齧歯類幹細胞及びその用途
本発明は、Ｓｃａ１＋細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト癌に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む、動物固形腫瘍モデルに関する。本発明は、ヒト病理に関連するヒト遺伝子異常を幹細胞に特異的に発現することができる幹細胞にも関する。ヒトの疾患の診断、治療及び予防の用途のようなこれらのモデル及び幹細胞の用途、生成物及び方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト病理に関連するヒト遺伝子異常を幹細胞に特異的に発現することができる齧歯類幹細胞に関する。ヒトの疾患の診断、治療及び予防の用途のような前記幹細胞の用途、生成物及び方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ＳＣ）は、それら自体が自己複製を介して永続化する能力、及び分化を介して特定の組織の成熟細胞を生成する能力を有する細胞として定義される。ＳＣの例には、造血幹細胞、神経幹細胞、癌幹細胞などが挙げられる。
現在、癌は、繁殖する能力及び新たな腫瘍を形成する能力が著しく異なる癌細胞の異種個体群から構成されると考えられている。大多数の癌細胞は限定された分裂能力を有するが、広範囲に繁殖し新たな腫瘍を形成する排他的能力を有する癌幹細胞（ＣＳＣ）の個体群は、マーカー発現に基づいて同定することができる。
正常な幹細胞の自己複製を調節する経路がＣＳＣにおいて調節解除され、自己複製癌細胞及び腫瘍形成の連続的な拡大をもたらすことを、ますます多くの証拠が示唆している。このことは、癌細胞における欠損自己複製経路を標的にする作用物質が、これらの疾患の治療において改善された治療転帰をもたらす可能性を示唆している。
この戦略は、腫瘍形成の生物学、並びに癌の診断及び治療において意味を持つ。癌を有効に治療するためには、ＣＳＣを排除しなければならない。そうでなければ、治療が非腫瘍形成癌細胞を排除するが、ＣＳＣの相当数の個体群を残した場合、腫瘍は急速に再形成する。伝統的には、癌の治療は、腫瘍を小さくする能力に依存してきた。多くの場合においてＣＳＣが腫瘍の小規模な細胞個体群に存在するので、ＣＳＣを選択的に死滅させる作用物質は、腫瘍サイズの急速な低減に依存する現行のスクリーニング法において見逃される可能性がある。
【０００３】
作用物質が相当数のＣＳＣを残してしまう場合、残存細胞は、腫瘍を急速に再形成することができる。現行の治療の効力についての理解に対するその影響に加えて、癌の幹細胞モデルは、将来の治療標的の同定に対して影響を及ぼす可能性がある。発現分析を腫瘍形成癌細胞の濃縮物個体群へ向けると、新規診断マーカー及び新規治療標的の同定がより効果的となるはずである。加えて、ＣＳＣの維持に関連する経路を直接標的とする治療が、成功する著しく大きな可能性を有するであろうことが明白となる。
癌発症に関与する遺伝子改変がＣＳＣで発生すると想定される場合、この問題に基づくマウスモデルを設計することができる。新たな戦略は、ＣＳＣ表現型の維持に関与する過程を決定することに焦点を合わせるべきである。このことが、新たな標的を同定して、それらに対して薬剤を設計する目的である。したがって、この方法で生成したマウスモデルは、この状況において、ＣＳＣの維持に対して向けられる薬剤を設計するための基本的なツールである。
多くの新しい抗癌剤は、癌発症の従来と異なった局面を標的にし、予測不可能な方法で他の薬剤と相互作用する。これらは、患者の小規模な亜集団にしか臨床利益を示さないと予測される。
加えて、現行の治療の効力を改善するために、癌の幹細胞モデルも潜在的な治療標的の同定の助けになる。発現分析を腫瘍形成癌細胞の濃縮物個体群へ向けると、新規診断マーカー及び新規治療標的の同定がより効果的となる。最近の証拠は、ＣＳＣの維持に関与する経路を直接標的にする治療が、成功する著しく大きな可能性を有することも示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌発症に関与する遺伝子改変がＣＳＣで発生するという理解に基づいて、この遺伝子改変を正確に再現するマウスモデルを設計することが可能である。第１に、ＣＳＣ表現型の維持に何が関与しているかを決定しなければならず、それは、標的の同定、及びそれらに対して使用する潜在的な薬剤の基本になるからである。したがって、この戦略に従って生成されたマウスモデルのような動物モデルは、ＣＳＣの維持を阻害する薬剤を設計する基本的なツールを表す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一つの態様において、本発明は、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む、動物癌モデルに関する。遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子は、本明細書において活性化されうる遺伝子と呼ばれる。この構築物によって、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、活性化されうる遺伝子を含み、かつ発現する幹細胞（ＳＣ）を含有する。
【０００６】
本発明の一つの態様は、ヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む、そのようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物から場合により単離される幹細胞（ＳＣ）に関する。特定の実施態様において、前記ＳＣは癌幹細胞（ＣＳＣ）である。ＳＣ又はＣＳＣは、とりわけ、齧歯類ＳＣ又はＣＳＣであることができる。
好ましくは、本発明の上記の態様によると、ヒト病理は、癌、好ましくは固形腫瘍である。固形腫瘍の幾つかの例には、間葉癌、例えば肉腫；上皮癌、例えば癌腫；リンパ腫などが挙げられる。
発明者たちは、動物モデルにおいて、ＣＳＣ生成癌が同等のヒト癌表現型を忠実に複製することを発見した。現行の動物モデル、主にマウスモデルは、ヒト癌と相関する遺伝子型−表現型を再現することに失敗している。これらのモデルにおいて、マウスに導入されたヒト癌遺伝子欠損は、癌遺伝子欠損が全ての細胞又は特定の分化細胞のいずれかに存在する動物モデルをもたらす。そのようなマウスモデルは、癌幹細胞モデルを考慮することなく生成され、したがって、正確なヒト癌標的細胞の性質を考慮していない。したがって、これらのモデルは、ヒト癌遺伝型−表現型相関関係をあまり再現しておらず、ヒト癌患者において見られる反応パターンと異なって薬剤に反応する。事実、そのような従来のモデルにおいて標的及び薬剤候補を選択すること及び／又は試験することは、ヒトの反応を予測し得ないことが、発明者たちの論点である。
【０００７】
例えば、Ｈ−ＲａｓV12Gがマウスで発現する場合、黒色腫を反映するマウス表現型をもたらす。対照的に、ヒト表現型は、膀胱癌、腎癌及び甲状腺癌である。例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を使用するマウスの遺伝子欠失は、癌のマウスモデルを治癒する。対照的に、同じ産物はヒトでは緩和をもたらさない。
第２の例は、マウスモデルでＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）をもたらすＢＣＲ−ＡＢＬp210により提供することができる。ヒトにおいて、表現型は、全く異なっている（慢性骨髄性白血病、ＣＭＬ）。マウスＢ−ＡＬＬモデルにおいて、Gleevec（商標）は、癌を治癒するが、ヒトにおいて、この生成物は、症状の緩和しかもたらさない。したがって、マウスモデルへの癌に関連している遺伝子欠損の単なる非標的化導入は、どのような方法によっても、ヒトの状態を映す疾患状態の確立をもたらさないことが明かであり、おそらくそれは、遺伝子が、疾患を生じることに関与するマウス中の細胞を正確に標的にしていないからである。
【０００８】
癌の新たな動物モデルの緊急の必要性は、この分野における専門家の意見により支持されており、現在、現行の動物モデルが、不適切であること、及び新たなマウスモデルが癌治療におけるあらゆる基本的な改善の鍵であることが十分に実証された事実である。例えば、Robert Weinbergは、「全体的な癌研究の努力において依然として未解決である基本的な問題は、ヒト癌の前診療モデルが必須であるということである」と記載している（２００４年３月）。フォーチュン誌において、彼は、「戦いに勝つためには、ヒトの反応をより良好に模倣する動物モデル及び癌発症を予測するバイオマーカーが必要である」と記載している（２００４年３月２２日）。
本発明者たちにより求められた疑問は、なぜそれほど多くの癌のマウスモデルが不適切であるかということを問うていた。その答えは、癌が繁殖性疾患ではないこと及び癌幹細胞がヒトの癌の真実の細胞標的を提供することに答えがあると発明者たちは信じている。ＣＳＣは、特有であり、かつ腫瘍の大部分を形成する細胞と異なっている特性及び経路を有すると考えられる。体幹細胞中で、ヒト病理に関連する遺伝子異常を標的にすることによって、ヒト病理状態を正確に映す動物モデルを確立することが、発明者たちによって確立された。白血病に加えて、これらの動物モデルは、固形腫瘍を生成する。このことは極めて驚くべきことであり、最も有益である。
【０００９】
癌幹細胞動物モデルの望ましい特性は、その動物においてヒト癌を反復しなければならないことである。そのような望ましい特性には、ヒト癌と同様な組織学的特徴の確立；同じ疾患ステージを通して進行しなければならないこと；宿主に対して同じ全身的効果を引き起こさなければならないこと；腫瘍開始／進行において同じ遺伝子経路を生じなければならないこと；現行の治療手法に対してヒトと同じように反応しなければならないことが挙げられる。
この知識を持ちながら、発明者たちは、ヒト腫瘍遺伝子を幹細胞に発現する複数の動物モデルを生成した。これらのモデルは、組織病理学と治療剤への反応の両方でヒト癌を模倣することが見出された。これらのモデルを、新規の治療手法を発見するため、治療効力を評価する新たな方法を発見するため、新たな診断ツールを発見し、最適化するため、スクリーニングするＣＳＣの供給源として、新規及び現存の薬剤／薬剤候補を試験するための組織化された手法で使用することができる。これらの手法及びモデルの全ては、本発明の実施態様を形成する。
本発明の記載の理解を促進するために、本発明の文脈における幾つかの用語及び表現の意味を下記で説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
用語「幹細胞」（ＳＣ）は、それ自体が自己複製を介して永続化する能力、及び分化を介して特定の組織の成熟細胞を生成する能力を有する細胞を意味する。これらは、多能性であり厳密に制御されている自己複製組織細胞である。ＳＣの例には、造血幹細胞、神経幹細胞、肉腫幹細胞、乳房幹細胞、肺幹細胞、能幹細胞、前立腺幹細胞、膵臓幹細胞などが挙げられる。
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍再発と転移の両方に関与しており、新規分子標的を提供する新規細胞標的を提供することが、発明者たちの論点である。癌幹細胞は、細胞に特徴的である特定のマーカーを幹細胞区画において発現し、そのことは当業者には知られている。例えば、幹細胞はＳｃａ１+である。幹細胞は、また、Ｌｉｎ-である。
用語「癌幹細胞」（ＣＳＣ）は、広範囲に繁殖し、新たな腫瘍を形成し、癌の進展を維持する能力を有する細胞、すなわち腫瘍の形成及び増殖を駆動する無限の繁殖潜在能力を有する細胞を意味し、前記用語には、ＳＣにおける遺伝子改変と、ＣＳＣになる細胞における遺伝子改変の両方が含まれる。好ましい実施態様において、前記ＣＳＣはＳｃａ１+である。
【００１１】
用語「被験者」は、哺乳動物の種のメンバーを含む脊椎動物を意味し、愛玩動物、齧歯類（特に、ネズミ科の動物（murine animal））、霊長類及びヒトが挙げられるが、これらに限定はされず、被験者は、好ましくは、男性又は女性、任意の年齢又人種のヒトである。
用語「齧歯類」としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、好ましい実施態様において、齧歯類動物はマウスである。
表現「ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子」は、本明細書以降、「活性化されうる遺伝子」と呼ばれ、哺乳動物のゲノムに組み込まれたとき、遺伝子、改変遺伝子又は遺伝子融合が関連するヒト病理を再現する、遺伝子、改変遺伝子（突然変異、欠失、挿入、複製などを含む）又は遺伝子融合を意味する。好ましくは、本発明の活性化されうる遺伝子は、腫瘍遺伝子である。多くの腫瘍遺伝子は既知であり、特定の型の癌に関連している。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０は、慢性骨髄性白血病に関連している。ＢＣＲ−ＡＢＬp190、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ及びＥ２Ａ−Ｐｂｘ１は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）に関連している。他の例が下記に提示されており、更なる例も当業者に知られている。例えば、腫瘍遺伝子の包括的なリストは、http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/Geneliste.htmlで提供されており、Cooper G. Oncogenes. Jones and Bartlett Publishers, 1995; Vogelstein B, Kinzler KW. The Genetic Basis of Human Cancer. McGraw-Hill: 1998; http://cancerquest.org/index.cfm?page=780も参照すること。
【００１２】
用語「ヒト病理」には、幹細胞由来のヒト病理、並びに非幹細胞由来のヒト病理が含まれる。特定の実施態様において、ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。別の特定の実施態様において、前記活性化されうる遺伝子は、ヒト腫瘍病理又はヒト非腫瘍病理のような幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子である。
更なる特定の実施態様において、前記ヒト病理は固形腫瘍である。ヒト病理は、上皮又は間葉の癌から選択することができる。そのような癌の特定の例には、骨髄増殖性疾患、ヒトリンパ腫（例えば、バーキット様リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び辺縁層リンパ腫）、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫を含むリンパ球増殖性症候群、白血球減少症、血小板減少症、血管形障害；カポジ肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫を含む任意の肉腫、任意の間葉癌；肺癌（例えば、小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））を含む任意の癌腫、並びにリンパ腫、乳癌、皮膚癌及び腎癌が挙げられる。他の例には、新生物；黒色腫；並びに固形腫瘍、例えば、肺、結腸直腸、乳房、子宮、前立腺、膵臓、頭部及び頸部、脳の固形腫瘍が挙げられる。
【００１３】
別の特定の実施態様において、前記活性化されうる遺伝子は、造血又は胎児幹細胞移動のようなヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子である。別の特定の実施態様において、前記活性化されうる遺伝子は、神経障害、奇病、代謝疾患、免疫疾患、心血管疾患のようなヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子である。
したがって、本発明は、ヒト病理が動物モデル、特にマウスモデルで生成される、ヒト癌のモデルを包含する。この態様に関連する本発明の別個の実施態様は、上皮又は間葉の癌のモデルを提供する。そのようなモデルの例には、本明細書で記載されている、ヒトリンパ腫、白血病、肉腫及び癌腫、特に慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ球増殖性症候群、多発性骨髄腫、肉腫、例えば脂肪肉腫、ユーイング肉腫、癌腫、例えば肺癌、乳癌、皮膚癌及び腎癌のモデルが挙げられる。
【００１４】
動物モデルは、本発明のこの態様に従って、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む幹細胞（ＳＣ）を動物において生成することによって生成することができる。発明者たちは、これらのモデルが、ヒト癌と同様な組織学的特徴の確立；同じ疾患ステージを通した進行；宿主に対する同じ全身的効果を引き起こすこと；腫瘍開始／進行において同じ遺伝子経路を活性化／抑制すること；多様な治療手法に対してヒトと同じように反応することを含む、癌状態のあらゆる忠実な再現に必要な特徴を全て共有することを確立した。
本発明の癌モデルを生成するために、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子（活性化されうる遺伝子）は、好ましくは、Ｓｃａ１+細胞において前記遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される。そのようなプロモーターは、転写の開始に関与し必要である核酸の配列であり、前記細胞において活性化されうる遺伝子の発現を指示し、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含む。本発明の文脈内において、用語「プロモーター」は、転写調節タンパク質が結合できる他の部位も含むことができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、このプロモーターは、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子異常の発現を指示する任意の真核細胞プロモーター、すなわち、幹細胞区画でのみ活性であり、細胞が幹細胞の状態を越えて分化すると不活性である任意のプロモーターであることができる。幹細胞区画で活性であるが、分化細胞でも活性であることができるプロモーターは、本発明での使用には不適切である。幹細胞にのみ特異的なプロモーターの活性は、本発明の重要な態様である。好ましくは、プロモーターは、Ｓｃａ１を発現する細胞で活性であり、場合により、ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）又はヒトの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３；α２βｌインテグリンなどを発現する細胞においても活性であるものである。プロモーターは、好ましくはＬｉｎ＋である細胞において不活性である。
例えば、プロモーターは、任意の真核細胞Ｓｃａ１プロモーター、特に脊椎動物、動物、哺乳動物、齧歯類又はマウスから誘導されるＳｃａ１プロモーターである。適切なプロモーターの別の例には、ｍｕｓａｓｈｉ−１及びｍｕｓａｓｈｉ−２プロモーター、並びにその機能的同等物が挙げられる（Siddall NA et al. Proc. Natl Acad. Sci.USA 103: 8402-8407, 2006）。マウスｍｕｓａｓｈｉ−１遺伝子の詳細は、GeneID: 17690 Primary source: MGI:107376 in Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で見出すことができる。
【００１６】
発明者たちが本発明を実証するために使用する特定の実施態様では、活性化されうる遺伝子の発現をＳｃａ１+細胞において指示するプロモーターは、マウスのｐＬｙ−６Ｅ１プロモーター又はその機能的フラグメント若しくはその機能的同等物であることができる。換言すると、動物モデルにおいて、例えばこの場合はマウスにおいて、異なる導入遺伝子の組織特異的発現を指示することができる。ｐＬｙ−６Ｅ１プロモーターは、十分に特徴決定されており、Ｓｃａ１+細胞における選択的発現に必要な全ての要素を含んでいる[Miles C., Sanchez M-J, Sinclair A, and Dzierzak, E. (1997) "Expression of the Ly-6E.1 (Sca-1) transgene in adult haematopoietic stem cells and the developing mouse embryo". Development 124:537-547]。したがって、特定の実施態様では、前記活性化されうる遺伝子の発現をＳｃａ１+細胞において指示するプロモーターは、マウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物である。このプロモーターの機能的同等物は、当業者に周知であり、ｐＬｙ６Ａ遺伝子、Ｔｍｔｓｐ遺伝子、ｃ−ｋｉｔ遺伝子、マウスＣＤ３４遺伝子、Ｔｈｙ１遺伝子などのプロモーターが挙げられる。
【００１７】
表現「機能的に結合される」は、活性化されうる遺伝子の配列に対するプロモーターの方向付けに関する。プロモーターは、活性化されうる遺伝子の発現を制御又は調節することができるように配置されている。
前記活性化されうる遺伝子の例示的な非限定例には、ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＢＣＲ−ＡＢＬp190、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、ＴＡＬ１、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１、ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３、ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ−ＡＴＦ１、ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７、Ｋ−ＲＡＳｖ１２、Ｎｏｔｃｈ１などとして当該技術で同定されている遺伝子が挙げられる。ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＢＣＲ−ＡＢＬp190、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２及びＴＡＬ１遺伝子に関する情報は、ＷＯ０３／０４６１８１に見出すことができる。これら全ての遺伝子及び遺伝子融合の配列は、当業者により現存のデータベース、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=geneから簡単に入手することができる。当業者が理解するように、使用されるこれらの遺伝子のいずれか１つの正確な配列は変わることができる。好ましくは、哺乳類の活性化されうる遺伝子、例えばマウス配列、より好ましくはヒト配列が使用される。しかし、本発明は、例えば多型変種、突然変異体及び野生型と考慮されない他の遺伝子型を含むように、変種の活性化されうる遺伝子の使用を含む。例えば、そのような遺伝子を、疾患のパターンの差を反映し、患者群にわたる治療に反応するなどの可能性があるような遺伝子の腫瘍形成潜在能力における差を調査するのに使用できる。したがって、上記で参照された各遺伝子に対する参照には、その範囲内で、例えば、上記で表された受入番号で表される配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上の有意な相同性又は配列同一性を共有するような遺伝子の変種への参照が含まれる。遺伝子は、ｃＤＮＡであることができるか、又はゲノム配列を含むことができる。ｃＤＮＡが好ましい。
【００１８】
固形組織Ｓｃａ１+細胞における腫瘍遺伝子活性化は、固形組織癌腫をもたらすことが、本明細書で示されている。この研究は、ＡｄｅｎｏＣｒｅを条件的に使用して腫瘍遺伝子（この場合、一つの好ましい例として、ヒトＫＲＡＳｖ１２）を活性化する条件系を使用して、マウスにおいて例示されている。この系において、非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の肺癌が、ＡｄｅｎｏＣｒｅ感染、すなわち腫瘍遺伝子活性化の約３〜５か月後に観察された。
したがって、固形組織中のＳｃａ１+細胞を、ヒト造血性癌に関連する遺伝子欠損について標的化すると、固形腫瘍発症をもたらすことが、本明細書で実証される。
例えば、発明者たちのＣＭＬのモデル（下記を参照すること）は、７９％のマウスでＣＭＬ疾患のみを生成することを示した。残りは、ＣＭＬと、肺腺癌（肺ＡＤＣ）（１２％）、肝腺癌（肝ＡＤＣ）（３％）、線維性組織球腫（２％）、骨肉腫（２％）及びセルトリ細胞腫（２％）から構成される。
【００１９】
したがって、本発明のこの態様は、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される活性化されうる遺伝子（すなわち、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子）を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有し、固形腫瘍を生成するか又は生成する潜在能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。固形腫瘍の例には、骨髄増殖性疾患、ヒトリンパ腫（例えば、バーキット様リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び辺縁層リンパ腫）、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫を含むリンパ球増殖性症候群、白血球減少症、血小板減少症、血管形障害；カポジ肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫を含む任意の肉腫、任意の間葉癌；肺癌（例えば、小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））を含む任意の癌腫、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、膵癌、頭部及び頸部、脳、並びに腎臓の癌、新生物；黒色腫などが挙げられる。
【００２０】
Ｓｃａ１+Ｒｈｏｍ２マウスを使用する発明者たちのＴ−ＡＬＬモデルは、７４％でＴ細胞又はＨＳＣ疾患のみを生成し、残りは、造血性疾患と、肺腺癌（１６％）、肝腺癌（５％）及び他（５％）から構成される。Ｓｃａ１+Ｈｏｘ１１マウスも同様なパターンを有する。
Ｓｃａ１+ＢＣＬ６マウスを使用する発明者たちのＢ細胞リンパ腫モデルは、８６％でリンパ腫疾患のみを生成し、残りは、リンパ腫と、肺腺癌（９％）及び肝腺癌（３％）から構成される。
ＢＣＲ−ＡＢＬp210は、慢性骨髄性白血病に関連している。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすＣＭＬの動物モデルを、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。ＢＣＲ−ＡＢＬp210をコードする構築物を、ＢＣＲ−ＡＢＬp210転写物が幹細胞区画、特にＳｃａ１+Ｌｉｎ-細胞で生成されるように配置するべきである。
【００２１】
そのようなモデルは、ヒトＣＭＬの病理の多様な特徴を反復することが見出された。例えば、発明者たちにより生成され、本明細書に記載されているマウスモデルは、慢性（骨髄増殖性）期及び急性転化を示す。造血幹細胞の大きさは正常である。更に、Gleevec（商標）はＣＭＬを治療するのに効果的ではなく、ヒトの状態の場合では、症状の緩和しか提供しない。このことは予想外ではあったが、ヒトＣＭＬの病理の関連する特徴を再現する現実的なモデルとして、このモデルの信頼性についての良好な証拠を提供する。
本発明のＣＭＬモデルは、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を動物の幹細胞区画に導入することによって確立することができる。ＢＣＲ−ＡＢＬp210の配列は、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されることができる。マウスモデルの生成に適切なそのようなプロモーターの例は、マウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又は機能的フラグメント若しくはその同等物である。他の例は、本明細書を読むことによって当業者に明らかになる。
【００２２】
そのようなモデルにおいて、幹細胞が幹細胞状態を越えて分化した後では、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞でのＢＣＲ−ＡＢＬp210転写物の割合は高く、Ｓｃａ１-Ｌｉｎ+細胞では低いことが見出されている。本発明者たちにより提唱されているＣＳＣ理論を支持するように、ＢＣＲ−ＡＢＬp210転写物のパターンは、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞とＳｃａ１-Ｌｉｎ+細胞の両方でＣＭＬの発症の前後で異なっていないことも見出されている。このことは、ＢＣＲ−ＡＢＬp210それ自体は、癌の状態に直接的な役割を演じないが、実際には癌疾患の真の原因である更に下流の（癌細胞の刷込みを課すことによる）発生的／後成的修飾を引き起こすという論点を支持する。
発明者たちの知る限りにおいて、この幹細胞駆動ＣＭＬ発症は、ヒトＣＭＬ及び急性転化を再現する最初のマウスモデルである。ヒトの状態で見られる疾患のパターンと同様に、これらのモデルは、ＣＭＬから急性転化へ自発的に進行する。更に、これらの動物の脾臓及び肝臓における巨核球が、骨髄化生を定義する。ＦＡＣＳ分析も末梢血における成熟骨髄細胞の蓄積を示す。更に、マウスモデルは、ヒトにおける悪性形質転換に関連するＤＮＡメチル化変化を反映する。
【００２３】
ＢＣＲ−ＡＢＬp190、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ及びＥ２Ａ−Ｐｂｘ１は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）に関連している。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすこの疾患の動物モデルを、ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ又はＥ２Ａ−Ｐｂｘ１のいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトＢ−ＡＬＬの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。腫瘍遺伝子配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２４】
Ｂ−ＡＬＬモデルのプロトタイプの例が本明細書においてマウスで示されており、ヒト病理の特性がマウス系で反映されている。特に、末梢血、肝臓、脾臓及び肺への広範囲なヒトＢ細胞芽細胞の浸潤が実証されている。
ＳＣＬ、ＨＯＸ１１、ＬＭＯ１及びＬＭＯ２は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に関連している。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすＴ−ＡＬＬの動物モデルを、ＳＣＬ、ＨＯＸ１１、ＬＭＯ１又はＬＭＯ２のいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトＴ−ＡＬＬの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、ＬＭＯ２配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２５】
Ｔ−ＡＬＬモデルのプロトタイプの例が本明細書においてマウスで示されており、ヒト病理の特性がマウス系で反映されている。特に、組織及び末梢血でのＴ細胞白血病の発症及びそれらへの芽球播種が示され、ヒト病理と同一である。
Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ及びＭＭＳＥＴ遺伝子は、多発性骨髄腫に関連する。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらす多発性骨髄腫の動物モデルを、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ又はＭＭＳＥＴのいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらのモデルは、全て、ヒトＢ−ＡＬＬの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ又はＭＭＳＥＴのいずれか１つの配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２６】
多発性骨髄腫モデルのプロトタイプの例が本明細書においてマウスで示されており、ヒト病理の特性がマウス系で反映されている。特に、形質細胞の浸潤が脾臓及び腎臓で示されており、腎不全の病理的徴候が見られる。形質細胞は、また、骨髄及び末梢血において、ヒトで見られるものと非常に類似した病理を示す。
ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及びｃｙｃｌｉｎ Ｄ３は、バーキット様リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）又は辺縁層リンパ腫のようなリンパ球増殖性障害に関連する。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすこれらの疾患の動物モデルを、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１又はｃｙｃｌｉｎ Ｄ３のいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトリンパ腫の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２７】
そのようなモデルのプロトタイプの例は、Ｓｃａ１+において配列の発現を指示するプロモーターの機能的な制御下で動物の幹細胞区画に組み込まれるＢＣＬ６遺伝子を使用して生成された。幹細胞が幹細胞状態を越えて分化した後では、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞でのＢＣＬ６転写物の割合は高く、Ｓｃａ１-Ｌｉｎ+細胞では低いことが見出されている。本発明者たちにより提唱されているＣＳＣ理論を支持するように、ＢＣＬ６転写物のパターンは、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞とＳｃａ１-Ｌｉｎ+細胞の両方でリンパ腫の発症の前後で異なっていないことも見出されている。このことは、ＢＣＬ６それ自体は、癌の状態に直接的な役割を演じないが、実際には癌疾患の真の原因である更に下流の（癌細胞の刷込みを課すことによる）発生的／後成的修飾を引き起こすという論点を支持する。
【００２８】
この疾患モデルは、ヒトで見出される疾患の病理を反映する。例えば、モデルでの脾臓における広汎性大Ｂ細胞リンパ腫は、ヒトで見られるものを正確に模倣する。Ｐａｘ５及びＣＤ２１＋ｖｅＢ細胞は、肺及び腎臓に浸潤する。事実、Ｓｃａ１+ＢＣＬ６マウスにおけるこれらのＢ細胞はＢＣＬ６を発現せず、ＢＣＬ６を標的にすることは、癌治療の過剰な実施であるという論点に更に重みを加える。更に、Ｓｃａ１+ＢＣＬ６マウスとＢｃｌ６欠損マウスとの交配は、表現型を救出しないことが見出された。
さらにより興味深いことに、マウスで生成されたＢ細胞リンパ腫は、ヒトＢ細胞リンパ腫と分子的に類似している。例えば、ヒトＤＬＢＣＬを分類するために使用される伝統的な分子予後マーカーは、本明細書で生成され記載されているＤＬＢＣＬモデルに存在する。そのようなマーカーには、Ｍｄｍ２、Ｂｃｌ−２、ｐ２７−Ｃｃｎｄ３、Ｅｚｈ２−Ｂｍｉ１、ｃ−Ｍｙｃ、Ｆｏｘｐ１及びＰｄｅ４ｂが挙げられる。このパターンのＢ細胞リンパ腫を有することによって特徴付けられる動物モデルは、本発明の更なる態様を形成する。
更に、本発明のモデルにおけるＢ細胞リンパ腫は、ヒトＡＢＣ−ＤＬＢＣＬと同様な分子サインを有する。ヒト（Alizadeh, AA. et al. Nature, 2000; 403:503）においてもこれらのマウスモデにおいてもＡＢＣ−ＤＬＢＣＬは、ＢＣＬ６を発現しない。加えて、Ｓｃａ１+Ｂｃｌ６マウスは、ヒトＡＢＣ−ＤＬＢＣＬで観察されるものと同様な形質細胞分化阻止を示す。
【００２９】
ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ及びＦＵＳ−ＥＲＧは、急性骨髄性白血病に関連している。発明者たちは、これらの疾患の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ又はＦＵＳ−ＥＲＧを組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒト骨髄性白血病の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
ＥＷＳ−ＷＴ１及びＥＷＳ ＦＬＩ１は、ユーイング肉腫に関連する。発明者たちは、ユーイング肉腫の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＥＷＳ−ＷＴ１又はＥＷＳ ＦＬＩ１を組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトユーイング肉腫の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００３０】
ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３及びＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３は、粘膜様脂肪肉腫に関連する。発明者たちは、粘膜様脂肪肉腫の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＦＵＳ−ＤＤＩＴ３又はＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３を組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒト粘膜様脂肪肉腫の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
ＦＵＳ−ＡＴＦ１は、血管腫様線維性組織球腫に関連する。発明者たちは、血管腫様線維性組織球腫の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＦＵＳ−ＡＴＦ１を組み込むことによって生成できることを確立した。この遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒト血管腫様線維性組織球腫の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、この配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００３１】
ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７は、低悪性線維粘液肉腫（ＬＧＦＭＳ）に関連する。発明者たちは、ＬＧＦＭＳの動物モデルが、動物の幹細胞区画へＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７を組み込むことによって生成できることを確立した。この遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトＬＧＦＭＳの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、この配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
本発明に従って生成されたモデルは、ヒトにおける薬剤反応で予測されるような方法で薬剤に反応する。
【００３２】
例えば、ヒト多発性骨髄腫の治療に成功していないメルファラン−プレドニゾンレジメンは、本明細書に記載されている多発性骨髄腫モデルにおいても成功していない。ヒト肺癌の治療に成功していないドキソルビシンは、本明細書に記載されている肺癌モデル、例えばＳｃａ１+ｈＫＲＡＳマウスにおいても成功していない。この薬剤については、本発明のマウスにおけるヒト及びＤＬＢＣＬモデルにおいても同じである。ドキソルビシンは、ヒトリンパ腫の治療において最も活発に使用されている薬剤の一つである。これは、実質的に全てのヒトリンパ腫患者がドキソルビシン再発により治療されている現実にも関わらずである。
ヒトＢｃｒＡｂｌ白血病の治療に成功していないGleevec（商標）（イマチニブ）は、本明細書に記載されているＢｃｒＡｂｌ白血病モデルにおいても成功していない。Gleevecは、ヒトＣＭＬに症状の緩和をもたらすが、この場合でも、本明細書に記載されているＣＭＬのマウスモデルにおいてＣＭＬを治癒しない。発明者たちにより提唱されている明快な仮説は、この有効な治療に失敗したのは、GleevecがＣＳＣを死滅させなかったからということである。本明細書に記載されているモデルを使用して、ＣＳＣを死滅させ、したがって癌を治癒する次世代のGleevecを開発することができる。
【００３３】
更に、ヒト精巣癌の成功した治療レジメンは、本明細書に記載されているマウスモデルでも成功している。ＳＮＡＩＬがＳｃａ１+細胞で発現するモデルにおいて、ＢＥＰ（ブレオマイシン、ＶＰ１６＝エトポシド、シス−プラチン）で処置されたマウスは、７週間以内に腫瘍がなくなっている。ＢＥＰはヒト精巣癌を治癒し、毒性が高いが、癌を治癒することが知られている唯一の癌治療である。
したがって、ＣＳＣの同定は、癌治療のパラダイムシフトを表すことが明確である。本明細書に含まれるデータは、ＣＳＣが細胞の真実の個体群であり、かつ癌疾患の生成に関与していることに疑う余地のないことを実証している。しかし、ＣＳＣを（標的同定、薬剤発見などのため）標的として治療プログラムで使用する前に、２つのことを示すことが重要である。第１には、これらの除去が、動物全身における腫瘍形成の後、インビボで癌を排除することを意味すること。第２には、ＣＳＣがどのように正常な幹細胞と異なるかを知る必要があり、それによってこれらを選択的に標的化できることである。
【００３４】
当然のことながら、ＣＳＣが癌疾患を維持できることが本明細書において示されている。例えば、本明細書に開示されている実験は、Ｓｃａ１Ｂｃｌ６マウスの骨髄から精製されたＳｃａ１+Ｌｉｎ-細胞が、再構成されたマウスの１００％でヒトＢ細胞リンパ腫を生成することを示している。対照的に、脾臓誘導腫瘍Ｂ細胞は、リンパ腫を全く生成しない。
加えて、ＣＳＣの除去後の癌の排除が、ｐＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスのガンシクロビル処置を使用して本明細書において初めて実証されている（実施例１を参照すること）。この場合、ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０構築物が、ｐＬｙ６プロモーターの機能的制御下でＳｃａ１+遺伝子に導入される。予測されたように、上記に記載されたＣＭＬモデルにおいてＢＣＲＡＢＬｐ２１０構築物の発現パターンをもたらすと、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０及びＴＫ転写物のパターンは、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞において高く、Ｓｃａ１-Ｌｉｎ+細胞では非常に低いことが見出された。ＨＳＶ−ｔｋの発現は、プロドラッグヌクレオシドガンシクロビルの、リン酸化塩基類似体としてのその薬剤形態への変換を誘導する。リン酸化ガンシクロビルは複製細胞のＤＮＡに組み込まれ、Ｇ２／Ｍチェックポイントで非可逆的停止を引き起こし、続いてアポトーシスを引き起こす（Rubsam LZ et al. Cancer Res 1998, 58: 3873-3882）。発明者たちは、Ｓｃａ１＋細胞の除去を治療標的として使用できるか、及びＣＳＣの死滅が癌治療の有効な治療戦略であるかを決定するために使用できるかという疑問に対処するためにこのモデルを開発した。１００％のマウスが腫瘍を有する出発時点から、３０匹のマウスを対照として使用し、毎日、生理食塩水に付した。残りの６０匹のマウスには、毎日、ＧＣＶを注射した。この期間の間で、癌は完全に消滅した。更に、ＧＣＶ処置後に消滅した癌を担持していたこれらのマウスを、更に３か月間観察して、腫瘍の再発は観察されなかった。したがって、これらのマウスにおけるガンシクロビル処置は、腫瘍量の完全なる低減をもたらす。
【００３５】
ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−Ｂｃｌ６構築物を含むマウスで実施された研究においても、全く同じことが事実であると示された。
この研究は、ＣＳＣの死滅が、癌治療の有効な治療戦略であり、その潜在的な用途が広いことを初めて実証する。
したがって、本発明は精製されたＣＳＣに部分的に関連する。これらのＣＳＣは、単離され、精製され、特徴決定された。これらの精製ＣＳＣを、上記に記載された本発明の態様のうちのいずれか１つのモデルから、特に上記に記載されたマウスモデルから単離することができる。実施態様において、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えばｍＣＳＣ）は、マーカーを、例えば、癌幹細胞の特定の単離及び／若しくは同定のために、又は癌幹細胞の獲得のために、又は健康な幹細胞から癌幹細胞を分化させるために有用なマーカーを更に含む。前記の目的を達成することができるＳＣから又はＣＳＳからの実質的にあらゆる産物、例えば、遺伝子、タンパク質などを使用することができる。前記マーカー関する情報を、ＳＣ及び／若しくはＣＳＣを単離する及び／若しくは同定するアッセイを設計するため、又はＳＣ及び／若しくはＣＳＣを獲得するため、又は健康なＳＣからＣＳＣを分化するために使用することができる。マウスゲノムとヒトゲノムとの類似性のために、上記に記述した目的に有用なマーカーを、ヒトＳＣ（ｈＳＣ）及び／又はヒトＣＳＣ（ｈＣＳＣ）において同じ目的を達成するために使用することもできる。
【００３６】
したがって、本発明の一つの態様は、癌幹細胞の実質的に純粋な培養物に関する。好ましくは、前記ＣＳＣはＳｃａ１+である。そのような細胞は、Ｓｃａ１抗原を有意なレベルで発現することができる。他の有用なバイオマーカーの例には、ヒトにおけるヒト上皮抗原（ＨＥＡ）、ＣＤ１３３；α２βｌインテグリンが挙げられる。１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のこの型のマーカーを、本発明の幹細胞により発現することができる。ＣＳＣは好ましくはＬｉｎ−である。ＣＳＣは、ＣＤ３８-であることもできる。
本発明のＣＳＣは、癌を繁殖及び維持する潜在能力を有する。この能力を、本明細書で記述されるアッセイのどれかを使用して試験することができる。例えば、健康なマウスへのＣＳＣの移植は癌を引き起こし、適切な機能確認アッセイをもたらす。適切なアッセイの特定の例は、実施例１３に提示されている。
【００３７】
本発明のＣＳＣは、例えば、前立腺癌幹細胞、脳、乳房、腸、結腸、肺、卵巣、白血病、上皮、固形腫瘍、又は任意の上皮及び間葉癌のようなあらゆる種類の癌幹細胞であることができる。ＣＳＣは、任意の脊椎動物癌幹細胞であることができるが、最も興味深いものはヒトと非ヒトの両方の癌幹細胞、哺乳類及び特にマウス細胞を含む齧歯類を含む動物幹細胞である。好ましくは、実質的に純粋な培養中の細胞の少なくとも５０％が癌幹細胞であり、この割合はより多くなることができ、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上であることができる。癌幹細胞の実質的に純粋な培養物は、好ましくは、癌幹細胞ではない癌細胞の５０％未満を含有し、この割合はより少なくなることができ、例えば、２５％、１０％、５％、１％又はそれ以下であることができる。
【００３８】
本発明の癌幹細胞は、他の型の細胞に対して、例えば患者又は細胞の培養から直接得られた未処理生物学的試料と比較して、５倍濃縮、２５倍濃縮、５０倍濃縮又はそれ以上のＣＳＣであることができる。そのような他の細胞型には、体内又はインビボ培養に存在する非幹癌細胞、非癌性幹細胞及び他の健康な細胞が挙げられる。
加えて、本発明の癌幹細胞は、好ましくは、ヒトにおけるＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ１４０ｂ及びグリコホリンＡ（ＧＰＡ）からなる群ｉ）より選択される１つ以上の成熟系列マーカーの有意なレベルを発現しない。本発明の癌幹細胞は、好ましくは、ＣＤ２４を発現しないか、低レベルのＣＤ２４を発現する。本発明の癌幹細胞は、Ｌｉｎ−であり、成熟系列マーカーを発現しない。
本明細書で使用されるとき、「有意なレベル」とは、好ましくは、例えばウエスタンブロッティングのようにブロッティング手順で抗体を使用して、マーカータンパク質を検出可能なレベルで発現させることを意味する。
【００３９】
本発明の特定の態様によると、多様な遺伝子及びそれらのコードタンパク質が、ＣＳＣ癌状態に関与している。これらの発見は多数の開発を可能にする。例えば、ＣＳＣを、これらの遺伝子及びタンパク質の同定に応じて、実施された個別及び関連する治療介入において同定することができる。腫瘍を、癌治療により有利に反応するような分類に層別化することができる。特定の評価を、これらの遺伝子の１つ以上について患者の発現プロフィールを作ることができ、これらの評価に基づいて、診断を、患者が治療に適切な候補者であるか、そうであれば、どのような治療剤が適切であるかについて処方することができる。そのような場合は、どのような形態の治療（例えば、投与量、投与時間及び方法、薬剤の組み合わせ）を行うことが最適であるべきかについてより詳細な評価を行うことができる。
例えば、マイクロアレイを使用して、発明者たちは、健康なＳＣと比較して、Ｂｍｉ−１、Ｎａｎｏｇ、ＰＵ．１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＥＢＰｇ／ｚ、Ｒ−ＩＬ３、Ｂｃｌ２、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＰＣＤＣ２、ｐ２１、ｐ５３、ｍｄｍ２、Ｐ２７及びＣＣＮＤ２の発現レベルがＣＳＣで異なることを発見した。更に、これらの遺伝子の発現レベルは、癌発症の前及び癌発症の後のＣＳＣで異なっている。このことは、リンパ腫の疾患で例示された。特に、マイクロアレイの結果の分析データは、３個のマーカー：Ｂｃｌ−２、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３で特に有意な差を示す。Ｂｃｌ−２マーカーは、対照レベルと比較して、リンパ腫の発症の後の遺伝子発現に有意な減少を表した。一方、後者の２個のマーカー、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３は、対照と比較して、リンパ腫の発症の後で増加した反応を示した。これらの結果は、臨床的に検出できる癌の前のＣＳＣは、癌が臨床的に検出されたときのＣＳＣと異なることを示す。これらの結果は、ＣＳＣの情報を、ｉ）健康なヒトにおける癌の発症を予測すること、及びｉｉ）予防治療により癌の発症を防止することなどに使用できることを示す。そのような情報は、癌患者又は従来のマウスモデルから得られる研究されたＣＳＣから得ることはできない。したがって本発明のマウスモデルは、この分野で提起された多様な挑戦に対処する独特の供給源を表す。
【００４０】
したがって本発明のこの態様は、癌を発症し易い又は癌に罹患している個人を診断する方法であって、前記患者からの組織において、Ｂｍｉ−１、Ｎａｎｏｇ、ＰＵ．１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＥＢＰｇ／ｚ、Ｒ−ＩＬ３、Ｂｃｌ２、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＰＣＤＣ２、ｐ２１、ｐ５３、ｍｄｍ２、Ｐ２７及びＣＣＮＤ２又はこれらの発現産物の群からの遺伝子のいずれか１つの配列、又は発現レベル、又は活性を検出すること、及び前記配列、発現レベル又は活性を基準と比較することを含み、前記基準と異なる配列、発現レベル又は活性が、疾患又は疾患に対する罹病性を示す方法を提供する。一般に、Ｂｍｉ−１、ＰＵ．１、Ｐａｘ−５ａ、ＣＥＢＰｇ／ｚ、Ｂｃｌ２、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＰＣＤＣ２及びｐ２１では、基準レベルよりも有意に高いレベルは、個人が罹病している又は罹病し易いことを示す。「有意に」とは、発現又は活性のレベルが、基準レベルよりも１０％、２５％、５０％、１００％、２５０％、５００％、１０００％又はそれ以上高いことを意味する。一般に、Ｎａｎｏｇ、Ｅ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ｃ−Ｋｉｔ、Ｒ−ＩＬ３、ｐ５３、ｍｄｍ２及びＣＣＮＤ２では、基準レベルよりも有意に低いレベルは、個人が罹病している又は罹病し易いことを示す。基準レベルは、患者の健康な幹細胞における発現レベルである。
【００４１】
更なる実施態様において、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えばｍＣＳＣ）は、更にレポーターを含む。本発明によると、レポーターは、細胞膜の表面に結合される又はＳＣ若しくはＣＳＣの内部に導入されている産物であり、発症、進行、播種、及び更なる生理病理学的過程の空間時間的同定を可能にし、並びに分子画像技術による効果的な治療を可能にする。適用できる例示的な非限定的分子画像技術には、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＴＡＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、高性能Ｘ腺など、酵素反応に基づく生物発光シグナルの発信に基づいた方法、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような標識を含有する遺伝子構築物の挿入に基づいた方法などが挙げられる。前記の目的を達成することができる実質的にあらゆるレポーターを使用することができる。前記レポーターを、診断アッセイ（例えば、ヒトの疾患の分子フィンガープリント法など）、薬剤発見及び開発法、標的同定、並びに薬剤耐性又は個別化医療の臨床開発の全段階及びその使用での効力及び信頼性の改善において役割を果たすこともできる。
【００４２】
本発明のＣＳＣを、例えば患者からの試料中で単離、濃縮及び精製することができる。患者は、癌と診断された個人、癌を罹患する危険性があると考えられる個人、癌を有すると疑われる個人、又は癌を有するとは疑われず、良好な健康状態であるという外観を与える個人であることができる。本発明で使用されるとき、用語「試料」は、液体試料、例えば血液、精液、血漿、唾液、尿など又は固形試料、例えば組織試料のような、ＳＣ又はＣＳＣを含有し易い任意の生物学的試料であることができる。適切な固形組織の例には、骨髄、脾臓、肝臓、肺などが挙げられる。試料は、固形試料の場合では外科的除去を含む、あらゆる従来の方法によって得ることができる。試料は、幹細胞由来のヒト病理、例えば癌を有すると以前に診断された若しくは診断されていない被験者から、又は治療を受けている、若しくは幹細胞由来の前記ヒト病理のために以前治療された被験者からも得ることができる。
本発明のこの態様は、患者又は患者の集団からＣＳＣの単離、濃縮及び精製を可能にする。このことは、癌幹細胞における癌性増殖に影響を与える因子を同定するため、遺伝子発現又はタンパク質発現のパターンについて癌幹細胞の個体群を分析するため、新たな抗癌剤標的を同定するため、現存の又は新たな治療に対する癌幹細胞の感受性を予測するため、並びに癌発症及び治療の一般的なモデル化を行うためのアッセイを開発することを可能にする。
【００４３】
代替案において、本発明のＣＳＣを培養中で増殖することができる。細胞を、本明細書で記載されている型のマウスモデルのような動物モデルから単離することができる。Ｓｃａ１の発現に加えて、癌モデル動物から単離したＣＳＣは、癌に関連する染色体異常（本明細書において、活性化されうる遺伝子と記載される）を含むことができる。前記染色体異常の例示的な非限定例には、ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＢＣＲ−ＡＢＬp190、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、ＴＡＬ１、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１、ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３、ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ−ＡＴＦ１、ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７、ｈＫＲＡＳｖ１２として同定されている遺伝子が挙げられる。上記に記述されたものを含む適切な活性化されうる遺伝子の配列は、従来技術において既知である。
【００４４】
本発明は、ＣＳＣを単離する方法も包含する。そのような方法は、本明細書に記載されているＣＳＣのバイオマーカーを発現する癌幹細胞の選択的濃縮を伴う。マーカーを発現する細胞の濃縮に適切な方法には、蛍光活性化細胞選別、免疫親和性交換などのような免疫学に基づく系が挙げられる。他の同等な例は当業者に既知であり、密度調整細胞選別、磁気細胞選別、抗原パニングなどが挙げられる。
本発明は、本発明の癌幹細胞を繁殖させる方法にも関する。そのような方法は、培養中の癌幹細胞を、少なくとも１つの選択される分化細胞型の細胞から産生された可溶化液の濃縮物に暴露し、濃縮物が、分裂した各癌幹細胞が２つの同一の娘癌幹細胞を産生する対称有糸分裂か、又は分裂した各癌幹細胞が１つの同一の娘癌幹細胞を産生し、癌幹細胞よりも分化している１つの娘癌幹細胞を産生する非対称有糸分裂のいずれかを優先的に起こすことによって癌幹細胞を繁殖させることができることを含む。
【００４５】
特定の実施態様において、ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。ヒト病理の例は、前に記載されている。説明のために、以下の遺伝子、改変遺伝子及び遺伝子融合が本明細書において特にヒト病理に関連している：多発性骨髄腫：ｍａｆ−Ｂ、ｆｇｆ−Ｒ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ；リンパ球増殖性症候群：Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−１０、ＭＡＬＴ１、ＣＹＣ Ｄ１、ＣＹＣ Ｄ３；Ｔ細胞急性白血病：ＳＣＬ、Ｈｏｘ１１、ＬＭＯ２、ＬＭＯ１；Ｂ細胞急性白血病：Ｂｃｒ−ａｂｌｐ１９０、ｔｅｌ、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２ａ−Ｐｂｘ１；急性骨髄性白血病：Ｔｅｌ−ａｂｌ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ；慢性骨髄性白血病：Ｂｃｒ−ａｂｌｐ２１０；脂肪肉腫：ＦＵＳ−ＣＨＯＰ；ユーイング肉腫：ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１；及び肺癌：Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ（Ｃｒｅリコンビナーゼ誘発性）。
【００４６】
本発明により提供されるＳＣ（ｍＳＣを含む）及び／又はＣＳＣ（ｍＣＳＣを含む）を、多数の戦略において、例えば、
−癌の過程を調査及び研究するため；又は
−ＣＳＣ個体群を同定、分類、単離、精製若しくは記述するため；又は
−被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出するため；又は
−被験者においてヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価するため；又は
−被験者においてヒト病理のステージ若しくは重篤度を決定するため；又は
−被験者においてヒト病理を有する被験者に与えられる治療の効果をモニタリングするため；又は
−被験者においてヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計するため；又は
−治療効果の治療的なモニタリング及び評価のため；又は
−ヒト臨床試験を設計するため及び臨床予後を予測するため；又は
−癌の診断、及び／若しくは癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；又は
−個別化治療のための患者の選択のため；又は
−新たな将来の薬剤による薬剤再配置の確認のため；又は
−薬剤発見及び薬物動態指針のため；又は
−先行／早期癌検出のため及び臨床的再発の可能性を予測するため
にバイオマーカーとして使用することができる。
上記で記述された戦略においてバイオマーカーとして本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）及び／又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）の使用は、本発明の追加的な態様を構成する。
【００４７】
更に、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）及び／又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）を、ヒト病理の標的を発見する、スクリーニングする、探索する、同定する、評価する及び検証するために、又は癌幹細胞の自己複製能力に関連する特定の遺伝子を同定するために使用することもできる。有利には、自己複製能力の（上方又は下方）制御に関連する前記遺伝子は、癌幹細胞だけに特異的である（健康な幹細胞には特異的ではない）。すでに上記で記述された目的において本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）及び／又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）の使用は、本発明の追加的な態様を構成する。
別の態様において、本発明は、被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出する方法、又は前記ヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価する方法であって、前記被験者からの試料中でＳＣを同定することを含み、前記ＳＣが、前記ヒト病理に関連する遺伝子異常を含む方法に関する。特定の実施態様において、前記ＳＣはＣＳＣである。したがって、本発明のこの態様は、癌を診断する方法を提供する。そのような方法は、癌のために又は癌の素因に関して被験者をスクリーニングすることを含むことができ、被験者からの試料をＣＳＣの存在のために試験することを含む。この種類の方法は、ＣＳＣで発現される遺伝子の産物を発現する細胞を検出することを含むことができ、その例は、本明細書に記載されている。例えば、この方法は、（ａ）抗体のようなリガンドを、生物学的試料によって、リガンド−タンパク質複合体の形成に適切な条件下でＣＳＣマーカータンパク質と接触させること、及び（ｂ）前記複合体を検出することを含むことができる。対照レベルと異なる、細胞に対する発現レベルは、癌幹細胞の存在を示す。そのような診断方法は、比較的多数の細胞を必要とする血液試験及び放射線研究のような従来の癌診断方法よりも有利である。したがって、これらの診断試験は、現在可能なものよりもさらに早期に腫瘍の検出を可能にする。
【００４８】
発現産物は、好ましくはタンパク質であるが、代替的には、ｍＲＮＡ発現産物を検出することもできる。ｍＲＮＡ発現産物を検出する場合、それは、例えば、ｍＲＮＡとプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、組織試料をプローブと接触させること、及び複合体の形成を検出することによって検出することができる。
ｍＲＮＡ発現産物を使用する場合、それは、好ましくは、ｍＲＮＡとプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、組織試料をプローブと接触させること、及び複合体の形成を検出することによって検出することができる。好ましい方法は、形成された複合体の量を、対照組織が使用されたときに形成された量と比較することを含み、対照と試料との形成された複合体の量の差が癌の存在を示す。好ましくは、正常な組織と比較した、試験組織により形成された複合体の量の差は、増加又は減少である。より好ましくは、形成された複合体の量における２倍の差が有意であると認められる。さらにより好ましくは、形成された複合体の量における３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又はさらには１００倍の増加又は減少が、有意である。
【００４９】
この代替的な方法論において、方法は、ａ）ＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸分子とプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者からの組織試料を核酸プローブと接触させること；ｂ）基準試料をプローブとことａ）で使用した同じ条件下で接触させること：及びｃ）前記試料中にハイブリッド複合体の存在を検出することを含むことができ、基準試料中のハイブリッド複合体のレベルと異なる、患者試料中のハイブリッド複合体のレベルの検出が、疾患又は疾患に対する罹病性を示す。
この方法は、ａ）ＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸分子とプライマーとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者の組織からの核酸の試料を核酸プライマーと接触させること；ｂ）基準試料をプライマーとことａ）で使用した同じ条件下で接触させること：ｃ）試料採取した核酸を増幅すること；及びｄ）患者試料と基準試料の両方からの増幅核酸のレベルを検出することを含むことができ、基準試料中の増幅核酸のレベルと有意に異なる、患者試料中の増幅核酸のレベルの検出が、基準状態と比べた疾患又は疾患に対する罹病性を示す。
【００５０】
この方法は、ａ）疾患について試験された患者から組織試料を得ること；ｂ）組織試料からのＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸分子を単離すること；及びｃ）癌に対する改変罹病性に関連する突然変異の存在を検出することによって患者を診断することを含むことができる。この方法は、核酸分子を増幅して増幅産物を形成すること、及び増幅産物中の突然変異の存在又は不在を検出することを更に含むことができる。患者における突然変異の存在又は不在は、罹病性プロフィールと関連する突然変異に対応する任意の部分で核酸プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成するストリンジェントな条件下で、核酸分子を、核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブと接触させること、及びプローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の存在又は不在を、罹病性関連突然変異の存在又は不在を示すものとして検出することによって検出することができる。
本発明は、抗体のようなリガンドも含み、これはＣＳＣ細胞に発現するタンパク質に特異的に結合し、好ましくはその活性を阻害する。そのようなリガンドを、癌のような繁殖性疾患、又は細胞分化若しくは増殖速度の変化に関与する疾患若しくは状態の診断又は治療のための薬剤の製造に使用することができる。
【００５１】
上記の方法をインビトロ又はインビボで実施することができる。したがって、被験者からの試料中の前記ＳＣ又はＳＣＳの同定は、前記被験者においてヒト病理の診断と予後の両方であることができる。例えば、被験者からの試料中の前記ＳＣ又はＣＳＣの同定は、ヒト病理、又は前記病理のいずれかを発症する被験者の重大な危険性若しくは素因を示す。
前記ＳＣ又は前記ＣＳＣを、本明細書に記載されている、同定されるマーカー及び／又はレポーターの観点から従来の技術により同定することができる。実施態様において、前記細胞を、抗原−抗原交差反応、リガンド−レセプター相互反応、分子画像技術などにより同定することができる。上記の方法をインビトロ又はインビボで実施することができる。
特定の抗原−抗体複合体の形成を検出及び定量化するために入手可能な多種多様な免疫学的アッセイが存在し、多数の競合及び非競合タンパク質結合アッセイが以前に開示されており、これらのアッセイの多数が市販されている。
【００５２】
したがって、検出されるマーカー又はレポーターは、抗原として作用し、前記産物を抗体で定量化することができる。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、無処置分子、並びにそのフラグメントを意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖであり、これらは該当の抗原決定要因に結合する、好ましくは特異的に結合することができる。用語「特異的に結合する」は、抗体が、その標的ポリペプチドに対して、他の関連するポリペプチドに対する親和性よりも著しく大きな親和性を有することを意味する。抗体は、ＣＳＣ関連タンパク質に特異的であることができる。例えば、ＣＳＣで発現される癌関連タンパク質のグリコシル化パターンは、健康な幹細胞のような非癌性細胞に発現している同じタンパク質におけるグリコシル化パターンと異なることができる。
好ましくは、目的のＣＳＣ標的に、他の非関連タンパク質よりも著しく大きな親和性で結合される抗体が使用される。「著しく大きな親和性」とは、本発明の標的ポリペプチドへの親和性が、他の関連するポリペプチドへの親和性と比較して測定可能に増加していることを意味する。好ましくは、親和性は、標的ポリペプチドに対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍又はそれ以上である。
好ましくは、抗体は、高い親和性、好ましくは１０-4Ｍ以下、好ましくは１０-7Ｍ以下、最も好ましくは１０-9Ｍ以下の解離定数で標的と結合し、ナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭ又はさらにそれ以下）が好ましい。
【００５３】
目的の標的ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、当業者は容易に産生することができる。ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は、よく知られている（例えば、Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)を参照すること）。他の関連する文献には、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103; Waldmann, T. A. (1991) Science 252:1657-1662が挙げられる。
非ヒト可変部領域がヒト定常部領域と結合又は融合しているキメラ抗体（例えば、Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)を参照すること）を使用することもできる。
抗体を、例えばヒト化により個人において免疫原性を低くすることができる（Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); and Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)を参照すること)。本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー抗体の重及び／又は軽鎖の可変部ドメインにおけるＣＤＲアミノ酸及び選択された他のアミノ酸が、ヒト抗体の同等なアミノ酸の位置で置換されている抗体分子を意味する。したがってヒト化抗体は、ヒト抗体と酷似しているが、ドナー抗体の結合能力を有する。
【００５４】
更なる代替案において、抗体は、「二重特異性」抗体であることができ、これは、２つの異なる抗原結合ドメインを有する抗体であり、各ドメインは、異なるエピトープに対して向けられている。本発明の場合、結合特異性のうちの一方は、標的ポリペプチド又はそのフラグメントに対してであり、他方は、他の任意の抗原に対して、好ましくは、同様に癌幹細胞で発現している細胞表面タンパク質又はレセプター若しくはレセプターサブユニットに対してである。
したがって本発明で使用される抗体は、前記産物に特異的な、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの無処理又は組み換えフラグメント、「組み合わせ体（“combibodies”）」及びＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントであることができ、これらの抗体は、ヒト、ヒト化又は非ヒト由来である。これらのアッセイで使用される抗体を標識するか又はしないことができ、非標識抗体を凝集アッセイで使用することができ、標識抗体を多種多様なアッセイで使用することができる。抗体を標識するのに使用できるマーカー分子には、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）、蛍光体、化学ルミネセンス試薬、酵素基質又は補助因子、酵素阻害剤、粒子、着色剤及び誘導体が挙げられる。
【００５５】
非標識抗体（一次抗体）及び標識抗体（二次抗体）を使用する本発明に使用できる広範囲な周知のアッセイが存在し、それらのうち含まれるものは、ウエスタンブロット又はウエスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合的ＥＩＡ（競合的酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学又は免疫組織化学技術、特定の抗体を含むタンパク質のバイオチップ又はマイクロアレイの使用に基づく技術、又はディップスティックのようなフォーマットにおけるコロイド沈殿に基づくアッセイである。前記産物（マーカー又はレポーター）を検出し定量化する他の方法には、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイなどが挙げられる。
癌関連遺伝子それ自体を、ＣＳＣで発現される遺伝子をコードする核酸発現産物とプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、生物学的試料を核酸プローブと接触させること、及び生物学的試料からプローブと核酸発現との間の複合体の形成を検出することによって検出することができる。
好ましい方法は、形成された複合体の量を、対照組織、例えば健康な幹細胞が使用されたときに形成された量と比較することを含み、対照と試料との形成された複合体の量の差が癌の存在又は癌の素因を示す。好ましくは、正常な組織と比較した、試験組織により形成された複合体の量の差は、増加である。より好ましくは、形成された複合体の量における２倍の増加が疾患を示す。さらにより好ましくは、形成された複合体の量における３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又はさらには１００倍の増加が、疾患を示す。
【００５６】
別の態様において、本発明は、被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定する方法、又は前記病理を有する被験者に与えられた治療の効果をモニタリングする方法であって、前記被験者からの試料中のＳＣの濃縮物を同定及び定量化し（前記ＳＣは、ヒト病理と関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む）、前記濃縮物を、対照試料と、又は前記被験者からの以前の試料と、又は治療が与えられる前に前記被験者から取られた以前の試料と比較することを含む方法に言及する。特定の実施態様において、前記ＳＣはＣＳＣである。前記ＳＣ又は前記ＣＳＣを、前に記述したように、任意の適切な従来の技術により同定及び定量化することができる。上記の方法をインビトロ又はインビボで実施することができる。この方法は、前記被験者からの試料中のＳＣの濃縮物を（前記ＳＣは、ヒト病理と関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む）、対照試料と、又は前記被験者からの以前の試料と、又は治療が与えられる前に前記被験者から取られた以前の試料と比較することを更に含む。対照試料は、ヒト病理のない被験者から得ることができる。この方法によると、被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定すること、又は前記病理を有する被験者に与えられた治療の効果をモニタリングすることが可能である。
【００５７】
本発明は、また、患者において癌の進行を評価する方法であって、第１の時点の生物学的試料中のＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物を、第２の時点の同じ発現産物の発現と比較することを含み、第１の時点に対する第２の時点での発現の増加又は発現の増加速度の増加が、癌の進行を示すことを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ヒト病理を治療する薬剤を発見、スクリーニング、探索、同定、開発及び／若しくは評価する、又は既知若しくは将来の薬剤、若しくは化合物の組み合わせを再配置する方法であって、候補化合物を、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）と接触させ、反応をモニタリングすることを含む方法に関する。前記細胞の繁殖を破棄するか若しくは遅くする化合物、又は前記細胞を死滅させる化合物を、更なるアッセイのために選択することができる。この方法を、インビトロ又はインビボで、例えばＳＣ又はＣＳＣを免疫不全マウスなどに異種移植することによって実施できる。
具体的には、本発明は、癌性幹細胞の増殖を調節する候補作用物質を同定するアッセイであって、
ａ）候補作用物質の存在下でＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを検出すること；及び
ｂ）その発現レベルを候補作用物質の不在下での発現レベルと比較することを含み、発現の低減が、ＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを候補作用物質が調節したことを示す、
アッセイを提供する。
【００５８】
本発明は、また、ＣＳＣで発現される遺伝子の発現レベルを修飾する作用物質を同定する方法であって、
ａ）遺伝子を発現している細胞を候補作用物質と接触させること、及び
ｂ）細胞に対する候補作用物質の効果を決定することを含み、発現レベルの変化が、候補作用物質が発現を調節できることを示す、
方法を提供する。
好ましくは、作用物質は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体又は小型有機分子である。
分子又は薬理学的治療薬を開発して、ヒト病理、例えば癌のような幹細胞由来の病理を首尾良く治療及び予防することは、ヒトの治療への適用の前にあらゆる戦略の治療上の潜在能力を正確に評価することを可能にすることを記述することが重要である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ＳＣ又はＣＳＣ、例えばマウス由来の細胞の生存、分裂、若しくは繁殖を破棄する若しくは遅くするか、又は分化を誘導する化合物を提供するか、或いは前記細胞を死滅させる化合物を提供する。前記化合物は、上記の方法のいずれか１つにより同定及び評価することができ、ヒト病理の治療に潜在的に有用である。実施態様において、前記化合物は、下記：
ａ）前記ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣに存在する１つ以上のエピトープの特異的な抗体又は抗体の組み合わせ；及び
ｂ）ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣの繁殖を破棄するか若しくは遅くする、又は前記細胞を死滅させる、小型有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、三重らせん分子などが挙げられるが、これらに限定はされない、抗体、毒素、放射性原子を有する化合物又は化学療法剤のような細胞毒性剤
から選択されるか又はこれらにより形成される。
（ｂ）の細胞毒性剤の例には、ＣＳＣバイオマーカーに特異的なｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００６０】
本発明の別の態様は、ヒト病理の治療用の医薬組成物の製造における、ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣの繁殖を破棄する若しくは遅くするか、又は前記細胞を分化する若しくは死滅させる上記で記述された化合物の使用に関する。
特に、本発明は、癌幹細胞の根絶方法を提供する。そのような方法は、ｉ）外部若しくは内部抗原又はそのコード遺伝子を標的にすることによって癌細胞へ向けられた免疫療法、ｉｉ）指数関数的から非指数関数的な細胞増殖への変化を行うか又は分化若しくはアポトーシスプログラムを誘発するために癌幹細胞で切り替えを誘導することを含む。そのような方法は、これらの変化に関与する因子を標的にすることができるが、ＣＳＣにも特異的であるべきである。
したがって、本発明は、患者に、上記で記載されたタンパク質、核酸分子又はリガンドの治療有効量を投与することによって、癌疾患の治療を、そのような治療の必要な患者において行う方法を提供する。そのような化合物を、医薬組成物の形態で投与することができる。そのような組成物は、化合物を、当業者に既知の薬学的に許容される担体と一緒に含む。
したがって、本発明は、例えば上記で記載された型の化合物を使用してＣＳＣを除去することによる、患者における癌の治療に関する。そのような方法は、好ましくは多数のＣＳＣを低減する。そのような方法は、好ましくは、患者に、癌幹細胞を標的にして破壊するのに十分な治療有効量の抗体、核酸、小型分子薬剤、又はポリペプチドを投与することを含む。
【００６１】
ＣＳＣに選択的に発現し、健康な細胞に発現しない特定のバイオマーカーの本明細書における同定は、癌幹細胞区画を選択的に破壊するように向けられた治療のための標的を提供する。そのような治療は、癌幹細胞に存在するマーカーを、これらの細胞を破壊する目的で、例えば患者の現存する免疫系を利用して標的にすることができる。これは、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発して実施することができる。あるいは、これは、最終分化、アポトーシス又はプログラム細胞死を誘発して実施することができる。これは、おそらく、対称繁殖性有糸分裂プログラムから非対称繁殖性有糸分裂へ、又は最終分化／アポトーシスプログラムへの切り替えを誘発して実施することができる。腫瘍内で細胞の不死個体群を標的化することによって、これらの治療は、癌細胞の数を低減することについて従来の治療よりも成功する可能性があり、患者が再発に苦しむ可能性も少なくなる。
したがって、別の態様において、本発明は、ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣの繁殖を破棄する若しくは遅くするか、又は前記細胞を分化若しくは死滅させる、１つ以上の前記の化合物の治療有効量を、１つ以上の賦形剤及び／又は担体物質と一緒に含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、ヒト病理を治療するのに有用な任意の他の活性成分を含有することもできる。特定の実施態様において、前記ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。
賦形剤、担体物質及び補助物質は、製剤又は調合剤の他の成分と組み合わせることができ、かつ治療される生物体に悪影響を与えないように、薬学的及び薬理学的耐性がなければならない。医薬組成物又は製剤には、経口又は非経口投与（皮下、皮内、筋肉内及び静脈内を含む）に適したものが挙げられるが、最適な投与経路は、被験者の状態によって決まる。製剤は、単一用量形態であることができる。製剤は、薬理学の分野で既知の方法に従って調製される。投与される活性物質の量は、治療の特殊性によって変わることができる。
【００６２】
本発明の別の目的は、本発明を実施するキットにある。したがって、本発明の実施態様は、ＳＣ又はＣＳＣに最終的に存在するマーカー又はレポーターに特異的な抗体と担体とを適切な包装の中に含むキットを提供し、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの無処理又は組み換えフラグメント、組み合わせ体（“combibody”）」又はＦａｂ若しくはｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、前記抗体は、ヒト、ヒト化又は非ヒト由来である。前記抗体を標識するか又はしないことができ、非標識抗体を凝集アッセイで使用することができ、標識抗体を多種多様なアッセイで使用することができる。抗体を標識するのに使用できるマーカー分子には、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）、酵素、蛍光体、化学ルミネセンス試薬、酵素基質又は補助因子、酵素阻害剤、粒子、着色剤及び誘導体が挙げられる。キットは、前記抗体の組み合わせを含むこともできる。キットは、前記抗体とマーカー又はレポーターポリペプチドとの結合反応の検出に有用な試薬を含むこともできる。
更に、本発明はＣＳＣにおける遺伝子発現にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブ、そのような遺伝子を増幅するのに有用なプライマー、場合により、疾患の診断を助けるためのプローブ及びプライマーの使用説明書を含む、癌診断に有用なキットを提供する。
【００６３】
本発明のキットは、他の使用のうちで、ＳＣ又はＣＳＣの存在を検出するため（前記細胞は、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常により作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子を含む）；又は被験者において幹細胞由来のヒト病理を発症する被験者の危険性又は素因を評価するため；又は被験者において幹細胞由来のヒト病理のステージ若しくは重篤度を決定するため；又は幹細胞由来のヒト病理を有する被験者に与えられた治療の効果をモニタリングするため（例えば、治療効果の治療モニタリング又は評価のため）；又は幹細胞由来のヒト病理に罹患する被験者に個別的な治療を設計するため；又はヒト臨床試験を設計するため；又は 癌の診断、及び／若しくは癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；又は個別化治療のための患者の選択のため；又は薬剤発見及び薬物動態指針のため；又はヒト病理の標的を発見する、スクリーニングする、探索する、同定する、評価する及び検証するため；又は癌幹細胞の自己複製能力に関連する特定の遺伝子を同定するために用いることができる。
別の態様において、本発明は、ヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計する方法であって、前記で同定された化合物を選択することを含み、前記化合物が、ＳＣ又はＣＳＣの繁殖を破棄する若しくは遅くするか又は前記細胞を死滅させ、前記化合物が、前記被験者に投与される医薬組成物に活性成分として使用されうる方法に言及する。この方法をインビトロ又はインビボの両方で実施することができる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、ヒト臨床試験を設計する方法であって、
ａ）本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）のための標的を選択すること、又は前記細胞の分子プロファイリングをすること；
ｂ）疾患状態における前記標的又は前記分子プロフィールを検証すること；及び
ｃ）特定の治療における非反応者に対して反応者を選択すること
を含む方法に関する。
別の態様において、本発明は、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される活性化されうる遺伝子（すなわち、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子）を含むＤＮＡ構築物（本明細書以降、本発明のＤＮＡ構築物）を提供する。好ましくは、遺伝子異常は、（ｉ）ＢＣＬ６遺伝子のような腫瘍遺伝子を含む核酸；（ｉｉ）キナーゼでコードされる１番目のヌクレオチド及びヒト病理に関連する遺伝子異常を含む２番目のヌクレオチド配列を含む核酸（そのような遺伝子異常の例には、ＢＣＲ−ＡＢＬp210及び本明細書上記で記載された腫瘍遺伝の他の例が挙げられる）；（ｉｉｉ）ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬp210をコードする核酸；（ｉｖ）ＬＭＯ２／ＲＨＯＭ２遺伝子配列を含む核酸から選択される。
【００６５】
上記の特定の実施態様（ｉｉｉ）において、本発明のＤＮＡ構築物は、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする１番目のヌクレオチド配列、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を含む２番目のヌクレオチド配列及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む３番目のヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記１番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記３番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合しており、前記３番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記２番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合される。
本発明のＤＮＡ構築物は、制限及び結合酵素を用いる、並びにSambrook, Fitsch and Maniatis, eds., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NYに記載されている同様の酵素を用いる従来の消化方法によって容易に得ることができる。
望ましい場合、本発明のＤＮＡ構築物を、上記で引用したSambrookらにより記載されたような従来の方法を使用して哺乳動物の胚を形質転換するため及びトランスジェニック動物を生成するために有用なベクターの産生に使用することができる。
【００６６】
あるいは、本発明のＤＮＡ構築物を、トランスジェニック動物を生成するため、ＤＮＡを精卵母細胞へマイクロインジェクションするのに有用なＤＮＡの直鎖状フラグメントを得るために使用することができる。マイクロインジェクションに有用なＤＮＡの前記直鎖状フラグメントは、活性化されうる遺伝子を含む直鎖状フラグメントを得るために、制限酵素により切断することによって得ることができる。
別の態様において、本発明は、上記に記載された実施態様のいずれか１つにおいて、本発明のＤＮＡ構築物をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。哺乳動物は、特定の実施態様において、これらの構築物の１つ以上、好ましくは２、３、４、５個又はそれ以上を含む。本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、その結果、非トランスジェニック動物と比較して、（例えば、幹細胞由来、あるいは非幹細胞由来の）癌のようなヒト病理を発症するより大きな傾向を付与する遺伝子型を有する。前記非ヒト哺乳動物は、とりわけ他の目標のうちで病理を研究するのに有用であり、前記病理を治療及び／又は予防する潜在的に有用な化合物を評価するのに有用である。好ましくは、ヒト病理は固形腫瘍である。
【００６７】
本記載で使用されるとき、表現「非ヒト哺乳動物」には、好ましくは哺乳動物の分類に属する任意の非ヒト動物、例えば齧歯類、特にマウスが挙げられる。上記及び下記に記載されているように、本発明の好ましい実施態様において、トランスジェニック非ヒト動物及び組織又はそれらから誘導される細胞は、好ましくは、マウスであるが、別の哺乳類の種、例えば別の齧歯類、例えばラット、ハムスター若しくはモルモット、又は別の種、例えばチンパンジー、サル、ブタ、ウサギ、又はイヌ科若しくはネコ科、又は有蹄類の種、例えばヒツジ、ヤギ、ウマ科、ウシ、又は非哺乳類動物の種であることができる。より好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物又は哺乳動物及び組織又は細胞は、齧歯類、より好ましくはマウスから誘導される。
トランスジェニック動物の使用が倫理的な性質の問題を提示するが、本明細書で記載されている種類の研究から人類が得られる利益は、トランスジェニック動物の創造及び試験により課される可能性のあるあらゆる苦痛を大きく越えていると考えられる。当業者には明白であるが、薬剤治療は、臨床試験をヒトにおいて開始できる前に動物試験を必要とし、現行の規制及び現在利用可能な動物モデル系では、動物試験を省くことはできない。あらゆる新たな薬剤は、生存している哺乳動物の少なくとも２つの異なる種で試験しなければならず、そのうちの一方は、大型の非齧歯類でなければならない。専門家は、体内で非常に特異的な方法で作用する、現在開発中の新たな部類の薬剤は、さらに多くに動物が将来的に使用される原因となる可能性があり、より多くの霊長類の使用をもたらす可能性があると考えている。したがって、本明細書に記載されているトランスジェニックモデルからの人類への利益は、一般にマウス又は齧歯類に限定されることは何もなく、霊長類を含む他の哺乳動物も包含する。
特定の実施態様において、本発明により提供される非ヒトトランスジェニック動物は、記載に附随している実施例で記載されているものである。
【００６８】
本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生成では、本発明のＤＮＡ構築物が、前記哺乳動物に、又は胚状態の、例えば細胞若しくはその受精卵母細胞の状態の、一般にはＧ細胞状態より後期ではない状態の先祖に導入されている。
したがって、本発明は、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製手順であって、
（ｉ）本発明のＤＮＡ構築物を非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること；
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
（ｉｉｉ）前記子孫を分析して、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常により活性化された遺伝子及び／又は作り出された遺伝子の存在を評価すること
を含む手順を提供する。
この方法は、
（ｉ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の受精卵母細胞に、Ｓｃａ１＋細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される固形腫瘍の発症に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物を導入すること；
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
（ｉｉｉ）前記子孫を分析すること
を含むことができる。
【００６９】
特定の実施態様において、ヒト病理に関連する前記遺伝子異常は、幹細胞由来のヒト病理であり、その場合、子孫は、当該の幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常により活性化された遺伝子及び／又は作り出された遺伝子の存在を評価することによって分析される。
核酸配列を、遺伝子的に活性な状態で組み込むことができるように動物の胚に導入することができる、現在の技術で考えられる異なる方法が存在し、その全てを、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生成に適用することができる。方法は、自然に起こるように、核酸の前記配列により胚に形質移入すること、及び前記配列が、結果的に前記配列の活性化をもたらす座位で染色体に組み込まれたトランスジェニック動物を選択することから構成される。別の方法は、核酸配列又はその制御配列の、胚へ導入する前の修飾を意味する。別の方法は、導入される核酸配列を含むベクターを使用した胚への形質移入から構成される。
特定の実施態様において、本発明のＤＮＡ構築物の、非ヒト哺乳動物の菌株への導入は、非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞におけるＳｃａ１+細胞で発現を指示するプロモーターに機能的に結合される活性化されうる遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントのマイクロインジェクションによって実施される。
【００７０】
受精卵母細胞を従来の方法、例えば雄との交尾に対する反応によって又は黄体化ホルモンでの処置による誘発によって雌の排卵を刺激することにより単離することができる。一般に、過剰排卵がホルモン作用により雌で誘発され、雄と交配する。適切な時間の後、雌を殺処理して受精卵母細胞を輸卵管から単離し、適切な培地に保持する。受精卵母細胞を前核の存在により顕微鏡下で認識することができる。直鎖状ＤＮＡフラグメントのマイクロインジェクションは、雄前核により有利に実施される。
本発明の動物モデルを生成する代替的な方法は、上記で記述されたＤＮＡ構築物を、例えばＥＳ細胞を介した相同組み換えにより、マウスゲノムの不活性座位内に導入することを含む。
【００７１】
受精卵母細胞に本発明のＤＮＡ構築物を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを導入した後、これらは、インビトロで適切な時間インキュベートされるか、又は偽妊娠性の乳母（雌を不妊雄と交尾させることにより得られる）に再移植される。移植は、従来の方法、例えば雌に麻酔をかけ、十分な数の胚、例えば１０〜２０個の胚を偽妊娠性の乳母の輸卵管に外科的に挿入することによって実施される。妊娠が終わると、幾つかの胚は、妊娠を終了させ、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生じ、これらは、理論的には、ゲノムに組み込まれ、かつ生物体の全ての細胞に存在している本発明のＤＮＡ構築物を有するはずである。この後代は、Ｇ０世代であり、この個体は、「初代トランスジェニック」である。個体には注入核酸が組み込まれていること及びトランスジェニックであることの確認は、後代の個体を分析することによって得られる。これを実施するために、動物材料の試料から、例えば動物の尾（例えば、マウスの場合）からの少量の試料又は血液試料から、ＤＮＡをそれぞれ個別に抽出し、従来の方法により、例えば特定の開始剤を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）により、又は例えば導入遺伝子の少なくとも一部と相補的であるプローブを使用するサザンブロット若しくはノーザンブロット分析により、そうでなければ、導入遺伝子によりコードされているタンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析により分析する。導入遺伝子の存在を評価する他の方法には、限定することなく、酵素的及び／又は免疫学的アッセイ、特定のマーカーの組織学的染色、酵素活性などのような適切な生化学的アッセイが挙げられる。
【００７２】
一般に、トランスジェニック動物において、挿入された導入遺伝子はメンデル特性として伝達され、それによってそれぞれ個別に安定した系統を確立することが困難ではない。Ｇ０個体が親株と交配（逆交配）し、導入遺伝子がメンデル特性で挙動する場合、後代の５０％が挿入された導入遺伝子の異型接合体である（半接合体）。これらの個体は、無限に維持することができるＧ１後代及びトランスジェニック系列を構成し、Ｇ１世代の異型接合体と正常な個体が交配する。あるいは、Ｇ１世代の個体はそれら自体で交配して、導入遺伝子が子孫の生存率に影響を与えないのであれば、挿入された導入遺伝子の同型接合体を２５％、異型接合体を５０％、導入遺伝子のないものを２５％産生することができる。
したがって、本発明により提供される非ヒト哺乳動物の後代、例えば本発明のより提供されるトランスジェニックマウスの後代は、トランスジェニック動物と適切な個体との交尾によって、又はトランスジェニック動物の卵及び／若しくは精子のインビトロ受精によって得ることができる。本記載で使用されるとき、用語「後代」又は「非ヒトトランスジェニック哺乳動物の後代」は、最初に形質転換された非ヒトトランスジェニック哺乳動物の前の世代の全ての子孫に関する。後代を、前記で記述された方法のいずれかにより分析して導入遺伝子の存在を検出することができる。
本発明は、また、そのゲノムに本発明のＤＮＡ構築物を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物細胞株に関する。特定の実施態様において、前記細胞株は齧歯類細胞株である。
【００７３】
本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、本発明により提供されるその後代又は細胞株は、他の用途のうち、幹細胞由来又は非幹細胞由来の新生物性又は非新生物性のヒト病理に関連する遺伝子異常を治療する及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価に有用である。したがって、本発明は、また、本発明により提供される非ヒトトランスジェニック哺乳動物、その後代又は細胞株の使用、ヒト病理に関連する遺伝子異常を治療及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価における使用に言及する。特定の実施態様において、前記ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。
トランスジェニック動物の場合では、幹細胞由来の前記ヒト病理を治療及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価は、試験される化合物を異なる用量でトランスジェニック動物に投与し、動物の生理学的反応を経時的に評価することにより実施することができる。アッセイされる化合物の投与は、評価される化合物の化学的性質に応じて経口又は非経口であることができる。幾つかの場合において、当該の化合物を、化合物の効果を増強する補助因子と併せて投与することが適切である場合がある。
本発明の細胞株の場合では、幹細胞由来の前記ヒト病理を治療及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価は、アッセイされる化合物を、細胞培地に異なる濃度で適切な時間加え、適切な生化学的及び／又は組織学的アッセイを使用して化合物に対する細胞の反応を経時的に評価することにより実施することができる。時々、当該の化合物を、化合物の効果を増強する補助因子と併せて細胞培地に添加する必要がある場合もある。
以下の実施例は、本発明を例示し、その範囲を制限するものとして考慮されるべきではない。本発明の実施は、特に指示のない限り、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の技術を用い、それらは当業者の技能の範囲内である。
【００７４】
最も一般的な分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. or Ausubel et al., Current protocols in molecular biology (1990) John Wiley and Sonsにおいて見出すことができる。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で引用される文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００７５】
材料及び方法
トランスジェニックＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスの産生
本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生成のために、ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０のようなＤＮＡ構築物を、前記哺乳動物に、又は胚状態の、例えば細胞若しくはその受精卵母細胞の状態の、一般にはＧ細胞状態より後期ではない状態の先祖に導入した。
【００７６】
幹細胞由来のヒト病理に関連するこの染色体異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製手順は、以下である：
（ｉ）本発明のＤＮＡ構築物を非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること；
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
（ｉｉｉ）前記子孫を分析して、幹細胞由来のヒト病理に関連する染色体異常により活性化された遺伝子及び／又は作り出された遺伝子の存在を評価すること。
（ガンシクロビル（ＧＶＣ）処置）
ＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスを使用して、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＣＳＣにおけるＧＣＶ誘発細胞死の効果を試験した。予備試験の後、ＧＣＶを、腹腔内注射により１００mg/kg/日の用量で１４日間投与した。この用量は、トランスジェニックマウスにおいてＨＳＶ−ｔｋを発現する細胞を死滅させたことが報告されている（Bush TG. Cell 1998, 93: 189-201）。マウスが白血病になったときに投与を開始した。対照群には、生理食塩水の注射を与えた。
（ＲＮＡ抽出）
全ＲＮＡを、製造者のＲＮＡクリーンアッププロトコールに従い、場合によりOn-column Dnase処理を用いて、TRIzol（Life Technologies, Inc., Grand Island, NY）を使用し、続いてRneasy Mini-Kit（Qiagen Inc., Valencia, CA）による精製の２工程で単離した。ＲＮＡの完全性及び品質を、電気泳動により確認し、その濃度を測定した。
【００７７】
（標的の調製）
ｃＤＮＡプローブのＴ−７−based ＲＮＡ増幅及び調製を、以前に記載されたように実施した（Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas JD, Eberwine JH: Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:1663-1667. Eberwine J: Amplification of mRNA populations using aRNA generated from immobilized oligo(dT)-T7 primed cDNA. Biotechniques 1996, 20:584-591）。簡潔に、全ＲＮＡの最大量の５μgを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを使用するスーパースクリプトチョイスシステム（Life Technologies）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡに変換した。二本鎖ｃＤＮＡをクリーンアップし、Ｔ７のインビトロ転写を、製造者の説明書に従ってMegascriptＴ７インビトロ転写キット（Ambion, Austin, TX）を使用して実施した。
（マイクロアレイ法）
各試料から２回目に増幅された２．５μgのＲＮＡを、シアニン３結合ｄＵＴＰ（Ｃｙ３）により直接標識し、Universal Mouse Reference RNA（Stratagene）からの２回目に増幅された２．５μgのＲＮＡを、シアニン５結合ｄＵＴＰ（Ｃｙ５）により基準として標識した。全てのマイクロアレイ研究では、マウスｃＤＮＡアレイを使用した。ハイブリダイゼーションを記載されているように実施した。洗浄した後、スライドをScanarray 5000 XL（GSI Lumonics Kanata, Ontario, Canada）を使用して走査し、画像をGenePix 4.0プログラム（Axon Instruments Inc., Union City, CA）により分析した。
（データ解析）
各ハイブリダイゼーションから得られたデータを解析のためにデータベースに保存した。Ｃｙ３：Ｃｙ５比率を、アレイの全てのスポットの中央比率値に正規化した。正規化の後、両方のチャンネルの強度（中央値の合計）がローカルバックグラウンドよりも低いスポットを除いた。残りのスポットの比率を対数変換し（ベース２）、マウスチップ上の重複スポットを中央値に平均化した。癌幹細胞（ＣＳＣ）の発現プロフィールを得るために、発明者たちは、ＣＳＣと対照造血幹細胞との比率を参照した。比率の差が少なくとも２倍である場合、遺伝子を上方制御又は下方制御で選択した。クラスター分析のため、SOTAクラスタープログラム（Yuspa SH et al. Cancer Res 1980; 40:4694-703）を使用して、ツリーを、TreeViewプログラムを使用して観察した。
【００７８】
（フローサイトメトリー）
有核細胞を、抹消血細胞懸濁液から調製した。フローサイトメトリー用に細胞を更に調製するために、汚染された赤血球を、８．３％塩化アンモニウムで溶解し、次に残りの細胞を、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を有するＰＢＳで洗浄した。染色した後、全ての細胞を、２μg/mLのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する２％ＦＣＳを有するＰＢＳで１回洗浄して、死亡細胞を分析と選別の両方の手順から除外した。モノクローナル抗体を、Pharmingenから得て、含まれている、Ｂ系列染色のためにＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ１９、Ｌｙ５１、ＣＤ４３、ＩｇＭ及び／又はＩｇＤに対する抗体；Ｔ系列染色のためにＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ３に対する抗体；骨髄系のためにＣＤ１１ｂ及びＧｒ１に対する抗体、並びに日常的な技術により得られる異なる組織試料からの単一細胞懸濁液を染色する幹細胞のためのＳｃａ１を、Ｆｃレセプターを介した結合を阻止するために、精製抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６（Pharmingen）と共に、それぞれ異なる抗体の適切な希釈と共に室温又は４℃でインキュベートした。試料及びデータを、CellQuestソフトウエアを使用するFACScan装置（Becton Dickinson, FACS-sorter apparatus）で解析した。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）及びＰＥ（フィコエリトリン）の特異的な蛍光は、それぞれ４８８nm（０．４W）及び６３３nm（３０mW）で励起した。マウス細胞の既知の前方及び直交光散乱特性を、確立されたゲートを用いて使用した。それぞれの分析において、少なくとも５０００個の生存（ＰＩ-）細胞を評価した。
【００７９】
（抗癌剤による動物の処置）
抗癌剤による動物の処置を以下のように実施した。
ＢＥＦ（ブレオマイシン、エトポシド／ＶＰ１６、シス−プラチン）：ＢＥＰプロトコールによる精巣癌の治療において、ブレオマイシンを３mg/日（１〜５日）、ＶＰ１６を１００mg/m2（１〜５日）及びシス−プラチンを４０mg/m2（１〜５日）で３週間投与した。水をプラセボとして使用した。薬剤を水に溶解し、静脈内に送達した。
ＤＸＲ（ドキソルビシン）を７mg/kgで投与した。投与スキームは、毎７日目、３回−ｑ７ｄ×３−を４〜５週間であった。薬剤を水に溶解し、静脈内に送達した。水をプラセボとして使用した。
Gleevec（商標）：貯蔵溶液５mg/ml及び１０mg/mlを濾過した滅菌の水で新たに作製し、１日２回、胃管栄養法により２５０mlの容量でマウスに投与した。Gleevec（商標）レジメンは、胃管栄養法による毎朝５０mg/kg、毎晩１００mg/kgであった。Gleevec（商標）を、滅菌水の２５０マイクロリットルの容量で投与した。水をプラセボとして使用した。
ガンシクロビル：貯蔵溶液をSIGMAの指示に従って調製した。レジメンは、腹腔内注射により１００mg/kg/日を１４日間であった。プラセボは、等量の希釈水／生理食塩水であった。
メルファラン及びプレドニゾン：２週間の間、メルファラン（２．５mg/kg/日）を静脈内に送達し、プレドニゾン（１０mg/kg/日）を１日経口用量で送達した。プラセボは、等量のＰＢＳであった。
【００８０】
（リアルタイムＰＣＲ定量化）
発現レベルを定量化するために、逆転写（ＲＴ）を、５０ngのランダム六量体、３μgの全ＲＮＡ及び２００単位のSuperscript II RNase H-free（RNase H-）逆転写酵素（GIBCO BRL）を含有する２０μlの反応で、製造者のプロトコールに従って実施した。リアルタイム定量化ＰＣＲを、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の定量化のために実施した。蛍光発生ＰＣＲを、TaqMan PCR Core Reagent kit（PE Biosystems）を使用して、５０μlの反応容量で設定した。ｃＤＮＡ増幅を、PE Applied Biosystems 5700 Sequence Detectorで９６ウエル反応プレートフォーマットにより同じプライマーを使用して実施した。熱サイクルを、９５℃で１０分間の最初の変性工程により開始した。続く熱プロフィールは、９５℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間の４０サイクルであった。マルチプルネガティブウオーターブランク（multiple negative water blank）を試験し、較正曲線を各分析と並行して決定した。Ａｂｌ内因性対照（PE Biosystems）を含めて、それぞれの試料においてＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０を全ｃＤＮＡに関連づけた。
特異的なプライマー及びプローブの配列は以下である：
ＢＣＲ−ＡＢＬp210、センスプライマー５′−ＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＣＡ−３′、
アンチセンスプライマー５′−ＡＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡ−３′及び
プローブ５′−ＣＣＡＣＴＧＧＡＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣ−３′；
ｃ−Ａｂｌ、センスプライマー５′−ＣＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＡ−３′、
アンチセンスプライマー５′−ＣＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ−３′及び
プローブ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴＧ−３′。
【実施例】
【００８１】
実施例１ ガンシクロビル（ＧＣＶ）治療後の齧歯類ＣＳＣ
ＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスにおいて（材料及び方法を参照すること）、チミジンキナーゼ及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の導入遺伝子発現をＳｃａ１+Ｌｉｎ-及びＳｃａ１-Ｌｉｎ+株で研究した。結果は、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-株においてのみ両方の導入遺伝子の高い発現レベルを示した（図１を参照すること）。この発現パターンは、癌幹細胞（Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-）における選択的な導入遺伝子発現を確認した。
表１において、ＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスで発症した異なる型の癌を示す。結果は、前記トランスジェニックマウスが、ＢＣＲＡＢＬｐ２１０遺伝子異常により影響を受けたヒトで観察されたものと同じ腫瘍パターンを発症したことを実証する。
【表１】
【００８２】
３０匹のマウスを対照として使用して、食塩水に毎日付し、一方、残りの６０匹には、方法のセクションで記載したように、ＧＣＶを毎日注射した。この期間の間に、癌は完全に消滅した。治療後に癌が消滅したマウスを、更に３か月観察すると、腫瘍の再発は観察されなかった（ＣＭＬ及び固形腫瘍）（図２）。
実施例２ マウスＣＳＣの遺伝子プロフィール
マイクロアレイ分析は、リンパ腫発症の前と後での癌幹細胞の異なる発現プロフィールを明らかにした。これらのデータは、３個のマーカー：Ｂｃｌ−２、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３で有意な差を示す。Ｂｃｌ−２マーカーは、対照レベルと比較して、リンパ腫の発症の後の遺伝子発現に有意な減少を表した。一方、後者の２個のマーカー、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３は、対照と比較して、リンパ腫の発症の後で増加した反応を示した（表２を参照すること）。
【表２】
【００８３】
図４は、Ｂｃｌ６マウス（Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-）からの癌幹細胞に対応する遺伝子発現パターンを示す。一方、ＢＣＬ６導入遺伝子を持つ齧歯類幹細胞は、リンパ腫ヒトＢ細胞と同様な発現プロフィール（図５）を示す（Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Levy R, Wilson W, Grever MR, Byrd JC, Botstein D, Brown PO, Staudt LM. 2000. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. Feb 3;403(6769): 503-11）。これは、Ｂｃｌ６導入遺伝子を持つ齧歯類癌幹細胞を、ヒトリンパ腫を模倣するモデルとして使用できることを示す。
実施例３ ＣＳＣ系マウス癌モデルの創造
発明者たちは、腫瘍遺伝子（ヒト遺伝子とそのマウス対応物の両方）がＳｃａ１（幹細胞抗原１）遺伝子の５′未翻訳領域（５′−ＵＴＲ）に挿入されている（図２９）多数の更なるマウス癌モデルを開発した。以下の実施例で更なる詳細が記載されるように、これらのマウスモデルを続いて使用して、ＣＳＣの特異的死滅が、癌治療の効果的な治療戦略となりうるかという疑問、並びに他の関連する疑問に対処するために使用した。
表３は、マウスモデルが得られた幾つかのヒト癌を提示する。
【表３】
【００８４】
本発明のマウスモデルの構築に使用された本発明の構築物には、図２９に示されている ＨＶＴＫ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０、又は、例えばＢＣＬ６（ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫ）若しくはｈＫＲＡＳの同等な構築物、及び表３に提示されている他の腫瘍遺伝子の構築物が含まれた。
ＨＶＴＫは、ＨＳＶ−ｔｋの代替的な略語であり、ＨＳＶは、単純ヘルペスウイルスを意味し、ｔｋ（又はＴＫ）は、チミジンキナーゼを意味する。ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位の略語である。
ＨＶＴＫ（ＴＫ）及び特定の腫瘍遺伝子、例えばＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の転写物は材料及び方法で記載された定量的リアルタイムＰＣＲにより確認された。Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞（すなわち、Ｓｃａ１を発現するが、Ｌｉｎは発現しない細胞）において、ＨＶＴＫ（ＴＫ）及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の発現は、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞よりも有意に高かった（図１、図２９）。興味深いことに、これは、疾患の発症の前と後の両方で事実であることが見出され、腫瘍遺伝子それ自体が癌の維持に関与していないことを示した（実施例１４も参照すること）。同様の観察が、例えば、ＨＶＴＫ及びＢＣＬ６転写物に関してＳｃａ１−ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫマウスで見られた。
【００８５】
実施例４ ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスは、ヒトＣＭＬの病理及び急性転化を再現する最初のマウスモデルを表す
実施例３のＣＳＣマウスモデルの１つにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子をＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲに挿入した。これらのマウスは、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０とも呼ばれる。
これらのマウスは、慢性（骨髄増殖性）期、急性転化、ＨＳＣの大きさ及びGleevec（商標）による治療に対する反応に関して、ヒトＣＭＬの症状及び病理を正確に再現した癌を発症したことが見出された。
これらのＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０転写物の割合は、ＣＭＬの前と後の両方で、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞において高く（０．２０〜０．３５％）、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞において低い（＜０．１％）ことが見出された（図６）。
【００８６】
これらのマウスからの脾臓及び肝臓の組織学的及び組織化学的分析は、骨髄化生に特徴的な巨核球を明らかにした（図７）。
これらのマウスからの末梢血試料のフローサイトメトリーによる分析（流動活性化細胞選別、ＦＡＣＳ）は、成熟骨髄細胞の蓄積を明らかにした（図７）。
ＣＳＣマウスモデルからの芽細胞を、ＤＮＡメチル化（５−メチルシチジン、５−ＭｅＣｙｄ）について分析した。５−ＭｅＣｙｄ検出によるＤＡＰＩ染色細胞の比較は、ヒトＣＭＬと同様に、悪性形質転換に特徴的であるＤＮＡメチル化がＣＳＣマウスモデルにおいて起こることを示した（図８）。
【００８７】
ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスは、ヒトにおける疾患の進行と似たように、ＣＭＬから急性転化へ自発的に進行することが見出された。フローサイトメトリー分析は、これらのＣＳＣマウスモデルにおいて芽細胞の存在と顆粒球の不在が同時にあることを実証した。そのような分析の結果は、Ｂ細胞白血病及び骨髄性白血病について図９で示されている。更に、組織化学的分析は、芽細胞による肝臓及び末梢血への浸潤を明らかにした（図９）。
肝臓及び脾臓試料を、マッソン三色プロトコールを使用して染色し、ヒトＣＭＬ／急性転化患者においても観察される肝臓及び脾臓の線維症を、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて明らかにした（図１０）。
【００８８】
実施例５ ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０ ＣＳＣマウスは、ヒトＢ−ＡＬＬの病理を再現する
ＡＣＲ−ＡＢＬｐ１９０をＣＳＣマウスモデルにおいて腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒトにおけるＢ−ＡＬＬに相当する病理を発症した。マウスの末梢血、肝臓、脾臓及び肺への広範囲なＢ細胞芽細胞の浸潤が、フローサイトメトリー及び組織化学的分析により観察された（図１１）。
実施例６ ＳＣＡ１／ＬＭＯ２−ＲＨＯＭ２ ＣＳＣマウスは、ヒトＴ−ＡＬＬの病理を再現する
ＬＭＯ２−ＲＨＯＭ２をＣＳＣマウスモデルにおいて腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒトＴ−ＡＬＬに相当する病理を発症した。組織及び末梢血でのＴ細胞白血病の発症及びそれらへの芽球播種は、ヒト病理と同一であった。図１２において、胸腺腫、肝臓、腎臓、精巣及び脾臓組織からの試料の組織化学的分析の結果、並びに末梢血及び骨髄試料のフローサイトメトリーの結果は、Ｔ−ＡＬＬのこの典型的な発症を実証することを示す。
【００８９】
実施例７ ＳＣＡ１／Ｍａｆ−Ｂ ＣＳＣマウスは、ヒト多発性骨髄腫の病理を再現する
Ｍａｆ−ＢをＣＳＣマウスモデルにおいて腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒト多発性骨髄腫に相当する病理を発症した。組織化学的分析は、脾臓及び肝臓への形質細胞の浸潤を明らかにし、腎不全の病理的徴候を有することを明らかにした（図１３）。更に、形質細胞が骨髄及び末梢血において同定された（図１４）。
実施例８ ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスは、ヒトリンパ腫の病理を再現する
ＢＣＬ６をＣＳＣマウスモデル（マウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ×ＣＢＡマウスから得た）において腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒトリンパ腫に相当する病理を発症した。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスは、約５〜７か月後にリンパ腫を発症した。ＢＣＬ６転写物の割合は、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞において高く（０．２〜０．３％）、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞において低かった（＜０．１％）（図１５）。
脾臓組織試料の組織化学分析は、ＣＳＣマウスモデルにおける広汎性大Ｂ細胞リンパ腫が、ヒト病理を正確に模倣することを実証した（図１６）。肺及び腎臓組織へのＰａｘ５＋及びＣＤ２１＋Ｂ細胞の浸潤も、組織化学的染色によって観察された（図１７）。Ｂ細胞（ＰＡＸ５＋、Ｂ２２０＋、ＣＤ２１＋）は、脾臓組織試料の組織化学的染色によって示されたように、このＣＳＣマウスモデルにおいてＢＣＬ６を発現しなかった（図１７）。
【００９０】
ＳＣＡ１／ＢＣＬ６（Ｂ細胞リンパ腫）マウスとＢＣＬ６−／−との交配は、後者のマウスにおいてＢｃｌ６−／−表現型の救出をもたらさなかった（図１８）。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６×ＢＣＬ６−／−の後代において、Ｂ細胞の発生は正常であった。更に、後代マウスは、胚中心を形成することができず、広範囲な炎症反応により特徴付けられた。
分子レベルでは、ＣＳＣマウスモデルのＢ細胞リンパ腫も、ヒトＢ細胞リンパ腫と非常に類似していた。ＣＤ２２＋Ｂ２２０＋細胞をフローサイトメトリーにより単離した。ＲＮＡ抽出及び増幅、並びにハイブリダイゼーションを、材料及び方法で記載したように実施した。図１９で示されているように、ヒトＤＬＢＣＬを分類するのに一般的に使用される分子予後マーカー、例えば、Ｐｄｅ４ｂ、Ｆｏｘｐ１、Ｍｄｍ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、ｐ２７−Ｃｃｎｄ３又はＥｚｈ２−Ｂｍｉ１も、ＤＬＢＣＬのＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスモデルに存在する。
しかし、特にＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスモデルのＤＬＢＣＬ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋）はＢＣＬ６を発現しないことが見出された。この観点から、前記ＣＳＣマウスモデルは、「胚中心Ｂ細胞様」（ＧＣＢ）ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＤＬＢＣＬ細胞ではなく、ヒト「活性化Ｂ細胞様」（ＡＢＣ）ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＤＬＢＣＬ細胞に似ている（図２０）。
ヒトＡＢＣ ＤＬＢＣＬの病理と同様に、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスは、形質細胞分化の阻止を示したことが更に見出された。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスからの胚中心Ｂ細胞及び形質細胞に対する、材料及び方法で記載したＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイは、Ｘｂｐ１及びｐ２７が上方制御され、Ｐａｘ５及びＢｃｌ６が下方制御されることを明らかにした（図２１）。
【００９１】
実施例９ 固形組織Ｓｃａ１＋細胞の腫瘍遺伝子活性化がマウスに固形組織癌腫をもたらす
ｌｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｈＫ−Ｒａｓv12遺伝子構築物を、図２２で示されているように、トランスジェニックマウスのＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲに挿入した。したがって腫瘍遺伝子を、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅによる感染で活性化することができた。このＣＳＣマウスモデルは、非幹細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）型の肺癌を発症し、それはＡｄｅｎｏ−Ｃｒｅ感染の３〜５か月後に観察された。
実施例１０ 造血性ＣＳＣマウスモデルは、固形腫瘍も発症する
造血性癌の多様なＣＳＣマウスモデルの評価は、これらのマウスが固形腫瘍も発症することを明らかにした。
ＣＭＬのＣＳＣマウスモデルにおいて（実施例３及び実施例４を参照すること）、合計８９匹のマウスのうち７９％がＤＭＬのみを発症した。しかし、これらのマウスの全試料において、肺腺癌（ＡＤＣ）は１２％、肝臓ＡＤＣは３％、線維性組織球腫は２％、骨肉腫は２％及びセルトリ細胞腫は２％で観察された（図２３）。
Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／ＲＨＯＭ２ Ｔ ＣＳＣマウスモデルにおいて（実施例３及び実施例６を参照すること）、合計４３匹のマウスのうち７４％（３２匹のマウス）がＴ−ＡＬＬのみを発症した。しかし、全ＳＣＡ１／ＲＨＯＭ２試料において、肺ＡＤＣは１６％（７匹のマウス）、肝癌は５％（２匹のマウス）で観察された。他の癌は、５％（２匹のマウス；図２４を参照すること）で観察された。
【００９２】
Ｂ細胞リンパ腫モデルにおいて（実施例８を参照すること）、合計３３匹のマウスの試料のうち８８％（２９匹のマウス）がＢ細胞リンパ腫のみを発症した。しかし、肺ＡＤＣは９％（３匹のマウス）で観察され、肝癌は３％（１匹のマウス；図２５を参照すること）で観察された。
Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／Ｈｏｘ１１ ＣＳＣマウスモデルにおいて（実施例３を参照すること）、合計３７匹のマウスのうち７５％がＴ−ＡＬＬのみを発症した。しかし、肺ＡＤＣはこれらの場合の１６％で観察された。肝癌及びセルトリ細胞腫は、それぞれこれらのマウスの３％で観察された。他の癌は、これらのマウスの更に３％で観察された（図２６を参照すること）。
【００９３】
実施例１１ ＳＣＡ１の再プログラムによる癌発症のモデル化
ＣｒｅリコンビナーゼをＳｃａ１遺伝子の５′−ＵＴＲに挿入して、マウスを生成した。これらのマウスを、Ｂｇａｌ活性／発現がｌｏｘＰ部位で「ｌｏｘＰが導入された（floxed）」ストップカセットにより防止されているＲＯＳＡ２６レポーター株と交配した。このように生成されたＲｏｓａ２６×Ｓｃａ１−ＣＲＥマウスの皮膚及び精巣の切片を、Ｂ−ｇａｌ染色に付した。青色に染色された領域は、幹細胞が正常に位置している領域であった（図２７及び図２８）。
実施例１２ ＣＳＣ除去が癌の有効な治療戦略であるという証拠
ＣＳＣマウス癌モデル（Ｓｃａ１−ＨＶＴＫ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０及びＳｃａ１−ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫマウス）を、Ｓｃａ１陽性細胞の選択的除去が癌の治療に有効であるかという疑問に対処するために使用した。
【００９４】
ＨＶＴＫを含むトランスジェニック構築物を伴うマウスモデルを、以下の論理的根拠：ＨＶＴＫの発現が、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルのプロドラッグ形態の、薬剤の活性なリン酸化形態への変換を誘導する、に基づいて生成した。Rubsam L.Z. et al., (1998) Cancer Res 58 3873-3882で記載されているように、リン酸化ガンシクロビルを複製細胞のＤＮＡに組み込むと、Ｇ２／Ｍチェックポイントで前記細胞の非可逆的停止を引き起こし、続いてアポトーシスを引き起こす。
このＣＳＣマウス癌モデルにおいてＨＶＴＫがＣＳＣで特異的に発現するので、ガンシクロビル治療によりこれらのマウスで特異的にＣＳＣを除去することが可能である。
これは、ＣＳＣが癌の発生及び再発の源であるという仮説を試すことを可能にし、それはこの仮説は、ＣＳＣを選択的に死滅させることにより、癌を有効的にかつ持続的な効果を持って治療することができると予測するからである。
【００９５】
マウスを、材料及び方法で記載したように、ガンシクロビル（ＧＣＶ）又はプラセボのいずれかにより治療した。各マウスモデルにおいて、６０匹のマウスにガンシクロビルを毎日注射し、３０匹のマウスは、対照として使用し、食塩水（プラセボ）を毎日注射した。
Ｓｃａ１−ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫマウスにおいて、ガンシクロビルによる治療は、１０週間後に全ての腫瘍の排除をもたらし（図３０）、一方、プラセボ治療では、腫瘍を有するマウスの数は変化しないままであった（１００％）。腫瘍が消滅したマウスを更に１１週間モニタリングし、その間、腫瘍の再発は観察されなかった。
Ｓｃａ１−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて、同等の結果が得られた（図３１）。ガンシクロビルで治療された６０匹のＳｃａ１−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて、腫瘍は治療の８週間後に完全に消滅し、更にモニタリングした８週間の間に再発しなかった。対照として食塩水プラセボで治療した３０匹のマウスでは、腫瘍の数の低減は観察されなかった。
この実験は、ＣＳＣの仮説を確認し、ＣＳＣの死滅が、癌治療の有効な治療戦略であり、広い潜在的な用途を持つことを初めて実証した。
【００９６】
実施例１３ 癌がＣＳＣにより維持されている証拠
癌の維持に関与する細胞個体群を同定するために、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞を、骨髄から精製し（これらの細胞は、未分化細胞、ＣＳＣに相当する）、Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋細胞を、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスの脾臓から精製した（これらの細胞は、分化腫瘍細胞に対応する）。
これらの細胞を、尾静脈注射により同系の健康なマウスに移植した。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６表現型及び対照のそれぞれにおいて、６匹の同系の健康な動物に、１０，０００個のＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞を移植し、６匹には１，０００個のＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞を移植した。Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋細胞では、同じ数の試験動物を使用したが、１０5個及び１０6個の細胞を移植した。
Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋細胞により再構成されたマウスは、リンパ腫を発症しなかった。しかし、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞で再構成されたマウスは、Ｂ細胞リンパ腫を発症した。疾患は、１０，０００個の細胞を受けた６匹のマウスでは移植後平均して７４（±１１）日後に発症し、１，０００個の細胞を受けた６匹のマウスでは移植後平均して８１（±９）日後に発症した。対照マウスのいずれにおいてもリンパ腫は検出されなかった。
これらの結果は、疾患がＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞（ＣＳＣ）により維持され、繁殖したことを示した。
【００９７】
実施例１４ ＢＣＲ−ＡＢＬを標的にしても癌幹細胞を死滅させない
発明者たちは、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０が腫瘍悪性のために必要とされるかを調査した。
この目的を達成するために、ＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲにおいてＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子がＬｏｘＰ部位の間に配置され、その後にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の遺伝子が続くマウス株を構築した。したがってＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子を、Ｃｒｅ仲介ＬｏｘＰ突然変異誘発により不活性化することができる。第２（下流）ＬｏｘＰ部位の下流のＧＦＰ遺伝子の位置は、ＧＦＰがＬｏｘＰ座位でのＣｒｅリコンビナーゼの作用によるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子の除去によってのみ発現するような位置である（図３２を参照すること）。
骨髄（ＢＭ）細胞を、上記で記載されたＢＣＲ−ＡＢＬ構築物を担持する８〜１０週齢の雄ドナーＣＳＣマウスモデルから単離し、図３２で概略的に表した。単離された骨髄細胞を細胞培養で繁殖させ、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルス（Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ）で感染した。ＧＦＰもこれらの細胞から精製した。
【００９８】
緑色蛍光タンパク質を発現している培養し感染した骨髄細胞（ＧＦＰ＋）を、フローサイトメトリーにより単離し（材料及び方法を参照すること）、内在性脊髄細胞を死滅させるのに十分な線量（約９６０ラド）で予め照射されている同系の健康な雌野生型マウスに移植した。
遺伝子Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ手法によりＢＲＣ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子が排除されている、移植された骨髄細胞（ＧＦＰ発現細胞）は、Gleevec（商標）が１００％の効力で作用している細胞に相当する。それにもかかわらず、レシピエントマウスは白血病を発症し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により実証されている（図３３のダイアグラム）。
ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０は癌治療にとって適切な標的ではないことが結論づけられた。これは、遺伝子の除去がＣＳＣを排除しないという事実によって説明することができる。
【００９９】
実施例１５ マウスモデル及び患者における幹細胞駆動癌は、Gleevec（商標）による治療と同様に反応する
ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスからの骨髄細胞を、致死的に照射したマウスに移植した。全てのレシピエントマウスは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を発症した。
第２の研究において、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０マウスからの骨髄細胞を、致死的に照射したマウスに移植した。この場合、レシピエントマウスは、Ｂ細胞急性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）を発症した。
疾患は、骨髄とＢ細胞の両方のマーカーを共に発現する芽細胞の存在によりモニタリングした。ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０発現を、材料及び方法で記載されたリアルタイムＰＣＲによりモニタリングした。
【０１００】
Gleevec（商標）（イマチニブ、ＳＴＩ５７１とも呼ばれる）は、ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤である。ヒトにおいて、Gleevec（商標）は分化癌細胞を枯渇させ、したがって最初は症状の緩和をもたらす場合もあるが、Gleevec（商標）は、白血病幹細胞を枯渇させないことが示唆されている（Michor F et al. Nature (2005) 435, 1267-70）。ＣＳＣの仮説と一致しており、したがってGleevec（商標）により治療されている患者は典型的には再発する。
ＣＭＬを有するＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０骨髄レシピエントマウスと、Ｂ−ＡＬＬを有するＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０骨髄レシピエントマウスの両方を、Gleevec（商標）で治療した。Gleevec（商標）の貯蔵溶液を、濾過した滅菌の水で新たに調製し、材料及び方法で記載したように、１日２回、胃管栄養法によりマウスに投与した。Gleevec（商標）又はプラセボによるマウスの治療を、白血病が確認された日（０日）の後に開始した。Gleevec（商標）を、直線又は曲線の動物摂取用針により投与した。マウスの治療耐性は良好であり、治療の中断は必要なかった。マウスを１週間に３回臨床的に調べ、周期的な末梢血のカウントを、示されているように、尾静脈の採血から得た。この研究の生存分析の部分では、死亡終点は、動物の自然死により、又は疼痛又は苦痛の徴候のため、確立された基準に従った選択的殺処理により決定した。
【０１０１】
Gleevec（商標）による治療は、マウスにおいて白血病を治癒しなかった（ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＭＬモデルは図３５、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０ Ｂ−ＡＬＬモデルは図３６を参照すること）。ＣＭＬマウスでは、１４週間後には、Gleevec（商標）により治療されたマウスで生存しているものはなかった。プラセボで治療されたマウスでは、２０％が１５週間生存した（図３５）。Ｂ−ＡＬＬでは、プラセボにより治療されたマウスで１５週目まで生存したものはなく、Gleevec（商標）により治療されたマウスで１７週目まで生存したものはなかった。
いずれの研究においても、癌幹細胞がGleevec（商標）治療により影響を受けているとは認められなかった。したがって、Gleevec（商標）によるヒト治療の全体的な効力は、ＣＳＣマウスモデルに反映されている。このことは、また、Gleevec（商標）による治療後のヒト癌患者での再発は、Gleevec（商標）がマウスにおいて有効ではないという同じ理由に起因すること、すなわち、通常の癌性Ｂ細胞と異なり、ＣＳＣは、Gleevec（商標）治療よって影響を受けないことを発明者たちに示唆した。これはＣＳＣ理論と一致する。
したがって、発明者たちは、本発明のマウスモデルを使用して、Gleevec（商標）に相当するが、ＣＳＣを死滅させることに向けられている新世代の薬剤を開発できると結論づけた。
【０１０２】
実施例１６ マウスモデル及び患者における幹細胞駆動癌は、ドキソルビシンによる治療と同様に反応する
ドキソルビシンは、ヒトリンパ腫の治療における最も効果的な治療の一つである。しかし、特に広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）において、ドキソルビシン治療は、実質的に全ての患者がドキソルビシン再発により治療されているので、多くの場合に全体として成功していないと考えられる。
図３７は、ドキソルビシン治療の３〜５か月間にわたる癌幹細胞モデルマウス（Ｓｃａ１／ＢＣＬ６）におけるＣＳＣ又はＢ細胞の数を示す。Ｂ細胞の数は僅かに減少又は増加したが、ＣＳＣの数は、３か月の間に７〜８倍急激に増加した。
図３８では、ＣＳＣモデル肺癌マウスの生存を、治療期間の２０週間にわたってプロットした。プラセボで治療したマウスのうち、１８週間後に生存したものはなく、ドキソルビシンで治療したマウスのうち、２０週間を過ぎて生存したものはなかった。
したがってドキソルビシンによる治療は、ＣＳＣマウスで成功しなかった。ＣＳＣ理論と一致するので、発明者たちは、最も可能性のある説明は、これらのマウスにおいてドキソルビシンがＣＳＣを死滅させなかったことであると結論づけた。
したがって、Gleevec（商標）と同様に、ドキソルビシンについては、ヒトにおける治療の無効力がＣＳＣマウスモデルにおいて反映されている。
【０１０３】
実施例１７ マウスモデル及び患者における幹細胞駆動癌は、メルファラン−プレドニゾンによる治療と同様に反応する
メルファラン−プレドニゾンレジメンは、ヒト多発性骨髄腫の治療に一般的に成功していない。
図３９では、ＣＳＣモデル肺癌マウスの生存を、治療期間の２０週間にわたってプロットした。プラセボで治療したマウスのうち、１７週間後に生存したものはなく、メルファラン−プレドニゾンで治療したマウスのうち、２２週間を過ぎて生存したものはなかった。
したがってメルファラン−プレドニゾンによる治療は、ＣＳＣマウスで成功しなかった。ＣＳＣ理論と一致するので、発明者たちは、最も可能性のある説明は、これらのマウスにおいてメルファラン−プレドニゾンがＣＳＣを死滅させなかったことであると結論づけた。
したがって、ドキソルビシン及びGleevec（商標）と同様に、メルファラン−プレドニゾンについては、ヒトでの治療効力がＣＳＣマウスモデルにおいて反映されている。
【０１０４】
実施例１８ ＢＥＰ治療は、ＣＳＣマウスモデルとヒトの両方において成功している
ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド／ＶＰ１６、シス−プラチン）はヒト精巣癌を治癒する。この治療は毒性が高いが、癌を完全に治癒できることが知られている唯一の癌治療である。
実施例３のマウスモデルと同様に、Ｓｃａ１陽性細胞（幹細胞）をゲノム挿入及び腫瘍細胞Ｓｎａｉｌの発現により癌幹細胞に形質転換した、癌幹細胞マウスモデルを構築した。
これらのマウスが発生した腫瘍をＢＥＰにより治療することは、大きな成功を収め、図４０で示されているように、マウスの３つの異なる系列（１系列あたり１０匹の動物）において、治療は７週間後に腫瘍量をゼロに低減した。未治療動物モデルにおいて、腫瘍量は変わらないままであった。
この実験は、ＣＳＣマウスモデルが、陰性（例えば、Gleevec（商標）及びドキソルビシンそれぞれによるＣＭＬ及びＤＬＢＣＬの治療について上記で報告されている）の場合だけでなく、陽性の場合でもヒトにおける癌治療の反応を反映することを確認した。
【０１０５】
実施例１９ 正常な幹細胞に対する癌幹細胞の示差遺伝子発現分析
細胞発現ＳｃａＩを、材料及び方法で記載されたようにフローサイトメトリーにより分析及び単離した。そのように単離した幹細胞から、ＲＮＡを抽出した。増幅アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を、例えば、Van Gelder et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1663-1667の方法に基づいて、材料及び方法で示されたように、抽出ＲＮＡから調製した。
ＲＮＡによるハイブリダイゼーション実験によって、以下の観察及び結果がもたらされた。
ＣＳＣは、Ｂｍｉ１、Ｔｅｌ／Ｅｔｖ６、Ｔｅｒｔ、Ｇｆｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、β−カテニン及びＭｅｉｓ１のような遺伝子の相対的な発現レベルに関して、正常な幹細胞と著しく異なる。これらの遺伝子、並びにＢｃｌ６、ｐ３００、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ３及びＧａｔａ２は、一般にＣＳＣにおいて上方制御された。
ＣＳＣを、許容されない副作用を引き起こす除去を行うことなく、標的にし、除去することができる。
【０１０６】
異なる腫瘍からのＣＳＣにおいて、同じ遺伝子及び／又は遺伝子群が正常な幹細胞に対し上方又は下方制御される傾向があるほど、ＣＳＣは、同種細胞個体群を形成する。異なる腫瘍間の遺伝子発現の類似性によって、発明者たちは、ＣＳＣを標的にし除去する治療手法を広い範囲、すなわち異なる癌の範囲で使用できると結論づけた。
例えば、一つのマウスモデルのＣＳＣにおけるＢｃｌ６の発現は、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）をもたらす。別のマウスモデルにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣの発現は、慢性骨髄性白血病をもたらす。しかし、これらの２つのマウスモデルは、類似している遺伝子がそのＣＳＣにおいて上方制御及び下方制御されるので、ある程度類似した遺伝子発現プロフィールを示す。
【０１０７】
以下の記述は、本発明の追加的な態様に関連する。
１．ヒト病理に関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む齧歯類幹細胞。
２．前記幹細胞が癌幹細胞である、態様１に記載の幹細胞。
３．前記ヒト病理が幹細胞由来のヒト病理である、態様１に記載の幹細胞。
４．前記ヒト病理が、ヒト上皮又は間葉癌である、態様１に記載の幹細胞。
５．前記ヒト病理が、リンパ腫、白血病、肉腫及び癌腫から選択される、態様４に記載の幹細胞。
６．前記ヒト病理が、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球増殖性症候群、多発性骨髄腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、肺癌、乳癌、皮膚癌、脳癌、直腸癌、膵癌、前立腺癌、腎癌などから選択される、態様５に記載の幹細胞。
７．マーカーを更に含む、態様１に記載の幹細胞。
８．前記マーカーが、癌幹細胞の特定の単離及び／若しくは同定のために、又は癌幹細胞の獲得のために、又は健康な幹細胞から癌幹細胞を分化させるために有用なマーカーである、態様７に記載の幹細胞。
９．レポーターを更に含む、態様１に記載の幹細胞。
１０．前記レポーターが、発症、進行、播種、及び更なる生理病理学的過程の空間時間的同定のために、分子画像技術により治療の効果を評価するために、診断アッセイ、薬剤発見及び開発過程のために、標的同定のために、臨床開発の全段階での効力及び信頼性の改善のために有用であるレポーターである、態様９に記載の幹細胞。
１１．以下：
−被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出するため；又は
−被験者においてヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価するため；又は
−被験者においてヒト病理のステージ若しくは重篤度を決定するため；又は
−ヒト病理を有する被験者に与えられる治療の効果をモニタリングするため；又は
−ヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計するため；又は
−ヒト臨床試験を設計するため；又は
−癌の診断、及び／若しくは癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；又は
−個別化治療のための患者の選択のため；又は
−治療効果の治療的なモニタリング及び評価のため；又は
−薬剤発見及び薬物動態指針のため
のバイオマーカーとしての態様１〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞の使用。
１２．ヒト病理の標的を発見する、スクリーニングする、探索する、同定する、評価する及び検証するため、又は癌幹細胞の自己複製能力に関連する特定の遺伝子を同定するための、態様１〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞の使用。
１３．被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出する方法、又は前記ヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価する方法であって、前記被験者からの試料中で幹細胞を同定することを含み、前記幹細胞が、幹細胞由来の前記ヒト病理に関連する遺伝子異常を含む方法。
１４．被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定する方法、又は前記病理を有する被験者に投与された治療の効果をモニタリングする方法であって、前記被験者からの試料中の幹細胞の濃縮物を同定及び定量化し（前記幹細胞は、ヒト病理と関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む）、前記濃縮物を、対照試料と、又は前記被験者からの以前の試料と、又は治療が与えられる前に前記被験者から取られた以前の試料と比較することを含む方法。
１５．前記幹細胞が癌幹細胞である、態様１３又は１４に記載の方法。
１６．前記ヒト病理が幹細胞由来のヒト病理である、態様１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ヒト病理を治療する薬剤をスクリーニング、探索、同定、開発及び／若しくは評価する、又は既知の薬剤若しくは化合物の組み合わせを再配置する方法であって、候補化合物を態様１３〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞と接触させ、反応をモニタリングすることを含む方法。
１８．ヒト病理に罹患しているヒトのために個別的な治療を設計する方法であって、態様１７で同定された化合物を選択することを含み、前記化合物が、前記癌幹細胞の繁殖若しくは分化をなくする若しくは遅くするか又は前記細胞を死滅させ、前記化合物が、前記被験者に投与される医薬組成物に活性成分として使用される方法。
１９．以下：
（ｉ）態様１〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞の標的を選択すること、又は前記齧歯類幹細胞の分子プロファイリングをすること；
（ｉｉ）疾患状態における前記標的又は前記分子プロフィールを検証すること、場合により最適化すること；及び
（ｉｉｉ）非反応者に対して反応者を選択すること
を含む、ヒト臨床試験を設計する方法。
２０．Ｓｃａ−１+細胞において遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含み、前記遺伝子異常が、（ｉ）ＢＣＬ６遺伝子を含む核酸、及び（ｉｉ）キナーゼでコードされる１番目のヌクレオチド配列と、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を含む２番目のヌクレオチド配列とを含む核酸から選択されるＤＮＡ構築物。
２１．遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される前記遺伝子が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする１番目のヌクレオチド配列、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を含む２番目のヌクレオチド配列及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む３番目のヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記１番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記３番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合しており、前記３番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記２番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合される、態様２０に記載のＤＮＡ構築物。
２２．Ｓｃａ−１+細胞における遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される前記遺伝子の発現を指示する前記プロモーターが、齧歯類プロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメントである、態様２０又は２１のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
２３．態様２０〜２２のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
２４．前記哺乳動物が齧歯類、好ましくはマウス又はラットである、態様２３記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
２５．態様２３又は２４のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の後代。
２６．細胞株が態様２０〜２２のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物をそのゲノムに含む、態様２３又は２４のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞株。
２７．細胞株が齧歯類細胞株である、態様２６記載の細胞株。
２８．幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製方法であって、
ａ．態様２０〜２３のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物を非ヒトトランスジェニック哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること；
ｂ．前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
ｃ．前記子孫を評価して、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常の存在を評価すること
を含む方法。
２９．前記非ヒト哺乳動物が齧歯類、好ましくはマウス又はラットである、態様２８記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-及びＳｃａ１-Ｌｉｎ+株に発現する導入遺伝子、チミジンキナーゼ及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０を示す。
【図２】図２は、 ガンシクロビル治療及び食塩水治療（対照）後に腫瘍を発症したマウスの割合を示す。
【図３】図３は、（ａ）正常な脾臓、（ｂ）ＤＬＢＣＬを発症した脾臓、（ｃ）攻撃性の小さいバーキットリンパ腫を発症した脾臓、及び（ｄ）攻撃性の大きいバーキットリンパ腫を発症した脾臓の３つ代表的な画像を示す。
【図４】図４は、Ｓｃａ１+Ｂｃｌ６マウスの骨髄癌幹細胞における既知の標的遺伝子の発現データの図示である。遺伝子（右側で確認）は、それぞれ着色ボックスの単一横列で表され、マウスは、それぞれ単一縦列で表される。
【図５】図５は、Ｂｃｌ６マウスモデルにおける、ヒト広汎性大ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）で上方／下方制御されている記載された幾つかの遺伝子の発現パターンの図示である。
【図６】図６は、ＣＭＬマウスモデルの構築に使用される、ＳＣＡ１へのＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子挿入の概略図、並びにＣＭＬ前後のＳｃａ＋Ｌｉｎ−及びＳｃａ−Ｌｉｎ＋細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０転写物レベルの測定をまとめたグラフである。
【図７】図７は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスがヒトＣＭＬの病理を再現したことを示す。巨核球が脾臓及び肝臓における骨髄化生を定義し、成熟骨髄細胞が末梢血に蓄積する。
【図８】図８は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスが、悪性形質転換に関連しヒトＣＭＬにも見出されるＤＮＡメチル化を示すことを示す、染色体を染色した光学顕微鏡画像を表す。
【図９】図９は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスが、ＣＭＬから急性転化へ自発的に進行し、ヒトＣＭＬの病理を再現することを示す。フローサイトメトリーによる分析は、末梢血に芽細胞は存在するが、成熟顆粒球は存在しないことを示す。組織化学的分析は、芽細胞が肝臓と末梢血の両方に浸潤することを示す。
【図１０】図１０は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスが、ヒトＣＭＬで見られる脾臓及び肝臓の線維症を再現することを示す（マッソン三色染色プロトコールによる肝臓及び脾臓切片の緑色染色）。
【図１１】図１１は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０ ＣＳＣマウスが、ヒトＢ−ＡＬＬの病理を再現することを示す。血液塗抹標本、脾臓、肝臓及び肺の試料のフローサイトメトリーの結果及び／又は組織化学的分析は、末梢血、脾臓、肝臓及び肺への広範囲なＢ細胞芽細胞の浸潤を示す。
【図１２】図１２は、ＳＣＡ１／ＬＭＯ２−ＲＨＯＭ２ ＣＳＣマウスが、ヒトＴ−ＡＬＬの病理を再現することを示す（脾臓、胸腺腫、肝臓、腎臓及び精巣のフローサイトメトリーデータ及び組織化学データ）。組織及び末梢血でのＴ細胞白血病の発症及びそれらへの芽球播種は、ヒト病理と同一である。
【図１３】図１３は、ＳＣＡ１／Ｍａｆ−Ｂ ＣＳＣマウスが、ヒト多発性骨髄腫の病理を再現することを示す（組織化学データ）。形質細胞が脾臓及び肝臓に浸潤し、腎不全の病理的徴候を有する。
【図１４】図１４は、ＳＣＡ１／Ｍａｆ−Ｂ ＣＳＣマウスが、ヒト多発性骨髄腫の病理を再現することを示す。フローサイトメトリー及び組織化学的分析は、ヒト多発性骨髄腫と同様に、骨髄及び末梢血における形質細胞を明らかにする。
【図１５】図１５は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスがヒトリンパ腫の病理を再現することを示す実験を要約する。ＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲへのＢＣＬ６挿入の概略図が提供される。リンパ腫のＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスモデルを構築するのに使用されるＣ５７ＢＬ／６×ＣＢＡマウスが、５〜７か月後にリンパ腫を発症した。ＢＣＬ６転写物レベルの測定は、ＢＣＬ６がＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞で転写されるが、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞では転写されないことを示す。
【図１６】図１６は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスがヒトリンパ腫の病理を再現することを示す（脾臓組織の組織化学的分析）。このＣＳＣマウスモデルの脾臓で見出される広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＢＬＢＣＬ）は、ヒトで見られるＤＬＢＣＬを模倣する。
【図１７】図１７は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスがヒトリンパ腫の病理を再現することを示す。脾臓、肺及び肝臓組織の組織化学的分析は、（１）Ｐａｘ５＋及びＣＤ２１＋Ｂ細胞が肺及び肝臓組織に浸潤すること、及び（２）Ｂ細胞はＢＣＬ６で発現しないことを明らかにする。
【図１８】図１８は、ヒトＢ細胞リンパ腫と同様に、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスはＢ細胞においてＢＣＬ＆を発現しないという観察を要約する。ＢＣＬ６−／−表現型は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６×ＢＣＬ６−／−マウスにおいて救出されない。
【図１９】図１９は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスが分子レベルでもヒトリンパ腫と同様の病理を示すことを示す、ＦＡＣＳ及びハイブリダイゼーション分析の結果を要約する。単離したＣＤ２２＋Ｂ２２０＋細胞によるハイブリダイゼーション実験は、ヒトＤＢＣＬを分類するのに使用される、図で提示されているような分子予後マーカーが、ＣＳＣ癌マウスモデルに存在することを示す。
【図２０】図２０は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスが、「胚中心Ｂ細胞様」（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬではなく、ヒト「活性化Ｂ細胞様」（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬに類似しているという観察を要約する。ヒトＡＢＣ ＤＬＢＣＬにおけるＣＤ１９＋ＣＤ２２＋細胞の場合にように、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣ ＤＬＢＣＬマウスモデルにおけるＢ２２０＋ＣＤ２２＋細胞は、ＢＣＬ６を発現しない。
【図２１】図２１は、制御、遺伝子発現のレベル及び関連する細胞分化の観点から、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスとヒト「活性化Ｂ細胞様」（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬとの類似性を更に要約する。Ｓｃａ１−Ｂｃｌ６マウスは、ヒトＡＢＣ ＤＬＢＣＬで観察されるものと同様な形質細胞分化阻止を示す。
【図２２】図２２は、肺癌モデルで使用されるｌｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｈＫ−Ｒａｓv12構築物の概略図、並びに、このモデルにおいて、固形組織Ｓｃａ１＋細胞での腫瘍遺伝子活性化が、マウスに固形組織癌をもたらすことを示す組織化学的分析を提供する。非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の肺癌が、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ感染の３〜５か月後に観察された。
【図２３】図２３は、ＣＭＬのＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２４】図２４は、Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／ＲＨＯＭＢ２ ＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２５】図２５は、Ｂ細胞リンパ腫のＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２６】図２６は、Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／ＨＯＸ１１ ＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２７】図２７は、Ｓｃａ１遺伝子の５′−ＵＴＲにＣｒｅリコンビナーゼを担持するマウスと、Ｂｇａｌ活性／発現がｌｏｘＰ部位で「ｌｏｘＰが導入された（floxed）」ストップカセットにより防止されているＲＯＳＡ２６レポーター株との交配の結果を示す。このように生成されたＲｏｓａ２６×Ｓｃａ１−ＣＲＥマウスの皮膚及び精巣の切片を、Ｂ−ｇａｌ染色に付した。青色に染色された領域は、幹細胞が正常に配置されている領域であった。ＲＯＳＡ２６×ＳＣＡ１／ＣＲＥ後代の皮膚試料が示されている。
【図２８】図２８は、ＲＯＳＡ２６×ＳＣＡ１／ＣＲＥ後代の精巣試料が示されている以外は、図２７と同じ実験の結果を示す。
【図２９】図２９は、ＣＭＬマウスモデルの構築に使用される、ＳＣＡ１へのＨＶＴＫ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子挿入の概略図、並びにＳｃａ＋Ｌｉｎ−及びＳｃａ−Ｌｉｎ＋細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０転写物レベルの測定をまとめたグラフを提供する。これは、ＣＳＣ除去が癌の有効な治療戦略であることを証明するために使用されたＣＳＣマウスモデルの一つであった。
【図３０】図３０は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウス癌モデルにおける癌を、再プログラム幹細胞（ＣＳＣ）を死滅させることによって有効に治療できることを示す。治療開始の１０週間後に検出可能な腫瘍はなく、更なる１１週間の観察の間、検出可能な腫瘍はなかった。
【図３１】図３１は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウス癌モデルにおける癌を、再プログラム幹細胞（ＣＳＣ）を死滅させることにより有効に治療できることを示す。治療開始の８週間後に検出可能な腫瘍はなく、更なる８週間の観察の間、検出可能な腫瘍はなかった。
【図３２】図３２は、「ｌｏｘＰが導入された（floxed）」ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０／ＧＦＰ構築物の概要を提供する。ｌｏｘＰが導入されたとは、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０が、ｌｏｘＰ座位でフランクされていることを意味する。したがって、この構築物におけるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０−又は同じ方法でｌｏｘＰが導入された他の遺伝子−を、Ｃｒｅ仲介ＬｏｘＰ突然変異誘発により不活性化することができる。ＧＦＰは、ｌｏｘＰが導入されたＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の下流及び／又はそれに隣接して配置されている。このことは、ｌｏｘＰが導入された遺伝子−この図ではＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０−がＣｒｅ仲介ＬｏｘＰ突然変異誘発により不活性化される場合、ＧＦＰの発現を可能にする。この構築物を使用して、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０が腫瘍悪性のために必要とされるかを試験した。ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の代わりに他の腫瘍遺伝子を含む同等の構築物は、前記の他の腫瘍遺伝子が腫瘍悪性のために必要とされるかを試験することを可能にする。
【図３３】図３３は、実施例１４に記載されている、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０と腫瘍悪性との関係を試験する実験を要約する。
【図３４】図３４は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣモデルとヒトＣＭＬにおけるＣＳＣ駆動癌が、Gleevec（商標）による治療に同じように臨床反応するという観察を要約する。ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ／Gleevec（商標）は、マウスにおいてＣＳＣを死滅させない。
【図３５】図３５は、Gleevec（商標）によるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０骨髄レシピエントマウスの治療の結果を表すグラフである。治療は、実施例１５で記載されているように効果がなかった。
【図３６】図３６は、癌幹細胞マウスモデルにおけるGleevec（商標）によるＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０白血病の治療が、成功しなかったことを示すグラフである。治療は、実施例１５で記載されているように効果がなかった。
【図３７】図３７は、ヒトと同様に、ドキソルビシンによる広汎性大Ｂ細胞リンパ腫の治療が、ＣＳＣマウスモデルにおいて効果がないことを示す（細胞カウントデータ、実施例１６を参照すること）。
【図３８】図３８は、ヒトと同様に、ドキソルビシンによる広汎性大Ｂ細胞リンパ腫の治療が、Ｓｃａ１／ｈＫＲＡＳ ＣＳＣマウスモデルにおいて効果がないことを示す（生存研究、実施例１６を参照すること）。
【図３９】図３９は、ヒトと同様に、メルファラン−プレドニゾンによる多発性骨髄腫の治療が、Ｓｃａ１／ＭＡＦ−Ｂ ＣＳＣマウスモデルにおいて効果がないことを示す（生存研究、実施例１７を参照すること）。
【図４０】図４０は、ヒト精巣癌の成功したＢＥＰ治療レジメンが、対応するＳＣＡ１／ＳＮＡＩＬ ＣＳＣマウスモデルにおいても成功することを示す。ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド／ＶＰ１６、シス−プラチン）により治療されたマウスは、７週間以内に腫瘍がなくなった（実施例１８を参照すること）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト病理に関連するヒト遺伝子異常を幹細胞に特異的に発現することができる齧歯類幹細胞に関する。ヒトの疾患の診断、治療及び予防の用途のような前記幹細胞の用途、生成物及び方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ＳＣ）は、それら自体が自己複製を介して永続化する能力、及び分化を介して特定の組織の成熟細胞を生成する能力を有する細胞として定義される。ＳＣの例には、造血幹細胞、神経幹細胞、癌幹細胞などが挙げられる。
現在、癌は、繁殖する能力及び新たな腫瘍を形成する能力が著しく異なる癌細胞の異種個体群から構成されると考えられている。大多数の癌細胞は限定された分裂能力を有するが、広範囲に繁殖し新たな腫瘍を形成する排他的能力を有する癌幹細胞（ＣＳＣ）の個体群は、マーカー発現に基づいて同定することができる。
正常な幹細胞の自己複製を調節する経路がＣＳＣにおいて調節解除され、自己複製癌細胞及び腫瘍形成の連続的な拡大をもたらすことを、ますます多くの証拠が示唆している。このことは、癌細胞における欠損自己複製経路を標的にする作用物質が、これらの疾患の治療において改善された治療転帰をもたらす可能性を示唆している。
この戦略は、腫瘍形成の生物学、並びに癌の診断及び治療において意味を持つ。癌を有効に治療するためには、ＣＳＣを排除しなければならない。そうでなければ、治療が非腫瘍形成癌細胞を排除するが、ＣＳＣの相当数の個体群を残した場合、腫瘍は急速に再形成する。伝統的には、癌の治療は、腫瘍を小さくする能力に依存してきた。多くの場合においてＣＳＣが腫瘍の小規模な細胞個体群に存在するので、ＣＳＣを選択的に死滅させる作用物質は、腫瘍サイズの急速な低減に依存する現行のスクリーニング法において見逃される可能性がある。
【０００３】
作用物質が相当数のＣＳＣを残してしまう場合、残存細胞は、腫瘍を急速に再形成することができる。現行の治療の効力についての理解に対するその影響に加えて、癌の幹細胞モデルは、将来の治療標的の同定に対して影響を及ぼす可能性がある。発現分析を腫瘍形成癌細胞の濃縮物個体群へ向けると、新規診断マーカー及び新規治療標的の同定がより効果的となるはずである。加えて、ＣＳＣの維持に関連する経路を直接標的とする治療が、成功する著しく大きな可能性を有するであろうことが明白となる。
癌発症に関与する遺伝子改変がＣＳＣで発生すると想定される場合、この問題に基づくマウスモデルを設計することができる。新たな戦略は、ＣＳＣ表現型の維持に関与する過程を決定することに焦点を合わせるべきである。このことが、新たな標的を同定して、それらに対して薬剤を設計する目的である。したがって、この方法で生成したマウスモデルは、この状況において、ＣＳＣの維持に対して向けられる薬剤を設計するための基本的なツールである。
多くの新しい抗癌剤は、癌発症の従来と異なった局面を標的にし、予測不可能な方法で他の薬剤と相互作用する。これらは、患者の小規模な亜集団にしか臨床利益を示さないと予測される。
加えて、現行の治療の効力を改善するために、癌の幹細胞モデルも潜在的な治療標的の同定の助けになる。発現分析を腫瘍形成癌細胞の濃縮物個体群へ向けると、新規診断マーカー及び新規治療標的の同定がより効果的となる。最近の証拠は、ＣＳＣの維持に関与する経路を直接標的にする治療が、成功する著しく大きな可能性を有することも示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌発症に関与する遺伝子改変がＣＳＣで発生するという理解に基づいて、この遺伝子改変を正確に再現するマウスモデルを設計することが可能である。第１に、ＣＳＣ表現型の維持に何が関与しているかを決定しなければならず、それは、標的の同定、及びそれらに対して使用する潜在的な薬剤の基本になるからである。したがって、この戦略に従って生成されたマウスモデルのような動物モデルは、ＣＳＣの維持を阻害する薬剤を設計する基本的なツールを表す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一つの態様において、本発明は、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む、動物癌モデルに関する。遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子は、本明細書において活性化されうる遺伝子と呼ばれる。この構築物によって、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、活性化されうる遺伝子を含み、かつ発現する幹細胞（ＳＣ）を含有する。
【０００６】
本発明の一つの態様は、ヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む、そのようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物から場合により単離される幹細胞（ＳＣ）に関する。特定の実施態様において、前記ＳＣは癌幹細胞（ＣＳＣ）である。ＳＣ又はＣＳＣは、とりわけ、齧歯類ＳＣ又はＣＳＣであることができる。
好ましくは、本発明の上記の態様によると、ヒト病理は、癌、好ましくは固形腫瘍である。固形腫瘍の幾つかの例には、間葉癌、例えば肉腫；上皮癌、例えば癌腫；リンパ腫などが挙げられる。
発明者たちは、動物モデルにおいて、ＣＳＣ生成癌が同等のヒト癌表現型を忠実に複製することを発見した。現行の動物モデル、主にマウスモデルは、ヒト癌と相関する遺伝子型−表現型を再現することに失敗している。これらのモデルにおいて、マウスに導入されたヒト癌遺伝子欠損は、癌遺伝子欠損が全ての細胞又は特定の分化細胞のいずれかに存在する動物モデルをもたらす。そのようなマウスモデルは、癌幹細胞モデルを考慮することなく生成され、したがって、正確なヒト癌標的細胞の性質を考慮していない。したがって、これらのモデルは、ヒト癌遺伝型−表現型相関関係をあまり再現しておらず、ヒト癌患者において見られる反応パターンと異なって薬剤に反応する。事実、そのような従来のモデルにおいて標的及び薬剤候補を選択すること及び／又は試験することは、ヒトの反応を予測し得ないことが、発明者たちの論点である。
【０００７】
例えば、Ｈ−ＲａｓV12Gがマウスで発現する場合、黒色腫を反映するマウス表現型をもたらす。対照的に、ヒト表現型は、膀胱癌、腎癌及び甲状腺癌である。例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を使用するマウスの遺伝子欠失は、癌のマウスモデルを治癒する。対照的に、同じ産物はヒトでは緩和をもたらさない。
第２の例は、マウスモデルでＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）をもたらすＢＣＲ−ＡＢＬp210により提供することができる。ヒトにおいて、表現型は、全く異なっている（慢性骨髄性白血病、ＣＭＬ）。マウスＢ−ＡＬＬモデルにおいて、Gleevec（商標）は、癌を治癒するが、ヒトにおいて、この生成物は、症状の緩和しかもたらさない。したがって、マウスモデルへの癌に関連している遺伝子欠損の単なる非標的化導入は、どのような方法によっても、ヒトの状態を映す疾患状態の確立をもたらさないことが明かであり、おそらくそれは、遺伝子が、疾患を生じることに関与するマウス中の細胞を正確に標的にしていないからである。
【０００８】
癌の新たな動物モデルの緊急の必要性は、この分野における専門家の意見により支持されており、現在、現行の動物モデルが、不適切であること、及び新たなマウスモデルが癌治療におけるあらゆる基本的な改善の鍵であることが十分に実証された事実である。例えば、Robert Weinbergは、「全体的な癌研究の努力において依然として未解決である基本的な問題は、ヒト癌の前診療モデルが必須であるということである」と記載している（２００４年３月）。フォーチュン誌において、彼は、「戦いに勝つためには、ヒトの反応をより良好に模倣する動物モデル及び癌発症を予測するバイオマーカーが必要である」と記載している（２００４年３月２２日）。
本発明者たちにより求められた疑問は、なぜそれほど多くの癌のマウスモデルが不適切であるかということを問うていた。その答えは、癌が繁殖性疾患ではないこと及び癌幹細胞がヒトの癌の真実の細胞標的を提供することに答えがあると発明者たちは信じている。ＣＳＣは、特有であり、かつ腫瘍の大部分を形成する細胞と異なっている特性及び経路を有すると考えられる。体幹細胞中で、ヒト病理に関連する遺伝子異常を標的にすることによって、ヒト病理状態を正確に映す動物モデルを確立することが、発明者たちによって確立された。白血病に加えて、これらの動物モデルは、固形腫瘍を生成する。このことは極めて驚くべきことであり、最も有益である。
【０００９】
癌幹細胞動物モデルの望ましい特性は、その動物においてヒト癌を反復しなければならないことである。そのような望ましい特性には、ヒト癌と同様な組織学的特徴の確立；同じ疾患ステージを通して進行しなければならないこと；宿主に対して同じ全身的効果を引き起こさなければならないこと；腫瘍開始／進行において同じ遺伝子経路を生じなければならないこと；現行の治療手法に対してヒトと同じように反応しなければならないことが挙げられる。
この知識を持ちながら、発明者たちは、ヒト腫瘍遺伝子を幹細胞に発現する複数の動物モデルを生成した。これらのモデルは、組織病理学と治療剤への反応の両方でヒト癌を模倣することが見出された。これらのモデルを、新規の治療手法を発見するため、治療効力を評価する新たな方法を発見するため、新たな診断ツールを発見し、最適化するため、スクリーニングするＣＳＣの供給源として、新規及び現存の薬剤／薬剤候補を試験するための組織化された手法で使用することができる。これらの手法及びモデルの全ては、本発明の実施態様を形成する。
本発明の記載の理解を促進するために、本発明の文脈における幾つかの用語及び表現の意味を下記で説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
用語「幹細胞」（ＳＣ）は、それ自体が自己複製を介して永続化する能力、及び分化を介して特定の組織の成熟細胞を生成する能力を有する細胞を意味する。これらは、多能性であり厳密に制御されている自己複製組織細胞である。ＳＣの例には、造血幹細胞、神経幹細胞、肉腫幹細胞、乳房幹細胞、肺幹細胞、能幹細胞、前立腺幹細胞、膵臓幹細胞などが挙げられる。
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍再発と転移の両方に関与しており、新規分子標的を提供する新規細胞標的を提供することが、発明者たちの論点である。癌幹細胞は、細胞に特徴的である特定のマーカーを幹細胞区画において発現し、そのことは当業者には知られている。例えば、幹細胞はＳｃａ１+である。幹細胞は、また、Ｌｉｎ-である。
用語「癌幹細胞」（ＣＳＣ）は、広範囲に繁殖し、新たな腫瘍を形成し、癌の進展を維持する能力を有する細胞、すなわち腫瘍の形成及び増殖を駆動する無限の繁殖潜在能力を有する細胞を意味し、前記用語には、ＳＣにおける遺伝子改変と、ＣＳＣになる細胞における遺伝子改変の両方が含まれる。好ましい実施態様において、前記ＣＳＣはＳｃａ１+である。
【００１１】
用語「被験者」は、哺乳動物の種のメンバーを含む脊椎動物を意味し、愛玩動物、齧歯類（特に、ネズミ科の動物（murine animal））、霊長類及びヒトが挙げられるが、これらに限定はされず、被験者は、好ましくは、男性又は女性、任意の年齢又人種のヒトである。
用語「齧歯類」としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、好ましい実施態様において、齧歯類動物はマウスである。
表現「ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子」は、本明細書以降、「活性化されうる遺伝子」と呼ばれ、哺乳動物のゲノムに組み込まれたとき、遺伝子、改変遺伝子又は遺伝子融合が関連するヒト病理を再現する、遺伝子、改変遺伝子（突然変異、欠失、挿入、複製などを含む）又は遺伝子融合を意味する。好ましくは、本発明の活性化されうる遺伝子は、腫瘍遺伝子である。多くの腫瘍遺伝子は既知であり、特定の型の癌に関連している。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０は、慢性骨髄性白血病に関連している。ＢＣＲ−ＡＢＬp190、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ及びＥ２Ａ−Ｐｂｘ１は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）に関連している。他の例が下記に提示されており、更なる例も当業者に知られている。例えば、腫瘍遺伝子の包括的なリストは、http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/Geneliste.htmlで提供されており、Cooper G. Oncogenes. Jones and Bartlett Publishers, 1995; Vogelstein B, Kinzler KW. The Genetic Basis of Human Cancer. McGraw-Hill: 1998; http://cancerquest.org/index.cfm?page=780も参照すること。
【００１２】
用語「ヒト病理」には、幹細胞由来のヒト病理、並びに非幹細胞由来のヒト病理が含まれる。特定の実施態様において、ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。別の特定の実施態様において、前記活性化されうる遺伝子は、ヒト腫瘍病理又はヒト非腫瘍病理のような幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子である。
更なる特定の実施態様において、前記ヒト病理は固形腫瘍である。ヒト病理は、上皮又は間葉の癌から選択することができる。そのような癌の特定の例には、骨髄増殖性疾患、ヒトリンパ腫（例えば、バーキット様リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び辺縁層リンパ腫）、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫を含むリンパ球増殖性症候群、白血球減少症、血小板減少症、血管形障害；カポジ肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫を含む任意の肉腫、任意の間葉癌；肺癌（例えば、小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））を含む任意の癌腫、並びにリンパ腫、乳癌、皮膚癌及び腎癌が挙げられる。他の例には、新生物；黒色腫；並びに固形腫瘍、例えば、肺、結腸直腸、乳房、子宮、前立腺、膵臓、頭部及び頸部、脳の固形腫瘍が挙げられる。
【００１３】
別の特定の実施態様において、前記活性化されうる遺伝子は、造血又は胎児幹細胞移動のようなヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子である。別の特定の実施態様において、前記活性化されうる遺伝子は、神経障害、奇病、代謝疾患、免疫疾患、心血管疾患のようなヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子である。
したがって、本発明は、ヒト病理が動物モデル、特にマウスモデルで生成される、ヒト癌のモデルを包含する。この態様に関連する本発明の別個の実施態様は、上皮又は間葉の癌のモデルを提供する。そのようなモデルの例には、本明細書で記載されている、ヒトリンパ腫、白血病、肉腫及び癌腫、特に慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ球増殖性症候群、多発性骨髄腫、肉腫、例えば脂肪肉腫、ユーイング肉腫、癌腫、例えば肺癌、乳癌、皮膚癌及び腎癌のモデルが挙げられる。
【００１４】
動物モデルは、本発明のこの態様に従って、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む幹細胞（ＳＣ）を動物において生成することによって生成することができる。発明者たちは、これらのモデルが、ヒト癌と同様な組織学的特徴の確立；同じ疾患ステージを通した進行；宿主に対する同じ全身的効果を引き起こすこと；腫瘍開始／進行において同じ遺伝子経路を活性化／抑制すること；多様な治療手法に対してヒトと同じように反応することを含む、癌状態のあらゆる忠実な再現に必要な特徴を全て共有することを確立した。
本発明の癌モデルを生成するために、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子（活性化されうる遺伝子）は、好ましくは、Ｓｃａ１+細胞において前記遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される。そのようなプロモーターは、転写の開始に関与し必要である核酸の配列であり、前記細胞において活性化されうる遺伝子の発現を指示し、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含む。本発明の文脈内において、用語「プロモーター」は、転写調節タンパク質が結合できる他の部位も含むことができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、このプロモーターは、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子異常の発現を指示する任意の真核細胞プロモーター、すなわち、幹細胞区画でのみ活性であり、細胞が幹細胞の状態を越えて分化すると不活性である任意のプロモーターであることができる。幹細胞区画で活性であるが、分化細胞でも活性であることができるプロモーターは、本発明での使用には不適切である。幹細胞にのみ特異的なプロモーターの活性は、本発明の重要な態様である。好ましくは、プロモーターは、Ｓｃａ１を発現する細胞で活性であり、場合により、ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）又はヒトの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３；α２βｌインテグリンなどを発現する細胞においても活性であるものである。プロモーターは、好ましくはＬｉｎ＋である細胞において不活性である。
例えば、プロモーターは、任意の真核細胞Ｓｃａ１プロモーター、特に脊椎動物、動物、哺乳動物、齧歯類又はマウスから誘導されるＳｃａ１プロモーターである。適切なプロモーターの別の例には、ｍｕｓａｓｈｉ−１及びｍｕｓａｓｈｉ−２プロモーター、並びにその機能的同等物が挙げられる（Siddall NA et al. Proc. Natl Acad. Sci.USA 103: 8402-8407, 2006）。マウスｍｕｓａｓｈｉ−１遺伝子の詳細は、GeneID: 17690 Primary source: MGI:107376 in Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で見出すことができる。
【００１６】
発明者たちが本発明を実証するために使用する特定の実施態様では、活性化されうる遺伝子の発現をＳｃａ１+細胞において指示するプロモーターは、マウスのｐＬｙ−６Ｅ１プロモーター又はその機能的フラグメント若しくはその機能的同等物であることができる。換言すると、動物モデルにおいて、例えばこの場合はマウスにおいて、異なる導入遺伝子の組織特異的発現を指示することができる。ｐＬｙ−６Ｅ１プロモーターは、十分に特徴決定されており、Ｓｃａ１+細胞における選択的発現に必要な全ての要素を含んでいる[Miles C., Sanchez M-J, Sinclair A, and Dzierzak, E. (1997) "Expression of the Ly-6E.1 (Sca-1) transgene in adult haematopoietic stem cells and the developing mouse embryo". Development 124:537-547]。したがって、特定の実施態様では、前記活性化されうる遺伝子の発現をＳｃａ１+細胞において指示するプロモーターは、マウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物である。このプロモーターの機能的同等物は、当業者に周知であり、ｐＬｙ６Ａ遺伝子、Ｔｍｔｓｐ遺伝子、ｃ−ｋｉｔ遺伝子、マウスＣＤ３４遺伝子、Ｔｈｙ１遺伝子などのプロモーターが挙げられる。
【００１７】
表現「機能的に結合される」は、活性化されうる遺伝子の配列に対するプロモーターの方向付けに関する。プロモーターは、活性化されうる遺伝子の発現を制御又は調節することができるように配置されている。
前記活性化されうる遺伝子の例示的な非限定例には、ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＢＣＲ−ＡＢＬp190、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、ＴＡＬ１、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１、ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３、ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ−ＡＴＦ１、ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７、Ｋ−ＲＡＳｖ１２、Ｎｏｔｃｈ１などとして当該技術で同定されている遺伝子が挙げられる。ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＢＣＲ−ＡＢＬp190、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２及びＴＡＬ１遺伝子に関する情報は、ＷＯ０３／０４６１８１に見出すことができる。これら全ての遺伝子及び遺伝子融合の配列は、当業者により現存のデータベース、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=geneから簡単に入手することができる。当業者が理解するように、使用されるこれらの遺伝子のいずれか１つの正確な配列は変わることができる。好ましくは、哺乳類の活性化されうる遺伝子、例えばマウス配列、より好ましくはヒト配列が使用される。しかし、本発明は、例えば多型変種、突然変異体及び野生型と考慮されない他の遺伝子型を含むように、変種の活性化されうる遺伝子の使用を含む。例えば、そのような遺伝子を、疾患のパターンの差を反映し、患者群にわたる治療に反応するなどの可能性があるような遺伝子の腫瘍形成潜在能力における差を調査するのに使用できる。したがって、上記で参照された各遺伝子に対する参照には、その範囲内で、例えば、上記で表された受入番号で表される配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上の有意な相同性又は配列同一性を共有するような遺伝子の変種への参照が含まれる。遺伝子は、ｃＤＮＡであることができるか、又はゲノム配列を含むことができる。ｃＤＮＡが好ましい。
【００１８】
固形組織Ｓｃａ１+細胞における腫瘍遺伝子活性化は、固形組織癌腫をもたらすことが、本明細書で示されている。この研究は、ＡｄｅｎｏＣｒｅを条件的に使用して腫瘍遺伝子（この場合、一つの好ましい例として、ヒトＫＲＡＳｖ１２）を活性化する条件系を使用して、マウスにおいて例示されている。この系において、非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の肺癌が、ＡｄｅｎｏＣｒｅ感染、すなわち腫瘍遺伝子活性化の約３〜５か月後に観察された。
したがって、固形組織中のＳｃａ１+細胞を、ヒト造血性癌に関連する遺伝子欠損について標的化すると、固形腫瘍発症をもたらすことが、本明細書で実証される。
例えば、発明者たちのＣＭＬのモデル（下記を参照すること）は、７９％のマウスでＣＭＬ疾患のみを生成することを示した。残りは、ＣＭＬと、肺腺癌（肺ＡＤＣ）（１２％）、肝腺癌（肝ＡＤＣ）（３％）、線維性組織球腫（２％）、骨肉腫（２％）及びセルトリ細胞腫（２％）から構成される。
【００１９】
したがって、本発明のこの態様は、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される活性化されうる遺伝子（すなわち、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子）を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有し、固形腫瘍を生成するか又は生成する潜在能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。固形腫瘍の例には、骨髄増殖性疾患、ヒトリンパ腫（例えば、バーキット様リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び辺縁層リンパ腫）、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫を含むリンパ球増殖性症候群、白血球減少症、血小板減少症、血管形障害；カポジ肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫を含む任意の肉腫、任意の間葉癌；肺癌（例えば、小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））を含む任意の癌腫、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、膵癌、頭部及び頸部、脳、並びに腎臓の癌、新生物；黒色腫などが挙げられる。
【００２０】
Ｓｃａ１+Ｒｈｏｍ２マウスを使用する発明者たちのＴ−ＡＬＬモデルは、７４％でＴ細胞又はＨＳＣ疾患のみを生成し、残りは、造血性疾患と、肺腺癌（１６％）、肝腺癌（５％）及び他（５％）から構成される。Ｓｃａ１+Ｈｏｘ１１マウスも同様なパターンを有する。
Ｓｃａ１+ＢＣＬ６マウスを使用する発明者たちのＢ細胞リンパ腫モデルは、８６％でリンパ腫疾患のみを生成し、残りは、リンパ腫と、肺腺癌（９％）及び肝腺癌（３％）から構成される。
ＢＣＲ−ＡＢＬp210は、慢性骨髄性白血病に関連している。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすＣＭＬの動物モデルを、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。ＢＣＲ−ＡＢＬp210をコードする構築物を、ＢＣＲ−ＡＢＬp210転写物が幹細胞区画、特にＳｃａ１+Ｌｉｎ-細胞で生成されるように配置するべきである。
【００２１】
そのようなモデルは、ヒトＣＭＬの病理の多様な特徴を反復することが見出された。例えば、発明者たちにより生成され、本明細書に記載されているマウスモデルは、慢性（骨髄増殖性）期及び急性転化を示す。造血幹細胞の大きさは正常である。更に、Gleevec（商標）はＣＭＬを治療するのに効果的ではなく、ヒトの状態の場合では、症状の緩和しか提供しない。このことは予想外ではあったが、ヒトＣＭＬの病理の関連する特徴を再現する現実的なモデルとして、このモデルの信頼性についての良好な証拠を提供する。
本発明のＣＭＬモデルは、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を動物の幹細胞区画に導入することによって確立することができる。ＢＣＲ−ＡＢＬp210の配列は、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されることができる。マウスモデルの生成に適切なそのようなプロモーターの例は、マウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又は機能的フラグメント若しくはその同等物である。他の例は、本明細書を読むことによって当業者に明らかになる。
【００２２】
そのようなモデルにおいて、幹細胞が幹細胞状態を越えて分化した後では、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞でのＢＣＲ−ＡＢＬp210転写物の割合は高く、Ｓｃａ１-Ｌｉｎ+細胞では低いことが見出されている。本発明者たちにより提唱されているＣＳＣ理論を支持するように、ＢＣＲ−ＡＢＬp210転写物のパターンは、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞とＳｃａ１-Ｌｉｎ+細胞の両方でＣＭＬの発症の前後で異なっていないことも見出されている。このことは、ＢＣＲ−ＡＢＬp210それ自体は、癌の状態に直接的な役割を演じないが、実際には癌疾患の真の原因である更に下流の（癌細胞の刷込みを課すことによる）発生的／後成的修飾を引き起こすという論点を支持する。
発明者たちの知る限りにおいて、この幹細胞駆動ＣＭＬ発症は、ヒトＣＭＬ及び急性転化を再現する最初のマウスモデルである。ヒトの状態で見られる疾患のパターンと同様に、これらのモデルは、ＣＭＬから急性転化へ自発的に進行する。更に、これらの動物の脾臓及び肝臓における巨核球が、骨髄化生を定義する。ＦＡＣＳ分析も末梢血における成熟骨髄細胞の蓄積を示す。更に、マウスモデルは、ヒトにおける悪性形質転換に関連するＤＮＡメチル化変化を反映する。
【００２３】
ＢＣＲ−ＡＢＬp190、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ及びＥ２Ａ−Ｐｂｘ１は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）に関連している。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすこの疾患の動物モデルを、ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ又はＥ２Ａ−Ｐｂｘ１のいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトＢ−ＡＬＬの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。腫瘍遺伝子配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２４】
Ｂ−ＡＬＬモデルのプロトタイプの例が本明細書においてマウスで示されており、ヒト病理の特性がマウス系で反映されている。特に、末梢血、肝臓、脾臓及び肺への広範囲なヒトＢ細胞芽細胞の浸潤が実証されている。
ＳＣＬ、ＨＯＸ１１、ＬＭＯ１及びＬＭＯ２は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に関連している。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすＴ−ＡＬＬの動物モデルを、ＳＣＬ、ＨＯＸ１１、ＬＭＯ１又はＬＭＯ２のいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトＴ−ＡＬＬの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、ＬＭＯ２配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２５】
Ｔ−ＡＬＬモデルのプロトタイプの例が本明細書においてマウスで示されており、ヒト病理の特性がマウス系で反映されている。特に、組織及び末梢血でのＴ細胞白血病の発症及びそれらへの芽球播種が示され、ヒト病理と同一である。
Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ及びＭＭＳＥＴ遺伝子は、多発性骨髄腫に関連する。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらす多発性骨髄腫の動物モデルを、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ又はＭＭＳＥＴのいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらのモデルは、全て、ヒトＢ−ＡＬＬの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ又はＭＭＳＥＴのいずれか１つの配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２６】
多発性骨髄腫モデルのプロトタイプの例が本明細書においてマウスで示されており、ヒト病理の特性がマウス系で反映されている。特に、形質細胞の浸潤が脾臓及び腎臓で示されており、腎不全の病理的徴候が見られる。形質細胞は、また、骨髄及び末梢血において、ヒトで見られるものと非常に類似した病理を示す。
ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及びｃｙｃｌｉｎ Ｄ３は、バーキット様リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）又は辺縁層リンパ腫のようなリンパ球増殖性障害に関連する。発明者たちは、特定の場合に固形腫瘍の発症ももたらすこれらの疾患の動物モデルを、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１又はｃｙｃｌｉｎ Ｄ３のいずれか１つを動物の幹細胞区画に組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトリンパ腫の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００２７】
そのようなモデルのプロトタイプの例は、Ｓｃａ１+において配列の発現を指示するプロモーターの機能的な制御下で動物の幹細胞区画に組み込まれるＢＣＬ６遺伝子を使用して生成された。幹細胞が幹細胞状態を越えて分化した後では、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞でのＢＣＬ６転写物の割合は高く、Ｓｃａ１-Ｌｉｎ+細胞では低いことが見出されている。本発明者たちにより提唱されているＣＳＣ理論を支持するように、ＢＣＬ６転写物のパターンは、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞とＳｃａ１-Ｌｉｎ+細胞の両方でリンパ腫の発症の前後で異なっていないことも見出されている。このことは、ＢＣＬ６それ自体は、癌の状態に直接的な役割を演じないが、実際には癌疾患の真の原因である更に下流の（癌細胞の刷込みを課すことによる）発生的／後成的修飾を引き起こすという論点を支持する。
【００２８】
この疾患モデルは、ヒトで見出される疾患の病理を反映する。例えば、モデルでの脾臓における広汎性大Ｂ細胞リンパ腫は、ヒトで見られるものを正確に模倣する。Ｐａｘ５及びＣＤ２１＋ｖｅＢ細胞は、肺及び腎臓に浸潤する。事実、Ｓｃａ１+ＢＣＬ６マウスにおけるこれらのＢ細胞はＢＣＬ６を発現せず、ＢＣＬ６を標的にすることは、癌治療の過剰な実施であるという論点に更に重みを加える。更に、Ｓｃａ１+ＢＣＬ６マウスとＢｃｌ６欠損マウスとの交配は、表現型を救出しないことが見出された。
さらにより興味深いことに、マウスで生成されたＢ細胞リンパ腫は、ヒトＢ細胞リンパ腫と分子的に類似している。例えば、ヒトＤＬＢＣＬを分類するために使用される伝統的な分子予後マーカーは、本明細書で生成され記載されているＤＬＢＣＬモデルに存在する。そのようなマーカーには、Ｍｄｍ２、Ｂｃｌ−２、ｐ２７−Ｃｃｎｄ３、Ｅｚｈ２−Ｂｍｉ１、ｃ−Ｍｙｃ、Ｆｏｘｐ１及びＰｄｅ４ｂが挙げられる。このパターンのＢ細胞リンパ腫を有することによって特徴付けられる動物モデルは、本発明の更なる態様を形成する。
更に、本発明のモデルにおけるＢ細胞リンパ腫は、ヒトＡＢＣ−ＤＬＢＣＬと同様な分子サインを有する。ヒト（Alizadeh, AA. et al. Nature, 2000; 403:503）においてもこれらのマウスモデにおいてもＡＢＣ−ＤＬＢＣＬは、ＢＣＬ６を発現しない。加えて、Ｓｃａ１+Ｂｃｌ６マウスは、ヒトＡＢＣ−ＤＬＢＣＬで観察されるものと同様な形質細胞分化阻止を示す。
【００２９】
ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ及びＦＵＳ−ＥＲＧは、急性骨髄性白血病に関連している。発明者たちは、これらの疾患の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ又はＦＵＳ−ＥＲＧを組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒト骨髄性白血病の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
ＥＷＳ−ＷＴ１及びＥＷＳ ＦＬＩ１は、ユーイング肉腫に関連する。発明者たちは、ユーイング肉腫の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＥＷＳ−ＷＴ１又はＥＷＳ ＦＬＩ１を組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトユーイング肉腫の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００３０】
ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３及びＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３は、粘膜様脂肪肉腫に関連する。発明者たちは、粘膜様脂肪肉腫の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＦＵＳ−ＤＤＩＴ３又はＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３を組み込むことによって生成できることを確立した。これらの遺伝子のいずれか１つを含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒト粘膜様脂肪肉腫の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、これらの配列のうちのいずれか１つは、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
ＦＵＳ−ＡＴＦ１は、血管腫様線維性組織球腫に関連する。発明者たちは、血管腫様線維性組織球腫の動物モデルが、動物の幹細胞区画へＦＵＳ−ＡＴＦ１を組み込むことによって生成できることを確立した。この遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒト血管腫様線維性組織球腫の病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、この配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
【００３１】
ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７は、低悪性線維粘液肉腫（ＬＧＦＭＳ）に関連する。発明者たちは、ＬＧＦＭＳの動物モデルが、動物の幹細胞区画へＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７を組み込むことによって生成できることを確立した。この遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの創造に基づくモデルは、ヒトＬＧＦＭＳの病理の多様な特徴を忠実に反復することが見出された。例えば、この配列は、上記で考察されたように、Ｓｃａ１+細胞において配列の発現を指示するプロモーターに、例えばマウスプロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメント若しくは同等物に機能的に結合されることができる。
本発明に従って生成されたモデルは、ヒトにおける薬剤反応で予測されるような方法で薬剤に反応する。
【００３２】
例えば、ヒト多発性骨髄腫の治療に成功していないメルファラン−プレドニゾンレジメンは、本明細書に記載されている多発性骨髄腫モデルにおいても成功していない。ヒト肺癌の治療に成功していないドキソルビシンは、本明細書に記載されている肺癌モデル、例えばＳｃａ１+ｈＫＲＡＳマウスにおいても成功していない。この薬剤については、本発明のマウスにおけるヒト及びＤＬＢＣＬモデルにおいても同じである。ドキソルビシンは、ヒトリンパ腫の治療において最も活発に使用されている薬剤の一つである。これは、実質的に全てのヒトリンパ腫患者がドキソルビシン再発により治療されている現実にも関わらずである。
ヒトＢｃｒＡｂｌ白血病の治療に成功していないGleevec（商標）（イマチニブ）は、本明細書に記載されているＢｃｒＡｂｌ白血病モデルにおいても成功していない。Gleevecは、ヒトＣＭＬに症状の緩和をもたらすが、この場合でも、本明細書に記載されているＣＭＬのマウスモデルにおいてＣＭＬを治癒しない。発明者たちにより提唱されている明快な仮説は、この有効な治療に失敗したのは、GleevecがＣＳＣを死滅させなかったからということである。本明細書に記載されているモデルを使用して、ＣＳＣを死滅させ、したがって癌を治癒する次世代のGleevecを開発することができる。
【００３３】
更に、ヒト精巣癌の成功した治療レジメンは、本明細書に記載されているマウスモデルでも成功している。ＳＮＡＩＬがＳｃａ１+細胞で発現するモデルにおいて、ＢＥＰ（ブレオマイシン、ＶＰ１６＝エトポシド、シス−プラチン）で処置されたマウスは、７週間以内に腫瘍がなくなっている。ＢＥＰはヒト精巣癌を治癒し、毒性が高いが、癌を治癒することが知られている唯一の癌治療である。
したがって、ＣＳＣの同定は、癌治療のパラダイムシフトを表すことが明確である。本明細書に含まれるデータは、ＣＳＣが細胞の真実の個体群であり、かつ癌疾患の生成に関与していることに疑う余地のないことを実証している。しかし、ＣＳＣを（標的同定、薬剤発見などのため）標的として治療プログラムで使用する前に、２つのことを示すことが重要である。第１には、これらの除去が、動物全身における腫瘍形成の後、インビボで癌を排除することを意味すること。第２には、ＣＳＣがどのように正常な幹細胞と異なるかを知る必要があり、それによってこれらを選択的に標的化できることである。
【００３４】
当然のことながら、ＣＳＣが癌疾患を維持できることが本明細書において示されている。例えば、本明細書に開示されている実験は、Ｓｃａ１Ｂｃｌ６マウスの骨髄から精製されたＳｃａ１+Ｌｉｎ-細胞が、再構成されたマウスの１００％でヒトＢ細胞リンパ腫を生成することを示している。対照的に、脾臓誘導腫瘍Ｂ細胞は、リンパ腫を全く生成しない。
加えて、ＣＳＣの除去後の癌の排除が、ｐＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスのガンシクロビル処置を使用して本明細書において初めて実証されている（実施例１を参照すること）。この場合、ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０構築物が、ｐＬｙ６プロモーターの機能的制御下でＳｃａ１+遺伝子に導入される。予測されたように、上記に記載されたＣＭＬモデルにおいてＢＣＲＡＢＬｐ２１０構築物の発現パターンをもたらすと、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０及びＴＫ転写物のパターンは、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-細胞において高く、Ｓｃａ１-Ｌｉｎ+細胞では非常に低いことが見出された。ＨＳＶ−ｔｋの発現は、プロドラッグヌクレオシドガンシクロビルの、リン酸化塩基類似体としてのその薬剤形態への変換を誘導する。リン酸化ガンシクロビルは複製細胞のＤＮＡに組み込まれ、Ｇ２／Ｍチェックポイントで非可逆的停止を引き起こし、続いてアポトーシスを引き起こす（Rubsam LZ et al. Cancer Res 1998, 58: 3873-3882）。発明者たちは、Ｓｃａ１＋細胞の除去を治療標的として使用できるか、及びＣＳＣの死滅が癌治療の有効な治療戦略であるかを決定するために使用できるかという疑問に対処するためにこのモデルを開発した。１００％のマウスが腫瘍を有する出発時点から、３０匹のマウスを対照として使用し、毎日、生理食塩水に付した。残りの６０匹のマウスには、毎日、ＧＣＶを注射した。この期間の間で、癌は完全に消滅した。更に、ＧＣＶ処置後に消滅した癌を担持していたこれらのマウスを、更に３か月間観察して、腫瘍の再発は観察されなかった。したがって、これらのマウスにおけるガンシクロビル処置は、腫瘍量の完全なる低減をもたらす。
【００３５】
ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−Ｂｃｌ６構築物を含むマウスで実施された研究においても、全く同じことが事実であると示された。
この研究は、ＣＳＣの死滅が、癌治療の有効な治療戦略であり、その潜在的な用途が広いことを初めて実証する。
したがって、本発明は精製されたＣＳＣに部分的に関連する。これらのＣＳＣは、単離され、精製され、特徴決定された。これらの精製ＣＳＣを、上記に記載された本発明の態様のうちのいずれか１つのモデルから、特に上記に記載されたマウスモデルから単離することができる。実施態様において、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えばｍＣＳＣ）は、マーカーを、例えば、癌幹細胞の特定の単離及び／若しくは同定のために、又は癌幹細胞の獲得のために、又は健康な幹細胞から癌幹細胞を分化させるために有用なマーカーを更に含む。前記の目的を達成することができるＳＣから又はＣＳＳからの実質的にあらゆる産物、例えば、遺伝子、タンパク質などを使用することができる。前記マーカー関する情報を、ＳＣ及び／若しくはＣＳＣを単離する及び／若しくは同定するアッセイを設計するため、又はＳＣ及び／若しくはＣＳＣを獲得するため、又は健康なＳＣからＣＳＣを分化するために使用することができる。マウスゲノムとヒトゲノムとの類似性のために、上記に記述した目的に有用なマーカーを、ヒトＳＣ（ｈＳＣ）及び／又はヒトＣＳＣ（ｈＣＳＣ）において同じ目的を達成するために使用することもできる。
【００３６】
したがって、本発明の一つの態様は、癌幹細胞の実質的に純粋な培養物に関する。好ましくは、前記ＣＳＣはＳｃａ１+である。そのような細胞は、Ｓｃａ１抗原を有意なレベルで発現することができる。他の有用なバイオマーカーの例には、ヒトにおけるヒト上皮抗原（ＨＥＡ）、ＣＤ１３３；α２βｌインテグリンが挙げられる。１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のこの型のマーカーを、本発明の幹細胞により発現することができる。ＣＳＣは好ましくはＬｉｎ−である。ＣＳＣは、ＣＤ３８-であることもできる。
本発明のＣＳＣは、癌を繁殖及び維持する潜在能力を有する。この能力を、本明細書で記述されるアッセイのどれかを使用して試験することができる。例えば、健康なマウスへのＣＳＣの移植は癌を引き起こし、適切な機能確認アッセイをもたらす。適切なアッセイの特定の例は、実施例１３に提示されている。
【００３７】
本発明のＣＳＣは、例えば、前立腺癌幹細胞、脳、乳房、腸、結腸、肺、卵巣、白血病、上皮、固形腫瘍、又は任意の上皮及び間葉癌のようなあらゆる種類の癌幹細胞であることができる。ＣＳＣは、任意の脊椎動物癌幹細胞であることができるが、最も興味深いものはヒトと非ヒトの両方の癌幹細胞、哺乳類及び特にマウス細胞を含む齧歯類を含む動物幹細胞である。好ましくは、実質的に純粋な培養中の細胞の少なくとも５０％が癌幹細胞であり、この割合はより多くなることができ、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上であることができる。癌幹細胞の実質的に純粋な培養物は、好ましくは、癌幹細胞ではない癌細胞の５０％未満を含有し、この割合はより少なくなることができ、例えば、２５％、１０％、５％、１％又はそれ以下であることができる。
【００３８】
本発明の癌幹細胞は、他の型の細胞に対して、例えば患者又は細胞の培養から直接得られた未処理生物学的試料と比較して、５倍濃縮、２５倍濃縮、５０倍濃縮又はそれ以上のＣＳＣであることができる。そのような他の細胞型には、体内又はインビボ培養に存在する非幹癌細胞、非癌性幹細胞及び他の健康な細胞が挙げられる。
加えて、本発明の癌幹細胞は、好ましくは、ヒトにおけるＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ１４０ｂ及びグリコホリンＡ（ＧＰＡ）からなる群ｉ）より選択される１つ以上の成熟系列マーカーの有意なレベルを発現しない。本発明の癌幹細胞は、好ましくは、ＣＤ２４を発現しないか、低レベルのＣＤ２４を発現する。本発明の癌幹細胞は、Ｌｉｎ−であり、成熟系列マーカーを発現しない。
本明細書で使用されるとき、「有意なレベル」とは、好ましくは、例えばウエスタンブロッティングのようにブロッティング手順で抗体を使用して、マーカータンパク質を検出可能なレベルで発現させることを意味する。
【００３９】
本発明の特定の態様によると、多様な遺伝子及びそれらのコードタンパク質が、ＣＳＣ癌状態に関与している。これらの発見は多数の開発を可能にする。例えば、ＣＳＣを、これらの遺伝子及びタンパク質の同定に応じて、実施された個別及び関連する治療介入において同定することができる。腫瘍を、癌治療により有利に反応するような分類に層別化することができる。特定の評価を、これらの遺伝子の１つ以上について患者の発現プロフィールを作ることができ、これらの評価に基づいて、診断を、患者が治療に適切な候補者であるか、そうであれば、どのような治療剤が適切であるかについて処方することができる。そのような場合は、どのような形態の治療（例えば、投与量、投与時間及び方法、薬剤の組み合わせ）を行うことが最適であるべきかについてより詳細な評価を行うことができる。
例えば、マイクロアレイを使用して、発明者たちは、健康なＳＣと比較して、Ｂｍｉ−１、Ｎａｎｏｇ、ＰＵ．１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＥＢＰｇ／ｚ、Ｒ−ＩＬ３、Ｂｃｌ２、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＰＣＤＣ２、ｐ２１、ｐ５３、ｍｄｍ２、Ｐ２７及びＣＣＮＤ２の発現レベルがＣＳＣで異なることを発見した。更に、これらの遺伝子の発現レベルは、癌発症の前及び癌発症の後のＣＳＣで異なっている。このことは、リンパ腫の疾患で例示された。特に、マイクロアレイの結果の分析データは、３個のマーカー：Ｂｃｌ−２、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３で特に有意な差を示す。Ｂｃｌ−２マーカーは、対照レベルと比較して、リンパ腫の発症の後の遺伝子発現に有意な減少を表した。一方、後者の２個のマーカー、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３は、対照と比較して、リンパ腫の発症の後で増加した反応を示した。これらの結果は、臨床的に検出できる癌の前のＣＳＣは、癌が臨床的に検出されたときのＣＳＣと異なることを示す。これらの結果は、ＣＳＣの情報を、ｉ）健康なヒトにおける癌の発症を予測すること、及びｉｉ）予防治療により癌の発症を防止することなどに使用できることを示す。そのような情報は、癌患者又は従来のマウスモデルから得られる研究されたＣＳＣから得ることはできない。したがって本発明のマウスモデルは、この分野で提起された多様な挑戦に対処する独特の供給源を表す。
【００４０】
したがって本発明のこの態様は、癌を発症し易い又は癌に罹患している個人を診断する方法であって、前記患者からの組織において、Ｂｍｉ−１、Ｎａｎｏｇ、ＰＵ．１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＥＢＰｇ／ｚ、Ｒ−ＩＬ３、Ｂｃｌ２、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＰＣＤＣ２、ｐ２１、ｐ５３、ｍｄｍ２、Ｐ２７及びＣＣＮＤ２又はこれらの発現産物の群からの遺伝子のいずれか１つの配列、又は発現レベル、又は活性を検出すること、及び前記配列、発現レベル又は活性を基準と比較することを含み、前記基準と異なる配列、発現レベル又は活性が、疾患又は疾患に対する罹病性を示す方法を提供する。一般に、Ｂｍｉ−１、ＰＵ．１、Ｐａｘ−５ａ、ＣＥＢＰｇ／ｚ、Ｂｃｌ２、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＰＣＤＣ２及びｐ２１では、基準レベルよりも有意に高いレベルは、個人が罹病している又は罹病し易いことを示す。「有意に」とは、発現又は活性のレベルが、基準レベルよりも１０％、２５％、５０％、１００％、２５０％、５００％、１０００％又はそれ以上高いことを意味する。一般に、Ｎａｎｏｇ、Ｅ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ｃ−Ｋｉｔ、Ｒ−ＩＬ３、ｐ５３、ｍｄｍ２及びＣＣＮＤ２では、基準レベルよりも有意に低いレベルは、個人が罹病している又は罹病し易いことを示す。基準レベルは、患者の健康な幹細胞における発現レベルである。
【００４１】
更なる実施態様において、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えばｍＣＳＣ）は、更にレポーターを含む。本発明によると、レポーターは、細胞膜の表面に結合される又はＳＣ若しくはＣＳＣの内部に導入されている産物であり、発症、進行、播種、及び更なる生理病理学的過程の空間時間的同定を可能にし、並びに分子画像技術による効果的な治療を可能にする。適用できる例示的な非限定的分子画像技術には、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＴＡＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、高性能Ｘ腺など、酵素反応に基づく生物発光シグナルの発信に基づいた方法、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような標識を含有する遺伝子構築物の挿入に基づいた方法などが挙げられる。前記の目的を達成することができる実質的にあらゆるレポーターを使用することができる。前記レポーターを、診断アッセイ（例えば、ヒトの疾患の分子フィンガープリント法など）、薬剤発見及び開発法、標的同定、並びに薬剤耐性又は個別化医療の臨床開発の全段階及びその使用での効力及び信頼性の改善において役割を果たすこともできる。
【００４２】
本発明のＣＳＣを、例えば患者からの試料中で単離、濃縮及び精製することができる。患者は、癌と診断された個人、癌を罹患する危険性があると考えられる個人、癌を有すると疑われる個人、又は癌を有するとは疑われず、良好な健康状態であるという外観を与える個人であることができる。本発明で使用されるとき、用語「試料」は、液体試料、例えば血液、精液、血漿、唾液、尿など又は固形試料、例えば組織試料のような、ＳＣ又はＣＳＣを含有し易い任意の生物学的試料であることができる。適切な固形組織の例には、骨髄、脾臓、肝臓、肺などが挙げられる。試料は、固形試料の場合では外科的除去を含む、あらゆる従来の方法によって得ることができる。試料は、幹細胞由来のヒト病理、例えば癌を有すると以前に診断された若しくは診断されていない被験者から、又は治療を受けている、若しくは幹細胞由来の前記ヒト病理のために以前治療された被験者からも得ることができる。
本発明のこの態様は、患者又は患者の集団からＣＳＣの単離、濃縮及び精製を可能にする。このことは、癌幹細胞における癌性増殖に影響を与える因子を同定するため、遺伝子発現又はタンパク質発現のパターンについて癌幹細胞の個体群を分析するため、新たな抗癌剤標的を同定するため、現存の又は新たな治療に対する癌幹細胞の感受性を予測するため、並びに癌発症及び治療の一般的なモデル化を行うためのアッセイを開発することを可能にする。
【００４３】
代替案において、本発明のＣＳＣを培養中で増殖することができる。細胞を、本明細書で記載されている型のマウスモデルのような動物モデルから単離することができる。Ｓｃａ１の発現に加えて、癌モデル動物から単離したＣＳＣは、癌に関連する染色体異常（本明細書において、活性化されうる遺伝子と記載される）を含むことができる。前記染色体異常の例示的な非限定例には、ＢＣＲ−ＡＢＬp210、ＢＣＲ−ＡＢＬp190、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、ＴＡＬ１、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１、ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３、ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ−ＡＴＦ１、ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７、ｈＫＲＡＳｖ１２として同定されている遺伝子が挙げられる。上記に記述されたものを含む適切な活性化されうる遺伝子の配列は、従来技術において既知である。
【００４４】
本発明は、ＣＳＣを単離する方法も包含する。そのような方法は、本明細書に記載されているＣＳＣのバイオマーカーを発現する癌幹細胞の選択的濃縮を伴う。マーカーを発現する細胞の濃縮に適切な方法には、蛍光活性化細胞選別、免疫親和性交換などのような免疫学に基づく系が挙げられる。他の同等な例は当業者に既知であり、密度調整細胞選別、磁気細胞選別、抗原パニングなどが挙げられる。
本発明は、本発明の癌幹細胞を繁殖させる方法にも関する。そのような方法は、培養中の癌幹細胞を、少なくとも１つの選択される分化細胞型の細胞から産生された可溶化液の濃縮物に暴露し、濃縮物が、分裂した各癌幹細胞が２つの同一の娘癌幹細胞を産生する対称有糸分裂か、又は分裂した各癌幹細胞が１つの同一の娘癌幹細胞を産生し、癌幹細胞よりも分化している１つの娘癌幹細胞を産生する非対称有糸分裂のいずれかを優先的に起こすことによって癌幹細胞を繁殖させることができることを含む。
【００４５】
特定の実施態様において、ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。ヒト病理の例は、前に記載されている。説明のために、以下の遺伝子、改変遺伝子及び遺伝子融合が本明細書において特にヒト病理に関連している：多発性骨髄腫：ｍａｆ−Ｂ、ｆｇｆ−Ｒ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ；リンパ球増殖性症候群：Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−１０、ＭＡＬＴ１、ＣＹＣ Ｄ１、ＣＹＣ Ｄ３；Ｔ細胞急性白血病：ＳＣＬ、Ｈｏｘ１１、ＬＭＯ２、ＬＭＯ１；Ｂ細胞急性白血病：Ｂｃｒ−ａｂｌｐ１９０、ｔｅｌ、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２ａ−Ｐｂｘ１；急性骨髄性白血病：Ｔｅｌ−ａｂｌ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ；慢性骨髄性白血病：Ｂｃｒ−ａｂｌｐ２１０；脂肪肉腫：ＦＵＳ−ＣＨＯＰ；ユーイング肉腫：ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１；及び肺癌：Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ（Ｃｒｅリコンビナーゼ誘発性）。
【００４６】
本発明により提供されるＳＣ（ｍＳＣを含む）及び／又はＣＳＣ（ｍＣＳＣを含む）を、多数の戦略において、例えば、
−癌の過程を調査及び研究するため；又は
−ＣＳＣ個体群を同定、分類、単離、精製若しくは記述するため；又は
−被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出するため；又は
−被験者においてヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価するため；又は
−被験者においてヒト病理のステージ若しくは重篤度を決定するため；又は
−被験者においてヒト病理を有する被験者に与えられる治療の効果をモニタリングするため；又は
−被験者においてヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計するため；又は
−治療効果の治療的なモニタリング及び評価のため；又は
−ヒト臨床試験を設計するため及び臨床予後を予測するため；又は
−癌の診断、及び／若しくは癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；又は
−個別化治療のための患者の選択のため；又は
−新たな将来の薬剤による薬剤再配置の確認のため；又は
−薬剤発見及び薬物動態指針のため；又は
−先行／早期癌検出のため及び臨床的再発の可能性を予測するため
にバイオマーカーとして使用することができる。
上記で記述された戦略においてバイオマーカーとして本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）及び／又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）の使用は、本発明の追加的な態様を構成する。
【００４７】
更に、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）及び／又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）を、ヒト病理の標的を発見する、スクリーニングする、探索する、同定する、評価する及び検証するために、又は癌幹細胞の自己複製能力に関連する特定の遺伝子を同定するために使用することもできる。有利には、自己複製能力の（上方又は下方）制御に関連する前記遺伝子は、癌幹細胞だけに特異的である（健康な幹細胞には特異的ではない）。すでに上記で記述された目的において本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）及び／又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）の使用は、本発明の追加的な態様を構成する。
別の態様において、本発明は、被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出する方法、又は前記ヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価する方法であって、前記被験者からの試料中でＳＣを同定することを含み、前記ＳＣが、前記ヒト病理に関連する遺伝子異常を含む方法に関する。特定の実施態様において、前記ＳＣはＣＳＣである。したがって、本発明のこの態様は、癌を診断する方法を提供する。そのような方法は、癌のために又は癌の素因に関して被験者をスクリーニングすることを含むことができ、被験者からの試料をＣＳＣの存在のために試験することを含む。この種類の方法は、ＣＳＣで発現される遺伝子の産物を発現する細胞を検出することを含むことができ、その例は、本明細書に記載されている。例えば、この方法は、（ａ）抗体のようなリガンドを、生物学的試料によって、リガンド−タンパク質複合体の形成に適切な条件下でＣＳＣマーカータンパク質と接触させること、及び（ｂ）前記複合体を検出することを含むことができる。対照レベルと異なる、細胞に対する発現レベルは、癌幹細胞の存在を示す。そのような診断方法は、比較的多数の細胞を必要とする血液試験及び放射線研究のような従来の癌診断方法よりも有利である。したがって、これらの診断試験は、現在可能なものよりもさらに早期に腫瘍の検出を可能にする。
【００４８】
発現産物は、好ましくはタンパク質であるが、代替的には、ｍＲＮＡ発現産物を検出することもできる。ｍＲＮＡ発現産物を検出する場合、それは、例えば、ｍＲＮＡとプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、組織試料をプローブと接触させること、及び複合体の形成を検出することによって検出することができる。
ｍＲＮＡ発現産物を使用する場合、それは、好ましくは、ｍＲＮＡとプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、組織試料をプローブと接触させること、及び複合体の形成を検出することによって検出することができる。好ましい方法は、形成された複合体の量を、対照組織が使用されたときに形成された量と比較することを含み、対照と試料との形成された複合体の量の差が癌の存在を示す。好ましくは、正常な組織と比較した、試験組織により形成された複合体の量の差は、増加又は減少である。より好ましくは、形成された複合体の量における２倍の差が有意であると認められる。さらにより好ましくは、形成された複合体の量における３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又はさらには１００倍の増加又は減少が、有意である。
【００４９】
この代替的な方法論において、方法は、ａ）ＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸分子とプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者からの組織試料を核酸プローブと接触させること；ｂ）基準試料をプローブとことａ）で使用した同じ条件下で接触させること：及びｃ）前記試料中にハイブリッド複合体の存在を検出することを含むことができ、基準試料中のハイブリッド複合体のレベルと異なる、患者試料中のハイブリッド複合体のレベルの検出が、疾患又は疾患に対する罹病性を示す。
この方法は、ａ）ＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸分子とプライマーとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者の組織からの核酸の試料を核酸プライマーと接触させること；ｂ）基準試料をプライマーとことａ）で使用した同じ条件下で接触させること：ｃ）試料採取した核酸を増幅すること；及びｄ）患者試料と基準試料の両方からの増幅核酸のレベルを検出することを含むことができ、基準試料中の増幅核酸のレベルと有意に異なる、患者試料中の増幅核酸のレベルの検出が、基準状態と比べた疾患又は疾患に対する罹病性を示す。
【００５０】
この方法は、ａ）疾患について試験された患者から組織試料を得ること；ｂ）組織試料からのＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸分子を単離すること；及びｃ）癌に対する改変罹病性に関連する突然変異の存在を検出することによって患者を診断することを含むことができる。この方法は、核酸分子を増幅して増幅産物を形成すること、及び増幅産物中の突然変異の存在又は不在を検出することを更に含むことができる。患者における突然変異の存在又は不在は、罹病性プロフィールと関連する突然変異に対応する任意の部分で核酸プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成するストリンジェントな条件下で、核酸分子を、核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブと接触させること、及びプローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の存在又は不在を、罹病性関連突然変異の存在又は不在を示すものとして検出することによって検出することができる。
本発明は、抗体のようなリガンドも含み、これはＣＳＣ細胞に発現するタンパク質に特異的に結合し、好ましくはその活性を阻害する。そのようなリガンドを、癌のような繁殖性疾患、又は細胞分化若しくは増殖速度の変化に関与する疾患若しくは状態の診断又は治療のための薬剤の製造に使用することができる。
【００５１】
上記の方法をインビトロ又はインビボで実施することができる。したがって、被験者からの試料中の前記ＳＣ又はＳＣＳの同定は、前記被験者においてヒト病理の診断と予後の両方であることができる。例えば、被験者からの試料中の前記ＳＣ又はＣＳＣの同定は、ヒト病理、又は前記病理のいずれかを発症する被験者の重大な危険性若しくは素因を示す。
前記ＳＣ又は前記ＣＳＣを、本明細書に記載されている、同定されるマーカー及び／又はレポーターの観点から従来の技術により同定することができる。実施態様において、前記細胞を、抗原−抗原交差反応、リガンド−レセプター相互反応、分子画像技術などにより同定することができる。上記の方法をインビトロ又はインビボで実施することができる。
特定の抗原−抗体複合体の形成を検出及び定量化するために入手可能な多種多様な免疫学的アッセイが存在し、多数の競合及び非競合タンパク質結合アッセイが以前に開示されており、これらのアッセイの多数が市販されている。
【００５２】
したがって、検出されるマーカー又はレポーターは、抗原として作用し、前記産物を抗体で定量化することができる。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、無処置分子、並びにそのフラグメントを意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖであり、これらは該当の抗原決定要因に結合する、好ましくは特異的に結合することができる。用語「特異的に結合する」は、抗体が、その標的ポリペプチドに対して、他の関連するポリペプチドに対する親和性よりも著しく大きな親和性を有することを意味する。抗体は、ＣＳＣ関連タンパク質に特異的であることができる。例えば、ＣＳＣで発現される癌関連タンパク質のグリコシル化パターンは、健康な幹細胞のような非癌性細胞に発現している同じタンパク質におけるグリコシル化パターンと異なることができる。
好ましくは、目的のＣＳＣ標的に、他の非関連タンパク質よりも著しく大きな親和性で結合される抗体が使用される。「著しく大きな親和性」とは、本発明の標的ポリペプチドへの親和性が、他の関連するポリペプチドへの親和性と比較して測定可能に増加していることを意味する。好ましくは、親和性は、標的ポリペプチドに対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍又はそれ以上である。
好ましくは、抗体は、高い親和性、好ましくは１０-4Ｍ以下、好ましくは１０-7Ｍ以下、最も好ましくは１０-9Ｍ以下の解離定数で標的と結合し、ナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭ又はさらにそれ以下）が好ましい。
【００５３】
目的の標的ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、当業者は容易に産生することができる。ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は、よく知られている（例えば、Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)を参照すること）。他の関連する文献には、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103; Waldmann, T. A. (1991) Science 252:1657-1662が挙げられる。
非ヒト可変部領域がヒト定常部領域と結合又は融合しているキメラ抗体（例えば、Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)を参照すること）を使用することもできる。
抗体を、例えばヒト化により個人において免疫原性を低くすることができる（Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); and Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)を参照すること)。本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー抗体の重及び／又は軽鎖の可変部ドメインにおけるＣＤＲアミノ酸及び選択された他のアミノ酸が、ヒト抗体の同等なアミノ酸の位置で置換されている抗体分子を意味する。したがってヒト化抗体は、ヒト抗体と酷似しているが、ドナー抗体の結合能力を有する。
【００５４】
更なる代替案において、抗体は、「二重特異性」抗体であることができ、これは、２つの異なる抗原結合ドメインを有する抗体であり、各ドメインは、異なるエピトープに対して向けられている。本発明の場合、結合特異性のうちの一方は、標的ポリペプチド又はそのフラグメントに対してであり、他方は、他の任意の抗原に対して、好ましくは、同様に癌幹細胞で発現している細胞表面タンパク質又はレセプター若しくはレセプターサブユニットに対してである。
したがって本発明で使用される抗体は、前記産物に特異的な、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの無処理又は組み換えフラグメント、「組み合わせ体（“combibodies”）」及びＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントであることができ、これらの抗体は、ヒト、ヒト化又は非ヒト由来である。これらのアッセイで使用される抗体を標識するか又はしないことができ、非標識抗体を凝集アッセイで使用することができ、標識抗体を多種多様なアッセイで使用することができる。抗体を標識するのに使用できるマーカー分子には、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）、蛍光体、化学ルミネセンス試薬、酵素基質又は補助因子、酵素阻害剤、粒子、着色剤及び誘導体が挙げられる。
【００５５】
非標識抗体（一次抗体）及び標識抗体（二次抗体）を使用する本発明に使用できる広範囲な周知のアッセイが存在し、それらのうち含まれるものは、ウエスタンブロット又はウエスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合的ＥＩＡ（競合的酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学又は免疫組織化学技術、特定の抗体を含むタンパク質のバイオチップ又はマイクロアレイの使用に基づく技術、又はディップスティックのようなフォーマットにおけるコロイド沈殿に基づくアッセイである。前記産物（マーカー又はレポーター）を検出し定量化する他の方法には、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイなどが挙げられる。
癌関連遺伝子それ自体を、ＣＳＣで発現される遺伝子をコードする核酸発現産物とプローブとの間にハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、生物学的試料を核酸プローブと接触させること、及び生物学的試料からプローブと核酸発現との間の複合体の形成を検出することによって検出することができる。
好ましい方法は、形成された複合体の量を、対照組織、例えば健康な幹細胞が使用されたときに形成された量と比較することを含み、対照と試料との形成された複合体の量の差が癌の存在又は癌の素因を示す。好ましくは、正常な組織と比較した、試験組織により形成された複合体の量の差は、増加である。より好ましくは、形成された複合体の量における２倍の増加が疾患を示す。さらにより好ましくは、形成された複合体の量における３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又はさらには１００倍の増加が、疾患を示す。
【００５６】
別の態様において、本発明は、被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定する方法、又は前記病理を有する被験者に与えられた治療の効果をモニタリングする方法であって、前記被験者からの試料中のＳＣの濃縮物を同定及び定量化し（前記ＳＣは、ヒト病理と関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む）、前記濃縮物を、対照試料と、又は前記被験者からの以前の試料と、又は治療が与えられる前に前記被験者から取られた以前の試料と比較することを含む方法に言及する。特定の実施態様において、前記ＳＣはＣＳＣである。前記ＳＣ又は前記ＣＳＣを、前に記述したように、任意の適切な従来の技術により同定及び定量化することができる。上記の方法をインビトロ又はインビボで実施することができる。この方法は、前記被験者からの試料中のＳＣの濃縮物を（前記ＳＣは、ヒト病理と関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む）、対照試料と、又は前記被験者からの以前の試料と、又は治療が与えられる前に前記被験者から取られた以前の試料と比較することを更に含む。対照試料は、ヒト病理のない被験者から得ることができる。この方法によると、被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定すること、又は前記病理を有する被験者に与えられた治療の効果をモニタリングすることが可能である。
【００５７】
本発明は、また、患者において癌の進行を評価する方法であって、第１の時点の生物学的試料中のＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物を、第２の時点の同じ発現産物の発現と比較することを含み、第１の時点に対する第２の時点での発現の増加又は発現の増加速度の増加が、癌の進行を示すことを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ヒト病理を治療する薬剤を発見、スクリーニング、探索、同定、開発及び／若しくは評価する、又は既知若しくは将来の薬剤、若しくは化合物の組み合わせを再配置する方法であって、候補化合物を、本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）と接触させ、反応をモニタリングすることを含む方法に関する。前記細胞の繁殖を破棄するか若しくは遅くする化合物、又は前記細胞を死滅させる化合物を、更なるアッセイのために選択することができる。この方法を、インビトロ又はインビボで、例えばＳＣ又はＣＳＣを免疫不全マウスなどに異種移植することによって実施できる。
具体的には、本発明は、癌性幹細胞の増殖を調節する候補作用物質を同定するアッセイであって、
ａ）候補作用物質の存在下でＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを検出すること；及び
ｂ）その発現レベルを候補作用物質の不在下での発現レベルと比較することを含み、発現の低減が、ＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを候補作用物質が調節したことを示す、
アッセイを提供する。
【００５８】
本発明は、また、ＣＳＣで発現される遺伝子の発現レベルを修飾する作用物質を同定する方法であって、
ａ）遺伝子を発現している細胞を候補作用物質と接触させること、及び
ｂ）細胞に対する候補作用物質の効果を決定することを含み、発現レベルの変化が、候補作用物質が発現を調節できることを示す、
方法を提供する。
好ましくは、作用物質は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体又は小型有機分子である。
分子又は薬理学的治療薬を開発して、ヒト病理、例えば癌のような幹細胞由来の病理を首尾良く治療及び予防することは、ヒトの治療への適用の前にあらゆる戦略の治療上の潜在能力を正確に評価することを可能にすることを記述することが重要である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ＳＣ又はＣＳＣ、例えばマウス由来の細胞の生存、分裂、若しくは繁殖を破棄する若しくは遅くするか、又は分化を誘導する化合物を提供するか、或いは前記細胞を死滅させる化合物を提供する。前記化合物は、上記の方法のいずれか１つにより同定及び評価することができ、ヒト病理の治療に潜在的に有用である。実施態様において、前記化合物は、下記：
ａ）前記ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣに存在する１つ以上のエピトープの特異的な抗体又は抗体の組み合わせ；及び
ｂ）ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣの繁殖を破棄するか若しくは遅くする、又は前記細胞を死滅させる、小型有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、三重らせん分子などが挙げられるが、これらに限定はされない、抗体、毒素、放射性原子を有する化合物又は化学療法剤のような細胞毒性剤
から選択されるか又はこれらにより形成される。
（ｂ）の細胞毒性剤の例には、ＣＳＣバイオマーカーに特異的なｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００６０】
本発明の別の態様は、ヒト病理の治療用の医薬組成物の製造における、ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣの繁殖を破棄する若しくは遅くするか、又は前記細胞を分化する若しくは死滅させる上記で記述された化合物の使用に関する。
特に、本発明は、癌幹細胞の根絶方法を提供する。そのような方法は、ｉ）外部若しくは内部抗原又はそのコード遺伝子を標的にすることによって癌細胞へ向けられた免疫療法、ｉｉ）指数関数的から非指数関数的な細胞増殖への変化を行うか又は分化若しくはアポトーシスプログラムを誘発するために癌幹細胞で切り替えを誘導することを含む。そのような方法は、これらの変化に関与する因子を標的にすることができるが、ＣＳＣにも特異的であるべきである。
したがって、本発明は、患者に、上記で記載されたタンパク質、核酸分子又はリガンドの治療有効量を投与することによって、癌疾患の治療を、そのような治療の必要な患者において行う方法を提供する。そのような化合物を、医薬組成物の形態で投与することができる。そのような組成物は、化合物を、当業者に既知の薬学的に許容される担体と一緒に含む。
したがって、本発明は、例えば上記で記載された型の化合物を使用してＣＳＣを除去することによる、患者における癌の治療に関する。そのような方法は、好ましくは多数のＣＳＣを低減する。そのような方法は、好ましくは、患者に、癌幹細胞を標的にして破壊するのに十分な治療有効量の抗体、核酸、小型分子薬剤、又はポリペプチドを投与することを含む。
【００６１】
ＣＳＣに選択的に発現し、健康な細胞に発現しない特定のバイオマーカーの本明細書における同定は、癌幹細胞区画を選択的に破壊するように向けられた治療のための標的を提供する。そのような治療は、癌幹細胞に存在するマーカーを、これらの細胞を破壊する目的で、例えば患者の現存する免疫系を利用して標的にすることができる。これは、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発して実施することができる。あるいは、これは、最終分化、アポトーシス又はプログラム細胞死を誘発して実施することができる。これは、おそらく、対称繁殖性有糸分裂プログラムから非対称繁殖性有糸分裂へ、又は最終分化／アポトーシスプログラムへの切り替えを誘発して実施することができる。腫瘍内で細胞の不死個体群を標的化することによって、これらの治療は、癌細胞の数を低減することについて従来の治療よりも成功する可能性があり、患者が再発に苦しむ可能性も少なくなる。
したがって、別の態様において、本発明は、ＳＣ又はＣＳＣ、例えばｍＳＣ又はｍＣＳＣの繁殖を破棄する若しくは遅くするか、又は前記細胞を分化若しくは死滅させる、１つ以上の前記の化合物の治療有効量を、１つ以上の賦形剤及び／又は担体物質と一緒に含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、ヒト病理を治療するのに有用な任意の他の活性成分を含有することもできる。特定の実施態様において、前記ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。
賦形剤、担体物質及び補助物質は、製剤又は調合剤の他の成分と組み合わせることができ、かつ治療される生物体に悪影響を与えないように、薬学的及び薬理学的耐性がなければならない。医薬組成物又は製剤には、経口又は非経口投与（皮下、皮内、筋肉内及び静脈内を含む）に適したものが挙げられるが、最適な投与経路は、被験者の状態によって決まる。製剤は、単一用量形態であることができる。製剤は、薬理学の分野で既知の方法に従って調製される。投与される活性物質の量は、治療の特殊性によって変わることができる。
【００６２】
本発明の別の目的は、本発明を実施するキットにある。したがって、本発明の実施態様は、ＳＣ又はＣＳＣに最終的に存在するマーカー又はレポーターに特異的な抗体と担体とを適切な包装の中に含むキットを提供し、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの無処理又は組み換えフラグメント、組み合わせ体（“combibody”）」又はＦａｂ若しくはｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、前記抗体は、ヒト、ヒト化又は非ヒト由来である。前記抗体を標識するか又はしないことができ、非標識抗体を凝集アッセイで使用することができ、標識抗体を多種多様なアッセイで使用することができる。抗体を標識するのに使用できるマーカー分子には、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）、酵素、蛍光体、化学ルミネセンス試薬、酵素基質又は補助因子、酵素阻害剤、粒子、着色剤及び誘導体が挙げられる。キットは、前記抗体の組み合わせを含むこともできる。キットは、前記抗体とマーカー又はレポーターポリペプチドとの結合反応の検出に有用な試薬を含むこともできる。
更に、本発明はＣＳＣにおける遺伝子発現にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブ、そのような遺伝子を増幅するのに有用なプライマー、場合により、疾患の診断を助けるためのプローブ及びプライマーの使用説明書を含む、癌診断に有用なキットを提供する。
【００６３】
本発明のキットは、他の使用のうちで、ＳＣ又はＣＳＣの存在を検出するため（前記細胞は、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常により作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子を含む）；又は被験者において幹細胞由来のヒト病理を発症する被験者の危険性又は素因を評価するため；又は被験者において幹細胞由来のヒト病理のステージ若しくは重篤度を決定するため；又は幹細胞由来のヒト病理を有する被験者に与えられた治療の効果をモニタリングするため（例えば、治療効果の治療モニタリング又は評価のため）；又は幹細胞由来のヒト病理に罹患する被験者に個別的な治療を設計するため；又はヒト臨床試験を設計するため；又は 癌の診断、及び／若しくは癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；又は個別化治療のための患者の選択のため；又は薬剤発見及び薬物動態指針のため；又はヒト病理の標的を発見する、スクリーニングする、探索する、同定する、評価する及び検証するため；又は癌幹細胞の自己複製能力に関連する特定の遺伝子を同定するために用いることができる。
別の態様において、本発明は、ヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計する方法であって、前記で同定された化合物を選択することを含み、前記化合物が、ＳＣ又はＣＳＣの繁殖を破棄する若しくは遅くするか又は前記細胞を死滅させ、前記化合物が、前記被験者に投与される医薬組成物に活性成分として使用されうる方法に言及する。この方法をインビトロ又はインビボの両方で実施することができる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、ヒト臨床試験を設計する方法であって、
ａ）本発明により提供されるＳＣ（例えば、ｍＳＣ）又はＣＳＣ（例えば、ｍＣＳＣ）のための標的を選択すること、又は前記細胞の分子プロファイリングをすること；
ｂ）疾患状態における前記標的又は前記分子プロフィールを検証すること；及び
ｃ）特定の治療における非反応者に対して反応者を選択すること
を含む方法に関する。
別の態様において、本発明は、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される活性化されうる遺伝子（すなわち、ヒト病理に関連する遺伝子異常よって作り出される及び／又は活性化される遺伝子）を含むＤＮＡ構築物（本明細書以降、本発明のＤＮＡ構築物）を提供する。好ましくは、遺伝子異常は、（ｉ）ＢＣＬ６遺伝子のような腫瘍遺伝子を含む核酸；（ｉｉ）キナーゼでコードされる１番目のヌクレオチド及びヒト病理に関連する遺伝子異常を含む２番目のヌクレオチド配列を含む核酸（そのような遺伝子異常の例には、ＢＣＲ−ＡＢＬp210及び本明細書上記で記載された腫瘍遺伝の他の例が挙げられる）；（ｉｉｉ）ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬp210をコードする核酸；（ｉｖ）ＬＭＯ２／ＲＨＯＭ２遺伝子配列を含む核酸から選択される。
【００６５】
上記の特定の実施態様（ｉｉｉ）において、本発明のＤＮＡ構築物は、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする１番目のヌクレオチド配列、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を含む２番目のヌクレオチド配列及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む３番目のヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記１番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記３番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合しており、前記３番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記２番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合される。
本発明のＤＮＡ構築物は、制限及び結合酵素を用いる、並びにSambrook, Fitsch and Maniatis, eds., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NYに記載されている同様の酵素を用いる従来の消化方法によって容易に得ることができる。
望ましい場合、本発明のＤＮＡ構築物を、上記で引用したSambrookらにより記載されたような従来の方法を使用して哺乳動物の胚を形質転換するため及びトランスジェニック動物を生成するために有用なベクターの産生に使用することができる。
【００６６】
あるいは、本発明のＤＮＡ構築物を、トランスジェニック動物を生成するため、ＤＮＡを精卵母細胞へマイクロインジェクションするのに有用なＤＮＡの直鎖状フラグメントを得るために使用することができる。マイクロインジェクションに有用なＤＮＡの前記直鎖状フラグメントは、活性化されうる遺伝子を含む直鎖状フラグメントを得るために、制限酵素により切断することによって得ることができる。
別の態様において、本発明は、上記に記載された実施態様のいずれか１つにおいて、本発明のＤＮＡ構築物をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。哺乳動物は、特定の実施態様において、これらの構築物の１つ以上、好ましくは２、３、４、５個又はそれ以上を含む。本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、その結果、非トランスジェニック動物と比較して、（例えば、幹細胞由来、あるいは非幹細胞由来の）癌のようなヒト病理を発症するより大きな傾向を付与する遺伝子型を有する。前記非ヒト哺乳動物は、とりわけ他の目標のうちで病理を研究するのに有用であり、前記病理を治療及び／又は予防する潜在的に有用な化合物を評価するのに有用である。好ましくは、ヒト病理は固形腫瘍である。
【００６７】
本記載で使用されるとき、表現「非ヒト哺乳動物」には、好ましくは哺乳動物の分類に属する任意の非ヒト動物、例えば齧歯類、特にマウスが挙げられる。上記及び下記に記載されているように、本発明の好ましい実施態様において、トランスジェニック非ヒト動物及び組織又はそれらから誘導される細胞は、好ましくは、マウスであるが、別の哺乳類の種、例えば別の齧歯類、例えばラット、ハムスター若しくはモルモット、又は別の種、例えばチンパンジー、サル、ブタ、ウサギ、又はイヌ科若しくはネコ科、又は有蹄類の種、例えばヒツジ、ヤギ、ウマ科、ウシ、又は非哺乳類動物の種であることができる。より好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物又は哺乳動物及び組織又は細胞は、齧歯類、より好ましくはマウスから誘導される。
トランスジェニック動物の使用が倫理的な性質の問題を提示するが、本明細書で記載されている種類の研究から人類が得られる利益は、トランスジェニック動物の創造及び試験により課される可能性のあるあらゆる苦痛を大きく越えていると考えられる。当業者には明白であるが、薬剤治療は、臨床試験をヒトにおいて開始できる前に動物試験を必要とし、現行の規制及び現在利用可能な動物モデル系では、動物試験を省くことはできない。あらゆる新たな薬剤は、生存している哺乳動物の少なくとも２つの異なる種で試験しなければならず、そのうちの一方は、大型の非齧歯類でなければならない。専門家は、体内で非常に特異的な方法で作用する、現在開発中の新たな部類の薬剤は、さらに多くに動物が将来的に使用される原因となる可能性があり、より多くの霊長類の使用をもたらす可能性があると考えている。したがって、本明細書に記載されているトランスジェニックモデルからの人類への利益は、一般にマウス又は齧歯類に限定されることは何もなく、霊長類を含む他の哺乳動物も包含する。
特定の実施態様において、本発明により提供される非ヒトトランスジェニック動物は、記載に附随している実施例で記載されているものである。
【００６８】
本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生成では、本発明のＤＮＡ構築物が、前記哺乳動物に、又は胚状態の、例えば細胞若しくはその受精卵母細胞の状態の、一般にはＧ細胞状態より後期ではない状態の先祖に導入されている。
したがって、本発明は、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製手順であって、
（ｉ）本発明のＤＮＡ構築物を非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること；
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
（ｉｉｉ）前記子孫を分析して、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常により活性化された遺伝子及び／又は作り出された遺伝子の存在を評価すること
を含む手順を提供する。
この方法は、
（ｉ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の受精卵母細胞に、Ｓｃａ１＋細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される固形腫瘍の発症に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物を導入すること；
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
（ｉｉｉ）前記子孫を分析すること
を含むことができる。
【００６９】
特定の実施態様において、ヒト病理に関連する前記遺伝子異常は、幹細胞由来のヒト病理であり、その場合、子孫は、当該の幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常により活性化された遺伝子及び／又は作り出された遺伝子の存在を評価することによって分析される。
核酸配列を、遺伝子的に活性な状態で組み込むことができるように動物の胚に導入することができる、現在の技術で考えられる異なる方法が存在し、その全てを、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生成に適用することができる。方法は、自然に起こるように、核酸の前記配列により胚に形質移入すること、及び前記配列が、結果的に前記配列の活性化をもたらす座位で染色体に組み込まれたトランスジェニック動物を選択することから構成される。別の方法は、核酸配列又はその制御配列の、胚へ導入する前の修飾を意味する。別の方法は、導入される核酸配列を含むベクターを使用した胚への形質移入から構成される。
特定の実施態様において、本発明のＤＮＡ構築物の、非ヒト哺乳動物の菌株への導入は、非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞におけるＳｃａ１+細胞で発現を指示するプロモーターに機能的に結合される活性化されうる遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントのマイクロインジェクションによって実施される。
【００７０】
受精卵母細胞を従来の方法、例えば雄との交尾に対する反応によって又は黄体化ホルモンでの処置による誘発によって雌の排卵を刺激することにより単離することができる。一般に、過剰排卵がホルモン作用により雌で誘発され、雄と交配する。適切な時間の後、雌を殺処理して受精卵母細胞を輸卵管から単離し、適切な培地に保持する。受精卵母細胞を前核の存在により顕微鏡下で認識することができる。直鎖状ＤＮＡフラグメントのマイクロインジェクションは、雄前核により有利に実施される。
本発明の動物モデルを生成する代替的な方法は、上記で記述されたＤＮＡ構築物を、例えばＥＳ細胞を介した相同組み換えにより、マウスゲノムの不活性座位内に導入することを含む。
【００７１】
受精卵母細胞に本発明のＤＮＡ構築物を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを導入した後、これらは、インビトロで適切な時間インキュベートされるか、又は偽妊娠性の乳母（雌を不妊雄と交尾させることにより得られる）に再移植される。移植は、従来の方法、例えば雌に麻酔をかけ、十分な数の胚、例えば１０〜２０個の胚を偽妊娠性の乳母の輸卵管に外科的に挿入することによって実施される。妊娠が終わると、幾つかの胚は、妊娠を終了させ、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生じ、これらは、理論的には、ゲノムに組み込まれ、かつ生物体の全ての細胞に存在している本発明のＤＮＡ構築物を有するはずである。この後代は、Ｇ０世代であり、この個体は、「初代トランスジェニック」である。個体には注入核酸が組み込まれていること及びトランスジェニックであることの確認は、後代の個体を分析することによって得られる。これを実施するために、動物材料の試料から、例えば動物の尾（例えば、マウスの場合）からの少量の試料又は血液試料から、ＤＮＡをそれぞれ個別に抽出し、従来の方法により、例えば特定の開始剤を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）により、又は例えば導入遺伝子の少なくとも一部と相補的であるプローブを使用するサザンブロット若しくはノーザンブロット分析により、そうでなければ、導入遺伝子によりコードされているタンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析により分析する。導入遺伝子の存在を評価する他の方法には、限定することなく、酵素的及び／又は免疫学的アッセイ、特定のマーカーの組織学的染色、酵素活性などのような適切な生化学的アッセイが挙げられる。
【００７２】
一般に、トランスジェニック動物において、挿入された導入遺伝子はメンデル特性として伝達され、それによってそれぞれ個別に安定した系統を確立することが困難ではない。Ｇ０個体が親株と交配（逆交配）し、導入遺伝子がメンデル特性で挙動する場合、後代の５０％が挿入された導入遺伝子の異型接合体である（半接合体）。これらの個体は、無限に維持することができるＧ１後代及びトランスジェニック系列を構成し、Ｇ１世代の異型接合体と正常な個体が交配する。あるいは、Ｇ１世代の個体はそれら自体で交配して、導入遺伝子が子孫の生存率に影響を与えないのであれば、挿入された導入遺伝子の同型接合体を２５％、異型接合体を５０％、導入遺伝子のないものを２５％産生することができる。
したがって、本発明により提供される非ヒト哺乳動物の後代、例えば本発明のより提供されるトランスジェニックマウスの後代は、トランスジェニック動物と適切な個体との交尾によって、又はトランスジェニック動物の卵及び／若しくは精子のインビトロ受精によって得ることができる。本記載で使用されるとき、用語「後代」又は「非ヒトトランスジェニック哺乳動物の後代」は、最初に形質転換された非ヒトトランスジェニック哺乳動物の前の世代の全ての子孫に関する。後代を、前記で記述された方法のいずれかにより分析して導入遺伝子の存在を検出することができる。
本発明は、また、そのゲノムに本発明のＤＮＡ構築物を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物細胞株に関する。特定の実施態様において、前記細胞株は齧歯類細胞株である。
【００７３】
本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、本発明により提供されるその後代又は細胞株は、他の用途のうち、幹細胞由来又は非幹細胞由来の新生物性又は非新生物性のヒト病理に関連する遺伝子異常を治療する及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価に有用である。したがって、本発明は、また、本発明により提供される非ヒトトランスジェニック哺乳動物、その後代又は細胞株の使用、ヒト病理に関連する遺伝子異常を治療及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価における使用に言及する。特定の実施態様において、前記ヒト病理は、幹細胞由来のヒト病理である。
トランスジェニック動物の場合では、幹細胞由来の前記ヒト病理を治療及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価は、試験される化合物を異なる用量でトランスジェニック動物に投与し、動物の生理学的反応を経時的に評価することにより実施することができる。アッセイされる化合物の投与は、評価される化合物の化学的性質に応じて経口又は非経口であることができる。幾つかの場合において、当該の化合物を、化合物の効果を増強する補助因子と併せて投与することが適切である場合がある。
本発明の細胞株の場合では、幹細胞由来の前記ヒト病理を治療及び／又は予防するのに潜在的に有用な化合物の評価は、アッセイされる化合物を、細胞培地に異なる濃度で適切な時間加え、適切な生化学的及び／又は組織学的アッセイを使用して化合物に対する細胞の反応を経時的に評価することにより実施することができる。時々、当該の化合物を、化合物の効果を増強する補助因子と併せて細胞培地に添加する必要がある場合もある。
以下の実施例は、本発明を例示し、その範囲を制限するものとして考慮されるべきではない。本発明の実施は、特に指示のない限り、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の技術を用い、それらは当業者の技能の範囲内である。
【００７４】
最も一般的な分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. or Ausubel et al., Current protocols in molecular biology (1990) John Wiley and Sonsにおいて見出すことができる。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で引用される文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００７５】
材料及び方法
トランスジェニックＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスの産生
本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生成のために、ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０のようなＤＮＡ構築物を、前記哺乳動物に、又は胚状態の、例えば細胞若しくはその受精卵母細胞の状態の、一般にはＧ細胞状態より後期ではない状態の先祖に導入した。
【００７６】
幹細胞由来のヒト病理に関連するこの染色体異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製手順は、以下である：
（ｉ）本発明のＤＮＡ構築物を非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること；
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
（ｉｉｉ）前記子孫を分析して、幹細胞由来のヒト病理に関連する染色体異常により活性化された遺伝子及び／又は作り出された遺伝子の存在を評価すること。
（ガンシクロビル（ＧＶＣ）処置）
ＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスを使用して、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＣＳＣにおけるＧＣＶ誘発細胞死の効果を試験した。予備試験の後、ＧＣＶを、腹腔内注射により１００mg/kg/日の用量で１４日間投与した。この用量は、トランスジェニックマウスにおいてＨＳＶ−ｔｋを発現する細胞を死滅させたことが報告されている（Bush TG. Cell 1998, 93: 189-201）。マウスが白血病になったときに投与を開始した。対照群には、生理食塩水の注射を与えた。
（ＲＮＡ抽出）
全ＲＮＡを、製造者のＲＮＡクリーンアッププロトコールに従い、場合によりOn-column Dnase処理を用いて、TRIzol（Life Technologies, Inc., Grand Island, NY）を使用し、続いてRneasy Mini-Kit（Qiagen Inc., Valencia, CA）による精製の２工程で単離した。ＲＮＡの完全性及び品質を、電気泳動により確認し、その濃度を測定した。
【００７７】
（標的の調製）
ｃＤＮＡプローブのＴ−７−based ＲＮＡ増幅及び調製を、以前に記載されたように実施した（Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas JD, Eberwine JH: Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:1663-1667. Eberwine J: Amplification of mRNA populations using aRNA generated from immobilized oligo(dT)-T7 primed cDNA. Biotechniques 1996, 20:584-591）。簡潔に、全ＲＮＡの最大量の５μgを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを使用するスーパースクリプトチョイスシステム（Life Technologies）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡに変換した。二本鎖ｃＤＮＡをクリーンアップし、Ｔ７のインビトロ転写を、製造者の説明書に従ってMegascriptＴ７インビトロ転写キット（Ambion, Austin, TX）を使用して実施した。
（マイクロアレイ法）
各試料から２回目に増幅された２．５μgのＲＮＡを、シアニン３結合ｄＵＴＰ（Ｃｙ３）により直接標識し、Universal Mouse Reference RNA（Stratagene）からの２回目に増幅された２．５μgのＲＮＡを、シアニン５結合ｄＵＴＰ（Ｃｙ５）により基準として標識した。全てのマイクロアレイ研究では、マウスｃＤＮＡアレイを使用した。ハイブリダイゼーションを記載されているように実施した。洗浄した後、スライドをScanarray 5000 XL（GSI Lumonics Kanata, Ontario, Canada）を使用して走査し、画像をGenePix 4.0プログラム（Axon Instruments Inc., Union City, CA）により分析した。
（データ解析）
各ハイブリダイゼーションから得られたデータを解析のためにデータベースに保存した。Ｃｙ３：Ｃｙ５比率を、アレイの全てのスポットの中央比率値に正規化した。正規化の後、両方のチャンネルの強度（中央値の合計）がローカルバックグラウンドよりも低いスポットを除いた。残りのスポットの比率を対数変換し（ベース２）、マウスチップ上の重複スポットを中央値に平均化した。癌幹細胞（ＣＳＣ）の発現プロフィールを得るために、発明者たちは、ＣＳＣと対照造血幹細胞との比率を参照した。比率の差が少なくとも２倍である場合、遺伝子を上方制御又は下方制御で選択した。クラスター分析のため、SOTAクラスタープログラム（Yuspa SH et al. Cancer Res 1980; 40:4694-703）を使用して、ツリーを、TreeViewプログラムを使用して観察した。
【００７８】
（フローサイトメトリー）
有核細胞を、抹消血細胞懸濁液から調製した。フローサイトメトリー用に細胞を更に調製するために、汚染された赤血球を、８．３％塩化アンモニウムで溶解し、次に残りの細胞を、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を有するＰＢＳで洗浄した。染色した後、全ての細胞を、２μg/mLのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する２％ＦＣＳを有するＰＢＳで１回洗浄して、死亡細胞を分析と選別の両方の手順から除外した。モノクローナル抗体を、Pharmingenから得て、含まれている、Ｂ系列染色のためにＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ１９、Ｌｙ５１、ＣＤ４３、ＩｇＭ及び／又はＩｇＤに対する抗体；Ｔ系列染色のためにＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ３に対する抗体；骨髄系のためにＣＤ１１ｂ及びＧｒ１に対する抗体、並びに日常的な技術により得られる異なる組織試料からの単一細胞懸濁液を染色する幹細胞のためのＳｃａ１を、Ｆｃレセプターを介した結合を阻止するために、精製抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６（Pharmingen）と共に、それぞれ異なる抗体の適切な希釈と共に室温又は４℃でインキュベートした。試料及びデータを、CellQuestソフトウエアを使用するFACScan装置（Becton Dickinson, FACS-sorter apparatus）で解析した。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）及びＰＥ（フィコエリトリン）の特異的な蛍光は、それぞれ４８８nm（０．４W）及び６３３nm（３０mW）で励起した。マウス細胞の既知の前方及び直交光散乱特性を、確立されたゲートを用いて使用した。それぞれの分析において、少なくとも５０００個の生存（ＰＩ-）細胞を評価した。
【００７９】
（抗癌剤による動物の処置）
抗癌剤による動物の処置を以下のように実施した。
ＢＥＦ（ブレオマイシン、エトポシド／ＶＰ１６、シス−プラチン）：ＢＥＰプロトコールによる精巣癌の治療において、ブレオマイシンを３mg/日（１〜５日）、ＶＰ１６を１００mg/m2（１〜５日）及びシス−プラチンを４０mg/m2（１〜５日）で３週間投与した。水をプラセボとして使用した。薬剤を水に溶解し、静脈内に送達した。
ＤＸＲ（ドキソルビシン）を７mg/kgで投与した。投与スキームは、毎７日目、３回−ｑ７ｄ×３−を４〜５週間であった。薬剤を水に溶解し、静脈内に送達した。水をプラセボとして使用した。
Gleevec（商標）：貯蔵溶液５mg/ml及び１０mg/mlを濾過した滅菌の水で新たに作製し、１日２回、胃管栄養法により２５０mlの容量でマウスに投与した。Gleevec（商標）レジメンは、胃管栄養法による毎朝５０mg/kg、毎晩１００mg/kgであった。Gleevec（商標）を、滅菌水の２５０マイクロリットルの容量で投与した。水をプラセボとして使用した。
ガンシクロビル：貯蔵溶液をSIGMAの指示に従って調製した。レジメンは、腹腔内注射により１００mg/kg/日を１４日間であった。プラセボは、等量の希釈水／生理食塩水であった。
メルファラン及びプレドニゾン：２週間の間、メルファラン（２．５mg/kg/日）を静脈内に送達し、プレドニゾン（１０mg/kg/日）を１日経口用量で送達した。プラセボは、等量のＰＢＳであった。
【００８０】
（リアルタイムＰＣＲ定量化）
発現レベルを定量化するために、逆転写（ＲＴ）を、５０ngのランダム六量体、３μgの全ＲＮＡ及び２００単位のSuperscript II RNase H-free（RNase H-）逆転写酵素（GIBCO BRL）を含有する２０μlの反応で、製造者のプロトコールに従って実施した。リアルタイム定量化ＰＣＲを、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の定量化のために実施した。蛍光発生ＰＣＲを、TaqMan PCR Core Reagent kit（PE Biosystems）を使用して、５０μlの反応容量で設定した。ｃＤＮＡ増幅を、PE Applied Biosystems 5700 Sequence Detectorで９６ウエル反応プレートフォーマットにより同じプライマーを使用して実施した。熱サイクルを、９５℃で１０分間の最初の変性工程により開始した。続く熱プロフィールは、９５℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間の４０サイクルであった。マルチプルネガティブウオーターブランク（multiple negative water blank）を試験し、較正曲線を各分析と並行して決定した。Ａｂｌ内因性対照（PE Biosystems）を含めて、それぞれの試料においてＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０を全ｃＤＮＡに関連づけた。
特異的なプライマー及びプローブの配列は以下である：
ＢＣＲ−ＡＢＬp210、センスプライマー５′−ＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＣＡ−３′、
アンチセンスプライマー５′−ＡＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡ−３′及び
プローブ５′−ＣＣＡＣＴＧＧＡＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣ−３′；
ｃ−Ａｂｌ、センスプライマー５′−ＣＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＡ−３′、
アンチセンスプライマー５′−ＣＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ−３′及び
プローブ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴＧ−３′。
【実施例】
【００８１】
実施例１ ガンシクロビル（ＧＣＶ）治療後の齧歯類ＣＳＣ
ＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスにおいて（材料及び方法を参照すること）、チミジンキナーゼ及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の導入遺伝子発現をＳｃａ１+Ｌｉｎ-及びＳｃａ１-Ｌｉｎ+株で研究した。結果は、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-株においてのみ両方の導入遺伝子の高い発現レベルを示した（図１を参照すること）。この発現パターンは、癌幹細胞（Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-）における選択的な導入遺伝子発現を確認した。
表１において、ＰＬｙ６−ＨＳＶｔｋ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲＡＢＬｐ２１０マウスで発症した異なる型の癌を示す。結果は、前記トランスジェニックマウスが、ＢＣＲＡＢＬｐ２１０遺伝子異常により影響を受けたヒトで観察されたものと同じ腫瘍パターンを発症したことを実証する。
【表１】
【００８２】
３０匹のマウスを対照として使用して、食塩水に毎日付し、一方、残りの６０匹には、方法のセクションで記載したように、ＧＣＶを毎日注射した。この期間の間に、癌は完全に消滅した。治療後に癌が消滅したマウスを、更に３か月観察すると、腫瘍の再発は観察されなかった（ＣＭＬ及び固形腫瘍）（図２）。
実施例２ マウスＣＳＣの遺伝子プロフィール
マイクロアレイ分析は、リンパ腫発症の前と後での癌幹細胞の異なる発現プロフィールを明らかにした。これらのデータは、３個のマーカー：Ｂｃｌ−２、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３で有意な差を示す。Ｂｃｌ−２マーカーは、対照レベルと比較して、リンパ腫の発症の後の遺伝子発現に有意な減少を表した。一方、後者の２個のマーカー、ｍｄｍ２及びＧＡＴＡ−３は、対照と比較して、リンパ腫の発症の後で増加した反応を示した（表２を参照すること）。
【表２】
【００８３】
図４は、Ｂｃｌ６マウス（Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-）からの癌幹細胞に対応する遺伝子発現パターンを示す。一方、ＢＣＬ６導入遺伝子を持つ齧歯類幹細胞は、リンパ腫ヒトＢ細胞と同様な発現プロフィール（図５）を示す（Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Levy R, Wilson W, Grever MR, Byrd JC, Botstein D, Brown PO, Staudt LM. 2000. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. Feb 3;403(6769): 503-11）。これは、Ｂｃｌ６導入遺伝子を持つ齧歯類癌幹細胞を、ヒトリンパ腫を模倣するモデルとして使用できることを示す。
実施例３ ＣＳＣ系マウス癌モデルの創造
発明者たちは、腫瘍遺伝子（ヒト遺伝子とそのマウス対応物の両方）がＳｃａ１（幹細胞抗原１）遺伝子の５′未翻訳領域（５′−ＵＴＲ）に挿入されている（図２９）多数の更なるマウス癌モデルを開発した。以下の実施例で更なる詳細が記載されるように、これらのマウスモデルを続いて使用して、ＣＳＣの特異的死滅が、癌治療の効果的な治療戦略となりうるかという疑問、並びに他の関連する疑問に対処するために使用した。
表３は、マウスモデルが得られた幾つかのヒト癌を提示する。
【表３】
【００８４】
本発明のマウスモデルの構築に使用された本発明の構築物には、図２９に示されている ＨＶＴＫ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０、又は、例えばＢＣＬ６（ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫ）若しくはｈＫＲＡＳの同等な構築物、及び表３に提示されている他の腫瘍遺伝子の構築物が含まれた。
ＨＶＴＫは、ＨＳＶ−ｔｋの代替的な略語であり、ＨＳＶは、単純ヘルペスウイルスを意味し、ｔｋ（又はＴＫ）は、チミジンキナーゼを意味する。ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位の略語である。
ＨＶＴＫ（ＴＫ）及び特定の腫瘍遺伝子、例えばＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の転写物は材料及び方法で記載された定量的リアルタイムＰＣＲにより確認された。Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞（すなわち、Ｓｃａ１を発現するが、Ｌｉｎは発現しない細胞）において、ＨＶＴＫ（ＴＫ）及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の発現は、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞よりも有意に高かった（図１、図２９）。興味深いことに、これは、疾患の発症の前と後の両方で事実であることが見出され、腫瘍遺伝子それ自体が癌の維持に関与していないことを示した（実施例１４も参照すること）。同様の観察が、例えば、ＨＶＴＫ及びＢＣＬ６転写物に関してＳｃａ１−ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫマウスで見られた。
【００８５】
実施例４ ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスは、ヒトＣＭＬの病理及び急性転化を再現する最初のマウスモデルを表す
実施例３のＣＳＣマウスモデルの１つにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子をＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲに挿入した。これらのマウスは、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０とも呼ばれる。
これらのマウスは、慢性（骨髄増殖性）期、急性転化、ＨＳＣの大きさ及びGleevec（商標）による治療に対する反応に関して、ヒトＣＭＬの症状及び病理を正確に再現した癌を発症したことが見出された。
これらのＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０転写物の割合は、ＣＭＬの前と後の両方で、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞において高く（０．２０〜０．３５％）、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞において低い（＜０．１％）ことが見出された（図６）。
【００８６】
これらのマウスからの脾臓及び肝臓の組織学的及び組織化学的分析は、骨髄化生に特徴的な巨核球を明らかにした（図７）。
これらのマウスからの末梢血試料のフローサイトメトリーによる分析（流動活性化細胞選別、ＦＡＣＳ）は、成熟骨髄細胞の蓄積を明らかにした（図７）。
ＣＳＣマウスモデルからの芽細胞を、ＤＮＡメチル化（５−メチルシチジン、５−ＭｅＣｙｄ）について分析した。５−ＭｅＣｙｄ検出によるＤＡＰＩ染色細胞の比較は、ヒトＣＭＬと同様に、悪性形質転換に特徴的であるＤＮＡメチル化がＣＳＣマウスモデルにおいて起こることを示した（図８）。
【００８７】
ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスは、ヒトにおける疾患の進行と似たように、ＣＭＬから急性転化へ自発的に進行することが見出された。フローサイトメトリー分析は、これらのＣＳＣマウスモデルにおいて芽細胞の存在と顆粒球の不在が同時にあることを実証した。そのような分析の結果は、Ｂ細胞白血病及び骨髄性白血病について図９で示されている。更に、組織化学的分析は、芽細胞による肝臓及び末梢血への浸潤を明らかにした（図９）。
肝臓及び脾臓試料を、マッソン三色プロトコールを使用して染色し、ヒトＣＭＬ／急性転化患者においても観察される肝臓及び脾臓の線維症を、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて明らかにした（図１０）。
【００８８】
実施例５ ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０ ＣＳＣマウスは、ヒトＢ−ＡＬＬの病理を再現する
ＡＣＲ−ＡＢＬｐ１９０をＣＳＣマウスモデルにおいて腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒトにおけるＢ−ＡＬＬに相当する病理を発症した。マウスの末梢血、肝臓、脾臓及び肺への広範囲なＢ細胞芽細胞の浸潤が、フローサイトメトリー及び組織化学的分析により観察された（図１１）。
実施例６ ＳＣＡ１／ＬＭＯ２−ＲＨＯＭ２ ＣＳＣマウスは、ヒトＴ−ＡＬＬの病理を再現する
ＬＭＯ２−ＲＨＯＭ２をＣＳＣマウスモデルにおいて腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒトＴ−ＡＬＬに相当する病理を発症した。組織及び末梢血でのＴ細胞白血病の発症及びそれらへの芽球播種は、ヒト病理と同一であった。図１２において、胸腺腫、肝臓、腎臓、精巣及び脾臓組織からの試料の組織化学的分析の結果、並びに末梢血及び骨髄試料のフローサイトメトリーの結果は、Ｔ−ＡＬＬのこの典型的な発症を実証することを示す。
【００８９】
実施例７ ＳＣＡ１／Ｍａｆ−Ｂ ＣＳＣマウスは、ヒト多発性骨髄腫の病理を再現する
Ｍａｆ−ＢをＣＳＣマウスモデルにおいて腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒト多発性骨髄腫に相当する病理を発症した。組織化学的分析は、脾臓及び肝臓への形質細胞の浸潤を明らかにし、腎不全の病理的徴候を有することを明らかにした（図１３）。更に、形質細胞が骨髄及び末梢血において同定された（図１４）。
実施例８ ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスは、ヒトリンパ腫の病理を再現する
ＢＣＬ６をＣＳＣマウスモデル（マウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ×ＣＢＡマウスから得た）において腫瘍遺伝子として使用したとき、マウスは、ヒトリンパ腫に相当する病理を発症した。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスは、約５〜７か月後にリンパ腫を発症した。ＢＣＬ６転写物の割合は、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞において高く（０．２〜０．３％）、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞において低かった（＜０．１％）（図１５）。
脾臓組織試料の組織化学分析は、ＣＳＣマウスモデルにおける広汎性大Ｂ細胞リンパ腫が、ヒト病理を正確に模倣することを実証した（図１６）。肺及び腎臓組織へのＰａｘ５＋及びＣＤ２１＋Ｂ細胞の浸潤も、組織化学的染色によって観察された（図１７）。Ｂ細胞（ＰＡＸ５＋、Ｂ２２０＋、ＣＤ２１＋）は、脾臓組織試料の組織化学的染色によって示されたように、このＣＳＣマウスモデルにおいてＢＣＬ６を発現しなかった（図１７）。
【００９０】
ＳＣＡ１／ＢＣＬ６（Ｂ細胞リンパ腫）マウスとＢＣＬ６−／−との交配は、後者のマウスにおいてＢｃｌ６−／−表現型の救出をもたらさなかった（図１８）。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６×ＢＣＬ６−／−の後代において、Ｂ細胞の発生は正常であった。更に、後代マウスは、胚中心を形成することができず、広範囲な炎症反応により特徴付けられた。
分子レベルでは、ＣＳＣマウスモデルのＢ細胞リンパ腫も、ヒトＢ細胞リンパ腫と非常に類似していた。ＣＤ２２＋Ｂ２２０＋細胞をフローサイトメトリーにより単離した。ＲＮＡ抽出及び増幅、並びにハイブリダイゼーションを、材料及び方法で記載したように実施した。図１９で示されているように、ヒトＤＬＢＣＬを分類するのに一般的に使用される分子予後マーカー、例えば、Ｐｄｅ４ｂ、Ｆｏｘｐ１、Ｍｄｍ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、ｐ２７−Ｃｃｎｄ３又はＥｚｈ２−Ｂｍｉ１も、ＤＬＢＣＬのＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスモデルに存在する。
しかし、特にＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスモデルのＤＬＢＣＬ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋）はＢＣＬ６を発現しないことが見出された。この観点から、前記ＣＳＣマウスモデルは、「胚中心Ｂ細胞様」（ＧＣＢ）ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＤＬＢＣＬ細胞ではなく、ヒト「活性化Ｂ細胞様」（ＡＢＣ）ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＤＬＢＣＬ細胞に似ている（図２０）。
ヒトＡＢＣ ＤＬＢＣＬの病理と同様に、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスは、形質細胞分化の阻止を示したことが更に見出された。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスからの胚中心Ｂ細胞及び形質細胞に対する、材料及び方法で記載したＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイは、Ｘｂｐ１及びｐ２７が上方制御され、Ｐａｘ５及びＢｃｌ６が下方制御されることを明らかにした（図２１）。
【００９１】
実施例９ 固形組織Ｓｃａ１＋細胞の腫瘍遺伝子活性化がマウスに固形組織癌腫をもたらす
ｌｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｈＫ−Ｒａｓv12遺伝子構築物を、図２２で示されているように、トランスジェニックマウスのＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲに挿入した。したがって腫瘍遺伝子を、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅによる感染で活性化することができた。このＣＳＣマウスモデルは、非幹細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）型の肺癌を発症し、それはＡｄｅｎｏ−Ｃｒｅ感染の３〜５か月後に観察された。
実施例１０ 造血性ＣＳＣマウスモデルは、固形腫瘍も発症する
造血性癌の多様なＣＳＣマウスモデルの評価は、これらのマウスが固形腫瘍も発症することを明らかにした。
ＣＭＬのＣＳＣマウスモデルにおいて（実施例３及び実施例４を参照すること）、合計８９匹のマウスのうち７９％がＤＭＬのみを発症した。しかし、これらのマウスの全試料において、肺腺癌（ＡＤＣ）は１２％、肝臓ＡＤＣは３％、線維性組織球腫は２％、骨肉腫は２％及びセルトリ細胞腫は２％で観察された（図２３）。
Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／ＲＨＯＭ２ Ｔ ＣＳＣマウスモデルにおいて（実施例３及び実施例６を参照すること）、合計４３匹のマウスのうち７４％（３２匹のマウス）がＴ−ＡＬＬのみを発症した。しかし、全ＳＣＡ１／ＲＨＯＭ２試料において、肺ＡＤＣは１６％（７匹のマウス）、肝癌は５％（２匹のマウス）で観察された。他の癌は、５％（２匹のマウス；図２４を参照すること）で観察された。
【００９２】
Ｂ細胞リンパ腫モデルにおいて（実施例８を参照すること）、合計３３匹のマウスの試料のうち８８％（２９匹のマウス）がＢ細胞リンパ腫のみを発症した。しかし、肺ＡＤＣは９％（３匹のマウス）で観察され、肝癌は３％（１匹のマウス；図２５を参照すること）で観察された。
Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／Ｈｏｘ１１ ＣＳＣマウスモデルにおいて（実施例３を参照すること）、合計３７匹のマウスのうち７５％がＴ−ＡＬＬのみを発症した。しかし、肺ＡＤＣはこれらの場合の１６％で観察された。肝癌及びセルトリ細胞腫は、それぞれこれらのマウスの３％で観察された。他の癌は、これらのマウスの更に３％で観察された（図２６を参照すること）。
【００９３】
実施例１１ ＳＣＡ１の再プログラムによる癌発症のモデル化
ＣｒｅリコンビナーゼをＳｃａ１遺伝子の５′−ＵＴＲに挿入して、マウスを生成した。これらのマウスを、Ｂｇａｌ活性／発現がｌｏｘＰ部位で「ｌｏｘＰが導入された（floxed）」ストップカセットにより防止されているＲＯＳＡ２６レポーター株と交配した。このように生成されたＲｏｓａ２６×Ｓｃａ１−ＣＲＥマウスの皮膚及び精巣の切片を、Ｂ−ｇａｌ染色に付した。青色に染色された領域は、幹細胞が正常に位置している領域であった（図２７及び図２８）。
実施例１２ ＣＳＣ除去が癌の有効な治療戦略であるという証拠
ＣＳＣマウス癌モデル（Ｓｃａ１−ＨＶＴＫ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０及びＳｃａ１−ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫマウス）を、Ｓｃａ１陽性細胞の選択的除去が癌の治療に有効であるかという疑問に対処するために使用した。
【００９４】
ＨＶＴＫを含むトランスジェニック構築物を伴うマウスモデルを、以下の論理的根拠：ＨＶＴＫの発現が、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルのプロドラッグ形態の、薬剤の活性なリン酸化形態への変換を誘導する、に基づいて生成した。Rubsam L.Z. et al., (1998) Cancer Res 58 3873-3882で記載されているように、リン酸化ガンシクロビルを複製細胞のＤＮＡに組み込むと、Ｇ２／Ｍチェックポイントで前記細胞の非可逆的停止を引き起こし、続いてアポトーシスを引き起こす。
このＣＳＣマウス癌モデルにおいてＨＶＴＫがＣＳＣで特異的に発現するので、ガンシクロビル治療によりこれらのマウスで特異的にＣＳＣを除去することが可能である。
これは、ＣＳＣが癌の発生及び再発の源であるという仮説を試すことを可能にし、それはこの仮説は、ＣＳＣを選択的に死滅させることにより、癌を有効的にかつ持続的な効果を持って治療することができると予測するからである。
【００９５】
マウスを、材料及び方法で記載したように、ガンシクロビル（ＧＣＶ）又はプラセボのいずれかにより治療した。各マウスモデルにおいて、６０匹のマウスにガンシクロビルを毎日注射し、３０匹のマウスは、対照として使用し、食塩水（プラセボ）を毎日注射した。
Ｓｃａ１−ＢＣＬ６−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫマウスにおいて、ガンシクロビルによる治療は、１０週間後に全ての腫瘍の排除をもたらし（図３０）、一方、プラセボ治療では、腫瘍を有するマウスの数は変化しないままであった（１００％）。腫瘍が消滅したマウスを更に１１週間モニタリングし、その間、腫瘍の再発は観察されなかった。
Ｓｃａ１−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて、同等の結果が得られた（図３１）。ガンシクロビルで治療された６０匹のＳｃａ１−ＩＲＥＳ−ＨＶＴＫ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスにおいて、腫瘍は治療の８週間後に完全に消滅し、更にモニタリングした８週間の間に再発しなかった。対照として食塩水プラセボで治療した３０匹のマウスでは、腫瘍の数の低減は観察されなかった。
この実験は、ＣＳＣの仮説を確認し、ＣＳＣの死滅が、癌治療の有効な治療戦略であり、広い潜在的な用途を持つことを初めて実証した。
【００９６】
実施例１３ 癌がＣＳＣにより維持されている証拠
癌の維持に関与する細胞個体群を同定するために、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞を、骨髄から精製し（これらの細胞は、未分化細胞、ＣＳＣに相当する）、Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋細胞を、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスの脾臓から精製した（これらの細胞は、分化腫瘍細胞に対応する）。
これらの細胞を、尾静脈注射により同系の健康なマウスに移植した。ＳＣＡ１／ＢＣＬ６表現型及び対照のそれぞれにおいて、６匹の同系の健康な動物に、１０，０００個のＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞を移植し、６匹には１，０００個のＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞を移植した。Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋細胞では、同じ数の試験動物を使用したが、１０5個及び１０6個の細胞を移植した。
Ｂ２２０＋ＣＤ２２＋細胞により再構成されたマウスは、リンパ腫を発症しなかった。しかし、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞で再構成されたマウスは、Ｂ細胞リンパ腫を発症した。疾患は、１０，０００個の細胞を受けた６匹のマウスでは移植後平均して７４（±１１）日後に発症し、１，０００個の細胞を受けた６匹のマウスでは移植後平均して８１（±９）日後に発症した。対照マウスのいずれにおいてもリンパ腫は検出されなかった。
これらの結果は、疾患がＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞（ＣＳＣ）により維持され、繁殖したことを示した。
【００９７】
実施例１４ ＢＣＲ−ＡＢＬを標的にしても癌幹細胞を死滅させない
発明者たちは、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０が腫瘍悪性のために必要とされるかを調査した。
この目的を達成するために、ＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲにおいてＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子がＬｏｘＰ部位の間に配置され、その後にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の遺伝子が続くマウス株を構築した。したがってＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子を、Ｃｒｅ仲介ＬｏｘＰ突然変異誘発により不活性化することができる。第２（下流）ＬｏｘＰ部位の下流のＧＦＰ遺伝子の位置は、ＧＦＰがＬｏｘＰ座位でのＣｒｅリコンビナーゼの作用によるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子の除去によってのみ発現するような位置である（図３２を参照すること）。
骨髄（ＢＭ）細胞を、上記で記載されたＢＣＲ−ＡＢＬ構築物を担持する８〜１０週齢の雄ドナーＣＳＣマウスモデルから単離し、図３２で概略的に表した。単離された骨髄細胞を細胞培養で繁殖させ、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルス（Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ）で感染した。ＧＦＰもこれらの細胞から精製した。
【００９８】
緑色蛍光タンパク質を発現している培養し感染した骨髄細胞（ＧＦＰ＋）を、フローサイトメトリーにより単離し（材料及び方法を参照すること）、内在性脊髄細胞を死滅させるのに十分な線量（約９６０ラド）で予め照射されている同系の健康な雌野生型マウスに移植した。
遺伝子Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ手法によりＢＲＣ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子が排除されている、移植された骨髄細胞（ＧＦＰ発現細胞）は、Gleevec（商標）が１００％の効力で作用している細胞に相当する。それにもかかわらず、レシピエントマウスは白血病を発症し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により実証されている（図３３のダイアグラム）。
ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０は癌治療にとって適切な標的ではないことが結論づけられた。これは、遺伝子の除去がＣＳＣを排除しないという事実によって説明することができる。
【００９９】
実施例１５ マウスモデル及び患者における幹細胞駆動癌は、Gleevec（商標）による治療と同様に反応する
ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０マウスからの骨髄細胞を、致死的に照射したマウスに移植した。全てのレシピエントマウスは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を発症した。
第２の研究において、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０マウスからの骨髄細胞を、致死的に照射したマウスに移植した。この場合、レシピエントマウスは、Ｂ細胞急性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）を発症した。
疾患は、骨髄とＢ細胞の両方のマーカーを共に発現する芽細胞の存在によりモニタリングした。ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０発現を、材料及び方法で記載されたリアルタイムＰＣＲによりモニタリングした。
【０１００】
Gleevec（商標）（イマチニブ、ＳＴＩ５７１とも呼ばれる）は、ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤である。ヒトにおいて、Gleevec（商標）は分化癌細胞を枯渇させ、したがって最初は症状の緩和をもたらす場合もあるが、Gleevec（商標）は、白血病幹細胞を枯渇させないことが示唆されている（Michor F et al. Nature (2005) 435, 1267-70）。ＣＳＣの仮説と一致しており、したがってGleevec（商標）により治療されている患者は典型的には再発する。
ＣＭＬを有するＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０骨髄レシピエントマウスと、Ｂ−ＡＬＬを有するＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０骨髄レシピエントマウスの両方を、Gleevec（商標）で治療した。Gleevec（商標）の貯蔵溶液を、濾過した滅菌の水で新たに調製し、材料及び方法で記載したように、１日２回、胃管栄養法によりマウスに投与した。Gleevec（商標）又はプラセボによるマウスの治療を、白血病が確認された日（０日）の後に開始した。Gleevec（商標）を、直線又は曲線の動物摂取用針により投与した。マウスの治療耐性は良好であり、治療の中断は必要なかった。マウスを１週間に３回臨床的に調べ、周期的な末梢血のカウントを、示されているように、尾静脈の採血から得た。この研究の生存分析の部分では、死亡終点は、動物の自然死により、又は疼痛又は苦痛の徴候のため、確立された基準に従った選択的殺処理により決定した。
【０１０１】
Gleevec（商標）による治療は、マウスにおいて白血病を治癒しなかった（ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＭＬモデルは図３５、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０ Ｂ−ＡＬＬモデルは図３６を参照すること）。ＣＭＬマウスでは、１４週間後には、Gleevec（商標）により治療されたマウスで生存しているものはなかった。プラセボで治療されたマウスでは、２０％が１５週間生存した（図３５）。Ｂ−ＡＬＬでは、プラセボにより治療されたマウスで１５週目まで生存したものはなく、Gleevec（商標）により治療されたマウスで１７週目まで生存したものはなかった。
いずれの研究においても、癌幹細胞がGleevec（商標）治療により影響を受けているとは認められなかった。したがって、Gleevec（商標）によるヒト治療の全体的な効力は、ＣＳＣマウスモデルに反映されている。このことは、また、Gleevec（商標）による治療後のヒト癌患者での再発は、Gleevec（商標）がマウスにおいて有効ではないという同じ理由に起因すること、すなわち、通常の癌性Ｂ細胞と異なり、ＣＳＣは、Gleevec（商標）治療よって影響を受けないことを発明者たちに示唆した。これはＣＳＣ理論と一致する。
したがって、発明者たちは、本発明のマウスモデルを使用して、Gleevec（商標）に相当するが、ＣＳＣを死滅させることに向けられている新世代の薬剤を開発できると結論づけた。
【０１０２】
実施例１６ マウスモデル及び患者における幹細胞駆動癌は、ドキソルビシンによる治療と同様に反応する
ドキソルビシンは、ヒトリンパ腫の治療における最も効果的な治療の一つである。しかし、特に広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）において、ドキソルビシン治療は、実質的に全ての患者がドキソルビシン再発により治療されているので、多くの場合に全体として成功していないと考えられる。
図３７は、ドキソルビシン治療の３〜５か月間にわたる癌幹細胞モデルマウス（Ｓｃａ１／ＢＣＬ６）におけるＣＳＣ又はＢ細胞の数を示す。Ｂ細胞の数は僅かに減少又は増加したが、ＣＳＣの数は、３か月の間に７〜８倍急激に増加した。
図３８では、ＣＳＣモデル肺癌マウスの生存を、治療期間の２０週間にわたってプロットした。プラセボで治療したマウスのうち、１８週間後に生存したものはなく、ドキソルビシンで治療したマウスのうち、２０週間を過ぎて生存したものはなかった。
したがってドキソルビシンによる治療は、ＣＳＣマウスで成功しなかった。ＣＳＣ理論と一致するので、発明者たちは、最も可能性のある説明は、これらのマウスにおいてドキソルビシンがＣＳＣを死滅させなかったことであると結論づけた。
したがって、Gleevec（商標）と同様に、ドキソルビシンについては、ヒトにおける治療の無効力がＣＳＣマウスモデルにおいて反映されている。
【０１０３】
実施例１７ マウスモデル及び患者における幹細胞駆動癌は、メルファラン−プレドニゾンによる治療と同様に反応する
メルファラン−プレドニゾンレジメンは、ヒト多発性骨髄腫の治療に一般的に成功していない。
図３９では、ＣＳＣモデル肺癌マウスの生存を、治療期間の２０週間にわたってプロットした。プラセボで治療したマウスのうち、１７週間後に生存したものはなく、メルファラン−プレドニゾンで治療したマウスのうち、２２週間を過ぎて生存したものはなかった。
したがってメルファラン−プレドニゾンによる治療は、ＣＳＣマウスで成功しなかった。ＣＳＣ理論と一致するので、発明者たちは、最も可能性のある説明は、これらのマウスにおいてメルファラン−プレドニゾンがＣＳＣを死滅させなかったことであると結論づけた。
したがって、ドキソルビシン及びGleevec（商標）と同様に、メルファラン−プレドニゾンについては、ヒトでの治療効力がＣＳＣマウスモデルにおいて反映されている。
【０１０４】
実施例１８ ＢＥＰ治療は、ＣＳＣマウスモデルとヒトの両方において成功している
ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド／ＶＰ１６、シス−プラチン）はヒト精巣癌を治癒する。この治療は毒性が高いが、癌を完全に治癒できることが知られている唯一の癌治療である。
実施例３のマウスモデルと同様に、Ｓｃａ１陽性細胞（幹細胞）をゲノム挿入及び腫瘍細胞Ｓｎａｉｌの発現により癌幹細胞に形質転換した、癌幹細胞マウスモデルを構築した。
これらのマウスが発生した腫瘍をＢＥＰにより治療することは、大きな成功を収め、図４０で示されているように、マウスの３つの異なる系列（１系列あたり１０匹の動物）において、治療は７週間後に腫瘍量をゼロに低減した。未治療動物モデルにおいて、腫瘍量は変わらないままであった。
この実験は、ＣＳＣマウスモデルが、陰性（例えば、Gleevec（商標）及びドキソルビシンそれぞれによるＣＭＬ及びＤＬＢＣＬの治療について上記で報告されている）の場合だけでなく、陽性の場合でもヒトにおける癌治療の反応を反映することを確認した。
【０１０５】
実施例１９ 正常な幹細胞に対する癌幹細胞の示差遺伝子発現分析
細胞発現ＳｃａＩを、材料及び方法で記載されたようにフローサイトメトリーにより分析及び単離した。そのように単離した幹細胞から、ＲＮＡを抽出した。増幅アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を、例えば、Van Gelder et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1663-1667の方法に基づいて、材料及び方法で示されたように、抽出ＲＮＡから調製した。
ＲＮＡによるハイブリダイゼーション実験によって、以下の観察及び結果がもたらされた。
ＣＳＣは、Ｂｍｉ１、Ｔｅｌ／Ｅｔｖ６、Ｔｅｒｔ、Ｇｆｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、β−カテニン及びＭｅｉｓ１のような遺伝子の相対的な発現レベルに関して、正常な幹細胞と著しく異なる。これらの遺伝子、並びにＢｃｌ６、ｐ３００、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ３及びＧａｔａ２は、一般にＣＳＣにおいて上方制御された。
ＣＳＣを、許容されない副作用を引き起こす除去を行うことなく、標的にし、除去することができる。
【０１０６】
異なる腫瘍からのＣＳＣにおいて、同じ遺伝子及び／又は遺伝子群が正常な幹細胞に対し上方又は下方制御される傾向があるほど、ＣＳＣは、同種細胞個体群を形成する。異なる腫瘍間の遺伝子発現の類似性によって、発明者たちは、ＣＳＣを標的にし除去する治療手法を広い範囲、すなわち異なる癌の範囲で使用できると結論づけた。
例えば、一つのマウスモデルのＣＳＣにおけるＢｃｌ６の発現は、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）をもたらす。別のマウスモデルにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣの発現は、慢性骨髄性白血病をもたらす。しかし、これらの２つのマウスモデルは、類似している遺伝子がそのＣＳＣにおいて上方制御及び下方制御されるので、ある程度類似した遺伝子発現プロフィールを示す。
【０１０７】
以下の記述は、本発明の追加的な態様に関連する。
１．ヒト病理に関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む齧歯類幹細胞。
２．前記幹細胞が癌幹細胞である、態様１に記載の幹細胞。
３．前記ヒト病理が幹細胞由来のヒト病理である、態様１に記載の幹細胞。
４．前記ヒト病理が、ヒト上皮又は間葉癌である、態様１に記載の幹細胞。
５．前記ヒト病理が、リンパ腫、白血病、肉腫及び癌腫から選択される、態様４に記載の幹細胞。
６．前記ヒト病理が、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球増殖性症候群、多発性骨髄腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、肺癌、乳癌、皮膚癌、脳癌、直腸癌、膵癌、前立腺癌、腎癌などから選択される、態様５に記載の幹細胞。
７．マーカーを更に含む、態様１に記載の幹細胞。
８．前記マーカーが、癌幹細胞の特定の単離及び／若しくは同定のために、又は癌幹細胞の獲得のために、又は健康な幹細胞から癌幹細胞を分化させるために有用なマーカーである、態様７に記載の幹細胞。
９．レポーターを更に含む、態様１に記載の幹細胞。
１０．前記レポーターが、発症、進行、播種、及び更なる生理病理学的過程の空間時間的同定のために、分子画像技術により治療の効果を評価するために、診断アッセイ、薬剤発見及び開発過程のために、標的同定のために、臨床開発の全段階での効力及び信頼性の改善のために有用であるレポーターである、態様９に記載の幹細胞。
１１．以下：
−被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出するため；又は
−被験者においてヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価するため；又は
−被験者においてヒト病理のステージ若しくは重篤度を決定するため；又は
−ヒト病理を有する被験者に与えられる治療の効果をモニタリングするため；又は
−ヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計するため；又は
−ヒト臨床試験を設計するため；又は
−癌の診断、及び／若しくは癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；又は
−個別化治療のための患者の選択のため；又は
−治療効果の治療的なモニタリング及び評価のため；又は
−薬剤発見及び薬物動態指針のため
のバイオマーカーとしての態様１〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞の使用。
１２．ヒト病理の標的を発見する、スクリーニングする、探索する、同定する、評価する及び検証するため、又は癌幹細胞の自己複製能力に関連する特定の遺伝子を同定するための、態様１〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞の使用。
１３．被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／若しくは活性化される遺伝子の存在を検出する方法、又は前記ヒト病理を発症する被験者の危険性若しくは素因を評価する方法であって、前記被験者からの試料中で幹細胞を同定することを含み、前記幹細胞が、幹細胞由来の前記ヒト病理に関連する遺伝子異常を含む方法。
１４．被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定する方法、又は前記病理を有する被験者に投与された治療の効果をモニタリングする方法であって、前記被験者からの試料中の幹細胞の濃縮物を同定及び定量化し（前記幹細胞は、ヒト病理と関連する遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含む）、前記濃縮物を、対照試料と、又は前記被験者からの以前の試料と、又は治療が与えられる前に前記被験者から取られた以前の試料と比較することを含む方法。
１５．前記幹細胞が癌幹細胞である、態様１３又は１４に記載の方法。
１６．前記ヒト病理が幹細胞由来のヒト病理である、態様１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ヒト病理を治療する薬剤をスクリーニング、探索、同定、開発及び／若しくは評価する、又は既知の薬剤若しくは化合物の組み合わせを再配置する方法であって、候補化合物を態様１３〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞と接触させ、反応をモニタリングすることを含む方法。
１８．ヒト病理に罹患しているヒトのために個別的な治療を設計する方法であって、態様１７で同定された化合物を選択することを含み、前記化合物が、前記癌幹細胞の繁殖若しくは分化をなくする若しくは遅くするか又は前記細胞を死滅させ、前記化合物が、前記被験者に投与される医薬組成物に活性成分として使用される方法。
１９．以下：
（ｉ）態様１〜１０のいずれか１つに記載の齧歯類幹細胞の標的を選択すること、又は前記齧歯類幹細胞の分子プロファイリングをすること；
（ｉｉ）疾患状態における前記標的又は前記分子プロフィールを検証すること、場合により最適化すること；及び
（ｉｉｉ）非反応者に対して反応者を選択すること
を含む、ヒト臨床試験を設計する方法。
２０．Ｓｃａ−１+細胞において遺伝子異常の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含み、前記遺伝子異常が、（ｉ）ＢＣＬ６遺伝子を含む核酸、及び（ｉｉ）キナーゼでコードされる１番目のヌクレオチド配列と、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を含む２番目のヌクレオチド配列とを含む核酸から選択されるＤＮＡ構築物。
２１．遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される前記遺伝子が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする１番目のヌクレオチド配列、ＢＣＲ−ＡＢＬp210を含む２番目のヌクレオチド配列及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む３番目のヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記１番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記３番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合しており、前記３番目のヌクレオチド配列の３′末端が前記２番目のヌクレオチド配列の５′末端と結合される、態様２０に記載のＤＮＡ構築物。
２２．Ｓｃａ−１+細胞における遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される前記遺伝子の発現を指示する前記プロモーターが、齧歯類プロモーターｐＬｙ−６Ｅ．１又はその機能的フラグメントである、態様２０又は２１のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
２３．態様２０〜２２のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
２４．前記哺乳動物が齧歯類、好ましくはマウス又はラットである、態様２３記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
２５．態様２３又は２４のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の後代。
２６．細胞株が態様２０〜２２のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物をそのゲノムに含む、態様２３又は２４のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞株。
２７．細胞株が齧歯類細胞株である、態様２６記載の細胞株。
２８．幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製方法であって、
ａ．態様２０〜２３のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物を非ヒトトランスジェニック哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること；
ｂ．前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
ｃ．前記子孫を評価して、幹細胞由来のヒト病理に関連する遺伝子異常の存在を評価すること
を含む方法。
２９．前記非ヒト哺乳動物が齧歯類、好ましくはマウス又はラットである、態様２８記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、Ｓｃａ１+Ｌｉｎ-及びＳｃａ１-Ｌｉｎ+株に発現する導入遺伝子、チミジンキナーゼ及びＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０を示す。
【図２】図２は、 ガンシクロビル治療及び食塩水治療（対照）後に腫瘍を発症したマウスの割合を示す。
【図３】図３は、（ａ）正常な脾臓、（ｂ）ＤＬＢＣＬを発症した脾臓、（ｃ）攻撃性の小さいバーキットリンパ腫を発症した脾臓、及び（ｄ）攻撃性の大きいバーキットリンパ腫を発症した脾臓の３つ代表的な画像を示す。
【図４】図４は、Ｓｃａ１+Ｂｃｌ６マウスの骨髄癌幹細胞における既知の標的遺伝子の発現データの図示である。遺伝子（右側で確認）は、それぞれ着色ボックスの単一横列で表され、マウスは、それぞれ単一縦列で表される。
【図５】図５は、Ｂｃｌ６マウスモデルにおける、ヒト広汎性大ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）で上方／下方制御されている記載された幾つかの遺伝子の発現パターンの図示である。
【図６】図６は、ＣＭＬマウスモデルの構築に使用される、ＳＣＡ１へのＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子挿入の概略図、並びにＣＭＬ前後のＳｃａ＋Ｌｉｎ−及びＳｃａ−Ｌｉｎ＋細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０転写物レベルの測定をまとめたグラフである。
【図７】図７は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスがヒトＣＭＬの病理を再現したことを示す。巨核球が脾臓及び肝臓における骨髄化生を定義し、成熟骨髄細胞が末梢血に蓄積する。
【図８】図８は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスが、悪性形質転換に関連しヒトＣＭＬにも見出されるＤＮＡメチル化を示すことを示す、染色体を染色した光学顕微鏡画像を表す。
【図９】図９は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスが、ＣＭＬから急性転化へ自発的に進行し、ヒトＣＭＬの病理を再現することを示す。フローサイトメトリーによる分析は、末梢血に芽細胞は存在するが、成熟顆粒球は存在しないことを示す。組織化学的分析は、芽細胞が肝臓と末梢血の両方に浸潤することを示す。
【図１０】図１０は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウスが、ヒトＣＭＬで見られる脾臓及び肝臓の線維症を再現することを示す（マッソン三色染色プロトコールによる肝臓及び脾臓切片の緑色染色）。
【図１１】図１１は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０ ＣＳＣマウスが、ヒトＢ−ＡＬＬの病理を再現することを示す。血液塗抹標本、脾臓、肝臓及び肺の試料のフローサイトメトリーの結果及び／又は組織化学的分析は、末梢血、脾臓、肝臓及び肺への広範囲なＢ細胞芽細胞の浸潤を示す。
【図１２】図１２は、ＳＣＡ１／ＬＭＯ２−ＲＨＯＭ２ ＣＳＣマウスが、ヒトＴ−ＡＬＬの病理を再現することを示す（脾臓、胸腺腫、肝臓、腎臓及び精巣のフローサイトメトリーデータ及び組織化学データ）。組織及び末梢血でのＴ細胞白血病の発症及びそれらへの芽球播種は、ヒト病理と同一である。
【図１３】図１３は、ＳＣＡ１／Ｍａｆ−Ｂ ＣＳＣマウスが、ヒト多発性骨髄腫の病理を再現することを示す（組織化学データ）。形質細胞が脾臓及び肝臓に浸潤し、腎不全の病理的徴候を有する。
【図１４】図１４は、ＳＣＡ１／Ｍａｆ−Ｂ ＣＳＣマウスが、ヒト多発性骨髄腫の病理を再現することを示す。フローサイトメトリー及び組織化学的分析は、ヒト多発性骨髄腫と同様に、骨髄及び末梢血における形質細胞を明らかにする。
【図１５】図１５は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスがヒトリンパ腫の病理を再現することを示す実験を要約する。ＳＣＡ１遺伝子の５′−ＵＴＲへのＢＣＬ６挿入の概略図が提供される。リンパ腫のＳＣＡ１／ＢＣＬ６マウスモデルを構築するのに使用されるＣ５７ＢＬ／６×ＣＢＡマウスが、５〜７か月後にリンパ腫を発症した。ＢＣＬ６転写物レベルの測定は、ＢＣＬ６がＳｃａ１＋Ｌｉｎ−細胞で転写されるが、Ｓｃａ１−Ｌｉｎ＋細胞では転写されないことを示す。
【図１６】図１６は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスがヒトリンパ腫の病理を再現することを示す（脾臓組織の組織化学的分析）。このＣＳＣマウスモデルの脾臓で見出される広汎性大Ｂ細胞リンパ腫（ＢＬＢＣＬ）は、ヒトで見られるＤＬＢＣＬを模倣する。
【図１７】図１７は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスがヒトリンパ腫の病理を再現することを示す。脾臓、肺及び肝臓組織の組織化学的分析は、（１）Ｐａｘ５＋及びＣＤ２１＋Ｂ細胞が肺及び肝臓組織に浸潤すること、及び（２）Ｂ細胞はＢＣＬ６で発現しないことを明らかにする。
【図１８】図１８は、ヒトＢ細胞リンパ腫と同様に、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスはＢ細胞においてＢＣＬ＆を発現しないという観察を要約する。ＢＣＬ６−／−表現型は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６×ＢＣＬ６−／−マウスにおいて救出されない。
【図１９】図１９は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスが分子レベルでもヒトリンパ腫と同様の病理を示すことを示す、ＦＡＣＳ及びハイブリダイゼーション分析の結果を要約する。単離したＣＤ２２＋Ｂ２２０＋細胞によるハイブリダイゼーション実験は、ヒトＤＢＣＬを分類するのに使用される、図で提示されているような分子予後マーカーが、ＣＳＣ癌マウスモデルに存在することを示す。
【図２０】図２０は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスが、「胚中心Ｂ細胞様」（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬではなく、ヒト「活性化Ｂ細胞様」（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬに類似しているという観察を要約する。ヒトＡＢＣ ＤＬＢＣＬにおけるＣＤ１９＋ＣＤ２２＋細胞の場合にように、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣ ＤＬＢＣＬマウスモデルにおけるＢ２２０＋ＣＤ２２＋細胞は、ＢＣＬ６を発現しない。
【図２１】図２１は、制御、遺伝子発現のレベル及び関連する細胞分化の観点から、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウスとヒト「活性化Ｂ細胞様」（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬとの類似性を更に要約する。Ｓｃａ１−Ｂｃｌ６マウスは、ヒトＡＢＣ ＤＬＢＣＬで観察されるものと同様な形質細胞分化阻止を示す。
【図２２】図２２は、肺癌モデルで使用されるｌｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｈＫ−Ｒａｓv12構築物の概略図、並びに、このモデルにおいて、固形組織Ｓｃａ１＋細胞での腫瘍遺伝子活性化が、マウスに固形組織癌をもたらすことを示す組織化学的分析を提供する。非小型細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の肺癌が、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ感染の３〜５か月後に観察された。
【図２３】図２３は、ＣＭＬのＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２４】図２４は、Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／ＲＨＯＭＢ２ ＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２５】図２５は、Ｂ細胞リンパ腫のＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２６】図２６は、Ｔ−ＡＬＬのＳＣＡ１／ＨＯＸ１１ ＣＳＣマウスモデルにおける固形腫瘍の発症を要約する。
【図２７】図２７は、Ｓｃａ１遺伝子の５′−ＵＴＲにＣｒｅリコンビナーゼを担持するマウスと、Ｂｇａｌ活性／発現がｌｏｘＰ部位で「ｌｏｘＰが導入された（floxed）」ストップカセットにより防止されているＲＯＳＡ２６レポーター株との交配の結果を示す。このように生成されたＲｏｓａ２６×Ｓｃａ１−ＣＲＥマウスの皮膚及び精巣の切片を、Ｂ−ｇａｌ染色に付した。青色に染色された領域は、幹細胞が正常に配置されている領域であった。ＲＯＳＡ２６×ＳＣＡ１／ＣＲＥ後代の皮膚試料が示されている。
【図２８】図２８は、ＲＯＳＡ２６×ＳＣＡ１／ＣＲＥ後代の精巣試料が示されている以外は、図２７と同じ実験の結果を示す。
【図２９】図２９は、ＣＭＬマウスモデルの構築に使用される、ＳＣＡ１へのＨＶＴＫ−ＩＲＥＳ−ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０遺伝子挿入の概略図、並びにＳｃａ＋Ｌｉｎ−及びＳｃａ−Ｌｉｎ＋細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０転写物レベルの測定をまとめたグラフを提供する。これは、ＣＳＣ除去が癌の有効な治療戦略であることを証明するために使用されたＣＳＣマウスモデルの一つであった。
【図３０】図３０は、ＳＣＡ１／ＢＣＬ６ ＣＳＣマウス癌モデルにおける癌を、再プログラム幹細胞（ＣＳＣ）を死滅させることによって有効に治療できることを示す。治療開始の１０週間後に検出可能な腫瘍はなく、更なる１１週間の観察の間、検出可能な腫瘍はなかった。
【図３１】図３１は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣマウス癌モデルにおける癌を、再プログラム幹細胞（ＣＳＣ）を死滅させることにより有効に治療できることを示す。治療開始の８週間後に検出可能な腫瘍はなく、更なる８週間の観察の間、検出可能な腫瘍はなかった。
【図３２】図３２は、「ｌｏｘＰが導入された（floxed）」ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０／ＧＦＰ構築物の概要を提供する。ｌｏｘＰが導入されたとは、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０が、ｌｏｘＰ座位でフランクされていることを意味する。したがって、この構築物におけるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０−又は同じ方法でｌｏｘＰが導入された他の遺伝子−を、Ｃｒｅ仲介ＬｏｘＰ突然変異誘発により不活性化することができる。ＧＦＰは、ｌｏｘＰが導入されたＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の下流及び／又はそれに隣接して配置されている。このことは、ｌｏｘＰが導入された遺伝子−この図ではＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０−がＣｒｅ仲介ＬｏｘＰ突然変異誘発により不活性化される場合、ＧＦＰの発現を可能にする。この構築物を使用して、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０が腫瘍悪性のために必要とされるかを試験した。ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０の代わりに他の腫瘍遺伝子を含む同等の構築物は、前記の他の腫瘍遺伝子が腫瘍悪性のために必要とされるかを試験することを可能にする。
【図３３】図３３は、実施例１４に記載されている、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０と腫瘍悪性との関係を試験する実験を要約する。
【図３４】図３４は、ＳＣＡ１／ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０ ＣＳＣモデルとヒトＣＭＬにおけるＣＳＣ駆動癌が、Gleevec（商標）による治療に同じように臨床反応するという観察を要約する。ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ／Gleevec（商標）は、マウスにおいてＣＳＣを死滅させない。
【図３５】図３５は、Gleevec（商標）によるＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０骨髄レシピエントマウスの治療の結果を表すグラフである。治療は、実施例１５で記載されているように効果がなかった。
【図３６】図３６は、癌幹細胞マウスモデルにおけるGleevec（商標）によるＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０白血病の治療が、成功しなかったことを示すグラフである。治療は、実施例１５で記載されているように効果がなかった。
【図３７】図３７は、ヒトと同様に、ドキソルビシンによる広汎性大Ｂ細胞リンパ腫の治療が、ＣＳＣマウスモデルにおいて効果がないことを示す（細胞カウントデータ、実施例１６を参照すること）。
【図３８】図３８は、ヒトと同様に、ドキソルビシンによる広汎性大Ｂ細胞リンパ腫の治療が、Ｓｃａ１／ｈＫＲＡＳ ＣＳＣマウスモデルにおいて効果がないことを示す（生存研究、実施例１６を参照すること）。
【図３９】図３９は、ヒトと同様に、メルファラン−プレドニゾンによる多発性骨髄腫の治療が、Ｓｃａ１／ＭＡＦ−Ｂ ＣＳＣマウスモデルにおいて効果がないことを示す（生存研究、実施例１７を参照すること）。
【図４０】図４０は、ヒト精巣癌の成功したＢＥＰ治療レジメンが、対応するＳＣＡ１／ＳＮＡＩＬ ＣＳＣマウスモデルにおいても成功することを示す。ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド／ＶＰ１６、シス−プラチン）により治療されたマウスは、７週間以内に腫瘍がなくなった（実施例１８を参照すること）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト癌に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む、動物固形腫瘍モデル。
【請求項２】
前記固形腫瘍が間葉癌又は上皮癌である、請求項１記載の動物モデル。
【請求項３】
前記固形腫瘍が肉腫、癌腫、多発性骨髄腫又はリンパ腫である、請求項２記載の動物モデル。
【請求項４】
遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される前記遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０、Ｓｌｕｇ（ＳＮＡＩ２）、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、ＴＡＬ１、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１、ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３、ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ−ＡＴＦ１、ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７、Ｋ−ＲＡＳｖ１２及びＮｏｔｃｈ１からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項５】
Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターが、幹細胞区画でのみ活性であり、細胞が幹細胞の状態を越えて分化すると不活性である、請求項１〜４のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項６】
プロモーターがｐＬｙ−６Ｅ．１プロモーター、Ｓｃａ１プロモーター、ｍｕｓａｓｈｉ−１プロモーター、ｍｕｓａｓｈｉ−２プロモーター、ｐＬｙ６Ａ遺伝子プロモーター、Ｔｍｔｓｐ遺伝子プロモーター、ｃ−ｋｉｔ遺伝子プロモーター、ＣＤ３４遺伝子プロモーター又はＴｈｙ１遺伝子プロモーターである、請求項５記載の動物モデル。
【請求項７】
遺伝子を活性化するためにリコンビナーゼが条件的に使用される条件系を使用する、請求項１〜６のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項８】
リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項７記載の動物モデル。
【請求項９】
前記活性化されうる遺伝子がＫＲＡＳｖ１２である、請求項１〜８のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１０】
動物モデルが動物が肺腺癌又は肝癌を発症するＴ−ＡＬＬモデルである、請求項１〜９のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１１】
活性化されうる遺伝子が、Ｒｈｏｍ２又はＨｏｘ１１である、請求項１０記載の動物モデル。
【請求項１２】
動物モデルが、動物が肺腺癌又は肝癌を発症するＢ細胞リンパ腫モデルである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１３】
活性化されうる遺伝子がＢＣＬ６である、請求項１２記載の動物モデル。
【請求項１４】
動物モデルが、動物が肺腺癌（ＡＤＣ）、肝腺癌（ＡＤＣ）、線維性組織球腫、骨肉腫又はセルトリ細胞腫を発症するＣＭＬモデルである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１５】
活性化されうる遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬp210である、請求項１４記載の動物モデル。
【請求項１６】
動物モデルが多発性骨髄腫モデルである、請求項１〜１５のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１７】
活性化されうる遺伝子がＭａｆ−Ｂ、ＦＧＦ−Ｒ、ｃ−ｍａｆ及びＭＭＳＥＴからなる群より選択される、請求項１６記載の動物モデル。
【請求項１８】
活性化されうる遺伝子がＭａｆ−Ｂである、請求項１６記載の動物モデル。
【請求項１９】
癌幹細胞（ＣＳＣ）の実質的に純粋な培養物。
【請求項２０】
前記ＣＳＣがＳｃａ１+Ｌｉｎ−である、請求項１９記載の培養物。
【請求項２１】
前記ＣＳＣが癌、特に固形腫瘍を繁殖及び維持する潜在能力を有する、請求項２０記載の培養物。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の動物モデルから単離される、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の培養物。
【請求項２３】
選択的濃縮により請求項１〜１８のいずれか１項記載のトランスジェニックモデルからＳｃａ１+細胞を単離することを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の幹細胞の培養物を単離する方法。
【請求項２４】
培養中の癌幹細胞を少なくとも１つの選択される分化細胞型の細胞から産生される可溶化液の濃縮物に暴露し、濃縮物が、各々の分裂癌幹細胞が２つの同一の娘癌幹細胞を産生する対称有糸分裂か、又は非対称有糸分裂のいずれかを優先的に起こすことによって癌幹細胞を繁殖させることができることを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の幹細胞の培養物を繁殖させる方法。
【請求項２５】
以下：
・癌の過程を調査及び研究するため；
・ＣＳＣ個体群を同定、分類、単離、精製又は記述するため；
・被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子の存在を検出するため；
・被験者においてヒト病理を発症する被験者の危険性又は素因を評価するため；
・被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定するため；
・被験者においてヒト病理を有する被験者に与えられる治療の効果をモニタリングするため；
・被験者においてヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計するため；
・治療効果の治療的なモニタリング及び評価のため；
・ヒト臨床試験を設計するため及び臨床予後を予測するため；
・癌の診断、及び／又は癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；
・個別化治療のための患者の選択のため；
・新たな将来の薬剤による薬剤再配置の確認のため；
・薬剤発見及び薬物動態指針のため；又は
・先行／早期癌検出のため及び臨床的再発の可能性を予測するため
のいずれか１つのための、請求項１〜１８のいずれか１項記載の動物モデルの使用及び／又は請求項１９〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣの培養物の使用。
【請求項２６】
被験者からの試料を請求項１９〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣの存在のために試験することを含む、癌のために又は癌の素因に関して被験者をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
ヒト固形腫瘍を治療する化合物を発見、スクリーニング、探索、同定、開発及び／若しくは評価する方法、又は薬剤を再配置する方法であって、候補化合物を、請求項１〜１８のいずれか１項記載の動物モデルと、又は請求項１〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣの培養物と接触させ、反応をモニタリングすることを含む方法。
【請求項２８】
ａ）候補作用物質の存在下でＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを検出すること；及び
ｂ）その発現レベルを候補作用物質の不在下での発現レベルと比較することを含み、発現の低減が、ＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを候補作用物質が調節したことを示す、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
患者において癌を治療する方法であって、請求項１９〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣを除去することを含む方法。
【請求項３０】
固形腫瘍の発症に関連する遺伝子異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製方法であって、
ａ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の受精卵母細胞に、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される固形腫瘍の発症に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物を導入すること；
ｂ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
ｃ）前記子孫を分析すること、
を含む方法。
【請求項３１】
上記の請求項１記載のＤＮＡ構築物をマウスゲノムの確定した不活性座位内に導入することを含む、動物モデルを生成する方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ構築物がＥＳ細胞を介して相同組み換えにより導入される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ構築物が、請求項５若しくは６記載のプロモーターを含む、及び／又は請求項７若しくは８記載のリコンビナーゼの使用を可能にする、請求項３１又は３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項１９〜２１記載のＣＳＣに対して免疫反応を刺激する方法であって、
ａ）ＣＳＣの濃縮物個体群を得ること；
ｂ）個体群を処理して、細胞の分裂又は複製を防止すること；
ｃ）処置済み細胞を、癌及び／又はＣＳＣに対する免疫反応を誘発するのに有効な量でヒト又は動物被験者に与えること、
を含む方法。
【請求項３５】
請求項１９〜２２記載のＣＳＣの個体群を、ＣＳＣ標的及びバイオマーカーの供給源として遺伝子及びタンパク質発現パターンについて分析する方法。
【請求項１】
Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合されるヒト癌に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む、動物固形腫瘍モデル。
【請求項２】
前記固形腫瘍が間葉癌又は上皮癌である、請求項１記載の動物モデル。
【請求項３】
前記固形腫瘍が肉腫、癌腫、多発性骨髄腫又はリンパ腫である、請求項２記載の動物モデル。
【請求項４】
遺伝子異常により作り出される及び／又は活性化される前記遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０、Ｓｌｕｇ（ＳＮＡＩ２）、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、ＴＡＬ１、Ｍａｆ−Ｂ、ＦＧＦＲ、ｃ−ｍａｆ、ＭＭＳＥＴ、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１、ＴＥＬ−ＡＢＬ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＦＵＳ−ＤＤＩＴ３、ＥＷＳ−ＷＴ１、ＥＷＳ ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ−ＡＴＦ１、ＦＵＳ−ＢＢＦ２Ｈ７、Ｋ−ＲＡＳｖ１２及びＮｏｔｃｈ１からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項５】
Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターが、幹細胞区画でのみ活性であり、細胞が幹細胞の状態を越えて分化すると不活性である、請求項１〜４のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項６】
プロモーターがｐＬｙ−６Ｅ．１プロモーター、Ｓｃａ１プロモーター、ｍｕｓａｓｈｉ−１プロモーター、ｍｕｓａｓｈｉ−２プロモーター、ｐＬｙ６Ａ遺伝子プロモーター、Ｔｍｔｓｐ遺伝子プロモーター、ｃ−ｋｉｔ遺伝子プロモーター、ＣＤ３４遺伝子プロモーター又はＴｈｙ１遺伝子プロモーターである、請求項５記載の動物モデル。
【請求項７】
遺伝子を活性化するためにリコンビナーゼが条件的に使用される条件系を使用する、請求項１〜６のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項８】
リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項７記載の動物モデル。
【請求項９】
前記活性化されうる遺伝子がＫＲＡＳｖ１２である、請求項１〜８のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１０】
動物モデルが動物が肺腺癌又は肝癌を発症するＴ−ＡＬＬモデルである、請求項１〜９のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１１】
活性化されうる遺伝子が、Ｒｈｏｍ２又はＨｏｘ１１である、請求項１０記載の動物モデル。
【請求項１２】
動物モデルが、動物が肺腺癌又は肝癌を発症するＢ細胞リンパ腫モデルである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１３】
活性化されうる遺伝子がＢＣＬ６である、請求項１２記載の動物モデル。
【請求項１４】
動物モデルが、動物が肺腺癌（ＡＤＣ）、肝腺癌（ＡＤＣ）、線維性組織球腫、骨肉腫又はセルトリ細胞腫を発症するＣＭＬモデルである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１５】
活性化されうる遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬp210である、請求項１４記載の動物モデル。
【請求項１６】
動物モデルが多発性骨髄腫モデルである、請求項１〜１５のいずれか１項記載の動物モデル。
【請求項１７】
活性化されうる遺伝子がＭａｆ−Ｂ、ＦＧＦ−Ｒ、ｃ−ｍａｆ及びＭＭＳＥＴからなる群より選択される、請求項１６記載の動物モデル。
【請求項１８】
活性化されうる遺伝子がＭａｆ−Ｂである、請求項１６記載の動物モデル。
【請求項１９】
癌幹細胞（ＣＳＣ）の実質的に純粋な培養物。
【請求項２０】
前記ＣＳＣがＳｃａ１+Ｌｉｎ−である、請求項１９記載の培養物。
【請求項２１】
前記ＣＳＣが癌、特に固形腫瘍を繁殖及び維持する潜在能力を有する、請求項２０記載の培養物。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の動物モデルから単離される、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の培養物。
【請求項２３】
選択的濃縮により請求項１〜１８のいずれか１項記載のトランスジェニックモデルからＳｃａ１+細胞を単離することを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の幹細胞の培養物を単離する方法。
【請求項２４】
培養中の癌幹細胞を少なくとも１つの選択される分化細胞型の細胞から産生される可溶化液の濃縮物に暴露し、濃縮物が、各々の分裂癌幹細胞が２つの同一の娘癌幹細胞を産生する対称有糸分裂か、又は非対称有糸分裂のいずれかを優先的に起こすことによって癌幹細胞を繁殖させることができることを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の幹細胞の培養物を繁殖させる方法。
【請求項２５】
以下：
・癌の過程を調査及び研究するため；
・ＣＳＣ個体群を同定、分類、単離、精製又は記述するため；
・被験者におけるヒト病理に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子の存在を検出するため；
・被験者においてヒト病理を発症する被験者の危険性又は素因を評価するため；
・被験者においてヒト病理のステージ又は重篤度を決定するため；
・被験者においてヒト病理を有する被験者に与えられる治療の効果をモニタリングするため；
・被験者においてヒト病理に罹患している被験者のために個別的な治療を設計するため；
・治療効果の治療的なモニタリング及び評価のため；
・ヒト臨床試験を設計するため及び臨床予後を予測するため；
・癌の診断、及び／又は癌播種のような癌進展の特別な過程及び影響の診断のため；
・個別化治療のための患者の選択のため；
・新たな将来の薬剤による薬剤再配置の確認のため；
・薬剤発見及び薬物動態指針のため；又は
・先行／早期癌検出のため及び臨床的再発の可能性を予測するため
のいずれか１つのための、請求項１〜１８のいずれか１項記載の動物モデルの使用及び／又は請求項１９〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣの培養物の使用。
【請求項２６】
被験者からの試料を請求項１９〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣの存在のために試験することを含む、癌のために又は癌の素因に関して被験者をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
ヒト固形腫瘍を治療する化合物を発見、スクリーニング、探索、同定、開発及び／若しくは評価する方法、又は薬剤を再配置する方法であって、候補化合物を、請求項１〜１８のいずれか１項記載の動物モデルと、又は請求項１〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣの培養物と接触させ、反応をモニタリングすることを含む方法。
【請求項２８】
ａ）候補作用物質の存在下でＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを検出すること；及び
ｂ）その発現レベルを候補作用物質の不在下での発現レベルと比較することを含み、発現の低減が、ＣＳＣで発現される遺伝子の発現産物の発現レベルを候補作用物質が調節したことを示す、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
患者において癌を治療する方法であって、請求項１９〜２２のいずれか１項記載のＣＳＣを除去することを含む方法。
【請求項３０】
固形腫瘍の発症に関連する遺伝子異常を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製方法であって、
ａ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の受精卵母細胞に、Ｓｃａ１+細胞において遺伝子の発現を指示するプロモーターに機能的に結合される固形腫瘍の発症に関連する遺伝子異常によって作り出される及び／又は活性化される遺伝子を含むＤＮＡ構築物を導入すること；
ｂ）前記受精卵母細胞を、偽妊娠性の乳母に移植し、子孫を産生すること；及び
ｃ）前記子孫を分析すること、
を含む方法。
【請求項３１】
上記の請求項１記載のＤＮＡ構築物をマウスゲノムの確定した不活性座位内に導入することを含む、動物モデルを生成する方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ構築物がＥＳ細胞を介して相同組み換えにより導入される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ構築物が、請求項５若しくは６記載のプロモーターを含む、及び／又は請求項７若しくは８記載のリコンビナーゼの使用を可能にする、請求項３１又は３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項１９〜２１記載のＣＳＣに対して免疫反応を刺激する方法であって、
ａ）ＣＳＣの濃縮物個体群を得ること；
ｂ）個体群を処理して、細胞の分裂又は複製を防止すること；
ｃ）処置済み細胞を、癌及び／又はＣＳＣに対する免疫反応を誘発するのに有効な量でヒト又は動物被験者に与えること、
を含む方法。
【請求項３５】
請求項１９〜２２記載のＣＳＣの個体群を、ＣＳＣ標的及びバイオマーカーの供給源として遺伝子及びタンパク質発現パターンについて分析する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【公表番号】特表２００８−５４５４０５（Ｐ２００８−５４５４０５Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１２９５１（Ｐ２００８−５１２９５１）
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００１９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３６９５１
【国際公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【出願人】（５０７３８８０５２）オンコステム ソシエダッド リミターダ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００１９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３６９５１
【国際公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【出願人】（５０７３８８０５２）オンコステム ソシエダッド リミターダ (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]