高分子由来の微粒子を含有する組成物の方法および使用
【課題】研究、診断および治療分野で使用できる高分子微粒子の作成法の提供
【解決手段】水性の高分子溶液を脱水し、そして脱水した高分子を水相中で、または加
熱しながら架橋剤で架橋結合して形成する高分子微粒子の作成方法。ここで、脱水剤がポ
リビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールのポリマー混合物であり、架橋剤がグ
ルタルアルデヒドであり、そして高分子がタンパク質、最も好ましくは免疫グロブリンで
あるものが好ましい。
【解決手段】水性の高分子溶液を脱水し、そして脱水した高分子を水相中で、または加
熱しながら架橋剤で架橋結合して形成する高分子微粒子の作成方法。ここで、脱水剤がポ
リビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールのポリマー混合物であり、架橋剤がグ
ルタルアルデヒドであり、そして高分子がタンパク質、最も好ましくは免疫グロブリンで
あるものが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学分野に関し、より詳細には診断、治療および研究のために使用する微粒
子の作成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において集合的に「微粒子」と呼ぶ微粒子、微小球およびマイクロカプセルは
１ミリメートルよりも小さい、より好ましくは１００ミクロンよりも小さい直径を持つ固
体粒子であり、合成ポリマー、タンパク質および多糖をはじめとする様々な物質で形成す
ることができる。微粒子は多くの様々な応用、主に分離、診断およびドラッグデリバリー
に使用されて来た。
【０００３】
分離技術において使用される微粒子の最も良く知られている例は、ポリアクリルアミド
、ハイドロキシアパタイドまたはアガロースのような合成またはタンパク質起源の合成さ
れたポリマーから形成されたものであり、その微粒子は分子量および／またはイオン電荷
に基づき、または微粒子に化学的に結合した分子との相互作用に基づいてタンパク質など
の分子を分離するために使用されている。
【０００４】
診断分野では微粒子は、酵素、酵素に対する基質または標識抗体の固定に役立つような
微粒子の状態で使用されることが最も多く、そしてこれは次に検出されるべき分子と直接
的または間接的に相互作用する。
【０００５】
制御されたドラッグデリバリー分野では、引き続き放出されるように、微粒子は微粒子
中にカプセル化される分子と混合状態にある。これらの微粒子を合成ポリマー、天然ポリ
マー、タンパク質および多糖から作成するための多くの様々な技術（相分離法、溶媒蒸発
法、乳化法および噴霧乾燥法を含む）が日常的に使用されている。
【０００６】
微粒子は例えば硫酸アンモニウムでの沈殿のような一定の沈殿法で分離技術の副産物と
しても作成できる。しかしこれらの場合、沈殿物は遠心および／または濾過により回収さ
れ、そして圧し縮められ、次いで沈殿剤（塩）を塩で沈殿した分子から分離するために溶
媒に再溶解される。したがって、微粒子は不安定であり、かつ中間生成物として機能する
だけで、それ自体が最終生成物ではない。
【０００７】
球状ビーズまたは粒子は長い間、生化学者に道具として市販されてきた。例えばしばし
ば抗体をビーズに結合させ、特定のリガンドに特異的な比較的大きな粒子が作成されてい
る。大きな抗体−被覆粒子は、細胞活性化のためにレセプターを細胞表面上に架橋結合す
るために日常的に使用され、そして免疫親和性精製法のために固体相に固定されるか、あ
るいは遠位部位に長時間にわたってゆっくり放出される治療薬を送達するために、所望部
位に薬剤を標的とするための粒子に結合した組織または腫瘍−特異的抗体が使用されてい
る。
【０００８】
抗体を固体相マトリックスに共有結合するための最も普通の方法は、ビーズを化学結合
剤で活性化し、次に抗体を活性化ビーズに結合させることにある。タンパク質分子よりも
合成ポリマービーズを使用するほうが、タンパク質が耐え得るよりも多くのより苛酷な活
性化条件を使用することができる。これは比較的安価で、かつ広範な変性条件に対して安
定な結合を生じることが多い。あらゆる多種多様な構成物およびサイズの数多くの活性化
ビーズが市販されている。ポリアクリルアミド、ポリアクリル性、ポリスチレンおよびラ
テックスのような合成ポリマーから形成されたビーズは、カリフォルニア州、リッチモン
ドのバイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および
スウェーデン、ストックホルムのＬＫＢプロダクター（ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）の
ような数多くの会社から市販されている。天然高分子および粒子から形成されたアガロー
ス、架橋アガロース、グロブリン、デオキシリボ核酸およびリポソームのようなものは、
カリフォルニア州、リッチモンドのバイオラッドラボラトリーズ、ニューヨーク州、ピス
カタウェイのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＩＢＦ（仏国）から市販されて
いる。ポリアクリルアミドおよびアガロースのコポリマーから形成されたビーズはＩＢＦ
およびファルマシアのような会社から購入できる。磁気ビーズはニューヨーク州、グレイ
トネックのダイナル社（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．）から入手できる。
【０００９】
広範な材料および応用は、新規微粒子の作成法および使用法の開発について絶え間のな
い必要性が存在することを示しており、特にただ１つの応用というよりは分離、診断およ
びドラッグデリバリー分野での使用に適することができる微粒子の作成法および使用法の
開発が望まれている。
【発明の開示】
【００１０】
したがって本発明の目的は安定な微粒子、および比較的簡単で、迅速かつ安価な微粒子
の作成法を提供することである。
【００１１】
さらに本発明の目的は標的分子に高い親和性および特異性を持つ微粒子を提供すること
である。
【００１２】
さらに本発明の目的はインビボに投与したとき吸収されない微粒子を提供することであ
る。
【００１３】
さらに本発明の目的は分離技術、特にアフィニティクロマトグラフィーに使用する微粒
子を提供することである。
【００１４】
さらに本発明の目的は、標的−特異的ドラッグデリバリーおよび組織病理学的あるいは
インビボにおける組織または腫瘍の画像化のようなは医薬および診断に応用するために使
用する微粒子を提供することである。
【００１５】
微粒子、その作成法および使用法は、タンパク質、炭水化物、多糖、核酸、ウイスル、
ウイスル粒子、有機または無機合成医薬化合物、あるいはそれらのいずれかの混合物のよ
うな高分子を「脱水」し、そして高分子微粒子を加熱状態でインキューベーションするか
、または液相で高分子を「架橋することにより形成する」方法に基づいて提供される。高
分子は、効果的に全部脱水するが液相中に溶解または懸濁されたとき、高分子の「ポケッ
ト」を形成する試薬を使用して脱水され、それは例えばアンモニアまたはナトリウム塩、
有機溶媒、高濃度の直鎖または分枝ポリマー、亜鉛のような二価イオンまたはカオトロピ
ック試薬のような試薬と共に脱水することによる。高分子は薬剤、生物学的に活性な分子
、キャリアー分子、親和性分子またはその混合物から成ることができる。微粒子は予め定
めた時間の長さ、室温よりも高い温度で脱水した高分子をインキューベーションすること
により形成される。あるいはグルタルアルデヒドまたは他のアミン類、多価イオンのよう
な薬剤、ならびに架橋される高分子の反応性基に特異的な「親和性」を持つ多官能性分子
を使用して、様々な温度で高分子を架橋させて微粒子を形成する。
【００１６】
微粒子を次に、もしあるならば脱水剤および過剰な架橋剤から濾過または遠心のような
分離法で分離する。その後、微粒子が標的分子と反応したときにいずれかの非−特異的結
合を効果的に減少するために、次に架橋剤のすべての未反応部位に結合するクエンチング
試薬で微粒子を洗浄することができる。これらの微粒子は広範な分離、診断、治療および
研究目的に使用できる。本発明によれは、特定の態様の発明として、以下のものが提供さ
れる。
【００１７】
１．ａ）高分子を、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属もしくは
アンモニウムもしくはマグネシウムのハロゲン塩、グリシン、水溶性有機溶媒、水溶性直
鎖または分枝ポリマー、二価のイオン、ポリアニオン、カオトロピック剤およびそれらの
混合物からなる群から選択される脱水剤と微粒子が形成するに十分な時間インキューベー
ションする工程、および
ｂ）インキューベーション混合物から微粒子を分離する工程、を含んで成り、かつ、高分
子が、脱水剤とインキューベーションされる間またはインキューベーションの前後に架橋
剤により架橋される、ことを特徴とする微粒子の作成方法。
【００１８】
２．ａ）高分子を、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属もしくは
アンモニウムもしくはマグネシウムのハロゲン塩、グリシン、水溶性有機溶媒、水溶性直
鎖または分枝ポリマー、二価のイオン、ポリアニオン、カオトロピック剤およびそれらの
混合物からなる群から選択される脱水剤と微粒子が形成するのに十分な時間インキューベ
ーションし、そして
ｂ）インキューベーション混合物から微粒子を分離し、ここで、高分子が、脱水剤とイン
キューベーションされる間またはインキューベーションの前後に架橋剤により架橋される
工程、
ｃ）微粒子を、標的分子を含有する複合混合物と該微粒子が該標的分子に結合するのに十
分な時間混合する工程であって、ここで、微粒子は標的分子に親和性を有するものである
、工程、および
ｄ）結合した標的分子を複合混合物から分離する工程、
を含むことを特徴とする標的分子を含有する複合混合物から標的分子の単離方法。
【００１９】
３．ａ）微粒子と試料を組み合わせる工程であって、ここで、微粒子が、硫酸塩、亜硫
酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属もしくはアンモニウムもしくはマグネシウム
のハロゲン化物塩、グリシン、水溶性有機溶媒、水溶性直鎖または分枝ポリマー、二価の
イオン、ポリアニオン、カオトロピック剤およびそれらの混合物からなる群から選択され
る脱水剤と、高分子を微粒子が形成するのに十分な時間インキューベーションすることに
より調製され、かつ、高分子が脱水剤とインキューベーションされる間またはインキュー
ベーションの前後に架橋剤により架橋されており、かつ、高分子が標的生体分子に特異的
な親和性分子を含んでなり、そして検出可能な造影剤で標識されているものである、工程
、および
ｂ）検出可能な造影剤を検出する工程、
を含むことを特徴とする試料中の標的分子の検出方法。
【００２０】
以下に記載する特定例では、微粒子は（１）後にグルタルアルデヒドにより架橋される
ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールを含む高濃度直鎖ポリマー混合物で
脱水された抗体のようなタンパク質、（２）ポリビニルピロリドンおよびポリエチレング
リコールを含む高濃度直鎖ポリマー混合物で脱水され、そしてポリアミノ酸のような多価
イオンまたは二価カチオンで架橋された生物学的に活性な分子と混合したアルギン酸塩の
ような多糖、（３）アンモニアまたは硫酸ナトリウムを用いてタンパク質混合物を脱水し
た後、グルタルアルデヒドで架橋される、医薬化合物のためのキャリアーであるアルブミ
ンのようなタンパク質、（４）ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールの混
合物で脱水した後、グルタルアルデヒドで架橋したインスリンのようなペプチドホルモン
、（５）ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールを含む直鎖ポリマー混合物
で脱水し、そして加熱下でインキューベーションしたアルブミンのようなタンパク質、で
形成される。
［発明を実施するため具体的な態様］
微粒子、調製法およびキットを診断、治療および研究使用のために提供する。微粒子は
大きな表面積を有する架橋結合された高分子構造物である。微粒子を形成する高分子には
限定するわけではないが、タンパク質、炭水化物、多糖、核酸、ウイルス、ウイルス粒子
、有機または無機合成医薬化合物またはそれらの混合物であり、これらを脱水条件下の液
相中で架橋結合することができる。
＜ポリマー性微粒子の形成＞
微粒子は粒子が形成するために十分量の架橋剤または加熱時間で、高分子を脱水剤が存
在する溶液中で、あるいは液相中でインキューベーションすることにより形成される。高
分子を始めに水性溶媒中に溶解し、次に高分子溶液を脱水剤に加えるか、あるいは脱水剤
を高分子溶液に加えるかのいずれか、好ましくは後者である。微粒子を形成するために、
脱水された高分子溶液を次に好ましくは予め定めた時間の長さで加熱する。あるいは微粒
子を形成するために、架橋剤を脱水高分子溶液に室温の前後または室温のような様々な温
度で加える。生成した微粒子を、次にインキューベーション混合物中に存在する未反応成
分から当該技術分野で周知な物理的分離法により分離する。
＜高分子＞
微粒子を形成する高分子は液相で架橋することができる任意の分子である。最も好まし
くは、高分子はタンパク質、炭水化物、多糖、核酸、ウイルス、ウイルス粒子またはそれ
らの混合物である。高分子は架橋することができる天然または合成の医薬化合物でもよい
。当業者は架橋することができない化合物は、本明細書にて提供される方法により続いて
架橋されるキャリアー分子中に化合物を取り込んだ微粒子を形成することができることを
理解するだろう。さらに当業者は高分子も、例えばペプチド、二本鎖の核酸分子の一本鎖
区分またはウイルス粒子のようなリガンドと結合または相互作用するのに必要な活性を有
する分子の一部であることができると理解するだろう。また当業者は、「高分子」という
用語は複数の高分子を含み、そして例えば医薬化合物と、医薬化合物を治療が必要な組織
、器官または腫瘍へ標的化するための親和性分子との組み合わせなどのような各種高分子
の組み合わせ物を含むことも理解するだろう。
【００２１】
さらに当業者は、親和性分子はレセプター−リガンド相互作用のレセプター部分または
リガンド部分のいずれかであることができると理解するだろう。他の生体分子と反応する
リガンドの例には、抗原として作用し、動物に投与された時に免疫応答を引き起こし、そ
して抗体の生産を引き起こすウイルス、細菌、多糖またはトキシンが挙げられる。
【００２２】
インキューベーション混合物中の高分子の濃度は、インキューベーション条件に応じて
、好ましくは０．１から１００ｍｇ／ｍＬの間である。
＜標識化高分子＞
高分子を検出しうるラベルで標識することができる。タンパク質および核酸分子を標識
する様々な種類の標識またはラベルおよび方法が当該技術分野で周知である。当業者は、
例えば金属のような磁気性物質または磁気粒子はラベルという用語の定義内に含まれると
理解するだろう。例えば高分子を金属のような金属性物質で標識して、微粒子を磁気性デ
バイスにより溶液中の他の物質から分離できるようにすることができる。
【００２３】
他の具体的なラベルまたはレポーター群を以下に説明する。
【００２４】
例えば、限定するわけではないがラベルは、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ
または１３１Ｉのような放射性標識であることができる。３２Ｐ標識は連結試薬でタンパ
ク質に結合、あるいはニックトランスレーション、末端−標識化または標識ヌクレオチド
の取り込みにより核酸分子の配列中に取り込むことができる。例えば３Ｈ、１４Ｃ、また
は３５Ｓ標識を標識された前駆体の取り込み、または化学修飾により核酸配列中に取り込
むことができ、一方１２５Ｉまたは１３１Ｉラベルは一般的に化学修飾により核酸配列中
に取り込むことができる。ラベルの検出はシンチレーションカウンティング、ガンマ線ス
ペクトロメトリーまたはオートラジオグラフィーのような方法により行われ得る。
【００２５】
ラベルはマスまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）標識、例えば１３Ｃ、１５Ｎまたは１９Ｏの
ようなものであってもよい。そのようなラベルの検出はマススペクトロメトリーまたはＮ
ＭＲにより行われ得る。
【００２６】
色素、化学発光剤および蛍光源も高分子を標識するために使用できる。核酸を標識する
のに有用な色素の例はエチジウムブロミド、アクチジン、プロピジウムおよび他のインタ
ーカレーション剤、ならびに４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰ
Ｉ）（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）、または他の適当な核酸染色剤である
。蛍光源の例には、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシア
ニン、フィコシアニン、ローダミン、テキサス レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）または他
の適当な蛍光源が挙げられる。蛍光源は一般的に化学修飾により結合される。色素ラベル
は分光光度計により検出でき、そして蛍光源は蛍光検出機により検出できる。
【００２７】
また、高分子は提供する酵素に対する色原体（酵素基質）、酵素またはアフィニティー
標識、あるいは酵素で標識することもできる。例えば高分子をビオチニル化して、酵素ま
たは蛍光源のようなラベルにカップルしていてもよいビオチン−アビジン反応に使用する
ことができる。高分子はペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または基質が添加
された時に発色反応または蛍光反応を与える他の酵素で標識することができる。
【００２８】
例えば、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（Ｌｕｍｉｎｏｌ
：商標として知られている）（シグマ化学者、セントルイス、モンタナ州）のような添加
剤、およびｐ−ヒドロキシビフェニル（ｐ−フェニルフェノールとして知られている）（
シグマ化学者、セントルイス、モンタナ州）のような速度エンハンサーを、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼのような酵素を発光反応を介して増幅するために使用でき、ならびに酵素
基質の発光性または蛍光性ジオキセタン誘導体も使用できる。
【００２９】
検出しうるラベルを提供するために、核酸分子の制限酵素部位のような酵素の認識部位
も高分子中に取り込むこともできる。ラベルは任意の修飾塩基、アミノ酸または任意のラ
ベルを含む前駆体を取り込むことによっても作成でき、修飾塩基または化学基を含有する
アミノ酸の取り込みは特異的抗体により、または免疫蛍光または免疫−酵素反応を含む様
々な手段による任意の結合抗体複合体を検出することにより認識できる。そのようなラベ
ルは抗体−結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用することにより、または分光光度計で
色の変化を検出することにより検出できる。
＜脱水剤＞
脱水剤は水を高分子から高イオン性媒質に拡散させることができる化合物または化合
物の混合物である。適当な脱水剤には、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、ある
いはアルカリ金属、アンモニウムまたはマグネシウムのハロゲン塩のような天然の塩；グ
リシン；エタノールのような水溶性有機溶媒；高分子量の水溶性非イオン性直鎖または分
枝ポリマー；亜鉛のような金属イオン；乳酸２−エトキシ−６，９−ジアミノ−アクリジ
ンのような有機カチオン；小さいアニオン；ならびにポリリン酸およびポリアクリル酸の
ようなポリアニオンがある。
【００３０】
好ましくは、脱水剤はポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールのような２
種以上の溶解性の直鎖ポリマー混合物である。そのようなポリマー混合物は、Ｊａｍｅｓ
Ｅ．Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏにより１９９２年１月７日に出願された同時係属中の出願で
ある米国特許出願第０７／８１７，６１０号明細書およびＪａｍｅｓ Ｅ．Ｗｏｉｓｚｗ
ｉｌｌｏにより１９９３年１月７日に出願された国際特許出願第ＵＳ９３−０００７３号
明細書に示された方法により調製することができ、これらは引用により本明細書に編入さ
れる。当業者は他の可溶性の直鎖ポリマー、例えばデキストラン、ノニルフェノール−エ
トキシレート、ポリビニルアルコールおよびそれらの混合物をポリビニルピドリドン（Ｐ
ＶＰ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に加えて、あるいはＰＶＰまたはＰＥＧ
の代わりに使用できるものと理解するであろう。
【００３１】
ＰＶＰは非−イオン性の親水性ポリマーであり、分子量範囲がおよそ１０，０００から
７００，０００の範囲であり、そして化学式（Ｃ６Ｈ９ＮＯ）ｎを有する。ＰＶＰはまた
ポリ［１−（２−オキソ−ピロリジニル）エチレン］、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ（商標）、Ｐｏ
ｌｙｖｉｄｏｎｅ（商標）、ＲＰ １４３（商標）、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（商標）、Ｐｅｒ
ｅｇａｌ ＳＴ（商標）、Ｐｅｒｉｓｔｏｎ（商標）、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（商標）、Ｐｌ
ａｓｍｏｓａｎ（商標）、Ｐｒｏｔａｇｅｎｔ（商標）、ＳｕｂｔｏｓａｎおよびＶｉｎ
ｉｓｉｌ（商標）としても知られている。ＰＶＰは無毒性で、高度に吸湿性であり、そし
て容易に水または有機溶媒に溶解する。
【００３２】
ＰＥＧはポリ（オキシエチレン）グリコールとしても知られており、エチレンオキシド
と水との縮合ポリマーであり、化学式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨを有する。
【００３３】
デキストランはシュクロース基質上で生育する細菌により生産される多糖に適用する用
語である。ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびラクトバクテリア デキストラニカム（Ｌａｃｔｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）のような細菌により生産される天然のデキストランは
通常、高い分子量を有する。
【００３４】
ノニルフェノール−エトキシレート（ＮＰＥ）は、しばしば界面活性剤として使用され
る長鎖化合物の種類である。これらは通常、必要な所望の溶解度に適合するように誘導さ
れる。
【００３５】
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）はポリビニル酢酸から、アセチル基をヒドロキシル基
に換えることにより調製され、式（ＣＨ２ＣＨＯＨ）ｎを有するポリマーである。ほとん
どのポリビニルアルコールが水溶性である。
【００３６】
ＰＥＧ、デキストラン、ＰＶＡおよびＰＶＰはシグマ化学社（セントルイス、モンタナ
州）等の化学会社から市販されている。ＮＰＥにはカスタム合成が必要であり、特定の化
学製造元に注文できる。
【００３７】
最も好ましいのは、脱水剤が分子量１０，０００から３６０，０００の間のＰＶＰの水
溶液を含むポリマー混合物であり、最も好ましいのは４０，０００、および２００から３
５，０００の分子量を持つＰＥＧである。４０，０００の分子量を持つＰＶＰおよび３５
００の分子量を持つＰＥＧが好ましい。あるいは均一サイズの微粒子を得るためには３６
０，０００の分子量を持つＰＶＰが好ましい。好ましくはＰＶＰを酢酸緩衝液に溶解し、
そしてＰＥＧをＰＶＰ水溶液に加える。各々のポリマー濃度は各ポリマーの分子量に応じ
て、好ましくは１から４０ｇ／１００ｍｌの間である。最も好ましくは各ポリマー濃度は
２４ｇ／１００ｍｌ、すなわち２４％である。一般的に等濃度のＰＶＰおよびＰＥＧが、
ポリマー性微粒子の形成に最適なポリマーマトリックスを提供する。高分子に添加するポ
リマーの容量は、高分子のサイズおよび量に依存する。好ましくは３容量のポリマー混合
物が１容量の高分子を含む溶液に加えられる。
＜加熱を利用するインキューベーション条件＞
微粒子は高分子および脱水剤混合物を室温よりも高い温度で予め定めた時間インキュー
ベーションすることにより形成される。好ましくは混合物を水浴中で３７℃以上で、かつ
８０℃以下の温度で約５分から２時間インキューベーションする。最も好ましくは混合物
を５０℃から７０℃の温度で１５−３０分間インキューベーションする。
【００３８】
微粒子のサイズはインキューベーション条件を調整することにより制御できる。例えば
、インキューベーション温度を室温から所望温度に次第に高くするか、または一定増分ず
つ高くするか、あるいは全体のインキューベーション時間を長くすることができる。さら
に、微粒子の凝集の量は脱水剤の濃度、容量または組成を変化させることにより制御でき
る。
＜架橋剤＞
また、微粒子は脱水した高分子を架橋結合させるために架橋剤を加えて形成される。架
橋剤は高分子を物理的に連結するニ官能性または多官能性化学試薬であり、そして場合に
よっては脱水剤を連結することもある。適当な架橋剤の例には、ジアルデヒドまたはアミ
ン類、多価イオンおよび架橋される高分子上の特定の反応性基に「親和性」を有する多官
能性分子のような他の試薬がある。
【００３９】
好適な態様では、架橋剤は共有的に高分子を安定な三−次元構造に連結する。最も好ま
しくは架橋剤はグルタルアルデヒド；ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェ
ニルスルフォン；ヘキサメチレンジイソシアネート；ｎ，ｎ’−（１，３−フェニレン）
−ビス−マレイミド；ｎ，ｎ’−エチレン−ビス−ヨードアセトアミド；３，６−ビス−
（メクリメチル）−ジオキサン；ビス−ジアゾベンジジン；ウッドワードのＫ；ビス−オ
キシラン；ジメチルアジピミデート；ジメチルスベリミデート；ジエチルマロニミデート
；フェノール−２，４−ジスルホニル−クロリド；ジビニルスルフォン；およびカルボジ
イミドのような二官能性試薬である。
【００４０】
最も好ましくは、架橋剤は第一アミンとシッフ塩基を形成するグルタルアルデヒドのよ
うなジアルデヒドであり、緩和な条件下でこれは水素化ホウ素で還元した時、安定な二級
アミンを与える。
【００４１】
別の種類の架橋剤は緩和な条件下でスルフヒドリル基に特異的なＮ−置換マレイミドで
ある。数種のＮ−アリルおよびＮ−アルキル−ビス−マレイミドが市販されており、それ
にはアゾフェニルジマレイミドも含まれる。これらは水に不溶性であり、一般的に固体で
化学量論的量をｐＨが７−８の反応物水溶液に加える。
【００４２】
二官能性ハロゲン化アルキルは主にチオール、イミダゾールおよびアミノ基と反応する
。中性からわずかにアルカリ性のｐＨで、スルフヒドリル基との反応は優先するが、より
高ｐＨ値ではアミノ基との反応が優先する。他の化合物には１，５−ジフルオロ−２，４
−ジニトロベンゼンのようなハロゲン化アリール（アリールハロゲン化物）があり、これ
は水に不溶性であり、そしてアミノ基およびチロシンフェノール性基と優先的に反応する
が、スルフヒドリルおよびイミダゾール基とも反応するだろう。迅速な反応には比較的高
いｐＨ値が必要である。一般的に試薬は濃厚アセトン溶液として反応物の水溶液に加えら
れ、生成物が形成する。イソシアネートはアミンと反応して置換ウレアを形成し、アルコ
ールと反応してウレタンを形成し、そして水と反応してアミンおよび二酸化炭素を形成す
る。アルカリｐＨではアミンとの反応が好ましい。２，２−ジカルボキシ−４，４’−ア
ゾフェニルジイソシアネートは水溶性であり、形成する橋が亜ジチオン酸塩によるアゾ基
の還元により容易に開裂するので有利である。緩和な条件下で活性化されて反応できる二
官能性アシル化剤を提供する多くの脂肪族または芳香族ジカルボン酸またはジスルホン酸
のようなアシル化剤も使用できる。ジカルボン酸のニトロフェニルエステルおよび芳香族
−ビス−スルフォニルクロライドがその例である。 これらは水に不溶性であり、そして
素早く加水分解する。ビス−スルホニルクロライドはアミノ基と反応し、安定なスルホン
アミド結合を形成し、そしてこれは続いて氷酢酸中のＨＢｒで開裂することができる。水
溶性で、かつ緩和な条件下でアミノ基と高い特異性で反応する二官能性のイミドエステル
も使用できる。ジメチルスベリミデートは０．２Ｍ トリエタノールアミンＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ ８．５）中で、室温にて３時間使用できる。生成するアミドは酸加水分解に対し
て安定であるが、アンモニアにより開裂しうる。主にアミノ基と反応するが、高いｐＨで
は炭水化物、フェノールおよびアルコールと反応するビニルスルフォンも使用できる。
【００４３】
インキューベーション混合物中の架橋剤濃度は高分子のすべての活性基を結合するため
に十分でなくてはならない。架橋剤濃度とインキューベーション後に形成された微粒子の
数との間には直接的な関係がある。一般的にインキューベーション混合物中の架橋剤濃度
が増すほど形成される微粒子が増す。好ましくはインキューベーション混合物中の架橋剤
の濃度は、インキューベーション混合物１ミリリットル当り約５から２００マイクロリッ
トルの２５％グルタルアルデヒド溶液である。
＜架橋するためのインキューベーション条件＞
微粒子を形成するために、アンモニウムまたはナトリウム塩、有機溶媒、亜鉛のような
二価イオンまたはカオトロピック剤のようなポリマー溶液以外の脱水剤を使用するときは
、微粒子を形成するための正しい架橋剤の組み合わせを注意深く選択しなければならない
。なぜならば脱水剤と架橋剤との間に相互作用が起こることがあるからである。微粒子は
硫酸アンモニウム、グルタルアルデヒドおよびタンパク質を使用して形成されるが、反応
物濃度は直鎖ポリマーを使用して形成される微粒子に必要であるものとは異なる。
【００４４】
好ましくは脱水剤がポリマー溶液であり、ここで高分子、ポリマーおよび架橋剤混合物
はボルテックスなどで一緒に激しく混合され、高分子、ポリマーおよび架橋剤の間で十分
な相互反応がおこり、そしてインキューベーションされるが、一方室温（２０℃）または
室温未満の温度で十分な時間混合すると、最高の微粒子の形成が可能になる。あるいは微
粒子は架橋剤および加熱の組み合わせを使用して形成することができ、好ましくは３７℃
以上、かつ８０℃以下の温度でインキューベーションすることによる。
【００４５】
インキューベーション時間の長さはポリマーおよび親和性分子それぞれの濃度ならびに
インキューベーション温度に依存する。好ましくはポリマー混合物および高分子は３０分
から２４時間の間でインキューベーションされる。最も好ましくはポリマー混合物および
高分子は撹拌または揺することにより１２０分間、室温で混合され、次に混合せずに４℃
で一晩静置する。
【００４６】
インキューベーション混合物のｐＨは一般的に脱水剤のｐＨにより決められ、そして適
当量の酸性または塩基性緩衝液のいずれかを、脱水剤または高分子溶液のいずれかまたは
両方に、混合前に加えることにより調整できる。脱水剤が直鎖ポリマー溶液である場合、
インキューベーション工程の最後に形成される微粒子のサイズとインキューベーション混
合物のｐＨとの間には直接的な関係がある。より高いｐＨ（より塩基性）では、より大き
な微粒子が形成する。より低いｐＨでは形成される微粒子はより小さい。直鎖ポリマーイ
ンキューベーション混合物のｐＨは好ましくは約５から８の間である。
＜結合性部位のクエンチング＞
当業者は後の非特異的結合を減らすために、架橋剤の任意の未反応結合性部位をブロッ
クするために、インキューベーション後に生成した微粒子にクエンチング（停止）剤を加
えることができると考えるだろう。脱水剤がＰＶＰ／ＰＥＧのような直鎖ポリマー溶液で
ある場合には、適当なクエンチング剤はアミノ酸またはアルブミンのような化合物であり
、これらは相当数のアミノ基を含有する。好ましくはクエンチング剤はリシンまたはグリ
シンを含む溶液である。最も好ましくはクエンチング剤はアミノ酸グリシンであり、その
濃度は０．１から０．５Ｍの範囲である。
＜微粒子の精製＞
生成した微粒子をインキューベーション混合物中の未反応成分から、当該技術分野で周
知の通常の分離法により分離する。好ましくはインキューベーション混合物を微粒子が遠
心管の底に落ちるように遠心し、そして未反応成分は上清に残り、これを次にデカントす
る。あるいは生成した微粒子を含むインキューベーション混合物を、微粒子がフィルター
に残り、そして未反応成分がフィルターを通過するように濾過する。
【００４７】
さらに微粒子の精製は適当量の洗浄溶液で洗浄することにより行われる。好適な洗浄溶
液は緩衝液、最も好ましくはクエンチング剤を含むリン酸緩衝塩溶液である。洗浄は必要
に応じて繰り返すことができる。
【００４８】
当業者は脱水剤の中には高分子構造中に取り込まれ、そして実際に各微粒子の分子組成
の一要素となるものがあるものと理解するだろう。
＜微粒子の特性＞
前述の方法で生成した微粒子は、温度、ポリマーサイズおよび混合物、ならびにタンパ
ク質濃度に応じて１つ以上の活性部位が各微粒子の表面に存在する球状または非球状の形
状であることができる。長円形および顆粒状の微粒子は、球状の微粒子ビーズよりもより
大きな表面積を持つ粒子を作り、そして従来の球状ビーズで達成されるよりも微粒子あた
り、より多くの数の高分子の取り込みを可能にする。
【００４９】
さらにＰＶＰ／ＰＥＧの存在中でグルタルアルデヒドにより架橋結合した免疫グロブリ
ンのような高分子で形成された微粒子の例では、微粒子はアルカリおよび酸性ｐＨで安定
であり、インビボに投与されたときに吸収されない。
【００５０】
微粒子は以下にさらに詳しく説明する多種多様な診断、治療および研究を目的に有用で
ある。例えばインビボ診断目的に関しては、微粒子は検出しうるラベルで標識された免疫
グロブリンまたは細胞レセプターのような高分子を含むことができる。標識された微粒子
を患者に注入すると、癌のような増殖性の疾患を診断するための造影剤となり、または特
定の悪性細胞または生物の増殖を減らすための治療薬の達成度を評価する道具となる。イ
ンビトロの診断では、検査条件下で細胞または生物に特異的な免疫グロブリン、細胞レセ
プターまたはオリゴヌクレオチドプローブのような高分子を含む微粒子を試験試料と混合
し、任意の未反応成分から微粒子を分離し、そして結合した分子を従来法により検出する
。徐放性または治療が必要な部位に薬剤を標的送達するために、微粒子が治療薬を含有し
、そして患者に投与されたとき、微粒子は治療薬としても有用である。
【００５１】
微粒子は特定分子を検出または定量するための試薬として、あるいは抗体のような分子
の産生のために、分子を複雑な混合物から精製するためにも有用である。例えば免疫グロ
ブリンのような高分子を含む微粒子をクロマトグラフィーカラムに結合して、免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーの状態で使用して、複雑な混合物からリガンドを分離するこ
とができる。あるいは標識された高分子または様々な細胞もしくは生体分子に特異的な標
識化高分子（例えば細胞レセプターのような）の混合物を含む微粒子を、フローサイトメ
トリーのような技術を使用して特定の試験条件で反応する細胞または生体分子の数の変化
を検出するために使用できる。さらに微粒子はワクチン生産のアジュバントとしても使用
でき、ここでは抗原含有微粒子をマウスまたはウサギのような実験動物に注射して、抗原
に対する抗体を生産するために強化された免疫応答を開始させる。
＜インビトロ 診断＞
＜インビトロ アッセイ＞
本明細書に記載された微粒子はアッセイ（酵素−結合免疫吸着体アッセイ、ドット−ブ
ロットまたはウエスタンブロットのような）における固体相粒子として、生物試料中の特
定の標的（細胞、生体分子または薬剤のような）を検出するために有用である。この使用
のために設計された微粒子は標的分子に特異的な親和性分子を含む。例えば高分子が免疫
グロブリンであり、細胞レセプターまたはオリゴヌクレオチドプローブであり、そして高
分子が試験管またはマイクロタイタープレートに結合している。
【００５２】
目的の標的分子の検出または定量のためには、試料を微粒子を含む溶液と混合し、微粒
子上の高分子が標的分子と反応し、微粒子を試料中の任意の未反応成分から分離し、そし
て結合した分子を含む微粒子を従来法で検出する。蛍光的に染色した微粒子は、当該技術
分野で周知のフローサイトメトリー分析に良く適している。
＜組織病理学＞
本明細書に記載された微粒子は組織学的試料中の病理学上の視覚的プローブまたはマー
カーとして有用である。この使用に設計された微粒子の高分子は特定の病理状態に現れる
生体分子に特異的であり、検出できるラベルで標識される。例えば高分子は免疫グロブリ
ン、細胞レセプターまたはオリゴヌクレオチドプローブであり、これらは急速に増殖する
細胞のような異常な細胞または病原体（例えばウイルス）に特異的である。
【００５３】
病理状態を検出するために、組織学的試料を微粒子を含む溶液と混合し、微粒子上の標
識高分子が目的の標的分子と反応し、そして結合した微粒子を当該技術分野で周知の方法
でラベルを検出することにより検出する。
＜インビボ診断−画像化＞
本明細書に記載された微粒子は上記の組織病理学用の微粒子の使用について記載された
ものと同様に、特定分子、細胞のタイプまたは病理状態のインビボでの位置に関する造影
剤として有用である。この使用のために設計された微粒子上の高分子は、特定の細胞また
は病原生物により発現されている分子に特異的であり、そして検出できるラベルで標識さ
れる。例えば、高分子は免疫グロブリン、細胞レセプターまたはオリゴヌクレオチドプロ
ーブであり、これらは腫瘍細胞またはウイスルのような病原体に特異的である。
【００５４】
微粒子は病理状態を検出するために、あるいは化学療法もしくは異常な組織腫瘍の大き
さが減少したか、または完全に切除されたかを確認する外科的治療の経過をモニターする
ために使用される。この使用のために、患者は微粒子溶液の投与を好ましくは静脈を介し
て受け、微粒子上の標識された高分子は体内の悪化した器官または部位に局在化するよう
に十分な量および時間で与えられ、高分子は検査条件下で細胞または器官により発現され
た標的分子と反応し、そして結合した微粒子はｘ−線のような当該技術分野で周知の従来
の画像化によりラベルを検出することにより検出される。
＜治療−ドラッグデリバリーシステム＞
微粒子は架橋結合医薬品化合物または架橋結合キャリアー（アルブミンのような）含有
治療剤から成るとき、治療に有用である。微粒子は薬剤を全身に徐放して提供するか、あ
るいは微粒子は標的組織、腫瘍に特異的な親和性分子を含むこができ、そして治療薬（抗
腫瘍、抗ウイルス、抗菌、抗寄生虫または抗関節炎剤、あるいはサイトカイン、ホルモン
もしくはインスリンのような）の標的送達のような治療が必要な部位に直接患者に注射す
るかのいずれかで提供できる。
＜研究への応用＞
微粒子は複雑な混合物から生体分子を精製するために研究の道具として、生体分子を検
出または定量するための試薬として、または抗体のような生体分子の生産のためにも有用
である。
【００５５】
例えば、免疫グロブリンのような高分子から成る微粒子はクロマトグラフィーカラムに
結合させて、複雑な混合物からリガンドを分離するための免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーに使用できる。当業者は高圧液体クロマトグラフィーに使用するための微粒子は
、始めに非−圧縮性固相球またはビーズに結合され、カラムのパッキング操作でその構造
が圧力下で強固になると理解するだろう。
【００５６】
あるいは種々の細胞または細胞レセプターに特異的な標識した高分子または標識した高
分子の混合物を含む微粒子は、フローサイトメトリーのような技術を使用する特定の試験
条件に応答して細胞数または細胞表面レセプター数の変化を検出するために使用される。
【００５７】
さらに微粒子は抗体産生のための有用なアジュバントであり、ここではワクチン生産の
ために抗原−含有微粒子がマウスまたはウサギのような実験動物に注射されるか、あるい
は抗原に対する免疫を誘導するためにヒトに注射され、そして抗原に対する抗体産生を強
化させる。
＜微粒子を調製するためのキット＞
微粒子を調製するためのキットを提供する。キットは以下の試薬を含む：脱水剤および
架橋剤。キットの使用者はカスタム微粒子の調製用キットとして使用することができ、こ
こでは使用者が微粒子中に形成される高分子を供給することになるだろう。あるいはキッ
トは使用者が目的とする微粒子の調製用に１つ以上の高分子を溶液状または凍結乾燥状で
含むことができる。形成された微粒子は次に研究、治療または診断を目的として上記のよ
うに使用できる。キットは好ましくはリン緩衝塩溶液のような緩衝液も含み、架橋剤によ
る非特異的結合をブロックするためのグリシンのようなクエンチング剤を含む。キットは
試料または患者の微粒子の存在を検出するための手段を提供するために検出しうるラベル
、またはあらかじめ標識した高分子も含むことができる。
【００５８】
ポリマー性微粒子および上記の方法は以下の限定することを意図するものではない実施
例によりさらに理解されるだろう。
【実施例１】
【００５９】
ガンマグロブリンならびにポリビニルピロリドンおよびポリエレングリコールのポリマー
混合物での微粒子の調製ならびにその安定性の分析
＜微粒子の形成＞
微粒子をガンマグロブリン、５つのうちの１つの分子量調製物（ＭＷ １０，０００−
３６０，０００）の５−２５％ポリビニルピロリドン溶液、および一定分子量（ＭＷ ３
，５００）調製物の２５％ポリエチレングリコール溶液（両方とも以下の実施例２に記載
されたように調製した）を、グルタルアルデヒドの存在下で、６．９から７．７５の間の
反応ｐＨ範囲で、以下の工程で混合することにより形成した。微粒子は酸性および塩基性
溶液中で安定であった。
【００６０】
各々異なる分子量調製物のポリビニルピロリドンを含む５種のポリマー混合物を、以下
の表１に示すように調製した。２０マイクロリットルのグルタルアルデヒド（２５％、シ
グマ化学社、セントルイス、モンタナ州）を各ポリマー混合物に加えた。Ｊａｍｅｓ Ｅ
．Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌにより１９９２年１月７日に出願された同時係属中の米国特許出願
第０７ ８１７，６１０号明細書およびＪａｍｅｓ Ｅ．Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌ１ｏにより
１９９３年１月７日に出願された国際特許出願第ＵＳ９３−０００７３号明細書に記載さ
れた方法（これらは引用により本明細書に編入される）により精製された１ミリリットル
の精製ヤギガンマグロブリン（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）を、各々５種
類のポリマー混合物とボルテックス混合して簡単に反応させた。反応溶液を４０分間、２
０℃で混合し、そして４℃で一晩インキューベーションした。
【００６１】
すべての５種の反応溶液を２０℃に保存し、１００μｌのＤＬ−リシン（シグマ化学社
、セントルイス、モンタナ州）を各々の溶液に加え、溶液を２０℃で９０分間混合した。
【００６２】
この溶液を５０００ｒｐｍで３０分間、２０℃で遠心した。上清をデカントし、そして
沈殿を０．２％ Ｔｗｅｅｎ（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）を含む１．０
ｍｌのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を含む１ｍｌの緩衝液に再懸濁した。
【００６３】
１００マイクロリットルの各再沈殿物を１００μｌの１：２０００に希釈した抗−ヤギ
ＩｇＧペルオキシダーゼ結合物と２０℃で１５分間反応させた。１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅ
ｅｎ緩衝液を各反応混合物に加え、そして混合物を４℃で一晩インキューベーションした
。
【００６４】
試料を遠心し、１００μｌの各上清をそれぞれから取り出し、そして３００μｌのＴＭ
Ｂｌｕｅと反応させた。残りの上清を注意深くデカントし、沈殿を１ｍｌのＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ溶液に再懸濁した。
【００６５】
再懸濁した試料を再度遠心し、そして１００μｌを取り出し、そして３００μｌのＴＭ
Ｂｌｕｅと反応させ、上清をデカントし、そして沈殿を１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに
再懸濁した。再懸濁沈殿物の１００μｌのアリコートを３００μｌのＴＭ Ｂｌｕｅと反
応させた。
【００６６】
再懸濁試料を再度遠心し、１００μｌを取り出し、そして３００μｌのＴＭ Ｂｌｕｅ
と反応させ、上清をデカントし、そして沈殿を１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに再懸濁した
。再懸濁沈殿物の１００μｌのアリコートを３００μｌのＴＭ Ｂｌｕｅと反応させた。
結果を以下の表１および２に表す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
表１に示される結果は、グルタルアルデヒドの存在下で異なる分子量のＰＶＰ調製物を
含むすべての５種類の溶液について、微粒子が形成されたことを示す。
【００７０】
表２に示される結果は、ガンマグロブリンが３回洗浄した後でも沈殿物中に存在する微
粒子に結合したことを示す。
＜微粒子安定性分析＞
微粒子の安定性に対する酸性または塩基性溶液の影響を分析するために、３種の反応を
反応＃３の第一再懸濁沈殿物について以下のように行った。
【００７１】
１００マイクロリットルの反応＃３の第一再懸濁沈殿物を３本の試験管に入れた。２０
０マイクロリットルの脱イオン水を第一試験管に加えた。粒子が観察された。２００マイ
クロリットルの１Ｎ 酢酸を第二試験管に加えた。第一試験管で観察されたものと同じサ
イズの粒子が観察された。２００マイクロリットルの１％ ＮａＯＨを第三試験管に加え
た。第一試験管で観察されたものと同じサイズの粒子が観察された。
【００７２】
３本のすべての試験管を４℃にて一晩静置し、そして翌日観察した。試験管１および２
は変わらなかった。試験管３は試験管１または２よりも小さい粒子を有した。結果では酸
性または塩基性ｐＨでは粒子の安定性を変化しないことが示された。
【実施例２】
【００７３】
放射性 ＣＥＡ対する抗−ＣＥＡ微粒子の調製およびその結合性のインビトロ分析
抗−ＣＥＡ（がん胎児性抗原）微粒子は一般的に実施例１の反応＃３について記載した
ように形成し、そしてより詳細には以下に記載した。形成した微粒子を次に種々の濃度の
放射性ＣＥＡと混合し、抗−ＣＥＡ抗体がＣＥＡリガンドに親和性を保持したまま微粒子
中に取り込まれたかどうかを測定した。
抗−ＣＥＡ微粒子の調製
１４．３％の各ポリマー溶液、ポリビニルピロリドン（ＭＷ ４０，０００）およびポ
リエチレングリコール（ＭＷ３５００）（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州から
得た）は、１４．３グラムのポリマーを１００ｍｌの蒸留水に加えて調製した。１４．３
％の各ポリマー溶液のｐＨはおよそ６．２５に調整した。このポリマー溶液を１：１で混
合し、ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物を作成した。
【００７４】
対照として、ポリマー混合物をグルタルアルデヒドが存在しないガンマグロブリン中に
加えながら、０．４５ｍｌの精製ヤギ抗−ＣＥＡガンマグロブリンのアリコートを、３．
６ｍｌのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物とボルテックスで反応させた。反応物を３℃で３
０分間静置した。反応物を２３００ｒｐｍで６０分間、２０℃で遠心した。上清をデカン
トし、そして沈殿物を０．９ｍｌのリン酸塩溶液に再懸濁した。
【００７５】
再懸濁した沈殿物を１．８ｍｌのポリマー混合物で洗浄し、予めｐＨを６．２５に調整
し、３℃で２０分間静置し、そして２０℃にて５０００ｒｐｍで３０分間遠心した。 ポ
リマー混合物／グルタルアルデヒドをガンマグロブリン中に加えながら、０．９ｍｌの精
製ヤギ抗−ＣＥＡガンマグロブリンを２ｍｌのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物、ｐＨ６．
２５（２０μｌのグルタルアルデヒドを含有する）とボルテックスで混合することにより
反応させた。反応物を２０℃で９０分間混合した。反応物を２３００ｒｐｍで６０分間、
２０℃で遠心した。上清をデカントし、そして沈殿物を１ｍｌのリン酸塩緩衝液中に再懸
濁した。８０マイクロリットルのＤＬ−リシンを、再懸濁沈殿物に加え、そして混合した
。反応物を４℃にて一晩静置した。
【００７６】
反応物を５０００ｒｐｍで３０分間、２０℃にて遠心した。試料を４℃で６０時間静置
し、そして次に再度遠心した。上清は透明になり、そしてデカントした。抗−ＣＥＡ微粒
子を含む沈殿物を１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（１Ｘ）に再懸濁した。
＜結合性分析＞
放射性ＣＥＡ（Ｉ１２５）を１０％の液体魚ゼラチンを含有するリン酸塩緩衝液で希釈
した。希釈したＩ１２５ＣＥＡは１００μｌあたり３９３１３カウントを含有した。
【００７７】
各々１００μｌの希釈Ｉ１２５ＣＥＡを含む１０本の反応試験管を、以下の表３に示す
ように適当容量再懸濁抗−ＣＥＡ微粒子を加えて準備した。
【００７８】
試験管１−５の中の放射性ＣＥＡ／抗−ＣＥＡ微粒子混合物を、２時間震盪しながら冷
蔵庫でインキューベーションした。試験管６−９中の放射性ＣＥＡ／抗−ＣＥＡ微粒子混
合物を１５分間、室温で震盪しながらインキューベーションした。反応物を３回、１０％
の液体魚ゼラチンを含有するリン酸塩緩衝液で洗浄し、１分間高速遠心機で遠心し、そし
てリン酸塩緩衝液に再懸濁した。結果は抗−ＣＥＡ微粒子が免疫学的に活性であり、そし
て表３に数字で、そして図１にグラフで示すようにＣＥＡと反応することを示す。
【００７９】
【表３】
【実施例３】
【００８０】
微粒子形成に対するｐＨの影響
この実験ではＩｇＧ微粒子形成能力に対するｐＨの影響を実証した。
【００８１】
＜実験法＞
ＰＶＰ／ＰＥＧのポリマー混合物を一般的に実施例２（４８％の全ポリマー）に記載し
たように調製し、そしてｐＨを表４に示すように調整した。１ミリリットルの各溶液を各
々７本の遠心管に入れた。
【００８２】
【表４】
【００８３】
脱イオン水中の１００μｌの５．０％グルタルアルデヒド（シグマ化学社、セントルイ
ス、モンタナ州）を各試験管に加え、そしてよく混合した。
【００８４】
ヒト血漿から精製したヒトＩｇＧの３００μｌの３Ｘ濃厚試料ｃｆを、上記実施例２に
記載したようにボルテックスで混合した。混合物を２０℃で１時間混合し、そして物質を
３８００ＲＰＭで３０分間、２０℃にて遠心した。上清をデカントし、そして粒子を５ｍ
ｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝液中）で洗浄し、次に６０分間、２０℃にて
混合し、そして３８００ＲＰＭで３０分間、２０℃で遠心した。上清をデカントし、そし
て粒子を５ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ中）で洗浄した。
＜観察＞
精製ＩｇＧを試験管に加え、そして２０分間混合した後、凝集サイズの傾向を観察した
。ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨが上昇すると、形成する凝集物のサイズも大きくなった。
＜第一沈殿物＞
ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨが上昇すると、沈殿物は小さくなり、より湿っており、そ
してオレンジ色になった。これらの特徴のこのような注目すべき変化はｐＨ６．６で起こ
った。
【００８５】
試験管＃７は沈殿物が試験管の壁に付着しないように大変注意深く処理しなければなら
なかった。９０％の上清を注意深く使い捨てピペットで取り出した。
＜第一再懸濁液＞
ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨと形成した粒子サイズの間には直接的な関係がある。ｐＨ
が上昇すると粒子サイズは大きくなった。ｐＨ６．６で粒子はｐＨ５．８よりも顕著に大
きかった。
＜第二沈殿物＞
ｐＨ６．６以上で、沈殿物は試験管の壁に付着せず、そして極めて容易に試験管の壁か
ら落ちた。ｐＨが上昇すると沈殿物は黄色からオレンジ色になった。
＜第二再懸濁液＞
第一再懸濁液と同一。
【００８６】
粒子を室温にし、よく混合し、そして次に２６００ＲＰＭで２０℃にて３０分間遠心し
た。上清をデカントし、そして沈殿物を５．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ
緩衝液、ｐＨ５．６中）に再懸濁した。洗浄工程は次に３回以上、上清が透明になるまで
繰り返した。
＜結論＞
ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨが９．２から４．６に下がると、グルタルアルデヒドの架
橋結合作用により形成した粒子のサイズはより小さくなり、そしてサイズがより均一にな
った。
【実施例４】
【００８７】
酵素−標識されたアルブミン微粒子の調製
１．６０ミリグラムの鶏卵アルブミンを、実施例２に記載したように調製した２ｍｌのＰ
ＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物に溶解した。ｐＨを４．５に１Ｎ ＨＣｌで調整した。２０
０μｌのカッペル（Ｃａｐｐｅｌｌ）アフィニティー精製ウサギ抗−ヤギＩｇＧ西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合物を加えた。
２．混合物を３０分間、回転させた。
３．１０％のグルタルアルデヒド溶液を１：４に希釈し、そして２００μｌを混合物に加
えた。
４．混合物を３０分間、回転させた。
５．混合物を１５００ｒｐｍで３０分間、２０℃にて遠心し、そして上清を取り出した。
６．沈殿物をグリシン緩衝液に再懸濁し、そして１５００ｒｐｍで１０分間、２０℃にて
２回遠心することにより洗浄した。
７．沈殿物を１％魚ゼラチを含む０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ塩、ｐＨ７．４、２ｍｌ全容量、
に再懸濁し、そして粒子を含有した。
＜分析＞
１．４滴のＨＲＰ基質を２つのガラス試験管に加えた。
２．工程７の４滴の再懸濁沈殿物を１つの試験管に加え混合した。
３．工程５の４滴の上清を別のガラス試験管に加え、そして混合した。
＜結果＞
１．工程５からの上清を含む試験管は透明だった（無色）。
２．工程７からの再懸濁沈殿物を含む試験管はマリンブルー色で、５分間以内で粒子がＨ
ＲＰにより標識されていることを示した。
【実施例５】
【００８８】
抗−ＨＣＧポリマー微粒子のインビボ投与
蛍光標識した抗−ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（抗−ＨＣＧ）微粒子をＢａｌｂ／ｃマウ
スに注射し、そしてクリアランスを検査した：
体重が３５ｇのメスのマウスにフェノバルビタールを５分間注射した。腹腔を外科的に
露出し、そして２７ １／２ ゲージ針を使用して大動脈に蛍光標識した抗−ＨＣＧを注
入した。
【００８９】
５分後、５０μｌの血液を採血した。
【００９０】
１０分後、５０μｌの血液を採血した。
【００９１】
動物は採血時に強く心臓が鼓動しながら依然として生存していた。
【００９２】
次にマウスを頸部転位により屠殺した。
＜分析＞
１．１滴の血液（５分および１０分）を、試料用のくぼみを持つスライドガラスに沈殿さ
せ、そして試料をガラスカバースリップで覆った。１滴の油をスリップカバーに塗った。
２．血液試料を高出力を使用して蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＩＩＩＲＳ）で検査した。
３．強い蛍光が５分の細胞の回りに観察され、微粒子が動物にすぐには吸収されないこと
を示した。
４．弱い蛍光が１０分の試料に観察された。
【実施例６】
【００９３】
蛍光−標識されたヒトＩｇＧ微粒子の形成に対するポリマー混合物濃度の影響
この実験は抗体微粒子の形成に対するＰＶＰ／ＰＥＧポリマー濃度の影響を測定するた
めに行った。
＜方法＞
１容量のＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物を実施例２に記載したように調製し、５３．３％
濃度のポリマーを有するポリマー混合物を形成し、ｐＨを４．８に調整した。ポリマーの
希釈は０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を使用して以下の表５に説明するように作
成した：
【００９４】
【表５】
【００９５】
表５に説明した１ｍｌの各希釈の組を、遠心管に分けた。各試験管に１００μｌの５％グ
ルタルアルデヒド溶液（４００μｌの２５％グルタルアルデヒドを２．０ｍｌのＨ２Ｏに
加え、そして混合して調製した）を加えた。ポリマー混合物／グルタルアルデヒド溶液を
徹底的にボルテックス混合した。
【００９６】
試験管を次に３００μｌの蛍光標識ヒトＩｇＧと反応させた。精製したヒト抗体を０．
１Ｍ グリシン溶液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ１１．０中）中で３Ｘに濃縮し、そして蛍光イ
ソチオシアネート（０．１Ｍ グリシン緩衝液、濃度３ｍｇ／ｍｌ）で標識した。抗体を
ボルテックス混合しながらポリマー混合希釈物に加え、そして試験管を１時間混合し、続
いて３０分間、２５００ｒｐｍで２０℃にて遠心した。 遠心後、上清をデカントし、そ
して沈殿物を５ｍｌの０．５Ｍ グリシン（ＰＢＳ中）に再懸濁した。沈殿物を破壊し、
そしてよく振った。それらを次に３０分間、３０℃にて２５００ｒｐｍで遠心した。この
洗浄工程を４回繰り返した。
＜結果＞
各試験管には反応の開始から異なる外観が現れた。５．３％ポリマーを含有する試験管
はわずかに沈殿し、そのほとんどが試験管の壁に一緒に凝集していた。５３．３％ポリマ
ーを含有する試験管は一緒に粘着しない、または試験管の壁に付かないきわめて微細な粒
子を含んでいた。
【００９７】
全体的に、ポリマー濃度が増加すると沈殿物質はより微細になり、粘着性が低くなった
。酢酸ナトリウム対照中の固体反応物質は小さくかつ粘着性であった。
【００９８】
遠心後、沈殿物のサイズはポリマー濃度に直接比例して増大するように思われた。沈殿
物のオレンジ色の明るさはポリマー濃度に逆比例した。 対照沈殿物は試験管中のポリマ
ー濃度が低いので、大変小さくかつ明るいオレンジ色を表した。沈殿物を０．５Ｍ グリ
シン洗浄緩衝液中に分散する容易さもポリマー濃度に関連した。試験管に含まれる沈殿物
のうち、５．３％ポリマー混合物のみが粘着性で、かつ分散し難かったが、各連続的試験
管中の粒子は粘着性が低かった。３１．８％以上のポリマー濃度で、粒子は容易に別れた
。
【００９９】
最初の洗浄および遠心の後、色の明るさの勾配が沈殿物中に未だ存在したが、その差異
の程度はより小さかった。上清はフルオレッセインイソチオシアネートが試料から洗い出
されているので明るいオレンジ色であった。第３回の洗浄後、上清は透明であり、そして
沈殿物の色は均一であった。沈殿物間のサイズの差異は変化しなかった。
＜結論＞
ポリマー濃度は、ポリマー混合物で作成された抗体粒子の特性の決定に明らかな役割を
果たす。４０％以上のポリマー濃度では付着しない大変微細な粒子が生成する。またポリ
マー混合物中のポリマー濃度が高いほど、より多数の抗体分子を形成することができる。
【実施例７】
【０１００】
ガンマグロブリン微粒子の形成に対するｐＨの影響
この実験は抗体粒子の形成に対するポリマー混合物をｐＨの影響を決定するために行っ
た。
＜方法＞
８本の遠心管のそれぞれに１ｍｌのヤギ血清アリコートを入れた。血清を１５分間、１
．８％ Ｔｒｉｔｏｎ／３％Ｂｒｉｊ（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）溶液
と一緒にインキューベーションした。続いて２ｍｌの４０％ポリマー混合物と反応させた
。ポリマー混合物の添加はボルテックス混合しながら行い、そして試験管を３０分間混合
した。試験管を次に３０分間、３６００ｒｐｍ、２０℃で遠心した。上清をデカントし、
そして沈殿物を１ｍｌの０．５Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ベーカーケミカル社：Ｂａｋｅ
ｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に再懸濁した。すべての試料は容易に、そして透明に再
懸濁した。
【０１０１】
Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液中で１５分間インキューベーションした後、ボルテックス混合
しながら試料に１ｍｌのポリマー混合物を加えた。試験管を３０分間混合し、そして３０
分間、２０℃にて３６００ｒｐｍで遠心した。上清をデカントし、そして沈殿物は１ｍｌ
の脱イオン水中に容易に、かつ透明に再懸濁した。試料をｐＨ勾配をもつポリマー混合物
（ｐＨを塩酸で下方に調整し、そして３Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌで上方に調整した）と反応
させた。調整したｐＨ値を以下の表６に記する：
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
１ｍｌのｐＨを調整したポリマー混合物を各試験管に加え、続いて１０分間混合した。
混合後、各試験管に４０μｌの２５％グルタルアルデヒド（脱イオン水で１：１０に希釈
した）を加えた。再度、試験管を１０分間混合し、そして３０分間、２０℃にて３６００
ＲＰＭで遠心した。試験管をデカントし、そして粒子を１ｍｌ １ＸＰＢＳ中に再懸濁し
た。
＜結果＞
遠心後、試料はｐＨに関連して大きさおよび色の両方について明らかな勾配を表した。
１Ｘ ＰＢＳ中に再懸濁する前に、試料１、２および七中の沈殿は他の試験管中のものよ
りもわずかに小さかった。高アルカリ性ではポリマー混合物がタンパク質を沈殿させる能
力を阻害するので、ｐＨ９．３の試料中では外観上の沈殿がなかった。酸性ｐＨ値の試料
は白色で、勾配にそって黄色−オレンジ色が増加した。また、粒子サイズはｐＨに直接比
例し、試料１の粒子が大変細かかった。ｐＨが上昇するにつれて、粒子は大きく、そして
より凝集し易くなった。
＜結論＞
抗体粒子のサイズはポリマー混合物のｐＨを変化させることにより容易に制御できた。
高ｐＨで、グルタルアルデヒドはタンパク質のアミノ基と大変強い結合を形成し、塩基性
試料の黄色−オレンジ色および全体の粘着性の原因となった。しかし酸性ｐＨ値で、グル
タルアルデヒドの効果は低下した。粒子はそれでも形成することができるが、それらはは
るかに微細であり、塩基性ポリマー混合物で作成された粒子よりも凝集し易い傾向が弱く
なる。
【実施例８】
【０１０４】
ＩｇＧ微粒子の形成に対するグルタルアルデヒド濃度の効果
この実施例はグルタルアルデヒド量を上昇させてＩｇＧ微粒子形成に対する効果を示す
ために行った。
＜実験法＞
実施例２に記載した１．０ｍｌのポリマー混合物（４８％全ポリマー、ｐＨ４．８を含
む）を７本の遠心管に入れた。各試験管に表７に示す様々な容量のグルタルアルデヒドを
加えた。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
各試験管をよく混合し、そして３００μｌの精製ＩｇＧ ３Ｘ 濃度（０．１Ｍ グリ
シン、ｐＨ１１．２、緩衝液は２ｎｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣを含む）を各試験管に加えた。すべての試験管を２０℃にて１時間混合し、次に３６
００ＲＰＭで２０℃にて３０分間遠心した。
【０１０７】
上清をデカントし、そして粒子を５．０ｍｌ ０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝
液、ｐＨ７．０）中で洗浄した。２０℃で３０分間混合した。２６００ＲＰＭで２０℃に
て３０分間遠心した。この洗浄工程は２回以上繰り返した。
【０１０８】
粒子を４℃で５．０ｍｌ ０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０）中
で保存した。
＜観察＞
グルタルアルデヒドの量が増加すると、粒子数およびより濃いオレンジ色が増した。
【０１０９】
粒子を上清が透明になるまで繰り返して洗浄した。
【０１１０】
最後の遠心で、試験管の壁に完全に付着しないペレットが生成した。上清は使い捨てピ
ペットで注意深く取り出されなければならず、そして１．０ｍｌの緩衝液を残した。
＜結論＞
ポリマー混合物（４８％全ポリマー）に加えたグルタルアルデヒド量の増加と、形成し
た粒子量の増加の間には直接的な関係があった。グルタルアルデヒドの量（２５％水溶液
２μｌから２００μｌの間）は粒子サイズの上昇または減少に対して効果がないようだっ
た。
【実施例９】
【０１１１】
抗−ＨＣＧモノクローナル抗体微粒子のヨード化ＨＣＧへの結合の調製およびインビトロ
分析
この実験はＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物および種々の濃度のグルタルアルデヒドで、
ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）特異的モノクローナル抗体微粒子を形成し、そして
微粒子がＨＣＧ提示抗原に結合する能力を免疫アッセイで実証するために行った。
＜実験法＞
実施例２に記載した方法により調製した、一緒にプールしておいた２つの１ｍｌ精製Ｈ
ＣＧ抗体試料を解凍した。よく混合した。グルタルアルデヒドのより低比率溶液（２５％
水溶液から）を以下の表８に説明するように増加させながら作成した。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
１５０μｌのプールしておいたＨＣＧ試料を１００μｌのグルタルアルデヒドパーセン
ト溶液を含む試験管にボルテックス混合しながら加えた。室温で４５分間混合した。
【０１１４】
０．５ｍｌのポリマー混合物（４０％全ポリマー、ｐＨ６．６）を素早く各試験管に加
え、そして２０℃で３０分間混合した。３５００ＲＰＭで４℃にて３分間遠心した。上清
をデカントした。２ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．０）を各試験管
に加え、そして２０℃で３０分間混合した。３０００ＲＰＭで４℃にて３０分間遠心した
。上清をデカントし、そして粒子を２．０ｍｌ ０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ中）
に再懸濁した。よく、しかし簡単に混合した。３０００ＲＰＭで４℃にて３分間遠心した
。洗浄工程をもう１回繰り返した。４℃に一晩静置した。
【０１１５】
粒子を３０００／ＲＰＭで４℃にて１２分間遠心した。上清をデカントし、そして粒子
を２．０ｍｌ １Ｘ ＰＢＳ中に再懸濁した。
＜観察＞
粒子サイズの傾向に注目した。グルタルアルデヒドの量が減少すると、粒子数は減少し
たが、粒子のサイズは上昇した。試験管＃７（対照）に粒子は観察されなかった。
＜免疫アッセイ＞
上記のように調製した粒子を含む各試料５０μｌを６本の試験管の３組（Ａ、Ｂおよび
Ｃ）中に入れた（全部で１８本）。
【０１１６】
総カウント用に２５μｌのＨＣＧトレーサー（ヨード化ＨＣＧ抗原、ベクトンデッキン
ソン：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サン ジョーズ、カリフォルニア州）をＡ組
の試験管１−６、およびＨＣＧ抗体対照含有試験管に加えた。
【０１１７】
総カウント用に２５μｌの小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）トレーサー（ヨード化ＦＳＨ抗
原）をＢ組の試験管１−６、およびＦＳＨ抗体対照含有試験管に加えた。
【０１１８】
総カウント用に２５μｌのエストラジオールトレーサー（ヨード化エストラジオール抗
原）をＣ組の試験管１−６、およびエストラジオール抗体対照含有試験管に加えた。
【０１１９】
すべての試験管を簡単にボステックス混合し、そして６０分間、室温に静置した。２．
０ｍｌの脱イオン水を混合し、そして３０分間、３０００ＲＰＭで遠心した。試験管を静
かにデカントした（およそ１００マイクロリットルの残りの水を試験管に残した）。
【０１２０】
すべての試験管を１分間、シンチレーションカウンターで計数した。結果を以下の表９
に示す。
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
【表１０】
【０１２３】
＜結論＞
グルタルアルデヒド濃度が減少すると、より少ない抗−ＨＣＧモノクローナル抗体微粒
子が形成されたが、その粒子サイズはより大きかった。抗−ＨＣＧ微粒子はヨード化ＨＣ
Ｇ抗原と免疫アッセイで結合できる。抗−ＨＣＧ微粒子は、ＦＳＨおよびエストラジオー
ルのような他のヨード化抗原と免疫アッセイで非特異的に結合できない。
【実施例１０】
【０１２４】
破傷風トキソイド微粒子の調製
この実験はＰＶＰおよびＰＥＧポリマー混合物ならびにグルタルアルデヒドで破傷風ト
キソイド微粒子を調製するために行った。
＜実験法＞
１．０ｍｌの５４％ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物を遠心管に入れた。１００μｌのグ
ルタルアルデヒド（２５％水溶液）を１つの試験管に入れ、そして１０μｌのグルタルア
ルデヒドを別の試験管に入れて徹底的にボルテックス混合した。０．５ｍｌの破傷風トキ
ソイド（１．０ｍｇ／ｍｌ）（公衆衛生部）を両方の試験管に加え徹底的にボルテックス
混合した。
【０１２５】
室温で４時間１５分間混合した。４℃にて３０００ＲＰＭで３０分間遠心した。上清を
デカントし、そして粒子を２．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１ＸＰＢＳ緩衝液中＿）に
再懸濁した。４℃に一晩おいた。
【０１２６】
洗浄工程を２回以上繰り返した。粒子を最終的に０．５ｍｌの１ＸＰＢＳ緩衝液中に再
懸濁した。
＜観察＞
１００μｌのグルタルアルデヒドを含む反応は１０μｌのグルタルアルデヒドを含む反
応よりもより多い粒子を有した。両反応の粒子はサイズが同じであった。粒子は目で見た
ところ大変小さい。
【実施例１１】
【０１２７】
ウシ血清アルブミンポリマー微粒子の調製
この実験はＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物ならびにグルタルアルデヒドでウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）微粒子の形成を実証し、そしてこの方法で使用する様々な容量のグルタ
ルアルデヒドの効果を観察するために行った。
＜実験法＞
１１０ｍｇのＢＳＡを０．１Ｍ １１ｍｌのＴｒｉｓ（商標）塩基、ｐＨ９．０中に入
れた。１１ｍｇのＦＩＴＣを加え、ｐＨを塩基で９．５に調整し、そして２０℃で３０分
間混合し、蛍光標識ＢＳＡを生成した。
【０１２８】
各々１ｍｌのポリマー混合物（ｐＨ５．０、４８％全ポリマー）を含む８本の試験管を
用意し、以下の量のグルタルアルデヒド（２５％水溶液）を表１０に示すように加えた。
【０１２９】
【表１１】
【０１３０】
簡単に、しかし徹底的にボルテックス混合した。３００ｍｌのＢＳＡ−ＦＩＴＣ溶液を
加えた。７．５時間混合した。
＜結論＞
各試験管にウシ血清アルブミン微粒子が形成した。グルタルアルデヒドの量を減少させ
ると、より大きな凝集が形成し、さらに小さく細かな粒子がすべての容量のグルタルアル
デヒド（１μｌから２００μｌ）で見られた。また、グルタルアルデヒド量を増加すると
、小さい微粒子の数が増加した。
【実施例１２】
【０１３１】
脱水剤として飽和硫酸アンモニウムを使用する免疫グロブリン微粒子の調製
この実験はｐＨ勾配にわたって、飽和硫酸アンモニウムを脱水剤として、そしてグルタ
ルアルデヒドを架橋剤として使用して免疫グロブリン微粒子を調製するために行った。
＜実験法＞
１００ｍｌの飽和硫酸アンモニウム溶液は７６．１ｇの硫酸アンモニム（フィッシャー
科学社：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルべニア州）を１
００ｍｌの脱イオン水、ｐＨ５．２に入れて調製した。
【０１３２】
様々なｐＨの飽和硫酸アンモニウム溶液は、上記のように調製した溶液のアリコートを
低いｐＨの場合は氷酢酸で、そして高ｐＨ値の場合は２Ｎ 水酸化ナトリウムで調整し、
以下の表１１に示すように調製した。
【０１３３】
【表１２】
【０１３４】
各々の飽和硫酸アンモニウム溶液のアリコート０．３ｍｌを１５ｍｌの遠心管に入れた
。
【０１３５】
５０ｍｌのグルタルアルデヒド（２５％水溶液）を各試験管に加え、そしてよく混合し
た。
【０１３６】
０．３ｍｌのヒト血漿由来の精製ＩｇＧ試料（実施例２に記載したように精製した）を
各試験管に入れた。すべての試験管を次に約１５分間、室温で混合した。粒子は精製Ｉｇ
Ｇ試料を加えるとすぐに形成されるのが観察された。
【０１３７】
５．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０中）を各試験管に
加えた。試験管をよく混合し、そして２６００ＲＰＭで３０分間、２０℃にて遠心した。
【０１３８】
上清をデカントし、そして粒子を５．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝
液、ｐＨ７．０中）中で洗浄した。２０℃で３０分間混合し、そして２６００ＲＰＭで３
０分間、２０℃にて遠心した。この洗浄を３回以上繰り返した。
＜観察＞
精製ＩｇＧをグルタルアルデヒドを含む硫酸アンモニウム（飽和）溶液に加えた直後に
、試験管を混合すると粒子が見られた。
【０１３９】
飽和硫酸アンモニウム溶液のｐＨの上昇と、形成した粒子量の増加には直接的な関係が
見られた。
【０１４０】
粒子サイズは飽和硫酸アンモニウム溶液のｐＨ範囲間で変化しなかった。
【実施例１３】
【０１４１】
脱水剤として飽和硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールの混合物を使用する
免疫グロブリン微粒子の調製
この実験は脱水剤として飽和硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）混合物を、そして架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用して免疫グロブリン微粒子を
調製するために行った。
＜実験法＞
１００ｍｌ容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を実施例１２に記載したように調製した。
２０％のポリエチレングリコール（シグマ、セントルイス、モンタナ州）溶液（０．１Ｍ
酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中）も調製した。硫酸アンモニウム溶液を小増分で１０ｍ
ｌのＰＥＧ溶液に硫酸アンモニウムが沈殿するまで加えた。溶液中に存在した最大の硫酸
アンモニウム容量は１．２ｍｌであった。１ｍｌのこの硫酸アンモニウム／ＰＥＧ溶液を
８本の各試験管に小分けした。試験管に次に２５％グルタルアルデヒド（シグマ、セント
ルイス、モンタナ州）を、以下の表１２に特定する量で加えた。
【０１４２】
【表１３】
【０１４３】
試験管５−８は勾配にそって色反応の増加を示した。色の明るさは時間の経過によって
も増大した。これは硫酸アンモニウムのアミンと反応するグルタルアルデヒドの結果であ
った。試験管１−４は、これらの試験管中のグルタルアルデヒド濃度が大変低いので色が
変化しなかった。
【０１４４】
３倍濃縮した精製ブタＩｇＧ抗体の３００μｌアリコートをボルテックス混合しながら
各試験管に加えた。試験管を次に６０分間混合し、そして３６００ＲＰＭで２０℃にて３
０分間遠心した。
【０１４５】
上清をデカントし、そして１０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（シグマ、セントルイス、モ
ンタナ州）、ｐＨ７．０（リン酸塩緩衝液中）を各沈殿物に加えた。試験管を次によく震
盪し、沈殿物を分散させて４℃にて一晩保存した。
【０１４６】
翌朝、試験管を３０分間３６００ＲＰＭで２０℃にて遠心した。上清をデカントし、そ
して沈殿物を５ｍｌの０．５Ｍ グリシン緩衝液で洗浄した。よく震盪した後、試験管を
３０分間３６００ＲＰＭで２０℃にて遠心した。遠心後、上清をデカントし、そして沈殿
物に５ｍｌの０．５Ｍ グリシン緩衝液を加えた。試験管をよく震盪した。
＜結果＞
初めの遠心後、沈殿物はサイズおよび色が異なり、沈殿物はグルタルアルデヒド濃度が
増すとより大きく、そして暗くなった。沈殿物を分散させ、そしてよく混合した後、試験
管＃１（これはグルタルアルデヒドを加えていない）を除いてすべての試験管に粒子が現
れた。試験管２−７には均一サイズに見える微細な粒子が存在した。しかし、粒子は粘着
性であり、そしてすべての試験管中で凝集する傾向があった。試験管中の粒子量に比べて
凝集化の割合がより大きいのは２０μｌ未満のグルタルアルデヒドを加えた試験管であっ
た。これらの結果は最後の２回の洗浄でも一定していた。
【実施例１４】
【０１４７】
インスリン微粒子の調製
この実験はＰＶＰおよびＰＥＧのポリマー混合物ならびにグルタルアルデヒドを使用し
てインスリン微粒子を調製し、形成した微粒子の濃度を測定し、そしてそれらの免疫活性
をアッセイするために行った。
＜微粒子の調製＞
ウシ膵臓由来の３０ｍｇインスリン（シグマ、セントルイス、モンタナ州）を、３．０
ｍｌの３Ｍ ＨＣｌに加え、乾燥したインスリンを溶解した。ｐＨを８．４から９．０の
間に２５μｌの２Ｎ ＮａＯＨを加えて調整した。
【０１４８】
５４％ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物、ｐＨ５．０のアリコート１．０ｍｌを遠心管に
加えた。以下の量のグルタルアルデヒド（ＩＩ級、２５％水溶液、シグマ化学社、セント
ルイス、モンタナ州）を各試験管に加えた：試験管Ａに２５μｌのグルタルアルデヒド、
試験管Ｂに５０μｌのグルタルアルデヒド、試験管Ｃに１００μｌのグルタルアルデヒド
。
【０１４９】
１．０ｍｌの可溶化インスリンをボルテックス混合しながら各試験管に加えた。２０℃
で６−８時間混合し、そして一晩静置した。
【０１５０】
５．０ｍｌのリシン溶液、ｐＨ９．４（１０ｍｇリシン／ｍｌ脱イオン水中に１ｍｇ／
ｍｌ アジ化ナトリウムを含む）を使用して粒子を９回洗浄した。洗浄工程は５．０ｍｌ
のリシン溶液を粒子に加え、よく、しかし簡単に混合した。２３００ｒｐｍで、２０℃に
て３０分間遠心した。上清を吸引し、そして工程を繰り返した。粒子をリシン溶液中で一
晩、４℃にて保存した。
【０１５１】
粒子を遠心し、上清を吸引し、そして粒子を５．０ｍｌの１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７
．０に再懸濁した。各再懸濁物のｐＨは以下のとおり：試験管ＡはｐＨ９．２、試験管Ｂ
はｐＨ９．２、試験管ＣはｐＨ８．８。
【０１５２】
粒子を遠心し、上清を吸引し、そして粒子を５．０ｍｌの１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７
．０に再懸濁した。各再懸濁物のｐＨは以下のとおり：試験管ＡはｐＨ８．０、試験管Ｂ
はｐＨ７．４、試験管ＣはｐＨ７．２。
【０１５３】
粒子を遠心し、上清を吸引し、そして粒子を５．０ｍｌの１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７
．０に再懸濁した。各再懸濁物のｐＨは以下のとおり：試験管ＡはｐＨ７．４、試験管Ｂ
はｐＨ７．２、試験管ＣはｐＨ７．２。
＜結果＞
形成した粒子は大変小さく、そして細かかった。リシン溶液中で遠心中に、粒子は完全
に固くなることができなかった。リン酸塩緩衝液で洗浄した後、粒子はかなりの程度固く
なることができ、そして粒子の凝集も形成した。
【０１５４】
試験管Ｃは最大量の粒子を有した。試験管Ｂは試験管Ａよりも粒子が多かった。したが
って形成された粒子は各試験管に加えたグルタルアルデヒドの量で増大した。
＜ヒツジ抗−インスリンペルオキシダーゼアッセイ＞
インスリン微粒子の免疫活性は、微粒子が抗−ヒツジインスリンに結合できる能力をヒ
ツジ抗−インスリンペルオキシダーゼアッセイで測定することにより決定した。
【０１５５】
４本の各試験管を３連で準備した。上記各試験管Ａ、ＢおよびＣから以下の量のインス
リン粒子を、以下の表１３に示される各連続した適当な試験管中に入れた。
【０１５６】
適当量の１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０を各試験管に加え、そして最終容量を１．０
ｍｌにした。すべての試験管をよく、しかし簡単に混合した。１００μｌのヒツジ抗−イ
ンスリンペルオキシダーゼ（バイオデザイン インターナショナル：Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ケンネバンクポート、メリーランド州、５ｍｇ／ｍｌタ
ンパク質）を加えた。よく混合した。試験管を室温で４時間１０分インキューベーション
した。試験管を４℃に一晩静置した。
【０１５７】
全連続のすべての試験管を３０００ｒｐｍで、２０℃にて３０分間遠心した。粒子が偶
然損失することがないように、約９０％だけの上清を注意深く取り出した。１．０ｍｌの
０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）表面活性剤（１Ｘリン酸緩衝塩溶液中）を吸引した試験管に
加え、そしてボルテックス混合した。１００μｌの各上清を０．５ｍｌの色原体 ＴＭ
Ｂｌｕｅ（商標）（テトラメチルベンジジン、ダイアグノスティク プロダクツセンター
：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ミルホード、マサ
チュセッツ州）と反応させた。すべての上清は陽性であった。この全洗浄工程を２回以上
繰り返し、すべての過剰な未反応ヒツジ抗−インスリンペルオキシダーゼを除去した。
【０１５８】
最後の洗浄後に、上清の９０％を吸引し、そして５０μｌの粒子を各試験管から取り出
し、そして０．２ｍｌのＴＭ Ｂｌｕｅ（商標）色原体と反応させた。
＜結果＞
以下の表１３に示す結果は、インスリン微粒子が抗−ヒツジインスリンと結合できるこ
とを実証し、これはこれらの粒子が免疫的に活性であることを示している。
【０１５９】
【化１４】
【０１６０】
＜阻害アッセイ＞
インスリン微粒子の免疫活性を、微粒子が抗−ヒツジインスリンに結合する能力を阻害
アッセイで測定することにより決定した。
【０１６１】
５本の各試験管を２連で以下のように準備した。上記反応物ＡおよびＣからの以下の容
量のインスリン粒子を、適当な遠心管中に表１４に示すように入れた。
【０１６２】
１００μｌのイムノフェイズ インスリン トレーサー（商標：Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｓ
ｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｔｒａｃｅｒ）（ヨード化インスリン、チバコーニング：Ｃｉｂａ
Ｃｏｒｎｉｎｇ）を両連の試験管に加えた。ボルテックス処理した。１．０μｌのＩｍ
ｍｕｎｏｐｈａｓｅ（商標）インスリン抗体（チバコーニング）を加えた。ボルテックス
処理した。室温で４時間３０分静置した。３０００ｒｐｍで２０℃にて３０分間遠心した
。
【０１６３】
試験管をシンチレーションガンマーカウンターで１分間計数した。
＜結果＞
阻害アッセイを使用した以下の表１４に示す結果は、インスリン微粒子が抗−ヒツジイ
ンスリンと結合できることを実証し、これはこれらの粒子が免疫的に活性であることを示
している。
【０１６４】
【表１５】
【実施例１５】
【０１６５】
破傷風トキソイド微粒子でのマウスの免疫化
この実験は破傷風トキソイド微粒子でインビボ免疫化の効果を測定するために行った。
【０１６６】
実験の方法、結果および結論は次のとおりである：
＜方法＞
破傷風トキソイド微粒子は一般的に実施例１０に記載されているように次のように調製
した：
モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得たポリビニルピロリドン（ＭＷ４０，
０００）およびポリエチレングリコール（ＭＷ３５００）の２７％の各ポリマー溶液を、
２７グラムのポリマーを１００ｍｌの蒸留水に添加することにより調製した。各ポリマー
溶液のｐＨは約ｐＨ６．２５に調整した。このポリマー溶液を１：１で混合してＰＶＰ／
ＰＥＧポリマー混合物（５４％全ポリマー）を作成した。
【０１６７】
脱イオン水中の１００μｌの５．０％グルタルアルデヒド（シグマ、セントルイス、モ
ンタナ）溶液を、１．０ｍｌのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物に加え、そして激しくボル
テックッス混合した。
【０１６８】
公衆衛生部から得た０．５ｍｌの破傷風トキソイド（１．０ｍｇ／ｍｌ）をＰＶＰ／Ｐ
ＥＧ−グルタルアルデヒド混合物に加え、そして激しくボルテックッス混合した。
【０１６９】
この混合物を室温で４時間１５分間混合し、そして次に４℃にて３０００ＲＰＭで３０
分間遠心した。上清をデカントし、そして粒子を２．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ
ＰＢＳ緩衝液中）に再懸濁し、そして４℃に一晩静置した。
【０１７０】
洗浄工程は２回以上繰り返した。破傷風トキソイド粒子を最後に０．５ｍｌの１Ｘ Ｐ
ＢＳ緩衝液中に再懸濁した。粒子はおよそ５０から１００ミクロンの間の粒子サイズを有
した。
【０１７１】
３２兎のマウスの群を、ＦＤＡプロトコールに従いそれぞれ皮下に２μｇの破傷風トキ
ソイド粒子を含有する一次投与量を接種した。２μｇの破傷風トキソイド粒子を含有する
二次投与は一次投与の７週間後に投与した。血液試料を一次接種後、２、４、５、８およ
び１０週間後にマウスから採血し、そして血中の力価を免疫アッセイで測定した。マウス
に致死量の破傷風トキソイドで一次接種後１４週間目に攻撃した。
＜結果＞
図２に示すように、抗体力価は一次接種４週間目のおよそ１０から一次接種１０週間目
にはおよそ３０００に上昇した。点線は破傷風トキソイドから２アンチトキシン単位の防
御を付与する力価を示す。点線より上の力価はＦＤＡ標準により２つの陽性免疫応答を示
す。したがって図２に示すように、マウスは破傷風トキソイド微粒子を接種後、わずか４
週間目に陽性の免疫応答を示した。４から１０週間目の抗体力価の上昇は、この微粒子が
破傷風トキソイド抗原をゆっくりと放出していることを示す。 １４週間目に投与した致
死量の破傷風トキソイドによる攻撃後に、１００％のマウスが生存した。この生存率は破
傷風トキソイドに対して防御を付与する強い免疫応答を示す。
【０１７２】
この実験の結論として、マウスはすべて健康であった。注射部位の特記すべき炎症およ
び傷痕はなく、そして接種後に有意な体重の減少もなかった。したがって破傷風トキソイ
ド微粒子は皮下投与したとき一般的に無毒性である。
【０１７３】
この実験は、上記方法により調製した破傷風トキソイド微粒子が、破傷風トキソイド抗
原をゆっくり放出し、陽性の免疫応答を引き起こし、そして悪い副作用無く破傷風トキソ
イドの致死量攻撃に対して防御を与えることを示すデータを提供する。
【実施例１６】
【０１７４】
直鎖ポリマーおよび加熱を使用したアルブミン微粒子の調製
この実験はアルブミンとＰＶＰおよびＰＥＧ混合物とを様々な温度でインキューベーシ
ョンすることによりアルブミン微粒子を調製するために行った。
＜実験法＞
４本の反応試験管に１．０ｍｌのウシ血清アルブミン−ＦＩＴＣ溶液（１％のウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）および１０μｌの透析したフルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）アルブミンを含む）を入れた。２．０ｍｌのポリマー混合物（８．０％ＰＶＰお
よび２０％のＰＥＧを０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に含む）をボルテックス混
合しながら各試験管に加えた。
【０１７５】
反応１は室温で１．５時間混合した。反応２は室温で３０分間混合し、そして５８℃で
３０分間、水浴中にてインキューベーションした。反応３は直ちに５８℃の水浴中に３０
分間置いた。反応４は室温で３０分間混合し、そして次に３７℃で３０分間、水浴中にて
インキューベーションし、次に５８℃の水浴中で３０分間インキューベーションした。
【０１７６】
２．０ｍｌの１０％エタノールを各反応混合物に加え、そして簡単に混合した。２０℃
にて３０分間、３０００ｒｐｍで遠心した。上清を注意深く吸引した。粒子を２．０ｍｌ
のエタノールに再懸濁した。反応混合物１は透明であり、一方２、３および４はくもって
いた。遠心および２．０ｍｌの脱イオン水中に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査した。
＜結果＞
反応混合物１には微粒子が見られなかった。反応混合物２は非−凝集性の直径約１から
１０μｍの微粒子を含んだ。反応混合物３は非−凝集性の直径約１０μｍの微粒子と多く
の１μｍ未満の直径の微粒子を含んだ。反応混合物４は非−凝集性の直径約１０μｍから
２５μｍの微粒子、および１μｍ未満の直径の微粒子をいくらか含んだ。
＜実験法＞
２連の６本の反応試験管に、１．０ｍｌのウシ血清アルブミン−ＦＩＴＣ溶液（１％の
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１０μｌの透析したフルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）アルブミンを含む）を入れた。０．５ｍｌ、１．０ｍｌ、２．０ｍｌ、
３．０ｍｌ、４．０ｍｌまたは５．０ｍｌのポリマー混合物（８．０％のＰＶＰ（ＭＷ９
０，０００）および２０％のＰＥＧ（ＭＷ３３５０）を含む、ｐＨ５．０）をＡの一連の
各試験管にボルテックス混合しながら加えた。０．５ｍｌ、１．０ｍｌ、２．０ｍｌ、３
．０ｍｌ、４．０ｍｌまたは５．０ｍｌのポリマー混合物（２０％のＰＶＰ（ＭＷ４０，
０００）および２０％のＰＥＧ（ＭＷ３３５０）を含む、ｐＨ５．０）をＢの一連の各試
験管にボルテックス混合しながら加えた。
【０１７７】
反応混合物を室温で３０分間静置し、そして次に試験管を３７−４０℃で３０分間、水
浴中に置き、次に試験管を５６−６０℃の水浴中で３０分間移した。２ｍｌの１０％エタ
ノールを加え、そして室温で３０分間、３０００ｒｐｍで遠心した。上清を吸引し、そし
て微粒子を２．０ｍｌの１０％エタノールに再懸濁した。再度１５分間遠心し、２．０ｍ
ｌの脱イオン水に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査した。
＜結果＞
＜Ａ連（８．０％ ＰＶＰ／２０％ ＰＥＧ）＞
０．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は最も均一で、１から３μｍ
の間の範囲の直径を有した。小さなクラスターが観察された。直径が約２５μｍの幾つか
の大きい微粒子が見つかった。
【０１７８】
１．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１から１０μｍの間の範囲の直径を有した。上記より
も少ないクラスターが観察された。大きな微粒子は見られなかった。
【０１７９】
２．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から１５μｍの間の範囲の直径を有した。極め
て少ないクラスターが観察された。大きな微粒子は見られなかった。
【０１８０】
３．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から２０μｍの間の範囲の直径を有した。極め
て少ないクラスターが観察された。大きな微粒子は見られなかった。
【０１８１】
４．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から２５μｍの間の範囲の直径を有した。クラ
スターおよび大きな微粒子は見られなかった。
【０１８２】
５．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から３０μｍの間の範囲の直径を有した。クラ
スターおよび大きな微粒子は見られなかった。
＜Ｂ連（２０％ ＰＶＰ／２０％ ＰＥＧ）＞
０．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は小さい凝集状態で、それぞれ
が１μｍ未満の直径の１０から２０個の間の微粒子を含んだ。直径が約５から２０μｍの
間の幾つかの大きい微粒子が観察された。
【０１８３】
１．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は小さい凝集状態で、それぞれ
が１μｍ未満の直径の１０から２０個の間の微粒子を含んだ。直径が約５から５０μｍの
間の幾つかの大きい微粒子がよく観察された。
【０１８４】
２．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は大きい凝集状態で、直径がサ
ブミクロンの微粒子を含んだ。直径が約１から１０μｍの間の幾つかの微粒子が観察され
た。
【０１８５】
３．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は大きい、および小さい凝集状
態であった。時折、個々の直径が約５μｍの微粒子が観察された。
【０１８６】
４．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は小さい凝集状態であり、それ
ぞれが０．５ｍｌのポリマー混合物を使用したときに観察されたものよりも小さい直径の
１０−２０個の微粒子を含んだ。個々の微粒子は観察されなかった。
【０１８７】
５．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、大変小さい微粒子を含んだ
小さいものと大きな凝集物の状態であった。個立した微粒子は観察されなかった。
＜実験法＞
７本の反応試験管に１．０ｍｌのウシ血清アルブミン−ＦＩＴＣ溶液を入れた。０．５
ｍｌ、０．７５ｍｌ、１．０ｍｌ、１．２５ｍｌ、１．５ｍｌ、１．７５ｍｌまたは２．
０ｍｌのポリマー混合物（２０％のＰＶＰ（ＭＷ４０，０００）および２０％のＰＥＧ（
ＭＷ３３５０）を０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に含む）を各試験管にボルテ
ックス混合しながら加えた。 反応混合物を室温で３０分間静置し、そして次に試験管
を３７−４０℃で３０分間、水浴中に置き、次に試験管を５６−６０℃の水浴中で３０分
間移した。２ｍｌの１０％エタノールを加え、そして２０℃で３０分間、３０００ｒｐｍ
で遠心した。上清を吸引し、そして微粒子を２．０ｍｌの１０％エタノールに再懸濁した
。再度１５分間遠心し、２．０ｍｌの脱イオン水に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査し
た。
＜結果＞
０．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、直径が１μｍ未満の小さい
微粒子の小さな凝集物（凝集物あたり１０−２０個の間）の状態であった。時折、大きな
単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観察された。
【０１８８】
０．７５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、凝集物あたり約１−１０
個の間の小さい凝集物の状態であった。時折、大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍ
の間）が観察された。
【０１８９】
１．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、３７−４０℃でのインキュ
ーベーション中に大きな粘着性凝集物を形成した。凝集物は凝集物あたり約１−５個の間
の微粒子を含んでいた。時折、より大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観
察された。
【０１９０】
１．２５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、５６−６０℃でのインキ
ューベーション中に凝集物を形成した。凝集物は凝集物あたり約１−５個の間の微粒子を
含んだ。時折、より大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観察された。
【０１９１】
１．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、５６−６０℃でのインキュ
ーベーション中に凝集物を形成した。凝集物は凝集物あたり約１−５個の間の微粒子を含
んだ。幾つかのより大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観察された。
【０１９２】
１．７５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、５６−６０℃でのインキ
ューベーション中に凝集物を形成した。サイズが小さいので、凝集物中に微粒子が存在す
るのかどうかを測定できなかった。幾つかのより大きな単一の微粒子（直径が１−１０μ
ｍの間）が観察された。
【０１９３】
２．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、凝集物あたり１０−１００
個の微粒子を形成した。直径が１μｍの幾つかの単一微粒子が観察された。
【０１９４】
この実施例ではアルブミン微粒子が、アルブミンおよびＰＶＰ／ＰＥＧ混合物を３７−
６０℃の温度で約３０分間インキューベーションすることにより調製できることを実証し
た。微粒子のサイズおよび凝集形成の程度はアルブミンに加えたＰＶＰ／ＰＥＧポリマー
混合物の組成または容量を変化させることにより変更できた。
【０１９５】
本発明のさらなる別の態様を以下に列挙する。
１．脱水剤が中性塩、グリシン、可溶性直鎖または分枝ポリマー、金属イオン、有機カチ
オン、小アニオンおよびポリアニオンから成る群から選択される化合物である、脱水剤に
近接して位置する架橋結合した高分子を含んで成る微粒子組成物。
２．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルス、ウイルス粒子、医薬品
およびその混合物から成る群から選択される、上記態様１記載の微粒子組成物。
３．タンパク質が免疫グロブリン、抗原および細胞レセプターから成る群から選択される
、上記態様２記載の微粒子組成物。
４．さらに治療用分子を含んで成る上記態様１記載の微粒子組成物。
５．治療用分子が化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、免疫抑制物質、サイ
トカイン、ホルモン、酵素およびその混合物から成る群から選択される、上記態様１記載
の微粒子組成物。
６．さらに磁気物質を含んで成る上記態様１記載の微粒子組成物。
７．高分子が検出できるラベルで標識されている上記態様１記載の微粒子組成物。
８．検出できるラベルが蛍光色素、化学発光ラベル、磁気粒子、酵素、酵素基質および放
射性ラベルから成る群から選択される、上記態様７記載の微粒子組成物。
９．微粒子がインビトロおよびインビボで安定である上記態様１記載の微粒子組成物。
１０．脱水剤がポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよびその混合物から成
る群から選択される可溶性の直鎖ポリマーである、上記態様１記載の微粒子組成物。
１１．高分子が、ジアルデヒド、アミン、多価イオン、架橋結合された高分子上の特別な
反応基に親和性を有する多官能性分子、Ｎ−置換マレイミド、二官能性アルキルハライド
、アリールハライド、イソシアネート、脂肪族または芳香族ジカルボン酸、脂肪族または
芳香族ジスルホン酸、二官能性イミドエステルおよびビニルスルホンから成る群から選択
される化合物で架橋結合されている上記態様１記載の微粒子組成物。
１２．微粒子の作成法であって、
ａ）高分子を脱水剤と、予め定めた温度で粒子が形成するに十分な量の時間インキューベ
ーションし、
ｂ）インキューベーション混合物から粒子を分離する、
工程を含んで成る上記方法。
１３．インキューベーション温度が室温よりも高い上記態様１記載の方法。
１４．インキューベーション温度が３７℃以上で、かつ８０℃以下である上記態様１２記
載の方法。
１５．インキューベーション混合物が５分から２４時間の間インキューベーションされる
上記態様１２記載の方法。
１６．工程ａ）のインキューベーション混合物がさらに架橋剤を含んで成る上記態様１２
記載の方法。
１７．インキューベーション温度が室温以下である上記態様１６記載の方法。
１８．さらにクエンチング剤を含む緩衝液で粒子を洗浄する工程を含んで成る上記態様１
６記載の方法。
１９．インキューベーション工程がｐＨ５から８の間で行われる上記態様１２記載の方法
。
２０．脱水剤が中性塩、グリシン、水溶性有機溶媒、可溶性直鎖または分枝ポリマー、金
属イオン、有機カチオン、小アニオンおよびポリアニオンから成る群から選択される化合
物である請求の範囲第１２項記載の方法。
２１．脱水剤がポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよびその混合物から成
る群から選択される可溶性の直鎖ポリマーである、上記態様１２記載の方法。
２２．脱水剤が分子量約４０，０００のポリビニルピロリドンおよび分子量約３５００の
ポリエチレングリコールの混合物である、上記態様１２記載の方法。
２３．架橋剤がジアルデヒド、アミン、多価イオン、架橋結合された高分子上の特別な反
応基に親和性を有する多官能性分子、Ｎ−置換マレイミド、二官能性アルキルハライド、
アリールハライド、イソシアネート、脂肪族または芳香族ジカルボン酸、脂肪族または芳
香族ジスルホン酸、二官能性イミドエステルおよびビニルスルホンから成る群から選択さ
れる上記態様１６記載の方法。
２４．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルス、ウイルス粒子、医薬
品およびその混合物から成る群から選択される、上記態様１２記載の方法。
２５．標的分子を該分子を含む複雑な混合物から単離する方法であって、
ａ）複雑な混合物を、標的分子に親和性を有する高分子微粒子と標的分子が高分子に結合
するのに十分な時間混合し、
ここで微粒子は脱水剤に近接して架橋結合された液相中の高分子
を含んでなる、そして
ｂ）結合した標的分子を複雑な混合物から分離する、
工程を含んで成る、上記方法。
２６．微粒子が固定されている請求の範囲第２５項記載の方法。
２７．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルス、ウイルス粒子、医薬
品およびその混合物から成る群から選択される、上記態様２５記載の方法。
２８．標的分子がタンパク質、炭水化物、核酸分子、ウイルスおよび細胞から成る群から
選択される、上記態様２５記載の方法。
２９．治療薬を患者に送達する方法であって、患者に脱水剤に近接して架橋結合された高
分子を含んで成る微粒子組成物を治療的に有効な量を投与することを含んで成り、ここで
高分子が治療薬を含んで成る上記方法。
３０．治療薬が化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、免疫抑制物質、サイト
カイン、ホルモン、酵素およびその混合物から成る群から選択される、上記態様２９記載
の方法。
３１．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルスおよびウイルス粒子、
医薬品およびその混合物から成る群から選択される、上記態様２９記載の方法。
３２．患者の標的組織を検出する方法であって、
ａ）患者に脱水剤に近接して架橋結合された高分子を含んで成る微粒子組成物を有効量で
投与し、
ここで高分子は検出できる造影剤で標識された標的組織に特異的
な親和性分子を含んでなるものであり、そして
ｂ）検出できる造影剤を検出する、
工程を含んで成る、上記方法。
３３．検出できる造影剤が蛍光色素、化学発光ラベル、磁気粒子、酵素、酵素基質および
放射性ラベルから成る群から選択される、上記態様３１記載の方法。
３４．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルスおよびウイルス粒子お
よびその混合物から成る群から選択される、上記態様３２記載の方法。
３５．試料中の標的生体分子を検出する方法であって、
ａ）脱水剤に近接して架橋結合された高分子を含んで成る微粒子組成物を試料と混合し、
ここで高分子は検出できる造影剤で標識された標的生体分子に特異的な親和性分子を
含んでなる、そして
ｂ）検出でき造影剤を検出する、
工程を含んで成る、上記方法。
３６．検出できる造影剤が蛍光色素、化学発光ラベル、磁気粒子、酵素、酵素基質および
放射性ラベルから成る群から選択される、上記態様３５記載の方法。
３７．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルスおよびウイルス粒子お
よびその混合物から成る群から選択される、上記態様３５記載の方法。
３８．ａ）中性塩、グリシン、可溶性直鎖または分枝ポリマー、金属イオン、有機カチオ
ン、小アニオンおよびポリアニオンから成る群から選択される脱水剤、および
ｂ）ジアルデヒド、アミン、多価イオン、架橋結合された高分子上の特別な反応基に親和
性を有する多官能性分子、Ｎ−置換から成る群から選択される架橋剤、
を含んで成る微粒子を調製するためのキット。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】抗−発癌性胎芽抗原微粒子濃度に対する１分間あたりの結合放射性発癌性胎芽抗原の計数（カウント）を表すグラフである。
【図２】破傷風トキソイド粒子の一次および二次投与で免疫化した後の週に対する抗体価を表すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学分野に関し、より詳細には診断、治療および研究のために使用する微粒
子の作成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において集合的に「微粒子」と呼ぶ微粒子、微小球およびマイクロカプセルは
１ミリメートルよりも小さい、より好ましくは１００ミクロンよりも小さい直径を持つ固
体粒子であり、合成ポリマー、タンパク質および多糖をはじめとする様々な物質で形成す
ることができる。微粒子は多くの様々な応用、主に分離、診断およびドラッグデリバリー
に使用されて来た。
【０００３】
分離技術において使用される微粒子の最も良く知られている例は、ポリアクリルアミド
、ハイドロキシアパタイドまたはアガロースのような合成またはタンパク質起源の合成さ
れたポリマーから形成されたものであり、その微粒子は分子量および／またはイオン電荷
に基づき、または微粒子に化学的に結合した分子との相互作用に基づいてタンパク質など
の分子を分離するために使用されている。
【０００４】
診断分野では微粒子は、酵素、酵素に対する基質または標識抗体の固定に役立つような
微粒子の状態で使用されることが最も多く、そしてこれは次に検出されるべき分子と直接
的または間接的に相互作用する。
【０００５】
制御されたドラッグデリバリー分野では、引き続き放出されるように、微粒子は微粒子
中にカプセル化される分子と混合状態にある。これらの微粒子を合成ポリマー、天然ポリ
マー、タンパク質および多糖から作成するための多くの様々な技術（相分離法、溶媒蒸発
法、乳化法および噴霧乾燥法を含む）が日常的に使用されている。
【０００６】
微粒子は例えば硫酸アンモニウムでの沈殿のような一定の沈殿法で分離技術の副産物と
しても作成できる。しかしこれらの場合、沈殿物は遠心および／または濾過により回収さ
れ、そして圧し縮められ、次いで沈殿剤（塩）を塩で沈殿した分子から分離するために溶
媒に再溶解される。したがって、微粒子は不安定であり、かつ中間生成物として機能する
だけで、それ自体が最終生成物ではない。
【０００７】
球状ビーズまたは粒子は長い間、生化学者に道具として市販されてきた。例えばしばし
ば抗体をビーズに結合させ、特定のリガンドに特異的な比較的大きな粒子が作成されてい
る。大きな抗体−被覆粒子は、細胞活性化のためにレセプターを細胞表面上に架橋結合す
るために日常的に使用され、そして免疫親和性精製法のために固体相に固定されるか、あ
るいは遠位部位に長時間にわたってゆっくり放出される治療薬を送達するために、所望部
位に薬剤を標的とするための粒子に結合した組織または腫瘍−特異的抗体が使用されてい
る。
【０００８】
抗体を固体相マトリックスに共有結合するための最も普通の方法は、ビーズを化学結合
剤で活性化し、次に抗体を活性化ビーズに結合させることにある。タンパク質分子よりも
合成ポリマービーズを使用するほうが、タンパク質が耐え得るよりも多くのより苛酷な活
性化条件を使用することができる。これは比較的安価で、かつ広範な変性条件に対して安
定な結合を生じることが多い。あらゆる多種多様な構成物およびサイズの数多くの活性化
ビーズが市販されている。ポリアクリルアミド、ポリアクリル性、ポリスチレンおよびラ
テックスのような合成ポリマーから形成されたビーズは、カリフォルニア州、リッチモン
ドのバイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および
スウェーデン、ストックホルムのＬＫＢプロダクター（ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）の
ような数多くの会社から市販されている。天然高分子および粒子から形成されたアガロー
ス、架橋アガロース、グロブリン、デオキシリボ核酸およびリポソームのようなものは、
カリフォルニア州、リッチモンドのバイオラッドラボラトリーズ、ニューヨーク州、ピス
カタウェイのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＩＢＦ（仏国）から市販されて
いる。ポリアクリルアミドおよびアガロースのコポリマーから形成されたビーズはＩＢＦ
およびファルマシアのような会社から購入できる。磁気ビーズはニューヨーク州、グレイ
トネックのダイナル社（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．）から入手できる。
【０００９】
広範な材料および応用は、新規微粒子の作成法および使用法の開発について絶え間のな
い必要性が存在することを示しており、特にただ１つの応用というよりは分離、診断およ
びドラッグデリバリー分野での使用に適することができる微粒子の作成法および使用法の
開発が望まれている。
【発明の開示】
【００１０】
したがって本発明の目的は安定な微粒子、および比較的簡単で、迅速かつ安価な微粒子
の作成法を提供することである。
【００１１】
さらに本発明の目的は標的分子に高い親和性および特異性を持つ微粒子を提供すること
である。
【００１２】
さらに本発明の目的はインビボに投与したとき吸収されない微粒子を提供することであ
る。
【００１３】
さらに本発明の目的は分離技術、特にアフィニティクロマトグラフィーに使用する微粒
子を提供することである。
【００１４】
さらに本発明の目的は、標的−特異的ドラッグデリバリーおよび組織病理学的あるいは
インビボにおける組織または腫瘍の画像化のようなは医薬および診断に応用するために使
用する微粒子を提供することである。
【００１５】
微粒子、その作成法および使用法は、タンパク質、炭水化物、多糖、核酸、ウイスル、
ウイスル粒子、有機または無機合成医薬化合物、あるいはそれらのいずれかの混合物のよ
うな高分子を「脱水」し、そして高分子微粒子を加熱状態でインキューベーションするか
、または液相で高分子を「架橋することにより形成する」方法に基づいて提供される。高
分子は、効果的に全部脱水するが液相中に溶解または懸濁されたとき、高分子の「ポケッ
ト」を形成する試薬を使用して脱水され、それは例えばアンモニアまたはナトリウム塩、
有機溶媒、高濃度の直鎖または分枝ポリマー、亜鉛のような二価イオンまたはカオトロピ
ック試薬のような試薬と共に脱水することによる。高分子は薬剤、生物学的に活性な分子
、キャリアー分子、親和性分子またはその混合物から成ることができる。微粒子は予め定
めた時間の長さ、室温よりも高い温度で脱水した高分子をインキューベーションすること
により形成される。あるいはグルタルアルデヒドまたは他のアミン類、多価イオンのよう
な薬剤、ならびに架橋される高分子の反応性基に特異的な「親和性」を持つ多官能性分子
を使用して、様々な温度で高分子を架橋させて微粒子を形成する。
【００１６】
微粒子を次に、もしあるならば脱水剤および過剰な架橋剤から濾過または遠心のような
分離法で分離する。その後、微粒子が標的分子と反応したときにいずれかの非−特異的結
合を効果的に減少するために、次に架橋剤のすべての未反応部位に結合するクエンチング
試薬で微粒子を洗浄することができる。これらの微粒子は広範な分離、診断、治療および
研究目的に使用できる。本発明によれは、特定の態様の発明として、以下のものが提供さ
れる。
【００１７】
１．ａ）高分子を、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属もしくは
アンモニウムもしくはマグネシウムのハロゲン塩、グリシン、水溶性有機溶媒、水溶性直
鎖または分枝ポリマー、二価のイオン、ポリアニオン、カオトロピック剤およびそれらの
混合物からなる群から選択される脱水剤と微粒子が形成するに十分な時間インキューベー
ションする工程、および
ｂ）インキューベーション混合物から微粒子を分離する工程、を含んで成り、かつ、高分
子が、脱水剤とインキューベーションされる間またはインキューベーションの前後に架橋
剤により架橋される、ことを特徴とする微粒子の作成方法。
【００１８】
２．ａ）高分子を、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属もしくは
アンモニウムもしくはマグネシウムのハロゲン塩、グリシン、水溶性有機溶媒、水溶性直
鎖または分枝ポリマー、二価のイオン、ポリアニオン、カオトロピック剤およびそれらの
混合物からなる群から選択される脱水剤と微粒子が形成するのに十分な時間インキューベ
ーションし、そして
ｂ）インキューベーション混合物から微粒子を分離し、ここで、高分子が、脱水剤とイン
キューベーションされる間またはインキューベーションの前後に架橋剤により架橋される
工程、
ｃ）微粒子を、標的分子を含有する複合混合物と該微粒子が該標的分子に結合するのに十
分な時間混合する工程であって、ここで、微粒子は標的分子に親和性を有するものである
、工程、および
ｄ）結合した標的分子を複合混合物から分離する工程、
を含むことを特徴とする標的分子を含有する複合混合物から標的分子の単離方法。
【００１９】
３．ａ）微粒子と試料を組み合わせる工程であって、ここで、微粒子が、硫酸塩、亜硫
酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属もしくはアンモニウムもしくはマグネシウム
のハロゲン化物塩、グリシン、水溶性有機溶媒、水溶性直鎖または分枝ポリマー、二価の
イオン、ポリアニオン、カオトロピック剤およびそれらの混合物からなる群から選択され
る脱水剤と、高分子を微粒子が形成するのに十分な時間インキューベーションすることに
より調製され、かつ、高分子が脱水剤とインキューベーションされる間またはインキュー
ベーションの前後に架橋剤により架橋されており、かつ、高分子が標的生体分子に特異的
な親和性分子を含んでなり、そして検出可能な造影剤で標識されているものである、工程
、および
ｂ）検出可能な造影剤を検出する工程、
を含むことを特徴とする試料中の標的分子の検出方法。
【００２０】
以下に記載する特定例では、微粒子は（１）後にグルタルアルデヒドにより架橋される
ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールを含む高濃度直鎖ポリマー混合物で
脱水された抗体のようなタンパク質、（２）ポリビニルピロリドンおよびポリエチレング
リコールを含む高濃度直鎖ポリマー混合物で脱水され、そしてポリアミノ酸のような多価
イオンまたは二価カチオンで架橋された生物学的に活性な分子と混合したアルギン酸塩の
ような多糖、（３）アンモニアまたは硫酸ナトリウムを用いてタンパク質混合物を脱水し
た後、グルタルアルデヒドで架橋される、医薬化合物のためのキャリアーであるアルブミ
ンのようなタンパク質、（４）ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールの混
合物で脱水した後、グルタルアルデヒドで架橋したインスリンのようなペプチドホルモン
、（５）ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールを含む直鎖ポリマー混合物
で脱水し、そして加熱下でインキューベーションしたアルブミンのようなタンパク質、で
形成される。
［発明を実施するため具体的な態様］
微粒子、調製法およびキットを診断、治療および研究使用のために提供する。微粒子は
大きな表面積を有する架橋結合された高分子構造物である。微粒子を形成する高分子には
限定するわけではないが、タンパク質、炭水化物、多糖、核酸、ウイルス、ウイルス粒子
、有機または無機合成医薬化合物またはそれらの混合物であり、これらを脱水条件下の液
相中で架橋結合することができる。
＜ポリマー性微粒子の形成＞
微粒子は粒子が形成するために十分量の架橋剤または加熱時間で、高分子を脱水剤が存
在する溶液中で、あるいは液相中でインキューベーションすることにより形成される。高
分子を始めに水性溶媒中に溶解し、次に高分子溶液を脱水剤に加えるか、あるいは脱水剤
を高分子溶液に加えるかのいずれか、好ましくは後者である。微粒子を形成するために、
脱水された高分子溶液を次に好ましくは予め定めた時間の長さで加熱する。あるいは微粒
子を形成するために、架橋剤を脱水高分子溶液に室温の前後または室温のような様々な温
度で加える。生成した微粒子を、次にインキューベーション混合物中に存在する未反応成
分から当該技術分野で周知な物理的分離法により分離する。
＜高分子＞
微粒子を形成する高分子は液相で架橋することができる任意の分子である。最も好まし
くは、高分子はタンパク質、炭水化物、多糖、核酸、ウイルス、ウイルス粒子またはそれ
らの混合物である。高分子は架橋することができる天然または合成の医薬化合物でもよい
。当業者は架橋することができない化合物は、本明細書にて提供される方法により続いて
架橋されるキャリアー分子中に化合物を取り込んだ微粒子を形成することができることを
理解するだろう。さらに当業者は高分子も、例えばペプチド、二本鎖の核酸分子の一本鎖
区分またはウイルス粒子のようなリガンドと結合または相互作用するのに必要な活性を有
する分子の一部であることができると理解するだろう。また当業者は、「高分子」という
用語は複数の高分子を含み、そして例えば医薬化合物と、医薬化合物を治療が必要な組織
、器官または腫瘍へ標的化するための親和性分子との組み合わせなどのような各種高分子
の組み合わせ物を含むことも理解するだろう。
【００２１】
さらに当業者は、親和性分子はレセプター−リガンド相互作用のレセプター部分または
リガンド部分のいずれかであることができると理解するだろう。他の生体分子と反応する
リガンドの例には、抗原として作用し、動物に投与された時に免疫応答を引き起こし、そ
して抗体の生産を引き起こすウイルス、細菌、多糖またはトキシンが挙げられる。
【００２２】
インキューベーション混合物中の高分子の濃度は、インキューベーション条件に応じて
、好ましくは０．１から１００ｍｇ／ｍＬの間である。
＜標識化高分子＞
高分子を検出しうるラベルで標識することができる。タンパク質および核酸分子を標識
する様々な種類の標識またはラベルおよび方法が当該技術分野で周知である。当業者は、
例えば金属のような磁気性物質または磁気粒子はラベルという用語の定義内に含まれると
理解するだろう。例えば高分子を金属のような金属性物質で標識して、微粒子を磁気性デ
バイスにより溶液中の他の物質から分離できるようにすることができる。
【００２３】
他の具体的なラベルまたはレポーター群を以下に説明する。
【００２４】
例えば、限定するわけではないがラベルは、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ
または１３１Ｉのような放射性標識であることができる。３２Ｐ標識は連結試薬でタンパ
ク質に結合、あるいはニックトランスレーション、末端−標識化または標識ヌクレオチド
の取り込みにより核酸分子の配列中に取り込むことができる。例えば３Ｈ、１４Ｃ、また
は３５Ｓ標識を標識された前駆体の取り込み、または化学修飾により核酸配列中に取り込
むことができ、一方１２５Ｉまたは１３１Ｉラベルは一般的に化学修飾により核酸配列中
に取り込むことができる。ラベルの検出はシンチレーションカウンティング、ガンマ線ス
ペクトロメトリーまたはオートラジオグラフィーのような方法により行われ得る。
【００２５】
ラベルはマスまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）標識、例えば１３Ｃ、１５Ｎまたは１９Ｏの
ようなものであってもよい。そのようなラベルの検出はマススペクトロメトリーまたはＮ
ＭＲにより行われ得る。
【００２６】
色素、化学発光剤および蛍光源も高分子を標識するために使用できる。核酸を標識する
のに有用な色素の例はエチジウムブロミド、アクチジン、プロピジウムおよび他のインタ
ーカレーション剤、ならびに４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰ
Ｉ）（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）、または他の適当な核酸染色剤である
。蛍光源の例には、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシア
ニン、フィコシアニン、ローダミン、テキサス レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）または他
の適当な蛍光源が挙げられる。蛍光源は一般的に化学修飾により結合される。色素ラベル
は分光光度計により検出でき、そして蛍光源は蛍光検出機により検出できる。
【００２７】
また、高分子は提供する酵素に対する色原体（酵素基質）、酵素またはアフィニティー
標識、あるいは酵素で標識することもできる。例えば高分子をビオチニル化して、酵素ま
たは蛍光源のようなラベルにカップルしていてもよいビオチン−アビジン反応に使用する
ことができる。高分子はペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または基質が添加
された時に発色反応または蛍光反応を与える他の酵素で標識することができる。
【００２８】
例えば、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（Ｌｕｍｉｎｏｌ
：商標として知られている）（シグマ化学者、セントルイス、モンタナ州）のような添加
剤、およびｐ−ヒドロキシビフェニル（ｐ−フェニルフェノールとして知られている）（
シグマ化学者、セントルイス、モンタナ州）のような速度エンハンサーを、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼのような酵素を発光反応を介して増幅するために使用でき、ならびに酵素
基質の発光性または蛍光性ジオキセタン誘導体も使用できる。
【００２９】
検出しうるラベルを提供するために、核酸分子の制限酵素部位のような酵素の認識部位
も高分子中に取り込むこともできる。ラベルは任意の修飾塩基、アミノ酸または任意のラ
ベルを含む前駆体を取り込むことによっても作成でき、修飾塩基または化学基を含有する
アミノ酸の取り込みは特異的抗体により、または免疫蛍光または免疫−酵素反応を含む様
々な手段による任意の結合抗体複合体を検出することにより認識できる。そのようなラベ
ルは抗体−結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用することにより、または分光光度計で
色の変化を検出することにより検出できる。
＜脱水剤＞
脱水剤は水を高分子から高イオン性媒質に拡散させることができる化合物または化合
物の混合物である。適当な脱水剤には、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、ある
いはアルカリ金属、アンモニウムまたはマグネシウムのハロゲン塩のような天然の塩；グ
リシン；エタノールのような水溶性有機溶媒；高分子量の水溶性非イオン性直鎖または分
枝ポリマー；亜鉛のような金属イオン；乳酸２−エトキシ−６，９−ジアミノ−アクリジ
ンのような有機カチオン；小さいアニオン；ならびにポリリン酸およびポリアクリル酸の
ようなポリアニオンがある。
【００３０】
好ましくは、脱水剤はポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールのような２
種以上の溶解性の直鎖ポリマー混合物である。そのようなポリマー混合物は、Ｊａｍｅｓ
Ｅ．Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏにより１９９２年１月７日に出願された同時係属中の出願で
ある米国特許出願第０７／８１７，６１０号明細書およびＪａｍｅｓ Ｅ．Ｗｏｉｓｚｗ
ｉｌｌｏにより１９９３年１月７日に出願された国際特許出願第ＵＳ９３−０００７３号
明細書に示された方法により調製することができ、これらは引用により本明細書に編入さ
れる。当業者は他の可溶性の直鎖ポリマー、例えばデキストラン、ノニルフェノール−エ
トキシレート、ポリビニルアルコールおよびそれらの混合物をポリビニルピドリドン（Ｐ
ＶＰ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に加えて、あるいはＰＶＰまたはＰＥＧ
の代わりに使用できるものと理解するであろう。
【００３１】
ＰＶＰは非−イオン性の親水性ポリマーであり、分子量範囲がおよそ１０，０００から
７００，０００の範囲であり、そして化学式（Ｃ６Ｈ９ＮＯ）ｎを有する。ＰＶＰはまた
ポリ［１−（２−オキソ−ピロリジニル）エチレン］、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ（商標）、Ｐｏ
ｌｙｖｉｄｏｎｅ（商標）、ＲＰ １４３（商標）、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（商標）、Ｐｅｒ
ｅｇａｌ ＳＴ（商標）、Ｐｅｒｉｓｔｏｎ（商標）、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（商標）、Ｐｌ
ａｓｍｏｓａｎ（商標）、Ｐｒｏｔａｇｅｎｔ（商標）、ＳｕｂｔｏｓａｎおよびＶｉｎ
ｉｓｉｌ（商標）としても知られている。ＰＶＰは無毒性で、高度に吸湿性であり、そし
て容易に水または有機溶媒に溶解する。
【００３２】
ＰＥＧはポリ（オキシエチレン）グリコールとしても知られており、エチレンオキシド
と水との縮合ポリマーであり、化学式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨを有する。
【００３３】
デキストランはシュクロース基質上で生育する細菌により生産される多糖に適用する用
語である。ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびラクトバクテリア デキストラニカム（Ｌａｃｔｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）のような細菌により生産される天然のデキストランは
通常、高い分子量を有する。
【００３４】
ノニルフェノール−エトキシレート（ＮＰＥ）は、しばしば界面活性剤として使用され
る長鎖化合物の種類である。これらは通常、必要な所望の溶解度に適合するように誘導さ
れる。
【００３５】
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）はポリビニル酢酸から、アセチル基をヒドロキシル基
に換えることにより調製され、式（ＣＨ２ＣＨＯＨ）ｎを有するポリマーである。ほとん
どのポリビニルアルコールが水溶性である。
【００３６】
ＰＥＧ、デキストラン、ＰＶＡおよびＰＶＰはシグマ化学社（セントルイス、モンタナ
州）等の化学会社から市販されている。ＮＰＥにはカスタム合成が必要であり、特定の化
学製造元に注文できる。
【００３７】
最も好ましいのは、脱水剤が分子量１０，０００から３６０，０００の間のＰＶＰの水
溶液を含むポリマー混合物であり、最も好ましいのは４０，０００、および２００から３
５，０００の分子量を持つＰＥＧである。４０，０００の分子量を持つＰＶＰおよび３５
００の分子量を持つＰＥＧが好ましい。あるいは均一サイズの微粒子を得るためには３６
０，０００の分子量を持つＰＶＰが好ましい。好ましくはＰＶＰを酢酸緩衝液に溶解し、
そしてＰＥＧをＰＶＰ水溶液に加える。各々のポリマー濃度は各ポリマーの分子量に応じ
て、好ましくは１から４０ｇ／１００ｍｌの間である。最も好ましくは各ポリマー濃度は
２４ｇ／１００ｍｌ、すなわち２４％である。一般的に等濃度のＰＶＰおよびＰＥＧが、
ポリマー性微粒子の形成に最適なポリマーマトリックスを提供する。高分子に添加するポ
リマーの容量は、高分子のサイズおよび量に依存する。好ましくは３容量のポリマー混合
物が１容量の高分子を含む溶液に加えられる。
＜加熱を利用するインキューベーション条件＞
微粒子は高分子および脱水剤混合物を室温よりも高い温度で予め定めた時間インキュー
ベーションすることにより形成される。好ましくは混合物を水浴中で３７℃以上で、かつ
８０℃以下の温度で約５分から２時間インキューベーションする。最も好ましくは混合物
を５０℃から７０℃の温度で１５−３０分間インキューベーションする。
【００３８】
微粒子のサイズはインキューベーション条件を調整することにより制御できる。例えば
、インキューベーション温度を室温から所望温度に次第に高くするか、または一定増分ず
つ高くするか、あるいは全体のインキューベーション時間を長くすることができる。さら
に、微粒子の凝集の量は脱水剤の濃度、容量または組成を変化させることにより制御でき
る。
＜架橋剤＞
また、微粒子は脱水した高分子を架橋結合させるために架橋剤を加えて形成される。架
橋剤は高分子を物理的に連結するニ官能性または多官能性化学試薬であり、そして場合に
よっては脱水剤を連結することもある。適当な架橋剤の例には、ジアルデヒドまたはアミ
ン類、多価イオンおよび架橋される高分子上の特定の反応性基に「親和性」を有する多官
能性分子のような他の試薬がある。
【００３９】
好適な態様では、架橋剤は共有的に高分子を安定な三−次元構造に連結する。最も好ま
しくは架橋剤はグルタルアルデヒド；ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェ
ニルスルフォン；ヘキサメチレンジイソシアネート；ｎ，ｎ’−（１，３−フェニレン）
−ビス−マレイミド；ｎ，ｎ’−エチレン−ビス−ヨードアセトアミド；３，６−ビス−
（メクリメチル）−ジオキサン；ビス−ジアゾベンジジン；ウッドワードのＫ；ビス−オ
キシラン；ジメチルアジピミデート；ジメチルスベリミデート；ジエチルマロニミデート
；フェノール−２，４−ジスルホニル−クロリド；ジビニルスルフォン；およびカルボジ
イミドのような二官能性試薬である。
【００４０】
最も好ましくは、架橋剤は第一アミンとシッフ塩基を形成するグルタルアルデヒドのよ
うなジアルデヒドであり、緩和な条件下でこれは水素化ホウ素で還元した時、安定な二級
アミンを与える。
【００４１】
別の種類の架橋剤は緩和な条件下でスルフヒドリル基に特異的なＮ−置換マレイミドで
ある。数種のＮ−アリルおよびＮ−アルキル−ビス−マレイミドが市販されており、それ
にはアゾフェニルジマレイミドも含まれる。これらは水に不溶性であり、一般的に固体で
化学量論的量をｐＨが７−８の反応物水溶液に加える。
【００４２】
二官能性ハロゲン化アルキルは主にチオール、イミダゾールおよびアミノ基と反応する
。中性からわずかにアルカリ性のｐＨで、スルフヒドリル基との反応は優先するが、より
高ｐＨ値ではアミノ基との反応が優先する。他の化合物には１，５−ジフルオロ−２，４
−ジニトロベンゼンのようなハロゲン化アリール（アリールハロゲン化物）があり、これ
は水に不溶性であり、そしてアミノ基およびチロシンフェノール性基と優先的に反応する
が、スルフヒドリルおよびイミダゾール基とも反応するだろう。迅速な反応には比較的高
いｐＨ値が必要である。一般的に試薬は濃厚アセトン溶液として反応物の水溶液に加えら
れ、生成物が形成する。イソシアネートはアミンと反応して置換ウレアを形成し、アルコ
ールと反応してウレタンを形成し、そして水と反応してアミンおよび二酸化炭素を形成す
る。アルカリｐＨではアミンとの反応が好ましい。２，２−ジカルボキシ−４，４’−ア
ゾフェニルジイソシアネートは水溶性であり、形成する橋が亜ジチオン酸塩によるアゾ基
の還元により容易に開裂するので有利である。緩和な条件下で活性化されて反応できる二
官能性アシル化剤を提供する多くの脂肪族または芳香族ジカルボン酸またはジスルホン酸
のようなアシル化剤も使用できる。ジカルボン酸のニトロフェニルエステルおよび芳香族
−ビス−スルフォニルクロライドがその例である。 これらは水に不溶性であり、そして
素早く加水分解する。ビス−スルホニルクロライドはアミノ基と反応し、安定なスルホン
アミド結合を形成し、そしてこれは続いて氷酢酸中のＨＢｒで開裂することができる。水
溶性で、かつ緩和な条件下でアミノ基と高い特異性で反応する二官能性のイミドエステル
も使用できる。ジメチルスベリミデートは０．２Ｍ トリエタノールアミンＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ ８．５）中で、室温にて３時間使用できる。生成するアミドは酸加水分解に対し
て安定であるが、アンモニアにより開裂しうる。主にアミノ基と反応するが、高いｐＨで
は炭水化物、フェノールおよびアルコールと反応するビニルスルフォンも使用できる。
【００４３】
インキューベーション混合物中の架橋剤濃度は高分子のすべての活性基を結合するため
に十分でなくてはならない。架橋剤濃度とインキューベーション後に形成された微粒子の
数との間には直接的な関係がある。一般的にインキューベーション混合物中の架橋剤濃度
が増すほど形成される微粒子が増す。好ましくはインキューベーション混合物中の架橋剤
の濃度は、インキューベーション混合物１ミリリットル当り約５から２００マイクロリッ
トルの２５％グルタルアルデヒド溶液である。
＜架橋するためのインキューベーション条件＞
微粒子を形成するために、アンモニウムまたはナトリウム塩、有機溶媒、亜鉛のような
二価イオンまたはカオトロピック剤のようなポリマー溶液以外の脱水剤を使用するときは
、微粒子を形成するための正しい架橋剤の組み合わせを注意深く選択しなければならない
。なぜならば脱水剤と架橋剤との間に相互作用が起こることがあるからである。微粒子は
硫酸アンモニウム、グルタルアルデヒドおよびタンパク質を使用して形成されるが、反応
物濃度は直鎖ポリマーを使用して形成される微粒子に必要であるものとは異なる。
【００４４】
好ましくは脱水剤がポリマー溶液であり、ここで高分子、ポリマーおよび架橋剤混合物
はボルテックスなどで一緒に激しく混合され、高分子、ポリマーおよび架橋剤の間で十分
な相互反応がおこり、そしてインキューベーションされるが、一方室温（２０℃）または
室温未満の温度で十分な時間混合すると、最高の微粒子の形成が可能になる。あるいは微
粒子は架橋剤および加熱の組み合わせを使用して形成することができ、好ましくは３７℃
以上、かつ８０℃以下の温度でインキューベーションすることによる。
【００４５】
インキューベーション時間の長さはポリマーおよび親和性分子それぞれの濃度ならびに
インキューベーション温度に依存する。好ましくはポリマー混合物および高分子は３０分
から２４時間の間でインキューベーションされる。最も好ましくはポリマー混合物および
高分子は撹拌または揺することにより１２０分間、室温で混合され、次に混合せずに４℃
で一晩静置する。
【００４６】
インキューベーション混合物のｐＨは一般的に脱水剤のｐＨにより決められ、そして適
当量の酸性または塩基性緩衝液のいずれかを、脱水剤または高分子溶液のいずれかまたは
両方に、混合前に加えることにより調整できる。脱水剤が直鎖ポリマー溶液である場合、
インキューベーション工程の最後に形成される微粒子のサイズとインキューベーション混
合物のｐＨとの間には直接的な関係がある。より高いｐＨ（より塩基性）では、より大き
な微粒子が形成する。より低いｐＨでは形成される微粒子はより小さい。直鎖ポリマーイ
ンキューベーション混合物のｐＨは好ましくは約５から８の間である。
＜結合性部位のクエンチング＞
当業者は後の非特異的結合を減らすために、架橋剤の任意の未反応結合性部位をブロッ
クするために、インキューベーション後に生成した微粒子にクエンチング（停止）剤を加
えることができると考えるだろう。脱水剤がＰＶＰ／ＰＥＧのような直鎖ポリマー溶液で
ある場合には、適当なクエンチング剤はアミノ酸またはアルブミンのような化合物であり
、これらは相当数のアミノ基を含有する。好ましくはクエンチング剤はリシンまたはグリ
シンを含む溶液である。最も好ましくはクエンチング剤はアミノ酸グリシンであり、その
濃度は０．１から０．５Ｍの範囲である。
＜微粒子の精製＞
生成した微粒子をインキューベーション混合物中の未反応成分から、当該技術分野で周
知の通常の分離法により分離する。好ましくはインキューベーション混合物を微粒子が遠
心管の底に落ちるように遠心し、そして未反応成分は上清に残り、これを次にデカントす
る。あるいは生成した微粒子を含むインキューベーション混合物を、微粒子がフィルター
に残り、そして未反応成分がフィルターを通過するように濾過する。
【００４７】
さらに微粒子の精製は適当量の洗浄溶液で洗浄することにより行われる。好適な洗浄溶
液は緩衝液、最も好ましくはクエンチング剤を含むリン酸緩衝塩溶液である。洗浄は必要
に応じて繰り返すことができる。
【００４８】
当業者は脱水剤の中には高分子構造中に取り込まれ、そして実際に各微粒子の分子組成
の一要素となるものがあるものと理解するだろう。
＜微粒子の特性＞
前述の方法で生成した微粒子は、温度、ポリマーサイズおよび混合物、ならびにタンパ
ク質濃度に応じて１つ以上の活性部位が各微粒子の表面に存在する球状または非球状の形
状であることができる。長円形および顆粒状の微粒子は、球状の微粒子ビーズよりもより
大きな表面積を持つ粒子を作り、そして従来の球状ビーズで達成されるよりも微粒子あた
り、より多くの数の高分子の取り込みを可能にする。
【００４９】
さらにＰＶＰ／ＰＥＧの存在中でグルタルアルデヒドにより架橋結合した免疫グロブリ
ンのような高分子で形成された微粒子の例では、微粒子はアルカリおよび酸性ｐＨで安定
であり、インビボに投与されたときに吸収されない。
【００５０】
微粒子は以下にさらに詳しく説明する多種多様な診断、治療および研究を目的に有用で
ある。例えばインビボ診断目的に関しては、微粒子は検出しうるラベルで標識された免疫
グロブリンまたは細胞レセプターのような高分子を含むことができる。標識された微粒子
を患者に注入すると、癌のような増殖性の疾患を診断するための造影剤となり、または特
定の悪性細胞または生物の増殖を減らすための治療薬の達成度を評価する道具となる。イ
ンビトロの診断では、検査条件下で細胞または生物に特異的な免疫グロブリン、細胞レセ
プターまたはオリゴヌクレオチドプローブのような高分子を含む微粒子を試験試料と混合
し、任意の未反応成分から微粒子を分離し、そして結合した分子を従来法により検出する
。徐放性または治療が必要な部位に薬剤を標的送達するために、微粒子が治療薬を含有し
、そして患者に投与されたとき、微粒子は治療薬としても有用である。
【００５１】
微粒子は特定分子を検出または定量するための試薬として、あるいは抗体のような分子
の産生のために、分子を複雑な混合物から精製するためにも有用である。例えば免疫グロ
ブリンのような高分子を含む微粒子をクロマトグラフィーカラムに結合して、免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーの状態で使用して、複雑な混合物からリガンドを分離するこ
とができる。あるいは標識された高分子または様々な細胞もしくは生体分子に特異的な標
識化高分子（例えば細胞レセプターのような）の混合物を含む微粒子を、フローサイトメ
トリーのような技術を使用して特定の試験条件で反応する細胞または生体分子の数の変化
を検出するために使用できる。さらに微粒子はワクチン生産のアジュバントとしても使用
でき、ここでは抗原含有微粒子をマウスまたはウサギのような実験動物に注射して、抗原
に対する抗体を生産するために強化された免疫応答を開始させる。
＜インビトロ 診断＞
＜インビトロ アッセイ＞
本明細書に記載された微粒子はアッセイ（酵素−結合免疫吸着体アッセイ、ドット−ブ
ロットまたはウエスタンブロットのような）における固体相粒子として、生物試料中の特
定の標的（細胞、生体分子または薬剤のような）を検出するために有用である。この使用
のために設計された微粒子は標的分子に特異的な親和性分子を含む。例えば高分子が免疫
グロブリンであり、細胞レセプターまたはオリゴヌクレオチドプローブであり、そして高
分子が試験管またはマイクロタイタープレートに結合している。
【００５２】
目的の標的分子の検出または定量のためには、試料を微粒子を含む溶液と混合し、微粒
子上の高分子が標的分子と反応し、微粒子を試料中の任意の未反応成分から分離し、そし
て結合した分子を含む微粒子を従来法で検出する。蛍光的に染色した微粒子は、当該技術
分野で周知のフローサイトメトリー分析に良く適している。
＜組織病理学＞
本明細書に記載された微粒子は組織学的試料中の病理学上の視覚的プローブまたはマー
カーとして有用である。この使用に設計された微粒子の高分子は特定の病理状態に現れる
生体分子に特異的であり、検出できるラベルで標識される。例えば高分子は免疫グロブリ
ン、細胞レセプターまたはオリゴヌクレオチドプローブであり、これらは急速に増殖する
細胞のような異常な細胞または病原体（例えばウイルス）に特異的である。
【００５３】
病理状態を検出するために、組織学的試料を微粒子を含む溶液と混合し、微粒子上の標
識高分子が目的の標的分子と反応し、そして結合した微粒子を当該技術分野で周知の方法
でラベルを検出することにより検出する。
＜インビボ診断−画像化＞
本明細書に記載された微粒子は上記の組織病理学用の微粒子の使用について記載された
ものと同様に、特定分子、細胞のタイプまたは病理状態のインビボでの位置に関する造影
剤として有用である。この使用のために設計された微粒子上の高分子は、特定の細胞また
は病原生物により発現されている分子に特異的であり、そして検出できるラベルで標識さ
れる。例えば、高分子は免疫グロブリン、細胞レセプターまたはオリゴヌクレオチドプロ
ーブであり、これらは腫瘍細胞またはウイスルのような病原体に特異的である。
【００５４】
微粒子は病理状態を検出するために、あるいは化学療法もしくは異常な組織腫瘍の大き
さが減少したか、または完全に切除されたかを確認する外科的治療の経過をモニターする
ために使用される。この使用のために、患者は微粒子溶液の投与を好ましくは静脈を介し
て受け、微粒子上の標識された高分子は体内の悪化した器官または部位に局在化するよう
に十分な量および時間で与えられ、高分子は検査条件下で細胞または器官により発現され
た標的分子と反応し、そして結合した微粒子はｘ−線のような当該技術分野で周知の従来
の画像化によりラベルを検出することにより検出される。
＜治療−ドラッグデリバリーシステム＞
微粒子は架橋結合医薬品化合物または架橋結合キャリアー（アルブミンのような）含有
治療剤から成るとき、治療に有用である。微粒子は薬剤を全身に徐放して提供するか、あ
るいは微粒子は標的組織、腫瘍に特異的な親和性分子を含むこができ、そして治療薬（抗
腫瘍、抗ウイルス、抗菌、抗寄生虫または抗関節炎剤、あるいはサイトカイン、ホルモン
もしくはインスリンのような）の標的送達のような治療が必要な部位に直接患者に注射す
るかのいずれかで提供できる。
＜研究への応用＞
微粒子は複雑な混合物から生体分子を精製するために研究の道具として、生体分子を検
出または定量するための試薬として、または抗体のような生体分子の生産のためにも有用
である。
【００５５】
例えば、免疫グロブリンのような高分子から成る微粒子はクロマトグラフィーカラムに
結合させて、複雑な混合物からリガンドを分離するための免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーに使用できる。当業者は高圧液体クロマトグラフィーに使用するための微粒子は
、始めに非−圧縮性固相球またはビーズに結合され、カラムのパッキング操作でその構造
が圧力下で強固になると理解するだろう。
【００５６】
あるいは種々の細胞または細胞レセプターに特異的な標識した高分子または標識した高
分子の混合物を含む微粒子は、フローサイトメトリーのような技術を使用する特定の試験
条件に応答して細胞数または細胞表面レセプター数の変化を検出するために使用される。
【００５７】
さらに微粒子は抗体産生のための有用なアジュバントであり、ここではワクチン生産の
ために抗原−含有微粒子がマウスまたはウサギのような実験動物に注射されるか、あるい
は抗原に対する免疫を誘導するためにヒトに注射され、そして抗原に対する抗体産生を強
化させる。
＜微粒子を調製するためのキット＞
微粒子を調製するためのキットを提供する。キットは以下の試薬を含む：脱水剤および
架橋剤。キットの使用者はカスタム微粒子の調製用キットとして使用することができ、こ
こでは使用者が微粒子中に形成される高分子を供給することになるだろう。あるいはキッ
トは使用者が目的とする微粒子の調製用に１つ以上の高分子を溶液状または凍結乾燥状で
含むことができる。形成された微粒子は次に研究、治療または診断を目的として上記のよ
うに使用できる。キットは好ましくはリン緩衝塩溶液のような緩衝液も含み、架橋剤によ
る非特異的結合をブロックするためのグリシンのようなクエンチング剤を含む。キットは
試料または患者の微粒子の存在を検出するための手段を提供するために検出しうるラベル
、またはあらかじめ標識した高分子も含むことができる。
【００５８】
ポリマー性微粒子および上記の方法は以下の限定することを意図するものではない実施
例によりさらに理解されるだろう。
【実施例１】
【００５９】
ガンマグロブリンならびにポリビニルピロリドンおよびポリエレングリコールのポリマー
混合物での微粒子の調製ならびにその安定性の分析
＜微粒子の形成＞
微粒子をガンマグロブリン、５つのうちの１つの分子量調製物（ＭＷ １０，０００−
３６０，０００）の５−２５％ポリビニルピロリドン溶液、および一定分子量（ＭＷ ３
，５００）調製物の２５％ポリエチレングリコール溶液（両方とも以下の実施例２に記載
されたように調製した）を、グルタルアルデヒドの存在下で、６．９から７．７５の間の
反応ｐＨ範囲で、以下の工程で混合することにより形成した。微粒子は酸性および塩基性
溶液中で安定であった。
【００６０】
各々異なる分子量調製物のポリビニルピロリドンを含む５種のポリマー混合物を、以下
の表１に示すように調製した。２０マイクロリットルのグルタルアルデヒド（２５％、シ
グマ化学社、セントルイス、モンタナ州）を各ポリマー混合物に加えた。Ｊａｍｅｓ Ｅ
．Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌにより１９９２年１月７日に出願された同時係属中の米国特許出願
第０７ ８１７，６１０号明細書およびＪａｍｅｓ Ｅ．Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌ１ｏにより
１９９３年１月７日に出願された国際特許出願第ＵＳ９３−０００７３号明細書に記載さ
れた方法（これらは引用により本明細書に編入される）により精製された１ミリリットル
の精製ヤギガンマグロブリン（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）を、各々５種
類のポリマー混合物とボルテックス混合して簡単に反応させた。反応溶液を４０分間、２
０℃で混合し、そして４℃で一晩インキューベーションした。
【００６１】
すべての５種の反応溶液を２０℃に保存し、１００μｌのＤＬ−リシン（シグマ化学社
、セントルイス、モンタナ州）を各々の溶液に加え、溶液を２０℃で９０分間混合した。
【００６２】
この溶液を５０００ｒｐｍで３０分間、２０℃で遠心した。上清をデカントし、そして
沈殿を０．２％ Ｔｗｅｅｎ（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）を含む１．０
ｍｌのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を含む１ｍｌの緩衝液に再懸濁した。
【００６３】
１００マイクロリットルの各再沈殿物を１００μｌの１：２０００に希釈した抗−ヤギ
ＩｇＧペルオキシダーゼ結合物と２０℃で１５分間反応させた。１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅ
ｅｎ緩衝液を各反応混合物に加え、そして混合物を４℃で一晩インキューベーションした
。
【００６４】
試料を遠心し、１００μｌの各上清をそれぞれから取り出し、そして３００μｌのＴＭ
Ｂｌｕｅと反応させた。残りの上清を注意深くデカントし、沈殿を１ｍｌのＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ溶液に再懸濁した。
【００６５】
再懸濁した試料を再度遠心し、そして１００μｌを取り出し、そして３００μｌのＴＭ
Ｂｌｕｅと反応させ、上清をデカントし、そして沈殿を１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに
再懸濁した。再懸濁沈殿物の１００μｌのアリコートを３００μｌのＴＭ Ｂｌｕｅと反
応させた。
【００６６】
再懸濁試料を再度遠心し、１００μｌを取り出し、そして３００μｌのＴＭ Ｂｌｕｅ
と反応させ、上清をデカントし、そして沈殿を１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに再懸濁した
。再懸濁沈殿物の１００μｌのアリコートを３００μｌのＴＭ Ｂｌｕｅと反応させた。
結果を以下の表１および２に表す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
表１に示される結果は、グルタルアルデヒドの存在下で異なる分子量のＰＶＰ調製物を
含むすべての５種類の溶液について、微粒子が形成されたことを示す。
【００７０】
表２に示される結果は、ガンマグロブリンが３回洗浄した後でも沈殿物中に存在する微
粒子に結合したことを示す。
＜微粒子安定性分析＞
微粒子の安定性に対する酸性または塩基性溶液の影響を分析するために、３種の反応を
反応＃３の第一再懸濁沈殿物について以下のように行った。
【００７１】
１００マイクロリットルの反応＃３の第一再懸濁沈殿物を３本の試験管に入れた。２０
０マイクロリットルの脱イオン水を第一試験管に加えた。粒子が観察された。２００マイ
クロリットルの１Ｎ 酢酸を第二試験管に加えた。第一試験管で観察されたものと同じサ
イズの粒子が観察された。２００マイクロリットルの１％ ＮａＯＨを第三試験管に加え
た。第一試験管で観察されたものと同じサイズの粒子が観察された。
【００７２】
３本のすべての試験管を４℃にて一晩静置し、そして翌日観察した。試験管１および２
は変わらなかった。試験管３は試験管１または２よりも小さい粒子を有した。結果では酸
性または塩基性ｐＨでは粒子の安定性を変化しないことが示された。
【実施例２】
【００７３】
放射性 ＣＥＡ対する抗−ＣＥＡ微粒子の調製およびその結合性のインビトロ分析
抗−ＣＥＡ（がん胎児性抗原）微粒子は一般的に実施例１の反応＃３について記載した
ように形成し、そしてより詳細には以下に記載した。形成した微粒子を次に種々の濃度の
放射性ＣＥＡと混合し、抗−ＣＥＡ抗体がＣＥＡリガンドに親和性を保持したまま微粒子
中に取り込まれたかどうかを測定した。
抗−ＣＥＡ微粒子の調製
１４．３％の各ポリマー溶液、ポリビニルピロリドン（ＭＷ ４０，０００）およびポ
リエチレングリコール（ＭＷ３５００）（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州から
得た）は、１４．３グラムのポリマーを１００ｍｌの蒸留水に加えて調製した。１４．３
％の各ポリマー溶液のｐＨはおよそ６．２５に調整した。このポリマー溶液を１：１で混
合し、ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物を作成した。
【００７４】
対照として、ポリマー混合物をグルタルアルデヒドが存在しないガンマグロブリン中に
加えながら、０．４５ｍｌの精製ヤギ抗−ＣＥＡガンマグロブリンのアリコートを、３．
６ｍｌのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物とボルテックスで反応させた。反応物を３℃で３
０分間静置した。反応物を２３００ｒｐｍで６０分間、２０℃で遠心した。上清をデカン
トし、そして沈殿物を０．９ｍｌのリン酸塩溶液に再懸濁した。
【００７５】
再懸濁した沈殿物を１．８ｍｌのポリマー混合物で洗浄し、予めｐＨを６．２５に調整
し、３℃で２０分間静置し、そして２０℃にて５０００ｒｐｍで３０分間遠心した。 ポ
リマー混合物／グルタルアルデヒドをガンマグロブリン中に加えながら、０．９ｍｌの精
製ヤギ抗−ＣＥＡガンマグロブリンを２ｍｌのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物、ｐＨ６．
２５（２０μｌのグルタルアルデヒドを含有する）とボルテックスで混合することにより
反応させた。反応物を２０℃で９０分間混合した。反応物を２３００ｒｐｍで６０分間、
２０℃で遠心した。上清をデカントし、そして沈殿物を１ｍｌのリン酸塩緩衝液中に再懸
濁した。８０マイクロリットルのＤＬ−リシンを、再懸濁沈殿物に加え、そして混合した
。反応物を４℃にて一晩静置した。
【００７６】
反応物を５０００ｒｐｍで３０分間、２０℃にて遠心した。試料を４℃で６０時間静置
し、そして次に再度遠心した。上清は透明になり、そしてデカントした。抗−ＣＥＡ微粒
子を含む沈殿物を１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（１Ｘ）に再懸濁した。
＜結合性分析＞
放射性ＣＥＡ（Ｉ１２５）を１０％の液体魚ゼラチンを含有するリン酸塩緩衝液で希釈
した。希釈したＩ１２５ＣＥＡは１００μｌあたり３９３１３カウントを含有した。
【００７７】
各々１００μｌの希釈Ｉ１２５ＣＥＡを含む１０本の反応試験管を、以下の表３に示す
ように適当容量再懸濁抗−ＣＥＡ微粒子を加えて準備した。
【００７８】
試験管１−５の中の放射性ＣＥＡ／抗−ＣＥＡ微粒子混合物を、２時間震盪しながら冷
蔵庫でインキューベーションした。試験管６−９中の放射性ＣＥＡ／抗−ＣＥＡ微粒子混
合物を１５分間、室温で震盪しながらインキューベーションした。反応物を３回、１０％
の液体魚ゼラチンを含有するリン酸塩緩衝液で洗浄し、１分間高速遠心機で遠心し、そし
てリン酸塩緩衝液に再懸濁した。結果は抗−ＣＥＡ微粒子が免疫学的に活性であり、そし
て表３に数字で、そして図１にグラフで示すようにＣＥＡと反応することを示す。
【００７９】
【表３】
【実施例３】
【００８０】
微粒子形成に対するｐＨの影響
この実験ではＩｇＧ微粒子形成能力に対するｐＨの影響を実証した。
【００８１】
＜実験法＞
ＰＶＰ／ＰＥＧのポリマー混合物を一般的に実施例２（４８％の全ポリマー）に記載し
たように調製し、そしてｐＨを表４に示すように調整した。１ミリリットルの各溶液を各
々７本の遠心管に入れた。
【００８２】
【表４】
【００８３】
脱イオン水中の１００μｌの５．０％グルタルアルデヒド（シグマ化学社、セントルイ
ス、モンタナ州）を各試験管に加え、そしてよく混合した。
【００８４】
ヒト血漿から精製したヒトＩｇＧの３００μｌの３Ｘ濃厚試料ｃｆを、上記実施例２に
記載したようにボルテックスで混合した。混合物を２０℃で１時間混合し、そして物質を
３８００ＲＰＭで３０分間、２０℃にて遠心した。上清をデカントし、そして粒子を５ｍ
ｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝液中）で洗浄し、次に６０分間、２０℃にて
混合し、そして３８００ＲＰＭで３０分間、２０℃で遠心した。上清をデカントし、そし
て粒子を５ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ中）で洗浄した。
＜観察＞
精製ＩｇＧを試験管に加え、そして２０分間混合した後、凝集サイズの傾向を観察した
。ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨが上昇すると、形成する凝集物のサイズも大きくなった。
＜第一沈殿物＞
ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨが上昇すると、沈殿物は小さくなり、より湿っており、そ
してオレンジ色になった。これらの特徴のこのような注目すべき変化はｐＨ６．６で起こ
った。
【００８５】
試験管＃７は沈殿物が試験管の壁に付着しないように大変注意深く処理しなければなら
なかった。９０％の上清を注意深く使い捨てピペットで取り出した。
＜第一再懸濁液＞
ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨと形成した粒子サイズの間には直接的な関係がある。ｐＨ
が上昇すると粒子サイズは大きくなった。ｐＨ６．６で粒子はｐＨ５．８よりも顕著に大
きかった。
＜第二沈殿物＞
ｐＨ６．６以上で、沈殿物は試験管の壁に付着せず、そして極めて容易に試験管の壁か
ら落ちた。ｐＨが上昇すると沈殿物は黄色からオレンジ色になった。
＜第二再懸濁液＞
第一再懸濁液と同一。
【００８６】
粒子を室温にし、よく混合し、そして次に２６００ＲＰＭで２０℃にて３０分間遠心し
た。上清をデカントし、そして沈殿物を５．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ
緩衝液、ｐＨ５．６中）に再懸濁した。洗浄工程は次に３回以上、上清が透明になるまで
繰り返した。
＜結論＞
ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨが９．２から４．６に下がると、グルタルアルデヒドの架
橋結合作用により形成した粒子のサイズはより小さくなり、そしてサイズがより均一にな
った。
【実施例４】
【００８７】
酵素−標識されたアルブミン微粒子の調製
１．６０ミリグラムの鶏卵アルブミンを、実施例２に記載したように調製した２ｍｌのＰ
ＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物に溶解した。ｐＨを４．５に１Ｎ ＨＣｌで調整した。２０
０μｌのカッペル（Ｃａｐｐｅｌｌ）アフィニティー精製ウサギ抗−ヤギＩｇＧ西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合物を加えた。
２．混合物を３０分間、回転させた。
３．１０％のグルタルアルデヒド溶液を１：４に希釈し、そして２００μｌを混合物に加
えた。
４．混合物を３０分間、回転させた。
５．混合物を１５００ｒｐｍで３０分間、２０℃にて遠心し、そして上清を取り出した。
６．沈殿物をグリシン緩衝液に再懸濁し、そして１５００ｒｐｍで１０分間、２０℃にて
２回遠心することにより洗浄した。
７．沈殿物を１％魚ゼラチを含む０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ塩、ｐＨ７．４、２ｍｌ全容量、
に再懸濁し、そして粒子を含有した。
＜分析＞
１．４滴のＨＲＰ基質を２つのガラス試験管に加えた。
２．工程７の４滴の再懸濁沈殿物を１つの試験管に加え混合した。
３．工程５の４滴の上清を別のガラス試験管に加え、そして混合した。
＜結果＞
１．工程５からの上清を含む試験管は透明だった（無色）。
２．工程７からの再懸濁沈殿物を含む試験管はマリンブルー色で、５分間以内で粒子がＨ
ＲＰにより標識されていることを示した。
【実施例５】
【００８８】
抗−ＨＣＧポリマー微粒子のインビボ投与
蛍光標識した抗−ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（抗−ＨＣＧ）微粒子をＢａｌｂ／ｃマウ
スに注射し、そしてクリアランスを検査した：
体重が３５ｇのメスのマウスにフェノバルビタールを５分間注射した。腹腔を外科的に
露出し、そして２７ １／２ ゲージ針を使用して大動脈に蛍光標識した抗−ＨＣＧを注
入した。
【００８９】
５分後、５０μｌの血液を採血した。
【００９０】
１０分後、５０μｌの血液を採血した。
【００９１】
動物は採血時に強く心臓が鼓動しながら依然として生存していた。
【００９２】
次にマウスを頸部転位により屠殺した。
＜分析＞
１．１滴の血液（５分および１０分）を、試料用のくぼみを持つスライドガラスに沈殿さ
せ、そして試料をガラスカバースリップで覆った。１滴の油をスリップカバーに塗った。
２．血液試料を高出力を使用して蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＩＩＩＲＳ）で検査した。
３．強い蛍光が５分の細胞の回りに観察され、微粒子が動物にすぐには吸収されないこと
を示した。
４．弱い蛍光が１０分の試料に観察された。
【実施例６】
【００９３】
蛍光−標識されたヒトＩｇＧ微粒子の形成に対するポリマー混合物濃度の影響
この実験は抗体微粒子の形成に対するＰＶＰ／ＰＥＧポリマー濃度の影響を測定するた
めに行った。
＜方法＞
１容量のＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物を実施例２に記載したように調製し、５３．３％
濃度のポリマーを有するポリマー混合物を形成し、ｐＨを４．８に調整した。ポリマーの
希釈は０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を使用して以下の表５に説明するように作
成した：
【００９４】
【表５】
【００９５】
表５に説明した１ｍｌの各希釈の組を、遠心管に分けた。各試験管に１００μｌの５％グ
ルタルアルデヒド溶液（４００μｌの２５％グルタルアルデヒドを２．０ｍｌのＨ２Ｏに
加え、そして混合して調製した）を加えた。ポリマー混合物／グルタルアルデヒド溶液を
徹底的にボルテックス混合した。
【００９６】
試験管を次に３００μｌの蛍光標識ヒトＩｇＧと反応させた。精製したヒト抗体を０．
１Ｍ グリシン溶液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ１１．０中）中で３Ｘに濃縮し、そして蛍光イ
ソチオシアネート（０．１Ｍ グリシン緩衝液、濃度３ｍｇ／ｍｌ）で標識した。抗体を
ボルテックス混合しながらポリマー混合希釈物に加え、そして試験管を１時間混合し、続
いて３０分間、２５００ｒｐｍで２０℃にて遠心した。 遠心後、上清をデカントし、そ
して沈殿物を５ｍｌの０．５Ｍ グリシン（ＰＢＳ中）に再懸濁した。沈殿物を破壊し、
そしてよく振った。それらを次に３０分間、３０℃にて２５００ｒｐｍで遠心した。この
洗浄工程を４回繰り返した。
＜結果＞
各試験管には反応の開始から異なる外観が現れた。５．３％ポリマーを含有する試験管
はわずかに沈殿し、そのほとんどが試験管の壁に一緒に凝集していた。５３．３％ポリマ
ーを含有する試験管は一緒に粘着しない、または試験管の壁に付かないきわめて微細な粒
子を含んでいた。
【００９７】
全体的に、ポリマー濃度が増加すると沈殿物質はより微細になり、粘着性が低くなった
。酢酸ナトリウム対照中の固体反応物質は小さくかつ粘着性であった。
【００９８】
遠心後、沈殿物のサイズはポリマー濃度に直接比例して増大するように思われた。沈殿
物のオレンジ色の明るさはポリマー濃度に逆比例した。 対照沈殿物は試験管中のポリマ
ー濃度が低いので、大変小さくかつ明るいオレンジ色を表した。沈殿物を０．５Ｍ グリ
シン洗浄緩衝液中に分散する容易さもポリマー濃度に関連した。試験管に含まれる沈殿物
のうち、５．３％ポリマー混合物のみが粘着性で、かつ分散し難かったが、各連続的試験
管中の粒子は粘着性が低かった。３１．８％以上のポリマー濃度で、粒子は容易に別れた
。
【００９９】
最初の洗浄および遠心の後、色の明るさの勾配が沈殿物中に未だ存在したが、その差異
の程度はより小さかった。上清はフルオレッセインイソチオシアネートが試料から洗い出
されているので明るいオレンジ色であった。第３回の洗浄後、上清は透明であり、そして
沈殿物の色は均一であった。沈殿物間のサイズの差異は変化しなかった。
＜結論＞
ポリマー濃度は、ポリマー混合物で作成された抗体粒子の特性の決定に明らかな役割を
果たす。４０％以上のポリマー濃度では付着しない大変微細な粒子が生成する。またポリ
マー混合物中のポリマー濃度が高いほど、より多数の抗体分子を形成することができる。
【実施例７】
【０１００】
ガンマグロブリン微粒子の形成に対するｐＨの影響
この実験は抗体粒子の形成に対するポリマー混合物をｐＨの影響を決定するために行っ
た。
＜方法＞
８本の遠心管のそれぞれに１ｍｌのヤギ血清アリコートを入れた。血清を１５分間、１
．８％ Ｔｒｉｔｏｎ／３％Ｂｒｉｊ（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）溶液
と一緒にインキューベーションした。続いて２ｍｌの４０％ポリマー混合物と反応させた
。ポリマー混合物の添加はボルテックス混合しながら行い、そして試験管を３０分間混合
した。試験管を次に３０分間、３６００ｒｐｍ、２０℃で遠心した。上清をデカントし、
そして沈殿物を１ｍｌの０．５Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ベーカーケミカル社：Ｂａｋｅ
ｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に再懸濁した。すべての試料は容易に、そして透明に再
懸濁した。
【０１０１】
Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液中で１５分間インキューベーションした後、ボルテックス混合
しながら試料に１ｍｌのポリマー混合物を加えた。試験管を３０分間混合し、そして３０
分間、２０℃にて３６００ｒｐｍで遠心した。上清をデカントし、そして沈殿物は１ｍｌ
の脱イオン水中に容易に、かつ透明に再懸濁した。試料をｐＨ勾配をもつポリマー混合物
（ｐＨを塩酸で下方に調整し、そして３Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌで上方に調整した）と反応
させた。調整したｐＨ値を以下の表６に記する：
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
１ｍｌのｐＨを調整したポリマー混合物を各試験管に加え、続いて１０分間混合した。
混合後、各試験管に４０μｌの２５％グルタルアルデヒド（脱イオン水で１：１０に希釈
した）を加えた。再度、試験管を１０分間混合し、そして３０分間、２０℃にて３６００
ＲＰＭで遠心した。試験管をデカントし、そして粒子を１ｍｌ １ＸＰＢＳ中に再懸濁し
た。
＜結果＞
遠心後、試料はｐＨに関連して大きさおよび色の両方について明らかな勾配を表した。
１Ｘ ＰＢＳ中に再懸濁する前に、試料１、２および七中の沈殿は他の試験管中のものよ
りもわずかに小さかった。高アルカリ性ではポリマー混合物がタンパク質を沈殿させる能
力を阻害するので、ｐＨ９．３の試料中では外観上の沈殿がなかった。酸性ｐＨ値の試料
は白色で、勾配にそって黄色−オレンジ色が増加した。また、粒子サイズはｐＨに直接比
例し、試料１の粒子が大変細かかった。ｐＨが上昇するにつれて、粒子は大きく、そして
より凝集し易くなった。
＜結論＞
抗体粒子のサイズはポリマー混合物のｐＨを変化させることにより容易に制御できた。
高ｐＨで、グルタルアルデヒドはタンパク質のアミノ基と大変強い結合を形成し、塩基性
試料の黄色−オレンジ色および全体の粘着性の原因となった。しかし酸性ｐＨ値で、グル
タルアルデヒドの効果は低下した。粒子はそれでも形成することができるが、それらはは
るかに微細であり、塩基性ポリマー混合物で作成された粒子よりも凝集し易い傾向が弱く
なる。
【実施例８】
【０１０４】
ＩｇＧ微粒子の形成に対するグルタルアルデヒド濃度の効果
この実施例はグルタルアルデヒド量を上昇させてＩｇＧ微粒子形成に対する効果を示す
ために行った。
＜実験法＞
実施例２に記載した１．０ｍｌのポリマー混合物（４８％全ポリマー、ｐＨ４．８を含
む）を７本の遠心管に入れた。各試験管に表７に示す様々な容量のグルタルアルデヒドを
加えた。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
各試験管をよく混合し、そして３００μｌの精製ＩｇＧ ３Ｘ 濃度（０．１Ｍ グリ
シン、ｐＨ１１．２、緩衝液は２ｎｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣを含む）を各試験管に加えた。すべての試験管を２０℃にて１時間混合し、次に３６
００ＲＰＭで２０℃にて３０分間遠心した。
【０１０７】
上清をデカントし、そして粒子を５．０ｍｌ ０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝
液、ｐＨ７．０）中で洗浄した。２０℃で３０分間混合した。２６００ＲＰＭで２０℃に
て３０分間遠心した。この洗浄工程は２回以上繰り返した。
【０１０８】
粒子を４℃で５．０ｍｌ ０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０）中
で保存した。
＜観察＞
グルタルアルデヒドの量が増加すると、粒子数およびより濃いオレンジ色が増した。
【０１０９】
粒子を上清が透明になるまで繰り返して洗浄した。
【０１１０】
最後の遠心で、試験管の壁に完全に付着しないペレットが生成した。上清は使い捨てピ
ペットで注意深く取り出されなければならず、そして１．０ｍｌの緩衝液を残した。
＜結論＞
ポリマー混合物（４８％全ポリマー）に加えたグルタルアルデヒド量の増加と、形成し
た粒子量の増加の間には直接的な関係があった。グルタルアルデヒドの量（２５％水溶液
２μｌから２００μｌの間）は粒子サイズの上昇または減少に対して効果がないようだっ
た。
【実施例９】
【０１１１】
抗−ＨＣＧモノクローナル抗体微粒子のヨード化ＨＣＧへの結合の調製およびインビトロ
分析
この実験はＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物および種々の濃度のグルタルアルデヒドで、
ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）特異的モノクローナル抗体微粒子を形成し、そして
微粒子がＨＣＧ提示抗原に結合する能力を免疫アッセイで実証するために行った。
＜実験法＞
実施例２に記載した方法により調製した、一緒にプールしておいた２つの１ｍｌ精製Ｈ
ＣＧ抗体試料を解凍した。よく混合した。グルタルアルデヒドのより低比率溶液（２５％
水溶液から）を以下の表８に説明するように増加させながら作成した。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
１５０μｌのプールしておいたＨＣＧ試料を１００μｌのグルタルアルデヒドパーセン
ト溶液を含む試験管にボルテックス混合しながら加えた。室温で４５分間混合した。
【０１１４】
０．５ｍｌのポリマー混合物（４０％全ポリマー、ｐＨ６．６）を素早く各試験管に加
え、そして２０℃で３０分間混合した。３５００ＲＰＭで４℃にて３分間遠心した。上清
をデカントした。２ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．０）を各試験管
に加え、そして２０℃で３０分間混合した。３０００ＲＰＭで４℃にて３０分間遠心した
。上清をデカントし、そして粒子を２．０ｍｌ ０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ中）
に再懸濁した。よく、しかし簡単に混合した。３０００ＲＰＭで４℃にて３分間遠心した
。洗浄工程をもう１回繰り返した。４℃に一晩静置した。
【０１１５】
粒子を３０００／ＲＰＭで４℃にて１２分間遠心した。上清をデカントし、そして粒子
を２．０ｍｌ １Ｘ ＰＢＳ中に再懸濁した。
＜観察＞
粒子サイズの傾向に注目した。グルタルアルデヒドの量が減少すると、粒子数は減少し
たが、粒子のサイズは上昇した。試験管＃７（対照）に粒子は観察されなかった。
＜免疫アッセイ＞
上記のように調製した粒子を含む各試料５０μｌを６本の試験管の３組（Ａ、Ｂおよび
Ｃ）中に入れた（全部で１８本）。
【０１１６】
総カウント用に２５μｌのＨＣＧトレーサー（ヨード化ＨＣＧ抗原、ベクトンデッキン
ソン：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サン ジョーズ、カリフォルニア州）をＡ組
の試験管１−６、およびＨＣＧ抗体対照含有試験管に加えた。
【０１１７】
総カウント用に２５μｌの小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）トレーサー（ヨード化ＦＳＨ抗
原）をＢ組の試験管１−６、およびＦＳＨ抗体対照含有試験管に加えた。
【０１１８】
総カウント用に２５μｌのエストラジオールトレーサー（ヨード化エストラジオール抗
原）をＣ組の試験管１−６、およびエストラジオール抗体対照含有試験管に加えた。
【０１１９】
すべての試験管を簡単にボステックス混合し、そして６０分間、室温に静置した。２．
０ｍｌの脱イオン水を混合し、そして３０分間、３０００ＲＰＭで遠心した。試験管を静
かにデカントした（およそ１００マイクロリットルの残りの水を試験管に残した）。
【０１２０】
すべての試験管を１分間、シンチレーションカウンターで計数した。結果を以下の表９
に示す。
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
【表１０】
【０１２３】
＜結論＞
グルタルアルデヒド濃度が減少すると、より少ない抗−ＨＣＧモノクローナル抗体微粒
子が形成されたが、その粒子サイズはより大きかった。抗−ＨＣＧ微粒子はヨード化ＨＣ
Ｇ抗原と免疫アッセイで結合できる。抗−ＨＣＧ微粒子は、ＦＳＨおよびエストラジオー
ルのような他のヨード化抗原と免疫アッセイで非特異的に結合できない。
【実施例１０】
【０１２４】
破傷風トキソイド微粒子の調製
この実験はＰＶＰおよびＰＥＧポリマー混合物ならびにグルタルアルデヒドで破傷風ト
キソイド微粒子を調製するために行った。
＜実験法＞
１．０ｍｌの５４％ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物を遠心管に入れた。１００μｌのグ
ルタルアルデヒド（２５％水溶液）を１つの試験管に入れ、そして１０μｌのグルタルア
ルデヒドを別の試験管に入れて徹底的にボルテックス混合した。０．５ｍｌの破傷風トキ
ソイド（１．０ｍｇ／ｍｌ）（公衆衛生部）を両方の試験管に加え徹底的にボルテックス
混合した。
【０１２５】
室温で４時間１５分間混合した。４℃にて３０００ＲＰＭで３０分間遠心した。上清を
デカントし、そして粒子を２．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１ＸＰＢＳ緩衝液中＿）に
再懸濁した。４℃に一晩おいた。
【０１２６】
洗浄工程を２回以上繰り返した。粒子を最終的に０．５ｍｌの１ＸＰＢＳ緩衝液中に再
懸濁した。
＜観察＞
１００μｌのグルタルアルデヒドを含む反応は１０μｌのグルタルアルデヒドを含む反
応よりもより多い粒子を有した。両反応の粒子はサイズが同じであった。粒子は目で見た
ところ大変小さい。
【実施例１１】
【０１２７】
ウシ血清アルブミンポリマー微粒子の調製
この実験はＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物ならびにグルタルアルデヒドでウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）微粒子の形成を実証し、そしてこの方法で使用する様々な容量のグルタ
ルアルデヒドの効果を観察するために行った。
＜実験法＞
１１０ｍｇのＢＳＡを０．１Ｍ １１ｍｌのＴｒｉｓ（商標）塩基、ｐＨ９．０中に入
れた。１１ｍｇのＦＩＴＣを加え、ｐＨを塩基で９．５に調整し、そして２０℃で３０分
間混合し、蛍光標識ＢＳＡを生成した。
【０１２８】
各々１ｍｌのポリマー混合物（ｐＨ５．０、４８％全ポリマー）を含む８本の試験管を
用意し、以下の量のグルタルアルデヒド（２５％水溶液）を表１０に示すように加えた。
【０１２９】
【表１１】
【０１３０】
簡単に、しかし徹底的にボルテックス混合した。３００ｍｌのＢＳＡ−ＦＩＴＣ溶液を
加えた。７．５時間混合した。
＜結論＞
各試験管にウシ血清アルブミン微粒子が形成した。グルタルアルデヒドの量を減少させ
ると、より大きな凝集が形成し、さらに小さく細かな粒子がすべての容量のグルタルアル
デヒド（１μｌから２００μｌ）で見られた。また、グルタルアルデヒド量を増加すると
、小さい微粒子の数が増加した。
【実施例１２】
【０１３１】
脱水剤として飽和硫酸アンモニウムを使用する免疫グロブリン微粒子の調製
この実験はｐＨ勾配にわたって、飽和硫酸アンモニウムを脱水剤として、そしてグルタ
ルアルデヒドを架橋剤として使用して免疫グロブリン微粒子を調製するために行った。
＜実験法＞
１００ｍｌの飽和硫酸アンモニウム溶液は７６．１ｇの硫酸アンモニム（フィッシャー
科学社：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルべニア州）を１
００ｍｌの脱イオン水、ｐＨ５．２に入れて調製した。
【０１３２】
様々なｐＨの飽和硫酸アンモニウム溶液は、上記のように調製した溶液のアリコートを
低いｐＨの場合は氷酢酸で、そして高ｐＨ値の場合は２Ｎ 水酸化ナトリウムで調整し、
以下の表１１に示すように調製した。
【０１３３】
【表１２】
【０１３４】
各々の飽和硫酸アンモニウム溶液のアリコート０．３ｍｌを１５ｍｌの遠心管に入れた
。
【０１３５】
５０ｍｌのグルタルアルデヒド（２５％水溶液）を各試験管に加え、そしてよく混合し
た。
【０１３６】
０．３ｍｌのヒト血漿由来の精製ＩｇＧ試料（実施例２に記載したように精製した）を
各試験管に入れた。すべての試験管を次に約１５分間、室温で混合した。粒子は精製Ｉｇ
Ｇ試料を加えるとすぐに形成されるのが観察された。
【０１３７】
５．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０中）を各試験管に
加えた。試験管をよく混合し、そして２６００ＲＰＭで３０分間、２０℃にて遠心した。
【０１３８】
上清をデカントし、そして粒子を５．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ ＰＢＳ緩衝
液、ｐＨ７．０中）中で洗浄した。２０℃で３０分間混合し、そして２６００ＲＰＭで３
０分間、２０℃にて遠心した。この洗浄を３回以上繰り返した。
＜観察＞
精製ＩｇＧをグルタルアルデヒドを含む硫酸アンモニウム（飽和）溶液に加えた直後に
、試験管を混合すると粒子が見られた。
【０１３９】
飽和硫酸アンモニウム溶液のｐＨの上昇と、形成した粒子量の増加には直接的な関係が
見られた。
【０１４０】
粒子サイズは飽和硫酸アンモニウム溶液のｐＨ範囲間で変化しなかった。
【実施例１３】
【０１４１】
脱水剤として飽和硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールの混合物を使用する
免疫グロブリン微粒子の調製
この実験は脱水剤として飽和硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）混合物を、そして架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用して免疫グロブリン微粒子を
調製するために行った。
＜実験法＞
１００ｍｌ容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を実施例１２に記載したように調製した。
２０％のポリエチレングリコール（シグマ、セントルイス、モンタナ州）溶液（０．１Ｍ
酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中）も調製した。硫酸アンモニウム溶液を小増分で１０ｍ
ｌのＰＥＧ溶液に硫酸アンモニウムが沈殿するまで加えた。溶液中に存在した最大の硫酸
アンモニウム容量は１．２ｍｌであった。１ｍｌのこの硫酸アンモニウム／ＰＥＧ溶液を
８本の各試験管に小分けした。試験管に次に２５％グルタルアルデヒド（シグマ、セント
ルイス、モンタナ州）を、以下の表１２に特定する量で加えた。
【０１４２】
【表１３】
【０１４３】
試験管５−８は勾配にそって色反応の増加を示した。色の明るさは時間の経過によって
も増大した。これは硫酸アンモニウムのアミンと反応するグルタルアルデヒドの結果であ
った。試験管１−４は、これらの試験管中のグルタルアルデヒド濃度が大変低いので色が
変化しなかった。
【０１４４】
３倍濃縮した精製ブタＩｇＧ抗体の３００μｌアリコートをボルテックス混合しながら
各試験管に加えた。試験管を次に６０分間混合し、そして３６００ＲＰＭで２０℃にて３
０分間遠心した。
【０１４５】
上清をデカントし、そして１０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（シグマ、セントルイス、モ
ンタナ州）、ｐＨ７．０（リン酸塩緩衝液中）を各沈殿物に加えた。試験管を次によく震
盪し、沈殿物を分散させて４℃にて一晩保存した。
【０１４６】
翌朝、試験管を３０分間３６００ＲＰＭで２０℃にて遠心した。上清をデカントし、そ
して沈殿物を５ｍｌの０．５Ｍ グリシン緩衝液で洗浄した。よく震盪した後、試験管を
３０分間３６００ＲＰＭで２０℃にて遠心した。遠心後、上清をデカントし、そして沈殿
物に５ｍｌの０．５Ｍ グリシン緩衝液を加えた。試験管をよく震盪した。
＜結果＞
初めの遠心後、沈殿物はサイズおよび色が異なり、沈殿物はグルタルアルデヒド濃度が
増すとより大きく、そして暗くなった。沈殿物を分散させ、そしてよく混合した後、試験
管＃１（これはグルタルアルデヒドを加えていない）を除いてすべての試験管に粒子が現
れた。試験管２−７には均一サイズに見える微細な粒子が存在した。しかし、粒子は粘着
性であり、そしてすべての試験管中で凝集する傾向があった。試験管中の粒子量に比べて
凝集化の割合がより大きいのは２０μｌ未満のグルタルアルデヒドを加えた試験管であっ
た。これらの結果は最後の２回の洗浄でも一定していた。
【実施例１４】
【０１４７】
インスリン微粒子の調製
この実験はＰＶＰおよびＰＥＧのポリマー混合物ならびにグルタルアルデヒドを使用し
てインスリン微粒子を調製し、形成した微粒子の濃度を測定し、そしてそれらの免疫活性
をアッセイするために行った。
＜微粒子の調製＞
ウシ膵臓由来の３０ｍｇインスリン（シグマ、セントルイス、モンタナ州）を、３．０
ｍｌの３Ｍ ＨＣｌに加え、乾燥したインスリンを溶解した。ｐＨを８．４から９．０の
間に２５μｌの２Ｎ ＮａＯＨを加えて調整した。
【０１４８】
５４％ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物、ｐＨ５．０のアリコート１．０ｍｌを遠心管に
加えた。以下の量のグルタルアルデヒド（ＩＩ級、２５％水溶液、シグマ化学社、セント
ルイス、モンタナ州）を各試験管に加えた：試験管Ａに２５μｌのグルタルアルデヒド、
試験管Ｂに５０μｌのグルタルアルデヒド、試験管Ｃに１００μｌのグルタルアルデヒド
。
【０１４９】
１．０ｍｌの可溶化インスリンをボルテックス混合しながら各試験管に加えた。２０℃
で６−８時間混合し、そして一晩静置した。
【０１５０】
５．０ｍｌのリシン溶液、ｐＨ９．４（１０ｍｇリシン／ｍｌ脱イオン水中に１ｍｇ／
ｍｌ アジ化ナトリウムを含む）を使用して粒子を９回洗浄した。洗浄工程は５．０ｍｌ
のリシン溶液を粒子に加え、よく、しかし簡単に混合した。２３００ｒｐｍで、２０℃に
て３０分間遠心した。上清を吸引し、そして工程を繰り返した。粒子をリシン溶液中で一
晩、４℃にて保存した。
【０１５１】
粒子を遠心し、上清を吸引し、そして粒子を５．０ｍｌの１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７
．０に再懸濁した。各再懸濁物のｐＨは以下のとおり：試験管ＡはｐＨ９．２、試験管Ｂ
はｐＨ９．２、試験管ＣはｐＨ８．８。
【０１５２】
粒子を遠心し、上清を吸引し、そして粒子を５．０ｍｌの１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７
．０に再懸濁した。各再懸濁物のｐＨは以下のとおり：試験管ＡはｐＨ８．０、試験管Ｂ
はｐＨ７．４、試験管ＣはｐＨ７．２。
【０１５３】
粒子を遠心し、上清を吸引し、そして粒子を５．０ｍｌの１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７
．０に再懸濁した。各再懸濁物のｐＨは以下のとおり：試験管ＡはｐＨ７．４、試験管Ｂ
はｐＨ７．２、試験管ＣはｐＨ７．２。
＜結果＞
形成した粒子は大変小さく、そして細かかった。リシン溶液中で遠心中に、粒子は完全
に固くなることができなかった。リン酸塩緩衝液で洗浄した後、粒子はかなりの程度固く
なることができ、そして粒子の凝集も形成した。
【０１５４】
試験管Ｃは最大量の粒子を有した。試験管Ｂは試験管Ａよりも粒子が多かった。したが
って形成された粒子は各試験管に加えたグルタルアルデヒドの量で増大した。
＜ヒツジ抗−インスリンペルオキシダーゼアッセイ＞
インスリン微粒子の免疫活性は、微粒子が抗−ヒツジインスリンに結合できる能力をヒ
ツジ抗−インスリンペルオキシダーゼアッセイで測定することにより決定した。
【０１５５】
４本の各試験管を３連で準備した。上記各試験管Ａ、ＢおよびＣから以下の量のインス
リン粒子を、以下の表１３に示される各連続した適当な試験管中に入れた。
【０１５６】
適当量の１Ｘリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０を各試験管に加え、そして最終容量を１．０
ｍｌにした。すべての試験管をよく、しかし簡単に混合した。１００μｌのヒツジ抗−イ
ンスリンペルオキシダーゼ（バイオデザイン インターナショナル：Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ケンネバンクポート、メリーランド州、５ｍｇ／ｍｌタ
ンパク質）を加えた。よく混合した。試験管を室温で４時間１０分インキューベーション
した。試験管を４℃に一晩静置した。
【０１５７】
全連続のすべての試験管を３０００ｒｐｍで、２０℃にて３０分間遠心した。粒子が偶
然損失することがないように、約９０％だけの上清を注意深く取り出した。１．０ｍｌの
０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）表面活性剤（１Ｘリン酸緩衝塩溶液中）を吸引した試験管に
加え、そしてボルテックス混合した。１００μｌの各上清を０．５ｍｌの色原体 ＴＭ
Ｂｌｕｅ（商標）（テトラメチルベンジジン、ダイアグノスティク プロダクツセンター
：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ミルホード、マサ
チュセッツ州）と反応させた。すべての上清は陽性であった。この全洗浄工程を２回以上
繰り返し、すべての過剰な未反応ヒツジ抗−インスリンペルオキシダーゼを除去した。
【０１５８】
最後の洗浄後に、上清の９０％を吸引し、そして５０μｌの粒子を各試験管から取り出
し、そして０．２ｍｌのＴＭ Ｂｌｕｅ（商標）色原体と反応させた。
＜結果＞
以下の表１３に示す結果は、インスリン微粒子が抗−ヒツジインスリンと結合できるこ
とを実証し、これはこれらの粒子が免疫的に活性であることを示している。
【０１５９】
【化１４】
【０１６０】
＜阻害アッセイ＞
インスリン微粒子の免疫活性を、微粒子が抗−ヒツジインスリンに結合する能力を阻害
アッセイで測定することにより決定した。
【０１６１】
５本の各試験管を２連で以下のように準備した。上記反応物ＡおよびＣからの以下の容
量のインスリン粒子を、適当な遠心管中に表１４に示すように入れた。
【０１６２】
１００μｌのイムノフェイズ インスリン トレーサー（商標：Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｓ
ｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｔｒａｃｅｒ）（ヨード化インスリン、チバコーニング：Ｃｉｂａ
Ｃｏｒｎｉｎｇ）を両連の試験管に加えた。ボルテックス処理した。１．０μｌのＩｍ
ｍｕｎｏｐｈａｓｅ（商標）インスリン抗体（チバコーニング）を加えた。ボルテックス
処理した。室温で４時間３０分静置した。３０００ｒｐｍで２０℃にて３０分間遠心した
。
【０１６３】
試験管をシンチレーションガンマーカウンターで１分間計数した。
＜結果＞
阻害アッセイを使用した以下の表１４に示す結果は、インスリン微粒子が抗−ヒツジイ
ンスリンと結合できることを実証し、これはこれらの粒子が免疫的に活性であることを示
している。
【０１６４】
【表１５】
【実施例１５】
【０１６５】
破傷風トキソイド微粒子でのマウスの免疫化
この実験は破傷風トキソイド微粒子でインビボ免疫化の効果を測定するために行った。
【０１６６】
実験の方法、結果および結論は次のとおりである：
＜方法＞
破傷風トキソイド微粒子は一般的に実施例１０に記載されているように次のように調製
した：
モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得たポリビニルピロリドン（ＭＷ４０，
０００）およびポリエチレングリコール（ＭＷ３５００）の２７％の各ポリマー溶液を、
２７グラムのポリマーを１００ｍｌの蒸留水に添加することにより調製した。各ポリマー
溶液のｐＨは約ｐＨ６．２５に調整した。このポリマー溶液を１：１で混合してＰＶＰ／
ＰＥＧポリマー混合物（５４％全ポリマー）を作成した。
【０１６７】
脱イオン水中の１００μｌの５．０％グルタルアルデヒド（シグマ、セントルイス、モ
ンタナ）溶液を、１．０ｍｌのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物に加え、そして激しくボル
テックッス混合した。
【０１６８】
公衆衛生部から得た０．５ｍｌの破傷風トキソイド（１．０ｍｇ／ｍｌ）をＰＶＰ／Ｐ
ＥＧ−グルタルアルデヒド混合物に加え、そして激しくボルテックッス混合した。
【０１６９】
この混合物を室温で４時間１５分間混合し、そして次に４℃にて３０００ＲＰＭで３０
分間遠心した。上清をデカントし、そして粒子を２．０ｍｌの０．５Ｍ グリシン（１Ｘ
ＰＢＳ緩衝液中）に再懸濁し、そして４℃に一晩静置した。
【０１７０】
洗浄工程は２回以上繰り返した。破傷風トキソイド粒子を最後に０．５ｍｌの１Ｘ Ｐ
ＢＳ緩衝液中に再懸濁した。粒子はおよそ５０から１００ミクロンの間の粒子サイズを有
した。
【０１７１】
３２兎のマウスの群を、ＦＤＡプロトコールに従いそれぞれ皮下に２μｇの破傷風トキ
ソイド粒子を含有する一次投与量を接種した。２μｇの破傷風トキソイド粒子を含有する
二次投与は一次投与の７週間後に投与した。血液試料を一次接種後、２、４、５、８およ
び１０週間後にマウスから採血し、そして血中の力価を免疫アッセイで測定した。マウス
に致死量の破傷風トキソイドで一次接種後１４週間目に攻撃した。
＜結果＞
図２に示すように、抗体力価は一次接種４週間目のおよそ１０から一次接種１０週間目
にはおよそ３０００に上昇した。点線は破傷風トキソイドから２アンチトキシン単位の防
御を付与する力価を示す。点線より上の力価はＦＤＡ標準により２つの陽性免疫応答を示
す。したがって図２に示すように、マウスは破傷風トキソイド微粒子を接種後、わずか４
週間目に陽性の免疫応答を示した。４から１０週間目の抗体力価の上昇は、この微粒子が
破傷風トキソイド抗原をゆっくりと放出していることを示す。 １４週間目に投与した致
死量の破傷風トキソイドによる攻撃後に、１００％のマウスが生存した。この生存率は破
傷風トキソイドに対して防御を付与する強い免疫応答を示す。
【０１７２】
この実験の結論として、マウスはすべて健康であった。注射部位の特記すべき炎症およ
び傷痕はなく、そして接種後に有意な体重の減少もなかった。したがって破傷風トキソイ
ド微粒子は皮下投与したとき一般的に無毒性である。
【０１７３】
この実験は、上記方法により調製した破傷風トキソイド微粒子が、破傷風トキソイド抗
原をゆっくり放出し、陽性の免疫応答を引き起こし、そして悪い副作用無く破傷風トキソ
イドの致死量攻撃に対して防御を与えることを示すデータを提供する。
【実施例１６】
【０１７４】
直鎖ポリマーおよび加熱を使用したアルブミン微粒子の調製
この実験はアルブミンとＰＶＰおよびＰＥＧ混合物とを様々な温度でインキューベーシ
ョンすることによりアルブミン微粒子を調製するために行った。
＜実験法＞
４本の反応試験管に１．０ｍｌのウシ血清アルブミン−ＦＩＴＣ溶液（１％のウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）および１０μｌの透析したフルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）アルブミンを含む）を入れた。２．０ｍｌのポリマー混合物（８．０％ＰＶＰお
よび２０％のＰＥＧを０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に含む）をボルテックス混
合しながら各試験管に加えた。
【０１７５】
反応１は室温で１．５時間混合した。反応２は室温で３０分間混合し、そして５８℃で
３０分間、水浴中にてインキューベーションした。反応３は直ちに５８℃の水浴中に３０
分間置いた。反応４は室温で３０分間混合し、そして次に３７℃で３０分間、水浴中にて
インキューベーションし、次に５８℃の水浴中で３０分間インキューベーションした。
【０１７６】
２．０ｍｌの１０％エタノールを各反応混合物に加え、そして簡単に混合した。２０℃
にて３０分間、３０００ｒｐｍで遠心した。上清を注意深く吸引した。粒子を２．０ｍｌ
のエタノールに再懸濁した。反応混合物１は透明であり、一方２、３および４はくもって
いた。遠心および２．０ｍｌの脱イオン水中に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査した。
＜結果＞
反応混合物１には微粒子が見られなかった。反応混合物２は非−凝集性の直径約１から
１０μｍの微粒子を含んだ。反応混合物３は非−凝集性の直径約１０μｍの微粒子と多く
の１μｍ未満の直径の微粒子を含んだ。反応混合物４は非−凝集性の直径約１０μｍから
２５μｍの微粒子、および１μｍ未満の直径の微粒子をいくらか含んだ。
＜実験法＞
２連の６本の反応試験管に、１．０ｍｌのウシ血清アルブミン−ＦＩＴＣ溶液（１％の
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１０μｌの透析したフルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）アルブミンを含む）を入れた。０．５ｍｌ、１．０ｍｌ、２．０ｍｌ、
３．０ｍｌ、４．０ｍｌまたは５．０ｍｌのポリマー混合物（８．０％のＰＶＰ（ＭＷ９
０，０００）および２０％のＰＥＧ（ＭＷ３３５０）を含む、ｐＨ５．０）をＡの一連の
各試験管にボルテックス混合しながら加えた。０．５ｍｌ、１．０ｍｌ、２．０ｍｌ、３
．０ｍｌ、４．０ｍｌまたは５．０ｍｌのポリマー混合物（２０％のＰＶＰ（ＭＷ４０，
０００）および２０％のＰＥＧ（ＭＷ３３５０）を含む、ｐＨ５．０）をＢの一連の各試
験管にボルテックス混合しながら加えた。
【０１７７】
反応混合物を室温で３０分間静置し、そして次に試験管を３７−４０℃で３０分間、水
浴中に置き、次に試験管を５６−６０℃の水浴中で３０分間移した。２ｍｌの１０％エタ
ノールを加え、そして室温で３０分間、３０００ｒｐｍで遠心した。上清を吸引し、そし
て微粒子を２．０ｍｌの１０％エタノールに再懸濁した。再度１５分間遠心し、２．０ｍ
ｌの脱イオン水に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査した。
＜結果＞
＜Ａ連（８．０％ ＰＶＰ／２０％ ＰＥＧ）＞
０．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は最も均一で、１から３μｍ
の間の範囲の直径を有した。小さなクラスターが観察された。直径が約２５μｍの幾つか
の大きい微粒子が見つかった。
【０１７８】
１．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１から１０μｍの間の範囲の直径を有した。上記より
も少ないクラスターが観察された。大きな微粒子は見られなかった。
【０１７９】
２．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から１５μｍの間の範囲の直径を有した。極め
て少ないクラスターが観察された。大きな微粒子は見られなかった。
【０１８０】
３．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から２０μｍの間の範囲の直径を有した。極め
て少ないクラスターが観察された。大きな微粒子は見られなかった。
【０１８１】
４．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から２５μｍの間の範囲の直径を有した。クラ
スターおよび大きな微粒子は見られなかった。
【０１８２】
５．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は０．５ｍｌのものを使用して
形成したものよりも均一性が低く、１未満から３０μｍの間の範囲の直径を有した。クラ
スターおよび大きな微粒子は見られなかった。
＜Ｂ連（２０％ ＰＶＰ／２０％ ＰＥＧ）＞
０．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は小さい凝集状態で、それぞれ
が１μｍ未満の直径の１０から２０個の間の微粒子を含んだ。直径が約５から２０μｍの
間の幾つかの大きい微粒子が観察された。
【０１８３】
１．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は小さい凝集状態で、それぞれ
が１μｍ未満の直径の１０から２０個の間の微粒子を含んだ。直径が約５から５０μｍの
間の幾つかの大きい微粒子がよく観察された。
【０１８４】
２．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は大きい凝集状態で、直径がサ
ブミクロンの微粒子を含んだ。直径が約１から１０μｍの間の幾つかの微粒子が観察され
た。
【０１８５】
３．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は大きい、および小さい凝集状
態であった。時折、個々の直径が約５μｍの微粒子が観察された。
【０１８６】
４．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は小さい凝集状態であり、それ
ぞれが０．５ｍｌのポリマー混合物を使用したときに観察されたものよりも小さい直径の
１０−２０個の微粒子を含んだ。個々の微粒子は観察されなかった。
【０１８７】
５．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、大変小さい微粒子を含んだ
小さいものと大きな凝集物の状態であった。個立した微粒子は観察されなかった。
＜実験法＞
７本の反応試験管に１．０ｍｌのウシ血清アルブミン−ＦＩＴＣ溶液を入れた。０．５
ｍｌ、０．７５ｍｌ、１．０ｍｌ、１．２５ｍｌ、１．５ｍｌ、１．７５ｍｌまたは２．
０ｍｌのポリマー混合物（２０％のＰＶＰ（ＭＷ４０，０００）および２０％のＰＥＧ（
ＭＷ３３５０）を０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に含む）を各試験管にボルテ
ックス混合しながら加えた。 反応混合物を室温で３０分間静置し、そして次に試験管
を３７−４０℃で３０分間、水浴中に置き、次に試験管を５６−６０℃の水浴中で３０分
間移した。２ｍｌの１０％エタノールを加え、そして２０℃で３０分間、３０００ｒｐｍ
で遠心した。上清を吸引し、そして微粒子を２．０ｍｌの１０％エタノールに再懸濁した
。再度１５分間遠心し、２．０ｍｌの脱イオン水に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査し
た。
＜結果＞
０．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、直径が１μｍ未満の小さい
微粒子の小さな凝集物（凝集物あたり１０−２０個の間）の状態であった。時折、大きな
単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観察された。
【０１８８】
０．７５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、凝集物あたり約１−１０
個の間の小さい凝集物の状態であった。時折、大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍ
の間）が観察された。
【０１８９】
１．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、３７−４０℃でのインキュ
ーベーション中に大きな粘着性凝集物を形成した。凝集物は凝集物あたり約１−５個の間
の微粒子を含んでいた。時折、より大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観
察された。
【０１９０】
１．２５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、５６−６０℃でのインキ
ューベーション中に凝集物を形成した。凝集物は凝集物あたり約１−５個の間の微粒子を
含んだ。時折、より大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観察された。
【０１９１】
１．５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、５６−６０℃でのインキュ
ーベーション中に凝集物を形成した。凝集物は凝集物あたり約１−５個の間の微粒子を含
んだ。幾つかのより大きな単一の微粒子（直径が１−１０μｍの間）が観察された。
【０１９２】
１．７５ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、５６−６０℃でのインキ
ューベーション中に凝集物を形成した。サイズが小さいので、凝集物中に微粒子が存在す
るのかどうかを測定できなかった。幾つかのより大きな単一の微粒子（直径が１−１０μ
ｍの間）が観察された。
【０１９３】
２．０ｍｌのポリマー混合物を使用して形成した微粒子は、凝集物あたり１０−１００
個の微粒子を形成した。直径が１μｍの幾つかの単一微粒子が観察された。
【０１９４】
この実施例ではアルブミン微粒子が、アルブミンおよびＰＶＰ／ＰＥＧ混合物を３７−
６０℃の温度で約３０分間インキューベーションすることにより調製できることを実証し
た。微粒子のサイズおよび凝集形成の程度はアルブミンに加えたＰＶＰ／ＰＥＧポリマー
混合物の組成または容量を変化させることにより変更できた。
【０１９５】
本発明のさらなる別の態様を以下に列挙する。
１．脱水剤が中性塩、グリシン、可溶性直鎖または分枝ポリマー、金属イオン、有機カチ
オン、小アニオンおよびポリアニオンから成る群から選択される化合物である、脱水剤に
近接して位置する架橋結合した高分子を含んで成る微粒子組成物。
２．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルス、ウイルス粒子、医薬品
およびその混合物から成る群から選択される、上記態様１記載の微粒子組成物。
３．タンパク質が免疫グロブリン、抗原および細胞レセプターから成る群から選択される
、上記態様２記載の微粒子組成物。
４．さらに治療用分子を含んで成る上記態様１記載の微粒子組成物。
５．治療用分子が化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、免疫抑制物質、サイ
トカイン、ホルモン、酵素およびその混合物から成る群から選択される、上記態様１記載
の微粒子組成物。
６．さらに磁気物質を含んで成る上記態様１記載の微粒子組成物。
７．高分子が検出できるラベルで標識されている上記態様１記載の微粒子組成物。
８．検出できるラベルが蛍光色素、化学発光ラベル、磁気粒子、酵素、酵素基質および放
射性ラベルから成る群から選択される、上記態様７記載の微粒子組成物。
９．微粒子がインビトロおよびインビボで安定である上記態様１記載の微粒子組成物。
１０．脱水剤がポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよびその混合物から成
る群から選択される可溶性の直鎖ポリマーである、上記態様１記載の微粒子組成物。
１１．高分子が、ジアルデヒド、アミン、多価イオン、架橋結合された高分子上の特別な
反応基に親和性を有する多官能性分子、Ｎ−置換マレイミド、二官能性アルキルハライド
、アリールハライド、イソシアネート、脂肪族または芳香族ジカルボン酸、脂肪族または
芳香族ジスルホン酸、二官能性イミドエステルおよびビニルスルホンから成る群から選択
される化合物で架橋結合されている上記態様１記載の微粒子組成物。
１２．微粒子の作成法であって、
ａ）高分子を脱水剤と、予め定めた温度で粒子が形成するに十分な量の時間インキューベ
ーションし、
ｂ）インキューベーション混合物から粒子を分離する、
工程を含んで成る上記方法。
１３．インキューベーション温度が室温よりも高い上記態様１記載の方法。
１４．インキューベーション温度が３７℃以上で、かつ８０℃以下である上記態様１２記
載の方法。
１５．インキューベーション混合物が５分から２４時間の間インキューベーションされる
上記態様１２記載の方法。
１６．工程ａ）のインキューベーション混合物がさらに架橋剤を含んで成る上記態様１２
記載の方法。
１７．インキューベーション温度が室温以下である上記態様１６記載の方法。
１８．さらにクエンチング剤を含む緩衝液で粒子を洗浄する工程を含んで成る上記態様１
６記載の方法。
１９．インキューベーション工程がｐＨ５から８の間で行われる上記態様１２記載の方法
。
２０．脱水剤が中性塩、グリシン、水溶性有機溶媒、可溶性直鎖または分枝ポリマー、金
属イオン、有機カチオン、小アニオンおよびポリアニオンから成る群から選択される化合
物である請求の範囲第１２項記載の方法。
２１．脱水剤がポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよびその混合物から成
る群から選択される可溶性の直鎖ポリマーである、上記態様１２記載の方法。
２２．脱水剤が分子量約４０，０００のポリビニルピロリドンおよび分子量約３５００の
ポリエチレングリコールの混合物である、上記態様１２記載の方法。
２３．架橋剤がジアルデヒド、アミン、多価イオン、架橋結合された高分子上の特別な反
応基に親和性を有する多官能性分子、Ｎ−置換マレイミド、二官能性アルキルハライド、
アリールハライド、イソシアネート、脂肪族または芳香族ジカルボン酸、脂肪族または芳
香族ジスルホン酸、二官能性イミドエステルおよびビニルスルホンから成る群から選択さ
れる上記態様１６記載の方法。
２４．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルス、ウイルス粒子、医薬
品およびその混合物から成る群から選択される、上記態様１２記載の方法。
２５．標的分子を該分子を含む複雑な混合物から単離する方法であって、
ａ）複雑な混合物を、標的分子に親和性を有する高分子微粒子と標的分子が高分子に結合
するのに十分な時間混合し、
ここで微粒子は脱水剤に近接して架橋結合された液相中の高分子
を含んでなる、そして
ｂ）結合した標的分子を複雑な混合物から分離する、
工程を含んで成る、上記方法。
２６．微粒子が固定されている請求の範囲第２５項記載の方法。
２７．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルス、ウイルス粒子、医薬
品およびその混合物から成る群から選択される、上記態様２５記載の方法。
２８．標的分子がタンパク質、炭水化物、核酸分子、ウイルスおよび細胞から成る群から
選択される、上記態様２５記載の方法。
２９．治療薬を患者に送達する方法であって、患者に脱水剤に近接して架橋結合された高
分子を含んで成る微粒子組成物を治療的に有効な量を投与することを含んで成り、ここで
高分子が治療薬を含んで成る上記方法。
３０．治療薬が化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、免疫抑制物質、サイト
カイン、ホルモン、酵素およびその混合物から成る群から選択される、上記態様２９記載
の方法。
３１．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルスおよびウイルス粒子、
医薬品およびその混合物から成る群から選択される、上記態様２９記載の方法。
３２．患者の標的組織を検出する方法であって、
ａ）患者に脱水剤に近接して架橋結合された高分子を含んで成る微粒子組成物を有効量で
投与し、
ここで高分子は検出できる造影剤で標識された標的組織に特異的
な親和性分子を含んでなるものであり、そして
ｂ）検出できる造影剤を検出する、
工程を含んで成る、上記方法。
３３．検出できる造影剤が蛍光色素、化学発光ラベル、磁気粒子、酵素、酵素基質および
放射性ラベルから成る群から選択される、上記態様３１記載の方法。
３４．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルスおよびウイルス粒子お
よびその混合物から成る群から選択される、上記態様３２記載の方法。
３５．試料中の標的生体分子を検出する方法であって、
ａ）脱水剤に近接して架橋結合された高分子を含んで成る微粒子組成物を試料と混合し、
ここで高分子は検出できる造影剤で標識された標的生体分子に特異的な親和性分子を
含んでなる、そして
ｂ）検出でき造影剤を検出する、
工程を含んで成る、上記方法。
３６．検出できる造影剤が蛍光色素、化学発光ラベル、磁気粒子、酵素、酵素基質および
放射性ラベルから成る群から選択される、上記態様３５記載の方法。
３７．高分子がタンパク質、炭水化物、多糖、核酸分子、ウイルスおよびウイルス粒子お
よびその混合物から成る群から選択される、上記態様３５記載の方法。
３８．ａ）中性塩、グリシン、可溶性直鎖または分枝ポリマー、金属イオン、有機カチオ
ン、小アニオンおよびポリアニオンから成る群から選択される脱水剤、および
ｂ）ジアルデヒド、アミン、多価イオン、架橋結合された高分子上の特別な反応基に親和
性を有する多官能性分子、Ｎ−置換から成る群から選択される架橋剤、
を含んで成る微粒子を調製するためのキット。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】抗−発癌性胎芽抗原微粒子濃度に対する１分間あたりの結合放射性発癌性胎芽抗原の計数（カウント）を表すグラフである。
【図２】破傷風トキソイド粒子の一次および二次投与で免疫化した後の週に対する抗体価を表すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中で１または複数の高分子から形成される高分子粒子。
【請求項２】
前記水溶液がさらに、ポリマー、架橋剤またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項３】
前記高分子がイムノグロブリンまたはインスリンである、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項４】
前記１または複数の高分子が架橋されたものである、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項５】
前記高分子が薬学的化合物である、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項６】
前記高分子が酵素または蛍光源と結合しているものである、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項７】
前記水溶液は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、デキストラン、ノニルフェノールエトキシレート、ポリビニルアルコールまたはその混合物をさらに含む、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項８】
前記水溶液は、ポリエチレングリコールの重量以下の重量での量でポリビニルピロリドンが存在する混合物をさらに含む、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項９】
球体または楕円の粒子の形態で高分子が存在する、高分子粒子。
【請求項１０】
前記高分子がタンパク質である、請求項９に記載の高分子粒子。
【請求項１１】
前記高分子がイムノグロブリンまたはインスリンである、請求項９に記載の高分子粒子。
【請求項１２】
前記高分子粒子が１ミクロン未満から１０ミクロンまでの直径を有する、請求項９に記載の高分子粒子。
【請求項１３】
球体粒子の形態でタンパク質が存在する、球体タンパク質粒子。
【請求項１】
水溶液中で１または複数の高分子から形成される高分子粒子。
【請求項２】
前記水溶液がさらに、ポリマー、架橋剤またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項３】
前記高分子がイムノグロブリンまたはインスリンである、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項４】
前記１または複数の高分子が架橋されたものである、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項５】
前記高分子が薬学的化合物である、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項６】
前記高分子が酵素または蛍光源と結合しているものである、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項７】
前記水溶液は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、デキストラン、ノニルフェノールエトキシレート、ポリビニルアルコールまたはその混合物をさらに含む、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項８】
前記水溶液は、ポリエチレングリコールの重量以下の重量での量でポリビニルピロリドンが存在する混合物をさらに含む、請求項１に記載の高分子粒子。
【請求項９】
球体または楕円の粒子の形態で高分子が存在する、高分子粒子。
【請求項１０】
前記高分子がタンパク質である、請求項９に記載の高分子粒子。
【請求項１１】
前記高分子がイムノグロブリンまたはインスリンである、請求項９に記載の高分子粒子。
【請求項１２】
前記高分子粒子が１ミクロン未満から１０ミクロンまでの直径を有する、請求項９に記載の高分子粒子。
【請求項１３】
球体粒子の形態でタンパク質が存在する、球体タンパク質粒子。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２９７６３３（Ｐ２００７−２９７６３３Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３１０９１（Ｐ２００７−１３１０９１）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【分割の表示】特願平６−５２０１７１の分割
【原出願日】平成６年３月４日（１９９４．３．４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【分割の表示】特願平６−５２０１７１の分割
【原出願日】平成６年３月４日（１９９４．３．４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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