高密度リポタンパク質に関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイス中の多孔性および生物学的活性を保持する接着膜
サンプル中のＨＤＬ関連コレステロールの濃度を測定するためのアッセイパッド、このパッドを用いるための方法、およびこの方法を実施するための診断アッセイデバイスが記載される。このアッセイパッドは、ポリマーパッドは、ポリマー接着剤または熱積層結合を含む。このアッセイ設計は、上記ＨＤＬ定量反応またはこの同じサンプルに対して実施されるその他のアッセイに対する、このような除去の使用のために用いられる試薬による妨害を防ぐ。所望であれば、非ＨＤＬリポタンパク質の除去およびＨＤＬコレステロールのアッセイが、アッセイの中断なくして実施され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）関連コレステロールアッセイパッド、このパッドを用いる方法、およびこの方法を実施するための診断アッセイデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．発明の背景）
血液中に存在するコレステロールの量は、冠状動脈疾患のリスクに関連していることが知られている。コレステロールは、主に、血液中を、タンパク質結合形態で循環する。コレステロールを輸送するタンパク質は、リポタンパク質であり、これらは、それらの密度を基に３つのクラスに分割される。非常に低い密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）は、肝臓中で合成されそして最終的に低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に変換されるトリグリセリドリッチのリポタンパク質であり、これは、ヒトにおいて大部分の血漿コレステロールを輸送する。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、トリグリセリドリッチなリポタンパク質の異化、ならびに末梢組織からのコレステロールの除去および肝臓への輸送に関与しているリポタンパク質である。血清ＨＤＬレベルと冠状動脈疾患との間の逆の関係が確立されている。特に、ＨＤＬと関連する血清コレステロールの比率が低いと、冠状動脈疾患のリスクは増加する。
【０００３】
アテローム生成疾患のリスク評価および管理における相対的血清コレステロールレベルの重要性を考慮して、相当な努力が費やされ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、および総コレステロールならびにトリグリセリドの血清レベルに対する、正常個体および高リスク個体の両方の大集団をスクリーニングしている。高リスク個体の処置の有効性は、種々のリポタンパク質区画におけるコレステロールの血清レベルの定期的試験によってモニターされている。
【０００４】
特異的ＨＤＬコレステロール試験の１つの方法は、代表的には、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋のような第２族カチオンの存在下の、硫酸デキストラン、ヘパリン、またはホスホタングステートのようなポリアニオン性化合物による血清中の非ＨＤＬリポタンパク質の選択的沈殿を基にしている。沈殿の特異性および程度は、種々の因子に依存し、沈殿試薬のタイプおよび濃度を含む。一般に、血清コレステロール粒子の沈殿の順序は、ポリアニオンの濃度の増加とともに、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬである。ＨＤＬの少量のａｐｏＥ種は、低密度粒子と共沈殿され得るが、ＨＤＬは、通常、低密度粒子を完全に沈殿させるヘパリンまたは硫酸デキストランの濃度で可溶性のままである。低密度粒子の選択的沈殿により、ＨＤＬ血清コレステロールレベルが決定され得る。
【０００５】
代表的な脂質アッセイ手順では、小容量の血液が採取され、そして遠心分離されて透明な血漿または血清サンプル流体を生成する。このサンプル流体は、次いで、（ａ）総血清コレステロール、（ｂ）トリグリセリド、および（ｃ）ＨＤＬコレステロールの決定のために、いくつかのアッセイチューブ中でアリコートにされる。ＨＤＬサンプルは、上記のように沈殿され、そして低密度粒子は、コレステロール検出の前に濾過または遠心分離によって除去される。次いで、これらサンプルは、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびＨ２Ｏ２の存在下で別個の着色産物に酸化され得る色素を含む酵素混合物と反応される。これらチューブは、分光光度計で読み取られ、そして所望の総、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール値が決定され得る。
【０００６】
まさに記載された液相コレステロールアッセイで達成され得る精度および信頼性にかかわらず、このアッセイは、広範なスクリーニングでの使用のためには多くの制限を有している。第１に、この方法は、静脈血サンプルを使用し、血液サンプルを採取および分画するため、および個々のアッセイチューブに処理血液をアリコートとするために訓練された技術者を必要とする。（ＨＤＬ決定のための）少なくとも１つのサンプルチューブは、沈殿剤で処理され、そして沈殿した物質を除去するために、さらに処理されなければならない。これら手順のいくつかは自動化され得るが、この目的のために設計された分析機械は高価であり、そして大病院の外では広く利用可能ではない。
【０００７】
本明細書中にそれら各々が参考として援用される、同時所有の米国特許第５，２１３，９６４号、同第５，２１３，９６５号、同第５，３１６，１９６号および同第５，４５１，３７０号は、血清コレステロールレベルを測定するための液体アッセイ手順にともなう上記の問題の多くを実質的に克服する方法およびアッセイデバイスを開示している。１つの実施形態では、このデバイスは、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子をもまた含む血液サンプル中のＨＤＬ関連コレステロールの濃度を測定するために設計されている。このデバイスは、流体サンプルがマトリックスを通じて移動するとき、可溶性リポタンパク質と沈殿したリポタンパク質とを分離し得る篩マトリックスを備える。このマトリックスと関連するリザーバーが、流体サンプルがこのマトリックス中に引かれ、かつそれを通るとき、ＬＤＬとＶＬＤＬとを選択的に沈殿するための可溶性沈殿剤を放出するように設計されている。これは、この篩マトリックスを通るより速いＨＤＬ移動を基に、沈殿したリポタンパク質からのＨＤＬ分離を可能にする。上記流体サンプルは、それ故、非ＨＤＬリポタンパク質が枯渇し、次いで試験表面に移され、そこで、それはコレステロールについてアッセイされる。
【０００８】
上記で参照したデバイスは、液体相アッセイを超える利点を提示するが、沈殿試薬での流れ輸送経路の汚染の可能性を提示する。このような試薬は、ＨＤＬ定量化、または複数アッセイデバイスのその他の領域で起こるその他のアッセイ化学を妨害し得る。本発明は、これらの問題を取り扱い、かつ克服する。
【０００９】
血液サンプル中のＨＤＬコレステロールを測定するためのさらなる方法およびデバイスは、ＥＰ ０４０８２２３およびＥＰ ０４１５２９８（Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆら）に開示され、これは、以下のステップおよび対応する要素を備える試験片上で実施される連続的アッセイ方法を記載している。血液サンプルは、細胞血液成分を分離するために分離層に付与される。毛細管力または重力により駆動され、サンプルは、可溶性沈殿剤を含むさらなるキャリアを通って流れ、これは、血清サンプル中に溶解した後、このサンプル中に含まれる非ＨＤＬリポタンパク質を沈殿する。さらなるキャリア中では、上記の沈殿された成分は、血清サンプルから濾過され、後のＨＤＬ定量をそれらが妨害することを防ぐ。同じキャリア中で、サンプルは、ＨＤＬ定量キャリアに隣接する位置に輸送され、そしてＨＤＬ定量ステップが開始されるまで貯蔵される。最後に、サンプルは、ＨＤＬ定量層に移され、そこで血清サンプル中のＨＤＬコレステロールが、酵素反応によって定量される。
【００１０】
このアッセイ設計の欠点は、リザーバーとして機能するキャリアが、沈殿成分または可溶性試薬のサンプル中への移動を可能にし、これが、ＨＤＬ定量を妨害し得ることである。さらに、血清サンプルの貯蔵の間に、ＨＤＬが、キャリア繊維への付着により捕獲され得、沈殿試薬が、さらなる所望されない反応を引き起こし得、そして上記キャリアが、血清サンプルを乾燥することにより凝集するようになり得る。
【００１１】
米国特許第５，１３５，７１６号（Ｔｈａｋｏｒｅ）は、血液流体サンプル中のＨＤＬ定量のためのさらなるデバイスおよび方法を開示している。これらのデバイスでは、流体サンプルが、ＨＤＬ定量のために、入口ウェルからキャリアに、非破壊経路を通って、連続的に流れる。従って、ＨＤＬ試験キャリアに入るサンプル容量を制御する、およびＨＤＬアッセイのための環境条件を制御する能力は、制限される。上記いずれのデバイスも、単一の流体サンプルからの種々の分析物の同時アッセイを提供しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、上記に記載した先行技術の欠点を克服するＨＤＬアッセイデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、ＨＤＬ試験パッドと試薬パッドを結合することによって形成されるアッセイパッドを含み、ここで、このアッセイパッドは、サンプルが、試薬パッドからＨＤＬ試験バッドに通過するに十分な多孔度を保持している。このアッセイパッドは、さらに、上記試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッド上の試薬の生物学的活性を保持している。
【００１４】
別の局面では、本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスおよび方法を含む。このデバイスは、サンプル分与アレイ、ＨＤＬ、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；およびこの血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備える。このＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドは、接着層により、またはこれらパッドを加熱することにより接合されている。
【００１５】
なお別の局面では、本発明は、上記接合されたＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドを調製するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、他であることが示されなければ、以下の意味を有している。
【００１７】
流体が、１つ要素からその他の要素に毛細管作用および／または重力によって移動し得るとき、要素は、別の要素と、「流体連通」にある。これら要素は、直接接触している必要はない；すなわち、上記流体は、その他の要素を通過して介入され得る。
【００１８】
「サンプル分与パッド」、「試験パッド」、「ＨＤＬ試験パッド」、および「試薬パッド」の文脈で用いられるとき、「パッド」は、吸収剤材料の薄い、平坦なマットもしくはクッション、またはその一片を意図する。パッドは、多孔性膜または繊維性細片（ｓｔｒｉｐ）のような任意の材料から構成され得、それは、含浸または固定化された試薬を含み得、そしてそれを通り流体が毛細管作用および／または重力により移動し得る。
【００１９】
（ＩＩ．アッセイデバイス）
本発明によるデバイスは図１〜３に示され、これらは、以下に論議される。便宜のため、類似の要素の番号付けは、同様の構造特徴を識別するためにすべての図１〜３で保持される。このデバイスは、代表的には１０〜５０μｌの小容量の血液または血清サンプルを用い、特に、ＨＤＬに関連する血清コレステロール（ＨＤＬ関連コレステロール、または単にＨＤＬコレステロールとも称される）を決定するために設計されている。総コレステロール、トリグリセリド、グルコース、アラニントランスフェラーゼレベル（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、またはクレアチニンのようなその他のアッセイは、同じサンプルから同時に決定され得る。ＨＤＬ関連コレステロールの決定はまた、単に、ＨＤＬの決定またはＨＤＬアッセイとも呼ばれ得る。
【００２０】
図１〜３を最初に参照して、複数分析物アッセイデバイスの種々の実施形態が示され、図２は分解された様式で示される。図１で最も良く観察されるように、この複数分析物アッイデバイス１４は、本体または支持体１５を含み、これは、一定量、代表的には、約２５〜５０μＬの間の血液サンプルを受容する寸法およびサイズのウェル１６を規定する。このウェルは、随意篩パッド２２と流体接触され得、これは、上記支持体の上エッジ中に形成されたノッチ領域２０中に保持され得る。この流体接触は直接であり得るか、または図１に示されるデバイスにおけるように、ウェルのベースでプレート中に形成される毛細導管１８によって提供される。この支持体は、好ましくは、標準的な鋳型または機械加工方法よって形成される、ウェル、ノッチのある領域および／または毛細管を有する。プラスチックプレートである。
【００２１】
領域２０に保持される篩パッド２２は、サンプルが、このパッドマトックスを通って、この図に示されるように、底から上の方向に移動するとき、（血液細胞を含む）大きな粒子状物質を部分的に除去するように作用する。パッド２２は、好ましくは、血液サンプルが上記マトリックスを通じて引かれるとき、表面湿潤によって水性流体を引き、そして血液細胞の移動を遅らすように設計されたガラス繊維状のマトリックス材料から形成される。１つの例示のパッドは、約０．１６ｇ／ｃｍ３の充填密度、および約１ｍｍの厚みを有する、Ｗｈａｔｍａｎから入手可能な、ＧＦ／Ｄ、ＰＤ００８、またはＦ１４５−０２フィルターのようなガラス繊維フィルターである。このパッドは、規定された容量、好ましくは約１５〜２５μＬの間のサンプル流体を吸収するような寸法である。篩パッド２２は、レクチン、赤血球細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、トロンビン、またはイオン交換剤のような、赤血球捕獲試薬をさらに含み得る。１つの実施形態では、上記パッドは、以下にさらに詳細に論議されるように、非ＨＤＬリポタンパク質の除去のための試薬を含み得る。
【００２２】
上記サンプルは、細長い細片またはサンプル分与アレイ２６と接触する。上記篩パッド２２は、ウェル１６とアレイ２６との間でアレイ２６と流体接触し得る。好ましい実施形態では、アレイ２６は、流体連通している３つ以上の別個の膜から形成される。図２に見られるように、アレイ２６が流体連通している３つの膜から形成される実施形態では、中央サンプル付与膜２８は、サンプル流体をサンプル回収膜３０および３２に分与する。このアレイ２６は、図示されてはいないが、サンプル付与膜２８とサンプル回収膜３０との間に配置された１つ以上の試薬膜をさらに備え得る。この試薬膜は、１以上の試薬を含み得る。１つの実施形態では、この試薬膜は、以下にさらに記載されるように、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に除去するための１つ以上の試薬を含み得る。別の実施形態では、試薬膜は、複数試験のためのサンプルを引く芯（ｗｉｃｋ）として機能し得る。アレイ２６はまた、図２に示されるように、発泡クッション２７またはその他の支持体によって支持され得る。アレイ２６は、好ましくは、ガラス繊維のマトリックスから形成される複数の膜である。上記マトリックスの充填密度および厚みは、上記サンプル付与膜およびサンプル回収膜に供給されるサンプル流体の容量、例えば、１０〜２５μＬを吸収および分与するようである。このマトリックスは、約０．１６ｇ／ｃｍ３と、４．０ｇ／ｃｍ３の間の好ましい充填密度を有する。１つの例示的な細片材料は、約０．２ｇ／ｃｍ３の充填密度おび約０．１２ｍｍの厚みを有する、Ｗｈａｔｍａｎから入手可能な、Ｆ−１６５−２５Ａガラス繊維フィルターである。
【００２３】
上記デバイスはさらに、湿潤可能な吸収剤反応試験パッドである、４つ以上の試験パッド６４、６６、６８、および７０を含む。特定のアッセイで用いられる各試験パッドは、以下にさらに記載されるように、公知の様式で検出され得るパッド中の分析物依存性変化を生成するために有効な分析物依存性試薬を含む。試験パッドのすべてのまたは任意の完全なサブセットは、特定のアッセイ中で採用され得る。
【００２４】
所望であれば、これらの試験パッドは多孔性ポリマー膜であり、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚み、および約３ｍｍの側方寸法を有する。各パッドの吸収容量は、好ましくは、約０．５〜１．０μＬの間である。１つの実施形態では、いくつかまたはすべての反応パッドは非対照的な膜であり；すなわち、膜は、膜の厚みを横切る多孔度の勾配を有する。
【００２５】
１つの実施形態では、試験パッド６４は、ＨＤＬの存在に応答して、パッド中に変化を生成するために有効な試薬を含むＨＤＬ試験パッドである。別の実施形態では、このＨＤＬ試験パッド６４はまた、ＨＤＬレベルをアッセイするための試薬を含むポリマー膜である。１つの例示の細片材料は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）から入手可能なＢＴＳ−８３非対称ポリスルホン膜である。所望であれば、ペルオキシダーゼのようなＨＤＬアッセイ試薬は、酵素固定化のための周知の方法に従って試験パッド膜に固定化され得る（例えば、米国特許第４，９９９，２８７号；米国特許第５，４１９，９０２号；Ｂｌｕｍ、Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．２０（２）：３１７〜２６（１９８７）；Ｋｉａｎｇ、Ｓ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２（８）：１３７８〜８２（１９７６）；Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、Ｇ．Ｇ．編、Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２巻：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｖ．Ｐ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１１巻：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９１）を参照のこと）。
【００２６】
試薬パッド７４は、上記ＨＤＬ試験パッド６４と接触し、そして非ＨＤＬコレステロールの沈殿のための化学薬品を含む。１つの実施形態では、この試薬パッドは、上記ＨＤＬ試験パッドと同じ材料、すなわち、非対称ポリスルホン膜である。このましい実施形態では、試薬パッド７４は、約１μｍ以下のポアサイズを有する多孔性ポリマー膜から構成される。図１に示されるデバイスでは、試薬パッド７４は単一の膜からなるが、本発明はまた、複数、すなわち約６までの積み上げられた膜の使用を企図し、そこでは、少なくとも１つ、そして好ましくは各々の膜か、非ＨＤＬリポタンパク質を結合するために試薬を含む。
【００２７】
上記試薬パッドは、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚み、約３×６ｍｍの側方寸法、および約０．５〜１．０μＬの吸収容量を有する。それは、流体サンプルからＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子を選択的に除去するのに有効な少なくとも１つの試薬を含む。この試薬は、例えば、抗体、または好ましくは、ポリアニオン性ＬＤＬ−およびＶＬＤＬ結合試薬であり得る。当該技術分野で公知であるこのような試薬は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋のような第２族カチオンの存在または非存在下の、スルホン化多糖、ヘパリン、およびホスホタングステートを含む。好ましい試薬は、必要に応じて酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムと組み合わせ、必要に応じて中性ｐＨを維持するよう緩衝化された、５０，０００〜５００，０００ダルトンの代表的な分子量を有する、硫酸デキストランのようなスルホン化多糖である。この試薬は、流体サンプルから、非ＨＤＬリポタンパク質を結合、および除去するに有効な固定化試薬であり得る。上記試薬パッドは、この試薬パッド内に結合された非ＨＤＬリポタンパク質を包括し、そしてそれらがＨＤＬ試験パッド６４に入ることを防ぐために有効である。１つの実施形態では、ＨＤＬ試験パッド６４から下流に拡散し得る任意の発生過酸化水素を分解するために有効である、カタラーゼのような試薬が、試薬パッド７４中に固定化され得る。
【００２８】
ＨＤＬ試験パッド６４および試薬パッド７４は、実施例６に記載のように、熱単独、または実施例１〜３に記載のように、熱活性化接着剤として溶融され得るアクリル酸コポリマーを用いて一緒に接着され得る。この組合せられたＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドは、アッセイパッドと呼ばれる。
【００２９】
デバイス１４はまた、透明であり得るか、または、ウインドウ、例えばウインドウ７６（図２）を有し得る細長い支持体である反応バー６０を含む。このウインドウ（単数または複数）は、試験パッド６４、６６、６８、および７０が、上記支持体を通して見られることを可能にする。これらのウインドウは、透明材料であり得るか、または単に支持体中の開口であり得る。これら試験パッドおよびアッセイバッドは、上記反応バーに、透明または半透明接着剤材料により、音波溶接により、またはその他の適切な結合方法により取り付けられる。
【００３０】
上記反応バーは、支持体１５上に、（ａ）上記デバイスを、試験パッドおよびアッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッドまたはウェルから間隔をおいて離れるサンプル分与位置に維持するため、および（ｂ）上記デバイスを、試験パッドおよびアッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッドおよびウェルと流体連通にある試験位置に移動するために有効な取り付け手段により取り付けられる。この取り付け手段はまた、このような流体連通を、所望の量のサンプルがアッセイパッドおよび／または試験パッドに入ったのち、および／または所定の接触時間の後、このデバイスを、試験位置から、アッセイパッドおよび／または試験パッドがサンプルウェルと流体連通していない位置（これは、「サンプル分与」位置と同じであり得る）へ移すことによって破壊するために用いられ得る。このような移動は、その内容が本明細書中に参考として援用される共有に係る米国特許第５，１１４，３５０号に記載のように、湿潤の程度を反映する、試験パッドの上表面における反射率をモニターすることにより制御され得る。あるいは、パッド材料の吸収能力およびサンプル取り込み速度が既知であるとき、サンプルの量は、単に所定の接触時間を用いることにより十分な正確さで制御され得る。
【００３１】
この取り付け手段は、例えば、エラストマーブロック７１、７２のような、一対の弾力性部材を含み得、これらは、アッセイパッドを、非移動またはサンプル分与位置に向かって付勢するように作用し、そこで、これらパッドは、サンプル分与アレイ、篩パッド、毛細導管またはサンプルウェルから間隔を置いて離れる。図３に示されるように、この弾力性部材の圧縮または解放により、アッセイパッド間の流体連通が選択的に確立かつ分離され得る。この流体連通は、直接接触によるか、または中間要素を通じてであり得る。支持体ブロックは、スプリングまたはピストン様作用により圧縮され得る。あるいは、外部の機械的デバイスは、本体１５および／または反応バー６０と係合し得、そして１つをその他に向かって移動する。このようなデバイスは、クランプ、ピストン、ステッピングモーター、ウォームギアなどのような従来コンポーネントを含み得る。例示のシステムは、本明細書に記載されるようなアッセイデバイスとの使用のために有利な、内蔵タイプの自動化分析器であるＣｈｏｌｅｓｔｅｃｈ ＬＤＸ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒである。
【００３２】
さらなる実施形態では、上記ＨＤＬ試験パッドは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５８９６６（Ｄｏｂｓｏｎら）に記載のようなバイオセンサーを備え、これは、本明細書中に参考として援用される。この文献は、伝導性表面、この伝導性表面を重層する誘電性材料、およびこの誘電層を通じて延びる複数のポアを備えるマイクロスケールのバイオセンサーデバイスを開示している。これらポアの各々は、上記伝導性表面と接触するバイオポリマーを含み、そして化学的応答を電気信号に変換する微小電極として作用し得る。使用において、アッセイされるべき分析物を含む流体は、上記ポアに上記バイオポリマーと接触するように付与される。本発明のＨＤＬアッセイデバイスでは、これは、ＨＤＬ試験パッド６４がサンプルと流体連通している、すなわち、図３に示されるような試験位置にあるとき達成される。
【００３３】
上記微小電極ポア内のバイオポリマーは、代表的には、例えば、ＨＤＬ関連コレステロールの測定のための、コレステロールオキシダーゼのような酵素である。コレステロールは、コレステロールオキシダーゼによって対応するケトンに酸化され、過酸化水素を放出し、これは、次いで、酵素ペルオキシダーゼによって水および酸素に変換され得る。酸素または過酸化水素のいずれかが、次いで、電気化学的に測定され得る。用いられ得る電気化学的方法は、Ｃｌａｒｋ酸素電極におけるように、酸素の還元または過酸化水素の酸化によって生成される電流を測定する電流測定方法、または電圧測定を含む。微小電極におけるサイクリックボルタンメトリーの使用は、種々の分析物の測定について記載されており（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２８９〜２９７（１９９４）を参照のこと）、例えば、ドーパミン（Ｐｉｈｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８（１３）：２０８４〜９（１９９６））およびフラーレン（Ｓｏｕｃａｚｅ−Ｇｕｉｌｌｏｕｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５（６）：６６９〜７２（１９９３））ならびに過酸化水素（Ｈｏｒｒｏｃｋｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５（２４）：３６０５〜１４（１９９３）；Ｎｏｗａｌｌら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ９（２）：１０２〜９（１９９７）；Ｄｅｑｕａｉｒｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４（２）：２４０〜５３（２００２））がある。
【００３４】
（ＩＩＩ．接着層を用いるアッセイパッドの調製）
図１に見られるように、１つの実施形態では、アッセイパッドは、実施例１〜３に記載されるように、試薬パッド７４とＨＤＬ試験パッド６４との間に接着層８０を形成することにより調製される。接着層８０によって接合され、試薬パッド７４とＨＤＬ試験パッド６４とは、アッセイパッドと称されるコンポジット構造体を形成する。この接着層は、例えば、周縁シールによって対向するパッドを固定するために十分であることのみが必要であるか、または対向するパッドの全体表面の上に延び得ることが認識される。
【００３５】
この接着層は、好ましくは、アクリル酸コポリマーから形成される。このコポリマーは、必ずしもそうである必要はないが、代表的には、用いられるＨＤＬアッセイ試薬の変性温度未満の融点を有し、すなわち、そうでなければ、ＨＤＬアッセイ試薬に損傷を与える。１つの例示のコポリマーは、エチレンアクリル酸コポリマー（ＥＡＡ）である。ＥＡＡは、Ｍｉｃｈｅｌｍａｎ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ ＯＨ、約７５℃の融点をもつＰ／Ｎ ＭＰ ４９９０Ｒ）から異なる粒径分散物として入手可能である。１つの好ましい粒子サイズは、３０〜５００ｎｍであり、平均粒子サイズは約９０ｎｍである。ポリエチレングリコール、ポリエチレンテレフタレート、およびポリビニルアルコールを含むその他のポリマーもまた、この接着層としての使用を見出し得る。これらのコポリマーは、架橋され得、そして第２の異なるポリマーとさらに共重合され得る。別の実施形態では、上記接着層は、感圧接着剤またはワックスエマルジョンから形成される。なお別の実施形態では、上記接着層は、本明細書に参考として援用される米国特許第６，５９６，１１２号に記載のようなホットメルト接着剤から形成される。上記アッセイパッドが、上記サンプルが試薬パッドからＨＤＬ試験パッドに流れるために適正な多孔度を保持する接着層のために任意の物質が用いられ得ることが認識される。
【００３６】
上記コンポジットアッセイパッドは、代表的には、上記コポリマーを、しばしば水ベースの溶液である適切な溶媒中に溶解することにより調製される。コポリマーエマルジョンまたは溶液の層が試薬パッド７４に付与される。パッドを被覆するための任意の適切な-方法が利用され得、これらパッドをエマルジョン中または溶液に浸漬すること、パッドをスプレーコーティングすること、または芯をもつパッドにポリマー溶液を付与することを含む。パッドは、一方の側面のみ、または両方の側面上にコートされ得る。このパッドは、適切な時間、すなわち、約２０分間、５０℃で乾燥される。沈殿試薬が、次いで、非対称膜の大ポア（鈍い（ｄｕｌｌ））側面上に分与される。
【００３７】
上記試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドが両方とも非対称膜から形成されるとき、この試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドは、試薬パッドの小ポア（ピカピカ（ｓｈｉｎｙ））側面が、ＨＤＬ試験パッドの開放ポア（鈍い（ｄｕｌｌ））側面に接触するように配向される。
【００３８】
上記ＨＤＬ試験パッド６４と試薬パッド７４との間のコポリマー接着層は、コートされた試薬パッド７４およびＨＤＬ試験パッド６４に熱および／または圧力を付与することにより形成され、それによって、このコポリマーは、隣接するパッド材料との結合を形成する。これらパッドは、必要な温度および圧力で熱を提供する任意の適切なデバイスを用いて加熱され得る。これらパッドを加熱するための好ましい温度は、約８０℃である。任意の適切な積層機械が用いられ得る。
【００３９】
試薬パッド上のコポリマーの濃度は、上記アッセイパッドが、上記サンプルが試薬パッドからＨＤＬ試験パッドに流れる多孔度を保持するようでなれればならない。接着を提供するためのコポリマーの適正な濃度は、約４．０％〜約１０．０％のエマルジョンである。ポリマーコーティングの好ましい濃度は、４％、５％、６％、７％、８％、９％および１０％である。１つの好ましいエマルジョンは、５．５％ＥＡＡエマルジョンである。
【００４０】
上記ＨＤＬ試薬は、ＨＤＬ試験パッド６４上に、試験パッドを試薬パッドに接着する前または後に任意の適正な方法によって分与され得る。このＨＤＬ試薬は、好ましくは、試験パッドを試薬パッドに接着した後、試験パッド上に分与される。
【００４１】
（ＩＶ．熱を用いるアッセイパッドの調製）
１つの実施形態では、アッセイパッドは、実施例６に記載のように、試薬パッドまたはＨＤＬ試験パッドの少なくとも１つを少なくとも部分的に溶融するに十分な温度で付与された熱を用いて、試薬を含む試薬パッド７４をＨＤＬ試験パッド６４に接着することにより調製される。この試薬パッドおよびＨＤＬパッドは、本明細書に参考として援用される米国特許第６，５９６，１１２号に記載されるように、約６５℃を超えて約２２０℃まで加熱される。好ましい実施形態では、試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドが約１６５℃を超えて加熱されるとき、これらパッドは、互いに接着するようになる。その他の好ましい実施形態では、試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドは、約９３℃、１２１℃、１４８℃、１６５℃、２００℃、または２０５℃を超えて加熱される。これらパッドは、上記のように配向される。ＨＤＬ試薬は、試験パッドを試薬パッドに接着する前、または後にＨＤＬ試験パッド上に分与される。好ましい実施形態では、試験パッドが試薬パッドに接着した後、上記ＨＤＬ試薬が、ＨＤＬ試験パッド上に分与され、および／または非ＨＤＬコレステロールの沈殿のための化学薬品が、試薬パッド上に分与される。特に好ましい実施形態では、ＨＤＬ試薬および沈殿のための化学薬品の両方が、試験パッドおよび試薬パッドが一緒に接着された後、ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッド上にそれぞれ分与される。
【００４２】
（Ｖ．プリントプロセスを用いてアッセイパッド上に試薬を分与すること）
別の実施形態では、食刻されたＧｒａｖｕｒｅシリンダーまたはＡｎｉｌｏｘシリンダーを取り込むプリントプロセスを用いて、１つ以上の試薬が予備積層された膜の対向する側面に付与される。この実施形態では、飽和容量より少ないＨＤＬ試薬および沈殿試薬が用いられる。非飽和容量を用いることにより、これら試薬は、それらの個々の膜に閉じ込められ得る。約８０ｍｌ／１０００インチ２（８０ｍｌ／０．６４５ｍ２）の容量が、代表的な飽和容量である。試薬の２５〜５５ｍｌ／１０００インチ２（２５〜５５ｍｌ／０．６４５ｍ２）の容量が適切であるが、１つの実施形態では、２０ｍｌ／１０００インチ２（２０ｍｌ／０．６４５ｍ２）の試薬が用いられる。沈殿試薬は、このＨＤＬ試薬の前または後に付与され得る。このプリンティングプロセスのその他の実施形態では、別個に維持されなければならない２つの成分を含むその他の試薬が、ＨＤＬ試薬について記載されるのと同様の様式で付与され得る。あるいは、単一の試薬が、単一の積層されていない膜に付与され得る。
【００４３】
（ＶＩ．アッセイ方法）
操作においては、血液サンプルがウェル１６中に配置され、そして篩パッド２２を通って吸収され、そこで、赤血球細胞を含む大きな粒子が除去され、そしてそれから、サンプル分与アレイ２６に入る。１つの実施形態では、これらのステップは、上記デバイスが、アッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッド、毛細導管、またはサンプルウェルと流体連通していないような、「サンプル分与」ステージにある間に起こる。
【００４４】
血漿サンプルは、サンプル付与膜２８からサンプル回収膜３０および３２に移動する。血漿サンプルがサンプル回収膜に到達するとき、デバイスは、好ましくは反応バー６０を移動することによって、例えば、図３に示されるような試験位置に調節され、アッセイパッドを、サンプル分与アレイとの流体連通に置く。この位置では、サンプル分与アレイ中のサンプル流体は、毛細管流れによって試薬パッド中に引かれる。このサンプル流体は、さらに、毛細管流れによってＨＤＬ試験パッド（単数または複数）中に引かれる。上記反応バーは、この位置に、試験パッド（単数または複数）の所望の程度の湿潤が達成されるまで、この位置に保持される。このバーは、次いで、所望であれば移動され、所望の量のサンプル流体がアッセイパッド（単数または複数）に入った後、および／または適切な接触時間の後、サンプル分与アレイとアッセイパッドとの間の流体連通を断絶する。
【００４５】
ＨＤＬ試験パッド６４を接触させる前に、サンプル血漿は、別個の試薬パッド７４中に含まれる沈殿試薬または結合試薬と、非ＨＤＬリポタンパク質が個々のキャリアに結合されるように接触する。このデバイスは、従って、液体相ＨＤＬを含むサンプル流体の、これらの要素（例えば、図２）でのＨＤＬ試験パッド６４への通過を可能にしながら、血清から非ＨＤＬリポタンパク質を除去するために有効である。この実施形態の１つの利点は、上記サンプル分与アレイおよび上流要素が非ＨＤＬ結合試薬を含まないことであり；このような試薬は、試薬パッド７４中にのみ存在する。従って、ＨＬＤ以外の分析物のアッセイにおけるこれらの試薬からの妨害の可能性は排除される。
【００４６】
操作の間、図１〜３に示されるような実施形態では、サンプルがパッド７４および６４を含むＨＤＬアッセイパスを通過するとき、その先導エッジは、非ＨＤＬリポタンパク質が反応かつ包括されるパッド７４を通って上方方向に、そしてＨＤＬ関連コレステロールの測定のために、ＨＤＬがその中でアッセイ試薬と反応する隣接試験パッド６４に直接通過する。サンプルのさらなる部分は、この時間の間、パッド７４と接触することを継続し、そしてパッド６４の吸収能力に到達するまで、パッド７４からパッド６４に同様の様式で進行する。従って、試験パッド６４中のＨＤＬ関連コレステロールの定量が、試薬パッド７４で起こる結合反応と同時に生じる。好ましくは、サンプル分与マトリックスからＨＤＬアッセイ経路（パッド７４および６４を含む）に移されるサンプル流体の容量は、試験パッド６４の吸収能力と等しいかまたはそれより大きく、そして試験パッド６４と試薬パッド７４の合わせた吸収能力より小さいかまたはそれに等しい。
【００４７】
これらの実施形態では、サンプル流体が結合試薬を含む試薬パッド７４と接触するとき、後者がＨＤＬ試験パッド６４と直接接触し、従って、ＨＤＬ反応の前に、血液サンプルの結合試薬との一時的接触を制限する。サンプル調製およびＨＤＬ評価は、従って、別個のステップで実施され、そこでは、サンプル調製は、例えば、細胞血液成分の濾過、そして必要に応じて、血液サンプルの一時的貯蔵、および温度、圧力および環境雰囲気のような試験要求または条件への血液サンプルの適応を含む。血液サンプルの異なる試薬との一時的接触が減少されるので、ＨＤＬ評価に関する任意の化学的妨害が防がれる。所望であれば、上記アッセイは、試験を支持するために、例えば、周囲雰囲気を調製または環境温度を適応するために、サンプル付与および細胞成分の除去の後ではあるが、結合試薬と接触する前に、所望の時間の間中断され得る。これは、サンプル分与位置にデバイスを維持することにより達成される。この目的のために、必要であれば、サンプル分与マトリックスは、さらにリザーバーとして供するように設計される。
【００４８】
上記ＨＤＬ試験パッドは、ＨＤＬ関連コレステロールの定量のための試薬を含む。好ましくは、これらは、ＨＤＬから遊離のコレステロールを放出するためのコレステロールエステラーゼ、遊離のコレステロールとの反応によりＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにペルオキシダーゼおよびＨ２Ｏ２の存在下で独特の着色信号反応産物に変換されるカップルされる色素システムを含む。この試験パッドはまた、上記のように、Ｈ２Ｏ２および／またはＯ２を電気化学的に定量するために有効なバイオセンサーを含み得る。
【００４９】
残りの試験パッド６６、６８、および７０はまた、公知の様式で、目視により、または検出器により光学的に検出され得るパッド中の変化を生成するアッセイ試薬を含む。本発明のデバイスおよび方法の好ましい実施形態では、上記非ＨＤＬ結合試薬は、サンプル分与アレイまたは篩パッド中ではなく、試薬パッド７４中に位置する。この実施形態では、ＨＤＬ以外の分析物のアッセイで、これら試薬からの妨害の可能性が排除される。
【００５０】
好ましくは、これら試験パッドの各々は、酵素を用いた分析物の反応を経由してＨ２Ｏ２を生成するための反応成分を含み；このＨ２Ｏ２は、引き続き、上記のように、基質試薬を着色信号反応産物に変換するか、または電気化学的に測定される。Ｈ２Ｏ２の酵素的生成のための種々の基質特異的オキシダーゼ、および着色反応産物を形成するための色素の引き続く酸化を採用する酵素着色反応は周知である。
【００５１】
４つ以上の試験パッドを有するデバイスを用いて、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、グルコース、総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド脂質（ＴＲＧ）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、および／またはクレアチニンを同時に測定し得る。各パッドは、上記に記載の共通経路成分（ペルオキシダーゼおよびカップルされた色素システム）を、発生したＨ２Ｏ２が、別個の着色信号反応産物を生成するように含む。沈殿試薬または結合試薬に曝されることなく血清に曝される総コレステロール試験パッド、およびＨＤＬ試験パッドは、各々、共通経路成分に加え、上記に記載のような、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ粒子を含む血清リポタンパク質から遊離のコレステロール形態にあるエステル化コレステロールを放出するためのコレステロールエステラーゼ、ならびにサンプル流体中の遊離のコレステロールとの反応によりＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロールオキシダーゼを含む。グルコースアッセイパッドは、上記共通経路成分に加え、グルコースオキシダーゼを含む。トリグリセリドバッドは、上記共通経路成分に加え、中間体Ｌ−グリセロール−３−リン酸を経由して、トリグリセリドからＨ２Ｏ２を生成するために、リパーゼ、Ｌ−グリセロールキナーゼ、およびＬ−グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを含む。このＴＲＧパッド中に引かれた血清サンプルは、沈殿試薬または結合試薬に曝されず、そしてそれ故、血清リポタンパク質のすべてを含むので、このＴＲＧ信号は、総血清トリグリセリドを表す。
【００５２】
参照標準パッドもまた、採用され得る；例えば、本明細書中に参考として援用される、共有に係るの米国特許第５，１１４，３５０号に記載のシステムを参照のこと。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明を示すが、いかなる様式においても、本発明を限定する意図はない。
【００５４】
（実施例１：ＨＤＬ試験パッドの調製）
ＢＴＳ−８３ポリスルホン膜に、７７μｌ／インチ２の充填容量でＨＤＬ試薬を充填し、そして連続ロールプロセスで２０分間５０℃で乾燥した。以下のＨＤＬ試薬を含む試験パッドを調製した：コレステロールオキシダーゼ３６．５単位／ｍｌ、コレステロールエステラーゼ２１５単位／ｍｌ、ペルオキシダーゼ２００単位／ｍｌ、４−アミノアンチピリン１．８８ｍｇ／ｍｌ、およびＴＯＯＳ（３−［エチル（３−メチルフェニル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）１２．０５ｍｇ／ｍｌ。例えば、１００フィートの長さが、この様式で調製され得、そしてアッセイデバイスに適合するために切断され得る。
【００５５】
（実施例２：結合試薬をもつ試薬パッドの調製）
５．５％の濃度でＥＡＡ分散物を含む試薬水溶液を、浸漬タンク内でＢＴＳ−８３ポリスルホン膜に付与し、そして連続ロールプロセスで２０分間５０℃で乾燥した。次いで、１〜５ｍｇ／ｍｌの硫酸デキストラン（５００，０００ＭＷ）および３５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２を含む試薬水溶液を、上記膜の１つの表面上への試薬を計測するためにシリンジポンプを用いて、同じ膜上に分散した。例えば、１００フィートの長さが、この様式で調製され得、そしてアッセイデバイスに適合するために切断され得る。
【００５６】
（実施例３：アッセイパッドの調製）
ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドを、それぞれ、実施例１および２に従って、調製した。これらパッドは配向されて、試薬パッドのピカピカの側面（小ポアサイズ）を有する層は、ＨＤＬ試験パッドの鈍いまたは開放ポア側面に接触している。これら２つの膜は、これら膜を８０℃に２０秒間連続ロールプロセスで加熱した積層機械を通過させた。
【００５７】
（実施例４：代表的なアッセイ手順）
代表的なアッセイを、本質的に実施例３に記載のように調製されたアッセイパッドを用い、ＬＤＸ（登録商標）分析器中で実施した。接着されたパッドのセクションを、反応膜サイズに手で切断し、そして反応バーに接着した。あるいは、積層されたアッセイパッドは、超音波溶接を用いる連続ロールプロセスで反応バーに付与され得る。血清サンプルをサンプルウェル中に充填した。サンプル分与の後、反応バーを、血清がＨＤＬ試験パッドを充填するに十分な血清を移動させるに十分な時間である約４秒間、接着されたパッドと接触し、その後、このバーをその元の位置に戻した。色を３分間発色させ、そして反射率をＬＤＸ（登録商標）分析器でモニターした。
【００５８】
（実施例５：試薬パッド上のアクリル酸コポリマー濃度）
試薬パッド上のＥＡＡの濃度を変動させて膜の多孔度を決定した。試薬パッドは、本質的に実施例２に従って調製した。ＥＡＡの系列希釈を、２０％溶液で開始して試薬パッドに付与した。これら試薬パッドは、実施例３に従って、ＨＤＬ試験パッドに接着した。試薬パッドの鈍い側面をＥｖａｎｓ ｂｌｕｅの希釈水溶液を用いて試験し、ＨＤＬ試験パッドまで、この試薬パッドを通る着色溶液の透過および／または拡散を決定した。この溶液の容易な透過および／または拡散を可能にしたＥＡＡの最高の濃度は、約１０％ＥＡＡであった。
【００５９】
（実施例６：熱を用いるアッセイパッドの調製）
ＢＴＳ８３の２つの層を、付与される任意の試薬なしで、連続ロールプロセスで一緒に積層する。膜の配向は、実施例３について記載されるようである。硫酸デキストラン（５０，０００ＭＷ）およびＭｇ（ＯＡｃ）２の水溶液を、標準的なグラビアコーター（ｇｒａｖｕｒｅ ｃｏａｔｅｒ）を用いてこの積層体の開放ポア側面上にコートする。このグラビアコーターは、非飽和容量の試薬をこの積層体の単一層上に分与するよう選択される。乾燥後、ＨＤＬ試薬は、同様の様式で対向する膜に付与される。これら試薬は、実施例１および２に示されるレベルから濃縮され、付与される減少した容量を補償する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、複数分析物アッセイデバイスの１つの実施形態の側面図である。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態に従って構成された複数分析物アッセイデバイスの分解された形態の斜視図である。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態による複数分析物アッセイデバイスの部分側面図である。
【技術分野】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）関連コレステロールアッセイパッド、このパッドを用いる方法、およびこの方法を実施するための診断アッセイデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．発明の背景）
血液中に存在するコレステロールの量は、冠状動脈疾患のリスクに関連していることが知られている。コレステロールは、主に、血液中を、タンパク質結合形態で循環する。コレステロールを輸送するタンパク質は、リポタンパク質であり、これらは、それらの密度を基に３つのクラスに分割される。非常に低い密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）は、肝臓中で合成されそして最終的に低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に変換されるトリグリセリドリッチのリポタンパク質であり、これは、ヒトにおいて大部分の血漿コレステロールを輸送する。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、トリグリセリドリッチなリポタンパク質の異化、ならびに末梢組織からのコレステロールの除去および肝臓への輸送に関与しているリポタンパク質である。血清ＨＤＬレベルと冠状動脈疾患との間の逆の関係が確立されている。特に、ＨＤＬと関連する血清コレステロールの比率が低いと、冠状動脈疾患のリスクは増加する。
【０００３】
アテローム生成疾患のリスク評価および管理における相対的血清コレステロールレベルの重要性を考慮して、相当な努力が費やされ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、および総コレステロールならびにトリグリセリドの血清レベルに対する、正常個体および高リスク個体の両方の大集団をスクリーニングしている。高リスク個体の処置の有効性は、種々のリポタンパク質区画におけるコレステロールの血清レベルの定期的試験によってモニターされている。
【０００４】
特異的ＨＤＬコレステロール試験の１つの方法は、代表的には、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋のような第２族カチオンの存在下の、硫酸デキストラン、ヘパリン、またはホスホタングステートのようなポリアニオン性化合物による血清中の非ＨＤＬリポタンパク質の選択的沈殿を基にしている。沈殿の特異性および程度は、種々の因子に依存し、沈殿試薬のタイプおよび濃度を含む。一般に、血清コレステロール粒子の沈殿の順序は、ポリアニオンの濃度の増加とともに、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬである。ＨＤＬの少量のａｐｏＥ種は、低密度粒子と共沈殿され得るが、ＨＤＬは、通常、低密度粒子を完全に沈殿させるヘパリンまたは硫酸デキストランの濃度で可溶性のままである。低密度粒子の選択的沈殿により、ＨＤＬ血清コレステロールレベルが決定され得る。
【０００５】
代表的な脂質アッセイ手順では、小容量の血液が採取され、そして遠心分離されて透明な血漿または血清サンプル流体を生成する。このサンプル流体は、次いで、（ａ）総血清コレステロール、（ｂ）トリグリセリド、および（ｃ）ＨＤＬコレステロールの決定のために、いくつかのアッセイチューブ中でアリコートにされる。ＨＤＬサンプルは、上記のように沈殿され、そして低密度粒子は、コレステロール検出の前に濾過または遠心分離によって除去される。次いで、これらサンプルは、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびＨ２Ｏ２の存在下で別個の着色産物に酸化され得る色素を含む酵素混合物と反応される。これらチューブは、分光光度計で読み取られ、そして所望の総、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール値が決定され得る。
【０００６】
まさに記載された液相コレステロールアッセイで達成され得る精度および信頼性にかかわらず、このアッセイは、広範なスクリーニングでの使用のためには多くの制限を有している。第１に、この方法は、静脈血サンプルを使用し、血液サンプルを採取および分画するため、および個々のアッセイチューブに処理血液をアリコートとするために訓練された技術者を必要とする。（ＨＤＬ決定のための）少なくとも１つのサンプルチューブは、沈殿剤で処理され、そして沈殿した物質を除去するために、さらに処理されなければならない。これら手順のいくつかは自動化され得るが、この目的のために設計された分析機械は高価であり、そして大病院の外では広く利用可能ではない。
【０００７】
本明細書中にそれら各々が参考として援用される、同時所有の米国特許第５，２１３，９６４号、同第５，２１３，９６５号、同第５，３１６，１９６号および同第５，４５１，３７０号は、血清コレステロールレベルを測定するための液体アッセイ手順にともなう上記の問題の多くを実質的に克服する方法およびアッセイデバイスを開示している。１つの実施形態では、このデバイスは、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子をもまた含む血液サンプル中のＨＤＬ関連コレステロールの濃度を測定するために設計されている。このデバイスは、流体サンプルがマトリックスを通じて移動するとき、可溶性リポタンパク質と沈殿したリポタンパク質とを分離し得る篩マトリックスを備える。このマトリックスと関連するリザーバーが、流体サンプルがこのマトリックス中に引かれ、かつそれを通るとき、ＬＤＬとＶＬＤＬとを選択的に沈殿するための可溶性沈殿剤を放出するように設計されている。これは、この篩マトリックスを通るより速いＨＤＬ移動を基に、沈殿したリポタンパク質からのＨＤＬ分離を可能にする。上記流体サンプルは、それ故、非ＨＤＬリポタンパク質が枯渇し、次いで試験表面に移され、そこで、それはコレステロールについてアッセイされる。
【０００８】
上記で参照したデバイスは、液体相アッセイを超える利点を提示するが、沈殿試薬での流れ輸送経路の汚染の可能性を提示する。このような試薬は、ＨＤＬ定量化、または複数アッセイデバイスのその他の領域で起こるその他のアッセイ化学を妨害し得る。本発明は、これらの問題を取り扱い、かつ克服する。
【０００９】
血液サンプル中のＨＤＬコレステロールを測定するためのさらなる方法およびデバイスは、ＥＰ ０４０８２２３およびＥＰ ０４１５２９８（Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆら）に開示され、これは、以下のステップおよび対応する要素を備える試験片上で実施される連続的アッセイ方法を記載している。血液サンプルは、細胞血液成分を分離するために分離層に付与される。毛細管力または重力により駆動され、サンプルは、可溶性沈殿剤を含むさらなるキャリアを通って流れ、これは、血清サンプル中に溶解した後、このサンプル中に含まれる非ＨＤＬリポタンパク質を沈殿する。さらなるキャリア中では、上記の沈殿された成分は、血清サンプルから濾過され、後のＨＤＬ定量をそれらが妨害することを防ぐ。同じキャリア中で、サンプルは、ＨＤＬ定量キャリアに隣接する位置に輸送され、そしてＨＤＬ定量ステップが開始されるまで貯蔵される。最後に、サンプルは、ＨＤＬ定量層に移され、そこで血清サンプル中のＨＤＬコレステロールが、酵素反応によって定量される。
【００１０】
このアッセイ設計の欠点は、リザーバーとして機能するキャリアが、沈殿成分または可溶性試薬のサンプル中への移動を可能にし、これが、ＨＤＬ定量を妨害し得ることである。さらに、血清サンプルの貯蔵の間に、ＨＤＬが、キャリア繊維への付着により捕獲され得、沈殿試薬が、さらなる所望されない反応を引き起こし得、そして上記キャリアが、血清サンプルを乾燥することにより凝集するようになり得る。
【００１１】
米国特許第５，１３５，７１６号（Ｔｈａｋｏｒｅ）は、血液流体サンプル中のＨＤＬ定量のためのさらなるデバイスおよび方法を開示している。これらのデバイスでは、流体サンプルが、ＨＤＬ定量のために、入口ウェルからキャリアに、非破壊経路を通って、連続的に流れる。従って、ＨＤＬ試験キャリアに入るサンプル容量を制御する、およびＨＤＬアッセイのための環境条件を制御する能力は、制限される。上記いずれのデバイスも、単一の流体サンプルからの種々の分析物の同時アッセイを提供しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、上記に記載した先行技術の欠点を克服するＨＤＬアッセイデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、ＨＤＬ試験パッドと試薬パッドを結合することによって形成されるアッセイパッドを含み、ここで、このアッセイパッドは、サンプルが、試薬パッドからＨＤＬ試験バッドに通過するに十分な多孔度を保持している。このアッセイパッドは、さらに、上記試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッド上の試薬の生物学的活性を保持している。
【００１４】
別の局面では、本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスおよび方法を含む。このデバイスは、サンプル分与アレイ、ＨＤＬ、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；およびこの血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備える。このＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドは、接着層により、またはこれらパッドを加熱することにより接合されている。
【００１５】
なお別の局面では、本発明は、上記接合されたＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドを調製するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、他であることが示されなければ、以下の意味を有している。
【００１７】
流体が、１つ要素からその他の要素に毛細管作用および／または重力によって移動し得るとき、要素は、別の要素と、「流体連通」にある。これら要素は、直接接触している必要はない；すなわち、上記流体は、その他の要素を通過して介入され得る。
【００１８】
「サンプル分与パッド」、「試験パッド」、「ＨＤＬ試験パッド」、および「試薬パッド」の文脈で用いられるとき、「パッド」は、吸収剤材料の薄い、平坦なマットもしくはクッション、またはその一片を意図する。パッドは、多孔性膜または繊維性細片（ｓｔｒｉｐ）のような任意の材料から構成され得、それは、含浸または固定化された試薬を含み得、そしてそれを通り流体が毛細管作用および／または重力により移動し得る。
【００１９】
（ＩＩ．アッセイデバイス）
本発明によるデバイスは図１〜３に示され、これらは、以下に論議される。便宜のため、類似の要素の番号付けは、同様の構造特徴を識別するためにすべての図１〜３で保持される。このデバイスは、代表的には１０〜５０μｌの小容量の血液または血清サンプルを用い、特に、ＨＤＬに関連する血清コレステロール（ＨＤＬ関連コレステロール、または単にＨＤＬコレステロールとも称される）を決定するために設計されている。総コレステロール、トリグリセリド、グルコース、アラニントランスフェラーゼレベル（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、またはクレアチニンのようなその他のアッセイは、同じサンプルから同時に決定され得る。ＨＤＬ関連コレステロールの決定はまた、単に、ＨＤＬの決定またはＨＤＬアッセイとも呼ばれ得る。
【００２０】
図１〜３を最初に参照して、複数分析物アッセイデバイスの種々の実施形態が示され、図２は分解された様式で示される。図１で最も良く観察されるように、この複数分析物アッイデバイス１４は、本体または支持体１５を含み、これは、一定量、代表的には、約２５〜５０μＬの間の血液サンプルを受容する寸法およびサイズのウェル１６を規定する。このウェルは、随意篩パッド２２と流体接触され得、これは、上記支持体の上エッジ中に形成されたノッチ領域２０中に保持され得る。この流体接触は直接であり得るか、または図１に示されるデバイスにおけるように、ウェルのベースでプレート中に形成される毛細導管１８によって提供される。この支持体は、好ましくは、標準的な鋳型または機械加工方法よって形成される、ウェル、ノッチのある領域および／または毛細管を有する。プラスチックプレートである。
【００２１】
領域２０に保持される篩パッド２２は、サンプルが、このパッドマトックスを通って、この図に示されるように、底から上の方向に移動するとき、（血液細胞を含む）大きな粒子状物質を部分的に除去するように作用する。パッド２２は、好ましくは、血液サンプルが上記マトリックスを通じて引かれるとき、表面湿潤によって水性流体を引き、そして血液細胞の移動を遅らすように設計されたガラス繊維状のマトリックス材料から形成される。１つの例示のパッドは、約０．１６ｇ／ｃｍ３の充填密度、および約１ｍｍの厚みを有する、Ｗｈａｔｍａｎから入手可能な、ＧＦ／Ｄ、ＰＤ００８、またはＦ１４５−０２フィルターのようなガラス繊維フィルターである。このパッドは、規定された容量、好ましくは約１５〜２５μＬの間のサンプル流体を吸収するような寸法である。篩パッド２２は、レクチン、赤血球細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、トロンビン、またはイオン交換剤のような、赤血球捕獲試薬をさらに含み得る。１つの実施形態では、上記パッドは、以下にさらに詳細に論議されるように、非ＨＤＬリポタンパク質の除去のための試薬を含み得る。
【００２２】
上記サンプルは、細長い細片またはサンプル分与アレイ２６と接触する。上記篩パッド２２は、ウェル１６とアレイ２６との間でアレイ２６と流体接触し得る。好ましい実施形態では、アレイ２６は、流体連通している３つ以上の別個の膜から形成される。図２に見られるように、アレイ２６が流体連通している３つの膜から形成される実施形態では、中央サンプル付与膜２８は、サンプル流体をサンプル回収膜３０および３２に分与する。このアレイ２６は、図示されてはいないが、サンプル付与膜２８とサンプル回収膜３０との間に配置された１つ以上の試薬膜をさらに備え得る。この試薬膜は、１以上の試薬を含み得る。１つの実施形態では、この試薬膜は、以下にさらに記載されるように、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に除去するための１つ以上の試薬を含み得る。別の実施形態では、試薬膜は、複数試験のためのサンプルを引く芯（ｗｉｃｋ）として機能し得る。アレイ２６はまた、図２に示されるように、発泡クッション２７またはその他の支持体によって支持され得る。アレイ２６は、好ましくは、ガラス繊維のマトリックスから形成される複数の膜である。上記マトリックスの充填密度および厚みは、上記サンプル付与膜およびサンプル回収膜に供給されるサンプル流体の容量、例えば、１０〜２５μＬを吸収および分与するようである。このマトリックスは、約０．１６ｇ／ｃｍ３と、４．０ｇ／ｃｍ３の間の好ましい充填密度を有する。１つの例示的な細片材料は、約０．２ｇ／ｃｍ３の充填密度おび約０．１２ｍｍの厚みを有する、Ｗｈａｔｍａｎから入手可能な、Ｆ−１６５−２５Ａガラス繊維フィルターである。
【００２３】
上記デバイスはさらに、湿潤可能な吸収剤反応試験パッドである、４つ以上の試験パッド６４、６６、６８、および７０を含む。特定のアッセイで用いられる各試験パッドは、以下にさらに記載されるように、公知の様式で検出され得るパッド中の分析物依存性変化を生成するために有効な分析物依存性試薬を含む。試験パッドのすべてのまたは任意の完全なサブセットは、特定のアッセイ中で採用され得る。
【００２４】
所望であれば、これらの試験パッドは多孔性ポリマー膜であり、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚み、および約３ｍｍの側方寸法を有する。各パッドの吸収容量は、好ましくは、約０．５〜１．０μＬの間である。１つの実施形態では、いくつかまたはすべての反応パッドは非対照的な膜であり；すなわち、膜は、膜の厚みを横切る多孔度の勾配を有する。
【００２５】
１つの実施形態では、試験パッド６４は、ＨＤＬの存在に応答して、パッド中に変化を生成するために有効な試薬を含むＨＤＬ試験パッドである。別の実施形態では、このＨＤＬ試験パッド６４はまた、ＨＤＬレベルをアッセイするための試薬を含むポリマー膜である。１つの例示の細片材料は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）から入手可能なＢＴＳ−８３非対称ポリスルホン膜である。所望であれば、ペルオキシダーゼのようなＨＤＬアッセイ試薬は、酵素固定化のための周知の方法に従って試験パッド膜に固定化され得る（例えば、米国特許第４，９９９，２８７号；米国特許第５，４１９，９０２号；Ｂｌｕｍ、Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．２０（２）：３１７〜２６（１９８７）；Ｋｉａｎｇ、Ｓ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２（８）：１３７８〜８２（１９７６）；Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、Ｇ．Ｇ．編、Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２巻：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｖ．Ｐ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１１巻：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９１）を参照のこと）。
【００２６】
試薬パッド７４は、上記ＨＤＬ試験パッド６４と接触し、そして非ＨＤＬコレステロールの沈殿のための化学薬品を含む。１つの実施形態では、この試薬パッドは、上記ＨＤＬ試験パッドと同じ材料、すなわち、非対称ポリスルホン膜である。このましい実施形態では、試薬パッド７４は、約１μｍ以下のポアサイズを有する多孔性ポリマー膜から構成される。図１に示されるデバイスでは、試薬パッド７４は単一の膜からなるが、本発明はまた、複数、すなわち約６までの積み上げられた膜の使用を企図し、そこでは、少なくとも１つ、そして好ましくは各々の膜か、非ＨＤＬリポタンパク質を結合するために試薬を含む。
【００２７】
上記試薬パッドは、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚み、約３×６ｍｍの側方寸法、および約０．５〜１．０μＬの吸収容量を有する。それは、流体サンプルからＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子を選択的に除去するのに有効な少なくとも１つの試薬を含む。この試薬は、例えば、抗体、または好ましくは、ポリアニオン性ＬＤＬ−およびＶＬＤＬ結合試薬であり得る。当該技術分野で公知であるこのような試薬は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋のような第２族カチオンの存在または非存在下の、スルホン化多糖、ヘパリン、およびホスホタングステートを含む。好ましい試薬は、必要に応じて酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムと組み合わせ、必要に応じて中性ｐＨを維持するよう緩衝化された、５０，０００〜５００，０００ダルトンの代表的な分子量を有する、硫酸デキストランのようなスルホン化多糖である。この試薬は、流体サンプルから、非ＨＤＬリポタンパク質を結合、および除去するに有効な固定化試薬であり得る。上記試薬パッドは、この試薬パッド内に結合された非ＨＤＬリポタンパク質を包括し、そしてそれらがＨＤＬ試験パッド６４に入ることを防ぐために有効である。１つの実施形態では、ＨＤＬ試験パッド６４から下流に拡散し得る任意の発生過酸化水素を分解するために有効である、カタラーゼのような試薬が、試薬パッド７４中に固定化され得る。
【００２８】
ＨＤＬ試験パッド６４および試薬パッド７４は、実施例６に記載のように、熱単独、または実施例１〜３に記載のように、熱活性化接着剤として溶融され得るアクリル酸コポリマーを用いて一緒に接着され得る。この組合せられたＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドは、アッセイパッドと呼ばれる。
【００２９】
デバイス１４はまた、透明であり得るか、または、ウインドウ、例えばウインドウ７６（図２）を有し得る細長い支持体である反応バー６０を含む。このウインドウ（単数または複数）は、試験パッド６４、６６、６８、および７０が、上記支持体を通して見られることを可能にする。これらのウインドウは、透明材料であり得るか、または単に支持体中の開口であり得る。これら試験パッドおよびアッセイバッドは、上記反応バーに、透明または半透明接着剤材料により、音波溶接により、またはその他の適切な結合方法により取り付けられる。
【００３０】
上記反応バーは、支持体１５上に、（ａ）上記デバイスを、試験パッドおよびアッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッドまたはウェルから間隔をおいて離れるサンプル分与位置に維持するため、および（ｂ）上記デバイスを、試験パッドおよびアッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッドおよびウェルと流体連通にある試験位置に移動するために有効な取り付け手段により取り付けられる。この取り付け手段はまた、このような流体連通を、所望の量のサンプルがアッセイパッドおよび／または試験パッドに入ったのち、および／または所定の接触時間の後、このデバイスを、試験位置から、アッセイパッドおよび／または試験パッドがサンプルウェルと流体連通していない位置（これは、「サンプル分与」位置と同じであり得る）へ移すことによって破壊するために用いられ得る。このような移動は、その内容が本明細書中に参考として援用される共有に係る米国特許第５，１１４，３５０号に記載のように、湿潤の程度を反映する、試験パッドの上表面における反射率をモニターすることにより制御され得る。あるいは、パッド材料の吸収能力およびサンプル取り込み速度が既知であるとき、サンプルの量は、単に所定の接触時間を用いることにより十分な正確さで制御され得る。
【００３１】
この取り付け手段は、例えば、エラストマーブロック７１、７２のような、一対の弾力性部材を含み得、これらは、アッセイパッドを、非移動またはサンプル分与位置に向かって付勢するように作用し、そこで、これらパッドは、サンプル分与アレイ、篩パッド、毛細導管またはサンプルウェルから間隔を置いて離れる。図３に示されるように、この弾力性部材の圧縮または解放により、アッセイパッド間の流体連通が選択的に確立かつ分離され得る。この流体連通は、直接接触によるか、または中間要素を通じてであり得る。支持体ブロックは、スプリングまたはピストン様作用により圧縮され得る。あるいは、外部の機械的デバイスは、本体１５および／または反応バー６０と係合し得、そして１つをその他に向かって移動する。このようなデバイスは、クランプ、ピストン、ステッピングモーター、ウォームギアなどのような従来コンポーネントを含み得る。例示のシステムは、本明細書に記載されるようなアッセイデバイスとの使用のために有利な、内蔵タイプの自動化分析器であるＣｈｏｌｅｓｔｅｃｈ ＬＤＸ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒである。
【００３２】
さらなる実施形態では、上記ＨＤＬ試験パッドは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５８９６６（Ｄｏｂｓｏｎら）に記載のようなバイオセンサーを備え、これは、本明細書中に参考として援用される。この文献は、伝導性表面、この伝導性表面を重層する誘電性材料、およびこの誘電層を通じて延びる複数のポアを備えるマイクロスケールのバイオセンサーデバイスを開示している。これらポアの各々は、上記伝導性表面と接触するバイオポリマーを含み、そして化学的応答を電気信号に変換する微小電極として作用し得る。使用において、アッセイされるべき分析物を含む流体は、上記ポアに上記バイオポリマーと接触するように付与される。本発明のＨＤＬアッセイデバイスでは、これは、ＨＤＬ試験パッド６４がサンプルと流体連通している、すなわち、図３に示されるような試験位置にあるとき達成される。
【００３３】
上記微小電極ポア内のバイオポリマーは、代表的には、例えば、ＨＤＬ関連コレステロールの測定のための、コレステロールオキシダーゼのような酵素である。コレステロールは、コレステロールオキシダーゼによって対応するケトンに酸化され、過酸化水素を放出し、これは、次いで、酵素ペルオキシダーゼによって水および酸素に変換され得る。酸素または過酸化水素のいずれかが、次いで、電気化学的に測定され得る。用いられ得る電気化学的方法は、Ｃｌａｒｋ酸素電極におけるように、酸素の還元または過酸化水素の酸化によって生成される電流を測定する電流測定方法、または電圧測定を含む。微小電極におけるサイクリックボルタンメトリーの使用は、種々の分析物の測定について記載されており（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２８９〜２９７（１９９４）を参照のこと）、例えば、ドーパミン（Ｐｉｈｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８（１３）：２０８４〜９（１９９６））およびフラーレン（Ｓｏｕｃａｚｅ−Ｇｕｉｌｌｏｕｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５（６）：６６９〜７２（１９９３））ならびに過酸化水素（Ｈｏｒｒｏｃｋｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５（２４）：３６０５〜１４（１９９３）；Ｎｏｗａｌｌら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ９（２）：１０２〜９（１９９７）；Ｄｅｑｕａｉｒｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４（２）：２４０〜５３（２００２））がある。
【００３４】
（ＩＩＩ．接着層を用いるアッセイパッドの調製）
図１に見られるように、１つの実施形態では、アッセイパッドは、実施例１〜３に記載されるように、試薬パッド７４とＨＤＬ試験パッド６４との間に接着層８０を形成することにより調製される。接着層８０によって接合され、試薬パッド７４とＨＤＬ試験パッド６４とは、アッセイパッドと称されるコンポジット構造体を形成する。この接着層は、例えば、周縁シールによって対向するパッドを固定するために十分であることのみが必要であるか、または対向するパッドの全体表面の上に延び得ることが認識される。
【００３５】
この接着層は、好ましくは、アクリル酸コポリマーから形成される。このコポリマーは、必ずしもそうである必要はないが、代表的には、用いられるＨＤＬアッセイ試薬の変性温度未満の融点を有し、すなわち、そうでなければ、ＨＤＬアッセイ試薬に損傷を与える。１つの例示のコポリマーは、エチレンアクリル酸コポリマー（ＥＡＡ）である。ＥＡＡは、Ｍｉｃｈｅｌｍａｎ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ ＯＨ、約７５℃の融点をもつＰ／Ｎ ＭＰ ４９９０Ｒ）から異なる粒径分散物として入手可能である。１つの好ましい粒子サイズは、３０〜５００ｎｍであり、平均粒子サイズは約９０ｎｍである。ポリエチレングリコール、ポリエチレンテレフタレート、およびポリビニルアルコールを含むその他のポリマーもまた、この接着層としての使用を見出し得る。これらのコポリマーは、架橋され得、そして第２の異なるポリマーとさらに共重合され得る。別の実施形態では、上記接着層は、感圧接着剤またはワックスエマルジョンから形成される。なお別の実施形態では、上記接着層は、本明細書に参考として援用される米国特許第６，５９６，１１２号に記載のようなホットメルト接着剤から形成される。上記アッセイパッドが、上記サンプルが試薬パッドからＨＤＬ試験パッドに流れるために適正な多孔度を保持する接着層のために任意の物質が用いられ得ることが認識される。
【００３６】
上記コンポジットアッセイパッドは、代表的には、上記コポリマーを、しばしば水ベースの溶液である適切な溶媒中に溶解することにより調製される。コポリマーエマルジョンまたは溶液の層が試薬パッド７４に付与される。パッドを被覆するための任意の適切な-方法が利用され得、これらパッドをエマルジョン中または溶液に浸漬すること、パッドをスプレーコーティングすること、または芯をもつパッドにポリマー溶液を付与することを含む。パッドは、一方の側面のみ、または両方の側面上にコートされ得る。このパッドは、適切な時間、すなわち、約２０分間、５０℃で乾燥される。沈殿試薬が、次いで、非対称膜の大ポア（鈍い（ｄｕｌｌ））側面上に分与される。
【００３７】
上記試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドが両方とも非対称膜から形成されるとき、この試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドは、試薬パッドの小ポア（ピカピカ（ｓｈｉｎｙ））側面が、ＨＤＬ試験パッドの開放ポア（鈍い（ｄｕｌｌ））側面に接触するように配向される。
【００３８】
上記ＨＤＬ試験パッド６４と試薬パッド７４との間のコポリマー接着層は、コートされた試薬パッド７４およびＨＤＬ試験パッド６４に熱および／または圧力を付与することにより形成され、それによって、このコポリマーは、隣接するパッド材料との結合を形成する。これらパッドは、必要な温度および圧力で熱を提供する任意の適切なデバイスを用いて加熱され得る。これらパッドを加熱するための好ましい温度は、約８０℃である。任意の適切な積層機械が用いられ得る。
【００３９】
試薬パッド上のコポリマーの濃度は、上記アッセイパッドが、上記サンプルが試薬パッドからＨＤＬ試験パッドに流れる多孔度を保持するようでなれればならない。接着を提供するためのコポリマーの適正な濃度は、約４．０％〜約１０．０％のエマルジョンである。ポリマーコーティングの好ましい濃度は、４％、５％、６％、７％、８％、９％および１０％である。１つの好ましいエマルジョンは、５．５％ＥＡＡエマルジョンである。
【００４０】
上記ＨＤＬ試薬は、ＨＤＬ試験パッド６４上に、試験パッドを試薬パッドに接着する前または後に任意の適正な方法によって分与され得る。このＨＤＬ試薬は、好ましくは、試験パッドを試薬パッドに接着した後、試験パッド上に分与される。
【００４１】
（ＩＶ．熱を用いるアッセイパッドの調製）
１つの実施形態では、アッセイパッドは、実施例６に記載のように、試薬パッドまたはＨＤＬ試験パッドの少なくとも１つを少なくとも部分的に溶融するに十分な温度で付与された熱を用いて、試薬を含む試薬パッド７４をＨＤＬ試験パッド６４に接着することにより調製される。この試薬パッドおよびＨＤＬパッドは、本明細書に参考として援用される米国特許第６，５９６，１１２号に記載されるように、約６５℃を超えて約２２０℃まで加熱される。好ましい実施形態では、試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドが約１６５℃を超えて加熱されるとき、これらパッドは、互いに接着するようになる。その他の好ましい実施形態では、試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドは、約９３℃、１２１℃、１４８℃、１６５℃、２００℃、または２０５℃を超えて加熱される。これらパッドは、上記のように配向される。ＨＤＬ試薬は、試験パッドを試薬パッドに接着する前、または後にＨＤＬ試験パッド上に分与される。好ましい実施形態では、試験パッドが試薬パッドに接着した後、上記ＨＤＬ試薬が、ＨＤＬ試験パッド上に分与され、および／または非ＨＤＬコレステロールの沈殿のための化学薬品が、試薬パッド上に分与される。特に好ましい実施形態では、ＨＤＬ試薬および沈殿のための化学薬品の両方が、試験パッドおよび試薬パッドが一緒に接着された後、ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッド上にそれぞれ分与される。
【００４２】
（Ｖ．プリントプロセスを用いてアッセイパッド上に試薬を分与すること）
別の実施形態では、食刻されたＧｒａｖｕｒｅシリンダーまたはＡｎｉｌｏｘシリンダーを取り込むプリントプロセスを用いて、１つ以上の試薬が予備積層された膜の対向する側面に付与される。この実施形態では、飽和容量より少ないＨＤＬ試薬および沈殿試薬が用いられる。非飽和容量を用いることにより、これら試薬は、それらの個々の膜に閉じ込められ得る。約８０ｍｌ／１０００インチ２（８０ｍｌ／０．６４５ｍ２）の容量が、代表的な飽和容量である。試薬の２５〜５５ｍｌ／１０００インチ２（２５〜５５ｍｌ／０．６４５ｍ２）の容量が適切であるが、１つの実施形態では、２０ｍｌ／１０００インチ２（２０ｍｌ／０．６４５ｍ２）の試薬が用いられる。沈殿試薬は、このＨＤＬ試薬の前または後に付与され得る。このプリンティングプロセスのその他の実施形態では、別個に維持されなければならない２つの成分を含むその他の試薬が、ＨＤＬ試薬について記載されるのと同様の様式で付与され得る。あるいは、単一の試薬が、単一の積層されていない膜に付与され得る。
【００４３】
（ＶＩ．アッセイ方法）
操作においては、血液サンプルがウェル１６中に配置され、そして篩パッド２２を通って吸収され、そこで、赤血球細胞を含む大きな粒子が除去され、そしてそれから、サンプル分与アレイ２６に入る。１つの実施形態では、これらのステップは、上記デバイスが、アッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッド、毛細導管、またはサンプルウェルと流体連通していないような、「サンプル分与」ステージにある間に起こる。
【００４４】
血漿サンプルは、サンプル付与膜２８からサンプル回収膜３０および３２に移動する。血漿サンプルがサンプル回収膜に到達するとき、デバイスは、好ましくは反応バー６０を移動することによって、例えば、図３に示されるような試験位置に調節され、アッセイパッドを、サンプル分与アレイとの流体連通に置く。この位置では、サンプル分与アレイ中のサンプル流体は、毛細管流れによって試薬パッド中に引かれる。このサンプル流体は、さらに、毛細管流れによってＨＤＬ試験パッド（単数または複数）中に引かれる。上記反応バーは、この位置に、試験パッド（単数または複数）の所望の程度の湿潤が達成されるまで、この位置に保持される。このバーは、次いで、所望であれば移動され、所望の量のサンプル流体がアッセイパッド（単数または複数）に入った後、および／または適切な接触時間の後、サンプル分与アレイとアッセイパッドとの間の流体連通を断絶する。
【００４５】
ＨＤＬ試験パッド６４を接触させる前に、サンプル血漿は、別個の試薬パッド７４中に含まれる沈殿試薬または結合試薬と、非ＨＤＬリポタンパク質が個々のキャリアに結合されるように接触する。このデバイスは、従って、液体相ＨＤＬを含むサンプル流体の、これらの要素（例えば、図２）でのＨＤＬ試験パッド６４への通過を可能にしながら、血清から非ＨＤＬリポタンパク質を除去するために有効である。この実施形態の１つの利点は、上記サンプル分与アレイおよび上流要素が非ＨＤＬ結合試薬を含まないことであり；このような試薬は、試薬パッド７４中にのみ存在する。従って、ＨＬＤ以外の分析物のアッセイにおけるこれらの試薬からの妨害の可能性は排除される。
【００４６】
操作の間、図１〜３に示されるような実施形態では、サンプルがパッド７４および６４を含むＨＤＬアッセイパスを通過するとき、その先導エッジは、非ＨＤＬリポタンパク質が反応かつ包括されるパッド７４を通って上方方向に、そしてＨＤＬ関連コレステロールの測定のために、ＨＤＬがその中でアッセイ試薬と反応する隣接試験パッド６４に直接通過する。サンプルのさらなる部分は、この時間の間、パッド７４と接触することを継続し、そしてパッド６４の吸収能力に到達するまで、パッド７４からパッド６４に同様の様式で進行する。従って、試験パッド６４中のＨＤＬ関連コレステロールの定量が、試薬パッド７４で起こる結合反応と同時に生じる。好ましくは、サンプル分与マトリックスからＨＤＬアッセイ経路（パッド７４および６４を含む）に移されるサンプル流体の容量は、試験パッド６４の吸収能力と等しいかまたはそれより大きく、そして試験パッド６４と試薬パッド７４の合わせた吸収能力より小さいかまたはそれに等しい。
【００４７】
これらの実施形態では、サンプル流体が結合試薬を含む試薬パッド７４と接触するとき、後者がＨＤＬ試験パッド６４と直接接触し、従って、ＨＤＬ反応の前に、血液サンプルの結合試薬との一時的接触を制限する。サンプル調製およびＨＤＬ評価は、従って、別個のステップで実施され、そこでは、サンプル調製は、例えば、細胞血液成分の濾過、そして必要に応じて、血液サンプルの一時的貯蔵、および温度、圧力および環境雰囲気のような試験要求または条件への血液サンプルの適応を含む。血液サンプルの異なる試薬との一時的接触が減少されるので、ＨＤＬ評価に関する任意の化学的妨害が防がれる。所望であれば、上記アッセイは、試験を支持するために、例えば、周囲雰囲気を調製または環境温度を適応するために、サンプル付与および細胞成分の除去の後ではあるが、結合試薬と接触する前に、所望の時間の間中断され得る。これは、サンプル分与位置にデバイスを維持することにより達成される。この目的のために、必要であれば、サンプル分与マトリックスは、さらにリザーバーとして供するように設計される。
【００４８】
上記ＨＤＬ試験パッドは、ＨＤＬ関連コレステロールの定量のための試薬を含む。好ましくは、これらは、ＨＤＬから遊離のコレステロールを放出するためのコレステロールエステラーゼ、遊離のコレステロールとの反応によりＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにペルオキシダーゼおよびＨ２Ｏ２の存在下で独特の着色信号反応産物に変換されるカップルされる色素システムを含む。この試験パッドはまた、上記のように、Ｈ２Ｏ２および／またはＯ２を電気化学的に定量するために有効なバイオセンサーを含み得る。
【００４９】
残りの試験パッド６６、６８、および７０はまた、公知の様式で、目視により、または検出器により光学的に検出され得るパッド中の変化を生成するアッセイ試薬を含む。本発明のデバイスおよび方法の好ましい実施形態では、上記非ＨＤＬ結合試薬は、サンプル分与アレイまたは篩パッド中ではなく、試薬パッド７４中に位置する。この実施形態では、ＨＤＬ以外の分析物のアッセイで、これら試薬からの妨害の可能性が排除される。
【００５０】
好ましくは、これら試験パッドの各々は、酵素を用いた分析物の反応を経由してＨ２Ｏ２を生成するための反応成分を含み；このＨ２Ｏ２は、引き続き、上記のように、基質試薬を着色信号反応産物に変換するか、または電気化学的に測定される。Ｈ２Ｏ２の酵素的生成のための種々の基質特異的オキシダーゼ、および着色反応産物を形成するための色素の引き続く酸化を採用する酵素着色反応は周知である。
【００５１】
４つ以上の試験パッドを有するデバイスを用いて、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、グルコース、総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド脂質（ＴＲＧ）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、および／またはクレアチニンを同時に測定し得る。各パッドは、上記に記載の共通経路成分（ペルオキシダーゼおよびカップルされた色素システム）を、発生したＨ２Ｏ２が、別個の着色信号反応産物を生成するように含む。沈殿試薬または結合試薬に曝されることなく血清に曝される総コレステロール試験パッド、およびＨＤＬ試験パッドは、各々、共通経路成分に加え、上記に記載のような、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ粒子を含む血清リポタンパク質から遊離のコレステロール形態にあるエステル化コレステロールを放出するためのコレステロールエステラーゼ、ならびにサンプル流体中の遊離のコレステロールとの反応によりＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロールオキシダーゼを含む。グルコースアッセイパッドは、上記共通経路成分に加え、グルコースオキシダーゼを含む。トリグリセリドバッドは、上記共通経路成分に加え、中間体Ｌ−グリセロール−３−リン酸を経由して、トリグリセリドからＨ２Ｏ２を生成するために、リパーゼ、Ｌ−グリセロールキナーゼ、およびＬ−グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを含む。このＴＲＧパッド中に引かれた血清サンプルは、沈殿試薬または結合試薬に曝されず、そしてそれ故、血清リポタンパク質のすべてを含むので、このＴＲＧ信号は、総血清トリグリセリドを表す。
【００５２】
参照標準パッドもまた、採用され得る；例えば、本明細書中に参考として援用される、共有に係るの米国特許第５，１１４，３５０号に記載のシステムを参照のこと。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明を示すが、いかなる様式においても、本発明を限定する意図はない。
【００５４】
（実施例１：ＨＤＬ試験パッドの調製）
ＢＴＳ−８３ポリスルホン膜に、７７μｌ／インチ２の充填容量でＨＤＬ試薬を充填し、そして連続ロールプロセスで２０分間５０℃で乾燥した。以下のＨＤＬ試薬を含む試験パッドを調製した：コレステロールオキシダーゼ３６．５単位／ｍｌ、コレステロールエステラーゼ２１５単位／ｍｌ、ペルオキシダーゼ２００単位／ｍｌ、４−アミノアンチピリン１．８８ｍｇ／ｍｌ、およびＴＯＯＳ（３−［エチル（３−メチルフェニル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）１２．０５ｍｇ／ｍｌ。例えば、１００フィートの長さが、この様式で調製され得、そしてアッセイデバイスに適合するために切断され得る。
【００５５】
（実施例２：結合試薬をもつ試薬パッドの調製）
５．５％の濃度でＥＡＡ分散物を含む試薬水溶液を、浸漬タンク内でＢＴＳ−８３ポリスルホン膜に付与し、そして連続ロールプロセスで２０分間５０℃で乾燥した。次いで、１〜５ｍｇ／ｍｌの硫酸デキストラン（５００，０００ＭＷ）および３５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２を含む試薬水溶液を、上記膜の１つの表面上への試薬を計測するためにシリンジポンプを用いて、同じ膜上に分散した。例えば、１００フィートの長さが、この様式で調製され得、そしてアッセイデバイスに適合するために切断され得る。
【００５６】
（実施例３：アッセイパッドの調製）
ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドを、それぞれ、実施例１および２に従って、調製した。これらパッドは配向されて、試薬パッドのピカピカの側面（小ポアサイズ）を有する層は、ＨＤＬ試験パッドの鈍いまたは開放ポア側面に接触している。これら２つの膜は、これら膜を８０℃に２０秒間連続ロールプロセスで加熱した積層機械を通過させた。
【００５７】
（実施例４：代表的なアッセイ手順）
代表的なアッセイを、本質的に実施例３に記載のように調製されたアッセイパッドを用い、ＬＤＸ（登録商標）分析器中で実施した。接着されたパッドのセクションを、反応膜サイズに手で切断し、そして反応バーに接着した。あるいは、積層されたアッセイパッドは、超音波溶接を用いる連続ロールプロセスで反応バーに付与され得る。血清サンプルをサンプルウェル中に充填した。サンプル分与の後、反応バーを、血清がＨＤＬ試験パッドを充填するに十分な血清を移動させるに十分な時間である約４秒間、接着されたパッドと接触し、その後、このバーをその元の位置に戻した。色を３分間発色させ、そして反射率をＬＤＸ（登録商標）分析器でモニターした。
【００５８】
（実施例５：試薬パッド上のアクリル酸コポリマー濃度）
試薬パッド上のＥＡＡの濃度を変動させて膜の多孔度を決定した。試薬パッドは、本質的に実施例２に従って調製した。ＥＡＡの系列希釈を、２０％溶液で開始して試薬パッドに付与した。これら試薬パッドは、実施例３に従って、ＨＤＬ試験パッドに接着した。試薬パッドの鈍い側面をＥｖａｎｓ ｂｌｕｅの希釈水溶液を用いて試験し、ＨＤＬ試験パッドまで、この試薬パッドを通る着色溶液の透過および／または拡散を決定した。この溶液の容易な透過および／または拡散を可能にしたＥＡＡの最高の濃度は、約１０％ＥＡＡであった。
【００５９】
（実施例６：熱を用いるアッセイパッドの調製）
ＢＴＳ８３の２つの層を、付与される任意の試薬なしで、連続ロールプロセスで一緒に積層する。膜の配向は、実施例３について記載されるようである。硫酸デキストラン（５０，０００ＭＷ）およびＭｇ（ＯＡｃ）２の水溶液を、標準的なグラビアコーター（ｇｒａｖｕｒｅ ｃｏａｔｅｒ）を用いてこの積層体の開放ポア側面上にコートする。このグラビアコーターは、非飽和容量の試薬をこの積層体の単一層上に分与するよう選択される。乾燥後、ＨＤＬ試薬は、同様の様式で対向する膜に付与される。これら試薬は、実施例１および２に示されるレベルから濃縮され、付与される減少した容量を補償する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、複数分析物アッセイデバイスの１つの実施形態の側面図である。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態に従って構成された複数分析物アッセイデバイスの分解された形態の斜視図である。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態による複数分析物アッセイデバイスの部分側面図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって：
サンプル分与アレイ；
ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；および
該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備え、ここで、該ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが接合されている、デバイス。
【請求項２】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、熱形成結合よって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、アクリル酸コポリマー接着剤結合によって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記アクリル酸コポリマーが、エチレンアクリル酸コポリマーである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つがポリスルホン層から構成される、請求項１〜４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
前記血液サンプルから、細胞成分を、該サンプルが前記分与サンプルアレイに接触する前に除去するに有効な篩パッドをさらに備える、請求項１〜５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
前記篩パッドを含むためのカセット本体をさらに備え、該カセット本体が、前記血液サンプルを含むための、かつ該篩パッドと流体連通するウェルを備える、請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記カセット本体に反応バーを取り付けるために有効な取り付け手段を備える反応バーさらに備える、請求項１〜７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
前記試薬が、結合性ポリアニオン試薬を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記結合性ポリアニオン試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項９に記載のデハイス。
【請求項１１】
前記ＨＤＬ試験パッドが、ＨＤＬコレステロールの存在下で検出可能な変化を生成する試薬を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１２】
前記変化が、光学的に検出され得る、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ＨＤＬ試験パッドが、バイオセンサーを備える、請求項１〜１２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
前記バイオセンサーが酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
血清コレステロールを測定するために適したデバイスを調製する方法であって：
試薬パッド、および小ポア側面および開放ポア側面を有する非対称ポリスルホン膜から形成されたＨＤＬ試験パッドを提供する工程；
該試薬パッドを、ＨＤＬ試験パッドと、該試薬パッドの小ポア側面が該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面と接触するように配向する工程；
該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；および
該デバイスを形成するために、（ｉ）該試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程、を包含する、方法。
【請求項１６】
前記加熱が１６５℃を超える温度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清コレステロールを測定するために適切なデバイスを調製する方法であって：
試薬パッドをアクリル酸コポリマーで被覆する工程；
（ｉ）ＨＤＬ試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程；
該デバイスを形成するために、該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；を包含する、方法。
【請求項１８】
前記アクリル酸コポリマーが、エレチンアクリル酸コポリマーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エレチンアクリル酸コポリマーが、約４．０％〜約１０．０％のエマルジョンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被覆する工程の後に、前記試薬パッドを乾燥する工程をさらに包含する、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドの各々が、小ポア側面および開放ポア側面を有し；該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドを、該試薬パッドの小ポア側面が、該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面に面するように配向する工程をさらに包含する、請求項１７から２０のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記加熱工程が、７５℃と９０℃との間の温度を付与することを包含する、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬに関連する血清コレステロールを測定する方法であって：
該サンプルを、（ｉ）ＨＤＬコレステロールの検出可能インジケータを有するＨＤＬ試験パッド、（ｉｉ）該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合かつ除去するために有効な試薬を含む試薬パッドを含む積層体と接触させる工程を包含し、
ここで、該血液サンプルが、該積層体を、該積層体を通る毛細管作用および／または重力によって通過し、ＨＤＬ濃度の測定を可能にする、方法。
【請求項２４】
前記篩パッドと、前記サンプル分与パッドと間の接触が、所望の量のサンプルが移動したとき断絶する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つが、多孔性ポリマー膜を備える、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬パッドが複数のスタック層を備え、その少なくとも１つが非ＨＤＬを結合するに有効な試薬を含む、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＤＬ濃度の測定が光学的検出による、請求項２３から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＤＬ試験パッドがバイオセンサーを備える、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオセンサーが、酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項２９に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって：
サンプル分与アレイ；
ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；および
取り付け手段に固定された、該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備え、ここで、該ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが接合され；
ここで、該取り付け手段が、該デバイスを、試験位置から、該ＨＤＬ試験パッドが該サンプル分与アレイと流体連通していない位置に移すために有効である、デバイス。
【請求項２】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、熱形成結合よって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、アクリル酸コポリマー接着剤結合によって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記アクリル酸コポリマーが、エチレンアクリル酸コポリマーである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つがポリスルホン層から構成される、請求項１〜４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
前記血液サンプルから、細胞成分を、該サンプルが前記サンプル分与アレイに接触する前に除去するに有効な篩パッドをさらに備える、請求項１〜５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
前記篩パッドを含むためのカセット本体をさらに備え、該カセット本体が、前記血液サンプルを含み、該篩パッドと流体連通するウェルを備える、請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記カセット本体に反応バーを取り付けるために有効な取り付け手段を備える反応バーさらに備える、請求項１〜７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
前記試薬が、結合性ポリアニオン試薬を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記結合性ポリアニオン試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項９に記載のデハイス。
【請求項１１】
前記ＨＤＬ試験パッドが、ＨＤＬコレステロールの存在下で検出可能な変化を生成する試薬を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１２】
前記変化が、光学的に検出され得る、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ＨＤＬ試験パッドが、バイオセンサーを備える、請求項１〜１２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
前記バイオセンサーが酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
血清コレステロールを測定するために適したデバイスを調製する方法であって：
試薬パッド、および小ポア側面および開放ポア側面を有する非対称ポリスルホン膜から形成されたＨＤＬ試験パッドを提供する工程；
該試薬パッドを、ＨＤＬ試験パッドと、該試薬パッドの小ポア側面が該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面と接触するように配向する工程；
該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；および
該デバイスを形成するために、（ｉ）該試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程、を包含する、方法。
【請求項１６】
前記加熱が１６５℃を超える温度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清コレステロールを測定するために適切なデバイスを調製する方法であって：
試薬パッドをアクリル酸コポリマーで被覆する工程；
（ｉ）ＨＤＬ試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程；
該デバイスを形成するために、該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；を包含する、方法。
【請求項１８】
前記アクリル酸コポリマーが、エレチンアクリル酸コポリマーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エレチンアクリル酸コポリマーが、約４．０％〜約１０．０％のエマルジョンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被覆する工程の後に、前記試薬パッドを乾燥する工程をさらに包含する、請求項１７から１９のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドの各々が、小ポア側面および開放ポア側面を有し；該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドを、該試薬パッドの小ポア側面が、該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面に面するように配向する工程をさらに包含する、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記加熱工程が、７５℃と９０℃との間の温度を付与することを包含する、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬに関連する血清コレステロールを測定する方法であって：
該サンプルを、（ｉ）ＨＤＬコレステロールの検出可能インジケータを有するＨＤＬ試験パッド、（ｉｉ）該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合かつ除去するために有効な試薬を含む試薬パッドを含む積層体と接触させる工程を包含し、
ここで、該血液サンプルが、該積層体を、該積層体を通る毛細管作用および／または重力によって通過し、ＨＤＬ濃度の測定を可能にする、方法。
【請求項２４】
前記篩パッドと、前記サンプル分与パッドと間の接触が、所望の量のサンプルが移動したとき断絶する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つが、多孔性ポリマー膜を備える、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬パッドが複数のスタック層を備え、その少なくとも１つが非ＨＤＬを結合するに有効な試薬を含む、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＤＬ濃度の測定が光学的検出による、請求項２３から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＤＬ試験パッドがバイオセンサーを備える、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオセンサーが、酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって：
サンプル分与アレイ；
ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；および
該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備え、ここで、該ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが接合されている、デバイス。
【請求項２】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、熱形成結合よって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、アクリル酸コポリマー接着剤結合によって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記アクリル酸コポリマーが、エチレンアクリル酸コポリマーである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つがポリスルホン層から構成される、請求項１〜４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
前記血液サンプルから、細胞成分を、該サンプルが前記分与サンプルアレイに接触する前に除去するに有効な篩パッドをさらに備える、請求項１〜５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
前記篩パッドを含むためのカセット本体をさらに備え、該カセット本体が、前記血液サンプルを含むための、かつ該篩パッドと流体連通するウェルを備える、請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記カセット本体に反応バーを取り付けるために有効な取り付け手段を備える反応バーさらに備える、請求項１〜７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
前記試薬が、結合性ポリアニオン試薬を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記結合性ポリアニオン試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項９に記載のデハイス。
【請求項１１】
前記ＨＤＬ試験パッドが、ＨＤＬコレステロールの存在下で検出可能な変化を生成する試薬を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１２】
前記変化が、光学的に検出され得る、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ＨＤＬ試験パッドが、バイオセンサーを備える、請求項１〜１２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
前記バイオセンサーが酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
血清コレステロールを測定するために適したデバイスを調製する方法であって：
試薬パッド、および小ポア側面および開放ポア側面を有する非対称ポリスルホン膜から形成されたＨＤＬ試験パッドを提供する工程；
該試薬パッドを、ＨＤＬ試験パッドと、該試薬パッドの小ポア側面が該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面と接触するように配向する工程；
該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；および
該デバイスを形成するために、（ｉ）該試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程、を包含する、方法。
【請求項１６】
前記加熱が１６５℃を超える温度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清コレステロールを測定するために適切なデバイスを調製する方法であって：
試薬パッドをアクリル酸コポリマーで被覆する工程；
（ｉ）ＨＤＬ試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程；
該デバイスを形成するために、該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；を包含する、方法。
【請求項１８】
前記アクリル酸コポリマーが、エレチンアクリル酸コポリマーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エレチンアクリル酸コポリマーが、約４．０％〜約１０．０％のエマルジョンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被覆する工程の後に、前記試薬パッドを乾燥する工程をさらに包含する、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドの各々が、小ポア側面および開放ポア側面を有し；該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドを、該試薬パッドの小ポア側面が、該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面に面するように配向する工程をさらに包含する、請求項１７から２０のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記加熱工程が、７５℃と９０℃との間の温度を付与することを包含する、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬに関連する血清コレステロールを測定する方法であって：
該サンプルを、（ｉ）ＨＤＬコレステロールの検出可能インジケータを有するＨＤＬ試験パッド、（ｉｉ）該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合かつ除去するために有効な試薬を含む試薬パッドを含む積層体と接触させる工程を包含し、
ここで、該血液サンプルが、該積層体を、該積層体を通る毛細管作用および／または重力によって通過し、ＨＤＬ濃度の測定を可能にする、方法。
【請求項２４】
前記篩パッドと、前記サンプル分与パッドと間の接触が、所望の量のサンプルが移動したとき断絶する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つが、多孔性ポリマー膜を備える、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬パッドが複数のスタック層を備え、その少なくとも１つが非ＨＤＬを結合するに有効な試薬を含む、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＤＬ濃度の測定が光学的検出による、請求項２３から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＤＬ試験パッドがバイオセンサーを備える、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオセンサーが、酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項２９に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって：
サンプル分与アレイ；
ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；および
取り付け手段に固定された、該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備え、ここで、該ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが接合され；
ここで、該取り付け手段が、該デバイスを、試験位置から、該ＨＤＬ試験パッドが該サンプル分与アレイと流体連通していない位置に移すために有効である、デバイス。
【請求項２】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、熱形成結合よって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび該試薬パッドが、アクリル酸コポリマー接着剤結合によって接合されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記アクリル酸コポリマーが、エチレンアクリル酸コポリマーである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つがポリスルホン層から構成される、請求項１〜４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
前記血液サンプルから、細胞成分を、該サンプルが前記サンプル分与アレイに接触する前に除去するに有効な篩パッドをさらに備える、請求項１〜５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
前記篩パッドを含むためのカセット本体をさらに備え、該カセット本体が、前記血液サンプルを含み、該篩パッドと流体連通するウェルを備える、請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記カセット本体に反応バーを取り付けるために有効な取り付け手段を備える反応バーさらに備える、請求項１〜７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
前記試薬が、結合性ポリアニオン試薬を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記結合性ポリアニオン試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項９に記載のデハイス。
【請求項１１】
前記ＨＤＬ試験パッドが、ＨＤＬコレステロールの存在下で検出可能な変化を生成する試薬を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１２】
前記変化が、光学的に検出され得る、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ＨＤＬ試験パッドが、バイオセンサーを備える、請求項１〜１２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
前記バイオセンサーが酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
血清コレステロールを測定するために適したデバイスを調製する方法であって：
試薬パッド、および小ポア側面および開放ポア側面を有する非対称ポリスルホン膜から形成されたＨＤＬ試験パッドを提供する工程；
該試薬パッドを、ＨＤＬ試験パッドと、該試薬パッドの小ポア側面が該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面と接触するように配向する工程；
該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；および
該デバイスを形成するために、（ｉ）該試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程、を包含する、方法。
【請求項１６】
前記加熱が１６５℃を超える温度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清コレステロールを測定するために適切なデバイスを調製する方法であって：
試薬パッドをアクリル酸コポリマーで被覆する工程；
（ｉ）ＨＤＬ試験パッドにＨＤＬ試験試薬を、そして（ｉｉ）流体サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程；
該デバイスを形成するために、該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程；を包含する、方法。
【請求項１８】
前記アクリル酸コポリマーが、エレチンアクリル酸コポリマーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エレチンアクリル酸コポリマーが、約４．０％〜約１０．０％のエマルジョンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被覆する工程の後に、前記試薬パッドを乾燥する工程をさらに包含する、請求項１７から１９のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドの各々が、小ポア側面および開放ポア側面を有し；該ＨＤＬ試験パッドと該試薬パッドを、該試薬パッドの小ポア側面が、該ＨＤＬ試験パッドの開放ポア側面に面するように配向する工程をさらに包含する、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記加熱工程が、７５℃と９０℃との間の温度を付与することを包含する、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のＨＤＬに関連する血清コレステロールを測定する方法であって：
該サンプルを、（ｉ）ＨＤＬコレステロールの検出可能インジケータを有するＨＤＬ試験パッド、（ｉｉ）該血液サンプルから非ＨＤＬを選択的に結合かつ除去するために有効な試薬を含む試薬パッドを含む積層体と接触させる工程を包含し、
ここで、該血液サンプルが、該積層体を、該積層体を通る毛細管作用および／または重力によって通過し、ＨＤＬ濃度の測定を可能にする、方法。
【請求項２４】
前記篩パッドと、前記サンプル分与パッドと間の接触が、所望の量のサンプルが移動したとき断絶する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＤＬ試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも１つが、多孔性ポリマー膜を備える、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬パッドが複数のスタック層を備え、その少なくとも１つが非ＨＤＬを結合するに有効な試薬を含む、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＤＬ濃度の測定が光学的検出による、請求項２３から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＤＬ試験パッドがバイオセンサーを備える、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオセンサーが、酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５２１８２３（Ｐ２００６−５２１８２３Ａ）
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９５７１（Ｐ２００６−５０９５７１）
【出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０００１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０５５５
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０４２７６７２７）コレステック コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０００１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０５５５
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０４２７６７２７）コレステック コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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