骨粗鬆症の予測分析方法、並びに、骨粗鬆症の治療剤及びそのスクリーニング方法
【課題】骨粗鬆症を早期に予測分析する方法、並びに、骨粗鬆症の治療剤及び骨粗鬆症及び骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングする方法を提供すること。
【解決手段】健常者と被験者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量を測定し、測定値に基づき骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を将来的に発症する可能性を判断する骨粗鬆症の予測分析方法である。さらに、Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤である。さらに、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下及び非存在下で培養することにより該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量を測定して、これらの発現量を基に被験化合物を骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤としてスクリーニングする方法である。
【解決手段】健常者と被験者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量を測定し、測定値に基づき骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を将来的に発症する可能性を判断する骨粗鬆症の予測分析方法である。さらに、Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤である。さらに、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下及び非存在下で培養することにより該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量を測定して、これらの発現量を基に被験化合物を骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤としてスクリーニングする方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより骨粗鬆症を予測分析する骨粗鬆症の予測分析方法、並びに、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分とする骨粗鬆症の治療剤及びＩｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を用いて骨粗鬆症を治療及び予防させる骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨量又は骨塩量の減少によって骨の微細構造が破綻し、骨強度が低下して骨折のリスクが高まった全身性疾患である。日本では骨粗鬆症の患者は約１１００万人と言われており、その８割は女性である。さらに、骨粗鬆症は中年以降に多く見られる疾患であるため、近年の高齢化に伴い今後患者数が増加すると推測される。
【０００３】
骨粗鬆症は大まかに原発性骨粗鬆症と持続性骨粗鬆症の２つに大別される。原発性骨粗鬆症は、加齢や閉経後に起きる骨粗鬆症のことであり、閉経後の女性に認められる閉経後骨粗鬆症と高齢者に認められる老人性骨粗鬆症に分類され、この両者は退行期骨粗鬆症と総称される。一方、持続性骨粗鬆症は、ステロイド剤の投与や糖尿病、卵巣摘出の疾患等が原因となる骨粗鬆症である。骨粗鬆症の一般的な診断方法はとしては、手の甲のＸ線撮影を行うＭＤ法、身体の下から２種類のＸ線を照射して骨量を測定する二重Ｘ線吸収骨塩定量（ＤＸＡ法）、踵骨に超音波を当てて骨量を測定する超音波法等が挙げられる。
【０００４】
高齢者人口が増えた現代社会において特に注目されるのが老人性骨粗鬆症である。骨粗鬆症患者の骨は骨量が低下して小さな穴が多発した状態になっているため、骨折する可能性がかなり高い。特に老人性骨粗鬆症患者の場合、骨折による痛みや障害以外にも大腿骨や股関節の骨折から寝たきりにつながることも多く、老人性骨粗鬆症患者の生活の質（ＱＯＬ）を著しく低下させる危険性を含んでいる。したがって、高齢化を迎えた現代社会においては、老人性骨粗鬆症に対する的確な診断方法や予防方法の必要性が高まっている。
【０００５】
骨粗鬆症の予防方法としては、一般的に、日照の不足、運動量の低下、過度のアルコール摂取、カフェインの過剰摂取、喫煙、ステロイド剤の薬剤を回避すること、さらに発症前の食事療法、運動療法、薬物療法等が従来から提唱されている。また、治療方法としては、骨粗鬆症の治療法はエストロゲン等の薬物の投与、リン酸カルシウム骨セメントを注入する手術方法、痛みの原因となる神経に麻酔薬を注射する方法等が知られている。しかしながら、エストロゲン投与は乳癌の発症率が高くなるという副作用、骨セメントを注入する手術方法では骨セメントが骨以外の場所に漏れて固まり神経を圧迫するという危険性、麻酔薬を注射する方法では脊椎専門医や麻酔医の高度な技術の必要性など、それぞれの方法に特有の問題がある。
【０００６】
ところで、骨髄内には多分化能を有する間葉系幹細胞が存在することが知られている。この細胞は近年急速に発展している再生医療の分野で注目されており、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、心筋細胞等のさまざまな細胞に分化できる能力を持つ。骨形成に関与する骨芽細胞は、コラーゲン線維をはじめ種々の細胞外マトリックス成分を合成・分泌しており、骨芽細胞の増殖は種々の成長因子やサイトカインにより制御されていることが知られている。
【０００７】
一方、哺乳動物の分化抑制因子としてＩｄ１〜Ｉｄ４が知られている。これらの分化抑制因子は、筋肉細胞、赤血球、顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、脂肪細胞、乳腺細胞、神経細胞や骨芽細胞の分化モデル系において細胞分化を強く抑制することが知られている。また、組織の修復過程や血清刺激による増殖刺激によって発現が誘導される遺伝子でもあり、培養細胞に過剰発現させると細胞増殖を促進し、条件によってはアポトーシスを誘導することも報告されている。このように、分化抑制因子Ｉｄｓは細胞の分化と増殖に関わる機能を併せ持っているが、その機能や分化抑制の機序については未知の点が多く、骨芽細胞への作用についても不明な点が多い。
【０００８】
老化に伴う活性型ビタミンＤ量の低下などで惹き起こされる老人性骨粗鬆症の特徴は、他の骨粗鬆症とは異なり、骨を形成する骨芽細胞が減少して骨が脆弱化するだけでなく、骨髄内に脂肪細胞が蓄積されて黄色化することである。したがって、骨髄中の脂肪細胞の蓄積が早期に発見できる分析方法や脂肪細胞の蓄積を抑制する治療剤があれば、老人性骨粗鬆症の予防や治療につながると考えられる。骨髄内の間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を抑制する因子は幾つか知られているが、同時に骨芽細胞への分化を抑制するため骨量減少という副作用も報告されており、老人性骨粗鬆症の治療剤としては適切ではない。骨量の維持には脂質生成と骨生成のバランスが重要であると思われるが、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化と骨芽細胞への分化という２つの異なる方向性を決める分子メカニズムは未だに判っていない。
したがって、骨髄中の脂肪細胞の蓄積に注目して老人性骨粗鬆症を早期に予測分析する方法、又は骨髄中の脂質生成と骨生成のバランスを維持する治療剤の提供が望まれているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、被験試料の骨髄内細胞において、骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することで骨髄中の脂質生成と骨形成のバランスを保ち、脂肪細胞の増殖による骨の黄色化と骨芽細胞の減少による骨量低下による骨の脆弱化を阻止するＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を早期に予測分析することができる骨粗鬆症の予測分析方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分として含むことにより骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することにより骨髄中の脂肪細胞の蓄積を抑制しつつ骨芽細胞の量を維持することで骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量と、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量と、を測定することにより、Ｉｄ４遺伝子の活性を高めることで骨髄中の間葉系幹細胞の分化の初期段階で脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進させて骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防して骨髄中の脂質生成と骨生成のバランスを維持することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングすることができるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、骨髄内に存在する間葉系幹細胞を利用して、脂肪細胞と骨芽細胞への分化過程に関わる因子を鋭意研究した結果、分化抑制因子Ｉｄ４ が、骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することを発見し、その結果、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより、被験試料の提供者が老人性骨粗鬆症を発症する可能性を有するか否かを早期に予測分析できること、また、Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とする骨粗鬆症の治療剤を老人性骨粗鬆症の患者の骨髄中に直接投与することにより、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化抑制と骨芽細胞への分化促進を同時に達成することで優れた治療効果を発揮することができること、さらに、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を用いて、骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングすることができること、という知見を得て、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 骨粗鬆症の予測分析方法であって、
（ａ）健常者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量Ａと、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量Ｂとをそれぞれ測定する測定工程と、
（ｂ）該発現量Ａと、該発現量Ｂと、に基づき、（Ｂ／Ａ）×１００（％）の計算値が７０（％）以下である場合に、前記被験試料の提供者が骨粗鬆症になる可能性が高いと判断する判断工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
＜２＞ 骨髄内細胞が間葉系幹細胞である、前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞ 骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、前記＜１＞から前記＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜１＞から前記＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜１＞から前記＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする、骨粗鬆症の治療剤である。
＜７＞ 骨髄内に直接投与される、前記＜６＞に記載の治療剤である。
＜８＞ 骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、前記＜６＞から前記＜７＞のいずれかに記載の治療剤である。
＜９＞ 骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量Ｘと、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量Ｙと、を測定する測定工程と
（ｂ）該発現量Ｘと、該発現量Ｙと、に基づき、Ｙ／Ｘの計算値が１．３以上である被験化合物を、骨粗鬆症の治療剤として選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
＜１０＞ Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の培養が液体培養で行われる、前記＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞ Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞が動物細胞由来である、前記＜９＞から前記＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞ 骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、前記＜９＞から前記＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜９＞から前記＜１２＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロットおよびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜９＞から前記＜１３＞のいずれかに記載の方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、前記従来における諸問題を解決することができる。すなわち、本発明は、被験試料の骨髄内細胞において、骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することで骨髄中の脂質生成と骨形成のバランスを保ち、脂肪細胞の増殖による骨の黄色化と骨芽細胞の減少による骨量低下による骨の脆弱化を阻止するＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を早期に予測分析することができる骨粗鬆症の予測分析方法を提供することができ、また、本発明は、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分として含むことにより骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することにより骨髄中の脂肪細胞の蓄積を抑制しつつ骨芽細胞の量を維持することで骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤を提供することができ、さらに、本発明は、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量と、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量と、を測定することにより、Ｉｄ４遺伝子の活性を高めることで骨髄中の間葉系幹細胞の分化の初期段階で脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進させて骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防して骨髄中の脂質生成と骨生成のバランスを維持することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングすることができるスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の骨粗鬆症の予測分析方法は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の早期の予測分析に好適に使用することができる。
【００１４】
本発明の骨粗鬆症の予測分析方法は、測定工程と、判断工程と、を少なくとも含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
【００１５】
＜測定工程＞
前記測定工程は、健常者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量Ａと、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量Ｂと、をそれぞれ測定する工程である。
【００１６】
−健常者−
健常者とは、被験試料を提供する時点で骨粗鬆症に罹患していない対象のことであり、尿中デオキシピリジノリン濃度（男性：２．１〜５．４、女性：２．８〜７．６ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ Ｃｒ）、尿中Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド濃度（男性：１３．０〜６６．２、女性：９．３〜５４．３ｎｍｏｌ ＢＣＥ／ｍｍｏｌ Ｃｒ）、血清Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド濃度（男性：９．５〜１７．７、女性：７．５〜１６．５ｎｍｏｌ ＢＣＥ／ｍｍｏｌ Ｃｒ）、尿中Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ-テロペプチド（男性：＜１８４．１、女性：４０．３〜３０１．４μg／ｍｍｏｌ Ｃｒ）および骨型アルカリフォスファターゼ (男性：１３．０〜３３．９、女性：９．６〜３５．４Ｕ／Ｌ)を基準値としている。
【００１７】
−骨髄内細胞−
骨髄内細胞とは骨髄内の海綿状組織に存在する細胞であり、種々の因子により骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、神経細胞のそれぞれに分化する間葉系幹細胞と血液細胞や免疫細胞に分化する造血幹細胞の２つの幹細胞に大別される。本発明では、骨芽細胞、脂肪細胞等に分化する間葉系幹細胞を用いる。
【００１８】
骨髄内細胞の採取の方法は、特に制限はないが、骨髄採取針を用いて腸骨から骨髄を吸引する方法などを利用して採取することが好ましい。
【００１９】
−Ｉｄ４遺伝子−
Ｉｄ４遺伝子とは文献名：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５，７４９−７５５などに記載されている公知の遺伝子であり、マウスの遺伝子は登録番号：ＮＭ＿０３１１６６、ヒトの遺伝子では登録番号：ＮＭ＿００１５４６としてＧｅｎＢａｎｋに各々対応するアミノ酸配列と共に登録されている。Ｉｄ４遺伝子は当初、Ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ（ＨＬＨ）モチーフを持つ分化抑制因子Ｉｄ１、Ｉｄ２およびＩｄ３といったＩｄファミリーの１つとしてとして哺乳動物から単離されたものであり、分化を決定づける転写因子がＤＮＡへ結合するのは阻害するモチーフをもつタンパクをコードしている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４， Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５，７４９−７５５）。Ｉｄ４遺伝子の公知の機能は、神経細胞の分化やグリア細胞の発生に関わることであるが、本発明者らにより、骨髄由来の間葉系幹細胞株の分化過程の初期段階において、Ｉｄ４が脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することであり、Ｉｄ４が骨髄中の脂質生成と骨形成のバランスを保ち、脂肪細胞の増殖による骨の黄色化と骨芽細胞の減少による骨量低下による骨の脆弱化を阻止する機能を有するという新たな知見が得られた。
【００２０】
−発現量Ａ−
発現量Ａとは、健常者の骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を示し、発現量の測定方法には、特に制限はないが、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロット等が挙げられるが、特に好ましいのは、定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００２１】
前記ＤＮＡマイクロアレイとは、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上の定められた領域に高密度に固定されているものを示し、例えばＤＮＡチップと呼称されるものを包含する。
【００２２】
前記ＤＮＡマイクロアレイの支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセルロース、ナイロンの膜等が使用される。また、支持体上に固定される遺伝子又はその断片としては、特に限定するものではないが、例えばゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、これらを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅されたＤＮＡ断片等が挙げられる。
【００２３】
前記ＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも測定できるという利点がある。
【００２４】
標識に用いられる前記標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。該蛍光物質としては、特に限定はないが、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、被験試料、対照として用いる試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが好ましい。
【００２５】
前記標識の検出法は、標識物質の種類により、適宜選択することができる。例えば、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出することができる。
【００２６】
前記ＲＮａｓｅプロテクションアッセイとは、１本鎖ＲＮＡには切断活性を示すが、２本鎖ＲＮＡには切断活性を示さない基質特異性を有するＲＮａｓｅの機能を利用する方法である。すなわち、検出対象となるｍＲＮＡに相補的となるようなＲＩ標識したプローブを合成し、組織又は培養細胞より抽出したｔｏｔａｌＲＮＡ又はｐｏｌｙＡ ＲＮＡとハイブリッドを形成させ、次いでＲＮａｓｅを作用させる。ここで、ハイブリッドを形成しなかった１本鎖ＲＮＡは分解されるが、２本鎖ＲＮＡは分解されないまま残る。この分解されなかったｍＲＮＡの発現量を、電気泳動により分離検出を行うことで目的とするｍＲＮＡの定量を行うことができる。
【００２７】
前記定量的リアルタイムＰＣＲとは、ＰＣＲの増幅産物の量をリアルタイムでモニタリングし、増幅産物が描く増幅曲線を利用して試料中のコピー数を算出する方法である。この方法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置が用いられる。
前記定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝子の発現量を測定する場合、段階希釈した既知量のＤＮＡをコントロールとしてＰＣＲを行い、これを基に、コピー数とサイクル数とで検量線を作製することにより、試料の増幅曲線からこの試料中に含まれる遺伝子の発現量を算出することができる。
【００２８】
前記ノーザンブロットとは、ＲＮＡの混合試料から特定の塩基配列を持つ分子を検出・定量する方法であり、ゲル電気泳動で分離して、ナイロン膜に転写した後、目的のＲＮＡ配列に相補的な核酸を標識した核酸プローブとハイブリダイズさせて目的のＲＮＡの発現量、サイズを検出する方法である。
【００２９】
前記核酸を標識する方法としてはＲＩを用いる方法、ＤＩＧと抗体を用いるｎｏｎＲＩ法、蛍光染色を用いる方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明において用いられるＩｄ４遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットにより定量することにより行われるが、特に好ましいのはウェスタンブロットである。
【００３１】
前記酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）とは、試料中に含まれるポリペプチドをペルオキシダーゼ、ビオチン等で酵素標識した抗体又は抗原を用いて、抗原抗体反応を利用して、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【００３２】
前記ウェスタンブロットとは、目的のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、メンブレン上に転写することにより、目的のタンパク質に対する特異的抗体と反応させて、特異的抗体にあらかじめ結合されている酵素の活性を利用した発色反応により目的のタンパク質を検出する方法である。
【００３３】
前記ドットブロット法とは、メンブレンに直接ＲＮＡをブロットし、プローブによって目的のｍＲＮＡ量を定量する方法である。
【００３４】
−発現量Ｂ−
発現量Ｂとは、被験試料の骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を示す。該発現量の測定方法としては、上記発現量Ａと同様の方法により測定することができる。
【００３５】
−被験試料−
被験試料とは、骨粗鬆症を発症していない健常者又は骨粗鬆症を発症する可能性のある健常者から直接採取された骨髄内細胞であるが、骨粗鬆症を発症していない健常者又は骨粗鬆症を発症する可能性のある健常者から採取された骨髄内細胞を入手したものでもよい。
【００３６】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定するために骨髄内細胞から採取する細胞数は、１，０００個〜１，０００，０００個の範囲が好ましく、さらに好ましくは１０，０００個〜１，０００，０００個、特に好ましくは１，０００，０００個である。
【００３７】
本発明において、「分化過程の初期段階」とは分化を誘導する処理を行ってから２日以内を指し、細胞増殖が止まり細胞周期が静止期に入る段階を示している。
【００３８】
＜判断工程＞
判断工程は、前記測定工程により測定された該発現量Ａと、該発現量Ｂと、に基づき、（Ｂ／Ａ）×１００（％）の計算値が７０（％）以下である場合に、前記被験試料の提供者が骨粗鬆症になる可能性が高いと判断する判断工程である。
【００３９】
−計算値−
前記計算値とは、特に制限はないが、測定されたＡとＢの値を入力して別々に格納し、格納されたＡとＢの値から自動的に（Ｂ／Ａ）×１００（％）を算出して出力する、コンピューター、電卓、等に基づいて計算される数値である。
【００４０】
前記計算値は７０％以下が好ましく、さらに好ましくは６０％以下、特に好ましくは５０％以下である。特に５０％以下では老人性骨粗鬆症を発症する確率は３０％である。
【００４１】
＜骨粗鬆症の治療剤＞
本発明の骨粗鬆症の治療剤は、骨粗鬆症を治療又は予防するための治療剤であり、上述したＩｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質（以下、Ｉｄ４と記載）の少なくともいずれかを有効成分として含み、さらに必要に応じてその他の成分を含む。
【００４２】
−Ｉｄ４遺伝子がコードするタンパク質−
Ｉｄ４遺伝子がコードするタンパク質とは、Ｉｄ４遺伝子が転写翻訳されたタンパク質のことである。
【００４３】
−Ｉｄ４遺伝子の調製−
本発明の骨粗鬆症の治療剤の有効成分であるＩｄ４遺伝子は、骨髄内に直接投与するため、ヒト組織内で発現してＩｄ４を産生することができる発現ベクターに導入することが好ましい。
まず、本発明のＩｄ４遺伝子は、常法に従い公知の配列を基に調製することができる。例えば、動物細胞からｍＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でクローニングすることにより目的とするＩｄ４遺伝子のｃＤＮＡを調製することができる。これらのクローニングの技法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）) 等のプロトコールを参照することにより行うことができる。
【００４４】
常法により調製した全長ｃＤＮＡは、必要に応じて、Ｉｄ４をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。該ＤＮＡ断片、又は全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、Ｉｄ４遺伝子の発現可能なベクターを作製することができる。
【００４５】
本発明に用いられる発現ベクターとしては、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、およびレンチウィルスベクター等の公知のウィルスベクターが挙げられるが、本発明のＩｄ４遺伝子が挿入でき、さらにヒト組織内で発現可能なベクターであれば特に限定されない。
【００４６】
−Ｉｄ４の調製−
本発明の骨粗鬆症の治療剤に含有するＩｄ４は、Ｉｄ４遺伝子のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入することで得られた形質転換体を培地中で培養し、宿主細胞内から精製するか、培地中にＩｄ４を産生分泌させ、該培地よりＩｄ４を抽出して調製することができる。
まず、本発明におけるＩｄ４遺伝子は、常法に従い公知の配列を基に調製することができる。例えば、動物細胞からｍＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でクローニングすることにより目的とするＩｄ４遺伝子のｃＤＮＡを調製することができる。これらのクローニングの技法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）) 等のプロトコールを参照することにより行うことができる。
【００４７】
常法により調製した全長ｃＤＮＡを基に、必要に応じて、Ｉｄ４をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片、又は全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、宿主細胞内でＩｄ４遺伝子の発現可能なベクターを作製できる。
【００４８】
本発明に用いられる発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＣＤＭ８、ｐＳＩＦ、ｐＨＩＶ、ｐＣＬＸＳＮ、ｐＣＬＮＣＸ等の公知の発現ベクターが挙げられるが、本発明のＩｄ４遺伝子のｃＤＮＡが挿入でき、宿主細胞内で発現可能なベクターであれば特に限定されない。
【００４９】
発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、特に制限はないが、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、アデノウィルス法、ワクシニアウィルス法、レトロウィルスベクター法、レンチウィルスベクター法等の公知の方法を用いることができる。
【００５０】
宿主細胞の培地としては、大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主細胞とする場合、栄養源となる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば特に制限はなく、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５１】
炭素源としては、特に制限はないが、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン、デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【００５２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(ＩＡＡ)等を培地に添加してもよい。
【００５４】
また、前記Ｉｄ４としては、市販品を使用してもよい。前記市販品は、例えば、シグマ−アルドリッチ株式会社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コスモバイオ株式会社（ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ ＣＯ．ＬＴＤ）等から入手可能である。
【００５５】
また、前記Ｉｄ４は、骨髄中の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、且つ骨芽細胞への分化を促進する作用を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、Ｉｄ４を構成するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。前記実質的に同一のアミノ酸配列とは、アミノ酸配列中、数個のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたもので、且つ、Ｉｄ４の生理活性を有するものをいう。また、前記Ｉｄ４としては、骨髄中の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、且つ骨芽細胞への分化を促進する作用を有するものであれば、前記ポリペプチドの断片であってもよい。また、前記Ｉｄ４は、骨髄中の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、且つ骨芽細胞への分化を促進する作用を有するものであれば、そのＮ末端及び／又はＣ末端が修飾されていてもよい。
【００５６】
また、前記Ｉｄ４の形態としては、特に制限はないが、溶液、結晶等が挙げられる。
【００５７】
−その他の成分−
本発明の骨粗鬆症の治療剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【００５８】
前記アミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、又はこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることができる。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいｐＨ値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合、又は対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、又はオルニチンである。更に、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、その塩の形（好ましくはナトリウム塩）、中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、アラニン、芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又は誘導体のＮ−アセチルトリプトファンを使用することもできる。
【００５９】
前記多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
前記糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
【００６０】
前記含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
【００６１】
＜剤型＞
本発明の骨粗鬆症の治療剤としての剤型には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、前記治療剤は被検体の骨髄内に投与されることを特徴とすることから、前記骨髄内への直接投与が可能な、注射剤であることが好ましい。前記注射剤としては、例えば、水性注射剤、懸濁性注射剤、用時溶解用固形注射剤などが挙げられる。
【００６２】
本発明の骨粗鬆症の治療剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
【００６３】
前記注射剤は、所望により、更にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等の医薬用の添加剤を添加することにより、製造することができる。
【００６４】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
また、溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、更に好ましくは１０〜２０ｍＭである。
【００６５】
また、本発明の骨粗鬆症の治療剤は、必要に応じて、有効成分をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ Ｅｄ．，１９８０等参照）。更に、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９８１，１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１９８２，１２：９８−１０５；米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９８３，２２：５４７−５５６；欧州特許第１３３，９８８号明細書）。使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜或いは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
＜投与＞
好ましい投与態様においては、前記治療剤は、被験体の骨髄内に直接投与されることにより使用される。中でも、前記被検体としては、骨粗鬆症が好適であり、中でも、初期から進行期までの老人性骨粗鬆症が特に好適である。前記治療剤は、骨髄内に直接投与されることから、経口投与が困難な被検体への適用にも好適である。なお、前記被検体の生物種としては、前記医薬の投与対象となり得る生物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等が挙げられる。好適にはヒト、ウマ、又はイヌであり、より好適にはヒトである。
【００６７】
＜投与量＞
−Ｉｄ４遺伝子の投与量−
本発明の骨粗鬆症の治療剤におけるＩｄ４遺伝子は、発現ベクターに挿入した形態で投与されることが好ましく、前記Ｉｄ４遺伝子を挿入した発現ベクターを骨髄内に直接投与する場合、成人への１回の投与量は、特に制限はなく、被験対象の年齢、体重、所望の効果の程度、さらに剤型等に応じて適宜選択することができるが、好適には１０〜１００μｇ、より好適には２５〜１００μｇ、更に好ましくは５０〜１００μｇである。
【００６８】
−Ｉｄ４の投与量−
また、Ｉｄ４を骨髄内に直接投与する場合、成人への１回の投与量は、特に制限はなく、被験対象の年齢、体重、所望の効果の程度、さらに剤型等に応じて適宜選択することができるが、好適には１００〜５００μｇ、より好適には１５０〜５００μｇ、更に好ましくは２５０〜５００μｇである。
【００６９】
また、本発明の骨粗鬆症の治療剤は、治療目的で投与されてもよいし、予防目的で投与されてもよい。
【００７０】
−治療方法−
本発明の骨粗鬆症の治療剤を注射剤という形で骨髄内への直接投与することにより、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症に特有の症状、即ち、骨髄中に脂肪細胞が蓄積し骨芽細胞が減少することに起因する骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防することができる。
また、本発明の骨粗鬆症の治療剤は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症に対する公知の治療法、例えば、運動療法、又はカルシウム剤、活性型ビタミンＤ、ビタミンＫ、カルシトニン、ビスフォスネートなどの投与と同時に又は時間を隔てて投与されてもよい。
【００７１】
＜スクリーニング方法＞
本発明の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法は、測定工程と、選択工程を少なくとも含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
【００７２】
＜測定工程＞
測定工程は、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量Ｘと、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量Ｙと、を測定する工程である。
【００７３】
−Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞−
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞とは、被験者から採取した骨髄細胞、もしくは組織幹細胞であることが望ましい。骨髄内細胞の採取の方法は、特に制限はないが、骨髄採取針を用いて腸骨から骨髄を吸引する方法などを利用して採取することが好ましい。組織幹細胞は、外科的処置により採取した皮下脂肪をコラゲナーゼで消化させ、培養液中に懸濁して遠心分離操作を行ったときに沈殿した細胞分画を示す。
【００７４】
−被験化合物−
被験化合物とは、抗骨粗鬆症活性、特に抗老人性骨粗鬆症活性の評価対象となり得る物質であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどが挙げられる。前記低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどは、天然物から抽出及び精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液などであっても、前記被験物質として使用することができる。本発明では、これらの中でも、前記被験化合物を、老人性骨粗鬆症の治療又は予防薬として適用することを考慮した場合、前記被験物質は低分子化合物であることが好ましい。前記被験物質としては、新規な物質に限らず、公知の物質やその改良物であってもよい。例えば、新規な抗骨粗鬆症治療薬や予防薬の開発のため、既存の治療薬又は予防薬やその誘導体につき、本発明の方法により、抗骨粗鬆症活性を評価することができる。
【００７５】
−発現量Ｘ−
発現量Ｘとは、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量を示す。該発現量の測定方法には、特に制限はないが、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロット等が挙げられるが、特に好ましいのは、定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００７６】
−発現量Ｙ−
発現量Ｙとは、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量を示す。該発現量の測定方法としては、上記発現量Ｘと同様の方法により測定することができる。
【００７７】
＜選択工程＞
選択工程は、該発現量Ｘと、該発現量Ｙと、に基づき、Ｙ／Ｘの計算値が１．３以上である被験化合物を、骨粗鬆症の治療剤として選択する工程である。
【００７８】
−計算値−
前記計算値とは、特に制限はないが、測定されたＸとＹの値を入力して別々に格納し、格納されたＸとＹの値から自動的にＹ／Ｘを算出して出力するコンピューター、電卓、等に基づいて計算される数値である。
【００７９】
前記選択工程の計算値は１．３以上が好ましく、さらに好ましくは１．５以上、特に好ましくは１．７以上である。特に１．７以上では老人性性骨粗鬆症の治療剤として有効である。
【００８０】
本発明のＩｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の培養は、特に制限はないが、液体培養で行われることが好ましい。
【００８１】
該細胞は、特に制限はないが、遺伝子導入効率が良い動物細胞として、２９３（細胞番号ＲＣＢ１６３７：理化学研究所・バイオリソースセンター）、ＣＨＯ−Ｋ１（細胞番号ＲＣＢ０２８５：理化学研究所・バイオリソースセンター）、ＣＶ１（細胞番号ＲＣＢ０１６０：理化学研究所・バイオリソースセンター）、 ＣＯＳ１（細胞番号ＲＣＢ０１４３：理化学研究所・バイオリソースセンター）であることが好ましい。
【００８２】
（確認方法）
前記スクリーニング方法により選択された、抗骨粗鬆症活性を有すると評価された被験化合物（候補物質）が、実際に骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療又は予防に有効であるかどうかは、例えば、骨粗鬆症モデル動物、特に老人性骨粗鬆症モデル動物への、候補物質の投与実験などにより確認することができる。
前記老人性骨粗鬆症モデル動物としては、例えば、骨粗鬆症モデルマウスＫｌｏｔｈｏ（京都大学・鍋島陽一教授）、老人性骨粗鬆症モデルマウスＳＡＭＰ６（京都大学・細川昌則教授）等が使用できる。
【００８３】
候補物質が投与された前記骨粗鬆症モデル動物又は前記老人性骨粗鬆症モデルマウスの、骨髄中の脂肪細胞蓄積の度合いと骨量を観察することによって、前記スクリーニング方法により選択された候補物質の骨粗鬆症の治療又は予防効果を確認することができる。
【００８４】
なお、前記スクリーニング方法により選択された骨粗鬆症治療又は予防薬の候補物質の適用対象となり得る動物としては、骨粗鬆症に罹患する可能性のある動物であれば特に制限はなく、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウスなどが挙げられる。
【００８５】
（効果）
前記スクリーニング方法によれば、抗骨粗鬆症活性を有する物質、中でも、老人性骨粗鬆症における骨髄中の脂肪細胞を治療又は予防可能な、優れた骨粗鬆症の治療又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。
より具体的には、前記スクリーニング方法によれば、所望の効果のバランスを有する、優れた骨粗鬆症治療又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。すなわち、骨髄内における間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化抑制と、骨芽細胞への分化促進という２種類の効果が、所望のバランスで奏される、優れた老人性骨粗鬆症治療又は予防薬の候補物質を選択することが可能となる。即ち、正常な細胞の増殖は阻害することなく脂肪細胞の蓄積のみを抑制することのできる、副作用の危険性の少ない物質を選択することも可能となり、一方で、骨芽細胞が増殖することにより骨量が増加するという、強い効果の期待できる物質を選択することも可能となる。
【００８６】
以下に、Ｉｄ４遺伝子が間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進するという機能を有することを証明する実験方法及びその結果を示す。
【００８７】
＜実験１：脂肪細胞分化誘導＞
１．１ ｓｉＲＮＡの調製及び細胞への添加
Ｉｄ４遺伝子の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡとネガティブコントロールは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）及びＱＩＡＧＥＮでそれぞれ購入した。
前記二本鎖ＲＮＡ約１５０ｎｇとリポフェクトアミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μｌを添付のプロトコールに従い混和して調製した。
【００８８】
細胞株としてマウス骨髄由来のストローマ細胞であるＳＴ２細胞（細胞番号ＲＣＢ０２２４：理化学研究所・バイオリソースセンター）を用いた。ＳＴ２細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で１日間培養し、３００,０００個／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに播種した。上記二本鎖ＲＮＡを含有する混和した溶液を１ウェルあたり最終濃度２０ｎＭとなるように添加した。４時間後に培養液を脂肪細胞分化誘導培地として調製した１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２５μＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍｌインスリン、及び１μＭ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。脂肪細胞分化誘導培地に交換した日を０日目とした。
【００８９】
１．２ 脂肪細胞への分化誘導及び遺伝子発現量の測定
脂肪細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で２日間培養した後、０．１％トリプシン溶液を用いてＳＴ２細胞を回収し、ｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写酵素により１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定は、逆転写産物をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い行った。プライマーの配列は、（ＧＡＰＤＨ−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ-３'）〔配列番号１〕、（ＧＡＰＤＨ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ-３'）〔配列番号２〕、（Ｉｄ１−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧ-３'）〔配列番号３〕、（Ｉｄ１−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧ-３'）〔配列番号４〕、（Ｉｄ２−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴ-３'）〔配列番号５〕、（Ｉｄ２−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＣ-３'）〔配列番号６〕、（Ｉｄ３−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣ-３'）〔配列番号７〕、（Ｉｄ３−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＴＣ-３'）〔配列番号８〕、（Ｉｄ４−ｆｏｒｗａｒｄ１：５'-ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ-３'）〔配列番号９〕、（Ｉｄ４−ｆｏｒｗａｒｄ２：５'-ＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣ-３'）〔配列番号１０〕、（Ｉｄ４−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＣＣＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＡ-３'）〔配列番号１１〕であった。
１．３ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄによる脂肪染色方法
脂肪細胞の分化誘導を確認するために、上記と同様に、脂肪細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で４日間培養したＳＴ２細胞をＮｉｌｅ Ｒｅｄを用いて細胞内に蓄積した脂肪を染色した。
まず、４日間培養したＳＴ２細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ホルマリンを含有するリン酸緩衝液で固定し、１時間室温に放置した。Ｎｉｌｅ Ｒｅｄをアセトンに溶解し、最終的に１ｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで調製したものを固定したＳＴ２細胞に加えて、室温で１０分間培養した。その後、蛍光顕微鏡により蛍光強度脂肪蓄積の増減を確認する共に、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄの発光量を、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８５ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５３５ｎｍ）。
【００９０】
＜実験２：骨芽細胞分化誘導＞
２．１ ｓｉＲＮＡの調製及び細胞への添加
実施例１の１．１と同様の方法によりｓｉＲＮＡの調製を行った。さらに、脂肪細胞分化誘導と同様に、細胞株としてＳＴ２を用いた。ＳＴ２細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。上記二本鎖ＲＮＡを含有する混和した溶液を２０ｎＭとなるようにＳＴ２細胞の培養液に直接加えた。４時間後に培養液を骨芽細胞分化誘導培地として調製した１０％ＦＢＳ、および１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。骨芽細胞分化誘導培地に交換した日を０日目とした。
２．２ 骨芽細胞への分化誘導及び遺伝子発現量の測定
骨芽細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で１日間培養した後、０．１％トリプシン溶液を用いてＳＴ２細胞を回収し、上記と同様にｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後２本鎖ｃＤＮＡを得て遺伝子発現量の測定を行った。遺伝子発現量の測定は、１．１と同様に、逆転写産物をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い行った。
２．３ アルカリフォスファターゼ染色法
骨芽細胞の分化誘導を確認するために、上記と同様に、骨芽細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で６日間培養したＳＴ２細胞をアルカリフォスファターゼ染色法により分析した。
ＳＴ２細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ホルマリン溶液を細胞に加えて室温で２０分間放置し、アセトンとエタノールを等量含んだ溶液で１分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。ＳＴ２細胞を固定した。
次いで、アルカリフォスファターゼ染色溶液として、１ｍｇのＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス ミズリー州）を５０μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬、日本）に溶解し、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させて、さらに、６ｍｇのＦａｓｔ ｂｌｕｅ ＢＢ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス ミズリー州）を加えて、４５μｍのフィルターで濾過したものを、固定したＳＴ２細胞に加えて、３７℃で２０分間培養した。
【実施例】
【００９１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００９２】
＜実施例１：骨粗鬆症の予測分析方法＞
１．１：測定工程
１．１．１：骨髄内細胞中の間葉系幹細胞の抽出
全身麻酔下の骨粗鬆症に罹患していない健常者１０人及び被験試料の提供者１０人から骨髄穿刺により骨髄細胞浮遊液１０ｍｌを採取した。採取した骨髄細胞浮遊液１０ｍｌからキット名：例 ＣＤ１０５マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク株式会社）を用いて添付のプロトコールに従い間葉系幹細胞を抽出し細胞数１００,０００個／ｍｌになるように希釈した。
１．１．２：Ｉｄ４ｍＲＮＡの抽出と発現量の測定
上記希釈細胞液からｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇをテンプレートとして、プライマーとスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州 カールズバッド）を用いて、Ｉｄ４ｃＤＮＡを合成した。プライマーの配列は（Ｉｄ４−ｆｏｒｗａｒｄ１：５'-ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ-３'）〔配列番号９〕、（Ｉｄ４−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＣＣＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＡ-３'）〔配列番号１１〕であった。
次いで、Ｉｄ４ｃＤＮＡ（ｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇ相当量）をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い遺伝子発現量を測定した。
【００９３】
２．１：判断工程
測定された健常者１０人の発現量の値の平均値を発現量（Ａ）として、これをコントロールとし、被験試料の提供者１０人の値を発現量（Ｂ）として、これらの値をコンピューターに入力し、自動的に（Ｂ／Ａ）×１００（％）の値を算出した。上記提供者１０人のうち５人について、算出した値が７０％以下であったため、骨粗鬆症を発症する可能性が高いと判断した。
＜実施例２：骨粗鬆症の治療剤＞
２．１：Ｉｄ４遺伝子を含む骨粗鬆症の治療剤の調製
実施例１と同様にしてＩｄ４ｃＤＮＡを調製した。次いで、キット名：アデノウィルスＣｒｅ−ｌｏｘＰキット（タカラバイオメディカル社製）を用いて、Ｉｄ４ｃＤＮＡをアデノウィルスベクターに挿入して組換えアデノウィルスベクターを作製した。得られた組換えアデノウィルスベクター１０μｇを緩衝液１００μｌに希釈して骨粗鬆症の治療剤とした。
２．２：Ｉｄ４を含む骨粗鬆症の治療剤の調製
上記４．１と同様にしてＩｄ４ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡ１μｇと発現ベクター（ベクター名：ｐＣＭＶベクター）１μｇを制限酵素：ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２本鎖ｃＤＮＡを発現ベクターに連結することによりＩｄ４遺伝子発現ベクターを完成させた。次いで、緩衝液に希釈した該発現ベクター（濃度：１００ｎｇ/μｌ）を動物細胞（細胞名：ＣＨＯ−Ｋ１）へリポフェクション法により導入し、培養液ＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で２日間培養した後、カラムクロマトグラフィーにより培養液中に産生分泌されたＩｄ４タンパクの抽出・精製を行った。得られたＩｄ４タンパクを緩衝液１００μｌに希釈して骨粗鬆症の治療剤とした。
【００９４】
２．３：薬理試験
上記骨粗鬆症の治療剤を老人性骨粗鬆症のマウス１０匹に投与し、骨髄中の脂肪蓄積及び骨量の変化を大腿骨の骨密度および尿中Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ-テロペプチド濃度を測定することにより調べた。これらの結果から、本発明の治療剤が骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症モデルマウスに効果的な治療効果を示すことが判明した。
【００９５】
＜実施例３：骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法＞
３．１：測定工程
３．１．１：Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の調製
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞株ＳＴ２を作成し、この細胞を培養増殖させることにより、本実施例に用いた。細胞株ＳＴ２は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２日間培養した。培養した細胞を遠心分離（１,０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、２５℃）にて回収して、培養液に希釈して２４ウェルプレートに 細胞数３００,０００個／ｍｌになるように播種した。２４ウェルプレート中で培養後１日目に被験化合物を１μＭになるように添加し、同時に被験化合物を添加しない細胞（コントロール）を同条件で用意し、共に２日間培養した。２日間経過した後、個々のウェルの細胞を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに回収して、ｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写酵素により１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した後、得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定は、逆転写産物をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い行った。
【００９６】
３．２：選択工程
測定された被験化合物の非存在下でのＩｄ４遺伝子の発現量をＸ、被験化合物の存在下でのＩｄ４遺伝子の発現量Ｙについてコンピューターに入力し、自動的にＹ／Ｘの計算値を算出して、１．３以上の値の化合物について骨粗鬆症の治療剤の候補物質として選択した。
【００９７】
以上の結果から、本発明において、Ｉｄ４遺伝子が間葉系幹細胞からの脂肪細胞への分化と骨芽細胞への分化の両者に関与する遺伝子であるという新たな知見に基づいて、Ｉｄ４遺伝子の発現量をマーカーとして、骨粗鬆症を早期に予測分析できる方法を確認した。また、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分とする骨粗鬆症の治療剤が、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症に特有の症状、即ち、骨髄中に脂肪細胞を蓄積すると同時に骨芽細胞が減少して骨が脆弱化する症状を治療又は予防する優れた治療効果を有することが示された。
さらに、本発明の骨粗鬆症の治療剤のＩｄ４遺伝子の発現量を用いたスクリーニング方法では、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤を候補物質としてスクリーニングできることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の骨粗鬆症の予測分析方法は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を発症する可能性を早期に予測するために好適に利用できる。さらに、骨粗鬆症の治療剤は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療又は予防に、好適に利用可能である。さらに本発明の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を治療及び予防させる候補物質のスクリーニングに好適である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより骨粗鬆症を予測分析する骨粗鬆症の予測分析方法、並びに、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分とする骨粗鬆症の治療剤及びＩｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を用いて骨粗鬆症を治療及び予防させる骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨量又は骨塩量の減少によって骨の微細構造が破綻し、骨強度が低下して骨折のリスクが高まった全身性疾患である。日本では骨粗鬆症の患者は約１１００万人と言われており、その８割は女性である。さらに、骨粗鬆症は中年以降に多く見られる疾患であるため、近年の高齢化に伴い今後患者数が増加すると推測される。
【０００３】
骨粗鬆症は大まかに原発性骨粗鬆症と持続性骨粗鬆症の２つに大別される。原発性骨粗鬆症は、加齢や閉経後に起きる骨粗鬆症のことであり、閉経後の女性に認められる閉経後骨粗鬆症と高齢者に認められる老人性骨粗鬆症に分類され、この両者は退行期骨粗鬆症と総称される。一方、持続性骨粗鬆症は、ステロイド剤の投与や糖尿病、卵巣摘出の疾患等が原因となる骨粗鬆症である。骨粗鬆症の一般的な診断方法はとしては、手の甲のＸ線撮影を行うＭＤ法、身体の下から２種類のＸ線を照射して骨量を測定する二重Ｘ線吸収骨塩定量（ＤＸＡ法）、踵骨に超音波を当てて骨量を測定する超音波法等が挙げられる。
【０００４】
高齢者人口が増えた現代社会において特に注目されるのが老人性骨粗鬆症である。骨粗鬆症患者の骨は骨量が低下して小さな穴が多発した状態になっているため、骨折する可能性がかなり高い。特に老人性骨粗鬆症患者の場合、骨折による痛みや障害以外にも大腿骨や股関節の骨折から寝たきりにつながることも多く、老人性骨粗鬆症患者の生活の質（ＱＯＬ）を著しく低下させる危険性を含んでいる。したがって、高齢化を迎えた現代社会においては、老人性骨粗鬆症に対する的確な診断方法や予防方法の必要性が高まっている。
【０００５】
骨粗鬆症の予防方法としては、一般的に、日照の不足、運動量の低下、過度のアルコール摂取、カフェインの過剰摂取、喫煙、ステロイド剤の薬剤を回避すること、さらに発症前の食事療法、運動療法、薬物療法等が従来から提唱されている。また、治療方法としては、骨粗鬆症の治療法はエストロゲン等の薬物の投与、リン酸カルシウム骨セメントを注入する手術方法、痛みの原因となる神経に麻酔薬を注射する方法等が知られている。しかしながら、エストロゲン投与は乳癌の発症率が高くなるという副作用、骨セメントを注入する手術方法では骨セメントが骨以外の場所に漏れて固まり神経を圧迫するという危険性、麻酔薬を注射する方法では脊椎専門医や麻酔医の高度な技術の必要性など、それぞれの方法に特有の問題がある。
【０００６】
ところで、骨髄内には多分化能を有する間葉系幹細胞が存在することが知られている。この細胞は近年急速に発展している再生医療の分野で注目されており、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、心筋細胞等のさまざまな細胞に分化できる能力を持つ。骨形成に関与する骨芽細胞は、コラーゲン線維をはじめ種々の細胞外マトリックス成分を合成・分泌しており、骨芽細胞の増殖は種々の成長因子やサイトカインにより制御されていることが知られている。
【０００７】
一方、哺乳動物の分化抑制因子としてＩｄ１〜Ｉｄ４が知られている。これらの分化抑制因子は、筋肉細胞、赤血球、顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、脂肪細胞、乳腺細胞、神経細胞や骨芽細胞の分化モデル系において細胞分化を強く抑制することが知られている。また、組織の修復過程や血清刺激による増殖刺激によって発現が誘導される遺伝子でもあり、培養細胞に過剰発現させると細胞増殖を促進し、条件によってはアポトーシスを誘導することも報告されている。このように、分化抑制因子Ｉｄｓは細胞の分化と増殖に関わる機能を併せ持っているが、その機能や分化抑制の機序については未知の点が多く、骨芽細胞への作用についても不明な点が多い。
【０００８】
老化に伴う活性型ビタミンＤ量の低下などで惹き起こされる老人性骨粗鬆症の特徴は、他の骨粗鬆症とは異なり、骨を形成する骨芽細胞が減少して骨が脆弱化するだけでなく、骨髄内に脂肪細胞が蓄積されて黄色化することである。したがって、骨髄中の脂肪細胞の蓄積が早期に発見できる分析方法や脂肪細胞の蓄積を抑制する治療剤があれば、老人性骨粗鬆症の予防や治療につながると考えられる。骨髄内の間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を抑制する因子は幾つか知られているが、同時に骨芽細胞への分化を抑制するため骨量減少という副作用も報告されており、老人性骨粗鬆症の治療剤としては適切ではない。骨量の維持には脂質生成と骨生成のバランスが重要であると思われるが、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化と骨芽細胞への分化という２つの異なる方向性を決める分子メカニズムは未だに判っていない。
したがって、骨髄中の脂肪細胞の蓄積に注目して老人性骨粗鬆症を早期に予測分析する方法、又は骨髄中の脂質生成と骨生成のバランスを維持する治療剤の提供が望まれているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、被験試料の骨髄内細胞において、骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することで骨髄中の脂質生成と骨形成のバランスを保ち、脂肪細胞の増殖による骨の黄色化と骨芽細胞の減少による骨量低下による骨の脆弱化を阻止するＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を早期に予測分析することができる骨粗鬆症の予測分析方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分として含むことにより骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することにより骨髄中の脂肪細胞の蓄積を抑制しつつ骨芽細胞の量を維持することで骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量と、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量と、を測定することにより、Ｉｄ４遺伝子の活性を高めることで骨髄中の間葉系幹細胞の分化の初期段階で脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進させて骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防して骨髄中の脂質生成と骨生成のバランスを維持することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングすることができるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、骨髄内に存在する間葉系幹細胞を利用して、脂肪細胞と骨芽細胞への分化過程に関わる因子を鋭意研究した結果、分化抑制因子Ｉｄ４ が、骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することを発見し、その結果、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより、被験試料の提供者が老人性骨粗鬆症を発症する可能性を有するか否かを早期に予測分析できること、また、Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とする骨粗鬆症の治療剤を老人性骨粗鬆症の患者の骨髄中に直接投与することにより、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化抑制と骨芽細胞への分化促進を同時に達成することで優れた治療効果を発揮することができること、さらに、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を用いて、骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングすることができること、という知見を得て、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 骨粗鬆症の予測分析方法であって、
（ａ）健常者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量Ａと、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量Ｂとをそれぞれ測定する測定工程と、
（ｂ）該発現量Ａと、該発現量Ｂと、に基づき、（Ｂ／Ａ）×１００（％）の計算値が７０（％）以下である場合に、前記被験試料の提供者が骨粗鬆症になる可能性が高いと判断する判断工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
＜２＞ 骨髄内細胞が間葉系幹細胞である、前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞ 骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、前記＜１＞から前記＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜１＞から前記＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜１＞から前記＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする、骨粗鬆症の治療剤である。
＜７＞ 骨髄内に直接投与される、前記＜６＞に記載の治療剤である。
＜８＞ 骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、前記＜６＞から前記＜７＞のいずれかに記載の治療剤である。
＜９＞ 骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量Ｘと、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量Ｙと、を測定する測定工程と
（ｂ）該発現量Ｘと、該発現量Ｙと、に基づき、Ｙ／Ｘの計算値が１．３以上である被験化合物を、骨粗鬆症の治療剤として選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
＜１０＞ Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の培養が液体培養で行われる、前記＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞ Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞が動物細胞由来である、前記＜９＞から前記＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞ 骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、前記＜９＞から前記＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜９＞から前記＜１２＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞ Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロットおよびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、前記＜９＞から前記＜１３＞のいずれかに記載の方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、前記従来における諸問題を解決することができる。すなわち、本発明は、被験試料の骨髄内細胞において、骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することで骨髄中の脂質生成と骨形成のバランスを保ち、脂肪細胞の増殖による骨の黄色化と骨芽細胞の減少による骨量低下による骨の脆弱化を阻止するＩｄ４遺伝子の発現量を測定することにより、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を早期に予測分析することができる骨粗鬆症の予測分析方法を提供することができ、また、本発明は、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分として含むことにより骨髄中の間葉系幹細胞の分化過程の初期段階において脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することにより骨髄中の脂肪細胞の蓄積を抑制しつつ骨芽細胞の量を維持することで骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤を提供することができ、さらに、本発明は、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量と、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量と、を測定することにより、Ｉｄ４遺伝子の活性を高めることで骨髄中の間葉系幹細胞の分化の初期段階で脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進させて骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防して骨髄中の脂質生成と骨生成のバランスを維持することができる骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤をスクリーニングすることができるスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の骨粗鬆症の予測分析方法は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の早期の予測分析に好適に使用することができる。
【００１４】
本発明の骨粗鬆症の予測分析方法は、測定工程と、判断工程と、を少なくとも含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
【００１５】
＜測定工程＞
前記測定工程は、健常者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量Ａと、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量Ｂと、をそれぞれ測定する工程である。
【００１６】
−健常者−
健常者とは、被験試料を提供する時点で骨粗鬆症に罹患していない対象のことであり、尿中デオキシピリジノリン濃度（男性：２．１〜５．４、女性：２．８〜７．６ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ Ｃｒ）、尿中Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド濃度（男性：１３．０〜６６．２、女性：９．３〜５４．３ｎｍｏｌ ＢＣＥ／ｍｍｏｌ Ｃｒ）、血清Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド濃度（男性：９．５〜１７．７、女性：７．５〜１６．５ｎｍｏｌ ＢＣＥ／ｍｍｏｌ Ｃｒ）、尿中Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ-テロペプチド（男性：＜１８４．１、女性：４０．３〜３０１．４μg／ｍｍｏｌ Ｃｒ）および骨型アルカリフォスファターゼ (男性：１３．０〜３３．９、女性：９．６〜３５．４Ｕ／Ｌ)を基準値としている。
【００１７】
−骨髄内細胞−
骨髄内細胞とは骨髄内の海綿状組織に存在する細胞であり、種々の因子により骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、神経細胞のそれぞれに分化する間葉系幹細胞と血液細胞や免疫細胞に分化する造血幹細胞の２つの幹細胞に大別される。本発明では、骨芽細胞、脂肪細胞等に分化する間葉系幹細胞を用いる。
【００１８】
骨髄内細胞の採取の方法は、特に制限はないが、骨髄採取針を用いて腸骨から骨髄を吸引する方法などを利用して採取することが好ましい。
【００１９】
−Ｉｄ４遺伝子−
Ｉｄ４遺伝子とは文献名：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５，７４９−７５５などに記載されている公知の遺伝子であり、マウスの遺伝子は登録番号：ＮＭ＿０３１１６６、ヒトの遺伝子では登録番号：ＮＭ＿００１５４６としてＧｅｎＢａｎｋに各々対応するアミノ酸配列と共に登録されている。Ｉｄ４遺伝子は当初、Ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ（ＨＬＨ）モチーフを持つ分化抑制因子Ｉｄ１、Ｉｄ２およびＩｄ３といったＩｄファミリーの１つとしてとして哺乳動物から単離されたものであり、分化を決定づける転写因子がＤＮＡへ結合するのは阻害するモチーフをもつタンパクをコードしている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４， Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５，７４９−７５５）。Ｉｄ４遺伝子の公知の機能は、神経細胞の分化やグリア細胞の発生に関わることであるが、本発明者らにより、骨髄由来の間葉系幹細胞株の分化過程の初期段階において、Ｉｄ４が脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進することであり、Ｉｄ４が骨髄中の脂質生成と骨形成のバランスを保ち、脂肪細胞の増殖による骨の黄色化と骨芽細胞の減少による骨量低下による骨の脆弱化を阻止する機能を有するという新たな知見が得られた。
【００２０】
−発現量Ａ−
発現量Ａとは、健常者の骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を示し、発現量の測定方法には、特に制限はないが、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロット等が挙げられるが、特に好ましいのは、定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００２１】
前記ＤＮＡマイクロアレイとは、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上の定められた領域に高密度に固定されているものを示し、例えばＤＮＡチップと呼称されるものを包含する。
【００２２】
前記ＤＮＡマイクロアレイの支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセルロース、ナイロンの膜等が使用される。また、支持体上に固定される遺伝子又はその断片としては、特に限定するものではないが、例えばゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、これらを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅されたＤＮＡ断片等が挙げられる。
【００２３】
前記ＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも測定できるという利点がある。
【００２４】
標識に用いられる前記標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。該蛍光物質としては、特に限定はないが、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、被験試料、対照として用いる試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが好ましい。
【００２５】
前記標識の検出法は、標識物質の種類により、適宜選択することができる。例えば、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出することができる。
【００２６】
前記ＲＮａｓｅプロテクションアッセイとは、１本鎖ＲＮＡには切断活性を示すが、２本鎖ＲＮＡには切断活性を示さない基質特異性を有するＲＮａｓｅの機能を利用する方法である。すなわち、検出対象となるｍＲＮＡに相補的となるようなＲＩ標識したプローブを合成し、組織又は培養細胞より抽出したｔｏｔａｌＲＮＡ又はｐｏｌｙＡ ＲＮＡとハイブリッドを形成させ、次いでＲＮａｓｅを作用させる。ここで、ハイブリッドを形成しなかった１本鎖ＲＮＡは分解されるが、２本鎖ＲＮＡは分解されないまま残る。この分解されなかったｍＲＮＡの発現量を、電気泳動により分離検出を行うことで目的とするｍＲＮＡの定量を行うことができる。
【００２７】
前記定量的リアルタイムＰＣＲとは、ＰＣＲの増幅産物の量をリアルタイムでモニタリングし、増幅産物が描く増幅曲線を利用して試料中のコピー数を算出する方法である。この方法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置が用いられる。
前記定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝子の発現量を測定する場合、段階希釈した既知量のＤＮＡをコントロールとしてＰＣＲを行い、これを基に、コピー数とサイクル数とで検量線を作製することにより、試料の増幅曲線からこの試料中に含まれる遺伝子の発現量を算出することができる。
【００２８】
前記ノーザンブロットとは、ＲＮＡの混合試料から特定の塩基配列を持つ分子を検出・定量する方法であり、ゲル電気泳動で分離して、ナイロン膜に転写した後、目的のＲＮＡ配列に相補的な核酸を標識した核酸プローブとハイブリダイズさせて目的のＲＮＡの発現量、サイズを検出する方法である。
【００２９】
前記核酸を標識する方法としてはＲＩを用いる方法、ＤＩＧと抗体を用いるｎｏｎＲＩ法、蛍光染色を用いる方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明において用いられるＩｄ４遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットにより定量することにより行われるが、特に好ましいのはウェスタンブロットである。
【００３１】
前記酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）とは、試料中に含まれるポリペプチドをペルオキシダーゼ、ビオチン等で酵素標識した抗体又は抗原を用いて、抗原抗体反応を利用して、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【００３２】
前記ウェスタンブロットとは、目的のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、メンブレン上に転写することにより、目的のタンパク質に対する特異的抗体と反応させて、特異的抗体にあらかじめ結合されている酵素の活性を利用した発色反応により目的のタンパク質を検出する方法である。
【００３３】
前記ドットブロット法とは、メンブレンに直接ＲＮＡをブロットし、プローブによって目的のｍＲＮＡ量を定量する方法である。
【００３４】
−発現量Ｂ−
発現量Ｂとは、被験試料の骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量を示す。該発現量の測定方法としては、上記発現量Ａと同様の方法により測定することができる。
【００３５】
−被験試料−
被験試料とは、骨粗鬆症を発症していない健常者又は骨粗鬆症を発症する可能性のある健常者から直接採取された骨髄内細胞であるが、骨粗鬆症を発症していない健常者又は骨粗鬆症を発症する可能性のある健常者から採取された骨髄内細胞を入手したものでもよい。
【００３６】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定するために骨髄内細胞から採取する細胞数は、１，０００個〜１，０００，０００個の範囲が好ましく、さらに好ましくは１０，０００個〜１，０００，０００個、特に好ましくは１，０００，０００個である。
【００３７】
本発明において、「分化過程の初期段階」とは分化を誘導する処理を行ってから２日以内を指し、細胞増殖が止まり細胞周期が静止期に入る段階を示している。
【００３８】
＜判断工程＞
判断工程は、前記測定工程により測定された該発現量Ａと、該発現量Ｂと、に基づき、（Ｂ／Ａ）×１００（％）の計算値が７０（％）以下である場合に、前記被験試料の提供者が骨粗鬆症になる可能性が高いと判断する判断工程である。
【００３９】
−計算値−
前記計算値とは、特に制限はないが、測定されたＡとＢの値を入力して別々に格納し、格納されたＡとＢの値から自動的に（Ｂ／Ａ）×１００（％）を算出して出力する、コンピューター、電卓、等に基づいて計算される数値である。
【００４０】
前記計算値は７０％以下が好ましく、さらに好ましくは６０％以下、特に好ましくは５０％以下である。特に５０％以下では老人性骨粗鬆症を発症する確率は３０％である。
【００４１】
＜骨粗鬆症の治療剤＞
本発明の骨粗鬆症の治療剤は、骨粗鬆症を治療又は予防するための治療剤であり、上述したＩｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質（以下、Ｉｄ４と記載）の少なくともいずれかを有効成分として含み、さらに必要に応じてその他の成分を含む。
【００４２】
−Ｉｄ４遺伝子がコードするタンパク質−
Ｉｄ４遺伝子がコードするタンパク質とは、Ｉｄ４遺伝子が転写翻訳されたタンパク質のことである。
【００４３】
−Ｉｄ４遺伝子の調製−
本発明の骨粗鬆症の治療剤の有効成分であるＩｄ４遺伝子は、骨髄内に直接投与するため、ヒト組織内で発現してＩｄ４を産生することができる発現ベクターに導入することが好ましい。
まず、本発明のＩｄ４遺伝子は、常法に従い公知の配列を基に調製することができる。例えば、動物細胞からｍＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でクローニングすることにより目的とするＩｄ４遺伝子のｃＤＮＡを調製することができる。これらのクローニングの技法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）) 等のプロトコールを参照することにより行うことができる。
【００４４】
常法により調製した全長ｃＤＮＡは、必要に応じて、Ｉｄ４をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。該ＤＮＡ断片、又は全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、Ｉｄ４遺伝子の発現可能なベクターを作製することができる。
【００４５】
本発明に用いられる発現ベクターとしては、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、およびレンチウィルスベクター等の公知のウィルスベクターが挙げられるが、本発明のＩｄ４遺伝子が挿入でき、さらにヒト組織内で発現可能なベクターであれば特に限定されない。
【００４６】
−Ｉｄ４の調製−
本発明の骨粗鬆症の治療剤に含有するＩｄ４は、Ｉｄ４遺伝子のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入することで得られた形質転換体を培地中で培養し、宿主細胞内から精製するか、培地中にＩｄ４を産生分泌させ、該培地よりＩｄ４を抽出して調製することができる。
まず、本発明におけるＩｄ４遺伝子は、常法に従い公知の配列を基に調製することができる。例えば、動物細胞からｍＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でクローニングすることにより目的とするＩｄ４遺伝子のｃＤＮＡを調製することができる。これらのクローニングの技法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）) 等のプロトコールを参照することにより行うことができる。
【００４７】
常法により調製した全長ｃＤＮＡを基に、必要に応じて、Ｉｄ４をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片、又は全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、宿主細胞内でＩｄ４遺伝子の発現可能なベクターを作製できる。
【００４８】
本発明に用いられる発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＣＤＭ８、ｐＳＩＦ、ｐＨＩＶ、ｐＣＬＸＳＮ、ｐＣＬＮＣＸ等の公知の発現ベクターが挙げられるが、本発明のＩｄ４遺伝子のｃＤＮＡが挿入でき、宿主細胞内で発現可能なベクターであれば特に限定されない。
【００４９】
発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、特に制限はないが、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、アデノウィルス法、ワクシニアウィルス法、レトロウィルスベクター法、レンチウィルスベクター法等の公知の方法を用いることができる。
【００５０】
宿主細胞の培地としては、大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主細胞とする場合、栄養源となる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば特に制限はなく、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５１】
炭素源としては、特に制限はないが、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン、デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【００５２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(ＩＡＡ)等を培地に添加してもよい。
【００５４】
また、前記Ｉｄ４としては、市販品を使用してもよい。前記市販品は、例えば、シグマ−アルドリッチ株式会社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コスモバイオ株式会社（ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ ＣＯ．ＬＴＤ）等から入手可能である。
【００５５】
また、前記Ｉｄ４は、骨髄中の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、且つ骨芽細胞への分化を促進する作用を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、Ｉｄ４を構成するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。前記実質的に同一のアミノ酸配列とは、アミノ酸配列中、数個のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたもので、且つ、Ｉｄ４の生理活性を有するものをいう。また、前記Ｉｄ４としては、骨髄中の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、且つ骨芽細胞への分化を促進する作用を有するものであれば、前記ポリペプチドの断片であってもよい。また、前記Ｉｄ４は、骨髄中の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、且つ骨芽細胞への分化を促進する作用を有するものであれば、そのＮ末端及び／又はＣ末端が修飾されていてもよい。
【００５６】
また、前記Ｉｄ４の形態としては、特に制限はないが、溶液、結晶等が挙げられる。
【００５７】
−その他の成分−
本発明の骨粗鬆症の治療剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【００５８】
前記アミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、又はこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることができる。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいｐＨ値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合、又は対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、又はオルニチンである。更に、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、その塩の形（好ましくはナトリウム塩）、中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、アラニン、芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又は誘導体のＮ−アセチルトリプトファンを使用することもできる。
【００５９】
前記多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
前記糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
【００６０】
前記含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
【００６１】
＜剤型＞
本発明の骨粗鬆症の治療剤としての剤型には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、前記治療剤は被検体の骨髄内に投与されることを特徴とすることから、前記骨髄内への直接投与が可能な、注射剤であることが好ましい。前記注射剤としては、例えば、水性注射剤、懸濁性注射剤、用時溶解用固形注射剤などが挙げられる。
【００６２】
本発明の骨粗鬆症の治療剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
【００６３】
前記注射剤は、所望により、更にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等の医薬用の添加剤を添加することにより、製造することができる。
【００６４】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
また、溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、更に好ましくは１０〜２０ｍＭである。
【００６５】
また、本発明の骨粗鬆症の治療剤は、必要に応じて、有効成分をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ Ｅｄ．，１９８０等参照）。更に、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９８１，１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１９８２，１２：９８−１０５；米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９８３，２２：５４７−５５６；欧州特許第１３３，９８８号明細書）。使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜或いは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
＜投与＞
好ましい投与態様においては、前記治療剤は、被験体の骨髄内に直接投与されることにより使用される。中でも、前記被検体としては、骨粗鬆症が好適であり、中でも、初期から進行期までの老人性骨粗鬆症が特に好適である。前記治療剤は、骨髄内に直接投与されることから、経口投与が困難な被検体への適用にも好適である。なお、前記被検体の生物種としては、前記医薬の投与対象となり得る生物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等が挙げられる。好適にはヒト、ウマ、又はイヌであり、より好適にはヒトである。
【００６７】
＜投与量＞
−Ｉｄ４遺伝子の投与量−
本発明の骨粗鬆症の治療剤におけるＩｄ４遺伝子は、発現ベクターに挿入した形態で投与されることが好ましく、前記Ｉｄ４遺伝子を挿入した発現ベクターを骨髄内に直接投与する場合、成人への１回の投与量は、特に制限はなく、被験対象の年齢、体重、所望の効果の程度、さらに剤型等に応じて適宜選択することができるが、好適には１０〜１００μｇ、より好適には２５〜１００μｇ、更に好ましくは５０〜１００μｇである。
【００６８】
−Ｉｄ４の投与量−
また、Ｉｄ４を骨髄内に直接投与する場合、成人への１回の投与量は、特に制限はなく、被験対象の年齢、体重、所望の効果の程度、さらに剤型等に応じて適宜選択することができるが、好適には１００〜５００μｇ、より好適には１５０〜５００μｇ、更に好ましくは２５０〜５００μｇである。
【００６９】
また、本発明の骨粗鬆症の治療剤は、治療目的で投与されてもよいし、予防目的で投与されてもよい。
【００７０】
−治療方法−
本発明の骨粗鬆症の治療剤を注射剤という形で骨髄内への直接投与することにより、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症に特有の症状、即ち、骨髄中に脂肪細胞が蓄積し骨芽細胞が減少することに起因する骨の黄色化と脆弱化を早期に治療又は予防することができる。
また、本発明の骨粗鬆症の治療剤は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症に対する公知の治療法、例えば、運動療法、又はカルシウム剤、活性型ビタミンＤ、ビタミンＫ、カルシトニン、ビスフォスネートなどの投与と同時に又は時間を隔てて投与されてもよい。
【００７１】
＜スクリーニング方法＞
本発明の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法は、測定工程と、選択工程を少なくとも含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
【００７２】
＜測定工程＞
測定工程は、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量Ｘと、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量Ｙと、を測定する工程である。
【００７３】
−Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞−
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞とは、被験者から採取した骨髄細胞、もしくは組織幹細胞であることが望ましい。骨髄内細胞の採取の方法は、特に制限はないが、骨髄採取針を用いて腸骨から骨髄を吸引する方法などを利用して採取することが好ましい。組織幹細胞は、外科的処置により採取した皮下脂肪をコラゲナーゼで消化させ、培養液中に懸濁して遠心分離操作を行ったときに沈殿した細胞分画を示す。
【００７４】
−被験化合物−
被験化合物とは、抗骨粗鬆症活性、特に抗老人性骨粗鬆症活性の評価対象となり得る物質であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどが挙げられる。前記低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどは、天然物から抽出及び精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液などであっても、前記被験物質として使用することができる。本発明では、これらの中でも、前記被験化合物を、老人性骨粗鬆症の治療又は予防薬として適用することを考慮した場合、前記被験物質は低分子化合物であることが好ましい。前記被験物質としては、新規な物質に限らず、公知の物質やその改良物であってもよい。例えば、新規な抗骨粗鬆症治療薬や予防薬の開発のため、既存の治療薬又は予防薬やその誘導体につき、本発明の方法により、抗骨粗鬆症活性を評価することができる。
【００７５】
−発現量Ｘ−
発現量Ｘとは、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量を示す。該発現量の測定方法には、特に制限はないが、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロット等が挙げられるが、特に好ましいのは、定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００７６】
−発現量Ｙ−
発現量Ｙとは、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量を示す。該発現量の測定方法としては、上記発現量Ｘと同様の方法により測定することができる。
【００７７】
＜選択工程＞
選択工程は、該発現量Ｘと、該発現量Ｙと、に基づき、Ｙ／Ｘの計算値が１．３以上である被験化合物を、骨粗鬆症の治療剤として選択する工程である。
【００７８】
−計算値−
前記計算値とは、特に制限はないが、測定されたＸとＹの値を入力して別々に格納し、格納されたＸとＹの値から自動的にＹ／Ｘを算出して出力するコンピューター、電卓、等に基づいて計算される数値である。
【００７９】
前記選択工程の計算値は１．３以上が好ましく、さらに好ましくは１．５以上、特に好ましくは１．７以上である。特に１．７以上では老人性性骨粗鬆症の治療剤として有効である。
【００８０】
本発明のＩｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の培養は、特に制限はないが、液体培養で行われることが好ましい。
【００８１】
該細胞は、特に制限はないが、遺伝子導入効率が良い動物細胞として、２９３（細胞番号ＲＣＢ１６３７：理化学研究所・バイオリソースセンター）、ＣＨＯ−Ｋ１（細胞番号ＲＣＢ０２８５：理化学研究所・バイオリソースセンター）、ＣＶ１（細胞番号ＲＣＢ０１６０：理化学研究所・バイオリソースセンター）、 ＣＯＳ１（細胞番号ＲＣＢ０１４３：理化学研究所・バイオリソースセンター）であることが好ましい。
【００８２】
（確認方法）
前記スクリーニング方法により選択された、抗骨粗鬆症活性を有すると評価された被験化合物（候補物質）が、実際に骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療又は予防に有効であるかどうかは、例えば、骨粗鬆症モデル動物、特に老人性骨粗鬆症モデル動物への、候補物質の投与実験などにより確認することができる。
前記老人性骨粗鬆症モデル動物としては、例えば、骨粗鬆症モデルマウスＫｌｏｔｈｏ（京都大学・鍋島陽一教授）、老人性骨粗鬆症モデルマウスＳＡＭＰ６（京都大学・細川昌則教授）等が使用できる。
【００８３】
候補物質が投与された前記骨粗鬆症モデル動物又は前記老人性骨粗鬆症モデルマウスの、骨髄中の脂肪細胞蓄積の度合いと骨量を観察することによって、前記スクリーニング方法により選択された候補物質の骨粗鬆症の治療又は予防効果を確認することができる。
【００８４】
なお、前記スクリーニング方法により選択された骨粗鬆症治療又は予防薬の候補物質の適用対象となり得る動物としては、骨粗鬆症に罹患する可能性のある動物であれば特に制限はなく、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウスなどが挙げられる。
【００８５】
（効果）
前記スクリーニング方法によれば、抗骨粗鬆症活性を有する物質、中でも、老人性骨粗鬆症における骨髄中の脂肪細胞を治療又は予防可能な、優れた骨粗鬆症の治療又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。
より具体的には、前記スクリーニング方法によれば、所望の効果のバランスを有する、優れた骨粗鬆症治療又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。すなわち、骨髄内における間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化抑制と、骨芽細胞への分化促進という２種類の効果が、所望のバランスで奏される、優れた老人性骨粗鬆症治療又は予防薬の候補物質を選択することが可能となる。即ち、正常な細胞の増殖は阻害することなく脂肪細胞の蓄積のみを抑制することのできる、副作用の危険性の少ない物質を選択することも可能となり、一方で、骨芽細胞が増殖することにより骨量が増加するという、強い効果の期待できる物質を選択することも可能となる。
【００８６】
以下に、Ｉｄ４遺伝子が間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制すると同時に骨芽細胞への分化を促進するという機能を有することを証明する実験方法及びその結果を示す。
【００８７】
＜実験１：脂肪細胞分化誘導＞
１．１ ｓｉＲＮＡの調製及び細胞への添加
Ｉｄ４遺伝子の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡとネガティブコントロールは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）及びＱＩＡＧＥＮでそれぞれ購入した。
前記二本鎖ＲＮＡ約１５０ｎｇとリポフェクトアミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μｌを添付のプロトコールに従い混和して調製した。
【００８８】
細胞株としてマウス骨髄由来のストローマ細胞であるＳＴ２細胞（細胞番号ＲＣＢ０２２４：理化学研究所・バイオリソースセンター）を用いた。ＳＴ２細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で１日間培養し、３００,０００個／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに播種した。上記二本鎖ＲＮＡを含有する混和した溶液を１ウェルあたり最終濃度２０ｎＭとなるように添加した。４時間後に培養液を脂肪細胞分化誘導培地として調製した１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２５μＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍｌインスリン、及び１μＭ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。脂肪細胞分化誘導培地に交換した日を０日目とした。
【００８９】
１．２ 脂肪細胞への分化誘導及び遺伝子発現量の測定
脂肪細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で２日間培養した後、０．１％トリプシン溶液を用いてＳＴ２細胞を回収し、ｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写酵素により１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定は、逆転写産物をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い行った。プライマーの配列は、（ＧＡＰＤＨ−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ-３'）〔配列番号１〕、（ＧＡＰＤＨ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ-３'）〔配列番号２〕、（Ｉｄ１−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧ-３'）〔配列番号３〕、（Ｉｄ１−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧ-３'）〔配列番号４〕、（Ｉｄ２−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴ-３'）〔配列番号５〕、（Ｉｄ２−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＣ-３'）〔配列番号６〕、（Ｉｄ３−ｆｏｒｗａｒｄ：５'-ＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣ-３'）〔配列番号７〕、（Ｉｄ３−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＴＣ-３'）〔配列番号８〕、（Ｉｄ４−ｆｏｒｗａｒｄ１：５'-ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ-３'）〔配列番号９〕、（Ｉｄ４−ｆｏｒｗａｒｄ２：５'-ＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣ-３'）〔配列番号１０〕、（Ｉｄ４−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＣＣＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＡ-３'）〔配列番号１１〕であった。
１．３ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄによる脂肪染色方法
脂肪細胞の分化誘導を確認するために、上記と同様に、脂肪細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で４日間培養したＳＴ２細胞をＮｉｌｅ Ｒｅｄを用いて細胞内に蓄積した脂肪を染色した。
まず、４日間培養したＳＴ２細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ホルマリンを含有するリン酸緩衝液で固定し、１時間室温に放置した。Ｎｉｌｅ Ｒｅｄをアセトンに溶解し、最終的に１ｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで調製したものを固定したＳＴ２細胞に加えて、室温で１０分間培養した。その後、蛍光顕微鏡により蛍光強度脂肪蓄積の増減を確認する共に、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄの発光量を、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８５ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５３５ｎｍ）。
【００９０】
＜実験２：骨芽細胞分化誘導＞
２．１ ｓｉＲＮＡの調製及び細胞への添加
実施例１の１．１と同様の方法によりｓｉＲＮＡの調製を行った。さらに、脂肪細胞分化誘導と同様に、細胞株としてＳＴ２を用いた。ＳＴ２細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。上記二本鎖ＲＮＡを含有する混和した溶液を２０ｎＭとなるようにＳＴ２細胞の培養液に直接加えた。４時間後に培養液を骨芽細胞分化誘導培地として調製した１０％ＦＢＳ、および１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。骨芽細胞分化誘導培地に交換した日を０日目とした。
２．２ 骨芽細胞への分化誘導及び遺伝子発現量の測定
骨芽細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で１日間培養した後、０．１％トリプシン溶液を用いてＳＴ２細胞を回収し、上記と同様にｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後２本鎖ｃＤＮＡを得て遺伝子発現量の測定を行った。遺伝子発現量の測定は、１．１と同様に、逆転写産物をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い行った。
２．３ アルカリフォスファターゼ染色法
骨芽細胞の分化誘導を確認するために、上記と同様に、骨芽細胞分化誘導培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で６日間培養したＳＴ２細胞をアルカリフォスファターゼ染色法により分析した。
ＳＴ２細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ホルマリン溶液を細胞に加えて室温で２０分間放置し、アセトンとエタノールを等量含んだ溶液で１分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。ＳＴ２細胞を固定した。
次いで、アルカリフォスファターゼ染色溶液として、１ｍｇのＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス ミズリー州）を５０μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬、日本）に溶解し、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させて、さらに、６ｍｇのＦａｓｔ ｂｌｕｅ ＢＢ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス ミズリー州）を加えて、４５μｍのフィルターで濾過したものを、固定したＳＴ２細胞に加えて、３７℃で２０分間培養した。
【実施例】
【００９１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００９２】
＜実施例１：骨粗鬆症の予測分析方法＞
１．１：測定工程
１．１．１：骨髄内細胞中の間葉系幹細胞の抽出
全身麻酔下の骨粗鬆症に罹患していない健常者１０人及び被験試料の提供者１０人から骨髄穿刺により骨髄細胞浮遊液１０ｍｌを採取した。採取した骨髄細胞浮遊液１０ｍｌからキット名：例 ＣＤ１０５マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク株式会社）を用いて添付のプロトコールに従い間葉系幹細胞を抽出し細胞数１００,０００個／ｍｌになるように希釈した。
１．１．２：Ｉｄ４ｍＲＮＡの抽出と発現量の測定
上記希釈細胞液からｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇをテンプレートとして、プライマーとスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州 カールズバッド）を用いて、Ｉｄ４ｃＤＮＡを合成した。プライマーの配列は（Ｉｄ４−ｆｏｒｗａｒｄ１：５'-ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ-３'）〔配列番号９〕、（Ｉｄ４−ｒｅｖｅｒｓｅ：５'-ＣＣＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＡ-３'）〔配列番号１１〕であった。
次いで、Ｉｄ４ｃＤＮＡ（ｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇ相当量）をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い遺伝子発現量を測定した。
【００９３】
２．１：判断工程
測定された健常者１０人の発現量の値の平均値を発現量（Ａ）として、これをコントロールとし、被験試料の提供者１０人の値を発現量（Ｂ）として、これらの値をコンピューターに入力し、自動的に（Ｂ／Ａ）×１００（％）の値を算出した。上記提供者１０人のうち５人について、算出した値が７０％以下であったため、骨粗鬆症を発症する可能性が高いと判断した。
＜実施例２：骨粗鬆症の治療剤＞
２．１：Ｉｄ４遺伝子を含む骨粗鬆症の治療剤の調製
実施例１と同様にしてＩｄ４ｃＤＮＡを調製した。次いで、キット名：アデノウィルスＣｒｅ−ｌｏｘＰキット（タカラバイオメディカル社製）を用いて、Ｉｄ４ｃＤＮＡをアデノウィルスベクターに挿入して組換えアデノウィルスベクターを作製した。得られた組換えアデノウィルスベクター１０μｇを緩衝液１００μｌに希釈して骨粗鬆症の治療剤とした。
２．２：Ｉｄ４を含む骨粗鬆症の治療剤の調製
上記４．１と同様にしてＩｄ４ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡ１μｇと発現ベクター（ベクター名：ｐＣＭＶベクター）１μｇを制限酵素：ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２本鎖ｃＤＮＡを発現ベクターに連結することによりＩｄ４遺伝子発現ベクターを完成させた。次いで、緩衝液に希釈した該発現ベクター（濃度：１００ｎｇ/μｌ）を動物細胞（細胞名：ＣＨＯ−Ｋ１）へリポフェクション法により導入し、培養液ＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で２日間培養した後、カラムクロマトグラフィーにより培養液中に産生分泌されたＩｄ４タンパクの抽出・精製を行った。得られたＩｄ４タンパクを緩衝液１００μｌに希釈して骨粗鬆症の治療剤とした。
【００９４】
２．３：薬理試験
上記骨粗鬆症の治療剤を老人性骨粗鬆症のマウス１０匹に投与し、骨髄中の脂肪蓄積及び骨量の変化を大腿骨の骨密度および尿中Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ-テロペプチド濃度を測定することにより調べた。これらの結果から、本発明の治療剤が骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症モデルマウスに効果的な治療効果を示すことが判明した。
【００９５】
＜実施例３：骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法＞
３．１：測定工程
３．１．１：Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の調製
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞株ＳＴ２を作成し、この細胞を培養増殖させることにより、本実施例に用いた。細胞株ＳＴ２は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２日間培養した。培養した細胞を遠心分離（１,０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、２５℃）にて回収して、培養液に希釈して２４ウェルプレートに 細胞数３００,０００個／ｍｌになるように播種した。２４ウェルプレート中で培養後１日目に被験化合物を１μＭになるように添加し、同時に被験化合物を添加しない細胞（コントロール）を同条件で用意し、共に２日間培養した。２日間経過した後、個々のウェルの細胞を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに回収して、ｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写酵素により１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した後、得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定は、逆転写産物をテンプレートとしてＭｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）とＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて添付のプロトコールに従い行った。
【００９６】
３．２：選択工程
測定された被験化合物の非存在下でのＩｄ４遺伝子の発現量をＸ、被験化合物の存在下でのＩｄ４遺伝子の発現量Ｙについてコンピューターに入力し、自動的にＹ／Ｘの計算値を算出して、１．３以上の値の化合物について骨粗鬆症の治療剤の候補物質として選択した。
【００９７】
以上の結果から、本発明において、Ｉｄ４遺伝子が間葉系幹細胞からの脂肪細胞への分化と骨芽細胞への分化の両者に関与する遺伝子であるという新たな知見に基づいて、Ｉｄ４遺伝子の発現量をマーカーとして、骨粗鬆症を早期に予測分析できる方法を確認した。また、Ｉｄ４遺伝子及びＩｄ４遺伝子がコードするタンパク質のいずれかを有効成分とする骨粗鬆症の治療剤が、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症に特有の症状、即ち、骨髄中に脂肪細胞を蓄積すると同時に骨芽細胞が減少して骨が脆弱化する症状を治療又は予防する優れた治療効果を有することが示された。
さらに、本発明の骨粗鬆症の治療剤のＩｄ４遺伝子の発現量を用いたスクリーニング方法では、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療剤を候補物質としてスクリーニングできることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の骨粗鬆症の予測分析方法は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を発症する可能性を早期に予測するために好適に利用できる。さらに、骨粗鬆症の治療剤は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療又は予防に、好適に利用可能である。さらに本発明の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法は、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症を治療及び予防させる候補物質のスクリーニングに好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）健常者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量Ａと、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量Ｂとをそれぞれ測定する測定工程と、
（ｂ）該発現量Ａと、該発現量Ｂに基づき、（Ｂ／Ａ）×１００（％）の計算値が７０（％）以下である場合に、前記被験試料の提供者が骨粗鬆症になる可能性が高いと判断する判断工程と、
を含むことを特徴とする、骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項２】
骨髄内細胞が間葉系幹細胞である、請求項１に記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項３】
骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、請求項１から２いずれかに記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項４】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項１から３のいずれかに記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項５】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項１から４のいずれかに記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項６】
Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする、骨粗鬆症の治療剤。
【請求項７】
骨髄内に直接投与される、請求項６に記載の骨粗鬆症の治療剤。
【請求項８】
骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、請求項６から７のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤。
【請求項９】
（ａ）Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量Ｘと、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量Ｙと、を測定する測定工程と
（ｂ）該発現量Ｘと、該発現量Ｙに基づき、Ｙ／Ｘの計算値が１．３以上である被験化合物を、骨粗鬆症の治療剤として選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする、骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の培養が液体培養で行われる、請求項９に記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞が動物細胞由来である、請求項９から１０のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、請求項９から１１のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項９から１２のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項９から１３のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
（ａ）健常者の骨髄内細胞におけるＩｄ４遺伝子の発現量Ａと、被験試料である骨髄内細胞のＩｄ４遺伝子の発現量Ｂとをそれぞれ測定する測定工程と、
（ｂ）該発現量Ａと、該発現量Ｂに基づき、（Ｂ／Ａ）×１００（％）の計算値が７０（％）以下である場合に、前記被験試料の提供者が骨粗鬆症になる可能性が高いと判断する判断工程と、
を含むことを特徴とする、骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項２】
骨髄内細胞が間葉系幹細胞である、請求項１に記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項３】
骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、請求項１から２いずれかに記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項４】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項１から３のいずれかに記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項５】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項１から４のいずれかに記載の骨粗鬆症の予測分析方法。
【請求項６】
Ｉｄ４遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする、骨粗鬆症の治療剤。
【請求項７】
骨髄内に直接投与される、請求項６に記載の骨粗鬆症の治療剤。
【請求項８】
骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、請求項６から７のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤。
【請求項９】
（ａ）Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の非存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４遺伝子の発現量Ｘと、Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞を被験化合物の存在下で培養した場合の該細胞中のＩｄ４の発現量Ｙと、を測定する測定工程と
（ｂ）該発現量Ｘと、該発現量Ｙに基づき、Ｙ／Ｘの計算値が１．３以上である被験化合物を、骨粗鬆症の治療剤として選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする、骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞の培養が液体培養で行われる、請求項９に記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
Ｉｄ４遺伝子を強制発現させた細胞が動物細胞由来である、請求項９から１０のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
骨粗鬆症が老人性骨粗鬆症である、請求項９から１１のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の転写産物であるＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項９から１２のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｉｄ４遺伝子の発現量の測定が、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびドットブロットの少なくともいずれかにより定量することにより行われる、請求項９から１３のいずれかに記載の骨粗鬆症の治療剤のスクリーニング方法。
【公開番号】特開２００８−１８７８９９（Ｐ２００８−１８７８９９Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２３５９（Ｐ２００７−２２３５９）
【出願日】平成１９年１月３１日（２００７．１．３１）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月３１日（２００７．１．３１）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【Ｆターム（参考）】
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