Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株を用いたメリビオースの製造方法
【課題】安価な原料であるグルコースとガラクトースからメリビオースを選択的に製造することが可能となるメリビオースの製造方法を提供すること。
【解決手段】グルコースとガラクトースを原料とするメリビオースの製造方法において、メリビオースを選択的に合成可能なＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα−ガラクトシダーゼを用いる。
【解決手段】グルコースとガラクトースを原料とするメリビオースの製造方法において、メリビオースを選択的に合成可能なＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα−ガラクトシダーゼを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用することを特徴とするメリビオースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活・社会生活が多様化する中で、健康に対する意識向上から消費者の食品や食品素材等への関心が高まっている。その中で、ラフィノースのフラクトース部分が除去された構造を持つメリビオースは、腸内細菌叢を改善する等の機能を有することが認められ、飲食品や医薬品、香粧品等あるいは、その原料として注目を浴びている。さらにメリビオースは、制癌効果やナチュラルキラー細胞活性化作用が報告されており非常に有用なオリゴ糖であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、メリビオースは大豆オリゴ糖中に少量存在するものの工業的に供給することは困難であった。人為的には、メリビオースはラフィノースの分解によって合成されている（例えば、非特許文献１）が、原料ラフィノースが高価なため、本手法を用いた場合メリビオースを安価に供給することは不可能であった。
【０００４】
一方、α−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトースとグルコースからα−ガラクトオリゴ糖を製造する方法についての報告もされている（特許文献１）が、メリビオースを選択的に製造する技術は世の中にはまったく知られていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】精糖技術研究会誌第３３号、３３、６４−７１、１９８４
【特許文献１】特許第３０２８２５８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、こうした状況のもとに、安価な原料であるガラクトースとグルコースを用いて、選択的にメリビオースを合成することを可能とするメリビオースの製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはこれらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、メリビオースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発見し、目的メリビオース以外の夾雑オリゴ糖の生成を抑制したメリビオースの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［５］に示すメリビオースの製造方法である。
［１］ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
［２］ α−ガラクトシダーゼが下記の特性を有する［１］に記載のメリビオースの製造方法。
（１）作用：本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【０００９】
［３］ 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
［４］ 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００１０】
［５］ α−ガラクトシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）、あるいはＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）を親株として得られる変異株由来のものである、［１］から［４］の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を用いることにより、安価な原料であるグルコースとガラクトースからメリビオースを選択的に製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明のα−ガラクトシダーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物に由来するものであり、当該微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、メリビオースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発現する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株が挙げられる。また、本発明における微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を親株として得られる変異株であってもかまわない。
【００１３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を親株として得られる変異株としては、公知の変異処理を施された変異株を用いることができる。ここでいう公知の変異処理とは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を、必要であれば紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤を使用し、変異誘導処理し、それらの菌株からα-ガラクトシダーゼ活性が高い菌株を選ぶ処理のことである。変異誘導処理に用いる微生物としては、親株としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株を用いることが好ましい。
【００１４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株はそれぞれ、平成１８年１１月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。受託番号は以下の通りである。なお、AKC-004株は、２００８年（平成２０年）１月３０日に、受領番号ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８、及び受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９４８として国際寄託に移管されている。
AKC-003株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）
AKC-004株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２；ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８；ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９４８）
AKC-005株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）
AKC-006株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）
【００１５】
本発明のα−ガラクトシダーゼは、下記の特性を有する。
（１）作用：作用：本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【００１６】
本発明の酵素の具体例としては、基質特異性及び金属イオンの影響として、以下の性質を有するものが挙げられる。
基質特異性：ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシドを基質とした場合、分解活性は最も高く、次いでメリビオース、次いでラフィノースの順である。一方、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド、ラクトース、スクロースは分解しない。
金属イオンの影響：カリウム、カルシウム、マグネシウム、クロム、マンガン、コバルト、鉄(II)、鉄(III)イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下は見られない。一方、ニッケル、亜鉛イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下が見られ、銅イオンを添加した場合に最も活性が低下する。
【００１７】
さらに本発明の酵素の具体例としては、下記の特性を有するものでもよい。
（５）（正反応の）至適温度範囲：35〜50℃
（６）安定温度範囲：45℃まで安定である。
【００１８】
本発明に用いる微生物の培養方法としては、通常の通気攪拌培養あるいは固体培養が用いられ、一般的に行われている微生物の培養方法が適応できる。培地としては、当該微生物が良好に生育し且つ、微生物中のα−ガラクトシダーゼを順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセロール、スクロース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、セロビオース、エルロース、有機酸、澱粉、オリーブ油、大豆油等を用いることができる。窒素源としては、例えば、硫安、硝安、尿素、アミノ酸、アミン類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、コーンスティープリカー、および大豆粕等があげられる。また、無機塩類としては、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。微生物の生育性の点から、培養温度は２５〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃、さらに好ましくは４０〜５５℃である。また、培地のｐＨは広範囲で選択可能であり、微生物の生育性の点からｐＨ３．０〜９．０が好ましく、より好ましくはｐＨ３．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ４．０〜８．０である。
【００１９】
本発明のα−ガラクトシダーゼの分離・精製は、例えば以下のようにして実施することができる。
【００２０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。こうして得られた菌体にはα−ガラクトシダーゼが含まれており、リゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いて菌体の破砕を行うことでα−ガラクトシダーゼの粗抽出液を得る。培養条件等により、α−ガラクトシダーゼの活性が培養上清に含まれる場合、培養上清をそのまま、または濃縮等の操作を加え、α−ガラクトシダーゼの粗抽出液として次の精製に用いることもできる。
【００２１】
上記のようにして得られる粗抽出液を、通常のタンパクの精製法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、塩析等を組み合わせて分画することによって、α−ガラクトシダーゼを精製することができる。
【００２２】
上記の操作の順は特に問わず、各操作は１回、または２回以上行ってもよい。また、それぞれのカラムに試料を通液する前に、透析等によって試料液を適当な緩衝液に交換しておくことが望ましい。さらにそれぞれの段階で試料液を濃縮しても良い。
【００２３】
精製の各段階においては、分画された各フラクション中に含まれるα−ガラクトシダーゼ活性を測定し、活性の高いフラクションを集めて次の段階に供試することが望ましい。
【００２４】
α−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５０μＬに酵素液１５０μＬを混合し、４０℃で５〜３０分間程度反応させた後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液１ｍＬに添加して酵素を失活させ、反応を停止する。得られた溶液の着色度を波長４２０ｎｍの吸収を測定し、各濃度のｐ−ニトロフェノールで作製した検量線を用いて濃度を算出する。また、酵素活性の単位は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして表示する。
【００２５】
精製されたα−ガラクトシダーゼの精製度の確認や分子量の測定は、電気泳動やゲル濾過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素学的性質は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定し、あるいは種々の酵素阻害剤や金属イオン等を反応液に添加し、残存活性を測定することによって検討すればよい。さらにα−ガラクトシダーゼを種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。また、基質濃度を変化させて反応を行うことで、各基質に対するα−ガラクトシダーゼのミカエリス定数 （Ｋm）、最大速度（Ｖmax）を求めることもできる。
【００２６】
本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の取得は、例えば以下のように行うことができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。
上記のようにして得られた菌体についてリゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いた菌体の破砕を行い、染色体ＤＮＡを単離する。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片を得る。
【００２７】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡ断片を用いて、ショットガンクローニングやインバースＰＣＲ法等を利用した公知の手段によりα−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長、またはその一部を含むＤＮＡ断片を取得する。ここで得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサー等を利用した公知の方法で解析し、その塩基配列を明らかにする。また、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の部分的な塩基配列のみが明らかになった場合、その塩基配列を基に再度α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することもできる。また、この操作を繰り返すことで、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長の塩基配列を明らかにすることも可能である。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を基に、ＰＣＲ法や制限酵素を用いた公知の方法によって、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列から、α−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を決定することができる。
【００２８】
配列番号２に本発明で用いることができるα−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がα-ガラクトシダーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよく、あるいは当該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。即ち、本発明で用いることができるα−ガラクトシダーゼの具体例としては、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを挙げることができる。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００２９】
上記のα−ガラクトシダーゼは、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いて遺伝子組み換えの手法により製造してもよい。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００３０】
上記（ｂ）における「１又は数個のアミノ酸」とは、一般的には１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸を意味する。
【００３１】
上記（ｃ）における「６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、一般的には、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
α−ガラクトシダーゼ遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を挙げることができる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００３３】
上記（ｂ）における「１又は数個の塩基」とは、一般的には１〜１５０個の塩基、好ましくは１〜９０個の塩基、より好ましくは１〜６０個の塩基、さらに好ましくは１〜３０個の塩基、さらに好ましくは１〜２０個の塩基、さらに好ましくは１〜１５個の塩基、さらに好ましくは１〜１０個の塩基、特に好ましくは１〜５個の塩基を意味する。
【００３４】
α−ガラクトシダーゼ遺伝子は公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体遺伝子は、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。即ち、α−ガラクトシダーゼ中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。
【００３５】
上記のようにして得られたα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を完全に含むＤＮＡ断片を大腸菌用発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ（＋）のマルチクローニングサイトに挿入、連結して、新たな組換えプラスミドを構築することができる。このプラスミドベクターは大腸菌内で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に発現できるｌａｃプロモーターが導入されており、組換えプラスミドを大腸菌に導入して得られる形質転換体を培養することでα−ガラクトシダーゼの大量発現が可能になる。
【００３６】
また、上記以外にも種々の宿主微生物、ベクターを利用したα−ガラクトシダーゼの大量発現は可能であり、例えばＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓの形質転換体を培養することで、α−ガラクトシダーゼの大量発現が可能である。より詳細には、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ-３ａ、ｐＥＴ-１１ａ、ｐＥＴ-３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させて本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを目的のベクターに組み込むことができる。
【００３７】
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。また、微生物宿主がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
【００３８】
また、形質転換微生物により本発明のα−ガラクトシダーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内または培養液中に本発明のα−ガラクトシダーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤などを添加して本発明のα−ガラクトシダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い本発明のα−ガラクトシダーゼを得ることができる。
【００３９】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。培養温度は微生物が発育し、本発明のα−ガラクトシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは、１０から４５℃程度、さらに好ましくは２０から３０℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、本発明のα−ガラクトシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、本発明のα−ガラクトシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００４０】
本発明によれば、前述の酵素を用いるに際しては、本発明の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物を用いてもよい。
【００４１】
本発明においては、上記したα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物を用いてもよい。上記酵素組成物には、例えば、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも１種以上の成分をさらに含有せしめることができる。
【００４２】
本発明において微生物触媒としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株のほかに、上記形質転換体を用いることができる。本発明においてメリビオース製造に利用する微生物触媒としては通常行われる培養方法によって得られる微生物そのものを利用することができ、α−ガラクトシダーゼを微生物から精製する必要はない。また、場合によっては、微生物培養液、微生物培養上清を利用することもできる。一方、培養法により得られた微生物は必要に応じて、水や緩衝液等で洗浄した後、利用することもできる。例えば、培養した微生物の培養液、または遠心分離、バッファーによる洗浄等により得た微生物懸濁液、微生物または微生物の処理物(例えば微生物の破砕物等)を懸濁または溶解させた水溶液、あるいは微生物または微生物処理物を包括法、架橋法、又は担体結合法によって固定化したものを用いることができる。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明によれば、上記した本発明のα−ガラクトシダーゼを用いたメリビオースの製造方法が提供される。原料としては、例えばグルコース及びガラクト−スを用いることができる。原料としてグルコースとガラクト−スを利用する際には例えば、α−ガラクトシダーゼによる脱水縮合反応を利用する性質上、原料濃度は高い方が好ましいが、ガラクトース濃度が高くなりすぎるとガラクトース分子間の縮合によりグルコースとガラクトース間の脱水縮合反応が抑制されるため好ましくない。グルコース濃度は３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。ガラクトース濃度は２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは、５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。
【００４４】
本発明のα−ガラクトシダーゼを用いてメリビオースを製造する際の反応温度は、１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。反応温度が１０℃未満である場合、反応速度が極めて小さく、９０℃を超える温度領域では酵素活性の失活が早く大量の酵素を要するため好ましくない。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ３．０〜７．５、さらに好ましくは３．５〜６．０である。反応ｐＨが２．０未満、あるいは１０．０より大きい場合、酵素の失活が著しく早くなるため好ましくない。反応時間は酵素の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分〜２００時間、より好ましくは、６〜８０時間である。しかしながら、本発明は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
【００４５】
本発明においては、生成オリゴ糖中のメリビオース含有率を５０％以上に向上することができ、より好ましい条件では７０％以上に向上することができる。メリビオース含有率が低い場合、生成物からのメリビオースの精製が著しく困難となるだけでなく、基質であるグルコースあるいはガラクトースの無駄な消費も重大な問題となる。
【００４６】
本発明において得られる生成オリゴ糖中のメリビオース含有率は以下の方法により測定される。
[生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率の測定方法]
グルコースとガラクトースを原料としたα−ガラクトオリゴ糖合成反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、さらに糖合成液を２０倍希釈し、イオンクロマト分析により、メリビオース蓄積濃度％（ｗ／ｖ）を算出した。また、反応停止後の糖合成液を２倍希釈して、ＨＰＬＣ分析を行い、全二糖蓄積濃度を算出した。イオンクロマト分析には、Ｃａｒｂｐａｃ ＰＡ１カラム（ダイオネクス社製）を用い、カラム温度３５℃、流量１ｍＬ／ｍｉｎ．で行った。検出器には、パルスドアンペロメトリ検出器を用いた。溶離液としては、水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を利用し、０−２０分、２０−４０分、４０−４５分の各々の段階で水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液の比率が４９／５０／１、３０／５０／２０、０／１００／０となるようなグラジエント条件で行った。ＨＰＬＣ分析には、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＣＬＧガードカラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＣ１０１１カラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラム（昭和電工社製）を連結して使用し、カラム温度８０℃、流量０．６ｍＬ／ｍｉｎ．、ＲＩ検出器で行った。溶離液には蒸留水を使用した。生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率（％）はメリビオース蓄積濃度／全二糖蓄積濃度×１００により算出した。
【００４７】
本発明の方法により製造されるメリビオースを精製、分離する方法としては、一般的に用いられている精製処理方法を利用することができる。すなわち、例えば、遠心分離、ＭＦ膜やＵＦ膜等による膜処理、フィルタープレス等により微生物触媒を除き、陽イオン交換クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマト処理や透析等の脱塩処理により緩衝液や培地等から持ち込まれる塩類等を除去し、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や溶解度の差等を利用した結晶化処理、その他の常法に従ってラフィノースを分離、精製することができる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良く、移動層方式や擬似移動層方式、多成分分離擬似移動層方式、多成分分離循環方式等を適宜利用することができる。これらのメリビオースの精製、分離処理方法は、バッチ式で行っても良いしカラムを利用するなどして連続的に行っても良い。
【００４８】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８に移管）：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、1日間培養してコロニーを形成させた。
【００５０】
ｐＨ７．２に調整した表１に示す培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、５０℃で、２５時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これをジャー培養のシードとした。
【００５１】
【表１】
【００５２】
次に、ｐＨ７．２に調整した表１に示す培地６Ｌを１０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記のジャー培養のシード１５ｍＬを移植し、５０℃で、４８時間、２００ｒｐｍ、０．２ｖｖｍで通気攪拌培養を行った。
【００５３】
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。得られた菌体のα−ガラクトシダーゼの活性を測定した結果、２６１Ｕであった。
【００５４】
この菌体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコースを含むＬｙｓｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し１５０ｍＬにした。この懸濁液を４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
【００５５】
Ｌｙｓｉｓ緩衝液で洗浄後の菌体を上記Ｌｙｓｉｓ緩衝液に再度懸濁し、１５０ｍＬとした。これに０．０２％のリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製 卵白由来）を添加して、３７℃で、１３時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
【００５６】
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。
【００５７】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて３７．５％飽和とし、４℃で一夜放置して沈殿を生じさせた。この沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
【００５８】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて５４．５％飽和とし、４℃で一夜放置して沈殿を生じさせた。この沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して回収し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ、４℃で、一夜、上記と同じリン酸緩衝液に対して透析した。
【００５９】
透析により得られた上清を、前記と同じリン酸バッファーで平衡化した「ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００６０】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、２Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ （ｈｉｇｈ ｓｕｂ）」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、２．０〜０Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００６１】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した「ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００６２】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸バッファーで平衡化した「ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
【００６３】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製α−ガラクトシダーゼとした。活性収率は１５％で、活性は２７０Ｕ／ｍＬであった。
【００６４】
実施例２
実施例１で得られた精製α−ガラクトシダーゼを用いて、その作用に関する実験を行った。
【００６５】
（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液に溶解させた６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド１５０μＬに、１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で５分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図１に示す。なお、使用した緩衝液は、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５〜３．５）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．５）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）である。
【００６６】
（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で１０ｍＭの緩衝液を用いて、各ｐＨで４５℃、１４０分間の加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図２に示す。なお、使用した各ｐＨの緩衝液の種類は前記のものと同様である。
【００６７】
（３）至適温度範囲
ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた４．７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド１９０μＬに、２０倍希釈した本発明の精製酵素液１０μＬを混合し、２０〜６０℃の範囲で５分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図３に示す。
【００６８】
（４）安定温度範囲
ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、３０〜５５℃の各温度で２０分間加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図４に示す。
【００６９】
（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めた。この結果を図５に示す。分子量は約８０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量８３，１２２とほぼ一致した。
【００７０】
（７）基質特異性
１０ｍＭの各種基質を含むｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１５０μＬに１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で２０分間反応させた。ただし、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質に用いた反応では、反応時間を５分間とした。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールの定量、あるいは「Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ」（昭和電工株式会社）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる分析から分解された基質の定量を行い、最大活性を１００とした各基質に対する相対活性を求めた。この結果を表２に示す。また、そのなかで基質となり得たものについて、反応速度を測定した結果を表３に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
（８）阻害因子
ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに各種金属イオンを終濃度１ｍＭとなるように添加して１５０μＬとし、１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で２０分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を表４に示す。
【００７４】
【表４】
【００７５】
実施例３
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株の染色体ＤＮＡを調製した。実施例１記載の方法で取得したＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株の培養液６０ｍＬを、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１ｍｇの染色体ＤＮＡを調製した。
【００７６】
（２）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡから、α−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計、合成した。プライマーの設計は公知の数種の微生物由来α−ガラクトシダーゼ遺伝子のアライメント結果を基に行い、センスプライマーは5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'（配列番号３）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3' （配列番号４）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。なお、配列中、Iはイノシン、YはC又はT、RはA又はGを示す。ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の増幅を行い、３８０塩基対からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を取得した。ここで得られた遺伝子断片の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーを用いて解析した。
【００７７】
解析の結果得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の塩基配列をもとに、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を取得するために、インバースＰＣＲ用ＰＣＲプライマーを設計、合成した。センスプライマーは5'-TGATCAACAACTGGGAAAGCGACCT-3' （配列番号５）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-GAACTGGTCCTGCTGCACAATTCC-3' （配列番号６）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。次に、インバースＰＣＲに用いる鋳型を調製した。上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化した後、得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化し、インバースＰＣＲの鋳型とした。この鋳型に対し、上記のように合成したインバースＰＣＲ用プライマーを用いて、ＰＣＲ法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行い、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全配列を含む４５００塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
【００７８】
（３）塩基配列の解析
ＤＮＡシークエンサーを用いて、（２）で得られたＰＣＲ産物からα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号２に示す５’末端からのＤＮＡ塩基配列を有する２１９０塩基対のα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を解読した。この配列はこれまで見出されていない新規な遺伝子であった。また、このＤＮＡ塩基配列より類推されるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株が生産するα−ガラクトシダーゼは７３０個のアミノ酸からなり、配列番号２に示すようなＮ末端からのアミノ酸配列を有していた。データベース検索の結果、このアミノ酸配列はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＮ）と５７％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＡ）と５６％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＢ）と５６％、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ由来α−ガラクトシダーゼと５６％の相同性を有し、新規なα−ガラクトシダーゼをコードしていることが明らかになった。
【００７９】
（４）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
（３）で得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を基に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のＳＤ配列、構造遺伝子、終始コドンを含む領域を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計・合成した。ＰＣＲプライマーの設計は（２）で得られた４５００塩基対からなるＰＣＲ産物の塩基配列を基に行い、センスプライマーは5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3' （配列番号７）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3' （配列番号８）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。（２）で得られた４５００塩基対からなるＰＣＲ産物を鋳型として、合成したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行い、２３２５塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。ここで得られたＰＣＲ産物を平滑末端化、リン酸化した。
【００８０】
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後に脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ（＋）ベクターに、上記で得られた平滑末端化、リン酸化したＰＣＲ産物を連結し、新たなプラスミドベクターｐＢｌｕｅ／ａｇａＡを構築した。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｌａｃプロモーターが導入されており、α−ガラクトシダーゼを効率的に発現・製造させることができる。得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
【００８１】
（５）形質転換体の培養及びα−ガラクトシダーゼの発現
（４）で作製した組換え大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢｌｕｅ／ａｇａＡを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む３０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で２４時間、振盪培養した。培養後、組換え大腸菌を遠心分離して回収した。菌体は１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。この破砕液のα−ガラクトシダーゼ活性を、前記の方法で測定したところ、１９．９Ｕ／培養液（ｍＬ）であった。
【００８２】
実施例４
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２５３：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート (ＤＩＦＣＯ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表１に示した培地 １００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５０℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。
【００８３】
本培養２８時間後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース８０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始２８３時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析した結果を図６に、ＨＰＬＣ分析した結果を図７に示した。メリビオース糖蓄積濃度は１．７９％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は７２．８％であった。
【００８４】
実施例５
実施例３記載の組換え体培養液１０ｍL分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース８０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析およびＨＰＬＣ分析した結果、メリビオース糖蓄積濃度は３．２４％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は７６．４％であった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明を用いることにより、安価な基質を原料として用いて、煩雑な酵素精製工程を行わずに、選択的にメリビオースを製造できるメリビオースの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの至適ｐＨ範囲（実施例２）を示す。
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの安定ｐＨ範囲（実施例２）を示す。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの至適温度範囲（実施例２）を示す。
【図４】図４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの安定温度範囲（実施例２）を示す。
【図５】図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例２）の結果を示す。
【図６】図６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４を用いた糖合成反応（実施例４）の反応液をイオンクロマト分析したリテンションタイム０〜２０分の結果を示す。
【図７】図７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４を用いた糖合成反応（実施例４）の反応液をＨＰＬＣ分析したリテンションタイム０〜４５分の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用することを特徴とするメリビオースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活・社会生活が多様化する中で、健康に対する意識向上から消費者の食品や食品素材等への関心が高まっている。その中で、ラフィノースのフラクトース部分が除去された構造を持つメリビオースは、腸内細菌叢を改善する等の機能を有することが認められ、飲食品や医薬品、香粧品等あるいは、その原料として注目を浴びている。さらにメリビオースは、制癌効果やナチュラルキラー細胞活性化作用が報告されており非常に有用なオリゴ糖であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、メリビオースは大豆オリゴ糖中に少量存在するものの工業的に供給することは困難であった。人為的には、メリビオースはラフィノースの分解によって合成されている（例えば、非特許文献１）が、原料ラフィノースが高価なため、本手法を用いた場合メリビオースを安価に供給することは不可能であった。
【０００４】
一方、α−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトースとグルコースからα−ガラクトオリゴ糖を製造する方法についての報告もされている（特許文献１）が、メリビオースを選択的に製造する技術は世の中にはまったく知られていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】精糖技術研究会誌第３３号、３３、６４−７１、１９８４
【特許文献１】特許第３０２８２５８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、こうした状況のもとに、安価な原料であるガラクトースとグルコースを用いて、選択的にメリビオースを合成することを可能とするメリビオースの製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはこれらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、メリビオースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発見し、目的メリビオース以外の夾雑オリゴ糖の生成を抑制したメリビオースの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［５］に示すメリビオースの製造方法である。
［１］ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
［２］ α−ガラクトシダーゼが下記の特性を有する［１］に記載のメリビオースの製造方法。
（１）作用：本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【０００９】
［３］ 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
［４］ 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００１０】
［５］ α−ガラクトシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）、あるいはＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）を親株として得られる変異株由来のものである、［１］から［４］の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を用いることにより、安価な原料であるグルコースとガラクトースからメリビオースを選択的に製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明のα−ガラクトシダーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物に由来するものであり、当該微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、メリビオースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発現する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株が挙げられる。また、本発明における微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を親株として得られる変異株であってもかまわない。
【００１３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を親株として得られる変異株としては、公知の変異処理を施された変異株を用いることができる。ここでいう公知の変異処理とは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を、必要であれば紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤を使用し、変異誘導処理し、それらの菌株からα-ガラクトシダーゼ活性が高い菌株を選ぶ処理のことである。変異誘導処理に用いる微生物としては、親株としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株を用いることが好ましい。
【００１４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株はそれぞれ、平成１８年１１月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。受託番号は以下の通りである。なお、AKC-004株は、２００８年（平成２０年）１月３０日に、受領番号ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８、及び受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９４８として国際寄託に移管されている。
AKC-003株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）
AKC-004株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２；ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８；ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９４８）
AKC-005株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）
AKC-006株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）
【００１５】
本発明のα−ガラクトシダーゼは、下記の特性を有する。
（１）作用：作用：本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【００１６】
本発明の酵素の具体例としては、基質特異性及び金属イオンの影響として、以下の性質を有するものが挙げられる。
基質特異性：ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシドを基質とした場合、分解活性は最も高く、次いでメリビオース、次いでラフィノースの順である。一方、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド、ラクトース、スクロースは分解しない。
金属イオンの影響：カリウム、カルシウム、マグネシウム、クロム、マンガン、コバルト、鉄(II)、鉄(III)イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下は見られない。一方、ニッケル、亜鉛イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下が見られ、銅イオンを添加した場合に最も活性が低下する。
【００１７】
さらに本発明の酵素の具体例としては、下記の特性を有するものでもよい。
（５）（正反応の）至適温度範囲：35〜50℃
（６）安定温度範囲：45℃まで安定である。
【００１８】
本発明に用いる微生物の培養方法としては、通常の通気攪拌培養あるいは固体培養が用いられ、一般的に行われている微生物の培養方法が適応できる。培地としては、当該微生物が良好に生育し且つ、微生物中のα−ガラクトシダーゼを順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセロール、スクロース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、セロビオース、エルロース、有機酸、澱粉、オリーブ油、大豆油等を用いることができる。窒素源としては、例えば、硫安、硝安、尿素、アミノ酸、アミン類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、コーンスティープリカー、および大豆粕等があげられる。また、無機塩類としては、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。微生物の生育性の点から、培養温度は２５〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃、さらに好ましくは４０〜５５℃である。また、培地のｐＨは広範囲で選択可能であり、微生物の生育性の点からｐＨ３．０〜９．０が好ましく、より好ましくはｐＨ３．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ４．０〜８．０である。
【００１９】
本発明のα−ガラクトシダーゼの分離・精製は、例えば以下のようにして実施することができる。
【００２０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。こうして得られた菌体にはα−ガラクトシダーゼが含まれており、リゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いて菌体の破砕を行うことでα−ガラクトシダーゼの粗抽出液を得る。培養条件等により、α−ガラクトシダーゼの活性が培養上清に含まれる場合、培養上清をそのまま、または濃縮等の操作を加え、α−ガラクトシダーゼの粗抽出液として次の精製に用いることもできる。
【００２１】
上記のようにして得られる粗抽出液を、通常のタンパクの精製法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、塩析等を組み合わせて分画することによって、α−ガラクトシダーゼを精製することができる。
【００２２】
上記の操作の順は特に問わず、各操作は１回、または２回以上行ってもよい。また、それぞれのカラムに試料を通液する前に、透析等によって試料液を適当な緩衝液に交換しておくことが望ましい。さらにそれぞれの段階で試料液を濃縮しても良い。
【００２３】
精製の各段階においては、分画された各フラクション中に含まれるα−ガラクトシダーゼ活性を測定し、活性の高いフラクションを集めて次の段階に供試することが望ましい。
【００２４】
α−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５０μＬに酵素液１５０μＬを混合し、４０℃で５〜３０分間程度反応させた後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液１ｍＬに添加して酵素を失活させ、反応を停止する。得られた溶液の着色度を波長４２０ｎｍの吸収を測定し、各濃度のｐ−ニトロフェノールで作製した検量線を用いて濃度を算出する。また、酵素活性の単位は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして表示する。
【００２５】
精製されたα−ガラクトシダーゼの精製度の確認や分子量の測定は、電気泳動やゲル濾過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素学的性質は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定し、あるいは種々の酵素阻害剤や金属イオン等を反応液に添加し、残存活性を測定することによって検討すればよい。さらにα−ガラクトシダーゼを種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。また、基質濃度を変化させて反応を行うことで、各基質に対するα−ガラクトシダーゼのミカエリス定数 （Ｋm）、最大速度（Ｖmax）を求めることもできる。
【００２６】
本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の取得は、例えば以下のように行うことができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。
上記のようにして得られた菌体についてリゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いた菌体の破砕を行い、染色体ＤＮＡを単離する。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片を得る。
【００２７】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡ断片を用いて、ショットガンクローニングやインバースＰＣＲ法等を利用した公知の手段によりα−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長、またはその一部を含むＤＮＡ断片を取得する。ここで得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサー等を利用した公知の方法で解析し、その塩基配列を明らかにする。また、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の部分的な塩基配列のみが明らかになった場合、その塩基配列を基に再度α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することもできる。また、この操作を繰り返すことで、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長の塩基配列を明らかにすることも可能である。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を基に、ＰＣＲ法や制限酵素を用いた公知の方法によって、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列から、α−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を決定することができる。
【００２８】
配列番号２に本発明で用いることができるα−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がα-ガラクトシダーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよく、あるいは当該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。即ち、本発明で用いることができるα−ガラクトシダーゼの具体例としては、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを挙げることができる。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００２９】
上記のα−ガラクトシダーゼは、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いて遺伝子組み換えの手法により製造してもよい。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００３０】
上記（ｂ）における「１又は数個のアミノ酸」とは、一般的には１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸を意味する。
【００３１】
上記（ｃ）における「６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、一般的には、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
α−ガラクトシダーゼ遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を挙げることができる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００３３】
上記（ｂ）における「１又は数個の塩基」とは、一般的には１〜１５０個の塩基、好ましくは１〜９０個の塩基、より好ましくは１〜６０個の塩基、さらに好ましくは１〜３０個の塩基、さらに好ましくは１〜２０個の塩基、さらに好ましくは１〜１５個の塩基、さらに好ましくは１〜１０個の塩基、特に好ましくは１〜５個の塩基を意味する。
【００３４】
α−ガラクトシダーゼ遺伝子は公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体遺伝子は、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。即ち、α−ガラクトシダーゼ中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。
【００３５】
上記のようにして得られたα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を完全に含むＤＮＡ断片を大腸菌用発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ（＋）のマルチクローニングサイトに挿入、連結して、新たな組換えプラスミドを構築することができる。このプラスミドベクターは大腸菌内で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に発現できるｌａｃプロモーターが導入されており、組換えプラスミドを大腸菌に導入して得られる形質転換体を培養することでα−ガラクトシダーゼの大量発現が可能になる。
【００３６】
また、上記以外にも種々の宿主微生物、ベクターを利用したα−ガラクトシダーゼの大量発現は可能であり、例えばＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓの形質転換体を培養することで、α−ガラクトシダーゼの大量発現が可能である。より詳細には、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ-３ａ、ｐＥＴ-１１ａ、ｐＥＴ-３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させて本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを目的のベクターに組み込むことができる。
【００３７】
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。また、微生物宿主がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
【００３８】
また、形質転換微生物により本発明のα−ガラクトシダーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内または培養液中に本発明のα−ガラクトシダーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤などを添加して本発明のα−ガラクトシダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い本発明のα−ガラクトシダーゼを得ることができる。
【００３９】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。培養温度は微生物が発育し、本発明のα−ガラクトシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは、１０から４５℃程度、さらに好ましくは２０から３０℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、本発明のα−ガラクトシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、本発明のα−ガラクトシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００４０】
本発明によれば、前述の酵素を用いるに際しては、本発明の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物を用いてもよい。
【００４１】
本発明においては、上記したα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物を用いてもよい。上記酵素組成物には、例えば、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも１種以上の成分をさらに含有せしめることができる。
【００４２】
本発明において微生物触媒としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株のほかに、上記形質転換体を用いることができる。本発明においてメリビオース製造に利用する微生物触媒としては通常行われる培養方法によって得られる微生物そのものを利用することができ、α−ガラクトシダーゼを微生物から精製する必要はない。また、場合によっては、微生物培養液、微生物培養上清を利用することもできる。一方、培養法により得られた微生物は必要に応じて、水や緩衝液等で洗浄した後、利用することもできる。例えば、培養した微生物の培養液、または遠心分離、バッファーによる洗浄等により得た微生物懸濁液、微生物または微生物の処理物(例えば微生物の破砕物等)を懸濁または溶解させた水溶液、あるいは微生物または微生物処理物を包括法、架橋法、又は担体結合法によって固定化したものを用いることができる。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明によれば、上記した本発明のα−ガラクトシダーゼを用いたメリビオースの製造方法が提供される。原料としては、例えばグルコース及びガラクト−スを用いることができる。原料としてグルコースとガラクト−スを利用する際には例えば、α−ガラクトシダーゼによる脱水縮合反応を利用する性質上、原料濃度は高い方が好ましいが、ガラクトース濃度が高くなりすぎるとガラクトース分子間の縮合によりグルコースとガラクトース間の脱水縮合反応が抑制されるため好ましくない。グルコース濃度は３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。ガラクトース濃度は２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは、５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。
【００４４】
本発明のα−ガラクトシダーゼを用いてメリビオースを製造する際の反応温度は、１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。反応温度が１０℃未満である場合、反応速度が極めて小さく、９０℃を超える温度領域では酵素活性の失活が早く大量の酵素を要するため好ましくない。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ３．０〜７．５、さらに好ましくは３．５〜６．０である。反応ｐＨが２．０未満、あるいは１０．０より大きい場合、酵素の失活が著しく早くなるため好ましくない。反応時間は酵素の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分〜２００時間、より好ましくは、６〜８０時間である。しかしながら、本発明は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
【００４５】
本発明においては、生成オリゴ糖中のメリビオース含有率を５０％以上に向上することができ、より好ましい条件では７０％以上に向上することができる。メリビオース含有率が低い場合、生成物からのメリビオースの精製が著しく困難となるだけでなく、基質であるグルコースあるいはガラクトースの無駄な消費も重大な問題となる。
【００４６】
本発明において得られる生成オリゴ糖中のメリビオース含有率は以下の方法により測定される。
[生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率の測定方法]
グルコースとガラクトースを原料としたα−ガラクトオリゴ糖合成反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、さらに糖合成液を２０倍希釈し、イオンクロマト分析により、メリビオース蓄積濃度％（ｗ／ｖ）を算出した。また、反応停止後の糖合成液を２倍希釈して、ＨＰＬＣ分析を行い、全二糖蓄積濃度を算出した。イオンクロマト分析には、Ｃａｒｂｐａｃ ＰＡ１カラム（ダイオネクス社製）を用い、カラム温度３５℃、流量１ｍＬ／ｍｉｎ．で行った。検出器には、パルスドアンペロメトリ検出器を用いた。溶離液としては、水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を利用し、０−２０分、２０−４０分、４０−４５分の各々の段階で水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液の比率が４９／５０／１、３０／５０／２０、０／１００／０となるようなグラジエント条件で行った。ＨＰＬＣ分析には、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＣＬＧガードカラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＣ１０１１カラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラム（昭和電工社製）を連結して使用し、カラム温度８０℃、流量０．６ｍＬ／ｍｉｎ．、ＲＩ検出器で行った。溶離液には蒸留水を使用した。生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率（％）はメリビオース蓄積濃度／全二糖蓄積濃度×１００により算出した。
【００４７】
本発明の方法により製造されるメリビオースを精製、分離する方法としては、一般的に用いられている精製処理方法を利用することができる。すなわち、例えば、遠心分離、ＭＦ膜やＵＦ膜等による膜処理、フィルタープレス等により微生物触媒を除き、陽イオン交換クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマト処理や透析等の脱塩処理により緩衝液や培地等から持ち込まれる塩類等を除去し、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や溶解度の差等を利用した結晶化処理、その他の常法に従ってラフィノースを分離、精製することができる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良く、移動層方式や擬似移動層方式、多成分分離擬似移動層方式、多成分分離循環方式等を適宜利用することができる。これらのメリビオースの精製、分離処理方法は、バッチ式で行っても良いしカラムを利用するなどして連続的に行っても良い。
【００４８】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８に移管）：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、1日間培養してコロニーを形成させた。
【００５０】
ｐＨ７．２に調整した表１に示す培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、５０℃で、２５時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これをジャー培養のシードとした。
【００５１】
【表１】
【００５２】
次に、ｐＨ７．２に調整した表１に示す培地６Ｌを１０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記のジャー培養のシード１５ｍＬを移植し、５０℃で、４８時間、２００ｒｐｍ、０．２ｖｖｍで通気攪拌培養を行った。
【００５３】
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。得られた菌体のα−ガラクトシダーゼの活性を測定した結果、２６１Ｕであった。
【００５４】
この菌体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコースを含むＬｙｓｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し１５０ｍＬにした。この懸濁液を４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
【００５５】
Ｌｙｓｉｓ緩衝液で洗浄後の菌体を上記Ｌｙｓｉｓ緩衝液に再度懸濁し、１５０ｍＬとした。これに０．０２％のリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製 卵白由来）を添加して、３７℃で、１３時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
【００５６】
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。
【００５７】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて３７．５％飽和とし、４℃で一夜放置して沈殿を生じさせた。この沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
【００５８】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて５４．５％飽和とし、４℃で一夜放置して沈殿を生じさせた。この沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して回収し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ、４℃で、一夜、上記と同じリン酸緩衝液に対して透析した。
【００５９】
透析により得られた上清を、前記と同じリン酸バッファーで平衡化した「ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００６０】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、２Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ （ｈｉｇｈ ｓｕｂ）」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、２．０〜０Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００６１】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した「ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００６２】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸バッファーで平衡化した「ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
【００６３】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製α−ガラクトシダーゼとした。活性収率は１５％で、活性は２７０Ｕ／ｍＬであった。
【００６４】
実施例２
実施例１で得られた精製α−ガラクトシダーゼを用いて、その作用に関する実験を行った。
【００６５】
（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液に溶解させた６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド１５０μＬに、１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で５分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図１に示す。なお、使用した緩衝液は、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５〜３．５）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．５）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）である。
【００６６】
（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で１０ｍＭの緩衝液を用いて、各ｐＨで４５℃、１４０分間の加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図２に示す。なお、使用した各ｐＨの緩衝液の種類は前記のものと同様である。
【００６７】
（３）至適温度範囲
ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた４．７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド１９０μＬに、２０倍希釈した本発明の精製酵素液１０μＬを混合し、２０〜６０℃の範囲で５分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図３に示す。
【００６８】
（４）安定温度範囲
ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、３０〜５５℃の各温度で２０分間加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図４に示す。
【００６９】
（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めた。この結果を図５に示す。分子量は約８０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量８３，１２２とほぼ一致した。
【００７０】
（７）基質特異性
１０ｍＭの各種基質を含むｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１５０μＬに１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で２０分間反応させた。ただし、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質に用いた反応では、反応時間を５分間とした。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールの定量、あるいは「Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ」（昭和電工株式会社）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる分析から分解された基質の定量を行い、最大活性を１００とした各基質に対する相対活性を求めた。この結果を表２に示す。また、そのなかで基質となり得たものについて、反応速度を測定した結果を表３に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
（８）阻害因子
ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに各種金属イオンを終濃度１ｍＭとなるように添加して１５０μＬとし、１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で２０分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を表４に示す。
【００７４】
【表４】
【００７５】
実施例３
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株の染色体ＤＮＡを調製した。実施例１記載の方法で取得したＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株の培養液６０ｍＬを、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１ｍｇの染色体ＤＮＡを調製した。
【００７６】
（２）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡから、α−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計、合成した。プライマーの設計は公知の数種の微生物由来α−ガラクトシダーゼ遺伝子のアライメント結果を基に行い、センスプライマーは5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'（配列番号３）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3' （配列番号４）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。なお、配列中、Iはイノシン、YはC又はT、RはA又はGを示す。ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の増幅を行い、３８０塩基対からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を取得した。ここで得られた遺伝子断片の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーを用いて解析した。
【００７７】
解析の結果得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の塩基配列をもとに、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を取得するために、インバースＰＣＲ用ＰＣＲプライマーを設計、合成した。センスプライマーは5'-TGATCAACAACTGGGAAAGCGACCT-3' （配列番号５）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-GAACTGGTCCTGCTGCACAATTCC-3' （配列番号６）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。次に、インバースＰＣＲに用いる鋳型を調製した。上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化した後、得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化し、インバースＰＣＲの鋳型とした。この鋳型に対し、上記のように合成したインバースＰＣＲ用プライマーを用いて、ＰＣＲ法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行い、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全配列を含む４５００塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
【００７８】
（３）塩基配列の解析
ＤＮＡシークエンサーを用いて、（２）で得られたＰＣＲ産物からα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号２に示す５’末端からのＤＮＡ塩基配列を有する２１９０塩基対のα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を解読した。この配列はこれまで見出されていない新規な遺伝子であった。また、このＤＮＡ塩基配列より類推されるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株が生産するα−ガラクトシダーゼは７３０個のアミノ酸からなり、配列番号２に示すようなＮ末端からのアミノ酸配列を有していた。データベース検索の結果、このアミノ酸配列はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＮ）と５７％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＡ）と５６％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＢ）と５６％、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ由来α−ガラクトシダーゼと５６％の相同性を有し、新規なα−ガラクトシダーゼをコードしていることが明らかになった。
【００７９】
（４）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
（３）で得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を基に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のＳＤ配列、構造遺伝子、終始コドンを含む領域を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計・合成した。ＰＣＲプライマーの設計は（２）で得られた４５００塩基対からなるＰＣＲ産物の塩基配列を基に行い、センスプライマーは5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3' （配列番号７）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3' （配列番号８）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。（２）で得られた４５００塩基対からなるＰＣＲ産物を鋳型として、合成したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行い、２３２５塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。ここで得られたＰＣＲ産物を平滑末端化、リン酸化した。
【００８０】
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後に脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ（＋）ベクターに、上記で得られた平滑末端化、リン酸化したＰＣＲ産物を連結し、新たなプラスミドベクターｐＢｌｕｅ／ａｇａＡを構築した。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｌａｃプロモーターが導入されており、α−ガラクトシダーゼを効率的に発現・製造させることができる。得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
【００８１】
（５）形質転換体の培養及びα−ガラクトシダーゼの発現
（４）で作製した組換え大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢｌｕｅ／ａｇａＡを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む３０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で２４時間、振盪培養した。培養後、組換え大腸菌を遠心分離して回収した。菌体は１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。この破砕液のα−ガラクトシダーゼ活性を、前記の方法で測定したところ、１９．９Ｕ／培養液（ｍＬ）であった。
【００８２】
実施例４
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２５３：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート (ＤＩＦＣＯ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表１に示した培地 １００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５０℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。
【００８３】
本培養２８時間後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース８０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始２８３時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析した結果を図６に、ＨＰＬＣ分析した結果を図７に示した。メリビオース糖蓄積濃度は１．７９％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は７２．８％であった。
【００８４】
実施例５
実施例３記載の組換え体培養液１０ｍL分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース８０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析およびＨＰＬＣ分析した結果、メリビオース糖蓄積濃度は３．２４％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は７６．４％であった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明を用いることにより、安価な基質を原料として用いて、煩雑な酵素精製工程を行わずに、選択的にメリビオースを製造できるメリビオースの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの至適ｐＨ範囲（実施例２）を示す。
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの安定ｐＨ範囲（実施例２）を示す。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの至適温度範囲（実施例２）を示す。
【図４】図４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの安定温度範囲（実施例２）を示す。
【図５】図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例２）の結果を示す。
【図６】図６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４を用いた糖合成反応（実施例４）の反応液をイオンクロマト分析したリテンションタイム０〜２０分の結果を示す。
【図７】図７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４を用いた糖合成反応（実施例４）の反応液をＨＰＬＣ分析したリテンションタイム０〜４５分の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
【請求項２】
α−ガラクトシダーゼが下記の特性を有する請求項１に記載のメリビオースの製造方法。
（１）作用：本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【請求項３】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項５】
α−ガラクトシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）、あるいはＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）を親株として得られる変異株由来のものである、請求項１から４の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
【請求項２】
α−ガラクトシダーゼが下記の特性を有する請求項１に記載のメリビオースの製造方法。
（１）作用：本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【請求項３】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項５】
α−ガラクトシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）、あるいはＡＫＣ−００３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９１）、ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４８）、ＡＫＣ−００５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９３）、又はＡＫＣ−００６株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０９４）を親株として得られる変異株由来のものである、請求項１から４の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２０７４５２（Ｐ２００９−２０７４５２Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５７６２（Ｐ２００８−５５７６２）
【出願日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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