高密度細胞集団の自動セグメンテーション方法およびシステム
細胞を含む画像をセグメンテーションするシステムおよび方法であって、画像は複数の画素を含んでおり、１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞クラスタは画像内で同定され、３Ｄ細胞クラスタは、１つまたは複数のモデルを使用して個別の細胞に自動的にセグメンテーションされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は概して、生体物質の高密度充填細胞集団を画像化および自動分析することに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]生化学過程が起こる実際の生活環境を模倣するために、モデルシステムが定期的に利用されている。例えば、細胞培地は、遺伝子を操作および調整し、生化学的経路を変更し、得られる効果を分離して観察するための単純なインビトロシステムを提供する。このような細胞培地は、基礎研究、薬物発見、および毒性研究において重要な役割を果たす。
【０００３】
[0003]がん細胞、細胞および組織培地、および生体試料を含む高密度細胞集団は分析されて、大型の動物および人間でのテストの前に、テスト薬剤、造影剤、および治療薬などのこれらの生体物質から幅広い情報を抽出し、がんおよび他の疾病の進行を検査する。細胞培地の場合、細胞はしばしば、普通は広視野または共焦点顕微鏡を使用して画像化される、３Ｄ分析においてインビトロで成長する。研究の結果は得られた画像スタックを調べることにより伝統的に分析されてきた。
【０００４】
[0004]他では３Ｄ環境で細胞をセグメンテーションしているが、これらの試みでは普通、背景から細胞を分離し、細胞群を個別の細胞に分割し、細胞の属性を測定する一式の標準的ステップを使用する。これらの方法は、高解像度データに最も役に立ち、スケーリングを可能にするには修正が必要である。
【０００５】
[0005]このような３Ｄ分析ツールは、新しい見識につながる可能性がある、細胞特徴の定量的測定、および細胞の統計的分布を可能にする。これらはまた、迅速かつ繰り返し可能な分析を可能にする。モデルシステムが生理学的に関連すればするほど、その予測値がより大きくなる。３Ｄ細胞モデルは、細胞間および細胞基質間相互作用の原因となる、生理学的に関連する内容を与える。腫瘍成長を研究するために、３Ｄ細胞クラスタ分析は、栄養素および酸素の細胞勾配などの位置効果、腫瘍成長への代謝性負荷の影響、および治療反応をモデリングする。これに対して、２次元（２Ｄ）単層細胞培地は、分析するのがより容易であるが、腫瘍微細環境などの特定の効果はモデリングしない。
【０００６】
[0006]３次元細胞クラスタは普通、共焦点顕微鏡を使用して画像化される。ｚスタックとして知られる、得られる共焦点画像スタックはその後伝統的に、実験結果を測定および分析するために手作業で調査される。これらの画像スタックの分析を自動化することにより、研究者が高スループット環境においてこのような培地を使用することが可能になる。今まで、多くの研究は、集合の合計量などの単純な測定、または単一の共焦点スライスに基づいた２Ｄ測定のいずれかに限られていた。最近の研究では、全体的統計は重要であるが、細胞クラスタ内の異なる空間的内容に豊富な情報があることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]個別の細胞を同定する能力は、細胞培地および生細胞分析試料の自動分析にとって重要な要件である。画像セグメンテーション方法は普通、このような問題に対処するために適用される。極めて高密度充填細胞の集団をセグメンテーションすることは、特に困難な課題である。特に染色方法に関する従来の知識、および細胞集団に関する基礎的前提は、モデルベースの枠組みの実施形態の１つまたは複数を使用する、本発明の方法およびシステムを使用して捉えることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]細胞の寸法および充填密度は様々な細胞集団で異なるが、これらの違いは正確なモデルに直ぐにつながるものではない。例えば、図１に示すゼブラフィッシュの眼の３Ｄ画像は、いくつかの異なるタイプの細胞を含んでいるが、同じタイプの細胞の中でさえも、寸法、形状、染色取込みおよび画素強度の変化がある。開示された方法およびシステムの実施形態の１つまたは複数は、部分的には、不均質な寸法および充填密度を示す細胞群に基づいて、このような細胞集団をセグメンテーションするためにモデリングを利用する。
【０００９】
[0009]これらのシステムおよび方法は、細胞形態学の測定および分析、チャンネルマーカ、チャンネルマーカの転座、および３Ｄ物理空間内の３Ｄ容量からの統計の抽出に関連する問題の多くを解決する。これらのシステムおよび方法は、ノイズの多いデータが存在する状態でさえも多数の解像度での細胞のセグメンテーションを可能にする。またこれにより、これに限らないが、細胞膜、基質および細胞核を含む、細胞クラスタ、個別の細胞、および細胞内構造物をセグメンテーションするための多数のチャンネルの使用が可能になる。
【００１０】
[0010]細胞を含む画像をセグメンテーションするシステムおよび方法の一実施形態は普通、複数の画素を含む１つまたは複数の画像を提供するステップと、画像内の１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞集団を同定するステップと、１つまたは複数の自動モデルを使用して１つまたは複数の個別の細胞に３Ｄ細胞集団をセグメンテーションするステップとを含んでいる。１つまたは複数の事前モデルおよび／または１つまたは複数の確率モデルを使用して、細胞を個別にセグメンテーションすることができる。事前および確率モデルは、これに限らないが、形状ベースモデルまたは相関ベースモデルなどの様々な細胞特性ベースモデルに基づくものであってもよい。画像はこれに限らないが、データセットにわたる中心体の統計的分布、形態学的測定、および１つの細胞内領域から別の細胞内領域への１つまたは複数のバイオマーカ転座などの、様々な細胞の生体関連測定のための方法およびシステムの自動実施形態の１つまたは複数を使用して分析することができる。
【００１１】
[0011]１つまたは複数の画像を提供するステップは、複数のｚスタック画像を提供するステップを含むことができ、ｚスタック画像は広視野画像を含むことができ、広視野画像は、少なくとも部分的に、細胞集団の１つまたは複数を１つまたは複数の細胞にセグメンテーションするために使用される。ｚスタック画像はまた、共焦点画像を含むことができ、共焦点画像は少なくとも部分的に、１つまたは複数の細胞内構造物をセグメンテーションするために使用される。
【００１２】
[0012]この方法はまた、分水界セグメンテーションを使用して細胞の１つまたは複数の細胞核をセグメンテーションするステップを含むことができ、細胞核中心は、分水界セグメンテーションのためのマーカとして使用される。
【００１３】
[0013]距離マップ飽和機構は、形状ベースモデルを使用して、個別の細胞に集合をセグメンテーションするために画像に適用することができる。細胞核などの細胞内成分は、少なくとも部分的に分水界セグメンテーションを使用してセグメンテーションすることができる。
【００１４】
[0014]本発明のこれらおよび他の特性、態様および利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読めばより良く理解されるものである。図中、同様の記号は、図面全体を通して同様の部品を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0015]本発明の方法およびシステムの実施形態の１つまたは複数を使用してセグメンテーションすることができる、３次元画像の例示的画像を示す図である。
【図２】[0016]２点確率関数が捉えるために使用することができる情報のタイプを示す４つのグラフである。
【図３】[0017]面積比が０．５である点に基づいて、物体の半径をどのように推定することができるかを示す図である。
【図４】[0018]図１に示すゼブラフィッシュの眼の画像の表面推定を示す図である。
【図５】[0019]レベルセット改良が適用された後の、図１に示すゼブラフィッシュの眼のセグメンテーションされた画像を示す図である。
【図６】[0020]本発明の方法の１つまたは複数を組み込むシステムの一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0021]システムおよび方法は、これに限らないが、細胞スクリーニングおよび薬剤テストを含む幅広い生物学的応用例を有する。システムおよび方法の実施形態の１つまたは複数は、１つまたは複数の細胞集団の中の細胞集団を自動的に同定し、１つまたは複数の実施形態は自動的に、多チャンネル画像データを使用して、各集合を個別の細胞および細胞内構造物にセグメンテーションする。システムおよび方法はさらに、多次元高密度充填細胞集団の自動分析を可能にする。システムおよび方法を使用して、これらの画像から集められた情報はさらに、細胞集団およびその細胞成分の生体関連測定を行い、分析するために使用することができる。これらの測定は、これに限らないが、データセットにわたる中心体の統計的分布、形態学的測定、および１つまたは複数の細胞内領域から別の細胞内領域へのバイオマーカの取込みおよび転座を含むことができる。これらの測定は、細胞レベルで、および細胞および／または細胞内レベルで行うことができる。システムおよび方法の技術的効果は、高密度充填細胞集団の３Ｄ画像化および定量的分析を可能にするためのものである。
【００１７】
[0022]このような分析への普通および従来の難しい第１のステップは、画像内の関連領域を背景から分離するための画像セグメンテーションを含んでいる。画像セグメンテーションは、多くの形態を呈することができるが、このステップの結果は、他の領域で測定またはこれと相関させることができる１セットの隔離物体または細胞クラスタである。例えば、核マーカで染色された細胞核をセグメンテーションすることができ、これらのセグメンテーションマスクはその後、様々な細胞プロセスを調査することを目的とした他の生物学的マーカに相関させることができる。システムおよび方法は特にこの応用例に限らないが、１つの応用例は、ゼブラフィッシュなどの多細胞生物の形態学、または高密度充填がん細胞集団内のバイオマーカの転座を測定するためのものである。
【００１８】
[0023]システムおよび方法の様々な実施形態で使用されるアルゴリズムの１つまたは複数は、例えば、多次元細胞集団内の細胞の生物形態学または分布を同定するために使用することができる。例えば、生物または集団内の細胞群は同定され、その後、各細胞群内の細胞は、多チャンネル画像データを使用して個別の細胞にセグメンテーションされる。システムおよび方法はさらに、これらの細胞集団の自動分析を可能にする。システムおよび方法を使用してこれらの画像から収集される情報はさらに、生物形態学または細胞集団の生体関連測定を行い、これを分析するために使用することができる。これらの測定は、これに限らないが、データセットにわたる中心体の統計的分布、形態学的測定、およびバイオマーカの取込みおよび転座を含むことができる。
【００１９】
[0024]特許請求する発明の主題をさらに明確および簡潔に説明し、これを指摘するために、以下の説明で使用される特定の用語に以下の定義を与える。
[0025]本明細書で使用する場合、「生体物質」という用語は、生体源である、またはこれから得られる物質のことを言う。生体源としては、これに限らないが、例えば体液（例えば、血液、血漿、血清、または尿）から生じる物質、器官、組織、画分、細胞、単細胞または多細胞臓器である、またはこれらから単離された細胞、細胞内および核物質、菌類、植物、およびこれに限らないが昆虫および人間を含む哺乳類などの動物が挙げられる。生体源としては、さらに非限定的な実施例として、単クローン抗体産生、ＧＭＰ接種増殖、昆虫細胞培養、遺伝子治療、潅流、大腸菌増殖、タンパク質発現、タンパク質増幅、植物細胞培養、病原体増殖、細胞治療、細菌産生およびアデノウィルス産生に使用される物質が挙げられる。
【００２０】
[0026]生体物質としては、これに限らないが、冷凍または染色、あるいは別の方法で処理されているような、その物理的状態は無関係な任意の物質を挙げることができる。いくつかの実施形態では、生体物質としては、組織サンプル、全細胞、細胞成分、サイトスピン、または細胞塗抹標本を挙げることができる。いくつかの実施形態では、生体物質は組織サンプルを含んでよい。他の実施形態では、目標組織の連続画像を、最初に参照染料で、その後、追加の染料で得ることができる場合に、生体物質はインサイチュー組織ターゲットであってもよい。組織サンプルは、同様の機能を有することができる生体対象の組織から得られる一群の同様の細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルは、ヒトの組織から得られる一群の同様の細胞を含むことができる。ヒトの組織の適切な実施例としては、これに限らないが、（１）上皮組織、（２）血管、骨および軟骨を含む結合組織、（３）筋組織、および（４）神経組織が挙げられる。組織サンプル源は、加工していない、冷凍した、および／または保存した器官または組織サンプルまたは生検または吸引物から得られる固体組織、血液または任意の血液成分、脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液、または被験者の妊娠または発達における任意の時からの細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、組織サンプルとしては、一次または培養細胞または細胞株を挙げることができる。
【００２１】
[0027]いくつかの実施形態では、生体物質としては、健康なまたは病気の組織サンプルからの組織切片（例えば、結腸、乳房細胞、前立腺からの組織切片）が挙げられる。組織切片としては、組織サンプルの単一部分または片、例えば、組織サンプルから切り取った組織または細胞の薄い薄片を挙げることができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの多数の切片を取り、分析を行うことができる。但し、本明細書に開示する方法は、少なくとも２つの（形態的または分子レベルで）異なるターゲットに対する組織サンプルの同じ切片の分析のために使用することができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの同じ切片は、少なくとも４つの（形態的または分子レベルで）異なるターゲットに対して分析することができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの同じ切片は、５つ以上の（形態的または分子レベルで）異なるターゲットに対して分析することができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの同じ切片は、形態的および分子レベルの両方で分析することができる。
【００２２】
[0028]本明細書で使用される場合、バイオマーカまたはチャンネルマーカという用語は、これに限らないが、特定の波長の光への露出によって励起された場合に、異なる波長で発光する化合物である蛍光造影剤および蛍光色素分子を含んでいる。蛍光色素分子は、その発光プロファイル、または「色」に関して説明することができる。緑色の蛍光色素分子（例えば、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ、およびオレゴングリーン）は、普通は５１０〜５４０ナノメートルの範囲の波長での発光を特徴とすることができる。赤色の蛍光色素分子（例えば、テキサスレッド、Ｃｙ５、およびテトラメチルローダミン）は、普通は５９０〜６９０ナノメートルの範囲の波長での発光を特徴とすることができる。オレンジ色の蛍光色素分子の例は、細胞核および細胞質の両方を染色する、１，５−ビス｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝―４，８−ジハイドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（ＣｙＴＲＡＫ Ｏｒａｎｇｅ（商標））の誘導体であり、遠赤外の蛍光色素分子の例は、１，５−ビス｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−４，８−ジハイドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（ＤＲＡＱ５（商標））の蛍光ＤＮＡ染料、および１，５−ビス（｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−４，８−ジハイトロキシアントラセン−９，１０−ジオン）−Ｎ−酸化物（ＡＰＯＰＴＲＡＫ（商標）の細胞プローブである。蛍光色素分子の例としては、これに限らないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネートの誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩（Ｌｕｃｉｆｉｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、クマリン誘導体、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−トリフルオロメチルクラリン（クマラン１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニディノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７−ジメチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）４−メチルクマリン、４，４’ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−塩化スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）、エオシン、エオシンイソチオシアネートなどのエオシン誘導体、エリトロシン、エリトロシンＢおよびエリトロシンイソチオシアネートなどのエリトロシン誘導体、エチジウム、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメチオキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＴＩＲＣ）などのフルオレセインおよび誘導体、（アミンとの反応の際に蛍光性の）フルオレスカミン誘導体、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、（アミンとの反応の際に蛍光性の）ｏ−フタルアルデヒド誘導体、ピレン、ピレンブチレートおよびサクシニミジル １−ピレンブチレートなどのピレンおよび誘導体、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ＲＴＭ．Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ塩化スルホニル、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、およびスルホローダミン１０１の塩化スルホニル（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）などのローダミンおよび誘導体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸およびランタニドキレート誘導体、量子ドット、シアニン、プレリウム染料、およびスクアラインが挙げられる。
【００２３】
[0029]本明細書で使用される場合、プローブを使用する応用例では、「プローブ」という用語は、結合剤、および信号ジェネレータまたは酵素などの標識を有する作用薬のことを言う。いくつかの実施形態では、結合剤および標識（信号ジェネレータまたは酵素）は、単一体で具現化される。結合剤および標識は、単一のステップで生体サンプルに直接的（例えば、結合剤内に組み込まれた蛍光分子を介して）、または間接的（例えば、分裂部位を含むことができるリンカを通して）取り付け、塗布することができる。代替実施形態では、結合剤および標識は、個別体（例えば、ターゲットおよび酵素を結合することが可能な一次抗体、または一次抗体を結合することが可能な信号ジェネレータ標識二次抗体）内で具現化される。結合剤および標識（信号ジェネレータまたは酵素）が個別体である場合、単一のステップまたは多数のステップで生体サンプルに塗布することができる。本明細書で使用される場合、「蛍光プローブ」という用語は、蛍光信号ジェネレータに連結された結合剤を有する作用薬のことを言う。
【００２４】
[0030]本明細書で使用する場合、固体担体上に生体物質を固定する必要がある応用例では、「固体担体」という用語は、生体サンプル内に存在するターゲットを本明細書で開示した方法によって固定化させ、その後検出することができる物体のことを言う。ターゲットは、物理吸着によって、共有結合形成によって、またはその組合せによって固体担体上に固定化させることができる。固体担体としては、重合体、ガラスまたは金属材料を挙げることができる。固体担体の例としては、膜、マイクロタイタープレート、ビード、フィルタ、テスト片、スライド、カバースリップ、および試験管が挙げられる。生体材料が膜に付着されるこれらの実施形態では、膜材料は、これに限らないが、ナイロン、ニトロセルロース、および二フッ化ポリビニリデンから選択することができる。いくつかの実施形態では、固体担体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびポリプロピレンから選択したプラスチック表面を含むことができる。
【００２５】
[0031]方法およびシステムは、これに限らないが、検体検出、組織化学、免疫組織化学、または免疫蛍光法などの分析、診断、または予後応用例での使用に適用させることができる。いくつかの実施形態では、方法およびシステムは、組織化学、免疫染色、免疫組織化学、免疫検定、または免疫蛍光応用例で特に応用可能である。いくつかの実施形態では、方法およびシステムは、免疫ブロット技術、例えばウエスタンブロット、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫検定で特に応用可能である。
【００２６】
[0032]方法およびシステムの１つまたは複数の実施形態は、所与の染色プロトコルが中心体を均一に明るくすると仮定する確率モデルを使用する。染料の発光周波数によって、全ての細胞核は均一に明るく見える。サンプル内の細胞が高密度充填されているので、隣接する細胞からの蛍光染色の放射により、直線フィルタリングによって取り除くことができないかなりの量の構造的背景ノイズが生成される。したがって、細胞核は十分分離されず、その境界はあまり特徴付けられていない。加えて、個別の細胞の形状に関する特定の仮定を行うことが可能であるが、細胞はかなり変形可能であるという事実を説明する必要がある。特性グループ化およびモデル予測を１つの一貫性のある枠組みに一体化するために、２００４年９月１６日出願の「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｇｍｅｎｔｉｎｇ Ｃｒｏｗｄｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｉｎｔｏ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｏｂｊｅｃｔｓ（混雑環境を個別の物体にセグメンテーションするシステムおよび方法）」という名称の米国特許出願第１０／９４２，０５６号に記載されたセグメンテーション方法を使用することができる。
【００２７】
[0033]任意の種類の画像特性、例えば端点、縁部、画像領域からなる、１セットのＮ個の観察結果Ｚ＝｛ｚｉ｝であると仮定すると、アルゴリズムは、潜在的物体前提の形状および位置に関してパラメータ化された尤度関数を使用してこれらを区切る。ＥＭ公式の変数を使用して、モデルパラメータおよびグループ化両方の最大尤度予測が同時に得られる。得られるアルゴリズムは、広域的最適化を行い、ローカルコンテキストのみを使用して決定を行うことができない場合でさえも、正確な結果を生成する。
【００２８】
[0034]幾何形状モデルは、ＺのうちのどのサブセットＣを単一の物体に関連させることができるかを特定するために使用される。前処理ステップでは、クリークとも呼ばれる、１セットのＫ個の可能なグループの特性が特定される。全てのクリークのセットは以下のように定義される。
Ｃ：＝｛Ｃ１，．．．，ＣＫ｝ （１）
ｙｉが［１，．．．，Ｋ］での長さＮの代入ベクトルＹ＝｛ｙｉ｝が、各特性ｚを特定のクリークＣｋに関連させるために使用される。クリークへの特定の関連性は、物体の仮定形状および外観に関する問題に直接結合される。こういう理由で、クリークＣｋが細胞の位置、形状および外観を符号化するパラメータθｋに関連させられている。形状パラメータの集合は、以下のように示される。
Θ＝［θｉ，．．．，θＫ］ （２）
方法は、代入ベクトルＹおよび特性セットＺ、すなわちｐ（Ｙ，Ｚ；Θ）の同時確率をモデリングする。ここで、Θは分布のパラメータを示している。読者は、
【００２９】
【数１】
【００３０】
によって与えられるランダム変数Ｙの範囲が、クリークＣのセットによって定義されることに留意すべきである。代入ベクトルＹは、クリークＣｋへの特性ｚの割当を直接観察することができないので、隠し関数として処理される。ＥＭは、Θの最大尤度予測、および起こりそうな割当を生成するためにサンプリングすることができるＹに対する分布を求めるために使用される。
【００３１】
[0035]同時確率ｐ（Ｙ，Ｚ；Θ）は、１セットの画像特性を前提として、特定の特性割り当Ｙに対するメリット関数を定義することによってモデリングすることができる。例えば、特定のクリークに対する特定のサブセットの画像特性（ｚｉ，．．．，ｚｊ）の類似性を測定することができる。この例示的実施形態では、単一の特性割当の類似性は、所与のクリークＣｋへのペアワイズ割当と同様に、形状パラメータθｋでモデリングされる。対応する類似性関数は、以下の通り示される。
ｇ（ｚｉ，θｋ）およびｇ（ｚｉ，ｚｊ，θｋ）
特性割当の対数尤度は、以下のような１セットの画像特性ｚを前提として公式化される。
【００３２】
【数２】
【００３３】
この実施例では、クリークのセットが変化しないので、Ｙによって決まる規格化定数を算出する必要がない。ｐ（Ｚ）の値は、公式全体を通して一定であるので以下のようになる。
【００３４】
【数３】
【００３５】
[0036]不均質な細胞集団をセグメンテーションする、または異なる細胞集団を同定することが望ましい実施形態では、方法は、全ての細胞が同様の形状であるということを前提とすることができない。したがって、特性点、形状モデル、および類似性関数は、このような不均質細胞集団をセグメンテーションするように適合される。所与の試料の不均質性を説明するために、方法の実施形態のいくつかは構造標識を使用する。例えば、標識Λｋは、同質構造を有する量の特定の領域に割り当てられている。いくつかの領域内では細胞が小さく、高密度に充填されており、細胞はその他の領域ではより大きい可能性がある。構造標識Λは、このような領域を同定するために使用される。本実施例では、形状パラメータの分布は、容量の所与の領域に割り当てられた構造標識によって決まる。尤度関数は、これにしたがって変更される。
【００３６】
【数４】
【００３７】
[0037]広視野および共焦点ｚスタックモードは両方とも、分析のために使用される画像を取得するのに使用することができる。広視野画像は、細胞クラスタをセグメンテーションするために使用され、共焦点ｚスタック画像は個別の細胞または細胞核をセグメンテーションするために使用される。非限定的な実施例として、２０Ｘ，０．４５ ＮＡ対物レンズを使用し、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００を使用して画像を取ることができる。ｚスタック画像は、得られる画像から焦点ズレの光を取り除くために構造光画像化を利用する、光学Ｚセクショニング（ＯＺ）モジュールと、広視野モードを使用して得ることができる。ｚスライス解像度は、個別のターゲット物体の寸法を越えて劣化するにしたがって、所与の検定は２Ｄ画像環境まで効果的に下がる可能性がある。というのは、各物体はいくつかの例では、単一のスライス内のみに存在することがあるからである。
【００３８】
[0038]システムおよび方法の本実施例では、画素の代わりに物理座標（例えば、μｍ）内で処理が行われる。物理座標は、本実施例では、アルゴリズムを一般化することができ、これが寸法および形状モデルを含むことができるように使用される。広視野および共焦点画像両方の利点は、処理のために利用される。というのは、広視野画像は核集合を区別し、共焦点画像は核を改良するからである。画像は最初、背景から前景を離すように前処理される。前処理ステップでは、局所画像統計が、背景画素をなくすために使用される。
【００３９】
[0039]細胞クラスタ内の核の近接により、核染色は普通、核から漏れて、その結果、細胞の周りの明るい背景につながる。さらに、励起光をブロックする核による信号減衰は、細胞集団内側の減光核につながる。このように、本実施例では、局所画像特性は、画像をセグメンテーションして、背景および前景を分離させるために使用される。容量Ｖ内の各ボクセルｘごとの閾値を特定するように閾値関数Ｔが算出される。任意の所与のボクセル位置ｘ∈Ｖでは、Ｔ（ｘ）の値は、ボクセルの近傍Ω内の局所画像統計に基づいている。本実施例では、この近傍の寸法は、平均細胞核の寸法にしたがって設定される。各ボクセルｘごとのＴ（ｘ）を算出することは、計算的に集中的であり、それによって３Ｄ格子Ｌを代わりに使用することができる。各ｘｉ∈Ｌでは、Ｔ（ｘｉ）の値は以下のように算出される。
【００４０】
【数５】
【００４１】
ここで、τＶは、全容量Ｖに関してＯｔｓｕ法を使用して算出された広域的閾値を示している。Ｏｔｓｕ法は、閾値を求めて、画素のヒストグラムの級間分散を最大限にする。同様に、τΩ（ｘｉ）は、局所近傍内で算出されたＯｔｓｕ閾値である。σΩ（Ｘｉ）は、近傍Ω（Ｘｉ）内のボクセル強度の分散であり、σＢは、Ｉ（ｘ）＜τＶであるボクセル強度の分散を示している。このような分散により、背景がどれだけ変化することが予測されるかの測定を行う。全ての残りのボクセル位置
【００４２】
【数６】
【００４３】
では、Ｔ（ｘ）の値は、線形補間を使用して算出される。この方法は、近傍ボクセル強度σΩ（Ｘｉ）の分散を使用して、近傍が背景および前景ボクセルの組合せを含んでいるかどうかを効果的に判断する。この分散がσＢに対して比較的小さい場合、広域的値τＶが使用され、これにより均質領域内のノイズの多い局所算出が防止される。
【００４４】
[0040]格子の寸法は、計算的要件に適合させることができる。近傍の重複に関連するトレードオフがあることに留意されたい。重複が大きすぎる場合、精度は高いが、処理時間は長くなる。重複が小さすぎる場合（例えば、非重複近傍）、処理時間ははるかに短いが、特に近傍の境界で精度に問題がある。
【００４５】
[0041]適用閾値化は、例えば、背景照明が画像にわたって一定である場合、必ずしも必要ではない。
[0042]核内の他の検出は、以下の通り欲張りな方法で核寸法制約を使用することによって除去することができる。核寸法に対応する所与の半径で最大である画像内の領域最大値を求める。その後、最大値の全ては（時間を節約するために背景のものをマスキングした後に）標識付けされ、強度によって分類される。その後、最も明るい最大値から始まり、その最大値からの距離測定内にあるリストからのこれらの最大値が除去される。このステップは、最大値の全てが検討されるまで、次第に暗い最大値まで続く。近似の細胞半径がこれらの算出のために使用されるので、方法の本実施例はモデル駆動される。これらの方法は、最初に画像を平滑化することによって最適化することができる。寸法制約は、それぞれの核が一度のみ検出されることを保証するので、平滑化は常に必要ではない。しかし、異常値を除去することによって中心の局所化を助けるものである。この方法で得られる核中心は、分水界アルゴリズムのシードとして働く。距離マップは、ダニエルソン距離アルゴリズムを使用してこれらのシードから生成される。核境界はその後、２つの制約、つまりモデルベース寸法制約、および背景マスクによって定義された形状を使用して画定される。水域アルゴリズムが得られる距離マップに適用された場合、細胞は効果的にセグメンテーションされる。
【００４６】
[0043]分水界セグメンテーションアルゴリズムは、接する細胞を分離させるようになっている。いくつかの例では、形態学操作により修正することができる形状は円滑でないが、このような操作は時々、過程の終わりに向かって最もよくそのままにされる。このような操作が過程の終わりに向かってより良く行われる例は、データから導き出された形状を基礎的に変更することが予測され、構造化素子の寸法に非常に左右される場合の例である。
【００４７】
[0044]前景が背景から分離された後に、二値オブジェクトの距離マップがその後置かれ、分水界ステップは集団を分離させるために行うことができる。しかし、距離マップ内の多数の最大値から得られるオーバーセグメンテーションにより、距離画像は水域を算出する前に処理することができる。距離マップは典型的には、多くの極大値を含んでいる。トポロジーマップとして見た場合、極大値は各領域に対する１つの最大値に組み合わされ、それによって各核集団をセグメンテーションするために使用することができることが好ましい。二値オブジェクトは典型的には細長く、表面は正確な円というよりはむしろ不規則であるので、多数の極大値が存在する。ターゲットオブジェクトが正確な円であったら、１つの最大値しかないだろう。これらの最大値を１つの最大値に組み合わせるために、距離マップ飽和が行われる。最大値が小さな高さだけ異なる場合、これらは組み合わせられ、それによりその頂点を切り取ることによって距離マップを飽和させる。この過程は、迅速な形態学操作を使用して行うことができる。飽和は強度寸法内で行われるが、空間寸法内の形態学操作は典型的には、同じ結果を与える。というのは、距離マップは普通、定義によって直線的に変化するからである。説明したように、距離マップ処理は、画像全体に一度行うことができ、各個別の集団を考慮する必要がなく、その結果より迅速な過程につながる。
距離マップ飽和ステップの実施例
１．飽和させるための高さ差であるｈを設定する。
２．グレースケールが、ｈだけ入力マップを侵食する。
３．グレースケールが、ｈ＋１だけステップ２から侵食されたマップを膨張させる。
４．ステップ３から入力マップ画像および膨張マップの最小値をとる。これにより、飽和最大値の画像が与えられる。
【００４８】
[0045]ｈの半径を備えたグレースケール侵食は基本的には、所与の距離内の最小オペレータである。これは典型的には、頂点を切り取る。というのは、本実施例と同様に、距離マップが使用されるからである。グレースケール膨張は、距離マップの境界を元の位置に戻すために本実施例では好ましい。本実施例では、膨張半径は侵食より１大きい、そうでないと詳細が失われてしまう可能性がある。原画像および膨張画像の最小値をとることにより、普通は元の侵食動作から回復しない頂点を除いて、画像中の全ての値が元の値に戻る。
【００４９】
[0046]本実施例の距離マップ飽和は、拡張極値を求めることと同様である。しかし、他の実施例では、拡張最大値を見つけるステップは、特に大きなｈ値ではかなり遅い可能性があるが、画像再構築を使用することができる。膨張および侵食操作は、大きなカーネルでは遅くなる可能性があり、核集団が比較的大きいので大きなカーネルが必要である可能性がある。このステップの速度を上げるために、サブサンプリングステップが行われる。サブサンプリングステップは、距離マップをサブサンプリングするステップと、処理するステップと、その後、結果をスーパーサンプリングするステップとを含むことができる。
【００５０】
[0047]サブサンプリングは、少なくとも、点間で線形補間を普通は定義により使用する、距離マップを使用する場合の選択肢である。これはまた、所望の量だけサブサンプリングし、１の半径の形態学を行うことによって、非一体型間隙に対するサブピクセル精度を備えた侵食および膨張を与えることができる。カーネルがｍｍで特定され、いくつかの小数値がある場合、膨張は常に四捨五入する。というのは、整数の半径が必要であるからである。これにより、誤差がシステムに持ち込まれる可能性がある。これはまた、特にグレースケール侵食を行う場合に、大きなカーネルに対して算出するための非常に長い時間が必要となる可能性がある。別の方法では、画像を、半径に対してｍｍで特定された量だけ再サンプリングし、その後、１の半径で侵食／膨張させ、その後、再サンプリングすることができる。
【００５１】
[0048]背景に対応する処理した距離マップ画像の領域が、その後マスキングされる。分水界ステップはその後、集団をセグメンテーションするために得られた画像に行われる。これらのステップは部分的に、平均画像内の核集団の迅速なセグメンテーションを可能にし、また、距離マップの核集団ごとに広域的最大値によって特定されるように各集団の中心（ｘ，ｙ）を配置する。
【００５２】
[0049]各集団の中心のスライス位置も判断されることが好ましい。集団は３Ｄで球状であるので、定義によって集団の最も幅広い部分に対応するスライスは、中心を含んでいる。このステップでは、普通は各画素がそのｘ、ｙ位置に対する最大値を含むスライスに対応する、２Ｄ画像である最大指数画像が生成される。いくつかのスライスが特定のｘ、ｙ位置に対して同じ強度を有する場合、これらのスライスの平均がとられる。核集団マスクはその後、この最大指数画像の前景を隔離し、各集団の所与の幅の輪郭を抽出するために、前のステップから使用される。ヒストグラムは、セグメンテーションマスクからの集団の境界周りの最大指数で生成することができる。このヒストグラム内で最も頻繁に起こるスライス指数はしたがって、集団の最も幅の広い部分、したがって集団中心に対応する。ヒストグラムのモードは、この値を与えるために同定される。集団中心のこのｚ位置を前に求めたｘおよびｙ位置に組み合わせることにより、各集団の３Ｄ位置が特定され、その後、集団中心から細胞核の分布を求めるために使用することができる。
核集団処理の実施例
１．二値マスクをサブサンプリングする。
２．高速二値アルゴリズムを使用して、小さな突起を取り除くために二値マスクを開閉する。
３．距離マップを求める。
４．飽和アルゴリズムを使用する。
５．値をリスケーリングした後に、距離マップをスーパーサンプリングする。
６．領域最大値を求める。
７．閾値化した背景によってマスキングされた距離マップの分水界を求める。これによって、集団のｘ、ｙセグメンテーションが与えられる。
８．各集団にｄｏコマンドを行う
９．「最大指数画像」を使用して各集団のスライス中心を求める。
１０．ｅｎｄ ｆｏｒコマンドを行う
１１．集団の中心から距離マップを生成する。
【００５３】
[0050]同じ３Ｄ分析の異なるスライス解像度でいくつかの取得を使用して、異なる解像度に対する核集団処理のロバスト性を判断することができる。これらの様々な解像度での細胞計数は近い可能性がある。普通、スライス解像度が低ければ低いほど、効果的に２Ｄ画像に対してより近くなる。これは、有用な測定値をさらに得ながら、どれだけ解像度が劣化する可能性があるかを示している。分布グラフを生成することもできる。集団のハイポキシティの測定値を与える分布グラフを生成することもできる。
【００５４】
[0051]アプリオリと呼ばれる、所与の試料の物理的および構造的特性に関する予備的知識を組み込んだ方法およびシステムの実施形態の１つまたは複数がある。限られた測定値のみを使用して、このような構造標識Ｌｉを定義するために、ランダム異種物質を使用することができる。
【００５５】
[0052]Ｎ点確率関数は、ランダム異種材料を特徴付けるために知られている。例えば、ｎ点相関関数に基づく測定値を細胞集団を同定するために使用することができる。空間の領域
【００５６】
【数７】
【００５７】
を仮定して、容量
【００５８】
【数８】
【００５９】
が２つの互いに素であるフェーズ
【００６０】
【数９】
【００６１】
および
【００６２】
【数１０】
【００６３】
内で区切られる。指標関数は、所与の位置
【００６４】
【数１１】
【００６５】
がどのセットに属するのかを示すために使用されている。
【００６６】
【数１２】
【００６７】
位置ｘ１、ｘ２；：：：；ｘｎでのｎ点の確率は、フェーズｉ＝（ｉ１；ｉ２；：：：；ｉｎ）で求められる。
【００６８】
【数１３】
【００６９】
セグメンテーションアルゴリズムに対するアプリオリを示すために、以下の２点確率関数を使用することができる。
【００７０】
【数１４】
【００７１】
式中、｜ｘ１−ｘ２｜＝ｒである。図２に示すグラフは、これらの２点確率関数を捉えるのに使用することができる情報のタイプを示している。Ｐ１１およびＰ０１の交点は、物体の半径に関するいくつかの情報を含んでいる。線ＡはＰ１１に言及し、線ＢはＰ０１に言及し、線ＣはＰ１０に言及し、線ＤはＰ００に言及している。
【００７２】
[0053]実験データを使用して、物体の寸法を推定することができる。図３に示すように、物体の半径は、面積比が０．５である点に基づいて推定することができる。これにより、半径の側に対する推定量を求めることができる。本実施例では、推定量は以下に基づいている。
Ｐ１１（ｒ）＝Ｐ１０（ｒ） （１０）
この例示的実施形態では、長さｒの線分
【００７３】
【数１５】
【００７４】
が前景内に完全に含まれている確率は、このような線分が前景領域が始点で、背景が終点で交差する確率に等しい。図３に示すように、試料が主として同様の寸法の丸い物体からなるという前提に基づいて、前景物体の寸法の分布に対する推定量を示すために、条件（８）が使用される。λ∈［０，２ｒ］である長さλｒの線分は、図３の線Ｅに平行であると仮定する。１セットの点は最初、長さλｒを有する線分に対する潜在的始点である円Ｃ内で算出され、それによって線分の両方の端点が円内にある。すなわち、以下の通りである。
【００７５】
【数１６】
【００７６】
セットの寸法
【００７７】
【数１７】
【００７８】
を直接算出することができる。図３に示す表記は、
【００７９】
【数１８】
【００８０】
を算出するために本実施例で使用される。
[0054]点ＱおよびＳによって画定される半径ｒおよび中心Ｐを有する円の扇形Ｓは、
【００８１】
【数１９】
【００８２】
のように算出することができる。
線分
【００８３】
【数２０】
【００８４】
は
【００８５】
【数２１】
【００８６】
の長さであると注意されたい。
角度ｑは、
【００８７】
【数２２】
【００８８】
のように算出することができる。
したがって、扇形Ｓの面積は
【００８９】
【数２３】
【００９０】
である。
次のステップでは、点Ｐ、ＯおよびＳによって画定される、三角形Ｋの面積が算出される。ピタゴラスの定理を使用する。
【００９１】
【数２４】
【００９２】
三角形の面積Ｋは次に、
【００９３】
【数２５】
【００９４】
のように算出することができる。
最後に、セットの寸法
【００９５】
【数２６】
【００９６】
を
【００９７】
【数２７】
【００９８】
のように算出することができる。
別の方法では、セットの寸法は
【００９９】
【数２８】
【０１００】
のように算出することができる。
半径ｒの寸法の推定量を作り出すために、実施形態の１つまたは複数は
【０１０１】
【数２９】
【０１０２】
の比を使用した。
τ＝０：５である例では、条件（８）を満たすことができる。しかし、この比は、半径ｒの実際の寸法によるものではない（図３）。
【０１０３】
[0055]実施形態の１つまたは複数では、充填密度を予測する必要があり得る。例えば、細胞集団は３Ｄ容量全体を満たしていない可能性がある。試料および染色アーチファクトの性質により、状況がより複雑になる可能性がある。例えば、図１に示す染色したゼブラフィッシュの眼の核は、空間内のマニホールドの上にある。したがって、材料統計の間違いを避けるためには、線処理過程を生成する前にこのマニホールドを予測する必要がある。図４は、図１に示すゼブラフィッシュの眼に対する表面予測である。
【０１０４】
[0056]アプリオリの前処理および生成後に、実施形態の１つまたは複数は、核または中心体などの細胞構造物を予測するための初期化ステップを含んでいる。初期化ステップは、これに限らないが、１つまたは複数の細胞特徴に基づく方法、および相関ベースの方法などの、細胞構造物を予測するための１つまたは複数の方法を含むことができる。
【０１０５】
[0057]様々な細胞特徴を使用して、候補セットの中心体を求めることができるが、方法およびシステム内で有用である細胞特徴の２つの非限定的な例としては、細胞形状および細胞外観が挙げられる。相関ベース方法は、より一般的であり、したがって行うのがより迅速である。
【０１０６】
[0058]初期化ステップの１つの例示的実施形態は、形状ベース初期化である。減衰依存セグメンテーションは、細胞を示す１セットの前景領域につながる。細胞群はその後、個別の細胞にさらに分割される。この実施形態は、マーカ制御分水界方法の使用により分水界セグメンテーションを算出する前に、全てのドメイン情報を含んでいる。マーカは、画像の最終パーティション内の連結成分の数を判断するので、マーカは細胞核全てに加えられる。本実施例では、分水界アルゴリズムまで通過された画像は、物体境界に沿って高い強度値を有する。細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションするために、形状および強度情報が組み合わされて、マーカ画像が生成される。実際のセグメンテーションステップを行う前に、モデル制約が課される。細胞の形状は非常に可変である可能性があるので、普通は強い形状アプリオリを加えないことが最も良い。例えば、距離マップを使用して形状情報を符号化することができる。距離マップＤ（ｘ）の例は、以下のように定義することができる。
【０１０７】
【数３０】
【０１０８】
式中のＴ（・）は、等式（４）内で定義されている。得られる距離マップは、全ての背景ボクセルに対してゼロである。前景の一部である全てのボクセルでは、距離マップは、背景ボクセルに最も近い距離を記録する。したがって、２つの接触している細胞が不均一な明るさであるが、その間にネックがある場合であっても、距離マップＤの輪郭を使用して、これらを異なる核にセグメンテーションすることができる。しかし、ネックがない場合、これらを分離するためには他の制約が必要である。また、染色された核は、縁部に向かってより拡散するより明るい中心を有するので、強度モデルを使用することもできる。これらの関数は異なる目盛を有するので、組み合わせる前に最初に正規化される。正規化は、両方の前景領域がゼロ平均および単位分散を有するように、ＩおよびＤをリスケーリングすることによって達成される。得られる組合せ関数は、以下のように算出される。
Ｗ（ｘ）＝λＩ（ｘ）＋（１−λ）Ｄ（ｘ） （２２）
式中の、λは、普通、強度および形状情報両方に等しい重要度を置くように０：５に設定される。強度および形状ベース関数は両方とも、多数のマーカを細胞内に配置する。
【０１０９】
[0059]得られる組合せマップＷは、多くの領域最大値を含んでいる。形状マップ内の多数の領域最大値は、二値物体の伸び、およびその表面の粗度によるものである。物体が真円である場合、１つの最大値しかない。強度マップは、高いレベルのノイズにより、多数の最大値を有する。位相マップとして見た場合、飽和過程を使用して、領域最大値は各領域ごとに１つの最大値に組み合わせられる。
【０１１０】
[0060]これらの最大値を１つの最大値に組み合わせるために、実施形態の１つまたは複数は、以下に示すｆの寸法ｎの侵食によるｆの再構築として定義された、寸法ｎでの再構築による開口方法を使用する。
【０１１１】
【数３１】
【０１１２】
グレースケール侵食は、頂点を切り取る。再構築により、元の侵食操作からけして回復しない頂点を除いて、画像内の全ての値はその元の値に戻される。
[0061]初期化ステップはまた、相関ベース方法を含むことができる。各個別の細胞の外観は、選択した染色プロトコル、もちろん、画像化システムの特徴によるものである。特定の顕微鏡のノイズおよび画像特徴は、この方法に１つまたは複数の要因として加えることができる。
【０１１３】
[0062]染色プロトコルに基づいて、単一の細胞核の外観をモデリングするテンプレートが生成される。このテンプレートは、中心体である尤度が高い、ボクセル位置を特定するために本実施例で使用される。ボクセル位置は、テンプレート照合方法を使用して特定することができる。
【０１１４】
[0063]機器およびアプリケーションの問題によって、データ収集の解像度は異なる可能性がある。しかし、あらゆる所与のスライス（すなわち、ｘ−ｙ平面）の解像度は普通、一定のままであり、ｚ軸に沿ったサンプリング周波数が普通は変化する。テンプレート照合は、元のデータセットの追加補間を算出することなく、所与の解像度に適合させることができる。
【０１１５】
[0064]染色プロトコルが、実施例の１つまたは複数で異なる強度分布につながる例では、通常の分布は、画像強度を直接はモデリングしないと推定することができる。代わりに、特定の画像特性の発生をモデリングする。このようなセットの画像特性は、学習アルゴリズムにより特定するべきである。
【０１１６】
[0065]実施形態の１つまたは複数では、細胞核は不均一に染色され、単一の隔離された核の強度分布は、３次元でガウス分布を有することが考えられる。しかし、全ての染色プロトコルが、均一な染色につながるわけではない。このような例では、外観モデルはデータから構成することができる。データは、以下の式が成り立つように適当な特性空間にマッピングすることができる。
【０１１７】
【数３２】
【０１１８】
これらのマップは、クラスタ化された細胞集団から個別の細胞の位置および形態を判断するために、方法およびシステムで使用することができる。特定の染色プロトコルに基づいて、特定のプロトコルに関連および重要な特性を有する外観モデルを設計することができる。密度の高い集団内の個別の細胞を回復させる過程はその後、以下のように一般化される。
１）特性に外観をマッピングする：染色プロトコルを前提として、個別の細胞をローカライズする１セットまたは１つの組合せの特性を選択する。核染色の場合、これは画素自体が強度値であり、膜染色は境界または縁部を求める必要がある可能性がある。プロトコルから特性およびセットの特性へのマッピングは、経験プロトコルの知識から予め判断する、または例示的データから学習することができる。特性はその後、容量内に細胞位置をローカライズするように、画像内でこれらを観察し測定する能力に基づいて、または容量内で細胞位置をローカライズする特性の能力で各プロトコルに対して自動的に選択される。
２）ノイズおよび不確実性をモデリングする：それぞれ選択された特性は、隣接する細胞との重複から生じる混同での細胞位置、染色および収集における変動性、および最後にノイズを示す。変動性およびノイズを説明するために、尤度モデルは等式２４内で説明したように作り出され、ガウス分布の代わりに、計算的に扱うことができる限り、他の分布を使用することもできる。
３）個別の細胞をセグメンテーションする：個別の細胞の外観をモデリングする特性分布（または尤度）が利用可能になると、細胞クラスタの結合外観が全体としてモデリングされ、ここで各特性は隣接する細胞間の相互作用により観察することができる。核染色を使用する実施例では、これは画素強度にわたってガウス分布の混合物としてモデリングされた。この方法はまた、一般化された特性セットに適用可能である。
【０１１９】
[0066]この方法を行うための自動システム１０（図６）は普通、マーカで染色されたデジタル画像を少なくとも一時的に記憶する手段１２と、方法のステップの１つまたは複数を行うプロセッサ１４とを備えている。記憶手段は、ＲＯＭ（読取り専用メモリ）、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）、またはＣＰＵ（中央処理装置）のＤＲＡＭ（ダイナミックランダムアクセスメモリ）などのプロセッサ、またはＤＶＤまたはＣＤなどの適切なディスクドライブメモリ、またはジップドライブまたはメモリカードに関連する任意の適切なハードドライブメモリデバイスを備えることができる。記憶手段は、プロセッサまたは画像を表示する手段から離れて配置することができ、さらに有線または無線かに関わらず、これに限らないが、ローカルエリアネットワーク、ケーブルネットワーク、衛星ネットワーク、およびインターネットを含む任意の適切な接続デバイスまたは通信ネットワークを通してアクセスすることができる。プロセッサまたはＣＰＵは、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、およびデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）を備えることができる。
【０１２０】
[0067]記憶手段１２およびプロセッサ１４は、１つのシステム内で画像化および分析する自動高速システムとしての分析デバイスの構成部品として組み込むことができる。このようなシステムの例としては、これに限らないが、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社のＩｎＣｅｌｌ分析システム（ニュージャージー州、ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕｐ）が挙げられる。記したように、システム１０はさらに、画像の１つまたは複数を表示する手段１６、インタラクティブビューア１８、バーチャル顕微鏡２０、および／または１つまたは複数の遠隔位置２６に通信ネットワーク２４上で画像の１つまたは複数、または任意の関連データまたは分析情報を伝達する手段２２を備えることができる。
【０１２１】
[0068]表示手段１６は、これに限らないがＬＣＤまたはＣＲＴを組み込んだデバイスなどの、デジタル画像を表示することが可能な任意の適切なデバイスを備えることができる。伝達手段２２としては、これに限らないが、有線または無線デジタル通信システムを含む、通信ネットワーク上でデジタル情報を伝達する任意の適切な手段が挙げられる。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００と同様に、システムはさらに、染色の１つまたは複数を行う自動デバイス２８と、これに限らないが、励起源３２を含み、ＴＭＡのデジタル画像を収集することが可能である蛍光画像化顕微鏡などのデジタル画像化デバイス３０とを備えることができる。このような画像化デバイスは、方法全体を通して、オートフォーカスし、必要に応じて焦点特性を維持および追跡することが可能であることが好ましい。
【０１２２】
[0069]方法およびシステムの実施形態は、これに限らないが、細胞分化、細胞成長、細胞運動および追跡、および細胞周期分析などの様々な応用例で使用することができる。細胞分化としては、これに限らないが、細胞クラスタ内の細胞のサブ集団の同定が挙げられる。このような情報は、これに限らないが、２つ以上の異なる種類の細胞が共に成長する共培養分析などの多くの異なるタイプの細胞分析で有用である。
【０１２３】
[0070]発明の特定の特性のみを本明細書に図示および説明したが、当業者は多くの変更形態および変形形態が思いつくだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、発明の真の趣旨内にあるような変更形態および変形形態全てを含むことを意図していることを理解されたい。
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は概して、生体物質の高密度充填細胞集団を画像化および自動分析することに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]生化学過程が起こる実際の生活環境を模倣するために、モデルシステムが定期的に利用されている。例えば、細胞培地は、遺伝子を操作および調整し、生化学的経路を変更し、得られる効果を分離して観察するための単純なインビトロシステムを提供する。このような細胞培地は、基礎研究、薬物発見、および毒性研究において重要な役割を果たす。
【０００３】
[0003]がん細胞、細胞および組織培地、および生体試料を含む高密度細胞集団は分析されて、大型の動物および人間でのテストの前に、テスト薬剤、造影剤、および治療薬などのこれらの生体物質から幅広い情報を抽出し、がんおよび他の疾病の進行を検査する。細胞培地の場合、細胞はしばしば、普通は広視野または共焦点顕微鏡を使用して画像化される、３Ｄ分析においてインビトロで成長する。研究の結果は得られた画像スタックを調べることにより伝統的に分析されてきた。
【０００４】
[0004]他では３Ｄ環境で細胞をセグメンテーションしているが、これらの試みでは普通、背景から細胞を分離し、細胞群を個別の細胞に分割し、細胞の属性を測定する一式の標準的ステップを使用する。これらの方法は、高解像度データに最も役に立ち、スケーリングを可能にするには修正が必要である。
【０００５】
[0005]このような３Ｄ分析ツールは、新しい見識につながる可能性がある、細胞特徴の定量的測定、および細胞の統計的分布を可能にする。これらはまた、迅速かつ繰り返し可能な分析を可能にする。モデルシステムが生理学的に関連すればするほど、その予測値がより大きくなる。３Ｄ細胞モデルは、細胞間および細胞基質間相互作用の原因となる、生理学的に関連する内容を与える。腫瘍成長を研究するために、３Ｄ細胞クラスタ分析は、栄養素および酸素の細胞勾配などの位置効果、腫瘍成長への代謝性負荷の影響、および治療反応をモデリングする。これに対して、２次元（２Ｄ）単層細胞培地は、分析するのがより容易であるが、腫瘍微細環境などの特定の効果はモデリングしない。
【０００６】
[0006]３次元細胞クラスタは普通、共焦点顕微鏡を使用して画像化される。ｚスタックとして知られる、得られる共焦点画像スタックはその後伝統的に、実験結果を測定および分析するために手作業で調査される。これらの画像スタックの分析を自動化することにより、研究者が高スループット環境においてこのような培地を使用することが可能になる。今まで、多くの研究は、集合の合計量などの単純な測定、または単一の共焦点スライスに基づいた２Ｄ測定のいずれかに限られていた。最近の研究では、全体的統計は重要であるが、細胞クラスタ内の異なる空間的内容に豊富な情報があることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]個別の細胞を同定する能力は、細胞培地および生細胞分析試料の自動分析にとって重要な要件である。画像セグメンテーション方法は普通、このような問題に対処するために適用される。極めて高密度充填細胞の集団をセグメンテーションすることは、特に困難な課題である。特に染色方法に関する従来の知識、および細胞集団に関する基礎的前提は、モデルベースの枠組みの実施形態の１つまたは複数を使用する、本発明の方法およびシステムを使用して捉えることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]細胞の寸法および充填密度は様々な細胞集団で異なるが、これらの違いは正確なモデルに直ぐにつながるものではない。例えば、図１に示すゼブラフィッシュの眼の３Ｄ画像は、いくつかの異なるタイプの細胞を含んでいるが、同じタイプの細胞の中でさえも、寸法、形状、染色取込みおよび画素強度の変化がある。開示された方法およびシステムの実施形態の１つまたは複数は、部分的には、不均質な寸法および充填密度を示す細胞群に基づいて、このような細胞集団をセグメンテーションするためにモデリングを利用する。
【０００９】
[0009]これらのシステムおよび方法は、細胞形態学の測定および分析、チャンネルマーカ、チャンネルマーカの転座、および３Ｄ物理空間内の３Ｄ容量からの統計の抽出に関連する問題の多くを解決する。これらのシステムおよび方法は、ノイズの多いデータが存在する状態でさえも多数の解像度での細胞のセグメンテーションを可能にする。またこれにより、これに限らないが、細胞膜、基質および細胞核を含む、細胞クラスタ、個別の細胞、および細胞内構造物をセグメンテーションするための多数のチャンネルの使用が可能になる。
【００１０】
[0010]細胞を含む画像をセグメンテーションするシステムおよび方法の一実施形態は普通、複数の画素を含む１つまたは複数の画像を提供するステップと、画像内の１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞集団を同定するステップと、１つまたは複数の自動モデルを使用して１つまたは複数の個別の細胞に３Ｄ細胞集団をセグメンテーションするステップとを含んでいる。１つまたは複数の事前モデルおよび／または１つまたは複数の確率モデルを使用して、細胞を個別にセグメンテーションすることができる。事前および確率モデルは、これに限らないが、形状ベースモデルまたは相関ベースモデルなどの様々な細胞特性ベースモデルに基づくものであってもよい。画像はこれに限らないが、データセットにわたる中心体の統計的分布、形態学的測定、および１つの細胞内領域から別の細胞内領域への１つまたは複数のバイオマーカ転座などの、様々な細胞の生体関連測定のための方法およびシステムの自動実施形態の１つまたは複数を使用して分析することができる。
【００１１】
[0011]１つまたは複数の画像を提供するステップは、複数のｚスタック画像を提供するステップを含むことができ、ｚスタック画像は広視野画像を含むことができ、広視野画像は、少なくとも部分的に、細胞集団の１つまたは複数を１つまたは複数の細胞にセグメンテーションするために使用される。ｚスタック画像はまた、共焦点画像を含むことができ、共焦点画像は少なくとも部分的に、１つまたは複数の細胞内構造物をセグメンテーションするために使用される。
【００１２】
[0012]この方法はまた、分水界セグメンテーションを使用して細胞の１つまたは複数の細胞核をセグメンテーションするステップを含むことができ、細胞核中心は、分水界セグメンテーションのためのマーカとして使用される。
【００１３】
[0013]距離マップ飽和機構は、形状ベースモデルを使用して、個別の細胞に集合をセグメンテーションするために画像に適用することができる。細胞核などの細胞内成分は、少なくとも部分的に分水界セグメンテーションを使用してセグメンテーションすることができる。
【００１４】
[0014]本発明のこれらおよび他の特性、態様および利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読めばより良く理解されるものである。図中、同様の記号は、図面全体を通して同様の部品を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0015]本発明の方法およびシステムの実施形態の１つまたは複数を使用してセグメンテーションすることができる、３次元画像の例示的画像を示す図である。
【図２】[0016]２点確率関数が捉えるために使用することができる情報のタイプを示す４つのグラフである。
【図３】[0017]面積比が０．５である点に基づいて、物体の半径をどのように推定することができるかを示す図である。
【図４】[0018]図１に示すゼブラフィッシュの眼の画像の表面推定を示す図である。
【図５】[0019]レベルセット改良が適用された後の、図１に示すゼブラフィッシュの眼のセグメンテーションされた画像を示す図である。
【図６】[0020]本発明の方法の１つまたは複数を組み込むシステムの一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0021]システムおよび方法は、これに限らないが、細胞スクリーニングおよび薬剤テストを含む幅広い生物学的応用例を有する。システムおよび方法の実施形態の１つまたは複数は、１つまたは複数の細胞集団の中の細胞集団を自動的に同定し、１つまたは複数の実施形態は自動的に、多チャンネル画像データを使用して、各集合を個別の細胞および細胞内構造物にセグメンテーションする。システムおよび方法はさらに、多次元高密度充填細胞集団の自動分析を可能にする。システムおよび方法を使用して、これらの画像から集められた情報はさらに、細胞集団およびその細胞成分の生体関連測定を行い、分析するために使用することができる。これらの測定は、これに限らないが、データセットにわたる中心体の統計的分布、形態学的測定、および１つまたは複数の細胞内領域から別の細胞内領域へのバイオマーカの取込みおよび転座を含むことができる。これらの測定は、細胞レベルで、および細胞および／または細胞内レベルで行うことができる。システムおよび方法の技術的効果は、高密度充填細胞集団の３Ｄ画像化および定量的分析を可能にするためのものである。
【００１７】
[0022]このような分析への普通および従来の難しい第１のステップは、画像内の関連領域を背景から分離するための画像セグメンテーションを含んでいる。画像セグメンテーションは、多くの形態を呈することができるが、このステップの結果は、他の領域で測定またはこれと相関させることができる１セットの隔離物体または細胞クラスタである。例えば、核マーカで染色された細胞核をセグメンテーションすることができ、これらのセグメンテーションマスクはその後、様々な細胞プロセスを調査することを目的とした他の生物学的マーカに相関させることができる。システムおよび方法は特にこの応用例に限らないが、１つの応用例は、ゼブラフィッシュなどの多細胞生物の形態学、または高密度充填がん細胞集団内のバイオマーカの転座を測定するためのものである。
【００１８】
[0023]システムおよび方法の様々な実施形態で使用されるアルゴリズムの１つまたは複数は、例えば、多次元細胞集団内の細胞の生物形態学または分布を同定するために使用することができる。例えば、生物または集団内の細胞群は同定され、その後、各細胞群内の細胞は、多チャンネル画像データを使用して個別の細胞にセグメンテーションされる。システムおよび方法はさらに、これらの細胞集団の自動分析を可能にする。システムおよび方法を使用してこれらの画像から収集される情報はさらに、生物形態学または細胞集団の生体関連測定を行い、これを分析するために使用することができる。これらの測定は、これに限らないが、データセットにわたる中心体の統計的分布、形態学的測定、およびバイオマーカの取込みおよび転座を含むことができる。
【００１９】
[0024]特許請求する発明の主題をさらに明確および簡潔に説明し、これを指摘するために、以下の説明で使用される特定の用語に以下の定義を与える。
[0025]本明細書で使用する場合、「生体物質」という用語は、生体源である、またはこれから得られる物質のことを言う。生体源としては、これに限らないが、例えば体液（例えば、血液、血漿、血清、または尿）から生じる物質、器官、組織、画分、細胞、単細胞または多細胞臓器である、またはこれらから単離された細胞、細胞内および核物質、菌類、植物、およびこれに限らないが昆虫および人間を含む哺乳類などの動物が挙げられる。生体源としては、さらに非限定的な実施例として、単クローン抗体産生、ＧＭＰ接種増殖、昆虫細胞培養、遺伝子治療、潅流、大腸菌増殖、タンパク質発現、タンパク質増幅、植物細胞培養、病原体増殖、細胞治療、細菌産生およびアデノウィルス産生に使用される物質が挙げられる。
【００２０】
[0026]生体物質としては、これに限らないが、冷凍または染色、あるいは別の方法で処理されているような、その物理的状態は無関係な任意の物質を挙げることができる。いくつかの実施形態では、生体物質としては、組織サンプル、全細胞、細胞成分、サイトスピン、または細胞塗抹標本を挙げることができる。いくつかの実施形態では、生体物質は組織サンプルを含んでよい。他の実施形態では、目標組織の連続画像を、最初に参照染料で、その後、追加の染料で得ることができる場合に、生体物質はインサイチュー組織ターゲットであってもよい。組織サンプルは、同様の機能を有することができる生体対象の組織から得られる一群の同様の細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルは、ヒトの組織から得られる一群の同様の細胞を含むことができる。ヒトの組織の適切な実施例としては、これに限らないが、（１）上皮組織、（２）血管、骨および軟骨を含む結合組織、（３）筋組織、および（４）神経組織が挙げられる。組織サンプル源は、加工していない、冷凍した、および／または保存した器官または組織サンプルまたは生検または吸引物から得られる固体組織、血液または任意の血液成分、脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液、または被験者の妊娠または発達における任意の時からの細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、組織サンプルとしては、一次または培養細胞または細胞株を挙げることができる。
【００２１】
[0027]いくつかの実施形態では、生体物質としては、健康なまたは病気の組織サンプルからの組織切片（例えば、結腸、乳房細胞、前立腺からの組織切片）が挙げられる。組織切片としては、組織サンプルの単一部分または片、例えば、組織サンプルから切り取った組織または細胞の薄い薄片を挙げることができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの多数の切片を取り、分析を行うことができる。但し、本明細書に開示する方法は、少なくとも２つの（形態的または分子レベルで）異なるターゲットに対する組織サンプルの同じ切片の分析のために使用することができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの同じ切片は、少なくとも４つの（形態的または分子レベルで）異なるターゲットに対して分析することができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの同じ切片は、５つ以上の（形態的または分子レベルで）異なるターゲットに対して分析することができる。いくつかの実施形態では、組織サンプルの同じ切片は、形態的および分子レベルの両方で分析することができる。
【００２２】
[0028]本明細書で使用される場合、バイオマーカまたはチャンネルマーカという用語は、これに限らないが、特定の波長の光への露出によって励起された場合に、異なる波長で発光する化合物である蛍光造影剤および蛍光色素分子を含んでいる。蛍光色素分子は、その発光プロファイル、または「色」に関して説明することができる。緑色の蛍光色素分子（例えば、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ、およびオレゴングリーン）は、普通は５１０〜５４０ナノメートルの範囲の波長での発光を特徴とすることができる。赤色の蛍光色素分子（例えば、テキサスレッド、Ｃｙ５、およびテトラメチルローダミン）は、普通は５９０〜６９０ナノメートルの範囲の波長での発光を特徴とすることができる。オレンジ色の蛍光色素分子の例は、細胞核および細胞質の両方を染色する、１，５−ビス｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝―４，８−ジハイドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（ＣｙＴＲＡＫ Ｏｒａｎｇｅ（商標））の誘導体であり、遠赤外の蛍光色素分子の例は、１，５−ビス｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−４，８−ジハイドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（ＤＲＡＱ５（商標））の蛍光ＤＮＡ染料、および１，５−ビス（｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−４，８−ジハイトロキシアントラセン−９，１０−ジオン）−Ｎ−酸化物（ＡＰＯＰＴＲＡＫ（商標）の細胞プローブである。蛍光色素分子の例としては、これに限らないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネートの誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩（Ｌｕｃｉｆｉｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、クマリン誘導体、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−トリフルオロメチルクラリン（クマラン１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニディノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７−ジメチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）４−メチルクマリン、４，４’ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−塩化スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）、エオシン、エオシンイソチオシアネートなどのエオシン誘導体、エリトロシン、エリトロシンＢおよびエリトロシンイソチオシアネートなどのエリトロシン誘導体、エチジウム、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメチオキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＴＩＲＣ）などのフルオレセインおよび誘導体、（アミンとの反応の際に蛍光性の）フルオレスカミン誘導体、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、（アミンとの反応の際に蛍光性の）ｏ−フタルアルデヒド誘導体、ピレン、ピレンブチレートおよびサクシニミジル １−ピレンブチレートなどのピレンおよび誘導体、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ＲＴＭ．Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ塩化スルホニル、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、およびスルホローダミン１０１の塩化スルホニル（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）などのローダミンおよび誘導体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸およびランタニドキレート誘導体、量子ドット、シアニン、プレリウム染料、およびスクアラインが挙げられる。
【００２３】
[0029]本明細書で使用される場合、プローブを使用する応用例では、「プローブ」という用語は、結合剤、および信号ジェネレータまたは酵素などの標識を有する作用薬のことを言う。いくつかの実施形態では、結合剤および標識（信号ジェネレータまたは酵素）は、単一体で具現化される。結合剤および標識は、単一のステップで生体サンプルに直接的（例えば、結合剤内に組み込まれた蛍光分子を介して）、または間接的（例えば、分裂部位を含むことができるリンカを通して）取り付け、塗布することができる。代替実施形態では、結合剤および標識は、個別体（例えば、ターゲットおよび酵素を結合することが可能な一次抗体、または一次抗体を結合することが可能な信号ジェネレータ標識二次抗体）内で具現化される。結合剤および標識（信号ジェネレータまたは酵素）が個別体である場合、単一のステップまたは多数のステップで生体サンプルに塗布することができる。本明細書で使用される場合、「蛍光プローブ」という用語は、蛍光信号ジェネレータに連結された結合剤を有する作用薬のことを言う。
【００２４】
[0030]本明細書で使用する場合、固体担体上に生体物質を固定する必要がある応用例では、「固体担体」という用語は、生体サンプル内に存在するターゲットを本明細書で開示した方法によって固定化させ、その後検出することができる物体のことを言う。ターゲットは、物理吸着によって、共有結合形成によって、またはその組合せによって固体担体上に固定化させることができる。固体担体としては、重合体、ガラスまたは金属材料を挙げることができる。固体担体の例としては、膜、マイクロタイタープレート、ビード、フィルタ、テスト片、スライド、カバースリップ、および試験管が挙げられる。生体材料が膜に付着されるこれらの実施形態では、膜材料は、これに限らないが、ナイロン、ニトロセルロース、および二フッ化ポリビニリデンから選択することができる。いくつかの実施形態では、固体担体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびポリプロピレンから選択したプラスチック表面を含むことができる。
【００２５】
[0031]方法およびシステムは、これに限らないが、検体検出、組織化学、免疫組織化学、または免疫蛍光法などの分析、診断、または予後応用例での使用に適用させることができる。いくつかの実施形態では、方法およびシステムは、組織化学、免疫染色、免疫組織化学、免疫検定、または免疫蛍光応用例で特に応用可能である。いくつかの実施形態では、方法およびシステムは、免疫ブロット技術、例えばウエスタンブロット、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫検定で特に応用可能である。
【００２６】
[0032]方法およびシステムの１つまたは複数の実施形態は、所与の染色プロトコルが中心体を均一に明るくすると仮定する確率モデルを使用する。染料の発光周波数によって、全ての細胞核は均一に明るく見える。サンプル内の細胞が高密度充填されているので、隣接する細胞からの蛍光染色の放射により、直線フィルタリングによって取り除くことができないかなりの量の構造的背景ノイズが生成される。したがって、細胞核は十分分離されず、その境界はあまり特徴付けられていない。加えて、個別の細胞の形状に関する特定の仮定を行うことが可能であるが、細胞はかなり変形可能であるという事実を説明する必要がある。特性グループ化およびモデル予測を１つの一貫性のある枠組みに一体化するために、２００４年９月１６日出願の「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｇｍｅｎｔｉｎｇ Ｃｒｏｗｄｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｉｎｔｏ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｏｂｊｅｃｔｓ（混雑環境を個別の物体にセグメンテーションするシステムおよび方法）」という名称の米国特許出願第１０／９４２，０５６号に記載されたセグメンテーション方法を使用することができる。
【００２７】
[0033]任意の種類の画像特性、例えば端点、縁部、画像領域からなる、１セットのＮ個の観察結果Ｚ＝｛ｚｉ｝であると仮定すると、アルゴリズムは、潜在的物体前提の形状および位置に関してパラメータ化された尤度関数を使用してこれらを区切る。ＥＭ公式の変数を使用して、モデルパラメータおよびグループ化両方の最大尤度予測が同時に得られる。得られるアルゴリズムは、広域的最適化を行い、ローカルコンテキストのみを使用して決定を行うことができない場合でさえも、正確な結果を生成する。
【００２８】
[0034]幾何形状モデルは、ＺのうちのどのサブセットＣを単一の物体に関連させることができるかを特定するために使用される。前処理ステップでは、クリークとも呼ばれる、１セットのＫ個の可能なグループの特性が特定される。全てのクリークのセットは以下のように定義される。
Ｃ：＝｛Ｃ１，．．．，ＣＫ｝ （１）
ｙｉが［１，．．．，Ｋ］での長さＮの代入ベクトルＹ＝｛ｙｉ｝が、各特性ｚを特定のクリークＣｋに関連させるために使用される。クリークへの特定の関連性は、物体の仮定形状および外観に関する問題に直接結合される。こういう理由で、クリークＣｋが細胞の位置、形状および外観を符号化するパラメータθｋに関連させられている。形状パラメータの集合は、以下のように示される。
Θ＝［θｉ，．．．，θＫ］ （２）
方法は、代入ベクトルＹおよび特性セットＺ、すなわちｐ（Ｙ，Ｚ；Θ）の同時確率をモデリングする。ここで、Θは分布のパラメータを示している。読者は、
【００２９】
【数１】
【００３０】
によって与えられるランダム変数Ｙの範囲が、クリークＣのセットによって定義されることに留意すべきである。代入ベクトルＹは、クリークＣｋへの特性ｚの割当を直接観察することができないので、隠し関数として処理される。ＥＭは、Θの最大尤度予測、および起こりそうな割当を生成するためにサンプリングすることができるＹに対する分布を求めるために使用される。
【００３１】
[0035]同時確率ｐ（Ｙ，Ｚ；Θ）は、１セットの画像特性を前提として、特定の特性割り当Ｙに対するメリット関数を定義することによってモデリングすることができる。例えば、特定のクリークに対する特定のサブセットの画像特性（ｚｉ，．．．，ｚｊ）の類似性を測定することができる。この例示的実施形態では、単一の特性割当の類似性は、所与のクリークＣｋへのペアワイズ割当と同様に、形状パラメータθｋでモデリングされる。対応する類似性関数は、以下の通り示される。
ｇ（ｚｉ，θｋ）およびｇ（ｚｉ，ｚｊ，θｋ）
特性割当の対数尤度は、以下のような１セットの画像特性ｚを前提として公式化される。
【００３２】
【数２】
【００３３】
この実施例では、クリークのセットが変化しないので、Ｙによって決まる規格化定数を算出する必要がない。ｐ（Ｚ）の値は、公式全体を通して一定であるので以下のようになる。
【００３４】
【数３】
【００３５】
[0036]不均質な細胞集団をセグメンテーションする、または異なる細胞集団を同定することが望ましい実施形態では、方法は、全ての細胞が同様の形状であるということを前提とすることができない。したがって、特性点、形状モデル、および類似性関数は、このような不均質細胞集団をセグメンテーションするように適合される。所与の試料の不均質性を説明するために、方法の実施形態のいくつかは構造標識を使用する。例えば、標識Λｋは、同質構造を有する量の特定の領域に割り当てられている。いくつかの領域内では細胞が小さく、高密度に充填されており、細胞はその他の領域ではより大きい可能性がある。構造標識Λは、このような領域を同定するために使用される。本実施例では、形状パラメータの分布は、容量の所与の領域に割り当てられた構造標識によって決まる。尤度関数は、これにしたがって変更される。
【００３６】
【数４】
【００３７】
[0037]広視野および共焦点ｚスタックモードは両方とも、分析のために使用される画像を取得するのに使用することができる。広視野画像は、細胞クラスタをセグメンテーションするために使用され、共焦点ｚスタック画像は個別の細胞または細胞核をセグメンテーションするために使用される。非限定的な実施例として、２０Ｘ，０．４５ ＮＡ対物レンズを使用し、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００を使用して画像を取ることができる。ｚスタック画像は、得られる画像から焦点ズレの光を取り除くために構造光画像化を利用する、光学Ｚセクショニング（ＯＺ）モジュールと、広視野モードを使用して得ることができる。ｚスライス解像度は、個別のターゲット物体の寸法を越えて劣化するにしたがって、所与の検定は２Ｄ画像環境まで効果的に下がる可能性がある。というのは、各物体はいくつかの例では、単一のスライス内のみに存在することがあるからである。
【００３８】
[0038]システムおよび方法の本実施例では、画素の代わりに物理座標（例えば、μｍ）内で処理が行われる。物理座標は、本実施例では、アルゴリズムを一般化することができ、これが寸法および形状モデルを含むことができるように使用される。広視野および共焦点画像両方の利点は、処理のために利用される。というのは、広視野画像は核集合を区別し、共焦点画像は核を改良するからである。画像は最初、背景から前景を離すように前処理される。前処理ステップでは、局所画像統計が、背景画素をなくすために使用される。
【００３９】
[0039]細胞クラスタ内の核の近接により、核染色は普通、核から漏れて、その結果、細胞の周りの明るい背景につながる。さらに、励起光をブロックする核による信号減衰は、細胞集団内側の減光核につながる。このように、本実施例では、局所画像特性は、画像をセグメンテーションして、背景および前景を分離させるために使用される。容量Ｖ内の各ボクセルｘごとの閾値を特定するように閾値関数Ｔが算出される。任意の所与のボクセル位置ｘ∈Ｖでは、Ｔ（ｘ）の値は、ボクセルの近傍Ω内の局所画像統計に基づいている。本実施例では、この近傍の寸法は、平均細胞核の寸法にしたがって設定される。各ボクセルｘごとのＴ（ｘ）を算出することは、計算的に集中的であり、それによって３Ｄ格子Ｌを代わりに使用することができる。各ｘｉ∈Ｌでは、Ｔ（ｘｉ）の値は以下のように算出される。
【００４０】
【数５】
【００４１】
ここで、τＶは、全容量Ｖに関してＯｔｓｕ法を使用して算出された広域的閾値を示している。Ｏｔｓｕ法は、閾値を求めて、画素のヒストグラムの級間分散を最大限にする。同様に、τΩ（ｘｉ）は、局所近傍内で算出されたＯｔｓｕ閾値である。σΩ（Ｘｉ）は、近傍Ω（Ｘｉ）内のボクセル強度の分散であり、σＢは、Ｉ（ｘ）＜τＶであるボクセル強度の分散を示している。このような分散により、背景がどれだけ変化することが予測されるかの測定を行う。全ての残りのボクセル位置
【００４２】
【数６】
【００４３】
では、Ｔ（ｘ）の値は、線形補間を使用して算出される。この方法は、近傍ボクセル強度σΩ（Ｘｉ）の分散を使用して、近傍が背景および前景ボクセルの組合せを含んでいるかどうかを効果的に判断する。この分散がσＢに対して比較的小さい場合、広域的値τＶが使用され、これにより均質領域内のノイズの多い局所算出が防止される。
【００４４】
[0040]格子の寸法は、計算的要件に適合させることができる。近傍の重複に関連するトレードオフがあることに留意されたい。重複が大きすぎる場合、精度は高いが、処理時間は長くなる。重複が小さすぎる場合（例えば、非重複近傍）、処理時間ははるかに短いが、特に近傍の境界で精度に問題がある。
【００４５】
[0041]適用閾値化は、例えば、背景照明が画像にわたって一定である場合、必ずしも必要ではない。
[0042]核内の他の検出は、以下の通り欲張りな方法で核寸法制約を使用することによって除去することができる。核寸法に対応する所与の半径で最大である画像内の領域最大値を求める。その後、最大値の全ては（時間を節約するために背景のものをマスキングした後に）標識付けされ、強度によって分類される。その後、最も明るい最大値から始まり、その最大値からの距離測定内にあるリストからのこれらの最大値が除去される。このステップは、最大値の全てが検討されるまで、次第に暗い最大値まで続く。近似の細胞半径がこれらの算出のために使用されるので、方法の本実施例はモデル駆動される。これらの方法は、最初に画像を平滑化することによって最適化することができる。寸法制約は、それぞれの核が一度のみ検出されることを保証するので、平滑化は常に必要ではない。しかし、異常値を除去することによって中心の局所化を助けるものである。この方法で得られる核中心は、分水界アルゴリズムのシードとして働く。距離マップは、ダニエルソン距離アルゴリズムを使用してこれらのシードから生成される。核境界はその後、２つの制約、つまりモデルベース寸法制約、および背景マスクによって定義された形状を使用して画定される。水域アルゴリズムが得られる距離マップに適用された場合、細胞は効果的にセグメンテーションされる。
【００４６】
[0043]分水界セグメンテーションアルゴリズムは、接する細胞を分離させるようになっている。いくつかの例では、形態学操作により修正することができる形状は円滑でないが、このような操作は時々、過程の終わりに向かって最もよくそのままにされる。このような操作が過程の終わりに向かってより良く行われる例は、データから導き出された形状を基礎的に変更することが予測され、構造化素子の寸法に非常に左右される場合の例である。
【００４７】
[0044]前景が背景から分離された後に、二値オブジェクトの距離マップがその後置かれ、分水界ステップは集団を分離させるために行うことができる。しかし、距離マップ内の多数の最大値から得られるオーバーセグメンテーションにより、距離画像は水域を算出する前に処理することができる。距離マップは典型的には、多くの極大値を含んでいる。トポロジーマップとして見た場合、極大値は各領域に対する１つの最大値に組み合わされ、それによって各核集団をセグメンテーションするために使用することができることが好ましい。二値オブジェクトは典型的には細長く、表面は正確な円というよりはむしろ不規則であるので、多数の極大値が存在する。ターゲットオブジェクトが正確な円であったら、１つの最大値しかないだろう。これらの最大値を１つの最大値に組み合わせるために、距離マップ飽和が行われる。最大値が小さな高さだけ異なる場合、これらは組み合わせられ、それによりその頂点を切り取ることによって距離マップを飽和させる。この過程は、迅速な形態学操作を使用して行うことができる。飽和は強度寸法内で行われるが、空間寸法内の形態学操作は典型的には、同じ結果を与える。というのは、距離マップは普通、定義によって直線的に変化するからである。説明したように、距離マップ処理は、画像全体に一度行うことができ、各個別の集団を考慮する必要がなく、その結果より迅速な過程につながる。
距離マップ飽和ステップの実施例
１．飽和させるための高さ差であるｈを設定する。
２．グレースケールが、ｈだけ入力マップを侵食する。
３．グレースケールが、ｈ＋１だけステップ２から侵食されたマップを膨張させる。
４．ステップ３から入力マップ画像および膨張マップの最小値をとる。これにより、飽和最大値の画像が与えられる。
【００４８】
[0045]ｈの半径を備えたグレースケール侵食は基本的には、所与の距離内の最小オペレータである。これは典型的には、頂点を切り取る。というのは、本実施例と同様に、距離マップが使用されるからである。グレースケール膨張は、距離マップの境界を元の位置に戻すために本実施例では好ましい。本実施例では、膨張半径は侵食より１大きい、そうでないと詳細が失われてしまう可能性がある。原画像および膨張画像の最小値をとることにより、普通は元の侵食動作から回復しない頂点を除いて、画像中の全ての値が元の値に戻る。
【００４９】
[0046]本実施例の距離マップ飽和は、拡張極値を求めることと同様である。しかし、他の実施例では、拡張最大値を見つけるステップは、特に大きなｈ値ではかなり遅い可能性があるが、画像再構築を使用することができる。膨張および侵食操作は、大きなカーネルでは遅くなる可能性があり、核集団が比較的大きいので大きなカーネルが必要である可能性がある。このステップの速度を上げるために、サブサンプリングステップが行われる。サブサンプリングステップは、距離マップをサブサンプリングするステップと、処理するステップと、その後、結果をスーパーサンプリングするステップとを含むことができる。
【００５０】
[0047]サブサンプリングは、少なくとも、点間で線形補間を普通は定義により使用する、距離マップを使用する場合の選択肢である。これはまた、所望の量だけサブサンプリングし、１の半径の形態学を行うことによって、非一体型間隙に対するサブピクセル精度を備えた侵食および膨張を与えることができる。カーネルがｍｍで特定され、いくつかの小数値がある場合、膨張は常に四捨五入する。というのは、整数の半径が必要であるからである。これにより、誤差がシステムに持ち込まれる可能性がある。これはまた、特にグレースケール侵食を行う場合に、大きなカーネルに対して算出するための非常に長い時間が必要となる可能性がある。別の方法では、画像を、半径に対してｍｍで特定された量だけ再サンプリングし、その後、１の半径で侵食／膨張させ、その後、再サンプリングすることができる。
【００５１】
[0048]背景に対応する処理した距離マップ画像の領域が、その後マスキングされる。分水界ステップはその後、集団をセグメンテーションするために得られた画像に行われる。これらのステップは部分的に、平均画像内の核集団の迅速なセグメンテーションを可能にし、また、距離マップの核集団ごとに広域的最大値によって特定されるように各集団の中心（ｘ，ｙ）を配置する。
【００５２】
[0049]各集団の中心のスライス位置も判断されることが好ましい。集団は３Ｄで球状であるので、定義によって集団の最も幅広い部分に対応するスライスは、中心を含んでいる。このステップでは、普通は各画素がそのｘ、ｙ位置に対する最大値を含むスライスに対応する、２Ｄ画像である最大指数画像が生成される。いくつかのスライスが特定のｘ、ｙ位置に対して同じ強度を有する場合、これらのスライスの平均がとられる。核集団マスクはその後、この最大指数画像の前景を隔離し、各集団の所与の幅の輪郭を抽出するために、前のステップから使用される。ヒストグラムは、セグメンテーションマスクからの集団の境界周りの最大指数で生成することができる。このヒストグラム内で最も頻繁に起こるスライス指数はしたがって、集団の最も幅の広い部分、したがって集団中心に対応する。ヒストグラムのモードは、この値を与えるために同定される。集団中心のこのｚ位置を前に求めたｘおよびｙ位置に組み合わせることにより、各集団の３Ｄ位置が特定され、その後、集団中心から細胞核の分布を求めるために使用することができる。
核集団処理の実施例
１．二値マスクをサブサンプリングする。
２．高速二値アルゴリズムを使用して、小さな突起を取り除くために二値マスクを開閉する。
３．距離マップを求める。
４．飽和アルゴリズムを使用する。
５．値をリスケーリングした後に、距離マップをスーパーサンプリングする。
６．領域最大値を求める。
７．閾値化した背景によってマスキングされた距離マップの分水界を求める。これによって、集団のｘ、ｙセグメンテーションが与えられる。
８．各集団にｄｏコマンドを行う
９．「最大指数画像」を使用して各集団のスライス中心を求める。
１０．ｅｎｄ ｆｏｒコマンドを行う
１１．集団の中心から距離マップを生成する。
【００５３】
[0050]同じ３Ｄ分析の異なるスライス解像度でいくつかの取得を使用して、異なる解像度に対する核集団処理のロバスト性を判断することができる。これらの様々な解像度での細胞計数は近い可能性がある。普通、スライス解像度が低ければ低いほど、効果的に２Ｄ画像に対してより近くなる。これは、有用な測定値をさらに得ながら、どれだけ解像度が劣化する可能性があるかを示している。分布グラフを生成することもできる。集団のハイポキシティの測定値を与える分布グラフを生成することもできる。
【００５４】
[0051]アプリオリと呼ばれる、所与の試料の物理的および構造的特性に関する予備的知識を組み込んだ方法およびシステムの実施形態の１つまたは複数がある。限られた測定値のみを使用して、このような構造標識Ｌｉを定義するために、ランダム異種物質を使用することができる。
【００５５】
[0052]Ｎ点確率関数は、ランダム異種材料を特徴付けるために知られている。例えば、ｎ点相関関数に基づく測定値を細胞集団を同定するために使用することができる。空間の領域
【００５６】
【数７】
【００５７】
を仮定して、容量
【００５８】
【数８】
【００５９】
が２つの互いに素であるフェーズ
【００６０】
【数９】
【００６１】
および
【００６２】
【数１０】
【００６３】
内で区切られる。指標関数は、所与の位置
【００６４】
【数１１】
【００６５】
がどのセットに属するのかを示すために使用されている。
【００６６】
【数１２】
【００６７】
位置ｘ１、ｘ２；：：：；ｘｎでのｎ点の確率は、フェーズｉ＝（ｉ１；ｉ２；：：：；ｉｎ）で求められる。
【００６８】
【数１３】
【００６９】
セグメンテーションアルゴリズムに対するアプリオリを示すために、以下の２点確率関数を使用することができる。
【００７０】
【数１４】
【００７１】
式中、｜ｘ１−ｘ２｜＝ｒである。図２に示すグラフは、これらの２点確率関数を捉えるのに使用することができる情報のタイプを示している。Ｐ１１およびＰ０１の交点は、物体の半径に関するいくつかの情報を含んでいる。線ＡはＰ１１に言及し、線ＢはＰ０１に言及し、線ＣはＰ１０に言及し、線ＤはＰ００に言及している。
【００７２】
[0053]実験データを使用して、物体の寸法を推定することができる。図３に示すように、物体の半径は、面積比が０．５である点に基づいて推定することができる。これにより、半径の側に対する推定量を求めることができる。本実施例では、推定量は以下に基づいている。
Ｐ１１（ｒ）＝Ｐ１０（ｒ） （１０）
この例示的実施形態では、長さｒの線分
【００７３】
【数１５】
【００７４】
が前景内に完全に含まれている確率は、このような線分が前景領域が始点で、背景が終点で交差する確率に等しい。図３に示すように、試料が主として同様の寸法の丸い物体からなるという前提に基づいて、前景物体の寸法の分布に対する推定量を示すために、条件（８）が使用される。λ∈［０，２ｒ］である長さλｒの線分は、図３の線Ｅに平行であると仮定する。１セットの点は最初、長さλｒを有する線分に対する潜在的始点である円Ｃ内で算出され、それによって線分の両方の端点が円内にある。すなわち、以下の通りである。
【００７５】
【数１６】
【００７６】
セットの寸法
【００７７】
【数１７】
【００７８】
を直接算出することができる。図３に示す表記は、
【００７９】
【数１８】
【００８０】
を算出するために本実施例で使用される。
[0054]点ＱおよびＳによって画定される半径ｒおよび中心Ｐを有する円の扇形Ｓは、
【００８１】
【数１９】
【００８２】
のように算出することができる。
線分
【００８３】
【数２０】
【００８４】
は
【００８５】
【数２１】
【００８６】
の長さであると注意されたい。
角度ｑは、
【００８７】
【数２２】
【００８８】
のように算出することができる。
したがって、扇形Ｓの面積は
【００８９】
【数２３】
【００９０】
である。
次のステップでは、点Ｐ、ＯおよびＳによって画定される、三角形Ｋの面積が算出される。ピタゴラスの定理を使用する。
【００９１】
【数２４】
【００９２】
三角形の面積Ｋは次に、
【００９３】
【数２５】
【００９４】
のように算出することができる。
最後に、セットの寸法
【００９５】
【数２６】
【００９６】
を
【００９７】
【数２７】
【００９８】
のように算出することができる。
別の方法では、セットの寸法は
【００９９】
【数２８】
【０１００】
のように算出することができる。
半径ｒの寸法の推定量を作り出すために、実施形態の１つまたは複数は
【０１０１】
【数２９】
【０１０２】
の比を使用した。
τ＝０：５である例では、条件（８）を満たすことができる。しかし、この比は、半径ｒの実際の寸法によるものではない（図３）。
【０１０３】
[0055]実施形態の１つまたは複数では、充填密度を予測する必要があり得る。例えば、細胞集団は３Ｄ容量全体を満たしていない可能性がある。試料および染色アーチファクトの性質により、状況がより複雑になる可能性がある。例えば、図１に示す染色したゼブラフィッシュの眼の核は、空間内のマニホールドの上にある。したがって、材料統計の間違いを避けるためには、線処理過程を生成する前にこのマニホールドを予測する必要がある。図４は、図１に示すゼブラフィッシュの眼に対する表面予測である。
【０１０４】
[0056]アプリオリの前処理および生成後に、実施形態の１つまたは複数は、核または中心体などの細胞構造物を予測するための初期化ステップを含んでいる。初期化ステップは、これに限らないが、１つまたは複数の細胞特徴に基づく方法、および相関ベースの方法などの、細胞構造物を予測するための１つまたは複数の方法を含むことができる。
【０１０５】
[0057]様々な細胞特徴を使用して、候補セットの中心体を求めることができるが、方法およびシステム内で有用である細胞特徴の２つの非限定的な例としては、細胞形状および細胞外観が挙げられる。相関ベース方法は、より一般的であり、したがって行うのがより迅速である。
【０１０６】
[0058]初期化ステップの１つの例示的実施形態は、形状ベース初期化である。減衰依存セグメンテーションは、細胞を示す１セットの前景領域につながる。細胞群はその後、個別の細胞にさらに分割される。この実施形態は、マーカ制御分水界方法の使用により分水界セグメンテーションを算出する前に、全てのドメイン情報を含んでいる。マーカは、画像の最終パーティション内の連結成分の数を判断するので、マーカは細胞核全てに加えられる。本実施例では、分水界アルゴリズムまで通過された画像は、物体境界に沿って高い強度値を有する。細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションするために、形状および強度情報が組み合わされて、マーカ画像が生成される。実際のセグメンテーションステップを行う前に、モデル制約が課される。細胞の形状は非常に可変である可能性があるので、普通は強い形状アプリオリを加えないことが最も良い。例えば、距離マップを使用して形状情報を符号化することができる。距離マップＤ（ｘ）の例は、以下のように定義することができる。
【０１０７】
【数３０】
【０１０８】
式中のＴ（・）は、等式（４）内で定義されている。得られる距離マップは、全ての背景ボクセルに対してゼロである。前景の一部である全てのボクセルでは、距離マップは、背景ボクセルに最も近い距離を記録する。したがって、２つの接触している細胞が不均一な明るさであるが、その間にネックがある場合であっても、距離マップＤの輪郭を使用して、これらを異なる核にセグメンテーションすることができる。しかし、ネックがない場合、これらを分離するためには他の制約が必要である。また、染色された核は、縁部に向かってより拡散するより明るい中心を有するので、強度モデルを使用することもできる。これらの関数は異なる目盛を有するので、組み合わせる前に最初に正規化される。正規化は、両方の前景領域がゼロ平均および単位分散を有するように、ＩおよびＤをリスケーリングすることによって達成される。得られる組合せ関数は、以下のように算出される。
Ｗ（ｘ）＝λＩ（ｘ）＋（１−λ）Ｄ（ｘ） （２２）
式中の、λは、普通、強度および形状情報両方に等しい重要度を置くように０：５に設定される。強度および形状ベース関数は両方とも、多数のマーカを細胞内に配置する。
【０１０９】
[0059]得られる組合せマップＷは、多くの領域最大値を含んでいる。形状マップ内の多数の領域最大値は、二値物体の伸び、およびその表面の粗度によるものである。物体が真円である場合、１つの最大値しかない。強度マップは、高いレベルのノイズにより、多数の最大値を有する。位相マップとして見た場合、飽和過程を使用して、領域最大値は各領域ごとに１つの最大値に組み合わせられる。
【０１１０】
[0060]これらの最大値を１つの最大値に組み合わせるために、実施形態の１つまたは複数は、以下に示すｆの寸法ｎの侵食によるｆの再構築として定義された、寸法ｎでの再構築による開口方法を使用する。
【０１１１】
【数３１】
【０１１２】
グレースケール侵食は、頂点を切り取る。再構築により、元の侵食操作からけして回復しない頂点を除いて、画像内の全ての値はその元の値に戻される。
[0061]初期化ステップはまた、相関ベース方法を含むことができる。各個別の細胞の外観は、選択した染色プロトコル、もちろん、画像化システムの特徴によるものである。特定の顕微鏡のノイズおよび画像特徴は、この方法に１つまたは複数の要因として加えることができる。
【０１１３】
[0062]染色プロトコルに基づいて、単一の細胞核の外観をモデリングするテンプレートが生成される。このテンプレートは、中心体である尤度が高い、ボクセル位置を特定するために本実施例で使用される。ボクセル位置は、テンプレート照合方法を使用して特定することができる。
【０１１４】
[0063]機器およびアプリケーションの問題によって、データ収集の解像度は異なる可能性がある。しかし、あらゆる所与のスライス（すなわち、ｘ−ｙ平面）の解像度は普通、一定のままであり、ｚ軸に沿ったサンプリング周波数が普通は変化する。テンプレート照合は、元のデータセットの追加補間を算出することなく、所与の解像度に適合させることができる。
【０１１５】
[0064]染色プロトコルが、実施例の１つまたは複数で異なる強度分布につながる例では、通常の分布は、画像強度を直接はモデリングしないと推定することができる。代わりに、特定の画像特性の発生をモデリングする。このようなセットの画像特性は、学習アルゴリズムにより特定するべきである。
【０１１６】
[0065]実施形態の１つまたは複数では、細胞核は不均一に染色され、単一の隔離された核の強度分布は、３次元でガウス分布を有することが考えられる。しかし、全ての染色プロトコルが、均一な染色につながるわけではない。このような例では、外観モデルはデータから構成することができる。データは、以下の式が成り立つように適当な特性空間にマッピングすることができる。
【０１１７】
【数３２】
【０１１８】
これらのマップは、クラスタ化された細胞集団から個別の細胞の位置および形態を判断するために、方法およびシステムで使用することができる。特定の染色プロトコルに基づいて、特定のプロトコルに関連および重要な特性を有する外観モデルを設計することができる。密度の高い集団内の個別の細胞を回復させる過程はその後、以下のように一般化される。
１）特性に外観をマッピングする：染色プロトコルを前提として、個別の細胞をローカライズする１セットまたは１つの組合せの特性を選択する。核染色の場合、これは画素自体が強度値であり、膜染色は境界または縁部を求める必要がある可能性がある。プロトコルから特性およびセットの特性へのマッピングは、経験プロトコルの知識から予め判断する、または例示的データから学習することができる。特性はその後、容量内に細胞位置をローカライズするように、画像内でこれらを観察し測定する能力に基づいて、または容量内で細胞位置をローカライズする特性の能力で各プロトコルに対して自動的に選択される。
２）ノイズおよび不確実性をモデリングする：それぞれ選択された特性は、隣接する細胞との重複から生じる混同での細胞位置、染色および収集における変動性、および最後にノイズを示す。変動性およびノイズを説明するために、尤度モデルは等式２４内で説明したように作り出され、ガウス分布の代わりに、計算的に扱うことができる限り、他の分布を使用することもできる。
３）個別の細胞をセグメンテーションする：個別の細胞の外観をモデリングする特性分布（または尤度）が利用可能になると、細胞クラスタの結合外観が全体としてモデリングされ、ここで各特性は隣接する細胞間の相互作用により観察することができる。核染色を使用する実施例では、これは画素強度にわたってガウス分布の混合物としてモデリングされた。この方法はまた、一般化された特性セットに適用可能である。
【０１１９】
[0066]この方法を行うための自動システム１０（図６）は普通、マーカで染色されたデジタル画像を少なくとも一時的に記憶する手段１２と、方法のステップの１つまたは複数を行うプロセッサ１４とを備えている。記憶手段は、ＲＯＭ（読取り専用メモリ）、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）、またはＣＰＵ（中央処理装置）のＤＲＡＭ（ダイナミックランダムアクセスメモリ）などのプロセッサ、またはＤＶＤまたはＣＤなどの適切なディスクドライブメモリ、またはジップドライブまたはメモリカードに関連する任意の適切なハードドライブメモリデバイスを備えることができる。記憶手段は、プロセッサまたは画像を表示する手段から離れて配置することができ、さらに有線または無線かに関わらず、これに限らないが、ローカルエリアネットワーク、ケーブルネットワーク、衛星ネットワーク、およびインターネットを含む任意の適切な接続デバイスまたは通信ネットワークを通してアクセスすることができる。プロセッサまたはＣＰＵは、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、およびデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）を備えることができる。
【０１２０】
[0067]記憶手段１２およびプロセッサ１４は、１つのシステム内で画像化および分析する自動高速システムとしての分析デバイスの構成部品として組み込むことができる。このようなシステムの例としては、これに限らないが、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社のＩｎＣｅｌｌ分析システム（ニュージャージー州、ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕｐ）が挙げられる。記したように、システム１０はさらに、画像の１つまたは複数を表示する手段１６、インタラクティブビューア１８、バーチャル顕微鏡２０、および／または１つまたは複数の遠隔位置２６に通信ネットワーク２４上で画像の１つまたは複数、または任意の関連データまたは分析情報を伝達する手段２２を備えることができる。
【０１２１】
[0068]表示手段１６は、これに限らないがＬＣＤまたはＣＲＴを組み込んだデバイスなどの、デジタル画像を表示することが可能な任意の適切なデバイスを備えることができる。伝達手段２２としては、これに限らないが、有線または無線デジタル通信システムを含む、通信ネットワーク上でデジタル情報を伝達する任意の適切な手段が挙げられる。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００と同様に、システムはさらに、染色の１つまたは複数を行う自動デバイス２８と、これに限らないが、励起源３２を含み、ＴＭＡのデジタル画像を収集することが可能である蛍光画像化顕微鏡などのデジタル画像化デバイス３０とを備えることができる。このような画像化デバイスは、方法全体を通して、オートフォーカスし、必要に応じて焦点特性を維持および追跡することが可能であることが好ましい。
【０１２２】
[0069]方法およびシステムの実施形態は、これに限らないが、細胞分化、細胞成長、細胞運動および追跡、および細胞周期分析などの様々な応用例で使用することができる。細胞分化としては、これに限らないが、細胞クラスタ内の細胞のサブ集団の同定が挙げられる。このような情報は、これに限らないが、２つ以上の異なる種類の細胞が共に成長する共培養分析などの多くの異なるタイプの細胞分析で有用である。
【０１２３】
[0070]発明の特定の特性のみを本明細書に図示および説明したが、当業者は多くの変更形態および変形形態が思いつくだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、発明の真の趣旨内にあるような変更形態および変形形態全てを含むことを意図していることを理解されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の画素を含む１つまたは複数の画像を提供するステップと、
前記画像内の１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞クラスタを同定するステップと、
１つまたは複数のモデルを使用して、前記３Ｄ細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞に自動的にセグメンテーションするステップと、
を含む、細胞を含む画像をセグメンテーションする方法。
【請求項２】
前記細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞にセグメンテーションするステップは、１つまたは複数の細胞特徴に対応する１つまたは複数のアプリオリを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションするステップは、１つまたは複数の確率モデルを初期化するステップを含んでいる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記確率モデルの少なくとも１つは、形状ベースモデルを含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記形状ベースモデルは、距離マップを含んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
距離マップ飽和機構を前記画像に適用するステップと、
分水界セグメンテーションを使用して、前記細胞の１つまたは複数の核をセグメンテーションするステップとをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記距離マップをサブサンプリングするステップと、
前記距離マップを処理ステップと、
前記処理した距離マップをスーパーサンプリングするステップとをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記確率モデルの少なくとも１つは、相関ベースモデルを含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記アプリオリの１つまたは複数は、ｎ点相関確率モデルに基づいている、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
最大指数画像を生成するステップであって、各画素はｘ、ｙ位置での最大値を含む画像スライスに対応しているステップと、
前記集合をセグメンテーションするステップにおいて生成されたマスクから導き出された、前記集合の１つまたは複数の境界周りに１つまたは複数の最大指数のヒストグラムを生成するステップと、
ヒストグラムのモードを探し、前記集合の１つまたは複数の１つまたは複数の中心を同定するステップとを含む、集合中心のｚ成分を求めるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を２つ以上の細胞サブ集団にセグメンテーションするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の１つまたは複数の生体関連測定値を分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定値の１つまたは複数は、１つのサブ細胞領域から別のサブ細胞領域までの１つまたは複数のバイオマーカの転座である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数の画像を提供する前記ステップは、複数のｚスタック画像を提供するステップを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｚスタック画像の前記少なくとも１つは、広視野画像を含んでいる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｚスタック画像の前記少なくとも１つは、共焦点画像を含んでいる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記共焦点画像は、少なくとも部分的に、前記細胞の１つまたは複数のサブ細胞成分をセグメンテーションするために使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞の前記サブ細胞成分の１つまたは複数は細胞核である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分水界セグメンテーションを使用して、前記細胞の１つまたは複数の核をセグメンテーションするステップであって、中心体は前記分水界セグメンテーションのマーカとして使用されるステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞にセグメンテーションするステップは、統計学習アルゴリズムを使用して、確率モデルのパラメータを予測することによって、１つまたは複数の細胞特徴を判断するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
複数の画素をそれぞれ含む１つまたは複数のｚスタック画像を少なくとも一時的に記憶する記憶デバイスと、
前記画像内の１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞クラスタを同定し、１つまたは複数の自動モデルを使用して前記３Ｄ細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションするプロセッサとを備えた、細胞を含む画像をセグメンテーションするシステム。
【請求項２２】
前記プロセッサは、１つまたは複数の細胞特徴に対応する１つまたは複数のアプリオリを使用して、前記細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞にセグメンテーションする、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記プロセッサは、少なくとも部分的に１つまたは複数の形状ベースモデルを初期化することによって、前記細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションする、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記プロセッサは、少なくとも部分的に１つまたは複数の相関ベースモデルを初期化することによって、前記細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションする、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記プロセッサは、
各画素はｘ、ｙ位置での最大値を含む画像スライスに対応している状態で、最大指数画像を生成し、
前記集合をセグメンテーションする前記ステップにおいて生成されたマスクから導き出された、前記集合の１つまたは複数の境界周りに１つまたは複数の最大指数のヒストグラムを生成し、
前記ヒストグラムのモードを探し、前記集合の１つまたは複数の１つまたは複数の中心を同定する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項１】
複数の画素を含む１つまたは複数の画像を提供するステップと、
前記画像内の１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞クラスタを同定するステップと、
１つまたは複数のモデルを使用して、前記３Ｄ細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞に自動的にセグメンテーションするステップと、
を含む、細胞を含む画像をセグメンテーションする方法。
【請求項２】
前記細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞にセグメンテーションするステップは、１つまたは複数の細胞特徴に対応する１つまたは複数のアプリオリを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションするステップは、１つまたは複数の確率モデルを初期化するステップを含んでいる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記確率モデルの少なくとも１つは、形状ベースモデルを含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記形状ベースモデルは、距離マップを含んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
距離マップ飽和機構を前記画像に適用するステップと、
分水界セグメンテーションを使用して、前記細胞の１つまたは複数の核をセグメンテーションするステップとをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記距離マップをサブサンプリングするステップと、
前記距離マップを処理ステップと、
前記処理した距離マップをスーパーサンプリングするステップとをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記確率モデルの少なくとも１つは、相関ベースモデルを含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記アプリオリの１つまたは複数は、ｎ点相関確率モデルに基づいている、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
最大指数画像を生成するステップであって、各画素はｘ、ｙ位置での最大値を含む画像スライスに対応しているステップと、
前記集合をセグメンテーションするステップにおいて生成されたマスクから導き出された、前記集合の１つまたは複数の境界周りに１つまたは複数の最大指数のヒストグラムを生成するステップと、
ヒストグラムのモードを探し、前記集合の１つまたは複数の１つまたは複数の中心を同定するステップとを含む、集合中心のｚ成分を求めるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を２つ以上の細胞サブ集団にセグメンテーションするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の１つまたは複数の生体関連測定値を分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定値の１つまたは複数は、１つのサブ細胞領域から別のサブ細胞領域までの１つまたは複数のバイオマーカの転座である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数の画像を提供する前記ステップは、複数のｚスタック画像を提供するステップを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｚスタック画像の前記少なくとも１つは、広視野画像を含んでいる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｚスタック画像の前記少なくとも１つは、共焦点画像を含んでいる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記共焦点画像は、少なくとも部分的に、前記細胞の１つまたは複数のサブ細胞成分をセグメンテーションするために使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞の前記サブ細胞成分の１つまたは複数は細胞核である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分水界セグメンテーションを使用して、前記細胞の１つまたは複数の核をセグメンテーションするステップであって、中心体は前記分水界セグメンテーションのマーカとして使用されるステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞にセグメンテーションするステップは、統計学習アルゴリズムを使用して、確率モデルのパラメータを予測することによって、１つまたは複数の細胞特徴を判断するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
複数の画素をそれぞれ含む１つまたは複数のｚスタック画像を少なくとも一時的に記憶する記憶デバイスと、
前記画像内の１つまたは複数の３次元（３Ｄ）細胞クラスタを同定し、１つまたは複数の自動モデルを使用して前記３Ｄ細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションするプロセッサとを備えた、細胞を含む画像をセグメンテーションするシステム。
【請求項２２】
前記プロセッサは、１つまたは複数の細胞特徴に対応する１つまたは複数のアプリオリを使用して、前記細胞クラスタの１つまたは複数を１つまたは複数の個別の細胞にセグメンテーションする、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記プロセッサは、少なくとも部分的に１つまたは複数の形状ベースモデルを初期化することによって、前記細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションする、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記プロセッサは、少なくとも部分的に１つまたは複数の相関ベースモデルを初期化することによって、前記細胞クラスタを個別の細胞にセグメンテーションする、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記プロセッサは、
各画素はｘ、ｙ位置での最大値を含む画像スライスに対応している状態で、最大指数画像を生成し、
前記集合をセグメンテーションする前記ステップにおいて生成されたマスクから導き出された、前記集合の１つまたは複数の境界周りに１つまたは複数の最大指数のヒストグラムを生成し、
前記ヒストグラムのモードを探し、前記集合の１つまたは複数の１つまたは複数の中心を同定する、請求項２１に記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５１５６７３（Ｐ２０１１−５１５６７３Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５００２２５（Ｐ２０１１−５００２２５）
【出願日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３２４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１５５７１
【国際公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３２４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１５５７１
【国際公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
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