高度に多型の標的配列の一塩基多型分析
本発明により、２つ以上の多型を有し、その多型の１つが識別され、別の多型がマスキングされる、標的配列を分析するための方法およびプローブが提供される。本発明は、高度に多型の核酸において一塩基多型（ＳＮＰ）を分析するためのプロセスに関し、具体的には、目的のＳＮＰの近くに１つ以上のさらなる多型を含む標的においてＳＮＰを分析するためのプロセスに関する。本発明は、１つの局面では、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号第６０／５０８，７９２号（２００３年１０月２日出願）の利益を請求し、この内容は本願明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府によって後援された研究または開発に基づいてなされた本発明に対する権利に関する記載）
適用なし。
【０００３】
（コンパクトディスクで提出された「配列リスト」、表またはコンピュータプログラムリスト付録に対する参照）
適用なし。
【０００４】
（発明の背景）
本発明は、高度に多型の核酸において一塩基多型（ＳＮＰ）を分析するためのプロセスに関し、具体的には、目的のＳＮＰの近くに１つ以上のさらなる多型を含む標的においてＳＮＰを分析するためのプロセスに関する。
【０００５】
典型的には、一塩基多型の遺伝子型特定は、１個のミスマッチを含むプローブまたはプライマーを用いて行われる。このことは、対立遺伝子の分析を非常に単純化する。しかし、プローブ領域における１個より多い多型の存在は、遺伝子型特定を複雑化し、多くのＳＮＰ検出法が不可能である場合には、検出が非常に困難なものとなる。ほとんどのＳＮＰ検出法は、プローブ配列が別の多型にもわたる場合、目的の多型の遺伝子型特定において問題点を有する。
【０００６】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムにおいて最も豊富な変異であり、配列多型の９０％を超える割合を占める。ＳＮＰは１０００ヌクレオチドごとに平均１個生じ、大雑把に言えば、特定の個々において任意の塩基位置の０．１％が異種である可能性が存在する。ヌクレオチド多様性は、ゲノム全体で一定ではなく、特に多様性が低い領域（例えば、Ｘ染色体）および特に多様性が高い領域（例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））遺伝子座において１０％までである（非特許文献１）。高度に多型のＳＮＰ標的配列もまた、他の種において知られている。例えば、植物（非特許文献２）およびウイルス（非特許文献３）。多くのＳＮＰ検出法は、その近位に別の多型が存在しない場合に核酸標的中の一塩基多型を検出するために記載されている（非特許文献１、非特許文献４）。融解曲線分析による遺伝子型特定が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３および米国特許出願番号第１０／１６５，４１０号を参照（これらそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。
【０００７】
他の技術では、第２の多型がプローブ長の中に存在する場合、目的の多型を同定するためにプローブを設計しておらず、普遍的な塩基を使用しておらず、プローブは、第２の多型と対になる位置に普遍的な塩基が組み込まれる。例えば、普遍的な塩基アナログについての刊行物の総説（非特許文献５）は、ＳＮＰ分析を議論しているが、１個より多い多型がプローブによっておおわれている場合は議論していない。非特許文献６は、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールの合成を開示する。その位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを含む相補体に対してハイブリダイズした１個の普遍的な塩基を含む１５マーオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）は３℃未満であった。しかし、そのＴｍは、完全にマッチしたオリゴヌクレオチドよりも顕著に低かった。非特許文献７および特許文献４は、人工的なミスマッチとしてこの塩基を導入することによってミスマッチ識別を増加させるための３−ニトロピロールの使用を開示する。特許文献５は、少なくとも２個の並置された普遍的な塩基を含むプローブおよびプライマーを開示する。非特許文献８は、確立された変異部位の近くの天然塩基のミクロな欠失またはミクロな挿入を含むプローブを用いた複数のＳＮＰの同時検出を開示する。特許文献６は、プライマー伸長反応の間にポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖に組み込むことができる、拡張可能なヌクレオチドと称される普遍的なヌクレオチドを開示する。特許文献７は、限定された数のＬＮＡ置換されたホスホラミダイト試薬を開示する。特許文献８は、薬学的適用のための多くの数の普遍的な塩基のトリホスフェート誘導体を開示する。
【０００８】
いくつかの刊行物は、ＳＮＰ分析におけるそれらの適用を議論することなく、普遍的な塩基を開示する。例えば、非特許文献９は、プローブおよびプライマーにおいて使用可能な２個の新規の変性された塩基６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピルミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ）および２−アミド−６−メトキシアミノプリン（Ｋ）を開示するが、ミスマッチ識別または遺伝子型特定におけるそれらの使用は開示していない。両塩基ＰおよびＫがそれらのアミノ互変異性体およびイミノ互変異性体に存在する可能性に起因して、これらはＡおよびＧならびにＣおよびＴの両方とそれぞれ対になる。非特許文献１０および非特許文献１１は、イソカルボスチリルコア構造に基づく非天然核酸塩基の合成を開示する。非特許文献１２は、４個の非天然塩基の合成を開示し、それぞれの塩基は、全ての４個の天然塩基と比較的同様にハイブリダイズする。非特許文献１３は、８−オキソ−７，８−ジヒドロアデノシンの塩基対の性質を開示する。非特許文献１４は、６個の新規の非天然塩基を開示するが、ＳＮＰ分析は観察していなかった。非特許文献１５、非特許文献１６および特許文献９は、天然アナログＡ、Ｃ、ＧおよびＴと顕著な構造識別を示さなかった３個の普遍的な塩基を開示する。特許文献１０は、限定された数のＬＮＡ置換されたホスホラミダイト試薬を開示する。特許文献１１は、薬学的適用のための多くの数の普遍的な塩基のトリホスフェート誘導体を開示する。
【０００９】
増幅された核酸標的に基づく分析は、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５および特許文献１６に開示され、これらはそれぞれ本願明細書中に参考として援用される。
【００１０】
天然に改変された塩基アナログおよびそれらの性質は、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９；および特許文献２０および非特許文献１７に開示され、これらはそれぞれ本願明細書中に参考として援用される。
【特許文献１】米国特許第６，５６９，６２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５０６，５６８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４４８，０１５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７８０，２３３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１６５８８８号明細書
【特許文献６】国際公開第０３／０４０３９５号パンフレット
【特許文献７】欧州特許第１３１４７３４号明細書
【特許文献８】国際公開第０２／０６２８１６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／０７２７６４号パンフレット
【特許文献１０】欧州特許第１３１４７３４号明細書
【特許文献１１】国際公開第０２／０６２８１６号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，１９７，５６３号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，３１２，７２８号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，２２１，６０３号明細書
【特許文献１７】国際公開第０１／０６５９５８号パンフレット
【特許文献１８】米国特許第６，１２７，１２１号明細書
【特許文献１９】米国特許第６，６６０，８４５号明細書
【特許文献２０】米国再発行特許発明第３８，４１６号明細書
【非特許文献１】ＴｗｙｍａｎおよびＰｒｉｍｒｏｓｅＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ４、２００２年、ｐ．１−１３
【非特許文献２】Ｃｈｉｎｇ Ａ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＫＳ，Ｊｕｎｇ Ｍ，Ｄｏｌａｎ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ ＯＳ，Ｔｉｎｇｅｙ Ｓ，Ｍｏｒｇａｎｔｅ Ｍ，Ｒａｆａｌｓｋｉ ＡＪ．ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔ．３、２００２年、ｐ．１９
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ，Ｌａｒｄｅｒ ＢＡ．Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．６ Ｓｕｐｐｌ ３、２００１年、ｐ．２５−４４
【非特許文献４】Ｇｅｒｏｍｅ Ｂｒｅｅｎ，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２、２００２年、ｐ．８３−８８
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９、２００１年、ｐ．２４３７−２４４７
【非特許文献６】Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７、１９９５年、ｐ．１２０１−１２０９
【非特許文献７】Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５、１９９７年、ｐ．３３１−３３５
【非特許文献８】Ｂｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅａｍｏｓｔ．，８０、１９９８年、ｐ．３２−３６
【非特許文献９】Ｌｉｎ，ＰＫＴおよびＢｒｏｗｎ，ＤＭ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０、１９９２年、ｐ．５１４９−５１５２
【非特許文献１０】ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１、１９９９年、ｐ．１１５８５−１１５８６
【非特許文献１１】Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２、２０００年、ｐ．３２７４−３２８７
【非特許文献１２】Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５、２００３年、ｐ．６１３４−６１３９
【非特許文献１３】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１２、２００２年、ｐ．１９７７−１９８０
【非特許文献１４】Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５、２００３年、ｐ．９６３８−９６４６
【非特許文献１５】ＳｅｅｌａおよびＤｅｂｅｌａｋ、Ｎｕｄｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｄｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ，２０、２００１年、ｐ．５７７−５８５
【非特許文献１６】ＳｅｅｌａおよびＤｅｂｅｌａｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８、２０００年、ｐ．３２２４−３２３２
【非特許文献１７】Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．，Ａｃｔａ，６９、１９８６年、ｐ．１６０２−１６１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それゆえに、第２のＳＮＰのプローブ長の中に配置される目的の第１のＳＮＰを識別可能なプライマー／プローブおよびこのようなプライマー／プローブを設計し用いるための方法が必要とされる。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面では、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記多型のそれぞれが前記標的核酸のプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的核酸を含むサンプルと前記標的配列の前記プローブ領域に隣接するかまたはそれと重複する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、重合する酵素、ヌクレオチド基質および下式：
【００１３】
【化９】
【００１４】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有するオリゴヌクレオチド結合体を混合して混合物を提供する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；
（ｂ）前記混合物を重合に有利な条件下でインキュベートする工程；および
（ｃ）前記増幅された標的に対する結合体ハイブリダイゼーションの際に生成される蛍光をモニタリングすることによって前記増幅を連続的にモニタリングする工程と
を含む、方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上記プローブは下式を有する。
【００１６】
【化１０】
【００１７】
〔式中、Ｍ、Ｗ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｆｌ、ｔおよびｎは上に提供される意味を有し、Ａｒ１およびＡｒ２は置換芳香環であり、典型的には置換ベンゼン環であり、置換基は、以下のアリール基について一般的に提供されるものから選択され、さらに、Ａｒ２は、アリールアゾ基またはスチリル基で置換され、さらに拡張されたビスアゾ色素またはそれらのアナログを提供することができる。〕モノアゾおよびビスアゾ色素について好ましい置換基は以下に提供される。
【００１８】
なおさらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、下式を有するオリゴヌクレオチドプローブ／結合体を使用する。
【００１９】
【化１１】
【００２０】
〔式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、記号Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ＯＲｇ、Ｎ（Ｒｇ）２、Ｎ＋（Ｒｇ）３、ＳＲｇ、ＣＯＲｇ、ＣＯ２Ｒｇ、ＣＯＮ（Ｒｇ）２、（ＣＨ２）ｍＳＯ３−、（ＣＨ２）ｍＣＯ２−、（ＣＨ２）ｍＯＰＯ３−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣＯ２−およびそれらのエステルおよびそれらの塩から選択される置換基をあらわし、各Ｒｇは独立してＨまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、添字ｍは０〜６の整数である。記号ＲｈはＨであるかまたはＣ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３０個の原子を有し、環状、非環状またはそれらの組み合わせのいずれかであり、利用可能な価数を満たすさらなる水素原子を有する基（典型的には、固相合成で使用される連結基の痕跡部分）を表す〕。
【００２１】
なおさらに好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は下式を有する。
【００２２】
【化１２】
【００２３】
〔式中、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂ、Ｒａ〜Ｒｈおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、記号Ｒ０、Ｒ１およびＲ２はＨであるかまたは好ましくは電子吸引基（電子を吸引するとは、水素原子よりも電気陰性度が高い基を指し、例えば、ニトロ、シアノ、アセチルなどであり、Ｒ０、Ｒ１およびＲ２のうち１つは、拡張されたアリールアゾまたはスチリルアゾ部分をあらわすことができる）であり、記号Ｒ３およびＲ４はＨをあらわすかまたは好ましくは電子供与基（電子を供与するとは、水素原子よりも電気的に陽性な基を指し、例えば、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノなどである）である。〕ビスアゾ色素または拡張系（例えば、Ｒ０が−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ３または−ＣＨ＝ＣＨ−Ａｒ３）である実施形態について、末端芳香環（Ａｒ３）は置換されていないかまたは好ましくは電子吸引置換基で置換されており、Ａｒ１およびＡｒ２環は置換されていないかまたは好ましくは電子供与置換基で置換されている。特に好ましい実施形態では、Ｗは−（ＣＨ２）３Ｎ（−）−（ＣＨ２）３−であり；Ｒ０＝ＮＯ２であり；Ｒ１＝Ｃｌであり；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり；Ｋは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンリンカーである。１つの実施形態では、ＭおよびＦｌはそれぞれ独立して、プローブの５’末端または３’末端のいずれかに結合することができる。
【００２４】
関連する方法は、以下の「詳細な記載」に提供され、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体の使用のために、関連するアッセイの間にマスキングされるＳＮＰの部位に入り交ざった塩基を有する。サンプル中で野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドを識別する方法が記載され、この標的は、識別されるＳＮＰと識別されないＳＮＰとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
（定義および略語）
以下の略語が、明細書中で使用される：Ｍ＝「マイナーグルーブバインダー」、ＭＧＢＴＭリガンドは、置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）であり；Ｆｌ＝「蛍光ラベル」または「フルオロフォア」であり；Ｑ＝「クエンチャー」であり；ＣＰＧ＝「制御細孔ガラス」（固体支持体の一例として）であり；およびＯＤＮ＝「オリゴヌクレオチド」部分または分子である。
【００２６】
特定の式において、基［Ａ−Ｂ］は、複数の塩基（Ｂ）を有し、かつ複数の糖、改変糖またはアミノ酸（Ａ）の骨格に沿って結合する、オリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチドまたはペプチド−核酸中のモノマー単位を指すために使用される。Ｂは、通常の塩基および改変塩基（適切な場合、普遍的な塩基または入り交ざった塩基を含む）を指す。
【００２７】
用語「プローブ」および「結合体」は、相互交換可能に使用され、結合したマイナーグルーブバインダー、フルオロフォアおよびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドを指す。
【００２８】
用語「普遍的な塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」は、それらの間がほとんど識別できない天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のそれぞれと「塩基対」を形成する塩基アナログを指す。
【００２９】
用語「入り交ざった（無差別な）塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ（ｉｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ）ｂａｓｅ）」は、完全に相補性のマッチする塩基に加えて、それらの間がほとんど識別できないＤＮＡまたはＲＮＡ中の２個以上の天然のミスマッチの塩基と２個の水素結合を形成する天然塩基または天然塩基アナログを指す。
【００３０】
用語「蛍光ラベル」または「フルオロフォア」は、約４００〜９００ｎｍに最大の蛍光発光を有する化合物を指す。これらの化合物としては（括弧中に最大発光（ｎｍ）を示す）、Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＧＦＰ（赤色にシフト）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ（Ｒ）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｒ）（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ（Ｒ）−３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）が挙げられる。
【００３１】
用語「リンカー」は、分子の種々の部分を整列させるかまたは固体支持体に分子（またはそれらの部分）を共有結合するために使用される部分を指す。典型的には、リンカーまたは連結基は、本発明において記載され使用されるリガンドまたは結合体の成分中の官能基（例えば、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、マイナーグルーブバインダーまたはクエンチャー）と相互作用し、共有結合を形成するために使用される官能基を有する。連結基上の官能基（他の成分と相互作用する前）の例としては、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＯＨまたは−ＳＨが挙げられる。連結基はさらに、結合体に対して他の基（例えば、ホスホラミダイト部分など）に接続する分子の一部分である。さらに、リンカーは、直鎖または非環状部分、環状部分、芳香族環またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００３２】
用語「固体支持体」は、オリゴヌクレオチド合成と適合性の任意の支持体を指し、例えば、ガラス、制御細孔ガラス、重合性物質、ポリスチレン、ビーズ、コーティングされたガラスなどが挙げられる。
【００３３】
用語「アルキル」は、接頭部に示される数の炭素原子を有する、直鎖、分枝または環状の飽和一価炭化水素基または環状および直鎖または分枝の飽和一価炭化水素基の組み合わせを指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチルなどを含むことを意味する。本願明細書中の定義のそれぞれ（例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アラルキルオキシ）について、アルキル部分の主鎖の炭素原子の数を示すために接頭部が含まれない場合、基またはそれらの一部分は、８個以下の主鎖炭素原子を有する。「ヘテロアルキル」基（「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」基を含む）について、この用語は、１個または２個の炭素原子がＯ、Ｎ、ＮＨまたはＳによって交換されたアルキル基を含むことを意味し、この理解で、ヘテロ原子がアルキル鎖の内部の位置を占める（すなわち、分子の残りに対する結合点を形成せず、アルキル基の末端ではない）。結果として、ヘテロアルキル基は、少なくとも２個の炭素原子を存在させ、指定された炭素原子の数は炭素原子に対するもののみである。
【００３４】
用語「アルキレン」は、接頭部に示される数の炭素原子を有する、直鎖の飽和二価炭化水素基または分枝飽和二価炭化水素基を意味する。例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、２−メチルプロピレン、ペンチレンなどを含むことを意味する。
【００３５】
用語「アリール」は、置換されていないかまたは独立して以下に提供される基から選択される１〜４個の置換基、好ましくは１個、２個または３個の置換基で置換された、一価または二価（例えばアリーレン）の単環式または二環式の５〜１０個の環原子を有する芳香族炭化水素基を意味する。用語「アリール」はさらに、芳香族性を保持しつつ１個以上のヘテロ原子およびヘテロ原子官能基が環炭素と交換された上述の基（例えば、ピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニルなど）を含むことを意味する。より特定的には、アリールとの用語は、限定されないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、チエニルおよびベンゾチアゾリルおよびそれらの置換形態を含む。
【００３６】
アリール基についての置換基はさまざまであり、芳香族環上で０個から空いた価数の全体数まで範囲において、以下から選択される：−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’”、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシおよびペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル；ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は、独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルおよび（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される。本発明のいくつかの実施形態では、アリール置換基は、示されるとおり、アリールアゾ基（−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ）またはスチリル基（−ＣＨ＝ＣＨ−Ａｒ）である。
【００３７】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−の置換基で場合により交換されてもよく、ここで、ＴおよびＵは独立して−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、ｑは０〜２の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で場合により交換されてもよく、ここで、ＡおよびＢは独立して−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜３の整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合のうち１つは、二重結合で場合により交換されてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つは、式−（ＣＨ２）Ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔの置換基で場合により交換されてもよく、ここで、ｓおよびｔは独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、水素または非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。なおさらに、アリール環（以下のＡｒ１およびＡｒ２）のうち１つは、芳香族系の共鳴能力を拡張するために、直接的にまたは例えば−（ＣＲ’＝ＣＲ’）ｎ−および−（Ｃ≡Ｃ）ｎ−（ここでｎは０〜５である）のような基を介して間接的に別の置換アリール基でさらに置換されることができ、波長吸収の最大値が増加する。
【００３８】
添字「ハロ」および用語「ハロゲン」は、置換基を記載するために使用される場合、−Ｆ、―Ｃｌ、―Ｂｒおよび−Ｉを指す。
【００３９】
本発明の特定の化合物またはオリゴヌクレオチドは、塩形態で存在してもよい。このような塩としては、塩基付加塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノまたはマグネシウムの塩または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物または改変オリゴヌクレオチドは、比較的塩基性の官能基を含有し、酸付加塩は、ニートまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、このような化合物の中性形態と十分な量の所望の酸とを接触させることによって得ることができる。受容可能な酸付加塩の例としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素塩、リン酸、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、硫酸、硫酸一水素塩、ヨウ化水素酸またはホスホン酸などから誘導される塩および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などから誘導される塩が挙げられる。さらに、アミノ酸の塩（例えばアルギネートなど）および有機酸（例えば、グルクロン酸またはガラクツロン酸など）の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７７，６６，１−１９を参照）。本発明の特定の化合物は、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換され得る塩基性官能基および酸性官能基の両方を含む。
【００４０】
上記化合物の中性形態は、上記の塩と塩基または酸とを接触させ、親化合物を従来の様式で単離することによって再生してもよい。上記化合物の親形態は、特定の物理的性質、例えば極性溶媒中の溶解度において種々の塩とは異なるが、それ以外では、上記塩は本発明の目的のための親化合物と等価である。
【００４１】
本発明の特定の化合物は、非溶媒化形態および溶媒化形態（水和形態を含む）で存在することができる。概して、溶媒化形態は、非溶媒化形態と等価であり、本発明の範囲内に包含されることが意図される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶またはアモルファス形態で存在してもよい。概して、全ての物理的形態は、本発明によって考察される用途のために等価であり、本発明の範囲内であることが意図される。本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を保有し；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体はすべて、本発明の範囲内に包含されることが意図される。立体化学の決定および異性体の分離のための方法は、当該技術分野で周知である（“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｊ． Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２のＣｈａｐｔｅｒ ４の議論を参照）。
【００４２】
本発明の化合物はさらに、このような化合物を構成する１つ以上の原子に非天然の比率で原子同位体を含有してもよい。例えば、上記化合物は、放射性同位体、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）で放射能標識されてもよい。本発明の化合物のすべての同位体改変体は、放射性であってもそうでなくても（例えば、２Ｈ）本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００４３】
「保護基」または「それらの保護形態」は、分子マスク中で反応性基に結合する場合、その反応性を減らすか妨害する原子のグループを指す。保護基の例は、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｏ． Ｆｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｗｉｌｅｙ，２ｎｄ ｅｄ．１９９１）およびＨａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−８（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．１９７１−１９９６）中に見出すことができる。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換トリチル基、アロイルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などが挙げられる。代表的なヒドロキシ基としては、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されたもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテルおよびアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが挙げられる。概して、好ましい保護基は、酸性条件または塩基性条件下で除去可能なものであるかまたは特定の光源を用いることによって除去可能な基（例えば、「光感受性保護基」）である。さらに、適切な保護基の選択は、保護基の組み込みまたは除去は、分子の残りの部分に干渉しないか、さもなければ顕著な影響を与えないように、分子中の他の官能基を考慮してなされる。
【００４４】
上述の定義中の「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続けて記載される事象または状況が起こることが必須ではなく、その記載がその事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「場合によりアルキル基で一置換または二置換されたアリール」は、アルキル基が、必須ではないが、存在してもよいことを意味し、この記載が、アリール基がアルキル基で一置換または二置換される状況およびアリール基がアルキル基で置換されていない状況を含むことを意味する。
【００４５】
本発明の実施は、他に言及されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および改変、生体接合化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝子学、組換えＤＮＡおよび当該技術分野の常識の範囲内の関連分野を使用する。これらの技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７，１９８８，１９８９，１９９０，１９９１，１９９２，１９９３，１９９４，１９９５，１９９６）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００２）；Ｇａｉｔ（ｅｄ．），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照。
【００４６】
用語「ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ」は、概して、５’−ＭＧＢ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌプローブを指す。対照的に、「ＴａｑＭａｎ（Ｒ） ＭＧＢプローブは、３’−ＭＧＢ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌプローブを指す。ＥｃｌｉｐｓｅＴＭおよびＭＧＢＴＭは、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの商標であり；ＴａｑＭａｎ（Ｒ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡの登録商標である。
【００４７】
（一般論）
本発明は、多型のある位置で塩基が置換される場合、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオチドと対になるための類似の安定性を有する、プローブまたはプライマー中で普遍的または入り交ざった塩基を同定し、使用する。第２の多型のある位置にあるプローブ中の塩基の普遍的な塩基を用いた置換（例えば、遺伝子型を特定されることが意図されない）は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ置換の独立したハイブリダイゼーション特性を与える。プローブ中の普遍的な塩基は、本質的に、第２の多型を「目につかない」状態にし、目的の第１の多型の特定の同定を可能にし、標準的な遺伝子型特定ハイブリダイゼーションに基づく方法の使用を可能にする。
【００４８】
本発明はさらに、多型のある位置において塩基で置換される場合、完全にマッチして形成されるものを除く特徴を有し、プローブまたはプライマー中で入り交ざった（無差別な）塩基、天然または天然の塩基アナログを同定し、使用する：
（ａ）ミスマッチの天然Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオチドのいずれかのうち、少なくとも２つ以上と２個の水素結合を形成し、
（ｂ）ミスマッチの天然Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオチドのいずれかのうち２つ以上と対になるための類似の熱力学的性質を有し、最近接物の構造に組み込まれる（−ＢＡ−ＮＰ−ＢＢ−；ここで、ＢＡおよびＢＢは、独立してＧ、Ｃ、ＡまたはＴである）
（ｃ）第２の多型のある位置でプローブ中に生じる塩基の入り交ざった（無差別な）塩基を用いた置換（例えば、遺伝子型特定されることが意図されない）は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ置換の少なくとも２つの独立した塩基対の熱力学的性質を与える。
【００４９】
（実施形態の記載）
（プローブおよび結合体）
本発明の方法は、以下の（ａ）、（ｂ）を含むオリゴヌクレオチドプローブ（またはオリゴヌクレオチド結合体、以下「プローブ／結合体」、「プローブ」または「結合体」と称する）を使用する。
【００５０】
（ａ）プローブ配列長の中で（典型的には野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチド）および少なくとも１つのさらなる一塩基多型を識別するための、目的の第１の一塩基多型を含む標的核酸配列に相補的な核酸配列、
（ｂ）１つ以上のさらなる一塩基多型のそれぞれに対して相補的に対になるために配置される１つ以上の普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基、ここで、上記プローブは、第１の一塩基多型を識別するために使用される。
【００５１】
広範囲に、本方法は、Ｍｔ−Ｑ−［Ａ−Ｂ］ｎ−Ｋ−Ｆｌプローブまたは結合体としてほぼ一般的に記述されるオリゴヌクレオチドプローブ（またはオリゴヌクレオチド結合体、以下「プローブ／結合体」、「プローブ」または「結合体」と称する）を提供する。上に記載されるように、このプローブの線形の記載は、マイナーグルーブバインダーおよびクエンチャーまたは消光剤がオリゴヌクレオチド部分の３’末端または５’末端のいずれかに結合し、フルオロフォアがオリゴヌクレオチド部分の他の末端に結合することを意味する。これらの共有結合した部分のいずれかについて、接続は、直接または連結基を介してのいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、連結基（式Ｉ中のＷおよびＫ）は、インタラクティブ部分（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー）または反応性部分（例えば、標的配列に対するプローブハイブリダイゼーションによって形成されるマイナーグルーブ中で非共有結合的に結合することを意味するマイナーグルーブバインダー）の間を十分に空けることが好ましい。
【００５２】
それゆえに、実施形態の１つのグループでは、プローブまたは結合体は下式を有する：
【００５３】
【化１３】
【００５４】
〔式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり、Ｑは約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｗは連結基であり、Ｋは結合基または連結基であり、Ｆｌは約４００〜８００ｎｍの発光を有するフルオロフォアであり、［Ａ−Ｂ］は核酸オリゴマー中のモノマー単位（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらのいずれかの組み合わせ、改変塩基および糖を有するものを含む）をあらわし、ここで、Ａは糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；Ｂは以下に詳細に記載されるような核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す。］少なくとも１つのＢは、プローブによってマスクされる（または目につかなくされる）ことが意図される一塩基多型の部位で置換された普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基で交換される。さらに特定的には、プローブのオリゴヌクレオチド部分は、目的の標的上の非ＳＮＰ部位に対して相補的な天然塩基または改変塩基の組み合わせを有するように設計される、複数のＳＮＰを含む標的のＳＮＰ部位で少なくとも１つの普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基は、遺伝子型特定のために「マスクされない」標的の１つのＳＮＰに残る。添字ｔは０〜１の整数であり、添字ｎは５〜５０の整数である。
【００５５】
さらに特定的には、Ｋが連結基である場合、一般的にＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉから選択される１〜３０個の主鎖原子（いずれかのペンダント原子または基を含まないが、全ての環原子を含む、連続した線に結合するオリゴヌクレオチド部分とＦｌ成分との間の原子のみを数える）を有する。連結基Ｗは、一般的に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉから選択される、約１００個までの主鎖原子を有する三価のリンカーをあらわす。さらに、Ｗは、分枝の脂肪族鎖、ヘテロアルキル鎖、１つ以上の置換された環構造またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｗは、三価部分、例えば、ペンダントの官能基化連結基を有するかまたは有さないアミノ基をあらわし、Ｑ−Ｗは、例えば、商業的な供給源（以下のクエンチャーの表３を参照）由来のクエンチャーを表す。それゆえに、Ｗが連結基として提供される場合、いくつかの実施形態では、これは、Ｑの一部分とみなされ得るアミノ基である。連結基のそれぞれおよび他の成分は、以下にさらに詳細に議論される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドプローブは下式を有する：
【００５７】
【化１４】
【００５８】
〔式中、Ｍ、Ｗ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｆｌ、ｔおよびｎは上に提供される意味を有し、Ａｒ１およびＡｒ２は置換された芳香族環、典型的には置換されたベンゼン環である〕概して、Ａｒ１は、置換されていないかまたは電子供与基である基（例えば、水素と比較して電気的に陽性を有する基、例えば、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノなど）で置換される。同様に、Ａｒ２は、好ましくは、置換されていないか、１個、２個または３個の電子吸引基（例えば、ニトロ、シアノ、ハロゲン、アシルなど）で置換されている。いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、式−Ｕ＝Ｕ−Ａｒ３を有する基で置換され、ここで、Ａｒ３は、アリールまたはヘテロアリール部分であり、好ましくは、０〜３個の電子吸引基を置換基として有するベンゼン環であり、各ＵはＮまたはＣＨである。後者のグループの実施形態では、Ａｒ３が電子吸引基で置換されている場合、Ａｒ１およびＡｒ２のそれぞれは、独立して、置換されていないかまたは電子供与基で置換されている。
【００５９】
式ＩＩの他の好ましい実施形態では、記号Ａｒ１は、１個以上の電子供与基（例えば、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノなど）で置換されたアリール基（好ましくはベンゼン環）を表し、Ａｒ２は、１個以上の電子吸引基、例えば、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホニル、ハロゲンなどで置換されたアリール基（例えばベンゼン環）を表す。
【００６０】
なお他の好ましい実施形態では、Ａｒ２は、式−Ｕ＝Ｕ−Ａｒ３を有する基で置換され、ここで、各Ｕは、独立して、ＣＨ、Ｃ（Ｒ）およびＮから選択され、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基であり、Ａｒ３は、置換または非置換アリール基である。Ａｒ１、Ａｒ２およびＡｒ３のそれぞれについての好ましいアリール基はフェニル基である。この基の好ましい実施形態の中で、Ａｒ１およびＡｒ２は、好ましくは、置換されていないかまたは好ましくは電子供与基（水素原子に対して）で置換されたフェニレンであり、一方、Ａｒ３は、フェニル、好ましくは、置換されていないかまたは電子吸引基（水素原子に対して）で置換されたフェニルである。
【００６１】
なおさらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、下式を有するオリゴヌクレオチドプローブ／結合体を使用する：
【００６２】
【化１５】
【００６３】
〔式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、ここで、記号Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ＯＲｇ、Ｎ（Ｒｇ）２、Ｎ＋（Ｒｇ）３、ＳＲｇ、ＣＯＲｇ、ＣＯ２Ｒｇ、ＣＯＮ（Ｒｇ）２、（ＣＨ２）ｍＳＯ３−、（ＣＨ２）ｍＣＯ２−、（ＣＨ２）ｍＯＰＯ３−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣＯ２−およびそれらのエステルおよび塩から選択される置換基をあらわし、各Ｒｇは独立して、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、添字ｍは０〜６の整数である。記号Ｒｈは、Ｈまたは環状、非環状またはそれらの組み合わせのいずれかであり、利用可能な価数を満たすようにさらなる水素原子を有する、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３０個の原子を有する基（典型的には、固相合成において使用される連結基の痕跡部分）を表す］。
【００６４】
なおさらに好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は下式を有する：
【００６５】
【化１６】
【００６６】
（式中、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、記号Ｒ０、Ｒ１およびＲ２はＨであるかまたは電子吸引基（電子を吸引するとは、水素原子よりも電気陰性度が高い基を指し、例えば、ニトロ、シアノ、アセチルなどである）であり、記号Ｒ３およびＲ４はＨを表すかまたは電子供与基（電子を供与するとは、水素原子よりも電気的に陽性な基を指し、例えば、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノなどである）である。）特に好ましい実施形態では、Ｗは−（ＣＨ２）３Ｎ（−）−（ＣＨ２）３−であり；Ｒ０＝ＮＯ２であり；Ｒ１＝Ｃｌであり；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり；およびＫは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンリンカーである。１つの実施形態では、ＭおよびＦｌはそれぞれ独立して、プローブの５’−末端または３’−末端のいずれかに結合することができる。
【００６７】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれについての特定の実施形態では、リンカーＫは、プローブ／結合体について特定の蛍光向上を提供するために選択され、プローブのオリゴヌクレオチド部分の長さに依存する。従って、１８以上のヌクレオチドを有するプローブ（改変ヌクレオチドまたはアナログを含む）について、Ｋは、結合または約２０原子長までの連結基であることができる。さらに特定的には、Ｋは、ポリアルキレングリコールリンカーまたはリボースまたはデオキシリボースリンカーである（以下にさらに詳細に議論される）。特に好ましい実施形態では、Ｋは、ポリアルキレングリコールリンカー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリブチレングリコールリンカーである。最も好ましいのは、商業的な供給源から得ることができるポリエチレングリコールおよび官能化ポリエチレングリコールリンカーである。
【００６８】
他の好ましいプローブまたは結合体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれにおけるものであり、ここで、ＯＤＮ部分は、３つ以上の保存的グアニン塩基を有するように選択され、このグアニン塩基の少なくとも１つが、改変塩基、好ましくはＰＰＧと交換される。他の実施形態では、ＯＤＮ部分は、ＲＮＡ、キメラ、ＰＮＡまたはロックト核酸である。
【００６９】
なお他の好ましいプローブまたは結合体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれにおけるものであり、ここで、ＯＤＮ部分は、目的の多型および２０塩基以内の少なくとも１つのさらなる多型を有する標的配列に対して相補的であるように選択され、ここで、さらなる多型に関与するさらなる塩基は、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基で置換される。なおさらに好ましくは、ＯＤＮ部分は、ＲＮＡ、キメラ、ＰＮＡまたはロックト核酸である。
【００７０】
なお他の好ましいプローブまたは結合体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれにおけるものであり、ここで、ＯＤＮ部分は、３０％以上のＡおよびＴ塩基を有する標的配列に対して相補的であるように選択され、ここで、ＯＤＮは、少なくとも約３℃の二本鎖（プローブ／標的ハイブリッド）の安定性を増加させるのに十分な少なくとも１つの改変塩基および目的の多型および２０塩基以内の少なくとも１つのさらなる多型を含有し、ここで、さらなる多型に関与するさらなる塩基は、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基で置換される。より好ましくは、ＯＤＮ部分は、５０％以上のＡおよびＴ塩基を有する標的配列に対して相補的であるように選択され、ここで、ＯＤＮは、少なくとも約５℃の二本鎖（プローブ／標的ハイブリッド）の安定性を増加させるのに十分な少なくとも１つの改変塩基を含む。なおさらに好ましくは、ＯＤＮ部分は、ＲＮＡ、キメラ、ＰＮＡまたはロックト核酸である。
【００７１】
本発明のプローブおよび結合体は、一般的には、当業者に既知の固相法を用いて調製される。アセンブリは、例えば、ＯＤＮモノマー、フルオロフォア、クエンチャーおよびマイナーグルーブバインダーをカップリングするための適切なホスホラミダイト試薬を用いて、５’→３’方向または３’→５’方向のいずれかで行うことができる。アセンブリのための他の方法としては、例えば、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合などを調製するための周知の官能基縮合が挙げられる。概して、出発物質は市販であるかまたは例えば、Ｍａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ−Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９２）に記載されるような適切な官能基操作を用いて市販の出発物質から直接的な様式で調製することができる。
【００７２】
本発明のプローブ／結合体についてのさらなる一般的な条件に戻り、以下の議論は、本発明において使用可能なオリゴヌクレオチド、普遍的な塩基、入り交ざった（無差別な）塩基、改変塩基、消光剤またはクエンチャー、マイナーグルーブバインダー、フルオロフォアおよび連結基の種類を説明する。
【００７３】
（オリゴヌクレオチドおよび改変オリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸との用語は、改変または非天然に生じるヌクレオチドを含むポリマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡ（またはその両方）の一本鎖または二本鎖ポリマーを指すためにまたは限定されないが、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）；ｂｉｃｙｃｌｏ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ（Ｂｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：４６６０−４６６７（１９９６））によって開示されるペプチド核酸および関連する構造を含むＤＮＡまたはＲＮＡに対して安定な塩基対を形成可能な任意の他の種類のポリマーを指すために相互変換可能に使用される。本発明の結合体について、場合により、マイナーグルーブバインダー部分および／または消光剤は、オリゴマーの５’または３’末端に結合し、フルオロフォアまたは蛍光ラベルは、このオリゴマーの非置換末端または内部部分に結合する。
【００７４】
本発明において好ましいのは、一本鎖であり、５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは３０ヌクレオチド以下、最も好ましくは２０ヌクレオチド以下（最も低い制限は約５ヌクレオチド）の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００７５】
重要なことに、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、マスクされるかまたは「目につかなく」される普遍的または入り交ざった塩基をＳＮＰ部位に含有し、プローブは、プローブによってマスクされない第１の多型の存在を同定することができる。
【００７６】
（普遍的塩基および変性塩基）
場合によりマイナーグルーブバインダーを有するフルオロフォア／クエンチャー対を含むオリゴヌクレオチド結合体は、少なくとも１つの普遍的な塩基を含有し、天然に生じる塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルに加えて、１つ以上の改変塩基を含んでもよい。
【００７７】
本発明において使用するための最も好ましい普遍的な塩基としては、ポリマー骨格上の２位に共有結合した非置換および置換ピラゾロピリミジン、より特定的には、グアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（４０）、アデニンアナログ４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３８）および２Ｈ−イソキノリン−１−オン（２５）、６−メチル−２−イソキノリン−１−オン（４１）および８−メチル−２−イソキノリン−１−オン（４２）が挙げられる。塩基アナログは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ミスマッチ識別および特定の遺伝子型特定を改良する。天然に存在する塩基、改変塩基および塩基アナログの全ての互変異性体形態は、本発明のオリゴヌクレオチド結合体中に含まれてもよい。本発明において有用な他の普遍的な塩基としては、表１に列挙される化合物が挙げられる。
【００７８】
（表１）
【００７９】
【表１−１】
【００８０】
【表１−２】
【００８１】
【表１−３】
【００８２】
（入り交ざった（無差別な）塩基）
本発明において使用するための最も好ましい入り交ざった（無差別な）塩基としては、ポリマー骨格上の１位に共有結合した非置換および置換ピラゾロピリミジン、より特定的には、グアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（４９）、置換６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンアナログ、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（５０）および置換１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミンアナログが挙げられる。本発明において有用な他の入り交ざった（無差別な）塩基としては、表２に列挙される化合物が挙げられる。
【００８３】
（表２）
【００８４】
【表２】
【００８５】
別の実施形態では、上記構造に基づく普遍的および入り交ざった（無差別な）塩基が考察される。１つ以上の置換基は、環構造のそれぞれの中に導入されてもよく、置換基としては、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２が挙げられ得、さらに、脂肪族部分（例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル部分）が、１つまたは２つのヒドロキシ、アミノまたはハロゲン原子でさらに置換された置換基が挙げられる。普遍的な塩基は、当該技術分野で既知の方法によって合成することができる（Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７−２４４７（２００１）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２：７６２１−７６３２（２０００）およびＳｅｅｌａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：３２２４−３２３２（２００１）。入り交ざった（無差別な）塩基は、既知の方法によって合成することができる（国際公開番号０１／６４９５８；国際公開番号０３／０２２８５９；および欧州特許第０６２４１６１号を参照）。
【００８６】
好ましい実施形態の１つのグループでは、ピラゾロピリミジンの入り交ざった（無差別な）塩基は、下式を有する
【００８７】
【化１７】
【００８８】
〔式中、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙおよびＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ、アミノまたはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す〕
実施形態の別のグループでは、４９および５０の塩基性環構造の炭素原子の１つ以上がＮによって置換されている。これらの化合物の合成は、当該技術分野において開示されている（例えば、Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．，６：３６９−３７８（２０００）；およびＨｕｔｚｅｎｌａｕｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５：８７９−８８３（１９７２）を参照）。
【００８９】
（改変塩基）
改変塩基は、１つ以上の官能基の付加または欠失、へテロ環構造中の違い（すなわち、特に、炭素をヘテロ原子で置換）および／または１つ以上のリンカーアーム構造の塩基への結合によって天然に生じる塩基とは異なるものであると考えられる。好ましい改変ヌクレオチドは、ピリミジン構造またはプリン構造に基づくものであり、後者でさらに好ましいのは、７−デアザプリンおよびそれらの誘導体およびピラゾロピリミジンである（ＰＣＴ国際公開番号９０／１４３５３および米国特許第６，１２７，１２１号に記載（これらの両方は、本願明細書中に参考として援用される））。
【００９０】
種々の改変塩基は、本発明において正常塩基と交換するために使用することができる。改変塩基の利点は他の部分に記載されている。重要なことに、改変塩基は、ＳＮＰ部位ではない位置で使用することができる。しかし、改変塩基の完全なリストは、普遍的または入り交ざった塩基としても特徴付けられるいくつかの塩基を含む。従って、本発明は、プローブが普遍的な塩基または入り交ざった塩基をＳＮＰ部位に有し、マスクされるか目につかなくされるが、プローブ中の他の部位に改変塩基を任意に有してもよいことを提供する。本発明において使用するための最も好ましい改変塩基としては、グアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＧまたはＰＰＧ、またＳｕｐｅｒ Ｇ）、アデニンアナログ４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ｐｐＡまたはＰＰＡ）および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ジピリミジン−５，７−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡ）が挙げられる。キサンチンアナログ１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（ｐｐＸ）も使用することができる。これらの塩基アナログは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ハイブリダイゼーションを強め、ミスマッチ識別を向上する。天然に存在する塩基、改変塩基および塩基アナログのすべての互変異性体は、本発明のオリゴヌクレオチド結合体に含まれ得る。本発明において有用な他の改変塩基としては、６−アミノ−３−プロパ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＨＯＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−アミノプロパ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＮＨ２ＰＰＰＧ；４−アミノ−３−（プロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＨＯＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−アミノプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＮＨ２ＰＰＰＡ；３−プロパ−１−イニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミノ、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡ；２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡＯＨ；３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡＮＨ２；５−プロパ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＰＵ；５−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＨＯＰＵ；６−アミノ−５−プロパ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＰＣ；６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＨＯＰＣ；および６−アミノ−５−（３−アミノプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＮＨ２ＰＣ；５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、ＣＨ３ＯＰＰＰＡ；６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロパ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＣＨ３ＯＰＰＰＧ；４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブタ−３−イル−１−オール、Ｓｕｐｅｒ Ａ；６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブタ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；５−（４−ヒドロキシ−ブタ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＢｒ）；３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＣｌ）；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＢｒ）；および３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＣｌ）が挙げられる。
【００９１】
上述の改変塩基に加えて、オリゴヌクレオチドは、糖またはグリコシド部分の骨格、好ましくは、２−デオキシリボフラノシドを有することができ、全てのヌクレオチド間結合は天然に生じるホスホジエステル結合である。しかし、代替の実施形態では、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース基は、他の糖、例えば、β−Ｄ−リボフラノースで交換される。それに加えて、β−Ｄ−リボフラノースが存在してもよく、ここで、リボース部分の２−ＯＨは、Ｃ１〜６アルキル基でアルキル化される（２−（Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）リボース）かまたはＣ２〜６アルケニル基でアルケニル化される（２−（Ｏ−Ｃ２〜６アルケニル）リボース）か、フルオロ基によって交換される（２−フルオロリボース）。本発明において有用なオリゴマー形成糖は、「ロックされて」おり、すなわち、Ｃ−４’とＣ−２’の酸素原子との間にメチレン架橋を含む。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと適合性の他の糖部分もさらに使用可能であり、当業者に既知であり、限定されないが、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２’−デオキシリボフラノシドまたは２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドが挙げられる。α−Ｄ−アラビノフラノシドと含むオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１７７，１９６号に記載され、この内容は本願明細書中に参考として援用される。２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６６１−２６６８（１９９５）に記載される。ロックト核酸のための合成手順（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｒｎ．，４５５−４５６（１９９８）；Ｗｅｎｇｅｌ Ｊ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２：３０１−３１０（１９９８））および２’−ハロゲン−２’−デオキシリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドのための合成手順（Ｐａｌｉｓｓａ ｅｔ ａｌ，Ｚ．Ｃｈｅｍ．２７：２１６（１９８７））もまた記載されている。本願明細書中に記載される改変オリゴヌクレオチドのホスフェート骨格はさらに、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合および／またはメチルホスホネートおよび／またはホスホロアミデートを含むように改変するもできる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６６２−２６６８（１９９５））。オリゴヌクレオチドの組み合わせはさらに、本発明の範囲内である。なお他の骨格改変は、当業者に既知である。
【００９２】
実施形態の１つのグループでは、ピラゾロピリミジンは、ポリマー骨格に対して通常３−位の代わりに２−位から置換される（化合物３８〜４０）。
【００９３】
実施形態の別のグループでは、本願明細書中に記載される改変塩基は、Ｔｍを調整するためにＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡに組み込まれ、改良されたミスマッチ識別を有する改変オリゴヌクレオチドを提供する。ＤＮＡおよびＤＮＡアナログの種々の改変形態は、プローブおよびプライマーとしてＤＮＡ分子の使用の欠点のうちいくつかを克服する企てにおいて使用されている。これらの中で、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ポリアミド核酸としても知られる）がある。Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）。ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡに特徴的な糖−リン酸骨格の変わりにポリアミド骨格によって結合する、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に見出されるようなヘテロ環塩基単位を含む。ＰＮＡは、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列に対してハイブリダイゼーション可能であり、実際に、対応する核酸プローブよりも強力にハイブリダイズする。ＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡオリゴマーの合成において使用される反応性モノマーの合成は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；同第５，７７３，５７１号；同第５，７３６，３３６号および同第５，７６６，８５５号に記載されており、これらそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される。ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ合成およびＰＮＡ合成のためのモノマーに対する代替的なアプローチがまとめられている。Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）。従って、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラのＴｍを調整するための、正常な塩基、非置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えば、ＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、改変プリン、改変ピリミジン、５−置換ピリミジン、普遍的および入り交ざった（無差別な）塩基、糖改変物、骨格改変物またはマイナーグルーブバインダーのいずれかの組み合わせの使用は、本発明の範囲内である。核酸、ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成に必要とされる改変塩基モノマー単位を合成するために必要な合成方法は当該技術分野で入手可能であり、本願明細書およびＵｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）を参照。
【００９４】
本願明細書中に記載される用途についておよび上述のように、オリゴヌクレオチドおよび改変オリゴヌクレオチドは、好ましくは５〜１００塩基、より典型的には５〜５０塩基または５〜３０塩基、通常は５〜２０塩基を有する。いくつかの実施形態では、プローブ／結合体のオリゴヌクレオチド部分は、５〜１５塩基を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド部分は、１つ以上の普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基に加えて、１つ以上の改変塩基を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰを「マスクする」ために設計された部位に少なくとも１つの普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基を含む、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０塩基または改変塩基を有する。
【００９５】
それらの熱力学的性質に基づき、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基、改変塩基、マイナーグルーブバインダー、フルオロフォアおよび／またはクエンチャーの使用または組み込みを直接用い得るアルゴリズムを用いて予測可能な様式でプローブおよびプライマーを設計する能力は、同時継続出願番号第１０／０３２，３０７号（２００１年１２月２１日出願、本願明細書中に参考として援用される）に記載されている。従って、核酸、ＰＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラとのハイブリッド産物のＴｍ（例えば、約５〜８℃）を調整するための、正常な塩基、非置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えば、ＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、改変プリン、改変ピリミジン、５−置換ピリミジン、普遍的および入り交ざった（無差別な）塩基、糖改変物、骨格改変物またはマイナーグルーブバインダーのいずれかの組み合わせの使用は、本発明によって考察される。さらに、入り交ざった塩基または普遍的な塩基のプライマー中での使用は、可変配列（例えば、ＨＩＶ変異、密接して関連する種、など）を用いた普遍的な増幅のために本願明細書中で記載される方法のそれぞれの適用を容易にする。さらに、核酸標的を検出するための直接的またはリガンド（例えばビオチン）を介して間接的に標識されたプライマーの使用は、当該技術分野で周知である。さらに、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、プローブの非存在下であっても、突然変異を検出するのに有用である（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２８：３７５２−３７６１（２０００）を参照）。
【００９６】
（新規な普遍的な塩基）
多くの新規な普遍的な塩基は、当該技術分野で既知の合成方法を用いて、反応スキーム１に概説されるように調製することができる。反応スキーム１において、Ｔｏｌはｐ−トリル基であり、ＤＭＴはジメトキシトリチル基であり、ＣＥＰはシアノエチル−ジイシプロピルホスホラミダイト基であり、Ｒは−（ＣＨ２）ｎＸであり、ここで、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＮであり、ｎは１〜６の整数である。
【００９７】
（反応スキーム１）
【００９８】
【化１８】
【００９９】
イソキノリン−１（２Ｈ）−オンに基づく普遍的な塩基を合成するためのスキームは、反応スキーム２および３に示される。５’−ホスホラミダイトアナログは、既知の普遍的な塩基２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−６−メチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（４１）から出発して、最初にジメチルテキシルシリルクロリドと反応させ、次いでジメトキシトリチルクロリドと反応させることによって合成され、３’−ジメトキシトリチル誘導体（５５）が得られた（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２：７６２１−７６３２（２０００））。ＣＨ２Ｃｌ２中での５５と２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（ＣＥＩＰＤＡ）との反応により、反応スキーム２に示されるように、所望のブロックされた５’−ホスホラミダイト（５６）を得た。
【０１００】
（反応スキーム２）
【０１０１】
【化１９】
【０１０２】
新規な普遍的な塩基ホスホラミダイト（６５）（４８のアナログ）の合成は、反応スキーム３に示される。
【０１０３】
（反応スキーム３）
【０１０４】
【化２０】
【０１０５】
２，４−ジメチルベンズアルデヒド（５７）を、２，２−ジメトキシエチルアミンと反応させ、イミン（５８）を得て、その後、酸処理によって６，８−ジメチルイソキノリン（５９）を得た。ｍ−クロロペルオキシ安息香酸を用いた酸化によりＮ−オキシド（６０）を得て、これを次いで無水酢酸およびＮａＯＨ水溶液と反応させ、６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６１）を得た。クロロ−糖（６２）を用いた（６１）のグリコシル化、次いで脱保護により、ヌクレオシド（６３）を得た。次に、３’−ジメトキシトリチル保護されたヌクレオシド（６４）を（６３）から調製し、標準的な手順によって５’−ホスホラミダイト（６５）に変換した。
【０１０６】
当該技術分野で既知の方法を用いる別の実施形態では、ヌクレオシドアナログ（６３）が３’−ホスホラミダイトアナログに変換可能である。
【０１０７】
（マイナーグルーブバインダー）
マイナーグルーブバインダーオリゴヌクレオチド結合体（または「プローブ」）は、米国特許第６，３１２，８９４に記載される（本願明細書中に参考として援用される）。これらの結合体は、相補ＤＮＡと超安定化された二本鎖を形成する。特に、短いマイナーグルーブバインダープローブの配列特異性は、高温適用（例えばＰＣＲ）に優れている。非常に驚くべきことに、マイナーグルーブに結合するクエンチャー化合物を５’−末端に含有し、フルオロフォアを３’−末端に含むプローブは、蛍光２’−デオキシヌクレオチドを用いるアッセイ法のために特に有用である（米国特許出願番号１０／１６５，４１０、本願明細書中に参考として援用される）。これらのプローブは、相補的な標的に対してハイブリダイゼーションする際に蛍光を発する。５’−ＭＧＢ−クエンチャーグループは、同種増幅の間にＴａｑポリメラーゼによる５’−ヌクレアーゼ消化を妨害することがわかっている。さらに、本願明細書中で記載される５’−ＭＧＢ−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォア（５’−ＭＧＢ−Ｗ−ＯＤＮ−Ｆｌ）プローブは、７桁の等級を有するダイナミックレンジを示し、リアルタイムＰＣＲ増幅反応においてサンプルあたり５複製よりも多い最終的な感度を有する。
【０１０８】
本発明のプローブ／結合体はさらに、任意に、共有結合したマイナーグルーブバインダーを有する。種々の適切なマイナーグルーブバインダーは、文献中に記載されている。例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．米国特許第５，８０１，１５５号（本願明細書中に参考として援用される）；Ｗｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄＤｅｒｖａｎ Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：３５５−３６１（１９９７）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｏｐｋａ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄＧｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４４：３２３−３３４（１９９７）；Ｚｉｍｍｅｒ，Ｃ＆Ｗａｈｎｅｒｔ，Ｕ．Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．４７：３１−１１２（１９８６）およびＲｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．Ｐ．，Ｄｏｎｄｈｉ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄＬｏｗｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，８４：１−１１１（１９９９）を参照。
【０１０９】
本発明のマイナーグルーブバインダー−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォアの結合体は、線状の配置であり得る（式５’−Ｍ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌ−３’によって示唆されるような）かまたはクエンチャー（Ｑ）およびマイナーグルーブバインダー（Ｍ）が連結基に結合してＯＤＮ、ＱおよびＭが接続する分枝状の配置であり得る。さらに、クエンチャーは、マイナーグルーブバインダーの遠位（ＯＤＮに対する結合に対して）末端に結合し得る（例えば、５’−Ｑ−Ｍ−ＯＤＮ−Ｆ１）。線状の省略形（Ｍ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆ１）が使用される場合、それぞれの配置が含まれる。さらに、ＭＧＢおよびＱ部分はそれぞれ、結合が結合体の消光機構と干渉しない限り、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかまたはオリゴヌクレオチドの内部位置に結合することができる。一般的に、このことは、適切な連結基の使用を介して達成することができる（米国特許出願番号１０／１６５，４１０（本願明細書中で参考として援用される））。
【０１１０】
リンカーを介してオリゴヌクレオチドにマイナーグルーブバインダー（および以下に記載されるようなリポーターグループ、例えばフルオロフォアおよびクエンチャー）を接続するための適切な方法は、例えば、米国特許出願第５，５１２，６７７号；同第５，４１９，９６６号；同第５，６９６，２５１号；同第５，５８５，４８１号；同第５，９４２，６１０号および同第５，７３６，６２６号（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１１１】
マイナーグルーブバインダーは、一般的に、適切な連結基を介してオリゴヌクレオチドの３’位または５’位に結合する。５’末端での結合は、ハイブリッド安定性に利点をもたらす（オリゴヌクレオチド二本鎖の融解が末端で開始する）だけではなく、増幅反応中のプローブのヌクレアーゼ消化を減らすおよび／または防ぐ。
【０１１２】
マイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体内のマイナーグルーブバインダーの位置はさらに、このような結合体の識別性能に影響を与え得る。二本鎖の対になっていない領域は、誤って対になっている塩基に隣接した位置でマイナーグルーブの形状を変化させる。完全にマッチしたＤＮＡ二本鎖のマイナーグルーブ内でマイナーグルーブバインダーは最適に適合するため、マイナーグルーブにおける変化を生じるミスマッチは、ミスマッチを含む領域に対するマイナーグルーブバインダーの結合強度を減らす。このようにして、マイナーグルーブバインダーがこのようなハイブリッドを安定化する能力が減少し、それにより、マイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体が完全にマッチした二本鎖からミスマッチを識別する能力を増大させる。一方、ミスマッチがマイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体に対して相補的な領域の外側にある場合、同じ長さの接合していないオリゴヌクレオチドとマイナーグルーブバインダーと接合したオリゴヌクレオチドについての識別能力はほぼ同じであると予想される。オリゴヌクレオチドプローブが一塩基対のミスマッチを識別する能力はその長さに依存するため、より短いオリゴヌクレオチドは、ミスマッチをより効果的に識別する。この内容におけるマイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体の使用の主な利点は、マイナーグルーブバインダー接合の安定化効果が増したことにより、従来技術において使用されるものと比較してかなり短いオリゴヌクレオチド（すなわち、２０マー以下、より大きな識別力を有する）を使用することができるという事実にある。
【０１１３】
実施形態の１つのグループでは、マイナーグルーブバインダーは、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュロカルマイシン、ペンタアミダイン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンおよび類似体からなる群より選択される。
【０１１４】
さらに好ましいマイナーグルーブバインダーは、下式から選択されるものである：
【０１１５】
【化２１】
【０１１６】
添字ｍは２〜５の整数であり；添字ｒは２〜１０の整数であり；かつＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して、オリゴヌクレオチドに対する連結基（直接的またはクエンチャーを介して間接的のいずれか）、Ｈ、−ＯＲｃ、−ＮＲｃＲｄ、−ＣＯＯＲｃまたは−ＣＯＮＲｃＲｄであり、ここで、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、Ｈ、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルおよびアリールから選択され、但し、ＲａおよびＲｂのうち１つは、ＯＤＮまたはＱに対する連結基を表す。さらなる実施形態では、それぞれの構造における環のそれぞれは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ＯＲｇ、Ｎ（Ｒｇ）２、Ｎ＋（Ｒｇ）３、ＳＲｇ、ＣＯＲｇ、ＣＯ２Ｒｇ、ＣＯＮ（Ｒｇ）２、（ＣＨ２）ｍＳＯ３−、（ＣＨ２）ｍＣＯ２−、（ＣＨ２）ｍＯＰＯ３−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣＯ２−およびそれらの塩それらのエステルから選択される１つ以上のさらなる置換基を含むことができ、ここで、Ｒｇはそれぞれ独立してＨまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、添字ｍは０〜６の整数である。記号ＲｈはＨであるかまたはＣ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３０個の原子を有し、環状、非環状またはそれらの組み合わせのいずれかであり、利用可能な価数を満たすさらなる水素原子を有する基（典型的には、固相合成で使用される連結基の痕跡部分）を表す。
【０１１７】
特に好ましいマイナーグルーブバインダーとしては、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのトリマー（ＣＤＰＩ３）または置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）、Ｎ−メチルピロール−４−カルボキシ−２−アミドのペンタマー（ＭＦＣ５）およびミスマッチ識別を増加させる他のマイナーグルーブバインダーが挙げられる。本発明の実施における用途が見出されるさらなるマイナーグルーブバインダー部分は、共同で所有する米国特許第５，８０１，１５５号（本願明細書中に参考として援用される）に開示される。特定の実施形態では、マイナーグルーブバインダーは、結合した高水溶性基（例えば、糖、アミノ酸、カルボン酸またはスルホン酸置換基など）を有することができる。米国特許出願番号第０９／６９３，２１３号および同第１０／３０２，６０７号（これら両方は、本願明細書中に参考として援用される）を参照。
【０１１８】
（クエンチャー）
最近開発された検出方法は、蛍光の直接的な検出よりもプローブハイブリダイゼーションを検出するための蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のプロセスを使用する。この種のアッセイにおいて、ＦＲＥＴは、クエンチャー分子の吸収スペクトルがドナーフルオロフォアの発光スペクトルとオーバーラップし、２つの分子が近位に密接している場合に、ドナーフルオロフォア（リポーター）とアクセプター分子（クエンチャー）との間で起こる。ドナーフルオロフォアの励起状態のエネルギーは、共鳴双極子−誘発された双極子の相互作用によって近くのアクセプターに移動し、ドナー蛍光の消光が起こる。アクセプター分子がフルオロフォアである場合、その蛍光はしばしば増大することがある。ドナー分子とアクセプター分子との間のエネルギー転移の効率は、分子間距離に非常に依存する。この関係を記載する式が知られている。Ｆｏｒｓｔｅｒ距離（Ｒ０）は、エネルギー転移が５０％効率であるドナー分子とアクセプター分子との間の距離として記載される。蛍光の消光の他の機構（例えば、衝突および電荷移動による消光）も知られている。クエンチャーとフルオロフォアの対およびオリゴヌクレオチドに対するそれらの結合を選択するために、当該技術分野で広範囲なガイダンスが存在する（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２、さらに、Ｗｅｂ Ｅｄｉｔｉｏｎ ａｔ ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ；米国特許出願第３，９９６，３４５号および同第４，３５１，７６０号（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）。好ましいクエンチャーは、共同で所有する米国特許出願第０９／４５７，６１６号（１９９９年１２月８日出願、本願明細書中に参考として援用される）に記載される。さらに特定的には、以下の表３は、既知の引用される化学反応に基づいて、プローブに組み込まれるための適切な官能基を有する構造に容易に改変可能なクエンチャーの構造（例えば、ＯＤＮおよびマイナーグルーブバインダー部分のための結合部位を有するＱ−Ｗ）を含む。（例えば、Ｔｈｉｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．ｆａｒ ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍｉｅ，３２８：４９７−５１４（１９８６）；米国特許第４，３２４，７２１号および同第４，０５４，５６０号；Ｔｉｍｍ，Ｍｅｌｌｉａｎｄ Ｔｅｘｔｉｌｂｅｒｉｃｈｔｅ，９：１０９０−１０９６（１９６９）；Ｈａｌｌａｓ，Ｊ．Ｓ．Ｄ．Ｃ．２８５−２９４（１９７９）；Ｂｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍ．，２４：１００−１０４（１９６４）；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．３：１７１９−１７２７（１９９７）およびＭｏｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ．，１０２：５８０２−５８０８（１９９８）；Ｈａａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｍｉｎｉｐｒｉｎｔ １０：２７０１−２７３５（１９９８）およびＲｕｇｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２６：８１４−８２６（１９４３）を参照。さらに、共同で所有する係属出願ＵＳ２００３／００９６２５４およびＵＳ２００２／０１５５４８４（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）も参照。種々の位置に異なる組み合わせの置換基を有するさらなる構造（例えば、モノ染料およびビスアゾ色素）は、色素化学の分野で既知の化合物および方法に基づいて調製することができる（ＣＤＤ−ＲＯＭのＣｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ、Ｉｓｓｕｅ ３、ページ４００９−４３２４；Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｙｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ｗｗｗ．ｓｄｃ．ｏｒｇ．ｕｋにまとめられている；さらに、国際公開番号０１／８６００１も参照）。
【０１１９】
（表３）
【０１２０】
【表３−１】
【０１２１】
【表３−２】
【０１２２】
上述のクエンチャーは、約４００〜８００ｎｍの範囲をカバーし、多くのものはＭＧＢに対して結合した場合に改良された消光効果を示す。オリゴヌクレオチドに対してクエンチャーをカップリングするのに使用される好ましい連結基として改変された態様が−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２を示す一方、マイナーグルーブバインダーまたは固体支持体、他の適切なリンカーの例は、当該技術分野で既知であるかまたは本願明細書中に提供される。
【０１２３】
本願明細書中の本発明の局面のそれぞれについての好ましいクエンチャーは、表３中のものおよびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．からのものを含むビスアゾクエンチャー（Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓとして提供される：ＢＨ−１、ＢＨ−２およびＢＨ−３）、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡおよびカルボキシテトラメチルローダミンから選択される。
【０１２４】
（フルオロフォア）
本発明において有用なフルオロフォアは、一般的に、オリゴヌクレオチドプローブの末端５’炭素に対して、好ましくは連結基を介して結合するために誘導体化された蛍光有機色素である。適切なフルオロフォアが、蛍光性であってもなくてもよい典型的には有機色素でもあるクエンチャーと組み合わせて選択されることを当業者は理解する。
【０１２５】
特定のプローブのための適切なフルオロフォア−クエンチャー対を選択するために、文献において利用可能な多くの実用的なガイダンスが存在する。例えば、Ｃｌｅｇｇ（上に引用される）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ（上に引用される）；Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）などを参照。これらの文献はさらに、蛍光性分子および色素産生性（消光性）分子のリストおよびフルオロフォア−クエンチャー対を選択するためのそれらの関連する光学的性質を与える参考文献を含み、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ， ２ＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２、さらに、ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋでのＷｅｂ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）など。さらに、通常の反応基を解した共有結合のためにフルオロフォアおよびクエンチャーを誘導体化するための方法も周知である。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（上に引用される）；Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，３５１，７６０号（これらそれぞれは、本願明細書中で参考として援用される）。
【０１２６】
好ましいフルオロフォアは、キサンタン色素に基づくものであり、これらの種々のものは、リンキング基を介する結合またはオリゴヌクレオチドに対する直接結合のいずれかの結合のために有用な置換基を有して市販されている。蛍光性化合物の他の群は、α−またはβ−位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物に含まれるものは、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートである。他の色素としては、３−フェニル−７−イソシアネートクマリン、アクリジン、例えば、９−イソチオシアネートアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが挙げられる。なお他の適切なフルオロフォアとしては、レゾルフィン色素、ローダミン色素、シアニン色素およびＢＯＤＩＰＹ色素が挙げられる。
【０１２７】
これらの色素およびオリゴヌクレオチドに結合するための適切な結合方法論は多くの参考文献に記載されており、例えば、Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（前出）；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，７：２９９−３０３（１９７５）；Ｍｅｎｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１８８，９３４号；Ｍｅｎｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，欧州特許出願第８７３１０２５６．０号；およびＢｅｒｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５。
【０１２８】
より特定的には、本願明細書中で記載されるフルオロフォアは、例えば、化学的方法または酵素的方法を用いてオリゴヌクレオチド部分に結合することができる。例えば、反応性化学基を特定の部位でオリゴヌクレオチドに組み込むための方法は、当業者に周知である。特定の部位に配置される反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、相補的な反応基に結合した標識と組み合わせることができ（例えば、求核性反応基を含むオリゴヌクレオチドは、求電子性反応基に結合した標識と反応することができ）、化学技術によってプローブに対する標識とカップリングすることができる。例示的な標識および標識をオリゴヌクレオチドに結合するための方法は、例えば、米国特許第５，８２４，７９６号；米国特許第５，２１０，０１５号；Ｋｅｓｓｌｅｒ（ｅｄ．），Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２；Ｋｒｉｃｋａ（ｅｄ．）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９２；およびＨｏｗａｒｄ（ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，１９９３に記載される。オリゴヌクレオチドの非特定的な化学的標識は、オリゴヌクレオチドと、例えばヌクレオチド塩基の特定の官能基と反応する化学物質とを組み合わせ、同時にまたは続けてオリゴヌクレオチドと標識とを反応させることによって達成することができる。例えば、Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：１７７４−１７８１を参照。標識をオリゴヌクレオチドへ酵素的に組み込むことは、酵素的改変または標識された前駆体を用いてオリゴヌクレオチドの重合を行うかまたは既存のオリゴヌクレオチドに対して標識を酵素的に付加することによって達成することができる。例えば、米国特許第５，４４９，７６７号（本願明細書中に参考として援用される）を参照。改変する酵素の例としては、限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。既存のオリゴヌクレオチドに対して標識を付加することができる酵素の例としては、限定されないが、キナーゼ、末端トランスフェラーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼなどが挙げられる。
【０１２９】
本発明の局面のそれぞれについて、好ましいフルオロフォアは、シアニン、キサンテン、ＢＯＤＩＰＹアナログ、５−ＦＡＭＴＭ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥＴＭ、ＨＥＸＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｂｏｔｈｅｌｌ ＢｌｕｅＴＭおよびＹａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗＴＭ（ＹＹ）から選択される。これらのフルオロフォアは、一般的に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡおよびＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡのような商業的な供給源から入手可能である。
【０１３０】
（連結基）
種々の連結基および方法は、フルオロフォア、クエンチャーおよびマイナーグルーブバインダーをオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に結合するために当業者に知られている。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）；Ｇｉｕｓｔｉ ｅｔ ａｌ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）、Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ，米国特許第４，７５７，１４１号；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４，７３９，０４４号；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）などを参照。なお他の市販の連結基は、合成中にオリゴヌクレオチドに結合することができ、使用することができる（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能）。フルオロフォアをオリゴヌクレオチド部分に結合するための他の方法論は、ホスホラミダイト部分で誘導体化された色素を用いることによって固相合成の結果物にホスホラミダイト化学を使用することを含む。例えば、国際公開番号ｏ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，２３１，１９１号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．，米国特許第４，９９７，９２８号；Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ，ＰＣＴ出願第国際公開番号０１／４２５０５号；米国特許出願第０９／８７６，８３０号；米国特許出願第１０／０８４，８１８号；および米国特許出願第１０／０２６，３７４号（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）を参照。
【０１３１】
多くの一般的な結合方法が利用可能であるが、他の因子（例えば、オリゴヌクレオチド長、マイナーグルーブバインダー、フルオロフォア−クエンチャー対など）と組み合わせて選択がなされる場合、特定の連結基の選択は、本発明の１つの局面を構築する。例えば、本発明において、マイナーグルーブバインダーの使用は、より少ないヌクレオチド塩基を有するプローブの調製を可能にする。概して、約１５塩基よりも少ない塩基を有するプローブは、シグナルが貧弱および／または標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションが貧弱であるため、不安定であると考えられる。さらに、より小さなプローブ（例えば、１５以下の塩基を有するもの）は、クエンチャー／フルオロフォアがしばしば十分に分割できずハイブリダイゼーションの際に適切なシグナルを提供することができないため、ビーコンアッセイでは避けられている。
【０１３２】
本発明において、結合したマイナーグルーブバインダーを有するさらに短いプローブが有用であることが発見され、フルオロフォアとクエンチャーとの間の十分な距離は、適切な連結基を選択することによって得られることが発見された。従って、本発明は、安価でリアルタイムアッセイにおいて有用な新規プローブ／結合体を提供する。
【０１３３】
本発明のプローブおよび結合体は、一般的に、１種類または２種類の連結基を有する。式Ｉに提供されるように、文字Ｋは二価の連結基をあらわし、一方、文字Ｗは三価の連結基をあらわす。特定の連結基は、一般的に、それらの合成容易性、固相合成における装置、プローブ構築および使用の際の安定性およびプローブまたは結合体にそれぞれ付与される物理的パラメーター、例えば、フルオロフォアとクエンチャーとの間に十分な距離を提供すること；またはプローブハイブリダイゼーションの際に形成されるマイナーグルーブとの非共有性相互作用をマイナーグルーブバインダー部分が行うことが可能な適切な長さの限界を提供すること、について選択される。
【０１３４】
より特定的には、Ｋは、プローブ／結合体のフルオロフォアとオリゴヌクレオチド部分との間の直接結合であるかまたはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉから選択される１〜３０個の主鎖原子を有する二価連結基である。適切な連結基の選択は、一般的に、プローブのＯＤＮ長を考慮してなされる。典型的に、ＯＤＮが約１５〜１８ヌクレオチドよりも長い場合により短い連結基を使用することができ、一方、より短いプローブが望ましいおよび／またはより短いプローブが構築される場合、より長い連結基がより有用である。好ましい実施形態の１つのグループでは、Ｋは−（Ｏ−（ＣＨ２）ｐ）ｑから選択され、ここで、添字ｐは２〜１４の整数であり、添字ｑは１〜１０の整数であり、但し、Ｋの全長は約５０原子未満である。好ましくは、Ｋは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−、−（Ｏ（ＣＨ２）１２）−および−（Ｏ（ＣＨ２）１２）２−から選択される。実施形態の別のグループでは、Ｋは、好ましくは下式を有する連結基である：
【０１３５】
【化２２】
【０１３６】
式中、添字ｒは１〜５の整数、好ましくは１または２、最も好ましくは２である。
【０１３７】
三価の連結基Ｗは、ＯＤＮとＱとＭとの適切な結合および可とう性を提供するために、種々の構造を包含することができる。実施形態の１つのグループでは、Ｗは下式を有する三価の官能基である：
【０１３８】
【化２３】
【０１３９】
式中、窒素原子は、モノアゾ色素またはビスアゾ色素（クエンチャー、Ｑ）の芳香族環に直接結合し、典型的にはクエンチャーの一部分であるとみなされ、成分Ａ１およびＡ２は独立して、単結合またはＣ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、ＳｉおよびＯから選択される１〜約５０原子を有するリンキング／スペーサー部分および利用可能な価数を満たすための追加の水素原子から選択される。さらに、Ａ１およびＡ２はそれぞれ、環状成分、非環状（直鎖または分枝）成分またはそれらの組み合わせを有することができる。
【０１４０】
（使用方法）
本発明のプローブ／結合体は、既存のプローブおよび結合体と比べて、遺伝子型特定を改良する優れたミスマッチ識別を含む、数多くの利点を提供する。本発明のプローブ／結合体は、標的配列に対するハイブリダイゼーションが、増幅プロセス（例えばＰＣＲ）とリアルタイムに（または同時に）検出され、特に有用である。さらに、１つの実施形態では、本発明のプローブ／結合体は、５’−ヌクレアーゼ活性によって消化されない。それゆえに、増幅反応を達成することができ、融解曲線分析によって再評価することができる。本発明のプローブ／結合体はさらに、標的を遺伝子特定するために酵素（例えば５’−ヌクレアーゼ）によって消化される場合において有用である。ハイブリダイズするプローブ／結合体からのフルオロフォアまたはクエンチャーの酵素的切断によるミスマッチの検出は、米国特許出願第１０／６４５，３５３号（本願明細書中で参考として援用される）に記載される。本発明のプローブ／結合体は、他の増幅システムにおいて使用される場合、遺伝子型特定において特に有用である。
【０１４１】
本発明のプローブ／結合体は、別の核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関与する他の技術において有用である。これらとしては、限定されないが、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが終点である技術；標的核酸に対する１つ以上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、プライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして標的核酸を使用する１つ以上のポリメラーゼによる伸長ステップに先行する技術；標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが別のプライマーの伸長をブロックするために使用される技術；および２つ以上のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされ、複数のオリゴヌクレオチド間の相互作用が測定される技術が挙げられる。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための条件およびハイブリダイゼーションの程度および特異性に影響を与える因子（例えば、温度、イオン強度および溶媒組成）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ（前出）；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５；およびｖａｎ Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１を参照。なお他の方法では、複数のプローブは、代替の標的部位領域を検出するため（例えば、困難な配列を同定するためまたは標的の種および亜種を識別するため）に使用することができる。
【０１４２】
標的配列に対するプローブおよび／または結合体のハイブリダイゼーションは、周知および当該技術分野で認識された塩基対の性質に従って進み、アデニン塩基はチミンまたはウラシルと対になり、グアニン塩基はシトシンと対になる。第２のヌクレオチドとの塩基対を可能にするヌクレオチドの性質は、相補性であると呼ばれる。従って、アデニンはチミンおよびウラシルの両方と相補性であり、逆もそうである；同様に、グアニンはシトシンと相補性であり、逆もそうである。標的配列とその全長にわたって相補性であるオリゴヌクレオチドは、完全に相補性であり、完全にマッチしまたは標的配列に対して完全に相補性であると呼ばれ、逆もそうである。オリゴヌクレオチドおよびその標的配列は、関連する配列を有することができ、２この配列中の塩基の大多数が相補性であるが、１つ以上の塩基が相補性でないかまたはマッチしていない。このような場合では、この配列は、互いに実質的に相補性であると呼ぶことができる。オリゴヌクレオチドの配列および標的配列が、１つを覗く全てのヌクレオチド位置で相補性である場合、このオリゴヌクレオチドおよび標的配列は、お互いに関して一塩基ヌクレオチドミスマッチを有する。
【０１４３】
プローブ／結合体について決定されるＴｍが、二本鎖の熱力学パラメーター、プローブおよび標的の濃度、最近接物およびプローブ長の関数であることが理解される。この理由のために、報告されたＴｍは、同じ長さのプローブ、既知のプローブおよび標的の濃度および同じ最近接物を用いて決定される。
【０１４４】
普遍的な塩基を組み込んだプローブ／結合体について、普遍的な塩基が天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のそれぞれと、ほとんどまたは全く識別されずに「塩基対」を形成することが理解される。ほとんどまたは全く識別されないことは、普遍的な塩基を含むプローブが、普遍的な塩基に対して相補的な塩基位置においてＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを含む以外は４つの同一の相補的な標的に対してハイブリダイズする場合に、Ｔｍの違いの観点から測定することができると理解される。好ましくは、普遍的な塩基に対して相補的なＡ、Ｃ、ＧまたはＴを含む４つの標的のプローブ／標的二本鎖のＴｍの違いは、約５℃、４℃または３℃である。最も好ましくは、Ｔｍの違いは、約２℃または約１℃またはそれよりも小さい。
【０１４５】
入り交ざった塩基を組み込んだプローブ／結合体の場合において、同様の熱力学的性質を有する天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のそれぞれの２つ以上と２つの水素結合を形成することが理解される。ほとんどまたは全く識別されないことまたは同様の熱力学的性質は、入り交ざった（無差別な）塩基を含むプローブが、普遍的な塩基に対して相補的な塩基位置においてＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを含む以外は２つ以上の同一の相補的な標的とハイブリダイズする場合に、Ｔｍの違いの観点から測定することができると理解される。好ましくは、普遍的な塩基に対して相補的なＡ、Ｃ、ＧまたはＴを含む４つの標的のプローブ／標的二本鎖のＴｍの違いは、約５℃、４℃または３℃である。最も好ましくは、Ｔｍの違いは、約２℃または約１℃またはそれよりも小さい。
【０１４６】
改変された塩基を組み込んだプローブ／結合体について、改変された塩基が天然に生じるアナログの塩基対特異性を保持することが理解される。例えば、ＰＰＰＧアナログは、シトシンと相補性であり、一方、ＰＰＰＡアナログは、チミンおよびウラシルと相補性である。ＰＰＰＧおよびＰＰＰＡアナログは、グアニンおよびアデニンと比較して、非相補性の塩基といわゆる「ぐらつく（国際公開番号ｂｂｌｅ）」対を形成する傾向が低いだけでなく、３−置換基は二本鎖における結合アフィニティを増大させる。同様に、改変されたピリミジンは、それらの天然に生じるカウンターパートナーに対して特異的にハイブリダイズする。
【０１４７】
ハイブリダイゼーションのための条件は当業者に周知であり、比較的広い限界内を変動することができる。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチのヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を好まず、それゆえに完全にマッチしたハイブリッドまたは数個のミスマッチを含むハイブリッドの形成を促進する程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチのハイブリッドについてより低い耐性と相関関係にある。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子としては、限定されないが、温度、ｐＨ、イオン強度、有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドおよびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ））の濃度が挙げられる。
【０１４８】
従って、プローブ／結合体とその標的配列との間のハイブリッド（二本鎖）の形成において、プローブ／結合体は、温度、イオン強度、ｐＨなどのハイブリダイゼーションに好ましい条件下（すなわち、ハイブリダイゼーション条件下）で標的配列を含むポリヌクレオチドと共に溶液中でインキュベートされる。ハイブリダイゼーション条件は、いくつかの環境において、ハイブリダイズする配列において１つ以上のミスマッチを有する核酸の対と比較して、完全にマッチした配列を有する２つの核酸間のハイブリダイゼーションを好むように選択される。他の環境において、ハイブリダイゼーション条件は、ミスマッチした配列間のハイブリダイゼーションを可能にし、より少ないミスマッチを有する核酸間のハイブリダイゼーションを好むように選択される。
【０１４９】
標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度（ハイブリダイゼーション強度としても知られる）は、当該技術分野で周知の方法によって決定される。好ましい方法は、ハイブリッド二本鎖のＴｍを決定することである。このことは、上述のように、溶液中で二本鎖の温度を徐々に上げ、変性に付随して起こる塩基対のアンスタッキング（ｕｎｓｔａｃｋｉｎｇ）を増大させる二本鎖の変性をモニタリングする（例えば、紫外線吸収によって）ことによって達成される。Ｔｍは、一般的に、ハイブリッド二本鎖の塩基の５０％がアンスタッキングする温度として定義される。あるいは、Ｔｍが既知である場合、ハイブリダイゼーション温度（イオン強度、ｐＨおよびプローブ／標的濃度は固定）は、所望の二本鎖のＴｍよりも低く、所望でない二本鎖のＴｍより高いように選択することができる。この場合では、ハイブリダイゼーションの程度の決定は、単純に、ハイブリダイズされたプローブの存在について試験することによって達成される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、プローブ／結合体は、プライマーとして作用することが可能であり、プローブ／結合体のハイブリダイゼーションの程度はさらに、プライマーの伸長産物のレベルを測定することによって決定することができる。この実施形態では、プライマーを標識することができるかまたは重合のための前駆体（通常はヌクレオシドトリホスフェート）の１つ以上を標識することができる。伸長産物は、例えば、サイズ（例えば、ゲル電気泳動）、リアルタイムＰＣＲにおけるようなハイブリダイゼーションプローブとのアフィニティ法または当業者に既知のいずれかの他の技術によって検出することができる。
【０１５１】
プライマー伸長（「ミニシークエンシング（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、「遺伝子ビット分析（ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）」）アッセイは、通常はＳＮＰタイピングのために使用され、さらに、他の遺伝子型特定および変異スクリーニング適用において使用することができる（Ｐａｓｔｉｎｅｎ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１０３１−４２（２０００））。本発明では、マイナーグルーブバインダーおよびいくつかの場合において、改変された塩基の存在は、プライマー伸長アッセイを向上させることができる。例えば、マイナーグルーブバインダーまたは５−置換ピリミジンまたは３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって提供される付加された二本鎖の安定性は、加温で行われる伸長を可能にする。標的分子中の問題のある第２の構造は加温状態で排除することができることは利点である。さらに、プライマーに対する標的のハイブリダイゼーションは、さらに高い温度で速い。熱安定性のポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）はこのような反応で使用することができる。マイナーグルーブバインダーおよび改変された塩基がプローブを提供することができ、プライマーが上述の利点を有するが、改変された塩基の使用は、典型的には、プライマー伸長の阻害を避けるために、３’−末端位置以外の位置である。
【０１５２】
さらに、マイナーグルーブバインダーおよび改変された塩基は、１つの種類の誤ったポジティブシグナルを排除することによってアッセイの特異性を高める。ヘアピン構造またはホモダイマーを形成するプライマー配列は、テンプレート依存性の伸長（テンプレートとしてプライマー機能の５’末端、その結果誤ったポジティブシグナルを生じる）である傾向がある。「テンプレート」上でのマイナーグルーブバインダーおよび改変された塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する。従って、５’末端上のマイナーグルーブバインダーまたは３’末端またはプライマーの内部上の改変された塩基は、プライマーヘアピンまたはプライマーダイマーからの伸長（誤ったポジティブ）を防ぐことができる。最後に、ＰＰＧは、Ｇ豊富なオリゴヌクレオチドによって形成される非標準的な構造を排除するために使用することができ、これによりこのような配列においてプライマー伸長アッセイを可能にする。
【０１５３】
本改変されたオリゴヌクレオチドが特に有用な他のアッセイは、米国特許第６，３１２，８９４号に記載される（本願明細書中に参考として援用される）。
【０１５４】
本プローブ／結合体が有用であるなお他の増幅アッセイとしては、フラップエンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドプローブの侵襲性切断に基づく増幅アッセイ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２９２−２９６（１９９９））；自己保持配列複製アッセイ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ａｓｓａｙｓ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０８：４３１−４３７（１９９７））、５’−ヌクレアーゼアッセイ（Ｌｉｖａｋ，Ｇｅｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ，１４：１４３−１４９（１９９９）、分子ビーコンアッセイ（米国特許第６，４８５，９０２号）およびＲｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅアッセイ（米国特許第６，３４４，３２９号）が挙げられる（これらそれぞれの教示は本願明細書中に参考として援用される）。本発明の改変されたプローブ／結合体としては、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基および任意に改変された塩基が挙げられる。非天然の骨格はさらに、ペプチド核酸、ロックト核酸などにおいて使用されるモノマーとして含まれる。
【０１５５】
上の観点において、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記多型のそれぞれが前記標的核酸のプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的核酸を含むサンプルと前記標的配列の前記プローブ領域に隣接するかまたはそれと重複する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、重合する酵素、ヌクレオチド基質および下式：
【０１５６】
【化２４】
【０１５７】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有するオリゴヌクレオチド結合体を混合して混合物を提供する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；
（ｂ）前記混合物を重合に好都合な条件下でインキュベートする工程；および
（ｃ）前記増幅された標的に対する結合体ハイブリダイゼーションの際に生成される蛍光をモニタリングすることによって前記増幅を連続的にモニタリングする工程
を含む、方法を提供する。
【０１５８】
関連する局面では、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記第１および第２の多型のそれぞれが前記標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチド配列を含む前記サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供し、前記第１のプローブは野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、第２のプローブは変異型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、前記第１および第２のプローブはそれぞれ独立して選択された式：
【０１５９】
【化２５】
【０１６０】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；およびそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、ハイブリッド形成が野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を含む、方法を提供する。
【０１６１】
なお別の局面では、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記第１および第２の多型のそれぞれが前記標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチド配列を含む前記サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供し、前記第１のプローブは野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、第２のプローブは変異型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、前記第１および第２のプローブはそれぞれ独立して選択された式：
【０１６２】
【化２６】
【０１６３】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成の融解曲線分析を用いて蛍光を測定し、野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を決定する工程
を含む、方法を提供する。
【０１６４】
なお別の局面では、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記第１および第２の多型のそれぞれが前記標的核酸のプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）識別されることが意図されない１つ以上の多型を含む少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含む前記サンプルと、前記野生型標的ポリヌクレオチドおよび変異型標的ポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするプローブとを接触させて混合物を提供し、前記第１のプローブは変異型標的ポリヌクレオチドと比較して野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、前記プローブは下式：
【０１６５】
【化２７】
【０１６６】
〔式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す〕
を有する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、ハイブリッド形成が野生型標的＋ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を含む、方法を提供する。
【０１６７】
上述の方法のそれぞれについて、プローブは、好ましくは、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置が逆転した改変とともにおよびマイナーグルーブバインダーおよびクエンチャーが３’−位に結合し、フルオロフォアが５’−位に結合する、式ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂおよびＩＶのものである。なお他の実施形態では、プライマーは、改変された塩基、普遍的な塩基または入り交ざった塩基を含む増幅において使用される。本発明の関連する局面は、式ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂおよびＩＶのプローブが、標的核酸のプローブ領域中の各ＳＮＰに対して相補的な部位で普遍的または入り交ざった塩基を有して使用される。
【実施例】
【０１６８】
（実施例１）
本実施例は、多型が、目的の対立遺伝子の際近接に第２の多型の存在下で、第２の多型に関与するプローブ位置で普遍的な塩基で置換することによって、遺伝子型を特定することができることを示す。一般的に、１個のプローブを有する二塩基の多型の従来の融解曲線分析による遺伝子型特定は、確定的ではない結果を与えた。以下の方法の使用は、以前に達成された遺伝子型特定よりもさらに正確な結果を与える。
【０１６９】
（材料および方法）
（１．１ テンプレート）
ヒトゲノムＤＮＡを、Ｃｏｒｉｅｌｌ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＹから購入した。遺伝子型特定を、制限長の多型およびＴａｑＭａｎ法を用いて出願人らの実験室であらかじめ行っておいた。
【０１７０】
（１．２ オリゴヌクレオチド）
使用したオリゴヌクレオチドの配列を図１に示す。５’→３’方向におけるオリゴヌクレオチドセグメントの合成のために設計された５’−β−シアノエチルホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ）を用いて、ＭＧＢ−Ｑ−改変されたガラス支持体（ＭＧＢＴＭリガンドはＤＰＩ３（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの商標）である）上で自動化ＤＮＡ合成機によって、５’−ＭＧＢ−Ｑ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブを調製した。製造業者によって供給されたプロトコルに従って０．０２Ｍヨウ素溶液を用いてＡＢＩ ３９４合成機でオリゴヌクレオチド合成を行った。ＰＰＧホスホロアミダイトを文献の方法に基づいて合成したが、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから購入することもできる。６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｙａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗＴＭ（ＹＹ、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから）および６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）レポーティング色素を、対応するホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて合成の最終段階で導入した。標準的な５’−ＤＭＴホスホロアミダイトをこのときに使用した。全てのオリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。
【０１７１】
（１．３ Ｔｍ予測）
ＭＧＢ ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を使用して５’−ＭＧＢ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌプローブを設計した。このソフトウェアの特徴の１つは、Ｇ：Ｇ自己会合に起因する検出力の乏しいプローブとして知られる３つを超える連続したＧｓを含有し、ＰＰＧを用いたＧの適切な置換を示すプローブを設計する能力である。さらに、このソフトウェアは、二重らせん安定性を向上するためにＡＴリッチな配列中にＳｕｐｅｒ ＡおよびＳｕｐｅｒ Ｔで改変された塩基を組み込んだプローブを設計することができる。このソフトウェアをプローブおよびプライマーを設計するために使用した。単位複製配列、プライマーおよびプローブを図１および表４に示す。
【０１７２】
（１．４ リアルタイムＰＣＲ）
（ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ）
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）熱サイクル蛍光測定器（Ａｆｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ，２５：２６８−２７５（２００２））のいずれかを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。両方の装置で、３ステップのＰＣＲを５０サイクル（９５℃で５秒、５８℃で２０秒および７６℃で３０秒）、その後５０℃で２分および９５℃で２分行った。ＡＢＩ ７９００について、Ｊｕｍｐ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ ＃９０ ４１８４）を最終量０．３７Ｕ／μｌ反応液まで追加した２ｍＭの最終Ｍｇ＋＋濃度（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ ７４４０３）を含む市販の２×Ｊｕｍｐ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使用してこのＰＣＲ反応を設定した。両方のプローブの最終濃度は０．２μＭであり；制限プライマーの濃度は０．１μＭであり、過剰プライマーは２μＭであった。反応の設定の前に、各５μｌの反応物に、プレート中でｓｐｅｅｄ ｖａｃを用いて凍結乾燥した１０ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅについて、反応物の最終量が１０μｌである以外は、設定は本質的に同じであり、サンプルＤＮＡを１×ＴＥまたは水に添加し、全量を１０ｎｇ／反応物にした。
【０１７３】
（蛍光融解曲線およびＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブを用いる遺伝子型特定）
融解曲線アッセイのためのＰＣＲの準備は、リアルタイム実験について記載されるのと同じであったが、ＰＣＲは、熱サイクリング蛍光光度計の外側で行うことができる。ＡＢＩ７９００での融解曲線分析の詳細は以下に概説され、ステップ毎の操作は、ｗｗｗ．ｅｐｏｃｈｂｉｏ．ｃｏｍで入手可能なＵｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに提供される。ＰＣＲ終了後、プレートをＡＢＩ７９００に移し、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセイン検出を用いる解離曲線分析のためにＳＤＳソフトウェアを設定する。熱プロフィールは、初期変性温度９５℃×３０秒、アニーリング温度３０℃および最終温度８０℃に設定される。ランプ速度は１０秒毎に約１℃である１０％に設定される。最終温度に到達した後、集めたデータを分析のためにセーブする。融解曲線データを、温度に対する融解曲線の一次導関数としてグラフにより視覚化することができる。自動化された遺伝子型特定のために、このデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに移し、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｅｐｏｃｈｂｉｏ．ｃｏｍ）から入手可能なＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｍｅｌｔ Ｍａｃｒｏを用いて分析する。このマクロにより、コントロールサンプルまたは各対立遺伝子について陽性のサンプルがプレート上に存在する場合、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインプローブのＴｍを自動的に決定できる。あるいは、ユーザは、まれな対立遺伝子を有する場合であり得るように、コントロールサンプルが入手できない場合、プローブのＴｍを手動で設定することができる。ユーザの入力は、融解曲線を試験した後にシグナルおよびＴｍ閾値を調整するために必要であり得る。この入力とともに、このマクロは自動的に遺伝子型を割り当て、個々のサンプルを呼び出し、遺伝子型特定の結果を表にして出力する。
【０１７４】
図１に示されるプライマーおよびプローブを使用して、プローブ配列中に２個の多型を含むゲノム標的を遺伝子型特定した。目的の［Ｇ／Ｔ］対立遺伝子により、図２に示される融解曲線分析によって、第２の対立遺伝子Ｎの存在下で遺伝子型特定することができた。ヘテロ接合体サンプルは、このマクロにおいて設定されたＴｍウインドウ範囲において両方の蛍光チャネルにおける融解曲線を示したが、正しいＴｍを有する野生型および変異型の対立遺伝子融解曲線は、それぞれの蛍光チャネルにおいてのみ存在した。
【０１７５】
（実施例２）
本実施例は、モデル系における普遍的な塩基としてニトロインドール（１３）およびニトロピロール（９）の評価結果を示す。８個の標的を調製し、プローブ配列領域中の２個のさらなる多型の存在下で目的の多型を有するプローブを評価した。プローブおよび標的配列は表４に示される。
【０１７６】
（表４）
（ニトロインドール（１３）およびニトロピロール（９）の塩基対の性質を評価するためのプローブおよび標的配列）
【０１７７】
【表４】
【０１７８】
Ｎ１塩基は目的の多型のＧ塩基およびＡ塩基にハイブリダイズする能力を評価する。Ｎ２塩基は４個の天然塩基にハイブリダイズする能力を評価する。ＮＡおよびＮＢは普遍的な塩基９および１３のいずれかによって同時に両方置換される。
【０１７９】
示されるように、９および１３の両方が４個全ての塩基とハイブリダイズし、Ｔｍ上昇効果を有していた。
【０１８０】
（実施例３）
本実施例は、プローブ：標的二本鎖の融解温度の決定を記載する。
【０１８１】
二本鎖形成の熱力学的パラメーターは、Ｖａｎ’ｔ Ｈｏｆｆ分析法によって誘導された。各融解曲線の形状を、非線形最小二乗プログラム（Ｌｏｋｈｏｖ，Ｓ．Ｇ．ａｎｄＰｙｓｈｎｙｉ，Ｄ．Ｖ．，ＦＥＢＳ ４２０，１３４−１３８ １９９７））を用いて線形ベースラインを有する２状態モデルにあわせた（Ｘｉａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７，１４７１９−１４７３５（１９９８））。他に言及されない限り、ＤＮＡ二本鎖のＴｍを、以前に記載されるように５×１０−７Ｍの濃度で１×ＰＣＲバッファー中で測定した（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８，６５５−６６１（２０００））。
【０１８２】
（実施例４）
本実施例は、入り交ざった（無差別な）塩基ＰＰＧの最近接の熱力学パラメーターの決定を示す。使用された理論および方法は、米国特許出願第０９／７９６，９８８号およびＰＣＴ出願ＷＯ０１／６４９５８（本願明細書中に参考として援用される）に開示される。
【０１８３】
（表５）
（ＰＰＧのΔＧ０およびＴｍについて最近接物の影響を評価するための標的およびｄプローブの配列）
＃はプローブおよび標的番号であり；「ｇ」はＰＰＧ（Ｓｕｐｅｒ Ｇ）であり、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴである。標的中のＮ置換は太字で示される。
【０１８４】
【表５】
【０１８５】
プローブおよび標的を使用してΔＧ０およびＴｍを決定し、４個の標的および１個のプローブのセットにおいて数または最近接物について表５に示す。実施例について各セットは４個の標的（例えば、１０番〜１３番）および１個のプローブ（１４）を含み、４個の二本鎖を生じ、３個のミスマッチと１つのマッチ１４を有する。それゆえに、図６ａ）からｃ）は、ΔＧ０およびＴｍデータに加えて、４つのグループのＴｍについての棒グラフ、４つのミスマッチと１つのマッチを示す。表５に列挙される標的およびプローブに対応する結果を図６ａ）に示す。−ＡｇＡ−配列を、プローブ１４および標的１０〜１３を用いておよび異なる配列環境のプローブ１９および標的１５〜１８を用いて評価した。図６ａ）に示されるように、異なる配列環境における−ＡｇＡ−について３個のミスマッチと１個のマッチを有する平均Ｔｍの比率は同じであった。このことは、最近接のモチーフの熱力学的構成は、配列の残りと独立しているということを示す。
【０１８６】
同様に他のプローブおよび標的（配列は示されない）を使用して、さらなる最近接物についてΔＧ０およびＴｍを決定し、その結果を図６ｂ）および６ｃ）に示す。図６における正常にマッチしたプローブおよび入り交ざった（無差別な）塩基で置換されたプローブの間の二本鎖Ｔｍの違いは、普遍的な塩基であるニトロピロールおよびニトロインドールでそれぞれ置換されたプローブ９および１３（表４）を用いて観察された結果と同様かそれよりも小さい。
【０１８７】
（実施例５）
本実施例は、標的の変異に対応する塩基における置換によって多型が「目につかなく」され得ることを示すための、プローブにおいて普遍的な塩基４１および４２の使用を示す。ＢＡＲＤ１−０３遺伝子配列において存在するＳＮＰの一部分を以下に示す（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ５００ｃａｎｃｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【０１８８】
【化２８】
【０１８９】
［Ｇ／Ａ］多型は、普遍的な塩基Ｎを有するプローブ中の対応する位置の置換によって「目に付かなく」される。図７は、Ｎが普遍的な塩基４１または４２のいずれかで置換される場合の、プローブの融解曲線分析を示す。各場合において、野生型および変異型標的の両方に対してプローブを分析した。示されるように（図７ａおよび７ｂを参照）、鋭い１本の融解曲線は、２個の改変塩基が野生型および変異型標的の両方に対して同じ熱安定性を有してハイブリダイズすることを示す。
【０１９０】
（実施例６）
本実施例は、融解曲線分析を用いてＢＡＲＤ１−０３遺伝子中に存在する二塩基ＳＮＰの遺伝子型特定に対処するための、プローブ中の普遍的な塩基４０および入り交ざった（無差別な）塩基Ｖ（ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）の使用および比較を示す。プローブ領域中の二塩基多型（Ｒ＝Ｇ／Ａ）を有するＢＡＲＤ１−０３配列の一部分およびプローブ配列を以下に示す：
【０１９１】
【化２９】
【０１９２】
目的の多型は、下線を引いた太字で示され、［Ｒ＝Ｇ／Ａ］多型は、プローブ中の対応する位置で普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基Ｎによってそれぞれ置換されることによって「目に付かなく」される。図８において、Ｎが普遍的な塩基４０または入り交ざった（無差別な）塩基Ｖ（ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）のいずれかで置換された、ＢＡＲＤ１−０３多型（上述の下線の太字）の融解曲線分析が示される。示されるように、図８ａ）およびｂ）における鋭い１本の融解曲線は、第２の多型が「目に付かなくされて」いることを示す。しかし、普遍的な塩基４０の場合には、図８ａ）において使用されるＮＡおよびＮＧプローブの間で約２．８℃のＴｍの差が存在する。図８ｂ）において使用される入り交ざった（無差別な）塩基は、ＮＡとＮＧプローブとの間のＴｍの差はたった０．８℃であった。
【０１９３】
（実施例７）
本実施例は、１個のプローブのみを有し、１個のミスマッチを有する２個の標的の検出結果を示す。１個のプローブを、プローブ領域中でたった１個のミスマッチのみが異なるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅおよびＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓを検出するために開発した。標的およびプローブ配列を以下に示す。本実施例では、ａ）ＰＰＧ（４９）およびｂ）置換ピラゾロピリミジン誘導体（Ｖ、ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）で置換された２種類の単一プローブを以下に示す。
【０１９４】
【化３０】
【０１９５】
ここで、Ｎは、ＰＰＧ（４９）または置換ピラゾロピリミジン（Ｖ、ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）のいずれかである。プローブ４９およびＶを、両方の標的を効率よく検出する能力について評価した。融解曲線分析の結果を図９に示す。図９ａ）は４９を用いて得られたデータを表し、図９ｂ）は置換ピラゾロピリミジン（Ｖ）を用いて得られたデータを表す。
【０１９６】
（実施例８）
本実施例は、普遍的な塩基５’ホスホラミダイト（５６）の合成を示す。
【０１９７】
【化３１】
【０１９８】
２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−テトラヒドロ−５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル）−６−メチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（５５）。１２５ｍｌの丸底フラスコに、磁気攪拌棒を入れ、無水ピリジン（１０ｍｌ）中の化合物（４１）（１．０３ｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびジメチルテキシルシリルクロリド（０．５９ｍｌ，０．５３６ｇ，３．０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１日間磁気攪拌した。ジメトキシトリチルクロリド（０．８８ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をさらに１日磁気攪拌した。反応混合物を氷水浴で冷却し、あらかじめ調製しておいたＨＦ−Ｐｙ錯体（約２．０ｇ，約１．４ｇＨＦ，約７０ｍｍｏｌ）のピリジン（１０ｍｌ）溶液を、シリンジを介して１０分間で添加した。得られた混合物を室温でさらに２日間磁気攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）に注意深く注いだ。有機層を分離し、食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンと共に２回共沸させ、カラムクロマトグラフィーで精製し、所望の生成物（５５）（０．７８ｇ，１．３６ｍｍｏｌ，収率＝６８％）を白色泡状物として得た。
【０１９９】
【化３２】
【０２００】
普遍的な塩基５’ホスホラミダイト（５６）。５０ｍｌの丸底フラスコに、化合物（２）（０．２５ｇ，０．４３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．０８１ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）および攪拌棒を入れた。フラスコを吸引し、アルゴンで満たした。次いで、無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を添加し、その後、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホラミダイト（０．２５９ｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物をアルゴン下室温で２時間攪拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）でクエンチした。有機溶液を分離し、食塩水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（カラムはヘキサン中の５％Ｅｔ３Ｎであらかじめ洗浄し、その後純粋なヘキサン；Ｈｅｘ中の３０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な所望の生成物（５６）（０．２８ｇ，０．３６ｍｍｏｌ，収率＝８４％）を白色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４４．５６（ｓ），１４４．２０（ｓ）。
【０２０１】
（実施例９）
本実施例は、普遍的な塩基５’ホスホラミダイト（６５）の合成を示す。
【０２０２】
【化３３】
【０２０３】
６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６１）：化合物（６１）を、市販の３，５−ジメチルベンズアルデヒド（５７）〜（６０）から出発して、確立された合成経路に従って調製した（Ｂｒｉｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８：５７６１−５７６６（２００２）。１Ｈ ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ６）：１０．９１（ｂｃ、１Ｈ）、７．２１（ｓ、１Ｈ）、７．１０−７．００（ｍ、２Ｈ）、６．３６（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．７６（ｓ、３Ｈ）、２．３３（ｓ、３Ｈ）。
【０２０４】
２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル）−６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６３）：０．２５Ｌ丸底フラスコに、攪拌棒を入れ、化合物（６１）（１．０ｇ，５．７７ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１０ｍｌ）およびＤＭＦ（２０ｍｌ）を入れた。混合物を、氷水浴を用いて＋０℃まで冷却し、水素化ナトリウム（０．１５０ｇ，５．９５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。５分後、反応混合物を室温まで加温し、１．５時間磁気攪拌した。化合物（６２）（２．２４５ｇ，５．７７ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を室温で６時間磁気攪拌した。化合物（６２）（０．４５３ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）をさらに一度に添加し、反応混合物を室温でさらに２時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水（５０ｍｌ）を添加し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍｌ）で抽出した。有機溶液を食塩水（２×２０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥剤からろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラム（ＤＣＭ中の０〜２％ＥｔＯＡｃ）で分離し、純粋なトルイル保護された中間体（０．６４ｇ，１．２２ｍｍｏｌ，収率＝２１％）を白色泡状物として得た。カラムをさらにＥｔＯＡｃで洗浄し、純粋な出発物質（６１）（０．６２ｇ，３．５８ｍｍｏｌ，収率＝６２％）をオフホワイト色の固体として得た。トルイル保護された中間体（２．７ｇ，５．１４ｍｍｏｌ）を、あらかじめ磁気攪拌棒を入れておいた０．５Ｌ丸底フラスコに入れ、メタノール（４０ｍｌ）およびＴＨＦ（８ｍｌ）を入れた。得られた混合物を＋０℃まで冷却し、ナトリウム（０．３４５ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）およびメタノール（２０ｍｌ）から新しく調製したナトリウムメトキシドを一度に添加した。反応混合物を＋０℃で１時間磁気攪拌した。反応混合物を塩化アンモニウム（１．０７ｇ，２０ｍｍｏｌ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラム（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝４：４：１）で分離し、所望の生成物（６３）（１．３６ｇ，純度約９０％，約４．２ｍｍｏｌ，収率＝８２％）をわずかに紫色の固体として得た。生成物は１Ｈ ＮＭＲによれば約１０％のトルエンを含有していた。
【０２０５】
【化３４】
【０２０６】
２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−テトラヒドロ−５−ヒドロキシメチル）フラン−２−イル）−６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６４）。化合物（６４）を化合物（５５）と同様に調製した。
【０２０７】
【化３５】
【０２０８】
普遍的な塩基の５’−ホスホラミダイト（６５）。化合物（６５）を化合物（５６）と同様に調製した。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４４．５６（ｓ），１４４．１６（ｓ）。
【０２０９】
本願明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が特別におよび個々に参考として援用されることが示されるように、本願明細書中に参考として援用される。上述の発明が、理解を明確にする目的のために説明および実施例を用いていくつか詳細に記載されているが、本発明の教示の観点から、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされることが当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】単位複製配列、プライマーおよびプローブの配列。Ｆａはフルオロセインであり、Ｆｂはテトラクロロフルオロセインである。「ａ」はＳｕｐｅｒ ＡＴＭである。ＭＧＢは置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）であり、ＭＧＢＴＭリガンドは、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの商標であり、プライマーは太字のイタリックであり、プローブは太字の下線部である。Ｎは第２の天然多型を表す。［Ｇ／Ｔ］は目的の多型をあらわす。Ｕ４０は６−アミノ−２−（４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−２−イル）−２，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン（４０）である。
【図２】プローブ結合領域中に二塩基多型を含有し、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインで標識されたプローブを有し、それぞれ第１の多型の野生型および変異型標的に対して相補的なサンプル４１８８ＤＮＡの融解曲線分析。第２の多型に対応する塩基は普遍的な塩基４０で置換された。
【図３】シチジン、グアニン、チミンおよびアデニン塩基とのグアニン塩基対幾何配置を提供する。
【図４】シチジン、グアニン、チミンおよびアデニン塩基とのＰＰＧ（Ｓｕｐｅｒ Ｇ）塩基対幾何配置を提供する。
【図５】シチジン、グアニン、チミンおよびアデニン塩基とのＳｕｐｅｒ Ａ塩基対幾何配置を提供する。
【図６ａ】ａ）−ＡｇＮ−、ｂ）−ＴｇＮ−およびｃ）ＣｇＮ−の再近接物についての熱力学的性質を示す。
【図６ｂ】ａ）−ＡｇＮ−、ｂ）−ＴｇＮ−およびｃ）ＣｇＮ−の再近接物についての熱力学的性質を示す。
【図６ｃ】ａ）−ＡｇＮ−、ｂ）−ＴｇＮ−およびｃ）ＣｇＮ−の再近接物についての熱力学的性質を示す。
【図７】プローブ結合領域中に一塩基多型を含有し、フルオレセインで標識されたプローブを有し、それぞれ多型の野生型および変異型標的に対して相補的なサンプルＢＡＲＤ１−０３ＤＮＡの融解曲線分析。多型に対応する塩基は普遍的な塩基４１または４２のいずれかで置換された。
【図８】プローブ結合領域中に二塩基多型を含有し、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインで標識されたプローブを有し、それぞれ第１の多型の野生型および変異型標的に対して相補的なサンプルＢＡＲＤ１−０３ＤＮＡの融解曲線分析。第２の多型に対応する塩基は普遍的な塩基４０または入り交ざった（無差別な）塩基（Ｖ、ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、Ｒｄはデオキシリボースである）のいずれかで置換された。
【図９】プローブ領域中の１個のミスマッチによってのみ異なり、１個のプローブを有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅおよびＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの両方の検出を示す。
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号第６０／５０８，７９２号（２００３年１０月２日出願）の利益を請求し、この内容は本願明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府によって後援された研究または開発に基づいてなされた本発明に対する権利に関する記載）
適用なし。
【０００３】
（コンパクトディスクで提出された「配列リスト」、表またはコンピュータプログラムリスト付録に対する参照）
適用なし。
【０００４】
（発明の背景）
本発明は、高度に多型の核酸において一塩基多型（ＳＮＰ）を分析するためのプロセスに関し、具体的には、目的のＳＮＰの近くに１つ以上のさらなる多型を含む標的においてＳＮＰを分析するためのプロセスに関する。
【０００５】
典型的には、一塩基多型の遺伝子型特定は、１個のミスマッチを含むプローブまたはプライマーを用いて行われる。このことは、対立遺伝子の分析を非常に単純化する。しかし、プローブ領域における１個より多い多型の存在は、遺伝子型特定を複雑化し、多くのＳＮＰ検出法が不可能である場合には、検出が非常に困難なものとなる。ほとんどのＳＮＰ検出法は、プローブ配列が別の多型にもわたる場合、目的の多型の遺伝子型特定において問題点を有する。
【０００６】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムにおいて最も豊富な変異であり、配列多型の９０％を超える割合を占める。ＳＮＰは１０００ヌクレオチドごとに平均１個生じ、大雑把に言えば、特定の個々において任意の塩基位置の０．１％が異種である可能性が存在する。ヌクレオチド多様性は、ゲノム全体で一定ではなく、特に多様性が低い領域（例えば、Ｘ染色体）および特に多様性が高い領域（例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））遺伝子座において１０％までである（非特許文献１）。高度に多型のＳＮＰ標的配列もまた、他の種において知られている。例えば、植物（非特許文献２）およびウイルス（非特許文献３）。多くのＳＮＰ検出法は、その近位に別の多型が存在しない場合に核酸標的中の一塩基多型を検出するために記載されている（非特許文献１、非特許文献４）。融解曲線分析による遺伝子型特定が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３および米国特許出願番号第１０／１６５，４１０号を参照（これらそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。
【０００７】
他の技術では、第２の多型がプローブ長の中に存在する場合、目的の多型を同定するためにプローブを設計しておらず、普遍的な塩基を使用しておらず、プローブは、第２の多型と対になる位置に普遍的な塩基が組み込まれる。例えば、普遍的な塩基アナログについての刊行物の総説（非特許文献５）は、ＳＮＰ分析を議論しているが、１個より多い多型がプローブによっておおわれている場合は議論していない。非特許文献６は、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールの合成を開示する。その位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを含む相補体に対してハイブリダイズした１個の普遍的な塩基を含む１５マーオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）は３℃未満であった。しかし、そのＴｍは、完全にマッチしたオリゴヌクレオチドよりも顕著に低かった。非特許文献７および特許文献４は、人工的なミスマッチとしてこの塩基を導入することによってミスマッチ識別を増加させるための３−ニトロピロールの使用を開示する。特許文献５は、少なくとも２個の並置された普遍的な塩基を含むプローブおよびプライマーを開示する。非特許文献８は、確立された変異部位の近くの天然塩基のミクロな欠失またはミクロな挿入を含むプローブを用いた複数のＳＮＰの同時検出を開示する。特許文献６は、プライマー伸長反応の間にポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖に組み込むことができる、拡張可能なヌクレオチドと称される普遍的なヌクレオチドを開示する。特許文献７は、限定された数のＬＮＡ置換されたホスホラミダイト試薬を開示する。特許文献８は、薬学的適用のための多くの数の普遍的な塩基のトリホスフェート誘導体を開示する。
【０００８】
いくつかの刊行物は、ＳＮＰ分析におけるそれらの適用を議論することなく、普遍的な塩基を開示する。例えば、非特許文献９は、プローブおよびプライマーにおいて使用可能な２個の新規の変性された塩基６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピルミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ）および２−アミド−６−メトキシアミノプリン（Ｋ）を開示するが、ミスマッチ識別または遺伝子型特定におけるそれらの使用は開示していない。両塩基ＰおよびＫがそれらのアミノ互変異性体およびイミノ互変異性体に存在する可能性に起因して、これらはＡおよびＧならびにＣおよびＴの両方とそれぞれ対になる。非特許文献１０および非特許文献１１は、イソカルボスチリルコア構造に基づく非天然核酸塩基の合成を開示する。非特許文献１２は、４個の非天然塩基の合成を開示し、それぞれの塩基は、全ての４個の天然塩基と比較的同様にハイブリダイズする。非特許文献１３は、８−オキソ−７，８−ジヒドロアデノシンの塩基対の性質を開示する。非特許文献１４は、６個の新規の非天然塩基を開示するが、ＳＮＰ分析は観察していなかった。非特許文献１５、非特許文献１６および特許文献９は、天然アナログＡ、Ｃ、ＧおよびＴと顕著な構造識別を示さなかった３個の普遍的な塩基を開示する。特許文献１０は、限定された数のＬＮＡ置換されたホスホラミダイト試薬を開示する。特許文献１１は、薬学的適用のための多くの数の普遍的な塩基のトリホスフェート誘導体を開示する。
【０００９】
増幅された核酸標的に基づく分析は、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５および特許文献１６に開示され、これらはそれぞれ本願明細書中に参考として援用される。
【００１０】
天然に改変された塩基アナログおよびそれらの性質は、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９；および特許文献２０および非特許文献１７に開示され、これらはそれぞれ本願明細書中に参考として援用される。
【特許文献１】米国特許第６，５６９，６２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５０６，５６８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４４８，０１５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７８０，２３３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１６５８８８号明細書
【特許文献６】国際公開第０３／０４０３９５号パンフレット
【特許文献７】欧州特許第１３１４７３４号明細書
【特許文献８】国際公開第０２／０６２８１６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／０７２７６４号パンフレット
【特許文献１０】欧州特許第１３１４７３４号明細書
【特許文献１１】国際公開第０２／０６２８１６号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，１９７，５６３号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，３１２，７２８号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，２２１，６０３号明細書
【特許文献１７】国際公開第０１／０６５９５８号パンフレット
【特許文献１８】米国特許第６，１２７，１２１号明細書
【特許文献１９】米国特許第６，６６０，８４５号明細書
【特許文献２０】米国再発行特許発明第３８，４１６号明細書
【非特許文献１】ＴｗｙｍａｎおよびＰｒｉｍｒｏｓｅＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ４、２００２年、ｐ．１−１３
【非特許文献２】Ｃｈｉｎｇ Ａ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＫＳ，Ｊｕｎｇ Ｍ，Ｄｏｌａｎ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ ＯＳ，Ｔｉｎｇｅｙ Ｓ，Ｍｏｒｇａｎｔｅ Ｍ，Ｒａｆａｌｓｋｉ ＡＪ．ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔ．３、２００２年、ｐ．１９
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ，Ｌａｒｄｅｒ ＢＡ．Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．６ Ｓｕｐｐｌ ３、２００１年、ｐ．２５−４４
【非特許文献４】Ｇｅｒｏｍｅ Ｂｒｅｅｎ，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２、２００２年、ｐ．８３−８８
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９、２００１年、ｐ．２４３７−２４４７
【非特許文献６】Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７、１９９５年、ｐ．１２０１−１２０９
【非特許文献７】Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５、１９９７年、ｐ．３３１−３３５
【非特許文献８】Ｂｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅａｍｏｓｔ．，８０、１９９８年、ｐ．３２−３６
【非特許文献９】Ｌｉｎ，ＰＫＴおよびＢｒｏｗｎ，ＤＭ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０、１９９２年、ｐ．５１４９−５１５２
【非特許文献１０】ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１、１９９９年、ｐ．１１５８５−１１５８６
【非特許文献１１】Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２、２０００年、ｐ．３２７４−３２８７
【非特許文献１２】Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５、２００３年、ｐ．６１３４−６１３９
【非特許文献１３】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１２、２００２年、ｐ．１９７７−１９８０
【非特許文献１４】Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５、２００３年、ｐ．９６３８−９６４６
【非特許文献１５】ＳｅｅｌａおよびＤｅｂｅｌａｋ、Ｎｕｄｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｄｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ，２０、２００１年、ｐ．５７７−５８５
【非特許文献１６】ＳｅｅｌａおよびＤｅｂｅｌａｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８、２０００年、ｐ．３２２４−３２３２
【非特許文献１７】Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．，Ａｃｔａ，６９、１９８６年、ｐ．１６０２−１６１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それゆえに、第２のＳＮＰのプローブ長の中に配置される目的の第１のＳＮＰを識別可能なプライマー／プローブおよびこのようなプライマー／プローブを設計し用いるための方法が必要とされる。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面では、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記多型のそれぞれが前記標的核酸のプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的核酸を含むサンプルと前記標的配列の前記プローブ領域に隣接するかまたはそれと重複する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、重合する酵素、ヌクレオチド基質および下式：
【００１３】
【化９】
【００１４】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有するオリゴヌクレオチド結合体を混合して混合物を提供する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；
（ｂ）前記混合物を重合に有利な条件下でインキュベートする工程；および
（ｃ）前記増幅された標的に対する結合体ハイブリダイゼーションの際に生成される蛍光をモニタリングすることによって前記増幅を連続的にモニタリングする工程と
を含む、方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上記プローブは下式を有する。
【００１６】
【化１０】
【００１７】
〔式中、Ｍ、Ｗ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｆｌ、ｔおよびｎは上に提供される意味を有し、Ａｒ１およびＡｒ２は置換芳香環であり、典型的には置換ベンゼン環であり、置換基は、以下のアリール基について一般的に提供されるものから選択され、さらに、Ａｒ２は、アリールアゾ基またはスチリル基で置換され、さらに拡張されたビスアゾ色素またはそれらのアナログを提供することができる。〕モノアゾおよびビスアゾ色素について好ましい置換基は以下に提供される。
【００１８】
なおさらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、下式を有するオリゴヌクレオチドプローブ／結合体を使用する。
【００１９】
【化１１】
【００２０】
〔式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、記号Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ＯＲｇ、Ｎ（Ｒｇ）２、Ｎ＋（Ｒｇ）３、ＳＲｇ、ＣＯＲｇ、ＣＯ２Ｒｇ、ＣＯＮ（Ｒｇ）２、（ＣＨ２）ｍＳＯ３−、（ＣＨ２）ｍＣＯ２−、（ＣＨ２）ｍＯＰＯ３−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣＯ２−およびそれらのエステルおよびそれらの塩から選択される置換基をあらわし、各Ｒｇは独立してＨまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、添字ｍは０〜６の整数である。記号ＲｈはＨであるかまたはＣ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３０個の原子を有し、環状、非環状またはそれらの組み合わせのいずれかであり、利用可能な価数を満たすさらなる水素原子を有する基（典型的には、固相合成で使用される連結基の痕跡部分）を表す〕。
【００２１】
なおさらに好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は下式を有する。
【００２２】
【化１２】
【００２３】
〔式中、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂ、Ｒａ〜Ｒｈおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、記号Ｒ０、Ｒ１およびＲ２はＨであるかまたは好ましくは電子吸引基（電子を吸引するとは、水素原子よりも電気陰性度が高い基を指し、例えば、ニトロ、シアノ、アセチルなどであり、Ｒ０、Ｒ１およびＲ２のうち１つは、拡張されたアリールアゾまたはスチリルアゾ部分をあらわすことができる）であり、記号Ｒ３およびＲ４はＨをあらわすかまたは好ましくは電子供与基（電子を供与するとは、水素原子よりも電気的に陽性な基を指し、例えば、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノなどである）である。〕ビスアゾ色素または拡張系（例えば、Ｒ０が−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ３または−ＣＨ＝ＣＨ−Ａｒ３）である実施形態について、末端芳香環（Ａｒ３）は置換されていないかまたは好ましくは電子吸引置換基で置換されており、Ａｒ１およびＡｒ２環は置換されていないかまたは好ましくは電子供与置換基で置換されている。特に好ましい実施形態では、Ｗは−（ＣＨ２）３Ｎ（−）−（ＣＨ２）３−であり；Ｒ０＝ＮＯ２であり；Ｒ１＝Ｃｌであり；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり；Ｋは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンリンカーである。１つの実施形態では、ＭおよびＦｌはそれぞれ独立して、プローブの５’末端または３’末端のいずれかに結合することができる。
【００２４】
関連する方法は、以下の「詳細な記載」に提供され、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体の使用のために、関連するアッセイの間にマスキングされるＳＮＰの部位に入り交ざった塩基を有する。サンプル中で野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドを識別する方法が記載され、この標的は、識別されるＳＮＰと識別されないＳＮＰとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
（定義および略語）
以下の略語が、明細書中で使用される：Ｍ＝「マイナーグルーブバインダー」、ＭＧＢＴＭリガンドは、置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）であり；Ｆｌ＝「蛍光ラベル」または「フルオロフォア」であり；Ｑ＝「クエンチャー」であり；ＣＰＧ＝「制御細孔ガラス」（固体支持体の一例として）であり；およびＯＤＮ＝「オリゴヌクレオチド」部分または分子である。
【００２６】
特定の式において、基［Ａ−Ｂ］は、複数の塩基（Ｂ）を有し、かつ複数の糖、改変糖またはアミノ酸（Ａ）の骨格に沿って結合する、オリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチドまたはペプチド−核酸中のモノマー単位を指すために使用される。Ｂは、通常の塩基および改変塩基（適切な場合、普遍的な塩基または入り交ざった塩基を含む）を指す。
【００２７】
用語「プローブ」および「結合体」は、相互交換可能に使用され、結合したマイナーグルーブバインダー、フルオロフォアおよびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドを指す。
【００２８】
用語「普遍的な塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」は、それらの間がほとんど識別できない天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のそれぞれと「塩基対」を形成する塩基アナログを指す。
【００２９】
用語「入り交ざった（無差別な）塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ（ｉｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ）ｂａｓｅ）」は、完全に相補性のマッチする塩基に加えて、それらの間がほとんど識別できないＤＮＡまたはＲＮＡ中の２個以上の天然のミスマッチの塩基と２個の水素結合を形成する天然塩基または天然塩基アナログを指す。
【００３０】
用語「蛍光ラベル」または「フルオロフォア」は、約４００〜９００ｎｍに最大の蛍光発光を有する化合物を指す。これらの化合物としては（括弧中に最大発光（ｎｍ）を示す）、Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＧＦＰ（赤色にシフト）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ（Ｒ）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｒ）（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ（Ｒ）−３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）が挙げられる。
【００３１】
用語「リンカー」は、分子の種々の部分を整列させるかまたは固体支持体に分子（またはそれらの部分）を共有結合するために使用される部分を指す。典型的には、リンカーまたは連結基は、本発明において記載され使用されるリガンドまたは結合体の成分中の官能基（例えば、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、マイナーグルーブバインダーまたはクエンチャー）と相互作用し、共有結合を形成するために使用される官能基を有する。連結基上の官能基（他の成分と相互作用する前）の例としては、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＯＨまたは−ＳＨが挙げられる。連結基はさらに、結合体に対して他の基（例えば、ホスホラミダイト部分など）に接続する分子の一部分である。さらに、リンカーは、直鎖または非環状部分、環状部分、芳香族環またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００３２】
用語「固体支持体」は、オリゴヌクレオチド合成と適合性の任意の支持体を指し、例えば、ガラス、制御細孔ガラス、重合性物質、ポリスチレン、ビーズ、コーティングされたガラスなどが挙げられる。
【００３３】
用語「アルキル」は、接頭部に示される数の炭素原子を有する、直鎖、分枝または環状の飽和一価炭化水素基または環状および直鎖または分枝の飽和一価炭化水素基の組み合わせを指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチルなどを含むことを意味する。本願明細書中の定義のそれぞれ（例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アラルキルオキシ）について、アルキル部分の主鎖の炭素原子の数を示すために接頭部が含まれない場合、基またはそれらの一部分は、８個以下の主鎖炭素原子を有する。「ヘテロアルキル」基（「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」基を含む）について、この用語は、１個または２個の炭素原子がＯ、Ｎ、ＮＨまたはＳによって交換されたアルキル基を含むことを意味し、この理解で、ヘテロ原子がアルキル鎖の内部の位置を占める（すなわち、分子の残りに対する結合点を形成せず、アルキル基の末端ではない）。結果として、ヘテロアルキル基は、少なくとも２個の炭素原子を存在させ、指定された炭素原子の数は炭素原子に対するもののみである。
【００３４】
用語「アルキレン」は、接頭部に示される数の炭素原子を有する、直鎖の飽和二価炭化水素基または分枝飽和二価炭化水素基を意味する。例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、２−メチルプロピレン、ペンチレンなどを含むことを意味する。
【００３５】
用語「アリール」は、置換されていないかまたは独立して以下に提供される基から選択される１〜４個の置換基、好ましくは１個、２個または３個の置換基で置換された、一価または二価（例えばアリーレン）の単環式または二環式の５〜１０個の環原子を有する芳香族炭化水素基を意味する。用語「アリール」はさらに、芳香族性を保持しつつ１個以上のヘテロ原子およびヘテロ原子官能基が環炭素と交換された上述の基（例えば、ピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニルなど）を含むことを意味する。より特定的には、アリールとの用語は、限定されないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、チエニルおよびベンゾチアゾリルおよびそれらの置換形態を含む。
【００３６】
アリール基についての置換基はさまざまであり、芳香族環上で０個から空いた価数の全体数まで範囲において、以下から選択される：−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’”、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシおよびペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル；ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は、独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルおよび（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される。本発明のいくつかの実施形態では、アリール置換基は、示されるとおり、アリールアゾ基（−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ）またはスチリル基（−ＣＨ＝ＣＨ−Ａｒ）である。
【００３７】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−の置換基で場合により交換されてもよく、ここで、ＴおよびＵは独立して−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、ｑは０〜２の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で場合により交換されてもよく、ここで、ＡおよびＢは独立して−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜３の整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合のうち１つは、二重結合で場合により交換されてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つは、式−（ＣＨ２）Ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔの置換基で場合により交換されてもよく、ここで、ｓおよびｔは独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、水素または非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。なおさらに、アリール環（以下のＡｒ１およびＡｒ２）のうち１つは、芳香族系の共鳴能力を拡張するために、直接的にまたは例えば−（ＣＲ’＝ＣＲ’）ｎ−および−（Ｃ≡Ｃ）ｎ−（ここでｎは０〜５である）のような基を介して間接的に別の置換アリール基でさらに置換されることができ、波長吸収の最大値が増加する。
【００３８】
添字「ハロ」および用語「ハロゲン」は、置換基を記載するために使用される場合、−Ｆ、―Ｃｌ、―Ｂｒおよび−Ｉを指す。
【００３９】
本発明の特定の化合物またはオリゴヌクレオチドは、塩形態で存在してもよい。このような塩としては、塩基付加塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノまたはマグネシウムの塩または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物または改変オリゴヌクレオチドは、比較的塩基性の官能基を含有し、酸付加塩は、ニートまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、このような化合物の中性形態と十分な量の所望の酸とを接触させることによって得ることができる。受容可能な酸付加塩の例としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素塩、リン酸、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、硫酸、硫酸一水素塩、ヨウ化水素酸またはホスホン酸などから誘導される塩および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などから誘導される塩が挙げられる。さらに、アミノ酸の塩（例えばアルギネートなど）および有機酸（例えば、グルクロン酸またはガラクツロン酸など）の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７７，６６，１−１９を参照）。本発明の特定の化合物は、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換され得る塩基性官能基および酸性官能基の両方を含む。
【００４０】
上記化合物の中性形態は、上記の塩と塩基または酸とを接触させ、親化合物を従来の様式で単離することによって再生してもよい。上記化合物の親形態は、特定の物理的性質、例えば極性溶媒中の溶解度において種々の塩とは異なるが、それ以外では、上記塩は本発明の目的のための親化合物と等価である。
【００４１】
本発明の特定の化合物は、非溶媒化形態および溶媒化形態（水和形態を含む）で存在することができる。概して、溶媒化形態は、非溶媒化形態と等価であり、本発明の範囲内に包含されることが意図される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶またはアモルファス形態で存在してもよい。概して、全ての物理的形態は、本発明によって考察される用途のために等価であり、本発明の範囲内であることが意図される。本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を保有し；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体はすべて、本発明の範囲内に包含されることが意図される。立体化学の決定および異性体の分離のための方法は、当該技術分野で周知である（“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｊ． Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２のＣｈａｐｔｅｒ ４の議論を参照）。
【００４２】
本発明の化合物はさらに、このような化合物を構成する１つ以上の原子に非天然の比率で原子同位体を含有してもよい。例えば、上記化合物は、放射性同位体、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）で放射能標識されてもよい。本発明の化合物のすべての同位体改変体は、放射性であってもそうでなくても（例えば、２Ｈ）本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００４３】
「保護基」または「それらの保護形態」は、分子マスク中で反応性基に結合する場合、その反応性を減らすか妨害する原子のグループを指す。保護基の例は、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｏ． Ｆｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｗｉｌｅｙ，２ｎｄ ｅｄ．１９９１）およびＨａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−８（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．１９７１−１９９６）中に見出すことができる。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換トリチル基、アロイルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などが挙げられる。代表的なヒドロキシ基としては、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されたもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテルおよびアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが挙げられる。概して、好ましい保護基は、酸性条件または塩基性条件下で除去可能なものであるかまたは特定の光源を用いることによって除去可能な基（例えば、「光感受性保護基」）である。さらに、適切な保護基の選択は、保護基の組み込みまたは除去は、分子の残りの部分に干渉しないか、さもなければ顕著な影響を与えないように、分子中の他の官能基を考慮してなされる。
【００４４】
上述の定義中の「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続けて記載される事象または状況が起こることが必須ではなく、その記載がその事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「場合によりアルキル基で一置換または二置換されたアリール」は、アルキル基が、必須ではないが、存在してもよいことを意味し、この記載が、アリール基がアルキル基で一置換または二置換される状況およびアリール基がアルキル基で置換されていない状況を含むことを意味する。
【００４５】
本発明の実施は、他に言及されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および改変、生体接合化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝子学、組換えＤＮＡおよび当該技術分野の常識の範囲内の関連分野を使用する。これらの技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７，１９８８，１９８９，１９９０，１９９１，１９９２，１９９３，１９９４，１９９５，１９９６）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００２）；Ｇａｉｔ（ｅｄ．），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照。
【００４６】
用語「ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ」は、概して、５’−ＭＧＢ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌプローブを指す。対照的に、「ＴａｑＭａｎ（Ｒ） ＭＧＢプローブは、３’−ＭＧＢ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌプローブを指す。ＥｃｌｉｐｓｅＴＭおよびＭＧＢＴＭは、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの商標であり；ＴａｑＭａｎ（Ｒ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡの登録商標である。
【００４７】
（一般論）
本発明は、多型のある位置で塩基が置換される場合、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオチドと対になるための類似の安定性を有する、プローブまたはプライマー中で普遍的または入り交ざった塩基を同定し、使用する。第２の多型のある位置にあるプローブ中の塩基の普遍的な塩基を用いた置換（例えば、遺伝子型を特定されることが意図されない）は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ置換の独立したハイブリダイゼーション特性を与える。プローブ中の普遍的な塩基は、本質的に、第２の多型を「目につかない」状態にし、目的の第１の多型の特定の同定を可能にし、標準的な遺伝子型特定ハイブリダイゼーションに基づく方法の使用を可能にする。
【００４８】
本発明はさらに、多型のある位置において塩基で置換される場合、完全にマッチして形成されるものを除く特徴を有し、プローブまたはプライマー中で入り交ざった（無差別な）塩基、天然または天然の塩基アナログを同定し、使用する：
（ａ）ミスマッチの天然Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオチドのいずれかのうち、少なくとも２つ以上と２個の水素結合を形成し、
（ｂ）ミスマッチの天然Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオチドのいずれかのうち２つ以上と対になるための類似の熱力学的性質を有し、最近接物の構造に組み込まれる（−ＢＡ−ＮＰ−ＢＢ−；ここで、ＢＡおよびＢＢは、独立してＧ、Ｃ、ＡまたはＴである）
（ｃ）第２の多型のある位置でプローブ中に生じる塩基の入り交ざった（無差別な）塩基を用いた置換（例えば、遺伝子型特定されることが意図されない）は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ置換の少なくとも２つの独立した塩基対の熱力学的性質を与える。
【００４９】
（実施形態の記載）
（プローブおよび結合体）
本発明の方法は、以下の（ａ）、（ｂ）を含むオリゴヌクレオチドプローブ（またはオリゴヌクレオチド結合体、以下「プローブ／結合体」、「プローブ」または「結合体」と称する）を使用する。
【００５０】
（ａ）プローブ配列長の中で（典型的には野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチド）および少なくとも１つのさらなる一塩基多型を識別するための、目的の第１の一塩基多型を含む標的核酸配列に相補的な核酸配列、
（ｂ）１つ以上のさらなる一塩基多型のそれぞれに対して相補的に対になるために配置される１つ以上の普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基、ここで、上記プローブは、第１の一塩基多型を識別するために使用される。
【００５１】
広範囲に、本方法は、Ｍｔ−Ｑ−［Ａ−Ｂ］ｎ−Ｋ−Ｆｌプローブまたは結合体としてほぼ一般的に記述されるオリゴヌクレオチドプローブ（またはオリゴヌクレオチド結合体、以下「プローブ／結合体」、「プローブ」または「結合体」と称する）を提供する。上に記載されるように、このプローブの線形の記載は、マイナーグルーブバインダーおよびクエンチャーまたは消光剤がオリゴヌクレオチド部分の３’末端または５’末端のいずれかに結合し、フルオロフォアがオリゴヌクレオチド部分の他の末端に結合することを意味する。これらの共有結合した部分のいずれかについて、接続は、直接または連結基を介してのいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、連結基（式Ｉ中のＷおよびＫ）は、インタラクティブ部分（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー）または反応性部分（例えば、標的配列に対するプローブハイブリダイゼーションによって形成されるマイナーグルーブ中で非共有結合的に結合することを意味するマイナーグルーブバインダー）の間を十分に空けることが好ましい。
【００５２】
それゆえに、実施形態の１つのグループでは、プローブまたは結合体は下式を有する：
【００５３】
【化１３】
【００５４】
〔式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり、Ｑは約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｗは連結基であり、Ｋは結合基または連結基であり、Ｆｌは約４００〜８００ｎｍの発光を有するフルオロフォアであり、［Ａ−Ｂ］は核酸オリゴマー中のモノマー単位（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらのいずれかの組み合わせ、改変塩基および糖を有するものを含む）をあらわし、ここで、Ａは糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；Ｂは以下に詳細に記載されるような核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す。］少なくとも１つのＢは、プローブによってマスクされる（または目につかなくされる）ことが意図される一塩基多型の部位で置換された普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基で交換される。さらに特定的には、プローブのオリゴヌクレオチド部分は、目的の標的上の非ＳＮＰ部位に対して相補的な天然塩基または改変塩基の組み合わせを有するように設計される、複数のＳＮＰを含む標的のＳＮＰ部位で少なくとも１つの普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基は、遺伝子型特定のために「マスクされない」標的の１つのＳＮＰに残る。添字ｔは０〜１の整数であり、添字ｎは５〜５０の整数である。
【００５５】
さらに特定的には、Ｋが連結基である場合、一般的にＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉから選択される１〜３０個の主鎖原子（いずれかのペンダント原子または基を含まないが、全ての環原子を含む、連続した線に結合するオリゴヌクレオチド部分とＦｌ成分との間の原子のみを数える）を有する。連結基Ｗは、一般的に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉから選択される、約１００個までの主鎖原子を有する三価のリンカーをあらわす。さらに、Ｗは、分枝の脂肪族鎖、ヘテロアルキル鎖、１つ以上の置換された環構造またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｗは、三価部分、例えば、ペンダントの官能基化連結基を有するかまたは有さないアミノ基をあらわし、Ｑ−Ｗは、例えば、商業的な供給源（以下のクエンチャーの表３を参照）由来のクエンチャーを表す。それゆえに、Ｗが連結基として提供される場合、いくつかの実施形態では、これは、Ｑの一部分とみなされ得るアミノ基である。連結基のそれぞれおよび他の成分は、以下にさらに詳細に議論される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドプローブは下式を有する：
【００５７】
【化１４】
【００５８】
〔式中、Ｍ、Ｗ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｆｌ、ｔおよびｎは上に提供される意味を有し、Ａｒ１およびＡｒ２は置換された芳香族環、典型的には置換されたベンゼン環である〕概して、Ａｒ１は、置換されていないかまたは電子供与基である基（例えば、水素と比較して電気的に陽性を有する基、例えば、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノなど）で置換される。同様に、Ａｒ２は、好ましくは、置換されていないか、１個、２個または３個の電子吸引基（例えば、ニトロ、シアノ、ハロゲン、アシルなど）で置換されている。いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、式−Ｕ＝Ｕ−Ａｒ３を有する基で置換され、ここで、Ａｒ３は、アリールまたはヘテロアリール部分であり、好ましくは、０〜３個の電子吸引基を置換基として有するベンゼン環であり、各ＵはＮまたはＣＨである。後者のグループの実施形態では、Ａｒ３が電子吸引基で置換されている場合、Ａｒ１およびＡｒ２のそれぞれは、独立して、置換されていないかまたは電子供与基で置換されている。
【００５９】
式ＩＩの他の好ましい実施形態では、記号Ａｒ１は、１個以上の電子供与基（例えば、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノなど）で置換されたアリール基（好ましくはベンゼン環）を表し、Ａｒ２は、１個以上の電子吸引基、例えば、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホニル、ハロゲンなどで置換されたアリール基（例えばベンゼン環）を表す。
【００６０】
なお他の好ましい実施形態では、Ａｒ２は、式−Ｕ＝Ｕ−Ａｒ３を有する基で置換され、ここで、各Ｕは、独立して、ＣＨ、Ｃ（Ｒ）およびＮから選択され、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基であり、Ａｒ３は、置換または非置換アリール基である。Ａｒ１、Ａｒ２およびＡｒ３のそれぞれについての好ましいアリール基はフェニル基である。この基の好ましい実施形態の中で、Ａｒ１およびＡｒ２は、好ましくは、置換されていないかまたは好ましくは電子供与基（水素原子に対して）で置換されたフェニレンであり、一方、Ａｒ３は、フェニル、好ましくは、置換されていないかまたは電子吸引基（水素原子に対して）で置換されたフェニルである。
【００６１】
なおさらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、下式を有するオリゴヌクレオチドプローブ／結合体を使用する：
【００６２】
【化１５】
【００６３】
〔式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、ここで、記号Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ＯＲｇ、Ｎ（Ｒｇ）２、Ｎ＋（Ｒｇ）３、ＳＲｇ、ＣＯＲｇ、ＣＯ２Ｒｇ、ＣＯＮ（Ｒｇ）２、（ＣＨ２）ｍＳＯ３−、（ＣＨ２）ｍＣＯ２−、（ＣＨ２）ｍＯＰＯ３−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣＯ２−およびそれらのエステルおよび塩から選択される置換基をあらわし、各Ｒｇは独立して、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、添字ｍは０〜６の整数である。記号Ｒｈは、Ｈまたは環状、非環状またはそれらの組み合わせのいずれかであり、利用可能な価数を満たすようにさらなる水素原子を有する、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３０個の原子を有する基（典型的には、固相合成において使用される連結基の痕跡部分）を表す］。
【００６４】
なおさらに好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は下式を有する：
【００６５】
【化１６】
【００６６】
（式中、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび添字ｎは上に提供される意味を有し、記号Ｒ０、Ｒ１およびＲ２はＨであるかまたは電子吸引基（電子を吸引するとは、水素原子よりも電気陰性度が高い基を指し、例えば、ニトロ、シアノ、アセチルなどである）であり、記号Ｒ３およびＲ４はＨを表すかまたは電子供与基（電子を供与するとは、水素原子よりも電気的に陽性な基を指し、例えば、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノなどである）である。）特に好ましい実施形態では、Ｗは−（ＣＨ２）３Ｎ（−）−（ＣＨ２）３−であり；Ｒ０＝ＮＯ２であり；Ｒ１＝Ｃｌであり；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり；およびＫは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンリンカーである。１つの実施形態では、ＭおよびＦｌはそれぞれ独立して、プローブの５’−末端または３’−末端のいずれかに結合することができる。
【００６７】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれについての特定の実施形態では、リンカーＫは、プローブ／結合体について特定の蛍光向上を提供するために選択され、プローブのオリゴヌクレオチド部分の長さに依存する。従って、１８以上のヌクレオチドを有するプローブ（改変ヌクレオチドまたはアナログを含む）について、Ｋは、結合または約２０原子長までの連結基であることができる。さらに特定的には、Ｋは、ポリアルキレングリコールリンカーまたはリボースまたはデオキシリボースリンカーである（以下にさらに詳細に議論される）。特に好ましい実施形態では、Ｋは、ポリアルキレングリコールリンカー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリブチレングリコールリンカーである。最も好ましいのは、商業的な供給源から得ることができるポリエチレングリコールおよび官能化ポリエチレングリコールリンカーである。
【００６８】
他の好ましいプローブまたは結合体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれにおけるものであり、ここで、ＯＤＮ部分は、３つ以上の保存的グアニン塩基を有するように選択され、このグアニン塩基の少なくとも１つが、改変塩基、好ましくはＰＰＧと交換される。他の実施形態では、ＯＤＮ部分は、ＲＮＡ、キメラ、ＰＮＡまたはロックト核酸である。
【００６９】
なお他の好ましいプローブまたは結合体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれにおけるものであり、ここで、ＯＤＮ部分は、目的の多型および２０塩基以内の少なくとも１つのさらなる多型を有する標的配列に対して相補的であるように選択され、ここで、さらなる多型に関与するさらなる塩基は、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基で置換される。なおさらに好ましくは、ＯＤＮ部分は、ＲＮＡ、キメラ、ＰＮＡまたはロックト核酸である。
【００７０】
なお他の好ましいプローブまたは結合体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂおよびＩＶのそれぞれにおけるものであり、ここで、ＯＤＮ部分は、３０％以上のＡおよびＴ塩基を有する標的配列に対して相補的であるように選択され、ここで、ＯＤＮは、少なくとも約３℃の二本鎖（プローブ／標的ハイブリッド）の安定性を増加させるのに十分な少なくとも１つの改変塩基および目的の多型および２０塩基以内の少なくとも１つのさらなる多型を含有し、ここで、さらなる多型に関与するさらなる塩基は、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基で置換される。より好ましくは、ＯＤＮ部分は、５０％以上のＡおよびＴ塩基を有する標的配列に対して相補的であるように選択され、ここで、ＯＤＮは、少なくとも約５℃の二本鎖（プローブ／標的ハイブリッド）の安定性を増加させるのに十分な少なくとも１つの改変塩基を含む。なおさらに好ましくは、ＯＤＮ部分は、ＲＮＡ、キメラ、ＰＮＡまたはロックト核酸である。
【００７１】
本発明のプローブおよび結合体は、一般的には、当業者に既知の固相法を用いて調製される。アセンブリは、例えば、ＯＤＮモノマー、フルオロフォア、クエンチャーおよびマイナーグルーブバインダーをカップリングするための適切なホスホラミダイト試薬を用いて、５’→３’方向または３’→５’方向のいずれかで行うことができる。アセンブリのための他の方法としては、例えば、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合などを調製するための周知の官能基縮合が挙げられる。概して、出発物質は市販であるかまたは例えば、Ｍａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ−Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９２）に記載されるような適切な官能基操作を用いて市販の出発物質から直接的な様式で調製することができる。
【００７２】
本発明のプローブ／結合体についてのさらなる一般的な条件に戻り、以下の議論は、本発明において使用可能なオリゴヌクレオチド、普遍的な塩基、入り交ざった（無差別な）塩基、改変塩基、消光剤またはクエンチャー、マイナーグルーブバインダー、フルオロフォアおよび連結基の種類を説明する。
【００７３】
（オリゴヌクレオチドおよび改変オリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸との用語は、改変または非天然に生じるヌクレオチドを含むポリマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡ（またはその両方）の一本鎖または二本鎖ポリマーを指すためにまたは限定されないが、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）；ｂｉｃｙｃｌｏ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ（Ｂｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：４６６０−４６６７（１９９６））によって開示されるペプチド核酸および関連する構造を含むＤＮＡまたはＲＮＡに対して安定な塩基対を形成可能な任意の他の種類のポリマーを指すために相互変換可能に使用される。本発明の結合体について、場合により、マイナーグルーブバインダー部分および／または消光剤は、オリゴマーの５’または３’末端に結合し、フルオロフォアまたは蛍光ラベルは、このオリゴマーの非置換末端または内部部分に結合する。
【００７４】
本発明において好ましいのは、一本鎖であり、５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは３０ヌクレオチド以下、最も好ましくは２０ヌクレオチド以下（最も低い制限は約５ヌクレオチド）の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００７５】
重要なことに、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、マスクされるかまたは「目につかなく」される普遍的または入り交ざった塩基をＳＮＰ部位に含有し、プローブは、プローブによってマスクされない第１の多型の存在を同定することができる。
【００７６】
（普遍的塩基および変性塩基）
場合によりマイナーグルーブバインダーを有するフルオロフォア／クエンチャー対を含むオリゴヌクレオチド結合体は、少なくとも１つの普遍的な塩基を含有し、天然に生じる塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルに加えて、１つ以上の改変塩基を含んでもよい。
【００７７】
本発明において使用するための最も好ましい普遍的な塩基としては、ポリマー骨格上の２位に共有結合した非置換および置換ピラゾロピリミジン、より特定的には、グアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（４０）、アデニンアナログ４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３８）および２Ｈ−イソキノリン−１−オン（２５）、６−メチル−２−イソキノリン−１−オン（４１）および８−メチル−２−イソキノリン−１−オン（４２）が挙げられる。塩基アナログは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ミスマッチ識別および特定の遺伝子型特定を改良する。天然に存在する塩基、改変塩基および塩基アナログの全ての互変異性体形態は、本発明のオリゴヌクレオチド結合体中に含まれてもよい。本発明において有用な他の普遍的な塩基としては、表１に列挙される化合物が挙げられる。
【００７８】
（表１）
【００７９】
【表１−１】
【００８０】
【表１−２】
【００８１】
【表１−３】
【００８２】
（入り交ざった（無差別な）塩基）
本発明において使用するための最も好ましい入り交ざった（無差別な）塩基としては、ポリマー骨格上の１位に共有結合した非置換および置換ピラゾロピリミジン、より特定的には、グアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（４９）、置換６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンアナログ、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（５０）および置換１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミンアナログが挙げられる。本発明において有用な他の入り交ざった（無差別な）塩基としては、表２に列挙される化合物が挙げられる。
【００８３】
（表２）
【００８４】
【表２】
【００８５】
別の実施形態では、上記構造に基づく普遍的および入り交ざった（無差別な）塩基が考察される。１つ以上の置換基は、環構造のそれぞれの中に導入されてもよく、置換基としては、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２が挙げられ得、さらに、脂肪族部分（例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル部分）が、１つまたは２つのヒドロキシ、アミノまたはハロゲン原子でさらに置換された置換基が挙げられる。普遍的な塩基は、当該技術分野で既知の方法によって合成することができる（Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７−２４４７（２００１）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２：７６２１−７６３２（２０００）およびＳｅｅｌａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：３２２４−３２３２（２００１）。入り交ざった（無差別な）塩基は、既知の方法によって合成することができる（国際公開番号０１／６４９５８；国際公開番号０３／０２２８５９；および欧州特許第０６２４１６１号を参照）。
【００８６】
好ましい実施形態の１つのグループでは、ピラゾロピリミジンの入り交ざった（無差別な）塩基は、下式を有する
【００８７】
【化１７】
【００８８】
〔式中、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙおよびＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ、アミノまたはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す〕
実施形態の別のグループでは、４９および５０の塩基性環構造の炭素原子の１つ以上がＮによって置換されている。これらの化合物の合成は、当該技術分野において開示されている（例えば、Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．，６：３６９−３７８（２０００）；およびＨｕｔｚｅｎｌａｕｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５：８７９−８８３（１９７２）を参照）。
【００８９】
（改変塩基）
改変塩基は、１つ以上の官能基の付加または欠失、へテロ環構造中の違い（すなわち、特に、炭素をヘテロ原子で置換）および／または１つ以上のリンカーアーム構造の塩基への結合によって天然に生じる塩基とは異なるものであると考えられる。好ましい改変ヌクレオチドは、ピリミジン構造またはプリン構造に基づくものであり、後者でさらに好ましいのは、７−デアザプリンおよびそれらの誘導体およびピラゾロピリミジンである（ＰＣＴ国際公開番号９０／１４３５３および米国特許第６，１２７，１２１号に記載（これらの両方は、本願明細書中に参考として援用される））。
【００９０】
種々の改変塩基は、本発明において正常塩基と交換するために使用することができる。改変塩基の利点は他の部分に記載されている。重要なことに、改変塩基は、ＳＮＰ部位ではない位置で使用することができる。しかし、改変塩基の完全なリストは、普遍的または入り交ざった塩基としても特徴付けられるいくつかの塩基を含む。従って、本発明は、プローブが普遍的な塩基または入り交ざった塩基をＳＮＰ部位に有し、マスクされるか目につかなくされるが、プローブ中の他の部位に改変塩基を任意に有してもよいことを提供する。本発明において使用するための最も好ましい改変塩基としては、グアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＧまたはＰＰＧ、またＳｕｐｅｒ Ｇ）、アデニンアナログ４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ｐｐＡまたはＰＰＡ）および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ジピリミジン−５，７−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡ）が挙げられる。キサンチンアナログ１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（ｐｐＸ）も使用することができる。これらの塩基アナログは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ハイブリダイゼーションを強め、ミスマッチ識別を向上する。天然に存在する塩基、改変塩基および塩基アナログのすべての互変異性体は、本発明のオリゴヌクレオチド結合体に含まれ得る。本発明において有用な他の改変塩基としては、６−アミノ−３−プロパ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＨＯＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−アミノプロパ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＮＨ２ＰＰＰＧ；４−アミノ−３−（プロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＨＯＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−アミノプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＮＨ２ＰＰＰＡ；３−プロパ−１−イニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミノ、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡ；２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡＯＨ；３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡＮＨ２；５−プロパ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＰＵ；５−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＨＯＰＵ；６−アミノ−５−プロパ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＰＣ；６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＨＯＰＣ；および６−アミノ−５−（３−アミノプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＮＨ２ＰＣ；５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、ＣＨ３ＯＰＰＰＡ；６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロパ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＣＨ３ＯＰＰＰＧ；４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブタ−３−イル−１−オール、Ｓｕｐｅｒ Ａ；６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブタ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；５−（４−ヒドロキシ−ブタ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＢｒ）；３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＣｌ）；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＢｒ）；および３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＣｌ）が挙げられる。
【００９１】
上述の改変塩基に加えて、オリゴヌクレオチドは、糖またはグリコシド部分の骨格、好ましくは、２−デオキシリボフラノシドを有することができ、全てのヌクレオチド間結合は天然に生じるホスホジエステル結合である。しかし、代替の実施形態では、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース基は、他の糖、例えば、β−Ｄ−リボフラノースで交換される。それに加えて、β−Ｄ−リボフラノースが存在してもよく、ここで、リボース部分の２−ＯＨは、Ｃ１〜６アルキル基でアルキル化される（２−（Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）リボース）かまたはＣ２〜６アルケニル基でアルケニル化される（２−（Ｏ−Ｃ２〜６アルケニル）リボース）か、フルオロ基によって交換される（２−フルオロリボース）。本発明において有用なオリゴマー形成糖は、「ロックされて」おり、すなわち、Ｃ−４’とＣ−２’の酸素原子との間にメチレン架橋を含む。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと適合性の他の糖部分もさらに使用可能であり、当業者に既知であり、限定されないが、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２’−デオキシリボフラノシドまたは２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドが挙げられる。α−Ｄ−アラビノフラノシドと含むオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１７７，１９６号に記載され、この内容は本願明細書中に参考として援用される。２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６６１−２６６８（１９９５）に記載される。ロックト核酸のための合成手順（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｒｎ．，４５５−４５６（１９９８）；Ｗｅｎｇｅｌ Ｊ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２：３０１−３１０（１９９８））および２’−ハロゲン−２’−デオキシリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドのための合成手順（Ｐａｌｉｓｓａ ｅｔ ａｌ，Ｚ．Ｃｈｅｍ．２７：２１６（１９８７））もまた記載されている。本願明細書中に記載される改変オリゴヌクレオチドのホスフェート骨格はさらに、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合および／またはメチルホスホネートおよび／またはホスホロアミデートを含むように改変するもできる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６６２−２６６８（１９９５））。オリゴヌクレオチドの組み合わせはさらに、本発明の範囲内である。なお他の骨格改変は、当業者に既知である。
【００９２】
実施形態の１つのグループでは、ピラゾロピリミジンは、ポリマー骨格に対して通常３−位の代わりに２−位から置換される（化合物３８〜４０）。
【００９３】
実施形態の別のグループでは、本願明細書中に記載される改変塩基は、Ｔｍを調整するためにＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡに組み込まれ、改良されたミスマッチ識別を有する改変オリゴヌクレオチドを提供する。ＤＮＡおよびＤＮＡアナログの種々の改変形態は、プローブおよびプライマーとしてＤＮＡ分子の使用の欠点のうちいくつかを克服する企てにおいて使用されている。これらの中で、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ポリアミド核酸としても知られる）がある。Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）。ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡに特徴的な糖−リン酸骨格の変わりにポリアミド骨格によって結合する、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に見出されるようなヘテロ環塩基単位を含む。ＰＮＡは、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列に対してハイブリダイゼーション可能であり、実際に、対応する核酸プローブよりも強力にハイブリダイズする。ＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡオリゴマーの合成において使用される反応性モノマーの合成は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；同第５，７７３，５７１号；同第５，７３６，３３６号および同第５，７６６，８５５号に記載されており、これらそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される。ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ合成およびＰＮＡ合成のためのモノマーに対する代替的なアプローチがまとめられている。Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）。従って、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラのＴｍを調整するための、正常な塩基、非置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えば、ＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、改変プリン、改変ピリミジン、５−置換ピリミジン、普遍的および入り交ざった（無差別な）塩基、糖改変物、骨格改変物またはマイナーグルーブバインダーのいずれかの組み合わせの使用は、本発明の範囲内である。核酸、ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成に必要とされる改変塩基モノマー単位を合成するために必要な合成方法は当該技術分野で入手可能であり、本願明細書およびＵｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）を参照。
【００９４】
本願明細書中に記載される用途についておよび上述のように、オリゴヌクレオチドおよび改変オリゴヌクレオチドは、好ましくは５〜１００塩基、より典型的には５〜５０塩基または５〜３０塩基、通常は５〜２０塩基を有する。いくつかの実施形態では、プローブ／結合体のオリゴヌクレオチド部分は、５〜１５塩基を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド部分は、１つ以上の普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基に加えて、１つ以上の改変塩基を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰを「マスクする」ために設計された部位に少なくとも１つの普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基を含む、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０塩基または改変塩基を有する。
【００９５】
それらの熱力学的性質に基づき、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基、改変塩基、マイナーグルーブバインダー、フルオロフォアおよび／またはクエンチャーの使用または組み込みを直接用い得るアルゴリズムを用いて予測可能な様式でプローブおよびプライマーを設計する能力は、同時継続出願番号第１０／０３２，３０７号（２００１年１２月２１日出願、本願明細書中に参考として援用される）に記載されている。従って、核酸、ＰＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラとのハイブリッド産物のＴｍ（例えば、約５〜８℃）を調整するための、正常な塩基、非置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えば、ＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、改変プリン、改変ピリミジン、５−置換ピリミジン、普遍的および入り交ざった（無差別な）塩基、糖改変物、骨格改変物またはマイナーグルーブバインダーのいずれかの組み合わせの使用は、本発明によって考察される。さらに、入り交ざった塩基または普遍的な塩基のプライマー中での使用は、可変配列（例えば、ＨＩＶ変異、密接して関連する種、など）を用いた普遍的な増幅のために本願明細書中で記載される方法のそれぞれの適用を容易にする。さらに、核酸標的を検出するための直接的またはリガンド（例えばビオチン）を介して間接的に標識されたプライマーの使用は、当該技術分野で周知である。さらに、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、プローブの非存在下であっても、突然変異を検出するのに有用である（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２８：３７５２−３７６１（２０００）を参照）。
【００９６】
（新規な普遍的な塩基）
多くの新規な普遍的な塩基は、当該技術分野で既知の合成方法を用いて、反応スキーム１に概説されるように調製することができる。反応スキーム１において、Ｔｏｌはｐ−トリル基であり、ＤＭＴはジメトキシトリチル基であり、ＣＥＰはシアノエチル−ジイシプロピルホスホラミダイト基であり、Ｒは−（ＣＨ２）ｎＸであり、ここで、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＮであり、ｎは１〜６の整数である。
【００９７】
（反応スキーム１）
【００９８】
【化１８】
【００９９】
イソキノリン−１（２Ｈ）−オンに基づく普遍的な塩基を合成するためのスキームは、反応スキーム２および３に示される。５’−ホスホラミダイトアナログは、既知の普遍的な塩基２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−６−メチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（４１）から出発して、最初にジメチルテキシルシリルクロリドと反応させ、次いでジメトキシトリチルクロリドと反応させることによって合成され、３’−ジメトキシトリチル誘導体（５５）が得られた（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２：７６２１−７６３２（２０００））。ＣＨ２Ｃｌ２中での５５と２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（ＣＥＩＰＤＡ）との反応により、反応スキーム２に示されるように、所望のブロックされた５’−ホスホラミダイト（５６）を得た。
【０１００】
（反応スキーム２）
【０１０１】
【化１９】
【０１０２】
新規な普遍的な塩基ホスホラミダイト（６５）（４８のアナログ）の合成は、反応スキーム３に示される。
【０１０３】
（反応スキーム３）
【０１０４】
【化２０】
【０１０５】
２，４−ジメチルベンズアルデヒド（５７）を、２，２−ジメトキシエチルアミンと反応させ、イミン（５８）を得て、その後、酸処理によって６，８−ジメチルイソキノリン（５９）を得た。ｍ−クロロペルオキシ安息香酸を用いた酸化によりＮ−オキシド（６０）を得て、これを次いで無水酢酸およびＮａＯＨ水溶液と反応させ、６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６１）を得た。クロロ−糖（６２）を用いた（６１）のグリコシル化、次いで脱保護により、ヌクレオシド（６３）を得た。次に、３’−ジメトキシトリチル保護されたヌクレオシド（６４）を（６３）から調製し、標準的な手順によって５’−ホスホラミダイト（６５）に変換した。
【０１０６】
当該技術分野で既知の方法を用いる別の実施形態では、ヌクレオシドアナログ（６３）が３’−ホスホラミダイトアナログに変換可能である。
【０１０７】
（マイナーグルーブバインダー）
マイナーグルーブバインダーオリゴヌクレオチド結合体（または「プローブ」）は、米国特許第６，３１２，８９４に記載される（本願明細書中に参考として援用される）。これらの結合体は、相補ＤＮＡと超安定化された二本鎖を形成する。特に、短いマイナーグルーブバインダープローブの配列特異性は、高温適用（例えばＰＣＲ）に優れている。非常に驚くべきことに、マイナーグルーブに結合するクエンチャー化合物を５’−末端に含有し、フルオロフォアを３’−末端に含むプローブは、蛍光２’−デオキシヌクレオチドを用いるアッセイ法のために特に有用である（米国特許出願番号１０／１６５，４１０、本願明細書中に参考として援用される）。これらのプローブは、相補的な標的に対してハイブリダイゼーションする際に蛍光を発する。５’−ＭＧＢ−クエンチャーグループは、同種増幅の間にＴａｑポリメラーゼによる５’−ヌクレアーゼ消化を妨害することがわかっている。さらに、本願明細書中で記載される５’−ＭＧＢ−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォア（５’−ＭＧＢ−Ｗ−ＯＤＮ−Ｆｌ）プローブは、７桁の等級を有するダイナミックレンジを示し、リアルタイムＰＣＲ増幅反応においてサンプルあたり５複製よりも多い最終的な感度を有する。
【０１０８】
本発明のプローブ／結合体はさらに、任意に、共有結合したマイナーグルーブバインダーを有する。種々の適切なマイナーグルーブバインダーは、文献中に記載されている。例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．米国特許第５，８０１，１５５号（本願明細書中に参考として援用される）；Ｗｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄＤｅｒｖａｎ Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：３５５−３６１（１９９７）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｏｐｋａ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄＧｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４４：３２３−３３４（１９９７）；Ｚｉｍｍｅｒ，Ｃ＆Ｗａｈｎｅｒｔ，Ｕ．Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．４７：３１−１１２（１９８６）およびＲｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．Ｐ．，Ｄｏｎｄｈｉ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄＬｏｗｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，８４：１−１１１（１９９９）を参照。
【０１０９】
本発明のマイナーグルーブバインダー−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォアの結合体は、線状の配置であり得る（式５’−Ｍ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌ−３’によって示唆されるような）かまたはクエンチャー（Ｑ）およびマイナーグルーブバインダー（Ｍ）が連結基に結合してＯＤＮ、ＱおよびＭが接続する分枝状の配置であり得る。さらに、クエンチャーは、マイナーグルーブバインダーの遠位（ＯＤＮに対する結合に対して）末端に結合し得る（例えば、５’−Ｑ−Ｍ−ＯＤＮ−Ｆ１）。線状の省略形（Ｍ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆ１）が使用される場合、それぞれの配置が含まれる。さらに、ＭＧＢおよびＱ部分はそれぞれ、結合が結合体の消光機構と干渉しない限り、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかまたはオリゴヌクレオチドの内部位置に結合することができる。一般的に、このことは、適切な連結基の使用を介して達成することができる（米国特許出願番号１０／１６５，４１０（本願明細書中で参考として援用される））。
【０１１０】
リンカーを介してオリゴヌクレオチドにマイナーグルーブバインダー（および以下に記載されるようなリポーターグループ、例えばフルオロフォアおよびクエンチャー）を接続するための適切な方法は、例えば、米国特許出願第５，５１２，６７７号；同第５，４１９，９６６号；同第５，６９６，２５１号；同第５，５８５，４８１号；同第５，９４２，６１０号および同第５，７３６，６２６号（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１１１】
マイナーグルーブバインダーは、一般的に、適切な連結基を介してオリゴヌクレオチドの３’位または５’位に結合する。５’末端での結合は、ハイブリッド安定性に利点をもたらす（オリゴヌクレオチド二本鎖の融解が末端で開始する）だけではなく、増幅反応中のプローブのヌクレアーゼ消化を減らすおよび／または防ぐ。
【０１１２】
マイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体内のマイナーグルーブバインダーの位置はさらに、このような結合体の識別性能に影響を与え得る。二本鎖の対になっていない領域は、誤って対になっている塩基に隣接した位置でマイナーグルーブの形状を変化させる。完全にマッチしたＤＮＡ二本鎖のマイナーグルーブ内でマイナーグルーブバインダーは最適に適合するため、マイナーグルーブにおける変化を生じるミスマッチは、ミスマッチを含む領域に対するマイナーグルーブバインダーの結合強度を減らす。このようにして、マイナーグルーブバインダーがこのようなハイブリッドを安定化する能力が減少し、それにより、マイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体が完全にマッチした二本鎖からミスマッチを識別する能力を増大させる。一方、ミスマッチがマイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体に対して相補的な領域の外側にある場合、同じ長さの接合していないオリゴヌクレオチドとマイナーグルーブバインダーと接合したオリゴヌクレオチドについての識別能力はほぼ同じであると予想される。オリゴヌクレオチドプローブが一塩基対のミスマッチを識別する能力はその長さに依存するため、より短いオリゴヌクレオチドは、ミスマッチをより効果的に識別する。この内容におけるマイナーグルーブバインダー−オリゴヌクレオチド結合体の使用の主な利点は、マイナーグルーブバインダー接合の安定化効果が増したことにより、従来技術において使用されるものと比較してかなり短いオリゴヌクレオチド（すなわち、２０マー以下、より大きな識別力を有する）を使用することができるという事実にある。
【０１１３】
実施形態の１つのグループでは、マイナーグルーブバインダーは、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュロカルマイシン、ペンタアミダイン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンおよび類似体からなる群より選択される。
【０１１４】
さらに好ましいマイナーグルーブバインダーは、下式から選択されるものである：
【０１１５】
【化２１】
【０１１６】
添字ｍは２〜５の整数であり；添字ｒは２〜１０の整数であり；かつＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して、オリゴヌクレオチドに対する連結基（直接的またはクエンチャーを介して間接的のいずれか）、Ｈ、−ＯＲｃ、−ＮＲｃＲｄ、−ＣＯＯＲｃまたは−ＣＯＮＲｃＲｄであり、ここで、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、Ｈ、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルおよびアリールから選択され、但し、ＲａおよびＲｂのうち１つは、ＯＤＮまたはＱに対する連結基を表す。さらなる実施形態では、それぞれの構造における環のそれぞれは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ＯＲｇ、Ｎ（Ｒｇ）２、Ｎ＋（Ｒｇ）３、ＳＲｇ、ＣＯＲｇ、ＣＯ２Ｒｇ、ＣＯＮ（Ｒｇ）２、（ＣＨ２）ｍＳＯ３−、（ＣＨ２）ｍＣＯ２−、（ＣＨ２）ｍＯＰＯ３−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣＯ２−およびそれらの塩それらのエステルから選択される１つ以上のさらなる置換基を含むことができ、ここで、Ｒｇはそれぞれ独立してＨまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、添字ｍは０〜６の整数である。記号ＲｈはＨであるかまたはＣ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３０個の原子を有し、環状、非環状またはそれらの組み合わせのいずれかであり、利用可能な価数を満たすさらなる水素原子を有する基（典型的には、固相合成で使用される連結基の痕跡部分）を表す。
【０１１７】
特に好ましいマイナーグルーブバインダーとしては、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのトリマー（ＣＤＰＩ３）または置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）、Ｎ−メチルピロール−４−カルボキシ−２−アミドのペンタマー（ＭＦＣ５）およびミスマッチ識別を増加させる他のマイナーグルーブバインダーが挙げられる。本発明の実施における用途が見出されるさらなるマイナーグルーブバインダー部分は、共同で所有する米国特許第５，８０１，１５５号（本願明細書中に参考として援用される）に開示される。特定の実施形態では、マイナーグルーブバインダーは、結合した高水溶性基（例えば、糖、アミノ酸、カルボン酸またはスルホン酸置換基など）を有することができる。米国特許出願番号第０９／６９３，２１３号および同第１０／３０２，６０７号（これら両方は、本願明細書中に参考として援用される）を参照。
【０１１８】
（クエンチャー）
最近開発された検出方法は、蛍光の直接的な検出よりもプローブハイブリダイゼーションを検出するための蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のプロセスを使用する。この種のアッセイにおいて、ＦＲＥＴは、クエンチャー分子の吸収スペクトルがドナーフルオロフォアの発光スペクトルとオーバーラップし、２つの分子が近位に密接している場合に、ドナーフルオロフォア（リポーター）とアクセプター分子（クエンチャー）との間で起こる。ドナーフルオロフォアの励起状態のエネルギーは、共鳴双極子−誘発された双極子の相互作用によって近くのアクセプターに移動し、ドナー蛍光の消光が起こる。アクセプター分子がフルオロフォアである場合、その蛍光はしばしば増大することがある。ドナー分子とアクセプター分子との間のエネルギー転移の効率は、分子間距離に非常に依存する。この関係を記載する式が知られている。Ｆｏｒｓｔｅｒ距離（Ｒ０）は、エネルギー転移が５０％効率であるドナー分子とアクセプター分子との間の距離として記載される。蛍光の消光の他の機構（例えば、衝突および電荷移動による消光）も知られている。クエンチャーとフルオロフォアの対およびオリゴヌクレオチドに対するそれらの結合を選択するために、当該技術分野で広範囲なガイダンスが存在する（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２、さらに、Ｗｅｂ Ｅｄｉｔｉｏｎ ａｔ ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ；米国特許出願第３，９９６，３４５号および同第４，３５１，７６０号（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）。好ましいクエンチャーは、共同で所有する米国特許出願第０９／４５７，６１６号（１９９９年１２月８日出願、本願明細書中に参考として援用される）に記載される。さらに特定的には、以下の表３は、既知の引用される化学反応に基づいて、プローブに組み込まれるための適切な官能基を有する構造に容易に改変可能なクエンチャーの構造（例えば、ＯＤＮおよびマイナーグルーブバインダー部分のための結合部位を有するＱ−Ｗ）を含む。（例えば、Ｔｈｉｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．ｆａｒ ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍｉｅ，３２８：４９７−５１４（１９８６）；米国特許第４，３２４，７２１号および同第４，０５４，５６０号；Ｔｉｍｍ，Ｍｅｌｌｉａｎｄ Ｔｅｘｔｉｌｂｅｒｉｃｈｔｅ，９：１０９０−１０９６（１９６９）；Ｈａｌｌａｓ，Ｊ．Ｓ．Ｄ．Ｃ．２８５−２９４（１９７９）；Ｂｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍ．，２４：１００−１０４（１９６４）；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．３：１７１９−１７２７（１９９７）およびＭｏｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ．，１０２：５８０２−５８０８（１９９８）；Ｈａａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｍｉｎｉｐｒｉｎｔ １０：２７０１−２７３５（１９９８）およびＲｕｇｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２６：８１４−８２６（１９４３）を参照。さらに、共同で所有する係属出願ＵＳ２００３／００９６２５４およびＵＳ２００２／０１５５４８４（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）も参照。種々の位置に異なる組み合わせの置換基を有するさらなる構造（例えば、モノ染料およびビスアゾ色素）は、色素化学の分野で既知の化合物および方法に基づいて調製することができる（ＣＤＤ−ＲＯＭのＣｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ、Ｉｓｓｕｅ ３、ページ４００９−４３２４；Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｙｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ｗｗｗ．ｓｄｃ．ｏｒｇ．ｕｋにまとめられている；さらに、国際公開番号０１／８６００１も参照）。
【０１１９】
（表３）
【０１２０】
【表３−１】
【０１２１】
【表３−２】
【０１２２】
上述のクエンチャーは、約４００〜８００ｎｍの範囲をカバーし、多くのものはＭＧＢに対して結合した場合に改良された消光効果を示す。オリゴヌクレオチドに対してクエンチャーをカップリングするのに使用される好ましい連結基として改変された態様が−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２を示す一方、マイナーグルーブバインダーまたは固体支持体、他の適切なリンカーの例は、当該技術分野で既知であるかまたは本願明細書中に提供される。
【０１２３】
本願明細書中の本発明の局面のそれぞれについての好ましいクエンチャーは、表３中のものおよびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．からのものを含むビスアゾクエンチャー（Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓとして提供される：ＢＨ−１、ＢＨ−２およびＢＨ−３）、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡおよびカルボキシテトラメチルローダミンから選択される。
【０１２４】
（フルオロフォア）
本発明において有用なフルオロフォアは、一般的に、オリゴヌクレオチドプローブの末端５’炭素に対して、好ましくは連結基を介して結合するために誘導体化された蛍光有機色素である。適切なフルオロフォアが、蛍光性であってもなくてもよい典型的には有機色素でもあるクエンチャーと組み合わせて選択されることを当業者は理解する。
【０１２５】
特定のプローブのための適切なフルオロフォア−クエンチャー対を選択するために、文献において利用可能な多くの実用的なガイダンスが存在する。例えば、Ｃｌｅｇｇ（上に引用される）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ（上に引用される）；Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）などを参照。これらの文献はさらに、蛍光性分子および色素産生性（消光性）分子のリストおよびフルオロフォア−クエンチャー対を選択するためのそれらの関連する光学的性質を与える参考文献を含み、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ， ２ＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２、さらに、ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋでのＷｅｂ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）など。さらに、通常の反応基を解した共有結合のためにフルオロフォアおよびクエンチャーを誘導体化するための方法も周知である。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（上に引用される）；Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，３５１，７６０号（これらそれぞれは、本願明細書中で参考として援用される）。
【０１２６】
好ましいフルオロフォアは、キサンタン色素に基づくものであり、これらの種々のものは、リンキング基を介する結合またはオリゴヌクレオチドに対する直接結合のいずれかの結合のために有用な置換基を有して市販されている。蛍光性化合物の他の群は、α−またはβ−位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物に含まれるものは、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートである。他の色素としては、３−フェニル−７−イソシアネートクマリン、アクリジン、例えば、９−イソチオシアネートアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが挙げられる。なお他の適切なフルオロフォアとしては、レゾルフィン色素、ローダミン色素、シアニン色素およびＢＯＤＩＰＹ色素が挙げられる。
【０１２７】
これらの色素およびオリゴヌクレオチドに結合するための適切な結合方法論は多くの参考文献に記載されており、例えば、Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（前出）；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，７：２９９−３０３（１９７５）；Ｍｅｎｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１８８，９３４号；Ｍｅｎｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，欧州特許出願第８７３１０２５６．０号；およびＢｅｒｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５。
【０１２８】
より特定的には、本願明細書中で記載されるフルオロフォアは、例えば、化学的方法または酵素的方法を用いてオリゴヌクレオチド部分に結合することができる。例えば、反応性化学基を特定の部位でオリゴヌクレオチドに組み込むための方法は、当業者に周知である。特定の部位に配置される反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、相補的な反応基に結合した標識と組み合わせることができ（例えば、求核性反応基を含むオリゴヌクレオチドは、求電子性反応基に結合した標識と反応することができ）、化学技術によってプローブに対する標識とカップリングすることができる。例示的な標識および標識をオリゴヌクレオチドに結合するための方法は、例えば、米国特許第５，８２４，７９６号；米国特許第５，２１０，０１５号；Ｋｅｓｓｌｅｒ（ｅｄ．），Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２；Ｋｒｉｃｋａ（ｅｄ．）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９２；およびＨｏｗａｒｄ（ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，１９９３に記載される。オリゴヌクレオチドの非特定的な化学的標識は、オリゴヌクレオチドと、例えばヌクレオチド塩基の特定の官能基と反応する化学物質とを組み合わせ、同時にまたは続けてオリゴヌクレオチドと標識とを反応させることによって達成することができる。例えば、Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：１７７４−１７８１を参照。標識をオリゴヌクレオチドへ酵素的に組み込むことは、酵素的改変または標識された前駆体を用いてオリゴヌクレオチドの重合を行うかまたは既存のオリゴヌクレオチドに対して標識を酵素的に付加することによって達成することができる。例えば、米国特許第５，４４９，７６７号（本願明細書中に参考として援用される）を参照。改変する酵素の例としては、限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。既存のオリゴヌクレオチドに対して標識を付加することができる酵素の例としては、限定されないが、キナーゼ、末端トランスフェラーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼなどが挙げられる。
【０１２９】
本発明の局面のそれぞれについて、好ましいフルオロフォアは、シアニン、キサンテン、ＢＯＤＩＰＹアナログ、５−ＦＡＭＴＭ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥＴＭ、ＨＥＸＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｂｏｔｈｅｌｌ ＢｌｕｅＴＭおよびＹａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗＴＭ（ＹＹ）から選択される。これらのフルオロフォアは、一般的に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡおよびＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡのような商業的な供給源から入手可能である。
【０１３０】
（連結基）
種々の連結基および方法は、フルオロフォア、クエンチャーおよびマイナーグルーブバインダーをオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に結合するために当業者に知られている。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）；Ｇｉｕｓｔｉ ｅｔ ａｌ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）、Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ，米国特許第４，７５７，１４１号；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４，７３９，０４４号；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）などを参照。なお他の市販の連結基は、合成中にオリゴヌクレオチドに結合することができ、使用することができる（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能）。フルオロフォアをオリゴヌクレオチド部分に結合するための他の方法論は、ホスホラミダイト部分で誘導体化された色素を用いることによって固相合成の結果物にホスホラミダイト化学を使用することを含む。例えば、国際公開番号ｏ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，２３１，１９１号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．，米国特許第４，９９７，９２８号；Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ，ＰＣＴ出願第国際公開番号０１／４２５０５号；米国特許出願第０９／８７６，８３０号；米国特許出願第１０／０８４，８１８号；および米国特許出願第１０／０２６，３７４号（これらのそれぞれは、本願明細書中に参考として援用される）を参照。
【０１３１】
多くの一般的な結合方法が利用可能であるが、他の因子（例えば、オリゴヌクレオチド長、マイナーグルーブバインダー、フルオロフォア−クエンチャー対など）と組み合わせて選択がなされる場合、特定の連結基の選択は、本発明の１つの局面を構築する。例えば、本発明において、マイナーグルーブバインダーの使用は、より少ないヌクレオチド塩基を有するプローブの調製を可能にする。概して、約１５塩基よりも少ない塩基を有するプローブは、シグナルが貧弱および／または標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションが貧弱であるため、不安定であると考えられる。さらに、より小さなプローブ（例えば、１５以下の塩基を有するもの）は、クエンチャー／フルオロフォアがしばしば十分に分割できずハイブリダイゼーションの際に適切なシグナルを提供することができないため、ビーコンアッセイでは避けられている。
【０１３２】
本発明において、結合したマイナーグルーブバインダーを有するさらに短いプローブが有用であることが発見され、フルオロフォアとクエンチャーとの間の十分な距離は、適切な連結基を選択することによって得られることが発見された。従って、本発明は、安価でリアルタイムアッセイにおいて有用な新規プローブ／結合体を提供する。
【０１３３】
本発明のプローブおよび結合体は、一般的に、１種類または２種類の連結基を有する。式Ｉに提供されるように、文字Ｋは二価の連結基をあらわし、一方、文字Ｗは三価の連結基をあらわす。特定の連結基は、一般的に、それらの合成容易性、固相合成における装置、プローブ構築および使用の際の安定性およびプローブまたは結合体にそれぞれ付与される物理的パラメーター、例えば、フルオロフォアとクエンチャーとの間に十分な距離を提供すること；またはプローブハイブリダイゼーションの際に形成されるマイナーグルーブとの非共有性相互作用をマイナーグルーブバインダー部分が行うことが可能な適切な長さの限界を提供すること、について選択される。
【０１３４】
より特定的には、Ｋは、プローブ／結合体のフルオロフォアとオリゴヌクレオチド部分との間の直接結合であるかまたはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉから選択される１〜３０個の主鎖原子を有する二価連結基である。適切な連結基の選択は、一般的に、プローブのＯＤＮ長を考慮してなされる。典型的に、ＯＤＮが約１５〜１８ヌクレオチドよりも長い場合により短い連結基を使用することができ、一方、より短いプローブが望ましいおよび／またはより短いプローブが構築される場合、より長い連結基がより有用である。好ましい実施形態の１つのグループでは、Ｋは−（Ｏ−（ＣＨ２）ｐ）ｑから選択され、ここで、添字ｐは２〜１４の整数であり、添字ｑは１〜１０の整数であり、但し、Ｋの全長は約５０原子未満である。好ましくは、Ｋは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−、−（Ｏ（ＣＨ２）１２）−および−（Ｏ（ＣＨ２）１２）２−から選択される。実施形態の別のグループでは、Ｋは、好ましくは下式を有する連結基である：
【０１３５】
【化２２】
【０１３６】
式中、添字ｒは１〜５の整数、好ましくは１または２、最も好ましくは２である。
【０１３７】
三価の連結基Ｗは、ＯＤＮとＱとＭとの適切な結合および可とう性を提供するために、種々の構造を包含することができる。実施形態の１つのグループでは、Ｗは下式を有する三価の官能基である：
【０１３８】
【化２３】
【０１３９】
式中、窒素原子は、モノアゾ色素またはビスアゾ色素（クエンチャー、Ｑ）の芳香族環に直接結合し、典型的にはクエンチャーの一部分であるとみなされ、成分Ａ１およびＡ２は独立して、単結合またはＣ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、ＳｉおよびＯから選択される１〜約５０原子を有するリンキング／スペーサー部分および利用可能な価数を満たすための追加の水素原子から選択される。さらに、Ａ１およびＡ２はそれぞれ、環状成分、非環状（直鎖または分枝）成分またはそれらの組み合わせを有することができる。
【０１４０】
（使用方法）
本発明のプローブ／結合体は、既存のプローブおよび結合体と比べて、遺伝子型特定を改良する優れたミスマッチ識別を含む、数多くの利点を提供する。本発明のプローブ／結合体は、標的配列に対するハイブリダイゼーションが、増幅プロセス（例えばＰＣＲ）とリアルタイムに（または同時に）検出され、特に有用である。さらに、１つの実施形態では、本発明のプローブ／結合体は、５’−ヌクレアーゼ活性によって消化されない。それゆえに、増幅反応を達成することができ、融解曲線分析によって再評価することができる。本発明のプローブ／結合体はさらに、標的を遺伝子特定するために酵素（例えば５’−ヌクレアーゼ）によって消化される場合において有用である。ハイブリダイズするプローブ／結合体からのフルオロフォアまたはクエンチャーの酵素的切断によるミスマッチの検出は、米国特許出願第１０／６４５，３５３号（本願明細書中で参考として援用される）に記載される。本発明のプローブ／結合体は、他の増幅システムにおいて使用される場合、遺伝子型特定において特に有用である。
【０１４１】
本発明のプローブ／結合体は、別の核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関与する他の技術において有用である。これらとしては、限定されないが、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが終点である技術；標的核酸に対する１つ以上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、プライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして標的核酸を使用する１つ以上のポリメラーゼによる伸長ステップに先行する技術；標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが別のプライマーの伸長をブロックするために使用される技術；および２つ以上のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされ、複数のオリゴヌクレオチド間の相互作用が測定される技術が挙げられる。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための条件およびハイブリダイゼーションの程度および特異性に影響を与える因子（例えば、温度、イオン強度および溶媒組成）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ（前出）；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５；およびｖａｎ Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１を参照。なお他の方法では、複数のプローブは、代替の標的部位領域を検出するため（例えば、困難な配列を同定するためまたは標的の種および亜種を識別するため）に使用することができる。
【０１４２】
標的配列に対するプローブおよび／または結合体のハイブリダイゼーションは、周知および当該技術分野で認識された塩基対の性質に従って進み、アデニン塩基はチミンまたはウラシルと対になり、グアニン塩基はシトシンと対になる。第２のヌクレオチドとの塩基対を可能にするヌクレオチドの性質は、相補性であると呼ばれる。従って、アデニンはチミンおよびウラシルの両方と相補性であり、逆もそうである；同様に、グアニンはシトシンと相補性であり、逆もそうである。標的配列とその全長にわたって相補性であるオリゴヌクレオチドは、完全に相補性であり、完全にマッチしまたは標的配列に対して完全に相補性であると呼ばれ、逆もそうである。オリゴヌクレオチドおよびその標的配列は、関連する配列を有することができ、２この配列中の塩基の大多数が相補性であるが、１つ以上の塩基が相補性でないかまたはマッチしていない。このような場合では、この配列は、互いに実質的に相補性であると呼ぶことができる。オリゴヌクレオチドの配列および標的配列が、１つを覗く全てのヌクレオチド位置で相補性である場合、このオリゴヌクレオチドおよび標的配列は、お互いに関して一塩基ヌクレオチドミスマッチを有する。
【０１４３】
プローブ／結合体について決定されるＴｍが、二本鎖の熱力学パラメーター、プローブおよび標的の濃度、最近接物およびプローブ長の関数であることが理解される。この理由のために、報告されたＴｍは、同じ長さのプローブ、既知のプローブおよび標的の濃度および同じ最近接物を用いて決定される。
【０１４４】
普遍的な塩基を組み込んだプローブ／結合体について、普遍的な塩基が天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のそれぞれと、ほとんどまたは全く識別されずに「塩基対」を形成することが理解される。ほとんどまたは全く識別されないことは、普遍的な塩基を含むプローブが、普遍的な塩基に対して相補的な塩基位置においてＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを含む以外は４つの同一の相補的な標的に対してハイブリダイズする場合に、Ｔｍの違いの観点から測定することができると理解される。好ましくは、普遍的な塩基に対して相補的なＡ、Ｃ、ＧまたはＴを含む４つの標的のプローブ／標的二本鎖のＴｍの違いは、約５℃、４℃または３℃である。最も好ましくは、Ｔｍの違いは、約２℃または約１℃またはそれよりも小さい。
【０１４５】
入り交ざった塩基を組み込んだプローブ／結合体の場合において、同様の熱力学的性質を有する天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のそれぞれの２つ以上と２つの水素結合を形成することが理解される。ほとんどまたは全く識別されないことまたは同様の熱力学的性質は、入り交ざった（無差別な）塩基を含むプローブが、普遍的な塩基に対して相補的な塩基位置においてＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを含む以外は２つ以上の同一の相補的な標的とハイブリダイズする場合に、Ｔｍの違いの観点から測定することができると理解される。好ましくは、普遍的な塩基に対して相補的なＡ、Ｃ、ＧまたはＴを含む４つの標的のプローブ／標的二本鎖のＴｍの違いは、約５℃、４℃または３℃である。最も好ましくは、Ｔｍの違いは、約２℃または約１℃またはそれよりも小さい。
【０１４６】
改変された塩基を組み込んだプローブ／結合体について、改変された塩基が天然に生じるアナログの塩基対特異性を保持することが理解される。例えば、ＰＰＰＧアナログは、シトシンと相補性であり、一方、ＰＰＰＡアナログは、チミンおよびウラシルと相補性である。ＰＰＰＧおよびＰＰＰＡアナログは、グアニンおよびアデニンと比較して、非相補性の塩基といわゆる「ぐらつく（国際公開番号ｂｂｌｅ）」対を形成する傾向が低いだけでなく、３−置換基は二本鎖における結合アフィニティを増大させる。同様に、改変されたピリミジンは、それらの天然に生じるカウンターパートナーに対して特異的にハイブリダイズする。
【０１４７】
ハイブリダイゼーションのための条件は当業者に周知であり、比較的広い限界内を変動することができる。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチのヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を好まず、それゆえに完全にマッチしたハイブリッドまたは数個のミスマッチを含むハイブリッドの形成を促進する程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチのハイブリッドについてより低い耐性と相関関係にある。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子としては、限定されないが、温度、ｐＨ、イオン強度、有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドおよびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ））の濃度が挙げられる。
【０１４８】
従って、プローブ／結合体とその標的配列との間のハイブリッド（二本鎖）の形成において、プローブ／結合体は、温度、イオン強度、ｐＨなどのハイブリダイゼーションに好ましい条件下（すなわち、ハイブリダイゼーション条件下）で標的配列を含むポリヌクレオチドと共に溶液中でインキュベートされる。ハイブリダイゼーション条件は、いくつかの環境において、ハイブリダイズする配列において１つ以上のミスマッチを有する核酸の対と比較して、完全にマッチした配列を有する２つの核酸間のハイブリダイゼーションを好むように選択される。他の環境において、ハイブリダイゼーション条件は、ミスマッチした配列間のハイブリダイゼーションを可能にし、より少ないミスマッチを有する核酸間のハイブリダイゼーションを好むように選択される。
【０１４９】
標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度（ハイブリダイゼーション強度としても知られる）は、当該技術分野で周知の方法によって決定される。好ましい方法は、ハイブリッド二本鎖のＴｍを決定することである。このことは、上述のように、溶液中で二本鎖の温度を徐々に上げ、変性に付随して起こる塩基対のアンスタッキング（ｕｎｓｔａｃｋｉｎｇ）を増大させる二本鎖の変性をモニタリングする（例えば、紫外線吸収によって）ことによって達成される。Ｔｍは、一般的に、ハイブリッド二本鎖の塩基の５０％がアンスタッキングする温度として定義される。あるいは、Ｔｍが既知である場合、ハイブリダイゼーション温度（イオン強度、ｐＨおよびプローブ／標的濃度は固定）は、所望の二本鎖のＴｍよりも低く、所望でない二本鎖のＴｍより高いように選択することができる。この場合では、ハイブリダイゼーションの程度の決定は、単純に、ハイブリダイズされたプローブの存在について試験することによって達成される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、プローブ／結合体は、プライマーとして作用することが可能であり、プローブ／結合体のハイブリダイゼーションの程度はさらに、プライマーの伸長産物のレベルを測定することによって決定することができる。この実施形態では、プライマーを標識することができるかまたは重合のための前駆体（通常はヌクレオシドトリホスフェート）の１つ以上を標識することができる。伸長産物は、例えば、サイズ（例えば、ゲル電気泳動）、リアルタイムＰＣＲにおけるようなハイブリダイゼーションプローブとのアフィニティ法または当業者に既知のいずれかの他の技術によって検出することができる。
【０１５１】
プライマー伸長（「ミニシークエンシング（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、「遺伝子ビット分析（ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）」）アッセイは、通常はＳＮＰタイピングのために使用され、さらに、他の遺伝子型特定および変異スクリーニング適用において使用することができる（Ｐａｓｔｉｎｅｎ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１０３１−４２（２０００））。本発明では、マイナーグルーブバインダーおよびいくつかの場合において、改変された塩基の存在は、プライマー伸長アッセイを向上させることができる。例えば、マイナーグルーブバインダーまたは５−置換ピリミジンまたは３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって提供される付加された二本鎖の安定性は、加温で行われる伸長を可能にする。標的分子中の問題のある第２の構造は加温状態で排除することができることは利点である。さらに、プライマーに対する標的のハイブリダイゼーションは、さらに高い温度で速い。熱安定性のポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）はこのような反応で使用することができる。マイナーグルーブバインダーおよび改変された塩基がプローブを提供することができ、プライマーが上述の利点を有するが、改変された塩基の使用は、典型的には、プライマー伸長の阻害を避けるために、３’−末端位置以外の位置である。
【０１５２】
さらに、マイナーグルーブバインダーおよび改変された塩基は、１つの種類の誤ったポジティブシグナルを排除することによってアッセイの特異性を高める。ヘアピン構造またはホモダイマーを形成するプライマー配列は、テンプレート依存性の伸長（テンプレートとしてプライマー機能の５’末端、その結果誤ったポジティブシグナルを生じる）である傾向がある。「テンプレート」上でのマイナーグルーブバインダーおよび改変された塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する。従って、５’末端上のマイナーグルーブバインダーまたは３’末端またはプライマーの内部上の改変された塩基は、プライマーヘアピンまたはプライマーダイマーからの伸長（誤ったポジティブ）を防ぐことができる。最後に、ＰＰＧは、Ｇ豊富なオリゴヌクレオチドによって形成される非標準的な構造を排除するために使用することができ、これによりこのような配列においてプライマー伸長アッセイを可能にする。
【０１５３】
本改変されたオリゴヌクレオチドが特に有用な他のアッセイは、米国特許第６，３１２，８９４号に記載される（本願明細書中に参考として援用される）。
【０１５４】
本プローブ／結合体が有用であるなお他の増幅アッセイとしては、フラップエンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドプローブの侵襲性切断に基づく増幅アッセイ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２９２−２９６（１９９９））；自己保持配列複製アッセイ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ａｓｓａｙｓ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０８：４３１−４３７（１９９７））、５’−ヌクレアーゼアッセイ（Ｌｉｖａｋ，Ｇｅｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ，１４：１４３−１４９（１９９９）、分子ビーコンアッセイ（米国特許第６，４８５，９０２号）およびＲｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅアッセイ（米国特許第６，３４４，３２９号）が挙げられる（これらそれぞれの教示は本願明細書中に参考として援用される）。本発明の改変されたプローブ／結合体としては、普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基および任意に改変された塩基が挙げられる。非天然の骨格はさらに、ペプチド核酸、ロックト核酸などにおいて使用されるモノマーとして含まれる。
【０１５５】
上の観点において、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記多型のそれぞれが前記標的核酸のプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的核酸を含むサンプルと前記標的配列の前記プローブ領域に隣接するかまたはそれと重複する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、重合する酵素、ヌクレオチド基質および下式：
【０１５６】
【化２４】
【０１５７】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有するオリゴヌクレオチド結合体を混合して混合物を提供する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；
（ｂ）前記混合物を重合に好都合な条件下でインキュベートする工程；および
（ｃ）前記増幅された標的に対する結合体ハイブリダイゼーションの際に生成される蛍光をモニタリングすることによって前記増幅を連続的にモニタリングする工程
を含む、方法を提供する。
【０１５８】
関連する局面では、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記第１および第２の多型のそれぞれが前記標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチド配列を含む前記サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供し、前記第１のプローブは野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、第２のプローブは変異型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、前記第１および第２のプローブはそれぞれ独立して選択された式：
【０１５９】
【化２５】
【０１６０】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；およびそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、ハイブリッド形成が野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を含む、方法を提供する。
【０１６１】
なお別の局面では、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記第１および第２の多型のそれぞれが前記標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチド配列を含む前記サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供し、前記第１のプローブは野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、第２のプローブは変異型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、前記第１および第２のプローブはそれぞれ独立して選択された式：
【０１６２】
【化２６】
【０１６３】
（式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す）
を有する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成の融解曲線分析を用いて蛍光を測定し、野生型、変異型および異種標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を決定する工程
を含む、方法を提供する。
【０１６４】
なお別の局面では、本発明は、少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の一塩基多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、前記第１および第２の多型のそれぞれが前記標的核酸のプローブ領域に存在し、当該方法は、
（ａ）識別されることが意図されない１つ以上の多型を含む少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含む前記サンプルと、前記野生型標的ポリヌクレオチドおよび変異型標的ポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするプローブとを接触させて混合物を提供し、前記第１のプローブは変異型標的ポリヌクレオチドと比較して野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、前記プローブは下式：
【０１６５】
【化２７】
【０１６６】
〔式中、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；かつそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表す〕
を有する工程であって、ここで、前記第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、前記オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して配列相補性を有する工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、ハイブリッド形成が野生型標的＋ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を含む、方法を提供する。
【０１６７】
上述の方法のそれぞれについて、プローブは、好ましくは、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置が逆転した改変とともにおよびマイナーグルーブバインダーおよびクエンチャーが３’−位に結合し、フルオロフォアが５’−位に結合する、式ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂおよびＩＶのものである。なお他の実施形態では、プライマーは、改変された塩基、普遍的な塩基または入り交ざった塩基を含む増幅において使用される。本発明の関連する局面は、式ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂおよびＩＶのプローブが、標的核酸のプローブ領域中の各ＳＮＰに対して相補的な部位で普遍的または入り交ざった塩基を有して使用される。
【実施例】
【０１６８】
（実施例１）
本実施例は、多型が、目的の対立遺伝子の際近接に第２の多型の存在下で、第２の多型に関与するプローブ位置で普遍的な塩基で置換することによって、遺伝子型を特定することができることを示す。一般的に、１個のプローブを有する二塩基の多型の従来の融解曲線分析による遺伝子型特定は、確定的ではない結果を与えた。以下の方法の使用は、以前に達成された遺伝子型特定よりもさらに正確な結果を与える。
【０１６９】
（材料および方法）
（１．１ テンプレート）
ヒトゲノムＤＮＡを、Ｃｏｒｉｅｌｌ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＹから購入した。遺伝子型特定を、制限長の多型およびＴａｑＭａｎ法を用いて出願人らの実験室であらかじめ行っておいた。
【０１７０】
（１．２ オリゴヌクレオチド）
使用したオリゴヌクレオチドの配列を図１に示す。５’→３’方向におけるオリゴヌクレオチドセグメントの合成のために設計された５’−β−シアノエチルホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ）を用いて、ＭＧＢ−Ｑ−改変されたガラス支持体（ＭＧＢＴＭリガンドはＤＰＩ３（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの商標）である）上で自動化ＤＮＡ合成機によって、５’−ＭＧＢ−Ｑ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブを調製した。製造業者によって供給されたプロトコルに従って０．０２Ｍヨウ素溶液を用いてＡＢＩ ３９４合成機でオリゴヌクレオチド合成を行った。ＰＰＧホスホロアミダイトを文献の方法に基づいて合成したが、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから購入することもできる。６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｙａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗＴＭ（ＹＹ、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから）および６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）レポーティング色素を、対応するホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて合成の最終段階で導入した。標準的な５’−ＤＭＴホスホロアミダイトをこのときに使用した。全てのオリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。
【０１７１】
（１．３ Ｔｍ予測）
ＭＧＢ ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を使用して５’−ＭＧＢ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌプローブを設計した。このソフトウェアの特徴の１つは、Ｇ：Ｇ自己会合に起因する検出力の乏しいプローブとして知られる３つを超える連続したＧｓを含有し、ＰＰＧを用いたＧの適切な置換を示すプローブを設計する能力である。さらに、このソフトウェアは、二重らせん安定性を向上するためにＡＴリッチな配列中にＳｕｐｅｒ ＡおよびＳｕｐｅｒ Ｔで改変された塩基を組み込んだプローブを設計することができる。このソフトウェアをプローブおよびプライマーを設計するために使用した。単位複製配列、プライマーおよびプローブを図１および表４に示す。
【０１７２】
（１．４ リアルタイムＰＣＲ）
（ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ）
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）熱サイクル蛍光測定器（Ａｆｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ，２５：２６８−２７５（２００２））のいずれかを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。両方の装置で、３ステップのＰＣＲを５０サイクル（９５℃で５秒、５８℃で２０秒および７６℃で３０秒）、その後５０℃で２分および９５℃で２分行った。ＡＢＩ ７９００について、Ｊｕｍｐ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ ＃９０ ４１８４）を最終量０．３７Ｕ／μｌ反応液まで追加した２ｍＭの最終Ｍｇ＋＋濃度（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ ７４４０３）を含む市販の２×Ｊｕｍｐ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使用してこのＰＣＲ反応を設定した。両方のプローブの最終濃度は０．２μＭであり；制限プライマーの濃度は０．１μＭであり、過剰プライマーは２μＭであった。反応の設定の前に、各５μｌの反応物に、プレート中でｓｐｅｅｄ ｖａｃを用いて凍結乾燥した１０ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅについて、反応物の最終量が１０μｌである以外は、設定は本質的に同じであり、サンプルＤＮＡを１×ＴＥまたは水に添加し、全量を１０ｎｇ／反応物にした。
【０１７３】
（蛍光融解曲線およびＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブを用いる遺伝子型特定）
融解曲線アッセイのためのＰＣＲの準備は、リアルタイム実験について記載されるのと同じであったが、ＰＣＲは、熱サイクリング蛍光光度計の外側で行うことができる。ＡＢＩ７９００での融解曲線分析の詳細は以下に概説され、ステップ毎の操作は、ｗｗｗ．ｅｐｏｃｈｂｉｏ．ｃｏｍで入手可能なＵｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに提供される。ＰＣＲ終了後、プレートをＡＢＩ７９００に移し、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセイン検出を用いる解離曲線分析のためにＳＤＳソフトウェアを設定する。熱プロフィールは、初期変性温度９５℃×３０秒、アニーリング温度３０℃および最終温度８０℃に設定される。ランプ速度は１０秒毎に約１℃である１０％に設定される。最終温度に到達した後、集めたデータを分析のためにセーブする。融解曲線データを、温度に対する融解曲線の一次導関数としてグラフにより視覚化することができる。自動化された遺伝子型特定のために、このデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに移し、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｅｐｏｃｈｂｉｏ．ｃｏｍ）から入手可能なＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｍｅｌｔ Ｍａｃｒｏを用いて分析する。このマクロにより、コントロールサンプルまたは各対立遺伝子について陽性のサンプルがプレート上に存在する場合、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインプローブのＴｍを自動的に決定できる。あるいは、ユーザは、まれな対立遺伝子を有する場合であり得るように、コントロールサンプルが入手できない場合、プローブのＴｍを手動で設定することができる。ユーザの入力は、融解曲線を試験した後にシグナルおよびＴｍ閾値を調整するために必要であり得る。この入力とともに、このマクロは自動的に遺伝子型を割り当て、個々のサンプルを呼び出し、遺伝子型特定の結果を表にして出力する。
【０１７４】
図１に示されるプライマーおよびプローブを使用して、プローブ配列中に２個の多型を含むゲノム標的を遺伝子型特定した。目的の［Ｇ／Ｔ］対立遺伝子により、図２に示される融解曲線分析によって、第２の対立遺伝子Ｎの存在下で遺伝子型特定することができた。ヘテロ接合体サンプルは、このマクロにおいて設定されたＴｍウインドウ範囲において両方の蛍光チャネルにおける融解曲線を示したが、正しいＴｍを有する野生型および変異型の対立遺伝子融解曲線は、それぞれの蛍光チャネルにおいてのみ存在した。
【０１７５】
（実施例２）
本実施例は、モデル系における普遍的な塩基としてニトロインドール（１３）およびニトロピロール（９）の評価結果を示す。８個の標的を調製し、プローブ配列領域中の２個のさらなる多型の存在下で目的の多型を有するプローブを評価した。プローブおよび標的配列は表４に示される。
【０１７６】
（表４）
（ニトロインドール（１３）およびニトロピロール（９）の塩基対の性質を評価するためのプローブおよび標的配列）
【０１７７】
【表４】
【０１７８】
Ｎ１塩基は目的の多型のＧ塩基およびＡ塩基にハイブリダイズする能力を評価する。Ｎ２塩基は４個の天然塩基にハイブリダイズする能力を評価する。ＮＡおよびＮＢは普遍的な塩基９および１３のいずれかによって同時に両方置換される。
【０１７９】
示されるように、９および１３の両方が４個全ての塩基とハイブリダイズし、Ｔｍ上昇効果を有していた。
【０１８０】
（実施例３）
本実施例は、プローブ：標的二本鎖の融解温度の決定を記載する。
【０１８１】
二本鎖形成の熱力学的パラメーターは、Ｖａｎ’ｔ Ｈｏｆｆ分析法によって誘導された。各融解曲線の形状を、非線形最小二乗プログラム（Ｌｏｋｈｏｖ，Ｓ．Ｇ．ａｎｄＰｙｓｈｎｙｉ，Ｄ．Ｖ．，ＦＥＢＳ ４２０，１３４−１３８ １９９７））を用いて線形ベースラインを有する２状態モデルにあわせた（Ｘｉａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７，１４７１９−１４７３５（１９９８））。他に言及されない限り、ＤＮＡ二本鎖のＴｍを、以前に記載されるように５×１０−７Ｍの濃度で１×ＰＣＲバッファー中で測定した（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８，６５５−６６１（２０００））。
【０１８２】
（実施例４）
本実施例は、入り交ざった（無差別な）塩基ＰＰＧの最近接の熱力学パラメーターの決定を示す。使用された理論および方法は、米国特許出願第０９／７９６，９８８号およびＰＣＴ出願ＷＯ０１／６４９５８（本願明細書中に参考として援用される）に開示される。
【０１８３】
（表５）
（ＰＰＧのΔＧ０およびＴｍについて最近接物の影響を評価するための標的およびｄプローブの配列）
＃はプローブおよび標的番号であり；「ｇ」はＰＰＧ（Ｓｕｐｅｒ Ｇ）であり、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴである。標的中のＮ置換は太字で示される。
【０１８４】
【表５】
【０１８５】
プローブおよび標的を使用してΔＧ０およびＴｍを決定し、４個の標的および１個のプローブのセットにおいて数または最近接物について表５に示す。実施例について各セットは４個の標的（例えば、１０番〜１３番）および１個のプローブ（１４）を含み、４個の二本鎖を生じ、３個のミスマッチと１つのマッチ１４を有する。それゆえに、図６ａ）からｃ）は、ΔＧ０およびＴｍデータに加えて、４つのグループのＴｍについての棒グラフ、４つのミスマッチと１つのマッチを示す。表５に列挙される標的およびプローブに対応する結果を図６ａ）に示す。−ＡｇＡ−配列を、プローブ１４および標的１０〜１３を用いておよび異なる配列環境のプローブ１９および標的１５〜１８を用いて評価した。図６ａ）に示されるように、異なる配列環境における−ＡｇＡ−について３個のミスマッチと１個のマッチを有する平均Ｔｍの比率は同じであった。このことは、最近接のモチーフの熱力学的構成は、配列の残りと独立しているということを示す。
【０１８６】
同様に他のプローブおよび標的（配列は示されない）を使用して、さらなる最近接物についてΔＧ０およびＴｍを決定し、その結果を図６ｂ）および６ｃ）に示す。図６における正常にマッチしたプローブおよび入り交ざった（無差別な）塩基で置換されたプローブの間の二本鎖Ｔｍの違いは、普遍的な塩基であるニトロピロールおよびニトロインドールでそれぞれ置換されたプローブ９および１３（表４）を用いて観察された結果と同様かそれよりも小さい。
【０１８７】
（実施例５）
本実施例は、標的の変異に対応する塩基における置換によって多型が「目につかなく」され得ることを示すための、プローブにおいて普遍的な塩基４１および４２の使用を示す。ＢＡＲＤ１−０３遺伝子配列において存在するＳＮＰの一部分を以下に示す（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ５００ｃａｎｃｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【０１８８】
【化２８】
【０１８９】
［Ｇ／Ａ］多型は、普遍的な塩基Ｎを有するプローブ中の対応する位置の置換によって「目に付かなく」される。図７は、Ｎが普遍的な塩基４１または４２のいずれかで置換される場合の、プローブの融解曲線分析を示す。各場合において、野生型および変異型標的の両方に対してプローブを分析した。示されるように（図７ａおよび７ｂを参照）、鋭い１本の融解曲線は、２個の改変塩基が野生型および変異型標的の両方に対して同じ熱安定性を有してハイブリダイズすることを示す。
【０１９０】
（実施例６）
本実施例は、融解曲線分析を用いてＢＡＲＤ１−０３遺伝子中に存在する二塩基ＳＮＰの遺伝子型特定に対処するための、プローブ中の普遍的な塩基４０および入り交ざった（無差別な）塩基Ｖ（ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）の使用および比較を示す。プローブ領域中の二塩基多型（Ｒ＝Ｇ／Ａ）を有するＢＡＲＤ１−０３配列の一部分およびプローブ配列を以下に示す：
【０１９１】
【化２９】
【０１９２】
目的の多型は、下線を引いた太字で示され、［Ｒ＝Ｇ／Ａ］多型は、プローブ中の対応する位置で普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基Ｎによってそれぞれ置換されることによって「目に付かなく」される。図８において、Ｎが普遍的な塩基４０または入り交ざった（無差別な）塩基Ｖ（ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）のいずれかで置換された、ＢＡＲＤ１−０３多型（上述の下線の太字）の融解曲線分析が示される。示されるように、図８ａ）およびｂ）における鋭い１本の融解曲線は、第２の多型が「目に付かなくされて」いることを示す。しかし、普遍的な塩基４０の場合には、図８ａ）において使用されるＮＡおよびＮＧプローブの間で約２．８℃のＴｍの差が存在する。図８ｂ）において使用される入り交ざった（無差別な）塩基は、ＮＡとＮＧプローブとの間のＴｍの差はたった０．８℃であった。
【０１９３】
（実施例７）
本実施例は、１個のプローブのみを有し、１個のミスマッチを有する２個の標的の検出結果を示す。１個のプローブを、プローブ領域中でたった１個のミスマッチのみが異なるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅおよびＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓを検出するために開発した。標的およびプローブ配列を以下に示す。本実施例では、ａ）ＰＰＧ（４９）およびｂ）置換ピラゾロピリミジン誘導体（Ｖ、ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）で置換された２種類の単一プローブを以下に示す。
【０１９４】
【化３０】
【０１９５】
ここで、Ｎは、ＰＰＧ（４９）または置換ピラゾロピリミジン（Ｖ、ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、骨格成分はデオキシリボースである）のいずれかである。プローブ４９およびＶを、両方の標的を効率よく検出する能力について評価した。融解曲線分析の結果を図９に示す。図９ａ）は４９を用いて得られたデータを表し、図９ｂ）は置換ピラゾロピリミジン（Ｖ）を用いて得られたデータを表す。
【０１９６】
（実施例８）
本実施例は、普遍的な塩基５’ホスホラミダイト（５６）の合成を示す。
【０１９７】
【化３１】
【０１９８】
２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−テトラヒドロ−５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル）−６−メチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（５５）。１２５ｍｌの丸底フラスコに、磁気攪拌棒を入れ、無水ピリジン（１０ｍｌ）中の化合物（４１）（１．０３ｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびジメチルテキシルシリルクロリド（０．５９ｍｌ，０．５３６ｇ，３．０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１日間磁気攪拌した。ジメトキシトリチルクロリド（０．８８ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をさらに１日磁気攪拌した。反応混合物を氷水浴で冷却し、あらかじめ調製しておいたＨＦ−Ｐｙ錯体（約２．０ｇ，約１．４ｇＨＦ，約７０ｍｍｏｌ）のピリジン（１０ｍｌ）溶液を、シリンジを介して１０分間で添加した。得られた混合物を室温でさらに２日間磁気攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）に注意深く注いだ。有機層を分離し、食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンと共に２回共沸させ、カラムクロマトグラフィーで精製し、所望の生成物（５５）（０．７８ｇ，１．３６ｍｍｏｌ，収率＝６８％）を白色泡状物として得た。
【０１９９】
【化３２】
【０２００】
普遍的な塩基５’ホスホラミダイト（５６）。５０ｍｌの丸底フラスコに、化合物（２）（０．２５ｇ，０．４３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．０８１ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）および攪拌棒を入れた。フラスコを吸引し、アルゴンで満たした。次いで、無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を添加し、その後、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホラミダイト（０．２５９ｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物をアルゴン下室温で２時間攪拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）でクエンチした。有機溶液を分離し、食塩水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（カラムはヘキサン中の５％Ｅｔ３Ｎであらかじめ洗浄し、その後純粋なヘキサン；Ｈｅｘ中の３０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な所望の生成物（５６）（０．２８ｇ，０．３６ｍｍｏｌ，収率＝８４％）を白色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４４．５６（ｓ），１４４．２０（ｓ）。
【０２０１】
（実施例９）
本実施例は、普遍的な塩基５’ホスホラミダイト（６５）の合成を示す。
【０２０２】
【化３３】
【０２０３】
６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６１）：化合物（６１）を、市販の３，５−ジメチルベンズアルデヒド（５７）〜（６０）から出発して、確立された合成経路に従って調製した（Ｂｒｉｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８：５７６１−５７６６（２００２）。１Ｈ ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ６）：１０．９１（ｂｃ、１Ｈ）、７．２１（ｓ、１Ｈ）、７．１０−７．００（ｍ、２Ｈ）、６．３６（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．７６（ｓ、３Ｈ）、２．３３（ｓ、３Ｈ）。
【０２０４】
２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル）−６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６３）：０．２５Ｌ丸底フラスコに、攪拌棒を入れ、化合物（６１）（１．０ｇ，５．７７ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１０ｍｌ）およびＤＭＦ（２０ｍｌ）を入れた。混合物を、氷水浴を用いて＋０℃まで冷却し、水素化ナトリウム（０．１５０ｇ，５．９５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。５分後、反応混合物を室温まで加温し、１．５時間磁気攪拌した。化合物（６２）（２．２４５ｇ，５．７７ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を室温で６時間磁気攪拌した。化合物（６２）（０．４５３ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）をさらに一度に添加し、反応混合物を室温でさらに２時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水（５０ｍｌ）を添加し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍｌ）で抽出した。有機溶液を食塩水（２×２０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥剤からろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラム（ＤＣＭ中の０〜２％ＥｔＯＡｃ）で分離し、純粋なトルイル保護された中間体（０．６４ｇ，１．２２ｍｍｏｌ，収率＝２１％）を白色泡状物として得た。カラムをさらにＥｔＯＡｃで洗浄し、純粋な出発物質（６１）（０．６２ｇ，３．５８ｍｍｏｌ，収率＝６２％）をオフホワイト色の固体として得た。トルイル保護された中間体（２．７ｇ，５．１４ｍｍｏｌ）を、あらかじめ磁気攪拌棒を入れておいた０．５Ｌ丸底フラスコに入れ、メタノール（４０ｍｌ）およびＴＨＦ（８ｍｌ）を入れた。得られた混合物を＋０℃まで冷却し、ナトリウム（０．３４５ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）およびメタノール（２０ｍｌ）から新しく調製したナトリウムメトキシドを一度に添加した。反応混合物を＋０℃で１時間磁気攪拌した。反応混合物を塩化アンモニウム（１．０７ｇ，２０ｍｍｏｌ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラム（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝４：４：１）で分離し、所望の生成物（６３）（１．３６ｇ，純度約９０％，約４．２ｍｍｏｌ，収率＝８２％）をわずかに紫色の固体として得た。生成物は１Ｈ ＮＭＲによれば約１０％のトルエンを含有していた。
【０２０５】
【化３４】
【０２０６】
２−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−テトラヒドロ−５−ヒドロキシメチル）フラン−２−イル）−６，８−ジメチルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（６４）。化合物（６４）を化合物（５５）と同様に調製した。
【０２０７】
【化３５】
【０２０８】
普遍的な塩基の５’−ホスホラミダイト（６５）。化合物（６５）を化合物（５６）と同様に調製した。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４４．５６（ｓ），１４４．１６（ｓ）。
【０２０９】
本願明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が特別におよび個々に参考として援用されることが示されるように、本願明細書中に参考として援用される。上述の発明が、理解を明確にする目的のために説明および実施例を用いていくつか詳細に記載されているが、本発明の教示の観点から、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされることが当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】単位複製配列、プライマーおよびプローブの配列。Ｆａはフルオロセインであり、Ｆｂはテトラクロロフルオロセインである。「ａ」はＳｕｐｅｒ ＡＴＭである。ＭＧＢは置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）であり、ＭＧＢＴＭリガンドは、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの商標であり、プライマーは太字のイタリックであり、プローブは太字の下線部である。Ｎは第２の天然多型を表す。［Ｇ／Ｔ］は目的の多型をあらわす。Ｕ４０は６−アミノ−２−（４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−２−イル）−２，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン（４０）である。
【図２】プローブ結合領域中に二塩基多型を含有し、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインで標識されたプローブを有し、それぞれ第１の多型の野生型および変異型標的に対して相補的なサンプル４１８８ＤＮＡの融解曲線分析。第２の多型に対応する塩基は普遍的な塩基４０で置換された。
【図３】シチジン、グアニン、チミンおよびアデニン塩基とのグアニン塩基対幾何配置を提供する。
【図４】シチジン、グアニン、チミンおよびアデニン塩基とのＰＰＧ（Ｓｕｐｅｒ Ｇ）塩基対幾何配置を提供する。
【図５】シチジン、グアニン、チミンおよびアデニン塩基とのＳｕｐｅｒ Ａ塩基対幾何配置を提供する。
【図６ａ】ａ）−ＡｇＮ−、ｂ）−ＴｇＮ−およびｃ）ＣｇＮ−の再近接物についての熱力学的性質を示す。
【図６ｂ】ａ）−ＡｇＮ−、ｂ）−ＴｇＮ−およびｃ）ＣｇＮ−の再近接物についての熱力学的性質を示す。
【図６ｃ】ａ）−ＡｇＮ−、ｂ）−ＴｇＮ−およびｃ）ＣｇＮ−の再近接物についての熱力学的性質を示す。
【図７】プローブ結合領域中に一塩基多型を含有し、フルオレセインで標識されたプローブを有し、それぞれ多型の野生型および変異型標的に対して相補的なサンプルＢＡＲＤ１−０３ＤＮＡの融解曲線分析。多型に対応する塩基は普遍的な塩基４１または４２のいずれかで置換された。
【図８】プローブ結合領域中に二塩基多型を含有し、フルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインで標識されたプローブを有し、それぞれ第１の多型の野生型および変異型標的に対して相補的なサンプルＢＡＲＤ１−０３ＤＮＡの融解曲線分析。第２の多型に対応する塩基は普遍的な塩基４０または入り交ざった（無差別な）塩基（Ｖ、ここで、Ｒｚ＝Ｒｙ＝−ＮＨ２、Ｒｘはヒドロキシブチリルであり、Ｒｄはデオキシリボースである）のいずれかで置換された。
【図９】プローブ領域中の１個のミスマッチによってのみ異なり、１個のプローブを有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅおよびＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの両方の検出を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法であって、ここで、第１の一塩基多型が識別され、かつ第２の一塩基多型が識別されず、該多型のそれぞれが該標的核酸のプローブ領域に存在し、該方法は、以下の工程：
（ａ）該標的核酸を含むサンプルと、該標的配列の該プローブ領域に隣接するかまたはそれと重複する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、重合酵素、ヌクレオチド基質および下式：
【化１】
を有するオリゴヌクレオチド結合体を混合して混合物を提供する工程であって、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎは、ｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そしてそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）該混合物を重合に有利な条件下でインキュベートする工程；および
（ｃ）該増幅された標的に対する結合体ハイブリダイゼーションの際に生成される蛍光をモニタリングすることによって増幅を連続的にモニタリングする工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンアナログからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、前記オリゴヌクレオチド結合体の５’末端に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、前記オリゴヌクレオチド結合体の３’末端に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｑが約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｆｌが約４００〜８００ｎｍの発光波長を有するフルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フルオロフォア（Ｆｌ）が、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、ベンゾキサンテン、シアニンおよびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記クエンチャー（Ｑ）が、モノアゾ色素およびビスアゾ色素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記糖リン酸骨格（Ａ）が、長さが８〜２５のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光が、前記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に直接生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に結合体プローブからのクエンチャーまたはフルオロフォアの酵素的切断によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記普遍的な塩基が、表１に提供される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記入り交ざった塩基が、表２に提供される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記入り交ざった（無差別な）塩基が、下式：
【化２】
を有し、
ここで、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙまたはＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、該第１および第２の多型のそれぞれが該標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、該方法は、以下：
（ａ）該標的ポリヌクレオチド配列を含む該サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供する工程であって、ここで該第１のプローブは、野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、該第２のプローブは、該変異型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、該第１および第２のプローブは、それぞれ独立して選択された式：
【化３】
を有し、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；そして［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そして、それぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、それによって、ハイブリッド形成が野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンアナログからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の５’末端に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の３’末端に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｑが約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｆｌが約４００〜８００ｎｍの発光波長を有するフルオロフォアである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記フルオロフォア（Ｆｌ）が、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、ベンゾキサンテン、シアニンおよびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記クエンチャー（Ｑ）がモノアゾ色素およびビスアゾ色素からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記糖リン酸骨格（Ａ）が、長さが８〜２５のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光が、前記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に直接生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に結合体プローブからのクエンチャーまたはフルオロフォアの酵素的切断によって生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記普遍的な塩基が表１に提供される群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記入り交ざった塩基が表２に提供される群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記入り交ざった（無差別な）塩基が、下式：
【化４】
を有し、
ここで、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙおよびＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合型標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、該第１および第２の多型のそれぞれが前記標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、該方法は、以下：
（ａ）該標的ポリヌクレオチド配列を含む該サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供する工程であって、ここで該第１のプローブは、野生型標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、第２のプローブは、変異型標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、該第１および第２のプローブはそれぞれ独立して選択された式：
【化５】
を有し、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；そして［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そしてそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成の融解曲線分析を用いて蛍光を測定して、野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドのそれぞれの存在または非存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンアナログからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の５’末端に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の３’末端に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
Ｑが約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｆｌが約４００〜８００ｎｍの発光波長を有するフルオロフォアである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記フルオロフォア（Ｆｌ）が、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、ベンゾキサンテン、シアニンおよびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記クエンチャー（Ｑ）がモノアゾ色素およびビスアゾ色素からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記糖リン酸骨格（Ａ）が、長さが８〜２５のヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光が、前記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に直接生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に結合体プローブからのクエンチャーまたはフルオロフォアの酵素的切断によって生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記普遍的な塩基が表１に提供される群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記入り交ざった塩基が表２に提供される群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記入り交ざった（無差別な）塩基が、下式：
【化６】
を有し、
ここで、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙおよびＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、該第１および第２の多型のそれぞれが該標的核酸のプローブ領域に存在し、該方法は、
（ａ）識別されることが意図されない１つ以上の多型を含む、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含むサンプルと、該野生型標的ポリヌクレオチドおよび変異型標的ポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするプローブとを接触させて混合物を提供する工程であって、ここで該プローブは該変異型標的ポリヌクレオチドと比較して該野生型標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、該プローブは下式：
【化７】
を有し、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；そして［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そしてそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、それによって、ハイブリッド形成が野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を包含する、方法。
【請求項４４】
以下：
【化８】
からなる群より選択される化合物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の化合物を用いて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４６】
表２の化合物４９、化合物５０、化合物５１、化合物５２、化合物５４および化合物５５からなる群より選択される１つ以上の入り交ざった塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的核酸配列のポリヌクレオチド増幅を連続的にモニタリングするための方法であって、ここで、第１の一塩基多型が識別され、かつ第２の一塩基多型が識別されず、該多型のそれぞれが該標的核酸のプローブ領域に存在し、該方法は、以下の工程：
（ａ）該標的核酸を含むサンプルと、該標的配列の該プローブ領域に隣接するかまたはそれと重複する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、重合酵素、ヌクレオチド基質および下式：
【化１】
を有するオリゴヌクレオチド結合体を混合して混合物を提供する工程であって、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合基または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；かつ［Ａ−Ｂ］ｎは、ｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そしてそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）該混合物を重合に有利な条件下でインキュベートする工程；および
（ｃ）該増幅された標的に対する結合体ハイブリダイゼーションの際に生成される蛍光をモニタリングすることによって増幅を連続的にモニタリングする工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンアナログからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、前記オリゴヌクレオチド結合体の５’末端に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、前記オリゴヌクレオチド結合体の３’末端に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｑが約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｆｌが約４００〜８００ｎｍの発光波長を有するフルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フルオロフォア（Ｆｌ）が、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、ベンゾキサンテン、シアニンおよびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記クエンチャー（Ｑ）が、モノアゾ色素およびビスアゾ色素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記糖リン酸骨格（Ａ）が、長さが８〜２５のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光が、前記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に直接生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に結合体プローブからのクエンチャーまたはフルオロフォアの酵素的切断によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記普遍的な塩基が、表１に提供される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記入り交ざった塩基が、表２に提供される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記入り交ざった（無差別な）塩基が、下式：
【化２】
を有し、
ここで、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙまたはＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、該第１および第２の多型のそれぞれが該標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、該方法は、以下：
（ａ）該標的ポリヌクレオチド配列を含む該サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供する工程であって、ここで該第１のプローブは、野生型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、該第２のプローブは、該変異型標的ポリヌクレオチドに対して優先的にハイブリダイズし、該第１および第２のプローブは、それぞれ独立して選択された式：
【化３】
を有し、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；そして［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そして、それぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、それによって、ハイブリッド形成が野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンアナログからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の５’末端に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の３’末端に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｑが約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｆｌが約４００〜８００ｎｍの発光波長を有するフルオロフォアである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記フルオロフォア（Ｆｌ）が、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、ベンゾキサンテン、シアニンおよびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記クエンチャー（Ｑ）がモノアゾ色素およびビスアゾ色素からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記糖リン酸骨格（Ａ）が、長さが８〜２５のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光が、前記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に直接生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に結合体プローブからのクエンチャーまたはフルオロフォアの酵素的切断によって生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記普遍的な塩基が表１に提供される群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記入り交ざった塩基が表２に提供される群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記入り交ざった（無差別な）塩基が、下式：
【化４】
を有し、
ここで、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙおよびＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合型標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、該第１および第２の多型のそれぞれが前記標的ポリヌクレオチドのプローブ領域に存在し、該方法は、以下：
（ａ）該標的ポリヌクレオチド配列を含む該サンプルと、目的の第１の多型をそれぞれ識別する第１のプローブおよび第２のプローブとを接触させて混合物を提供する工程であって、ここで該第１のプローブは、野生型標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、第２のプローブは、変異型標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、該第１および第２のプローブはそれぞれ独立して選択された式：
【化５】
を有し、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり、各プローブは異なるフルオロフォアを有し；そして［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そしてそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成の融解曲線分析を用いて蛍光を測定して、野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドのそれぞれの存在または非存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が、ＣＣ１０６５アナログ、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンアナログからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が置換ジヒドロシクロピロロインドールトリアミド（ＤＰＩ３）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の５’末端に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイナーグルーブバインダー（Ｍ）が前記オリゴヌクレオチド結合体の３’末端に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
Ｑが約４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを有するクエンチャーであり、Ｆｌが約４００〜８００ｎｍの発光波長を有するフルオロフォアである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記フルオロフォア（Ｆｌ）が、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、ベンゾキサンテン、シアニンおよびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記クエンチャー（Ｑ）がモノアゾ色素およびビスアゾ色素からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記糖リン酸骨格（Ａ）が、長さが８〜２５のヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光が、前記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に直接生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの際に結合体プローブからのクエンチャーまたはフルオロフォアの酵素的切断によって生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記普遍的な塩基が表１に提供される群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記入り交ざった塩基が表２に提供される群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記入り交ざった（無差別な）塩基が、下式：
【化６】
を有し、
ここで、ＲｙおよびＲｚはＯＨおよびＮＨ２からなる群より独立して選択され、ＲｙおよびＲｚのうち少なくとも１つはＮＨ２であり；Ｒｘは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、（Ｃ２〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、−Ｓ−（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、ヘテロシクリル（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、ヘテロシクリル（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニル、アリール（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＣＯＮＨ２からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、Ｒｘの脂肪族部分が、１つまたは２つのヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン基でさらに置換され；波線は前記プローブの残りの部分に対する結合点を示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも２つの一塩基多型を有する標的ポリヌクレオチド配列において野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドをサンプル中で識別するための方法であって、第１の多型が識別され、第２の一塩基多型が識別されず、該第１および第２の多型のそれぞれが該標的核酸のプローブ領域に存在し、該方法は、
（ａ）識別されることが意図されない１つ以上の多型を含む、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含むサンプルと、該野生型標的ポリヌクレオチドおよび変異型標的ポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするプローブとを接触させて混合物を提供する工程であって、ここで該プローブは該変異型標的ポリヌクレオチドと比較して該野生型標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、該プローブは下式：
【化７】
を有し、
ここで、Ｍはマイナーグルーブバインダーであり；添字ｔは０または１であり；Ｑはクエンチャーであり；Ｗは連結基であり；Ｋは結合または連結基であり；Ｆｌはフルオロフォアであり；そして［Ａ−Ｂ］ｎはｎ単位を有する核酸オリゴマーを表し、ｎは５〜５０の整数であり；それぞれのＡは独立して、糖リン酸骨格、改変糖リン酸骨格、ロックト核酸骨格、ペプチド骨格または核酸調製において使用されるそれらの改変体からなる群より選択される核酸骨格成分を表し；そしてそれぞれのＢは独立して、核酸塩基、改変塩基または塩基アナログを表し、ここで、該第２の一塩基多型に対して相補的な部位での塩基は普遍的または入り交ざった（無差別な）塩基であり、該オリゴヌクレオチド部分は増幅される標的配列の一部分に対して相補的な配列を有する、工程；および
（ｂ）ハイブリッド形成で生成される蛍光を測定し、それによって、ハイブリッド形成が野生型標的ポリヌクレオチド、変異型標的ポリヌクレオチドおよびヘテロ接合体標的ポリヌクレオチドそれぞれの存在または非存在を示す工程
を包含する、方法。
【請求項４４】
以下：
【化８】
からなる群より選択される化合物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の化合物を用いて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４６】
表２の化合物４９、化合物５０、化合物５１、化合物５２、化合物５４および化合物５５からなる群より選択される１つ以上の入り交ざった塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５１０４０１（Ｐ２００７−５１０４０１Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４１２３（Ｐ２００６−５３４１２３）
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３２２６５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５５４５
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５００４６１５７２）エポック・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (4)
【住所又は居所原語表記】２１７２０２３ＲＤ ＤＲＩＶＥ，Ｓ．Ｅ．，ＳＵＩＴＥ １５０，ＢＯＴＨＥＬＬ，ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ９８０２１，ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３２２６５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５５４５
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５００４６１５７２）エポック・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (4)
【住所又は居所原語表記】２１７２０２３ＲＤ ＤＲＩＶＥ，Ｓ．Ｅ．，ＳＵＩＴＥ １５０，ＢＯＴＨＥＬＬ，ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ９８０２１，ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
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