギ中に豊富なフラボノイド、ルチンがタマネギ及び他の植物で認められる作用の原因であり得る（Ｎａｔｕｒｅ １９９９，４０１，３４３−３４４）と提案した他の研究者の意見（Ｈｏｒｃａｊａｄａ−Ｍｏｌｔｅｎｉ，Ｍ．Ｎ．；Ｃｒｅｓｐｙ，Ｖ．；Ｃｏｘａｍ，Ｖ．；Ｄａｖｉｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｒｅｍｅｓｙ，Ｃ．；Ｂａｒｌｅｔ，Ｊ．Ｐ．Ｒｕｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２０００，１５，２２５１−２２５８に述べられている）と対照的である。この試験では、ルチンの単一薬理用量はラットにおける骨損失を抑制したが、植物１ｇ中に含まれる量よりもはるかに高い用量であった（Ｎａｔｕｒｅ １９９９，４０１，３４３−３４４）。従って、ルチンがインビボで骨吸収の抑制に寄与するかどうかは議論の余地がある（Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｒｕｔｉｎ ｃａｎｎｏｔ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．（編集者宛ての書信）。Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００１，１６，９７０；及びＢａｒｌｅｔ，Ｊ．Ｐ．Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｕｔ（ｉｎ） ｔｈｅ ｒｏａｄ．（返信）。Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００１，１６，９７１）。
【０１３６】
画分Ａはまた、１．７４、１７．４及び５２．２ｍｇ／ｍＬの乾燥タマネギ当量に相当する用量で試験したときインビトロで破骨細胞の吸収活性を阻害する（図２）。従って、このインビトロモデルは、活性試験のために小量の物質しか必要としないので、バイオアッセイとして使用することができる。画分Ｂも、９、１７及び２６ｍｇ／ｍＬの乾燥タマネギに等しい用量、すなわち０．０６、０．１２及び０．１８ｍｇ／ｍＬ培地でこのモデルにおいて検討した（結果は示していない）。より高濃度では親油性物質は細胞傷害性であるが（非常に低い数の生存細胞及び壊死細胞の多くの断片）、細胞数に無視し得る程度の作用しか及ぼさない用量である、９ｍｇ／ｍＬタマネギ当量で、本発明者らは作用を検出することができなかった。従って、タマネギフラボノイドを含む画分Ｂもインビトロで不活性とみなされた。これは、ルチンは骨代謝への植物の作用を説明できないことを示唆する本発明者らの付加的な証拠と一致する（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００１，１６，９７０）。
【０１３７】
セミ分取ＨＰＬＣ及び活性スクリーニングを用いたさらに広汎な単離作業により、Ａ１−４Ｃが出発物質Ａ１−４から誘導される唯一の活性画分と特定することができた（図３）。さらに、Ａ１−４Ｃより先に溶出する（画分Ａ１−４Ａ及びＡ１−４Ｂ）及び後に溶出する（画分Ａ１−４Ｄ）、プールしたＨＰＬＣピークを試験した（２．５３ｍｇ／ｍｌ）が、これらは細胞傷害性であるため、結論を引き出すことができなかった（結果は示していない）。ＨＰＬＣは、画分Ａ１−４Ｃが単一化合物から成ることを示したので、続く特定を試みた。
【０１３８】
画分Ａ１−４Ｃに関するＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ実験は、正及び負イオン化モードでそれぞれｍ／ｚ３０７及びｍ／ｚ３０５の親イオンを示した。従って、画分Ａ１−４Ｃ中の化合物の非荷電分子イオンは３０６μであった。タマネギ化合物の文献の調査（Ｂｒｅｕ，Ｗ．Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ．（ｏｎｉｏｎ）Ｐａｒｔ １：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９６，３，２９３−３０６）は、この化合物がγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ＧＰＣＳ；図５参照）であることを明らかにした。さらに、認められたｍ／ｚ１３０という質量は、他の研究者達（Ｉｓｏｂｅ，Ｍ．；Ｕｙａｋｕｌ，Ｄ．；Ｌｉｕ，Ｋ．Ｌ．；Ｇｏｔｏ，Ｔ．ＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０，５４，１６５１−１６６０．）によって記述されているγ−グルタミル型結合の存在に適合した。酸加水分解後のＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳスペクトルでは、グルタミン酸、システイン及びシスチンに対応する断片が認められ、仮説を確認した。１Ｈ−、１Ｈ／１Ｈ ＣＯＳＹ及び１３Ｃ／１Ｈ ＨＳＱＣ ＮＭＲ測定は、分子内の２つのアミノ酸、グルタミン酸（Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０及びＣ１１）、システイン（Ｃ４、Ｃ５及びＣ６）、及び二重結合を有する脂肪族Ｃ鎖（Ｃ１、Ｃ２及びＣ３）の存在を確認した（図５）。Ｈ２とＨ３の間の１５．２６Ｈｚという結合定数はトランス配置を指示した（Ｋｕｔｔａｎ，Ｒ．；Ｎａｉｒ，Ｎ．Ｇ．；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．Ｎ．；Ｓｐａｎｄｅ，Ｔ．Ｆ．；Ｙｅｈ，Ｈ．Ｊ．；Ｗｉｔｋｏｐ，Ｂ．Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｓ−（ｔｒａｎｓ−１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓａｎｄａｌ （Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ Ｌ）．Ａｎ ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｄｉａｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４，１３，４３９４−４４００）。化学シフト及びカップリングについては表１参照。１３Ｃ／１Ｈ ＨＭＢＣスペクトルにおける１３Ｃ−カルボキシ領域への焦点化は、グルタミン酸のγ−Ｃ７（１７４．００ｐｐｍ）とシステインのα−Ｈ５（４．５０ｐｐｍ）及びグルタミン酸の２つのγ−Ｈ８（２．５０ｐｐｍ）とのカップリング及びグルタミン酸のα−Ｃ１１（１７３．１０ｐｐｍ）とグルタミン酸のα−Ｈ１０（３．８０ｐｐｍ）だけとのカップリングを明らかにした。これは、分子内のγ−グルタミル型結合の存在を明らかに証明する。この所見は、ＧＰＣＳの純粋な標準試料とのスペクトル比較によって確認された（Ｓｈａｗ，Ｍ．Ｌ．；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．；Ｌａｎｅ，Ｇ．Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇ ｇｌｕｔａｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｏｎｉｏｎ ｂｕｌｂｓ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）．Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ １９８９，４８，４５９−４６７）。
【０１３９】
画分Ａ １０８．０ｇを最初に陽イオン、次いで陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供することによってＧＰＣＳのアップスケール単離を実施し、それぞれ陽イオン画分６．９７４ｇ（６．４６％）及びＧＰＣＳ ７８８．０ｍｇ（０．７３％）を生成した。ＧＰＣＳを含まない画分を廃棄した。この方法によって単離したＧＰＣＳは、破骨細胞をＰＴＨで刺激するか否かに関わらず、破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する（図４）。しかし、ＰＴＨを培養に添加したときの方が添加しないときよりも阻害の程度が幾分小さい。これは陽性対照であるカルシトニンにも当てはまると思われる。画分Ａ１−４Ｃは、０．５３ｍｇ／ｍＬの濃度で、すなわち１．７ｍＭ ＧＰＣＳで活性であったが、本実験では、２ｍＭでは阻害は有意でなかった。合わせて考慮すると、このモデルにおけるＧＰＣＳの最小有効量は、ＰＴＨで刺激しない培養物では約２ｍＭ付近であると思われる。ＰＴＨで刺激した培養物では、この値は２から４ｍＭの間であり、図４からのグラフの補間法は、約３ｍＭ付近であり得ることを示唆する。
【０１４０】
画分Ａ１−４Ｃの他の成分は阻害活性を示さなかったので、ＧＰＣＳがインビトロでの骨吸収へのタマネギの作用の原因であると思われ、十分な化合物が入手可能になり次第、インビボで確認されるべき論点である。骨粗しょう症モデルにおいて骨量減少を抑制するのに必要な用量を確立するため、及び骨細胞へのこの作用機構を検討するための今後の試験も必要である。現在の文献によれば、骨の健康を支える、植物由来食品中に生じる化合物は、ミネラル（カルシウム、カリウム及びマグネシウム）、ビタミン（Ｋ及びＣ）、植物エストロゲン（クメストロール、ゼアラレノール、イソフラボン及びフムロン）、おそらくは他のフラボノイド（ルチン及びヘスペリジン）及びモノテルペンに限られている（Ｈｏｒｃａｊａｄａ−Ｍｏｌｔｅｎｉ，Ｍ．Ｎ．；Ｃｒｅｓｐｙ，Ｖ．；Ｃｏｘａｍ，Ｖ．；Ｄａｖｉｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｒｅｍｅｓｙ，Ｃ．；Ｂａｒｌｅｔ，Ｊ．Ｐ．Ｒｕｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２０００，１５，２２５１−２２５８；Ｔｕｃｋｅｒ， Ｋ．Ｌ．；Ｈａｎｎａｎ，Ｍ．Ｔ．；Ｃｈｅｎ，Ｈ．；Ｃｕｐｐｌｅｓ，Ｌ．Ａ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．；Ｋｉｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ａｎｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｉｎｔａｋｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔｅｒ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｍｅｎ ａｎｄ ｗｏｍｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９９，９，７２７−７３６；Ｎｅｗ，Ｓ．Ａ．；Ｂｏｌｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．；Ｇｒｕｂｂ，Ｄ．Ａ．；Ｒｅｉｄ，Ｄ．Ｍ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ：ａ ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９７，６５，１８３１−１８３９；ａｎｄ Ｄｒａｐｅｒ，Ｃ．Ｒ．；Ｅｄｅｌ，Ｍ．Ｊ．；Ｄｉｃｋ，ｌ．Ｍ．；Ｒａｎｄａｌｌ，Ａ．Ｇ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｂ．；Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ｌ．Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｒｅｄｕｃｅ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｏｏｐｈｏｒｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ １９９７，１２７，１７９５−１７９９；Ａｒｊｍａｎｄｉ，Ｂ．Ｈ．；Ａｌｅｋｅｌ，Ｌ．；Ｈｏｌｌｉｓ，Ｂ．Ｗ．；Ａｍｉｎ，Ｄ．；Ｓｔａｃｅｗｉｃｚ−Ｓａｐｕｎｔｚａｋｉｓ，Ｍ．；Ｇｕｏ，Ｐ．；Ｋｕｋｒｅｊａ，Ｓ．Ｃ．Ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ １９９６，１２６，１６１− １６７）。そこで、骨に対して活性な化合物、従って骨粗しょう症への食事アプローチのための候補物質は植物界に広く分布する。
【０１４１】
本発明者らは、乾燥タマネギ１ｇ中に１７．３ｍｇ、すなわち１．７３％（ｗ／ｗ）のＧＰＣＳを見出した。この結果は、乾燥重量の０．５８−２．８８％の範囲内のＧＰＣＳ濃度を測定した他の研究者達の所見と一致する（Ｓｈａｗ，Ｍ．Ｌ．；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｊ． Ｅ．；Ｌａｎｅ，Ｇ．Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｏｎｉｏｎ ｂｕｌｂｓ （Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）．Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ １９８９，４８，４５９−４６７；及びＫｏｐｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．；Ｒａｎｄｌｅ，Ｗ．Ｍ．Ｓｅｌｅｎｉｕｍ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ Ｓ−ａｌｋ（ｅｎ）ｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅｓ ａｍｏｎｇ ｓｈｏｒｔ−ｄａｙ ｏｎｉｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔｉｃ Ｓｃｉ １９９９，１２４，３０７−３１１）。
【０１４２】
骨吸収細胞の活性を阻害する化合物としてのＧＰＣＳの特定は、さらにもう１つ別のクラスの分子に属するもう１つ別の化合物を、骨に対して活性な天然化合物のリストに追加する。ＧＰＣＳが活性化合物のファミリーを代表するのか又は単独の活性化合物であるのかは現在のところ不明である。この問題を明らかにするためには、これまでに特定された他の２５の活性植物食品項目（Ｊ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）の作用におけるこの役割を検討すること、そして場合によりこのクラスの化合物の他の活性な成員を特定することが必要である。
【実施例４】
【０１４３】
以下は、粉末形態の本発明の栄養補助食品の適切な組成物の一例である。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
上記補助食品は、水と混合して、食事の間に、例えば１日２から４回、適切な濃度で摂取し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、乾燥タマネギ１ｇ（白い四角）、又はタマネギ１ｇに相当する乾燥タマネギアルコール抽出物６３９ｍｇ（白い三角）、又はタマネギ１ｇに相当する乾燥親水性画分Ａ５９５ｍｇ（黒い三角）、又は最後にタマネギ１ｇに相当する乾燥親油性画分Ｂ７．１ｍｇ（白い菱形）のいずれかを含む精製飼料を与えたラットにおける骨吸収への作用を例示するグラフである。未処置対照群の９５％信頼区間（ＣＩ；１．９６×ＳＥＭ）を斜線の背景の箱として示す。数値は平均±ＳＥＭである。対照についてはｎ＝６、処置群についてはｎ＝５。９５％ＣＩの外側の平均値は対照と有意に異なる（ｐ＜０．０５）（以前にＭｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｏｚａｎｏ，Ａ．；Ｒｅｉｎｌｉ，Ａ．；Ｗｅｔｌｉ，Ｈ．Ｖａｒｉｏｕｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，ｆｒｕｉｔｓ，ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ ａｎｄ ｒｅｄ ｗｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）の中で公表された）。
【図２】図２は、破骨細胞のインビトロ吸収活性への親水性画分Ａ及びカルシトニンの用量依存的作用を例示するグラフである。画分Ａは、１、１０及び３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、カルシトニンは１０−１２Ｍで培地に添加した。データ表示：処置群（ｎ＝８）の数値を処置／未処置の比±ＳＥＭとして示す。未処置対照群（ｎ＝１６）の９５％ＣＩ（１．９６×ＳＥＭ）を平均±ＳＥＭとして示す（斜線の背景の箱）。未処置群の９５％ＣＩの外側の平均値は有意に異なる（ｐ＜０．０５）（以前にＪ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）の中で公表された）。
【図３】図３は、破骨細胞のインビトロ吸収活性への様々なタマネギ画分及びカルシトニンの作用を例示するグラフである。画分Ａ１−４、Ａ１−４Ｂ及びＡ１−４Ｃをそれぞれ２．２８、０．４３及び０．５３ｍｇ／ｍＬの濃度で培地に添加した。カルシトニンは１０−１２Ｍの用量で使用した。データ表示は図２で述べたとおりである。
【図４】図４は、破骨細胞のインビトロ吸収活性へのＧＰＣＳ及びカルシトニンの作用を例示するグラフである。ＧＰＣＳは、２、４及び８ｍＭの濃度で培地に添加した。カルシトニンは１０−１１Ｍの用量で使用した。２つの別個の実験を実施した：１つは副甲状腺ホルモンの添加なし（パネルＡ）で、１つは骨吸収を刺激するために全ての培養物にＰＴＨ（１０−８Ｍ）を添加した。データ表示は図２で述べたとおりである。
【図５】図５は、γ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ＧＰＣＳ）の構造描写である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨吸収阻害活性を有する植物由来物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も一般的な代謝性骨疾患は骨粗しょう症である。骨粗しょう症は一般に、どちらの場合もこの結果は骨格組織の量の減少である、骨形成の低下又は骨吸収の促進のいずれかからの、骨の量の減少と定義することができる。成人における骨量は年齢と共に減少し、骨折の危険度上昇を導く。骨粗しょう症性骨折は、患者に苦痛を生じさせることに加えて、骨粗しょう症及び関連骨折についての直接支出が米国だけで年間約１７０億ドルに上るので、保健医療にとって大きな負担となっている（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｌ．Ｊ．；Ｈｅａｎｅｙ，Ｒ．Ｐ．Ｔｏｏ ｍｕｃｈ ｍｅｄｉｃｉｎｅ？Ｏｒ ｔｏｏ ｌｉｔｔｌｅ？Ｂｏｎｅ ２００３，３２，３２７−３３１）。
【０００３】
破骨細胞（骨吸収細胞）は、吸収過程における骨の一部の掘削の役割を担う。吸収後、骨芽細胞（骨形成細胞）が出現し、吸収された部分を新しい骨で再び満たす。
【０００４】
若年健常成人では、破骨細胞と骨芽細胞が形成されて機能する速度は、骨吸収と骨形成の間でバランスを維持する。しかし、加齢の正常な結果として、このリモデリング過程に不均衡が発現し、骨の減少を生じさせる。不均衡が長期にわたって継続すると、骨量の減少、従って骨強度の低下が骨折を導く。
【０００５】
骨粗しょう症の治療のための多くの組成物及び方法が医学文献において記述されている。例えばエストロゲン、カルシトニン及びビスホスホネートは骨吸収の有効な阻害剤であることが知られている。
【０００６】
この目標を達成するための栄養的アプローチは安価な手段である。しかし、今日推奨されている栄養戦略の効果はかなり控えめである。実際に、股関節骨折の相対的危険度への乳中のカルシウムの効果でさえも、カルシウムの摂取量が最も低い女性母集団の１０％に限定されると思われる（Ｋａｎｉｓ，Ｊ．Ａ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｂｏｎｅ １９９９，２４，２７９−２９０）。従って、骨量減少を予防する新規栄養戦略が求められている。
【０００７】
欧州特許第９８０２５０号は、中でも特に、ａｌｌｉｕｍ（ネギ・ニンニク属）の植物抽出物又は濃縮物を含有する栄養組成物、例えば獣医用組成物、又は医薬組成物、例えば動物薬、及びパジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は特に骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療又は予防のためのこれらの使用を開示する。欧州特許第９８０２５０号の対象は参照により本出願に組み込まれる。
【０００８】
ラットの食餌への７％のタマネギの添加は、発育中のラットにおいて骨吸収を低下させ、骨ミネラル含量を上昇させる（Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｆ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ １９９９，４０１，３４３−３４４）。この作用はタマネギの塩基過剰とは無関係である（Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｏｚａｎｏ，Ａ．；Ｒｅｉｎｌｉ，Ａ．Ｏｎｉｏｎ ａｎｄ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，ｓａｌａｄｓ ａｎｄ ｈｅｒｂｓ ａｆｆｅｃｔ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｂａｓｅ ｅｘｃｅｓｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００２，１７，１２３０−１２３６）。
【０００９】
さらに、タマネギからのエタノール抽出物は、骨粗しょう症モデルにおいて骨量減少を予防し、インビトロで破骨細胞の吸収作用を阻害した（Ｉｎｇｏｌｄ，Ｐ．；Ｋｎｅｉｓｓｅｌ，Ｍ．；Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｇａｓｓｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｏｎｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｉｂｉａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｎｄ ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｅｔ ｉｎ ａｇｅｄ ｒｅｔｉｒｅｄ ｂｒｅｅｄｅｒ ｒａｔｓ．Ｂｏｎｅ １９９８，２３，Ｓ３８７，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．Ｗ３８８；及びＭｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｆ．；Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｃｏｍｍｏｎ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎｓ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｏｎｅ １９９８，２３，Ｓ３８７，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．Ｗ３９１）。これは、骨吸収へのタマネギの阻害活性が薬理活性化合物によるものであり得ることを示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
エタノール抽出物の最初の分画はインビボでフラボノイド含有画分の活性を示さなかったが、代わりに、より極性の高い化合物の溶出で活性を示した。これは、タマネギ中に豊富なフラボノイドを試験するという容易なアプローチを陳腐化した。前記極性物質は破骨細胞の吸収活性も阻害したので、このインビトロ培養系はバイオアッセイとして使用することができ、骨吸収を阻害するタマネギ中の未知の化合物の単離と特定に着手することを本発明者らに促した。
【００１１】
しかし、骨吸収阻害作用に関与するａｌｌｉｕｍの活性成分はこれまで記述されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
骨吸収阻害作用に関与するａｌｌｉｕｍの活性成分は、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａなどのａｌｌｉｕｍの親水性エタノール抽出物中に見出し得る。骨吸収への潜在的阻害作用を有する活性成分は、γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドと特定された。
【００１３】
ここで使用する、ａｌｌｉｕｍという用語は、ａｌｌｉｕｍ属（ニンニクのラテン名、タマネギ科の成員）を指し、例えば植物種、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ（リーキ／無臭ニンニク）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ（チャイブ）、Ａｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック）、Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ニンニク）又はＡｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ（ネギ）の成員を含む。好ましい種は、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）及びＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック、ｂｅａｒ ｐａｗ ｇａｒｌｉｃとしても知られる）、特に最後の２つであり、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａが特に好ましい。
【００１４】
本発明の有効成分は、ａｌｌｉｕｍ、例えばＡｌｌｉｕｍ ｃｅｐａから、例えばこの植物の全食用部分から、分画によって、例えばインビトロバイオアッセイ誘導分画によって、例えば以下で述べるように単離し得る。又は、本発明の有効成分、特にこのシス形態は、例えば当業者に容易に公知のように、完全又は半化学合成によって入手し得る。
【００１５】
γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを、以下本発明の有効成分と称する。本発明によれば、本発明の有効成分は濃縮物形態であり得る。
【００１６】
従って、１つの態様では、本発明は、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための薬剤又は栄養製剤、例えば動物薬又は獣医用組成物、の製造における、例えば濃縮物形態の、γ−グルタミル−ペプチド、例えば濃縮物形態の、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの使用に関する。さらなる態様では、本発明は、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分及び場合により：
（ａ）許容される担体；
（ｂ）カルシウム源；
（ｃ）炭水化物、脂肪及び窒素源から成る群より選択される少なくとも１つのエネルギー源；
（ｄ）ビタミンＤ；又はこれらの何らかの組合せ
を含有する、栄養組成物、例えば獣医用組成物、又は医薬組成物、例えば動物薬、に関する。
【００１７】
本発明の１つの態様では、薬剤又は栄養製剤のγ−グルタミル−ペプチドは、破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する。
【００１８】
本発明のもう１つの態様では、薬剤又は栄養製剤は、少なくとも２ｍＭのγ−グルタミル−ペプチドの用量を有する。
【００１９】
本発明はさらに、骨吸収を抑制するために有効な量の、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する薬剤又は栄養製剤を、ヒト又は動物、例えば哺乳動物に投与することを含む、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための方法を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、この必要のあるヒト又は動物、例えば哺乳動物に、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の有効量を投与することを含む、骨吸収を抑制する方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、骨吸収上昇の食事療法における、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の使用を提供する。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｃ）例えば、
（ｃ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｃ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｃ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｃ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、順相中圧液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物の分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｃ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、
（ｅ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｅ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｅ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｅ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、ＮＰ−ＭＰＬＣを使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
（ｆ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物のインビトロバイオアッセイ誘導分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００２４】
画分Ａ１−４Ｃの化合物を、例えばＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置を使用する、例えば四重極イオントラップ（ＱＩＴ）を備えたＭＳを使用する、質量分析によって分析し得る。フラグメンテーションは、例えば３５％の衝突エネルギーを使用して、正に荷電したイオン化分子をヘリウムガスと衝突させることによって達成し得る。
【００２５】
画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造を、酸加水分解後ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによってさらに確認し得る。
【００２６】
さらに、画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、例えばＤ２Ｏを溶媒として使用し、トリメチルシリル−プロパンスルホン酸を外部標準として使用する、例えば１Ｈ−ＮＮＭＲ、１ＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲ、１Ｈ−Ｈ−ＣＯＳＹ、及び／又はｎＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲによって確認し得るか、又は画分Ａ１−４Ｃの化合物の分析のための他の手法は当業者に容易に公知である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
長期にわたる徹底的な試験後、今や意外にも、骨吸収阻害作用の役割を担う活性成分がＡｌｌｉｕｍ ｃｅｐａなどのａｌｌｉｕｍ親水性エタノール抽出物中に見出し得ることが発見された。骨吸収への潜在的阻害作用を有する活性成分は、γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドと特定された。
【００２８】
γ−グルタミル−ペプチド、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを、以下本発明の有効成分と称する。本発明によれば、本発明の有効成分は濃縮物形態であり得る。
【００２９】
従って、１つの態様では、本発明は、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための薬剤又は栄養製剤、例えば動物薬又は獣医用組成物、の製造における、例えば濃縮物形態の、γ−グルタミル−ペプチド、例えば濃縮物形態の、例えばγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド、さらなる例としてγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの使用に関する。さらなる態様では、本発明は、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する、栄養組成物、例えば獣医用組成物、又は医薬組成物、例えば動物薬、に関する。
【００３０】
本発明はさらに、骨吸収を抑制するために有効な量の、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する薬剤又は栄養製剤を、ヒト又は動物、例えば哺乳動物に投与することを含む、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症などの、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための方法を提供する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、この必要のあるヒト又は動物、例えば哺乳動物に、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の有効量を投与することを含む、骨吸収を抑制する方法を提供する。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、骨吸収上昇の食事療法における、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分を含有する組成物の使用を提供する。
【００３３】
ここで使用する骨粗しょう症は、ホルモン欠乏（例えば閉経後の）及び老年期によって誘導される骨粗しょう症、並びにステロイド治療に続発する又は神経性食欲不振によって引き起こされる栄養失調に起因する骨粗しょう症などの二次性骨粗しょう症を包含する。
【００３４】
本発明の有効成分は、ａｌｌｉｕｍ、例えばＡｌｌｉｕｍ ｃｅｐａから、例えばこの植物の全食用部分から、分画によって、例えばインビトロバイオアッセイ誘導分画によって、例えば以下で述べるように単離し得る。又は、本発明の有効成分、特にこのシス形態は、例えば当業者に容易に公知のように、完全又は半化学合成によって入手し得る。
【００３５】
１つの態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｃ）例えば、
（ｃ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｃ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｃ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｃ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、順相中圧液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物の分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィー、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４を使用することにより、以下画分Ａと称する、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｃ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、
（ｅ１）例えば６：５：３（ｖ／ｖ）の比率の、メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、
（ｅ２）例えば９ｍｌ：１ｍｌ：１滴の比率の、アセトン−水−塩酸３７％、
（ｅ３）例えば９：６：３：１（ｖ／ｖ）の比率の、ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、
（ｅ４）例えば６．４：５：１の比率の、クロロホルム−メタノール−水
から選択される移動相を使用する、例えば６．４：５：１のクロロホルム−メタノール−水を移動相として使用する、ＮＰ−ＭＰＬＣを使用することにより、画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
（ｅ）例えば、０．００６２５％ギ酸で緩衝した、無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用する、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
（ｆ）破骨細胞ピットアッセイを使用することにより、骨吸収阻害活性をインビトロで評価すること、
を含む、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａの親水性エタノール抽出物のインビトロバイオアッセイ誘導分画によって得られる、例えば濃縮物形態の、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを提供する。
【００３７】
破骨細胞ピットアッセイは十分に確立された骨吸収のインビトロモデルであり、当業者に容易に公知であることは認識される。簡単に述べると、試験する試料、例えば３０ｍｇ又はそれ以下の凍結乾燥親水性画分Ａ／ｍｌを含む培地を、象牙片上に置いた新生仔ラットの破骨細胞に添加する。２４時間のインキュベーション後、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性多核細胞、すなわち破骨細胞を計数する。続いて、吸収孔の数を判定する。活性を破骨細胞当りの吸収孔の割合として算定し、陰性対照、例えば１０％ウシ胎仔血清を含む培地、及び陽性対照、例えば１０−１２Ｍカルシトニンと比較する。統計的有意性の解析のために、処置群の割合±これらのそれぞれのＳＥＭを、陰性対照のＳＥＭの９５％信頼区間と比較する。
【００３８】
画分Ａ１−４Ｃの化合物を、例えばＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置を使用する、例えば四重極イオントラップ（ＱＩＴ）を備えたＭＳを使用する、質量分析によって分析し得る。フラグメンテーションは、例えば３５％の衝突エネルギーを使用して、正に荷電したイオン化分子をヘリウムガスと衝突させることによって達成し得る。
【００３９】
画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造を、酸加水分解後ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによってさらに確認し得る。
【００４０】
さらに、画分Ａ１−４Ｃの化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、例えばＤ２Ｏを溶媒として使用し、トリメチルシリル−プロパンスルホン酸を外部標準として使用する、例えば１Ｈ−ＮＮＭＲ、１ＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲ、１Ｈ−Ｈ−ＣＯＳＹ、及び／又はｎＪＣＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲによって確認し得る。
【００４１】
画分Ａ１−４Ｃの化合物の分析のためのこのような手法が当業者に容易に公知であることは認識される。
【００４２】
ここで使用する、ａｌｌｉｕｍという用語は、ａｌｌｉｕｍ属（ニンニクのラテン名、タマネギ科の成員）を指し、例えば植物種、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ（リーキ／無臭ニンニク）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ（チャイブ）、Ａｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック）、Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ニンニク）又はＡｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ（ネギ）の成員を含む。好ましい種は、Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ（エシャロット）、Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ（リーキ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）及びＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ（ベアガーリック、ｂｅａｒ ｐａｗ ｇａｒｌｉｃとしても知られる）、特に最後の２つであり、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａが特に好ましい。Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ種の成員の例は、一般的なタマネギ（赤色又は白色又は黄色外皮）又はエシャロットであり、赤色又は白色の一般的なタマネギが好ましい。
【００４３】
本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを含有する抽出物は、液体形態、例えば水性形態で、又は固体形態、例えば顆粒又は粉末形態で使用し得る。又は、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドは、それ自体で、例えば固体で、例えば粉末又は顆粒形態で使用し得るか、又は液体、例えば水性液体中に溶解又は分散し得る。
【００４４】
供給する本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの量は、中でも特に所望する治療、治療する被験者、例えばヒト又は動物、又は被験者の必要に依存して、広い範囲内で変化し得る。そこで、治療する被験者が成人（典型的には約６０から７５ｋｇ体重）である場合、骨吸収への満足し得る阻害作用は、一般に、例えば無溶媒ベースで、本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド約２０から約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約４０から約８０ｍｇ／ｋｇの１日投与量を与えるように製剤された組成物で得られ得る。
【００４５】
本発明によれば、「栄養組成物」という用語は、ヒト又は動物、例えば哺乳動物に適した、栄養製剤及び栄養製品を指す。本発明に従った栄養組成物は、例えば、動物栄養補助飼料、機能性食品、飲料製品、調理済み食品又は食品添加物などの、栄養補助食品、完全調整食、栄養又は健康補助食品の形態であり得る。
【００４６】
本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドを含有する適切な栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、本発明のさらなる目的である。従って、１つの態様では、本発明は、
（ａ）本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド、
（ｂ）カルシウム源、及び
（ｃ）炭水化物、脂肪及び窒素源から成る群より選択される少なくとも１つのエネルギー源、及び場合により
（ｄ）ビタミンＤ
を含有する栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料を提供する。
【００４７】
成分（ａ）に関しては、γ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドについての上記の定義、選択及び量が適用される。本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、好都合には、約２０から約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約４０から約８０ｍｇ／ｋｇの１日投与量を与える量の成分（ａ）を含有する。
【００４８】
カルシウム源（ｂ）は、カルシウムを含む生理学的に許容される無機又は有機化合物を含み得る。例は、無機カルシウム塩、例えば塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム又は炭酸カルシウム、又は全脂粉乳又は脱脂粉乳のような有機カルシウム成分、カゼインカルシウム、又はクエン酸カルシウム、マレイン酸カルシウムなどの有機酸のカルシウム塩、又はこれらの混合物である。カルシウム源（ｂ）としての、有機カルシウム化合物、特に脱脂粉乳、カゼインカルシウム又はこれらの混合物の使用は好ましい。供給するカルシウム成分の量は広い範囲内で変化し得る。一般に、本発明の組成物は、１単位投与量中に約１００ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは２００ｍｇから７００ｍｇ、最も好ましくは３００から６００ｍｇのカルシウムを含む（元素ベースで）。
【００４９】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、好都合には、例えば約１から６０重量％、好ましくは約５から５０重量％、最も好ましくは約１０から４０重量％のカルシウム成分（ｂ）を含む。
【００５０】
適切な炭水化物源は、例えばマルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット及び／又はソルビットを含む。これらの形態では、炭水化物はエネルギー供給源及び甘味料の両方である。本発明の組成物は、１又はそれ以上の異なる炭水化物源を含み得る。
【００５１】
適切な脂肪源は、ω−６多不飽和脂肪酸源、ω−３多不飽和脂肪酸源、単不飽和脂肪酸源、中鎖脂肪酸源（すなわちＣ６−Ｃ１２−脂肪酸）、又はこれらの混合物を含む。上記脂肪酸は、各々の場合に、遊離酸の形態、モノ、ジ又は特にトリグリセリド形態、又は薬理的に又は栄養上許容される自然源の形態で使用し得る。
【００５２】
ω−６多不飽和脂肪酸の適切な自然源は、紅花油、ヒマワリ油、ダイズ油、綿実油及びトウモロコシ油などの植物油を含む。ω−３多不飽和脂肪酸の適切な自然源は、亜麻仁油、及びニシン油、サケ油、サバ油、マグロ油、肝油及びアンチョビー油などの魚油を含む。
【００５３】
単不飽和脂肪酸源の適切な自然源は、特にω−９単不飽和脂肪酸、例えばオリーブ、カノーラ、紅花（ハイブリッド）及びヒマワリ（ハイブリッド）である。
【００５４】
好ましい脂肪源は、所望量のω−６多不飽和脂肪酸及びω−３多不飽和脂肪酸を供給し、中鎖脂肪酸残基（すなわちＣ６−Ｃ１２−脂肪酸の残基）及び／又は単不飽和脂肪酸残基に富む、トリグリセリド油を含む。本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料は、１又はそれ以上の異なる脂肪源を含み得る。
【００５５】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の適切な窒素源の例は、ダイズ由来タンパク質、乳清タンパク質又はカゼイン塩などの乳タンパク質、及び／又はタンパク質加水分解産物、及び／又は遊離アミノ酸形態又は塩形態の必須アミノ酸混合物、及び／又は遊離アミノ酸形態又は塩形態の、アルギニン、アルギニン前駆体、オルニチン等のようなポリアミドの合成に関連する化合物などの、栄養的に許容されるタンパク質を含むソースを包含する。
【００５６】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の好ましい窒素源は、
（ｉ）ダイズの形態又は何らかの適切なダイズ抽出物又は濃縮物の形態、例えばダイズ粉、乾燥モヤシ、豆乳の形態、又はダイズからの乾燥水抽出物として使用し得る、ダイズ由来タンパク質；又は
（ｉｉ）乳タンパク質、例えば、乳清粉末、カゼインカルシウムなどのカゼイン塩及び／又は全脂粉乳又は好ましくは脱脂粉乳の形態で使用し得る、乳清由来タンパク質又はカゼイン塩、及び／又は
（ｉｉｉ）必須アミノ酸混合物、及び／又は
（ｉｖ）窒素源としてのアルギニン
である。
【００５７】
乳清粉末、カゼイン塩、特にカゼインカルシウム、及び／又は脱脂粉乳などの乳タンパク質は、特許請求する栄養組成物のもう１つの特に好ましい窒素源である。本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料は、１又はそれ以上の異なる窒素源を含み得る。
【００５８】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、例えば約０．１重量％から９８．９重量％、好ましくは約１から約９５重量％、最も好ましくは１０から９０重量％のエネルギー源成分（ｃ）を含む。
【００５９】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の熱量への窒素源、炭水化物源及び脂肪源の寄与は、広い範囲内で変化し得る。例えば炭水化物源は、総エネルギー供給量の３０から７０％、窒素源は５から４０％、及び脂肪源は０．１から１５％を提供する。本発明の好ましい組成物では、炭水化物源は、組成物の総エネルギー供給量の４０から６０％、窒素源は２０から３５％、及び脂肪源は３から１２％を提供する。
【００６０】
本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料の好ましいエネルギー源（ｃ）は、総エネルギー供給量の３０から７０％の、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット及びソルビットから成る群より選択される１又はそれ以上の炭水化物源；
総エネルギー供給量の５から４５％の、ダイズ由来タンパク質、乳タンパク質、必須アミノ酸の混合物及びアルギニンから成る群より選択される１又はそれ以上の窒素源；
総エネルギー供給量の０．１から１５％の、ω−３及びω−６多不飽和脂肪酸を含む１又はそれ以上の脂肪源
を含む。
【００６１】
本発明の組成物の特に好ましいエネルギー源（ｃ）は、総エネルギー供給量の４０から６０％の、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット及びソルビットから成る群より選択される１又はそれ以上の炭水化物源；
総エネルギー供給量の２０から３５％の、ダイズ由来タンパク質、脱脂粉乳及びカゼイン塩から成る群より選択される１又はそれ以上の窒素源；
総エネルギー供給量の３から１２％の、ω−３及びω−６多不飽和脂肪酸を含む１又はそれ以上の脂肪源を含む。
【００６２】
供給するビタミンＤ（場合により含まれる成分（ｄ））の量は広い範囲内で変化し得る。一般に、本発明の組成物は、１単位投与量中に約４００ＩＵから１０００ＩＵ、好ましくは約５００ＩＵを含む。
【００６３】
本発明の栄養製剤、例えば動物栄養補助飼料は、ビタミン、ミネラル、微量元素、繊維（好ましくは可溶性繊維）、香味料、防腐剤、着色料、甘味料及び乳化剤等のような他の栄養上許容される成分を含み得る。
【００６４】
本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料中に組み込むのに適するビタミンの例は、製薬又は栄養上許容される形態のビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、葉酸、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、ビオチン及びパントテン酸を含む。
【００６５】
本発明の組成物、例えば動物栄養補助飼料中に組み込むのに適するミネラル元素及び微量元素の例は、製薬又は栄養上許容される形態のナトリウム、カリウム、リン、マグネシウム、銅、亜鉛、鉄、セレン、クロム及びモリブデンを含む。
【００６６】
ここで使用する可溶性繊維という用語は、結腸内で実質的に発酵を受けて短鎖脂肪酸を生成する繊維を指す。適切な可溶性繊維の例は、寒天、アルギン酸塩、カルビン、カラゲナン、アラビアゴム、グアーガム、カラヤゴム、ローカストビーンゴム、トラガカント又はキサンタンガムを含む。これらは加水分解されていてもよく又は加水分解されていなくてもよい。
【００６７】
適切な香味料は、天然又は人工香味料、例えばバナナ、オレンジ、ピーチ、パイナップル又はラズベリーなどの果物香味料；又はバニラ、ココア、チョコレート、コーヒー等を含む。
【００６８】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料の好ましい成分は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）に加えて、β−カロテン（ビタミンＡ）、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チアミン、ビタミンＢ１、Ｂ６及び／又はＢ１２、カリウム、マグネシウム、セレン、亜鉛、リン及び製薬又は栄養上許容される形態の可溶性繊維を含む。
【００６９】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、約０．１重量％から１５重量％、好ましくは約０．２から約１０重量％、最も好ましくは０．５から５重量％の、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び場合により（ｄ）以外のこれらの付加的な成分を含み得る。
【００７０】
本発明の栄養製剤、例えば動物栄養補助飼料は、経腸投与、例えば経口投与又は経管栄養法、例えば経鼻投与に適する何らかの形態に製剤し、投与し得る。製剤は、好都合には水性液体の形態で投与される。腸内適用に適する製剤は、従って、好ましくは水性形態又は粉末又は顆粒形態であり、前記粉末又は顆粒は、好都合には使用前に水に添加される。経管栄養法としての使用に関しては、添加する水の量は、中でも特に、患者の液体必要量及び状態に依存する。
【００７１】
本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、単独栄養源として使用するとき、基本的に１日当りのカロリー、窒素、脂肪酸、ビタミン、ミネラル及び微量元素必要量の全てを満たすような、完全調整食（液体又は粉末形態）の形態であり得る。一般に、成人に供給すべき１日量は、７５０から３５００ｋｃａｌ／日、特に１０００から２０００ｋｃａｌ／日の範囲内である。しかし、本発明の栄養組成物は、好ましくは栄養補助食品としての使用を意図する。補助食品によって供給されるエネルギーの量は、不必要に患者の食欲を抑制しないために、あまりに過剰であってはいけない。補助食品は、好都合には５０から１５００ｋｃａｌ／日、好ましくは１００から９００ｋｃａｌ／日、最も好ましくは１５０から７００ｋｃａｌ／日を供給する量のエネルギー源を含む。
【００７２】
液体形態、例えば飲料形態、又は固体形態、例えば顆粒又は粉末形態の、本発明の栄養組成物、例えば動物栄養補助飼料は、それ自体公知のように、例えば成分を混合し、場合により水を添加することによって入手し得る。
【００７３】
本発明はさらに、
（ａ）本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド、
（ｂ）医薬として許容される担体、例えば動物によって生理学的に良好に耐容される担体
を含有する個別単位用量形態の医薬組成物、例えば動物薬又は獣医用組成物に関する。
【００７４】
これらの医薬組成物、例えば獣医用組成物は、経口、経鼻又は直腸投与などの経腸投与用の組成物である。適切な医薬組成物は、液体形態又は固体形態であり得、例えば約０．００１重量％から１００重量％、さらなる例として約０．１重量％から約５０重量％の有効成分（ａ）を含有する。
【００７５】
経腸投与用の医薬組成物、例えば獣医用組成物は、例えば糖衣丸、錠剤、カプセル、小袋などの個別単位用量形態のものである。これらは、それ自体公知のように、例えば従来の混合、造粒、調合、溶解又は凍結乾燥工程によって、製造される。
【００７６】
例えば経口投与用の医薬組成物は、有効成分を固体担体と組み合わせること、場合により生じた混合物を造粒し、所望に応じて又は必要に応じて適切な賦形剤の添加後、混合物又は顆粒を加工して錠剤又は糖衣丸コアを形成することによって入手できる。
【００７７】
適切な担体は、特に、糖類、例えばラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビット、セルロース製剤及び／又はリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウムなどの充填剤、及びまた、例えばトウモロコシ、小麦、コメ又はジャガイモデンプンを使用するデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドンなどの結合剤、及び所望する場合は、上述したデンプン及びまたカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムのようなこの塩などの崩壊剤である。賦形剤は、特に流動調整剤及び潤滑剤、例えばケイ酸、滑石、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム又はカルシウムのようなこの塩、及び／又はポリエチレングリコールである。糖衣丸コアは、適切な、場合により腸溶性の、剤皮で提供され、中でも特に、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、又は適切な有機溶媒又は溶媒混合物中の剤皮溶液、又は腸溶剤皮の製造のための、フタル酸アセチルセルロース又はフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース製剤の溶液が使用される。例えば特定のため又は有効成分の異なる用量を指示するために、錠剤又は糖衣丸コアに染料又は色素を添加してもよい。
【００７８】
他の経口投与用医薬組成物は、硬ゼラチンカプセル及びまたゼラチンとグリセロール又はソルビットなどの可塑剤から成る軟密閉カプセルである。硬ゼラチンカプセルは、顆粒の形態の有効成分を、例えばラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又は滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの流動促進剤、及び所望に応じて安定剤と混合して含み得る。軟カプセルでは、有効成分は、好ましくは脂肪油、パラフィン油又は液状ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解又は懸濁され、さらに安定剤を添加することも可能である。
【００７９】
適切な直腸投与用医薬組成物は、例えば有効成分と坐薬基剤物質の組合せから成る坐薬である。適切な坐薬基剤物質は、例えば天然又は合成トリグリセリド、パラフィン系炭化水素、ポリエチレングリコール又は高級アルカノールである。有効成分と基剤物質の組合せを含有するゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。適切な基剤物質は、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール又はパラフィン系炭化水素である。
【００８０】
骨吸収への本発明の有効成分、例えばγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドの阻害作用は、例えば上記で述べたように、新鮮単離破骨細胞をこの上に置いた象牙片を、試験する抽出物又は濃縮物を含む培地と共にインキュベートするインビトロアッセイによって評価し得る。象牙片上の破骨細胞吸収孔を計数することによって破骨細胞への阻害作用を評価する。
【００８１】
以下の実施例は本発明を例示する。
【実施例１】
【００８２】
バイオアッセイ誘導分画
１．１ 親水性タマネギ画分、画分Ａを得るために、吸着カラムクロマトグラフィーを使用する。８５％エタノール水溶液を使用してカラムにスラリー充填する。充填後、固定相（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４）をエタノール４００ｍｌ、８５％エタノール水溶液５００ｍｌ、水２５００ｍｌ及び８５％エタノール水溶液５００ｍｌで段階的に洗浄する。洗浄後、固定相を、分離のために使用する第一溶媒、すなわち１５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）で予備処理する。
【００８３】
乾燥タマネギ粉末３８．１０ｇを１５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）６００ｍｌに溶解し、一定攪拌下で３０分間加熱する（６０℃）。室温に冷却した後、混濁溶液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を分画に供する。残留物を廃棄する。
【００８４】
フラボノイド、例えばケルセチンを含まないプールした１５％水性分画、及びフラボノイドを含む８５％水性エタノール画分を真空下に４０℃で還元して、凍結乾燥する。水画分を廃棄する。
【００８５】
１．２ 画分Ａの活性成分からフルクトース、グルコース及びスクロースなどのサッカリドを分離するため、５％メタノール水溶液を移動相として使用する、予備逆相高性能薄層クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＴＬＣ）実験を実施した。前記方法を逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）カラムでアップスケールし、画分Ａの１．０ｇ試料を分離に供する。検出のためにアニスアルデヒド試薬を使用して、ＴＬＣによって分画モニタリングを実施する。できるだけ多くの出発物質を回収するため、各々の実施後、カラムをメタノールで十分に洗浄する。
【００８６】
親水性タマネギ画分、画分Ａの骨吸収阻害化合物を単離するため、バイオアッセイ誘導分画を実施する。骨吸収阻害活性をインビトロで評価するため、破骨細胞ピットアッセイを使用する。３０ｍｇ又はそれ以下の凍結乾燥親水性画分／ｍｌを含む培地を、象牙片上に置いた新生仔ラットの破骨細胞に添加する。２４時間のインキュベーション後、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性多核細胞、すなわち破骨細胞を計数する。続いて、吸収孔の数を判定する。活性を破骨細胞当りの吸収孔の割合として算定し、陰性対照、すなわち１０％ウシ胎仔血清を含む培地、及び陽性対照、すなわち１０−１２Ｍカルシトニンと比較する。統計的有意性の解析のために、処置群の割合±これらのそれぞれのＳＥＭを、陰性対照のＳＥＭの９５％信頼区間と比較する。
【００８７】
ａ）ＲＰ−ＭＰＬＣ分画のＴＬＣスクリーニング及び収量
サッカリドを含む画分を「画分Ａ２」と称し、サッカリドを含まない画分を「画分Ａ１」と称する。
【００８８】
【表１】
【００８９】
ｂ）ＲＰ−ＭＰＬＣ分画の生物学的結果
用量をｍｇ／ｍｌで示し、結果を吸収孔／酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性（ＴＲＡＰ＋）多核細胞±ＳＥＭとして示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】
ｃ）考察及び結論
１倍比例量（１２ｍｇ／ｍｌ）で試験した画分Ａ１は、破骨細胞活性を有意に阻害しない。しかし、２倍用量（２４ｍｇ／ｍｌ）は、破骨細胞活性を０．１４４の吸収孔／細胞比に有意に低下させ（１２ｍｇ／ｍｌに比して−４０％）、３０ｍｇ／ｍｌではより一層強力な破骨活性の阻害、すなわち０．０１５及び０．０２０吸収孔／細胞（１２ｍｇ／ｍｌに比して−９０％）が測定できる。画分Ａ１は破骨細胞活性を阻害する化合物を含むと結論される。
【００９２】
画分Ａ２によるわずかな破骨細胞活性の阻害は、少量の画分Ａ１の化合物の存在によって説明し得る。
【００９３】
バイオアッセイ誘導分画を継続するために画分Ａ１を選択し、画分Ａ２を廃棄する。骨吸収阻害性化合物がまだサッカリドで溶出したので、活性化合物からサッカリドを分離するためにさらなる分画を実施する。
【００９４】
１．３ 次の分取分離のために適切な方法を選択するため、極性化合物又は糖類のＮＰ−ＴＬＣのための４つの異なる移動相を試験する。系の分離効率を評価するため、画分Ａ１とサッカリド、フルクトース、グルコース及びスクロースを試料として使用する：
（ａ）メチルエチルケトン−酢酸−メタノール、６：５：３（ｖ／ｖ）、
（ｂ）アセトン−水−塩酸３７％、９ｍｌ：１ｍｌ：１滴、
（ｃ）ｎ−ブタノール−酢酸−ジエチルエーテル−水、９：６：３：１（ｖ／ｖ）、
（ｄ）クロロホルム−メタノール−水、６．４：５：１。
【００９５】
全てのＴＬＣをＮＰ−ＴＬＣで実施し、視覚化のためにアニスアルデヒド試薬を噴霧する。使用した移動相の間に著明な定性的相違は存在しない。次の分取分離工程を実施するために移動相（ｄ）を選択した。
【００９６】
上述したＮＰ−ＴＬＣ計をＮＰ−ＭＰＬＣカラムにアップスケールし、画分Ａ１の４００ｍｇ試料を分画に供する。再びＮＰ−ＴＬＣによって分画モニタリングを実施する。ＴＬＣでもはやそれ以上スポットが認められないとき、系を７０％メタノール水溶液（ｖ／ｖ）で十分に洗浄する。
【００９７】
ａ）ＮＰ−ＭＰＬＣ分画のＴＬＣスクリーニング及び収量
【００９８】
【表３】
【００９９】
ｂ）ＮＰ−ＭＰＬＣ分画の生物学的結果
用量をｍｇ／ｍｌで示し、結果を吸収孔／酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性（ＴＲＡＰ＋）多核細胞±ＳＥＭとして示す。分画の間の損失を相殺するため、画分Ａ１−２を除き、全ての画分を、画分Ａと比較してそれぞれの収量の１倍、２倍及び３倍比例量で試験する。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
ｃ）考察及び結論
画分Ａ１−１、Ａ１−２及びＡ１−３において阻害は測定されない。これら全ての画分の吸収孔／細胞比は、陰性対照のＳＥＭの９５％信頼区間内に位置する。全く糖類を含まない画分Ａ１−４は、３倍用量で有意の破骨細胞活性阻害を示す。１倍及び２倍用量での細胞活性の見かけ上の刺激は、細胞数の低下によるものである。画分Ａ１−４をさらなる分画のために選択する。
【０１０２】
１．４ セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）による画分Ａ１−４の分画
０．００６２５％ギ酸で緩衝した無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用して、画分Ａ１−４をＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣで４つの画分、Ａ１−４Ａ、Ａ１−４Ｂ、Ａ１−４Ｃ及びＡ１−４Ｄにさらに分画する。画分Ａ１−４Ｂは画分Ａ１−４の２つの少量の化合物を含み、画分Ａ１−４Ｃは画分Ａ１−４の最も主要な化合物から成り、画分Ａ１−４Ａ及びＡ１−４Ｄは前留出と後留出（ｐｒｅｒｕｎ ａｎｄ ａｆｔｅｒｒｕｎ）である。画分Ａ１−４ＡとＡ１−４Ｄをさらなる試験のために一緒にプールする。全体として、各ランの実施時に０．１２５ｍｇを適用し、各画分をプールする、６５回の単一ＨＰＬＣの実施により、画分Ａ１−４ ８．１２５ｍｇを分離する。分画は、ＨＰＬＣ装置の出口でタップを切り替えることによって手動で実施する。
【０１０３】
ａ）ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分画の収量
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
ｂ）ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分画の生物学的結果
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
ｃ）考察及び結論
画分Ａ１に相当する３倍比例量の画分Ａ１−４及び画分Ａ１−４Ｃは骨吸収を有意に（ｐ＜０．５）阻害する。画分Ａ１−４ＣはＡ１−４と同様に破骨活性を阻害し、Ａ１−４Ｃが画分Ａ１−４の唯一の活性化合物であることを示す。構造解明実験に十分な量を回収するためにＡ１−４Ｃの単離を反復する。
【０１０８】
要約：エタノール鱗茎抽出物を、４つの異なるクロマトグラフィー系−Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４抽出；ＲＰ−ＭＰＬＣ；ＮＰ−ＭＰＬＣ；及びセミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣの連続使用によって精製する。生じる画分Ａ１−４Ｃは、破骨活性を阻害する唯一の化合物から成る。
【０１０９】
以下のグラフは、画分Ａ１−４Ｃを導くバイオアッセイ誘導単離の概要を示す：
【０１１０】
【化１】
【実施例２】
【０１１１】
構造解明実験
２．１ Ａ１−４ＣのＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ２
Ａ１−４Ｃの構造に関する第一構造情報を得るためにＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置を用いて質量分析を実施する。前記ＭＳは四重極イオントラップを備える。フラグメンテーションは、３５％の衝突エネルギーを使用して、正に荷電したイオン化分子をヘリウムガスと衝突させることによって達成される。
【０１１２】
Ａ１−４Ｃの正電荷を有する親イオンは３０７ｍ／ｚ［ｍ＋Ｈ］＋である。文献検索により、同一質量のタマネギ化合物、すなわちγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ｇ−ＧＰｅＣＳＯ）の存在が明らかにされた。生じるフラグメンテーションパターンがこの化合物と一致し得るかどうかを調べるためにさらなるフラグメンテーションを実施する。
【０１１３】
２．２ 酸加水分解後のＡ１−４ＣのＥＳＩ−ＭＳ
ＥＳＩ−ＭＳによって得た結果は、画分Ａ１−４Ｃがｇ−ＧＰｅＣＳＯであるという推定をさらに裏づけ、先のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ実験結果と矛盾しない。
【０１１４】
２．３ Ａ１−４Ｃの核磁気共鳴実験
トリメチルシリル−プロパンスルホン酸を外部標準として使用して、Ｄ２Ｏ中で測定を実施する。
【０１１５】
画分Ａ１−４Ｃの化合物は、ＮＭＲ質量分析によってγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ｇ−ＧＰｅＣＳＯ）と特定することができ、先のＨＰＬＣ−ＭＳ実験を確認する。
【実施例３】
【０１１６】
バイオアッセイ誘導分画−スケールアップ単離
３．１ 抽出。タマネギの乾燥薄片（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ，Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）を粉砕し、４００ｇを、６０℃で１時間、エタノール水溶液（８５％ｖ／ｖ）２０００ｍＬで２回抽出し、ろ過した。エタノールの蒸発後、水性残留物を凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１１７】
３．２ バイオアッセイ誘導分画。画分Ａ及びＢ。タマネギ抽出物約３８ｇを１５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）６００ｍＬに再溶解し、一定攪拌下に６０℃で３０分間加熱した。室温に冷却した後、前記混合物を７０００ｒ．ｐ．ｍ．で２０分間遠心分離し、上清を吸着カラムクロマトグラフィーによる分画に供した（残留物は廃棄した）。画分Ａ及び画分Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を固定相として使用し、（１）１５％エタノール水溶液１２８０ｍＬ、（２）水１２８０ｍＬ及び（３）８５％エタノール水溶液１４００ｍＬを用いて１０ｍＬ／分の流速で溶出することによって生じた。クロロホルム−メタノール−水 ６．４：５：１（ｖ／ｖ）を移動相とし、ジフェニルホウ酸−β−エチルアミノエートの１％メタノール溶液、次いでポリエチレングリコール４０００の５％エタノール溶液で視覚化する、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４プレート１０×１０ｃｍ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、完全にフラボノイドを欠く親水性画分Ａを示し、一方親油性画分Ｂはフラボノイドを含んだ。画分Ａ及びＢを、次に、破骨細胞ピットアッセイ及び以下でさらに説明する［３Ｈ］−テトラサイクリン尿中排泄ラットモデルをそれぞれ使用することによってインビトロ及びインビボで試験した。画分Ａは骨吸収阻害作用を示し、一方画分Ｂは不活性であり、従って廃棄した。
【０１１８】
画分Ａ１及びＡ２．移動相５ｍＬに溶解した画分Ａの１ｇアリコートを、Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８、１５−２５μｍ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４６×２．５ｃｍと１３×１ｃｍのプレカラムでの中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ；６８１ポンプ、６８４自動分取装置、どちらもＢｕｅｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに分離した；溶出は、（１）５％メタノール水溶液３４０ｍＬ及び（２）メタノール３００ｍＬにより４ｍＬ／分の流速で実施した。６０の４ｍＬ画分のモニタリングを、水−メタノール １９：１を移動相とし、視覚化のためにアニスアルデヒド試薬（アニスアルデヒドの５％酢酸溶液、次に１２０℃で加熱）を用いて、ＲＰ−１８ Ｆ２５４１０×１０ｃｍプレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって実施した。画分Ａ１は主としてサッカリド（グルコース、フルクトース、スクロース）を含み、インビトロで活性であり、画分Ａ２はサッカリドを含まず、ほとんど不活性であり、従って廃棄した。
【０１１９】
画分Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ１−３、Ａ１−４。画分Ａ１の４００ｍｇアリコートを、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０、１５−４０μｍ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２２×２．５ｃｍと１３×１ｃｍのプレカラムでのＭＰＬＣによってさらに分離した；溶出は、（１）クロロホルム−メタノール−水 ６．４：５：１ １２０８ｍＬ及び（２）メタノール３００ｍＬにより４ｍＬ／分の流速で実施した。１２０の８ｍＬ画分のモニタリングを、ｎ−ブタノール−ｎ−プロパノール−酢酸−水 ３：１：１：１を移動相とし、視覚化のためにアニスアルデヒド試薬を用いて、Ｓｉｌｉｃａｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４１０×１０ｃｍプレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＴＬＣによって実施した。サッカリド不含画分Ａ１−４は有意のインビトロ活性を示し、サッカリド含有画分Ａ１−１、Ａ１−２及びＡ１−３は破骨細胞ピットアッセイにおいて活性ではなく、従ってさらなる試験は行わなかった。
【０１２０】
画分Ａ１−４Ａ、Ａ１−４Ｂ、Ａ１−４Ｃ、Ａ１−４Ｄ。画分Ａ１−４の０．１２５ｍｇのアリコートを、最後に、４０℃で、内径２５０×１０ｍｍのＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ５μｍカラムでのセミ分取無勾配高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＤＡＤ）を備えたＨＰ １０９０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。移動相は、１．５ｍＬ／分の流速の０．００６２５％ギ酸を含む水−アセトニトリル１：１であった。検出は１９５ｎｍであった。等しい画分をプールし、蒸発させて、凍結乾燥し、インビトロで試験した。主要ＨＰＬＣピークに対応し、クロマトグラフ的に純粋な画分Ａ１−４Ｃは、画分Ａ１−４とほぼ同様に強さで破骨細胞活性を阻害し、他の全ての画分は不活性であった。
【０１２１】
３．３ Ａ１−４Ｃのスケールアップ単離。より大量のＡ１−４Ｃ（ＧＰＣＳ）の製造のために、水に溶解した画分Ａの１０．８ｇアリコートを、最初に、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を満たした４３×３ｃｍカラムでの陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分離した。非陽イオン画分を水９７５ｍＬで溶出し、陽イオン画分を１５−２０ｍＬ／分の流速の０．７５Ｍアンモニア １４２５ｍＬで溶出した。ｎ−ブタノール−ｎ−プロパノール−酢酸−水 ３：１：１：１を移動相とし、視覚化のためにアセトアルデヒド及びニンヒドリン試薬を用いたＳｉｌｉｃａｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４でのＴＬＣを画分のモニタリングのために使用した。加えて、１２５×４ｍｍのＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ３μｍカラム、移動相として０．７ｍＬ／分の流速で０．０５％リン酸を含む、水−アセトニトリル １：３、１９５ｎｍでの検出を使用して、ＨＰＬＣ−ＤＡＤによって画分を調べた。非陽イオン画分は主としてサッカリドを含み、一方陽イオン画分では、ペプチド及びアミノ酸の濃縮が認められた。従って、凍結乾燥陽イオン画分の７００ｍｇアリコートを、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を満たした４００×２６ｍｍカラムでの陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによってさらに分離した。０．１Ｍ酢酸２３７．５ｍＬ、０．５Ｍ酢酸１２５０ｍＬ及び２Ｍ酢酸１０００ｍＬを溶出のために使用し、ペリ環状ポンプＭｉｎｉｐｕｌｓ ３（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｖｉｌｌｉｅｒｓ−ｌｅ−Ｂｅｌ，Ｆｒａｎｃｅ）によって９５ｍＬ／分の流速を維持して、７０００ Ｕｌｔｒｏｒａｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって画分を収集し、ＴＬＣによってモニターした（上記参照）。等しい画分をプールし、凍結乾燥した後、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ及びＨＰＬＣ−ＤＡＤによって最終的に検査した。
【０１２２】
３．４ 化合物Ａ１−４Ｃの構造解明。ＨＰＬＣ−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）。使用機器は、ＬＣＱ ＥＳＩ質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した、ＤＡＤを備えるＨＰ １１００液体クロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から成った。分離は、０．７ｍＬ／分の流速で０．０５％ギ酸を含む水−アセトニトリル １：４を用いてＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ３μｍカラム、１２５×４ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において４０℃で無勾配的に実施した。衝突ガスはヘリウムであり、エネルギー３５％であった。測定は正及び負イオン化モードの両方で実施した。
【０１２３】
ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによって得た結果の確認のため、Ａ１−４Ｃを、７０％ギ酸による酸加水分解（１００℃で２２時間）後直接注入ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによってさらに分析した。使用機器は、ナノエレクトロスプレーイオンソースを備えたハイブリッド四重極飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳである、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ Ｑｓｔａｒ Ｐｕｌｓａｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）であった。
【０１２４】
３．５ 核磁気共鳴質量分光法（ＮＭＲ）。Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ５００装置（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＮＭＲ実験を実施した。実験は、１Ｈについては５００ＭＨｚ及び１３Ｃについては１２５ＭＨｚで実施した。Ｄ２ＯはＥｕｒｉｓｏ−Ｔｏｐ（Ｇｉｆ−ｓｕｒ−Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入し、外部標準としてのトリメチルシリル−プロピオン酸（Ｎａ塩）（Ｗｉｌｍａｄ Ｃｏｒｐ．，Ｂｕｅｎａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）に比して化学シフトを報告した。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
全てのＨＰＬＣ実験についての溶媒はＬｉｃｈｒｏｓｏｌｖ（登録商標）勾配グレード品質であり、ＭＰＬＣ及びカラムクロマトグラフィーのための化学物質及び溶媒並びにＴＬＣ検出試薬はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのｐ．ａ．品質であった。
【０１２７】
３．６ ＨＰＬＣによるタマネギ中のＧＰＣＳの定量的測定。タマネギ中のＧＰＣＳを、１９５ｎｍに設定したＤＡＤを備えるＨＰ １０９０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量した。分析は、０．７ｍＬ／分の流速で０．０５％ギ酸を含む水−アセトニトリル １：４を用いてＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ−１ ３μｍカラム、１２５×４ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において４０℃で無勾配的に実施した。ＧＰＣＳを、Ｍｕｅｔｓｃｈ−Ｅｃｋｎｅｒ，Ｍ．；Ｓｔｉｃｈｅｒ，Ｏ．；Ｍｅｉｅｒ，Ｂ．Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｓ−ａｌｋ（ｅｎ）ｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ（＋）−Ｓ−ａｌｌｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ，ｇ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｓ−ａｌｌｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｇ−Ｌ−ａｌｕｔａｍｙｌ−Ｓ−（ｔｒａｎｓ−１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ）−ｃｙｓｔｅｉｎｅ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ １９９２，６２５，１８３−１９０に述べられている方法に従って、室温でメタノール−水（５０：５０；ｖ／ｖ）を用いて乾燥粉末化タマネギから抽出した。この方法は、親水性溶媒を使用し、同時にメタノールの添加によってグルタミルペプチダーゼ及びアリイナーゼなどの切断酵素を阻害する、極性化合物の効率的な抽出を可能にした。ろ過後に残存する残留物を２回再抽出して、ＧＰＣＳを十分に抽出した。最後に、真空中でろ液からメタノールを除去した後、凍結乾燥及びＨＰＬＣ分析を実施した。
【０１２８】
この化合物の構造を、高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析法、飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量分析法、及び核磁気共鳴分光法で解明した。
【０１２９】
単一ピークがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドと特定され、約３０６μの分子量を有する。
【０１３０】
３．７ 生物学的試験。動物。Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎｌｂｍラット（ＲＣＣ Ｌｔｄ．，Ｆｕｅｌｌｉｎｓｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を飼育し、スイス及び米国国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに適合する標準動物施設に保持した。実施した実験は、国立動物実験管理委員会によって承認された。実験の完了時にラットを二酸化炭素で安楽死させた。
【０１３１】
骨吸収のインビボ評価。広く有効性確認された方法である、慢性的に前標識したラットからの３Ｈ−標識テトラサイクリン（［３Ｈ］−Ｔｃ）の尿排泄量を用いて骨吸収を評価した（３；４；８−１１）。本実験のために、各々１２匹の３日齢雄性仔を有する３匹のＷｉｓｔａｒ Ｈａｎｌｂｍ母ラットを購入した。３６匹の仔に、Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｆｌｅｉｓｃｈ，Ｈ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｔｉｎｕａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｉｕｒｎａｌ ｒｈｙｔｈｍ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９０，２５９，Ｒ６７９−Ｒ６８９に述べられている方法に従って、出生後第１週から週に２回６週間にわたって漸増量の［３Ｈ］−Ｔｃを注射した。［３Ｈ］−Ｔｃは骨内に沈着し、骨が再吸収されるときに放出される（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９０，２５９，Ｒ６７９−Ｒ６８９）。標識の停止後、ラットを代謝ケージに移した。１０日間の順化後、毎日の尿中［３Ｈ］排泄を測定することによって基線骨吸収を観測した。１０日間の基線測定後、群に均一に割り当てたラットにおいて１０日間の食餌介入を開始した、すなわち、全ラットの基線［３Ｈ］尿排泄量を等級付け、各群当りの動物数に達するまで（対照群についてはｎ＝６；処置群については各々ｎ＝５）、同様の等級を有する１匹の動物を各々の処置群に割り当てた。このプロトコールを使用すると、食餌介入の開始時には全ての群について平均［３Ｈ］排泄は同様であった。液体シンチレーション計数によって尿中の３Ｈを定量した。尿１ｍＬのアリコートをＩｒｇａ−Ｓａｆｅ Ｐｌｕｓ（商標）シンチレーター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１０ｍＬ中で計数し、結果（ｄｐｍ）に２４時間の尿量を乗じた。
【０１３２】
給餌及び食餌。ラットを代謝ケージに収容した時点から、脱塩水をラットに摂取させた。食餌は、ケージ内のこぼれを最小限に抑えるためステンレススチール製るつぼ中で水分を含む湿潤食として与えた；従って、食品ボールを形成することができる練り粉様の稠度を与えるために脱イオン水を食品粉末のバッチに添加した。代謝ケージでの１０日間の順化期間中及び１０日間の基線尿収集の間、ラットには、以下で述べる「半精製」食において使用される同様の高いＣａ及びＰ濃度（１００ｇ当りＣａ １．１ｇ及びＰ １．２ｇ）を有する規格「通常」食２１３４（Ｋｌｉｂａ−Ｍｕｈｌｅｎ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を与えた。順化期間中、ラットを、２３グラムの湿潤食／日（乾燥物質１３．１ｇ）を消費するように慣れさせた；反復して全１日量を食べなかったラットはこの期間中に除外した。食餌介入のために乾燥添加物を「半精製」食（Ｊ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）と混合した。検討する項目の適切な量を、５匹のラットに１０日間給餌するために十分な湿潤食のバッチに添加した。これらの食餌を、次に、１日分ずつの分割量に分け、使用時まで−２０℃で凍結保存した。前記食餌のカルシウム及びリン濃度を、１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌに溶解した３つの灰化試料において確認した。カルシウムは原子吸光分析によって、リンは高度測定法によって測定した（８；１３）。製造者が示す数値を確認した。
【０１３３】
バイオアッセイ（破骨活性のインビトロ評価）。破骨細胞を２日齢のラットの大腿骨及び脛骨から単離し、鉱化基質として使用した４×４ｍｍの象牙片上に４０分間置いた。非接着細胞を洗い流した後、個々の切片を４８穴培養プレートに移し、５％ＣＯ２／空気雰囲気下に試験物質と共に又は試験物質なしで１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地中、３７℃で２４時間インキュベートした。１２Ｍ ＨＣｌの添加によってＭＥＭイーグル培地中の炭酸水素濃度を１５ｍＭに低下させた。各々の実験において、カルシトニン（サケカルシトニン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０−１１Ｍ又は１０−１２Ｍの濃度で陽性対照として加えた。１つの実験では、骨吸収を刺激するため、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ；ウシ１−３４、Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０−８Ｍの濃度で添加した。各々の試験物質について８つの切片を使用し、未処置対照に関しては２×８切片を使用した。固定後、破骨細胞を酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（キット３８６−Ａ、Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に関して染色し、ＴＲＡＰ陽性（ＴＲＡＰ＋）多核（２個以上の核）細胞（ＭＮＣ）としてブラインド計数した。細胞を除去した後、切片を金でスパッター被覆し、吸収孔を、Ｖｉｔｔｅ，Ｃ．；Ｆｌｅｉｓｃｈ．Ｈ．：Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９６，１３７，２３２４−２３３３に述べられている工程でブラインド計数した。破骨細胞吸収活性を吸収孔／ＴＲＡＰ＋ＭＮＣの比として算定した。
【０１３４】
３．８ 結果及び考察。インビボ及びインビトロで活性なエタノール抽出物の非イオン性高分子逆相及び順相カラムでの連続的バイオアッセイ誘導クロマトグラフィー分画は、それぞれ画分Ａ（５１．５２％（ｗ／ｗ）、前の画分に対応する平均収率）、Ａ１（３６．４８％）及びＡ１−４（７．３４％）を生じた。画分Ａ１−４ １０．５ｍｇをセミ分取ＲＰ−１８ ＨＰＬＣによって精製し、画分Ａ１−４Ｃ（ＧＰＣＳ）１．６ｍｇ（１５．２０％）を得た。
【０１３５】
タマネギからの骨吸収阻害活性は極性画分Ａに関連する（図１）。これに対し、フラボノイドを含む画分Ｂは、インビボで乾燥タマネギ１ｇに相当する用量で試験したとき活性を持たない。これは、タマネギ中に豊富なフラボノイド、ルチンがタマネギ及び他の植物で認められる作用の原因であり得る（Ｎａｔｕｒｅ １９９９，４０１，３４３−３４４）と提案した他の研究者の意見（Ｈｏｒｃａｊａｄａ−Ｍｏｌｔｅｎｉ，Ｍ．Ｎ．；Ｃｒｅｓｐｙ，Ｖ．；Ｃｏｘａｍ，Ｖ．；Ｄａｖｉｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｒｅｍｅｓｙ，Ｃ．；Ｂａｒｌｅｔ，Ｊ．Ｐ．Ｒｕｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２０００，１５，２２５１−２２５８に述べられている）と対照的である。この試験では、ルチンの単一薬理用量はラットにおける骨損失を抑制したが、植物１ｇ中に含まれる量よりもはるかに高い用量であった（Ｎａｔｕｒｅ １９９９，４０１，３４３−３４４）。従って、ルチンがインビボで骨吸収の抑制に寄与するかどうかは議論の余地がある（Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｒｕｔｉｎ ｃａｎｎｏｔ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．（編集者宛ての書信）。Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００１，１６，９７０；及びＢａｒｌｅｔ，Ｊ．Ｐ．Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｕｔ（ｉｎ） ｔｈｅ ｒｏａｄ．（返信）。Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００１，１６，９７１）。
【０１３６】
画分Ａはまた、１．７４、１７．４及び５２．２ｍｇ／ｍＬの乾燥タマネギ当量に相当する用量で試験したときインビトロで破骨細胞の吸収活性を阻害する（図２）。従って、このインビトロモデルは、活性試験のために小量の物質しか必要としないので、バイオアッセイとして使用することができる。画分Ｂも、９、１７及び２６ｍｇ／ｍＬの乾燥タマネギに等しい用量、すなわち０．０６、０．１２及び０．１８ｍｇ／ｍＬ培地でこのモデルにおいて検討した（結果は示していない）。より高濃度では親油性物質は細胞傷害性であるが（非常に低い数の生存細胞及び壊死細胞の多くの断片）、細胞数に無視し得る程度の作用しか及ぼさない用量である、９ｍｇ／ｍＬタマネギ当量で、本発明者らは作用を検出することができなかった。従って、タマネギフラボノイドを含む画分Ｂもインビトロで不活性とみなされた。これは、ルチンは骨代謝への植物の作用を説明できないことを示唆する本発明者らの付加的な証拠と一致する（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００１，１６，９７０）。
【０１３７】
セミ分取ＨＰＬＣ及び活性スクリーニングを用いたさらに広汎な単離作業により、Ａ１−４Ｃが出発物質Ａ１−４から誘導される唯一の活性画分と特定することができた（図３）。さらに、Ａ１−４Ｃより先に溶出する（画分Ａ１−４Ａ及びＡ１−４Ｂ）及び後に溶出する（画分Ａ１−４Ｄ）、プールしたＨＰＬＣピークを試験した（２．５３ｍｇ／ｍｌ）が、これらは細胞傷害性であるため、結論を引き出すことができなかった（結果は示していない）。ＨＰＬＣは、画分Ａ１−４Ｃが単一化合物から成ることを示したので、続く特定を試みた。
【０１３８】
画分Ａ１−４Ｃに関するＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ実験は、正及び負イオン化モードでそれぞれｍ／ｚ３０７及びｍ／ｚ３０５の親イオンを示した。従って、画分Ａ１−４Ｃ中の化合物の非荷電分子イオンは３０６μであった。タマネギ化合物の文献の調査（Ｂｒｅｕ，Ｗ．Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ．（ｏｎｉｏｎ）Ｐａｒｔ １：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９６，３，２９３−３０６）は、この化合物がγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ＧＰＣＳ；図５参照）であることを明らかにした。さらに、認められたｍ／ｚ１３０という質量は、他の研究者達（Ｉｓｏｂｅ，Ｍ．；Ｕｙａｋｕｌ，Ｄ．；Ｌｉｕ，Ｋ．Ｌ．；Ｇｏｔｏ，Ｔ．ＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０，５４，１６５１−１６６０．）によって記述されているγ−グルタミル型結合の存在に適合した。酸加水分解後のＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳスペクトルでは、グルタミン酸、システイン及びシスチンに対応する断片が認められ、仮説を確認した。１Ｈ−、１Ｈ／１Ｈ ＣＯＳＹ及び１３Ｃ／１Ｈ ＨＳＱＣ ＮＭＲ測定は、分子内の２つのアミノ酸、グルタミン酸（Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０及びＣ１１）、システイン（Ｃ４、Ｃ５及びＣ６）、及び二重結合を有する脂肪族Ｃ鎖（Ｃ１、Ｃ２及びＣ３）の存在を確認した（図５）。Ｈ２とＨ３の間の１５．２６Ｈｚという結合定数はトランス配置を指示した（Ｋｕｔｔａｎ，Ｒ．；Ｎａｉｒ，Ｎ．Ｇ．；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．Ｎ．；Ｓｐａｎｄｅ，Ｔ．Ｆ．；Ｙｅｈ，Ｈ．Ｊ．；Ｗｉｔｋｏｐ，Ｂ．Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｓ−（ｔｒａｎｓ−１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓａｎｄａｌ （Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ Ｌ）．Ａｎ ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｄｉａｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４，１３，４３９４−４４００）。化学シフト及びカップリングについては表１参照。１３Ｃ／１Ｈ ＨＭＢＣスペクトルにおける１３Ｃ−カルボキシ領域への焦点化は、グルタミン酸のγ−Ｃ７（１７４．００ｐｐｍ）とシステインのα−Ｈ５（４．５０ｐｐｍ）及びグルタミン酸の２つのγ−Ｈ８（２．５０ｐｐｍ）とのカップリング及びグルタミン酸のα−Ｃ１１（１７３．１０ｐｐｍ）とグルタミン酸のα−Ｈ１０（３．８０ｐｐｍ）だけとのカップリングを明らかにした。これは、分子内のγ−グルタミル型結合の存在を明らかに証明する。この所見は、ＧＰＣＳの純粋な標準試料とのスペクトル比較によって確認された（Ｓｈａｗ，Ｍ．Ｌ．；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．；Ｌａｎｅ，Ｇ．Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇ ｇｌｕｔａｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｏｎｉｏｎ ｂｕｌｂｓ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）．Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ １９８９，４８，４５９−４６７）。
【０１３９】
画分Ａ １０８．０ｇを最初に陽イオン、次いで陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供することによってＧＰＣＳのアップスケール単離を実施し、それぞれ陽イオン画分６．９７４ｇ（６．４６％）及びＧＰＣＳ ７８８．０ｍｇ（０．７３％）を生成した。ＧＰＣＳを含まない画分を廃棄した。この方法によって単離したＧＰＣＳは、破骨細胞をＰＴＨで刺激するか否かに関わらず、破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する（図４）。しかし、ＰＴＨを培養に添加したときの方が添加しないときよりも阻害の程度が幾分小さい。これは陽性対照であるカルシトニンにも当てはまると思われる。画分Ａ１−４Ｃは、０．５３ｍｇ／ｍＬの濃度で、すなわち１．７ｍＭ ＧＰＣＳで活性であったが、本実験では、２ｍＭでは阻害は有意でなかった。合わせて考慮すると、このモデルにおけるＧＰＣＳの最小有効量は、ＰＴＨで刺激しない培養物では約２ｍＭ付近であると思われる。ＰＴＨで刺激した培養物では、この値は２から４ｍＭの間であり、図４からのグラフの補間法は、約３ｍＭ付近であり得ることを示唆する。
【０１４０】
画分Ａ１−４Ｃの他の成分は阻害活性を示さなかったので、ＧＰＣＳがインビトロでの骨吸収へのタマネギの作用の原因であると思われ、十分な化合物が入手可能になり次第、インビボで確認されるべき論点である。骨粗しょう症モデルにおいて骨量減少を抑制するのに必要な用量を確立するため、及び骨細胞へのこの作用機構を検討するための今後の試験も必要である。現在の文献によれば、骨の健康を支える、植物由来食品中に生じる化合物は、ミネラル（カルシウム、カリウム及びマグネシウム）、ビタミン（Ｋ及びＣ）、植物エストロゲン（クメストロール、ゼアラレノール、イソフラボン及びフムロン）、おそらくは他のフラボノイド（ルチン及びヘスペリジン）及びモノテルペンに限られている（Ｈｏｒｃａｊａｄａ−Ｍｏｌｔｅｎｉ，Ｍ．Ｎ．；Ｃｒｅｓｐｙ，Ｖ．；Ｃｏｘａｍ，Ｖ．；Ｄａｖｉｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｒｅｍｅｓｙ，Ｃ．；Ｂａｒｌｅｔ，Ｊ．Ｐ．Ｒｕｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２０００，１５，２２５１−２２５８；Ｔｕｃｋｅｒ， Ｋ．Ｌ．；Ｈａｎｎａｎ，Ｍ．Ｔ．；Ｃｈｅｎ，Ｈ．；Ｃｕｐｐｌｅｓ，Ｌ．Ａ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．；Ｋｉｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ａｎｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｉｎｔａｋｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔｅｒ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｍｅｎ ａｎｄ ｗｏｍｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９９，９，７２７−７３６；Ｎｅｗ，Ｓ．Ａ．；Ｂｏｌｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．；Ｇｒｕｂｂ，Ｄ．Ａ．；Ｒｅｉｄ，Ｄ．Ｍ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ：ａ ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９７，６５，１８３１−１８３９；ａｎｄ Ｄｒａｐｅｒ，Ｃ．Ｒ．；Ｅｄｅｌ，Ｍ．Ｊ．；Ｄｉｃｋ，ｌ．Ｍ．；Ｒａｎｄａｌｌ，Ａ．Ｇ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｂ．；Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ｌ．Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｒｅｄｕｃｅ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｏｏｐｈｏｒｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ １９９７，１２７，１７９５−１７９９；Ａｒｊｍａｎｄｉ，Ｂ．Ｈ．；Ａｌｅｋｅｌ，Ｌ．；Ｈｏｌｌｉｓ，Ｂ．Ｗ．；Ａｍｉｎ，Ｄ．；Ｓｔａｃｅｗｉｃｚ−Ｓａｐｕｎｔｚａｋｉｓ，Ｍ．；Ｇｕｏ，Ｐ．；Ｋｕｋｒｅｊａ，Ｓ．Ｃ．Ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ １９９６，１２６，１６１− １６７）。そこで、骨に対して活性な化合物、従って骨粗しょう症への食事アプローチのための候補物質は植物界に広く分布する。
【０１４１】
本発明者らは、乾燥タマネギ１ｇ中に１７．３ｍｇ、すなわち１．７３％（ｗ／ｗ）のＧＰＣＳを見出した。この結果は、乾燥重量の０．５８−２．８８％の範囲内のＧＰＣＳ濃度を測定した他の研究者達の所見と一致する（Ｓｈａｗ，Ｍ．Ｌ．；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｊ． Ｅ．；Ｌａｎｅ，Ｇ．Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｏｎｉｏｎ ｂｕｌｂｓ （Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）．Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ １９８９，４８，４５９−４６７；及びＫｏｐｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．；Ｒａｎｄｌｅ，Ｗ．Ｍ．Ｓｅｌｅｎｉｕｍ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ Ｓ−ａｌｋ（ｅｎ）ｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅｓ ａｍｏｎｇ ｓｈｏｒｔ−ｄａｙ ｏｎｉｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔｉｃ Ｓｃｉ １９９９，１２４，３０７−３１１）。
【０１４２】
骨吸収細胞の活性を阻害する化合物としてのＧＰＣＳの特定は、さらにもう１つ別のクラスの分子に属するもう１つ別の化合物を、骨に対して活性な天然化合物のリストに追加する。ＧＰＣＳが活性化合物のファミリーを代表するのか又は単独の活性化合物であるのかは現在のところ不明である。この問題を明らかにするためには、これまでに特定された他の２５の活性植物食品項目（Ｊ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）の作用におけるこの役割を検討すること、そして場合によりこのクラスの化合物の他の活性な成員を特定することが必要である。
【実施例４】
【０１４３】
以下は、粉末形態の本発明の栄養補助食品の適切な組成物の一例である。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
上記補助食品は、水と混合して、食事の間に、例えば１日２から４回、適切な濃度で摂取し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、乾燥タマネギ１ｇ（白い四角）、又はタマネギ１ｇに相当する乾燥タマネギアルコール抽出物６３９ｍｇ（白い三角）、又はタマネギ１ｇに相当する乾燥親水性画分Ａ５９５ｍｇ（黒い三角）、又は最後にタマネギ１ｇに相当する乾燥親油性画分Ｂ７．１ｍｇ（白い菱形）のいずれかを含む精製飼料を与えたラットにおける骨吸収への作用を例示するグラフである。未処置対照群の９５％信頼区間（ＣＩ；１．９６×ＳＥＭ）を斜線の背景の箱として示す。数値は平均±ＳＥＭである。対照についてはｎ＝６、処置群についてはｎ＝５。９５％ＣＩの外側の平均値は対照と有意に異なる（ｐ＜０．０５）（以前にＭｕｅｈｌｂａｕｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｏｚａｎｏ，Ａ．；Ｒｅｉｎｌｉ，Ａ．；Ｗｅｔｌｉ，Ｈ．Ｖａｒｉｏｕｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，ｆｒｕｉｔｓ，ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ ａｎｄ ｒｅｄ ｗｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）の中で公表された）。
【図２】図２は、破骨細胞のインビトロ吸収活性への親水性画分Ａ及びカルシトニンの用量依存的作用を例示するグラフである。画分Ａは、１、１０及び３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、カルシトニンは１０−１２Ｍで培地に添加した。データ表示：処置群（ｎ＝８）の数値を処置／未処置の比±ＳＥＭとして示す。未処置対照群（ｎ＝１６）の９５％ＣＩ（１．９６×ＳＥＭ）を平均±ＳＥＭとして示す（斜線の背景の箱）。未処置群の９５％ＣＩの外側の平均値は有意に異なる（ｐ＜０．０５）（以前にＪ Ｎｕｔｒ ２００３，１３３，３５９２−３５９７）の中で公表された）。
【図３】図３は、破骨細胞のインビトロ吸収活性への様々なタマネギ画分及びカルシトニンの作用を例示するグラフである。画分Ａ１−４、Ａ１−４Ｂ及びＡ１−４Ｃをそれぞれ２．２８、０．４３及び０．５３ｍｇ／ｍＬの濃度で培地に添加した。カルシトニンは１０−１２Ｍの用量で使用した。データ表示は図２で述べたとおりである。
【図４】図４は、破骨細胞のインビトロ吸収活性へのＧＰＣＳ及びカルシトニンの作用を例示するグラフである。ＧＰＣＳは、２、４及び８ｍＭの濃度で培地に添加した。カルシトニンは１０−１１Ｍの用量で使用した。２つの別個の実験を実施した：１つは副甲状腺ホルモンの添加なし（パネルＡ）で、１つは骨吸収を刺激するために全ての培養物にＰＴＨ（１０−８Ｍ）を添加した。データ表示は図２で述べたとおりである。
【図５】図５は、γ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド（ＧＰＣＳ）の構造描写である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための、ヒト又は動物用薬剤又は栄養製剤の製造におけるγ−グルタミル−ペプチドの使用。
【請求項２】
恩恵を得ることができるヒト又は動物に有効量のγ−グルタミル−ペプチドを投与する方法。
【請求項３】
ヒト又は動物がγ−グルタミル−ペプチドを必要としている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
骨吸収が阻害される、請求項２及び３に記載の方法。
【請求項５】
必要のあるヒト又は動物に有効量のγ−グルタミル−ペプチドを投与することを含む、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための方法。
【請求項６】
骨吸収上昇の食事療法におけるγ−グルタミル−ペプチドの使用。
【請求項７】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの何らかの組合せである、請求項１から６のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項８】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項７に記載の使用又は方法。
【請求項９】
骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態が、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症又はこれらの何らかの組合せである、請求項１、３、４、５、７又は８のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１０】
γ−グルタミル−ペプチド及び栄養学上許容される担体を含有する栄養組成物。
【請求項１１】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの組合せである、請求項１０に記載の栄養組成物。
【請求項１２】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項１１に記載の栄養組成物。
【請求項１３】
（ａ）カルシウム源、
（ｂ）炭水化物、脂肪及び窒素源から成る群より選択される少なくとも１つのエネルギー源、及び場合により
（ｃ）ビタミンＤ
をさらに含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１４】
カルシウム源（ａ）が有機カルシウム塩である、請求項１３に記載の栄養組成物。
【請求項１５】
成分（ｂ）の炭水化物源が、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット、ソルビット、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１３又は１４に記載の栄養組成物。
【請求項１６】
成分（ｂ）の脂肪源が、ω−６多不飽和脂肪酸源、ω−３多不飽和脂肪酸源、単不飽和脂肪酸源、Ｃ６−Ｃ１２−脂肪酸源、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１７】
成分（ｂ）の窒素源が、ダイズ由来タンパク質、乳タンパク質、タンパク質加水分解産物、必須アミノ酸の混合物及びアルギニン、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１８】
炭水化物源が組成物の総エネルギー供給量の３０から７０％を提供し、窒素源が５から４０％、及び脂肪源が０．０１から５％を提供する、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１９】
栄養組成物の総重量に基づき、３から２５重量％の成分（ａ）、５から５０重量％の成分（ｂ）及び１から９５重量％の成分（ｃ）を含有する、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２０】
０．２から１０重量％の、ビタミン、ミネラル、微量元素、繊維、香味料、防腐剤、着色料、甘味料及び乳化剤から選択される他の栄養学上許容される成分をさらに含む、請求項１０から１９のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２１】
５０から１５００ｋｃａｌ／日を提供する栄養補助食品の形態、又は動物栄養補助飼料の形態の、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２２】
液体形態の、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２３】
顆粒又は粉末形態の、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２４】
γ−グルタミル−ペプチドと医薬として許容される担体を含有する、個別単位用量形態の医薬組成物。
【請求項２５】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの組合せである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
糖衣丸、錠剤、カプセル、小袋又は坐薬の形態の経腸投与のための、請求項２４から２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
獣医用組成物の形態の、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィーを使用することにより、以下画分Ａと称する、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）の親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｃ）クロロホルム−メタノール−水 ６．４：５：１を移動相として使用するＮＰ−ＭＰＬＣによって画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）例えば０．００６２５％ギ酸で緩衝した無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用するセミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
を含む、ネギ属植物（Ａｌｌｉｕｍ）の親水性エタノール抽出物の分画によって得られるγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３０】
前記ネギ属植物が、タマネギ、エシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ）、リーキ／無臭ニンニク（Ａｌｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、ベアガーリック（Ａｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ）、オオニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）又はネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を含む、請求項２９に記載のγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３１】
前記ネギ属植物が、エシャロット、リーキ／無臭ニンニク、タマネギ、ベアガーリックを含む、請求項３０に記載のγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３２】
前記ネギ属植物がタマネギを含む、請求項３１に記載のγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３３】
動物にとって生理学的に許容される１又はそれ以上の担体と有効量のγ−グルタミル−ペプチドの混合物を均質化することを含む、骨吸収上昇を特徴とする動物における疾患又は状態の治療又は予防のため又は動物における骨吸収上昇の管理のための獣医用組成物を製造するための方法。
【請求項３４】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
γ−グルタミル−ペプチドが破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する、請求項１から９に記載の使用又は方法。
【請求項３７】
最小有効量が約２ｍＭである、請求項１から９に記載の使用又は方法。
【請求項３８】
γ−グルタミル−ペプチドが破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する、請求項１０から２８に記載の栄養又は医薬組成物。
【請求項３９】
最小有効量が約２ｍＭである、請求項１０から２８に記載の栄養又は医薬組成物。
【請求項４０】
用量が少なくとも２ｍＭである、請求項１０から２８に記載の栄養又は医薬組成物。
【請求項１】
骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための、ヒト又は動物用薬剤又は栄養製剤の製造におけるγ−グルタミル−ペプチドの使用。
【請求項２】
恩恵を得ることができるヒト又は動物に有効量のγ−グルタミル−ペプチドを投与する方法。
【請求項３】
ヒト又は動物がγ−グルタミル−ペプチドを必要としている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
骨吸収が阻害される、請求項２及び３に記載の方法。
【請求項５】
必要のあるヒト又は動物に有効量のγ−グルタミル−ペプチドを投与することを含む、骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態の治療、検査又は予防のための方法。
【請求項６】
骨吸収上昇の食事療法におけるγ−グルタミル−ペプチドの使用。
【請求項７】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの何らかの組合せである、請求項１から６のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項８】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項７に記載の使用又は方法。
【請求項９】
骨吸収上昇を特徴とする疾患又は状態が、パジェット病、腫瘍誘導性骨疾患又は骨粗しょう症又はこれらの何らかの組合せである、請求項１、３、４、５、７又は８のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１０】
γ−グルタミル−ペプチド及び栄養学上許容される担体を含有する栄養組成物。
【請求項１１】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの組合せである、請求項１０に記載の栄養組成物。
【請求項１２】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項１１に記載の栄養組成物。
【請求項１３】
（ａ）カルシウム源、
（ｂ）炭水化物、脂肪及び窒素源から成る群より選択される少なくとも１つのエネルギー源、及び場合により
（ｃ）ビタミンＤ
をさらに含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１４】
カルシウム源（ａ）が有機カルシウム塩である、請求項１３に記載の栄養組成物。
【請求項１５】
成分（ｂ）の炭水化物源が、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリット、ソルビット、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１３又は１４に記載の栄養組成物。
【請求項１６】
成分（ｂ）の脂肪源が、ω−６多不飽和脂肪酸源、ω−３多不飽和脂肪酸源、単不飽和脂肪酸源、Ｃ６−Ｃ１２−脂肪酸源、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１７】
成分（ｂ）の窒素源が、ダイズ由来タンパク質、乳タンパク質、タンパク質加水分解産物、必須アミノ酸の混合物及びアルギニン、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１８】
炭水化物源が組成物の総エネルギー供給量の３０から７０％を提供し、窒素源が５から４０％、及び脂肪源が０．０１から５％を提供する、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１９】
栄養組成物の総重量に基づき、３から２５重量％の成分（ａ）、５から５０重量％の成分（ｂ）及び１から９５重量％の成分（ｃ）を含有する、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２０】
０．２から１０重量％の、ビタミン、ミネラル、微量元素、繊維、香味料、防腐剤、着色料、甘味料及び乳化剤から選択される他の栄養学上許容される成分をさらに含む、請求項１０から１９のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２１】
５０から１５００ｋｃａｌ／日を提供する栄養補助食品の形態、又は動物栄養補助飼料の形態の、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２２】
液体形態の、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２３】
顆粒又は粉末形態の、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２４】
γ−グルタミル−ペプチドと医薬として許容される担体を含有する、個別単位用量形態の医薬組成物。
【請求項２５】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの組合せである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
糖衣丸、錠剤、カプセル、小袋又は坐薬の形態の経腸投与のための、請求項２４から２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
獣医用組成物の形態の、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
（ａ）吸着カラムクロマトグラフィーを使用することにより、以下画分Ａと称する、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）の親水性エタノール抽出物を得ること、
（ｂ）逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）を使用することにより、画分Ａからサッカリドを分離して、画分Ａ１を得ること、
（ｃ）クロロホルム−メタノール−水 ６．４：５：１を移動相として使用するＮＰ−ＭＰＬＣによって画分Ａ１からサッカリドをさらに分離して、画分Ａ１−４を得ること、
（ｄ）例えば０．００６２５％ギ酸で緩衝した無勾配水／アセトニトリル系を溶媒として使用するセミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＳＲ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分画して、画分Ａ１−４Ｃを得ること、
を含む、ネギ属植物（Ａｌｌｉｕｍ）の親水性エタノール抽出物の分画によって得られるγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３０】
前記ネギ属植物が、タマネギ、エシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ）、リーキ／無臭ニンニク（Ａｌｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、ベアガーリック（Ａｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ）、オオニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）又はネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を含む、請求項２９に記載のγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３１】
前記ネギ属植物が、エシャロット、リーキ／無臭ニンニク、タマネギ、ベアガーリックを含む、請求項３０に記載のγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３２】
前記ネギ属植物がタマネギを含む、請求項３１に記載のγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシド。
【請求項３３】
動物にとって生理学的に許容される１又はそれ以上の担体と有効量のγ−グルタミル−ペプチドの混合物を均質化することを含む、骨吸収上昇を特徴とする動物における疾患又は状態の治療又は予防のため又は動物における骨吸収上昇の管理のための獣医用組成物を製造するための方法。
【請求項３４】
γ−グルタミル−ペプチドがγ−グルタミル−アルキル−システインスルホキシド又はγ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシド又はこれらの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
γ−グルタミル−アルケニル−システインスルホキシドがγ−Ｌ−グルタミル−トランス−Ｓ−１−プロペニル−Ｌ−システインスルホキシドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
γ−グルタミル−ペプチドが破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する、請求項１から９に記載の使用又は方法。
【請求項３７】
最小有効量が約２ｍＭである、請求項１から９に記載の使用又は方法。
【請求項３８】
γ−グルタミル−ペプチドが破骨細胞の吸収活性を用量依存的に阻害する、請求項１０から２８に記載の栄養又は医薬組成物。
【請求項３９】
最小有効量が約２ｍＭである、請求項１０から２８に記載の栄養又は医薬組成物。
【請求項４０】
用量が少なくとも２ｍＭである、請求項１０から２８に記載の栄養又は医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５１２２８４（Ｐ２００７−５１２２８４Ａ）
【公表日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４０３８８（Ｐ２００６−５４０３８８）
【出願日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１３４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５１４０９
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０１２５１０７９）ウニフェルシテット ベルン (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１３４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５１４０９
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０１２５１０７９）ウニフェルシテット ベルン (3)
【Ｆターム（参考）】
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