Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏおよびこれらの誘導体の使用
本開示は、部分的に、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストのグループに属する２種のヒトタンパク質、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏが、ミオスタチン、ＧＤＦ１１およびＮｏｄａｌに結合してこれらを拮抗するという発見、そしてさらに、ミオスタチン／ＧＤＦ１１結合ドメインが、これらのタンパク質のシステイン−ノットドメインに存在するという発見に関する。本開示は、ミオスタチン、ｎｏｄａｌおよびＧＤＦ−１１に関連する種々の障害の処置において使用するためのＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年１２月８日に出願された、米国仮特許出願第６０／８７３，９３３号の利益を主張し、この仮特許出願は、その全体が本明細書により参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーのタンパク質は、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびミューラー阻害物質（ＭＩＳ）を含むサイトカインの大きなファミリーを表す（概説については、非特許文献１を参照のこと）。これらのタンパク質は、保存されたＣ末端システイン−ノットモチーフを含み、そして、原形質膜レセプターの多様なファミリーに対するリガンドとして機能する。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、多様な細胞のタイプに対して広範な生物学的作用を及ぼす。このファミリーの多くのメンバーは、胚発生の間に、パターンの形成および組織の特殊化において重要な機能を持つ；成体では、これらの因子は、組織修復および免疫系の調節のようなプロセスに関与する。
【０００３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質の活性は、種々の手段により調節を受ける。タンパク質のＢＭＰサブファミリーのタンパク質に対する負の調節の一つは、いわゆる骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト／抑制因子の比較的大きなファミリーの全体にわたってである。これらのＢＭＰ抑制因子は、ＢＭＰに結合し、その膜レセプターへのＢＭＰの結合に干渉し、それによって、発生および形態発生の間にその作用を拮抗する、タンパク質のサブグループを表す。
【０００４】
ＢＭＰ抑制因子はさらに、構造解析、特に、そのＣ末端に特徴的な「Ｃｙｓ−ノット」構造における構造的に保存されたＣｙｓ残基の数に基づいて、以下の３つの群のタンパク質に分けられ得る：８員環Ｃｙｓ−ノットＢＭＰ抑制因子、９員環Ｃｙｓ−ノットＢＭＰ抑制因子、または１０員環Ｃｙｓ−ノットＢＭＰ抑制因子。その８員環（ＣＡＮサブファミリー）抑制因子は、さらなるシステイン残基の保存配列に基づいて、さらに以下の４つのサブグループに分けられ得る−グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）およびＰＲＤＣ、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏ、ならびに、ＵＳＡＧ−Ｉを伴うＤＡＮおよびスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）。いくつかのモデル有機体のゲノムにおけるこれらのヒトＢＭＰアンタゴニストのオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）もまた同定されており、その系統発生的関係性が解析されている（非特許文献２、本明細書中に参考として援用される）。
【０００５】
ミオスタチンすなわち増殖／分化因子８（ＧＤＦ−８）もまた、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属している（非特許文献３）。ヒトミオスタチン遺伝子はクローニングされており（非特許文献４）、そして、ミオスタチンの免疫反応性が、ヒトの骨格筋の１型および２型の両方の線維で検出可能であることが報告されている。機能に関しては、ミオスタチンは、骨格筋の成長および発生の負の調節において役割を担う可能性がある（Ｎｅｓｔｏｒら、非特許文献４ 上掲）。
【０００６】
ミオスタチンノックアウトマウスを用いた研究は、ミオスタチンが筋発生の重要な負の調節因子であるという最初の証拠を提供した（非特許文献３）。ミオスタチンヌル（ｎｕｌｌ）マウスでは、動物は、野生型マウスよりもかなり大きく、そして、大幅かつ広範囲に及ぶ骨格筋重量の増加を有していた。さらに、筋重量の増加によって特徴付けられる２品種のウシが、ミオスタチンをコードする配列に変異を有する（非特許文献５）。ヒトの小児における天然に存在するミオスタチンの機能低下は、筋肉全体の肥大、および尋常でない強度の家族歴と関連している（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、２００４ Ｊｕｎ ２４；３５０（２６）：２６８２−８）。ミオスタチンに対する抗体は、筋萎縮性側索硬化症を含む筋肉の障害の動物モデルにおいて有益な作用を有することが報告されている（非特許文献６）。
【０００７】
さらに、免疫反応性ミオスタチンの血清および筋肉内の濃度は、健康な男性と比べて筋肉を消耗しているＨＩＶに感染した男性において増加しており、そして、除脂肪体重指数（ｆａｔ−ｆｒｅｅ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）と逆相関していることに注目すべきである。これらのデータは、ミオスタチンが成人男性における骨格筋成長の負の調節因子であり、そして、ＨＩＶに感染した男性における筋肉の消耗に寄与しているという仮説を支持する（Ｎｅｓｔｏｒら、非特許文献４ 上掲）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｓｓａｇｕｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１８７−１９２，１９９７
【非特許文献２】Ａｖｓｉａｎ−ＫｒｅｔｃｈｍｅｒおよびＨｓｕｅｈ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８（１）：１−１２，２００４
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８３−９０（１９９７）
【非特許文献４】Ｎｅｓｔｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４９３８−４３（１９９８）
【非特許文献５】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２４５７−６１（１９９７）
【非特許文献６】Ｈｏｌｚｂａｕｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００６ Ｓｅｐ；２３（３）：６９７−７０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の知見をかんがみて、特に、状態または疾患状態（例えば、加齢に関連するもろさ、自己免疫不全症候群（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＡＩＤＳ）における悪液質、多発性硬化症、筋ジストロフィー、ＡＬＳおよび癌−悪液質など）の結果として筋肉の消耗を受けている個体において、ミオスタチンの活性を調節する様式に対する必要性が存在する。本発明は、このような筋肉消耗状態を有する個体を助けるために利用され得る方法および組成物を提供し、そして、さらに、ミオスタチン遺伝子発現の調節に見通しを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本開示は、部分的に、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストのグループに属する２種のヒトタンパク質、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏが、ミオスタチン、ＧＤＦ１１およびＮｏｄａｌに結合してこれらを拮抗するという発見、そしてさらに、ミオスタチン／ＧＤＦ１１結合ドメインが、これらのタンパク質のシステイン−ノットドメインに存在するという発見に関する。さらに、Ｃｅｒｂｅｒｕｓに関して、ミオスタチン／ＧＤＦ１１の結合およびアンタゴニスト活性は、ＢＭＰ４／２の結合およびアンタゴニスト活性とは分離され得る。したがって、本開示は、部分的に、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏまたはこれらの改変体のミオスタチン結合部分を含むポリペプチドを投与することによって、インビボでミオスタチンおよびＧＤＦ１１を拮抗するための方法を提供する。本発明の一局面は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン、ＧＤＦ１１、そして、特定の形態で、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ２の機能／シグナル伝達を阻害するための、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ（ヒトまたは非ヒト動物に由来するもの）またはこれらの誘導体（まとめて、本明細書中で「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質」）のポリペプチドおよびその薬学的調製物を提供する。特定の実施形態では、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの調製物は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン、ＧＤＦ１１および／または別のＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ４）に対する親タンパク質の結合親和性の全てまたは実質的な部分を保持する、改変体ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｏｃｏタンパク質を包含し得る。特定の実施形態では、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ２への結合を排除または低減する一方で、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１への親タンパク質の結合親和性の全てまたは実質的な部分を保持する、改変体ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｏｃｏタンパク質を包含する。特定の実施形態では、本開示は、全長のヒトＣｅｒｂｅｒｕｓがヒトの血清の存在下で不安定であるという観察を提供し、したがって、少なくとも２４時間の期間にわたり、そして、必要に応じて、２日、３日、５日、７日、１４日もしくは２１日、またはそれよりも長い期間にわたり血清中で安定なＣｅｒｂｅｒｕｓの変化形態（ＢＭＰ４結合形態および選択的ミオスタチン／ＧＤＦ１１／Ｎｏｄａｌ結合形態の両方）が調製され得る。この観察は、Ｃｏｃｏに外挿され得、したがって、少なくとも２４時間の期間にわたり、そして、必要に応じて、２日、３日、５日、７日、１４日もしくは２１日、またはそれよりも長い期間にわたり血清中で安定なＣｏｃｏの変化形態が調製され得る。特定の実施形態では、本開示は、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体の（少なくとも）ミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含有する、ミオスタチンを阻害するための薬学的調製物を提供する。ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、１以上のｎｏｄａｌおよび／またはミオスタチンに結合し、そして中和する。好ましくは、薬学的調製物は、ヒトまたは獣医学的な治療として投与するために適切となるように、発熱物質を実質的に含まない。
【００１１】
ミオスタチンは、筋肉成長のアンタゴニストとして広く認識されている。
【００１２】
さらに、ミオスタチンヌルマウスは、特定の状態において、肥満および糖尿病に対する抵抗性を示している。したがって、本明細書中に記載されるＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質および薬学的調製物は、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、成長もしくは代謝活性によって少なくとも部分的に特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減させるために使用され得る。例えば、本発明の薬学的調製物は、加齢に関連する消耗、加齢に関連するもろさ、悪液質、食欲不振、デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）症候群、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）症候群、顔面肩甲上腕（ＦＳＨ）筋ジストロフィー、他の筋ジストロフィー、ＡＩＤＳ消耗症候群、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。過剰のＢＭＰ４活性は、種々の結合組織の病理学的な骨化と関連している。したがって、抗ＢＭＰ４活性を保持するＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質および薬学的調製物は、少なくとも部分的に、筋、腱および靭帯のような組織における異常な骨化によって特徴付けられる病理的な状態の重症度を低減するために使用され得る。ＢＭＰ４はまた、骨棘の発生および滑膜の肥厚；進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）；およびアテローム性動脈硬化症（特に、病変を起こしやすい領域でのアテローム発生の早期段階における炎症性応答）；ならびに、頭蓋骨癒合症を含む、変形性関節症（ＯＡ）にも関連している。Ｎｏｄａｌのシグナル伝達は、特定の癌、特に黒色腫と関連している。したがって、抗Ｎｏｄａｌ活性を保持するＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質および薬学的調製物は、腫瘍、特に、Ｎｏｄａｌが腫瘍の増殖および成長に関与している黒色腫のような特定の腫瘍を処置するために使用され得る。
【００１３】
本発明の別の局面は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４）のシグナル伝達を実質的に損ねることなく（例えば、実質的にＢＭＰ−４または他のＢＭＰに結合しない）、Ｎｏｄａｌおよび／またはミオスタチンの機能を特異的に阻害するためのＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質誘導体の薬学的調製物を提供する。本発明のこの局面の例示的な調製物としては、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのＮ末端短縮型バージョン、または、システイン−コアを含む他のフラグメントを含むポリペプチドが挙げられる。これらのいわゆる「Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏ誘導体」は、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、成長もしくは代謝活性によって少なくとも部分的に特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減させるために使用され得る。例えば、本発明の薬学的調製物は、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。
【００１４】
特定の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである。例えば、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質改変体は、ヒト、マウスまたは他の種のＣｅｒｂｅｒｕｓに由来し得、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列の類似性もしくは同一性を共有するヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓ改変体配列を含み、そして、野生型のＣｅｒｂｅｒｕｓのミオスタチンに対する結合親和性を実質的に保持し得る。同様に、Ｃｏｃｏタンパク質改変体は、ヒト、マウスまたは他の種のＣｏｃｏに由来し得、ヒトもしくはマウスのＣｏｃｏタンパク質と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列の類似性もしくは同一性を共有するヒトもしくはマウスのＣｏｃｏ改変体配列を含み、そして、野生型のＣｏｃｏのミオスタチンに対する結合親和性を実質的に保持し得る。
【００１５】
特定の関連する実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドであり、このポリペプチドは、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−２に実質的に結合しない。例えば、ミオスタチン結合ドメインは、ヒト、マウスもしくは他の種のＮ末端短縮型のＣｅｒｂｅｒｕｓに由来し得、そのアミノ酸残基は、配列番号１もしくは２の残基１０６〜１１９のいずれか１つから始まり、配列番号１もしくは２の残基２４１の後の任意の残基において終わり、好ましくは、配列番号１もしくは２の残基２４１と残基２６７との間の任意の残基で終わる（全ての残基の番号を含む）。
【００１６】
例えば、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの残基１０６〜１１９は、以下：
ＰＰＧＴＱＳＬＩＱＰＩＤＧＭ（配列番号７）
のとおりである。
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの残基２４１〜２６７は、以下：
ＣＫＶＫＴＥＨＥＤＧＨＩＬＨＡＧＳＱＤＳＦＩＰＧＶＳＡ（配列番号８）
のとおりである。
【００１７】
また、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ由来の改変体配列、例えば、ミオスタチン結合活性は保持するが、他のＢＭＰ結合活性は失っている、ＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型ミオスタチン結合ドメインも包含される。改変体配列は、（例えば、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１またはｎｏｄａｌの結合に関する）インヒビターの選択性を変更するか、ミオスタチンに関する他の結合特性（例えば、Ｋｄ、および／または、ＫｏｎもしくはＫｏｆｆの速度）を変更するか、または、生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、または、インビボもしくは保管中の（ｏｎ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）半減期を改善するための方法として所望され得る。
【００１８】
特定の好ましい実施形態では、ミオスタチン結合ドメインを含むＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（全長もしくはＮ末端短縮型）は、１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは、１００ｎＭ、１０ｎＭもしくはさらには１ｎＭ以下のＫｄでミオスタチンに結合する。
【００１９】
特定の関連する実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、配列番号５もしくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号２２７４９３２９に示されるヒトＣｏｃｏタンパク質のようなＣｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである。
【００２０】
特定の好ましい実施形態では、ミオスタチン結合ドメインを含むＣｏｃｏポリペプチド（全長もしくはＮ末端短縮型）は、１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは、１００ｎＭ、１０ｎＭもしくはさらには１ｎＭ以下のＫｄでミオスタチンに結合する。
【００２１】
特定の実施形態では、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド（例えば、そのミオスタチン結合ドメイン）は、ミオスタチン結合ドメインに加えて、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１以上のポリペプチド部分を含む融合タンパク質の一部である。例えば、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインを含み得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、または、ＧＳＴ融合物のような精製配列を含み得る。
【００２２】
特定の実施形態では、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド（例えば、そのミオスタチン結合ドメイン）は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子（ｏｒｇａｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に結合されたアミノ酸のような、１以上の改変アミノ酸残基を含むタンパク質の一部である。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、例えば、ＧＤＦ−１１および／またはｎｏｄａｌと比べて、ミオスタチンに対する結合および阻害に選択的である。例えば、改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、ＧＤＦ−１１および／もしくはｎｏｄａｌへの結合についてのそのＫｄの少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１よりも小さい、ミオスタチンの結合に対する解離定数（Ｋｄ）を有するものであり得る。結合の速度論の理由であれ、生体内分布の理由であれ、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドはまた、例えば、ＧＤＦ−１１および／もしくはｎｏｄａｌ活性の阻害についてのそのＥＣ５０の少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１より小さい、ミオスタチン活性の阻害、または、特定の生理学的結果（例えば、筋成長の促進）についてのＥＣ５０を有するインヒビター、のように、相対的なインビボでの効力に基づいて選択され得る。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、例えば、他のＢＭＰタンパク質（例えば、ＢＭＰ−４）と比べて、ミオスタチンに対する結合および阻害に選択的である。例えば、改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、ＢＭＰ−４への結合についてのそのＫｄの少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１よりも小さい、ミオスタチンの結合に対する解離定数（Ｋｄ）を有するものであり得る。結合の速度論の理由であれ、生体内分布の理由であれ、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドはまた、例えば、ＢＭＰ−４活性の阻害についてのそのＥＣ５０の少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１より小さい、ミオスタチン活性の阻害、または、特定の生理学的結果（例えば、筋成長の促進）についてのＥＣ５０を有するインヒビター、のように、相対的なインビボでの効力に基づいて選択され得る。
【００２５】
特定の好ましい実施形態では、その改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド結合ドメインは、１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは、１００ｎＭ、１０ｎＭもしくはさらには１ｎＭ以下のＫｄでミオスタチンに結合する。
【００２６】
一般に、本発明のミオスタチンインヒビター調製物は、ヒト患者における使用に適切である。好ましい実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの調製物は、ヒト患者への投与に適切であるように、発熱物質を実質的に含まない。
【００２７】
他の実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、非ヒト動物、特に、他の哺乳動物に投与され得る。例えば、本開示の化合物は、ニワトリ、シチメンチョウ、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシなど）、愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）に与えられ得、または、成長を加速し、そして、タンパク質／脂質比を改善するために、水産養殖における有用性を有し得る。さらに例示するために、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドは、食肉生産に関して生じる動物の成長を促進するかもしくは飼料効率を高めて、鮮肉の品質を高めるため、または、乳牛における牛乳生産を増加させるために使用され得る。
【００２８】
本開示の別の局面は、ヒト患者における筋組織の成長の促進における使用のための、本明細書中に記載されるような改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの薬学的調製物と、ラベルもしくは指示書とを含む包装された医薬品に関する。
【００２９】
本開示のなお別の局面は、非ヒト哺乳動物における筋組織の成長の促進における獣医学的使用のための、本明細書中に記載されるような改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの薬学的組成物と、ラベルもしくは指示書とを含む包装された医薬品に関する。
【００３０】
本開示の別の局面は、１以上の本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの薬学的調製物を投与することにより、ミオスタチンのインビボでのシグナル伝達を阻害するための方法に関する。本発明の方法は、ヒト患者または非ヒト動物において、筋肉の成長を促進するため、脂肪細胞への分化を促進するため、そして／または、骨の成長もしくは鉱化作用を促進するために使用され得る。
【００３１】
特定の実施形態では、本開示の処置方法は、少なくとも部分的に、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、成長もしくは代謝活性によって特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減するために使用され得る。例えば、本開示の薬学的調製物は、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。
【００３２】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な筋ジストロフィーとしては以下が挙げられる：デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（また、ランドジー−デジェリーヌとしても公知）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（また、シュタイネルト病としても公知）、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー（Ｄｉｓｔａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＤＤ）および先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）。
【００３３】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な運動ニューロン疾患としては以下が挙げられる：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（また、ルー・ゲーリグ病としても公知）、小児進行性脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ、ＳＭＡ１またはＷＨ）（また、ＳＭＡ１型、ヴェルドニッヒ−ホフマンとしても公知）、中間型脊髄性筋萎縮（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ＳＭＡまたはＳＭＡ２）（また、ＳＭＡ２型としても公知）、若年性脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ、ＳＭＡ３またはＫＷ）（また、ＳＭＡ３型、クーゲルベルク−ヴェランデルとしても公知）、球脊髄性筋萎縮（Ｓｐｉｎａｌ Ｂｕｌｂａｒ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ＳＢＭＡ）（また、ケネディ病およびＸ連鎖ＳＢＭＡとしても公知）、および成人脊髄性筋萎縮（Ａｄｕｌｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ＳＭＡ）。
【００３４】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な炎症性筋障害としては以下が挙げられる：皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭｌＤＭ）、および封入体筋炎（ＩＢＭ）。
【００３５】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な神経筋接合部の疾患としては以下が挙げられる：重症筋無力症（ＭＧ）、ランバート−イートン症候群（ＬＥＳ）、および先天性筋無力症症候群（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｍｙａｓｔｈｅｎｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＭＳ）。
【００３６】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な内分泌異常に起因する筋障害としては以下が挙げられる：甲状腺機能亢進性筋障害（Ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｉｄ Ｍｙｏｐａｔｈｙ）（ＨＹＰＴＭ）および甲状腺機能低下性筋障害（Ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ Ｍｙｏｐａｔｈｙ）（ＨＹＰＯＴＭ）。
【００３７】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る末梢神経の例示的な疾患としては以下が挙げられる：シャルコー−マリー−ツース病（ＣＭＴ）、ドゥジュリーヌ−ソッタ病（ＤＳ）およびフリートライヒ運動失調（ＦＡ）。
【００３８】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る他の例示的な筋障害としては以下が挙げられる：先天性筋緊張症（ＭＣ）、先天性パラミオトニア（ＰＣ）、中心コア病（ＣＣＤ）、ネマリン筋障害（ＮＭ）、筋細管筋障害（ＭＴＭもしくはＭＭ）、および周期性四肢麻痺（ＰＰ）。
【００３９】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る筋肉の例示的な代謝性疾患としては、以下が挙げられる：ホスホリラーゼ欠損症（ＭＰＤもしくはＰＹＧＭ）、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（ＰＦＫＭ）、脱分枝酵素欠損症（ＤＢＤ）、ミトコンドリア性筋障害（ＭＩＴＯ）、カルニチン欠損症（ＣＤ）、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセレートキナーゼ欠損症（ＰＧＫ）、ホスホグリセレートムターゼ欠損症（ＰＧＡＭもしくはＰＧＡＭＭ）、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＤＨＡ）、およびミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症（ＭＡＤ）。
【００４０】
本発明の方法はまた、肥満またはＩＩ型糖尿病の処置のような、代謝障害を防止、その重症度を改善または低減するために使用され得る。さらに例示すると、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド調製物は、被験体における体脂肪の割合を減少させるために使用され得る。
【００４１】
なお他の実施形態では、改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド調製物は、加齢に関連するもろさを低減するような方法の一部として使用され得る。
【００４２】
本発明の薬学的組成物はまた、脊髄損傷および卒中のようなＣＮＳ傷害／疾患、ならびに、ＰＮＳ傷害／疾患を含む、多数の神経系疾患状態を処置するためのミオスタチンアンタゴニストとしても使用され得る。
【００４３】
一局面では、本開示は、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号２）のアミノ酸１６２〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を提供し、このタンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたり実質的に血清に対して安定である。
【００４４】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２６７の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２６７の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１１９〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２６７の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２４１の配列またはヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２６７の配列のうちの１種以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００４５】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する。ミオスタチンアンタゴニスト活性は、例えば、Ａ２０４細胞ベースのアッセイで評価され得る。
【００４６】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む。配列番号２のアミノ酸配列に関する改変は、以下の配列：ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＳＨＣＬＰＡＫ、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＭＦＲＫＴＰまたはヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＮＱＲＥＬＰのうち１以上における切断を低減もしくは排除し得る。
【００４７】
別の局面では、本開示は、ヒトＣｏｃｏ（配列番号５）のアミノ酸１０１〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を提供し、このタンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたって、実質的に血清に対して安定である。
【００４８】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：ヒトＣｏｃｏのアミノ酸１０１〜１８９の配列、ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８５の配列、ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８９の配列、ヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８５の配列またはヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８９の配列のうちの１種以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する。ミオスタチンアンタゴニスト活性は、例えば、Ａ２０４細胞ベースのアッセイで評価され得る。
【００５０】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号５のアミノ酸配列に関する改変を含む。配列番号５のアミノ酸配列に関する改変が、以下のヒトＣｏｃｏの配列：ＰＡＲＫＲＷおよびＳＲＲＲＶＫの一方もしくは両方における切断を低減もしくは排除し得る。
【００５１】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である。特定の実施形態では、親和性試薬は、以下：（ｉ）抗体因子、（ｉｉ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチド、（ｉｉｉ）ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメイン、または（ｉｖ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子、のうちの１以上である。適切な抗体因子の例としては、例えば、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖが挙げられる。特定の実施形態では、抗体因子は、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである。
【００５３】
別の局面では、本開示は、本明細書中に記載される１以上のミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む薬学的調製物を提供する。
【００５４】
別の局面では、本開示は、患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１および／またはＮｏｄａｌを阻害するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される１以上のミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含する。特定の実施形態では、患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１および／またはＮｏｄａｌの阻害は、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１および／またはＮｏｄａｌによって調節される遺伝子の発現の検出可能な変化を引き起こす。
【００５５】
別の局面では、本開示は、患者において筋重量を増加させるための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される１以上のミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００５６】
別の局面では、本開示は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む、発熱物質を実質的に含まない薬学的調製物を提供し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、（ａ）Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンのうちの１以上に結合し、そして、そのシグナル伝達活性を阻害し；そして、（ｂ）ＢＭＰ４には実質的に結合しない。
【００５７】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、筋組織の成長を促進する。
【００５８】
特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、以下のアミノ酸配列の１つまたは両方に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する：配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１、配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一な（ａｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）アミノ酸配列を有する。
【００５９】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、全長の成熟なヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質を含まない。
【００６０】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。
【００６１】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である。特定の実施形態では、親和性試薬は、以下：（ｉ）抗体因子、（ｉｉ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチド、（ｉｉｉ）ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメイン、または（ｉｖ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子、のうちの１以上である。適切な抗体因子の例としては、例えば、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖが挙げられる。特定の実施形態では、抗体因子は、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである。
【００６３】
別の局面では、本開示は、患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１を阻害するための方法を提供し、この方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１の阻害が、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によって調節される遺伝子の発現の検出可能な変化を引き起こす。特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない。
【００６４】
別の局面では、本開示は、骨格筋重量の増加を必要とする患者において骨格筋重量を増加させるための方法を提供し、この方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない。
【００６５】
別の局面では、本開示は、哺乳動物における筋組織の成長を促進するための薬物の調製のための、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の使用を提供し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、Ｗｎｔ、ＮｏｄａｌおよびＢＭＰがＣｅｒｂｅｒｕｓに結合している、概略図を示す。ＢＭＰ−２および高度に関連するＢＭＰ−４は、おそらくは同じ領域において、Ｃｅｒｂｅｒｕｓに対して競合的に結合する。他のより関連性が低いかもしくは関連のないタンパク質（例えば、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ）は、ＢＭＰ−４と競合しない。ＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型バージョンは、依然としてＸｎｒ−１（マウスＮｏｄａｌのＸｅｎｏｐｕｓホモログ）に結合する（Ｐｉｃｃｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：７０７−７１０，１９９９から改作）。
【図２】Ｃａｒｏｎｔｅ−ＦｃのＧＤＦ−１１への結合。トレーシングは、Ｃａｒｏｎｔｅ−ＦｃがＢｉａＣｏｒｅチップ上のＧＤＦ−１１に結合することを示す。ＧＤＦ−１１は、標準的なアミンカップリング処理を用いてＢｉａＣｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定化された。トレース：Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃ（２００μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＧＤＦ−１１をカップリングさせたチップ上に注入した。
【図３】Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイ。この図は、レポーターベクターであるｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を示す（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００に記載されたもの）。ＣＡＧＡ１２モチーフが、ＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在しており、したがって、このベクターは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介してシグナル伝達する因子に一般に使用される。
【図４】Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）融合物もまた、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。
【図５】Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてアクチビンＡを阻害しない。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合物（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）は、予想どおりに、アクチビンＡのシグナル伝達を阻害する。
【図６】Ｃｅｒｂｅｒｕｓ−ＦｃおよびＣａｒｏｎｔｅ−Ｆｃはともに、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてＧＤＦ−８のシグナル伝達を阻害する。
【図７】ヒトＣｏｃｏ−Ｆｃ（マウスＦｃ）は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。ヒトＣｏｃｏ−ｍＦｃを発現する細胞からの馴化培地を、ＧＤＦ−１１の存在下でのＡ−２０４レポーター遺伝子の発現に対する作用について調べた。
【図８】ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃは、ヒト血清中で分解する。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃを発現する細胞からの馴化培地を、種々の量のヒト血清（加えた血清の割合を上部に示す）と共に３７℃にて一晩インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分けた。Ｃｅｒｂｅｒｕｓを、一次抗体：ビオチン化ポリクローナル抗Ｃｅｒｂｅｒｕｓ抗体および二次抗体：アビジン−ＨＲＰを用いてウェスタンブロットにより検出した。左レーンは、分子量標準物質である。およそ７０ｋＤの主要なバンドは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃであり、これは、５％ヒト血清と共にインキュベートした場合、完全に分解されている。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な説明
Ｉ．概要
Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、発生中に前内中胚葉（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｍｅｓｏｄｅｒｍ）において発現される（Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：５９５−６０１，１９９６；Ｐｉｃｃｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：７０７−１０，１９９９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：２４３−５１，１９９９）。Ｃａｒｏｎｔｅ（ニワトリオーソログ）は、ニワトリ胚における左右非対称性に関与している（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、上掲）。Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、細胞外空間において多効果の増殖因子アンタゴニストとして機能し、そして、ＢＭＰ−４、ｎｏｄａｌおよびＷｎｔによるシグナル伝達を阻害する（Ｂｅｌｏら、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２６：２６５−７０，２０００）。マウスのＣｅｒｂｅｒｕｓは、独立の部位を介してＢＭＰタンパク質およびｎｏｄａｌに結合するが（Ｐｉｃｃｏｌｏ、上掲）、ＸｅｎｏｐｕｓのＣｅｒｂｅｒｕｓもまた、Ｗｎｔタンパク質に結合してその作用を阻害する（Ｂｅｌｏ、上掲）。Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、体幹構造（ｔｒｕｎｋ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を持たない異所性の頭部を誘導するという独特の特性を持つ（Ｐｉｃｃｏｌｏ、上掲）。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの発現は、原腸形成の間に、内胚葉におけるｎｏｄａｌに関するシグナルによって、そして、Ｓｐｅｍａｎｎオーガナイザー因子によって活性化される（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５７：１９０−２０４，２００３）。
【００６８】
Ｃｅｒｂｅｒｕｓのオーソログは、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＦｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓに見られ得るが、無脊椎動物においては欠失している。Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓでは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓに対する唯一のオーソログが存在する。Ｃｅｒｂｅｒｕｓに対する全てのオーソログ遺伝子は、２つのエキソンを有する；第１の８アミノ酸のシスチン−ノットドメインは、第１エキソンの３’末端によってコードされ、モチーフの残りは第２エキソンによってコードされる。いくつかのオーソログでは、推定のタンパク質分解による切断部位は、シスチン−ノットドメインの開始点の上流に見られ得る。
【００６９】
Ｃｏｃｏは、Ｎｏｄａｌのシグナル伝達を阻害するタンパク質のＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｄａｎファミリーの別のメンバーである。
【００７０】
本開示は、一部において、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−１１および／またはミオスタチンの機能を阻害するためのＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体を提供する。特定の実施形態では、ＣｏｃｏおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４）のシグナル伝達を実質的に損ねることなく（例えば、ＢＭＰ−４または他のＢＭＰに実質的に結合しない）、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−１１および／またはミオスタチンの機能を阻害する。本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体はまた、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４）のシグナル伝達を阻害するためにも使用され得る。
【００７１】
本開示の例示的な調製物としては、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのＮ末端短縮型バージョンを含むＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド誘導体が挙げられる。これらのいわゆる「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体」または「Ｃｏｃｏ誘導体」は、少なくとも部分的に、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、発生もしくは代謝活性によって特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減させるために使用され得る。例えば、本開示の薬学的調製物は、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。
【００７２】
ＩＩ．定義
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作成方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
【００７３】
「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または正確さを仮定して、測定された量についての誤差の容認可能な程度を意味する。代表的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の、２０パーセント（％）内、好ましくは１０パーセント（％）内、そしてより好ましくは５％内である。
【００７４】
あるいは、そして、特に生物学的な系において、用語「約」および「およそ」は、所与の値のあるオーダーの大きさの範囲内、好ましくは、５倍以内、そしてより好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられる数量は、特に明記しない限り近似値であり、明白に記述されない場合には、用語「約」または「およそ」は、推量され得ることを意味する。
【００７５】
本開示の方法は、配列を互いに比較する工程を包含し得、この比較には、野生型配列の１以上の変異体／配列改変体に対する比較を含む。このような比較は代表的には、例えば、当該分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、少数の名を挙げれば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を用いた、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、変異が残基の挿入または欠失を含むようなこのようなアラインメントにおいて、配列のアラインメントは、挿入もしくは欠失された残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」（代表的には、―または「Ａ」で表される）を導入することを容易に理解し得る。
【００７６】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて、同種の生物におけるスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに、異なる種の生物に由来する相同なタンパク質を含む、「共通する進化の起源」を有する２タンパク質間の関係をいう。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【００７７】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有していても共有していなくても、核酸もしくはアミノ酸間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００７８】
しかし、一般的な用法および本願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００７９】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングし得る場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸についての予備的なスクリーニングには、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用され得る（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．２５％ ミルク、およびホルムアミドなし；または、３０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ）。
【００８０】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応する（例えば、４０％ ホルムアミド、および５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ）。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍに対応する（例えば、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ）。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａである。
【００８１】
「高ストリンジェンシーの条件」は、構造的に関連するが、構造的に似ていない核酸のハイブリダイゼーションを可能にする、ハイブリダイゼーション条件を包含するということは、当該分野で充分に理解される。用語「ストリンジェント」は、高度に相補的な核酸のみのアニーリングを可能にする任意の数多くの代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載するものとして当業者に理解される当該分野の用語である。
【００８２】
例示的な高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は、約１Ｍの塩濃度において形成されるＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を下回る、約２０〜２７℃に等価である。多くの等価な手順が存在し、そして、いくつかの一般的な分子クローニングのマニュアルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションのための適切な条件を記載しており、さらに、これらの条件下で安定であると予測されるハイブリッドの長さを計算するための等式を提供している（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６もしくは１３．３．６；または、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓの９．４７−９．５７頁を参照のこと）。
【００８３】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにもよるが、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、相補性の度合い、当該分野で周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、これらの配列を持つ核酸のハイブリッドに対するＴｍの値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さ１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについて、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲、９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲、１１．８を参照のこと）。ハイブリダイゼーション可能な核酸についての最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；そして、より好ましくは、長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００８４】
特定されない限り、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、約５５℃のＴｍを指し、上に示されるような条件を利用する。好ましい実施形態では、Ｔｍは６０℃である；より好ましい実施形態では、Ｔｍは６５℃である。特定の実施形態では、「高ストリンジェンシー」は、０．２×ＳＳＣにおいて６８℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣにおいて４２℃、または、これらの２つの条件下で観察されるものと等価なハイブリダイゼーションのレベルを与える条件下での、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件を指す。
【００８５】
オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー）についての適切なハイブリダイゼーション条件は、代表的には、オリゴヌクレオチドのより低い融解温度に起因して、全長核酸（例えば、全長ｃＤＮＡ）についてのものとは幾分異なる。オリゴヌクレオチドの融解温度は、関与するオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するので、適切なハイブリダイゼーション温度は、使用されるオリゴヌクレオチド分子に依存して変化する。例示的な温度は、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）であり得る。オリゴヌクレオチドのための例示的な適切なハイブリダイゼーション条件としては、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、または、等価なレベルのハイブリダイゼーションを与える他の条件が挙げられる。
【００８６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、「ペプチド結合」と呼ばれる化学結合によって互いに連結されたアミノ酸の鎖を説明するために交換可能に用いられる。タンパク質またはポリペプチドは、酵素を含めて、「ネイティブ」または「野生型」であっても（これらが天然に存在することを意味する）；「変異体」、「改変体」または「改変」であっても（これらが、作製されたか、変更されたか、誘導されたか、あるいは、ネイティブなタンパク質もしくは別の変異体とは幾分異なるか、または、変更されていることを意味する）よい。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質」は、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏタンパク質、ならびに、他の種に由来するホモログ（例えば、ＣａｒｏｎｔｅはニワトリのＣｅｒｂｅｒｕｓホモログである）、および天然に存在する形態の生物学的活性を保持する誘導体（変更された配列を持つ形態および短縮型形態を含む）を示すために用いられる。
【００８８】
「ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質」は、マウス（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０３４０１７）またはヒト（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５４４５）のＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（また、それぞれ、ＵＳ２００２／０１６４６８２ Ａ１（この全内容は本明細書中に参考として援用される）の配列番号２および８を参照のこと）のような哺乳動物ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質、ならびに、哺乳動物Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質のＣ末端部分の高度に保存されたシステインのパターンに対して配列相同性を共有する他のタンパク質を指す。Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質についての例示的なアミノ酸配列としては、以下が挙げられる：
マウスＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０３４０１７）（配列番号１）：
【００８９】
【数１】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５４４５）（配列番号２）：
【００９０】
【数２】
マウスおよびヒトのＣｅｒｂｅｒｕｓは、配列番号１および７としてＵＳ２００２／０１６４６８２ Ａ１（本明細書中に参考として援用される）において開示されるようなものである。
ＮＭ＿００９８８７．１（マウスＣｅｒｂｅｒｕｓ ｍＲＮＡ）（配列番号３）。
【００９１】
【数３】
ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５４５４．１（ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ ｍＲＮＡ）（配列番号４）。
【００９２】
【数４】
また、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ関連タンパク質は、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュにおけるファミリーメンバーを含む他の種、ならびに、全ての哺乳動物（例えば、ラット、マウスおよびヒト）にも存在するものと予測される。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質」はまた、対立遺伝子改変体または変異誘発もしくは欠失により誘導された改変体のようなＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の改変体、および、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質のフラグメントも包含し、これらの改変体およびフラグメントは、ミオスタチン結合活性を保持する。「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ様」タンパク質はまた、本明細書中にさらに記載されるタンパク質を含め、構造的および／または機能的類似性を共有するタンパク質のファミリーを示すためにも使用される。このようなタンパク質は、全長にわたって、または少なくとも、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓのミオスタチン結合ドメイン内で、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質と有意な配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い）を共有するアミノ酸配列を有し得る。Ｃｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質はまた、ストリンジェントな条件下で、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓについてのコード配列と、特に、ミオスタチン結合ドメインについてのコード配列の部分とハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体または改変体の配列は、Ｎ末端のＢＭＰ結合ドメインを欠失していても欠失していなくともよい。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの多様な対立遺伝子改変体が公知であり、これとしては、Ａ６５Ｇ（６５位のアラニンのグリシンへの改変）、Ｖｌ７９ＩおよびＬ２２１Ｖが挙げられる。
【００９３】
「ＣｏｃｏまたはＣｏｃｏ様タンパク質」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号２２７４９３２９のヒトＣｏｃｏタンパク質のような哺乳動物Ｃｏｃｏタンパク質および関連のホモログ、ならびに、哺乳動物Ｃｏｃｏタンパク質のＣ末端部分の高度に保存されたシステインのパターンに対して配列相同性を共有する他のタンパク質を指す。ヒトＣｏｃｏタンパク質についての例示的なアミノ酸配列は、以下：
【００９４】
【数５】
である。
【００９５】
配列番号５のアミノ酸１〜２１は、代替のリーダー配列と置き換えられ得るシグナルペプチドに対応する。成熟な分泌型Ｃｏｃｏポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２２〜１８９に対応するものと予測されるが、シグナルペプチドプロセシング酵素の不正確さは、２２位のグリシンからアミノ末端もしくはカルボキシ末端へと向かう１〜５アミノ酸の範囲の位置における、代替的もしくはさらなる切断をもたらし得る。本明細書中に開示されるように、ｔＰＡリーダー配列または異種性のリーダー配列が、ネイティブなリーダー配列の代わりに使用され得る。推奨されるリーダー配列は以下のとおりである：
（ｉ）ミツバチメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号８）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号９）。
【００９６】
ヒトＣｏｃｏをコードする配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号２２７４９３２８（本明細書中に参考として援用される）に開示される（配列番号６）。
【００９７】
【数６】
また、Ｃｏｃｏ関連タンパク質は、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュにおけるファミリーメンバーを含む他の種、ならびに、全ての哺乳動物（例えば、ラット、マウスおよび非ヒト霊長類）にも存在するものと予測される。「ＣｏｃｏまたはＣｏｃｏ様タンパク質」はまた、対立遺伝子改変体または変異誘発もしくは欠失により誘導された改変体のような天然に存在するＣｏｃｏタンパク質の改変体、および、Ｃｏｃｏタンパク質のフラグメントも包含し、これらの改変体およびフラグメントは、ミオスタチン結合活性を保持する。「Ｃｏｃｏ様」タンパク質はまた、本明細書中にさらに記載されるタンパク質を含め、構造的および／または機能的類似性を共有するタンパク質のファミリーを示すためにも使用される。このようなタンパク質は、全長にわたって、または少なくとも、ヒトＣｏｃｏのミオスタチン結合ドメイン内で、ヒトＣｏｃｏタンパク質と有意な配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い）を共有するアミノ酸配列を有し得る。Ｃｏｃｏ様タンパク質はまた、ストリンジェントな条件下で、ヒトＣｏｃｏについてのコード配列と、特に、ミオスタチン結合ドメインについてのコード配列の部分とハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。Ｃｏｃｏ誘導体または改変体の配列は、Ｎ末端のＢＭＰ結合ドメインを欠失していても欠失していなくともよい。
【００９８】
特にそうでないと記述されない限り、「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ（誘導体）治療薬」またはその文法的なバリエーションは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ治療薬の全長またはＮ末端短縮型バージョンを包含する。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」とは、本開示の哺乳動物Ｃｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質によって示される活性の１以上を指す。特に、「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」は、ニューロンならびに／または関連の神経細胞および組織（例えば、脳細胞、シュワン細胞、グリア細胞および星状細胞）の形成、成長、増殖、分化、維持を誘導、増強および／または阻害する能力を含む。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様」活性はまた、神経内分泌系組織または外胚葉組織の分子マーカー（例えば、ＯＴＸ２、Ｎ−ＣＡＭ、ＭＡＳＨ、クロマグラニン（ｃｈｒｏｍａｇｒａｎｉｎ）およびＡＰ２）を誘導する能力、ならびに、ニューロンならびに／または関連の神経細胞および組織（例えば、脳細胞、シュワン細胞、グリア細胞および星状細胞）の形成を誘導する能力も含む。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」はまた、リガンドおよびそのタンパク質レセプターの相互作用を調節する能力を含み得る。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」はさらに、他の細胞および／または組織（例えば、結合組織、器官および創傷治癒）の形成、分化、増殖および／または維持を調節する能力を含み得る。特に、「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」は、心臓、脾臓、肝臓、膵臓、胃、腎臓、肺および脳の細胞および組織、ならびに、骨芽細胞および骨、軟骨細胞および軟骨、腱、表皮および筋肉の形成、成長、増殖、分化および／または維持を増強および／または阻害する能力を含み得る。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」はまた、本明細書中の実施例および説明に記載されるアッセイにおける、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質の活性を含む。
【０１００】
マウスおよびヒトにおけるＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様ヌクレオチド配列は、配列番号１および７としてＵＳ ２００２／０１６４６８２ Ａ１（本明細書中に参考として援用される）に開示される。また、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５４５４．１（ヒト）およびＮＭ＿００９８８７．１（マウス）も参照のこと。
【０１０１】
特定の関連する実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒトＣｏｃｏタンパク質のようなＣｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである。
【０１０２】
用語「抗体」および「抗体因子」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして、体液性応答のインビトロもしくはインビボでの産生によって得られる免疫グロブリン分子を指し、そして、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、異種結合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体（例えば、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体）、および組換え単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）のような、遺伝子操作された形態を含む。用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよび逆転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ＩｇＧ）を含む。
【０１０３】
用語「抗原結合フラグメント」は、標的エピトープに結合する抗体のあらゆる部分を含む。抗原結合フラグメントは、例えば、ＣＤＲ３領域を含むポリペプチド、または、ミオスタチンエピトープの親和性および特異性を保持する免疫グロブリン分子の他のフラグメントであり得る。
【０１０４】
「特異的に結合する」は、リガンドの全体または一部の、その標的分子を欠く組成物に関係する特定の標的分子（すなわち、「結合パートナー」または「結合部分」）との優先的な会合の関係を含む。当然のことながら、特定の程度の非特異的な相互作用が、本発明のミオスタチン中和抗体と他のタンパク質との間で生じ得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的な結合は、ミオスタチンタンパク質の特異的な認識により媒介されるものと識別され得る。代表的には、特異的な結合は、抗体と他のタンパク質（例えば、ＧＤＦ１１）との間よりも、抗体とミオスタチンタンパク質との間にかなり強力な会合をもたらす。このような条件下での抗体によるミオスタチンに対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする。その同系の一価抗原に対する抗体結合部位の親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋｄに対し、Ｋａ）は、少なくとも１０７Ｍであり、通常は少なくとも１０８Ｍであり、好ましくは少なくとも１０９Ｍであり、より好ましくは、少なくとも１０１０Ｍであり、そして最も好ましくは少なくとも１０１１Ｍである。種々の免疫アッセイ形式が、ミオスタチンに対して選択的に反応性の抗体を選択するために適切である。例えば、タンパク質に対して選択的に反応性のモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが慣用的に使用されている。特異的な反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイの形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１０５】
競合的結合形式の免疫アッセイは、抗体のミオスタチンとの交差反応性を決定するため、例えば、試験抗体がミオスタチン中和抗体であるかどうかを同定するために使用され得る。例えば、ミオスタチンタンパク質またはそのフラグメントが固体支持体に固定される。固定された抗原に対するＴＧＦレセプター（例えば、ＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ７）の結合と競合させるために、試験抗体がこのアッセイに加えられる。固定されたミオスタチン抗原に対するＴＧＦレセプターの結合と競合する試験抗体の能力が比較される。
【０１０６】
同様に、競合的結合形式の免疫アッセイは、交差反応性の傾向を決定するため、例えば、ミオスタチン中和抗体の特異性を決定するために使用され得る。例えば、ミオスタチンタンパク質またはそのミオスタチンエピトープが、固体支持体に固定される。固定された抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の結合と競合させるために、他のタンパク質（例えば、ＧＤＦ−１１、ＮｏｄａｌもしくはＢＭＰ−４、またはミオスタチンと配列相同性を持つ他のタンパク質）に由来するエピトープが、このアッセイに加えられる。固定されたミオスタチン抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の結合と競合する試験ペプチドの能力が比較される。標準的な計算を用いて、他の抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の交差反応性の割合が計算される。特定の好ましい実施形態では、本発明のミオスタチン中和抗体は、ＧＤＦ−１１に対して１０％未満の交差反応性を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のミオスタチン中和抗体は、ＢＭＰ−４に対して、１％未満、５％未満もしくは１０％未満の交差反応性を有する。
【０１０７】
ＩＩＩ．例示的なＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏ誘導体
特定の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒトまたはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の全長にわたって、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列同一性を共有するＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドである。
【０１０８】
特定の他の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒト、マウスもしくは他の種から得たＣｅｒｂｅｒｕｓ配列を含むポリペプチド、その改変体もしくは誘導体（ＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型バージョンを含む）である。それぞれ、配列番号２および８としてＵＳ２００２／０１６４６８２ Ａ１に開示される全長のマウスおよびヒトのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質はまた、ＮＣＢＩ参照配列の形式で以下に開示される：
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ全長タンパク質（配列番号２）：
【０１０９】
【数７】
残基１０６〜１１９（このいずれかの残基から、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が開始し得る）および残基２４１〜２６７（このいずれかの残基までで、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が終結し得る）に下線が付される。
【０１１０】
マウスＣｅｒｂｅｒｕｓ全長タンパク質（配列番号１）：
【０１１１】
【数８】
残基１０６〜１１９（このいずれかの残基から、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が開始し得る）および残基２４１〜２７２（このいずれかの残基までで、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が終結し得る）に下線が付される。マウスのタンパク質は、Ｃ末端の５つの追加の残基があることを除いて、配列の全体にわたりヒトのタンパク質に対して大部分相同であることに注意されたい。したがって、非ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が使用される場合は常に、残基数は、ヒト配列に対応するものを参照する。
【０１１２】
上述のように、特定の実施形態では、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体タンパク質の好ましいフラグメントは、Ｎ末端の残基１０６〜１１９（含めてある）のいずれかの位置から開始し、そして、残基２４１の後のいずれかの位置で終結するものである。種々のさらなるＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏの誘導体および改変体が、実施例に記載される。
【０１１３】
また、ミオスタチン結合活性を保持し、必要に応じて、ＢＭＰ−４結合を実質的に欠く、野生型ミオスタチン結合ドメインの変異体または改変体を含む、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ由来の改変体配列が含まれる。ＢＭＰ結合親和性を持たない改変体配列は、インヒビターの選択性（例えば、ＧＤＦ−１１またはｎｏｄａｌの結合に対するもの、ここでは、一方のタンパク質に対する優先的な結合が生じる。また、より優先的な−野生型よりも親和性の高い−ミオスタチンへの結合、または、より識別的な（ｄｉｓｃｒｉｍｉｔｏｒｙ）−野生型の短縮型バージョンよりも親和性の低い−ＢＭＰ−４への結合が含まれる）を変更するか、ミオスタチンに関する他の結合特性（例えば、Ｋｄ、および／または、ＫｏｎもしくはＫｏｆｆの速度）を変更するか、または、生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、または、インビボもしくは保管中の半減期を改善するための方法として所望され得る。
【０１１４】
同定されたタンパク質のデータベースにおける相同性検索に基づき、特定の他のＣｅｒｂｅｒｕｓ配列が以下に列挙され、そして、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドは、これらのタンパク質からも誘導され得る。これらの配列は、インターネット上で利用可能な公的データベースから検索されたものであるので、これらのデータベースが更新されると、他の種におけるタンパク質のさらなるホモログが得られる可能性がある。さらに、他の種のＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（特に、哺乳動物のもの）は、ＰＣＲ、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション、標的種において同定されたＣｅｒｂｅｒｕｓホモログと交差反応する抗体を用いた、発現ライブラリーのＡｂ媒介性のスクリーニングなどのような標準的な分子生物学的プロトコールによって容易に得られ得る。
【０１１５】
例えば、ＤＮＡＳｔａｒ製のＭｅｇａＡｌｉｇｎ（上掲）のようなソフトウェアを用いた配列アラインメントは、タンパク質ファミリーの既知のメンバーにおいて、最も保存された領域を同定し得る。その後、このような最も保存された領域をカバーする縮重オリゴと、標的生物に由来する鋳型ＤＮＡとを用いて、ＰＣＲが行われ得る。好ましい実施形態では、このような保存された領域は、キナーゼドメインおよび／またはリガンド結合ドメインを含む。
【０１１６】
これらの同じ保存された領域は、中程度〜低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（定義の節を参照のこと）において核酸ライブラリーをスクリーニングするためのプローブを生成するために使用され得る。
【０１１７】
特定の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の全長にわたり、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列同一性を共有するＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドである。
【０１１８】
特定の他の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒト、マウスもしくは他の種から得られたＣｏｃｏ配列を含むポリペプチド、その改変体もしくは誘導体（ＣｏｃｏのＮ末端短縮型バージョンを含む）である。全長のヒトＣｏｃｏタンパク質は、上に開示される。
【０１１９】
種々のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチドは、融合タンパク質として調製され得る。融合タンパク質は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１以上のさらなるポリペプチド部分を含み得る。例えば、融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）およびそこからの精製サブ配列（エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合物から選択される）を含み得る。ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変されたアミノ酸残基を含み得る。
【０１２０】
融合タンパク質またはカップリングしたタンパク質系（例えば、架橋による非融合性の共役結合）はまた、第二のミオスタチンインヒビタードメインを含み得、これは、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である。親和性試薬は、抗体因子であり得る。抗体因子は、例えば、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖ、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントであり得る。親和性試薬は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは足場を持つペプチドである。親和性試薬は、ＡＬＫ７またはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインを含み得る。例えば、ＡＬＫ７またはＡＬＫ４（好ましくは、ヒトＡＬＫ７またはＡＬＫ４）の細胞外ドメインが使用され得る。親和性試薬は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子であり得る。
【０１２１】
ヒトＡＬＫ７のミオスタチン結合ドメインの一例が以下に示される：
ＬＫＣＶＣＬＬＣＤＳＳＮＦＴＣＱＴＥＧＡＣＷＡＳＶＭＬＴＮＧＫＥＱＶＩＫＳＣＶＳＬＰＥＬＮＡＱＶＦＣＨＳＳＮＮＶＴＫＴＥＣＣＦＴＤＦＣＮＮＩＴＬＨＬＰ（配列番号９）
ヒトＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインの一例が以下に示される：
ＡＬＬＣＡＣＴＳＣＬＱＡＮＹＴＣＥＴＤＧＡＣＭＶＳＩＦＮＬＤＧＭＥＨＨＶＲＴＣＩＰＫＶＥＬＶＰＡＧＫＰＦＹＣＬＳＳＥＤＬＲＮＴＨＣＣＹＴＤＹ（配列番号１０）。
【０１２２】
本明細書中に示されるように、Ｃａｒｏｎｔｅ（Ｃｅｒｂｅｒｕｓのニワトリオーソログ）は、Ａ２０４レポーター遺伝子アッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない。同様に、本発明者らは、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏがアクチビンＡを阻害しないことを決定した。したがって、このようなミオスタチンアンタゴニストは、好ましくは、アクチビンＡが媒介するシグナル伝達との相互作用をほとんど示さないか、または全く示さない。
【０１２３】
ＩＶ．例示的な治療的用途
本発明のＣｏｃｏおよびＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（例えば、全長およびＮ末端短縮型のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体またはＣｏｃｏ誘導体）は、ミオスタチンの存在から生じるか、または、ミオスタチンの存在によって悪化される多数の疾患を処置するために、多数の治療環境において使用され得る。ミオスタチンの発現または活性の低下は、筋成長を促進し、脂肪の蓄積を阻害し、そして、糖尿病モデルの文脈においてグルコースの恒常性を正常化するために有益であることが示されている。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドおよびその誘導体は、筋ジストロフィーの処置の一部として使用され得る。用語「筋ジストロフィー」は、骨格筋、そしてときおり、心筋および呼吸筋の漸次的な弱化および劣化によって特徴付けられる変性性の筋肉疾患の一群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉における顕微鏡的な変化から始まる、進行性の筋消耗および弱化によって特徴付けられる遺伝子障害である。経時的に筋肉が変性すると、人間の筋肉の強度が低下する。本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な筋ジストロフィーとしては、以下が挙げられる：デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（また、ランドジー−デジェリーヌとしても公知）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（また、シュタイネルト病としても公知）、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）。
【０１２５】
デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、１８６０年代に、フランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａｍａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって最初に記述された。ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代に最初にこのＤＭＤの変種を記述したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ Ｅｍｉｌ Ｂｅｃｋｅｒによって後に命名される。ＤＭＤは、３５００人に１人の少年を冒す、男性において最も頻発する遺伝性疾患の一つである。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕上に位置するジストロフィン遺伝子が破壊されるときに生じる。男性は、１コピーのＸ染色体のみを有するので、１コピーのジストロフィン遺伝子のみを有する。ジストロフィンタンパク質がないと、筋肉は、収縮および弛緩のサイクルの間に、容易に損傷を受ける。早期の疾病筋肉では再生によって補われるが、後期では、筋前駆細胞が進行中の損傷に追いつけず、そして、健康な筋肉が機能的でない繊維−脂肪組織に取って代わられる。
【０１２６】
ＤＭＤにおいて、少年は、早くも３歳から、筋肉の弱化の徴候を示し始める。この疾患は、腕、脚および体幹における骨格筋または随意筋を次第に弱化させる。十代前半またはそれより早い時期までに、少年の心筋および呼吸筋もまた冒され得る。ＢＭＤは、ＤＭＤのかなり穏やかなバージョンである。その発症は、十代または若い成人においてであるのが通常であり、そして、その経過は、ＤＭＤよりも遅く、そして、かなり予測不能である（ＤＭＤおよびＢＭＤはほぼ専ら少年を冒すが、稀に、少女を冒し得る）。
【０１２７】
１９８０年代まで、いかなる種類の筋ジストロフィーの原因についてもあまり知られていなかった。１９８６年に、ジストロフィン遺伝子の欠失が、ＤＭＤの原因として同定された。ＢＭＤは、同じ遺伝子における異なる変異から生じる。ＢＭＤ患者は、いくらかのジストロフィンを有するが、それは、量が不十分であるか、質が劣っているかのいずれかである。いくらかのジストロフィンを有することで、ＢＭＤを罹患する人の筋肉が、ＤＭＤを罹患する人ほどひどくまたは急速に変性することから保護されている。
【０１２８】
最近の研究者らは、インビボでのミオスタチン機能をブロックまたは排除することで、ＤＭＤおよびＢＭＤの患者における少なくとも特定の症状を効率的に処置し得ることを実証している（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、上掲；Ｗａｇｎｅｒら、上掲）。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）は、ＤＭＤおよびＢＭＤの患者において、インビボでのミオスタチンの機能をブロックする代替的な手段を構成する。
【０１２９】
同様に、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）は、筋成長を必要とする他の疾患状態において、筋重量を増加させるための有効な手段を提供する。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、（上掲）は、ミオスタチンの発現が、ヒトにおける除脂肪体重（ｆａｔ−ｆｒｅｅ ｍａｓｓ）と逆相関していること、そして、ミオスタチン遺伝子の発現の増加が、ＡＩＤＳ消耗症候群を有する男性における体重の減少と関連していることを報告した。ＡＩＤＳ患者においてミオスタチンの機能を阻害することによって、完全には排除されないとしても、ＡＩＤＳの少なくとも特定の症状が軽減され得、したがって、ＡＩＤＳ患者のクオリティオブライフを有意に向上させる。
【０１３０】
ミオスタチン機能の喪失はまた、栄養摂取の減少を伴わない脂肪の喪失と関連しているので（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上掲；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、上掲）、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）はさらに、肥満およびＩＩ型糖尿病の発症を遅らせるか、または予防するための治療剤として使用され得る。
【０１３１】
癌性の食欲不振−悪液質症候群は、とりわけ、癌の最も人を衰弱させ、かつ生命を脅かす局面である。癌性の食欲不振−悪液質症候群における進行性の体重の減少は、多くのタイプの癌に共通する特徴であり、そして、乏しいクオリティオブライフおよび化学療法に対する乏しい応答を担うのみならず、体重の減少を伴わないかなりの腫瘍を有する患者において見られるものよりも短い生存時間も担う。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗、精神的な疲労およびクオリティオブライフの低下に伴い、悪液質が、癌と宿主との間の複雑な相互作用から生じる。これは、癌患者の中でもとりわけ、最も一般的な死因であり、そして、死亡時に８０％において存在している。これは、タンパク質、炭水化物および脂質の代謝に影響を与える、代謝性カオスの複雑な例である。腫瘍は、直接的および間接的の両方で異常を生じ、食欲不振および体重の減少をもたらす。現在、このプロセスを制御または逆進させる処置はない。
【０１３２】
癌性の食欲不振−悪液質症候群は、サイトカインの産生、脂質動員因子およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに、中間代謝における変化に影響を及ぼす。食欲不振は一般的であるが、食物摂取の減少だけでは、癌患者で見られる身体組成の変化の説明はできず、そして、養分摂取を増加させても、消耗性症候群を逆進させることができない。罹病前の体重の５％を超える故意でない体重の減少が６ヶ月の期間内に生じる場合、癌を罹患する患者において、悪液質が疑われるべきである。
【０１３３】
成体マウスにおけるミオスタチンの全身性の過剰発現は、ヒトの悪液質症候群で見られるものと類似する顕著な筋肉および脂肪の喪失を誘導することが分かっているので（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上掲）、薬学的組成物としての本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）は、筋成長が望まれる悪液質症候群の症状を予防、処置または軽減するために、ミオスタチンアンタゴニスト／ブロッカーとして有益に使用され得る。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明の改変体ＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（特に、Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体）は、神経変性を伴う疾患の宿主の症状を予防、処置または軽減するために有益に使用され得る薬学的組成物を形成するために使用され得る。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、野生型ＡＬＫ７レセプターを介して媒介される抑制性のフィードバック機構と拮抗し得、こうして、新しい神経の成長および分化を可能にする。本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、薬学的組成物として、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病などを含む神経変性を伴う疾患の症状を予防、処置または軽減するために有益に使用され得る。
【０１３５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、漸次的に生じ、記憶の喪失、異常な挙動、人格の変化、および、思考能の低下をもたらす、慢性的な不治でかつ止められない中枢神経系（ＣＮＳ）の障害である。これらの喪失は、特定のタイプの脳細胞の死、および、これらの間の連絡の崩壊に関連している。
【０１３６】
ＡＤは、子供の発育の逆として説明されている。ＡＤを罹患する多くの人において、症状は、６０歳より上で出現する。最も早い症状としては、近時の記憶の喪失、誤った判断、および人格の変化が挙げられる。疾患の後期では、ＡＤを罹患する人は、自分の手を洗うなどのような単純な作業のやり方を忘れる可能性がある。ＡＤを罹患する人は最終的に、あらゆる理性的な力を失い、自身の毎日の世話を他の人に依存するようになる。最終的には、この疾患は、人をかなり衰弱させて、患者は寝たきりになり、代表的には、並存の疾患を発症する。ＡＤ患者は、疾患の発症から８〜２０年で、最も一般的には肺炎で亡くなる。
【０１３７】
パーキンソン病（ＰＤ）は、漸次的に生じ、そして、制御できない身体の動作、固縮、振戦、および、歩行困難をもたらす、慢性的な不治でかつ止められないＣＮＳの障害である。これらの運動系の問題は、筋肉の活動の制御を助ける化学物質であるドパミンを生成する脳の領域における脳細胞の死に関連している。
【０１３８】
ＰＤを罹患する多くの人において、症状は５０歳より上で出現する。ＰＤの最初の症状は、末端部（特に、手または唇において）に影響を及ぼす顕著な振戦である。それに続くＰＤの特徴的な症状は、強直または動きの遅速化、引きずり歩行（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｗａｌｋ）、前傾姿勢およびバランス機能不全である。記憶の喪失、痴呆、抑うつ、情動の変化、嚥下困難、異常発語（ａｂｎｏｒｍａｌ ｓｐｅｅｃｈ）、性的不能ならびに、膀胱および腸の問題のような、広範囲の二次的な症状がある。これらの症状は、フォークを持つ、または、新聞を読むなどの、慣用的な活動を阻み始める。最終的には、ＰＤを罹患する人は、全く無力となり、寝たきりになる。ＰＤを罹患する人は、通常、肺炎で亡くなる。
【０１３９】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病；運動ニューロン疾患）は、脳と骨格筋とをつなぐＣＮＳの構成要素である運動ニューロンを攻撃する、慢性的な不治のＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンは劣化して、最終的には死滅し、そして、患者の脳は通常、完全に機能するままに留まり、鋭敏であるが、動作の指令が、筋肉に達することはない。
【０１４０】
多くの人が、４０歳〜７０歳の間の年齢で、ＡＬＳを罹患していると診断される。弱化する最初の運動ニューロンは、腕または脚に至る運動ニューロンである。ＡＬＳを罹患する人は、歩行が困難で有り得、物を落とし、転倒し、言語が不鮮明であり、および制御不能に泣き笑いし得る。最終的には、肢の筋肉が不使用ために萎縮し始める。この筋肉の弱化は、人を衰弱させ、そして、人は、車椅子を必要とするか、または、ベッドの外では活動できなくなる。多くのＡＬＳ患者は、疾患の発症から３〜５年で、呼吸不全、または、肺炎のような人工呼吸器による補助の合併症で亡くなる。
【０１４１】
これらの神経学的疾患の原因は、大部分は不明なままである。これらは、慣習的に別個の疾患として定義されているが、明らかに、基本的なプロセスの非常な類似性を示し、そして、共通して、単なる偶然として考えられるよりもはるかに大きな症状の重なりを示している。現在の疾患の定義は、この重なりの問題を適切に扱っておらず、神経変性傷害の新しい分類が必要とされている。
【０１４２】
ハンチントン病（ＨＤ）は、脳の特定の領域におけるニューロンの遺伝子によりプログラムされた変性から生じる、別の神経変性疾患である。この変性は、制御できない動作、知的能力の喪失および情動の乱れを引き起こす。ＨＤは、家族性の疾患であり、野生型遺伝子における優性変異により、親から子へと受け継がれる。ＨＤのいくつかの早期の症状は、気分変動、抑うつ、被刺激性、または、運転すること、新しい物事を学習すること、事実を記憶していること、もしくは、決定を行うことの不調（ｔｒｏｕｂｌｅ）である。疾患が進行するにつれ、知的作業に対する集中が次第に困難となり、そして、患者は、自分自身で食事をすること、そして、嚥下することが困難となり得る。疾患の進行速度および発症の年齢は、人ごとに多様である。
【０１４３】
テイ−サックス病およびザントホフ病は、リソソームのβ−ヘキソサミニダーゼの欠失によって引き起こされる糖脂質蓄積症である（Ｇｒａｖｅｌら、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２８３９−２８７９，１９９５）。両方の障害において、ＧＭ２ガングリオシドおよびβ−ヘキソサミニダーゼに対する関連の糖脂質基質が、神経系に蓄積し、急性の神経変性を誘発する。重症な形態の多くにおいて、症状の発症は、早期新生児期に始まる。その後、急な神経変性の経過が続き、罹患した新生児は、運動機能障害、てんかん発作、視覚喪失および難聴を示す。死は、通常、２〜５歳の年齢で起こる。アポトーシス性の機構による神経の喪失が示されている（Ｈｕａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１８７９−１８８５，１９９７）。
【０１４４】
アポトーシスは、免疫系におけるＡＩＤＳの病因において役割を担うことが周知である。しかし、ＨＩＶ−１もまた、神経学的疾患を誘導する。Ｓｈｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１９７９−１９９０，１９９６）は、インビトロモデルおよびＡＩＤＳ患者に由来する脳組織における、中枢神経系（ＣＮＳ）のＨＩＶ−１感染により誘導されるアポトーシスを調べ、そして、初代脳培養物のＨＩＶ−１感染が、インビトロで、ニューロンおよび星状細胞におけるアポトーシスを誘導したことを見出した。ニューロンおよび星状細胞のアポトーシスはまた、１１人中１０人のＡＩＤＳ患者（５人中５人のＨＩＶ−１による痴呆を有する患者、そして、５人中４人の非痴呆患者を含む）に由来する脳組織においても検出された。
【０１４５】
神経の喪失はまた、ヒトにおけるクロイツフェルト−ヤコブ病、ウシにおけるＢＳＥ（狂牛病）、ヒツジおよびヤギにおけるスクラピー、ならびにネコにおけるネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）のような、プリオン病の著しい特徴でもある。
【０１４６】
Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体を含む本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチドはまた、以下に記載されるもののような種々のＰＮＳ障害の症状を予防、処置および軽減するためにも有用である。ＰＮＳは、ＣＮＳへ至るか、または、ＣＮＳから分岐する神経から構成される。末梢神経は、多様な系列の身体の機能（感覚神経、運動神経および自律神経の機能を含む）を取り扱う。個体が末梢神経障害を有する場合、ＰＮＳの神経が損傷を受けている。神経損傷は、疾患、物理的傷害、中毒または栄養失調のような多数の原因から生じ得る。これらの因子は、求心性もしくは遠心性のいずれかの神経に影響を与え得る。損傷の原因に依存して、神経細胞軸索、その保護性のミエリン鞘またはこの両方が、傷害され得るか、または、破壊され得る。
【０１４７】
用語「末梢神経障害」は、脳および脊髄の外側の神経−末梢神経−が損傷を受けている広範囲の障害を包含する。末梢神経障害はまた末梢神経炎とも称され得、また、多くの神経が関与している場合には、用語「多発性神経障害」または「多発性神経炎」が使用され得る。
【０１４８】
末梢神経障害は、広範囲に及ぶ障害であり、そして、多くの根底にある原因が存在する。これらの原因には一般的なものもあれば（例えば、糖尿病）、極めて稀なものもある（例えば、アクリルアミド中毒および特定の遺伝性障害）。末梢神経障害の最も一般的な世界的な原因は、らい病である。らい病は、細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅによって引き起こされ、この菌は、冒された人の末梢神経を攻撃する。世界保健機関によって集められた統計によれば、世界中で推定１１５万人がらい病を有している。
【０１４９】
らい病は、米国では極めて稀であり、米国では、糖尿病が最も一般に知られる末梢神経障害の原因である。米国および欧州において１７００万人超が糖尿病に関連する多発性神経障害を有すると推定されている。多くの神経障害は特発性であり、既知の原因を見出すことができない。米国における最も一般的な遺伝性の末梢神経障害は、シャルコー−マリー−ツース病であり、これは、およそ１２．５万人を冒している。
【０１５０】
より知られる末梢神経障害の別の例はギラン−バレー症候群であり、これは、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルス性疾患、または、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉおよびＬｙｍｅ病を含む細菌感染に関連する合併症から生じる。世界的な発生率は、年間、１０万人におよそ１．７症例である。末梢神経障害の他の周知の原因としては、慢性アルコール中毒、水痘−帯状疱疹ウイルス感染、ボツリヌス中毒およびポリオが挙げられる。末梢神経障害は、一次の症状として発症しても、別の疾患に起因していてもよい。例えば、末梢神経障害は、アミロイド神経障害、特定の癌または遺伝性の神経学的障害のような疾患の一症状に過ぎない。このような疾患は、末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）ならびに他の身体組織に影響を及ぼし得る。
【０１５１】
本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチドを用いて処置可能な他のＰＮＳ疾患としては以下が挙げられる：腕神経叢神経障害（腕神経叢の頚根および第一胸根（ｃｅｒｖｉｃａｌ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｒｏｏｔ）、神経幹、索および上腕神経叢の末梢神経構成要素の疾患。臨床的な症状発現としては、局部疼痛、感覚異常；上肢における筋肉の弱化および感覚の低下が挙げられる。これらの障害は、外傷（出生時の傷害を含む）；胸郭出口症候群；新生物、神経炎、放射線治療；および他の状態に関連し得る。Ａｄａｍｓら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，ｐｐ１３５１−２）を参照のこと；糖尿病性神経障害（真性糖尿病に関連する末梢神経、自律神経および脳神経の障害）。これらの状態は、通常、神経に供給している小さな血管（神経の脈管）に関わる糖尿病性の微小血管傷害から生じる。糖尿病性神経障害に付随し得る比較的一般的な状態としては、以下が挙げられる：第三脳神経麻痺（ｔｈｉｒｄ ｎｅｒｖｅ ｐａｌｓｙ）；単発神経障害；多発性単神経炎；糖尿病性筋萎縮症；疼痛性多発性神経障害（ｐａｉｎｆｕｌ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）；自律神経障害；および胸腹部神経障害（ｔｈｏｒａｃｏａｂｄｏｍｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，ｐ１３２５を参照のこと）；単発神経障害（孤立性であるか、または、びまん性末梢神経機能障害の証拠に対し不均衡な、単一の末梢神経を含む疾患または外傷。多発性単神経炎は、多発性でかつ孤立性の神経傷害によって特徴付けられる状態を指す。単発神経障害は、虚血；外傷性傷害；圧迫；結合組織の疾患；蓄積外傷疾患；および他の状態を含む広範な種々の原因から生じ得る）；神経痛（末梢神経または脳神経の進路または分布に沿って生じる、強烈もしくはずきずきと痛む疼痛）；末梢神経系新生物（末梢神経組織から生じる新生物。これには、神経線維腫；神経鞘腫；顆粒細胞腫瘍；および悪性神経鞘腫が含まれる。ＤｅＶｉｔａ Ｊｒら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第５版，ｐｐ１７５０−１を参照のこと）；神経圧迫症候群（内部もしくは外部の原因からの神経もしくは神経根の機械的な圧迫。これらは、例えば、ミエリン鞘機能不全または軸索の喪失に起因する神経のインパルスに対する伝導ブロックをもたらし得る。神経および神経鞘の傷害は、虚血；炎症；または直接的な機械的作用によって引き起こされ得る）；神経炎（末梢神経または脳神経の炎症を示す一般的な用語。臨床的な症状発現としては、疼痛；感覚異常；不全麻痺；または知覚過敏（ｈｙｐｅｒｔｈｅｓｉａ）が挙げられ得る）；多発性神経障害（複数の末梢神経の疾患。冒される神経のタイプ（例えば、感覚神経、運動神経または自律神経）によって、神経傷害の分布（例えば、遠位 対 近位）によって、一次に影響を及ぼされる神経の構成要素（例えば、脱髄性 対 軸索性）によって、病因によって、または、遺伝形質のパターンによって、種々の形態が分類される）。
【０１５２】
特定の実施形態では、本発明の全長のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドまたはその改変体は、以下に記載されるもののような、過剰もしくは所望されないレベルのＢＭＰによって特徴付けられる疾患または状態の処置の一部として使用される。
【０１５３】
筋、腱および靭帯の異所性骨化は、整形外科医が直面する共通の問題である。Ｈａｎｎａｌｌａｈら（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００４ Ｊａｎ；８６−Ａ（１）：８０−９１）は、Ｎｏｇｇｉｎ（ＢＭＰ［骨形成タンパク質］アンタゴニスト）の異所性骨化を抑制する能力を調べた。３つの多様な用量のＮｏｇｇｉｎを発現する筋肉由来の幹細胞が、ＢＭＰ−４を発現する筋肉由来の幹細胞によって誘発される異所性骨化を抑制した。３つの多様な用量のＮｏｇｇｉｎを発現する筋肉由来の幹細胞の各々はまた、脱髄した骨基質によって誘発される異所性骨化も有意に抑制した。アキレス腱切除術を受けた１１匹の動物の全てが、コントロールの肢における傷害部位において異所性骨化を発症した。対照的に、Ｎｏｇｇｉｎを発現する筋肉由来の幹細胞で処置した肢は、異所性骨化の形成における８３％の減少を有し、そして、１１匹中８匹の動物は、異所性骨化の放射線撮像による徴候を有さなかった（ｐ＜０．０５）。したがって、筋肉由来の幹細胞により媒介されるＮｏｇｇｉｎの送達は、動物モデルにおけるＢＭＰ−４によって引き起こされる異所性骨化、脱髄した骨基質および外傷を抑制し得、ＢＭＰインヒビター（ＮｏｇｇｉｎまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ）を送達するための遺伝子治療が、身体の標的領域における異所性骨化を抑制するための効果的な方法となり得ることを示唆した。また、Ｇｌａｓｅｒら（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００３ Ｄｅｃ；８５−Ａ（１２）：２３３２−４２）も参照のこと。
【０１５４】
変形性関節症（ＯＡ）は、骨棘の発生、線維症および関節軟骨損傷によって特徴付けられる関節の疾患である。外因性のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）アイソフォームおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の作用は、ＯＡの病因におけるこれらの増殖因子の役割を示唆している。Ｓｃｈａｒｓｔｕｈｌら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００３ Ｄｅｃ；４８（１２）：３４４２−５１）は、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰのシグナル伝達をブロックするために、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアンタゴニストのアデノウイルスによる過剰発現を使用した。研究されたインヒビターには、マウス潜伏期関連ペプチド（ｍｕｒｉｎｅ ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）１（ｍＬＡＰ−１）と呼ばれる分泌型の汎特異的ＴＧＦ−βアンタゴニスト、細胞内阻害性Ｓｍａｄ６（ＢＭＰアンタゴニスト）およびＳｍａｄ７（ＴＧＦ−β／ＢＭＰインヒビター）が含まれる。パパインの関節内注射は、滑膜および靭帯においていくつかのＴＧＦ−βおよびＢＭＰのアイソフォームのタンパク質発現を増加させた。関節内へのアデノウイルストランスフェクションは、滑膜内層におけるトランスジーンの強い発現をもたらした。ｍＬＡＰ−１、Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７の過剰発現は、コントロールにおけるものと比較して、骨棘の形成の有意な減少をもたらした。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７の過剰発現はまた、滑膜の肥厚を有意に低下させた。さらに、分泌型のＴＧＦ−βインヒビターであるｍＬＡＰ−１は、関節軟骨におけるＰＧの喪失を増加させた。これらの結果は、骨棘および滑膜肥厚の発生における過剰な外因性ＴＧＦ−βおよびＢＭＰの中心的な役割を示し、ＯＡの病因における過剰な外因性ＴＧＦ−βおよびＢＭＰの関与を示している。対照的に、外因性ＴＧＦ−βによる靭帯損傷の防止は、関節軟骨におけるＴＧＦ−βの保護性の役割を意味する。したがって、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓの薬学的組成物は、ＯＡ（骨棘および滑膜肥厚の発生を含む）を処置するためのＢＭＰアンタゴニストとして使用され得る。
【０１５５】
正常な卵巣胚上皮（ＯＳＥ）細胞および卵巣癌（ＯＣ）細胞の解析において、ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＮａｃｈｔｉｇａｌ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００３ Ａｕｇ；１４４（８）：３３０６−１４）は、ＢＭＰ４ ｍＲＮＡの発現を観察し、そして、初代ＯＣ細胞が、成熟なＢＭＰ４を生成することを見出した。さらに、下流のシグナル伝達経路の各メンバーが、初代のＯＳＥ細胞およびＯＣ細胞において発現された。Ｓｍａｄ１は、リン酸化され、そして、ＢＭＰ４での処理の際に、正常なＯＳＥ細胞およびＯＣ細胞において、核転座を受けた。興味深いことに、ＢＭＰ標的遺伝子ＩＤ１およびＩＤ３は、正常なＯＳＥでは、２〜３倍の増加であったのに対し、初代のＯＣ細胞において１０〜１５倍アップレギュレートされた。いくつかの初代ＯＣ細胞の増殖は、ＢＭＰ４処理によって比較的不変であった；しかし、初代ＯＣ細胞の長期にわたるＢＭＰ４処理は、細胞密度の低下、ならびに、細胞の拡延性および粘着性の増加をもたらした。これらのデータは、正常なＯＳＥ細胞およびＯＣ細胞におけるＢＭＰシグナル伝達の存在および推定の機能を示し、したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓの薬学的調製物は、ＯＣの病因においてＢＭＰ４シグナル伝達を調節するために使用され得る。
【０１５６】
異所性骨形成によって特徴付けられる稀な遺伝性無能化疾患（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓａｂｌｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）である進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）は、多方面にわたる医療にとり特に関心が持たれている。なぜなら、その病因に関与する骨形成タンパク質（特に、ＢＭＰ−４）が、骨格の形態形成において役割を担うことが知られており、さらに、ＢＭＰ−４に対する遺伝子アンタゴニスト（例えば、ｎｏｇｇｉｎ）が、層板状の骨形成の予防において有用であり得るからである。Ｂｌａｓｚｃｚｙｋら（Ｅｕｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１３（３）：２３４−７）を参照のこと。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓの治療薬はまた、ＦＯＰを処置するためにも使用され得る。
【０１５７】
アテローム性動脈硬化症は、現在、分枝動脈における流れが妨げられた状態（律動様ずれ応力（ＯＳ）を含む）に曝露された動脈領域において優先的に生じる炎症性疾患と見られている。Ｓｏｒｅｓｃｕら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（３３）：３１１２８−３５，２００３）は、ＢＭＰ４が、病巣となりがちな領域におけるアテローム発生の早期段階において重要な役割を担う、機械感覚性の（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）炎症性因子であることを示唆している。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓの治療薬は、これらの領域におけるアテローム発生の早期段階においてＢＭＰ−４誘導性の炎症性応答を制御するために使用され得る。
【０１５８】
頭蓋発生の間に、頭の結合組織の間質は膜内骨化を受けて、頭蓋骨（頭蓋冠）を形成する。頭蓋冠骨が前進して脳を覆うと、頭蓋冠プレート間に線維性の縫合が形成する。脳の拡大は、頭蓋縫合（ｃｒａｎｉａｌ ｓｕｔｕｒｅ）複合体内での一連の組織相互作用による頭蓋冠の成長と結び付けられる。頭蓋骨癒合症、すなわち、未熟な頭蓋縫合の癒合は、異常な頭蓋の形状、盲および精神遅滞をもたらす。最近の研究は、線維芽細胞増殖因子レセプター（ｆｇｆｒ）における機能獲得型変異が、頭蓋骨癒合症の症候性形態と関連していることを実証している。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストであるＮｏｇｇｉｎは、胚の神経管、体節および骨格のパターン形成に必要とされる。Ｗａｒｒｅｎら（Ｎａｔｕｒｅ．２００３ Ａｐｒ １０；４２２（６９３２）：６２５−９）は、ｎｏｇｇｉｎが、開存性の縫合間葉において生後に発現されるが、癒合している頭蓋縫合では発現されないこと、そして、ｎｏｇｇｉｎの発現が、ＦＧＦ２および症候性ｆｇｆｒのシグナル伝達によって抑制されることを示している。ｎｏｇｇｉｎの発現がないと、インビトロおよびインビボでの頭蓋縫合の癒合が防止されるので、症候性ｆｇｆｒ媒介性の頭蓋骨癒合症は、異常に高いＢＭＰ活性につながる、ｎｏｇｇｉｎ発現の不適切なダウンレギュレーションの結果であり得ることが示唆される。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏの治療薬は、ＢＭＰ活性をダウンレギュレートして、このような状態を予防または処置するために使用され得る。
【０１５９】
Ｖ．例示的な処方物
本発明の組成物は、単独で、または、他の化合物／薬学的組成物との組み合わせ治療の一部として使用され得る。
【０１６０】
本発明の方法において使用するための、可溶性のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体を含む）の治療薬は、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、またはこれらの適切な混合物のような生物学的に受容可能な媒体と共に投与するために簡便に処方され得る。選択した媒体中の活性成分の最適な濃度は、医薬化学者に周知の手順によって、経験的に決定され得る。本明細書中で使用される場合、「生物学的に受容可能な媒体」は、薬学的調製物の所望される投与経路に適切であり得る、任意およびあらゆる溶媒、分散媒などを包含する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体または因子が、治療薬の活性と調和できない場合を除いて、本開示の薬学的調製物におけるその使用が企図される。適切なビヒクルおよび他のタンパク質を含むその処方物は、例えば、書籍、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ １９８５）に記載される。これらのビヒクルは、注射可能な「デポジット処方物（ｄｅｐｏｓｉｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」を含む。
【０１６１】
本開示の薬学的処方物はまた、獣医学的組成物（例えば、獣医学的用途のため（例えば、家畜類（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびウマなど）または愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）の処置のため）に適したＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体治療薬の薬学的調製物）を含み得る。
【０１６２】
本開示の方法はまた、再充填可能もしくは生分解性のデバイスによって提供され得る。近年、タンパク質性の生物製剤（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｉｏｕｓ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を含む薬物の制御された送達のための種々の緩慢放出ポリマーデバイスが開発されており、そして、インビボで試験されている。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーの両方を含む種々の生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）が、特定の標的部位での治療薬の持続放出のための埋没物を形成するために使用され得る。
【０１６３】
本開示による薬学的組成物は、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。本開示の薬学的組成物は、個々の治療剤として、または他の治療剤との組み合わせるかのいずれかで投与され得る。本開示の処置は、従来の治療と併用され得、これらは、連続して投与されても、同時に投与されてもよい。本開示の薬学的組成物は、ＣｏｃｏもしくはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が標的細胞／組織／臓器に到達することを可能とするあらゆる手段によって投与され得る。いくつかの実施形態では、投与経路は、標的細胞が存在する臓器の血液供給源への、もしくは細胞内への直接的な、経口投与、膀胱内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、局所投与からなる群より選択される経路を含む。静脈内投与が好ましい投与様式である。静脈内投与は、注入ポンプの助けにより達成され得る。
【０１６４】
句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、本明細書中で使用される場合、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、そして、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｍａｌ）の注射および注入が挙げられる。
【０１６５】
句「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」とは、本明細書中で使用される場合、化合物、薬物または他の物質の、中枢神経系内への直接投与以外の投与であって、その投与の結果、化合物、薬物または他の物質が患者の系に入り、したがって、代謝および他の同様のプロセスに供されるような投与を意味する（例えば、皮下投与）。
【０１６６】
これらの化合物は、任意の適切な投与経路（経口、膀胱内、例えばスプレーなどにより鼻に（ｎａｓａｌｌｙ）、直腸に（ｒｅｃｔａｌｌｙ）、膣内、非経口、クモ膜下槽内、および、散剤、軟膏もしくはドロップにより局所的に（頬側に（ｂｕｃｃａｌｌｙ）および舌下を含む）が挙げられる）によって、治療のためにヒトおよび他の動物に投与され得る。
【０１６７】
選択される投与経路とは無関係に、適切な水和形態で使用され得る本開示の化合物および／または本開示の薬学的組成物は、以下に記載されるような薬学的に受容可能な投薬形態で、または、当業者に公知の他の従来の方法によって処方され得る。
【０１６８】
本開示の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、個々の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を達成するように変更され得る。
【０１６９】
選択される投与量のレベルは、用いられる本開示の特定の化合物、または、そのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、用いられる特定の治療薬と併用して用いられる他の薬物、化合物および／もしくは物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および前病歴、ならびに、医療分野において周知の同様の因子を含む、種々の因子に依存する。
【０１７０】
当該分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定および処方し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも少ないレベルの、薬学的組成物において用いられる本開示の化合物の用量から開始して、所望の効果が達成されるまで、漸次的に投薬量を増加させ得る。
【０１７１】
一般に、本開示の化合物の適切な一日量は、治療効果を生じるのに有効な最低の用量である化合物の量である。このような有効用量は、一般に、上記のような因子に依存する。一般に、患者のための本開示の化合物の静脈内、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｉｔｒｉｃｕｌａｒ）および皮下の用量は、１日につき体重１キログラムあたり約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲である。
【０１７２】
所望される場合、活性化合物の有効な一日量は、１日を通して適切な間隔で分けて、必要に応じて単位投与量形態で別々に投与される、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の準用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として投与され得る。
【０１７３】
用語「処置」はまた、予防、治療および治癒を包含することも意図される。
【０１７４】
この処置を受ける患者は、この処置を必要とするあらゆる動物であり、これには、霊長類、特に、ヒト、および他の非ヒト哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ）；ならびに、家禽およびペット一般が含まれる。
【０１７５】
本開示の化合物は、単独で、または、薬学的に受容可能なキャリアとの混合物において投与され得、そしてまた、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよび糖ペプチドのような他の抗菌剤と組み合わせて投与され得る。したがって、組み合わせ治療（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）は、最初に投与したものの治療効果が、次に投与されるときに完全に消失されないような方法での、活性化合物の連続的、同時および別個の投与を含む。
【０１７６】
特定の処方物と組み合わせると、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、有効な可溶性因子であり得る。治療用ポリペプチドは、可溶性を促進する第２のペプチドと共に融合ペプチドとして提供され得る。例を挙げると、本開示のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、免疫グロブリンのヒンジもしくはＦｃ部分の全体もしくはフラグメント（可溶性および／または血清安定性を促進し得る）との融合ポリペプチドの一部として提供され得る。
【０１７７】
本開示はまた、本明細書中に記載されるような本発明のポリペプチド誘導体のペプチド模倣配列を企図する。
【０１７８】
一般に、本明細書中で使用される用語法および本開示において利用される実験室の手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を包含する。このような技術は、文献において徹底的に説明されている。例えば、以下を参照のこと：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら、（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」，第１〜４巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９および同第５，２７２，０５７号に示されるような方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら、（編），「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは、特許文献および科学技術文献に詳細に記載されており、例えば以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１および同第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１〜３１７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらは全て、完全に本明細書中に示されるかの如く、参考として援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書の全体にわたり提供される。これらの文献における手順は、当該分野で周知であると考えられるが、読み手の便のために提供される。これらの文献に含まれる情報は全て、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１７９】
本開示は、ここで、一般的に記載されているが、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される。以下の実施例は、特定の実施形態および本開示の実施形態を例示する目的のためだけに含まれるものであり、本開示を限定することを意図するものではない。
【０１８０】
実施例１．ＣａｒｏｎｔｅおよびヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の供給源
Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓに由来するＣｅｒｂｅｒｕｓホモログ）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に注文した。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ配列の全長およびＮ末端短縮型形態を、Ｃ末端をＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒトおよびマウスの両方のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物を生成した）に融合させてか、または、融合させずに、ヒトＣＭＶ由来の発現ベクター中にクローニングした。これらの構築物を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。培養した後、細胞を回収し、そして、精製のために馴化培地を回収した。
【０１８１】
以下の構築物を調べた：
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、全長、Ｆｃなし（配列番号１１）
【０１８２】
【数９】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、全長、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびＦｃに下線を付す；ネイティブなシグナル配列には、点線の下線を付す）（配列番号１２）
【０１８３】
【数１０】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、短縮型、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびＦｃに下線を付す）（配列番号１３）
【０１８４】
【数１１】
３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１４）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１５）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＨＬＬＬＦＱＬＬＶＬＬＰＬＧＫＴ（配列番号１６）。
【０１８５】
異種性またはネイティブなリーダー配列は、最初の３０個のアミノ酸内の任意の位置にあるタンパク質配列に融合させ得る。モデリングは、１８位の「ＴＲＨ．．．」から開始する生成物を生じることを示唆する。本明細書において表される生成物の解析は、ネイティブなリーダーは、より代表的に、１６位の「ＫＴＴ．．．」から開始する生成物を生じることを示す。それゆえ、異種のリーダー配列は、１６位または１８位にＮ末端を融合させ得る。
【０１８６】
実施例２．ＣａｒｏｎｔｅはＧＤＦ−１１に結合する
ＧＤＦ−１１は、神経学的プロセスを調節するミオスタチンの近いホモログである。ＧＤＦ−１１を、標準的なアミンカップリング手順を用いて、ＢｉａＣｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定した。トレース：Ｃａｒｏｎｔｅ（２００μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＧＤＦ−１１をカップリングさせたチップ上に注入した。図２のトレーシングは、ＧＤＦ−１１へのＣａｒｏｎｔｅの結合を示す。
【０１８７】
実施例３．ＣａｒｏｎｔｅおよびヒトＣｅｒｂｅｒｕｓは、ＧＤＦ−１１およびミオスタチン媒介性のシグナル伝達を阻害する
Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＧＤＦ−１１、ミオスタチンおよびアクチビンＡによるシグナル伝達に対する、ＣａｒｏｎｔｅおよびＣｅｒｂｅｒｕｓの作用を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉由来）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００に記載されるもの）。図３を参照のこと。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）内に存在しており、したがって、このベクターは、一般に、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介してシグナル伝達される因子に用いられる。
１日目：Ａ−２０４細胞の４８ウェルプレートへの分割。
２日目：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２の１０μｇまたはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）と、Ｆｕｇｅｎｅとを用いてトランスフェクトしたＡ−２０４細胞。
３日目：因子（０．１％ ＢＳＡを含む培地中に希釈したもの）を添加。インヒビターは、細胞に加える前に、１時間にわたって因子と予備インキュベートする必要がある。６時間後に細胞をＰＢＳでリンスし、そして細胞を溶解させる。
【０１８８】
この次に、ルシフェラーゼアッセイを行う。あらゆるインヒビターの非存在下で、アクチビンＡは、レポーター遺伝子の発現の１０倍の刺激と、約２０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０とを示した。ＧＤＦ−８：ＥＤ５０：約５ｎｇ／ｍｌ、１５倍の刺激。ＧＤＦ−１１：１６倍の刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌ。
【０１８９】
図４に示されるように、Ｃａｒｏｎｔｅは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）融合物もまた、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。図５に示されるように、Ｃａｒｏｎｔｅは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてアクチビンＡを阻害しない。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合物（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）は、予測された通り、アクチビンＡのシグナル伝達を阻害する。したがって、Ｃａｒｏｎｔｅは、アクチビンＡのシグナル伝達には影響を与えないが、ＧＤＦ−１１／ミオスタチンの選択的なインヒビターである。このタイプの選択性は、Ｃａｒｏｎｔｅ、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏが、治療薬として使用された場合の副作用が比較的少ないことを示唆する。予測された通り、Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、Ｃａｒｏｎｔｅとかなり似た挙動を示し、ミオスタチンのシグナル伝達を阻害した。図６を参照のこと。ヒトのＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏのアクチビンＡに対する結合を調べるために、同様の実験を行い、そして、これらの実験は、これらの分子がアクチビンＡに結合しないことを確認する。
【０１９０】
実施例４．ヒトＣｏｃｏタンパク質の供給源
全長ヒトＣｏｃｏを、Ｃ末端をＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒトおよびマウスの両方のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物を生成した）に融合させてか、または、融合させずに、ヒトＣＭＶ由来の発現ベクター中にクローニングした。これらの構築物を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。培養した後、細胞を回収し、そして、精製のために馴化培地を回収した。
【０１９１】
以下の構築物を作製し、マウスＦｃ融合物もまた作製し、そして、これらを本明細書中に示されるアッセイにおいて使用した：
ヒトＣｏｃｏ、全長、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびｍＦｃ）（配列番号１７）
【０１９２】
【数１２】
以下の構築物は、短縮型のＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃ融合タンパク質と同様である：
ヒトＣｏｃｏ、短縮型、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびｍＦｃ）（配列番号１８）
【０１９３】
【数１３】
３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１４）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１５）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＬＬＧＱＬＳＴＬＬＣＬＬＳＧＡＬＰＴＧＳ（配列番号１９）。
【０１９４】
異種性またはネイティブなリーダー配列は、最初の３０個のアミノ酸内の任意場所に、特に、Ｎ末端をアミノ酸１６〜２３のいずれかに融合させ得る。
【０１９５】
実施例５：ヒトＣｏｃｏは、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する
ヒトＣｏｃｏ−ｍＦｃを発現する細胞からの馴化培地を、ＧＤＦ−１１の存在下でＡ−２０４レポーター遺伝子発現に対する作用について調べた。
【０１９６】
図７に示されるように、Ｃｏｃｏ−ｍＦｃを含む馴化培地は、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいて、Ｃｅｒｂｅｒｕｓとかなり類似して、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。同様の実験が、Ｃｏｃｏ−ｍＦｃがＮｏｄａｌのシグナル伝達を阻害することを示した。
【０１９７】
実施例６：ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃは、ヒト血清中で分解される
血清の存在下でのＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドの安定性を評価した。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃを発現する細胞からの馴化培地を、種々の量のヒト血清（加えた血清の割合を上部に示す）と共に３７℃にて一晩インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分けた。ウェスタンブロット（図８）は、５％ヒト血清と共にインキュベートした場合に、Ｃｅｒｂｅｒｕｓが完全に分解されていることを示した。
【０１９８】
開裂フラグメントのＮ末端の配列決定は、タンパク質分解が以下の部位において起こったことを明らかにした（開裂を＾で示す）：
３８ ＮＱＲ＾ＥＬＰ ４３
１３８ ＭＦＲ＾ＫＴＰ １４３
２０７ ＳＨＣ＾ＬＰＡ ２１２。
【０１９９】
実施例７：血清に対して安定なヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチド
血清に対して安定なＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドを生成するために、種々の改変が開裂部位および周囲の配列に導入され得る。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの短縮形態において、Ｌ２１２開裂部位のみが残り（アミノ酸の番号付けは、全長のネイティブなＣｅｒｂｅｒｕｓ配列、配列番号２を参照する）、したがって、配列ＳＨＣＬＰＡ中のアミノ酸のいずれか、いくつか、または全ての改変が、この開裂部位を除くために変更され得る。一般に、改変は、アラニンもしくはセリンのような小さな非荷電の基への改変である。Ｃ２１１および／またはＬ２１２のセリンもしくはアラニンへの改変が、特に望ましい。さらに、または代替的に、Ｎ連結グリコシル化部位（ＮＸＴ／Ｓ）は、アミノ酸２０２〜２２２の範囲内のある位置に導入され得る。Ｎ連結グリコシル化部位はまた、タンパク質の３次元構造において２１２位に近いと予測される位置にも導入され得る。用いられるＣｅｒｂｅｒｕｓ分子の長さに依存して、同様の改変が、他の部位３８ＮＱＲ＾ＥＬＰ４３および１３８ＭＦＲ＾ＫＴＰ１４３の各々に作製され得る。３８ＮＱＲ＾ＥＬＰ４３開裂部位に関して特に望ましい改変は、配列３８ＮＱ（Ｓ／Ｔ）ＥＬＰ４３を作製するＲのＳ／Ｔへの改変であり、これは開裂部位を除くと同時に、Ｎ連結グリコシル化部位を導入するものである。さらに、Ｅ４１およびＫ１４１において開裂された生成物が、ミオスタチン結合活性を保持していることが実験により示された。したがって、Ｅ４１またはＫ１４１から始まるＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型形態は、これらの部位における開裂に対して抵抗性であり、そして活性を保持する。短縮形態の活性は、最小のミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１に位置するシステイン−ノットであることを示唆している。
【０２００】
１以上の変更（以下で、角括弧［］内に示される；例えば、”［Ｒ（Ｔ）］”は、通常その位置にあるアルギニンが、スレオニンで置き換えられ得ることを意味する）を有するＣｅｒｂｅｒｕｓ構築物は、開裂をブロックし、そして、改善された薬力学的特性を与えるものと予測される、Ｎ連結グリコシル化部位を有する。以下の構築物は、例えば、ｔＰＡリーダー配列およびＦｃ配列と共に発現され得る
【０２０１】
【数１４】
Ｃｏｃｏは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓと同様の様式の挙動を示すと予測されるが、Ｃｏｃｏにおける２つの同様の開裂部位は、以下の配列：１５０ＰＡＲ＾ＫＲＷ１５５および１６８ＳＲＲ＾ＲＶＫ１７３におけるシステイン−ノットドメイン内に生じる。これらの位置におけるアミノ酸が、開裂を除くために変更され得る：アラニンおよびセリンが特に好ましいアミノ酸である。さらに、もしくは代替的に、Ｎ連結グリコシル化部位（ＮＸＴ／Ｓ）は、これらの位置のいずれか、またはその付近に導入され得る。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの短縮形態の活性は、Ｃｏｃｏの最小のミオスタチン結合ドメインが、配列番号５のアミノ酸１０１〜１８５に位置するシステイン−ノットであることを示唆している。
【０２０２】
１以上の変更（以下で、角括弧［］内に示される）を有するＣｏｃｏ構築物は、開裂をブロックし、そして、改善された薬力学的特性を与えるものと予測される、Ｎ連結グリコシル化部位を有する。以下の構築物は、例えば、ｔＰＡリーダー配列およびＦｃ配列と共に発現され得る
【０２０３】
【数１５】
実施例８：ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏのシステイン改変体
いくつかのタンパク質では、奇数のシステイン残基が、タンパク質の凝集を引き起こし得るか、または、他の方法でタンパク質の生成を妨害し得る、遊離スルフヒドリル基を生じる。ネイティブなＣｏｃｏおよびネイティブなＣｅｒｂｅｒｕｓは共に、奇数のシステイン残基を有する。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの発現を改善するために、より少ないシステイン残基を持つ改変体、および、１以上のシステインの近くに変更を持つ改変体を作製した。配列番号２に対し、以下の改変を作製した：
Ｃ１７６Ｇ；
Ｃ２０６Ｇ；
Ｃ２２３Ｇ；
Ｎ２２２Ｄ。
【０２０４】
これらのタンパク質は各々が、発現可能でありかつＧＤＦ１１への結合を保持しており、これらのタンパク質の生化学的活性がインタクトなままであったことを示している。Ｃｏｃｏについても（配列番号５に対して）、同様の特定の改変を作製し得る：
Ｃ１１５Ｇ；
Ｃ１４５Ｇ；
Ｃ１６２Ｇ。
【０２０５】
したがって、本開示は、１以上のシステイン残基が欠失もしくは置換された、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏ改変体を提供する。置換される場合には、置換アミノ酸は、他の１９の必須アミノ酸のいずれかであり得るが、Ｇ、Ａ、ＳおよびＴが好ましい。
【０２０６】
等価物
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または、慣用的に過ぎない実験を用いて確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年１２月８日に出願された、米国仮特許出願第６０／８７３，９３３号の利益を主張し、この仮特許出願は、その全体が本明細書により参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーのタンパク質は、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびミューラー阻害物質（ＭＩＳ）を含むサイトカインの大きなファミリーを表す（概説については、非特許文献１を参照のこと）。これらのタンパク質は、保存されたＣ末端システイン−ノットモチーフを含み、そして、原形質膜レセプターの多様なファミリーに対するリガンドとして機能する。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、多様な細胞のタイプに対して広範な生物学的作用を及ぼす。このファミリーの多くのメンバーは、胚発生の間に、パターンの形成および組織の特殊化において重要な機能を持つ；成体では、これらの因子は、組織修復および免疫系の調節のようなプロセスに関与する。
【０００３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質の活性は、種々の手段により調節を受ける。タンパク質のＢＭＰサブファミリーのタンパク質に対する負の調節の一つは、いわゆる骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト／抑制因子の比較的大きなファミリーの全体にわたってである。これらのＢＭＰ抑制因子は、ＢＭＰに結合し、その膜レセプターへのＢＭＰの結合に干渉し、それによって、発生および形態発生の間にその作用を拮抗する、タンパク質のサブグループを表す。
【０００４】
ＢＭＰ抑制因子はさらに、構造解析、特に、そのＣ末端に特徴的な「Ｃｙｓ−ノット」構造における構造的に保存されたＣｙｓ残基の数に基づいて、以下の３つの群のタンパク質に分けられ得る：８員環Ｃｙｓ−ノットＢＭＰ抑制因子、９員環Ｃｙｓ−ノットＢＭＰ抑制因子、または１０員環Ｃｙｓ−ノットＢＭＰ抑制因子。その８員環（ＣＡＮサブファミリー）抑制因子は、さらなるシステイン残基の保存配列に基づいて、さらに以下の４つのサブグループに分けられ得る−グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）およびＰＲＤＣ、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏ、ならびに、ＵＳＡＧ−Ｉを伴うＤＡＮおよびスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）。いくつかのモデル有機体のゲノムにおけるこれらのヒトＢＭＰアンタゴニストのオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）もまた同定されており、その系統発生的関係性が解析されている（非特許文献２、本明細書中に参考として援用される）。
【０００５】
ミオスタチンすなわち増殖／分化因子８（ＧＤＦ−８）もまた、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属している（非特許文献３）。ヒトミオスタチン遺伝子はクローニングされており（非特許文献４）、そして、ミオスタチンの免疫反応性が、ヒトの骨格筋の１型および２型の両方の線維で検出可能であることが報告されている。機能に関しては、ミオスタチンは、骨格筋の成長および発生の負の調節において役割を担う可能性がある（Ｎｅｓｔｏｒら、非特許文献４ 上掲）。
【０００６】
ミオスタチンノックアウトマウスを用いた研究は、ミオスタチンが筋発生の重要な負の調節因子であるという最初の証拠を提供した（非特許文献３）。ミオスタチンヌル（ｎｕｌｌ）マウスでは、動物は、野生型マウスよりもかなり大きく、そして、大幅かつ広範囲に及ぶ骨格筋重量の増加を有していた。さらに、筋重量の増加によって特徴付けられる２品種のウシが、ミオスタチンをコードする配列に変異を有する（非特許文献５）。ヒトの小児における天然に存在するミオスタチンの機能低下は、筋肉全体の肥大、および尋常でない強度の家族歴と関連している（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、２００４ Ｊｕｎ ２４；３５０（２６）：２６８２−８）。ミオスタチンに対する抗体は、筋萎縮性側索硬化症を含む筋肉の障害の動物モデルにおいて有益な作用を有することが報告されている（非特許文献６）。
【０００７】
さらに、免疫反応性ミオスタチンの血清および筋肉内の濃度は、健康な男性と比べて筋肉を消耗しているＨＩＶに感染した男性において増加しており、そして、除脂肪体重指数（ｆａｔ−ｆｒｅｅ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）と逆相関していることに注目すべきである。これらのデータは、ミオスタチンが成人男性における骨格筋成長の負の調節因子であり、そして、ＨＩＶに感染した男性における筋肉の消耗に寄与しているという仮説を支持する（Ｎｅｓｔｏｒら、非特許文献４ 上掲）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｓｓａｇｕｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１８７−１９２，１９９７
【非特許文献２】Ａｖｓｉａｎ−ＫｒｅｔｃｈｍｅｒおよびＨｓｕｅｈ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８（１）：１−１２，２００４
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８３−９０（１９９７）
【非特許文献４】Ｎｅｓｔｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４９３８−４３（１９９８）
【非特許文献５】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２４５７−６１（１９９７）
【非特許文献６】Ｈｏｌｚｂａｕｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００６ Ｓｅｐ；２３（３）：６９７−７０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の知見をかんがみて、特に、状態または疾患状態（例えば、加齢に関連するもろさ、自己免疫不全症候群（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＡＩＤＳ）における悪液質、多発性硬化症、筋ジストロフィー、ＡＬＳおよび癌−悪液質など）の結果として筋肉の消耗を受けている個体において、ミオスタチンの活性を調節する様式に対する必要性が存在する。本発明は、このような筋肉消耗状態を有する個体を助けるために利用され得る方法および組成物を提供し、そして、さらに、ミオスタチン遺伝子発現の調節に見通しを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本開示は、部分的に、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストのグループに属する２種のヒトタンパク質、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏが、ミオスタチン、ＧＤＦ１１およびＮｏｄａｌに結合してこれらを拮抗するという発見、そしてさらに、ミオスタチン／ＧＤＦ１１結合ドメインが、これらのタンパク質のシステイン−ノットドメインに存在するという発見に関する。さらに、Ｃｅｒｂｅｒｕｓに関して、ミオスタチン／ＧＤＦ１１の結合およびアンタゴニスト活性は、ＢＭＰ４／２の結合およびアンタゴニスト活性とは分離され得る。したがって、本開示は、部分的に、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏまたはこれらの改変体のミオスタチン結合部分を含むポリペプチドを投与することによって、インビボでミオスタチンおよびＧＤＦ１１を拮抗するための方法を提供する。本発明の一局面は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン、ＧＤＦ１１、そして、特定の形態で、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ２の機能／シグナル伝達を阻害するための、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ（ヒトまたは非ヒト動物に由来するもの）またはこれらの誘導体（まとめて、本明細書中で「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質」）のポリペプチドおよびその薬学的調製物を提供する。特定の実施形態では、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの調製物は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン、ＧＤＦ１１および／または別のＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ４）に対する親タンパク質の結合親和性の全てまたは実質的な部分を保持する、改変体ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｏｃｏタンパク質を包含し得る。特定の実施形態では、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ２への結合を排除または低減する一方で、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１への親タンパク質の結合親和性の全てまたは実質的な部分を保持する、改変体ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｏｃｏタンパク質を包含する。特定の実施形態では、本開示は、全長のヒトＣｅｒｂｅｒｕｓがヒトの血清の存在下で不安定であるという観察を提供し、したがって、少なくとも２４時間の期間にわたり、そして、必要に応じて、２日、３日、５日、７日、１４日もしくは２１日、またはそれよりも長い期間にわたり血清中で安定なＣｅｒｂｅｒｕｓの変化形態（ＢＭＰ４結合形態および選択的ミオスタチン／ＧＤＦ１１／Ｎｏｄａｌ結合形態の両方）が調製され得る。この観察は、Ｃｏｃｏに外挿され得、したがって、少なくとも２４時間の期間にわたり、そして、必要に応じて、２日、３日、５日、７日、１４日もしくは２１日、またはそれよりも長い期間にわたり血清中で安定なＣｏｃｏの変化形態が調製され得る。特定の実施形態では、本開示は、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体の（少なくとも）ミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含有する、ミオスタチンを阻害するための薬学的調製物を提供する。ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、１以上のｎｏｄａｌおよび／またはミオスタチンに結合し、そして中和する。好ましくは、薬学的調製物は、ヒトまたは獣医学的な治療として投与するために適切となるように、発熱物質を実質的に含まない。
【００１１】
ミオスタチンは、筋肉成長のアンタゴニストとして広く認識されている。
【００１２】
さらに、ミオスタチンヌルマウスは、特定の状態において、肥満および糖尿病に対する抵抗性を示している。したがって、本明細書中に記載されるＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質および薬学的調製物は、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、成長もしくは代謝活性によって少なくとも部分的に特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減させるために使用され得る。例えば、本発明の薬学的調製物は、加齢に関連する消耗、加齢に関連するもろさ、悪液質、食欲不振、デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）症候群、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）症候群、顔面肩甲上腕（ＦＳＨ）筋ジストロフィー、他の筋ジストロフィー、ＡＩＤＳ消耗症候群、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。過剰のＢＭＰ４活性は、種々の結合組織の病理学的な骨化と関連している。したがって、抗ＢＭＰ４活性を保持するＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質および薬学的調製物は、少なくとも部分的に、筋、腱および靭帯のような組織における異常な骨化によって特徴付けられる病理的な状態の重症度を低減するために使用され得る。ＢＭＰ４はまた、骨棘の発生および滑膜の肥厚；進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）；およびアテローム性動脈硬化症（特に、病変を起こしやすい領域でのアテローム発生の早期段階における炎症性応答）；ならびに、頭蓋骨癒合症を含む、変形性関節症（ＯＡ）にも関連している。Ｎｏｄａｌのシグナル伝達は、特定の癌、特に黒色腫と関連している。したがって、抗Ｎｏｄａｌ活性を保持するＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質および薬学的調製物は、腫瘍、特に、Ｎｏｄａｌが腫瘍の増殖および成長に関与している黒色腫のような特定の腫瘍を処置するために使用され得る。
【００１３】
本発明の別の局面は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４）のシグナル伝達を実質的に損ねることなく（例えば、実質的にＢＭＰ−４または他のＢＭＰに結合しない）、Ｎｏｄａｌおよび／またはミオスタチンの機能を特異的に阻害するためのＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質誘導体の薬学的調製物を提供する。本発明のこの局面の例示的な調製物としては、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのＮ末端短縮型バージョン、または、システイン−コアを含む他のフラグメントを含むポリペプチドが挙げられる。これらのいわゆる「Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏ誘導体」は、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、成長もしくは代謝活性によって少なくとも部分的に特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減させるために使用され得る。例えば、本発明の薬学的調製物は、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。
【００１４】
特定の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである。例えば、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質改変体は、ヒト、マウスまたは他の種のＣｅｒｂｅｒｕｓに由来し得、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列の類似性もしくは同一性を共有するヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓ改変体配列を含み、そして、野生型のＣｅｒｂｅｒｕｓのミオスタチンに対する結合親和性を実質的に保持し得る。同様に、Ｃｏｃｏタンパク質改変体は、ヒト、マウスまたは他の種のＣｏｃｏに由来し得、ヒトもしくはマウスのＣｏｃｏタンパク質と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列の類似性もしくは同一性を共有するヒトもしくはマウスのＣｏｃｏ改変体配列を含み、そして、野生型のＣｏｃｏのミオスタチンに対する結合親和性を実質的に保持し得る。
【００１５】
特定の関連する実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドであり、このポリペプチドは、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−２に実質的に結合しない。例えば、ミオスタチン結合ドメインは、ヒト、マウスもしくは他の種のＮ末端短縮型のＣｅｒｂｅｒｕｓに由来し得、そのアミノ酸残基は、配列番号１もしくは２の残基１０６〜１１９のいずれか１つから始まり、配列番号１もしくは２の残基２４１の後の任意の残基において終わり、好ましくは、配列番号１もしくは２の残基２４１と残基２６７との間の任意の残基で終わる（全ての残基の番号を含む）。
【００１６】
例えば、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの残基１０６〜１１９は、以下：
ＰＰＧＴＱＳＬＩＱＰＩＤＧＭ（配列番号７）
のとおりである。
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの残基２４１〜２６７は、以下：
ＣＫＶＫＴＥＨＥＤＧＨＩＬＨＡＧＳＱＤＳＦＩＰＧＶＳＡ（配列番号８）
のとおりである。
【００１７】
また、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ由来の改変体配列、例えば、ミオスタチン結合活性は保持するが、他のＢＭＰ結合活性は失っている、ＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型ミオスタチン結合ドメインも包含される。改変体配列は、（例えば、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１またはｎｏｄａｌの結合に関する）インヒビターの選択性を変更するか、ミオスタチンに関する他の結合特性（例えば、Ｋｄ、および／または、ＫｏｎもしくはＫｏｆｆの速度）を変更するか、または、生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、または、インビボもしくは保管中の（ｏｎ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）半減期を改善するための方法として所望され得る。
【００１８】
特定の好ましい実施形態では、ミオスタチン結合ドメインを含むＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（全長もしくはＮ末端短縮型）は、１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは、１００ｎＭ、１０ｎＭもしくはさらには１ｎＭ以下のＫｄでミオスタチンに結合する。
【００１９】
特定の関連する実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、配列番号５もしくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号２２７４９３２９に示されるヒトＣｏｃｏタンパク質のようなＣｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである。
【００２０】
特定の好ましい実施形態では、ミオスタチン結合ドメインを含むＣｏｃｏポリペプチド（全長もしくはＮ末端短縮型）は、１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは、１００ｎＭ、１０ｎＭもしくはさらには１ｎＭ以下のＫｄでミオスタチンに結合する。
【００２１】
特定の実施形態では、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド（例えば、そのミオスタチン結合ドメイン）は、ミオスタチン結合ドメインに加えて、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１以上のポリペプチド部分を含む融合タンパク質の一部である。例えば、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインを含み得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、または、ＧＳＴ融合物のような精製配列を含み得る。
【００２２】
特定の実施形態では、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド（例えば、そのミオスタチン結合ドメイン）は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子（ｏｒｇａｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に結合されたアミノ酸のような、１以上の改変アミノ酸残基を含むタンパク質の一部である。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、例えば、ＧＤＦ−１１および／またはｎｏｄａｌと比べて、ミオスタチンに対する結合および阻害に選択的である。例えば、改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、ＧＤＦ−１１および／もしくはｎｏｄａｌへの結合についてのそのＫｄの少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１よりも小さい、ミオスタチンの結合に対する解離定数（Ｋｄ）を有するものであり得る。結合の速度論の理由であれ、生体内分布の理由であれ、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドはまた、例えば、ＧＤＦ−１１および／もしくはｎｏｄａｌ活性の阻害についてのそのＥＣ５０の少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１より小さい、ミオスタチン活性の阻害、または、特定の生理学的結果（例えば、筋成長の促進）についてのＥＣ５０を有するインヒビター、のように、相対的なインビボでの効力に基づいて選択され得る。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、例えば、他のＢＭＰタンパク質（例えば、ＢＭＰ−４）と比べて、ミオスタチンに対する結合および阻害に選択的である。例えば、改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、ＢＭＰ−４への結合についてのそのＫｄの少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１よりも小さい、ミオスタチンの結合に対する解離定数（Ｋｄ）を有するものであり得る。結合の速度論の理由であれ、生体内分布の理由であれ、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドはまた、例えば、ＢＭＰ−４活性の阻害についてのそのＥＣ５０の少なくとも２分の１より小さい、なおより好ましくは、少なくとも５分の１、１０分の１、１００分の１、さらには１０００分の１より小さい、ミオスタチン活性の阻害、または、特定の生理学的結果（例えば、筋成長の促進）についてのＥＣ５０を有するインヒビター、のように、相対的なインビボでの効力に基づいて選択され得る。
【００２５】
特定の好ましい実施形態では、その改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド結合ドメインは、１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは、１００ｎＭ、１０ｎＭもしくはさらには１ｎＭ以下のＫｄでミオスタチンに結合する。
【００２６】
一般に、本発明のミオスタチンインヒビター調製物は、ヒト患者における使用に適切である。好ましい実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの調製物は、ヒト患者への投与に適切であるように、発熱物質を実質的に含まない。
【００２７】
他の実施形態では、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドは、非ヒト動物、特に、他の哺乳動物に投与され得る。例えば、本開示の化合物は、ニワトリ、シチメンチョウ、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシなど）、愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）に与えられ得、または、成長を加速し、そして、タンパク質／脂質比を改善するために、水産養殖における有用性を有し得る。さらに例示するために、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドは、食肉生産に関して生じる動物の成長を促進するかもしくは飼料効率を高めて、鮮肉の品質を高めるため、または、乳牛における牛乳生産を増加させるために使用され得る。
【００２８】
本開示の別の局面は、ヒト患者における筋組織の成長の促進における使用のための、本明細書中に記載されるような改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの薬学的調製物と、ラベルもしくは指示書とを含む包装された医薬品に関する。
【００２９】
本開示のなお別の局面は、非ヒト哺乳動物における筋組織の成長の促進における獣医学的使用のための、本明細書中に記載されるような改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの薬学的組成物と、ラベルもしくは指示書とを含む包装された医薬品に関する。
【００３０】
本開示の別の局面は、１以上の本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチドの薬学的調製物を投与することにより、ミオスタチンのインビボでのシグナル伝達を阻害するための方法に関する。本発明の方法は、ヒト患者または非ヒト動物において、筋肉の成長を促進するため、脂肪細胞への分化を促進するため、そして／または、骨の成長もしくは鉱化作用を促進するために使用され得る。
【００３１】
特定の実施形態では、本開示の処置方法は、少なくとも部分的に、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、成長もしくは代謝活性によって特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減するために使用され得る。例えば、本開示の薬学的調製物は、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。
【００３２】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な筋ジストロフィーとしては以下が挙げられる：デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（また、ランドジー−デジェリーヌとしても公知）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（また、シュタイネルト病としても公知）、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー（Ｄｉｓｔａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＤＤ）および先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）。
【００３３】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な運動ニューロン疾患としては以下が挙げられる：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（また、ルー・ゲーリグ病としても公知）、小児進行性脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ、ＳＭＡ１またはＷＨ）（また、ＳＭＡ１型、ヴェルドニッヒ−ホフマンとしても公知）、中間型脊髄性筋萎縮（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ＳＭＡまたはＳＭＡ２）（また、ＳＭＡ２型としても公知）、若年性脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ、ＳＭＡ３またはＫＷ）（また、ＳＭＡ３型、クーゲルベルク−ヴェランデルとしても公知）、球脊髄性筋萎縮（Ｓｐｉｎａｌ Ｂｕｌｂａｒ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ＳＢＭＡ）（また、ケネディ病およびＸ連鎖ＳＢＭＡとしても公知）、および成人脊髄性筋萎縮（Ａｄｕｌｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ＳＭＡ）。
【００３４】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な炎症性筋障害としては以下が挙げられる：皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭｌＤＭ）、および封入体筋炎（ＩＢＭ）。
【００３５】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な神経筋接合部の疾患としては以下が挙げられる：重症筋無力症（ＭＧ）、ランバート−イートン症候群（ＬＥＳ）、および先天性筋無力症症候群（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｍｙａｓｔｈｅｎｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＭＳ）。
【００３６】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な内分泌異常に起因する筋障害としては以下が挙げられる：甲状腺機能亢進性筋障害（Ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｉｄ Ｍｙｏｐａｔｈｙ）（ＨＹＰＴＭ）および甲状腺機能低下性筋障害（Ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ Ｍｙｏｐａｔｈｙ）（ＨＹＰＯＴＭ）。
【００３７】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る末梢神経の例示的な疾患としては以下が挙げられる：シャルコー−マリー−ツース病（ＣＭＴ）、ドゥジュリーヌ−ソッタ病（ＤＳ）およびフリートライヒ運動失調（ＦＡ）。
【００３８】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る他の例示的な筋障害としては以下が挙げられる：先天性筋緊張症（ＭＣ）、先天性パラミオトニア（ＰＣ）、中心コア病（ＣＣＤ）、ネマリン筋障害（ＮＭ）、筋細管筋障害（ＭＴＭもしくはＭＭ）、および周期性四肢麻痺（ＰＰ）。
【００３９】
本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る筋肉の例示的な代謝性疾患としては、以下が挙げられる：ホスホリラーゼ欠損症（ＭＰＤもしくはＰＹＧＭ）、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（ＰＦＫＭ）、脱分枝酵素欠損症（ＤＢＤ）、ミトコンドリア性筋障害（ＭＩＴＯ）、カルニチン欠損症（ＣＤ）、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセレートキナーゼ欠損症（ＰＧＫ）、ホスホグリセレートムターゼ欠損症（ＰＧＡＭもしくはＰＧＡＭＭ）、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＤＨＡ）、およびミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症（ＭＡＤ）。
【００４０】
本発明の方法はまた、肥満またはＩＩ型糖尿病の処置のような、代謝障害を防止、その重症度を改善または低減するために使用され得る。さらに例示すると、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド調製物は、被験体における体脂肪の割合を減少させるために使用され得る。
【００４１】
なお他の実施形態では、改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏポリペプチド調製物は、加齢に関連するもろさを低減するような方法の一部として使用され得る。
【００４２】
本発明の薬学的組成物はまた、脊髄損傷および卒中のようなＣＮＳ傷害／疾患、ならびに、ＰＮＳ傷害／疾患を含む、多数の神経系疾患状態を処置するためのミオスタチンアンタゴニストとしても使用され得る。
【００４３】
一局面では、本開示は、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号２）のアミノ酸１６２〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を提供し、このタンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたり実質的に血清に対して安定である。
【００４４】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２６７の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２６７の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１１９〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２４１の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２６７の配列、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２４１の配列またはヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２６７の配列のうちの１種以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００４５】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する。ミオスタチンアンタゴニスト活性は、例えば、Ａ２０４細胞ベースのアッセイで評価され得る。
【００４６】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む。配列番号２のアミノ酸配列に関する改変は、以下の配列：ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＳＨＣＬＰＡＫ、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＭＦＲＫＴＰまたはヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＮＱＲＥＬＰのうち１以上における切断を低減もしくは排除し得る。
【００４７】
別の局面では、本開示は、ヒトＣｏｃｏ（配列番号５）のアミノ酸１０１〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を提供し、このタンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたって、実質的に血清に対して安定である。
【００４８】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：ヒトＣｏｃｏのアミノ酸１０１〜１８９の配列、ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８５の配列、ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８９の配列、ヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８５の配列またはヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８９の配列のうちの１種以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する。ミオスタチンアンタゴニスト活性は、例えば、Ａ２０４細胞ベースのアッセイで評価され得る。
【００５０】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号５のアミノ酸配列に関する改変を含む。配列番号５のアミノ酸配列に関する改変が、以下のヒトＣｏｃｏの配列：ＰＡＲＫＲＷおよびＳＲＲＲＶＫの一方もしくは両方における切断を低減もしくは排除し得る。
【００５１】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である。特定の実施形態では、親和性試薬は、以下：（ｉ）抗体因子、（ｉｉ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチド、（ｉｉｉ）ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメイン、または（ｉｖ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子、のうちの１以上である。適切な抗体因子の例としては、例えば、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖが挙げられる。特定の実施形態では、抗体因子は、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである。
【００５３】
別の局面では、本開示は、本明細書中に記載される１以上のミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む薬学的調製物を提供する。
【００５４】
別の局面では、本開示は、患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１および／またはＮｏｄａｌを阻害するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される１以上のミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含する。特定の実施形態では、患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１および／またはＮｏｄａｌの阻害は、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１および／またはＮｏｄａｌによって調節される遺伝子の発現の検出可能な変化を引き起こす。
【００５５】
別の局面では、本開示は、患者において筋重量を増加させるための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される１以上のミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００５６】
別の局面では、本開示は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む、発熱物質を実質的に含まない薬学的調製物を提供し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、（ａ）Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンのうちの１以上に結合し、そして、そのシグナル伝達活性を阻害し；そして、（ｂ）ＢＭＰ４には実質的に結合しない。
【００５７】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、筋組織の成長を促進する。
【００５８】
特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、以下のアミノ酸配列の１つまたは両方に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する：配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１、配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一な（ａｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）アミノ酸配列を有する。
【００５９】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、全長の成熟なヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質を含まない。
【００６０】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。
【００６１】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である。特定の実施形態では、親和性試薬は、以下：（ｉ）抗体因子、（ｉｉ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチド、（ｉｉｉ）ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメイン、または（ｉｖ）ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子、のうちの１以上である。適切な抗体因子の例としては、例えば、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖが挙げられる。特定の実施形態では、抗体因子は、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである。
【００６３】
別の局面では、本開示は、患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１を阻害するための方法を提供し、この方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１の阻害が、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によって調節される遺伝子の発現の検出可能な変化を引き起こす。特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない。
【００６４】
別の局面では、本開示は、骨格筋重量の増加を必要とする患者において骨格筋重量を増加させるための方法を提供し、この方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を患者に投与する工程を包含し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ミオスタチン結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない。
【００６５】
別の局面では、本開示は、哺乳動物における筋組織の成長を促進するための薬物の調製のための、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の使用を提供し、ここで、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、Ｗｎｔ、ＮｏｄａｌおよびＢＭＰがＣｅｒｂｅｒｕｓに結合している、概略図を示す。ＢＭＰ−２および高度に関連するＢＭＰ−４は、おそらくは同じ領域において、Ｃｅｒｂｅｒｕｓに対して競合的に結合する。他のより関連性が低いかもしくは関連のないタンパク質（例えば、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ）は、ＢＭＰ−４と競合しない。ＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型バージョンは、依然としてＸｎｒ−１（マウスＮｏｄａｌのＸｅｎｏｐｕｓホモログ）に結合する（Ｐｉｃｃｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：７０７−７１０，１９９９から改作）。
【図２】Ｃａｒｏｎｔｅ−ＦｃのＧＤＦ−１１への結合。トレーシングは、Ｃａｒｏｎｔｅ−ＦｃがＢｉａＣｏｒｅチップ上のＧＤＦ−１１に結合することを示す。ＧＤＦ−１１は、標準的なアミンカップリング処理を用いてＢｉａＣｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定化された。トレース：Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃ（２００μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＧＤＦ−１１をカップリングさせたチップ上に注入した。
【図３】Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイ。この図は、レポーターベクターであるｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を示す（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００に記載されたもの）。ＣＡＧＡ１２モチーフが、ＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在しており、したがって、このベクターは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介してシグナル伝達する因子に一般に使用される。
【図４】Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）融合物もまた、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。
【図５】Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてアクチビンＡを阻害しない。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合物（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）は、予想どおりに、アクチビンＡのシグナル伝達を阻害する。
【図６】Ｃｅｒｂｅｒｕｓ−ＦｃおよびＣａｒｏｎｔｅ−Ｆｃはともに、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてＧＤＦ−８のシグナル伝達を阻害する。
【図７】ヒトＣｏｃｏ−Ｆｃ（マウスＦｃ）は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。ヒトＣｏｃｏ−ｍＦｃを発現する細胞からの馴化培地を、ＧＤＦ−１１の存在下でのＡ−２０４レポーター遺伝子の発現に対する作用について調べた。
【図８】ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃは、ヒト血清中で分解する。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃを発現する細胞からの馴化培地を、種々の量のヒト血清（加えた血清の割合を上部に示す）と共に３７℃にて一晩インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分けた。Ｃｅｒｂｅｒｕｓを、一次抗体：ビオチン化ポリクローナル抗Ｃｅｒｂｅｒｕｓ抗体および二次抗体：アビジン−ＨＲＰを用いてウェスタンブロットにより検出した。左レーンは、分子量標準物質である。およそ７０ｋＤの主要なバンドは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃであり、これは、５％ヒト血清と共にインキュベートした場合、完全に分解されている。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な説明
Ｉ．概要
Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、発生中に前内中胚葉（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｍｅｓｏｄｅｒｍ）において発現される（Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：５９５−６０１，１９９６；Ｐｉｃｃｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：７０７−１０，１９９９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：２４３−５１，１９９９）。Ｃａｒｏｎｔｅ（ニワトリオーソログ）は、ニワトリ胚における左右非対称性に関与している（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、上掲）。Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、細胞外空間において多効果の増殖因子アンタゴニストとして機能し、そして、ＢＭＰ−４、ｎｏｄａｌおよびＷｎｔによるシグナル伝達を阻害する（Ｂｅｌｏら、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２６：２６５−７０，２０００）。マウスのＣｅｒｂｅｒｕｓは、独立の部位を介してＢＭＰタンパク質およびｎｏｄａｌに結合するが（Ｐｉｃｃｏｌｏ、上掲）、ＸｅｎｏｐｕｓのＣｅｒｂｅｒｕｓもまた、Ｗｎｔタンパク質に結合してその作用を阻害する（Ｂｅｌｏ、上掲）。Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、体幹構造（ｔｒｕｎｋ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を持たない異所性の頭部を誘導するという独特の特性を持つ（Ｐｉｃｃｏｌｏ、上掲）。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの発現は、原腸形成の間に、内胚葉におけるｎｏｄａｌに関するシグナルによって、そして、Ｓｐｅｍａｎｎオーガナイザー因子によって活性化される（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５７：１９０−２０４，２００３）。
【００６８】
Ｃｅｒｂｅｒｕｓのオーソログは、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＦｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓに見られ得るが、無脊椎動物においては欠失している。Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓでは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓに対する唯一のオーソログが存在する。Ｃｅｒｂｅｒｕｓに対する全てのオーソログ遺伝子は、２つのエキソンを有する；第１の８アミノ酸のシスチン−ノットドメインは、第１エキソンの３’末端によってコードされ、モチーフの残りは第２エキソンによってコードされる。いくつかのオーソログでは、推定のタンパク質分解による切断部位は、シスチン−ノットドメインの開始点の上流に見られ得る。
【００６９】
Ｃｏｃｏは、Ｎｏｄａｌのシグナル伝達を阻害するタンパク質のＣｅｒｂｅｒｕｓ／Ｄａｎファミリーの別のメンバーである。
【００７０】
本開示は、一部において、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−１１および／またはミオスタチンの機能を阻害するためのＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体を提供する。特定の実施形態では、ＣｏｃｏおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４）のシグナル伝達を実質的に損ねることなく（例えば、ＢＭＰ−４または他のＢＭＰに実質的に結合しない）、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−１１および／またはミオスタチンの機能を阻害する。本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体はまた、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４）のシグナル伝達を阻害するためにも使用され得る。
【００７１】
本開示の例示的な調製物としては、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのＮ末端短縮型バージョンを含むＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド誘導体が挙げられる。これらのいわゆる「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体」または「Ｃｏｃｏ誘導体」は、少なくとも部分的に、被験体における筋肉もしくは脂肪組織の異常な量、発生もしくは代謝活性によって特徴付けられる病理学的状態の重症度を低減させるために使用され得る。例えば、本開示の薬学的調製物は、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性筋障害のような消耗性障害を防止、その重症度を改善または低減するために有効な量で投与され得る。
【００７２】
ＩＩ．定義
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作成方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
【００７３】
「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または正確さを仮定して、測定された量についての誤差の容認可能な程度を意味する。代表的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の、２０パーセント（％）内、好ましくは１０パーセント（％）内、そしてより好ましくは５％内である。
【００７４】
あるいは、そして、特に生物学的な系において、用語「約」および「およそ」は、所与の値のあるオーダーの大きさの範囲内、好ましくは、５倍以内、そしてより好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられる数量は、特に明記しない限り近似値であり、明白に記述されない場合には、用語「約」または「およそ」は、推量され得ることを意味する。
【００７５】
本開示の方法は、配列を互いに比較する工程を包含し得、この比較には、野生型配列の１以上の変異体／配列改変体に対する比較を含む。このような比較は代表的には、例えば、当該分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、少数の名を挙げれば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を用いた、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、変異が残基の挿入または欠失を含むようなこのようなアラインメントにおいて、配列のアラインメントは、挿入もしくは欠失された残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」（代表的には、―または「Ａ」で表される）を導入することを容易に理解し得る。
【００７６】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて、同種の生物におけるスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに、異なる種の生物に由来する相同なタンパク質を含む、「共通する進化の起源」を有する２タンパク質間の関係をいう。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【００７７】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有していても共有していなくても、核酸もしくはアミノ酸間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００７８】
しかし、一般的な用法および本願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００７９】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングし得る場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸についての予備的なスクリーニングには、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用され得る（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．２５％ ミルク、およびホルムアミドなし；または、３０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ）。
【００８０】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応する（例えば、４０％ ホルムアミド、および５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ）。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍに対応する（例えば、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ）。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａである。
【００８１】
「高ストリンジェンシーの条件」は、構造的に関連するが、構造的に似ていない核酸のハイブリダイゼーションを可能にする、ハイブリダイゼーション条件を包含するということは、当該分野で充分に理解される。用語「ストリンジェント」は、高度に相補的な核酸のみのアニーリングを可能にする任意の数多くの代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載するものとして当業者に理解される当該分野の用語である。
【００８２】
例示的な高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は、約１Ｍの塩濃度において形成されるＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を下回る、約２０〜２７℃に等価である。多くの等価な手順が存在し、そして、いくつかの一般的な分子クローニングのマニュアルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションのための適切な条件を記載しており、さらに、これらの条件下で安定であると予測されるハイブリッドの長さを計算するための等式を提供している（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６もしくは１３．３．６；または、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓの９．４７−９．５７頁を参照のこと）。
【００８３】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにもよるが、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、相補性の度合い、当該分野で周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、これらの配列を持つ核酸のハイブリッドに対するＴｍの値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さ１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについて、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲、９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲、１１．８を参照のこと）。ハイブリダイゼーション可能な核酸についての最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；そして、より好ましくは、長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００８４】
特定されない限り、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、約５５℃のＴｍを指し、上に示されるような条件を利用する。好ましい実施形態では、Ｔｍは６０℃である；より好ましい実施形態では、Ｔｍは６５℃である。特定の実施形態では、「高ストリンジェンシー」は、０．２×ＳＳＣにおいて６８℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣにおいて４２℃、または、これらの２つの条件下で観察されるものと等価なハイブリダイゼーションのレベルを与える条件下での、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件を指す。
【００８５】
オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー）についての適切なハイブリダイゼーション条件は、代表的には、オリゴヌクレオチドのより低い融解温度に起因して、全長核酸（例えば、全長ｃＤＮＡ）についてのものとは幾分異なる。オリゴヌクレオチドの融解温度は、関与するオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するので、適切なハイブリダイゼーション温度は、使用されるオリゴヌクレオチド分子に依存して変化する。例示的な温度は、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）であり得る。オリゴヌクレオチドのための例示的な適切なハイブリダイゼーション条件としては、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、または、等価なレベルのハイブリダイゼーションを与える他の条件が挙げられる。
【００８６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、「ペプチド結合」と呼ばれる化学結合によって互いに連結されたアミノ酸の鎖を説明するために交換可能に用いられる。タンパク質またはポリペプチドは、酵素を含めて、「ネイティブ」または「野生型」であっても（これらが天然に存在することを意味する）；「変異体」、「改変体」または「改変」であっても（これらが、作製されたか、変更されたか、誘導されたか、あるいは、ネイティブなタンパク質もしくは別の変異体とは幾分異なるか、または、変更されていることを意味する）よい。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／Ｃｏｃｏタンパク質」は、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏタンパク質、ならびに、他の種に由来するホモログ（例えば、ＣａｒｏｎｔｅはニワトリのＣｅｒｂｅｒｕｓホモログである）、および天然に存在する形態の生物学的活性を保持する誘導体（変更された配列を持つ形態および短縮型形態を含む）を示すために用いられる。
【００８８】
「ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質」は、マウス（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０３４０１７）またはヒト（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５４４５）のＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（また、それぞれ、ＵＳ２００２／０１６４６８２ Ａ１（この全内容は本明細書中に参考として援用される）の配列番号２および８を参照のこと）のような哺乳動物ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質、ならびに、哺乳動物Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質のＣ末端部分の高度に保存されたシステインのパターンに対して配列相同性を共有する他のタンパク質を指す。Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質についての例示的なアミノ酸配列としては、以下が挙げられる：
マウスＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０３４０１７）（配列番号１）：
【００８９】
【数１】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５４４５）（配列番号２）：
【００９０】
【数２】
マウスおよびヒトのＣｅｒｂｅｒｕｓは、配列番号１および７としてＵＳ２００２／０１６４６８２ Ａ１（本明細書中に参考として援用される）において開示されるようなものである。
ＮＭ＿００９８８７．１（マウスＣｅｒｂｅｒｕｓ ｍＲＮＡ）（配列番号３）。
【００９１】
【数３】
ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５４５４．１（ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ ｍＲＮＡ）（配列番号４）。
【００９２】
【数４】
また、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ関連タンパク質は、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュにおけるファミリーメンバーを含む他の種、ならびに、全ての哺乳動物（例えば、ラット、マウスおよびヒト）にも存在するものと予測される。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質」はまた、対立遺伝子改変体または変異誘発もしくは欠失により誘導された改変体のようなＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の改変体、および、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質のフラグメントも包含し、これらの改変体およびフラグメントは、ミオスタチン結合活性を保持する。「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ様」タンパク質はまた、本明細書中にさらに記載されるタンパク質を含め、構造的および／または機能的類似性を共有するタンパク質のファミリーを示すためにも使用される。このようなタンパク質は、全長にわたって、または少なくとも、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓのミオスタチン結合ドメイン内で、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質と有意な配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い）を共有するアミノ酸配列を有し得る。Ｃｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質はまた、ストリンジェントな条件下で、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓについてのコード配列と、特に、ミオスタチン結合ドメインについてのコード配列の部分とハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体または改変体の配列は、Ｎ末端のＢＭＰ結合ドメインを欠失していても欠失していなくともよい。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの多様な対立遺伝子改変体が公知であり、これとしては、Ａ６５Ｇ（６５位のアラニンのグリシンへの改変）、Ｖｌ７９ＩおよびＬ２２１Ｖが挙げられる。
【００９３】
「ＣｏｃｏまたはＣｏｃｏ様タンパク質」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号２２７４９３２９のヒトＣｏｃｏタンパク質のような哺乳動物Ｃｏｃｏタンパク質および関連のホモログ、ならびに、哺乳動物Ｃｏｃｏタンパク質のＣ末端部分の高度に保存されたシステインのパターンに対して配列相同性を共有する他のタンパク質を指す。ヒトＣｏｃｏタンパク質についての例示的なアミノ酸配列は、以下：
【００９４】
【数５】
である。
【００９５】
配列番号５のアミノ酸１〜２１は、代替のリーダー配列と置き換えられ得るシグナルペプチドに対応する。成熟な分泌型Ｃｏｃｏポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２２〜１８９に対応するものと予測されるが、シグナルペプチドプロセシング酵素の不正確さは、２２位のグリシンからアミノ末端もしくはカルボキシ末端へと向かう１〜５アミノ酸の範囲の位置における、代替的もしくはさらなる切断をもたらし得る。本明細書中に開示されるように、ｔＰＡリーダー配列または異種性のリーダー配列が、ネイティブなリーダー配列の代わりに使用され得る。推奨されるリーダー配列は以下のとおりである：
（ｉ）ミツバチメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号８）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号９）。
【００９６】
ヒトＣｏｃｏをコードする配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号２２７４９３２８（本明細書中に参考として援用される）に開示される（配列番号６）。
【００９７】
【数６】
また、Ｃｏｃｏ関連タンパク質は、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュにおけるファミリーメンバーを含む他の種、ならびに、全ての哺乳動物（例えば、ラット、マウスおよび非ヒト霊長類）にも存在するものと予測される。「ＣｏｃｏまたはＣｏｃｏ様タンパク質」はまた、対立遺伝子改変体または変異誘発もしくは欠失により誘導された改変体のような天然に存在するＣｏｃｏタンパク質の改変体、および、Ｃｏｃｏタンパク質のフラグメントも包含し、これらの改変体およびフラグメントは、ミオスタチン結合活性を保持する。「Ｃｏｃｏ様」タンパク質はまた、本明細書中にさらに記載されるタンパク質を含め、構造的および／または機能的類似性を共有するタンパク質のファミリーを示すためにも使用される。このようなタンパク質は、全長にわたって、または少なくとも、ヒトＣｏｃｏのミオスタチン結合ドメイン内で、ヒトＣｏｃｏタンパク質と有意な配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い）を共有するアミノ酸配列を有し得る。Ｃｏｃｏ様タンパク質はまた、ストリンジェントな条件下で、ヒトＣｏｃｏについてのコード配列と、特に、ミオスタチン結合ドメインについてのコード配列の部分とハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。Ｃｏｃｏ誘導体または改変体の配列は、Ｎ末端のＢＭＰ結合ドメインを欠失していても欠失していなくともよい。
【００９８】
特にそうでないと記述されない限り、「Ｃｅｒｂｅｒｕｓ（誘導体）治療薬」またはその文法的なバリエーションは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ治療薬の全長またはＮ末端短縮型バージョンを包含する。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」とは、本開示の哺乳動物Ｃｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質によって示される活性の１以上を指す。特に、「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」は、ニューロンならびに／または関連の神経細胞および組織（例えば、脳細胞、シュワン細胞、グリア細胞および星状細胞）の形成、成長、増殖、分化、維持を誘導、増強および／または阻害する能力を含む。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様」活性はまた、神経内分泌系組織または外胚葉組織の分子マーカー（例えば、ＯＴＸ２、Ｎ−ＣＡＭ、ＭＡＳＨ、クロマグラニン（ｃｈｒｏｍａｇｒａｎｉｎ）およびＡＰ２）を誘導する能力、ならびに、ニューロンならびに／または関連の神経細胞および組織（例えば、脳細胞、シュワン細胞、グリア細胞および星状細胞）の形成を誘導する能力も含む。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」はまた、リガンドおよびそのタンパク質レセプターの相互作用を調節する能力を含み得る。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」はさらに、他の細胞および／または組織（例えば、結合組織、器官および創傷治癒）の形成、分化、増殖および／または維持を調節する能力を含み得る。特に、「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」は、心臓、脾臓、肝臓、膵臓、胃、腎臓、肺および脳の細胞および組織、ならびに、骨芽細胞および骨、軟骨細胞および軟骨、腱、表皮および筋肉の形成、成長、増殖、分化および／または維持を増強および／または阻害する能力を含み得る。「ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ様活性」はまた、本明細書中の実施例および説明に記載されるアッセイにおける、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質の活性を含む。
【０１００】
マウスおよびヒトにおけるＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様ヌクレオチド配列は、配列番号１および７としてＵＳ ２００２／０１６４６８２ Ａ１（本明細書中に参考として援用される）に開示される。また、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５４５４．１（ヒト）およびＮＭ＿００９８８７．１（マウス）も参照のこと。
【０１０１】
特定の関連する実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒトＣｏｃｏタンパク質のようなＣｏｃｏタンパク質のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである。
【０１０２】
用語「抗体」および「抗体因子」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして、体液性応答のインビトロもしくはインビボでの産生によって得られる免疫グロブリン分子を指し、そして、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、異種結合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体（例えば、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体）、および組換え単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）のような、遺伝子操作された形態を含む。用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよび逆転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ＩｇＧ）を含む。
【０１０３】
用語「抗原結合フラグメント」は、標的エピトープに結合する抗体のあらゆる部分を含む。抗原結合フラグメントは、例えば、ＣＤＲ３領域を含むポリペプチド、または、ミオスタチンエピトープの親和性および特異性を保持する免疫グロブリン分子の他のフラグメントであり得る。
【０１０４】
「特異的に結合する」は、リガンドの全体または一部の、その標的分子を欠く組成物に関係する特定の標的分子（すなわち、「結合パートナー」または「結合部分」）との優先的な会合の関係を含む。当然のことながら、特定の程度の非特異的な相互作用が、本発明のミオスタチン中和抗体と他のタンパク質との間で生じ得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的な結合は、ミオスタチンタンパク質の特異的な認識により媒介されるものと識別され得る。代表的には、特異的な結合は、抗体と他のタンパク質（例えば、ＧＤＦ１１）との間よりも、抗体とミオスタチンタンパク質との間にかなり強力な会合をもたらす。このような条件下での抗体によるミオスタチンに対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする。その同系の一価抗原に対する抗体結合部位の親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋｄに対し、Ｋａ）は、少なくとも１０７Ｍであり、通常は少なくとも１０８Ｍであり、好ましくは少なくとも１０９Ｍであり、より好ましくは、少なくとも１０１０Ｍであり、そして最も好ましくは少なくとも１０１１Ｍである。種々の免疫アッセイ形式が、ミオスタチンに対して選択的に反応性の抗体を選択するために適切である。例えば、タンパク質に対して選択的に反応性のモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが慣用的に使用されている。特異的な反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイの形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１０５】
競合的結合形式の免疫アッセイは、抗体のミオスタチンとの交差反応性を決定するため、例えば、試験抗体がミオスタチン中和抗体であるかどうかを同定するために使用され得る。例えば、ミオスタチンタンパク質またはそのフラグメントが固体支持体に固定される。固定された抗原に対するＴＧＦレセプター（例えば、ＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ７）の結合と競合させるために、試験抗体がこのアッセイに加えられる。固定されたミオスタチン抗原に対するＴＧＦレセプターの結合と競合する試験抗体の能力が比較される。
【０１０６】
同様に、競合的結合形式の免疫アッセイは、交差反応性の傾向を決定するため、例えば、ミオスタチン中和抗体の特異性を決定するために使用され得る。例えば、ミオスタチンタンパク質またはそのミオスタチンエピトープが、固体支持体に固定される。固定された抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の結合と競合させるために、他のタンパク質（例えば、ＧＤＦ−１１、ＮｏｄａｌもしくはＢＭＰ−４、またはミオスタチンと配列相同性を持つ他のタンパク質）に由来するエピトープが、このアッセイに加えられる。固定されたミオスタチン抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の結合と競合する試験ペプチドの能力が比較される。標準的な計算を用いて、他の抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の交差反応性の割合が計算される。特定の好ましい実施形態では、本発明のミオスタチン中和抗体は、ＧＤＦ−１１に対して１０％未満の交差反応性を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のミオスタチン中和抗体は、ＢＭＰ−４に対して、１％未満、５％未満もしくは１０％未満の交差反応性を有する。
【０１０７】
ＩＩＩ．例示的なＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏ誘導体
特定の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒトまたはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の全長にわたって、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列同一性を共有するＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドである。
【０１０８】
特定の他の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒト、マウスもしくは他の種から得たＣｅｒｂｅｒｕｓ配列を含むポリペプチド、その改変体もしくは誘導体（ＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型バージョンを含む）である。それぞれ、配列番号２および８としてＵＳ２００２／０１６４６８２ Ａ１に開示される全長のマウスおよびヒトのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質はまた、ＮＣＢＩ参照配列の形式で以下に開示される：
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ全長タンパク質（配列番号２）：
【０１０９】
【数７】
残基１０６〜１１９（このいずれかの残基から、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が開始し得る）および残基２４１〜２６７（このいずれかの残基までで、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が終結し得る）に下線が付される。
【０１１０】
マウスＣｅｒｂｅｒｕｓ全長タンパク質（配列番号１）：
【０１１１】
【数８】
残基１０６〜１１９（このいずれかの残基から、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が開始し得る）および残基２４１〜２７２（このいずれかの残基までで、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が終結し得る）に下線が付される。マウスのタンパク質は、Ｃ末端の５つの追加の残基があることを除いて、配列の全体にわたりヒトのタンパク質に対して大部分相同であることに注意されたい。したがって、非ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が使用される場合は常に、残基数は、ヒト配列に対応するものを参照する。
【０１１２】
上述のように、特定の実施形態では、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体タンパク質の好ましいフラグメントは、Ｎ末端の残基１０６〜１１９（含めてある）のいずれかの位置から開始し、そして、残基２４１の後のいずれかの位置で終結するものである。種々のさらなるＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏの誘導体および改変体が、実施例に記載される。
【０１１３】
また、ミオスタチン結合活性を保持し、必要に応じて、ＢＭＰ−４結合を実質的に欠く、野生型ミオスタチン結合ドメインの変異体または改変体を含む、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ由来の改変体配列が含まれる。ＢＭＰ結合親和性を持たない改変体配列は、インヒビターの選択性（例えば、ＧＤＦ−１１またはｎｏｄａｌの結合に対するもの、ここでは、一方のタンパク質に対する優先的な結合が生じる。また、より優先的な−野生型よりも親和性の高い−ミオスタチンへの結合、または、より識別的な（ｄｉｓｃｒｉｍｉｔｏｒｙ）−野生型の短縮型バージョンよりも親和性の低い−ＢＭＰ−４への結合が含まれる）を変更するか、ミオスタチンに関する他の結合特性（例えば、Ｋｄ、および／または、ＫｏｎもしくはＫｏｆｆの速度）を変更するか、または、生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、または、インビボもしくは保管中の半減期を改善するための方法として所望され得る。
【０１１４】
同定されたタンパク質のデータベースにおける相同性検索に基づき、特定の他のＣｅｒｂｅｒｕｓ配列が以下に列挙され、そして、本発明の改変体Ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドは、これらのタンパク質からも誘導され得る。これらの配列は、インターネット上で利用可能な公的データベースから検索されたものであるので、これらのデータベースが更新されると、他の種におけるタンパク質のさらなるホモログが得られる可能性がある。さらに、他の種のＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質（特に、哺乳動物のもの）は、ＰＣＲ、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション、標的種において同定されたＣｅｒｂｅｒｕｓホモログと交差反応する抗体を用いた、発現ライブラリーのＡｂ媒介性のスクリーニングなどのような標準的な分子生物学的プロトコールによって容易に得られ得る。
【０１１５】
例えば、ＤＮＡＳｔａｒ製のＭｅｇａＡｌｉｇｎ（上掲）のようなソフトウェアを用いた配列アラインメントは、タンパク質ファミリーの既知のメンバーにおいて、最も保存された領域を同定し得る。その後、このような最も保存された領域をカバーする縮重オリゴと、標的生物に由来する鋳型ＤＮＡとを用いて、ＰＣＲが行われ得る。好ましい実施形態では、このような保存された領域は、キナーゼドメインおよび／またはリガンド結合ドメインを含む。
【０１１６】
これらの同じ保存された領域は、中程度〜低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（定義の節を参照のこと）において核酸ライブラリーをスクリーニングするためのプローブを生成するために使用され得る。
【０１１７】
特定の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒトもしくはマウスのＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の全長にわたり、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより高い配列同一性を共有するＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドである。
【０１１８】
特定の他の実施形態では、ミオスタチンインヒビターは、ヒト、マウスもしくは他の種から得られたＣｏｃｏ配列を含むポリペプチド、その改変体もしくは誘導体（ＣｏｃｏのＮ末端短縮型バージョンを含む）である。全長のヒトＣｏｃｏタンパク質は、上に開示される。
【０１１９】
種々のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチドは、融合タンパク質として調製され得る。融合タンパク質は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１以上のさらなるポリペプチド部分を含み得る。例えば、融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）およびそこからの精製サブ配列（エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合物から選択される）を含み得る。ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変されたアミノ酸残基を含み得る。
【０１２０】
融合タンパク質またはカップリングしたタンパク質系（例えば、架橋による非融合性の共役結合）はまた、第二のミオスタチンインヒビタードメインを含み得、これは、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である。親和性試薬は、抗体因子であり得る。抗体因子は、例えば、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖ、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントであり得る。親和性試薬は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは足場を持つペプチドである。親和性試薬は、ＡＬＫ７またはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインを含み得る。例えば、ＡＬＫ７またはＡＬＫ４（好ましくは、ヒトＡＬＫ７またはＡＬＫ４）の細胞外ドメインが使用され得る。親和性試薬は、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子であり得る。
【０１２１】
ヒトＡＬＫ７のミオスタチン結合ドメインの一例が以下に示される：
ＬＫＣＶＣＬＬＣＤＳＳＮＦＴＣＱＴＥＧＡＣＷＡＳＶＭＬＴＮＧＫＥＱＶＩＫＳＣＶＳＬＰＥＬＮＡＱＶＦＣＨＳＳＮＮＶＴＫＴＥＣＣＦＴＤＦＣＮＮＩＴＬＨＬＰ（配列番号９）
ヒトＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインの一例が以下に示される：
ＡＬＬＣＡＣＴＳＣＬＱＡＮＹＴＣＥＴＤＧＡＣＭＶＳＩＦＮＬＤＧＭＥＨＨＶＲＴＣＩＰＫＶＥＬＶＰＡＧＫＰＦＹＣＬＳＳＥＤＬＲＮＴＨＣＣＹＴＤＹ（配列番号１０）。
【０１２２】
本明細書中に示されるように、Ｃａｒｏｎｔｅ（Ｃｅｒｂｅｒｕｓのニワトリオーソログ）は、Ａ２０４レポーター遺伝子アッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない。同様に、本発明者らは、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏがアクチビンＡを阻害しないことを決定した。したがって、このようなミオスタチンアンタゴニストは、好ましくは、アクチビンＡが媒介するシグナル伝達との相互作用をほとんど示さないか、または全く示さない。
【０１２３】
ＩＶ．例示的な治療的用途
本発明のＣｏｃｏおよびＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（例えば、全長およびＮ末端短縮型のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体またはＣｏｃｏ誘導体）は、ミオスタチンの存在から生じるか、または、ミオスタチンの存在によって悪化される多数の疾患を処置するために、多数の治療環境において使用され得る。ミオスタチンの発現または活性の低下は、筋成長を促進し、脂肪の蓄積を阻害し、そして、糖尿病モデルの文脈においてグルコースの恒常性を正常化するために有益であることが示されている。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドおよびその誘導体は、筋ジストロフィーの処置の一部として使用され得る。用語「筋ジストロフィー」は、骨格筋、そしてときおり、心筋および呼吸筋の漸次的な弱化および劣化によって特徴付けられる変性性の筋肉疾患の一群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉における顕微鏡的な変化から始まる、進行性の筋消耗および弱化によって特徴付けられる遺伝子障害である。経時的に筋肉が変性すると、人間の筋肉の強度が低下する。本発明のミオスタチンを含むレジメンで処置され得る例示的な筋ジストロフィーとしては、以下が挙げられる：デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（また、ランドジー−デジェリーヌとしても公知）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（また、シュタイネルト病としても公知）、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）。
【０１２５】
デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、１８６０年代に、フランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａｍａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって最初に記述された。ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代に最初にこのＤＭＤの変種を記述したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ Ｅｍｉｌ Ｂｅｃｋｅｒによって後に命名される。ＤＭＤは、３５００人に１人の少年を冒す、男性において最も頻発する遺伝性疾患の一つである。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕上に位置するジストロフィン遺伝子が破壊されるときに生じる。男性は、１コピーのＸ染色体のみを有するので、１コピーのジストロフィン遺伝子のみを有する。ジストロフィンタンパク質がないと、筋肉は、収縮および弛緩のサイクルの間に、容易に損傷を受ける。早期の疾病筋肉では再生によって補われるが、後期では、筋前駆細胞が進行中の損傷に追いつけず、そして、健康な筋肉が機能的でない繊維−脂肪組織に取って代わられる。
【０１２６】
ＤＭＤにおいて、少年は、早くも３歳から、筋肉の弱化の徴候を示し始める。この疾患は、腕、脚および体幹における骨格筋または随意筋を次第に弱化させる。十代前半またはそれより早い時期までに、少年の心筋および呼吸筋もまた冒され得る。ＢＭＤは、ＤＭＤのかなり穏やかなバージョンである。その発症は、十代または若い成人においてであるのが通常であり、そして、その経過は、ＤＭＤよりも遅く、そして、かなり予測不能である（ＤＭＤおよびＢＭＤはほぼ専ら少年を冒すが、稀に、少女を冒し得る）。
【０１２７】
１９８０年代まで、いかなる種類の筋ジストロフィーの原因についてもあまり知られていなかった。１９８６年に、ジストロフィン遺伝子の欠失が、ＤＭＤの原因として同定された。ＢＭＤは、同じ遺伝子における異なる変異から生じる。ＢＭＤ患者は、いくらかのジストロフィンを有するが、それは、量が不十分であるか、質が劣っているかのいずれかである。いくらかのジストロフィンを有することで、ＢＭＤを罹患する人の筋肉が、ＤＭＤを罹患する人ほどひどくまたは急速に変性することから保護されている。
【０１２８】
最近の研究者らは、インビボでのミオスタチン機能をブロックまたは排除することで、ＤＭＤおよびＢＭＤの患者における少なくとも特定の症状を効率的に処置し得ることを実証している（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、上掲；Ｗａｇｎｅｒら、上掲）。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）は、ＤＭＤおよびＢＭＤの患者において、インビボでのミオスタチンの機能をブロックする代替的な手段を構成する。
【０１２９】
同様に、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）は、筋成長を必要とする他の疾患状態において、筋重量を増加させるための有効な手段を提供する。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、（上掲）は、ミオスタチンの発現が、ヒトにおける除脂肪体重（ｆａｔ−ｆｒｅｅ ｍａｓｓ）と逆相関していること、そして、ミオスタチン遺伝子の発現の増加が、ＡＩＤＳ消耗症候群を有する男性における体重の減少と関連していることを報告した。ＡＩＤＳ患者においてミオスタチンの機能を阻害することによって、完全には排除されないとしても、ＡＩＤＳの少なくとも特定の症状が軽減され得、したがって、ＡＩＤＳ患者のクオリティオブライフを有意に向上させる。
【０１３０】
ミオスタチン機能の喪失はまた、栄養摂取の減少を伴わない脂肪の喪失と関連しているので（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上掲；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、上掲）、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）はさらに、肥満およびＩＩ型糖尿病の発症を遅らせるか、または予防するための治療剤として使用され得る。
【０１３１】
癌性の食欲不振−悪液質症候群は、とりわけ、癌の最も人を衰弱させ、かつ生命を脅かす局面である。癌性の食欲不振−悪液質症候群における進行性の体重の減少は、多くのタイプの癌に共通する特徴であり、そして、乏しいクオリティオブライフおよび化学療法に対する乏しい応答を担うのみならず、体重の減少を伴わないかなりの腫瘍を有する患者において見られるものよりも短い生存時間も担う。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗、精神的な疲労およびクオリティオブライフの低下に伴い、悪液質が、癌と宿主との間の複雑な相互作用から生じる。これは、癌患者の中でもとりわけ、最も一般的な死因であり、そして、死亡時に８０％において存在している。これは、タンパク質、炭水化物および脂質の代謝に影響を与える、代謝性カオスの複雑な例である。腫瘍は、直接的および間接的の両方で異常を生じ、食欲不振および体重の減少をもたらす。現在、このプロセスを制御または逆進させる処置はない。
【０１３２】
癌性の食欲不振−悪液質症候群は、サイトカインの産生、脂質動員因子およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに、中間代謝における変化に影響を及ぼす。食欲不振は一般的であるが、食物摂取の減少だけでは、癌患者で見られる身体組成の変化の説明はできず、そして、養分摂取を増加させても、消耗性症候群を逆進させることができない。罹病前の体重の５％を超える故意でない体重の減少が６ヶ月の期間内に生じる場合、癌を罹患する患者において、悪液質が疑われるべきである。
【０１３３】
成体マウスにおけるミオスタチンの全身性の過剰発現は、ヒトの悪液質症候群で見られるものと類似する顕著な筋肉および脂肪の喪失を誘導することが分かっているので（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上掲）、薬学的組成物としての本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体（特に、そのＮ末端短縮型バージョン）は、筋成長が望まれる悪液質症候群の症状を予防、処置または軽減するために、ミオスタチンアンタゴニスト／ブロッカーとして有益に使用され得る。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明の改変体ＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（特に、Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体）は、神経変性を伴う疾患の宿主の症状を予防、処置または軽減するために有益に使用され得る薬学的組成物を形成するために使用され得る。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、野生型ＡＬＫ７レセプターを介して媒介される抑制性のフィードバック機構と拮抗し得、こうして、新しい神経の成長および分化を可能にする。本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、薬学的組成物として、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病などを含む神経変性を伴う疾患の症状を予防、処置または軽減するために有益に使用され得る。
【０１３５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、漸次的に生じ、記憶の喪失、異常な挙動、人格の変化、および、思考能の低下をもたらす、慢性的な不治でかつ止められない中枢神経系（ＣＮＳ）の障害である。これらの喪失は、特定のタイプの脳細胞の死、および、これらの間の連絡の崩壊に関連している。
【０１３６】
ＡＤは、子供の発育の逆として説明されている。ＡＤを罹患する多くの人において、症状は、６０歳より上で出現する。最も早い症状としては、近時の記憶の喪失、誤った判断、および人格の変化が挙げられる。疾患の後期では、ＡＤを罹患する人は、自分の手を洗うなどのような単純な作業のやり方を忘れる可能性がある。ＡＤを罹患する人は最終的に、あらゆる理性的な力を失い、自身の毎日の世話を他の人に依存するようになる。最終的には、この疾患は、人をかなり衰弱させて、患者は寝たきりになり、代表的には、並存の疾患を発症する。ＡＤ患者は、疾患の発症から８〜２０年で、最も一般的には肺炎で亡くなる。
【０１３７】
パーキンソン病（ＰＤ）は、漸次的に生じ、そして、制御できない身体の動作、固縮、振戦、および、歩行困難をもたらす、慢性的な不治でかつ止められないＣＮＳの障害である。これらの運動系の問題は、筋肉の活動の制御を助ける化学物質であるドパミンを生成する脳の領域における脳細胞の死に関連している。
【０１３８】
ＰＤを罹患する多くの人において、症状は５０歳より上で出現する。ＰＤの最初の症状は、末端部（特に、手または唇において）に影響を及ぼす顕著な振戦である。それに続くＰＤの特徴的な症状は、強直または動きの遅速化、引きずり歩行（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｗａｌｋ）、前傾姿勢およびバランス機能不全である。記憶の喪失、痴呆、抑うつ、情動の変化、嚥下困難、異常発語（ａｂｎｏｒｍａｌ ｓｐｅｅｃｈ）、性的不能ならびに、膀胱および腸の問題のような、広範囲の二次的な症状がある。これらの症状は、フォークを持つ、または、新聞を読むなどの、慣用的な活動を阻み始める。最終的には、ＰＤを罹患する人は、全く無力となり、寝たきりになる。ＰＤを罹患する人は、通常、肺炎で亡くなる。
【０１３９】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病；運動ニューロン疾患）は、脳と骨格筋とをつなぐＣＮＳの構成要素である運動ニューロンを攻撃する、慢性的な不治のＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンは劣化して、最終的には死滅し、そして、患者の脳は通常、完全に機能するままに留まり、鋭敏であるが、動作の指令が、筋肉に達することはない。
【０１４０】
多くの人が、４０歳〜７０歳の間の年齢で、ＡＬＳを罹患していると診断される。弱化する最初の運動ニューロンは、腕または脚に至る運動ニューロンである。ＡＬＳを罹患する人は、歩行が困難で有り得、物を落とし、転倒し、言語が不鮮明であり、および制御不能に泣き笑いし得る。最終的には、肢の筋肉が不使用ために萎縮し始める。この筋肉の弱化は、人を衰弱させ、そして、人は、車椅子を必要とするか、または、ベッドの外では活動できなくなる。多くのＡＬＳ患者は、疾患の発症から３〜５年で、呼吸不全、または、肺炎のような人工呼吸器による補助の合併症で亡くなる。
【０１４１】
これらの神経学的疾患の原因は、大部分は不明なままである。これらは、慣習的に別個の疾患として定義されているが、明らかに、基本的なプロセスの非常な類似性を示し、そして、共通して、単なる偶然として考えられるよりもはるかに大きな症状の重なりを示している。現在の疾患の定義は、この重なりの問題を適切に扱っておらず、神経変性傷害の新しい分類が必要とされている。
【０１４２】
ハンチントン病（ＨＤ）は、脳の特定の領域におけるニューロンの遺伝子によりプログラムされた変性から生じる、別の神経変性疾患である。この変性は、制御できない動作、知的能力の喪失および情動の乱れを引き起こす。ＨＤは、家族性の疾患であり、野生型遺伝子における優性変異により、親から子へと受け継がれる。ＨＤのいくつかの早期の症状は、気分変動、抑うつ、被刺激性、または、運転すること、新しい物事を学習すること、事実を記憶していること、もしくは、決定を行うことの不調（ｔｒｏｕｂｌｅ）である。疾患が進行するにつれ、知的作業に対する集中が次第に困難となり、そして、患者は、自分自身で食事をすること、そして、嚥下することが困難となり得る。疾患の進行速度および発症の年齢は、人ごとに多様である。
【０１４３】
テイ−サックス病およびザントホフ病は、リソソームのβ−ヘキソサミニダーゼの欠失によって引き起こされる糖脂質蓄積症である（Ｇｒａｖｅｌら、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２８３９−２８７９，１９９５）。両方の障害において、ＧＭ２ガングリオシドおよびβ−ヘキソサミニダーゼに対する関連の糖脂質基質が、神経系に蓄積し、急性の神経変性を誘発する。重症な形態の多くにおいて、症状の発症は、早期新生児期に始まる。その後、急な神経変性の経過が続き、罹患した新生児は、運動機能障害、てんかん発作、視覚喪失および難聴を示す。死は、通常、２〜５歳の年齢で起こる。アポトーシス性の機構による神経の喪失が示されている（Ｈｕａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１８７９−１８８５，１９９７）。
【０１４４】
アポトーシスは、免疫系におけるＡＩＤＳの病因において役割を担うことが周知である。しかし、ＨＩＶ−１もまた、神経学的疾患を誘導する。Ｓｈｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１９７９−１９９０，１９９６）は、インビトロモデルおよびＡＩＤＳ患者に由来する脳組織における、中枢神経系（ＣＮＳ）のＨＩＶ−１感染により誘導されるアポトーシスを調べ、そして、初代脳培養物のＨＩＶ−１感染が、インビトロで、ニューロンおよび星状細胞におけるアポトーシスを誘導したことを見出した。ニューロンおよび星状細胞のアポトーシスはまた、１１人中１０人のＡＩＤＳ患者（５人中５人のＨＩＶ−１による痴呆を有する患者、そして、５人中４人の非痴呆患者を含む）に由来する脳組織においても検出された。
【０１４５】
神経の喪失はまた、ヒトにおけるクロイツフェルト−ヤコブ病、ウシにおけるＢＳＥ（狂牛病）、ヒツジおよびヤギにおけるスクラピー、ならびにネコにおけるネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）のような、プリオン病の著しい特徴でもある。
【０１４６】
Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体を含む本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチドはまた、以下に記載されるもののような種々のＰＮＳ障害の症状を予防、処置および軽減するためにも有用である。ＰＮＳは、ＣＮＳへ至るか、または、ＣＮＳから分岐する神経から構成される。末梢神経は、多様な系列の身体の機能（感覚神経、運動神経および自律神経の機能を含む）を取り扱う。個体が末梢神経障害を有する場合、ＰＮＳの神経が損傷を受けている。神経損傷は、疾患、物理的傷害、中毒または栄養失調のような多数の原因から生じ得る。これらの因子は、求心性もしくは遠心性のいずれかの神経に影響を与え得る。損傷の原因に依存して、神経細胞軸索、その保護性のミエリン鞘またはこの両方が、傷害され得るか、または、破壊され得る。
【０１４７】
用語「末梢神経障害」は、脳および脊髄の外側の神経−末梢神経−が損傷を受けている広範囲の障害を包含する。末梢神経障害はまた末梢神経炎とも称され得、また、多くの神経が関与している場合には、用語「多発性神経障害」または「多発性神経炎」が使用され得る。
【０１４８】
末梢神経障害は、広範囲に及ぶ障害であり、そして、多くの根底にある原因が存在する。これらの原因には一般的なものもあれば（例えば、糖尿病）、極めて稀なものもある（例えば、アクリルアミド中毒および特定の遺伝性障害）。末梢神経障害の最も一般的な世界的な原因は、らい病である。らい病は、細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅによって引き起こされ、この菌は、冒された人の末梢神経を攻撃する。世界保健機関によって集められた統計によれば、世界中で推定１１５万人がらい病を有している。
【０１４９】
らい病は、米国では極めて稀であり、米国では、糖尿病が最も一般に知られる末梢神経障害の原因である。米国および欧州において１７００万人超が糖尿病に関連する多発性神経障害を有すると推定されている。多くの神経障害は特発性であり、既知の原因を見出すことができない。米国における最も一般的な遺伝性の末梢神経障害は、シャルコー−マリー−ツース病であり、これは、およそ１２．５万人を冒している。
【０１５０】
より知られる末梢神経障害の別の例はギラン−バレー症候群であり、これは、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルス性疾患、または、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉおよびＬｙｍｅ病を含む細菌感染に関連する合併症から生じる。世界的な発生率は、年間、１０万人におよそ１．７症例である。末梢神経障害の他の周知の原因としては、慢性アルコール中毒、水痘−帯状疱疹ウイルス感染、ボツリヌス中毒およびポリオが挙げられる。末梢神経障害は、一次の症状として発症しても、別の疾患に起因していてもよい。例えば、末梢神経障害は、アミロイド神経障害、特定の癌または遺伝性の神経学的障害のような疾患の一症状に過ぎない。このような疾患は、末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）ならびに他の身体組織に影響を及ぼし得る。
【０１５１】
本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチドを用いて処置可能な他のＰＮＳ疾患としては以下が挙げられる：腕神経叢神経障害（腕神経叢の頚根および第一胸根（ｃｅｒｖｉｃａｌ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｒｏｏｔ）、神経幹、索および上腕神経叢の末梢神経構成要素の疾患。臨床的な症状発現としては、局部疼痛、感覚異常；上肢における筋肉の弱化および感覚の低下が挙げられる。これらの障害は、外傷（出生時の傷害を含む）；胸郭出口症候群；新生物、神経炎、放射線治療；および他の状態に関連し得る。Ａｄａｍｓら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，ｐｐ１３５１−２）を参照のこと；糖尿病性神経障害（真性糖尿病に関連する末梢神経、自律神経および脳神経の障害）。これらの状態は、通常、神経に供給している小さな血管（神経の脈管）に関わる糖尿病性の微小血管傷害から生じる。糖尿病性神経障害に付随し得る比較的一般的な状態としては、以下が挙げられる：第三脳神経麻痺（ｔｈｉｒｄ ｎｅｒｖｅ ｐａｌｓｙ）；単発神経障害；多発性単神経炎；糖尿病性筋萎縮症；疼痛性多発性神経障害（ｐａｉｎｆｕｌ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）；自律神経障害；および胸腹部神経障害（ｔｈｏｒａｃｏａｂｄｏｍｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，ｐ１３２５を参照のこと）；単発神経障害（孤立性であるか、または、びまん性末梢神経機能障害の証拠に対し不均衡な、単一の末梢神経を含む疾患または外傷。多発性単神経炎は、多発性でかつ孤立性の神経傷害によって特徴付けられる状態を指す。単発神経障害は、虚血；外傷性傷害；圧迫；結合組織の疾患；蓄積外傷疾患；および他の状態を含む広範な種々の原因から生じ得る）；神経痛（末梢神経または脳神経の進路または分布に沿って生じる、強烈もしくはずきずきと痛む疼痛）；末梢神経系新生物（末梢神経組織から生じる新生物。これには、神経線維腫；神経鞘腫；顆粒細胞腫瘍；および悪性神経鞘腫が含まれる。ＤｅＶｉｔａ Ｊｒら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第５版，ｐｐ１７５０−１を参照のこと）；神経圧迫症候群（内部もしくは外部の原因からの神経もしくは神経根の機械的な圧迫。これらは、例えば、ミエリン鞘機能不全または軸索の喪失に起因する神経のインパルスに対する伝導ブロックをもたらし得る。神経および神経鞘の傷害は、虚血；炎症；または直接的な機械的作用によって引き起こされ得る）；神経炎（末梢神経または脳神経の炎症を示す一般的な用語。臨床的な症状発現としては、疼痛；感覚異常；不全麻痺；または知覚過敏（ｈｙｐｅｒｔｈｅｓｉａ）が挙げられ得る）；多発性神経障害（複数の末梢神経の疾患。冒される神経のタイプ（例えば、感覚神経、運動神経または自律神経）によって、神経傷害の分布（例えば、遠位 対 近位）によって、一次に影響を及ぼされる神経の構成要素（例えば、脱髄性 対 軸索性）によって、病因によって、または、遺伝形質のパターンによって、種々の形態が分類される）。
【０１５２】
特定の実施形態では、本発明の全長のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドまたはその改変体は、以下に記載されるもののような、過剰もしくは所望されないレベルのＢＭＰによって特徴付けられる疾患または状態の処置の一部として使用される。
【０１５３】
筋、腱および靭帯の異所性骨化は、整形外科医が直面する共通の問題である。Ｈａｎｎａｌｌａｈら（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００４ Ｊａｎ；８６−Ａ（１）：８０−９１）は、Ｎｏｇｇｉｎ（ＢＭＰ［骨形成タンパク質］アンタゴニスト）の異所性骨化を抑制する能力を調べた。３つの多様な用量のＮｏｇｇｉｎを発現する筋肉由来の幹細胞が、ＢＭＰ−４を発現する筋肉由来の幹細胞によって誘発される異所性骨化を抑制した。３つの多様な用量のＮｏｇｇｉｎを発現する筋肉由来の幹細胞の各々はまた、脱髄した骨基質によって誘発される異所性骨化も有意に抑制した。アキレス腱切除術を受けた１１匹の動物の全てが、コントロールの肢における傷害部位において異所性骨化を発症した。対照的に、Ｎｏｇｇｉｎを発現する筋肉由来の幹細胞で処置した肢は、異所性骨化の形成における８３％の減少を有し、そして、１１匹中８匹の動物は、異所性骨化の放射線撮像による徴候を有さなかった（ｐ＜０．０５）。したがって、筋肉由来の幹細胞により媒介されるＮｏｇｇｉｎの送達は、動物モデルにおけるＢＭＰ−４によって引き起こされる異所性骨化、脱髄した骨基質および外傷を抑制し得、ＢＭＰインヒビター（ＮｏｇｇｉｎまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ）を送達するための遺伝子治療が、身体の標的領域における異所性骨化を抑制するための効果的な方法となり得ることを示唆した。また、Ｇｌａｓｅｒら（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００３ Ｄｅｃ；８５−Ａ（１２）：２３３２−４２）も参照のこと。
【０１５４】
変形性関節症（ＯＡ）は、骨棘の発生、線維症および関節軟骨損傷によって特徴付けられる関節の疾患である。外因性のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）アイソフォームおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の作用は、ＯＡの病因におけるこれらの増殖因子の役割を示唆している。Ｓｃｈａｒｓｔｕｈｌら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００３ Ｄｅｃ；４８（１２）：３４４２−５１）は、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰのシグナル伝達をブロックするために、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアンタゴニストのアデノウイルスによる過剰発現を使用した。研究されたインヒビターには、マウス潜伏期関連ペプチド（ｍｕｒｉｎｅ ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）１（ｍＬＡＰ−１）と呼ばれる分泌型の汎特異的ＴＧＦ−βアンタゴニスト、細胞内阻害性Ｓｍａｄ６（ＢＭＰアンタゴニスト）およびＳｍａｄ７（ＴＧＦ−β／ＢＭＰインヒビター）が含まれる。パパインの関節内注射は、滑膜および靭帯においていくつかのＴＧＦ−βおよびＢＭＰのアイソフォームのタンパク質発現を増加させた。関節内へのアデノウイルストランスフェクションは、滑膜内層におけるトランスジーンの強い発現をもたらした。ｍＬＡＰ−１、Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７の過剰発現は、コントロールにおけるものと比較して、骨棘の形成の有意な減少をもたらした。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７の過剰発現はまた、滑膜の肥厚を有意に低下させた。さらに、分泌型のＴＧＦ−βインヒビターであるｍＬＡＰ−１は、関節軟骨におけるＰＧの喪失を増加させた。これらの結果は、骨棘および滑膜肥厚の発生における過剰な外因性ＴＧＦ−βおよびＢＭＰの中心的な役割を示し、ＯＡの病因における過剰な外因性ＴＧＦ−βおよびＢＭＰの関与を示している。対照的に、外因性ＴＧＦ−βによる靭帯損傷の防止は、関節軟骨におけるＴＧＦ−βの保護性の役割を意味する。したがって、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓの薬学的組成物は、ＯＡ（骨棘および滑膜肥厚の発生を含む）を処置するためのＢＭＰアンタゴニストとして使用され得る。
【０１５５】
正常な卵巣胚上皮（ＯＳＥ）細胞および卵巣癌（ＯＣ）細胞の解析において、ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＮａｃｈｔｉｇａｌ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００３ Ａｕｇ；１４４（８）：３３０６−１４）は、ＢＭＰ４ ｍＲＮＡの発現を観察し、そして、初代ＯＣ細胞が、成熟なＢＭＰ４を生成することを見出した。さらに、下流のシグナル伝達経路の各メンバーが、初代のＯＳＥ細胞およびＯＣ細胞において発現された。Ｓｍａｄ１は、リン酸化され、そして、ＢＭＰ４での処理の際に、正常なＯＳＥ細胞およびＯＣ細胞において、核転座を受けた。興味深いことに、ＢＭＰ標的遺伝子ＩＤ１およびＩＤ３は、正常なＯＳＥでは、２〜３倍の増加であったのに対し、初代のＯＣ細胞において１０〜１５倍アップレギュレートされた。いくつかの初代ＯＣ細胞の増殖は、ＢＭＰ４処理によって比較的不変であった；しかし、初代ＯＣ細胞の長期にわたるＢＭＰ４処理は、細胞密度の低下、ならびに、細胞の拡延性および粘着性の増加をもたらした。これらのデータは、正常なＯＳＥ細胞およびＯＣ細胞におけるＢＭＰシグナル伝達の存在および推定の機能を示し、したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓの薬学的調製物は、ＯＣの病因においてＢＭＰ４シグナル伝達を調節するために使用され得る。
【０１５６】
異所性骨形成によって特徴付けられる稀な遺伝性無能化疾患（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓａｂｌｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）である進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）は、多方面にわたる医療にとり特に関心が持たれている。なぜなら、その病因に関与する骨形成タンパク質（特に、ＢＭＰ−４）が、骨格の形態形成において役割を担うことが知られており、さらに、ＢＭＰ−４に対する遺伝子アンタゴニスト（例えば、ｎｏｇｇｉｎ）が、層板状の骨形成の予防において有用であり得るからである。Ｂｌａｓｚｃｚｙｋら（Ｅｕｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１３（３）：２３４−７）を参照のこと。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓの治療薬はまた、ＦＯＰを処置するためにも使用され得る。
【０１５７】
アテローム性動脈硬化症は、現在、分枝動脈における流れが妨げられた状態（律動様ずれ応力（ＯＳ）を含む）に曝露された動脈領域において優先的に生じる炎症性疾患と見られている。Ｓｏｒｅｓｃｕら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（３３）：３１１２８−３５，２００３）は、ＢＭＰ４が、病巣となりがちな領域におけるアテローム発生の早期段階において重要な役割を担う、機械感覚性の（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）炎症性因子であることを示唆している。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓの治療薬は、これらの領域におけるアテローム発生の早期段階においてＢＭＰ−４誘導性の炎症性応答を制御するために使用され得る。
【０１５８】
頭蓋発生の間に、頭の結合組織の間質は膜内骨化を受けて、頭蓋骨（頭蓋冠）を形成する。頭蓋冠骨が前進して脳を覆うと、頭蓋冠プレート間に線維性の縫合が形成する。脳の拡大は、頭蓋縫合（ｃｒａｎｉａｌ ｓｕｔｕｒｅ）複合体内での一連の組織相互作用による頭蓋冠の成長と結び付けられる。頭蓋骨癒合症、すなわち、未熟な頭蓋縫合の癒合は、異常な頭蓋の形状、盲および精神遅滞をもたらす。最近の研究は、線維芽細胞増殖因子レセプター（ｆｇｆｒ）における機能獲得型変異が、頭蓋骨癒合症の症候性形態と関連していることを実証している。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストであるＮｏｇｇｉｎは、胚の神経管、体節および骨格のパターン形成に必要とされる。Ｗａｒｒｅｎら（Ｎａｔｕｒｅ．２００３ Ａｐｒ １０；４２２（６９３２）：６２５−９）は、ｎｏｇｇｉｎが、開存性の縫合間葉において生後に発現されるが、癒合している頭蓋縫合では発現されないこと、そして、ｎｏｇｇｉｎの発現が、ＦＧＦ２および症候性ｆｇｆｒのシグナル伝達によって抑制されることを示している。ｎｏｇｇｉｎの発現がないと、インビトロおよびインビボでの頭蓋縫合の癒合が防止されるので、症候性ｆｇｆｒ媒介性の頭蓋骨癒合症は、異常に高いＢＭＰ活性につながる、ｎｏｇｇｉｎ発現の不適切なダウンレギュレーションの結果であり得ることが示唆される。したがって、本発明のＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏの治療薬は、ＢＭＰ活性をダウンレギュレートして、このような状態を予防または処置するために使用され得る。
【０１５９】
Ｖ．例示的な処方物
本発明の組成物は、単独で、または、他の化合物／薬学的組成物との組み合わせ治療の一部として使用され得る。
【０１６０】
本発明の方法において使用するための、可溶性のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（Ｎ末端短縮型Ｃｅｒｂｅｒｕｓ誘導体を含む）の治療薬は、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、またはこれらの適切な混合物のような生物学的に受容可能な媒体と共に投与するために簡便に処方され得る。選択した媒体中の活性成分の最適な濃度は、医薬化学者に周知の手順によって、経験的に決定され得る。本明細書中で使用される場合、「生物学的に受容可能な媒体」は、薬学的調製物の所望される投与経路に適切であり得る、任意およびあらゆる溶媒、分散媒などを包含する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体または因子が、治療薬の活性と調和できない場合を除いて、本開示の薬学的調製物におけるその使用が企図される。適切なビヒクルおよび他のタンパク質を含むその処方物は、例えば、書籍、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ １９８５）に記載される。これらのビヒクルは、注射可能な「デポジット処方物（ｄｅｐｏｓｉｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」を含む。
【０１６１】
本開示の薬学的処方物はまた、獣医学的組成物（例えば、獣医学的用途のため（例えば、家畜類（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびウマなど）または愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）の処置のため）に適したＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体治療薬の薬学的調製物）を含み得る。
【０１６２】
本開示の方法はまた、再充填可能もしくは生分解性のデバイスによって提供され得る。近年、タンパク質性の生物製剤（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｉｏｕｓ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を含む薬物の制御された送達のための種々の緩慢放出ポリマーデバイスが開発されており、そして、インビボで試験されている。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーの両方を含む種々の生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）が、特定の標的部位での治療薬の持続放出のための埋没物を形成するために使用され得る。
【０１６３】
本開示による薬学的組成物は、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。本開示の薬学的組成物は、個々の治療剤として、または他の治療剤との組み合わせるかのいずれかで投与され得る。本開示の処置は、従来の治療と併用され得、これらは、連続して投与されても、同時に投与されてもよい。本開示の薬学的組成物は、ＣｏｃｏもしくはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体が標的細胞／組織／臓器に到達することを可能とするあらゆる手段によって投与され得る。いくつかの実施形態では、投与経路は、標的細胞が存在する臓器の血液供給源への、もしくは細胞内への直接的な、経口投与、膀胱内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、局所投与からなる群より選択される経路を含む。静脈内投与が好ましい投与様式である。静脈内投与は、注入ポンプの助けにより達成され得る。
【０１６４】
句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、本明細書中で使用される場合、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、そして、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｍａｌ）の注射および注入が挙げられる。
【０１６５】
句「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」とは、本明細書中で使用される場合、化合物、薬物または他の物質の、中枢神経系内への直接投与以外の投与であって、その投与の結果、化合物、薬物または他の物質が患者の系に入り、したがって、代謝および他の同様のプロセスに供されるような投与を意味する（例えば、皮下投与）。
【０１６６】
これらの化合物は、任意の適切な投与経路（経口、膀胱内、例えばスプレーなどにより鼻に（ｎａｓａｌｌｙ）、直腸に（ｒｅｃｔａｌｌｙ）、膣内、非経口、クモ膜下槽内、および、散剤、軟膏もしくはドロップにより局所的に（頬側に（ｂｕｃｃａｌｌｙ）および舌下を含む）が挙げられる）によって、治療のためにヒトおよび他の動物に投与され得る。
【０１６７】
選択される投与経路とは無関係に、適切な水和形態で使用され得る本開示の化合物および／または本開示の薬学的組成物は、以下に記載されるような薬学的に受容可能な投薬形態で、または、当業者に公知の他の従来の方法によって処方され得る。
【０１６８】
本開示の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、個々の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を達成するように変更され得る。
【０１６９】
選択される投与量のレベルは、用いられる本開示の特定の化合物、または、そのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、用いられる特定の治療薬と併用して用いられる他の薬物、化合物および／もしくは物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および前病歴、ならびに、医療分野において周知の同様の因子を含む、種々の因子に依存する。
【０１７０】
当該分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定および処方し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも少ないレベルの、薬学的組成物において用いられる本開示の化合物の用量から開始して、所望の効果が達成されるまで、漸次的に投薬量を増加させ得る。
【０１７１】
一般に、本開示の化合物の適切な一日量は、治療効果を生じるのに有効な最低の用量である化合物の量である。このような有効用量は、一般に、上記のような因子に依存する。一般に、患者のための本開示の化合物の静脈内、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｉｔｒｉｃｕｌａｒ）および皮下の用量は、１日につき体重１キログラムあたり約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲である。
【０１７２】
所望される場合、活性化合物の有効な一日量は、１日を通して適切な間隔で分けて、必要に応じて単位投与量形態で別々に投与される、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の準用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として投与され得る。
【０１７３】
用語「処置」はまた、予防、治療および治癒を包含することも意図される。
【０１７４】
この処置を受ける患者は、この処置を必要とするあらゆる動物であり、これには、霊長類、特に、ヒト、および他の非ヒト哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ）；ならびに、家禽およびペット一般が含まれる。
【０１７５】
本開示の化合物は、単独で、または、薬学的に受容可能なキャリアとの混合物において投与され得、そしてまた、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよび糖ペプチドのような他の抗菌剤と組み合わせて投与され得る。したがって、組み合わせ治療（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）は、最初に投与したものの治療効果が、次に投与されるときに完全に消失されないような方法での、活性化合物の連続的、同時および別個の投与を含む。
【０１７６】
特定の処方物と組み合わせると、本発明のＣｏｃｏまたはＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、有効な可溶性因子であり得る。治療用ポリペプチドは、可溶性を促進する第２のペプチドと共に融合ペプチドとして提供され得る。例を挙げると、本開示のＣｅｒｂｅｒｕｓ誘導体は、免疫グロブリンのヒンジもしくはＦｃ部分の全体もしくはフラグメント（可溶性および／または血清安定性を促進し得る）との融合ポリペプチドの一部として提供され得る。
【０１７７】
本開示はまた、本明細書中に記載されるような本発明のポリペプチド誘導体のペプチド模倣配列を企図する。
【０１７８】
一般に、本明細書中で使用される用語法および本開示において利用される実験室の手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を包含する。このような技術は、文献において徹底的に説明されている。例えば、以下を参照のこと：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら、（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」，第１〜４巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９および同第５，２７２，０５７号に示されるような方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら、（編），「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは、特許文献および科学技術文献に詳細に記載されており、例えば以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１および同第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１〜３１７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらは全て、完全に本明細書中に示されるかの如く、参考として援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書の全体にわたり提供される。これらの文献における手順は、当該分野で周知であると考えられるが、読み手の便のために提供される。これらの文献に含まれる情報は全て、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１７９】
本開示は、ここで、一般的に記載されているが、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される。以下の実施例は、特定の実施形態および本開示の実施形態を例示する目的のためだけに含まれるものであり、本開示を限定することを意図するものではない。
【０１８０】
実施例１．ＣａｒｏｎｔｅおよびヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質の供給源
Ｃａｒｏｎｔｅ−Ｆｃ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓに由来するＣｅｒｂｅｒｕｓホモログ）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に注文した。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ配列の全長およびＮ末端短縮型形態を、Ｃ末端をＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒトおよびマウスの両方のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物を生成した）に融合させてか、または、融合させずに、ヒトＣＭＶ由来の発現ベクター中にクローニングした。これらの構築物を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。培養した後、細胞を回収し、そして、精製のために馴化培地を回収した。
【０１８１】
以下の構築物を調べた：
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、全長、Ｆｃなし（配列番号１１）
【０１８２】
【数９】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、全長、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびＦｃに下線を付す；ネイティブなシグナル配列には、点線の下線を付す）（配列番号１２）
【０１８３】
【数１０】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、短縮型、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびＦｃに下線を付す）（配列番号１３）
【０１８４】
【数１１】
３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１４）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１５）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＨＬＬＬＦＱＬＬＶＬＬＰＬＧＫＴ（配列番号１６）。
【０１８５】
異種性またはネイティブなリーダー配列は、最初の３０個のアミノ酸内の任意の位置にあるタンパク質配列に融合させ得る。モデリングは、１８位の「ＴＲＨ．．．」から開始する生成物を生じることを示唆する。本明細書において表される生成物の解析は、ネイティブなリーダーは、より代表的に、１６位の「ＫＴＴ．．．」から開始する生成物を生じることを示す。それゆえ、異種のリーダー配列は、１６位または１８位にＮ末端を融合させ得る。
【０１８６】
実施例２．ＣａｒｏｎｔｅはＧＤＦ−１１に結合する
ＧＤＦ−１１は、神経学的プロセスを調節するミオスタチンの近いホモログである。ＧＤＦ−１１を、標準的なアミンカップリング手順を用いて、ＢｉａＣｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定した。トレース：Ｃａｒｏｎｔｅ（２００μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＧＤＦ−１１をカップリングさせたチップ上に注入した。図２のトレーシングは、ＧＤＦ−１１へのＣａｒｏｎｔｅの結合を示す。
【０１８７】
実施例３．ＣａｒｏｎｔｅおよびヒトＣｅｒｂｅｒｕｓは、ＧＤＦ−１１およびミオスタチン媒介性のシグナル伝達を阻害する
Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＧＤＦ−１１、ミオスタチンおよびアクチビンＡによるシグナル伝達に対する、ＣａｒｏｎｔｅおよびＣｅｒｂｅｒｕｓの作用を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉由来）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００に記載されるもの）。図３を参照のこと。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）内に存在しており、したがって、このベクターは、一般に、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介してシグナル伝達される因子に用いられる。
１日目：Ａ−２０４細胞の４８ウェルプレートへの分割。
２日目：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２の１０μｇまたはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）と、Ｆｕｇｅｎｅとを用いてトランスフェクトしたＡ−２０４細胞。
３日目：因子（０．１％ ＢＳＡを含む培地中に希釈したもの）を添加。インヒビターは、細胞に加える前に、１時間にわたって因子と予備インキュベートする必要がある。６時間後に細胞をＰＢＳでリンスし、そして細胞を溶解させる。
【０１８８】
この次に、ルシフェラーゼアッセイを行う。あらゆるインヒビターの非存在下で、アクチビンＡは、レポーター遺伝子の発現の１０倍の刺激と、約２０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０とを示した。ＧＤＦ−８：ＥＤ５０：約５ｎｇ／ｍｌ、１５倍の刺激。ＧＤＦ−１１：１６倍の刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌ。
【０１８９】
図４に示されるように、Ｃａｒｏｎｔｅは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）融合物もまた、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。図５に示されるように、Ｃａｒｏｎｔｅは、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいてアクチビンＡを阻害しない。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合物（「ＩＩＡ ｍｕＧ２ａ」）は、予測された通り、アクチビンＡのシグナル伝達を阻害する。したがって、Ｃａｒｏｎｔｅは、アクチビンＡのシグナル伝達には影響を与えないが、ＧＤＦ−１１／ミオスタチンの選択的なインヒビターである。このタイプの選択性は、Ｃａｒｏｎｔｅ、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏが、治療薬として使用された場合の副作用が比較的少ないことを示唆する。予測された通り、Ｃｅｒｂｅｒｕｓは、Ｃａｒｏｎｔｅとかなり似た挙動を示し、ミオスタチンのシグナル伝達を阻害した。図６を参照のこと。ヒトのＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏのアクチビンＡに対する結合を調べるために、同様の実験を行い、そして、これらの実験は、これらの分子がアクチビンＡに結合しないことを確認する。
【０１９０】
実施例４．ヒトＣｏｃｏタンパク質の供給源
全長ヒトＣｏｃｏを、Ｃ末端をＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒトおよびマウスの両方のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物を生成した）に融合させてか、または、融合させずに、ヒトＣＭＶ由来の発現ベクター中にクローニングした。これらの構築物を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。培養した後、細胞を回収し、そして、精製のために馴化培地を回収した。
【０１９１】
以下の構築物を作製し、マウスＦｃ融合物もまた作製し、そして、これらを本明細書中に示されるアッセイにおいて使用した：
ヒトＣｏｃｏ、全長、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびｍＦｃ）（配列番号１７）
【０１９２】
【数１２】
以下の構築物は、短縮型のＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃ融合タンパク質と同様である：
ヒトＣｏｃｏ、短縮型、Ｆｃあり（ＴＧＧＧリンカーおよびｍＦｃ）（配列番号１８）
【０１９３】
【数１３】
３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１４）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１５）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＬＬＧＱＬＳＴＬＬＣＬＬＳＧＡＬＰＴＧＳ（配列番号１９）。
【０１９４】
異種性またはネイティブなリーダー配列は、最初の３０個のアミノ酸内の任意場所に、特に、Ｎ末端をアミノ酸１６〜２３のいずれかに融合させ得る。
【０１９５】
実施例５：ヒトＣｏｃｏは、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する
ヒトＣｏｃｏ−ｍＦｃを発現する細胞からの馴化培地を、ＧＤＦ−１１の存在下でＡ−２０４レポーター遺伝子発現に対する作用について調べた。
【０１９６】
図７に示されるように、Ｃｏｃｏ−ｍＦｃを含む馴化培地は、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおいて、Ｃｅｒｂｅｒｕｓとかなり類似して、ＧＤＦ−１１のシグナル伝達を阻害する。同様の実験が、Ｃｏｃｏ−ｍＦｃがＮｏｄａｌのシグナル伝達を阻害することを示した。
【０１９７】
実施例６：ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃは、ヒト血清中で分解される
血清の存在下でのＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドの安定性を評価した。ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ−Ｆｃを発現する細胞からの馴化培地を、種々の量のヒト血清（加えた血清の割合を上部に示す）と共に３７℃にて一晩インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分けた。ウェスタンブロット（図８）は、５％ヒト血清と共にインキュベートした場合に、Ｃｅｒｂｅｒｕｓが完全に分解されていることを示した。
【０１９８】
開裂フラグメントのＮ末端の配列決定は、タンパク質分解が以下の部位において起こったことを明らかにした（開裂を＾で示す）：
３８ ＮＱＲ＾ＥＬＰ ４３
１３８ ＭＦＲ＾ＫＴＰ １４３
２０７ ＳＨＣ＾ＬＰＡ ２１２。
【０１９９】
実施例７：血清に対して安定なヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏポリペプチド
血清に対して安定なＣｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドを生成するために、種々の改変が開裂部位および周囲の配列に導入され得る。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの短縮形態において、Ｌ２１２開裂部位のみが残り（アミノ酸の番号付けは、全長のネイティブなＣｅｒｂｅｒｕｓ配列、配列番号２を参照する）、したがって、配列ＳＨＣＬＰＡ中のアミノ酸のいずれか、いくつか、または全ての改変が、この開裂部位を除くために変更され得る。一般に、改変は、アラニンもしくはセリンのような小さな非荷電の基への改変である。Ｃ２１１および／またはＬ２１２のセリンもしくはアラニンへの改変が、特に望ましい。さらに、または代替的に、Ｎ連結グリコシル化部位（ＮＸＴ／Ｓ）は、アミノ酸２０２〜２２２の範囲内のある位置に導入され得る。Ｎ連結グリコシル化部位はまた、タンパク質の３次元構造において２１２位に近いと予測される位置にも導入され得る。用いられるＣｅｒｂｅｒｕｓ分子の長さに依存して、同様の改変が、他の部位３８ＮＱＲ＾ＥＬＰ４３および１３８ＭＦＲ＾ＫＴＰ１４３の各々に作製され得る。３８ＮＱＲ＾ＥＬＰ４３開裂部位に関して特に望ましい改変は、配列３８ＮＱ（Ｓ／Ｔ）ＥＬＰ４３を作製するＲのＳ／Ｔへの改変であり、これは開裂部位を除くと同時に、Ｎ連結グリコシル化部位を導入するものである。さらに、Ｅ４１およびＫ１４１において開裂された生成物が、ミオスタチン結合活性を保持していることが実験により示された。したがって、Ｅ４１またはＫ１４１から始まるＣｅｒｂｅｒｕｓのＮ末端短縮型形態は、これらの部位における開裂に対して抵抗性であり、そして活性を保持する。短縮形態の活性は、最小のミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１に位置するシステイン−ノットであることを示唆している。
【０２００】
１以上の変更（以下で、角括弧［］内に示される；例えば、”［Ｒ（Ｔ）］”は、通常その位置にあるアルギニンが、スレオニンで置き換えられ得ることを意味する）を有するＣｅｒｂｅｒｕｓ構築物は、開裂をブロックし、そして、改善された薬力学的特性を与えるものと予測される、Ｎ連結グリコシル化部位を有する。以下の構築物は、例えば、ｔＰＡリーダー配列およびＦｃ配列と共に発現され得る
【０２０１】
【数１４】
Ｃｏｃｏは、Ｃｅｒｂｅｒｕｓと同様の様式の挙動を示すと予測されるが、Ｃｏｃｏにおける２つの同様の開裂部位は、以下の配列：１５０ＰＡＲ＾ＫＲＷ１５５および１６８ＳＲＲ＾ＲＶＫ１７３におけるシステイン−ノットドメイン内に生じる。これらの位置におけるアミノ酸が、開裂を除くために変更され得る：アラニンおよびセリンが特に好ましいアミノ酸である。さらに、もしくは代替的に、Ｎ連結グリコシル化部位（ＮＸＴ／Ｓ）は、これらの位置のいずれか、またはその付近に導入され得る。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの短縮形態の活性は、Ｃｏｃｏの最小のミオスタチン結合ドメインが、配列番号５のアミノ酸１０１〜１８５に位置するシステイン−ノットであることを示唆している。
【０２０２】
１以上の変更（以下で、角括弧［］内に示される）を有するＣｏｃｏ構築物は、開裂をブロックし、そして、改善された薬力学的特性を与えるものと予測される、Ｎ連結グリコシル化部位を有する。以下の構築物は、例えば、ｔＰＡリーダー配列およびＦｃ配列と共に発現され得る
【０２０３】
【数１５】
実施例８：ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏのシステイン改変体
いくつかのタンパク質では、奇数のシステイン残基が、タンパク質の凝集を引き起こし得るか、または、他の方法でタンパク質の生成を妨害し得る、遊離スルフヒドリル基を生じる。ネイティブなＣｏｃｏおよびネイティブなＣｅｒｂｅｒｕｓは共に、奇数のシステイン残基を有する。Ｃｅｒｂｅｒｕｓの発現を改善するために、より少ないシステイン残基を持つ改変体、および、１以上のシステインの近くに変更を持つ改変体を作製した。配列番号２に対し、以下の改変を作製した：
Ｃ１７６Ｇ；
Ｃ２０６Ｇ；
Ｃ２２３Ｇ；
Ｎ２２２Ｄ。
【０２０４】
これらのタンパク質は各々が、発現可能でありかつＧＤＦ１１への結合を保持しており、これらのタンパク質の生化学的活性がインタクトなままであったことを示している。Ｃｏｃｏについても（配列番号５に対して）、同様の特定の改変を作製し得る：
Ｃ１１５Ｇ；
Ｃ１４５Ｇ；
Ｃ１６２Ｇ。
【０２０５】
したがって、本開示は、１以上のシステイン残基が欠失もしくは置換された、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＣｏｃｏ改変体を提供する。置換される場合には、置換アミノ酸は、他の１９の必須アミノ酸のいずれかであり得るが、Ｇ、Ａ、ＳおよびＴが好ましい。
【０２０６】
等価物
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または、慣用的に過ぎない実験を用いて確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号２）のアミノ酸１６２〜２４１の配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたって、実質的に血清に対して安定である、タンパク質。
【請求項２】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項４】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項５】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項６】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１１９〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項７】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項８】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項９】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項１０】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する、タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、ミオスタチンアンタゴニスト活性がＡ２０４細胞ベースのアッセイで評価される、タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＳＨＣＬＰＡＫ内における切断を低減もしくは排除する、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１５】
請求項６〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＭＦＲＫＴＰ内における切断を低減もしくは排除する、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１６】
請求項９〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＮＱＲＥＬＰ内における切断を低減もしくは排除する、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１７】
ヒトＣｏｃｏ（配列番号５）のアミノ酸１０１〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたって、実質的に血清に対して安定である、タンパク質。
【請求項１８】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸１０１〜１８９の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項１９】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２０】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８９の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２１】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２２】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８９の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する、タンパク質。
【請求項２４】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、ミオスタチンアンタゴニスト活性がＡ２０４細胞ベースのアッセイで評価される、タンパク質。
【請求項２５】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号５のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項２６】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、以下のヒトＣｏｃｏの配列：ＰＡＲＫＲＷおよびＳＲＲＲＶＫの一方もしくは両方における切断を低減もしくは排除する、配列番号５のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜１０および１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与, 組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、タンパク質。
【請求項２８】
前記融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む、請求項２７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項２７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３０】
請求項２７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、前記の該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む、タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜１０および１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である、タンパク質。
【請求項３２】
前記親和性試薬が抗体因子である、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３３】
前記抗体因子が、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖである、請求項３２に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３４】
前記抗体因子が、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項３２に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３５】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチドである、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３６】
前記親和性試薬が、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインである、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３７】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子である、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む薬学的調製物。
【請求項３９】
患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１を阻害するための方法であって、該方法は、請求項１〜３７のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１の阻害が、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によって調節される遺伝子の発現に検出可能な変化を引き起こす、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者において筋重量を増加させるための方法であって、該方法は、請求項１〜３７のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む、発熱物質を実質的に含まない薬学的調製物であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：
ａ．ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンのうちの１以上に結合し、そして、そのシグナル伝達活性を阻害し；そして
ｂ．ＢＭＰ４には実質的に結合しない、
薬学的調製物。
【請求項４３】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が筋組織の成長を促進する、請求項４２に記載の薬学的調製物。
【請求項４４】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４５】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４６】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、全長の成熟なヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質を含まない、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４７】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４８】
前記融合タンパク質が免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む、請求項４７に記載の調製物。
【請求項４９】
前記融合タンパク質が免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項４７に記載の調製物。
【請求項５０】
前記の該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む、請求項４７に記載の調製物。
【請求項５１】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である、請求項４２に記載の調製物。
【請求項５２】
前記親和性試薬が抗体因子である、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５３】
前記抗体因子が、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖである、請求項５２に記載の調製物。
【請求項５４】
前記抗体因子が、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項５２に記載の調製物。
【請求項５５】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチドである、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５６】
前記親和性試薬が、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインである、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５７】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子である、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５８】
患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１を阻害するための方法であって、該方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を該患者に投与する工程を包含し、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する、方法。
【請求項５９】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１の阻害が、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によって調節される遺伝子の発現に検出可能な変化を引き起こす、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
骨格筋重量の増加を必要とする患者において骨格筋重量を増加させるための方法であって、該方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を該患者に投与する工程を包含し、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する、方法。
【請求項６４】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物における筋組織の成長を促進するための薬物の調製のための、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の使用であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する、使用。
【請求項６８】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号２）のアミノ酸１６２〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、前記ポリペプチド内の少なくとも１つのシステインが、配列番号２に対して欠失または置換されている、タンパク質。
【請求項６９】
ヒトＣｏｃｏ（配列番号５）のアミノ酸１０１〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、前記ポリペプチド内の少なくとも１つのシステインが、配列番号５に対して欠失または置換されている、タンパク質。
【請求項１】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号２）のアミノ酸１６２〜２４１の配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたって、実質的に血清に対して安定である、タンパク質。
【請求項２】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１５６〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項４】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項５】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１４１〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項６】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１１９〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項７】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項８】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸４１〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項９】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項１０】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓのアミノ酸１８〜２６７の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する、タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、ミオスタチンアンタゴニスト活性がＡ２０４細胞ベースのアッセイで評価される、タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＳＨＣＬＰＡＫ内における切断を低減もしくは排除する、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１５】
請求項６〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＭＦＲＫＴＰ内における切断を低減もしくは排除する、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１６】
請求項９〜１０のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓの配列ＮＱＲＥＬＰ内における切断を低減もしくは排除する、配列番号２のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項１７】
ヒトＣｏｃｏ（配列番号５）のアミノ酸１０１〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質は、少なくとも２４時間の期間にわたって、実質的に血清に対して安定である、タンパク質。
【請求項１８】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸１０１〜１８９の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項１９】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２０】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸９５〜１８９の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２１】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２２】
ヒトＣｏｃｏのアミノ酸２２〜１８９の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、３７℃において２４時間のヒト血清への曝露後に、少なくとも５０％のミオスタチンアンタゴニスト活性を保持する、タンパク質。
【請求項２４】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、ミオスタチンアンタゴニスト活性がＡ２０４細胞ベースのアッセイで評価される、タンパク質。
【請求項２５】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、ヒト血清における切断が低減もしくは排除されるような、配列番号５のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項２６】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該タンパク質が、以下のヒトＣｏｃｏの配列：ＰＡＲＫＲＷおよびＳＲＲＲＶＫの一方もしくは両方における切断を低減もしくは排除する、配列番号５のアミノ酸配列に関する改変を含む、タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜１０および１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与, 組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、タンパク質。
【請求項２８】
前記融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む、請求項２７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項２７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３０】
請求項２７に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、前記の該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む、タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜１０および１７〜２２のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である、タンパク質。
【請求項３２】
前記親和性試薬が抗体因子である、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３３】
前記抗体因子が、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖである、請求項３２に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３４】
前記抗体因子が、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項３２に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３５】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチドである、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３６】
前記親和性試薬が、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインである、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３７】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子である、請求項３１に記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれかに記載のミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む薬学的調製物。
【請求項３９】
患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１を阻害するための方法であって、該方法は、請求項１〜３７のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１の阻害が、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によって調節される遺伝子の発現に検出可能な変化を引き起こす、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者において筋重量を増加させるための方法であって、該方法は、請求項１〜３７のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含む、発熱物質を実質的に含まない薬学的調製物であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、以下：
ａ．ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンのうちの１以上に結合し、そして、そのシグナル伝達活性を阻害し；そして
ｂ．ＢＭＰ４には実質的に結合しない、
薬学的調製物。
【請求項４３】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が筋組織の成長を促進する、請求項４２に記載の薬学的調製物。
【請求項４４】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４５】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４６】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、全長の成熟なヒトＣｅｒｂｅｒｕｓタンパク質を含まない、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４７】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強する１つのさらなるポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、請求項４２に記載の調製物。
【請求項４８】
前記融合タンパク質が免疫グロブリン重鎖定常ドメインの一部を含む、請求項４７に記載の調製物。
【請求項４９】
前記融合タンパク質が免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項４７に記載の調製物。
【請求項５０】
前記の該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸および有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の改変アミノ酸残基を含む、請求項４７に記載の調製物。
【請求項５１】
前記ミオスタチンアンタゴニストタンパク質が、第二のミオスタチンインヒビタードメインをさらに含む融合タンパク質であり、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するポリペプチド親和性試薬である、請求項４２に記載の調製物。
【請求項５２】
前記親和性試薬が抗体因子である、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５３】
前記抗体因子が、組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；またはジスルフィド結合したＦｖである、請求項５２に記載の調製物。
【請求項５４】
前記抗体因子が、完全ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである、請求項５２に記載の調製物。
【請求項５５】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合するペプチドもしくは骨組ペプチドである、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５６】
前記親和性試薬が、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４のミオスタチン結合ドメインである、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５７】
前記親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合し、そして、ＡＬＫ７もしくはＡＬＫ４レセプターの結合と競合する小さな有機分子である、請求項５１に記載の調製物。
【請求項５８】
患者においてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１を阻害するための方法であって、該方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を該患者に投与する工程を包含し、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する、方法。
【請求項５９】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
患者におけるミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１の阻害が、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によって調節される遺伝子の発現に検出可能な変化を引き起こす、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
骨格筋重量の増加を必要とする患者において骨格筋重量を増加させるための方法であって、該方法は、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の有効量を該患者に投与する工程を包含し、ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する、方法。
【請求項６４】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ミオスタチン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸１６２〜２４１および配列番号５のアミノ酸１０１〜１８９、またはこれらの任意の天然に存在するヒト対立遺伝子改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ミオスタチンアンタゴニストが実質的にＢＭＰ４に結合しない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物における筋組織の成長を促進するための薬物の調製のための、ＣｅｒｂｅｒｕｓもしくはＣｏｃｏのポリペプチドまたはこれらの改変体のミオスタチン結合ドメインを含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質の使用であって、該ミオスタチンアンタゴニストタンパク質は、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンの１以上に結合し、そのシグナル伝達活性を阻害する、使用。
【請求項６８】
ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号２）のアミノ酸１６２〜２４１の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、前記ポリペプチド内の少なくとも１つのシステインが、配列番号２に対して欠失または置換されている、タンパク質。
【請求項６９】
ヒトＣｏｃｏ（配列番号５）のアミノ酸１０１〜１８５の配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むミオスタチンアンタゴニストタンパク質であって、前記ポリペプチド内の少なくとも１つのシステインが、配列番号５に対して欠失または置換されている、タンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５１２３２６（Ｐ２０１０−５１２３２６Ａ）
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０３２９（Ｐ２００９−５４０３２９）
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２５１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３３５１
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０９１２５４７５）アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２５１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３３５１
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０９１２５４７５）アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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