本発明は、それだけには限定されないが、炎症、虚血、喘息、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、アレルギー、寄生虫などの病原性生物の感染、および移植片拒絶を含む障害を治療するために、CD38を発現する細胞の遊走活性をモジュレートするための方法に関する。このような細胞には、例えば、好中球、リンパ球、好酸球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。本発明は、CD38のADP-リボシルシクラーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するために設計された薬物スクリーニングアッセイ、およびCD38がモジュレートした細胞遊走を伴う障害の治療におけるそのような化合物の使用にさらに関する。さらに、本発明は、寄生性の扁形動物であるマンソン住血吸虫からのCD38ホモログの単離、および特徴付けに関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(i)CD38を発現する細胞を試験化合物および基質と接触させ、CD38活性のレベルを測定するステップ、(ii)別個の実験において、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38を発現する細胞と基質とを接触させ、CD38活性のレベルを測定するステップ、および、次いで(iii)パート(i)で測定したCD38活性のレベルを、パート(ii)におけるCD38活性のレベルと比較するステップ
を含み、該試験化合物の存在下におけるCD38活性のレベルの低下が、試験化合物がCD38阻害剤であることを示す、CD38酵素活性を阻害する化合物を同定するための方法。
【請求項２】
ステップ(i)および(ii)において化学誘引物質の存在をさらに含み、かつ前記のCD38を発現する細胞が化学誘引物質受容体を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
(i)精製されたCD38ポリペプチドを試験化合物および基質と接触させ、CD38活性のレベルを測定するステップ、
(ii)別個の実験において、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38を発現する細胞と基質とを接触させ、CD38活性のレベルを測定するステップ、ならびに
(iii)パート(i)で測定したCD38活性のレベルを、パート(ii)におけるCD38活性のレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下でCD38活性のレベルの低下が観察された場合は、CD38がモジュレートした細胞遊走をその化合物が阻害することができるかどうかを決定するためにその化合物を試験する、CD38がモジュレートした細胞遊走を阻害する化合物を同定するための方法。
【請求項４】
CD38活性が、NAD+グリコヒドロラーゼ、ADP-リボシルシクラーゼ、およびグリコシド交換活性からなる酵素活性の群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
CD38酵素を、ニコチンアミド、ADP-リボース(ADPR)、サイクリック-ADPR(cADPR)、またはニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸(NAADP)の形成速度をモニターすることにより測定する、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項６】
CD38活性を、測定される細胞内カルシウムレベルにおける変化をモニターすることにより測定する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項７】
細胞内Ca²⁺レベルにおける変化を、Indo、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-5F、Fluo-4FF、Fluo-5N、Fura-Red、カルシウムグリーン、カルシウムオレンジ、カルシウムクリムゾン、マグネシウムグリーン、オレゴングリーン、およびRhod-2からなる群から選択されるカルシウム指示色素を用いて検出する、請求項２４に記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
(i)試験化合物をCD38タンパク質と接触させるステップ、
(ii)前記化合物がCD38タンパク質に結合するかどうかを決定するステップ、および
(iii)前記CD38タンパク質に結合する試験化合物を、CD38タンパク質の活性をモジュレートするのに用いることができる化合物であるとして選択するステップ
を含む、CD38の活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項９】
ステップ(i)および(ii)において、試験化合物または対照ビヒクルと接触させるべき細胞またはCD38タンパク質を、一続きの位置で提供する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
以下のステップ：
(i)CD38を発現する細胞を1,N⁶-エテノ-NADの存在下で試験化合物と接触させ、1,N⁶-エテノ-ADPRの形成を測定するステップ、
(ii)対照として、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38タンパク質を発現する細胞を、1,N⁶-エテノ-NADの存在下で対照ビヒクルと接触させ、1,N⁶-エテノ-ADPRの形成を測定するステップ、および
(iii)パート(i)で測定した1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルを、パート(ii)で測定した1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下で測定された1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルにおける相違が、試験化合物がCD38モジュレーターであることを示す、CD38活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項１０】
以下のステップ：
(i)CD38タンパク質を1,N⁶-エテノ-NADの存在下で試験化合物と接触させ、1,N⁶-エテノ-ADPRの形成を測定するステップ、
(ii)対照実験として、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38タンパク質を、1,N⁶-エテノ-NADの存在下で対照ビヒクルと接触させ、1,N⁶-エテノ-ADPRの形成を測定するステップ、および
(iii)パート(i)で測定した1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルを、パート(ii)で測定した1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下で測定された1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルにおける相違が、試験化合物がCD38モジュレーターであることを示す、CD38活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項１１】
ステップ(i)および(ii)において、試験化合物または対照ビヒクルと接触させるべき細胞またはCD38タンパク質を、一続きの位置で提供する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
一続きの位置がマルチウェルプレートにより提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗ADPR特異抗体がウェルの内側表面に結合し、該抗体に結合している1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルを測定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
マルチウェルプレートのウェルが、少なくとも1つのシステイン残基を含むアクセプタータンパク質でコーティングされており、該アクセプタータンパク質に結合している1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルを測定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アクセプタータンパク質がウシのリゾチームである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後に、細胞をマルチウェルプレートの底部へと遠心分離し、遠心分離された細胞に結合している1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルを測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
マルチウェルプレートのウェルが抗CD38抗体でコーティングされており、それによってSM38を固定化し、そしてステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後にプレートのウェルを洗浄し、固定化したSM38に結合している1,N⁶-エテノ-ADPRのレベルを測定する、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップ：
(i)CD38を発現する細胞を、放射標識した基質の存在下で試験化合物と接触させて、放射標識されたADPRの形成を測定するステップ、
(ii)対照として、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38タンパク質を発現する細胞を、放射標識した基質の存在下で対照ビヒクルと接触させ、放射標識されたADPRの形成を測定するステップ、および
(iii)パート(i)で測定した放射標識されたADPRのレベルを、パート(ii)で測定した放射標識されたADPRのレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下で測定された放射標識されたADPRのレベルにおける相違が、試験化合物がCD38モジュレーターであることを示す、CD38活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項１９】
以下のステップ：
(i)CD38タンパク質を、放射標識した基質の存在下で試験化合物と接触させ、放射標識されたADPRの形成を測定するステップ、
(ii)対照として、パート(i)と本質的に同じ条件で、精製されたCD38タンパク質を、放射標識した基質の存在下で対照ビヒクルと接触させ、放射標識されたADPRの形成を測定するステップ、および
(iii)パート(i)で測定した放射標識されたADPRのレベルを、パート(ii)で測定した放射標識されたADPRのレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下で測定した放射標識されたADPRのレベルにおける相違が、試験化合物がCD38モジュレーターであることを示す、CD38活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項２０】
放射標識した基質が、[¹⁴C-アデノシン]-NAD、[³H-アデノシン]-NAD、および[³²P-アデノシン]-NADからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ(i)および(ii)において、試験化合物または対照ビヒクルと接触させるべき細胞またはCD38タンパク質を、一続きの位置で提供する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
一続きの位置がマルチウェルプレートにより提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗ADPR特異抗体がウェルの内側表面に結合し、該抗体に結合している放射標識されたADPRのレベルを測定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
マルチウェルプレートのウェルが、少なくとも1つのシステイン残基を含むアクセプタータンパク質でコーティングされており、該アクセプタータンパク質に結合している放射標識したADPRのレベルを測定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
アクセプタータンパク質がウシのリゾチームである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後に、細胞をマルチウェルプレートの底部へと遠心分離し、遠心分離された細胞に結合している放射標識したADPRのレベルを測定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
マルチウェルプレートのウェルが抗CD38抗体でコーティングされており、それによってSM38を固定化し、そしてステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後にプレートのウェルを洗浄し、固定化したCD38に結合している放射標識されたADPRのレベルを測定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
以下のステップ：
(i)CD38を発現する細胞を、NAD+基質の存在下で試験化合物と接触させ、ADPRの形成を測定するステップ、
(ii)対照として、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38タンパク質を発現する細胞を、NAD+基質の存在下で対照ビヒクルと接触させ、ADPRの形成を測定するステップ、および
(iii)パート(i)で測定したADPRのレベルを、パート(ii)で測定したADPRのレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下で測定されたADPRのレベルにおける相違が、試験化合物がCD38モジュレーターであることを示す、CD38活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項２９】
以下のステップ：
(i)CD38タンパク質を、NAD+基質の存在下で試験化合物と接触させ、ADPRの形成を測定するステップ、
(ii)対照として、パート(i)と本質的に同じ条件で、CD38タンパク質を、NAD+基質の存在下で対照ビヒクルと接触させ、ADPRの形成を測定するステップ、および
(iii)パート(i)で測定したADPRのレベルを、パート(ii)で測定したADPRのレベルと比較するステップ
を含み、試験化合物の存在下で測定したADPRのレベルにおける相違が、試験化合物がCD38モジュレーターであることを示す、CD38活性をモジュレートする化合物を同定するための方法。
【請求項３０】
ステップ(i)および(ii)において、試験化合物または対照ビヒクルと接触させるべき細胞またはCD38タンパク質を、一続きの位置で提供する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
一続きの位置がマルチウェルプレートにより提供される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗ADPR特異抗体がウェルの内側表面に結合し、該抗体に結合しているcADPRのレベルを測定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項３３】
ADPRのレベルを抗ADPR特異抗体を用いて測定する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が蛍光で標識されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
マルチウェルプレートのウェルが、少なくとも1つのシステイン残基を含むアクセプタータンパク質でコーティングされており、該アクセプタータンパク質に結合しているcADPRのレベルを測定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
アクセプタータンパク質がウシのリゾチームである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後に、細胞をマルチウェルプレートの底部へと遠心分離し、遠心分離された細胞に結合しているcADPRのレベルを測定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
マルチウェルプレートのウェルが抗CD38抗体でコーティングされており、それによってSM38を固定化し、そしてステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後にプレートのウェルを洗浄し、固定化したSM38に結合しているcADPRのレベルを測定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ(i)およびステップ(ii)が完了した後に、細胞をマルチウェルプレートの底部へと遠心分離し、遠心分離された細胞に結合しているADPRのレベルを測定する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ(i)および(ii)において化学誘引物質の存在をさらに含み、かつ前記のCD38を発現する細胞が化学誘引物質受容体を発現する、請求項１０、１８、および２８に記載の方法。
【請求項４１】
CD38を発現する細胞の遊走をモジュレートするための方法であって、前記細胞をCD38酵素活性のモジュレーターと接触させることを含む方法。
【請求項４２】
前記細胞が、好中球、樹状細胞、好酸球、単球、およびT細胞からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８（Ａ）（Ｃ）】

【図８（Ｂ）】

【図８（Ｄ）】

【図９（Ａ）】

【図９（Ｂ）（Ｃ）（Ｅ）（Ｆ）（Ｇ）】

【図９（Ｄ）】

【図１０（Ａ）（Ｂ）】

【図１０（Ｃ）（Ｄ）】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【公表番号】特表２００８−５３０９９０（Ｐ２００８−５３０９９０Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５３６７（Ｐ２００７−５５５３６７）
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５３１４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８９５１
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０７２７４７２２）トリュデュ　インスティチュート，インク． (1)
【出願人】（３０８００６９７７）
【出願人】（３０８００６９８８）
【出願人】（３０８００６９９９）
【Ｆターム（参考）】