２環状シトシン誘導体含有人工二本鎖核酸
【課題】ＨＩＶなどの変異しやすく多様性の高いウイルスに対しても優れたＲＮＡ干渉効果を発揮し、またヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入効率の高い、人工二本鎖核酸の提供。
【解決手段】特定の塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列の少なくとも１５塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のアンチセンス鎖核酸と、当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のセンス鎖核酸とからなり、かつアンチセンス鎖またはセンス鎖中の少なくとも１個のシトシンを２環状シトシン誘導体に置換した人工二本鎖核酸。
【解決手段】特定の塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列の少なくとも１５塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のアンチセンス鎖核酸と、当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のセンス鎖核酸とからなり、かつアンチセンス鎖またはセンス鎖中の少なくとも１個のシトシンを２環状シトシン誘導体に置換した人工二本鎖核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレアーゼによる酵素分解に対して耐性を有する人工二本鎖核酸、及び該人工二本鎖核酸を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus：ヒト免疫不全ウイルス）は、エイズ（ＡＩＤＳ：Acquired Immunodeficiency Syndrome：後天性免疫不全症候群）の原因となるレトロウイルスである。ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞といったＣＤ４陽性細胞群を標的とし、これら免疫担当細胞を破壊し、免疫不全症を引き起こす。従って、エイズの治療又は予防のために、生体内のＨＩＶを根絶するか又はその増殖を抑制する薬剤の開発が重要である。
【０００３】
ＨＩＶは、２分子のＲＮＡ遺伝子を殻内に有し、更にその殻は外皮タンパク質で覆われている。ＲＮＡにはウイルス特有の複数の酵素（ＨＩＶプロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなど）がコードされている。ＨＩＶは宿主細胞に吸着／侵入後、脱殻を起こし、細胞質内にＲＮＡとインテグラーゼ等の複合体を放出する。該ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡが転写され、完全長の二本鎖ＤＮＡが生成する。該ＤＮＡは宿主細胞核内に移行し、インテグラーゼにより宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡは宿主細胞のポリメラーゼによってｍＲＮＡに変換され、該ｍＲＮＡからはウイルス形成に必要な種々のタンパク質が合成され、最終的にウイルス粒子が形成され、出芽・遊離する。
【０００４】
ＨＩＶのライフサイクルにおいて、ＨＩＶプロテアーゼは前駆体タンパク質（preprotein）を切断し、逆転写酵素、インテグラーゼ、構造タンパク質などを生成する役割を果たしており、ＨＩＶの感染・増殖に必須である。そのためＨＩＶプロテアーゼは抗ウイルス剤開発のターゲットとして注目されている。
【０００５】
これまでに多くのＨＩＶプロテアーゼ阻害剤が開発されており、例えば、インジナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプリナビル、ダルナビル等が既に日本において承認されている。しかしながらＨＩＶの遺伝子は変異しやすく、薬剤耐性を有する変異株が出現するため、これらの薬剤は根本的なエイズ治療薬とはなっていない。
【０００６】
ＨＩＶの増殖を抑制するための、ＨＩＶ特異的ｓｉＲＮＡについても知られている（特許文献１）。しかしながら、そのようなｓｉＲＮＡは予め設定した一定の条件に基づいて設計されており、その基準から外れる分子は自動的に除外されるため、効果的にＲＮＡ干渉を引き起こす分子全てが開示されている訳ではない。したがってｓｉＲＮＡを利用したエイズ治療薬のさらなる研究開発が引き続き重要である。
【０００７】
またｓｉＲＮＡは通常天然成分で構成されているため、細胞内、培養液中、または生体内に存在するヌクレアーゼによって速やかに分解されるという問題がある。それらのヌクレアーゼが存在する状況下でｓｉＲＮＡの有効濃度を長期的に維持することは困難である。
【０００８】
ｓｉＲＮＡの化学的な修飾は、天然型のｓｉＲＮＡにはない機能を持たせる有効な手法であり、ｓｉＲＮＡの安定性の向上などのための手段として検討されている。例えば、ヌクレアーゼ耐性、細胞導入率、ＲＮＡ干渉効果を高めたｓｉＲＮＡとして、センス鎖に芳香族化合物を結合させたｓｉＲＮＡや、アンチセンス鎖の５’末端部分のヌクレオチドの２’位を様々な官能基で修飾したｓｉＲＮＡが知られている（特許文献２及び３）。またホスホロチオエートなどの修飾オリゴヌクレオチドに関する特許が、米国Alnylam社やIsis Pharmaceuticals社によって多数取得されている。これらの化学修飾は、ＲＮＡ分子のリン酸ジエステルとリボース部分を構造変換したもの、あるいはＲＮＡ鎖の末端に化学物質を結合させたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−３０６９６２号
【特許文献２】特開２００９−１０６１６５号
【特許文献３】国際公開第２００４／０９０１０５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＨＩＶなどの変異しやすく多様性の高いウイルスに対しても優れたＲＮＡ干渉効果を発揮し、またヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入効率の高い、人工二本鎖核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、天然型二本鎖核酸中のシトシンを２環状シトシンに置換した人工二本鎖核酸が、高いヌクレアーゼ耐性及び細胞導入効率を示すことを見出した。さらにＨＩＶプロテアーゼをコードするＲＮＡ配列（特にＨＩＶ変異株間で高度に保存された塩基配列）を標的とする天然型二本鎖核酸中のシトシンを２環状シトシンに置換した人工二本鎖核酸が、ＨＩＶプロテアーゼに対して優れたＲＮＡ干渉効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下に示す通りである。
【００１２】
［１］配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列の少なくとも１５塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のアンチセンス鎖核酸と、当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のセンス鎖核酸とからなり、アンチセンス鎖またはセンス鎖中の少なくとも１個のシトシンを２環状シトシン誘導体に置換した人工二本鎖核酸。
［２］標的塩基配列が、ＧＡＡ ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ ＡＣＡ（配列番号１）で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号１で表される塩基配列の１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列であり、当該センス鎖核酸が連続する９塩基ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ（ただしＮはシトシンまたは２環状シトシン誘導体であってもよい）を含む少なくとも１５塩基の連続する標的塩基配列を含む、［１］に記載の人工二本鎖核酸。
［３］二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである、［１］または［２］に記載の人工二本鎖核酸。
［４］標的塩基配列が下記のいずれかで表される塩基配列又は下記のいずれかで表される塩基配列において塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列の１〜数個の塩基に置換、欠失もしくは付加が導入された塩基配列である、［１］〜［３］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸：
ＡＧＣ ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ Ａ（配列番号２）；
ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号３）；
ＣＵＣ ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ Ｃ（配列番号４）；
ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ Ａ（配列番号５）；
ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ Ｇ（配列番号６）；
ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ（配列番号７）；
ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｕ（配列番号８）；
ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ Ｇ（配列番号９）；
ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＵＧ Ａ（配列番号１０）；
ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＵＧＡ Ｕ（配列番号１１）；及び
ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ Ａ（配列番号１２）。
［５］下記のいずれかから選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸：
（ａ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｂ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｃ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において１〜４塩基削除された塩基配列（ただし塩基配列ＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を含む）からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｄ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、配列番号２４〜３４から選ばれる塩基配列からなるセンス鎖核酸（ここで、センス鎖の配列番号ｎ（ｎは１３〜２３である）に対してアンチセンス鎖の配列番号はｎ＋１１である）とからなる二本鎖核酸；
（ｅ）（ｄ）の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、塩基配列ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ及びＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を除く塩基配列において１〜数塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖核酸；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸および／またはセンス鎖核酸の３’末端または５’末端にヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを１〜４個付加した二本鎖核酸。
［６］２環状シトシン誘導体が下記式（Ｉ）で表される、［１］〜［５］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸：
【００１３】
【化１】
【００１４】
。
［７］２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドの糖部分がデオキシリボースまたはリボースである、［１］〜［６］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸。
［８］ウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸。
［９］ウイルス由来タンパク質がヒト免疫不全ウイルス由来プロテアーゼである、［８］に記載の人工二本鎖核酸。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物。
［１１］ウイルス増殖の抑制用である、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、［１１］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の人工二本鎖核酸に含まれる２環状シトシン誘導体は、該人工二本鎖核酸の塩基対形成能を向上させると共に、ヌクレアーゼによる酵素分解に対する耐性を付与する。そのためウイルス由来タンパク質をコードする標的遺伝子に対して効果的にＲＮＡ干渉を引き起こすことができ、該ウイルスの増殖を抑制しうる。また本発明の医薬組成物は、従来のｓｉＲＮＡよりも高い安定性を有するため、用量および／または投与回数の低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、人工ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害効果を示す。ＨＩＶ−ＰＲを発現するプラスミド及びＧＦＰを発現するプラスミド、ならびにｓｉＲＮＡを、HeLa細胞に導入した（上パネル）。トランスフェクトした各細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ活性を測定し、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしていない細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ発現を１００として、ＨＩＶ−ＰＲの発現（％）を算出した。
【図２】図２は、ＲＮＡ分解酵素に対する本発明の人工ｓｉＲＮＡの安定性を示す。天然型ｓｉＲＮＡ（菱形）、3'-biC（四角）及び5'-biC（三角）の存在量を経時的に測定し、反応開始時の存在量を１００として、残存率（％）を算出した。各試料について３連で実験を行ない、結果を平均値±標準偏差で表した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
二本鎖核酸とは、センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズした二本鎖領域を有する核酸分子であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子であり得る。
【００１８】
ＲＮＡは、それぞれがリン酸基及び窒素を含む塩基（典型的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ））に結合した糖リボースを含むリボヌクレオチドのポリマーである。ＤＮＡは、それぞれがリン酸基及び窒素を含む塩基（典型的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ））に結合した糖デオキシリボースを含むデオキシリボヌクレオチドのポリマーである。ＲＮＡ中のＵは、ＤＮＡにおいてはＴに一義的に読み替えることができる。ＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子とは、ＲＮＡ分子中の一部のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである分子、又はＤＮＡ分子中の一部のデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドである分子をいう。これらの核酸分子の配列は、特に明記されない限り、５’末端から３’末端の方向に左から右へ、核酸分子上の塩基の配列として表される。
【００１９】
ＲＮＡは、ＤＮＡと同様に、相補水素結合を形成することができる。それゆえＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖オーバーハングを有する二本鎖でありうる。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個のヌクレオチドの付加により形成されるものであり、他方の鎖と塩基対を形成しない領域である。
【００２０】
またＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み、それぞれが細胞内で特定の役割を果たしている。本明細書に用いられる場合、用語「ＲＮＡ」は、これらのすべてを含む。
【００２１】
ｓｉＲＮＡは、タンパク質発現に特異的に干渉するそれらの能力に因んで名付けられた約１０塩基長から約３０塩基長までの二本鎖ＲＮＡ分子を指す。
【００２２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性核酸により仲介される、遺伝子発現（タンパク質合成）の配列特異的又は遺伝子特異的抑制を指す。特定の理論又は作用様式に限定されないが、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RISC）によりｍＲＮＡを分解すること、および転写されたｍＲＮＡの翻訳を阻害することを含みうる。また遺伝子の転写を抑制するゲノムＤＮＡのメチル化も含み得る。ＲＮＡｉにより引き起こされる遺伝子発現の抑制は、一過性であっても、長期間持続してもよい。
【００２３】
ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。
【００２４】
人工二本鎖核酸とは、センス鎖またはアンチセンス鎖中に少なくとも１つの人工的な修飾を有する二本鎖核酸をいう。人工的な修飾の例としては、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型ＤＮＡ／ＲＮＡなどのリン酸骨格を修飾したもの；２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡ、２’−Ｆ修飾ＲＮＡなどの２’修飾ヌクレオチド；ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）などのヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルフォリノヌクレオチドなどの基本骨格が異なる修飾ヌクレオチド；５−フルオロウリジン、５−プロピルウリジン、２環状シトシン誘導体（後述）などの塩基修飾型ヌクレオチド等が挙げられる。
【００２５】
２環状シトシン誘導体含有人工二本鎖核酸
本発明の人工二本鎖核酸は、ウイルス由来タンパク質をコードする遺伝子中に存在する塩基配列を標的とする。
【００２６】
ウイルス由来のタンパク質は、任意のウイルスの感染または増殖に必要なウイルス由来のタンパク質であってよい。ウイルスとしては、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１））などのＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスが挙げられる。ウイルス由来のタンパク質は、好ましくはＨＩＶ由来のタンパク質であり、より好ましくはＨＩＶ由来のプロテアーゼ（ＨＩＶ−ＰＲ）である。
【００２７】
現在までにＨＩＶの２つの異なるファミリー、すなわち、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が明らかにされている。したがって本明細書中で用いられる場合、ＨＩＶ−ＰＲには、ＨＩＶ−１由来のプロテアーゼ及びＨＩＶ−２由来のプロテアーゼの両方が含まれる。
【００２８】
標的塩基配列は、配列番号４１又は４２で表される塩基配列からなる標的塩基配列であり得る。配列番号４１で表される塩基配列は、ＨＩＶ−１由来のプロテアーゼをコードする遺伝子（ＨＩＶ−１ゲノム（アクセッション番号：Ｍ１９９２１（2010年5月24日更新））の２２５３位〜２５４９位）の配列である。配列番号４２で表される塩基配列は、ＨＩＶ−２由来のプロテアーゼをコードする遺伝子（ヒトに感染したＨＩＶ−２のｐｏｌタンパク質をコードする遺伝子（アクセッション番号：ＧＵ０１２５０５）の塩基配列（ただし該遺伝子中のＴは、ＲＮＡにおいてはＵに一義的に読み替えられている）の１位〜２９７位）の配列である。
【００２９】
また標的塩基配列は、配列番号４１又は４２で表される塩基配列において１〜数個（具体的には１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個）の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列であり得る。このような塩基配列としては、様々なＨＩＶ−１変異株由来のプロテアーゼやＨＩＶ−２変異株由来のプロテアーゼをコードする遺伝子の配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
標的塩基配列は、好ましくは、ＧＡＡ ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ ＡＣＡ（配列番号１）で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号１で表される塩基配列の１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列である。
【００３１】
配列番号１で表される配列は、配列番号４１で表される配列の部分配列であり、当該配列の５’末端から６１位〜９３位（ＨＩＶ−１ゲノムの２３１３位〜２３４５位）に位置する。また配列番号１で表される配列は、配列番号４２で表される配列の部分配列であり、当該配列の５’末端から６１位〜９３位に位置する。配列番号１で表される配列の５’末端から１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）は、少なくとも９種のＨＩＶ−１の変異株の間で完全に保存されている（D.S. Dauber et al. Journal of Virology, 2002, 76 (3), 1359-1368）。このことはこの保存領域がＨＩＶ−ＰＲの機能または発現に重要であることを示唆する。そのため、この保存された配列を含む塩基配列を標的とすることで、ＲＮＡ干渉に対する耐性株の発生を特に効果的に抑えることが可能である。一方、配列番号１で表される配列の５'末端から１位〜１２位の塩基配列および２２位〜３３位の塩基については、各ＨＩＶ−１変異株又はＨＩＶ−２変異株の配列に合せて、１〜数個（具体的には１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）の塩基が置換、欠失もしくは付加されうる。例えば、配列番号１で表される配列の５'末端から２８位のグアニンはアデニンに置換されうる。以上のような標的塩基配列は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２以外の他のウイルス由来タンパク質をコードする遺伝子にも存在していてもよい。
【００３２】
より好ましくは、本発明の人工二本鎖核酸の標的塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の部分配列であって、下記のいずれかで表される配列または下記のいずれかで表される塩基配列において塩基配列ＧＡＵＡＣＡＧＧＡを除く塩基配列の１〜数個（具体的には１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）の塩基に置換、欠失もしくは付加が導入された塩基配列である（下線は標的塩基配列中の保存領域を示す）：
ＡＧＣ ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ Ａ（配列番号２）；
ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号３）；
ＣＵＣ ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ Ｃ（配列番号４）；
ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ Ａ（配列番号５）；
ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ Ｇ（配列番号６）；
ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ（配列番号７）；
ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｕ（配列番号８）；
ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ Ｇ（配列番号９）；
ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＵＧ Ａ（配列番号１０）；
ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＵＧＡ Ｕ（配列番号１１）；及び
ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ Ａ（配列番号１２）。
【００３３】
本発明の人工二本鎖核酸に含まれる２環状シトシン誘導体は、本発明者らによって修飾塩基として新たに開発されたものであり、シトシンと同様にグアニンと塩基対を形成し、且つ７，８−ジヒドロピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オン構造を含む修飾塩基である。２環状シトシン誘導体は、具体的には下記式（Ｉ）の構造を有する。
【００３４】
【化２】
【００３５】
２環状シトシン誘導体は、シトシンと同様に、３つの水素結合によりグアニンとの間で塩基対を形成することができる。いかなる理論にも拘束されないが、２環状シトシン誘導体は、シトシンと比較して、二重結合がさらに導入されたことで隣接する核酸塩基との追加のスタッキング相互作用を有し、炭化水素が追加されたことで疎水性相互作用が増加し、環化したことで強固な塩基対合のための固定された構造を有している。そのため２環状シトシン誘導体とグアニンの塩基対は、シトシンとグアニンの塩基対よりも安定であり得、安定な二本鎖核酸の形成に寄与しうる。
【００３６】
２環状シトシン誘導体（式（Ｉ）の塩基など）を含むリボヌクレオチドは、例えば、５−ヨードウリジンを出発材料として下記実施例１に記載の手順1)→2)→3)→4)→5)→6)→7)→8)で合成することができる。また、最終産物の収率は低下するものの、より簡単な経路として、実施例１に記載の手順を変更した下記手順1)→2)→6)→4)→7)→8)で合成することもできる。
【００３７】
【化３】
【００３８】
また２環状シトシン誘導体（式（Ｉ）の塩基など）を含むデオキシリボヌクレオチドは、例えば、５−ヨード２’−デオキシウリジンを出発材料として下記実施例１に記載の手順から２’水酸基への保護基の導入工程を除いた手順1)→2)→6)→7)→8)で合成することができる。２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドは、これら以外の手順で合成してもよい。
【００３９】
２環状シトシン誘導体を含む人工二本鎖核酸は、２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドと天然型のヌクレオチドを用いて、公知の化学合成を用いる方法（例えば市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いたホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法など）により合成することができる。
【００４０】
２環状シトシン誘導体は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方にのみ含まれていてもよく、両方に含まれていてもよい。２環状シトシン誘導体が含まれる位置も特に限定されない。
【００４１】
人工二本鎖核酸中に含まれる２環状シトシン誘導体の総数は、１個以上であれば特に限定されず、センス鎖またはアンチセンス鎖中のグアニンと相補的な塩基（即ちシトシン）の全てが２環状シトシン誘導体であってもよい。好ましくは、人工二本鎖核酸中に含まれる２環状シトシン誘導体の総数は１〜１６個である。
【００４２】
２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドの糖部分は、リボースであってもデオキシリボースであってもよい。オリゴヌクレオチド合成の原料として取り扱いの容易さの観点から、該糖部分は好ましくはデオキシリボースである。
【００４３】
本発明の人工二本鎖核酸は、少なくとも１つの２環状シトシン誘導体を含むが、他の修飾も含みうる。他の修飾としては、例えば上記人工二本鎖核酸の定義に記載した修飾が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４４】
本発明の人工二本鎖核酸をウイルスが原因の疾患の予防または治療剤に用いる場合、該人工二本鎖核酸は、該ウイルス受容体と結合するリガンドとコンジュゲートしていてもよい。このようなリガンドとのコンジュゲートは、患者の生体内の器官、組織または細胞に存在する標的ウイルスへの該人工二本鎖核酸の送達を効率よく行なうために有用でありうる。例えばＨＩＶ−１が標的ウイルスである場合、人工二本鎖核酸の３’末端または５’末端に、Ｔ細胞上のＣＤ４表面タンパク質に結合することができるＨＩＶ−１表面抗原を付着させることにより、標的ウイルスへの高効率の送達を行ないうる（Kilby JM and Eron JJ, New England J. of Medicine, 348(22):2228-2238 (2003)）。
【００４５】
本発明の人工二本鎖核酸は、前記標的塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる（ただしシトシンは２環状シトシン誘導体であってもよい）。本明細書において「相補的な」とは、二本鎖の二重鎖形成部の塩基対の総数に対する塩基間のＡ：Ｕ又はＴ、Ｇ：Ｃ又は２環状シトシン誘導体の塩基対合の割合が高いことを意味し、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４６】
本発明の人工二本鎖核酸は、標的塩基配列と相互作用するように、即ち標的塩基配列に結合するのに十分な相補性を有するように、当業者に公知の方法により設計されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどについての様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、前記標的塩基配列から適切な二本鎖核酸の塩基配列を選択することができる。
【００４７】
前記センス鎖核酸の長さは、連続する９塩基ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ（ただしＮはシトシンまたは２環状シトシン誘導体であってもよい）を含む少なくとも１５塩基長であれば特に限定されず、例えば１５〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１７〜２３塩基長、１９〜２１塩基長である。したがって前記センス鎖核酸の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基長であり得る。
【００４８】
本明細書中、二本鎖核酸の長さは、オーバーハング（overhang）を含まない二本鎖領域の長さで表す。よって、二本鎖核酸がｓｉＲＮＡの場合、二本鎖核酸の長さは、二本鎖核酸の二重鎖形成部の塩基対数を表す。例えば、１９塩基長の二本鎖核酸は、１９個の連続した塩基対を形成して共にアニールする２つの逆向きのＲＮＡ鎖を含み、各鎖は３’末端又は５’末端（好ましくは３’末端）にオーバーハングを有していてもよい。
【００４９】
オーバーハングの長さは変わりうるが、好ましくは、１〜数塩基長（例、１、２、３または４塩基長）であり、より好ましくは２塩基長である。またオーバーハングに含まれるヌクレオチドは特に限定されず、標的塩基配列（センス鎖の場合）又はそれに相補的な配列（アンチセンス鎖の場合）を形成してもよいが、そのような配列でなくてもよい。オーバーハングに含まれるヌクレオチドは修飾ヌクレオチド（例えば上記人工二本鎖核酸の定義に記載した修飾ヌクレオチド）であってもよい。一具体例として、オーバーハングは、ＴＴの塩基配列からなるジヌクレオチドである。
【００５０】
本発明の人工二本鎖核酸における二本鎖構造は、連結されていないセンス鎖とアンチセンス鎖で構成されていてもよいし（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられてもよい（ｓｈＲＮＡなど）。したがって本発明の人工二本鎖核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどが挙げられるが、転写抑制活性が強いことから、好ましくはｓｉＲＮＡである。
【００５１】
一実施形態において、本発明の人工二本鎖核酸は、下記のいずれかから選択されるアンチセンス鎖とセンス鎖とからなる二本鎖核酸である：
（ａ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｂ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｃ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において１〜４塩基削除された塩基配列（ただし塩基配列ＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を含む）からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；ならびに
（ｄ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、配列番号２４〜３４から選ばれる塩基配列からなるセンス鎖核酸（ここで、アンチセンス鎖の配列番号ｎ（ｎは１３〜２３である）に対してセンス鎖の配列番号はｎ＋１１である）とからなる二本鎖核酸。
【００５２】
【表１】
【００５３】
別の実施形態において、本発明の人工二本鎖核酸は、以下の二本鎖核酸でありうる：
（ｅ）前記（ｄ）の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、塩基配列ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ及びＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を除く塩基配列において１〜数塩基（例えば１〜４個、１〜３個、１又は２個）が置換、欠失もしくは付加され、かつウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖核酸。
【００５４】
ウイルス由来タンパク質の発現抑制活性の有無は種々の公知の試験方法（例、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＲＴＰＣＲ、発現プロファイリングなど）により評価することができる。該発現抑制活性の有無は、例えば、標的塩基配列を含むｍＲＮＡの切断の検出や、該ウイルス由来タンパク質が酵素である場合にはその酵素活性測定などによっても評価することができる。これらの試験は、インビトロまたはインビボの当該分野において公知の実験系を用いて行なうことができる。
【００５５】
さらに別の実施形態において、本発明の人工二本鎖核酸は、オーバーハングを有していてもよく、この場合以下の二本鎖核酸である：
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸および／またはセンス鎖核酸の３’末端または５’末端にヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを１〜４個（例、１、２、３または４個）付加した二本鎖核酸。
好適なヌクレオチドの付加としては、ＴＴの塩基配列からなるジヌクレオチドの付加が挙げられる。
【００５６】
本発明の人工二本鎖核酸は、標的塩基配列を有する遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有し、その結果該遺伝子又は該遺伝子産物の発現を抑制しうる。本発明の人工二本鎖核酸は、好ましくはウイルス由来タンパク質（好ましくはヒト免疫不全ウイルス由来プロテアーゼ（ＨＩＶプロテアーゼ））の発現抑制活性を有する。発現抑制活性の有無は、種々の公知の試験方法（例、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＲＴＰＣＲ、発現プロファイリングなど）により評価することができる。該発現抑制活性の有無は、例えば、標的塩基配列を含むｍＲＮＡの切断の検出や、該ウイルス由来タンパク質が酵素である場合にはその酵素活性測定などによっても評価することができる。これらの試験は、インビトロまたはインビボの当該分野において公知の実験系を用いて行なうことができる。
【００５７】
本発明の人工二本鎖核酸は、標的塩基配列を有する遺伝子又はその遺伝子産物の発現を抑制しうるため、該遺伝子の機能の解析に有用である。また本発明の人工二本鎖核酸により発現が抑制されるウイルス由来タンパク質がウイルスの増殖に重要な役割を果たしている場合（例えば、ウイルス由来タンパク質がＨＩＶプロテアーゼである場合）、その発現抑制活性を有する本発明の人工二本鎖核酸は、ウイルスの増殖を抑制しうるため、ウイルスが原因の疾患の予防または治療剤の製造に有用である。
【００５８】
本発明の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物
さらに本発明は、上記本発明の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ウイルス由来タンパク質の発現を抑制しうるため、好ましくはウイルス増殖の抑制用の医薬組成物である。より好ましくは、本発明の医薬組成物はヒト免疫不全ウイルス増殖の抑制用である。
【００５９】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分の種類もしくは活性、投与対象となる動物種、投与対象の病気の重篤度、薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇが例示され、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１回〜数回投与することもでき、１日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。
【００６０】
本発明の医薬組成物の投与対象としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、本発明の人工二本鎖核酸のみを含有するものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与される。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、患者に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与形態としては、経口投与、または気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。また医薬組成物は、必要に応じて、薬理学的に許容される添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、坐剤、噴霧剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などが挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。本発明の医薬組成物は、ウイルス増殖の抑制効果を奏する限りその投与経路および剤形は特に限定されない。
【００６３】
例えば、本発明の治療剤を注射剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
【００６４】
本発明の医薬組成物に含まれる二本鎖核酸と担体との配合比は、二本鎖核酸１重量部に対して担体１〜２００重量部が適当である。好ましくは、二本鎖核酸１重量部に対して担体２．５〜１００重量部、さらに好ましくは担体１０〜２０重量部である。
【００６５】
また本発明の医薬組成物は、リポソームの形態として製剤化することもできる。リポソームの形態にすることで、負に苛電した核酸分子を、負に荷電している細胞に高い親和力で取り込ませることができる。リポソームの調製は、一般的にはリン脂質または他の脂質を用いて、当該分野において公知の方法により行なうことができる。例えば、リポソームの調製は、LipofectinやLipofectamin（いずれもLife Technologies、California、USA）などの市販の試薬を用いて行なうことができる。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００６７】
（ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いた人工オリゴヌクレオチドの合成）
人工オリゴヌクレオチドの合成は、Applied Biosystems社の394 DNA/RNA Synthesizerを使用して、公知のホスホロアミダイト法に従い行った。天然核酸のホスホロアミダイト体は、情報に従い0.1 Mのアセトニトリル溶液として用いた。一方、２環状デオキシシチジンのホスホロアミダイト体は、0.15 Mのアセトニトリル溶液に調製して用いた。
【００６８】
（ｓｉＲＮＡの調製）
互いに相補的なオリゴヌクレオチドを等濃度になるよう混和し、95℃で2分間加温した後、1℃/2.5分の温度勾配でアニーリングを行った。二本鎖ｓｉＲＮＡの生成は、20%未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認した。
【００６９】
（HeLa細胞の培養）
半径6 cmのシャーレにて、3x105個のHeLa細胞を、10%牛胎仔血清（FBS）、300 Uペニシリン及び300μgストレプトマイシンを含むMinimum essential medium（MEM）中で、5% CO2雰囲気下37℃で2日間培養した。細胞培養液を除去した後、10% FBSを含むペニシリン・ストレプトマイシン無添加のMEMを添加し、5% CO2雰囲気下37℃で更に1日間培養した。
【００７０】
（プラスミドの作製）
ＨＩＶ−１由来のプロテアーゼ（ＨＩＶ−ＰＲ；以下、実施例においてはＨＩＶ−ＰＲとしてＨＩＶ−１由来のプロテアーゼを用いた）をコードする遺伝子を染色体に挿入したヒト胎児腎細胞株であるE-PR293（T. Fuse et al. Microbes Infect, 2006, 8, 1783-1789）のゲノムを鋳型として、５’-CAACAAGGACCAGCTAGCATGAAAATC（配列番号３９）および５’-AGGAAGCTTTTAAAAATTTAAAGTGCAGCC（配列番号４０）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ＨＩＶ−ＰＲをコードする遺伝子領域を増幅した。反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、ＰＣＲ産物由来のバンドを切り取り、QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN, California、USA）で抽出した。ＰＣＲ産物抽出液に制限酵素NheI及びHindIII（いずれもNew England Biolab、Massachusetts、USA）を添加し、37℃で1時間処理後、75℃で10分加熱した。反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、目的のＤＮＡ断片由来のバンドを切り取り、QIAEX II Gel Extraction Kitで抽出した。一方、遺伝子発現用プラスミドであるpcDNA 3.1（New England Biolab、Massachusetts、USA）に制限酵素NheI及びHindIIIを添加し、37℃で1時間処理後、75℃で10分加熱した。この溶液に先のＤＮＡ断片抽出液及びligation high（Toyobo Biologics、Osaka、JAPAN）を添加し、16℃で1時間処理した。作製した組換えプラスミド溶液を大腸菌ＤＨ５α（New England Biolab、Massachusetts、USA）に形質転換し、ＬＡ寒天培地（1% 塩化ナトリウム、1% トリプトン、0.5% 酵母抽出物、50ug/mLアンピシリン）上で37℃で終夜培養した。形成した大腸菌コロニーからQIASpin Miniprep Kit（QIAGEN、California、USA）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、DNAシークエンサー（Prism 3100-AvantGenetic Analyzer、Applied Biosystems、California、USA）で塩基配列を決定し、ＨＩＶ−ＰＲの配列を含むプラスミドＤＮＡをpcDNA-HIV-PR 1として用いた。
【００７１】
（ＨＩＶ-ＰＲ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミド、並びにｓｉＲＮＡのトランスフェクション）
トランスフェクションの1時間前に、ＧＦＰを発現するプラスミドＤＮＡ（pAcGFP（Clontech、California、USA））及びＨＩＶ-ＰＲを発現するプラスミドＤＮＡ（pcDNA-HIV-PR 1）をそれぞれMEMに溶解し、5分間静置した。これらのプラスミド溶液を混合して5分間静置した後、Lipofectamin 2000（Life Technologies、California、USA）のMEM溶液を加えた。この溶液を5分間静置した後、ｓｉＲＮＡのMEM溶液を、終濃度が1〜1000 nM（好ましくは20〜200 nM）となるように加え、更に20分間静置した。この溶液全量を上述のHeLa細胞培養液に添加して、細胞を5% CO2雰囲気下37℃で22時間培養した。細胞培養液を除去し、10% FBS、300 Uペニシリン及び300μgストレプトマイシンを含むMEMを添加して、5% CO2雰囲気下37℃で更に2日間培養した。
【００７２】
（細胞溶解とＧＦＰ発現量の測定）
トランスフェクションの後、細胞培養液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した。トリプシン-EDTA溶液をシャーレに加え、顕微鏡で接着した細胞が浮遊するのを確認した後、10% FBSを含むMEMを加えた。この細胞懸濁液をチューブに移して5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿した細胞を10% FBSを含むMEMに懸濁させ、細胞数を計測した後、5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿した細胞をFBS未添加のMEMに懸濁させ5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿した細胞をFBS未添加のMEM 2 mLに懸濁させ、懸濁液1 mLを3分間遠心分離し、上清を除去した後、更に20秒間遠心分離して生じた上清を除去した。水をチューブに加えて細胞をよく懸濁させ、氷浴中で10分間超音波処理を施した。この操作を計3回30分間行った。細胞破砕液を20分間遠心分離して上清を回収し、更に20分間遠心分離した。得られた上清50μLを用いて、蛍光分光光度計により、発現したGFP量を測定した。遠心分離は、12000rpm、4℃の条件で行なった。
【００７３】
実施例１
ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成用の２環状シトシンを持つリボヌクレオチド前駆材料化合物の新規合成
【００７４】
【化４】
【００７５】
５−{３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−イン−１−イル}ウリジン (1)
窒素気流下、室温にて、５−ヨードウリジン（1.46 g、3.95 mmol）の無水DMF溶液（20mL）に、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロプ−２−イン−１−イルアセトアミド（1.92 g、12.6 mmol）、ヨウ化銅(I)（162 mg、0.85 mmol）、トリエチルアミン（1.11 mL、7.96 mmol）を順に加えた。ヨウ化銅(I)が溶解した後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)（465 mg、0.40 mmol）を加え、室温にて終夜撹拌した。16時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣にメタノールを加え、室温にて1時間撹拌した。生じた白色沈殿を濾去し、濾液を減圧下溶媒留去した。残渣にアセトニトリルを加え、よく振盪しながら沸騰させ、さらに残渣を超音波破砕しながら室温まで冷却した後、冷蔵庫で終夜静置した。生じた淡黄色粉末を濾取し、アセトニトリルで洗浄した後真空乾燥を行い、化合物1をクリーム色粉末として得た（1.11 g、71%）。
【００７６】
５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−エン−１−イル}ウリジン (2)
窒素気流下、-78℃にて、化合物1（397 mg、1.0 mmol）及びNiCl2（133 mg、1.0 mmol）のメタノール溶液（40 mL）に、NaBH4（46 mg、1.2 mmol）を1分ごと4回に分けて加え攪拌した。30分後、反応液を徐々に室温に戻しながら攪拌し、反応液の色が黒色に変化した時点でシリカゲル（400 mg）を加えた。反応液を減圧下溶媒留去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル→メタノール/酢酸エチル＝2/8→メタノール/酢酸エチル＝1/1）にて精製し、化合物2を白色泡状物質として得た（1.02 g、91%）。
【００７７】
３’，５’−Ｏ−(ジ−ｔｅｒｔ−ブチルシランジイル)−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−エン−１−イル}ウリジン (3)
窒素気流下、0℃にて、化合物2（946 mg、2.4 mmol）のDMF溶液（20 mL）に硝酸銀（1.22 g、7.2 mmol）を加え、攪拌しながらジ−ｔｅｒｔ−ブチルジクロロシラン（0.75 mL、3.6 mmol）を滴下し、15分間攪拌した。トリエチルアミン（1.1 mL、7.2 mmol）を加えて室温で5分間攪拌した後、反応液を酢酸エチル（80 mL）で希釈し、有機層を水（150 mL）で3回及び飽和食塩水（80 mL）の順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ジクロロメタン（DCM）＝2/8→酢酸エチル/DCM＝3/7）で精製し、化合物3を白色泡状物質として得た（889 mg、69%）。
【００７８】
２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’，５’−Ｏ−(ジ−ｔｅｒｔ−ブチルシランジイル)−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−1−エン−１−イル}ウリジン (4)
窒素気流下、室温にて、化合物3（597 mg、1.1 mmol）の無水DMF溶液（10 mL）に、イミダゾール（226 mg、3.3 mmol）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（250 mg、1.7 mmol）を順に加え、室温にて攪拌した。28時間後、tert−ブチルジメチル−クロロシラン（36 mg、0.2 mmol）を追加し、更に11時間攪拌した。反応液にメタノールを加え、反応液を減圧下溶媒留去し真空乾燥を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/DCM=3/7）で精製し、化合物4を白色粉末として得た（469 mg、65%）。
【００７９】
２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−1−エン−１−イル}ウリジン (5)
窒素気流下、0℃にて、化合物4（247 mg、0.4 mmol）のTHF溶液（1.8 mL）に、10% HF-ピリジン（0.25 mL）を加え30分間攪拌した。反応液にピリジン（2.0 mL）を加えた後、DCMで希釈し、有機層を水で3回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（30 mL）、飽和食塩水（30 mL）の順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM→メタノール/DCM＝1/99→メタノール/DCM＝3/97→メタノール）にて精製し、化合物5を白色泡状物質として得た（161 mg、83%）。
【００８０】
２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−エン−１−イル}ウリジン (6)
窒素気流下、室温にて、化合物5（3.8 g、1.0 mmol）のピリジン溶液（70 mL）にＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（62.mg、0.5 mmol）及び４−４−ジメトキシトリチルクロライド（4.1 g、12.0 mmol）を順に加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下溶媒除去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリエチルアミン/DCM＝1/199→トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/10/189）にて精製し、化合物6を淡黄色泡状物質として得た（3.9 g、57%）。
【００８１】
３−(２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル)−７，８−ジヒドロピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オン (7)
化合物6（1.8 g、2.7 mmol）のメタノール溶液（24 mL）に、28%アンモニア水溶液（24 mL）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下溶媒除去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/2/197→トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/6/193→トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/10/189）にて精製し、化合物7を淡黄色泡状物質として得た（1.28 g、84%）。
【００８２】
３−[２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル−ホスホロアミジル)−β−Ｄ−リボフラノシル]−７，８−ジヒドロピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オン (8)
窒素気流下、室温にて、化合物7（227 mg、0.4 mmol）及びテトラゾール（21 mg、0.3 mmol）のDCM溶液（10 mL）に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（220μL、0.68 mmol）を滴下し、終夜攪拌した。反応液を減圧下溶媒除去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製（トリエチルアミン/酢酸エチル/DCM＝1/4.5/4.5）した。フラクションを30℃にて減圧下溶媒除去し、真空乾燥を行い、化合物8を淡黄色泡状物質として得た（222 mg、62%）。
【００８３】
実施例２
人工ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害
実施例１の化合物8を用いて、表２に記載する人工ｓｉＲＮＡ（天然型ｓｉＲＮＡ、3'-biC、及び5'-biC）を合成した。
【００８４】
【表２】
【００８５】
ただし表２の配列中、小文字はリボヌクレオチドの塩基を、大文字はデオキシリボヌクレオチドの塩基を、Ｘは下記式（Ｉ）の塩基を表す。
【００８６】
【化５】
【００８７】
これらのｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害効果を、ＨＩＶプロテアーゼ（ＨＩＶ-ＰＲ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミド、並びにこれらのｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたHeLa細胞を用いて以下のように評価した。
プラスミド及びｓｉＲＮＡ（終濃度20又は40 nMの天然型ｓｉＲＮＡ、3'-biC、又は5'-biC）でトランスフェクトしたHeLa細胞又はプラスミドのみでトランスフェクトしたHeLa細胞から、細胞溶解液を調製した。この細胞溶解液10 μLを、1.0 M塩化ナトリウム、1.0 mM エチレンジアミン四酢酸、2.5 % グリセロールを含む50 mM酢酸緩衝液（pH5.5）66 μLに加え、次いでＨＩＶ−ＰＲの基質としてアセチル化したペプチド（Ac-SGIFLETS、Ac-ARVLFEAM、Ac-RKILFLDG、Ac-SQNYLIVQ（Sigma-Genosis、Hokkaido、JAPAN）、各2.5 mM）6 μLを加えた。37℃で2時間インキュベーション後、0.1 M 水酸化ナトリウム5 μL及び1ｘPBS 20 μLを加えてpH=7.0とし、次いで2.5 mM カテコール 100 μL、1.0 mM NaIO4 50 μL及び0.3 Mホウ酸緩衝液（pH 7.0）50 μLを加えて100℃で10分加熱することにより、生成したペプチド断片を蛍光体に変換した。この蛍光体を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、蛍光検出した（HPLC分離条件：溶離液A＝メタノール、溶離液B＝0.1% トリフルオロ酢酸を含む水、溶離液C＝250 mMホウ酸緩衝液（pH 7.0）;Aを40分で15%から80%へ、Bを40分で80%から15%へ、Cは5%で一定。検出条件：励起波長400 nm、蛍光波長500 nm）。この検出値を、ＧＦＰ量の測定値で標準化し、酵素活性レベルを算出した。
結果を図１に示す。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしていない細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ発現を１００として、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ発現を百分率で表した。3'-biC及び5'-biCはいずれも、天然型ｓｉＲＮＡと同程度までＨＩＶ−ＰＲ発現を阻害した。即ち、ｓｉＲＮＡに２環状シトシン誘導体を導入しても優れたＲＮＡ干渉効果が保持されることが示された。
【００８８】
実施例３
ＲＮＡ分解酵素に対する人工ｓｉＲＮＡの安定性評価
市販のＲＮＡ分解酵素Ｉ（RNase A (ナカライテスク株式会社、Kyoto、JAPAN)）500 μg、75 mM 塩化ナトリウム及び1 mMエチレンジアミン四酢酸を含む10 mMリン酸緩衝液（pH7.5）49 μLに、人工ｓｉＲＮＡ（20 μM）1 μLを添加し、37℃にて反応させた。反応開始後0、10、20、30、60分後に反応液の一部（5μL）を2%ジエチルピロカーボネート水溶液5μLに加えて反応を停止させた。
これらの溶液を、20%未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、CYBR GOLDにてゲルを染色した。得られた人工ｓｉＲＮＡ由来のバンドをゲルイメージング装置により検出し、バンド由来の蛍光強度から反応後の各時点における人工ｓｉＲＮＡの残存率を算出した。
結果を図２に示す。天然型ｓｉＲＮＡは反応開始から30分後には約10%しか残っていなかったが、人工ｓｉＲＮＡ（3'-biC及び5'-biC）は反応開始から30分後には約40%の残存率を示し、60分後でも残存率の更なる低下はみられなかった。従って、２環状シトシン誘導体を含む人工ｓｉＲＮＡは、同じ塩基配列の天然型ｓｉＲＮＡと比較して、優れたヌクレアーゼ耐性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の医薬組成物によれば、ウイルスの増殖を抑制することができ、ウイルスが原因の疾患の患者に新たな治療手段を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
［配列番号１３］
配列番号２で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１４］
配列番号３で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１５］
配列番号４で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１６］
配列番号５で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１７］
配列番号６で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１８］
配列番号７で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１９］
配列番号８で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２０］
配列番号９で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２１］
配列番号１０で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２２］
配列番号１１で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２３］
配列番号１２で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２４］
配列番号２で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２５］
配列番号３で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２６］
配列番号４で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２７］
配列番号５で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２８］
配列番号６で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２９］
配列番号７で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３０］
配列番号８で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３１］
配列番号９で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３２］
配列番号１０で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３３］
配列番号１１で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３４］
配列番号１２で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３５］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成センス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
［配列番号３６］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成アンチセンス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
［配列番号３７］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成アンチセンス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
ｎは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３８］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成アンチセンス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
ｎは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３９］
ＰＣＲプライマー
［配列番号４０］
ＰＣＲプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレアーゼによる酵素分解に対して耐性を有する人工二本鎖核酸、及び該人工二本鎖核酸を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus：ヒト免疫不全ウイルス）は、エイズ（ＡＩＤＳ：Acquired Immunodeficiency Syndrome：後天性免疫不全症候群）の原因となるレトロウイルスである。ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞といったＣＤ４陽性細胞群を標的とし、これら免疫担当細胞を破壊し、免疫不全症を引き起こす。従って、エイズの治療又は予防のために、生体内のＨＩＶを根絶するか又はその増殖を抑制する薬剤の開発が重要である。
【０００３】
ＨＩＶは、２分子のＲＮＡ遺伝子を殻内に有し、更にその殻は外皮タンパク質で覆われている。ＲＮＡにはウイルス特有の複数の酵素（ＨＩＶプロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなど）がコードされている。ＨＩＶは宿主細胞に吸着／侵入後、脱殻を起こし、細胞質内にＲＮＡとインテグラーゼ等の複合体を放出する。該ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡが転写され、完全長の二本鎖ＤＮＡが生成する。該ＤＮＡは宿主細胞核内に移行し、インテグラーゼにより宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡは宿主細胞のポリメラーゼによってｍＲＮＡに変換され、該ｍＲＮＡからはウイルス形成に必要な種々のタンパク質が合成され、最終的にウイルス粒子が形成され、出芽・遊離する。
【０００４】
ＨＩＶのライフサイクルにおいて、ＨＩＶプロテアーゼは前駆体タンパク質（preprotein）を切断し、逆転写酵素、インテグラーゼ、構造タンパク質などを生成する役割を果たしており、ＨＩＶの感染・増殖に必須である。そのためＨＩＶプロテアーゼは抗ウイルス剤開発のターゲットとして注目されている。
【０００５】
これまでに多くのＨＩＶプロテアーゼ阻害剤が開発されており、例えば、インジナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプリナビル、ダルナビル等が既に日本において承認されている。しかしながらＨＩＶの遺伝子は変異しやすく、薬剤耐性を有する変異株が出現するため、これらの薬剤は根本的なエイズ治療薬とはなっていない。
【０００６】
ＨＩＶの増殖を抑制するための、ＨＩＶ特異的ｓｉＲＮＡについても知られている（特許文献１）。しかしながら、そのようなｓｉＲＮＡは予め設定した一定の条件に基づいて設計されており、その基準から外れる分子は自動的に除外されるため、効果的にＲＮＡ干渉を引き起こす分子全てが開示されている訳ではない。したがってｓｉＲＮＡを利用したエイズ治療薬のさらなる研究開発が引き続き重要である。
【０００７】
またｓｉＲＮＡは通常天然成分で構成されているため、細胞内、培養液中、または生体内に存在するヌクレアーゼによって速やかに分解されるという問題がある。それらのヌクレアーゼが存在する状況下でｓｉＲＮＡの有効濃度を長期的に維持することは困難である。
【０００８】
ｓｉＲＮＡの化学的な修飾は、天然型のｓｉＲＮＡにはない機能を持たせる有効な手法であり、ｓｉＲＮＡの安定性の向上などのための手段として検討されている。例えば、ヌクレアーゼ耐性、細胞導入率、ＲＮＡ干渉効果を高めたｓｉＲＮＡとして、センス鎖に芳香族化合物を結合させたｓｉＲＮＡや、アンチセンス鎖の５’末端部分のヌクレオチドの２’位を様々な官能基で修飾したｓｉＲＮＡが知られている（特許文献２及び３）。またホスホロチオエートなどの修飾オリゴヌクレオチドに関する特許が、米国Alnylam社やIsis Pharmaceuticals社によって多数取得されている。これらの化学修飾は、ＲＮＡ分子のリン酸ジエステルとリボース部分を構造変換したもの、あるいはＲＮＡ鎖の末端に化学物質を結合させたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−３０６９６２号
【特許文献２】特開２００９−１０６１６５号
【特許文献３】国際公開第２００４／０９０１０５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＨＩＶなどの変異しやすく多様性の高いウイルスに対しても優れたＲＮＡ干渉効果を発揮し、またヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入効率の高い、人工二本鎖核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、天然型二本鎖核酸中のシトシンを２環状シトシンに置換した人工二本鎖核酸が、高いヌクレアーゼ耐性及び細胞導入効率を示すことを見出した。さらにＨＩＶプロテアーゼをコードするＲＮＡ配列（特にＨＩＶ変異株間で高度に保存された塩基配列）を標的とする天然型二本鎖核酸中のシトシンを２環状シトシンに置換した人工二本鎖核酸が、ＨＩＶプロテアーゼに対して優れたＲＮＡ干渉効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下に示す通りである。
【００１２】
［１］配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列の少なくとも１５塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のアンチセンス鎖核酸と、当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のセンス鎖核酸とからなり、アンチセンス鎖またはセンス鎖中の少なくとも１個のシトシンを２環状シトシン誘導体に置換した人工二本鎖核酸。
［２］標的塩基配列が、ＧＡＡ ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ ＡＣＡ（配列番号１）で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号１で表される塩基配列の１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列であり、当該センス鎖核酸が連続する９塩基ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ（ただしＮはシトシンまたは２環状シトシン誘導体であってもよい）を含む少なくとも１５塩基の連続する標的塩基配列を含む、［１］に記載の人工二本鎖核酸。
［３］二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである、［１］または［２］に記載の人工二本鎖核酸。
［４］標的塩基配列が下記のいずれかで表される塩基配列又は下記のいずれかで表される塩基配列において塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列の１〜数個の塩基に置換、欠失もしくは付加が導入された塩基配列である、［１］〜［３］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸：
ＡＧＣ ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ Ａ（配列番号２）；
ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号３）；
ＣＵＣ ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ Ｃ（配列番号４）；
ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ Ａ（配列番号５）；
ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ Ｇ（配列番号６）；
ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ（配列番号７）；
ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｕ（配列番号８）；
ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ Ｇ（配列番号９）；
ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＵＧ Ａ（配列番号１０）；
ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＵＧＡ Ｕ（配列番号１１）；及び
ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ Ａ（配列番号１２）。
［５］下記のいずれかから選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸：
（ａ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｂ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｃ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において１〜４塩基削除された塩基配列（ただし塩基配列ＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を含む）からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｄ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、配列番号２４〜３４から選ばれる塩基配列からなるセンス鎖核酸（ここで、センス鎖の配列番号ｎ（ｎは１３〜２３である）に対してアンチセンス鎖の配列番号はｎ＋１１である）とからなる二本鎖核酸；
（ｅ）（ｄ）の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、塩基配列ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ及びＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を除く塩基配列において１〜数塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖核酸；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸および／またはセンス鎖核酸の３’末端または５’末端にヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを１〜４個付加した二本鎖核酸。
［６］２環状シトシン誘導体が下記式（Ｉ）で表される、［１］〜［５］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸：
【００１３】
【化１】
【００１４】
。
［７］２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドの糖部分がデオキシリボースまたはリボースである、［１］〜［６］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸。
［８］ウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸。
［９］ウイルス由来タンパク質がヒト免疫不全ウイルス由来プロテアーゼである、［８］に記載の人工二本鎖核酸。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物。
［１１］ウイルス増殖の抑制用である、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、［１１］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の人工二本鎖核酸に含まれる２環状シトシン誘導体は、該人工二本鎖核酸の塩基対形成能を向上させると共に、ヌクレアーゼによる酵素分解に対する耐性を付与する。そのためウイルス由来タンパク質をコードする標的遺伝子に対して効果的にＲＮＡ干渉を引き起こすことができ、該ウイルスの増殖を抑制しうる。また本発明の医薬組成物は、従来のｓｉＲＮＡよりも高い安定性を有するため、用量および／または投与回数の低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、人工ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害効果を示す。ＨＩＶ−ＰＲを発現するプラスミド及びＧＦＰを発現するプラスミド、ならびにｓｉＲＮＡを、HeLa細胞に導入した（上パネル）。トランスフェクトした各細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ活性を測定し、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしていない細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ発現を１００として、ＨＩＶ−ＰＲの発現（％）を算出した。
【図２】図２は、ＲＮＡ分解酵素に対する本発明の人工ｓｉＲＮＡの安定性を示す。天然型ｓｉＲＮＡ（菱形）、3'-biC（四角）及び5'-biC（三角）の存在量を経時的に測定し、反応開始時の存在量を１００として、残存率（％）を算出した。各試料について３連で実験を行ない、結果を平均値±標準偏差で表した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
二本鎖核酸とは、センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズした二本鎖領域を有する核酸分子であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子であり得る。
【００１８】
ＲＮＡは、それぞれがリン酸基及び窒素を含む塩基（典型的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ））に結合した糖リボースを含むリボヌクレオチドのポリマーである。ＤＮＡは、それぞれがリン酸基及び窒素を含む塩基（典型的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ））に結合した糖デオキシリボースを含むデオキシリボヌクレオチドのポリマーである。ＲＮＡ中のＵは、ＤＮＡにおいてはＴに一義的に読み替えることができる。ＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子とは、ＲＮＡ分子中の一部のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである分子、又はＤＮＡ分子中の一部のデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドである分子をいう。これらの核酸分子の配列は、特に明記されない限り、５’末端から３’末端の方向に左から右へ、核酸分子上の塩基の配列として表される。
【００１９】
ＲＮＡは、ＤＮＡと同様に、相補水素結合を形成することができる。それゆえＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖オーバーハングを有する二本鎖でありうる。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個のヌクレオチドの付加により形成されるものであり、他方の鎖と塩基対を形成しない領域である。
【００２０】
またＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み、それぞれが細胞内で特定の役割を果たしている。本明細書に用いられる場合、用語「ＲＮＡ」は、これらのすべてを含む。
【００２１】
ｓｉＲＮＡは、タンパク質発現に特異的に干渉するそれらの能力に因んで名付けられた約１０塩基長から約３０塩基長までの二本鎖ＲＮＡ分子を指す。
【００２２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性核酸により仲介される、遺伝子発現（タンパク質合成）の配列特異的又は遺伝子特異的抑制を指す。特定の理論又は作用様式に限定されないが、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RISC）によりｍＲＮＡを分解すること、および転写されたｍＲＮＡの翻訳を阻害することを含みうる。また遺伝子の転写を抑制するゲノムＤＮＡのメチル化も含み得る。ＲＮＡｉにより引き起こされる遺伝子発現の抑制は、一過性であっても、長期間持続してもよい。
【００２３】
ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。
【００２４】
人工二本鎖核酸とは、センス鎖またはアンチセンス鎖中に少なくとも１つの人工的な修飾を有する二本鎖核酸をいう。人工的な修飾の例としては、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型ＤＮＡ／ＲＮＡなどのリン酸骨格を修飾したもの；２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡ、２’−Ｆ修飾ＲＮＡなどの２’修飾ヌクレオチド；ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）などのヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルフォリノヌクレオチドなどの基本骨格が異なる修飾ヌクレオチド；５−フルオロウリジン、５−プロピルウリジン、２環状シトシン誘導体（後述）などの塩基修飾型ヌクレオチド等が挙げられる。
【００２５】
２環状シトシン誘導体含有人工二本鎖核酸
本発明の人工二本鎖核酸は、ウイルス由来タンパク質をコードする遺伝子中に存在する塩基配列を標的とする。
【００２６】
ウイルス由来のタンパク質は、任意のウイルスの感染または増殖に必要なウイルス由来のタンパク質であってよい。ウイルスとしては、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１））などのＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスが挙げられる。ウイルス由来のタンパク質は、好ましくはＨＩＶ由来のタンパク質であり、より好ましくはＨＩＶ由来のプロテアーゼ（ＨＩＶ−ＰＲ）である。
【００２７】
現在までにＨＩＶの２つの異なるファミリー、すなわち、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が明らかにされている。したがって本明細書中で用いられる場合、ＨＩＶ−ＰＲには、ＨＩＶ−１由来のプロテアーゼ及びＨＩＶ−２由来のプロテアーゼの両方が含まれる。
【００２８】
標的塩基配列は、配列番号４１又は４２で表される塩基配列からなる標的塩基配列であり得る。配列番号４１で表される塩基配列は、ＨＩＶ−１由来のプロテアーゼをコードする遺伝子（ＨＩＶ−１ゲノム（アクセッション番号：Ｍ１９９２１（2010年5月24日更新））の２２５３位〜２５４９位）の配列である。配列番号４２で表される塩基配列は、ＨＩＶ−２由来のプロテアーゼをコードする遺伝子（ヒトに感染したＨＩＶ−２のｐｏｌタンパク質をコードする遺伝子（アクセッション番号：ＧＵ０１２５０５）の塩基配列（ただし該遺伝子中のＴは、ＲＮＡにおいてはＵに一義的に読み替えられている）の１位〜２９７位）の配列である。
【００２９】
また標的塩基配列は、配列番号４１又は４２で表される塩基配列において１〜数個（具体的には１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個）の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列であり得る。このような塩基配列としては、様々なＨＩＶ−１変異株由来のプロテアーゼやＨＩＶ−２変異株由来のプロテアーゼをコードする遺伝子の配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
標的塩基配列は、好ましくは、ＧＡＡ ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ ＡＣＡ（配列番号１）で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号１で表される塩基配列の１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列である。
【００３１】
配列番号１で表される配列は、配列番号４１で表される配列の部分配列であり、当該配列の５’末端から６１位〜９３位（ＨＩＶ−１ゲノムの２３１３位〜２３４５位）に位置する。また配列番号１で表される配列は、配列番号４２で表される配列の部分配列であり、当該配列の５’末端から６１位〜９３位に位置する。配列番号１で表される配列の５’末端から１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）は、少なくとも９種のＨＩＶ−１の変異株の間で完全に保存されている（D.S. Dauber et al. Journal of Virology, 2002, 76 (3), 1359-1368）。このことはこの保存領域がＨＩＶ−ＰＲの機能または発現に重要であることを示唆する。そのため、この保存された配列を含む塩基配列を標的とすることで、ＲＮＡ干渉に対する耐性株の発生を特に効果的に抑えることが可能である。一方、配列番号１で表される配列の５'末端から１位〜１２位の塩基配列および２２位〜３３位の塩基については、各ＨＩＶ−１変異株又はＨＩＶ−２変異株の配列に合せて、１〜数個（具体的には１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）の塩基が置換、欠失もしくは付加されうる。例えば、配列番号１で表される配列の５'末端から２８位のグアニンはアデニンに置換されうる。以上のような標的塩基配列は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２以外の他のウイルス由来タンパク質をコードする遺伝子にも存在していてもよい。
【００３２】
より好ましくは、本発明の人工二本鎖核酸の標的塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の部分配列であって、下記のいずれかで表される配列または下記のいずれかで表される塩基配列において塩基配列ＧＡＵＡＣＡＧＧＡを除く塩基配列の１〜数個（具体的には１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）の塩基に置換、欠失もしくは付加が導入された塩基配列である（下線は標的塩基配列中の保存領域を示す）：
ＡＧＣ ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ Ａ（配列番号２）；
ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号３）；
ＣＵＣ ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ Ｃ（配列番号４）；
ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ Ａ（配列番号５）；
ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ Ｇ（配列番号６）；
ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ（配列番号７）；
ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｕ（配列番号８）；
ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ Ｇ（配列番号９）；
ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＵＧ Ａ（配列番号１０）；
ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＵＧＡ Ｕ（配列番号１１）；及び
ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ Ａ（配列番号１２）。
【００３３】
本発明の人工二本鎖核酸に含まれる２環状シトシン誘導体は、本発明者らによって修飾塩基として新たに開発されたものであり、シトシンと同様にグアニンと塩基対を形成し、且つ７，８−ジヒドロピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オン構造を含む修飾塩基である。２環状シトシン誘導体は、具体的には下記式（Ｉ）の構造を有する。
【００３４】
【化２】
【００３５】
２環状シトシン誘導体は、シトシンと同様に、３つの水素結合によりグアニンとの間で塩基対を形成することができる。いかなる理論にも拘束されないが、２環状シトシン誘導体は、シトシンと比較して、二重結合がさらに導入されたことで隣接する核酸塩基との追加のスタッキング相互作用を有し、炭化水素が追加されたことで疎水性相互作用が増加し、環化したことで強固な塩基対合のための固定された構造を有している。そのため２環状シトシン誘導体とグアニンの塩基対は、シトシンとグアニンの塩基対よりも安定であり得、安定な二本鎖核酸の形成に寄与しうる。
【００３６】
２環状シトシン誘導体（式（Ｉ）の塩基など）を含むリボヌクレオチドは、例えば、５−ヨードウリジンを出発材料として下記実施例１に記載の手順1)→2)→3)→4)→5)→6)→7)→8)で合成することができる。また、最終産物の収率は低下するものの、より簡単な経路として、実施例１に記載の手順を変更した下記手順1)→2)→6)→4)→7)→8)で合成することもできる。
【００３７】
【化３】
【００３８】
また２環状シトシン誘導体（式（Ｉ）の塩基など）を含むデオキシリボヌクレオチドは、例えば、５−ヨード２’−デオキシウリジンを出発材料として下記実施例１に記載の手順から２’水酸基への保護基の導入工程を除いた手順1)→2)→6)→7)→8)で合成することができる。２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドは、これら以外の手順で合成してもよい。
【００３９】
２環状シトシン誘導体を含む人工二本鎖核酸は、２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドと天然型のヌクレオチドを用いて、公知の化学合成を用いる方法（例えば市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いたホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法など）により合成することができる。
【００４０】
２環状シトシン誘導体は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方にのみ含まれていてもよく、両方に含まれていてもよい。２環状シトシン誘導体が含まれる位置も特に限定されない。
【００４１】
人工二本鎖核酸中に含まれる２環状シトシン誘導体の総数は、１個以上であれば特に限定されず、センス鎖またはアンチセンス鎖中のグアニンと相補的な塩基（即ちシトシン）の全てが２環状シトシン誘導体であってもよい。好ましくは、人工二本鎖核酸中に含まれる２環状シトシン誘導体の総数は１〜１６個である。
【００４２】
２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドの糖部分は、リボースであってもデオキシリボースであってもよい。オリゴヌクレオチド合成の原料として取り扱いの容易さの観点から、該糖部分は好ましくはデオキシリボースである。
【００４３】
本発明の人工二本鎖核酸は、少なくとも１つの２環状シトシン誘導体を含むが、他の修飾も含みうる。他の修飾としては、例えば上記人工二本鎖核酸の定義に記載した修飾が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４４】
本発明の人工二本鎖核酸をウイルスが原因の疾患の予防または治療剤に用いる場合、該人工二本鎖核酸は、該ウイルス受容体と結合するリガンドとコンジュゲートしていてもよい。このようなリガンドとのコンジュゲートは、患者の生体内の器官、組織または細胞に存在する標的ウイルスへの該人工二本鎖核酸の送達を効率よく行なうために有用でありうる。例えばＨＩＶ−１が標的ウイルスである場合、人工二本鎖核酸の３’末端または５’末端に、Ｔ細胞上のＣＤ４表面タンパク質に結合することができるＨＩＶ−１表面抗原を付着させることにより、標的ウイルスへの高効率の送達を行ないうる（Kilby JM and Eron JJ, New England J. of Medicine, 348(22):2228-2238 (2003)）。
【００４５】
本発明の人工二本鎖核酸は、前記標的塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる（ただしシトシンは２環状シトシン誘導体であってもよい）。本明細書において「相補的な」とは、二本鎖の二重鎖形成部の塩基対の総数に対する塩基間のＡ：Ｕ又はＴ、Ｇ：Ｃ又は２環状シトシン誘導体の塩基対合の割合が高いことを意味し、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４６】
本発明の人工二本鎖核酸は、標的塩基配列と相互作用するように、即ち標的塩基配列に結合するのに十分な相補性を有するように、当業者に公知の方法により設計されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどについての様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、前記標的塩基配列から適切な二本鎖核酸の塩基配列を選択することができる。
【００４７】
前記センス鎖核酸の長さは、連続する９塩基ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ（ただしＮはシトシンまたは２環状シトシン誘導体であってもよい）を含む少なくとも１５塩基長であれば特に限定されず、例えば１５〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１７〜２３塩基長、１９〜２１塩基長である。したがって前記センス鎖核酸の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基長であり得る。
【００４８】
本明細書中、二本鎖核酸の長さは、オーバーハング（overhang）を含まない二本鎖領域の長さで表す。よって、二本鎖核酸がｓｉＲＮＡの場合、二本鎖核酸の長さは、二本鎖核酸の二重鎖形成部の塩基対数を表す。例えば、１９塩基長の二本鎖核酸は、１９個の連続した塩基対を形成して共にアニールする２つの逆向きのＲＮＡ鎖を含み、各鎖は３’末端又は５’末端（好ましくは３’末端）にオーバーハングを有していてもよい。
【００４９】
オーバーハングの長さは変わりうるが、好ましくは、１〜数塩基長（例、１、２、３または４塩基長）であり、より好ましくは２塩基長である。またオーバーハングに含まれるヌクレオチドは特に限定されず、標的塩基配列（センス鎖の場合）又はそれに相補的な配列（アンチセンス鎖の場合）を形成してもよいが、そのような配列でなくてもよい。オーバーハングに含まれるヌクレオチドは修飾ヌクレオチド（例えば上記人工二本鎖核酸の定義に記載した修飾ヌクレオチド）であってもよい。一具体例として、オーバーハングは、ＴＴの塩基配列からなるジヌクレオチドである。
【００５０】
本発明の人工二本鎖核酸における二本鎖構造は、連結されていないセンス鎖とアンチセンス鎖で構成されていてもよいし（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられてもよい（ｓｈＲＮＡなど）。したがって本発明の人工二本鎖核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどが挙げられるが、転写抑制活性が強いことから、好ましくはｓｉＲＮＡである。
【００５１】
一実施形態において、本発明の人工二本鎖核酸は、下記のいずれかから選択されるアンチセンス鎖とセンス鎖とからなる二本鎖核酸である：
（ａ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｂ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｃ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において１〜４塩基削除された塩基配列（ただし塩基配列ＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を含む）からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；ならびに
（ｄ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、配列番号２４〜３４から選ばれる塩基配列からなるセンス鎖核酸（ここで、アンチセンス鎖の配列番号ｎ（ｎは１３〜２３である）に対してセンス鎖の配列番号はｎ＋１１である）とからなる二本鎖核酸。
【００５２】
【表１】
【００５３】
別の実施形態において、本発明の人工二本鎖核酸は、以下の二本鎖核酸でありうる：
（ｅ）前記（ｄ）の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、塩基配列ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ及びＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を除く塩基配列において１〜数塩基（例えば１〜４個、１〜３個、１又は２個）が置換、欠失もしくは付加され、かつウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖核酸。
【００５４】
ウイルス由来タンパク質の発現抑制活性の有無は種々の公知の試験方法（例、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＲＴＰＣＲ、発現プロファイリングなど）により評価することができる。該発現抑制活性の有無は、例えば、標的塩基配列を含むｍＲＮＡの切断の検出や、該ウイルス由来タンパク質が酵素である場合にはその酵素活性測定などによっても評価することができる。これらの試験は、インビトロまたはインビボの当該分野において公知の実験系を用いて行なうことができる。
【００５５】
さらに別の実施形態において、本発明の人工二本鎖核酸は、オーバーハングを有していてもよく、この場合以下の二本鎖核酸である：
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸および／またはセンス鎖核酸の３’末端または５’末端にヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを１〜４個（例、１、２、３または４個）付加した二本鎖核酸。
好適なヌクレオチドの付加としては、ＴＴの塩基配列からなるジヌクレオチドの付加が挙げられる。
【００５６】
本発明の人工二本鎖核酸は、標的塩基配列を有する遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有し、その結果該遺伝子又は該遺伝子産物の発現を抑制しうる。本発明の人工二本鎖核酸は、好ましくはウイルス由来タンパク質（好ましくはヒト免疫不全ウイルス由来プロテアーゼ（ＨＩＶプロテアーゼ））の発現抑制活性を有する。発現抑制活性の有無は、種々の公知の試験方法（例、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＲＴＰＣＲ、発現プロファイリングなど）により評価することができる。該発現抑制活性の有無は、例えば、標的塩基配列を含むｍＲＮＡの切断の検出や、該ウイルス由来タンパク質が酵素である場合にはその酵素活性測定などによっても評価することができる。これらの試験は、インビトロまたはインビボの当該分野において公知の実験系を用いて行なうことができる。
【００５７】
本発明の人工二本鎖核酸は、標的塩基配列を有する遺伝子又はその遺伝子産物の発現を抑制しうるため、該遺伝子の機能の解析に有用である。また本発明の人工二本鎖核酸により発現が抑制されるウイルス由来タンパク質がウイルスの増殖に重要な役割を果たしている場合（例えば、ウイルス由来タンパク質がＨＩＶプロテアーゼである場合）、その発現抑制活性を有する本発明の人工二本鎖核酸は、ウイルスの増殖を抑制しうるため、ウイルスが原因の疾患の予防または治療剤の製造に有用である。
【００５８】
本発明の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物
さらに本発明は、上記本発明の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ウイルス由来タンパク質の発現を抑制しうるため、好ましくはウイルス増殖の抑制用の医薬組成物である。より好ましくは、本発明の医薬組成物はヒト免疫不全ウイルス増殖の抑制用である。
【００５９】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分の種類もしくは活性、投与対象となる動物種、投与対象の病気の重篤度、薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇが例示され、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１回〜数回投与することもでき、１日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。
【００６０】
本発明の医薬組成物の投与対象としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、本発明の人工二本鎖核酸のみを含有するものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与される。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、患者に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与形態としては、経口投与、または気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。また医薬組成物は、必要に応じて、薬理学的に許容される添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、坐剤、噴霧剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などが挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。本発明の医薬組成物は、ウイルス増殖の抑制効果を奏する限りその投与経路および剤形は特に限定されない。
【００６３】
例えば、本発明の治療剤を注射剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
【００６４】
本発明の医薬組成物に含まれる二本鎖核酸と担体との配合比は、二本鎖核酸１重量部に対して担体１〜２００重量部が適当である。好ましくは、二本鎖核酸１重量部に対して担体２．５〜１００重量部、さらに好ましくは担体１０〜２０重量部である。
【００６５】
また本発明の医薬組成物は、リポソームの形態として製剤化することもできる。リポソームの形態にすることで、負に苛電した核酸分子を、負に荷電している細胞に高い親和力で取り込ませることができる。リポソームの調製は、一般的にはリン脂質または他の脂質を用いて、当該分野において公知の方法により行なうことができる。例えば、リポソームの調製は、LipofectinやLipofectamin（いずれもLife Technologies、California、USA）などの市販の試薬を用いて行なうことができる。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００６７】
（ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いた人工オリゴヌクレオチドの合成）
人工オリゴヌクレオチドの合成は、Applied Biosystems社の394 DNA/RNA Synthesizerを使用して、公知のホスホロアミダイト法に従い行った。天然核酸のホスホロアミダイト体は、情報に従い0.1 Mのアセトニトリル溶液として用いた。一方、２環状デオキシシチジンのホスホロアミダイト体は、0.15 Mのアセトニトリル溶液に調製して用いた。
【００６８】
（ｓｉＲＮＡの調製）
互いに相補的なオリゴヌクレオチドを等濃度になるよう混和し、95℃で2分間加温した後、1℃/2.5分の温度勾配でアニーリングを行った。二本鎖ｓｉＲＮＡの生成は、20%未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認した。
【００６９】
（HeLa細胞の培養）
半径6 cmのシャーレにて、3x105個のHeLa細胞を、10%牛胎仔血清（FBS）、300 Uペニシリン及び300μgストレプトマイシンを含むMinimum essential medium（MEM）中で、5% CO2雰囲気下37℃で2日間培養した。細胞培養液を除去した後、10% FBSを含むペニシリン・ストレプトマイシン無添加のMEMを添加し、5% CO2雰囲気下37℃で更に1日間培養した。
【００７０】
（プラスミドの作製）
ＨＩＶ−１由来のプロテアーゼ（ＨＩＶ−ＰＲ；以下、実施例においてはＨＩＶ−ＰＲとしてＨＩＶ−１由来のプロテアーゼを用いた）をコードする遺伝子を染色体に挿入したヒト胎児腎細胞株であるE-PR293（T. Fuse et al. Microbes Infect, 2006, 8, 1783-1789）のゲノムを鋳型として、５’-CAACAAGGACCAGCTAGCATGAAAATC（配列番号３９）および５’-AGGAAGCTTTTAAAAATTTAAAGTGCAGCC（配列番号４０）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ＨＩＶ−ＰＲをコードする遺伝子領域を増幅した。反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、ＰＣＲ産物由来のバンドを切り取り、QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN, California、USA）で抽出した。ＰＣＲ産物抽出液に制限酵素NheI及びHindIII（いずれもNew England Biolab、Massachusetts、USA）を添加し、37℃で1時間処理後、75℃で10分加熱した。反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、目的のＤＮＡ断片由来のバンドを切り取り、QIAEX II Gel Extraction Kitで抽出した。一方、遺伝子発現用プラスミドであるpcDNA 3.1（New England Biolab、Massachusetts、USA）に制限酵素NheI及びHindIIIを添加し、37℃で1時間処理後、75℃で10分加熱した。この溶液に先のＤＮＡ断片抽出液及びligation high（Toyobo Biologics、Osaka、JAPAN）を添加し、16℃で1時間処理した。作製した組換えプラスミド溶液を大腸菌ＤＨ５α（New England Biolab、Massachusetts、USA）に形質転換し、ＬＡ寒天培地（1% 塩化ナトリウム、1% トリプトン、0.5% 酵母抽出物、50ug/mLアンピシリン）上で37℃で終夜培養した。形成した大腸菌コロニーからQIASpin Miniprep Kit（QIAGEN、California、USA）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、DNAシークエンサー（Prism 3100-AvantGenetic Analyzer、Applied Biosystems、California、USA）で塩基配列を決定し、ＨＩＶ−ＰＲの配列を含むプラスミドＤＮＡをpcDNA-HIV-PR 1として用いた。
【００７１】
（ＨＩＶ-ＰＲ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミド、並びにｓｉＲＮＡのトランスフェクション）
トランスフェクションの1時間前に、ＧＦＰを発現するプラスミドＤＮＡ（pAcGFP（Clontech、California、USA））及びＨＩＶ-ＰＲを発現するプラスミドＤＮＡ（pcDNA-HIV-PR 1）をそれぞれMEMに溶解し、5分間静置した。これらのプラスミド溶液を混合して5分間静置した後、Lipofectamin 2000（Life Technologies、California、USA）のMEM溶液を加えた。この溶液を5分間静置した後、ｓｉＲＮＡのMEM溶液を、終濃度が1〜1000 nM（好ましくは20〜200 nM）となるように加え、更に20分間静置した。この溶液全量を上述のHeLa細胞培養液に添加して、細胞を5% CO2雰囲気下37℃で22時間培養した。細胞培養液を除去し、10% FBS、300 Uペニシリン及び300μgストレプトマイシンを含むMEMを添加して、5% CO2雰囲気下37℃で更に2日間培養した。
【００７２】
（細胞溶解とＧＦＰ発現量の測定）
トランスフェクションの後、細胞培養液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した。トリプシン-EDTA溶液をシャーレに加え、顕微鏡で接着した細胞が浮遊するのを確認した後、10% FBSを含むMEMを加えた。この細胞懸濁液をチューブに移して5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿した細胞を10% FBSを含むMEMに懸濁させ、細胞数を計測した後、5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿した細胞をFBS未添加のMEMに懸濁させ5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿した細胞をFBS未添加のMEM 2 mLに懸濁させ、懸濁液1 mLを3分間遠心分離し、上清を除去した後、更に20秒間遠心分離して生じた上清を除去した。水をチューブに加えて細胞をよく懸濁させ、氷浴中で10分間超音波処理を施した。この操作を計3回30分間行った。細胞破砕液を20分間遠心分離して上清を回収し、更に20分間遠心分離した。得られた上清50μLを用いて、蛍光分光光度計により、発現したGFP量を測定した。遠心分離は、12000rpm、4℃の条件で行なった。
【００７３】
実施例１
ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成用の２環状シトシンを持つリボヌクレオチド前駆材料化合物の新規合成
【００７４】
【化４】
【００７５】
５−{３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−イン−１−イル}ウリジン (1)
窒素気流下、室温にて、５−ヨードウリジン（1.46 g、3.95 mmol）の無水DMF溶液（20mL）に、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロプ−２−イン−１−イルアセトアミド（1.92 g、12.6 mmol）、ヨウ化銅(I)（162 mg、0.85 mmol）、トリエチルアミン（1.11 mL、7.96 mmol）を順に加えた。ヨウ化銅(I)が溶解した後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)（465 mg、0.40 mmol）を加え、室温にて終夜撹拌した。16時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣にメタノールを加え、室温にて1時間撹拌した。生じた白色沈殿を濾去し、濾液を減圧下溶媒留去した。残渣にアセトニトリルを加え、よく振盪しながら沸騰させ、さらに残渣を超音波破砕しながら室温まで冷却した後、冷蔵庫で終夜静置した。生じた淡黄色粉末を濾取し、アセトニトリルで洗浄した後真空乾燥を行い、化合物1をクリーム色粉末として得た（1.11 g、71%）。
【００７６】
５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−エン−１−イル}ウリジン (2)
窒素気流下、-78℃にて、化合物1（397 mg、1.0 mmol）及びNiCl2（133 mg、1.0 mmol）のメタノール溶液（40 mL）に、NaBH4（46 mg、1.2 mmol）を1分ごと4回に分けて加え攪拌した。30分後、反応液を徐々に室温に戻しながら攪拌し、反応液の色が黒色に変化した時点でシリカゲル（400 mg）を加えた。反応液を減圧下溶媒留去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル→メタノール/酢酸エチル＝2/8→メタノール/酢酸エチル＝1/1）にて精製し、化合物2を白色泡状物質として得た（1.02 g、91%）。
【００７７】
３’，５’−Ｏ−(ジ−ｔｅｒｔ−ブチルシランジイル)−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−エン−１−イル}ウリジン (3)
窒素気流下、0℃にて、化合物2（946 mg、2.4 mmol）のDMF溶液（20 mL）に硝酸銀（1.22 g、7.2 mmol）を加え、攪拌しながらジ−ｔｅｒｔ−ブチルジクロロシラン（0.75 mL、3.6 mmol）を滴下し、15分間攪拌した。トリエチルアミン（1.1 mL、7.2 mmol）を加えて室温で5分間攪拌した後、反応液を酢酸エチル（80 mL）で希釈し、有機層を水（150 mL）で3回及び飽和食塩水（80 mL）の順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ジクロロメタン（DCM）＝2/8→酢酸エチル/DCM＝3/7）で精製し、化合物3を白色泡状物質として得た（889 mg、69%）。
【００７８】
２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’，５’−Ｏ−(ジ−ｔｅｒｔ−ブチルシランジイル)−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−1−エン−１−イル}ウリジン (4)
窒素気流下、室温にて、化合物3（597 mg、1.1 mmol）の無水DMF溶液（10 mL）に、イミダゾール（226 mg、3.3 mmol）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（250 mg、1.7 mmol）を順に加え、室温にて攪拌した。28時間後、tert−ブチルジメチル−クロロシラン（36 mg、0.2 mmol）を追加し、更に11時間攪拌した。反応液にメタノールを加え、反応液を減圧下溶媒留去し真空乾燥を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/DCM=3/7）で精製し、化合物4を白色粉末として得た（469 mg、65%）。
【００７９】
２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−1−エン−１−イル}ウリジン (5)
窒素気流下、0℃にて、化合物4（247 mg、0.4 mmol）のTHF溶液（1.8 mL）に、10% HF-ピリジン（0.25 mL）を加え30分間攪拌した。反応液にピリジン（2.0 mL）を加えた後、DCMで希釈し、有機層を水で3回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（30 mL）、飽和食塩水（30 mL）の順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM→メタノール/DCM＝1/99→メタノール/DCM＝3/97→メタノール）にて精製し、化合物5を白色泡状物質として得た（161 mg、83%）。
【００８０】
２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−{(１Ｚ)−３−[(トリフルオロアセチル)アミノ]プロプ−１−エン−１−イル}ウリジン (6)
窒素気流下、室温にて、化合物5（3.8 g、1.0 mmol）のピリジン溶液（70 mL）にＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（62.mg、0.5 mmol）及び４−４−ジメトキシトリチルクロライド（4.1 g、12.0 mmol）を順に加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下溶媒除去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリエチルアミン/DCM＝1/199→トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/10/189）にて精製し、化合物6を淡黄色泡状物質として得た（3.9 g、57%）。
【００８１】
３−(２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル)−７，８−ジヒドロピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オン (7)
化合物6（1.8 g、2.7 mmol）のメタノール溶液（24 mL）に、28%アンモニア水溶液（24 mL）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下溶媒除去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/2/197→トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/6/193→トリエチルアミン/メタノール/DCM＝1/10/189）にて精製し、化合物7を淡黄色泡状物質として得た（1.28 g、84%）。
【００８２】
３−[２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル−ホスホロアミジル)−β−Ｄ−リボフラノシル]−７，８−ジヒドロピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オン (8)
窒素気流下、室温にて、化合物7（227 mg、0.4 mmol）及びテトラゾール（21 mg、0.3 mmol）のDCM溶液（10 mL）に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（220μL、0.68 mmol）を滴下し、終夜攪拌した。反応液を減圧下溶媒除去して真空乾燥後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製（トリエチルアミン/酢酸エチル/DCM＝1/4.5/4.5）した。フラクションを30℃にて減圧下溶媒除去し、真空乾燥を行い、化合物8を淡黄色泡状物質として得た（222 mg、62%）。
【００８３】
実施例２
人工ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害
実施例１の化合物8を用いて、表２に記載する人工ｓｉＲＮＡ（天然型ｓｉＲＮＡ、3'-biC、及び5'-biC）を合成した。
【００８４】
【表２】
【００８５】
ただし表２の配列中、小文字はリボヌクレオチドの塩基を、大文字はデオキシリボヌクレオチドの塩基を、Ｘは下記式（Ｉ）の塩基を表す。
【００８６】
【化５】
【００８７】
これらのｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害効果を、ＨＩＶプロテアーゼ（ＨＩＶ-ＰＲ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミド、並びにこれらのｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたHeLa細胞を用いて以下のように評価した。
プラスミド及びｓｉＲＮＡ（終濃度20又は40 nMの天然型ｓｉＲＮＡ、3'-biC、又は5'-biC）でトランスフェクトしたHeLa細胞又はプラスミドのみでトランスフェクトしたHeLa細胞から、細胞溶解液を調製した。この細胞溶解液10 μLを、1.0 M塩化ナトリウム、1.0 mM エチレンジアミン四酢酸、2.5 % グリセロールを含む50 mM酢酸緩衝液（pH5.5）66 μLに加え、次いでＨＩＶ−ＰＲの基質としてアセチル化したペプチド（Ac-SGIFLETS、Ac-ARVLFEAM、Ac-RKILFLDG、Ac-SQNYLIVQ（Sigma-Genosis、Hokkaido、JAPAN）、各2.5 mM）6 μLを加えた。37℃で2時間インキュベーション後、0.1 M 水酸化ナトリウム5 μL及び1ｘPBS 20 μLを加えてpH=7.0とし、次いで2.5 mM カテコール 100 μL、1.0 mM NaIO4 50 μL及び0.3 Mホウ酸緩衝液（pH 7.0）50 μLを加えて100℃で10分加熱することにより、生成したペプチド断片を蛍光体に変換した。この蛍光体を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、蛍光検出した（HPLC分離条件：溶離液A＝メタノール、溶離液B＝0.1% トリフルオロ酢酸を含む水、溶離液C＝250 mMホウ酸緩衝液（pH 7.0）;Aを40分で15%から80%へ、Bを40分で80%から15%へ、Cは5%で一定。検出条件：励起波長400 nm、蛍光波長500 nm）。この検出値を、ＧＦＰ量の測定値で標準化し、酵素活性レベルを算出した。
結果を図１に示す。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしていない細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ発現を１００として、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＨＩＶ−ＰＲ発現を百分率で表した。3'-biC及び5'-biCはいずれも、天然型ｓｉＲＮＡと同程度までＨＩＶ−ＰＲ発現を阻害した。即ち、ｓｉＲＮＡに２環状シトシン誘導体を導入しても優れたＲＮＡ干渉効果が保持されることが示された。
【００８８】
実施例３
ＲＮＡ分解酵素に対する人工ｓｉＲＮＡの安定性評価
市販のＲＮＡ分解酵素Ｉ（RNase A (ナカライテスク株式会社、Kyoto、JAPAN)）500 μg、75 mM 塩化ナトリウム及び1 mMエチレンジアミン四酢酸を含む10 mMリン酸緩衝液（pH7.5）49 μLに、人工ｓｉＲＮＡ（20 μM）1 μLを添加し、37℃にて反応させた。反応開始後0、10、20、30、60分後に反応液の一部（5μL）を2%ジエチルピロカーボネート水溶液5μLに加えて反応を停止させた。
これらの溶液を、20%未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、CYBR GOLDにてゲルを染色した。得られた人工ｓｉＲＮＡ由来のバンドをゲルイメージング装置により検出し、バンド由来の蛍光強度から反応後の各時点における人工ｓｉＲＮＡの残存率を算出した。
結果を図２に示す。天然型ｓｉＲＮＡは反応開始から30分後には約10%しか残っていなかったが、人工ｓｉＲＮＡ（3'-biC及び5'-biC）は反応開始から30分後には約40%の残存率を示し、60分後でも残存率の更なる低下はみられなかった。従って、２環状シトシン誘導体を含む人工ｓｉＲＮＡは、同じ塩基配列の天然型ｓｉＲＮＡと比較して、優れたヌクレアーゼ耐性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の医薬組成物によれば、ウイルスの増殖を抑制することができ、ウイルスが原因の疾患の患者に新たな治療手段を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
［配列番号１３］
配列番号２で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１４］
配列番号３で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１５］
配列番号４で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１６］
配列番号５で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１７］
配列番号６で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１８］
配列番号７で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号１９］
配列番号８で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２０］
配列番号９で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２１］
配列番号１０で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２２］
配列番号１１で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２３］
配列番号１２で表される配列の相補配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２４］
配列番号２で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２５］
配列番号３で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２６］
配列番号４で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２７］
配列番号５で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２８］
配列番号６で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号２９］
配列番号７で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３０］
配列番号８で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３１］
配列番号９で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３２］
配列番号１０で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３３］
配列番号１１で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３４］
配列番号１２で表される配列に基づき合成された人工核酸。
ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３５］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成センス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
［配列番号３６］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成アンチセンス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
［配列番号３７］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成アンチセンス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
ｎは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３８］
ＨＩＶ−ＰＲ発現の阻害用ｓｉＲＮＡの合成アンチセンス鎖。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
ｎは２環状シトシン誘導体を表す。
［配列番号３９］
ＰＣＲプライマー
［配列番号４０］
ＰＣＲプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列の少なくとも１５塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のアンチセンス鎖核酸と、当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のセンス鎖核酸とからなり、アンチセンス鎖またはセンス鎖中の少なくとも１個のシトシンを２環状シトシン誘導体に置換した人工二本鎖核酸。
【請求項２】
標的塩基配列が、ＧＡＡ ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ ＡＣＡ（配列番号１）で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号１で表される塩基配列の１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列であり、当該センス鎖核酸が連続する９塩基ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ（ただしＮはシトシンまたは２環状シトシン誘導体であってもよい）を含む少なくとも１５塩基の連続する標的塩基配列を含む、請求項１に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項３】
二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１又は２に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項４】
標的塩基配列が下記のいずれかで表される塩基配列又は下記のいずれかで表される塩基配列において塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列の１〜数個の塩基に置換、欠失もしくは付加が導入された塩基配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸：
ＡＧＣ ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ Ａ（配列番号２）；
ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号３）；
ＣＵＣ ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ Ｃ（配列番号４）；
ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ Ａ（配列番号５）；
ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ Ｇ（配列番号６）；
ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ（配列番号７）；
ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｕ（配列番号８）；
ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ Ｇ（配列番号９）；
ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＵＧ Ａ（配列番号１０）；
ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＵＧＡ Ｕ（配列番号１１）；及び
ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ Ａ（配列番号１２）。
【請求項５】
下記のいずれかから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸：
（ａ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｂ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｃ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において１〜４塩基削除された塩基配列（ただし塩基配列ＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を含む）からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｄ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、配列番号２４〜３４から選ばれる塩基配列からなるセンス鎖核酸（ここで、センス鎖の配列番号ｎ（ｎは１３〜２３である）に対してアンチセンス鎖の配列番号はｎ＋１１である）とからなる二本鎖核酸；
（ｅ）（ｄ）の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、塩基配列ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ及びＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を除く塩基配列において１〜数塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖核酸；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸および／またはセンス鎖核酸の３’末端または５’末端にヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを１〜４個付加した二本鎖核酸。
【請求項６】
２環状シトシン誘導体が下記式（Ｉ）で表される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸：
【化１】
。
【請求項７】
２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドの糖部分がデオキシリボースまたはリボースである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項８】
ウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項９】
ウイルス由来タンパク質がヒト免疫不全ウイルス由来プロテアーゼである、請求項８に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ウイルス増殖の抑制用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１】
配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号４１もしくは４２で表される塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列の少なくとも１５塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のアンチセンス鎖核酸と、当該アンチセンス鎖核酸に相補的な塩基配列を含む１５〜３０塩基長のセンス鎖核酸とからなり、アンチセンス鎖またはセンス鎖中の少なくとも１個のシトシンを２環状シトシン誘導体に置換した人工二本鎖核酸。
【請求項２】
標的塩基配列が、ＧＡＡ ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ ＡＣＡ（配列番号１）で表される塩基配列からなる標的塩基配列または配列番号１で表される塩基配列の１３位〜２１位の塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列において１〜数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなる標的塩基配列であり、当該センス鎖核酸が連続する９塩基ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ（ただしＮはシトシンまたは２環状シトシン誘導体であってもよい）を含む少なくとも１５塩基の連続する標的塩基配列を含む、請求項１に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項３】
二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１又は２に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項４】
標的塩基配列が下記のいずれかで表される塩基配列又は下記のいずれかで表される塩基配列において塩基配列（ＧＡＵＡＣＡＧＧＡ）を除く塩基配列の１〜数個の塩基に置換、欠失もしくは付加が導入された塩基配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸：
ＡＧＣ ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ Ａ（配列番号２）；
ＧＣＵ ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号３）；
ＣＵＣ ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ Ｃ（配列番号４）；
ＵＣＵ ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ Ａ（配列番号５）；
ＣＵＡ ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ Ｇ（配列番号６）；
ＵＡＵ ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ（配列番号７）；
ＡＵＵ ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｕ（配列番号８）；
ＵＵＡ ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ Ｇ（配列番号９）；
ＵＡＧ ＡＵＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＵＧ Ａ（配列番号１０）；
ＡＧＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＵＧＡ Ｕ（配列番号１１）；及び
ＧＡＵ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＵ ＧＡＵ Ａ（配列番号１２）。
【請求項５】
下記のいずれかから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸：
（ａ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｂ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｃ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において１〜４塩基削除された塩基配列（ただし塩基配列ＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を含む）からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸；
（ｄ）配列番号１３〜２３のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、配列番号２４〜３４から選ばれる塩基配列からなるセンス鎖核酸（ここで、センス鎖の配列番号ｎ（ｎは１３〜２３である）に対してアンチセンス鎖の配列番号はｎ＋１１である）とからなる二本鎖核酸；
（ｅ）（ｄ）の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、塩基配列ＧＡＵＡＮＡＧＧＡ及びＵＮＮＵＧＵＡＵＮ（Ｎはシトシンまたは２環状シトシン誘導体を表す）を除く塩基配列において１〜数塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖核酸；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸および／またはセンス鎖核酸の３’末端または５’末端にヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを１〜４個付加した二本鎖核酸。
【請求項６】
２環状シトシン誘導体が下記式（Ｉ）で表される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸：
【化１】
。
【請求項７】
２環状シトシン誘導体を含むヌクレオチドの糖部分がデオキシリボースまたはリボースである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項８】
ウイルス由来タンパク質の発現抑制活性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項９】
ウイルス由来タンパク質がヒト免疫不全ウイルス由来プロテアーゼである、請求項８に記載の人工二本鎖核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の人工二本鎖核酸を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ウイルス増殖の抑制用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１７９０２７（Ｐ２０１２−１７９０２７Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４５４８５（Ｐ２０１１−４５４８５）
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年１１月２５日 日本薬学会 九州支部発行の「平成２２年度 第２７回日本薬学会九州支部大会講演要旨集」に発表、および平成２２年１２月１１日日本薬学会九州支部主催の「第２７回日本薬学会九州支部大会」において文書（スライド）をもって発表
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年１１月２５日 日本薬学会 九州支部発行の「平成２２年度 第２７回日本薬学会九州支部大会講演要旨集」に発表、および平成２２年１２月１１日日本薬学会九州支部主催の「第２７回日本薬学会九州支部大会」において文書（スライド）をもって発表
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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