Ａｎｔｈｏｚｏａ綱の非生物発光性種由来の蛍光タンパク質、そのようなタンパク質をコードする遺伝子、およびそれらの使用
【課題】新規な蛍光タンパク質、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法、およびそれらの使用を提供することを課題とする。
【解決手段】上記課題は、Ａｎｔｈｏｚｏａ綱由来の非生物発光生物由来の新規な蛍光タンパク質（具体的には、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質）を提供することにより解決された。その蛍光タンパク質をコードする核酸配列を同定する方法、さらにそのタンパク質を分析する方法が開示される。
【解決手段】上記課題は、Ａｎｔｈｏｚｏａ綱由来の非生物発光生物由来の新規な蛍光タンパク質（具体的には、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質）を提供することにより解決された。その蛍光タンパク質をコードする核酸配列を同定する方法、さらにそのタンパク質を分析する方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、新規な蛍光タンパク質、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
蛍光標識は、目的のタンパク質、細胞、または生物を標識するための特に有用なツールである。伝統的に、目的のタンパク質は精製され、次いで蛍光団誘導体に共有結合的に結合体化される。インビボ研究のために、次いで、タンパク質−色素複合体が、マイクロピペッティングまたは可逆的透過化処理の方法を使用して、目的の細胞に挿入される。しかし、色素吸着工程および色素挿入工程は、プロセスを、骨が折れかつ制御することが困難にする。目的のタンパク質を標識する代替的な方法は、目的のタンパク質を発現する遺伝子を、マーカーを発現する遺伝子に連結または融合させ、次いで融合産物を発現することである。タンパク質標識のこの方法のための代表的なマーカーは、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼである。しかし、これらのマーカーは、外因性の基質または補因子を必要とし、従ってインビボ研究のためには用途が限定される。
【０００３】
外因性補因子または基質を必要としないマーカーは、クラゲであるＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、このタンパク質は、３９５ｎｍに最大励起を有し、４７５ｎｍに第２の励起ピークおよび５１０ｎｍに最大発光を有する。ＧＦＰは、２３８アミノ酸タンパク質であり、アミノ酸６５〜６７が発色団の形成に関与する。
【０００４】
遺伝子発現およびタンパク質局在の研究のためのＧＦＰの使用は、非特許文献１、および非特許文献２によって詳細に議論される。さらに、非特許文献３は、細胞中で細胞内オルガネラを可視化するためのツールとしての野生型ＧＦＰの使用を議論するが、一方非特許文献４は、野生型ＧＦＰを使用して、分泌経路に沿ったタンパク質輸送の可視化を報告する。植物細胞におけるＧＦＰの発現は、非特許文献５によって議論されるが、一方Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚におけるＧＦＰ発現は、非特許文献６によって記載される。
【０００５】
野生型ＧＦＰおよび変異型ＧＦＰ Ｓ６５Ｔの結晶構造は、ＧＦＰの三次元構造がバレルに類似することを示す（非特許文献７；非特許文献８）。バレルは、コンパクトな構造中のβシートからなり、ここで、その中心において、発色団を含有するαヘリックスは、バレルによって遮蔽されている。コンパクトな構造は、ＧＦＰを、多様な条件下および／または厳しい条件下（例えば、プロテアーゼ処理）で非常に安定にして、一般に、ＧＦＰを極度に有用なレポーターにする。しかし、ＧＦＰの安定性は、短期間の事象または反復する事象を決定することについて、ＧＦＰを最適より下にする。
【０００６】
多数の研究が行われており、種々の研究目的のために、ＧＦＰの特性を改善し、そして、有用かつ最適化されたＧＦＰ試薬を生成する。ＧＦＰの新しいバージョンが開発され（例えば、「ヒト化」されたＧＦＰ ＤＮＡ）、そのタンパク質産物が哺乳動物細胞中で合成を増大される（非特許文献９；非特許文献１０）。そのような１つのヒト化タンパク質は、「増強されたグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）」である。ＧＦＰへの他の変異は、ブルー光、シアン光、およびイエロー−グリーン光放射バージョンを生じた。ＧＦＰの大きな有用性に関わらず、ＧＦＰに類似しているかまたは異なる特性を有する他の蛍光タンパク質が、当該分野において有用である。新規な蛍光タンパク質は、可能な新規な色を生じるか、またはｐＨ依存性の蛍光を生成する。より大きな励起についての新規なスペクトルおよびより良好な適合性に基づいて、新規な蛍光タンパク質の他の有用な利点には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の可能性を含む。
【０００７】
先行技術は、そのＤＮＡコード配列が公知である新規な蛍光タンパク質において不完全である。本発明は、当該分野におけるこの長年にわたる必要性を満足する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（１９９４）、８０２−８０５頁
【非特許文献２】Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）、１２５０１−１２５０４
【非特許文献３】Ｒｉｚｚｕｔｏら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１９９５）、６３５−６４２
【非特許文献４】ＫａｅｔｈｅｒおよびＧｅｒｄｅｓ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９（１９９５）、２６７−２７１
【非特許文献５】ＨｕおよびＣｈｅｎｇ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９（１９９５）、３３１〜３３４
【非特許文献６】Ｄａｖｉｓら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １７０（１９９５）、７２６〜７２９
【非特許文献７】Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（１９９６）１３９２〜１３９５
【非特許文献８】Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）、１２４６−１２５１
【非特許文献９】Ｈａａｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（１９９６）３１５〜３２４
【非特許文献１０】Ｙａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１９９６）４５９２〜４５９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質に関する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程を包含する、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供され、ここで上記核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２、および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードする。上記核酸配列の存在は、上記蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程を包含する、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供され、ここで上記核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１５、および１６からなる群より選択されるプライマーとハイブリダイズする。上記核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態において、細胞中で蛍光タンパク質を分析する方法が提供され、上記方法は、上記細胞中で配列番号５５〜６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程；および上記タンパク質からの蛍光シグナルを測定する工程を包含する。この方法はさらに、上記シグナルに従って上記細胞を分別する工程を包含する。好ましくは、上記細胞は、蛍光活性化細胞分別法によって分別される。なお好ましくは、上記核酸配列が、上記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含み、ここで上記目的のタンパク質は上記蛍光タンパク質と異なる。検出された蛍光シグナルは、上記細胞中の上記目的の遺伝子の存在を、およびさらに、上記目的のタンパク質の存在を示す。上記蛍光タンパク質の細胞内局在を同定することによって、上記目的のタンパク質の細胞内局在もまた、同定される。
【００１３】
本発明の他のおよびさらなる局面、特色、および利点は、開示の目的のために与えられる本発明の現在好ましい実施形態の以下の記載から明白である。
【００１４】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） 蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、以下：
サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程であって、ここで該核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２、および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードし、該核酸配列の存在は、該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する工程、
を包含する方法。
（項目２） 蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、以下：
サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程であって、ここで該核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１５、および１６からなる群より選択されるプライマーとハイブリダイズし、該核酸配列の存在は、該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する工程、
を包含する方法。
（項目３） 細胞中で蛍光タンパク質を分析する方法であって、以下：
ａ）該細胞中で配列番号５５〜６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程；および
ｂ）該タンパク質からの蛍光シグナルを測定する工程、
を包含する方法。
（項目４） 前記シグナルに従って前記細胞を分別する工程をさらに包含する、項目３に記載の方法。
（項目５） 前記分別する工程は、前記細胞を、蛍光活性化細胞分別法によって分別することを包含する、項目４に記載の方法。
（項目６） 前記核酸配列が、前記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含み、該目的のタンパク質は該蛍光タンパク質と異なる、項目３に記載の方法。
（項目７） 前記蛍光シグナルは、前記細胞中の前記目的の遺伝子の存在を示す、項目６に記載の方法。
（項目８） 前記細胞は、前記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９） 前記蛍光タンパク質の細胞内局在を同定することによって、前記目的のタンパク質の細胞内局在が同定される工程をさらに包含する、項目８に記載の方法。
（項目１０） ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、標的フラグメントを単離するために使用される３’−ＲＡＣＥの改変されたストラテジーを示す。使用されたオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。Ｄｐ１およびＤｐ２は、第１および第２のＰＣＲにおいてそれぞれ使用された縮重プライマーである（縮重プライマーの配列については、表３および表４を参照のこと）。
【図２】図２Ａは、新規な蛍光タンパク質の多重アラインメントを示す。番号付けは、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に基づく。Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来の２つのタンパク質およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ由来の４つのタンパク質を、互いの間で比較する：シリーズの第１のタンパク質中の残基と一致する残基と同一の残基を、ダッシュで表す。導入したギャップをドットで表す。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの配列において、βシートを形成するストレッチに下線を付す；側鎖がβ−ｃａｎの内部を形成する残基に影を付ける（Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，１２４６−１２５１（１９９６）に従う）。図２Ｂは、ｃＦＰ４８４のＮ末端部分を示し、これは、他のタンパク質とは相同性を有さない。推定シグナルペプチドに下線を付す。
【図３】図３は、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｍａｊａｎｏ、ａｍＦＰ４８６由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図４】図４は、Ｃｌａｖｕｌａｒｉａ、ｃＦＰ４８４由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図５】図５は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ、ｚＦＰ５０６由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図６】図６は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ、ｚＦＰ５３８由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図７】図７は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ、ｄｓＦＰ４８３由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図８】図８は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｒＦＰ５８３由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図９】図９は、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ、ａｓＦＰ６００由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｇＦＰ５１２由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｍＦＰ５９２由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本明細書において用いる場合、用語「ＧＦＰ」は、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の塩基性のグリーン蛍光タンパク質をいう。これには、より大きい蛍光を提供するかまたは異なる色で蛍光発光するように操作されたＧＦＰの先行技術のバージョンを含む。Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰの配列（配列番号５４）は、Ｐｒｅｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ １１１（１９９２）、２２９〜３３に開示されている。
【００１７】
本明細書において用いる場合、用語「ＥＧＦＰ」は、２つのアミノ酸置換を有するＧＦＰの変異改変体をいう：Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔ（Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３（１９９５），６６３〜６６４）。用語「ヒト化」は、ヒト細胞におけるタンパク質の発現についてコドンを最適化するようにＧＦＰ核酸配列に作製された変化をいう（Ｙａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１９９６）、４５９２〜４５９３）。
【００１８】
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術（当業
者の範囲内）が使用され得る。このような技術は、文献中で十分に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｓｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。
【００１９】
「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。ここでは、付着したセグメントの複製をもたらすように、別のＤＮＡセグ
メントが付着され得る。
【００２０】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかでの、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形成をいう。この用語は、この分子の一次構造および二次構造のみをいい、そして任意の特定の３次形態に限定しない。従って、この用語は、とりわけ、直線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。
【００２１】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビボで転写されポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、コード配列の３’側に位置付けされ得る。
【００２２】
本明細書において用いる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、反対側の核酸鎖の残基の間の水素結合により安定化された逆平行の二重鎖を形成する２つの核酸鎖の会合のプロセスをいう。
【００２３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、短い（１００塩基長未満）の核酸分子をいう。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「ＤＮＡ調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのような転写制御配列および翻訳制御配列である。これは、宿主細胞中のコード配列の発現を提供し、そして／または発現を調節する。
【００２５】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そして下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的のために、このプロモーター配列を、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上記の検出可能バックグラウンドレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、しばしば（ただし常にではない）「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。種々のプロモーター（誘導プロモーターを含む）が、本発明の種々のベクターを駆動するために用いられ得る。
【００２６】
本明細書において用いる場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれが特異的ヌクレオチド配列でまたはその近位で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。
【００２７】
細胞は、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡが細胞の内側に導入された場合、このようなＤＮＡにより「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、または組み込まれなくても（共有結合）よい。原核生物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞において、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームのエレメント上に維持され得る。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれており、それにより形質転換ＤＮＡが染色体複製を通じて娘細胞に遺伝される細胞である。この安定性は、この真核生物細胞が形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する能力により実証される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代についてインビトロで安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。
【００２８】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、事実上、より大きい分子との会合が見出されていない、より大きいＤＮＡ分子内の、同定可能なＤＮＡセグメントである。従って、この異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、この遺伝子は、供給源の生物体のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡと、通常隣接する。別の実施例では、異種ＤＮＡは、２つの異なる供給源由来の遺伝子の部分が（融合タンパク質産物を産生するように）一緒にされている構築物中にコード配列を含む。対立遺伝子改変体または天然に存在する変異事象は、本明細書において規定されるようなＤＮＡの異種領域を生じない。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「レポーター遺伝子」は、異種プロモーターまたはエンハンサーエレメントに結合したコード配列（そしてその産物は、その構築物が組織または細胞中に導入される場合、容易にそして定量的にアッセイされ得る）をいう。
【００３０】
本明細書において記載されるアミノ酸は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。このアミノ酸配列は、１文字コードで与えられる（Ａ：アラニン；Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：チロシン；Ｘ：任意の残基）。ＮＨ2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基をいう。標準的ポリペプチド命名法に従って、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（１９６９）、３５５２〜５９を用いる。
【００３１】
本発明は、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される単離かつ精製された蛍光タンパク質に関する
。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供される。この方法は、サンプル中の核酸配列の存在についてのスクリーニングの工程であって、ここで、この核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードする工程、を包含する。核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供される。この方法は、サンプル中の核酸配列の存在についてのスクリーニングの工程であって、ここで、この核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１５および１６からなる群より選択されるプライマーにハイブリダイズする工程、を包含する。核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００３４】
本発明のなお別の実施形態において、細胞中の蛍光タンパク質を分析する方法が提供される。この方法は、細胞中の配列番号５５〜６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程；およびこのタンパク質由来の蛍光シグナルを測定する工程、を包含する。この方法は、さらにシグナルに従って細胞をソートする工程を包含する。好ましくは、この細胞は蛍光発色セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：蛍光標示式細胞ソーティング）によりソートされる。なお好ましくは、この核酸配列は、蛍光タンパク質に融合される（ここで目的のタンパク質は蛍光タンパク質とは別である）、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む。検出された蛍光シグナルは、目的の遺伝子、およびさらに細胞中の目的のタンパク質の存在を示す。蛍光タンパク質の細胞内位置を同定することにより、目的のタンパク質の細胞内位置がまた同定される。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的のために与えられ、そしていかなる様式でも本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
（生物学的材料）
新規な蛍光タンパク質を、Ａｎｔｈｏｚｏａのいくつかの属から同定した。これらの属は、いかなる生物発光も示さないが、通常の白色光または紫外光の下で観察した場合に、蛍光色を有する。６つの種を選択した（表１を参照のこと）。
【００３７】
【表１】
（実施例２）
（ｃＤＮＡの調製）
全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２（１９８７）、１５６〜１５９）のプロトコルに従って、目的の種から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を提供されたプロトコルに従って使用して、１〜３μｇの全ＲＮＡから開始して合成したが、唯一、このキット中に提供された「ｃＤＮＡ合成プライマー」をプライマーＴＮ３（５’−ＣＧＣＡＧＴＣＧＡＣＣＧ（Ｔ）13、配列番号１）（表２）で置き換える変更を行った。次いで、増幅されたｃＤＮＡサンプルを、提供されたプロトコルに記載されたように調製したが、ただし、ＰＣＲに使用した２つのプライマーがＴＳプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ、配列番号２）（表２）およびＴＮ３プライマー（表２）であった（ともに、０．１μＭの濃度）ことが異なる。２０〜２５回のＰＣＲサイクルを実施して、ｃＤＮＡサンプルを増幅した。この増幅されたｃＤＮＡを水で２０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを、続く手順にて使用した。
【００３８】
（表２）
ｃＤＮＡ合成およびＲＡＣＥにて使用したオリゴ
【００３９】
【表２】
（実施例３）
（オリゴの設計）
新規な蛍光タンパク質のｃＤＮＡのフラグメントを単離するために、縮重プライマーを使用するＰＣＲを実施した。縮重プライマーは、蛍光タンパク質のファミリー中で最も変化しないと予測された領域におけるｍＲＮＡの配列と一致するように設計した。このような４つのストレッチを選択し（表３）、そして縮重プライマーの変異体を設計した。このようなプライマーはすべて、ｍＲＮＡの３’末端に関した。すべてのオリゴを、使用前にゲル精製した。表２は、ｃＤＮＡ合成およびＲＡＣＥにおいて使用したオリゴを示す。
【００４０】
（表３）
（重要なアミノ酸ストレッチおよび蛍光タンパク質の単離のために使用した対応縮重プライマー）
【００４１】
【表３】
（実施例４）
（ｎＦＰの３’−ｃＤＮＡフラグメントの単離）
３’−ＲＡＣＥの改変型ストラテジーを使用して、標的フラグメントを単離した（図１を参照のこと）。このＲＡＣＥストラテジーは、連続する２つのＰＣＲ工程を含んだ。第１のＰＣＲ工程は、第１の縮重プライマー（表４）およびｃＤＮＡ合成のために使用されたＴＮ３プライマーと同一の３’部分を有する、Ｔ７−ＴＮ３プライマー（配列番号１７）（Ｔ７−ＴＮ３の配列については、表２）を含んだ。このＰＣＲ工程において長い方であるＴ７−ＴＮ３プライマーを置き換えた理由は、短い方であるＴＮ３プライマーを使用した場合、特にＴ７−ＴＮ３プライマーを低濃度（０．１μＭ）にて使用した場合に、生じるバックグラウンド増幅が効果的に抑制されたことである（Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５、８９９８〜９００２）。第２のＰＣＲ工程は、ＴＮ３プライマー（配列番号１、表２）および第２の縮重プライマー（表４）を含んだ。
【００４２】
（表４）
（ｎＦＰ ｃＤＮＡの３’フラグメントの特異的増幅を生じる、第１および第２のＰＣＲのための縮重プライマーの組み合わせ）
【００４３】
【表４】
第１のＰＣＲ反応を、以下のように実施した：増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを反応混合物に添加した。この反応混合物は、提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．３μＭの第１の縮重プライマー（表４）および０．１μＭのＴ７−ＴＮ３（配列番号１７）プライマーを、総量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、５５℃で１分、７２℃で４０秒を１サイクル；９５℃で１０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒を２４サイクル。次いで、この反応物を水で２０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを第２のＰＣＲ反応物に添加した。この第２のＰＣＲ反応物は、製造業者により提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．３μＭの第２の縮重プライマー（表４）および０．１μＭのＴＮ３プライマーを含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、５５℃（ＧＥＧ／ＧＮＧまたはＰＶＭに関して）または５２℃（ＮＦＰに関して）で１分、７２℃で４０秒を１サイクル；９５℃で１０秒、６２℃（ＧＥＧ／ＧＮＧまたはＰＶＭに関して）または５８℃（ＮＦＰに関して）で３０秒、７２℃で４０秒を１３サイクル。ＰＣＲの産物を、製造業者のプロトコルに従って、ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。
【００４４】
縮重プライマーの異なる組み合わせを、各種由来のＤＮＡに対する第１および第２のＰＣＲ反応において試し続けて、特異的増幅を生じるプライマーの組み合わせを見出した。この特定の増幅とは、予期されるサイズの顕著なバンド（ＮＧＨおよびＧＥＧ／ＧＮＧについて約６５０〜８００ｂｐ、そしてＮＦＰおよびＰＶＭについて約３５０〜５００ｂｐ（時に、少数の弱いバンドを伴う））が、２つのＰＣＲ反応後にアガロースゲル上で検出されたことを意味する。Ａｎｔｈｏｚｏａ綱の異なる種についてのプライマーの選り抜きの組み合わせを、表４に列挙する。プライマーの他のいくつかの組み合わせもまた、正確なサイズのフラグメントの増幅を生じたが、これらのフラグメントの配列は、同定された他の蛍光タンパク質またはＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰに対して、相同性を示さなかった。
【００４５】
（実施例５）
（全長ｃＤＮＡのコピーの取得）
得られた新規な蛍光タンパク質ｃＤＮＡの３’フラグメントを配列決定する際に、２つの５’指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーをｃＤＮＡについて合成し（表５）、次いでこのｃＤＮＡの５’末端を、連続する２つのＰＣＲを使用して増幅した。その次のＰＣＲ反応において、「ステップアウトＰＣＲ」という新規なアプローチを使用して、バックグラウンドの増幅を抑制した。このステップアウト反応混合物は、製造業者により提供された緩衝液を用いる１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭの第１の遺伝子特異的プライマー（表５を参照のこと）、０．０２μＭのＴ７−ＴＳプライマー（配列番号１８）、０．１μＭのＴ７プライマー（配列番号１９）および増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを、総容量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を２３〜２７サイクル。増幅の産物を水で５０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを、第２の（入れ子）ＰＣＲに添加した。この反応は、提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭの第２の遺伝子特異的プライマーおよび０．１μＭのＴＳプライマー（配列番号２）を、総容量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を１２サイクル。次いで増幅の産物を、製造業者のプロトコルに従って、ｐＡｔｌａｓベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中にクローニングした。
【００４６】
（表５）
（５’−ＲＡＣＥに使用した遺伝子特異的プライマー）
【００４７】
【表５】
（実施例６）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｎＦＰの発現）
新規な蛍光タンパク質発現のためのＤＮＡ構築物を調製するために、以下の２つのプライマーを各ＤＮＡについて合成した：そのｃＤＮＡの３’−ＵＴＲに位置するアニーリング部位を有する５’指向性「下流」プライマー、および翻訳開始部位（最初のＡＴＧコドンを含まない）の部位に対応する３’指向性「上流」プライマー（表６）。両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼについての部位をコードする５’−ヒール（ｈｅｅｌ）を有した；さらに、この上流プライマーは、そのＰＣＲ産物をｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中に、このベクターにコードされる６×ＨｉｓタグとｎＦＰのリーディングフレームの融合が生じるような様式でクローニングすることを可能にするように設計した。ＰＣＲを以下のように実施した：増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを反応混合物に添加した。この反応混合物は、製造業者により提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭの上流プライマーおよび０．２μＭの下流プライマーを、最終容量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を２３〜２７サイクル。この増幅工程の産物を、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製し、次いで標準的プロトコルに従ってこのプライマーの配列に対応する制限エンドヌクレアーゼを使用して、ｐＱＥ３０ベクター中にクローニングした。
【００４８】
すべてのプライマーを、ＸＬ−１ ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ中にて増幅し、そしてプラスミドＤＮＡミニプレップキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）によって精製した。この組換えクローンを、コロニーの色によって選択し、そして３ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充）中にて３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮なＬＢ培地２００ｍｌに移し、そして３７℃、２００ｒｐｍにて、ＯＤ600０．６〜０．７まで増殖させた。次いで、１ｍＭ ＩＰＴＧをこの培養物に添加し、そしてインキュベーションを、３７℃でさらに１６時間進行させた。この細胞を収集し、そして組換えタンパク質（Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグを組み込んでいる）を、製造業者のプロトコルに従って、ＴＡＬＯＮTM金属アフィニティー樹脂（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して精製した。
【００４９】
（表６）
（発現構築物へとクローニングするためにｎＦＰの全長コード領域を得るために使用したプライマー）
【００５０】
【表６】
（実施例７）
（新規な蛍光タンパク質およびこのタンパク質をコードするｃＤＮＡ）
蛍光タンパク質をコードする７つの全長ｃＤＮＡを得（配列番号４５〜５１）、そして７つの新規な蛍光タンパク質を産生した（配列番号５３〜５９）。これらの単離された新規な蛍光タンパク質のスペクトル特性を表７に示し、そしてこれらの新規なタンパク質についての発光スペクトルおよび励起スペクトルを、表３〜１１に示す。
【００５１】
（表７）
（単離したＮＦＰのスペクトル特性）
【００５２】
【表７】
＊相対量子収率は、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの量子収率と比較して決定した。
＊＊相対輝度は、励起係数に量子収率を掛けて、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰについての量子収率で割ったものである。
【００５３】
蛍光タンパク質の多重整列を図２Ａに示す。番号付けは、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ、配列番号５４）に基づく。これらの新規な蛍光タンパク質のアミノ酸配列に、配列番号５５〜６３と名付ける。Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来の２つのタンパク質およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ由来の４つのタンパク質を、互いの間で比較する：このシリーズの第１のタンパク質中の対応残基と同一である残基を、ダッシュによって示す。導入されたギャップを、点によって示す。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの配列において、βシートを形成するストレッチに下線を付す：側鎖がこのβ−ｃａｎの内側を形成する残基に影を付ける。図２Ｂは、ｃＦＰ４８４のＮ末端部分を示す、この部分は、他のタンパク質との相同性を有さない。推定シグナルペプチドに下線を付す。
【００５４】
以下の参考文献を、本明細書中に引用した。
１．Ｏｒｍｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜１３９５。
２．Ｙａｎｇ，Ｆ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：１２４６〜１２５１。
３．Ｃｏｒｍａｃｋら（１９９６）Ｇｅｎｅ １７３、３３〜３８。
４．Ｈａａｓら（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６．３１５〜３２４。
５．Ｙａｎｇら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４、４５９２〜４５９３。
６．Ｇｈｏｄａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１８２３〜１１８２６。
７．Ｐｒａｓｈｅｒ Ｄ．Ｃ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ １１１：２２９〜３３。
８．Ｋａｉｎら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９（４）６５０〜５５。
９．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ．ら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６〜１５９。
１０．Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５、８９９８〜９００２。
【００５５】
本明細書中で言及されるいずれの特許または刊行物も、本発明が属する分野の当業者レベルの指標である。これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物が参考として援用されると詳細かつ個別に示されたのと同じ程度に、参考として本明細書中で援用される。
【００５６】
本発明が、言及された対象を実行しそして目的および利益を得るため、ならびに本発明に固有の対象を実行しそして目的および利益を得るために、十分に適合されることを、当業者は容易に理解する。これらの実施例は、本明細書中に記載の方法、手順、処理、分子、および特定の化合物とともに、好ましい実施形態の現在の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定としては意図されない。特許請求の範囲の範囲によって規定されるような本発明の意図内に包含される、本発明における変化および他の使用は当業者が思い付く。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、新規な蛍光タンパク質、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
蛍光標識は、目的のタンパク質、細胞、または生物を標識するための特に有用なツールである。伝統的に、目的のタンパク質は精製され、次いで蛍光団誘導体に共有結合的に結合体化される。インビボ研究のために、次いで、タンパク質−色素複合体が、マイクロピペッティングまたは可逆的透過化処理の方法を使用して、目的の細胞に挿入される。しかし、色素吸着工程および色素挿入工程は、プロセスを、骨が折れかつ制御することが困難にする。目的のタンパク質を標識する代替的な方法は、目的のタンパク質を発現する遺伝子を、マーカーを発現する遺伝子に連結または融合させ、次いで融合産物を発現することである。タンパク質標識のこの方法のための代表的なマーカーは、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼである。しかし、これらのマーカーは、外因性の基質または補因子を必要とし、従ってインビボ研究のためには用途が限定される。
【０００３】
外因性補因子または基質を必要としないマーカーは、クラゲであるＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、このタンパク質は、３９５ｎｍに最大励起を有し、４７５ｎｍに第２の励起ピークおよび５１０ｎｍに最大発光を有する。ＧＦＰは、２３８アミノ酸タンパク質であり、アミノ酸６５〜６７が発色団の形成に関与する。
【０００４】
遺伝子発現およびタンパク質局在の研究のためのＧＦＰの使用は、非特許文献１、および非特許文献２によって詳細に議論される。さらに、非特許文献３は、細胞中で細胞内オルガネラを可視化するためのツールとしての野生型ＧＦＰの使用を議論するが、一方非特許文献４は、野生型ＧＦＰを使用して、分泌経路に沿ったタンパク質輸送の可視化を報告する。植物細胞におけるＧＦＰの発現は、非特許文献５によって議論されるが、一方Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚におけるＧＦＰ発現は、非特許文献６によって記載される。
【０００５】
野生型ＧＦＰおよび変異型ＧＦＰ Ｓ６５Ｔの結晶構造は、ＧＦＰの三次元構造がバレルに類似することを示す（非特許文献７；非特許文献８）。バレルは、コンパクトな構造中のβシートからなり、ここで、その中心において、発色団を含有するαヘリックスは、バレルによって遮蔽されている。コンパクトな構造は、ＧＦＰを、多様な条件下および／または厳しい条件下（例えば、プロテアーゼ処理）で非常に安定にして、一般に、ＧＦＰを極度に有用なレポーターにする。しかし、ＧＦＰの安定性は、短期間の事象または反復する事象を決定することについて、ＧＦＰを最適より下にする。
【０００６】
多数の研究が行われており、種々の研究目的のために、ＧＦＰの特性を改善し、そして、有用かつ最適化されたＧＦＰ試薬を生成する。ＧＦＰの新しいバージョンが開発され（例えば、「ヒト化」されたＧＦＰ ＤＮＡ）、そのタンパク質産物が哺乳動物細胞中で合成を増大される（非特許文献９；非特許文献１０）。そのような１つのヒト化タンパク質は、「増強されたグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）」である。ＧＦＰへの他の変異は、ブルー光、シアン光、およびイエロー−グリーン光放射バージョンを生じた。ＧＦＰの大きな有用性に関わらず、ＧＦＰに類似しているかまたは異なる特性を有する他の蛍光タンパク質が、当該分野において有用である。新規な蛍光タンパク質は、可能な新規な色を生じるか、またはｐＨ依存性の蛍光を生成する。より大きな励起についての新規なスペクトルおよびより良好な適合性に基づいて、新規な蛍光タンパク質の他の有用な利点には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の可能性を含む。
【０００７】
先行技術は、そのＤＮＡコード配列が公知である新規な蛍光タンパク質において不完全である。本発明は、当該分野におけるこの長年にわたる必要性を満足する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（１９９４）、８０２−８０５頁
【非特許文献２】Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）、１２５０１−１２５０４
【非特許文献３】Ｒｉｚｚｕｔｏら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１９９５）、６３５−６４２
【非特許文献４】ＫａｅｔｈｅｒおよびＧｅｒｄｅｓ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９（１９９５）、２６７−２７１
【非特許文献５】ＨｕおよびＣｈｅｎｇ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９（１９９５）、３３１〜３３４
【非特許文献６】Ｄａｖｉｓら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １７０（１９９５）、７２６〜７２９
【非特許文献７】Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（１９９６）１３９２〜１３９５
【非特許文献８】Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）、１２４６−１２５１
【非特許文献９】Ｈａａｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（１９９６）３１５〜３２４
【非特許文献１０】Ｙａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１９９６）４５９２〜４５９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質に関する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程を包含する、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供され、ここで上記核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２、および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードする。上記核酸配列の存在は、上記蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程を包含する、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供され、ここで上記核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１５、および１６からなる群より選択されるプライマーとハイブリダイズする。上記核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態において、細胞中で蛍光タンパク質を分析する方法が提供され、上記方法は、上記細胞中で配列番号５５〜６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程；および上記タンパク質からの蛍光シグナルを測定する工程を包含する。この方法はさらに、上記シグナルに従って上記細胞を分別する工程を包含する。好ましくは、上記細胞は、蛍光活性化細胞分別法によって分別される。なお好ましくは、上記核酸配列が、上記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含み、ここで上記目的のタンパク質は上記蛍光タンパク質と異なる。検出された蛍光シグナルは、上記細胞中の上記目的の遺伝子の存在を、およびさらに、上記目的のタンパク質の存在を示す。上記蛍光タンパク質の細胞内局在を同定することによって、上記目的のタンパク質の細胞内局在もまた、同定される。
【００１３】
本発明の他のおよびさらなる局面、特色、および利点は、開示の目的のために与えられる本発明の現在好ましい実施形態の以下の記載から明白である。
【００１４】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） 蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、以下：
サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程であって、ここで該核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２、および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードし、該核酸配列の存在は、該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する工程、
を包含する方法。
（項目２） 蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、以下：
サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニングする工程であって、ここで該核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１５、および１６からなる群より選択されるプライマーとハイブリダイズし、該核酸配列の存在は、該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する工程、
を包含する方法。
（項目３） 細胞中で蛍光タンパク質を分析する方法であって、以下：
ａ）該細胞中で配列番号５５〜６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程；および
ｂ）該タンパク質からの蛍光シグナルを測定する工程、
を包含する方法。
（項目４） 前記シグナルに従って前記細胞を分別する工程をさらに包含する、項目３に記載の方法。
（項目５） 前記分別する工程は、前記細胞を、蛍光活性化細胞分別法によって分別することを包含する、項目４に記載の方法。
（項目６） 前記核酸配列が、前記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含み、該目的のタンパク質は該蛍光タンパク質と異なる、項目３に記載の方法。
（項目７） 前記蛍光シグナルは、前記細胞中の前記目的の遺伝子の存在を示す、項目６に記載の方法。
（項目８） 前記細胞は、前記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９） 前記蛍光タンパク質の細胞内局在を同定することによって、前記目的のタンパク質の細胞内局在が同定される工程をさらに包含する、項目８に記載の方法。
（項目１０） ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、標的フラグメントを単離するために使用される３’−ＲＡＣＥの改変されたストラテジーを示す。使用されたオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。Ｄｐ１およびＤｐ２は、第１および第２のＰＣＲにおいてそれぞれ使用された縮重プライマーである（縮重プライマーの配列については、表３および表４を参照のこと）。
【図２】図２Ａは、新規な蛍光タンパク質の多重アラインメントを示す。番号付けは、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に基づく。Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来の２つのタンパク質およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ由来の４つのタンパク質を、互いの間で比較する：シリーズの第１のタンパク質中の残基と一致する残基と同一の残基を、ダッシュで表す。導入したギャップをドットで表す。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの配列において、βシートを形成するストレッチに下線を付す；側鎖がβ−ｃａｎの内部を形成する残基に影を付ける（Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，１２４６−１２５１（１９９６）に従う）。図２Ｂは、ｃＦＰ４８４のＮ末端部分を示し、これは、他のタンパク質とは相同性を有さない。推定シグナルペプチドに下線を付す。
【図３】図３は、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｍａｊａｎｏ、ａｍＦＰ４８６由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図４】図４は、Ｃｌａｖｕｌａｒｉａ、ｃＦＰ４８４由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図５】図５は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ、ｚＦＰ５０６由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図６】図６は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ、ｚＦＰ５３８由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図７】図７は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ、ｄｓＦＰ４８３由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図８】図８は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｒＦＰ５８３由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図９】図９は、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ、ａｓＦＰ６００由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｇＦＰ５１２由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｍＦＰ５９２由来の新規な蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本明細書において用いる場合、用語「ＧＦＰ」は、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の塩基性のグリーン蛍光タンパク質をいう。これには、より大きい蛍光を提供するかまたは異なる色で蛍光発光するように操作されたＧＦＰの先行技術のバージョンを含む。Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰの配列（配列番号５４）は、Ｐｒｅｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ １１１（１９９２）、２２９〜３３に開示されている。
【００１７】
本明細書において用いる場合、用語「ＥＧＦＰ」は、２つのアミノ酸置換を有するＧＦＰの変異改変体をいう：Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔ（Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３（１９９５），６６３〜６６４）。用語「ヒト化」は、ヒト細胞におけるタンパク質の発現についてコドンを最適化するようにＧＦＰ核酸配列に作製された変化をいう（Ｙａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１９９６）、４５９２〜４５９３）。
【００１８】
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術（当業
者の範囲内）が使用され得る。このような技術は、文献中で十分に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｓｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。
【００１９】
「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。ここでは、付着したセグメントの複製をもたらすように、別のＤＮＡセグ
メントが付着され得る。
【００２０】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかでの、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形成をいう。この用語は、この分子の一次構造および二次構造のみをいい、そして任意の特定の３次形態に限定しない。従って、この用語は、とりわけ、直線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。
【００２１】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビボで転写されポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、コード配列の３’側に位置付けされ得る。
【００２２】
本明細書において用いる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、反対側の核酸鎖の残基の間の水素結合により安定化された逆平行の二重鎖を形成する２つの核酸鎖の会合のプロセスをいう。
【００２３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、短い（１００塩基長未満）の核酸分子をいう。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「ＤＮＡ調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのような転写制御配列および翻訳制御配列である。これは、宿主細胞中のコード配列の発現を提供し、そして／または発現を調節する。
【００２５】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そして下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的のために、このプロモーター配列を、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上記の検出可能バックグラウンドレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、しばしば（ただし常にではない）「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。種々のプロモーター（誘導プロモーターを含む）が、本発明の種々のベクターを駆動するために用いられ得る。
【００２６】
本明細書において用いる場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれが特異的ヌクレオチド配列でまたはその近位で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。
【００２７】
細胞は、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡが細胞の内側に導入された場合、このようなＤＮＡにより「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、または組み込まれなくても（共有結合）よい。原核生物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞において、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームのエレメント上に維持され得る。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれており、それにより形質転換ＤＮＡが染色体複製を通じて娘細胞に遺伝される細胞である。この安定性は、この真核生物細胞が形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する能力により実証される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代についてインビトロで安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。
【００２８】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、事実上、より大きい分子との会合が見出されていない、より大きいＤＮＡ分子内の、同定可能なＤＮＡセグメントである。従って、この異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、この遺伝子は、供給源の生物体のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡと、通常隣接する。別の実施例では、異種ＤＮＡは、２つの異なる供給源由来の遺伝子の部分が（融合タンパク質産物を産生するように）一緒にされている構築物中にコード配列を含む。対立遺伝子改変体または天然に存在する変異事象は、本明細書において規定されるようなＤＮＡの異種領域を生じない。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「レポーター遺伝子」は、異種プロモーターまたはエンハンサーエレメントに結合したコード配列（そしてその産物は、その構築物が組織または細胞中に導入される場合、容易にそして定量的にアッセイされ得る）をいう。
【００３０】
本明細書において記載されるアミノ酸は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。このアミノ酸配列は、１文字コードで与えられる（Ａ：アラニン；Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：チロシン；Ｘ：任意の残基）。ＮＨ2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基をいう。標準的ポリペプチド命名法に従って、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（１９６９）、３５５２〜５９を用いる。
【００３１】
本発明は、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される単離かつ精製された蛍光タンパク質に関する
。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供される。この方法は、サンプル中の核酸配列の存在についてのスクリーニングの工程であって、ここで、この核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードする工程、を包含する。核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法が提供される。この方法は、サンプル中の核酸配列の存在についてのスクリーニングの工程であって、ここで、この核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１５および１６からなる群より選択されるプライマーにハイブリダイズする工程、を包含する。核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。
【００３４】
本発明のなお別の実施形態において、細胞中の蛍光タンパク質を分析する方法が提供される。この方法は、細胞中の配列番号５５〜６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程；およびこのタンパク質由来の蛍光シグナルを測定する工程、を包含する。この方法は、さらにシグナルに従って細胞をソートする工程を包含する。好ましくは、この細胞は蛍光発色セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：蛍光標示式細胞ソーティング）によりソートされる。なお好ましくは、この核酸配列は、蛍光タンパク質に融合される（ここで目的のタンパク質は蛍光タンパク質とは別である）、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む。検出された蛍光シグナルは、目的の遺伝子、およびさらに細胞中の目的のタンパク質の存在を示す。蛍光タンパク質の細胞内位置を同定することにより、目的のタンパク質の細胞内位置がまた同定される。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的のために与えられ、そしていかなる様式でも本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
（生物学的材料）
新規な蛍光タンパク質を、Ａｎｔｈｏｚｏａのいくつかの属から同定した。これらの属は、いかなる生物発光も示さないが、通常の白色光または紫外光の下で観察した場合に、蛍光色を有する。６つの種を選択した（表１を参照のこと）。
【００３７】
【表１】
（実施例２）
（ｃＤＮＡの調製）
全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２（１９８７）、１５６〜１５９）のプロトコルに従って、目的の種から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を提供されたプロトコルに従って使用して、１〜３μｇの全ＲＮＡから開始して合成したが、唯一、このキット中に提供された「ｃＤＮＡ合成プライマー」をプライマーＴＮ３（５’−ＣＧＣＡＧＴＣＧＡＣＣＧ（Ｔ）13、配列番号１）（表２）で置き換える変更を行った。次いで、増幅されたｃＤＮＡサンプルを、提供されたプロトコルに記載されたように調製したが、ただし、ＰＣＲに使用した２つのプライマーがＴＳプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ、配列番号２）（表２）およびＴＮ３プライマー（表２）であった（ともに、０．１μＭの濃度）ことが異なる。２０〜２５回のＰＣＲサイクルを実施して、ｃＤＮＡサンプルを増幅した。この増幅されたｃＤＮＡを水で２０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを、続く手順にて使用した。
【００３８】
（表２）
ｃＤＮＡ合成およびＲＡＣＥにて使用したオリゴ
【００３９】
【表２】
（実施例３）
（オリゴの設計）
新規な蛍光タンパク質のｃＤＮＡのフラグメントを単離するために、縮重プライマーを使用するＰＣＲを実施した。縮重プライマーは、蛍光タンパク質のファミリー中で最も変化しないと予測された領域におけるｍＲＮＡの配列と一致するように設計した。このような４つのストレッチを選択し（表３）、そして縮重プライマーの変異体を設計した。このようなプライマーはすべて、ｍＲＮＡの３’末端に関した。すべてのオリゴを、使用前にゲル精製した。表２は、ｃＤＮＡ合成およびＲＡＣＥにおいて使用したオリゴを示す。
【００４０】
（表３）
（重要なアミノ酸ストレッチおよび蛍光タンパク質の単離のために使用した対応縮重プライマー）
【００４１】
【表３】
（実施例４）
（ｎＦＰの３’−ｃＤＮＡフラグメントの単離）
３’−ＲＡＣＥの改変型ストラテジーを使用して、標的フラグメントを単離した（図１を参照のこと）。このＲＡＣＥストラテジーは、連続する２つのＰＣＲ工程を含んだ。第１のＰＣＲ工程は、第１の縮重プライマー（表４）およびｃＤＮＡ合成のために使用されたＴＮ３プライマーと同一の３’部分を有する、Ｔ７−ＴＮ３プライマー（配列番号１７）（Ｔ７−ＴＮ３の配列については、表２）を含んだ。このＰＣＲ工程において長い方であるＴ７−ＴＮ３プライマーを置き換えた理由は、短い方であるＴＮ３プライマーを使用した場合、特にＴ７−ＴＮ３プライマーを低濃度（０．１μＭ）にて使用した場合に、生じるバックグラウンド増幅が効果的に抑制されたことである（Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５、８９９８〜９００２）。第２のＰＣＲ工程は、ＴＮ３プライマー（配列番号１、表２）および第２の縮重プライマー（表４）を含んだ。
【００４２】
（表４）
（ｎＦＰ ｃＤＮＡの３’フラグメントの特異的増幅を生じる、第１および第２のＰＣＲのための縮重プライマーの組み合わせ）
【００４３】
【表４】
第１のＰＣＲ反応を、以下のように実施した：増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを反応混合物に添加した。この反応混合物は、提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．３μＭの第１の縮重プライマー（表４）および０．１μＭのＴ７−ＴＮ３（配列番号１７）プライマーを、総量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、５５℃で１分、７２℃で４０秒を１サイクル；９５℃で１０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒を２４サイクル。次いで、この反応物を水で２０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを第２のＰＣＲ反応物に添加した。この第２のＰＣＲ反応物は、製造業者により提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．３μＭの第２の縮重プライマー（表４）および０．１μＭのＴＮ３プライマーを含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、５５℃（ＧＥＧ／ＧＮＧまたはＰＶＭに関して）または５２℃（ＮＦＰに関して）で１分、７２℃で４０秒を１サイクル；９５℃で１０秒、６２℃（ＧＥＧ／ＧＮＧまたはＰＶＭに関して）または５８℃（ＮＦＰに関して）で３０秒、７２℃で４０秒を１３サイクル。ＰＣＲの産物を、製造業者のプロトコルに従って、ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。
【００４４】
縮重プライマーの異なる組み合わせを、各種由来のＤＮＡに対する第１および第２のＰＣＲ反応において試し続けて、特異的増幅を生じるプライマーの組み合わせを見出した。この特定の増幅とは、予期されるサイズの顕著なバンド（ＮＧＨおよびＧＥＧ／ＧＮＧについて約６５０〜８００ｂｐ、そしてＮＦＰおよびＰＶＭについて約３５０〜５００ｂｐ（時に、少数の弱いバンドを伴う））が、２つのＰＣＲ反応後にアガロースゲル上で検出されたことを意味する。Ａｎｔｈｏｚｏａ綱の異なる種についてのプライマーの選り抜きの組み合わせを、表４に列挙する。プライマーの他のいくつかの組み合わせもまた、正確なサイズのフラグメントの増幅を生じたが、これらのフラグメントの配列は、同定された他の蛍光タンパク質またはＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰに対して、相同性を示さなかった。
【００４５】
（実施例５）
（全長ｃＤＮＡのコピーの取得）
得られた新規な蛍光タンパク質ｃＤＮＡの３’フラグメントを配列決定する際に、２つの５’指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーをｃＤＮＡについて合成し（表５）、次いでこのｃＤＮＡの５’末端を、連続する２つのＰＣＲを使用して増幅した。その次のＰＣＲ反応において、「ステップアウトＰＣＲ」という新規なアプローチを使用して、バックグラウンドの増幅を抑制した。このステップアウト反応混合物は、製造業者により提供された緩衝液を用いる１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭの第１の遺伝子特異的プライマー（表５を参照のこと）、０．０２μＭのＴ７−ＴＳプライマー（配列番号１８）、０．１μＭのＴ７プライマー（配列番号１９）および増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを、総容量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を２３〜２７サイクル。増幅の産物を水で５０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを、第２の（入れ子）ＰＣＲに添加した。この反応は、提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭの第２の遺伝子特異的プライマーおよび０．１μＭのＴＳプライマー（配列番号２）を、総容量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を１２サイクル。次いで増幅の産物を、製造業者のプロトコルに従って、ｐＡｔｌａｓベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中にクローニングした。
【００４６】
（表５）
（５’−ＲＡＣＥに使用した遺伝子特異的プライマー）
【００４７】
【表５】
（実施例６）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｎＦＰの発現）
新規な蛍光タンパク質発現のためのＤＮＡ構築物を調製するために、以下の２つのプライマーを各ＤＮＡについて合成した：そのｃＤＮＡの３’−ＵＴＲに位置するアニーリング部位を有する５’指向性「下流」プライマー、および翻訳開始部位（最初のＡＴＧコドンを含まない）の部位に対応する３’指向性「上流」プライマー（表６）。両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼについての部位をコードする５’−ヒール（ｈｅｅｌ）を有した；さらに、この上流プライマーは、そのＰＣＲ産物をｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中に、このベクターにコードされる６×ＨｉｓタグとｎＦＰのリーディングフレームの融合が生じるような様式でクローニングすることを可能にするように設計した。ＰＣＲを以下のように実施した：増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを反応混合物に添加した。この反応混合物は、製造業者により提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭの上流プライマーおよび０．２μＭの下流プライマーを、最終容量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を２３〜２７サイクル。この増幅工程の産物を、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製し、次いで標準的プロトコルに従ってこのプライマーの配列に対応する制限エンドヌクレアーゼを使用して、ｐＱＥ３０ベクター中にクローニングした。
【００４８】
すべてのプライマーを、ＸＬ−１ ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ中にて増幅し、そしてプラスミドＤＮＡミニプレップキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）によって精製した。この組換えクローンを、コロニーの色によって選択し、そして３ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充）中にて３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮なＬＢ培地２００ｍｌに移し、そして３７℃、２００ｒｐｍにて、ＯＤ600０．６〜０．７まで増殖させた。次いで、１ｍＭ ＩＰＴＧをこの培養物に添加し、そしてインキュベーションを、３７℃でさらに１６時間進行させた。この細胞を収集し、そして組換えタンパク質（Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグを組み込んでいる）を、製造業者のプロトコルに従って、ＴＡＬＯＮTM金属アフィニティー樹脂（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して精製した。
【００４９】
（表６）
（発現構築物へとクローニングするためにｎＦＰの全長コード領域を得るために使用したプライマー）
【００５０】
【表６】
（実施例７）
（新規な蛍光タンパク質およびこのタンパク質をコードするｃＤＮＡ）
蛍光タンパク質をコードする７つの全長ｃＤＮＡを得（配列番号４５〜５１）、そして７つの新規な蛍光タンパク質を産生した（配列番号５３〜５９）。これらの単離された新規な蛍光タンパク質のスペクトル特性を表７に示し、そしてこれらの新規なタンパク質についての発光スペクトルおよび励起スペクトルを、表３〜１１に示す。
【００５１】
（表７）
（単離したＮＦＰのスペクトル特性）
【００５２】
【表７】
＊相対量子収率は、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの量子収率と比較して決定した。
＊＊相対輝度は、励起係数に量子収率を掛けて、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰについての量子収率で割ったものである。
【００５３】
蛍光タンパク質の多重整列を図２Ａに示す。番号付けは、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ、配列番号５４）に基づく。これらの新規な蛍光タンパク質のアミノ酸配列に、配列番号５５〜６３と名付ける。Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来の２つのタンパク質およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ由来の４つのタンパク質を、互いの間で比較する：このシリーズの第１のタンパク質中の対応残基と同一である残基を、ダッシュによって示す。導入されたギャップを、点によって示す。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの配列において、βシートを形成するストレッチに下線を付す：側鎖がこのβ−ｃａｎの内側を形成する残基に影を付ける。図２Ｂは、ｃＦＰ４８４のＮ末端部分を示す、この部分は、他のタンパク質との相同性を有さない。推定シグナルペプチドに下線を付す。
【００５４】
以下の参考文献を、本明細書中に引用した。
１．Ｏｒｍｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜１３９５。
２．Ｙａｎｇ，Ｆ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：１２４６〜１２５１。
３．Ｃｏｒｍａｃｋら（１９９６）Ｇｅｎｅ １７３、３３〜３８。
４．Ｈａａｓら（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６．３１５〜３２４。
５．Ｙａｎｇら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４、４５９２〜４５９３。
６．Ｇｈｏｄａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１８２３〜１１８２６。
７．Ｐｒａｓｈｅｒ Ｄ．Ｃ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ １１１：２２９〜３３。
８．Ｋａｉｎら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９（４）６５０〜５５。
９．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ．ら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６〜１５９。
１０．Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５、８９９８〜９００２。
【００５５】
本明細書中で言及されるいずれの特許または刊行物も、本発明が属する分野の当業者レベルの指標である。これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物が参考として援用されると詳細かつ個別に示されたのと同じ程度に、参考として本明細書中で援用される。
【００５６】
本発明が、言及された対象を実行しそして目的および利益を得るため、ならびに本発明に固有の対象を実行しそして目的および利益を得るために、十分に適合されることを、当業者は容易に理解する。これらの実施例は、本明細書中に記載の方法、手順、処理、分子、および特定の化合物とともに、好ましい実施形態の現在の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定としては意図されない。特許請求の範囲の範囲によって規定されるような本発明の意図内に包含される、本発明における変化および他の使用は当業者が思い付く。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−２６８７９８（Ｐ２０１０−２６８７９８Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４１０５０（Ｐ２０１０−１４１０５０）
【出願日】平成２２年６月２１日（２０１０．６．２１）
【分割の表示】特願２０００−５８６９５８（Ｐ２０００−５８６９５８）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１０日（１９９９．１２．１０）
【出願人】（５００４８１４９９）クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２１日（２０１０．６．２１）
【分割の表示】特願２０００−５８６９５８（Ｐ２０００−５８６９５８）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１０日（１９９９．１２．１０）
【出願人】（５００４８１４９９）クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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