ＣＢＨ１相同体及び変異体ＣＢＨ１セルラーゼ
【課題】セロビオヒドロラーゼＩ相同体及び変異体の提供。
【解決手段】ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ Ｃｅｌ７Ａ（元はトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩまたはＣＢＨ１）の多数の相同体及び変異体、これらをエンコードする単離核酸、及びこれらを生成する方法。当該相同体及び変異体セルラーゼはファミリー７Ａのグリコシル加水分解酵素のアミノ酸配列を有し、１以上のアミノ酸残基が置換及び／または欠失されている。
【解決手段】ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ Ｃｅｌ７Ａ（元はトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩまたはＣＢＨ１）の多数の相同体及び変異体、これらをエンコードする単離核酸、及びこれらを生成する方法。当該相同体及び変異体セルラーゼはファミリー７Ａのグリコシル加水分解酵素のアミノ酸配列を有し、１以上のアミノ酸残基が置換及び／または欠失されている。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００３年３月２１日に出願された米国仮出願番号６０／４５６，３６８号（代理人整理番号、ＧＣ７９３Ｐ）及び２００３年３月２７日に出願された米国仮出願番号６０／４５８，６９６号（代理人整理番号、ＧＣ７９３−２Ｐ）に基づく優先権を主張するものであり、これらすべてをここに引用する。
【０００２】
連邦政府後援による研究開発のもと行われた発明に対する権利に関する陳述
この研究の一部は、米国エネルギー省の元契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７の下、再生可能エネルギー研究所の下請け番号ＺＣＯ−０−３００１７−０１により資金援助されたものである。従って、米国政府は本発明における特定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明はヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）ｊｅｃｏｒｉｎａ（トリコデルマ・リーゼイ）ＣＢＨ１の相同体及び変異体に関する。本発明はセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをエンコードする単離核酸配列に関する。また、本発明は当該核酸配列を含む核酸構築体、ベクター、及び宿主細胞、並びに組換え変異体ＣＢＨポリペプチド及び新規なＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の相同体を生成する方法に関する。
【表１】
【０００４】
発明の背景
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生成される最も豊富な植物材料である。これらは、細菌、酵母及び真菌などの多数の微生物により分解及びエネルギー源として使用でき、これらの微生物はポリマー基質を単糖類に加水分解できる細胞外酵素を生成する（Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、２００１）。非再生材料源の限界が近づいているため、セルロースが主な再生可能エネルギー源となる可能性は非常に大きい（Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．、２００１）。生物プロセスを通じたセルロースの効果的な活用は食料、飼料及び燃料不足の克服手段のひとつである（Ｏｈｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。
【０００５】
セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成を生じる酵素である。セルラーゼは従来から３つの主な分類に分けられる：エンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）、及びβ−グルコシダーゼ（［β］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｓｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。エンドグルカナーゼは主にセルロース繊維のアモルファス部分で作用するのに対し、セロビオヒドロラーゼは結晶セルロースを分解することもできる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ ａｎｄ Ｐｅｎｔｔｉｌａ、１９９５）。従って、結晶セルロースを効果的に可溶化するために、セルラーゼ系中にセロビオヒドロラーゼの存在が必要である（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、ｅｔ ａｌ．２０００）。β−グルコシダーゼはセロビース、セロ−オリゴ糖、及びその他のグルコシド由来Ｄ−グルコース単位の遊離に作用する（Ｆｒｅｅｒ、１９９３）。
【０００６】
セルラーゼは大量の細菌、酵母及び真菌により生成されることが知られる。特定の真菌はセルロース結晶を分解できる完全なセルラーゼ系を生成し、発酵により大量のセルラーゼが容易に生成される。サッカロミセス・セレビシェなど多くの酵母がセルロースの加水分解能を有さないので、糸状菌は特別な役割を担う。例えば、Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、１９８８及びＣｏｕｇｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。
【０００７】
ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの真菌セルラーゼ分類はさらに、各分類内で複数の構成に拡大できる。例えば、複数のＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧは、２つのＣＢＨ（すなわち、ＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩ）、少なくとも８つのＥＧ（すなわち、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩ、ＥＧＩＶ、ＥＧＶ、ＥＧＶＩ、ＥＧＶＩＩ、及びＥＧＶＩＩＩ）及び少なくとも５つのＢＧ（すなわち、ＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４、及びＢＧ５）に関する公知遺伝子を含むトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの多数の真菌源から単離される。
【０００８】
結晶セルロースをグルコースに効果的に変換するためには、結晶セルロースの加水分解にほとんど効果がない単離成分とともに、ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの各分類由来の成分を含む完全なセルラーゼ系が必要である（Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．、１９９６）。それぞれの分類由来のセルラーゼ成分間で相乗関係が観測されている。特に、ＥＧ型セルラーゼ及びＣＢＨ型セルラーゼは相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解する。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５を参照されたい。
【０００９】
セルラーゼは洗剤組成物の洗浄能力を高めるため、柔軟剤としての使用のため、綿織物の手触り及び外観を向上させるため等の使用で、織物処理に有用であることが当業界で公知である（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。
【００１０】
改善された洗浄性能を有するセルラーゼ含有洗剤組成物（米国特許第４，４３５，３０７号；ＧＢ出願番号第２，０９５，２７５号及び第２，０９４，８２６号）及び織物の手触り及び外観を改善させるための織物処理での使用（米国特許第５，６４８，２６３号、第５，６９１，１７８号及び第５，７７６，７５７号；ＧＢ出願番号第１，３５８，５９９号；Ｔｈｅ Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｐｏｒｔ、第２４巻、第５４〜６１頁、１９８６）が開示されている。
【００１１】
従って、真菌及び細菌内で生成されるセルラーゼは著しい注目を集めている。特に、トリコデルマ種の発酵（例えば、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）またはトリコデルマ・リーゼイ）は結晶形態のセルロースを分解できる完全なセルラーゼ系を生成することが示されている。
【００１２】
セルラーゼ組成物については従来から開示されているが、家庭用洗剤、ストーンウォッシュ組成物または洗濯用洗剤等に使用するための新規で改善されたセルラーゼ組成物の必要性が依然としてある。改善された性能を示すセルラーゼは特に関心が高い。
【００１３】
発明の概要
本発明は、ここで所望のセルラーゼとして同定される、単離セルラーゼタンパク質、及び当該所望のセルラーゼをエンコードする核酸を提供する。当該所望のセルラーゼは、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来の変異体ＣＢＨ１、及びヒポクレア・シュワイニッチィ（ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）、ヒポクレア・オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、トリコデルマ・プソイドコニンギー（ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）またはトリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ由来の新規なＣＢＨ１からなる群より選択できる。
【００１４】
変異体ＣＢＨ１セルラーゼを提供し、ここで当該変異体は、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＣＢＨ１における１以上の残基Ｌ６、Ｓ８、Ｐ１３、Ｑ１７、Ｇ２２、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｔ４１、Ｓ４７、Ｎ４９、Ｔ５９、Ｔ６６、Ａ６８、Ｃ７１、Ａ７７、Ｇ８８、Ｎ８９、Ａ１００、Ｎ１０３、Ａ１１２、Ｓ１１３、Ｌ１２５、Ｔ１６０、Ｙ１７１、Ｑ１８６、Ｅ１９３、Ｓ１９５、Ｃ２１０、Ｍ２１３、Ｌ２２５、Ｔ２２６、Ｐ２２７、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｔ２４６、Ｄ２４９、Ｎ２５０、Ｒ２５１、Ｙ２５２、Ｄ２５７、Ｄ２５９、Ｓ２７８、Ｔ２８１、Ｌ２８８、Ｅ２９５、Ｔ２９６、Ｓ２９７、Ａ２９９、Ｎ３０１、Ｆ３１１、Ｌ３１８、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ａ３３６、Ｓ３４１、Ｓ３４２、Ｆ３５２、Ｋ３５４、Ｔ３５６、Ｇ３５９、Ｄ３６８、Ｙ３７１、Ｎ３７３、Ｔ３８０、Ｙ３８１、Ｎ３８４、Ｖ３９３、Ｒ３９４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、Ｆ４１８、Ｇ４３０、Ｎ４３６、Ｇ４４０、Ｐ４４３、Ｔ４４５、Ｙ４６６、Ｔ４７８、Ａ４８１及び／またはＮ４９０に対応する位置に置換または欠失を含む。
【００１５】
第２の側面において、変異体ＣＢＨ１は１以上の残基Ｑ１８６（Ｅ）、Ｓ１９５（Ａ／Ｅ）、Ｅ２３９Ｓ、Ｇ２４２（Ｈ／Ｙ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ａ）、Ｄ２４９（Ｋ／Ｌ／Ｙ／Ｃ／Ｉ／Ｖ／Ｗ／Ｔ／Ｎ／Ｍ）、Ｅ３２５（Ｓ／Ｔ）、Ｔ３３２（Ａ／Ｈ／Ｙ／Ｌ／Ｋ）及びＰ４１２（Ｔ／Ｓ／Ａ）に対応する位置に置換を有する。
【００１６】
第２の実施態様において、本発明はヒポクレア・オリエンタリスＣＢＨ１を提供する。
【００１７】
第３の実施態様において、本発明はヒポクレア・シュワイニッチィＣＢＨ１を提供する。
【００１８】
第４の実施態様において、本発明はトリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａＣＢＨ１を提供する。
【００１９】
第５の実施態様において、本発明はトリコデルマ・プソイドコニンギーＣＢＨ１を提供する。
【００２０】
本発明の他の実施態様において、本発明の所望のセルラーゼをエンコードする核酸を提供する。他の実施態様において、ＤＮＡはベクター内に含まれる。さらに他の実施態様において、ベクターは宿主細胞を形質転換するために用いる。
【００２１】
本発明の他の実施態様において、本発明の所望のセルラーゼを生成する方法を提供する。該方法は所望のセルラーゼをエンコードする核酸で形質転換した宿主細胞を適当な培養基中、適当な条件下で培養して、所望のセルラーゼを生成する工程、及び生成された所望のセルラーゼを回収する工程を含む。
【００２２】
本発明のさらに他の実施態様において、界面活性剤及び所望のセルラーゼを含む洗剤を提供する。本発明の１の側面において、該洗剤は洗濯または食器用洗剤である。本発明の第２の側面において、所望のＣＢＨ１セルラーゼをセルロース含有織物、特にストーンウォッシュまたはインディゴ染色デニムの処理に用いる。もしくは本発明のセルラーゼは飼料添加剤として、木材パルプ処理、及びバイオマスからグルコースへの還元に用いることができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、参照目的のみにより以下の定義及び実施例を用いて詳細を説明する。ここに引用する全ての特許及び文献は、当該特許及び文献内に開示される全ての配列も含めて、明示的にここに引用するものとする。
【００２４】
特段に示す場合を除いて、ここで用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する当業者にとって理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学及び分子生物学の辞典）、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は当業者に本発明で用いる多くの用語の一般的な辞書を提供するものである。ここに記載の方法及び物質に類似または同等のいかなる方法及び物質も本発明を実施及び試験する際に用いることができるが、好ましい方法及び物質を記載する。数値範囲は範囲を定める数字を含める。別に示す場合を除いて、それぞれ核酸は左から右に５’〜３’方向；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。実務者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、１９９３を当業界の定義及び用語のために参照できる。本発明は記載された特定の方法、手順及び試薬に限定されないことは、これらが種々多様であることから当然に理解される。
【００２５】
ここに提供する表題は、明細書全体を参照することにより得られる本発明の種々の側面または実施態様を限定するものではない。従って、下記に定義する用語は明細書全体を参照することによりさらに十分に定義される。
【００２６】
ここに引用する全ての文献は、本発明に関連し得る組成物及び方法を記載及び開示する目的のため参照することによりここに明示的に引用する。
【００２７】
Ｉ．定義
“セルラーゼ”、“セルロース分解酵素” “セルラーゼ酵素”は細菌性または真菌性エキソグルカナーゼまたはエキソセロビオヒドロラーゼ、及び／またはエンドグルカナーゼ、及び／またはβ−グルコシダーゼを意味する。これらの３つの異なる種類のセルラーゼ酵素はセルロース及びその誘導体をグルコースに変換するために相乗的に作用する。
【００２８】
多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を生成し、例えば木材腐朽菌トリコデルマ、土壌細菌Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、バチルス、及びセルロモナス；ストレプトマイセス；及び真菌フミコーラ、アルペルギルス及びフサリウムなどがある。これらの微生物から作られる酵素は、セルロースをグルコースに変換するのに有用な３種の作用を有するタンパク質の混合物：すなわち、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼである。
【００２９】
ここで用いる“所望のセルラーゼ”とは以下のいずれか１つを意味する：
ａ）本発明に従うヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来の変異体ＣＢＨ１；
ｂ）Ｈ．オリエンタリス由来のＣＢＨ１相同体；
ｃ）Ｈ．シュワイニッチィ由来のＣＢＨ１相同体；
ｄ）Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ由来のＣＢＨ１相同体；
ｅ）Ｔ．プソイドコニンギー由来のＣＢＨ１相同体、及び
ｆ）ストリンジェントな条件下でａ−ｅのいずれか１つをエンコードする核酸とハイブリダイズする核酸によりエンコードされるポリペプチド。
【００３０】
ここで用いる“所望のセルラーゼ−エンコード核酸”は以下のいずれか１つを意味する：
ａ）本発明に従うヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来の変異体ＣＢＨ１をエンコードする核酸；
ｂ）図３に示す配列を有するＨ．オリエンタリス由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸；
ｃ）図５に示す配列を有するＨ．シュワイニッチィ由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸；
ｄ）図７に示す配列を有するＴ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸；
ｅ）図９に示す配列を有するＴ．プソイドコニンギー由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸、及び
ｆ）ストリンジェントな条件下で上述のａ−ｅのいずれか１つにより提供される核酸のいずれか１つとハイブリダイズする核酸。
【００３１】
“変異体”とは、アミノ酸配列において１以上の異なる部位で１以上のアミノ酸が置換した前駆体タンパク質（例えば、天然タンパク質）由来のタンパク質を意味する。酵素変異体の調製は、好ましくは天然タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を修飾し、該ＤＮＡ配列を適当な宿主内に形質転換し、及び該修飾ＤＮＡ配列を発現させて、誘導体酵素または酵素変異体を形成することにより達成する。本発明の変異体ＣＢＨ１酵素は前駆体酵素アミノ酸配列と比較して変異したアミノ酸配列を含むペプチドを含み、変異体ＣＢＨ１酵素は前駆体酵素の特徴的なセルロース分解性は保持するが、特定の側面において変異特性を有し得る。例えば、変異体ＣＢＨ１酵素は増加したｐＨ最適条件または増加した温度または酸化安定性を有し得るが、特徴的なセルロース分解活性は保持する。
【００３２】
ここで用いる“遺伝子”の語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、コード領域の先行及び後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または“リーダー”配列及び３’ＵＴＲまたは“トレーラー”配列、及び個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）などを含んでも含まなくてもよい。
【００３３】
本発明の“糸状菌”は真核微生物であり、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ細目の全ての糸状形態を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（入門菌類学），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙを参照）。これらの真菌はキチン、セルロース及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、及び遺伝学的に酵母とはっきりと区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、Ｓ．セレビシェなどの酵母による栄養増殖は単細胞性葉状体の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。Ｓ．セレビシェは突出した、非常に安定な複相を有し、一方、複相は、例えばアスペルギルス及びニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）など糸状菌における減数分裂前のごく短期間だけに存在する。特定条件下で酵母は偽菌糸成長を示すが、このことにより酵母が糸状菌の定義内に入るということにはならないことが理解される。Ｓ．セレビシェは１７の染色体を有し、一方、Ａ．ニデュランス及びアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）はそれぞれ８及び７の染色体を有する。Ｓ．セレビシェと糸状菌間のさらなる違いとして、Ｓ．セレビシェはアスペルギルス及びトリコデルマ・イントロンを処理できず、糸状菌の多くの転写制御因子を認識できない（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．他．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，２１−２６）。
【００３４】
核酸の一部に言及して用いる“異種”の語は、当該核酸が、通常は同じ関係において天然では見られない２以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、当該核酸は通常、遺伝子組換えにより生成し、例えば新しい機能的核酸を作るために配置した関連性のない遺伝子から２以上の配列を有し、例えば、１の供給源からプロモーターを有し、他の供給源からコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は同じ関係でお互いに天然では見られない２以上のサブ配列をいうことも多い（例えば、融合タンパク質）。
【００３５】
“異種”核酸構築体または配列は、発現する細胞に天然ではない配列の一部を有する。制御配列に関して異種とは、発現が目下調節している同じ遺伝子を調節するために天然では機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）をいう。通常、異種核酸配列はそれが存在する細胞またはゲノムの一部に内生のものではなく、挿入、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等により細胞に加えられたものである。“異種”核酸構築体は、天然細胞に見られる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同じまたは異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含む。
【００３６】
ここで用いる“単離”または“精製”の語は、天然に結合する少なくとも１の成分から除去された核酸またはアミノ酸をいう。
【００３７】
ここで用いる、“プロモーター”の語は下流遺伝子の転写に導くように作用する核酸配列をいう。プロモーターは通常、標的遺伝子が発現する宿主細胞に適したものである。プロモーターはその他の転写及び翻訳調節核酸配列（“制御配列”とも呼ぶ）と一緒に所定の遺伝子を発現するために必要である。通常、転写及び翻訳調節配列は、限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列及びエンハンサーまたは活性化配列を含む。
【００３８】
通常、“プロモーター配列”は発現のために特定の糸状菌に認識されるＤＮＡ配列である。“構造”プロモーターはほとんどの環境及び発育条件下で活性なプロモーターである。“誘導性”プロモーターは環境または発育調整下で活性なプロモーターである。本発明で有用な誘導性プロモーターの例は、ジェンバンクにアクセッション番号Ｄ８６２３５で寄託されているＴ．リーゼイ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｃｂｈ１プロモーターである。他の側面において、プロモーターはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のｃｂｈＩＩまたはキシラナーゼプロモーターである。
【００３９】
典型的なプロモーターは、Ａ．アワモリまたはＡ．ニガーグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．他（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２３０６−２３１５；Ｂｏｅｌ，Ｅ．他（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，１５８１−１５８５）、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ カルボキシル・プロテアーゼ遺伝子、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．他（１９８４）欧州特許出願番号第ＥＰＯ０１３７２８０Ａ１）由来のプロモーター、Ａ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，１４７０−１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７−４５）、Ａ．ニデュランスａｌｃＡ遺伝子（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．他（１９８６）Ｇｅｎｅ３３、１３７−１４９）、Ａ．ニデュランスｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．他（１９８６）Ｃｅｌｌ４６，１４３−１４７）、Ａ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．他（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，１４３０−１４３９）、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｘｌｎ１遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｃｂｈ２遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｅｇｌ１遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｅｇｌ２遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｅｇｌ３遺伝子、及びＳＶ４０早期プロモーターなどの高等真核プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．Ｌ．とＥ．Ｍｅｌｌｅｒ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，２１１７−２１３０）を含む。
【００４０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に位置する場合、“動作可能に連結”する。例えば、分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）をエンコードするＤＮＡ、すなわちシグナルペプチドは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に動作可能に連結し；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するために位置する場合、コード配列に動作可能に連結する。通常、“動作可能に連結する”とは、連結ＤＮＡ配列が隣接しており、及び分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位で連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド・アダプタまたはリンカーを従来実務に従って用いる。従って、“動作可能に連結”の語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、転写因子結合部位配列）と第２の核酸配列間の機能的結合をいい、発現制御配列は第２の配列に対応する核酸の転写を目的とする。
【００４１】
ここで定義する“キメラ遺伝子”または“異種核酸構築体”は、調節因子などを含む種々の遺伝子部分からなる非天然遺伝子（すなわち、宿主内に導入された遺伝子）をいう。宿主細胞を形質転換するためのキメラ遺伝子構築体は一般的に、異種タンパク質コード配列に動作可能に連結した、または選択マーカーキメラ遺伝子内で、形質転換細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をエンコードする選択マーカー遺伝子に動作可能に連結した転写調節領域（プロモーター）からなる。宿主細胞内への形質転換のため、本発明の一般的なキメラ遺伝子は、構造性または誘導性の転写調節領域、タンパク質コード配列、及びターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構築体は、標的タンパク質の分泌を望む場合、シグナルペプチドをエンコードする第２のＤＮＡ配列も含むことができる。
【００４２】
細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる“組換え体”の語は、該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の挿入により、または天然核酸またはタンパク質の変異により修飾されたこと、または該細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は当該細胞の天然（非組換え）型内では見られない遺伝子を発現し、または発現、または全く発現しない条件下で、通常は異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００４３】
“分泌シグナル配列”の語は、大ポリペプチドの構成要素として、ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路から当該大ポリペプチドに導かれるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をエンコードするＤＮＡ配列を示す。当該大ペプチドは普通は分割されて、分泌経路を通過する際に分泌ペプチドが取り除かれる。
【００４４】
ここで用いる、“セルラーゼ調製物全体”及び“セルラーゼ組成物全体”の語句は交換可能に用いられ、天然及び非天然組成物の両方をいう。“天然”組成物は天然源により生成した組成物であり、１以上のセロビオヒドロラーゼ型、１以上のエンドグルカナーゼ型、及び１以上のβ−グルコシダーゼ成分を含み、これらの各成分は供給源より生じた比率で見られる。天然組成物はセルロース分解酵素が非修飾の微生物から生成したものであり、従って当該成分酵素の比率は天然微生物により生成したものから変更されていない。
【００４５】
“非天然”組成物は、（１）天然比率または非天然、すなわち変更された比率で成分をセルロース分解酵素と混合；または（２）１以上のセルロース分解酵素を過剰発現または過少発現するように微生物を修飾；または（３）少なくとも１のセルロース分解酵素が欠失するように微生物を修飾することにより生成したこれらの組成物を包含する。
【００４６】
“同等残基”は前駆体セルラーゼの三次構造レベルで相同性を測定することにより定義することもでき、その三次構造はＸ線結晶法により測定される。同等残基は、セルラーゼ及びヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子の原子座標が配列後、０．１３ｎｍ以内、及び好ましくは０．１ｎｍである残基として定義される（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ及びＯ上のＯ）。配置は、最良モデルを配向及び位置して、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１に対する問題のセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大重複を得た後に達成される。最良モデルは利用可能な最も高い解像度において実験回折データの最も低いＲ因子を与える結晶学モデルである。
【式１】
【００４７】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の特定残基に機能的に類似した同等残基は、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の特定残基の特徴とする、それに起因したタンパク質構造、基質結合または触媒を変異、修飾または寄与するような立体構造を採用するセルラーゼアミノ酸として定義される。さらに、これらは、所定残基の主鎖原子は相同位置の占有に基づいて同等性基準を満たさないかもしれなが、当該残基の少なくとも２つの側鎖原子の原子座標がＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨの対応側鎖原子が０．１３ｎｍである範囲内において、類似位置を占有するセルラーゼの残基（三次構造はＸ線結晶法により得る）である。
【００４８】
“核酸分子”の語はＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子を含む。当然のことながら、遺伝コードの縮退の結果、ＣＢＨ１など所定タンパク質をエンコードする複数のヌクレオチド配列が生じ得る。本発明は、可能性のある全てのＣＢＨ１をエンコードする変異ヌクレオチド配列を意図するものであり、その全てが遺伝コードの縮退を生じ得る。
【００４９】
ここで用いる“ベクター”の語は、異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築体をいう。“発現ベクター”とは、外来細胞中に異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核及び真核発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
【００５０】
従って、“発現カセット”または“発現ベクター”は、標的細胞中で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定核酸要素を用いて、組換え技術により、または合成的に生成した核酸構築体である。組換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片内に組み込むことができる。一般的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。
【００５１】
ここで用いる“プラスミド”の語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体をいい、多くの細菌及びいくつかの真核性物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する。
【００５２】
ここで用いる“選択マーカーエンコードヌクレオチド配列”とは、細胞内で発現できるヌクレオチド配列をいい、ここで選択マーカーの発現により発現遺伝子を含む細胞は、対応する選択剤の存在下、または対応する選択成長条件下で成長できる能力が備わる。
【００５３】
通常、変異体ＣＢＨ１をエンコードする核酸分子は中から高ストリンジェンシー条件下でここに配列番号（天然Ｈ．ｈｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１）として提供する野生型配列にハイブリダイズする。しかしながら、場合によっては実質的に異なるコドン使用を有するＣＢＨ１エンコードヌクレオチド配列を用いこともあるが、ＣＢＨ１エンコードヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質は天然タンパク質と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コード配列は特定の原核または真核生物発現系内でのより速いＣＢＨ１発現を促進するために、宿主に利用される特定コドン頻度に従って修飾できる。Ｔｅ’ｏ、他（２０００）、は例えば、糸状菌内での遺伝子発現の最適化について記載している。
【００５４】
核酸配列は、２つの配列が特異的に中程度から高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でお互いにハイブリダイズする場合、対照核酸配列に“選択的にハイブリダイズ”すると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、“最大ストリンジェンシー”は通常、約Ｔｍ−５℃で起こり（プローブのＴｍより５℃低い）；“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５−１０℃低く；“中間”または“中ストリンジェンシー”はプローブのＴｍより約１０−２０℃低く；及び“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０−２５℃低い。機能的に、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密に同一またはほぼ厳密に同一な配列を同定するために用いることができ、高ストリンジェンシー条件はプローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために用いる。
【００５５】
中程度から高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当業界に公知である（例えば、明示的にここに引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、第９章及び１１章、及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３を参照）。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーション、及び続いて２Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中、室温で２回洗浄及びさらに０．１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、４２℃で２回洗浄を含む。
【００５６】
ここで用いる細胞に関する“形質転換”、“安定に形質転換された”または“トランスジェニック”の語は、細胞が、ゲノム内に統合された、または複数の世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして非天然（異種）核酸配列を有することを意味する。
【００５７】
ここで用いる“発現”の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
【００５８】
細胞への核酸配列の挿入に関する“導入”の語は“トランスフェクション”または“形質転換”または“形質導入”を意味し、原核または真核細胞内への核酸配列の組込みに関する場合を含み、ここで核酸配列は細胞のゲノム内（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれることができ、自己レプリコンに変換され、または一時的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００５９】
“所望のセルラーゼ発現”の語は所望のセルラーゼ遺伝子の転写及び翻訳、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセッシングポリペプチドの生成物ということになる。例として、ＣＢＨ１発現の分析は、ＣＢＨ１タンパク質のウエスタンブロット、ＣＢＨ１ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、及びＳｈｏｅｍａｋｅｒ Ｓ．Ｐ．及びＢｒｏｗｎ Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８，５２３：１３３−１４６）及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）に記載のエンドグルカナーゼ活性分析を含む。
【００６０】
“選択的スプライシング”の語は、複数のポリペプチドイソ型が１の遺伝子から生じるプロセスをいい、遺伝子の全部ではないがいくつかの転写処理中、非連続エキソンを一緒にスプライシングすることに関する。従って、特定のエキソンはメッセンジャーＲＮＡを形成するためにいくつかの選択的エキソンのいずれかひとつに結合することができる。選択的スプライスｍＲＮＡはポリペプチド（“スプライス変異体”）を生成し、共通する部分もあれば異なる部分もある。
【００６１】
“宿主細胞”の語はベクターを含み、複製及び／または転写または発現構築体の転写及び翻訳（発現）を助ける細胞を意味する。本発明で用いる宿主細胞は大腸菌などの原核細胞または酵母などの真核細胞、植物、昆虫、両生類または哺乳類細胞などの細胞である。通常、宿主細胞は糸状菌である。
【００６２】
“セルラーゼ”の語はセルロースポリマーをより短いセロ−オリゴ糖オリゴマー、セロビオース及び／またはグルコースに加水分解できる酵素分類をいう。多数のセルラーゼの例として、例えば、エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びグルコシダーゼは、セルロース分解性生物、特に真菌、植物及び細菌から得られる。
【００６３】
ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来ＣＢＨ１はグリコシル加水分解酵素群７（従って、Ｃｅｌ７）の一種であり、具体的には、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ中で最初に同定された当該群の種類である（従って、Ｃｅｌ７Ａ）。グリコシル加水分解酵素群７はエンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼ／エキソグルカナーゼの両方を含み、ＣＢＨ１は後者である。従って、ＣＢＨ１、ＣＢＨ−１型タンパク質及びＣｅｌ７セロビオヒドロラーゼは交換可能に用いることができる。
【００６４】
ここで用いる“セルロース結合ドメイン”の語は、セルラーゼのアミノ酸配列の一部をいい、またはセルラーゼまたはその誘導体のセルロース結合活性に関する酵素領域をいう。セルロース結合ドメインまたは各要素は通常、セルラーゼのセルロース、セルロース誘導体またはその他の多糖類同等物への非共有結合により作用する。セルロース結合ドメインは、触媒コア領域を構造的に区別することによりセルロース繊維の加水分解を促進または可能にし、通常、触媒コアの独立に作用する。従って、セルロース結合ドメインは触媒コアに起因する大きな加水分解活性は有さない。言いかえると、セルロース結合ドメインは、触媒活性を有する構造的因子から区別されるセルラーゼ酵素タンパク質三次構造の構造的因子である。
【００６５】
ここで用いる“界面活性剤”の語は、表面活性特性を有するものとして当業界で通常認識されている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性界面活性剤を含み、例えば洗剤において通常見られるものである。陰イオン性界面活性剤は、直鎖または分岐鎖アルキルベンゼンスルフォネート；直鎖または分岐鎖アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォネート；及びアルカンスルフォネートが挙げられる。両性界面活性剤は第４級アンモニウム塩スルフォネート及びベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。当該両性界面活性剤は同じ分子内に正及び負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤はポリオキシアルキレンエーテル及び高脂肪酸アルカノールアミドまたはその酸化アルキレン付加、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含むことができる。
【００６６】
ここで用いる“セルロース含有繊維”の語は、セルロースを含有する綿または非綿、またはセルロースブレンド、例えば天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、ジュート（黄麻）、亜麻布、ラミー、レーヨン及びリヨセル）を含有する綿または非綿から作られた任意の織布または不織布、糸または繊維をいう。
【００６７】
ここで用いる、“綿含有繊維”の語は、純粋な綿または綿ブレンドから作られた織布または不織布、糸または繊維をいい、綿織物、綿ニット、綿デニム、綿糸、原綿等を含む。
【００６８】
ここで用いる、“ストーンウォッシュ組成物”の語は、セルロース含有繊維をストーンウォッシュする際に用いる製剤をいう。ストーンウォッシュ組成物は販売前、すなわち製造プロセス時にセルロース含有繊維を修正するために用いる。これに対し、洗剤組成物は汚れた衣類の洗浄を目的とするものであり、製造プロセス時には用いられない。
【００６９】
ここで用いる“洗剤組成物”の語は汚れたセルロース含有繊維を洗濯するための洗浄手段で用いることを意図した混合物をいう。本発明において、当該組成物はセルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光色素、ケーキング防止剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤及び可溶化剤を含むことができる。
【００７０】
ここで用いる“ｃｂｈ１遺伝子発現の減少または除去”とは、ｃｂｈ１遺伝子がゲノムから欠失され、従って組換え宿主微生物により発現できないこと；またはｃｂｈ１遺伝子が修飾され、機能的ＣＢＨ１酵素が宿主微生物により生成されないことを意味する。
【００７１】
“変異ｃｂｈ１遺伝子”または“変異ＣＢＨ１”の語はそれぞれ、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来ｃｂｈ１遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／または操作することにより変異されたこと、または発現タンパク質のアミノ酸配列がここに記載の発明に一致するように修飾されたことを意味する。
【００７２】
ここで用いる“活性”及び“生物活性”の語は、特定タンパク質に関する生物活性をいい、ここで交換可能に用いられる。例えばプロテアーゼに関する酵素活性はタンパク質分解性であり、従って、プロテアーゼはタンパク質分解活性を有する。従って、所定タンパク質の生物活性は通常、当業者とって当該タンパク質に起因する任意の生物活性をいうことになる。
【００７３】
酵素溶液中で用いる場合、相同体または変異ＣＢＨ１成分は通常、バイオマスからの可溶性糖の放出速度を最高にするために十分な量で加える。加える相同体または変異ＣＢＨ１成分の量は、糖化されるバイオマスの種類に依存し、当業者により容易に測定できる。しかしながら、使用時の、セルラーゼ組成物中に存在するＥＧ型成分と比較した、相同体または変異ＣＢＨ１成分の重量％は、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、または好ましくは約２０重量％〜好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは約４５、または好ましくは約５０重量％である。さらに、好ましい範囲は約０．５〜約１５重量％、約０．５〜約２０重量％、約１〜約１０重量％、約１〜約１５重量％、約１〜約２０重量％、約１〜約２５重量％、約５〜約２０重量％、約５〜約２５重量％、約５〜約３０重量％、約５〜約３５重量％、約５〜約４０重量％、約５〜約４５重量％、約５〜約５０重量％、約１０〜約２０重量％、約１０〜約２５重量％、約１０〜約３０重量％、約１０〜約３５重量％、約１０〜約４０重量％、約１０〜約４５重量％、約１０〜約５０重量％、約１５〜約２０重量％、約１５〜約２５重量％、約１５〜約３０重量％、約１５〜約３５重量％、約１５〜約４０重量％、約１５〜約４５重量％、約１５〜約５０重量％である。
【００７４】
ＩＩ．宿主微生物
糸状菌は、細目の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての線状体を含む。糸状菌はキチン、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖類からなる細胞壁を有する栄養菌糸、及び菌糸伸長による栄養成長並びに偏性好気性の炭素異化を特徴とする。
【００７５】
本発明において、糸状菌親細胞は限定されないが、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラチアタム、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアナム；ペニシリン種；フミコーラ・インソレンス及びフミコーラｇｒｉｓｅａなどのフミコーラ種；Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅなどのクリソスポリウム種；グリオクラディウム種；アスペルギルス種；フサリウム種、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア種及びエメリセラ種の一連の細胞である。ここで用いる“トリコデルマ”または“トリコデルマ種”の語は、既にトリコデルマとして分類されている、または最近トリコデルマとして分類された任意の真菌株をいう。
【００７６】
１の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓまたはアスペルギルス・ニデュランス細胞である。
【００７７】
他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はトリコデルマ・リーゼイ細胞である。
【００７８】
ＩＩＩ．セルラーゼ
セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生じる酵素として当業界に公知である。上述の通り、セルラーゼは従来から３つの主な分類に分けられる：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ、他、１９８７；Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。
【００７９】
特定の真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼまたはＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはＥＧ型セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼまたはＢＧ型セルラーゼを含む完全なセルラーゼ系を生じる（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。しかしながら、これらの系はＣＢＨ型セルラーゼを欠く場合があり、また、細菌性セルラーゼは通常ＣＢＨ型セルラーゼを含まないか、またはほとんど含まない。さらに、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解することが示されている。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５を参照されたい。異なる成分、すなわち、複数成分または完全なセルラーゼ系中の種々のエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼは通常、等電点、分子量、糖化度、基質特異性及び酵素作用パターンなど異なる性質を有する。
【００８０】
また、セルラーゼ組成物は綿含有織物を分解し、織物の強度を損なうことも示されており（米国特許第４，８２２，５１６号）、市販の洗剤用途にセルラーゼ組成物が用いにくい原因となっている。エンドグルカナーゼ成分を含むセルラーゼ組成物は完全なセルラーゼ系を含む組成物と比較して、綿含有織物の損失強度の減少を示すことが示唆されている。
【００８１】
また、セルラーゼはセルロースバイオマスからエタノールへの分解（ここでセルラーゼはセルロースをグルコースに分解し、酵母またはその他の微生物がさらにグルコースを発酵してエタノールになる）、機械パルプの処理（Ｐｅｒｅ、他、１９９６）、飼料添加物としての使用（ＷＯ９１／０４６７３）及び穀物湿式粉砕に有用であることが示されている。
【００８２】
ほとんどのＣＢＨ及びＥＧは、リンカーペプチドによりセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離したコアドメインからなるマルチドメイン構造を有する（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、他、２０００）。コアドメインは活性部位を含むのに対し、ＣＢＤは酵素をセルロースに結合させることによりセルロースと相互作用する（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８６；Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。ＣＢＤは結晶セルロースの加水分解において特に重要である。結晶セルロースを分解するセロビオヒドロラーゼの能力はＣＢＤが不存在の場合には明確に減少することが示されている（Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｔｅｅｒｉ、１９９７）。しかしながら、ＣＢＤの正確な役割及び活性メカニズムは依然として推論のままである。ＣＢＤはセルロースの表面で効果的な酵素濃度を単に増加させることによって（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、他、１９９１）、及び／またはセルロース表面からセルロース一本鎖を解くことにより（Ｔｏｒｍｏ、他、１９９６）、酵素活性を高めることが示唆されている。異なる基質上のセルラーゼドメインの効果に関する研究の大部分はセロビオヒドロラーゼのコアタンパク質を用いて行われており、それらのコアタンパク質はパパインを用いた限定タンパク質分解により容易に生成できる（Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、例として：トリコデルマ・リーゼイ由来：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ、他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１−６９６、１９８３（ＣＢＨＩについて記載）；Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．他、Ｇｅｎｅ，５１：４３−５２、１９８７（ＣＢＨＩＩについて記載）が挙げられる。トリコデルマ以外の種由来のセルラーゼも例えば以下の文献に記載されている：Ｏｏｉ、他、１９９０（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生成されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を記載）；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ，他、１９９６（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来β−グルコシダーゼ１をエンコードするｃＤＮＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；Ｓａｋａｍｏｔｏ、他、１９９５（アスペルギルス・カワチＩＦＯ４３０８由来エンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ１をエンコードするｃＤＮＡ配列を開示）；Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ、他、１９９０（エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａ）由来エンドグルカナーゼを開示）；Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．、１９９４（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ由来好熱性βグルカナーゼをコードする、ｂｇｌＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；及びＨａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ Ｓ、他、１９９８（グリコシル加水分解酵素群１２の熱安定性セルラーゼをエンコードするＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ遺伝子のクローニング、シーケンシング及び過剰発現を開示）。しかしながら、熱応力条件下、または界面活性剤の存在下での改善された特性、増加した特異活性、変異した基質開裂パターン、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベル発現など、改善された特性を有する新規なセルラーゼの同定及びキャラクタリゼーションの必要性が依然として存在する。
【００８３】
様々な量のＣＢＨ型セルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物の開発は以下の用途に注目されている：（１）洗浄能力の向上、柔軟剤としての機能及び／または綿織物の手触りの改善を示す洗剤組成物（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）での使用；（２）木材パルプまたはその他のバイオマスを糖に分解する組成物での使用（例えば、バイオ−エタノール生成）；及び／または（３）飼料組成物での使用。
【００８４】
ＩＶ．分子生物学
１の実施態様において、本発明は糸状菌において機能的なプロモーターの制御下、所望のセルラーゼ遺伝子の発現を提供する。従って、本発明は組換え遺伝学の分野における一般的な技術に依拠する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本テキストは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（遺伝子導入及び発現）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、編集。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
【００８５】
Ａ．相同ＣＢＨ１遺伝子の同定方法
野生型Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の核酸配列は図１に示す。１の側面において、本発明はここに記載のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸分子を包含する。核酸はＤＮＡ分子であってもよい。
【００８６】
相同体ＣＢＨ１−エンコードＤＮＡ配列を単離するために用いることができる技術は当業者に公知であり、限定されないが、相同ＤＮＡプローブを用いるｃＤＮＡ及び／またはゲノムライブラリースクリーニング及び活性分析またはＣＢＨ１に対する抗体を用いる発現スクリーニングを含む。これらのいずれの方法もＳａｍｂｒｏｏｋ、他、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）で見ることができる。
【００８７】
Ｂ．ＣＢＨ核酸配列の変異方法
変異を導入できる当業界で公知のいかなる方法も本発明で使用できる。
【００８８】
本発明は変異ＣＢＨ１の発現、精製及び／または単離、及び使用に関する。これらの酵素は、好ましくはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来ｃｂｈ遺伝子を利用した組換え方法により調製する。
【００８９】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａからｃｂｈ１遺伝子を単離及びクローニングした後、部位特異的突然変異誘発法などの当業者に公知のその他の方法を用いて、発現ＣＢＨ１変異体中の置換アミノ酸に対応する置換、付加または欠失を作成する。繰返しになるが、部位特異的突然変異誘発及びＤＮＡレベルで発現タンパク質中にアミノ酸変化を組込むその他の方法は、Ｓａｍｂｒｒｏｋ。他及びＡｕｓｕｂｅｌ、他に見ることができる。
【００９０】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１のアミノ酸配列変異体をエンコードするＤＮＡは当業界に公知の種々の方法により調製できる。これらの方法は、限定されないが、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１をエンコードする先に調製したＤＮＡの、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異法、カセット突然変異法が挙げられる。
【００９１】
部位特異的突然変異誘発法は置換変異体の調製に好ましい方法である。当該技術は当業界に公知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）及びＫｕｎｋｅｌ、他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８７）を参照）。つまり、ＤＮＡの部位特異的突然変異を行うことで、出発ＤＮＡはまず所望の変異をエンコードするオリゴヌクレオチドを当該出発ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイジングすることにより変異される。ハイブリダイゼーション後、当該ハイブリダイズオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いながらＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖全体を合成する。従って、所望の変異をエンコードするオリゴヌクレオチドは得られた二本鎖ＤＮＡ内に組込まれる。
【００９２】
また、ＰＣＲ突然変異誘発も出発ポリペプチド（すなわち、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１）のアミノ酸配列変異体を作るのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第１７７−１８３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；及びＶａｌｌｅｔｔｅ，他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）を参照されたい。つまり、少量のテンプレートＤＮＡを出発物質としてＰＣＲで用いる場合、テンプレートＤＮＡの対応領域と配列がわずかに異なるプライマーは比較的大きな量の特定ＤＮＡ断片を生じるために用いることができ、当該特定ＤＮＡ断片は、プライマーがテンプレートと異なる位置においてのみテンプレート配列と異なる。
【００９３】
変異体、カセット突然変異誘発を調製する他の方法は、Ｗｅｌｌｓ、他、Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）に記載の技術に基づく。出発物質は変異される出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクター）である。変異する出発ＤＮＡ中のコドンを同定する。同定された変異部位の各部位上に固有の制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制限部位が存在しない場合、上述のオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発法を用いて制限部位を作ることができ、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適当な位置に導入できる。プラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断し、線状にする。制限部位間のＤＮＡ配列をエンコードするが、所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは標準手順を用いて合成でき、オリゴヌクレオチドの２つのストランドは別々に合成し、それから標準技術を用いて一緒にハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットは５’及び３’末端を有するように設計し、これらは線形化プラスミドの末端と適合し、従って、プラスミドに直接連結できる。このプラスミドは変異ＤＮＡ配列を含む。
【００９４】
もしくは、またはそれに加えて、所望のセルラーゼをエンコードする所望のアミノ酸配列を決定でき、そのようなアミノ酸配列変異体をエンコードする核酸配列を合成して生成できる。
【００９５】
そのように調製した所望のセルラーゼはさらに修飾でき、セルラーゼの使用目的に依存することが多い。当該修飾はアミノ酸配列のさらなる変異、異種ポリペプチドへの融合及び／または共有結合修飾を含む。
【００９６】
Ｖ．ｃｂｈ１核酸及びＣＢＨ１ポリペプチド
Ａ．変異体ｃｂｈ−型核酸
ＣＢＨ１変異体をエンコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築体内にクローンした後、当該ＤＮＡを微生物の形質転換に用いる。本発明に従って変異体ＣＢＨ１を発現するために形質転換される微生物はトリコデルマ種由来の株を有利に含むことができる。従って、本発明に従って変異体ＣＢＨ１セルラーゼを調製するための好ましい方法は、変異体ＣＢＨ１の一部または全部をエンコードするＤＮＡの少なくとも断片を含むＤＮＡ構築体を用いてトリコデルマ種宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築体は通常、プロモーターを機能的に付随する。形質転換宿主細胞を続いて所望のタンパク質を発現する条件下で成長させる。その後、所望のタンパク質生成物を精製し、実質的に均一にする。
【００９７】
しかしながら、実際に、変異ＣＢＨ１をエンコードする所定ＤＮＡの最良の発現媒体がＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａではない場合も考えられる。従って、変異体ＣＢＨ１の微生物源と系統発生類似性を有する形質転換宿主で当該タンパク質を発現することが最も有利かもしれない。他の実施態様において、アスペルギルス・ニガーを発現媒体として用いることができる。Ａ．ニガーを用いる形質転換技術の記載に関しては、ここに開示の内容を引用するＷＯ９８／３１８２１を参照されたい。
【００９８】
従って、トリコデルマ種発現系の本発明の記載は説明目的のみのため提供するものであり、本発明の変異体ＣＢＨ１を発現する１の選択肢として提供するものである。しかしながら、当業者は適切な場合に種々の宿主細胞中で変異体ＣＢＨ１をエンコードするＤＮＡを発現させるものであると考えられ、最適な発現宿主を決定する際に変異体ＣＢＨ１の供給源を考慮すべきであることは当然である。さらに、本発明の分野の当業者は、当業界で利用可能な手段を利用して一般的な技術により特定遺伝子のために最良な発現系を選択することができる。
【００９９】
Ｂ．変異体ＣＢＨ１ポリペプチド
野生型Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１のアミノ酸配列は図１に示す。変異体ＣＢＨ１ポリペプチドはヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来ＣＢＨ１中の１以上の以下の残基に対応する位置で置換または欠失を含む：Ｌ６、Ｓ８、Ｐ１３、Ｑ１７、Ｇ２２、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｔ４１、Ｓ４７、Ｎ４９、Ｔ５９、Ｔ６６、Ａ６８、Ｃ７１、Ａ７７、Ｇ８８、Ｎ８９、Ａ１００、Ｎ１０３、Ａ１１２、Ｓ１１３、Ｌ１２５、Ｔ１６０、Ｙ１７１、Ｑ１８６、Ｅ１９３、Ｓ１９５、Ｃ２１０、Ｍ２１３、Ｌ２２５、Ｔ２２６、Ｐ２２７、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｔ２４６、Ｄ２４９、Ｎ２５０、Ｒ２５１、Ｙ２５２、Ｄ２５７、Ｄ２５９、Ｓ２７８、Ｔ２８１、Ｌ２８８、Ｅ２９５、Ｔ２９６、Ｓ２９７、Ａ２９９、Ｎ３０１、Ｆ３１１、Ｌ３１８、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ａ３３６、Ｓ３４１、Ｓ３４２、Ｆ３５２、Ｋ３５４、Ｔ３５６、Ｇ３５９、Ｄ３６８、Ｙ３７１、Ｎ３７３、Ｔ３８０、Ｙ３８１、Ｎ３８４、Ｖ３９３、Ｒ３９４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、Ｆ４１８、Ｇ４３０、Ｎ４３６、Ｇ４４０、Ｐ４４３、Ｔ４４５、Ｙ４６６、Ｔ４７８、Ａ４８１及び／またはＮ４９０。
【０１００】
本発明の変異体ＣＢＨ１は前駆体Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。ＣＢＨ１変異体のアミノ酸配列は前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失または挿入されていることにより前駆体ＣＢＨ１アミノ酸配列と異なる。Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の成熟アミノ酸配列は図１に示す。従って、本発明はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中の特定の同定残基に等しい位置にアミノ酸残基を含むＣＢＨ１変異体を目的とする。ＣＢＨ１変異体の残基（アミノ酸）はヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の残基と、相同体（すなわち、一次または三次構造で位置が対応する）またはヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中の残基の特定残基または一部に機能的に類似（すなわち、同じまたは類似の一体化、反応または化学的または構造的に相互作用する能力を有する）である場合、同等である。ここで用いる番号は図１に示すように、成熟ＣＢＨ１アミノ酸配列の番号に対応するものとする。前駆体ＣＢＨ１内の配置に加えて、前駆体ＣＢＨ１が熱応力下にある場合、不安定性に関与するアミノ酸位置に対応する前駆体ＣＢＨ１中の特定残基は、置換または欠失に関してここで同定される。アミノ酸位置番号（例えば、＋５１）は図１に表す成熟ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１配列に割当てられた番号をいう。
【０１０１】
相同性を測定するためのアミノ酸配列の配置は好ましくは“配列比較アルゴリズム”を用いて決定する。比較のために最適な配列配置を行うことができ、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性配列アルゴリズム、Ｐｅａｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法のサーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化の実現（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ジェネティックスソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，マディソン，ウィスコンシン州）、目視検査またはＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（モントリオール、カナダ）のＭＯＥにより行う。
【０１０２】
配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載）がある。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センターにより一般に利用可能である（<www.ncbi.nlm.nih.gov>）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの語を並べた場合、いくつかの正の数の閾値スコアＴとマッチまたは満足する問い合わせ配列中の長さＷの短い語を同定することにより、最初に高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。これらのヒットした最初の近傍の語はこれらを含むさらに長いＨＳＰを見つけるために出発点として働く。ヒットした語は、増加できる累積配列スコアの範囲で比較される２つの配列それぞれに沿って両方向に広げられる。ヒットした語の伸長は以下の場合停止する：累積配列スコアが最大達成値からＸ量減少した場合；累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズム・パラメーターＷ、Ｔ及びＸは配列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期設定として単語長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）配列（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ’５、Ｎ’−４及び両ストランドの比較を用いる。
【０１０３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは次に、２配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１の基準は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然起こる確率を示す。例えば、アミノ酸配列は、最小合計確率が試験アミノ酸配列とプロテアーゼアミノ酸配列の比較で約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満の場合、プロテアーゼに類似すると考えられる。
【０１０４】
ＣＢＨ１セルラーゼの安定性を修正するさらなる具体的な方法を以下に示す：
（１）主鎖展開（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）のエントロピーの減少により酵素の安定性を導入できる。例えば、プロリン残基の導入は展開エントロピーを減少することにより著しくタンパク質を安定化する（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ、他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：２７７−２８３（１９９４）を参照）。同様に、グリシン残基はβ−炭素を有さず、従って、他の多くの残基よりもかなり大きな骨格立体配座自由度を有する。グリシン、好ましくはアラニンの置換により、展開エントロピーを減少でき、安定性を改善できる（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ、他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４；６６６３−６６６７（１９８７）を参照）。さらに、外側ループを短くすることで安定性を改善することが可能である。超好熱菌は中温好性相同体よりも短い外側ループを有するタンパク質を生成することが観測されている（例えば、Ｒｕｓｓｅｌ、他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：３７０−３７４（１９９５）を参照）。ジスルフィド結合の導入はお互いに明確に区別できる三次構造を安定化させるのにも効果的である。従って、現存するシステインに接近可能な残基にシステインの導入、またはジスルフィド結合を形成できるシステインペアの導入はＣＢＨ１変異体の安定性を変えることができる。
【０１０５】
（２）側鎖疎水性を増加することにより内部空洞を減少させて、酵素の安定性を変化させることができる。内部空洞の数及び体積を減少させることにより、疎水性相互作用を最大化し、パッキング不良が減少されて、酵素の安定性が増加する（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１３９−１６０（１９９３）；Ｂｕｒｌｅｙ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２３−２９（１９８５）；Ｚｕｂｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２９：１７１−１７９（１９８８）；Ｋｅｌｌｉｓ、他、Ｎａｔｕｒｅ ３３３：７８４−７８６（１９８８）を参照）。好熱菌由来の多量体タンパク質は、対応する中温好性菌のタンパク質よりも疎水性サブユニット接合部分を多く有することが多く、より表面補完性が大きい。この原則は単量体タンパク質のドメイン接合部分にも適用可能であると考えられる。疎水性を増加することにより安定性を改善できる特定の置換は、リジンからアルギニン、セリンからアラニン及びトレオニンからアラニンを含む（Ｒｕｓｓｅｌ，他、上記）。アラニンまたはプロリンへの置換による修飾により、側鎖サイズを増加でき、最終的に空洞の減少、より良いパッキング、及び増加した疎水性が得られる。空洞サイズを減少し、疎水性を増加し、ＣＢＨ１のドメイン間の接合部分の補完性を改善するための置換は酵素の安定性を改善できる。具体的には、これらの位置の特定残基をフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン及びイソロイシンから選択される異なる残基で修飾することにより特性を改善できる。
【０１０６】
（３）堅い二次構造中の平衡電荷、すなわち、α−ヘリックス及びβターンは安定性を改善できる。例えば、ヘリックスＮ末端上の部分正電荷をアスパラギン酸上の負電荷で中和することにより構造安定性を改善できる（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７８−１８３（１９９２）を参照）。同様に、ヘリックスＣ末端上の部分負電荷を正電荷で中和することにより安定性を改善できる。正電荷をβターン中のペプチドＮ末端との相互作用から遠ざけることは三次構造安定性を得るのに効果的である。正に帯電していない残基で置換することで、望ましくない正電荷がターン中に存在するアミド窒素と相互作用しないようにすることができる。
【０１０７】
（４）三次構造を安定化するために塩橋及び水素結合を導入することは効果的である。例えば、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸とリジン、アルギニンまたはヒスチジン間のイオン対相互作用は強い安定化効果を導入でき、及び異なる三次構造成分を付随させるために用いることができ、結果として熱安定性が改善される。さらに、帯電残基／非帯電残基水素結合の数の増加及び水素結合の数は通常、熱安定性を増加させることができる（例えば、Ｔａｎｎｅｒ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２５９７−２６０９（１９９６）を参照）。アスパラギン酸、アルパラギン、グルタミン酸またはグルタミンとの置換は骨格アミドとの水素結合を導入できる。アルギニンとの置換は塩橋を改善でき、骨格カルボニル内にＨ−結合を銅導入できる。
【０１０８】
（５）熱不安定性残基を避けることにより通常、熱安定性を増加できる。例えば、アスパラギン及びグルタミンはアミド分解を受け易く、システインは高温で酸化されやすい。敏感な位置でのこれらの残基数を減らすことで、改善された熱安定性を得ることができる（Ｒｕｓｓｅｌ、他、上記）。グルタミンまたはシステイン以外の任意の残基により置換または欠失することで、熱不安定性残基を避けることにより、安定性が増加する。
【０１０９】
（６）ＣＢＨ１変異体に修飾された安定性を与える配位子の結合の安定化または不安定化。例えば、本発明のＣＢＨ１変異体が用いられるマトリックスの成分はＣＢＨ１変異体の特定の界面活性剤／熱感受性部位に結合できる。当該部位を置換修飾することにより、当該成分の変異体への結合を強化または弱めることができる。例えば、ＣＢＨ１の結合切断部（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｒｅｖｉｃｅ）中の非芳香族残基はフェニルアラニンまたはチロシンと置換されて、芳香族側鎖安定性を導入でき、そこでセルロース基質の相互作用はベンジル環と有利に相互作用でき、ＣＢＨ１の安定性が増加する。
【０１１０】
（７）界面活性剤／熱感受性配位子のいずれかの電気陰性度を増加させることにより、界面活性剤または熱応力下での安定性を改善できる。例えば、フェニルアラニンまたはチロシンとの置換は、溶媒からの保護を改善することによりＤ（アスパラギン酸塩）残基の電気陰性度を増加させることができ、従って安定性が改善する。
【０１１１】
Ｃ．相同体ＣＢＨ１核酸及びポリペプチド
細菌微生物由来のゲノムＤＮＡを膜に固定する。ゲノムＤＮＡを遺伝子特異プローブとハイブリダイズし、ＰＣＲを用いてスクリーニングする。ＰＣＲ生成物を当業者に公知の技術を用いて単離し、配列決定する。
【０１１２】
ＶＩ．組換えＣＢＨ１相同体及び変異体の発現
本発明の方法は所望のセルラーゼを発現するために使用する細胞に依存し、特定の発現方法は必要でない。
【０１１３】
本発明は、所望のセルラーゼをエンコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて変換、形質転換または核酸導入される宿主細胞を提供する。温度、ｐＨ等の培養条件は変換、形質転換または核酸導入前に親宿主細胞に既に用いた条件であり、当業者に明らかである。
【０１１４】
１の手段において、糸状菌細胞または酵母細胞に、宿主細胞株で機能し、所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片に動作可能に連結する、プロモーターまたは生物学的に活性なプロモーター断片または１以上の（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクターを用いて核酸導入し、所望のセルラーゼが細胞株内で発現する。
【０１１５】
Ａ．核酸構築体／発現ベクター
所望のセルラーゼをエンコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（“所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列”）は異種核酸構築体またはベクター内に組込むことができ、糸状菌または酵母細菌内に導入でき、かつ複製できる。ここに開示するベクター及び方法は所望のセルラーゼを発現するための宿主細胞中で使用するのに適している。導入される細胞内で複製可能かつ生存可能である限り、任意のベクターが使用できる。多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。また、クローニング及び発現ベクターについてもここに明示的に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ、他、１９８９及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ、他、１９８１に記載されている。真菌に適切な発現ベクターはｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（編集）Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第３９６〜４２８頁に記載されている。適当なＤＮＡ配列が種々の手順によりプラスミドまたはベクター（集合的にここで“ベクター”という）内に挿入できる。通常、ＤＮＡ配列は標準手順により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。このような手順及び関連サブクローニング手順は当業者の知識の範囲内であると考えられる。
【０１１６】
所望のセルラーゼのコード配列を含む組換え糸状菌は、所望のセルラーゼ−コード配列を含む異種核酸構築体を糸状菌の選択株細胞内に導入することにより生成できる。
【０１１７】
所望の形態の所望のセルラーゼ核酸配列が得られると、それを種々の方法で修飾することができる。当該配列が非コードフランキング領域を含む場合、当該フランキング領域は切除、突然変異等に供することができる。従って、転移、塩基転換、欠失及び挿入を天然配列上で行うことができる。
【０１１８】
選択した所望のセルラーゼ−コード配列は公知の組換え技術に従って適切なベクター内に挿入でき、セルラーゼ発現が可能な糸状菌を形質転換するために用いることができる。遺伝コードの固有縮退のため、実質的に同じまたは機能的に同等なアミノ酸配列をエンコードするその他の核酸配列が所望のセルラーゼをクローン及び発現するために用いることができる。そのため、コード領域内の当該置換は、本発明によりカバーされる配列変異体の範囲内に当然含まれる。
【０１１９】
また、本発明は上述の１以上の所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を含む組換え核酸構築体を含むこともできる。当該構築体はプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含み、そこに本発明の配列がフォワードまたはリバース方向に挿入される。
【０１２０】
異種核酸構築体は所望のセルラーゼのコード配列を含むことができ、それらは（ｉ）単離して（ｉｉ）融合タンパク質またはシグナルペプチドコード配列などの他のコード配列と組み合わせて（ここで所望のセルラーゼ−コード配列は優性コード配列）；（ｉｉｉ）イントロンなどの非コード配列、及び適当な宿主中でコード配列の発現に効果的な、プロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域など制御因子と組み合わせて；及び／または（ｉｖ）所望のセルラーゼ−コード配列が異種遺伝子となるベクターまたは宿主環境において、含むことができる。
【０１２１】
本発明の１の側面において、異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を細胞内に移動させるために用いられ、確立された糸状菌及び酵母株が好ましい。所望のセルラーゼの長期間生成のために、安定な発現が好ましい。従って、安定な形質転換を生じるために効果的な任意の方法が本発明の実施に用いることができる。
【０１２２】
適当なベクターは通常、選択マーカー−エンコード核酸配列、挿入部位及び適当な制御因子、例えばプロモーター及びターミネーター配列などを備える。当該ベクターは調節配列を含んでもよく、例えば、イントロンなどの非コード配列、及び制御因子、すなわち宿主細胞（及び／または修飾可溶性タンパク質抗原コード配列が通常は発現されないベクターまたは宿主細胞環境）内でコード配列の発現に効果的で、コード配列に動作可能に連結したプロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域を含むことができる。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、その多くが市販されており、及び／またはＳａｍｂｒｏｏｋ、他、（上記）に記載されている。
【０１２３】
典型的なプロモーターは保存プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含み、例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆシステムにおいてｔｅｔ応答性因子（ＴＲＥ）を含むプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ ａｎｄ ＢＡＳＦ）、β−アクチンプロモーター及び特定の金属塩の添加により非調節にできるメタロチオニンプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は発現のために特定の糸状菌により認識されるＤＮＡ配列である。これは変異体ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結する。当該連結は開示した発現ベクター中において変異体ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の開始コドンに関するプロモーターの位置決定を含む。プロモーター配列は、変異体ＣＢＨ１ポリペプチドの発現を媒介する転写及び翻訳制御配列を含む。例えば、アスペルギルス・ニガー、Ａ．アワモリまたはＡ．オリゼー・グルコアミラーゼ、α−アミラーゼまたはα−グルコシダーゼエンコード遺伝子；Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡまたはｔｒｐＣ遺伝子；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ｃｂｈ１またはｔｒｐ１遺伝子；Ａ．ニガーまたはリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ−エンコード遺伝子；Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２またはその他のセルラーゼエンコード遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
【０１２４】
適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、種々の宿主の適当なマーカーは当業界に公知である。一般的な選択マーカー遺伝子はＡ．ニデュランスまたはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｒｇＢ、Ａ．ニデュランス由来のａｍｄＳ、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはＨ．ｊｏｃｏｒｉｎａ由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガーまたはＡ．ニデュランス由来のｐｙｒＧを含む。他の典型的な選択マーカーは、限定されないが、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤまたはｌｅｕ２が挙げられ、これらはｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等などの変異株を形質転換するために用いる異種核酸構築体に含まれる。
【０１２５】
当該選択マーカーは形質転換体に、通常は糸状菌により代謝されない代謝産物を利用できる能力を与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードするＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｍｄＳ遺伝子は、形質転換細胞が窒素源としてアセトアミド上で成長できるようにする。選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は栄養要求性変異株が選択最小培地上で成長する能力を回復させることができ、または選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は形質転換体に阻害薬または抗生物質の存在下で成長できる能力を与えることができる。
【０１２６】
選択マーカーコード配列は当業界で用いられる一般的な方法を用いて適切なプラスミド内にクローンされる。典型的なプラスミドはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドはＡ．ニデュランス由来のＡＭＡ１配列を含み、Ａ．ニガー中での複製を可能にする。
【０１２７】
本発明の実施には他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用い、当業者の技術の範囲内である。当該技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３；及びＣｏｌｉｇａｎ、他、１９９１を参照されたい。ここで言及する全ての特許、特許出願、雑誌及び文献はここに明示的に引用される。
【０１２８】
Ｂ．ＣＢＨ１生成のための宿主細胞及び培養条件
（ｉ）糸状菌
従って、本発明は、対応する非形質転換親真菌と比較して所望のセルラーゼ生成または発現を生じるために効果的な方法で修飾、選択及び培養された細胞を含む糸状菌を提供する。
【０１２９】
所望のセルラーゼ発現のために処理及び／または修飾できる親糸状菌の種の例としては、限定されないが、トリコデルマ、ペニシリン種、フミコーラ種、例えばフミコーラ・インソレンス；アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・ニガー、クリソスポリウム種、フサリウム種、ヒポクレア種及びエメリセラ種が挙げられる。
【０１３０】
所望のセルラーゼを発現する細胞は通常、親真菌株を培養するために用いる条件下で培養する。一般的に、細胞はＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、編集、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．他、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第７７〜８６頁、１９８８及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６、１９９７に記載されるような生理食塩及び栄養物を含む標準培地内で培養する。また、培養条件も標準であり、例えば培養物は２８℃、振とう培養または発酵槽中で、所望レベルの所望のセルラーゼ発現が達成されるまで培養する。
【０１３１】
所定の糸状菌の好ましい培養条件は科学文献及び／またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；<www.atcc.org>）などの真菌源から見つけることができる。真菌成長の達成後、当該細胞は所望のセルラーゼの発現を生じるまたは可能にするために効果的な条件に曝す。
【０１３２】
所望のセルラーゼ−コード配列が誘導プロモーターの制御下にある場合、例えば糖、金属塩または抗生物質などの誘発剤を所望のセルラーゼ発現を誘導するために有効な濃度で培地に加える。
【０１３３】
１の実施態様において、株はアスペルギルス・ニガーを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ ｄｇｒ２４６は高められた量の分泌セルラーゼを分泌することが公知である（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ、他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２）４１：８９−９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４及びＧＡＰ３−４などのアスペルギルス・ニガー ｖａｒ アワモリのその他の株は公知である（Ｗａｒｄ，Ｍ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．及びＫｏｄａｍａ，Ｋ．Ｈ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３）。
【０１３４】
他の実施態様において、株はトリコデルマ・リーゼイを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、ＲＬ−Ｐ３７はＳｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ、他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）に記載されており、高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られる。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物としては、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ番号５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）を含む。これらの株は変異体ＣＢＨ１を過剰発現するのにも有用である。
【０１３５】
潜在的に有害な天然セルロース分解活性がない所望のセルラーゼを得ることが望ましい場合、所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築体またはプラスミドの導入前に、１以上の欠失したセルラーゼ遺伝子を持った宿主細胞株を得ることは有用である。このような株は、ここに開示の内容を引用する米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ９２／０６２０９に開示の方法により調製できる。１以上のセルラーゼ遺伝子が欠落した宿主微生物中で所望のセルラーゼを発現することにより、同定及び次の精製手順が簡略化される。
【０１３６】
遺伝子欠失は欠失または分離される所望の遺伝子形態を当業界に公知の方法によりプラスミド内に挿入することにより達成できる。次に、欠失プラスミドは所望の遺伝子コード領域及び遺伝子コード配列または選択マーカーで置換された当該配列の一部の内部にある適当な制限酵素部位で切断される。欠失または分離される遺伝子座由来のフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５〜２．０ｋｂであり、両側の選択マーカー遺伝子を保持する。適当な欠失プラスミドは一般に、固有の制限酵素部位を有し、当該断片が欠失遺伝子を含み、フランキングＤＮＡ配列を含むことを可能にし、選択マーカー遺伝子が一本の線状片として除去される。
【０１３７】
選択マーカーは形質転換微生物の検出が可能となるように選択しなければならない。選択した微生物中で発現する選択マーカー遺伝子は適している。例えば、アスペルギルス種を用いて選択マーカーを選択すると、形質転換体中の選択マーカーの存在はその特性に大きな影響を与えない。このような選択マーカーは分析可能な生成物をエンコードする遺伝子であると考えられる。例えば、アスペルギルス種遺伝子の機能的コピーは、宿主株中の欠失により栄養要求性表現型を示す宿主株を生じる場合、使用できる。
【０１３８】
好ましい実施態様において、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は機能的ｐｙｒＧ遺伝子を用いて形質転換し、従って、形質転換のための選択マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株はフルオロオロト酸（ＦＯＡ）に耐性のアスペルギルス種株を選択することにより得ることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素である、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードする。原型のｐｙｒＧ遺伝子を含む株はウリジン不足の培地中で成長するが、フルオロオロト酸に感受性である。機能的オロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ酵素を欠いており、ＦＯＲ耐性選択により成長のためにウリジンを必要とするｐｙｒＧ−誘導体株の選択が可能である。ＦＯＡ選択技術を用いて、機能的オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが不足したウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞をこの酵素をエンコードする遺伝子の機能的コピーを用いて形質転換することが可能である（Ｂｅｒｇｅｓ＆Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１）、及びｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔｅ、他（１９８６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ（ｐｙｒＧ遺伝子に基づくアスペルギルス・ニガーの相同形質転換系の進展）．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１−７５）。誘導体株の選択は、上述のＦＯＡ耐性技術を用いて容易に行われ、従って、ｐｙｒＧ遺伝子は選択マーカーとして用いるのが好ましい。
【０１３９】
１以上のセルラーゼ遺伝子の発現能力が欠落するようにｐｙｒＧ−アルペルギルス種を形質転換するために、分離または欠失したセルラーゼ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ断片をそれから欠失プラスミドから単離し、適当なｐｙｒ−アスペルギルス宿主を形質転換するために用いる。次に、形質転換体はｐｙｒＧ遺伝子生成物を発現するそれらの能力に基づいて同定及び選択され、従って宿主株のウリジン栄養要求性を補う。サザンブロット分析を次に得られた形質転換体について行い、欠失する遺伝子のゲノムコピーのコード領域の一部または全部をｐｙｒ４選択マーカーで置換するダブルクロスオーバー融合イベントを同定及び確認する。
【０１４０】
上述の特定プラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の調製に関連するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。種々の遺伝子がアスペルギルス種株内で上述の技術を用いて欠失及び置換できる。さらに、上述の通り、任意の入手可能な選択マーカーが使用できる。実際、クローンされ、そして同定された任意のアスペルギルス種遺伝子が上述の方法を用いてゲノムから欠失できる。
【０１４１】
上述の通り、使用する宿主株は、選んだ選択マーカーに対応する非機能的遺伝子を欠く、または有するアスペルギルス種の誘導体である。例えば、ｐｙｒGの選択マーカーを選択した場合、それから形質転換手順において特定のｐｙｒＧ−誘導体株を受容体として用いる。同様に、アスペルギルス・ニデュランス遺伝子ａｍｄＤ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤに同等なアスペルギルス種遺伝子を含む選択マーカーが用いることができる。対応する受容体株は従って、それぞれａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−などの誘導体株でなければならない。
【０１４２】
所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡは次に、適当な微生物内に挿入するために調製する。本発明に従うと、所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡは機能的セルロース分解活性を有するタンパク質をエンコードするために必要なＤＮＡを含む。所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片は真菌プロモーター配列、例えばｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに機能的に接合できる。
【０１４３】
２以上の所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡのコピーが過剰発現を促進するために株内に組換えできることも本発明の範囲内である。所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡは当該セルラーゼをエンコードするＤＮＡを運ぶ発現ベクターを構築することにより調製できる。所望のセルラーゼをエンコードする挿入ＤＮＡ断片を運ぶ発現ベクターは所定の宿主微生物中で独立して複製できる、または宿主、一般的にはプラスミドのＤＮＡ内に統合できるベクターである。好ましい実施態様において、遺伝子発現が得られる２種の発現ベクターが考えられる。１つは、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現する遺伝子由来であるＤＮＡ配列を含む。遺伝子切断は、自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを残すために、望ましくないＤＮＡ配列（例えば、望ましくないドメインをコードする）を欠失することが望ましい場合に行うことができる。選択マーカーはベクター上に含むこともでき、宿主内に新規な遺伝子配列の複数コピーを統合するための選択が可能になる。
【０１４４】
２つ目の発現ベクターはあらかじめ組立てられ、高レベル転写に必要な配列及び選択マーカーを含む。遺伝子またはその一部のコード領域はこの汎用性発現ベクター内に挿入できると考えられ、従って、発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下にある。例えば、ｐＲＡＸはそのような汎用性発現ベクターである。遺伝子またはその一部は強力なｇｌａＡプロモーターの下流に挿入できる。
【０１４５】
ベクター中、本発明の所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列は転写及び翻訳配列、すなわち、リーディングフレームから構造遺伝子中の適当なプロモーター配列及びシグナル配列に動作可能に連結するべきである。プロモーターは宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、宿主細胞と同種または異種のタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。任意のシグナルペプチドは所望のセルラーゼの細胞外生成を提供する。シグナル配列をエンコードするＤＮＡは発現する遺伝子に天然で関連していることが好ましいが、任意の適当な供給源由来のシグナル配列が本発明で使用できる。
【０１４６】
本発明の所望のセルラーゼをコードするＤＮＡ配列とプロモーターを適当なベクター内に融合するために用いる手順は当業界に公知である。
【０１４７】
上述のＤＮＡベクターまたは構築体は、形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、遺伝子銃等の公知の技術に従って宿主細胞中に導入できる。
【０１４８】
形質転換のためにアスペルギルス種を調製する本発明の好ましい方法は、真菌の菌糸体由来の原形質体の調製を含む。Ｃａｍｐｂｅｌｌ、他、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ．ｎｅｇｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｉａＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（硝酸還元酵素の相同体ｎｉａＤ遺伝子を用いたＡ．ニガーの改善された形質転換効率）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６；１９８９を参照されたい。菌糸体は発芽植物性胞子から得ることができる。菌糸体は細胞壁を消化して原形質体を生じる酵素で処理する。原形質体は次に懸濁培地中、浸透圧安定化剤の存在により保護される。これらの安定化剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これら安定化剤の濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍ間で様々である。懸濁培地中、約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【０１４９】
ＤＮＡの宿主アスペルギルス種株内への摂取はカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＣａＣｌ２が摂取溶液内で用いられる。摂取溶液中でカルシウムイオンが必要であることに加え、通常含まれるその他の品目は緩衝系、例えばＴＥバッファ（１０Ｍｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０バッファ（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜の融合に作用すると考えられており、従って培地の内容物がアスペルギルス種株の細胞質内に運ばれ、プラスミドＤＮＡが核に移動する。この融合により、宿主染色体内に穏やかに統合されるプラスミドＤＮＡの複数コピーが残ることが多い。
【０１５０】
通常、アスペルギルス種原形質体または細胞を含む、密度１０５〜１０６／ｍＬ、好ましくは２×１０５／ｍＬで浸透圧処理に供した懸濁液を形質転換に使用する。適当な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ ＣａＣｌ２）の１００μＬの量のこれら原形質体または細胞は所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを摂取溶液に加える。０．１〜１の量（ｖｏｌｕｍｅ）の２５％ ＰＥＧ ４０００は原形質体の懸濁液に加えることができる。しかしながら、約０．２５の量（ｖｏｌｕｍｅ）を原形質体の懸濁液に加えることが好ましい。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤も摂取溶液に加えてもよく、形質転換を助ける。
【０１５１】
通常、混合物はそれから約０℃で１０〜３０分間培養する。追加のＰＥＧをそれから混合物に加え、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の摂取をさらに高める。２５％ ＰＥＧ ４０００は通常、形質転換混合物の体積の５〜１５倍の体積で加えるが、それより大きい体積または小さい体積も適している。２５％ ＰＥＧ ４０００は好ましくは形質転換混合物の体積の約１０倍である。ＰＥＧを加えた後、形質転換混合物をそれから室温または氷上で、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加する前に培養する。原形質体懸濁液をそれからさらに成長培地の融解アリコートに加える。この成長培地により形質転換だけの成長が可能になる。所望の形質転換の成長に適した任意の成長培地が本発明で使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換を選択した場合、ウリジンを含まない成長培地を使用することが好ましい。その結果生じたコロニーをウリジンを使い尽くした成長培地上で移動及び精製する。
【０１５２】
この段階で、速い成長速度及びウリジンが欠落した固体培養基上の不規則な外形よりもむしろ、順調な環状コロニーの形成により安定な形質転換が不安定な形質転換と区別できる。さらに、場合によっては安定性のさらなる試験を、固体非選択性培地（すなわち、ウリジンを含む）上の形質転換体を成長させる、この培養基から胞子を収集し、及び次にウリジンが欠落した選択培地上で発芽及び成長するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより、行うことができる。
【０１５３】
上記方法の特定の実施態様において、所望のセルラーゼは液体培地中で成長後、所望のセルラーゼの適当な翻訳後処理の結果として、宿主細胞から活性体で回収される。
【０１５４】
（ｉｉ）酵母
また、本発明は所望のセルラーゼ生成のための宿主細胞として酵母の使用も考えられる。加水分解酵素をエンコードするその他いくつかの遺伝子が種々の酵母Ｓ．セレヴィシエ株において発現する。これらは、２つのエンドグルカナーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ、他、１９８７）、２つのセロビオヒドロラーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ、他、１９８８）、及びトリコデルマ・リーゼイ由来の１のβ−グルコシダーゼ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ａｎｄ Ｆｏｗｌｅｒ、１９９６）、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｌｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ由来キシラナーゼ（Ｌｉ ａｎｄ Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、１９９６）、小麦由来のα−アミラーゼ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、他、１９８７）等をエンコードする配列を含む。さらに、ルーメン細菌（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）エンド−［ベータ］−１，４−グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓセロデキストリナーゼ（ＣＥＬ１）及びエンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）ｆｒｂｒｉｌｉｚｅｒセロビアーゼ（Ｂｇｌ１）をエンコードするセルラーゼ遺伝子カセットはＳ．セレヴィシエ（Ｖａｎ Ｒｅｎｓｂｕｒｇ、他、１９９８）の研究所株中でうまく発現された。
【０１５５】
Ｃ．所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列の宿主細胞内への導入
本発明はさらに、外来の所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を含むように遺伝子組換えされた細胞及び細胞組成物を提供する。親細胞または細胞株はクローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子組み換え（すなわち、変換、形質転換またはトランスフェクト）できる。ベクターは、上述したように例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態である。
【０１５６】
本発明の形質転換の方法は、形質転換ベクターの全部または一部を糸状菌のゲノム内に安定に統合できる。しかしながら、自己複製の余分な染色体形質転換ベクターを維持する形質転換も考えられる。
【０１５７】
大量の異種タンパク質を発現するトリコデルマ・リーゼイ細胞株を生成するために多くの標準トランスフェクション方法を用いることができる。ＤＮＡ構築体をトリコデルマのセルラーゼ生成株内に導入するための公開されている方法のいくつかとしては、Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｔｒｏ及びＨａｒｍａｎ，１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ及びＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９−１７４；Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ及びＫｎｏｗｌｅｓ，１９８７、Ｇｅｎｅ ６：１５５−１６４、アスペルギルスに関して、Ｙｅｌｔｏｎ、Ｈａｍｅｒ及びＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４、フサリウムに関して、Ｂａｊａｒ、Ｐｏｄｉｌａ及びＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８２０２−８２１２、ストレプトマイセスに関して、Ｈｏｐｗｏｏｄ、他、１９８５、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ及びバチルスに関して、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ及びＭａｔｔｅｕｚｚｉ，１９９０、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８が挙げられる。
【０１５８】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入する公知の手順を用いることができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質体融合、エレクトロポレーション、バイオリスティクス、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター及びクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはその他の外来遺伝物質を宿主細胞内に導入するためのその他の公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、上記を参照）の使用が挙げられる。米国特許第６，２５５，１１５号に記載のアグロバクテリウム媒介トランスフェクション法も使用できる。唯一必要なのは、使用する特定の遺伝子組換え手順により、少なくとも１の遺伝子が異種遺伝子を発現できる宿主細胞内にうまく導入されることができるということである。
【０１５９】
さらに、所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を含む異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写でき、得られたＲＮＡは公知の方法、例えばインジェクションにより宿主細胞内に導入される。
【０１６０】
本発明はさらに、真菌セルラーゼ組成物の生成に使用するためのＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ及びＡ．ニガーなど糸状菌の新規で有用な形質転換体を含む。本発明は糸状菌、特に所望のセルラーゼコード配列または内生ｃｂｈコード配列の欠失を含む真菌の形質転換体を含む。
【０１６１】
ＶＩＩ．ＣＢＨ１核酸コード配列及び／またはタンパク質発現の分析
所望のセルラーゼ−エンコード核酸構築体を用いて形質転換した細胞株により所望のセルラーゼ発現を評価するために、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルで分析を行うことができ、または特にグルコシダーゼ活性及び／または生成に対する機能的バイオアッセイを使用することにより分析を行うことができる。
【０１６２】
ここに記載の所望のセルラーゼ核酸及びタンパク質配列の１の典型的な用途において、糸状菌、例えばトリコデルマ・リーゼイの遺伝子組換え株は増加した量の所望のセルラーゼを生成するように設計できる。このような遺伝子組換え糸状菌はセルロース分解能が大きく増加したセルラーゼ生成物を生成するのに有用である。１の手段においてこれは、適当な宿主、例えばアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌内に所望のセルラーゼをコードする配列を導入することにより達成される。
【０１６３】
従って、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主の細胞内に所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを導入することにより糸状菌またはその他の適当な宿主内で所望のセルラーゼを発現するための方法を含む。
【０１６４】
他の側面において、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主内での所望のセルラーゼ発現を修飾するための方法を含む。当該修飾は内生ＣＢＨの発現の減少または除去を含む。
【０１６５】
通常、所望のセルラーゼ発現を分析するために用いる分析は、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、または適当な標識プローブ（核酸コード配列に基づく）を用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーが挙げられる。
【０１６６】
さらに、所望のセルラーゼの生成及び／または発現はサンプル内で直接測定でき、例えばセロビオヒドロラーゼ活性、発現及び／または生成の分析により測定できる。当該分析は例えば、それぞれここに明示的に引用するＢｅｃｋｅｒ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２００１）３５６：１９−３０及びＭｉｔｓｕｉｓｈｉ、他、ＦＥＢＳ（１９９０）２７５：１３５−１３８に記載されている。ＣＢＨ１の単離可溶性及び不溶性基質を加水分解する能力はＳｒｉｓｏｄｓｕｋ、他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９７）５７：４９−５７及びＮｉｄｅｔｚｋｙ及びＣｌａｅｙｓｓｅｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９４）４４：９６１−９６６に記載の分析を用いて測定できる。セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼまたはβ−グルコシダーゼ活性を分析するために有用な基質は結晶性セルロース、ろ紙、リン酸膨潤セルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリル・ラクトシド、メチルウンベリフェリル・セロビオシド、オルトニトロフェニル・ラクトシド、パラニトロフェニル・ラクトシド、オルトニトロフェニル・セロビオシド、パラニトロフェニル・セロビオシドが挙げられる。
【０１６７】
さらに、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織化学的染色または組織培養基の免疫学的分析など免疫学的方法、例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価できる。当該免疫分析は所望のセルラーゼ発現を定性的及び定量的に評価するために用いることができる。当該方法の詳細は当業者に公知であり、当該方法を実施するための多くの試薬が市販されている。
【０１６８】
所望のセルラーゼの精製体は種々の免疫分析に用いるために発現タンパク質に特異なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成するために用いることができる（例えば、Ｈｕ、他、１９９１を参照）。典型的な分析はＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接免疫蛍光試験などが挙げられる。通常、市販の抗体及び／またはキットはセロビオヒドロラーゼタンパク質発現レベルの定量免疫分析に用いることができる。
【０１６９】
ＶＩＩＩ．組換えＣＢＨ１タンパク質の単離及び精製
通常、細胞培養基内で生成した所望のセルラーゼタンパク質は培養基内に分泌され、例えば細胞培養基から不要な成分を除去することにより精製または単離できる。しかしながら、場合によっては、所望のセルラーゼタンパク質は細胞溶解物から回収が必要な細胞型で生成できる。その場合、所望のセルラーゼタンパク質を細胞から精製し、当業者により通常用いられる技術を用いて生成した。例としては限定されないが、アフィニティクロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８４）、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ、他、１９９１；Ｆｌｉｅｓｓ、他、１９８３；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ、他、１９８４；Ｅｌｌｏｕｚ、他、１９８７）、例えば高い分解力を有する物質を用いたイオン交換（Ｍｅｄｖｅ、他、１９９８）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ、１９９９）及び２相分離（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ、他、１９９９）が挙げられる。
【０１７０】
通常、所望のセルラーゼタンパク質は、特定の結合剤（例えば抗体または受容体）への結合親和性、または選択分子量範囲または等電点範囲を有するなどの選択特性を有するタンパク質を分離するために分画する。
【０１７１】
所定の所望のセルラーゼタンパク質発現が達成されると、生成した所望のセルラーゼタンパク質を細胞または細胞培養基から精製する。このような精製に適した典型的な手順は以下を含む：抗体親和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過。種々のタンパク質精製方法が用いることができ、当該方法は当業者に公知であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ，１９８２に記載されている。選択する精製工程は例えば、用いる生成工程の性質及び生成される特定タンパク質に依存する。
【０１７２】
ＩＸ．ｃｂｈ１及びＣＢＨ１の活用
当然のことながら、所望のセルラーゼ核酸、所望のセルラーゼタンパク質及び所望のセルラーゼタンパク質活性を含む組成物は多種多様な用途で用いることができ、そのいくつかを下記に説明する。
【０１７３】
様々な量で所望のセルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物は高い洗浄能を示し、柔軟剤として作用し、及び／または綿織物の手触りを改善させる（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）洗剤組成物、木材パルプを糖に分解する組成物（例えば、バイオ−エタノール生成）及び／または飼料組成物に用いることができる。各タイプのセルラーゼの単離及びキャラクタリゼーションにより当該組成物の特徴を制御する能力が提供される。
【０１７４】
減少した熱安定性を有する所望のセルラーゼは、例えば、存在すると考えられるその他の酵素に影響しないように酵素活性を低温で中和する必要がある場合に有用である。さらに、当該酵素はセルロース誘導体の限られた変換に有用であり、例えば結晶度またはセルロース誘導体の鎖長を制御するのに有用である。所望の変換範囲に達した後、糖化温度は不安定化されたＣＢＨ１の生存温度以上に挙げることができる。ＣＢＨ１活性は結晶セルロースの加水分解に不可欠であるので、結晶セルロースの変換は高温で停止する。
【０１７５】
１の好ましい手段において、本発明のセルラーゼは洗剤組成物または手触り及び外観を改善するための織物処理に使用できる。
【０１７６】
セルロース誘導体生成物の加水分解速度は、複製可能プラスミドとして、またはゲノム内への挿入として少なくとも１の所望のセルラーゼ遺伝子のさらなるコピーを有する形質転換体を用いて増加させることができるので、セルロースまたはヘテログリカンを含む生成物がより速い速度でより大量に分解できる。紙、綿、セルロース系オムツ等のセルロースから作られる生成物は埋立て処理地においてより効果的に分解できる。従って、当該形質転換から得られる発酵生成物または形質転換自体は組成物中に使用でき、満杯の埋立て処理地にある多種多様のセルロース生成物を液化することにより分解を助けることができる。
【０１７７】
分離した糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、続いて酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。同時糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、同時に同じ反応器内で酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。従って、他の手段において、本発明の所望のセルラーゼはバイオマスからエタノールへの分解に利用できる。容易に入手可能なセルロース源からのエタノール生成は安定で再生可能な燃料源を提供する。
【０１７８】
セルロースベース供給原料は農業廃棄物、草及び木材及びその他の低価値バイオマス、例えば都市ゴミ（例えば、再生紙、庭伐採ゴミ（ｙａｒｄ ｃｌｉｐｐｉｎｇｓ）等）からなる。エタノールは任意のこれらセルロース系供給原料の発酵から生成できる。しかしながら、セルロースは、エタノール変換の前にまず糖に変換されなければならない。
【０１７９】
多種多様の供給原料が本発明の所望のセルラーゼと用いることができ、使用する種類の選択は変換が行われる地域に依存する。例えば、アメリカ中西部では麦かん、伐採残（コーンストーバー）及びバガスなどの農業廃棄物が主流であり、一方、カリフォルニアでは稲わらが主流である。しかしながら、当然のことながらいかなる入手可能なセルロース系バイオマスも任意の地域で使用できる。
【０１８０】
増加した量でセロビオヒドロラーゼを含むセルラーゼ組成物はエタノール生成に利用することができる。この方法から得たエタノールはさらにオクタンエンハンサーとして用いることができ、またはガソリンの代わりに直接燃料として用いることができ、燃料源としてのエタノールは石油由来生成物よりもより環境に優しいので有用である。エタノールの使用は大気環境を改善し、局所オゾンレベル及びスモッグを減少させる可能性があることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは非再生エネルギー及び石油化学供給の突然移行の影響を緩衝するために戦略的に重要である。
【０１８１】
エタノールは糖化及び発酵プロセスにより木、葉状植物、都市固体ゴミ及び農業及び林業残留物などのセルロース系バイオマスから生成できる。しかしながら、微生物により生成される天然セロビオヒドロラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の比率は、バイオマスからグルコースへのセルロース変換を速く行うために最も効果的な比率ではない。エンドグルカナーゼは新しいセルロース鎖末端の生成に作用し、それ自身はセロビオヒドロラーゼ活性の基質であり、それによってセルラーゼ系全体の加水分解効率が改善することが知られている。従って、増加した、または最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性を使用してエタノール生成を大きく高めることができる。
【０１８２】
従って、本発明のセロビオヒドロラーゼはセルロースをその糖成分に加水分解する際に使用できる。１の実施態様において、所望のセルラーゼは発酵生物添加前にバイオマスに添加する。第２の実施態様において、所望のセルラーゼは発酵生物と同時にバイオマスに添加する。任意で、いずれの実施態様もその他のセルラーゼ成分が存在できる。
【０１８３】
他の実施態様において、セルロース系供給原料を前処理することができる。前処理は高温及び希酸、濃酸または希アルカリ溶液を添加することによる。前処理溶液はヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解するのに十分な時間で加え、それから中和する。
【０１８４】
本発明の洗剤組成物はセルラーゼ組成物に加えて（セロビオヒドロラーゼ含量に関係なく、すなわち、セロビオヒドロラーゼを含まない、実質的に含まないまたは増加した量のセロビオヒドロラーゼ）、界面活性剤、例えば陰イオン性、非イオン性及び両性イオン性界面活性剤、ヒドロラーゼ、ビルディング剤、漂白剤、青味剤及び蛍光剤、ケーキング防止剤、可溶化剤、カチオン性界面活性剤等を用いることができる。これら全ての成分は洗剤業界に公知である。上述のセルラーゼ組成物は、希釈液、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペースト等の洗剤組成物に加えることができる。当該形態は当業者に公知である。固形洗剤組成物を用いる場合、セルラーゼ組成物は顆粒として処方するのが好ましい。好ましくは、顆粒はセルラーゼ保護剤を含むように処方される。さらに詳細な議論については、ここに引用する米国特許第６，１６２，７８２号、表題“Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＣＢＨ Ｉ ｔｙｐｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ＣＢＨ Ｉ型成分が欠損したセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物）”を参照されたい。
【０１８５】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．００００５重量％〜約５重量％で用いる。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．０００２重量％〜約２重量％を用いる。
【０１８６】
さらに、所望のセルラーゼ核酸配列は関連核酸配列の同定及びキャラクタリゼーションに使用できる。関連遺伝子または遺伝子産物の機能の測定（予測または確認）に有用な多数の技術は、限定されないが、以下を含む、（Ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、例えば（１）過剰発現、異所性発現及びその他の種における発現；（２）遺伝子ノックアウト（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルスによる遺伝子抑制（ＶＩＧＳ、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９を参照）；（３）遺伝子、特にフランキング調節領域のメチル化状態の分析；及び（４）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（Ｂ）遺伝子産物分析、例えば（１）組換えタンパク質発現；（２）抗血清生成、（３）免疫学的局在決定；（４）触媒的またはその他の活性の生化学分析；（５）リン酸化反応状態；及び（６）酵母２ハイブリッド分析によるその他のタンパク質との相互作用；（Ｃ）経路分析、例えば、過剰発現表現型に基づいた、または関連遺伝子との配列相同性による、特定生化学またはシグナリング経路内の遺伝子または遺伝子産物のプレイシング；及び（Ｄ）特定代謝またはシグナリング経路において単離遺伝子及びその産物の関与を測定または確認するために実施でき、遺伝子機能の測定に役立つ、その他の分析。
【０１８７】
実施例
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明し、これらは本発明の範囲をいかなる形においても制限するものではない。添付の図は本発明の明細書及び説明の不可欠な要素として考慮される。ここに引用する全ての文献はここに明示的に引用されるものとする。
【０１８８】
実施例１
ＣＢＨ１相同体の同定
この実施例は、種々の真菌において見られる新規なＣＢＨ１相同体について説明する。ゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応を行うためにいくつかの異なる微生物に関して調製し、相同体ＣＢＨ１セルラーゼが特定の微生物のＤＮＡによりエンコードされるかどうかを測定した。
【０１８９】
ゲノムＤＮＡの同定
ゲノムＤＮＡは当業界に公知の任意の方法を用いて単離できる。この一連の実験において、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ（ＴＵＶ）との協力により、多様なヒポクレア及びトリコデルマ種、ヒポクレア・シュワイニッチィ（ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）（ＣＢＳ ２４３．６３）、ヒポクレア・オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（ＰＰＲＩ ３８９４）、トリコデルマ・プソイドコニンギー（ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）（ＣＢＳ ４０８．９１）及びトリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ（単離１）から４８のゲノムＤＮＡ溶液を入手した。しかしながら、以下の手順を用いることもできる：
細胞を２０ｍｌポテトデキストロース培養液（ＰＤＢ）中、３０℃で２４時間成長させる。当該細胞を新しいＰＤＢ培地中で１：２０に希釈し、一晩中成長させる。２ｍＬの細胞を遠心し、ペレットを１ｍＬ ＫＣ（６０ｇ、ＫＣｌ、２ｇクエン酸／Ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨを６．２に調節）中で洗浄する。細胞ペレットを９００μＬ ＫＣ中で再懸濁させる。１００μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ：登録商標）を加え、ゆっくりと混合し、次に９５％以上の原形質体が形成されるまで、微視的に３７℃、最大２時間でプロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）を行う。当該細胞を１５００ｒｐｍで（４６０ｇ）１０分間遠心する。２００μＬ ＴＥＳ／ＳＤＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）を加え、混合し、室温で５分間培養する。ＤＮＡをキアゲンミニプレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。カラムを１００μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて溶出させ、ＤＮＡを収集する。
【０１９０】
もしくは、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）法を用いる方法も好ましい。当該システムはＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）機器及び核酸単離のためのＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）キットからなる。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）はＱｂｉｏｇｅｎｅから利用可能である。
【０１９１】
プライマーの構築
ＰＣＲはＰＣＴ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）などの標準ＰＣＲ機械上で、以下の条件下で行った：
１）１分、９６℃で１サイクル
２）３０秒、９４℃
９０秒、４５℃（＋１℃／サイクル）
２分、７２℃
３）繰り返し工程２、１０サイクル
４）３０秒、９４℃
９０秒、５５℃
２分、７２℃
５）繰り返し工程４、２０サイクル
６）７分、７２℃、１サイクル、及び
７）保管及びさらなる分析のため、低温から１５℃。
【０１９２】
以下のＤＮＡプライマーを種々の微生物から単離したゲノムＤＮＡ由来の相同体ＣＢＨ１遺伝子の増幅に使用するために構築した。タンパク質及びＤＮＡに関してここで用いる全ての記号はＩＵＰＡＣ ＩＵＢ生化学命名法割当てコードに対応する。
【０１９３】
相同体５’（ＦＲＧ１９２）及び３’（ ＦＲＧ１９３）プライマーをトリコデルマ・リーゼイ由来ＣＢＨ１配列に基づいて開発した。両プライマーはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＧａｔｅｗａｙクローニング配列をプライマーの５’に含む。プライマーＦＲＧ１９２はａｔｔＢ１配列を含み、プライマーＦＲＧ１９３はａｔｔＢ２配列を含む。
【式２】
【０１９４】
ＰＣＲ条件は以下の通り：１０μＬの１０Ｘ反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８−８．５；２５０ｍＭ ＫＣｌ；５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；２０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む１０Ｘ反応緩衝液）；各０．２ｍＭの、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（最終濃度）、１μＬの１００ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡ、０．５μＬのＰＷＯポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１６４４−９４７）、μＬ当たり１ユニット、各０．２μＭのプライマー、ＦＲＧ１９２及びＦＲＧ１９３（最終濃度）、４μＬ ＤＭＳＯ及び水１００μＬまで。
【０１９５】
これらの条件により異なる種から４つの遺伝子を最終的に得た：
１．ヒポクレア・シュワイニッチィ（ＣＢＳ ２４３．６３）
２．ヒポクレア・オリエンタリス（ＰＰＲＩ ３８９４）
３．トリコデルマ・プソイドコニンギ（ＣＢＳ ４０８．９１）
４．トリコデルマ・ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ
Ｃｅｌ７Ａ遺伝子配列の単離
完全長配列をＮ末端（ＦＲＧ１９２）及びＣ末端（ＦＲＧ１９３）プライマーを用いることにより直接得た。完全長ＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアを用いる３つのオープンリーディングフレーム内に翻訳した。ＤＮＡ及びタンパク質とＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ Ｃｅｌ７Ａとの比較を行い、推定上のイントロン配列を同定した。イントロン配列を含まないゲノムＤＮＡ配列の翻訳により相同体ＣＢＨ１のタンパク質配列を示した。得られた完全長遺伝子を図３、５、７及び９に示した。
【０１９６】
実施例２
ＣＢＨ１相同体の発現及び熱安定性
実施例１の完全長遺伝子を目的地ベクターを適合性のあるＡ．ニガー Ｇａｔｅｗａｙ（ジェネンコーが開発）に移した。このベクターを骨格としてｐＲＡＸ１を用いることにより、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング・テクノロジー：バージョン１、第３４−３８頁の所定のマニュアルに従って構築した（図１１に示す）。
【０１９７】
新しく開発した発現ベクターを図１２に示す。これは新しい遺伝子を目的地ベクターｐＲＡＸｄｅｓ２内に移すものである。これにより最終発現ベクターが得られ、ｐＲＡＸｄｅｓＣＢＨ１を呼ぶ（種名で特定）。
【０１９８】
当該構築体をＣａｏ、他に記載の方法に従ってＡ．ニガー ｖａｒ．アワモリ内に形質転換した（Ｃａｏ Ｑ−Ｎ、Ｓｔｕｂｂｓ Ｍ、Ｎｇｏ ＫＱＰ，Ｗａｒｄ Ｍ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ａ，Ｐａｉ ＥＦ，Ｔｕ Ｇ−Ｃ及びＨｏｆｍａｎｎ Ｔ（２０００）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ−ＪＴ２ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｉｎ ｓｕｂｓｉｔｅ Ｓ３ ｔｏ ｋｃａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１−１００１）。
【０１９９】
形質転換を最小培地プレート（Ｂａｌｌａｎｃｅ ＤＪ，Ｂｕｘｔｏｎ ＦＰ、及びＴｕｒｎｅｒ Ｇ（１９８３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １１２：２８４−２８９）上に筋上に加え、４日間、３０℃で成長させた。胞子を当業界に公知の方法を用いて回収した（<http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>を参照）。Ａ．ニデュランス分生子を水中で（胞子を取除くために殺菌湾曲ガラス棒を用いて分生子（ｃｏｎｉｄｉａｔｉｎｇ）培養物の表面を擦ることにより）収集し、生存に深刻な損失を生じることなく４℃で数週間から数ヶ月保存できる。しかしながら、新しく収集した胞子はより繁殖して発芽した。長期保存に関して、胞子は５０％グリセロール中、−２０℃で、または１５−２０％グリセロール中、−８０℃で保存できる。グリセロールは８０％水溶液としてより簡単にピペットで取られる。８００μＬの分生子懸濁水溶液（４℃保存用として作成）を２００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−８０℃保存用に用いる。４００μＬ懸濁液を６００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−２０℃保存用に用いる。凍結前に遠心（ｖｏｒｔｅｘ）する。変異体を回収するため、少量の分生子培養物を摘出し、２０％ グリセロール内に加え、遠心し、及び−８０℃保存として凍結させる。この場合、これらを５０％ グリセロール内、−８０℃で保存する。
【０２００】
Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ形質転換体をウリジンが欠落した最小培地（Ｂａｌｌａｎｃｅ、他、１９８３）上で成長させた。形質転換体を、Ｃａｏ、他（２０００）に記載の通り、胞子形成成長寒天プレートからの１ｃｍ２の胞子懸濁液を１００ｍＬの振とうフラスコ中に３日間、３７℃で植菌することによりセルラーゼ活性をスクリーニングした。
【０２０１】
ＣＢＨ１活性分析は非蛍光４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシドから生成物ラクトース及び７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンへの加水分解に基づき、後者の生成物は蛍光シグナルに関与する。１７０μＬ ５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液 ｐＨ４．５を９６ウェル・マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｌｕｏｔｒａｃ ２００、ａｒｔ．ｎｒ．６５５０７６）中にピペットで取り、蛍光に適している。１０μＬの上澄みを加え、それから１０μＬのＭＵＬ（１ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシド（ＭＵＬ）のｍｉｌｌｉＱ水）を加え、ＭＴＰをＦｌｕｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｄ−７７６５６ Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ）中に置く。反応速度を１６分間（それぞれ１２０秒、８サイクル）、λ３２０ｎｍ（励起）及びλ４６０ｎｍ（発光）を用いて５０℃で測定する。ＣＢＨ活性を有する上澄みをそれから下記の実施例５の説明の通り、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。
【０２０２】
アミノ酸配列を上記実施例１の通り推定した。ＣＢＨ１相同体のアミノ酸配列を図４（ヒポクレア・オリエンタリス）、６（ヒポクレア・シュワイニッチィ）、８（トリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、及び１０（トリコデルマ・プソイドコニンギー）に示す。
【０２０３】
当該相同体の熱安定性は以下の実施例５に説明する通り測定した。
【表２】
【０２０４】
見ての通り、ＣＢＨ１セルラーゼ相同体は野生型と比較して変異体ＣＢＨ１セルラーゼの熱安定性にわずかな影響または悪影響を与えた。当該相同体はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１に緊密に関連しており、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａと相同体間の熱安定性の違いはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中見られるアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を含む部位が熱安定性に関連している可能性を示す。
【０２０５】
実施例３
安定性に重要な部位の同定
上述の実施例２で特徴付けられたＣＢＨ１相同体のアミノ酸配列を、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩとＪ．ｊｅｃｏｒｉｎａ配列を用いて、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅｒｃｈ、２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）を用いて配列した。当該配列を図２に示す。
【０２０６】
ＣＢＨ１酵素の安定性に関連する可能性のある部位をＣＢＨ１を含む相同体の配列配置に基づいて３つの異なる方法で測定した。第１の方法において、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１触媒ドメインと低安定性の少なくとも１の相同体の触媒ドメイン（すなわち、Ｈ．オリエンタリスのみ除く）間で異なる部位をＣＢＨ１の熱安定性に関係する可能性のある部位として同定した。同定された部位は、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＣＢＨ１中のＬ６、Ｐ１３、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｓ４７、Ｔ５９、Ｔ６６、Ｇ８８、Ｎ８９、Ｔ１６０、Ｑ１８６、Ｓ１９５、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｄ２４９、Ｎ２５０、Ｔ２８１、Ｅ２９５、Ｆ３１１、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ａ３３６、Ｋ３５４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、及び／またはＦ４１８である。
【０２０７】
第２の方法において、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａまたはＨ．オリエンタリス中の残基が減少した安定性酵素相同体の全てにおいて見られる残基と同じ場合の部位はＴｍと相関性がない部位を同定した。安定性との関連性を保有するとして同定された部位は、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＣＢＨ１中の、Ｌ６、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｓ４７、Ｔ５９、Ｔ６６、Ｔ１６０、Ｑ１８６、Ｓ１９５、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｇ２４２、Ｄ２４９、Ｔ２８１、Ｅ２９５、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ｋ３５４、及び／またはＰ４１２である。
【０２０８】
最後の方法において、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ及びＨ．オリエンタリスが同じである部位において、Ｈ．シュワイニッチィ中の対応残基がこれらの２つのいずれとも同じまたは異なるが、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａまたはＴ．プソイドコニンギーの対応部位中に異なるアミノ酸を有する場合の部位は酵素の熱安定性に関連する可能性がある部位として考慮した。これらの部位は、実験的にＴｍ安定性との相関性を最もよく示し、Ｑ１８６、Ｓ１９５、Ｅ３２５、Ｔ３３２、及びＰ４１２として同定した。
【０２０９】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中に見られるアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を含む部位の同定を従って、部位飽和突然変異（ｓｉｔｅ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に供した。
【０２１０】
実施例４
ＣＢＨ１変異体の発現
ＰＣＲ断片を実施例１に記載のプライマー及び手順を用いて得た。当該断片をキアゲン・ゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。精製断片を、ここに引用するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー指示マニュアル（バージョンＣ）（インビトロジェン（登録商標））を用いてｐＤＯＮＲ（登録商標）２０１ベクター（インビトロジェン（登録商標））とクロナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）反応を行うために用いた。それから遺伝子をこのエントリー（ＥＮＴＲＹ）ベクターから目的地ベクター（ｐＲＡＸｄｅｓ２）に移動させ、発現ベクターｐＲＡＸＣＢＨ１を得た。
【０２１１】
細胞を所望のセルラーゼ−エンコード核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換させた。宿主細胞、Ａ．ニガーをそれから実施例２に説明するように、所望のセルラーゼの発現可能な条件下で成長させた。
【０２１２】
実施例３で同定された、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１と異なる部位は当該変異体の熱安定性に関連する可能性があるので、従って部位飽和突然変異に供した。
【０２１３】
実施例５
ＣＢＨ１変異体の熱安定性
ＣＢＨ１セルラーゼ変異体を上述の通りクローン及び発現させる（実施例４を参照）。Ｃｅｌ７Ａ野生型及び変異体をそれからカラムクロマトグラフィーによりこれらの培養物の細胞を含まない（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）上澄みから精製する。タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製する。カラムをＢｉｏＣＡＤ（登録商標）Ｓｐｒｉｎｔ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎクロマトグラフィーシステム上でＰｏｒｏｓ（登録商標）２０ＨＰ２樹脂を用いて操作し、これらは両方ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製である。
【０２１４】
ＨＩＣカラムを５カラム体積の０．０２０Ｍ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムを用いてｐＨ６．８で平衡にする。硫酸アンモニウムを上澄みに加え、最終濃度が約０．５Ｍになるようにし、及びｐＨを６．８に調節する。ろ過後、上澄みをカラム上に充填する。充填後、カラムを１０カラム量（ｖｏｌｕｍｅ）の平衡緩衝液で洗浄し、それから１０カラム量で０．５Ｍ硫酸アンモニウムからゼロ硫酸アンモニウム勾配で、ｐＨ６．８、０．０２Ｍリン酸ナトリウム中で溶出させる。Ｃｅｌ７Ａをおおよそ中間勾配で溶出させる。断片を収集し、還元、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析に基づいてプールする。
【０２１５】
融点をＬｕｏ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５６１２の方法に従って測定する。
【０２１６】
データをＡｖｉｖ ２１５円偏光二色性分光計により集める。２１０〜２６０ナノメートルの変異体のスペクトルを２５℃で取る。緩衝液条件は５０ｍＭ ビス−トリス−プロパン／５０ｍＭ 酢酸アンモニウム／氷酢酸、ｐＨ５．５である。タンパク質濃度は０．２５〜０．５ｍｇｓ／ｍＬに維持する。非折り畳みを観測するための最適波長を測定した後、サンプルを同じ緩衝条件下、温度２５℃〜７５℃に傾斜させることにより熱変性させる。データを５秒間、２度毎に回収する。部分的に可逆的な非折り畳みを２３０ナノメートル、０．１ｃｍパス・レングス細胞中で観測する。
【０２１７】
ＣＢＨ１セルラーゼ変異体に導入された変異は、野生型と比較して変異体ＣＢＨ１セルラーゼの熱安定性に好ましく影響する。
【０２１８】
ここに記載される実施例及び実施態様は説明目的のためのみであり、これに照らして種々の修正または変形が当業者に示唆され、本発明の概念及び精神及び請求の範囲の範囲内であることが理解される。ここに記載の全ての文献、特許及び特許出願はその全体を全ての目的においてここに引用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図１はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来の野生型Ｃｅｌ７Ａ（ＣＢＨ１）の核酸（下の行）（配列番号１）及びアミノ酸（上の行）（配列番号２）配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、Ｃｅｌ７ＡファミリーメンバーのＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｔ．リーゼイともいう）（配列番号２）、Ｈ．オリエンタリス（配列番号５）、Ｈ．シュワイニッチィ（配列番号８）、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ（配列番号１１）及びＴ．プソイドコニンギー（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す。また、コンセンサス配列も示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、Ｃｅｌ７ＡファミリーメンバーのＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｔ．リーゼイともいう）（配列番号２）、Ｈ．オリエンタリス（配列番号５）、Ｈ．シュワイニッチィ（配列番号８）、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ（配列番号１１）及びＴ．プソイドコニンギー（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す。また、コンセンサス配列も示す。
【図３】図３はＨ．オリエンタリスＣＢＨ１（配列番号３）のゲノムＤＮＡ配列である。イントロンは太字、下線で示す。
【図４】図４はＨ．オリエンタリスＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号４）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号５）である。
【図５】図５はＨ．シュワイニッチィＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ配列（配列番号６）である。イントロンは太字、下線で示す。
【図６】図６はＨ．シュワイニッチィＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号７）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号８）である。
【図７】図７はＴ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ配列（配列番号９）である。イントロンは太字、下線で示す。
【図８】図８はＴ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号１０）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号１１）である。
【図９】図９はＴ．プソイドコニンギーＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１２）である。イントロンは太字、下線で示す。
【図１０】図１０はＴ．プソイドコニンギーＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号１３）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号１４）である。
【図１１】図１１はｐＲＡＸ１ベクターである。このベクターは、アスペルギルス・ニドランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ゲノムＤＮＡ断片ＡＭＡ１配列の５２５９ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６ １９：５６５−５７４）を挿入したこと以外は、プラスミドｐＧＡＰＴ２に基づく。塩基１〜１１３４はアスペルギルスニガー・グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターを含む。塩基３０９８〜３３５６及び４９５０〜４９７１はアスペルギルスニガー・グルコアミラーゼターミネーターを含む。アスペルギルス・ニドランスｐｙｒＧ遺伝子は３３５７〜４９４９に真菌形質転換のためのマーカーとして挿入した。遺伝子が挿入できるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）も存在する。
【図１２】図１２はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクター骨格である。このベクターはプラスミドベクターｐＲＡＸ１に基づく。ゲートウェイカセットをｐＲＡＸ１ベクター内に挿入した（環状プラスミドの内部の矢印により示す）。このカセットは組換え配列ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２及び選択マーカーｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含む。当該ベクターはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング・テクノロジーのマニュアル：バーション１第３４−３８頁に従って作成し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌ＤＢ３．１中でのみ複製し、その他の大腸菌宿主におけるｃｃｄＢ遺伝子は死滅した。まず、ＰＣＲ断片をａｔｔＢ１／２組換え配列を含むプライマーを用いて作る。この断片をｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェンから市販）を用いて組換える。このベクターはｃａｔＨ及びｃｃｄＢを有するａｔｔＰ１／２組換え配列を組換え部位間に含む。インビトロジェンのＢＰクロナーゼ酵素をこのいわゆるエントリー（ＥＮＴＲＹ）ベクター中に当該ＰＣＲ断片を組み込むために用い、当該ＰＣＲ断片が挿入されたクローンは、ｃｃｄＢを発現するクローンは生存できないので５０μｇ／ｍｌカナマイシンで選択できる。そして、ａｔｔ配列を変異させ、ａｔｔＬ１及びａｔｔＬ２と呼ぶ。２番目の工程はこのクローンをｐＲＡＸｄｅｓ２ベクターと組合わせる（ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２ ｃａｔＨ及びｃｃｃＢを組換え部位間に含む）。インビトロジェンのＬＲクロナーゼ酵素を目的ベクター中のエントリーベクターからの導入を組合わせるために用いる。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを用いると、ｃｃｃＢは死滅し、エントリーベクターはアンピシリン感受性なので、ｐＲＡＸＣＢＨ１ベクターのみ選択される。この方法により、発現ベクターを調製し、Ａ．ニガーを形質転換するために用いることができる。
【図１３】図１３は、アスペルギルス中、ＣＢＨ１相同体または変異体をエンコードする核酸の発現に用いる、ｐＲＡＸｄｅｓ２ｃｂｈ１ベクターの説明である。ＣＢＨ１酵素相同体または変異体をエンコードする核酸は、ａｔｔ配列の相同組換えによりベクター内にクローンした。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００３年３月２１日に出願された米国仮出願番号６０／４５６，３６８号（代理人整理番号、ＧＣ７９３Ｐ）及び２００３年３月２７日に出願された米国仮出願番号６０／４５８，６９６号（代理人整理番号、ＧＣ７９３−２Ｐ）に基づく優先権を主張するものであり、これらすべてをここに引用する。
【０００２】
連邦政府後援による研究開発のもと行われた発明に対する権利に関する陳述
この研究の一部は、米国エネルギー省の元契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７の下、再生可能エネルギー研究所の下請け番号ＺＣＯ−０−３００１７−０１により資金援助されたものである。従って、米国政府は本発明における特定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明はヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）ｊｅｃｏｒｉｎａ（トリコデルマ・リーゼイ）ＣＢＨ１の相同体及び変異体に関する。本発明はセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをエンコードする単離核酸配列に関する。また、本発明は当該核酸配列を含む核酸構築体、ベクター、及び宿主細胞、並びに組換え変異体ＣＢＨポリペプチド及び新規なＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の相同体を生成する方法に関する。
【表１】
【０００４】
発明の背景
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生成される最も豊富な植物材料である。これらは、細菌、酵母及び真菌などの多数の微生物により分解及びエネルギー源として使用でき、これらの微生物はポリマー基質を単糖類に加水分解できる細胞外酵素を生成する（Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、２００１）。非再生材料源の限界が近づいているため、セルロースが主な再生可能エネルギー源となる可能性は非常に大きい（Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．、２００１）。生物プロセスを通じたセルロースの効果的な活用は食料、飼料及び燃料不足の克服手段のひとつである（Ｏｈｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。
【０００５】
セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成を生じる酵素である。セルラーゼは従来から３つの主な分類に分けられる：エンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）、及びβ−グルコシダーゼ（［β］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｓｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。エンドグルカナーゼは主にセルロース繊維のアモルファス部分で作用するのに対し、セロビオヒドロラーゼは結晶セルロースを分解することもできる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ ａｎｄ Ｐｅｎｔｔｉｌａ、１９９５）。従って、結晶セルロースを効果的に可溶化するために、セルラーゼ系中にセロビオヒドロラーゼの存在が必要である（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、ｅｔ ａｌ．２０００）。β−グルコシダーゼはセロビース、セロ−オリゴ糖、及びその他のグルコシド由来Ｄ−グルコース単位の遊離に作用する（Ｆｒｅｅｒ、１９９３）。
【０００６】
セルラーゼは大量の細菌、酵母及び真菌により生成されることが知られる。特定の真菌はセルロース結晶を分解できる完全なセルラーゼ系を生成し、発酵により大量のセルラーゼが容易に生成される。サッカロミセス・セレビシェなど多くの酵母がセルロースの加水分解能を有さないので、糸状菌は特別な役割を担う。例えば、Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、１９８８及びＣｏｕｇｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。
【０００７】
ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの真菌セルラーゼ分類はさらに、各分類内で複数の構成に拡大できる。例えば、複数のＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧは、２つのＣＢＨ（すなわち、ＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩ）、少なくとも８つのＥＧ（すなわち、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩ、ＥＧＩＶ、ＥＧＶ、ＥＧＶＩ、ＥＧＶＩＩ、及びＥＧＶＩＩＩ）及び少なくとも５つのＢＧ（すなわち、ＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４、及びＢＧ５）に関する公知遺伝子を含むトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの多数の真菌源から単離される。
【０００８】
結晶セルロースをグルコースに効果的に変換するためには、結晶セルロースの加水分解にほとんど効果がない単離成分とともに、ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの各分類由来の成分を含む完全なセルラーゼ系が必要である（Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．、１９９６）。それぞれの分類由来のセルラーゼ成分間で相乗関係が観測されている。特に、ＥＧ型セルラーゼ及びＣＢＨ型セルラーゼは相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解する。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５を参照されたい。
【０００９】
セルラーゼは洗剤組成物の洗浄能力を高めるため、柔軟剤としての使用のため、綿織物の手触り及び外観を向上させるため等の使用で、織物処理に有用であることが当業界で公知である（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。
【００１０】
改善された洗浄性能を有するセルラーゼ含有洗剤組成物（米国特許第４，４３５，３０７号；ＧＢ出願番号第２，０９５，２７５号及び第２，０９４，８２６号）及び織物の手触り及び外観を改善させるための織物処理での使用（米国特許第５，６４８，２６３号、第５，６９１，１７８号及び第５，７７６，７５７号；ＧＢ出願番号第１，３５８，５９９号；Ｔｈｅ Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｐｏｒｔ、第２４巻、第５４〜６１頁、１９８６）が開示されている。
【００１１】
従って、真菌及び細菌内で生成されるセルラーゼは著しい注目を集めている。特に、トリコデルマ種の発酵（例えば、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）またはトリコデルマ・リーゼイ）は結晶形態のセルロースを分解できる完全なセルラーゼ系を生成することが示されている。
【００１２】
セルラーゼ組成物については従来から開示されているが、家庭用洗剤、ストーンウォッシュ組成物または洗濯用洗剤等に使用するための新規で改善されたセルラーゼ組成物の必要性が依然としてある。改善された性能を示すセルラーゼは特に関心が高い。
【００１３】
発明の概要
本発明は、ここで所望のセルラーゼとして同定される、単離セルラーゼタンパク質、及び当該所望のセルラーゼをエンコードする核酸を提供する。当該所望のセルラーゼは、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来の変異体ＣＢＨ１、及びヒポクレア・シュワイニッチィ（ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）、ヒポクレア・オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、トリコデルマ・プソイドコニンギー（ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）またはトリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ由来の新規なＣＢＨ１からなる群より選択できる。
【００１４】
変異体ＣＢＨ１セルラーゼを提供し、ここで当該変異体は、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＣＢＨ１における１以上の残基Ｌ６、Ｓ８、Ｐ１３、Ｑ１７、Ｇ２２、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｔ４１、Ｓ４７、Ｎ４９、Ｔ５９、Ｔ６６、Ａ６８、Ｃ７１、Ａ７７、Ｇ８８、Ｎ８９、Ａ１００、Ｎ１０３、Ａ１１２、Ｓ１１３、Ｌ１２５、Ｔ１６０、Ｙ１７１、Ｑ１８６、Ｅ１９３、Ｓ１９５、Ｃ２１０、Ｍ２１３、Ｌ２２５、Ｔ２２６、Ｐ２２７、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｔ２４６、Ｄ２４９、Ｎ２５０、Ｒ２５１、Ｙ２５２、Ｄ２５７、Ｄ２５９、Ｓ２７８、Ｔ２８１、Ｌ２８８、Ｅ２９５、Ｔ２９６、Ｓ２９７、Ａ２９９、Ｎ３０１、Ｆ３１１、Ｌ３１８、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ａ３３６、Ｓ３４１、Ｓ３４２、Ｆ３５２、Ｋ３５４、Ｔ３５６、Ｇ３５９、Ｄ３６８、Ｙ３７１、Ｎ３７３、Ｔ３８０、Ｙ３８１、Ｎ３８４、Ｖ３９３、Ｒ３９４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、Ｆ４１８、Ｇ４３０、Ｎ４３６、Ｇ４４０、Ｐ４４３、Ｔ４４５、Ｙ４６６、Ｔ４７８、Ａ４８１及び／またはＮ４９０に対応する位置に置換または欠失を含む。
【００１５】
第２の側面において、変異体ＣＢＨ１は１以上の残基Ｑ１８６（Ｅ）、Ｓ１９５（Ａ／Ｅ）、Ｅ２３９Ｓ、Ｇ２４２（Ｈ／Ｙ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ａ）、Ｄ２４９（Ｋ／Ｌ／Ｙ／Ｃ／Ｉ／Ｖ／Ｗ／Ｔ／Ｎ／Ｍ）、Ｅ３２５（Ｓ／Ｔ）、Ｔ３３２（Ａ／Ｈ／Ｙ／Ｌ／Ｋ）及びＰ４１２（Ｔ／Ｓ／Ａ）に対応する位置に置換を有する。
【００１６】
第２の実施態様において、本発明はヒポクレア・オリエンタリスＣＢＨ１を提供する。
【００１７】
第３の実施態様において、本発明はヒポクレア・シュワイニッチィＣＢＨ１を提供する。
【００１８】
第４の実施態様において、本発明はトリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａＣＢＨ１を提供する。
【００１９】
第５の実施態様において、本発明はトリコデルマ・プソイドコニンギーＣＢＨ１を提供する。
【００２０】
本発明の他の実施態様において、本発明の所望のセルラーゼをエンコードする核酸を提供する。他の実施態様において、ＤＮＡはベクター内に含まれる。さらに他の実施態様において、ベクターは宿主細胞を形質転換するために用いる。
【００２１】
本発明の他の実施態様において、本発明の所望のセルラーゼを生成する方法を提供する。該方法は所望のセルラーゼをエンコードする核酸で形質転換した宿主細胞を適当な培養基中、適当な条件下で培養して、所望のセルラーゼを生成する工程、及び生成された所望のセルラーゼを回収する工程を含む。
【００２２】
本発明のさらに他の実施態様において、界面活性剤及び所望のセルラーゼを含む洗剤を提供する。本発明の１の側面において、該洗剤は洗濯または食器用洗剤である。本発明の第２の側面において、所望のＣＢＨ１セルラーゼをセルロース含有織物、特にストーンウォッシュまたはインディゴ染色デニムの処理に用いる。もしくは本発明のセルラーゼは飼料添加剤として、木材パルプ処理、及びバイオマスからグルコースへの還元に用いることができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、参照目的のみにより以下の定義及び実施例を用いて詳細を説明する。ここに引用する全ての特許及び文献は、当該特許及び文献内に開示される全ての配列も含めて、明示的にここに引用するものとする。
【００２４】
特段に示す場合を除いて、ここで用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する当業者にとって理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学及び分子生物学の辞典）、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は当業者に本発明で用いる多くの用語の一般的な辞書を提供するものである。ここに記載の方法及び物質に類似または同等のいかなる方法及び物質も本発明を実施及び試験する際に用いることができるが、好ましい方法及び物質を記載する。数値範囲は範囲を定める数字を含める。別に示す場合を除いて、それぞれ核酸は左から右に５’〜３’方向；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。実務者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、１９９３を当業界の定義及び用語のために参照できる。本発明は記載された特定の方法、手順及び試薬に限定されないことは、これらが種々多様であることから当然に理解される。
【００２５】
ここに提供する表題は、明細書全体を参照することにより得られる本発明の種々の側面または実施態様を限定するものではない。従って、下記に定義する用語は明細書全体を参照することによりさらに十分に定義される。
【００２６】
ここに引用する全ての文献は、本発明に関連し得る組成物及び方法を記載及び開示する目的のため参照することによりここに明示的に引用する。
【００２７】
Ｉ．定義
“セルラーゼ”、“セルロース分解酵素” “セルラーゼ酵素”は細菌性または真菌性エキソグルカナーゼまたはエキソセロビオヒドロラーゼ、及び／またはエンドグルカナーゼ、及び／またはβ−グルコシダーゼを意味する。これらの３つの異なる種類のセルラーゼ酵素はセルロース及びその誘導体をグルコースに変換するために相乗的に作用する。
【００２８】
多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を生成し、例えば木材腐朽菌トリコデルマ、土壌細菌Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、バチルス、及びセルロモナス；ストレプトマイセス；及び真菌フミコーラ、アルペルギルス及びフサリウムなどがある。これらの微生物から作られる酵素は、セルロースをグルコースに変換するのに有用な３種の作用を有するタンパク質の混合物：すなわち、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼである。
【００２９】
ここで用いる“所望のセルラーゼ”とは以下のいずれか１つを意味する：
ａ）本発明に従うヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来の変異体ＣＢＨ１；
ｂ）Ｈ．オリエンタリス由来のＣＢＨ１相同体；
ｃ）Ｈ．シュワイニッチィ由来のＣＢＨ１相同体；
ｄ）Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ由来のＣＢＨ１相同体；
ｅ）Ｔ．プソイドコニンギー由来のＣＢＨ１相同体、及び
ｆ）ストリンジェントな条件下でａ−ｅのいずれか１つをエンコードする核酸とハイブリダイズする核酸によりエンコードされるポリペプチド。
【００３０】
ここで用いる“所望のセルラーゼ−エンコード核酸”は以下のいずれか１つを意味する：
ａ）本発明に従うヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来の変異体ＣＢＨ１をエンコードする核酸；
ｂ）図３に示す配列を有するＨ．オリエンタリス由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸；
ｃ）図５に示す配列を有するＨ．シュワイニッチィ由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸；
ｄ）図７に示す配列を有するＴ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸；
ｅ）図９に示す配列を有するＴ．プソイドコニンギー由来のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸、及び
ｆ）ストリンジェントな条件下で上述のａ−ｅのいずれか１つにより提供される核酸のいずれか１つとハイブリダイズする核酸。
【００３１】
“変異体”とは、アミノ酸配列において１以上の異なる部位で１以上のアミノ酸が置換した前駆体タンパク質（例えば、天然タンパク質）由来のタンパク質を意味する。酵素変異体の調製は、好ましくは天然タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を修飾し、該ＤＮＡ配列を適当な宿主内に形質転換し、及び該修飾ＤＮＡ配列を発現させて、誘導体酵素または酵素変異体を形成することにより達成する。本発明の変異体ＣＢＨ１酵素は前駆体酵素アミノ酸配列と比較して変異したアミノ酸配列を含むペプチドを含み、変異体ＣＢＨ１酵素は前駆体酵素の特徴的なセルロース分解性は保持するが、特定の側面において変異特性を有し得る。例えば、変異体ＣＢＨ１酵素は増加したｐＨ最適条件または増加した温度または酸化安定性を有し得るが、特徴的なセルロース分解活性は保持する。
【００３２】
ここで用いる“遺伝子”の語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、コード領域の先行及び後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または“リーダー”配列及び３’ＵＴＲまたは“トレーラー”配列、及び個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）などを含んでも含まなくてもよい。
【００３３】
本発明の“糸状菌”は真核微生物であり、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ細目の全ての糸状形態を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（入門菌類学），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙを参照）。これらの真菌はキチン、セルロース及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、及び遺伝学的に酵母とはっきりと区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、Ｓ．セレビシェなどの酵母による栄養増殖は単細胞性葉状体の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。Ｓ．セレビシェは突出した、非常に安定な複相を有し、一方、複相は、例えばアスペルギルス及びニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）など糸状菌における減数分裂前のごく短期間だけに存在する。特定条件下で酵母は偽菌糸成長を示すが、このことにより酵母が糸状菌の定義内に入るということにはならないことが理解される。Ｓ．セレビシェは１７の染色体を有し、一方、Ａ．ニデュランス及びアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）はそれぞれ８及び７の染色体を有する。Ｓ．セレビシェと糸状菌間のさらなる違いとして、Ｓ．セレビシェはアスペルギルス及びトリコデルマ・イントロンを処理できず、糸状菌の多くの転写制御因子を認識できない（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．他．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，２１−２６）。
【００３４】
核酸の一部に言及して用いる“異種”の語は、当該核酸が、通常は同じ関係において天然では見られない２以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、当該核酸は通常、遺伝子組換えにより生成し、例えば新しい機能的核酸を作るために配置した関連性のない遺伝子から２以上の配列を有し、例えば、１の供給源からプロモーターを有し、他の供給源からコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は同じ関係でお互いに天然では見られない２以上のサブ配列をいうことも多い（例えば、融合タンパク質）。
【００３５】
“異種”核酸構築体または配列は、発現する細胞に天然ではない配列の一部を有する。制御配列に関して異種とは、発現が目下調節している同じ遺伝子を調節するために天然では機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）をいう。通常、異種核酸配列はそれが存在する細胞またはゲノムの一部に内生のものではなく、挿入、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等により細胞に加えられたものである。“異種”核酸構築体は、天然細胞に見られる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同じまたは異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含む。
【００３６】
ここで用いる“単離”または“精製”の語は、天然に結合する少なくとも１の成分から除去された核酸またはアミノ酸をいう。
【００３７】
ここで用いる、“プロモーター”の語は下流遺伝子の転写に導くように作用する核酸配列をいう。プロモーターは通常、標的遺伝子が発現する宿主細胞に適したものである。プロモーターはその他の転写及び翻訳調節核酸配列（“制御配列”とも呼ぶ）と一緒に所定の遺伝子を発現するために必要である。通常、転写及び翻訳調節配列は、限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列及びエンハンサーまたは活性化配列を含む。
【００３８】
通常、“プロモーター配列”は発現のために特定の糸状菌に認識されるＤＮＡ配列である。“構造”プロモーターはほとんどの環境及び発育条件下で活性なプロモーターである。“誘導性”プロモーターは環境または発育調整下で活性なプロモーターである。本発明で有用な誘導性プロモーターの例は、ジェンバンクにアクセッション番号Ｄ８６２３５で寄託されているＴ．リーゼイ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｃｂｈ１プロモーターである。他の側面において、プロモーターはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のｃｂｈＩＩまたはキシラナーゼプロモーターである。
【００３９】
典型的なプロモーターは、Ａ．アワモリまたはＡ．ニガーグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．他（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２３０６−２３１５；Ｂｏｅｌ，Ｅ．他（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，１５８１−１５８５）、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ カルボキシル・プロテアーゼ遺伝子、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．他（１９８４）欧州特許出願番号第ＥＰＯ０１３７２８０Ａ１）由来のプロモーター、Ａ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，１４７０−１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７−４５）、Ａ．ニデュランスａｌｃＡ遺伝子（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．他（１９８６）Ｇｅｎｅ３３、１３７−１４９）、Ａ．ニデュランスｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．他（１９８６）Ｃｅｌｌ４６，１４３−１４７）、Ａ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．他（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，１４３０−１４３９）、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｘｌｎ１遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｃｂｈ２遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｅｇｌ１遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｅｇｌ２遺伝子、Ｈ．ｊｏｃｏｒｉｎａ ｅｇｌ３遺伝子、及びＳＶ４０早期プロモーターなどの高等真核プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．Ｌ．とＥ．Ｍｅｌｌｅｒ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，２１１７−２１３０）を含む。
【００４０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に位置する場合、“動作可能に連結”する。例えば、分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）をエンコードするＤＮＡ、すなわちシグナルペプチドは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に動作可能に連結し；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するために位置する場合、コード配列に動作可能に連結する。通常、“動作可能に連結する”とは、連結ＤＮＡ配列が隣接しており、及び分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位で連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド・アダプタまたはリンカーを従来実務に従って用いる。従って、“動作可能に連結”の語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、転写因子結合部位配列）と第２の核酸配列間の機能的結合をいい、発現制御配列は第２の配列に対応する核酸の転写を目的とする。
【００４１】
ここで定義する“キメラ遺伝子”または“異種核酸構築体”は、調節因子などを含む種々の遺伝子部分からなる非天然遺伝子（すなわち、宿主内に導入された遺伝子）をいう。宿主細胞を形質転換するためのキメラ遺伝子構築体は一般的に、異種タンパク質コード配列に動作可能に連結した、または選択マーカーキメラ遺伝子内で、形質転換細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をエンコードする選択マーカー遺伝子に動作可能に連結した転写調節領域（プロモーター）からなる。宿主細胞内への形質転換のため、本発明の一般的なキメラ遺伝子は、構造性または誘導性の転写調節領域、タンパク質コード配列、及びターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構築体は、標的タンパク質の分泌を望む場合、シグナルペプチドをエンコードする第２のＤＮＡ配列も含むことができる。
【００４２】
細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる“組換え体”の語は、該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の挿入により、または天然核酸またはタンパク質の変異により修飾されたこと、または該細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は当該細胞の天然（非組換え）型内では見られない遺伝子を発現し、または発現、または全く発現しない条件下で、通常は異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００４３】
“分泌シグナル配列”の語は、大ポリペプチドの構成要素として、ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路から当該大ポリペプチドに導かれるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をエンコードするＤＮＡ配列を示す。当該大ペプチドは普通は分割されて、分泌経路を通過する際に分泌ペプチドが取り除かれる。
【００４４】
ここで用いる、“セルラーゼ調製物全体”及び“セルラーゼ組成物全体”の語句は交換可能に用いられ、天然及び非天然組成物の両方をいう。“天然”組成物は天然源により生成した組成物であり、１以上のセロビオヒドロラーゼ型、１以上のエンドグルカナーゼ型、及び１以上のβ−グルコシダーゼ成分を含み、これらの各成分は供給源より生じた比率で見られる。天然組成物はセルロース分解酵素が非修飾の微生物から生成したものであり、従って当該成分酵素の比率は天然微生物により生成したものから変更されていない。
【００４５】
“非天然”組成物は、（１）天然比率または非天然、すなわち変更された比率で成分をセルロース分解酵素と混合；または（２）１以上のセルロース分解酵素を過剰発現または過少発現するように微生物を修飾；または（３）少なくとも１のセルロース分解酵素が欠失するように微生物を修飾することにより生成したこれらの組成物を包含する。
【００４６】
“同等残基”は前駆体セルラーゼの三次構造レベルで相同性を測定することにより定義することもでき、その三次構造はＸ線結晶法により測定される。同等残基は、セルラーゼ及びヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子の原子座標が配列後、０．１３ｎｍ以内、及び好ましくは０．１ｎｍである残基として定義される（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ及びＯ上のＯ）。配置は、最良モデルを配向及び位置して、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１に対する問題のセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大重複を得た後に達成される。最良モデルは利用可能な最も高い解像度において実験回折データの最も低いＲ因子を与える結晶学モデルである。
【式１】
【００４７】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の特定残基に機能的に類似した同等残基は、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の特定残基の特徴とする、それに起因したタンパク質構造、基質結合または触媒を変異、修飾または寄与するような立体構造を採用するセルラーゼアミノ酸として定義される。さらに、これらは、所定残基の主鎖原子は相同位置の占有に基づいて同等性基準を満たさないかもしれなが、当該残基の少なくとも２つの側鎖原子の原子座標がＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨの対応側鎖原子が０．１３ｎｍである範囲内において、類似位置を占有するセルラーゼの残基（三次構造はＸ線結晶法により得る）である。
【００４８】
“核酸分子”の語はＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子を含む。当然のことながら、遺伝コードの縮退の結果、ＣＢＨ１など所定タンパク質をエンコードする複数のヌクレオチド配列が生じ得る。本発明は、可能性のある全てのＣＢＨ１をエンコードする変異ヌクレオチド配列を意図するものであり、その全てが遺伝コードの縮退を生じ得る。
【００４９】
ここで用いる“ベクター”の語は、異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築体をいう。“発現ベクター”とは、外来細胞中に異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核及び真核発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
【００５０】
従って、“発現カセット”または“発現ベクター”は、標的細胞中で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定核酸要素を用いて、組換え技術により、または合成的に生成した核酸構築体である。組換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片内に組み込むことができる。一般的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。
【００５１】
ここで用いる“プラスミド”の語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体をいい、多くの細菌及びいくつかの真核性物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する。
【００５２】
ここで用いる“選択マーカーエンコードヌクレオチド配列”とは、細胞内で発現できるヌクレオチド配列をいい、ここで選択マーカーの発現により発現遺伝子を含む細胞は、対応する選択剤の存在下、または対応する選択成長条件下で成長できる能力が備わる。
【００５３】
通常、変異体ＣＢＨ１をエンコードする核酸分子は中から高ストリンジェンシー条件下でここに配列番号（天然Ｈ．ｈｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１）として提供する野生型配列にハイブリダイズする。しかしながら、場合によっては実質的に異なるコドン使用を有するＣＢＨ１エンコードヌクレオチド配列を用いこともあるが、ＣＢＨ１エンコードヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質は天然タンパク質と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コード配列は特定の原核または真核生物発現系内でのより速いＣＢＨ１発現を促進するために、宿主に利用される特定コドン頻度に従って修飾できる。Ｔｅ’ｏ、他（２０００）、は例えば、糸状菌内での遺伝子発現の最適化について記載している。
【００５４】
核酸配列は、２つの配列が特異的に中程度から高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でお互いにハイブリダイズする場合、対照核酸配列に“選択的にハイブリダイズ”すると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、“最大ストリンジェンシー”は通常、約Ｔｍ−５℃で起こり（プローブのＴｍより５℃低い）；“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５−１０℃低く；“中間”または“中ストリンジェンシー”はプローブのＴｍより約１０−２０℃低く；及び“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０−２５℃低い。機能的に、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密に同一またはほぼ厳密に同一な配列を同定するために用いることができ、高ストリンジェンシー条件はプローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために用いる。
【００５５】
中程度から高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当業界に公知である（例えば、明示的にここに引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、第９章及び１１章、及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３を参照）。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーション、及び続いて２Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中、室温で２回洗浄及びさらに０．１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、４２℃で２回洗浄を含む。
【００５６】
ここで用いる細胞に関する“形質転換”、“安定に形質転換された”または“トランスジェニック”の語は、細胞が、ゲノム内に統合された、または複数の世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして非天然（異種）核酸配列を有することを意味する。
【００５７】
ここで用いる“発現”の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
【００５８】
細胞への核酸配列の挿入に関する“導入”の語は“トランスフェクション”または“形質転換”または“形質導入”を意味し、原核または真核細胞内への核酸配列の組込みに関する場合を含み、ここで核酸配列は細胞のゲノム内（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれることができ、自己レプリコンに変換され、または一時的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００５９】
“所望のセルラーゼ発現”の語は所望のセルラーゼ遺伝子の転写及び翻訳、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセッシングポリペプチドの生成物ということになる。例として、ＣＢＨ１発現の分析は、ＣＢＨ１タンパク質のウエスタンブロット、ＣＢＨ１ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、及びＳｈｏｅｍａｋｅｒ Ｓ．Ｐ．及びＢｒｏｗｎ Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８，５２３：１３３−１４６）及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）に記載のエンドグルカナーゼ活性分析を含む。
【００６０】
“選択的スプライシング”の語は、複数のポリペプチドイソ型が１の遺伝子から生じるプロセスをいい、遺伝子の全部ではないがいくつかの転写処理中、非連続エキソンを一緒にスプライシングすることに関する。従って、特定のエキソンはメッセンジャーＲＮＡを形成するためにいくつかの選択的エキソンのいずれかひとつに結合することができる。選択的スプライスｍＲＮＡはポリペプチド（“スプライス変異体”）を生成し、共通する部分もあれば異なる部分もある。
【００６１】
“宿主細胞”の語はベクターを含み、複製及び／または転写または発現構築体の転写及び翻訳（発現）を助ける細胞を意味する。本発明で用いる宿主細胞は大腸菌などの原核細胞または酵母などの真核細胞、植物、昆虫、両生類または哺乳類細胞などの細胞である。通常、宿主細胞は糸状菌である。
【００６２】
“セルラーゼ”の語はセルロースポリマーをより短いセロ−オリゴ糖オリゴマー、セロビオース及び／またはグルコースに加水分解できる酵素分類をいう。多数のセルラーゼの例として、例えば、エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びグルコシダーゼは、セルロース分解性生物、特に真菌、植物及び細菌から得られる。
【００６３】
ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来ＣＢＨ１はグリコシル加水分解酵素群７（従って、Ｃｅｌ７）の一種であり、具体的には、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ中で最初に同定された当該群の種類である（従って、Ｃｅｌ７Ａ）。グリコシル加水分解酵素群７はエンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼ／エキソグルカナーゼの両方を含み、ＣＢＨ１は後者である。従って、ＣＢＨ１、ＣＢＨ−１型タンパク質及びＣｅｌ７セロビオヒドロラーゼは交換可能に用いることができる。
【００６４】
ここで用いる“セルロース結合ドメイン”の語は、セルラーゼのアミノ酸配列の一部をいい、またはセルラーゼまたはその誘導体のセルロース結合活性に関する酵素領域をいう。セルロース結合ドメインまたは各要素は通常、セルラーゼのセルロース、セルロース誘導体またはその他の多糖類同等物への非共有結合により作用する。セルロース結合ドメインは、触媒コア領域を構造的に区別することによりセルロース繊維の加水分解を促進または可能にし、通常、触媒コアの独立に作用する。従って、セルロース結合ドメインは触媒コアに起因する大きな加水分解活性は有さない。言いかえると、セルロース結合ドメインは、触媒活性を有する構造的因子から区別されるセルラーゼ酵素タンパク質三次構造の構造的因子である。
【００６５】
ここで用いる“界面活性剤”の語は、表面活性特性を有するものとして当業界で通常認識されている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性界面活性剤を含み、例えば洗剤において通常見られるものである。陰イオン性界面活性剤は、直鎖または分岐鎖アルキルベンゼンスルフォネート；直鎖または分岐鎖アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォネート；及びアルカンスルフォネートが挙げられる。両性界面活性剤は第４級アンモニウム塩スルフォネート及びベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。当該両性界面活性剤は同じ分子内に正及び負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤はポリオキシアルキレンエーテル及び高脂肪酸アルカノールアミドまたはその酸化アルキレン付加、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含むことができる。
【００６６】
ここで用いる“セルロース含有繊維”の語は、セルロースを含有する綿または非綿、またはセルロースブレンド、例えば天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、ジュート（黄麻）、亜麻布、ラミー、レーヨン及びリヨセル）を含有する綿または非綿から作られた任意の織布または不織布、糸または繊維をいう。
【００６７】
ここで用いる、“綿含有繊維”の語は、純粋な綿または綿ブレンドから作られた織布または不織布、糸または繊維をいい、綿織物、綿ニット、綿デニム、綿糸、原綿等を含む。
【００６８】
ここで用いる、“ストーンウォッシュ組成物”の語は、セルロース含有繊維をストーンウォッシュする際に用いる製剤をいう。ストーンウォッシュ組成物は販売前、すなわち製造プロセス時にセルロース含有繊維を修正するために用いる。これに対し、洗剤組成物は汚れた衣類の洗浄を目的とするものであり、製造プロセス時には用いられない。
【００６９】
ここで用いる“洗剤組成物”の語は汚れたセルロース含有繊維を洗濯するための洗浄手段で用いることを意図した混合物をいう。本発明において、当該組成物はセルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光色素、ケーキング防止剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤及び可溶化剤を含むことができる。
【００７０】
ここで用いる“ｃｂｈ１遺伝子発現の減少または除去”とは、ｃｂｈ１遺伝子がゲノムから欠失され、従って組換え宿主微生物により発現できないこと；またはｃｂｈ１遺伝子が修飾され、機能的ＣＢＨ１酵素が宿主微生物により生成されないことを意味する。
【００７１】
“変異ｃｂｈ１遺伝子”または“変異ＣＢＨ１”の語はそれぞれ、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来ｃｂｈ１遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／または操作することにより変異されたこと、または発現タンパク質のアミノ酸配列がここに記載の発明に一致するように修飾されたことを意味する。
【００７２】
ここで用いる“活性”及び“生物活性”の語は、特定タンパク質に関する生物活性をいい、ここで交換可能に用いられる。例えばプロテアーゼに関する酵素活性はタンパク質分解性であり、従って、プロテアーゼはタンパク質分解活性を有する。従って、所定タンパク質の生物活性は通常、当業者とって当該タンパク質に起因する任意の生物活性をいうことになる。
【００７３】
酵素溶液中で用いる場合、相同体または変異ＣＢＨ１成分は通常、バイオマスからの可溶性糖の放出速度を最高にするために十分な量で加える。加える相同体または変異ＣＢＨ１成分の量は、糖化されるバイオマスの種類に依存し、当業者により容易に測定できる。しかしながら、使用時の、セルラーゼ組成物中に存在するＥＧ型成分と比較した、相同体または変異ＣＢＨ１成分の重量％は、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、または好ましくは約２０重量％〜好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは約４５、または好ましくは約５０重量％である。さらに、好ましい範囲は約０．５〜約１５重量％、約０．５〜約２０重量％、約１〜約１０重量％、約１〜約１５重量％、約１〜約２０重量％、約１〜約２５重量％、約５〜約２０重量％、約５〜約２５重量％、約５〜約３０重量％、約５〜約３５重量％、約５〜約４０重量％、約５〜約４５重量％、約５〜約５０重量％、約１０〜約２０重量％、約１０〜約２５重量％、約１０〜約３０重量％、約１０〜約３５重量％、約１０〜約４０重量％、約１０〜約４５重量％、約１０〜約５０重量％、約１５〜約２０重量％、約１５〜約２５重量％、約１５〜約３０重量％、約１５〜約３５重量％、約１５〜約４０重量％、約１５〜約４５重量％、約１５〜約５０重量％である。
【００７４】
ＩＩ．宿主微生物
糸状菌は、細目の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての線状体を含む。糸状菌はキチン、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖類からなる細胞壁を有する栄養菌糸、及び菌糸伸長による栄養成長並びに偏性好気性の炭素異化を特徴とする。
【００７５】
本発明において、糸状菌親細胞は限定されないが、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラチアタム、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアナム；ペニシリン種；フミコーラ・インソレンス及びフミコーラｇｒｉｓｅａなどのフミコーラ種；Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅなどのクリソスポリウム種；グリオクラディウム種；アスペルギルス種；フサリウム種、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア種及びエメリセラ種の一連の細胞である。ここで用いる“トリコデルマ”または“トリコデルマ種”の語は、既にトリコデルマとして分類されている、または最近トリコデルマとして分類された任意の真菌株をいう。
【００７６】
１の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓまたはアスペルギルス・ニデュランス細胞である。
【００７７】
他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はトリコデルマ・リーゼイ細胞である。
【００７８】
ＩＩＩ．セルラーゼ
セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生じる酵素として当業界に公知である。上述の通り、セルラーゼは従来から３つの主な分類に分けられる：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ、他、１９８７；Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。
【００７９】
特定の真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼまたはＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはＥＧ型セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼまたはＢＧ型セルラーゼを含む完全なセルラーゼ系を生じる（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。しかしながら、これらの系はＣＢＨ型セルラーゼを欠く場合があり、また、細菌性セルラーゼは通常ＣＢＨ型セルラーゼを含まないか、またはほとんど含まない。さらに、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解することが示されている。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５を参照されたい。異なる成分、すなわち、複数成分または完全なセルラーゼ系中の種々のエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼは通常、等電点、分子量、糖化度、基質特異性及び酵素作用パターンなど異なる性質を有する。
【００８０】
また、セルラーゼ組成物は綿含有織物を分解し、織物の強度を損なうことも示されており（米国特許第４，８２２，５１６号）、市販の洗剤用途にセルラーゼ組成物が用いにくい原因となっている。エンドグルカナーゼ成分を含むセルラーゼ組成物は完全なセルラーゼ系を含む組成物と比較して、綿含有織物の損失強度の減少を示すことが示唆されている。
【００８１】
また、セルラーゼはセルロースバイオマスからエタノールへの分解（ここでセルラーゼはセルロースをグルコースに分解し、酵母またはその他の微生物がさらにグルコースを発酵してエタノールになる）、機械パルプの処理（Ｐｅｒｅ、他、１９９６）、飼料添加物としての使用（ＷＯ９１／０４６７３）及び穀物湿式粉砕に有用であることが示されている。
【００８２】
ほとんどのＣＢＨ及びＥＧは、リンカーペプチドによりセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離したコアドメインからなるマルチドメイン構造を有する（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、他、２０００）。コアドメインは活性部位を含むのに対し、ＣＢＤは酵素をセルロースに結合させることによりセルロースと相互作用する（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８６；Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。ＣＢＤは結晶セルロースの加水分解において特に重要である。結晶セルロースを分解するセロビオヒドロラーゼの能力はＣＢＤが不存在の場合には明確に減少することが示されている（Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｔｅｅｒｉ、１９９７）。しかしながら、ＣＢＤの正確な役割及び活性メカニズムは依然として推論のままである。ＣＢＤはセルロースの表面で効果的な酵素濃度を単に増加させることによって（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、他、１９９１）、及び／またはセルロース表面からセルロース一本鎖を解くことにより（Ｔｏｒｍｏ、他、１９９６）、酵素活性を高めることが示唆されている。異なる基質上のセルラーゼドメインの効果に関する研究の大部分はセロビオヒドロラーゼのコアタンパク質を用いて行われており、それらのコアタンパク質はパパインを用いた限定タンパク質分解により容易に生成できる（Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、例として：トリコデルマ・リーゼイ由来：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ、他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１−６９６、１９８３（ＣＢＨＩについて記載）；Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．他、Ｇｅｎｅ，５１：４３−５２、１９８７（ＣＢＨＩＩについて記載）が挙げられる。トリコデルマ以外の種由来のセルラーゼも例えば以下の文献に記載されている：Ｏｏｉ、他、１９９０（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生成されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を記載）；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ，他、１９９６（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来β−グルコシダーゼ１をエンコードするｃＤＮＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；Ｓａｋａｍｏｔｏ、他、１９９５（アスペルギルス・カワチＩＦＯ４３０８由来エンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ１をエンコードするｃＤＮＡ配列を開示）；Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ、他、１９９０（エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａ）由来エンドグルカナーゼを開示）；Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．、１９９４（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ由来好熱性βグルカナーゼをコードする、ｂｇｌＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；及びＨａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ Ｓ、他、１９９８（グリコシル加水分解酵素群１２の熱安定性セルラーゼをエンコードするＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ遺伝子のクローニング、シーケンシング及び過剰発現を開示）。しかしながら、熱応力条件下、または界面活性剤の存在下での改善された特性、増加した特異活性、変異した基質開裂パターン、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベル発現など、改善された特性を有する新規なセルラーゼの同定及びキャラクタリゼーションの必要性が依然として存在する。
【００８３】
様々な量のＣＢＨ型セルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物の開発は以下の用途に注目されている：（１）洗浄能力の向上、柔軟剤としての機能及び／または綿織物の手触りの改善を示す洗剤組成物（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）での使用；（２）木材パルプまたはその他のバイオマスを糖に分解する組成物での使用（例えば、バイオ−エタノール生成）；及び／または（３）飼料組成物での使用。
【００８４】
ＩＶ．分子生物学
１の実施態様において、本発明は糸状菌において機能的なプロモーターの制御下、所望のセルラーゼ遺伝子の発現を提供する。従って、本発明は組換え遺伝学の分野における一般的な技術に依拠する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本テキストは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（遺伝子導入及び発現）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、編集。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
【００８５】
Ａ．相同ＣＢＨ１遺伝子の同定方法
野生型Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の核酸配列は図１に示す。１の側面において、本発明はここに記載のＣＢＨ１相同体をエンコードする核酸分子を包含する。核酸はＤＮＡ分子であってもよい。
【００８６】
相同体ＣＢＨ１−エンコードＤＮＡ配列を単離するために用いることができる技術は当業者に公知であり、限定されないが、相同ＤＮＡプローブを用いるｃＤＮＡ及び／またはゲノムライブラリースクリーニング及び活性分析またはＣＢＨ１に対する抗体を用いる発現スクリーニングを含む。これらのいずれの方法もＳａｍｂｒｏｏｋ、他、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）で見ることができる。
【００８７】
Ｂ．ＣＢＨ核酸配列の変異方法
変異を導入できる当業界で公知のいかなる方法も本発明で使用できる。
【００８８】
本発明は変異ＣＢＨ１の発現、精製及び／または単離、及び使用に関する。これらの酵素は、好ましくはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来ｃｂｈ遺伝子を利用した組換え方法により調製する。
【００８９】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａからｃｂｈ１遺伝子を単離及びクローニングした後、部位特異的突然変異誘発法などの当業者に公知のその他の方法を用いて、発現ＣＢＨ１変異体中の置換アミノ酸に対応する置換、付加または欠失を作成する。繰返しになるが、部位特異的突然変異誘発及びＤＮＡレベルで発現タンパク質中にアミノ酸変化を組込むその他の方法は、Ｓａｍｂｒｒｏｋ。他及びＡｕｓｕｂｅｌ、他に見ることができる。
【００９０】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１のアミノ酸配列変異体をエンコードするＤＮＡは当業界に公知の種々の方法により調製できる。これらの方法は、限定されないが、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１をエンコードする先に調製したＤＮＡの、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異法、カセット突然変異法が挙げられる。
【００９１】
部位特異的突然変異誘発法は置換変異体の調製に好ましい方法である。当該技術は当業界に公知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）及びＫｕｎｋｅｌ、他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８７）を参照）。つまり、ＤＮＡの部位特異的突然変異を行うことで、出発ＤＮＡはまず所望の変異をエンコードするオリゴヌクレオチドを当該出発ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイジングすることにより変異される。ハイブリダイゼーション後、当該ハイブリダイズオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いながらＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖全体を合成する。従って、所望の変異をエンコードするオリゴヌクレオチドは得られた二本鎖ＤＮＡ内に組込まれる。
【００９２】
また、ＰＣＲ突然変異誘発も出発ポリペプチド（すなわち、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１）のアミノ酸配列変異体を作るのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第１７７−１８３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；及びＶａｌｌｅｔｔｅ，他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）を参照されたい。つまり、少量のテンプレートＤＮＡを出発物質としてＰＣＲで用いる場合、テンプレートＤＮＡの対応領域と配列がわずかに異なるプライマーは比較的大きな量の特定ＤＮＡ断片を生じるために用いることができ、当該特定ＤＮＡ断片は、プライマーがテンプレートと異なる位置においてのみテンプレート配列と異なる。
【００９３】
変異体、カセット突然変異誘発を調製する他の方法は、Ｗｅｌｌｓ、他、Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）に記載の技術に基づく。出発物質は変異される出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクター）である。変異する出発ＤＮＡ中のコドンを同定する。同定された変異部位の各部位上に固有の制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制限部位が存在しない場合、上述のオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発法を用いて制限部位を作ることができ、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適当な位置に導入できる。プラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断し、線状にする。制限部位間のＤＮＡ配列をエンコードするが、所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは標準手順を用いて合成でき、オリゴヌクレオチドの２つのストランドは別々に合成し、それから標準技術を用いて一緒にハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットは５’及び３’末端を有するように設計し、これらは線形化プラスミドの末端と適合し、従って、プラスミドに直接連結できる。このプラスミドは変異ＤＮＡ配列を含む。
【００９４】
もしくは、またはそれに加えて、所望のセルラーゼをエンコードする所望のアミノ酸配列を決定でき、そのようなアミノ酸配列変異体をエンコードする核酸配列を合成して生成できる。
【００９５】
そのように調製した所望のセルラーゼはさらに修飾でき、セルラーゼの使用目的に依存することが多い。当該修飾はアミノ酸配列のさらなる変異、異種ポリペプチドへの融合及び／または共有結合修飾を含む。
【００９６】
Ｖ．ｃｂｈ１核酸及びＣＢＨ１ポリペプチド
Ａ．変異体ｃｂｈ−型核酸
ＣＢＨ１変異体をエンコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築体内にクローンした後、当該ＤＮＡを微生物の形質転換に用いる。本発明に従って変異体ＣＢＨ１を発現するために形質転換される微生物はトリコデルマ種由来の株を有利に含むことができる。従って、本発明に従って変異体ＣＢＨ１セルラーゼを調製するための好ましい方法は、変異体ＣＢＨ１の一部または全部をエンコードするＤＮＡの少なくとも断片を含むＤＮＡ構築体を用いてトリコデルマ種宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築体は通常、プロモーターを機能的に付随する。形質転換宿主細胞を続いて所望のタンパク質を発現する条件下で成長させる。その後、所望のタンパク質生成物を精製し、実質的に均一にする。
【００９７】
しかしながら、実際に、変異ＣＢＨ１をエンコードする所定ＤＮＡの最良の発現媒体がＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａではない場合も考えられる。従って、変異体ＣＢＨ１の微生物源と系統発生類似性を有する形質転換宿主で当該タンパク質を発現することが最も有利かもしれない。他の実施態様において、アスペルギルス・ニガーを発現媒体として用いることができる。Ａ．ニガーを用いる形質転換技術の記載に関しては、ここに開示の内容を引用するＷＯ９８／３１８２１を参照されたい。
【００９８】
従って、トリコデルマ種発現系の本発明の記載は説明目的のみのため提供するものであり、本発明の変異体ＣＢＨ１を発現する１の選択肢として提供するものである。しかしながら、当業者は適切な場合に種々の宿主細胞中で変異体ＣＢＨ１をエンコードするＤＮＡを発現させるものであると考えられ、最適な発現宿主を決定する際に変異体ＣＢＨ１の供給源を考慮すべきであることは当然である。さらに、本発明の分野の当業者は、当業界で利用可能な手段を利用して一般的な技術により特定遺伝子のために最良な発現系を選択することができる。
【００９９】
Ｂ．変異体ＣＢＨ１ポリペプチド
野生型Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１のアミノ酸配列は図１に示す。変異体ＣＢＨ１ポリペプチドはヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来ＣＢＨ１中の１以上の以下の残基に対応する位置で置換または欠失を含む：Ｌ６、Ｓ８、Ｐ１３、Ｑ１７、Ｇ２２、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｔ４１、Ｓ４７、Ｎ４９、Ｔ５９、Ｔ６６、Ａ６８、Ｃ７１、Ａ７７、Ｇ８８、Ｎ８９、Ａ１００、Ｎ１０３、Ａ１１２、Ｓ１１３、Ｌ１２５、Ｔ１６０、Ｙ１７１、Ｑ１８６、Ｅ１９３、Ｓ１９５、Ｃ２１０、Ｍ２１３、Ｌ２２５、Ｔ２２６、Ｐ２２７、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｔ２４６、Ｄ２４９、Ｎ２５０、Ｒ２５１、Ｙ２５２、Ｄ２５７、Ｄ２５９、Ｓ２７８、Ｔ２８１、Ｌ２８８、Ｅ２９５、Ｔ２９６、Ｓ２９７、Ａ２９９、Ｎ３０１、Ｆ３１１、Ｌ３１８、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ａ３３６、Ｓ３４１、Ｓ３４２、Ｆ３５２、Ｋ３５４、Ｔ３５６、Ｇ３５９、Ｄ３６８、Ｙ３７１、Ｎ３７３、Ｔ３８０、Ｙ３８１、Ｎ３８４、Ｖ３９３、Ｒ３９４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、Ｆ４１８、Ｇ４３０、Ｎ４３６、Ｇ４４０、Ｐ４４３、Ｔ４４５、Ｙ４６６、Ｔ４７８、Ａ４８１及び／またはＮ４９０。
【０１００】
本発明の変異体ＣＢＨ１は前駆体Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。ＣＢＨ１変異体のアミノ酸配列は前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失または挿入されていることにより前駆体ＣＢＨ１アミノ酸配列と異なる。Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の成熟アミノ酸配列は図１に示す。従って、本発明はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中の特定の同定残基に等しい位置にアミノ酸残基を含むＣＢＨ１変異体を目的とする。ＣＢＨ１変異体の残基（アミノ酸）はヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１の残基と、相同体（すなわち、一次または三次構造で位置が対応する）またはヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中の残基の特定残基または一部に機能的に類似（すなわち、同じまたは類似の一体化、反応または化学的または構造的に相互作用する能力を有する）である場合、同等である。ここで用いる番号は図１に示すように、成熟ＣＢＨ１アミノ酸配列の番号に対応するものとする。前駆体ＣＢＨ１内の配置に加えて、前駆体ＣＢＨ１が熱応力下にある場合、不安定性に関与するアミノ酸位置に対応する前駆体ＣＢＨ１中の特定残基は、置換または欠失に関してここで同定される。アミノ酸位置番号（例えば、＋５１）は図１に表す成熟ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１配列に割当てられた番号をいう。
【０１０１】
相同性を測定するためのアミノ酸配列の配置は好ましくは“配列比較アルゴリズム”を用いて決定する。比較のために最適な配列配置を行うことができ、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性配列アルゴリズム、Ｐｅａｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法のサーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化の実現（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ジェネティックスソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，マディソン，ウィスコンシン州）、目視検査またはＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（モントリオール、カナダ）のＭＯＥにより行う。
【０１０２】
配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載）がある。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センターにより一般に利用可能である（<www.ncbi.nlm.nih.gov>）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの語を並べた場合、いくつかの正の数の閾値スコアＴとマッチまたは満足する問い合わせ配列中の長さＷの短い語を同定することにより、最初に高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。これらのヒットした最初の近傍の語はこれらを含むさらに長いＨＳＰを見つけるために出発点として働く。ヒットした語は、増加できる累積配列スコアの範囲で比較される２つの配列それぞれに沿って両方向に広げられる。ヒットした語の伸長は以下の場合停止する：累積配列スコアが最大達成値からＸ量減少した場合；累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズム・パラメーターＷ、Ｔ及びＸは配列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期設定として単語長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）配列（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ’５、Ｎ’−４及び両ストランドの比較を用いる。
【０１０３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは次に、２配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１の基準は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然起こる確率を示す。例えば、アミノ酸配列は、最小合計確率が試験アミノ酸配列とプロテアーゼアミノ酸配列の比較で約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満の場合、プロテアーゼに類似すると考えられる。
【０１０４】
ＣＢＨ１セルラーゼの安定性を修正するさらなる具体的な方法を以下に示す：
（１）主鎖展開（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）のエントロピーの減少により酵素の安定性を導入できる。例えば、プロリン残基の導入は展開エントロピーを減少することにより著しくタンパク質を安定化する（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ、他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：２７７−２８３（１９９４）を参照）。同様に、グリシン残基はβ−炭素を有さず、従って、他の多くの残基よりもかなり大きな骨格立体配座自由度を有する。グリシン、好ましくはアラニンの置換により、展開エントロピーを減少でき、安定性を改善できる（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ、他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４；６６６３−６６６７（１９８７）を参照）。さらに、外側ループを短くすることで安定性を改善することが可能である。超好熱菌は中温好性相同体よりも短い外側ループを有するタンパク質を生成することが観測されている（例えば、Ｒｕｓｓｅｌ、他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：３７０−３７４（１９９５）を参照）。ジスルフィド結合の導入はお互いに明確に区別できる三次構造を安定化させるのにも効果的である。従って、現存するシステインに接近可能な残基にシステインの導入、またはジスルフィド結合を形成できるシステインペアの導入はＣＢＨ１変異体の安定性を変えることができる。
【０１０５】
（２）側鎖疎水性を増加することにより内部空洞を減少させて、酵素の安定性を変化させることができる。内部空洞の数及び体積を減少させることにより、疎水性相互作用を最大化し、パッキング不良が減少されて、酵素の安定性が増加する（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１３９−１６０（１９９３）；Ｂｕｒｌｅｙ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２３−２９（１９８５）；Ｚｕｂｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２９：１７１−１７９（１９８８）；Ｋｅｌｌｉｓ、他、Ｎａｔｕｒｅ ３３３：７８４−７８６（１９８８）を参照）。好熱菌由来の多量体タンパク質は、対応する中温好性菌のタンパク質よりも疎水性サブユニット接合部分を多く有することが多く、より表面補完性が大きい。この原則は単量体タンパク質のドメイン接合部分にも適用可能であると考えられる。疎水性を増加することにより安定性を改善できる特定の置換は、リジンからアルギニン、セリンからアラニン及びトレオニンからアラニンを含む（Ｒｕｓｓｅｌ，他、上記）。アラニンまたはプロリンへの置換による修飾により、側鎖サイズを増加でき、最終的に空洞の減少、より良いパッキング、及び増加した疎水性が得られる。空洞サイズを減少し、疎水性を増加し、ＣＢＨ１のドメイン間の接合部分の補完性を改善するための置換は酵素の安定性を改善できる。具体的には、これらの位置の特定残基をフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン及びイソロイシンから選択される異なる残基で修飾することにより特性を改善できる。
【０１０６】
（３）堅い二次構造中の平衡電荷、すなわち、α−ヘリックス及びβターンは安定性を改善できる。例えば、ヘリックスＮ末端上の部分正電荷をアスパラギン酸上の負電荷で中和することにより構造安定性を改善できる（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７８−１８３（１９９２）を参照）。同様に、ヘリックスＣ末端上の部分負電荷を正電荷で中和することにより安定性を改善できる。正電荷をβターン中のペプチドＮ末端との相互作用から遠ざけることは三次構造安定性を得るのに効果的である。正に帯電していない残基で置換することで、望ましくない正電荷がターン中に存在するアミド窒素と相互作用しないようにすることができる。
【０１０７】
（４）三次構造を安定化するために塩橋及び水素結合を導入することは効果的である。例えば、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸とリジン、アルギニンまたはヒスチジン間のイオン対相互作用は強い安定化効果を導入でき、及び異なる三次構造成分を付随させるために用いることができ、結果として熱安定性が改善される。さらに、帯電残基／非帯電残基水素結合の数の増加及び水素結合の数は通常、熱安定性を増加させることができる（例えば、Ｔａｎｎｅｒ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２５９７−２６０９（１９９６）を参照）。アスパラギン酸、アルパラギン、グルタミン酸またはグルタミンとの置換は骨格アミドとの水素結合を導入できる。アルギニンとの置換は塩橋を改善でき、骨格カルボニル内にＨ−結合を銅導入できる。
【０１０８】
（５）熱不安定性残基を避けることにより通常、熱安定性を増加できる。例えば、アスパラギン及びグルタミンはアミド分解を受け易く、システインは高温で酸化されやすい。敏感な位置でのこれらの残基数を減らすことで、改善された熱安定性を得ることができる（Ｒｕｓｓｅｌ、他、上記）。グルタミンまたはシステイン以外の任意の残基により置換または欠失することで、熱不安定性残基を避けることにより、安定性が増加する。
【０１０９】
（６）ＣＢＨ１変異体に修飾された安定性を与える配位子の結合の安定化または不安定化。例えば、本発明のＣＢＨ１変異体が用いられるマトリックスの成分はＣＢＨ１変異体の特定の界面活性剤／熱感受性部位に結合できる。当該部位を置換修飾することにより、当該成分の変異体への結合を強化または弱めることができる。例えば、ＣＢＨ１の結合切断部（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｒｅｖｉｃｅ）中の非芳香族残基はフェニルアラニンまたはチロシンと置換されて、芳香族側鎖安定性を導入でき、そこでセルロース基質の相互作用はベンジル環と有利に相互作用でき、ＣＢＨ１の安定性が増加する。
【０１１０】
（７）界面活性剤／熱感受性配位子のいずれかの電気陰性度を増加させることにより、界面活性剤または熱応力下での安定性を改善できる。例えば、フェニルアラニンまたはチロシンとの置換は、溶媒からの保護を改善することによりＤ（アスパラギン酸塩）残基の電気陰性度を増加させることができ、従って安定性が改善する。
【０１１１】
Ｃ．相同体ＣＢＨ１核酸及びポリペプチド
細菌微生物由来のゲノムＤＮＡを膜に固定する。ゲノムＤＮＡを遺伝子特異プローブとハイブリダイズし、ＰＣＲを用いてスクリーニングする。ＰＣＲ生成物を当業者に公知の技術を用いて単離し、配列決定する。
【０１１２】
ＶＩ．組換えＣＢＨ１相同体及び変異体の発現
本発明の方法は所望のセルラーゼを発現するために使用する細胞に依存し、特定の発現方法は必要でない。
【０１１３】
本発明は、所望のセルラーゼをエンコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて変換、形質転換または核酸導入される宿主細胞を提供する。温度、ｐＨ等の培養条件は変換、形質転換または核酸導入前に親宿主細胞に既に用いた条件であり、当業者に明らかである。
【０１１４】
１の手段において、糸状菌細胞または酵母細胞に、宿主細胞株で機能し、所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片に動作可能に連結する、プロモーターまたは生物学的に活性なプロモーター断片または１以上の（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクターを用いて核酸導入し、所望のセルラーゼが細胞株内で発現する。
【０１１５】
Ａ．核酸構築体／発現ベクター
所望のセルラーゼをエンコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（“所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列”）は異種核酸構築体またはベクター内に組込むことができ、糸状菌または酵母細菌内に導入でき、かつ複製できる。ここに開示するベクター及び方法は所望のセルラーゼを発現するための宿主細胞中で使用するのに適している。導入される細胞内で複製可能かつ生存可能である限り、任意のベクターが使用できる。多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。また、クローニング及び発現ベクターについてもここに明示的に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ、他、１９８９及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ、他、１９８１に記載されている。真菌に適切な発現ベクターはｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（編集）Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第３９６〜４２８頁に記載されている。適当なＤＮＡ配列が種々の手順によりプラスミドまたはベクター（集合的にここで“ベクター”という）内に挿入できる。通常、ＤＮＡ配列は標準手順により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。このような手順及び関連サブクローニング手順は当業者の知識の範囲内であると考えられる。
【０１１６】
所望のセルラーゼのコード配列を含む組換え糸状菌は、所望のセルラーゼ−コード配列を含む異種核酸構築体を糸状菌の選択株細胞内に導入することにより生成できる。
【０１１７】
所望の形態の所望のセルラーゼ核酸配列が得られると、それを種々の方法で修飾することができる。当該配列が非コードフランキング領域を含む場合、当該フランキング領域は切除、突然変異等に供することができる。従って、転移、塩基転換、欠失及び挿入を天然配列上で行うことができる。
【０１１８】
選択した所望のセルラーゼ−コード配列は公知の組換え技術に従って適切なベクター内に挿入でき、セルラーゼ発現が可能な糸状菌を形質転換するために用いることができる。遺伝コードの固有縮退のため、実質的に同じまたは機能的に同等なアミノ酸配列をエンコードするその他の核酸配列が所望のセルラーゼをクローン及び発現するために用いることができる。そのため、コード領域内の当該置換は、本発明によりカバーされる配列変異体の範囲内に当然含まれる。
【０１１９】
また、本発明は上述の１以上の所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を含む組換え核酸構築体を含むこともできる。当該構築体はプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含み、そこに本発明の配列がフォワードまたはリバース方向に挿入される。
【０１２０】
異種核酸構築体は所望のセルラーゼのコード配列を含むことができ、それらは（ｉ）単離して（ｉｉ）融合タンパク質またはシグナルペプチドコード配列などの他のコード配列と組み合わせて（ここで所望のセルラーゼ−コード配列は優性コード配列）；（ｉｉｉ）イントロンなどの非コード配列、及び適当な宿主中でコード配列の発現に効果的な、プロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域など制御因子と組み合わせて；及び／または（ｉｖ）所望のセルラーゼ−コード配列が異種遺伝子となるベクターまたは宿主環境において、含むことができる。
【０１２１】
本発明の１の側面において、異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を細胞内に移動させるために用いられ、確立された糸状菌及び酵母株が好ましい。所望のセルラーゼの長期間生成のために、安定な発現が好ましい。従って、安定な形質転換を生じるために効果的な任意の方法が本発明の実施に用いることができる。
【０１２２】
適当なベクターは通常、選択マーカー−エンコード核酸配列、挿入部位及び適当な制御因子、例えばプロモーター及びターミネーター配列などを備える。当該ベクターは調節配列を含んでもよく、例えば、イントロンなどの非コード配列、及び制御因子、すなわち宿主細胞（及び／または修飾可溶性タンパク質抗原コード配列が通常は発現されないベクターまたは宿主細胞環境）内でコード配列の発現に効果的で、コード配列に動作可能に連結したプロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域を含むことができる。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、その多くが市販されており、及び／またはＳａｍｂｒｏｏｋ、他、（上記）に記載されている。
【０１２３】
典型的なプロモーターは保存プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含み、例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆシステムにおいてｔｅｔ応答性因子（ＴＲＥ）を含むプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ ａｎｄ ＢＡＳＦ）、β−アクチンプロモーター及び特定の金属塩の添加により非調節にできるメタロチオニンプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は発現のために特定の糸状菌により認識されるＤＮＡ配列である。これは変異体ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結する。当該連結は開示した発現ベクター中において変異体ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の開始コドンに関するプロモーターの位置決定を含む。プロモーター配列は、変異体ＣＢＨ１ポリペプチドの発現を媒介する転写及び翻訳制御配列を含む。例えば、アスペルギルス・ニガー、Ａ．アワモリまたはＡ．オリゼー・グルコアミラーゼ、α−アミラーゼまたはα−グルコシダーゼエンコード遺伝子；Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡまたはｔｒｐＣ遺伝子；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ｃｂｈ１またはｔｒｐ１遺伝子；Ａ．ニガーまたはリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ−エンコード遺伝子；Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２またはその他のセルラーゼエンコード遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
【０１２４】
適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、種々の宿主の適当なマーカーは当業界に公知である。一般的な選択マーカー遺伝子はＡ．ニデュランスまたはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｒｇＢ、Ａ．ニデュランス由来のａｍｄＳ、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはＨ．ｊｏｃｏｒｉｎａ由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガーまたはＡ．ニデュランス由来のｐｙｒＧを含む。他の典型的な選択マーカーは、限定されないが、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤまたはｌｅｕ２が挙げられ、これらはｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等などの変異株を形質転換するために用いる異種核酸構築体に含まれる。
【０１２５】
当該選択マーカーは形質転換体に、通常は糸状菌により代謝されない代謝産物を利用できる能力を与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードするＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｍｄＳ遺伝子は、形質転換細胞が窒素源としてアセトアミド上で成長できるようにする。選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は栄養要求性変異株が選択最小培地上で成長する能力を回復させることができ、または選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は形質転換体に阻害薬または抗生物質の存在下で成長できる能力を与えることができる。
【０１２６】
選択マーカーコード配列は当業界で用いられる一般的な方法を用いて適切なプラスミド内にクローンされる。典型的なプラスミドはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドはＡ．ニデュランス由来のＡＭＡ１配列を含み、Ａ．ニガー中での複製を可能にする。
【０１２７】
本発明の実施には他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用い、当業者の技術の範囲内である。当該技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３；及びＣｏｌｉｇａｎ、他、１９９１を参照されたい。ここで言及する全ての特許、特許出願、雑誌及び文献はここに明示的に引用される。
【０１２８】
Ｂ．ＣＢＨ１生成のための宿主細胞及び培養条件
（ｉ）糸状菌
従って、本発明は、対応する非形質転換親真菌と比較して所望のセルラーゼ生成または発現を生じるために効果的な方法で修飾、選択及び培養された細胞を含む糸状菌を提供する。
【０１２９】
所望のセルラーゼ発現のために処理及び／または修飾できる親糸状菌の種の例としては、限定されないが、トリコデルマ、ペニシリン種、フミコーラ種、例えばフミコーラ・インソレンス；アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・ニガー、クリソスポリウム種、フサリウム種、ヒポクレア種及びエメリセラ種が挙げられる。
【０１３０】
所望のセルラーゼを発現する細胞は通常、親真菌株を培養するために用いる条件下で培養する。一般的に、細胞はＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、編集、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．他、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第７７〜８６頁、１９８８及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６、１９９７に記載されるような生理食塩及び栄養物を含む標準培地内で培養する。また、培養条件も標準であり、例えば培養物は２８℃、振とう培養または発酵槽中で、所望レベルの所望のセルラーゼ発現が達成されるまで培養する。
【０１３１】
所定の糸状菌の好ましい培養条件は科学文献及び／またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；<www.atcc.org>）などの真菌源から見つけることができる。真菌成長の達成後、当該細胞は所望のセルラーゼの発現を生じるまたは可能にするために効果的な条件に曝す。
【０１３２】
所望のセルラーゼ−コード配列が誘導プロモーターの制御下にある場合、例えば糖、金属塩または抗生物質などの誘発剤を所望のセルラーゼ発現を誘導するために有効な濃度で培地に加える。
【０１３３】
１の実施態様において、株はアスペルギルス・ニガーを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ ｄｇｒ２４６は高められた量の分泌セルラーゼを分泌することが公知である（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ、他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２）４１：８９−９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４及びＧＡＰ３−４などのアスペルギルス・ニガー ｖａｒ アワモリのその他の株は公知である（Ｗａｒｄ，Ｍ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．及びＫｏｄａｍａ，Ｋ．Ｈ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３）。
【０１３４】
他の実施態様において、株はトリコデルマ・リーゼイを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、ＲＬ−Ｐ３７はＳｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ、他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）に記載されており、高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られる。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物としては、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ番号５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）を含む。これらの株は変異体ＣＢＨ１を過剰発現するのにも有用である。
【０１３５】
潜在的に有害な天然セルロース分解活性がない所望のセルラーゼを得ることが望ましい場合、所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築体またはプラスミドの導入前に、１以上の欠失したセルラーゼ遺伝子を持った宿主細胞株を得ることは有用である。このような株は、ここに開示の内容を引用する米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ９２／０６２０９に開示の方法により調製できる。１以上のセルラーゼ遺伝子が欠落した宿主微生物中で所望のセルラーゼを発現することにより、同定及び次の精製手順が簡略化される。
【０１３６】
遺伝子欠失は欠失または分離される所望の遺伝子形態を当業界に公知の方法によりプラスミド内に挿入することにより達成できる。次に、欠失プラスミドは所望の遺伝子コード領域及び遺伝子コード配列または選択マーカーで置換された当該配列の一部の内部にある適当な制限酵素部位で切断される。欠失または分離される遺伝子座由来のフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５〜２．０ｋｂであり、両側の選択マーカー遺伝子を保持する。適当な欠失プラスミドは一般に、固有の制限酵素部位を有し、当該断片が欠失遺伝子を含み、フランキングＤＮＡ配列を含むことを可能にし、選択マーカー遺伝子が一本の線状片として除去される。
【０１３７】
選択マーカーは形質転換微生物の検出が可能となるように選択しなければならない。選択した微生物中で発現する選択マーカー遺伝子は適している。例えば、アスペルギルス種を用いて選択マーカーを選択すると、形質転換体中の選択マーカーの存在はその特性に大きな影響を与えない。このような選択マーカーは分析可能な生成物をエンコードする遺伝子であると考えられる。例えば、アスペルギルス種遺伝子の機能的コピーは、宿主株中の欠失により栄養要求性表現型を示す宿主株を生じる場合、使用できる。
【０１３８】
好ましい実施態様において、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は機能的ｐｙｒＧ遺伝子を用いて形質転換し、従って、形質転換のための選択マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株はフルオロオロト酸（ＦＯＡ）に耐性のアスペルギルス種株を選択することにより得ることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素である、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードする。原型のｐｙｒＧ遺伝子を含む株はウリジン不足の培地中で成長するが、フルオロオロト酸に感受性である。機能的オロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ酵素を欠いており、ＦＯＲ耐性選択により成長のためにウリジンを必要とするｐｙｒＧ−誘導体株の選択が可能である。ＦＯＡ選択技術を用いて、機能的オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが不足したウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞をこの酵素をエンコードする遺伝子の機能的コピーを用いて形質転換することが可能である（Ｂｅｒｇｅｓ＆Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１）、及びｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔｅ、他（１９８６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ（ｐｙｒＧ遺伝子に基づくアスペルギルス・ニガーの相同形質転換系の進展）．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１−７５）。誘導体株の選択は、上述のＦＯＡ耐性技術を用いて容易に行われ、従って、ｐｙｒＧ遺伝子は選択マーカーとして用いるのが好ましい。
【０１３９】
１以上のセルラーゼ遺伝子の発現能力が欠落するようにｐｙｒＧ−アルペルギルス種を形質転換するために、分離または欠失したセルラーゼ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ断片をそれから欠失プラスミドから単離し、適当なｐｙｒ−アスペルギルス宿主を形質転換するために用いる。次に、形質転換体はｐｙｒＧ遺伝子生成物を発現するそれらの能力に基づいて同定及び選択され、従って宿主株のウリジン栄養要求性を補う。サザンブロット分析を次に得られた形質転換体について行い、欠失する遺伝子のゲノムコピーのコード領域の一部または全部をｐｙｒ４選択マーカーで置換するダブルクロスオーバー融合イベントを同定及び確認する。
【０１４０】
上述の特定プラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の調製に関連するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。種々の遺伝子がアスペルギルス種株内で上述の技術を用いて欠失及び置換できる。さらに、上述の通り、任意の入手可能な選択マーカーが使用できる。実際、クローンされ、そして同定された任意のアスペルギルス種遺伝子が上述の方法を用いてゲノムから欠失できる。
【０１４１】
上述の通り、使用する宿主株は、選んだ選択マーカーに対応する非機能的遺伝子を欠く、または有するアスペルギルス種の誘導体である。例えば、ｐｙｒGの選択マーカーを選択した場合、それから形質転換手順において特定のｐｙｒＧ−誘導体株を受容体として用いる。同様に、アスペルギルス・ニデュランス遺伝子ａｍｄＤ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤに同等なアスペルギルス種遺伝子を含む選択マーカーが用いることができる。対応する受容体株は従って、それぞれａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−などの誘導体株でなければならない。
【０１４２】
所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡは次に、適当な微生物内に挿入するために調製する。本発明に従うと、所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡは機能的セルロース分解活性を有するタンパク質をエンコードするために必要なＤＮＡを含む。所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片は真菌プロモーター配列、例えばｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに機能的に接合できる。
【０１４３】
２以上の所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡのコピーが過剰発現を促進するために株内に組換えできることも本発明の範囲内である。所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡは当該セルラーゼをエンコードするＤＮＡを運ぶ発現ベクターを構築することにより調製できる。所望のセルラーゼをエンコードする挿入ＤＮＡ断片を運ぶ発現ベクターは所定の宿主微生物中で独立して複製できる、または宿主、一般的にはプラスミドのＤＮＡ内に統合できるベクターである。好ましい実施態様において、遺伝子発現が得られる２種の発現ベクターが考えられる。１つは、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現する遺伝子由来であるＤＮＡ配列を含む。遺伝子切断は、自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを残すために、望ましくないＤＮＡ配列（例えば、望ましくないドメインをコードする）を欠失することが望ましい場合に行うことができる。選択マーカーはベクター上に含むこともでき、宿主内に新規な遺伝子配列の複数コピーを統合するための選択が可能になる。
【０１４４】
２つ目の発現ベクターはあらかじめ組立てられ、高レベル転写に必要な配列及び選択マーカーを含む。遺伝子またはその一部のコード領域はこの汎用性発現ベクター内に挿入できると考えられ、従って、発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下にある。例えば、ｐＲＡＸはそのような汎用性発現ベクターである。遺伝子またはその一部は強力なｇｌａＡプロモーターの下流に挿入できる。
【０１４５】
ベクター中、本発明の所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列は転写及び翻訳配列、すなわち、リーディングフレームから構造遺伝子中の適当なプロモーター配列及びシグナル配列に動作可能に連結するべきである。プロモーターは宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、宿主細胞と同種または異種のタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。任意のシグナルペプチドは所望のセルラーゼの細胞外生成を提供する。シグナル配列をエンコードするＤＮＡは発現する遺伝子に天然で関連していることが好ましいが、任意の適当な供給源由来のシグナル配列が本発明で使用できる。
【０１４６】
本発明の所望のセルラーゼをコードするＤＮＡ配列とプロモーターを適当なベクター内に融合するために用いる手順は当業界に公知である。
【０１４７】
上述のＤＮＡベクターまたは構築体は、形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、遺伝子銃等の公知の技術に従って宿主細胞中に導入できる。
【０１４８】
形質転換のためにアスペルギルス種を調製する本発明の好ましい方法は、真菌の菌糸体由来の原形質体の調製を含む。Ｃａｍｐｂｅｌｌ、他、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ．ｎｅｇｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｉａＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（硝酸還元酵素の相同体ｎｉａＤ遺伝子を用いたＡ．ニガーの改善された形質転換効率）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６；１９８９を参照されたい。菌糸体は発芽植物性胞子から得ることができる。菌糸体は細胞壁を消化して原形質体を生じる酵素で処理する。原形質体は次に懸濁培地中、浸透圧安定化剤の存在により保護される。これらの安定化剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これら安定化剤の濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍ間で様々である。懸濁培地中、約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【０１４９】
ＤＮＡの宿主アスペルギルス種株内への摂取はカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＣａＣｌ２が摂取溶液内で用いられる。摂取溶液中でカルシウムイオンが必要であることに加え、通常含まれるその他の品目は緩衝系、例えばＴＥバッファ（１０Ｍｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０バッファ（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜の融合に作用すると考えられており、従って培地の内容物がアスペルギルス種株の細胞質内に運ばれ、プラスミドＤＮＡが核に移動する。この融合により、宿主染色体内に穏やかに統合されるプラスミドＤＮＡの複数コピーが残ることが多い。
【０１５０】
通常、アスペルギルス種原形質体または細胞を含む、密度１０５〜１０６／ｍＬ、好ましくは２×１０５／ｍＬで浸透圧処理に供した懸濁液を形質転換に使用する。適当な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ ＣａＣｌ２）の１００μＬの量のこれら原形質体または細胞は所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを摂取溶液に加える。０．１〜１の量（ｖｏｌｕｍｅ）の２５％ ＰＥＧ ４０００は原形質体の懸濁液に加えることができる。しかしながら、約０．２５の量（ｖｏｌｕｍｅ）を原形質体の懸濁液に加えることが好ましい。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤も摂取溶液に加えてもよく、形質転換を助ける。
【０１５１】
通常、混合物はそれから約０℃で１０〜３０分間培養する。追加のＰＥＧをそれから混合物に加え、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の摂取をさらに高める。２５％ ＰＥＧ ４０００は通常、形質転換混合物の体積の５〜１５倍の体積で加えるが、それより大きい体積または小さい体積も適している。２５％ ＰＥＧ ４０００は好ましくは形質転換混合物の体積の約１０倍である。ＰＥＧを加えた後、形質転換混合物をそれから室温または氷上で、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加する前に培養する。原形質体懸濁液をそれからさらに成長培地の融解アリコートに加える。この成長培地により形質転換だけの成長が可能になる。所望の形質転換の成長に適した任意の成長培地が本発明で使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換を選択した場合、ウリジンを含まない成長培地を使用することが好ましい。その結果生じたコロニーをウリジンを使い尽くした成長培地上で移動及び精製する。
【０１５２】
この段階で、速い成長速度及びウリジンが欠落した固体培養基上の不規則な外形よりもむしろ、順調な環状コロニーの形成により安定な形質転換が不安定な形質転換と区別できる。さらに、場合によっては安定性のさらなる試験を、固体非選択性培地（すなわち、ウリジンを含む）上の形質転換体を成長させる、この培養基から胞子を収集し、及び次にウリジンが欠落した選択培地上で発芽及び成長するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより、行うことができる。
【０１５３】
上記方法の特定の実施態様において、所望のセルラーゼは液体培地中で成長後、所望のセルラーゼの適当な翻訳後処理の結果として、宿主細胞から活性体で回収される。
【０１５４】
（ｉｉ）酵母
また、本発明は所望のセルラーゼ生成のための宿主細胞として酵母の使用も考えられる。加水分解酵素をエンコードするその他いくつかの遺伝子が種々の酵母Ｓ．セレヴィシエ株において発現する。これらは、２つのエンドグルカナーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ、他、１９８７）、２つのセロビオヒドロラーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ、他、１９８８）、及びトリコデルマ・リーゼイ由来の１のβ−グルコシダーゼ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ａｎｄ Ｆｏｗｌｅｒ、１９９６）、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｌｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ由来キシラナーゼ（Ｌｉ ａｎｄ Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、１９９６）、小麦由来のα−アミラーゼ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、他、１９８７）等をエンコードする配列を含む。さらに、ルーメン細菌（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）エンド−［ベータ］−１，４−グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓセロデキストリナーゼ（ＣＥＬ１）及びエンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）ｆｒｂｒｉｌｉｚｅｒセロビアーゼ（Ｂｇｌ１）をエンコードするセルラーゼ遺伝子カセットはＳ．セレヴィシエ（Ｖａｎ Ｒｅｎｓｂｕｒｇ、他、１９９８）の研究所株中でうまく発現された。
【０１５５】
Ｃ．所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列の宿主細胞内への導入
本発明はさらに、外来の所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を含むように遺伝子組換えされた細胞及び細胞組成物を提供する。親細胞または細胞株はクローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子組み換え（すなわち、変換、形質転換またはトランスフェクト）できる。ベクターは、上述したように例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態である。
【０１５６】
本発明の形質転換の方法は、形質転換ベクターの全部または一部を糸状菌のゲノム内に安定に統合できる。しかしながら、自己複製の余分な染色体形質転換ベクターを維持する形質転換も考えられる。
【０１５７】
大量の異種タンパク質を発現するトリコデルマ・リーゼイ細胞株を生成するために多くの標準トランスフェクション方法を用いることができる。ＤＮＡ構築体をトリコデルマのセルラーゼ生成株内に導入するための公開されている方法のいくつかとしては、Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｔｒｏ及びＨａｒｍａｎ，１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ及びＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９−１７４；Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ及びＫｎｏｗｌｅｓ，１９８７、Ｇｅｎｅ ６：１５５−１６４、アスペルギルスに関して、Ｙｅｌｔｏｎ、Ｈａｍｅｒ及びＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４、フサリウムに関して、Ｂａｊａｒ、Ｐｏｄｉｌａ及びＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８２０２−８２１２、ストレプトマイセスに関して、Ｈｏｐｗｏｏｄ、他、１９８５、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ及びバチルスに関して、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ及びＭａｔｔｅｕｚｚｉ，１９９０、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８が挙げられる。
【０１５８】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入する公知の手順を用いることができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質体融合、エレクトロポレーション、バイオリスティクス、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター及びクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはその他の外来遺伝物質を宿主細胞内に導入するためのその他の公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、上記を参照）の使用が挙げられる。米国特許第６，２５５，１１５号に記載のアグロバクテリウム媒介トランスフェクション法も使用できる。唯一必要なのは、使用する特定の遺伝子組換え手順により、少なくとも１の遺伝子が異種遺伝子を発現できる宿主細胞内にうまく導入されることができるということである。
【０１５９】
さらに、所望のセルラーゼ−エンコード核酸配列を含む異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写でき、得られたＲＮＡは公知の方法、例えばインジェクションにより宿主細胞内に導入される。
【０１６０】
本発明はさらに、真菌セルラーゼ組成物の生成に使用するためのＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ及びＡ．ニガーなど糸状菌の新規で有用な形質転換体を含む。本発明は糸状菌、特に所望のセルラーゼコード配列または内生ｃｂｈコード配列の欠失を含む真菌の形質転換体を含む。
【０１６１】
ＶＩＩ．ＣＢＨ１核酸コード配列及び／またはタンパク質発現の分析
所望のセルラーゼ−エンコード核酸構築体を用いて形質転換した細胞株により所望のセルラーゼ発現を評価するために、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルで分析を行うことができ、または特にグルコシダーゼ活性及び／または生成に対する機能的バイオアッセイを使用することにより分析を行うことができる。
【０１６２】
ここに記載の所望のセルラーゼ核酸及びタンパク質配列の１の典型的な用途において、糸状菌、例えばトリコデルマ・リーゼイの遺伝子組換え株は増加した量の所望のセルラーゼを生成するように設計できる。このような遺伝子組換え糸状菌はセルロース分解能が大きく増加したセルラーゼ生成物を生成するのに有用である。１の手段においてこれは、適当な宿主、例えばアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌内に所望のセルラーゼをコードする配列を導入することにより達成される。
【０１６３】
従って、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主の細胞内に所望のセルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを導入することにより糸状菌またはその他の適当な宿主内で所望のセルラーゼを発現するための方法を含む。
【０１６４】
他の側面において、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主内での所望のセルラーゼ発現を修飾するための方法を含む。当該修飾は内生ＣＢＨの発現の減少または除去を含む。
【０１６５】
通常、所望のセルラーゼ発現を分析するために用いる分析は、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、または適当な標識プローブ（核酸コード配列に基づく）を用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーが挙げられる。
【０１６６】
さらに、所望のセルラーゼの生成及び／または発現はサンプル内で直接測定でき、例えばセロビオヒドロラーゼ活性、発現及び／または生成の分析により測定できる。当該分析は例えば、それぞれここに明示的に引用するＢｅｃｋｅｒ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２００１）３５６：１９−３０及びＭｉｔｓｕｉｓｈｉ、他、ＦＥＢＳ（１９９０）２７５：１３５−１３８に記載されている。ＣＢＨ１の単離可溶性及び不溶性基質を加水分解する能力はＳｒｉｓｏｄｓｕｋ、他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９７）５７：４９−５７及びＮｉｄｅｔｚｋｙ及びＣｌａｅｙｓｓｅｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９４）４４：９６１−９６６に記載の分析を用いて測定できる。セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼまたはβ−グルコシダーゼ活性を分析するために有用な基質は結晶性セルロース、ろ紙、リン酸膨潤セルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリル・ラクトシド、メチルウンベリフェリル・セロビオシド、オルトニトロフェニル・ラクトシド、パラニトロフェニル・ラクトシド、オルトニトロフェニル・セロビオシド、パラニトロフェニル・セロビオシドが挙げられる。
【０１６７】
さらに、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織化学的染色または組織培養基の免疫学的分析など免疫学的方法、例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価できる。当該免疫分析は所望のセルラーゼ発現を定性的及び定量的に評価するために用いることができる。当該方法の詳細は当業者に公知であり、当該方法を実施するための多くの試薬が市販されている。
【０１６８】
所望のセルラーゼの精製体は種々の免疫分析に用いるために発現タンパク質に特異なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成するために用いることができる（例えば、Ｈｕ、他、１９９１を参照）。典型的な分析はＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接免疫蛍光試験などが挙げられる。通常、市販の抗体及び／またはキットはセロビオヒドロラーゼタンパク質発現レベルの定量免疫分析に用いることができる。
【０１６９】
ＶＩＩＩ．組換えＣＢＨ１タンパク質の単離及び精製
通常、細胞培養基内で生成した所望のセルラーゼタンパク質は培養基内に分泌され、例えば細胞培養基から不要な成分を除去することにより精製または単離できる。しかしながら、場合によっては、所望のセルラーゼタンパク質は細胞溶解物から回収が必要な細胞型で生成できる。その場合、所望のセルラーゼタンパク質を細胞から精製し、当業者により通常用いられる技術を用いて生成した。例としては限定されないが、アフィニティクロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８４）、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ、他、１９９１；Ｆｌｉｅｓｓ、他、１９８３；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ、他、１９８４；Ｅｌｌｏｕｚ、他、１９８７）、例えば高い分解力を有する物質を用いたイオン交換（Ｍｅｄｖｅ、他、１９９８）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ、１９９９）及び２相分離（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ、他、１９９９）が挙げられる。
【０１７０】
通常、所望のセルラーゼタンパク質は、特定の結合剤（例えば抗体または受容体）への結合親和性、または選択分子量範囲または等電点範囲を有するなどの選択特性を有するタンパク質を分離するために分画する。
【０１７１】
所定の所望のセルラーゼタンパク質発現が達成されると、生成した所望のセルラーゼタンパク質を細胞または細胞培養基から精製する。このような精製に適した典型的な手順は以下を含む：抗体親和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過。種々のタンパク質精製方法が用いることができ、当該方法は当業者に公知であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ，１９８２に記載されている。選択する精製工程は例えば、用いる生成工程の性質及び生成される特定タンパク質に依存する。
【０１７２】
ＩＸ．ｃｂｈ１及びＣＢＨ１の活用
当然のことながら、所望のセルラーゼ核酸、所望のセルラーゼタンパク質及び所望のセルラーゼタンパク質活性を含む組成物は多種多様な用途で用いることができ、そのいくつかを下記に説明する。
【０１７３】
様々な量で所望のセルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物は高い洗浄能を示し、柔軟剤として作用し、及び／または綿織物の手触りを改善させる（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）洗剤組成物、木材パルプを糖に分解する組成物（例えば、バイオ−エタノール生成）及び／または飼料組成物に用いることができる。各タイプのセルラーゼの単離及びキャラクタリゼーションにより当該組成物の特徴を制御する能力が提供される。
【０１７４】
減少した熱安定性を有する所望のセルラーゼは、例えば、存在すると考えられるその他の酵素に影響しないように酵素活性を低温で中和する必要がある場合に有用である。さらに、当該酵素はセルロース誘導体の限られた変換に有用であり、例えば結晶度またはセルロース誘導体の鎖長を制御するのに有用である。所望の変換範囲に達した後、糖化温度は不安定化されたＣＢＨ１の生存温度以上に挙げることができる。ＣＢＨ１活性は結晶セルロースの加水分解に不可欠であるので、結晶セルロースの変換は高温で停止する。
【０１７５】
１の好ましい手段において、本発明のセルラーゼは洗剤組成物または手触り及び外観を改善するための織物処理に使用できる。
【０１７６】
セルロース誘導体生成物の加水分解速度は、複製可能プラスミドとして、またはゲノム内への挿入として少なくとも１の所望のセルラーゼ遺伝子のさらなるコピーを有する形質転換体を用いて増加させることができるので、セルロースまたはヘテログリカンを含む生成物がより速い速度でより大量に分解できる。紙、綿、セルロース系オムツ等のセルロースから作られる生成物は埋立て処理地においてより効果的に分解できる。従って、当該形質転換から得られる発酵生成物または形質転換自体は組成物中に使用でき、満杯の埋立て処理地にある多種多様のセルロース生成物を液化することにより分解を助けることができる。
【０１７７】
分離した糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、続いて酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。同時糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、同時に同じ反応器内で酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。従って、他の手段において、本発明の所望のセルラーゼはバイオマスからエタノールへの分解に利用できる。容易に入手可能なセルロース源からのエタノール生成は安定で再生可能な燃料源を提供する。
【０１７８】
セルロースベース供給原料は農業廃棄物、草及び木材及びその他の低価値バイオマス、例えば都市ゴミ（例えば、再生紙、庭伐採ゴミ（ｙａｒｄ ｃｌｉｐｐｉｎｇｓ）等）からなる。エタノールは任意のこれらセルロース系供給原料の発酵から生成できる。しかしながら、セルロースは、エタノール変換の前にまず糖に変換されなければならない。
【０１７９】
多種多様の供給原料が本発明の所望のセルラーゼと用いることができ、使用する種類の選択は変換が行われる地域に依存する。例えば、アメリカ中西部では麦かん、伐採残（コーンストーバー）及びバガスなどの農業廃棄物が主流であり、一方、カリフォルニアでは稲わらが主流である。しかしながら、当然のことながらいかなる入手可能なセルロース系バイオマスも任意の地域で使用できる。
【０１８０】
増加した量でセロビオヒドロラーゼを含むセルラーゼ組成物はエタノール生成に利用することができる。この方法から得たエタノールはさらにオクタンエンハンサーとして用いることができ、またはガソリンの代わりに直接燃料として用いることができ、燃料源としてのエタノールは石油由来生成物よりもより環境に優しいので有用である。エタノールの使用は大気環境を改善し、局所オゾンレベル及びスモッグを減少させる可能性があることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは非再生エネルギー及び石油化学供給の突然移行の影響を緩衝するために戦略的に重要である。
【０１８１】
エタノールは糖化及び発酵プロセスにより木、葉状植物、都市固体ゴミ及び農業及び林業残留物などのセルロース系バイオマスから生成できる。しかしながら、微生物により生成される天然セロビオヒドロラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の比率は、バイオマスからグルコースへのセルロース変換を速く行うために最も効果的な比率ではない。エンドグルカナーゼは新しいセルロース鎖末端の生成に作用し、それ自身はセロビオヒドロラーゼ活性の基質であり、それによってセルラーゼ系全体の加水分解効率が改善することが知られている。従って、増加した、または最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性を使用してエタノール生成を大きく高めることができる。
【０１８２】
従って、本発明のセロビオヒドロラーゼはセルロースをその糖成分に加水分解する際に使用できる。１の実施態様において、所望のセルラーゼは発酵生物添加前にバイオマスに添加する。第２の実施態様において、所望のセルラーゼは発酵生物と同時にバイオマスに添加する。任意で、いずれの実施態様もその他のセルラーゼ成分が存在できる。
【０１８３】
他の実施態様において、セルロース系供給原料を前処理することができる。前処理は高温及び希酸、濃酸または希アルカリ溶液を添加することによる。前処理溶液はヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解するのに十分な時間で加え、それから中和する。
【０１８４】
本発明の洗剤組成物はセルラーゼ組成物に加えて（セロビオヒドロラーゼ含量に関係なく、すなわち、セロビオヒドロラーゼを含まない、実質的に含まないまたは増加した量のセロビオヒドロラーゼ）、界面活性剤、例えば陰イオン性、非イオン性及び両性イオン性界面活性剤、ヒドロラーゼ、ビルディング剤、漂白剤、青味剤及び蛍光剤、ケーキング防止剤、可溶化剤、カチオン性界面活性剤等を用いることができる。これら全ての成分は洗剤業界に公知である。上述のセルラーゼ組成物は、希釈液、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペースト等の洗剤組成物に加えることができる。当該形態は当業者に公知である。固形洗剤組成物を用いる場合、セルラーゼ組成物は顆粒として処方するのが好ましい。好ましくは、顆粒はセルラーゼ保護剤を含むように処方される。さらに詳細な議論については、ここに引用する米国特許第６，１６２，７８２号、表題“Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＣＢＨ Ｉ ｔｙｐｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ＣＢＨ Ｉ型成分が欠損したセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物）”を参照されたい。
【０１８５】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．００００５重量％〜約５重量％で用いる。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．０００２重量％〜約２重量％を用いる。
【０１８６】
さらに、所望のセルラーゼ核酸配列は関連核酸配列の同定及びキャラクタリゼーションに使用できる。関連遺伝子または遺伝子産物の機能の測定（予測または確認）に有用な多数の技術は、限定されないが、以下を含む、（Ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、例えば（１）過剰発現、異所性発現及びその他の種における発現；（２）遺伝子ノックアウト（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルスによる遺伝子抑制（ＶＩＧＳ、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９を参照）；（３）遺伝子、特にフランキング調節領域のメチル化状態の分析；及び（４）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（Ｂ）遺伝子産物分析、例えば（１）組換えタンパク質発現；（２）抗血清生成、（３）免疫学的局在決定；（４）触媒的またはその他の活性の生化学分析；（５）リン酸化反応状態；及び（６）酵母２ハイブリッド分析によるその他のタンパク質との相互作用；（Ｃ）経路分析、例えば、過剰発現表現型に基づいた、または関連遺伝子との配列相同性による、特定生化学またはシグナリング経路内の遺伝子または遺伝子産物のプレイシング；及び（Ｄ）特定代謝またはシグナリング経路において単離遺伝子及びその産物の関与を測定または確認するために実施でき、遺伝子機能の測定に役立つ、その他の分析。
【０１８７】
実施例
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明し、これらは本発明の範囲をいかなる形においても制限するものではない。添付の図は本発明の明細書及び説明の不可欠な要素として考慮される。ここに引用する全ての文献はここに明示的に引用されるものとする。
【０１８８】
実施例１
ＣＢＨ１相同体の同定
この実施例は、種々の真菌において見られる新規なＣＢＨ１相同体について説明する。ゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応を行うためにいくつかの異なる微生物に関して調製し、相同体ＣＢＨ１セルラーゼが特定の微生物のＤＮＡによりエンコードされるかどうかを測定した。
【０１８９】
ゲノムＤＮＡの同定
ゲノムＤＮＡは当業界に公知の任意の方法を用いて単離できる。この一連の実験において、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ（ＴＵＶ）との協力により、多様なヒポクレア及びトリコデルマ種、ヒポクレア・シュワイニッチィ（ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）（ＣＢＳ ２４３．６３）、ヒポクレア・オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（ＰＰＲＩ ３８９４）、トリコデルマ・プソイドコニンギー（ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）（ＣＢＳ ４０８．９１）及びトリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ（単離１）から４８のゲノムＤＮＡ溶液を入手した。しかしながら、以下の手順を用いることもできる：
細胞を２０ｍｌポテトデキストロース培養液（ＰＤＢ）中、３０℃で２４時間成長させる。当該細胞を新しいＰＤＢ培地中で１：２０に希釈し、一晩中成長させる。２ｍＬの細胞を遠心し、ペレットを１ｍＬ ＫＣ（６０ｇ、ＫＣｌ、２ｇクエン酸／Ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨを６．２に調節）中で洗浄する。細胞ペレットを９００μＬ ＫＣ中で再懸濁させる。１００μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ：登録商標）を加え、ゆっくりと混合し、次に９５％以上の原形質体が形成されるまで、微視的に３７℃、最大２時間でプロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）を行う。当該細胞を１５００ｒｐｍで（４６０ｇ）１０分間遠心する。２００μＬ ＴＥＳ／ＳＤＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）を加え、混合し、室温で５分間培養する。ＤＮＡをキアゲンミニプレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。カラムを１００μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて溶出させ、ＤＮＡを収集する。
【０１９０】
もしくは、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）法を用いる方法も好ましい。当該システムはＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）機器及び核酸単離のためのＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）キットからなる。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）はＱｂｉｏｇｅｎｅから利用可能である。
【０１９１】
プライマーの構築
ＰＣＲはＰＣＴ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）などの標準ＰＣＲ機械上で、以下の条件下で行った：
１）１分、９６℃で１サイクル
２）３０秒、９４℃
９０秒、４５℃（＋１℃／サイクル）
２分、７２℃
３）繰り返し工程２、１０サイクル
４）３０秒、９４℃
９０秒、５５℃
２分、７２℃
５）繰り返し工程４、２０サイクル
６）７分、７２℃、１サイクル、及び
７）保管及びさらなる分析のため、低温から１５℃。
【０１９２】
以下のＤＮＡプライマーを種々の微生物から単離したゲノムＤＮＡ由来の相同体ＣＢＨ１遺伝子の増幅に使用するために構築した。タンパク質及びＤＮＡに関してここで用いる全ての記号はＩＵＰＡＣ ＩＵＢ生化学命名法割当てコードに対応する。
【０１９３】
相同体５’（ＦＲＧ１９２）及び３’（ ＦＲＧ１９３）プライマーをトリコデルマ・リーゼイ由来ＣＢＨ１配列に基づいて開発した。両プライマーはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＧａｔｅｗａｙクローニング配列をプライマーの５’に含む。プライマーＦＲＧ１９２はａｔｔＢ１配列を含み、プライマーＦＲＧ１９３はａｔｔＢ２配列を含む。
【式２】
【０１９４】
ＰＣＲ条件は以下の通り：１０μＬの１０Ｘ反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８−８．５；２５０ｍＭ ＫＣｌ；５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；２０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む１０Ｘ反応緩衝液）；各０．２ｍＭの、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（最終濃度）、１μＬの１００ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡ、０．５μＬのＰＷＯポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１６４４−９４７）、μＬ当たり１ユニット、各０．２μＭのプライマー、ＦＲＧ１９２及びＦＲＧ１９３（最終濃度）、４μＬ ＤＭＳＯ及び水１００μＬまで。
【０１９５】
これらの条件により異なる種から４つの遺伝子を最終的に得た：
１．ヒポクレア・シュワイニッチィ（ＣＢＳ ２４３．６３）
２．ヒポクレア・オリエンタリス（ＰＰＲＩ ３８９４）
３．トリコデルマ・プソイドコニンギ（ＣＢＳ ４０８．９１）
４．トリコデルマ・ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ
Ｃｅｌ７Ａ遺伝子配列の単離
完全長配列をＮ末端（ＦＲＧ１９２）及びＣ末端（ＦＲＧ１９３）プライマーを用いることにより直接得た。完全長ＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアを用いる３つのオープンリーディングフレーム内に翻訳した。ＤＮＡ及びタンパク質とＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ Ｃｅｌ７Ａとの比較を行い、推定上のイントロン配列を同定した。イントロン配列を含まないゲノムＤＮＡ配列の翻訳により相同体ＣＢＨ１のタンパク質配列を示した。得られた完全長遺伝子を図３、５、７及び９に示した。
【０１９６】
実施例２
ＣＢＨ１相同体の発現及び熱安定性
実施例１の完全長遺伝子を目的地ベクターを適合性のあるＡ．ニガー Ｇａｔｅｗａｙ（ジェネンコーが開発）に移した。このベクターを骨格としてｐＲＡＸ１を用いることにより、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング・テクノロジー：バージョン１、第３４−３８頁の所定のマニュアルに従って構築した（図１１に示す）。
【０１９７】
新しく開発した発現ベクターを図１２に示す。これは新しい遺伝子を目的地ベクターｐＲＡＸｄｅｓ２内に移すものである。これにより最終発現ベクターが得られ、ｐＲＡＸｄｅｓＣＢＨ１を呼ぶ（種名で特定）。
【０１９８】
当該構築体をＣａｏ、他に記載の方法に従ってＡ．ニガー ｖａｒ．アワモリ内に形質転換した（Ｃａｏ Ｑ−Ｎ、Ｓｔｕｂｂｓ Ｍ、Ｎｇｏ ＫＱＰ，Ｗａｒｄ Ｍ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ａ，Ｐａｉ ＥＦ，Ｔｕ Ｇ−Ｃ及びＨｏｆｍａｎｎ Ｔ（２０００）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ−ＪＴ２ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｉｎ ｓｕｂｓｉｔｅ Ｓ３ ｔｏ ｋｃａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１−１００１）。
【０１９９】
形質転換を最小培地プレート（Ｂａｌｌａｎｃｅ ＤＪ，Ｂｕｘｔｏｎ ＦＰ、及びＴｕｒｎｅｒ Ｇ（１９８３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １１２：２８４−２８９）上に筋上に加え、４日間、３０℃で成長させた。胞子を当業界に公知の方法を用いて回収した（<http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>を参照）。Ａ．ニデュランス分生子を水中で（胞子を取除くために殺菌湾曲ガラス棒を用いて分生子（ｃｏｎｉｄｉａｔｉｎｇ）培養物の表面を擦ることにより）収集し、生存に深刻な損失を生じることなく４℃で数週間から数ヶ月保存できる。しかしながら、新しく収集した胞子はより繁殖して発芽した。長期保存に関して、胞子は５０％グリセロール中、−２０℃で、または１５−２０％グリセロール中、−８０℃で保存できる。グリセロールは８０％水溶液としてより簡単にピペットで取られる。８００μＬの分生子懸濁水溶液（４℃保存用として作成）を２００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−８０℃保存用に用いる。４００μＬ懸濁液を６００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−２０℃保存用に用いる。凍結前に遠心（ｖｏｒｔｅｘ）する。変異体を回収するため、少量の分生子培養物を摘出し、２０％ グリセロール内に加え、遠心し、及び−８０℃保存として凍結させる。この場合、これらを５０％ グリセロール内、−８０℃で保存する。
【０２００】
Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ形質転換体をウリジンが欠落した最小培地（Ｂａｌｌａｎｃｅ、他、１９８３）上で成長させた。形質転換体を、Ｃａｏ、他（２０００）に記載の通り、胞子形成成長寒天プレートからの１ｃｍ２の胞子懸濁液を１００ｍＬの振とうフラスコ中に３日間、３７℃で植菌することによりセルラーゼ活性をスクリーニングした。
【０２０１】
ＣＢＨ１活性分析は非蛍光４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシドから生成物ラクトース及び７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンへの加水分解に基づき、後者の生成物は蛍光シグナルに関与する。１７０μＬ ５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液 ｐＨ４．５を９６ウェル・マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｌｕｏｔｒａｃ ２００、ａｒｔ．ｎｒ．６５５０７６）中にピペットで取り、蛍光に適している。１０μＬの上澄みを加え、それから１０μＬのＭＵＬ（１ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシド（ＭＵＬ）のｍｉｌｌｉＱ水）を加え、ＭＴＰをＦｌｕｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｄ−７７６５６ Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ）中に置く。反応速度を１６分間（それぞれ１２０秒、８サイクル）、λ３２０ｎｍ（励起）及びλ４６０ｎｍ（発光）を用いて５０℃で測定する。ＣＢＨ活性を有する上澄みをそれから下記の実施例５の説明の通り、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。
【０２０２】
アミノ酸配列を上記実施例１の通り推定した。ＣＢＨ１相同体のアミノ酸配列を図４（ヒポクレア・オリエンタリス）、６（ヒポクレア・シュワイニッチィ）、８（トリコデルマｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、及び１０（トリコデルマ・プソイドコニンギー）に示す。
【０２０３】
当該相同体の熱安定性は以下の実施例５に説明する通り測定した。
【表２】
【０２０４】
見ての通り、ＣＢＨ１セルラーゼ相同体は野生型と比較して変異体ＣＢＨ１セルラーゼの熱安定性にわずかな影響または悪影響を与えた。当該相同体はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１に緊密に関連しており、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａと相同体間の熱安定性の違いはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中見られるアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を含む部位が熱安定性に関連している可能性を示す。
【０２０５】
実施例３
安定性に重要な部位の同定
上述の実施例２で特徴付けられたＣＢＨ１相同体のアミノ酸配列を、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩとＪ．ｊｅｃｏｒｉｎａ配列を用いて、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅｒｃｈ、２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）を用いて配列した。当該配列を図２に示す。
【０２０６】
ＣＢＨ１酵素の安定性に関連する可能性のある部位をＣＢＨ１を含む相同体の配列配置に基づいて３つの異なる方法で測定した。第１の方法において、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１触媒ドメインと低安定性の少なくとも１の相同体の触媒ドメイン（すなわち、Ｈ．オリエンタリスのみ除く）間で異なる部位をＣＢＨ１の熱安定性に関係する可能性のある部位として同定した。同定された部位は、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＣＢＨ１中のＬ６、Ｐ１３、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｓ４７、Ｔ５９、Ｔ６６、Ｇ８８、Ｎ８９、Ｔ１６０、Ｑ１８６、Ｓ１９５、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｄ２４９、Ｎ２５０、Ｔ２８１、Ｅ２９５、Ｆ３１１、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ａ３３６、Ｋ３５４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、及び／またはＦ４１８である。
【０２０７】
第２の方法において、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａまたはＨ．オリエンタリス中の残基が減少した安定性酵素相同体の全てにおいて見られる残基と同じ場合の部位はＴｍと相関性がない部位を同定した。安定性との関連性を保有するとして同定された部位は、ヒポクレアｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＣＢＨ１中の、Ｌ６、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｓ４７、Ｔ５９、Ｔ６６、Ｔ１６０、Ｑ１８６、Ｓ１９５、Ｔ２３２、Ｅ２３６、Ｇ２４２、Ｄ２４９、Ｔ２８１、Ｅ２９５、Ｅ３２５、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ｔ３３２、Ｋ３５４、及び／またはＰ４１２である。
【０２０８】
最後の方法において、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ及びＨ．オリエンタリスが同じである部位において、Ｈ．シュワイニッチィ中の対応残基がこれらの２つのいずれとも同じまたは異なるが、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａまたはＴ．プソイドコニンギーの対応部位中に異なるアミノ酸を有する場合の部位は酵素の熱安定性に関連する可能性がある部位として考慮した。これらの部位は、実験的にＴｍ安定性との相関性を最もよく示し、Ｑ１８６、Ｓ１９５、Ｅ３２５、Ｔ３３２、及びＰ４１２として同定した。
【０２０９】
Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中に見られるアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を含む部位の同定を従って、部位飽和突然変異（ｓｉｔｅ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に供した。
【０２１０】
実施例４
ＣＢＨ１変異体の発現
ＰＣＲ断片を実施例１に記載のプライマー及び手順を用いて得た。当該断片をキアゲン・ゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。精製断片を、ここに引用するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー指示マニュアル（バージョンＣ）（インビトロジェン（登録商標））を用いてｐＤＯＮＲ（登録商標）２０１ベクター（インビトロジェン（登録商標））とクロナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）反応を行うために用いた。それから遺伝子をこのエントリー（ＥＮＴＲＹ）ベクターから目的地ベクター（ｐＲＡＸｄｅｓ２）に移動させ、発現ベクターｐＲＡＸＣＢＨ１を得た。
【０２１１】
細胞を所望のセルラーゼ−エンコード核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換させた。宿主細胞、Ａ．ニガーをそれから実施例２に説明するように、所望のセルラーゼの発現可能な条件下で成長させた。
【０２１２】
実施例３で同定された、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１と異なる部位は当該変異体の熱安定性に関連する可能性があるので、従って部位飽和突然変異に供した。
【０２１３】
実施例５
ＣＢＨ１変異体の熱安定性
ＣＢＨ１セルラーゼ変異体を上述の通りクローン及び発現させる（実施例４を参照）。Ｃｅｌ７Ａ野生型及び変異体をそれからカラムクロマトグラフィーによりこれらの培養物の細胞を含まない（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）上澄みから精製する。タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製する。カラムをＢｉｏＣＡＤ（登録商標）Ｓｐｒｉｎｔ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎクロマトグラフィーシステム上でＰｏｒｏｓ（登録商標）２０ＨＰ２樹脂を用いて操作し、これらは両方ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製である。
【０２１４】
ＨＩＣカラムを５カラム体積の０．０２０Ｍ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムを用いてｐＨ６．８で平衡にする。硫酸アンモニウムを上澄みに加え、最終濃度が約０．５Ｍになるようにし、及びｐＨを６．８に調節する。ろ過後、上澄みをカラム上に充填する。充填後、カラムを１０カラム量（ｖｏｌｕｍｅ）の平衡緩衝液で洗浄し、それから１０カラム量で０．５Ｍ硫酸アンモニウムからゼロ硫酸アンモニウム勾配で、ｐＨ６．８、０．０２Ｍリン酸ナトリウム中で溶出させる。Ｃｅｌ７Ａをおおよそ中間勾配で溶出させる。断片を収集し、還元、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析に基づいてプールする。
【０２１５】
融点をＬｕｏ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５６１２の方法に従って測定する。
【０２１６】
データをＡｖｉｖ ２１５円偏光二色性分光計により集める。２１０〜２６０ナノメートルの変異体のスペクトルを２５℃で取る。緩衝液条件は５０ｍＭ ビス−トリス−プロパン／５０ｍＭ 酢酸アンモニウム／氷酢酸、ｐＨ５．５である。タンパク質濃度は０．２５〜０．５ｍｇｓ／ｍＬに維持する。非折り畳みを観測するための最適波長を測定した後、サンプルを同じ緩衝条件下、温度２５℃〜７５℃に傾斜させることにより熱変性させる。データを５秒間、２度毎に回収する。部分的に可逆的な非折り畳みを２３０ナノメートル、０．１ｃｍパス・レングス細胞中で観測する。
【０２１７】
ＣＢＨ１セルラーゼ変異体に導入された変異は、野生型と比較して変異体ＣＢＨ１セルラーゼの熱安定性に好ましく影響する。
【０２１８】
ここに記載される実施例及び実施態様は説明目的のためのみであり、これに照らして種々の修正または変形が当業者に示唆され、本発明の概念及び精神及び請求の範囲の範囲内であることが理解される。ここに記載の全ての文献、特許及び特許出願はその全体を全ての目的においてここに引用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図１はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来の野生型Ｃｅｌ７Ａ（ＣＢＨ１）の核酸（下の行）（配列番号１）及びアミノ酸（上の行）（配列番号２）配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、Ｃｅｌ７ＡファミリーメンバーのＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｔ．リーゼイともいう）（配列番号２）、Ｈ．オリエンタリス（配列番号５）、Ｈ．シュワイニッチィ（配列番号８）、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ（配列番号１１）及びＴ．プソイドコニンギー（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す。また、コンセンサス配列も示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、Ｃｅｌ７ＡファミリーメンバーのＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｔ．リーゼイともいう）（配列番号２）、Ｈ．オリエンタリス（配列番号５）、Ｈ．シュワイニッチィ（配列番号８）、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ（配列番号１１）及びＴ．プソイドコニンギー（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す。また、コンセンサス配列も示す。
【図３】図３はＨ．オリエンタリスＣＢＨ１（配列番号３）のゲノムＤＮＡ配列である。イントロンは太字、下線で示す。
【図４】図４はＨ．オリエンタリスＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号４）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号５）である。
【図５】図５はＨ．シュワイニッチィＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ配列（配列番号６）である。イントロンは太字、下線で示す。
【図６】図６はＨ．シュワイニッチィＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号７）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号８）である。
【図７】図７はＴ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ配列（配列番号９）である。イントロンは太字、下線で示す。
【図８】図８はＴ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号１０）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号１１）である。
【図９】図９はＴ．プソイドコニンギーＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１２）である。イントロンは太字、下線で示す。
【図１０】図１０はＴ．プソイドコニンギーＣＢＨ１のシグナル配列（Ａ）（配列番号１３）及び成熟アミノ酸配列（Ｂ）（配列番号１４）である。
【図１１】図１１はｐＲＡＸ１ベクターである。このベクターは、アスペルギルス・ニドランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ゲノムＤＮＡ断片ＡＭＡ１配列の５２５９ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６ １９：５６５−５７４）を挿入したこと以外は、プラスミドｐＧＡＰＴ２に基づく。塩基１〜１１３４はアスペルギルスニガー・グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターを含む。塩基３０９８〜３３５６及び４９５０〜４９７１はアスペルギルスニガー・グルコアミラーゼターミネーターを含む。アスペルギルス・ニドランスｐｙｒＧ遺伝子は３３５７〜４９４９に真菌形質転換のためのマーカーとして挿入した。遺伝子が挿入できるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）も存在する。
【図１２】図１２はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクター骨格である。このベクターはプラスミドベクターｐＲＡＸ１に基づく。ゲートウェイカセットをｐＲＡＸ１ベクター内に挿入した（環状プラスミドの内部の矢印により示す）。このカセットは組換え配列ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２及び選択マーカーｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含む。当該ベクターはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング・テクノロジーのマニュアル：バーション１第３４−３８頁に従って作成し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌ＤＢ３．１中でのみ複製し、その他の大腸菌宿主におけるｃｃｄＢ遺伝子は死滅した。まず、ＰＣＲ断片をａｔｔＢ１／２組換え配列を含むプライマーを用いて作る。この断片をｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェンから市販）を用いて組換える。このベクターはｃａｔＨ及びｃｃｄＢを有するａｔｔＰ１／２組換え配列を組換え部位間に含む。インビトロジェンのＢＰクロナーゼ酵素をこのいわゆるエントリー（ＥＮＴＲＹ）ベクター中に当該ＰＣＲ断片を組み込むために用い、当該ＰＣＲ断片が挿入されたクローンは、ｃｃｄＢを発現するクローンは生存できないので５０μｇ／ｍｌカナマイシンで選択できる。そして、ａｔｔ配列を変異させ、ａｔｔＬ１及びａｔｔＬ２と呼ぶ。２番目の工程はこのクローンをｐＲＡＸｄｅｓ２ベクターと組合わせる（ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２ ｃａｔＨ及びｃｃｃＢを組換え部位間に含む）。インビトロジェンのＬＲクロナーゼ酵素を目的ベクター中のエントリーベクターからの導入を組合わせるために用いる。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを用いると、ｃｃｃＢは死滅し、エントリーベクターはアンピシリン感受性なので、ｐＲＡＸＣＢＨ１ベクターのみ選択される。この方法により、発現ベクターを調製し、Ａ．ニガーを形質転換するために用いることができる。
【図１３】図１３は、アスペルギルス中、ＣＢＨ１相同体または変異体をエンコードする核酸の発現に用いる、ｐＲＡＸｄｅｓ２ｃｂｈ１ベクターの説明である。ＣＢＨ１酵素相同体または変異体をエンコードする核酸は、ａｔｔ配列の相同組換えによりベクター内にクローンした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に表す成熟Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１タンパク質の１以上の残基Ｌ６、Ｐ１３、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｓ４７、Ｔ５９、Ｔ６６、Ｇ８８、Ｑ１８６、Ｓ１９５、T２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｎ２５０、Ｔ２８１、Ｆ３１１、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ａ３３６、Ｋ３５４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、及び／またはＦ４１８に対応する位置で置換または欠失を含む、変異体ＣＢＨ１セルラーゼ。
【請求項２】
前記変異体が、Ｑ１８６（Ｅ）、Ｓ１９５（Ａ／Ｅ）、Ｅ２３９Ｓ、Ｇ２４２（Ｈ／Ｙ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ａ）、及びＰ４１２（Ｔ／Ｓ／Ａ）からなる群より選択される残基に対応する位置に置換を有する、請求項１に記載の変異体ＣＢＨ１セルラーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に従うＣＢＨ１変異体をエンコードする単離核酸配列。
【請求項４】
請求項３に従う核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項６】
以下の工程を含むＣＢＨ１変異体の生成方法：
（ａ）適当な条件下、適当な培養基中で、請求項５に従う宿主細胞を培養して、ＣＢＨ１変異体を生成する工程；
（ｂ）前記生成したＣＢＨ１変異体を得る工程。
【請求項７】
請求項１又は２のＣＢＨ１変異体を含む飼料添加物。
【請求項８】
木材パルプと請求項１又は２のＣＢＨ１変異体を接触させることを含む、木材パルプの処理方法。
【請求項９】
バイオマスと請求項１又は２のＣＢＨ１変異体を接触させることを含む、バイオマスから糖への変換方法。
【請求項１】
図１に表す成熟Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１タンパク質の１以上の残基Ｌ６、Ｐ１３、Ｔ２４、Ｑ２７、Ｓ４７、Ｔ５９、Ｔ６６、Ｇ８８、Ｑ１８６、Ｓ１９５、T２３２、Ｅ２３６、Ｅ２３９、Ｇ２４２、Ｎ２５０、Ｔ２８１、Ｆ３１１、Ｎ３２７、Ｄ３２９、Ａ３３６、Ｋ３５４、Ｖ４０７、Ｐ４１２、Ｔ４１７、及び／またはＦ４１８に対応する位置で置換または欠失を含む、変異体ＣＢＨ１セルラーゼ。
【請求項２】
前記変異体が、Ｑ１８６（Ｅ）、Ｓ１９５（Ａ／Ｅ）、Ｅ２３９Ｓ、Ｇ２４２（Ｈ／Ｙ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ａ）、及びＰ４１２（Ｔ／Ｓ／Ａ）からなる群より選択される残基に対応する位置に置換を有する、請求項１に記載の変異体ＣＢＨ１セルラーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に従うＣＢＨ１変異体をエンコードする単離核酸配列。
【請求項４】
請求項３に従う核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項６】
以下の工程を含むＣＢＨ１変異体の生成方法：
（ａ）適当な条件下、適当な培養基中で、請求項５に従う宿主細胞を培養して、ＣＢＨ１変異体を生成する工程；
（ｂ）前記生成したＣＢＨ１変異体を得る工程。
【請求項７】
請求項１又は２のＣＢＨ１変異体を含む飼料添加物。
【請求項８】
木材パルプと請求項１又は２のＣＢＨ１変異体を接触させることを含む、木材パルプの処理方法。
【請求項９】
バイオマスと請求項１又は２のＣＢＨ１変異体を接触させることを含む、バイオマスから糖への変換方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−１５２１３６（Ｐ２０１１−１５２１３６Ａ）
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４５１２０（Ｐ２０１１−４５１２０）
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【分割の表示】特願２００６−５０９２４９（Ｐ２００６−５０９２４９）の分割
【原出願日】平成１６年３月１９日（２００４．３．１９）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【分割の表示】特願２００６−５０９２４９（Ｐ２００６−５０９２４９）の分割
【原出願日】平成１６年３月１９日（２００４．３．１９）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
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