ＤＮＡコピー数変化を同定するための方法
ゲノムＤＮＡのコピー数における変化を同定する方法が、開示される。ホモ接合性欠失および遺伝子増幅を同定するための方法が、開示される。複数の異なる配列の存在もしくは不在を検出するために設計された、群のプローブが、開示される。上記プローブは、減少した複雑性のサンプルにおいて存在することが予測される配列にハイブリダイズするために設計される。上記方法は、正常組織と比較した癌性組織におけるコピー数変化を検出するのに使用され得る。上記方法は、癌を診断するのに使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年４月３０日に出願された米国仮出願第６０／４６７，１０５号、２００２年１１月１１日に出願された第６０／３１９，６８５号、および２００２年１２月３日に出願された６０／３１９，７５０号の優先権を主張し、それらの開示は、その全体が参考として本明細書中で援用される。
（発明の分野）
本発明は、サンプル中に存在するゲノム領域のコピー数を推定する方法に関する。具体的には、本発明は、生物学的サンプルからの染色体の増幅領域および欠失領域を検出するための方法、コンピュータソフトウェア製品およびシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
正常細胞をガン細胞へと形質転換する遺伝的事象の基礎的進行は、二倍体状態から異数体状態へのシフトによって特徴付けられる（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎら（２００３），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．３６９−７６およびＬｅｎｇａｕｅｒら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９６，ｐｐ．６４３−９）。ゲノムの不安定性の結果として、ガン細胞は、点変異から全染色体異常までの複数のレベルで無作為な変異および原因がある変異を蓄積する。ＤＮＡのコピー数変化としては、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）およびホモ接合性の欠失、これは、腫瘍抑制遺伝子の喪失および遺伝子増幅事象、細胞内の癌原遺伝子の活性化を生じ得るがこれらに限定されない。腫瘍細胞の複雑な核型を解明するための連続したチャレンジの一つが、ＬＯＨの獲得及び喪失のリストを全体的に作成し得る、高い分解能と正確性の両方を有し改善された分子方法の開発である。
【０００３】
多くの分子アプローチが、腫瘍内でのゲノム全体のＬＯＨおよびコピー数変化を同定するために記載されている。腫瘍と血液サンプルのペアを使用して、対立遺伝子の喪失を同定するために設計された古典的なＬＯＨの研究は、制限断片長多型（ＲＥＬＰ）を使用し、多型のマイクロサテライトマーカー（ＳＴＲＳ、ＶＮＴＲ）を使用している。網膜芽細胞腫遺伝子であるＲｂ１のＬＯＨ分析を使用したＫｎｕｄｓｏｎツーヒット腫瘍形成モデルの実施により変異対立遺伝子のコピー数が、生物学的に異なる第二のヒットメカニズムの結果として１コピーから３コピーまで変化し得ることが示された（Ｃａｖｅｎｅｅら（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０５、ｐｐ．７７９〜８４）。従って、ＬＯＨを起こす領域は、必ずしもＤＮＡコピー数の変化を含むわけではない。ゲノム範囲の増加もしくは減少をＤＮＡコピー数において、測定するためのアプローチとしては、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５８，ｐｐ．８１８〜２１），スペクトル核型分析（ＳＫＹ）（Ｓｃｈｒｏｃｋら（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ．４９４〜７），蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｐｉｎｋｅｌら（１９８８），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．９１３８〜４２），ＲＤＡのような分子サブトラクション（Ｌｉｓｉｔｓｙｎら（１９９５），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．１５１〜５．；Ｌｕｃｉｔｏら（１９８８），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５，ｐｐ．４４８７〜９２），およびデジタル核型分析（Ｗａｎｇら（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１６１５６〜６１．）が挙げられる。おそらく最も広範に使用され、強力なアプローチであるＣＧＨは、蛍光色素でそれぞれ標識された正常細胞および腫瘍細胞由来のＤＮＡの混合物を使用する。標的ＤＮＡは、中期の染色体、または配列ＣＧＨにおいて、ｃＤＮＡクローン（Ｐｏｌｌａｃｋら（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１２９６３〜８）、または細菌性の人工染色体（ＢＡＣ）およびＰ１人工染色体（ＰＡＣ）（Ｓｎｉｊｄｅｒｓら（２００１），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２６３〜４，Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．２０７〜１１）に競合的にハイブリダイズされる。しかし、中期の染色体へのハイブリダイゼーションは、１０Ｍｂ〜２０Ｍｂに対する分解能を限定し、わずかな獲得および喪失の検出を不可能にする。整列したｃＤＮＡクローンの使用は、ゲノム内の転写的に活性な領域の解析を可能にする一方で、そのハイブリダイゼーションの反応速度論は、大きなゲノムクローンを使用する場合ほど均一ではないかもしれない。現在、ゲノムにわたるＢＡＣクローンの利用可能性によって、ＣＧＨの分解能は、１Ｍｂ〜２Ｍｂに制限されるが、最近のオリゴヌクレオチドの使用は、１５ｋｂにまで分解能を改善する（Ｌｕｃｉｔｏら（２００３），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．，ｐｐ．）。しかし、ＣＧＨは、一つの対立遺伝子が存在するようなＬＯＨを起こすゲノムの領域の同定には十分には適していないが、コピー数の減少は存在しない。
【０００４】
ヒトゲノムの完了とともに、個人間で最も代表的な配列多様性である１塩基多型（ＳＮＰ）が、その量、安定性ならびに相対的なスコアリングの容易さに起因して、大規模な遺伝的研究におけるマーカーの選択の対象として出現する。これらの同様の特性が、ＳＮＰをＬＯＨ研究についての強力なマーカーにする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、コピー数における変化を検出し、コピー数を評価するための核酸アレイからの分析に適切な方法、システムおよびコンピュータソフトウェア製品を提供する。例えば、プローブアレイは、個人のＳＮＰの遺伝子型を決定するために複数のＳＮＰの各々に対して複数のプローブを使用する遺伝子型決定アレイであり得るか、あるいはゲノムまたはゲノムの位置、例えば、全染色体にわたって１００塩基ごとの同じ距離で間隔をあけられるプローブのアレイであり得る。
【０００６】
一つの実施形態において、実験サンプル中のゲノムの増幅領域および欠失領域を同定する方法が、開示される。そのサンプルは、実験サンプル由来の核酸を単離する工程、核酸の少なくともいくつかの領域を増幅する工程；増幅産物を標識する工程によって調製される。標識増幅産物が、遺伝子型決定アレイにハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーションパターンを得る。その遺伝子型決定アレイは、複数のＳＮＰについての複数の遺伝子型決定プローブセットを含む。プローブセットは、ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、ＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、およびＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、を含む。ハイブリダイゼーションパターンは、実験サンプルにおけるＳＮＰについての測定値を得るために使用される。測定値Ｓは、ハイブリダイゼーションパターンにおけるＳＮＰについての完全一致プローブの強度の算術平均の対数である。Ｓ値は、遺伝子型呼出しにおける実験サンプルに一致する複数の参照サンプルの各々におけるＳＮＰについてもまた計算される。参照サンプルについての平均および標準偏差は、Ｓ値において得られた値を使用して計算され、対数強度差は、参照サンプルおよび実験サンプルについての平均値を減算することで計算される。ＳＮＰを含む領域のコピー数は、対数−対数直線モデルにおいて、参照サンプルにおけるＳＮＰについての平均値と実験サンプルにおけるＳＮＰについてのＳ値との間の差を使用することにより推定される。
【０００７】
一つの実施形態において、実験サンプルおよび各参照サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰについてのＳ値は、サンプルにおける全ての常染色体のＳＮＰについての平均が０であり、そしてその分散が１であるように正規化される。
【０００８】
別の実施形態においてｐ値は、推定したコピー数変化について推定され、そのｐ値が、ｐ値における閾値より小さい場合、コピー数変化の評価した方向は有意である。
【０００９】
好ましい実施形態において、Ｓ値は、
【００１０】
【数２８】
を使用して推定される。
ここにおいて、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であって、Ｘはある組おける完全一致プローブの数である。Ｓを計算するために使用される完全一致プローブの数は、１と３０の間であり得る。好ましい実施形態において、２０ＰＭプローブが、使用される。
【００１１】
一つの実施形態においてコピー数は、
【００１２】
【数２９】
を使用して推定され、ここで、
【００１３】
【数３０】
は、実験サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰのＳ値に対し正規化された、実験サンプルｃ中の遺伝子型ｇのＳＮＰｊについての完全一致プローブの強度平均の対数であって、
【００１４】
【数３１】
は、ＳＮＰｊでの遺伝子型ｇの複数の参照サンプル中のＳＮＰｊについて正規化されたＳ値の平均である。
【００１５】
別の実施形態において、ｐ値は、
【００１６】
【数３２】
を使用して推定されるコピー数変化の方向について計算される。得られたｐ値は、評価の方向が有意であるか否かを決定するのに使用される。
【００１７】
実験サンプルは、腫瘍、腫瘍細胞および正常細胞の混合物もしくは疾患を有すると推測される供給源由来であり得る非ガン細胞由来であり得る。
【００１８】
別の実施形態においてコピー数は、
【００１９】
【数３３】
を使用して評価され、ここで、
【００２０】
【数３４】
は、実験サンプルにおける遺伝子型決定された全てのＳＮＰのＳ値に対して正規化された、実験サンプルｃ中の遺伝子型ｇのＳＮＰｊについての完全一致プローブの強度の平均の対数であって、
【００２１】
【数３５】
は、ＳＮＰｊでの遺伝子型ｇの複数の参照サンプル中のＳＮＰｊについての正規化されたＳ値の平均であり、ｂは、ｙ切片であり、そしてｍは、既知のコピー数のＳＮＰに起因した強度値をプロットすることにより規定された直線の傾きである。一つの実施形態において、その直線は、異なる数のＸ染色体上の変化した数を有するコントロールサンプルを使用してＸ染色体上のそのＳＮＰからの強度値をプロットすることにより定義される。
【００２２】
別の実施形態においてコピー数の第二の推定は、参照サンプルに一致する複数の遺伝子型におけるそのＳＮＰからの平均ＤＲと実験サンプル中の、ＳＮＰの判別比であるＤＲとを比較することで得られ、ここにおいて、２０ＰＭ／ＭＭプローブ対を有するプローブセットについてのＤＲは、
【００２３】
【数３６】
を使用して計算される。
【００２４】
別の実施形態において、Ｓ値の平均よりも３標準偏差上で得られる各Ｓ値は、参照サンプルの平均および分散の推定から除外される。
【００２５】
別の実施形態において、少なくとも一つのヘテロ接合性を喪失する領域は以下の工程によって実験サンプル中で同定される：実験サンプルの遺伝子型におけるホモ接合性のＳＮＰの遺伝子型呼出しの少なくとも一つの連続した配列を同定する工程；連続した広がりにおける各ＳＮＰについてのホモ接合性の確率
【００２６】
【数３７】
を得る工程であって、ここで
【００２７】
【数３８】
である工程；
連続した配列におけるＳＮＰの各々がホモ接合性である確率を、
【００２８】
【数３９】
を使用することにより、計算する工程；および、
【００２９】
【数４０】
がｐ値における閾値より小さい場合、ヘテロ接合性を喪失する領域としてＳＮＰを含む領域を同定する工程。例えば、連続した配列におけるＳＮＰの数は、１０〜１００である。
【００３０】
別の実施形態において、コピー数が、
【００３１】
【数４１】
を使用して実験サンプルにおいて同定された領域内の少なくとも一つのＳＮＰについてのＳ値を計算することによりヘテロ接合性を喪失する領域として同定される領域について推定され、ここで、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であって、Ｘは、ある組におけるプローブ対の数であり、Ｓ値を正規化し；
正規化されたＳ値は、複数の一致した遺伝子型呼出しの参照サンプル由来の少なくとも一つのＳＮＰについて計算され、参照サンプルの正規化されたＳ値の平均は、ＳＮＰについて計算される。実験サンプルにおけるＳＮＰについての正規化されたＳ値は、参照サンプルにおけるＳＮＰについての正規化されたＳ値の平均と比較され、比を得る；実験サンプルにおけるＳＮＰのコピー数は、対数−対数直線モデルを使用して推定される。これは、サンプルにおける２つ以上のＳＮＰについてなされ得、ｐ値が、計算され得る。
【００３２】
別の実施形態において、二つ以上の連続したＳＮＰのコピー数の推定が、複数の以下により、その有意性について評価される；参照サンプルに対して、全てがコピー数の減少を示すか、または全てがコピー数増加を示すかのいずれかである二つ以上のＳＮＰの配列を同定する工程；
【００３３】
【数４２】
を計算する工程；
標準的なφ関数を使用して
【００３４】
【数４３】
を確率へと転換してｐ値を得る工程；および、
その推定値が、ｐ値の閾値を使用して有意であることを結論づける工程
別の実施形態において、一つ以上のヘテロ接合性を喪失する領域が、
上記実験サンプル由来の標的配列の収集物を増幅する以下の工程によって、実験サンプルで検出される；
増幅した標的配列を、設計されたプローブのアレイにハイブリダイズし、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによって標的配列の集合中の多型の集合を取り出し、実験サンプル由来のハイブリダイゼーションパターンを生じさせる工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションパターンは、複数のＳＮＰについての完全一致プローブおよびミスマッチプローブの強度測定を含む工程。実験サンプルにおける各ＳＮＰにおいての完全一致プローブの平均ハイブリダイゼーション強度が、計算され、アレイ上の全てのＳＮＰの平均ハイブリダイゼーション強度が、正規化される。アレイ上の各ＳＮＰについてのＳＮＰの判別比が、計算される。実験サンプルからの個別のＳＮＰの判別比およびハイブリダイゼーション強度が、複数の参照サンプルからの個別のＳＮＰについてのＳＮＰの判別比の平均ならびにハイブリダイゼーション強度である、ＳＮＰ判別比およびハイブリダイゼーション強度と比較され、ここで参照サンプル内での可変性が考慮され、実験サンプルにおけるＤＮＡコピー数変化を有する領域が、同定される。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
（（Ａ）概論）
本発明は、多くの好ましい実施形態を有し、当業者に公知の詳細について多くの特許、特許出願および他の参考文献に依存する。それゆえに、特許、特許出願もしくは他の参考文献が引用されるか、または下で繰り返される場合、それが、全ての目的のために、そして記載される主張のために、その全体が参考として援用されると理解されるべきである。
【００３６】
本出願で使用されるように、単数形式、「ａ」、「ａｎ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈に、他で明確な指示がない場合、複数の参照を含む。例えば、用語「薬剤」は、複数の薬剤（その混合物を含む）を含む。
【００３７】
個体は、ヒトに限定されないが、哺乳類、植物、細菌、もしくは上記のいずれかに由来する細胞を含むがこれに限定されないことを含む他の生物であり得る。
【００３８】
本開示を通して、本発明の種々の局面は、範囲を用いた形式において示され得る。範囲を用いた記載は、単に便利さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲について柔軟性のない限定として解釈されるべきでないと理解されるべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内で、可能な限りの全ての部分的な範囲および全ての個々の数値を具体的に開示するとして考慮されるべきである。例えば、１〜６といった範囲の記載は、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的な範囲、ならびに１、２、３、４、５および６というその範囲内での個別の数を具体的に開示すると考慮されるべきである。このことは範囲の広さにかかわらず適用される。その対数の関数に関する全ての参照は、他に規定されない場合（ｌｏｇ１０）、底としてｅ（自然対数）を採用する。
【００３９】
本発明の実施は、他に指示されない場合、当該分野の技術の範囲内である有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、生物化学および免疫学の通常の技術、および記載を使用し得る。そのような通常の技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の詳細な例示は、本明細書中で下記の実施例を参照してなされ得る。しかし、当然、他の等価な通常の手順もまた使用され得る。そのような通常の技術ならびに記載は、標準的な研究所のマニュアルに見出され得る。（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより），Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」 １９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹおよびＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、その全ては、本明細書中で、全ての目的のための参考として、その全体が援用される）。
【００４０】
本発明は、いくつかの好ましい実施形態におけるアレイを含む、固体の基材を使用し得る。（タンパク質を含む）ポリマーアレイ合成に適用可能な方法および技術は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、ＷＯ公開番号００／５８５１６号、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号および同第６，４２８，７５２号中、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０号（国際公開番号ＷＯ９９/３６７６０）および第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５号中に記載され、これらは全て本明細書中で、全ての目的のためにその全体が、参考としてその全体が援用される。
【００４１】
特定の実施形態における合成技術を説明する特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号、および同第５，９５９，０９８号が挙げられる。核酸配列は、上記特許の多くに記載されるが、同様の技術がポリペプチド配列に適用される。
【００４２】
本発明で有用である核酸アレイは、商標名ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から市販されるアレイが挙げられる。例示的なアレイは、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍでウェブサイト上に示される。
【００４３】
本発明はまた、固体基材に結合するポリマーについての多くの使用を意図する。これらの用途としては、遺伝子発現のモニタリング、プロファイリング、ライブラリスクリーニング、遺伝子型の決定ならびに診断が挙げられる。遺伝子発現のモニタリング法、およびプロファイリング法は、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，０１３，４４９号、同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１３８号、同第６，１７７，２４８号および同第６，３０９，８２２号で示され得る。従って、遺伝子型決定および使用は、米国特許出願同第６０／３１９，２５３号、同第１０／０１３，５９８号並びに米国特許第５，８５６，０９２号、同第６，３００，０６３号、同第５，８５８，６５９号、同第６，２８４，４６０号、同第６，３６１，９４７号、同第６，３６８，７９９号および同第６，３３３，１７９号で示される。他の用途は、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，９０２，７２３号、同第６，０４５，９９６号、同第５，５４１，０６１号および６，１９７，５０６号で具体化される。
【００４４】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるサンプルの調製方法を意図している。遺伝子型決定より前にまたはそれと同時に、遺伝子サンプルは、種々の機構によって増幅され得、そのいくつかはＰＣＲを使用し得る。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １，１７（１９９１）；ＰＣＲ（Ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号および同第５，３３３，６７５号を参照のこと。その各々は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中で援用される。サンプルは、アレイ上で増幅され得る。例えば、参考として援用される、米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願第０９／５１３，３００号、を参照のこと。
【００４５】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０）），転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ９０／０６９９５），標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号），相同配列プライマーＰＣＲ（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意配列プライマーＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号）および核酸に基づく配列の増幅（ＮＡＢＳＡ）が、挙げられる（米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号および同第６，０６３，６０３号を参照のこと。その各々は、本明細書中に参考として援用される）。使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号および米国特許出願第０９／８５４，３１７号に記載され、その各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００４６】
サンプル調製のさらなる方法（Ｄｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１））ならびに核サンプルの複雑性を減少させるための技術は、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号および米国特許出願第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号および同第１０／０１３，５９８号における、に記載される。
【００４７】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実行するための方法は、当該分野において十分に開発されしている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順ならびに条件は、適用によって変化し、Ｍａｎｉａｔｉｓら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８７）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）で言及されるような方法を含む、公知の一般的な結合方法に従って選択される。反復され、制御されたハイブリダイゼーション反応を実行するための方法ならびに装置が、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号に記載され、その各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００４８】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるリガンド間のハイブリダイゼーション信号の検出を考慮する。米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８３４，７５８号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（ＷＯ９９／４７９６４号として公開中の）を参照のこと。その各々はまた、全ての目的のためにその全体が、参考として本明細書中に援用される。
【００４９】
信号の検出および強度データの処理のための方法および装置が、例えば米国特許番号第５，１４３，８５４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８００，９９２号、同第５，８３４，７５８号、同第５，８５６，０９２号、同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号；および米国特許出願第６０／３６４，７３１号、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（ＷＯ９９／４７９６４号として公開）中に開示される。その各々はまた、全ての目的のためにその全体が、参考として本明細書中に援用される。
【００５０】
本発明の実施は、通常の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムを使用し得る。本発明のコンピュータソフトウェア製品は、通常、本発明の方法の論理的工程を実行するためのコンピュータが実行可能な命令を有するコンピュータの読出し可能な媒体を含む。適切なコンピュータの読出し可能媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。コンピュータが実行可能な命令は、適切なコンピュータ言語もしくは、複数の言語の組み合せにおいて記述され得る。基本的なコンピュータ生物学の方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ，（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）およびＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，２００１）に記載される。
【００５１】
本発明は、また、種々のコンピュータプログラム製品ならびにプローブの設計、データの管理、解析および機器の操作といった種々の目的のためのソフトウェアを利用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号を参照のこと。
【００５２】
さらに、本発明は、米国特許出願第１０／０６３，５５９号、同第６０／３４９，５４６号、同第６０／３７６，００３号、同第６０／３９４，５７４号、同第６０／４０３，３８１号において示されるように、インターネットのようなネットワークを介して遺伝的情報を提供するための方法を包含する好ましい実施形態を有し得る。
【００５３】
本発明は、米国特許出願第１０／２６４，９４５および米国の特許仮出願第６０／４１７，１９０号および同第６０／３１９，６８５号に関し、それらは、全ての目的のためにその全体が、参考として本明細書中に援用される。
（（Ｂ）定義）
本発明に従って、核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基（好ましくは、シトシン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニン）、任意のポリマー、またはオリゴマーをそれぞれ含み得る（Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９３〜８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）を参照のこと。この文献は、全ての目的のためにその全体が本明細書中で援用される）。実際に、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸成分、および任意の化学的改変体にこれらの塩基のメチル化様式、ヒドロメチル化様式またはグリコシル化様式などを意図する。ポリマーまたはオリゴマーは、組成において異質または同質であり得、および天然に発生する供給源から単離され得るか、もしくは人工的または合成的に生産され得る。さらに、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡもしくはその混合物であり得、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖およびそのハイブリッド状態を含む、シングルストランドもしくはダブルストラランド形態において、永久にまたは一過性に存在し得る。
【００５４】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、その長さにおいて少なくとも２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド，１５ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドの範囲にある核酸であるが、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチドもしくは５０００ヌクレオチド長までであり得るか、またはポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする化合物である。本発明のポリヌクレオチドとしては、天然の供給源から単離され得るか、組換え産生され得るか、または人工的に合成され得る、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列、またはその模倣物が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る（米国特許第６，１５６，５０１号を参照のこと。これは本明細書中に参考としてその全体が援用される）。本発明はまた、特定のｔＲＮＡ分子において同定され、三重へリックス中に存在すると仮定されるＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対のような伝統的でない塩基対が存在するような状態を包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本出願において、互換可能で使用される。
【００５５】
用語、フラグメントとは、より大きなＤＮＡポリヌクレオチドの一部またはＤＮＡをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、複数のフラグメントにバラバラにされ得るか、または断片化され得る。核酸を断片化する様々な方法は、当該分野において周知である。例えば、これらの方法は、本質的に、化学的または物理学的のどちらかであり得る。化学的断片化としては、ＤＮａｓｅによる部分的な分解；酸による部分的脱プリン化；制限酵素の使用；イントロンにコードされエンドヌクレアーゼ；核酸分子における特定の位置に対して切断薬剤を局在化するための核酸断片の特異的ハイブリダイゼーションに依存した、三重鎖形成法やハイブリッド形成法のようなＤＮＡ塩基切断方法；あるいはＤＮＡを既知または未知の位置で切断する他の酵素もしくは化合物、が挙げられ得る。物理学的断片化方法としては、ＤＮＡを高切断率に供する工程をが挙げられ得る。例えば、高切断率は、窪みやスパイクを有するチャンバーまたはチャネルを通してＤＮＡを移動する工程あるいは、例えばマイクロもしくはマイクロ未満のスケールでの断面積とを有する開口部のような、制限されたサイズの流動通過を通すように、ＤＮＡサンプルに力を加える工程によって実現され得る。他の物理学的な方法は、超音波処理および噴霧が挙げられる。熱およびイオン媒介加水分解による断片化のような物理学的に、片化方法および化学的断片化方法の組み合わせが、同様に使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」３ｒｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）（「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」）を参照のこと（全ての目的のために本明細書中にその全体が参考として援用される）。これらの方法は、核酸を選択されるサイズの範囲のフラグメントに消化するのに最適化され得る。有用なサイズ範囲は、１００塩基対，２００塩基対，４００塩基対、７００塩基対または１０００塩基対から、５００塩基対，８００塩基対，１５００塩基対，２０００塩基対，４０００塩基対または１０，０００塩基対であり得る。しかし、４０００塩基対、１０，０００塩基対または２０，０００塩基対から、１０，０００塩基対、２０，０００塩基対または５００，０００塩基対のようなより大きなサイズの範囲もまた、有用であり得る。
【００５６】
アダプター配列またはアダプターは、一般的に、少なくとも５、１０、または１５塩基長、好ましくは５０または６０塩基長以下のオリゴヌクレオチドであるが、それらは１００または２００塩基まで、より長くなり得る。アダプター配列は、当業者に公知の任意の方法を使用して合成され得る。本発明の目的のために、これらは、ＰＣＲのプライマーのためのテンプレート、制限酵素サイトおよびプロモーターを必要に応じて含み得る。アダプターは、全体的にまたは実質的にダブルストランドであり得る。アダプターは、一方の差においてか、または両方の差において、リン酸化されていても、されていなくても良い。アダプターは、それらが実質的に二本鎖領域、および制限酵素で消化されることにより作成される一本鎖領域に対して相補的である短い一本酸領域領域を含む場合、本発明の一つの実施形態において特に有用である。例えば、ＤＮＡが、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化され、生じた二本鎖フラグメントが、一本鎖化突出５’−ＡＡＴＴ−３’とどちらかの末端で隣接する場合、一本鎖突出５’−ＡＡＴＴ−３’を有するアダプターが、突出領域の間の相補性を介してフラグメントとハイブリダイズする。フラグメントへのアダプターの「粘着末端」ハイブリダイゼーションは、フラグメントに対するアダプターの連結を容易にし得るが、平滑末端ライゲーションもまた可能である。
【００５７】
「ゲノム」は、生物体のＤＮＡとしてコードされる、生物体についての遺伝的命令の、完全な、１コピーのセットを示すか、または意味する。ゲノムは、ＤＮＡが複数の個別の染色体中で、細胞内に分配されるような複数の染色体であり得る。例えば、ヒトにおいて、性別関連のＸＸ対またはＸＹ対に加え、２２対の染色体がある。
【００５８】
用語「染色体」は、クロマチン由来であり、ＤＮＡおよびタンパク質成分（特にヒストン）を含む生細胞の遺伝を保持する遺伝子のキャリアをいう。従来の国際的に認識された個人のヒトゲノム染色体の番号付けが、本明細書中で使用される。個々の染色体のサイズは、ある種類と所与の複数の染色体ゲノムを有する別の種類との間で、およびあるゲノムと別のゲノムとの間で変化する。ヒトゲノムの場合に、所与の染色体の全体のＤＮＡ量は、通常、約１００，０００，０００ｂｐより大きい。例えば、ヒトゲノム全体のサイズは、約３×１０９ｂｐである。最大の染色体である第１番染色体は、約２．４×１０８ｂｐを含む一方、最少の染色体である第２２番染色体は、約５．３×１０７ｂｐを含む。
【００５９】
「染色体領域」は、染色体の一部である。実際の物理学的サイズまたは任意の個々の染色体領域の範囲は、大きく変化し得る。用語「領域」は、領域が、個々の遺伝子の特定のコード断片（エキソン）を特に考慮に入れる必要がないことから、特定の一つ以上の遺伝子を必ずしも決定するわけではない。
【００６０】
用語サブセットまたは代表的なサブセットとは、ゲノムの画分をいう。サブセットは、ゲノムの０．１、１、３、５、１０、２５、５０または７５％であり得る。サブセットへのフラグメントの分配は、個々のフラグメントの物理学的特性の多様性に従ってなされ得る。例えば、フラグメントは、サイズに従って、フラグメントの終点での制限部位の特定の組み合わせに従ってか、または一つ以上の特定の配列の存在もしくは不在に基づいてサブセットへと分割され得る。
【００６１】
「アレイ」は、支持体と付着される核酸のプローブを有する支持体、好ましくは固体を包含する。好ましいアレイは、典型的に、それぞれの既知の位置において機材の表面と結合する複数の異なる核酸プローブを含む。「マイクロアレイ」もしくは、口語的に「チップ」として記載されるこれらのアレイは、一般的に当該分野において、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，４４５，９３４号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、同第５，８００，９９２号、同第６，０４０，１９３号、同第５，４２４，１８６号およびＦｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）に記載される。その各々は、全ての目的のために参考としてその全体が援用される。
【００６２】
アレイは、一般的に機械的な合成方法または写真平板法および固相合成法の組み合せを組み込む光指向性の合成法といった様々な技術を使用して製造され得る。機械的な合成法を使用したこれらの配列の合成のための技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号もしくは同第６，０４０，１９３号において記載され、これらは、全ての目的のためにその全体が、本明細書中で参考文献として援用される。平面アレイの表面が好ましいが、アレイは、実質的に任意の形状の表面上においてか、または多数の表面上においてさえも作成される。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマーの表面、光ファイバのような線維、ガラスもしくは任意の他の適切な基材上の核酸であり得る（米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、同第５，８００，９９２号を参照のこと、それらは全ての目的のための本明細書中でその全てが参考として援用される）。
【００６３】
アレイは、診断使用を考慮するような様式において包装され得るか、または全てを含む様式であり得る；例えば、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号、それらは全ての目的のために本明細書中でその全てが、参考として援用される。
【００６４】
好ましいアレイが、商標ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）のもとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘより市販され、種々の真核生物種および原核生物種のための遺伝子型の決定および遺伝子発現の観察を包含する種々の目的に向けられる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａおよびａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍでのそれらのウェブサイトを参照のこと）。
【００６５】
ハイブリダイゼーションプローブは、核酸の相補的な鎖に対し塩基特異的な様式における結合の可能なオリゴヌクレオチドである。そのようなプローブとしては、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載されるようなペプチド核酸、および他の核酸アナログおよび核酸の模倣物が挙げられる。１９９６年４月３日に出願された米国特許出願第０８／６３０，４２７号を参照のこと。
【００６６】
例えば、ハイブリダイゼーションは、通常、緊縮条件下、１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で実行される。例えば、５Ｘ ＳＳＰＥの条件（７５０ｍＭ 塩化ナトリウム，５０ｍＭ 燐酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ７．４）および２５℃〜３０℃の温度が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションについて適切である。例えば、緊縮条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈｅおよびＭａｎｉａｔｉｓ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。それらは上記の全ての目的のために本明細書中でその全てが、参考として援用される。
【００６７】
対立遺伝子とは、細胞内の、個体内のまたは集団内の（遺伝子といった）遺伝的配列（例えば、遺伝子）のある特定の形態、少なくとも一つの配列における同じ遺伝子の他の形態と異なるある特定の形態および頻繁には、一つよりも多くの遺伝子配列内の変異部位をいう。種々の対立遺伝子間で異なるこれらの変異部位の配列は、「多様性」、「多型」または「変異体」と呼ばれる。各常染色体の特定の染色体位置もしくは「座」で、個体は、一つの片親から遺伝した一つ、ならびにもう１人の親から遺伝した一つ、（例えば、母親からの一つおよび父親からの一つ）といった二つの対立遺伝子を保有する。ある座において２つの異なる対立遺伝子を有する場合、個体は、その座において「ヘテロ接合性」である。ある座において二つの同じ対立遺伝子を有する場合、個体は、その座において「ホモ接合性」である。
【００６８】
多型とは、集団における二つ以上の遺伝的に決定された代替的な配列もしくは対立遺伝子の出現をいう。多型のマーカーまたは部位は、分岐が起こる座である。好ましいマーカーは、少なくとも二つの対立遺伝子を有し、それぞれ、好ましくは１％より大きい頻度で、そしてより好ましくは選択した集団の１０％もしくは２０％より大きい頻度で起こる。多型は、ひとつ以上の塩基の変化、挿入、繰り返しまたは欠失を含み得る。多型の座は、一つの塩基対と同程度に小さくなり得る。多型のマーカーは、制限フラグメント長多型、多様な数の縦列反復配列（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純な配列の反復、およびＡｌｕのような挿入要素が挙げられる。第一の同定された対立遺伝子の形態は、参照の形態として任意に指定され、対立遺伝子形態は、代替的な対立遺伝子または改変対立遺伝子として命令される。選択された集合において最も頻繁に起こる他の対立遺伝子の形態は、時折、野生型形態として言及される。二倍体組織体は、対立遺伝子の形態についてホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。二つの対立遺伝子の多型は二つの形態を有する。三つの対立遺伝子の多型は、三つの形態を有する。二つの核酸の間の多型は、天然に起こり得るか、あるいは化学物質、酵素もしくは他の薬剤に曝露、もしくは接触することによって、あるいは核酸に対してダメージを生じる薬剤、例えば、紫外線照射、突然変異誘発物質、発癌物質に曝露することにより生じ得る。
【００６９】
用語、遺伝子型決定は、ゲノムにおける一つ以上の位置における個体が保有する遺伝情報の決定をいう。例えば、遺伝子型決定は、一つのＳＮＰについて個体が保有する対立遺伝子の決定または複数のＳＮＰについて個体が保有する対立遺伝子の決定を含む。例えば、ゲノムにおける特定のヌクレオチドは、いくつかの個体においてＡもであり、他の個体においてＣであり得る。その位置でＡを有する個体は、Ａ対立遺伝子を有し、Ｃを有する個体は、Ｃ対立遺伝子を有する。二倍体生物において、固体は、その個体がＡ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子、もしくは代わりに２コピーのＡ対立遺伝子のまたは２コピーのＣ対立遺伝子を有するように、多型位置を含む２コピーの配列を有する。２コピーのＣ対立遺伝子を有する個体は、Ｃ対立遺伝子においてホモ接合性であり、２コピーのＡ対立遺伝子を有する個体は、Ｃ対立遺伝子についてホモ接合性であり、１コピーの各対立遺伝子を有する個体は、ヘテロ接合性である。配列は、３つのあり得る結果の各々の間で識別するように設計され得る。多型位置は、二つ以上の可能な対立遺伝子を有し得、そのアレイは、全ての可能な組み合わせを区別するよう設計される。
【００７０】
連鎖不均衡もしくは対立遺伝子の関連とは、集合において何らかの特定の対立遺伝子の頻度についての偶然、期待されるよりも高い頻度で付近の染色体の位置での、特定の対立遺伝子もしくは遺伝的マーカーと、特定の対立遺伝子もしくは遺伝的マーカーとが優先的に関連することを意味する。例えば、座Ｘが、同じ頻度で起こる対立遺伝子ａおよびｂを有し、連鎖した座Ｙが、同じ頻度で起こる対立遺伝子ｃおよびｄを有する場合、組み合せａｃが、頻度０．２５で起こることが予期される。ａｃがより頻繁に起こる場合、対立遺伝子ａおよびｃは、連鎖不均衡である。例えば、連鎖不均衡は、それらの領域が物理的に近いので、もしくは対立遺伝子が連鎖した対立遺伝子と平衡状態に達するには新しく集団に導入されたので、対立遺伝子の特定の組み合わせの天然の選択により生じる。連鎖の不均衡に置けるマーカーは、そのマーカーが疾患を生じないにもかかわらずその疾患（または他の表現型）に対する感受性を検出するのに特に有効であり得る。例えば、それ自体は、疾患の原因要素ではないが、表現型の原因要素である遺伝子（Ｙ）（調節配列を含む）と連鎖不均衡である、マーカー（Ｘ）は、遺伝子Ｙが同定されていないかもしれないか、または容易には検出できないかもしれない状況でその疾患に対する感受性を示すために検出され得る。
【００７１】
一つ以上の座でヘテロ接合性である正常細胞は、その座でホモ接合性である腫瘍細胞を生じ得る。このヘテロ接合性の喪失は、正常遺伝子の構造欠失、または正常遺伝子を有する正常細胞の欠失、正常遺伝子と変異遺伝子の間の有糸分裂組み換えとその後の欠失または不活性化（変異）遺伝子についてホモ接合性である娘細胞の形成から生じえるか；あるいは正常遺伝子を有する染色体の喪失、および欠失もしくは不活性化された（変異）遺伝子を有する染色体の重複から生じる。
【００７２】
ホモ接合性の欠失は、遺伝子またはゲノム領域の両方のコピーの欠失である。２倍体生物は、２コピーの各常染色体を一般的に有し、従って、２コピーの任意の選択されたゲノム領域の二つのコピーを有する。ゲノム領域の両方のコピーが、存在しない場合、その細胞またはサンプルは、その領域のホモ接合性の欠失を有する。同様に、ヘミ接合性の欠失は、遺伝子またはゲノム領域の一つのコピーの欠失である。
【００７３】
遺伝的再配列は、ＤＮＡの複製においてエラーが起こる場合におこり、クロスオーバーが、ある染色体の位置から別の位置へ移動する遺伝的物質を生じる非相同性領域の間で起こる。再配列は、その再配列付近でその遺伝子の変化した発現を生じ得る。
【００７４】
異数体は、染色体の構成が真の二倍体から変化している細胞（例えば、染色体もしくは染色体領域の余分なコピー）であるような細胞である。
【００７５】
個体は、ヒトに限定されないが、他の生物（哺乳動物、植物、細菌もしくは上のどれかに由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない）もまた包含する。
【００７６】
全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）は、サンプルにおけるフラグメントのサブセットを増幅することにより核酸サンプルの複雑性を減少する。核酸サンプルは、一つ以上の制限酵素によって断片化され、アダプターは、それらのフラグメントの両末端と接続される。結合配列と相補的であるプライマーは、ＰＣＲを使用してそれらのフラグメントを増幅するのに使用される。ＰＣＲの間、選択されるサイズ範囲のフラグメントが、選択的に増幅される。そのサイズの範囲は、例えば、４００塩基対〜８００塩基対もしくは４００塩基対〜２０００塩基対であり得る。選択されるサイズの範囲外であるフラグメントは、効率的に増幅されない。
【００７７】
ＷＧＳＡにより増幅されるフラグメントは、インシリコ消化によって予測され得、アレイが、増幅されると予測されるＳＮＰを遺伝子型決定するように設計され得る。遺伝子型決定は、ＳＮＰの個別の対立遺伝子に対し完全に相補的であるプローブを使用した対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによってなされ得る。各ＳＮＰを囲む領域に対し相補的であるプローブのセットが、そのアレイ上に存在し得る。完全一致プローブは、そのプローブの全長にわたって標的に対し相補的である。ミスマッチプローブは、一つのミスマッチ塩基以外で、ＰＭプローブと、同一である。そのミスマッチの位置は、一般的には、中央の位置であり、そのため２５塩基のプローブについては、ミスマッチが１３位である。
【００７８】
上記方法は、他のゲノム解析方法および複雑性を減少する方法と組み合わされ得る。例えば、複雑度を減少する他の方法としては、例えば、ＡＦＬＰ（米国特許第６，０４５，９９４号（これらは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。任意配列プライマーＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）(ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄおよびＷｅｌｓｈ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９９５）Ｃ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，例えば、ｐ２０３，これらは、本明細書中で参考としてその全てが援用される）が挙げられる。サンプル調製のさらなる方法および核サンプルの複雑度の減少のための技術は、Ｄｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１），米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号、同第６，４５８，５３０号および米国特許出願第２００３００３９０６９号、同第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号、同第１０／２６４，９４５号に記載され、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。
【００７９】
多型を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３−１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ， ＥＰ ２３５，７２６，Ｓａｉｋｉ，および ＷＯ ８９／１１５４８によって記載される。対立遺伝子特異的プローブは、一つの個体由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体に由来する対応するセグメントには、その二つの個体由来のそれぞれのセグメントにおける異なる多型の形態の存在に起因してハイブリダイズしないように設計され得る。ハイブリダイゼーションの条件は、対立遺伝子の間でハイブリダイゼーション強度における有意差が存在するように、十分に厳密であるべきであり、好ましくは本質的に応答であり、それによってプローブは、それらの対立遺伝子の一つのみにハイブリダイズする。
【００８０】
（（Ｃ）コピー数における変化の検出）
ＤＮＡのコピー数における変化のような遺伝的不安定性は、多くのヒトの癌の１つである。高密度のＤＮＡアレイ技術は、腫瘍細胞におけるゲノム変異（最も著しくは）ＬＯＨの同定に対して適用される（Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ，ら（２０００），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１００１−５，Ｍｅｉ，Ｒ．，ら（２０００），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１１２６−３７，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ら（２００２），Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，Ｖｏｌ．１６０，ｐｐ．７３−９，およびＤｕｍｕｒら（２００３），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．２６０−９）。ＬＯＨならびにゲノムの増幅および欠失の検出のために高密度アレイを使用するための方法が、開示される。多くの実施形態において、高密度アレイは、遺伝子型決定アレイである。しかし、他のプローブのアレイ、例えば、ヒトゲノムの異なる領域に対して相補的なプローブのアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａから入手可能なＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０が使用され得る。一般的に、上記方法は、完全一致プローブに対する核酸のハイブリダイゼーション強度を比較し、より高い強度を、より高いコピー数と相関付ける。対数強度と対数コピー数の間の関係は、およそ直線にあることが見出された。既知のコピー数のコントロールサンプルを使用して、その直線の傾きおよびｙ切片が推定され得る。
【００８１】
並列に多型の遺伝子型決定する方法が、複数の染色体にわたってＤＮＡの獲得及び喪失を同定するために使用され得る。予測可能な接式でゲノムサンプルの複雑性を減少する方法が、生じる複雑性が減少したゲノムサンプルにおける多型を調べるために設計された一群のプローブ配列と組み合わせて使用され得る。米国特許出願第１０／２６４，９４５号で開示されるような方法が、遺伝子型を検出するために使用され得、その遺伝子型情報が、ホモ接合性欠失領域または遺伝子増幅領域を同定するのに使用され得る。一つのプライマーが、ゲノムの代表的な部分を増幅した後に、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖由来の完全一致（ＰＭ）プローブまたはミスマッチ（ＭＭ）プローブ、を含む高密度のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションを介してＳＮＰ遺伝子型決定するＳＮＰにされるのに使用され得る。例えば、対となるＰＭコピー強度値とＭＭ強度値との間の判別比を使用するアルゴリズムが、ホモ接合性欠失の領域を同定するのに使用され得るか、または中央値ＰＭ強度が、遺伝子増幅領域を同定するのに使用され得る。チップ強度の正規化の後、実験サンプルに由来するＳＮＰ判別比およびＰＭ強度は、正常個体を含む参照セットに由来する分布と比較され得る。一つの実施形態において、そのサンプルセットは、１００個体，４００個体，５００個体または１０００個体より多を含み、ＤＮＡコピー数変化を有する統計学的に有意な領域が同定されるのを可能にする。
【００８２】
さらに、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）を示す統計学的に有意なゲノムの間隔は、既知の対立遺伝子の頻度に基づいてホモ接合性マーカーの連続する広がりの確率を計算することにより同定され得る。そのＳＮＰは、使用されるアレイ上で遺伝子型決定されるＳＮＰであり、遺伝子型決定されない、遺伝子型決定済みのＳＮＰの間でＳＮＰが存在し得る。対立遺伝子の頻度が、例えば、参照サンプルセットを遺伝子型決定することにより、ｄｂＳＮＰといった公に利用可能なデータベースから、もしくは、対立遺伝子頻度についての任意の利用可能なデータベースから、得られ得る。一つのアレイに由来するデータセットを使用して、サンプルは、ＬＯＨ、欠失および増幅について分析され得る。一つの実施形態において、平均ＳＮＰ間距離および中央地ＤＮＰ間距離それぞれ約２５０ｋｂおよび約１２０ｋｂを有するアレイが、使用され得る。別の実施形態において、平均ＳＮＰ間距離および中間値ＳＮＰ間距離は、それぞれ１００ｋｂ未満および２０ｋｂ未満である。この方法は、任意のサンプルにおいてコピー数変化を検出するのに使用され得る。好ましい実施形態において、組織は、癌性組織（例えば、ヒトの乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌）であると疑われる組織である。
【００８３】
全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）といった高密度のマイクロアレイ遺伝子型決定法を使用して、高分解能で染色体の獲得および喪失を同定するための方法が、開示される（Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．，ｐｐ．１２３３−１２３７，および米国特許出願第０９／９２０，４９２、同第０９／９０４，０３９号、同第１０／６８１，７７３号、同第１０／３１６，５１７号、同第１０／４４２，０２１号、同第１０／４６３，９９１号、同第１０／３１６，６２９号および同第１０／２６４，９４５号ならびに米国特許第６，３６１，９４７号を参照のこと）。ＷＧＳＡは、アレイ上で合成される完全一致（ＰＭ）プローブおよびミスマッチ（ＭＭ）プローブに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによって、並列に１０，０００個をより多いＳＮＰと同時に遺伝子型決定する。
【００８４】
本発明のある局面において、ＤＮＡコピー数変化を同定するためにＳＮＰ遺伝子型決定を使用するための方法が、提供され得る。ＳＮＰ遺伝子型決定は、全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）を使用する（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡから入手可能な）１０Ｋ ＳＮＰアレイのような遺伝子型決定アレイ、もしくは複雑性の減少を含んでも含まなくてもよい他の増幅法を含む、多数の適切な方法を使用して実行される。より多数のＳＮＰを有するアレイはまた、利用可能な任意のゲノム増幅方法とともに使用され得る。その方法は、例としてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの１０Ｋ ＳＮＰアレイを使用して説明される。しかし、当業者は、その方法がこの１０ＫＳＮＰアレイに限定されないことを理解する。ゲノムの領域と相補的である完全一致プローブを有する任意のアレイが使用され得る。一つの実施形態において、アレイは、ゲノム全体を通して広がっている領域についての完全一致プローブを含むプローブセットを有するように設計される。例えば、そのアレイは、ゲノム全体を通して約２５ｂｐ、１００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ離れて間隔を空けたプローブセットを有し得る。そのアレイは、１つの生物についてのプローブ、または２つ以上の平均についてのプローブを含み得る。そのプローブセットは、１、２、５、１０、１５、２０または３０個以上の間の完全一致プローブを有し得る。プローブは、ＰＭプローブおよびＭＭプローブを含むプローブ対であり得、またはＭＭプローブは、そのアレイから離れてないかもしれない。
【００８５】
図１は、本発明の実施形態のソフトウェアを実行するのに使用され得るコンピュータシステムの例を示す。図１は、ディスプレイ１０３、スクリーン１０５、キャビネット１０７、キーボード１０９およびマウス１１１を含むコンピュータシステム１０１を示す。マウス１１１は、グラフィックユーザーインターフェースと相互作用するための一つ以上のボタンを有し得る。キャビネット１０７は、フロッピー（登録商標）ドライブ１１２、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ１０２、システムメモリ、ならびに利用され得るハードドライブ（１１３）（図２もまた参照のこと）本発明を実行するコンピュータコードを組み込むソフトウェアプログラムを格納および読出すために、本発明とともに使用するためのデータなどを収納する。ＣＤ１１４は、例示的なコンピュータ読出し可能媒体として示されるが、フレキシブルディスク、テープ、フラッシュメモリ、システムメモリ、およびハードドライブを含む、他のコンピュータ読出し可能格納媒体が利用され得る。さらに、搬送波（例えば、インターネットを含むネットワーク）において実施されるデータシグナルは、コンピュータ読出し可能格納媒体であり得る。
【００８６】
図２は、本発明の実施形態のソフトウェアを実行するのに使用されるコンピュータシステム１０１のシステムブロックダイアグラムを示す。図１のように、コンピュータシステム１０１は、モニター２０１およびキーボード２０９を含む。コンピュータシステム１０１は、さらに、（ＩｎｔｅｌのＰｅｎｔｉｕｍＴＭ ＩＩＩ プロセッサーといった）中央プロセッサ２０３、システムメモリ２０２、固定記憶装置２１０（例えば、ハードドライブ）、除去可能保存機２０８（例えば、フロッピー（登録商標）もしくはＣＤ−ＲＯＭ）、ディスプレイアダプタ２０６、スピーカー２０４、およびネットワークインターフェース２１１といった、サブシステムを含む。本発明を使用するために適切な他のコンピュータシステムは、さらなるサブシステム、もしくはより少ないサブシステムを含み得る。例えば、別のコンピュータシステムは、一つより多いくのプロセッサ２０３、もしくはキャッシュメモリを含み得る。本発明を使用するために適切であるコンピュータシステムはまた、測定機器において実施され得る。
【００８７】
好ましい実施形態において、コピー数は、実験サンプルにおけるＳＮＰについての強度測定を、複数の参照サンプルにおける同じＳＮＰに起因する強度測定の分布を比較することにより、推定される。一つの実施形態において、参照セットは、例えば、１０、１００、２００、３００または５００個より多くの正常な個体であり得、統計的に有意な領域の同定を可能にする。好ましい実施形態において、特定のＳＮＰについての正常な分布を計算するために使用される、複数の参照サンプルについて選択されるデータポイントは、実験サンプルに対する遺伝子型呼出しにおいて一致し、例えば、実験サンプルがＡＡの遺伝子型呼出しを有する場合、ＡＡ呼出しを有する参照サンプルは、このＳＮＰについての正常分布を生じるように選択される。遺伝子型呼出しにおける実験サンプルかつ一致する参照サンプルの数が、非常に小さい場合、もしくは、実験サンプルについての遺伝子型呼出しが、「呼出し無し」の場合、全ての参照サンプルは、遺伝子型の呼出しと無関係に使用され得る。
【００８８】
一般的に、その方法の工程は、実験サンプルにおけるＳＮＰについての強度測定を得ること、実験サンプルに一致する遺伝子型呼出しを有する複数のサンプルにおけるＳＮＰについての強度測定値を得ること、および複数の正常サンプルにおけるそのＳＮＰについての平均強度を計算すること、それらの測定値を比較して、その正常サンプルにおける強度測定値と実験サンプルにおける強度測定値との間の比を得ること、その強度の対数とコピー数の対数との間の直線関係を使用して実験サンプルにおけるコピー数を推定すること、推定されるコピー数についてのｐ値を計算してその推定値についての信頼レベルを決定すること、およびそのｐ値が選択された閾値よりも小さい場合にその信頼レベルは高いと結論付けることである。その閾値は、例えば、１０−４または１０−６であり得る。
【００８９】
その方法は、純粋な腫瘍サンプルまたは正常ＤＮＡと腫瘍ＤＮＡとを含む混合サンプルを用いて使用され得るが、その方法は任意のサンプルを用いて使用され得る。一つの実施形態において、その方法は、サンプルにおいてコピー数変化を検出して、そのサンプルが正常であるかまたはコピー数変化を有するかの否かを決定するのに使用される。例えば、その方法は、ゲノム領域の増幅または欠失と相関関係がある疾患の出産前診断のために使用され得る。
【００９０】
その方法は、癌ゲノムの改善された理解をもたらし得る、増幅領域とともに対立遺伝子の損失を一つの実験領域内で同定するために使用される分子アプローチを開示する。この方法は、疾患（例えば、癌、または対立遺伝子の不均衡から生じる疾患）を診断するのに使用され得る。この方法はまた、特定の処置がゲノム領域におけるコピー数変化を生じるか否かを決定するために、処置レジメンをモニターするのに使用され得る。
【００９１】
一つの実施形態において、参照セットからの既知の対立遺伝子頻度は、ホモ接合性マーカーの連続した広がりを含むゲノムの間隔を同定するのに使用され、一致した正常コントロールサンプルを必要とすることなく、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）領域の検出を可能にする。ゲノムの間隔が同定され得る確率を決定するための方法もまた開示される。
【００９２】
一つの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、複雑性が減少することなく直接増幅される。ゲノムＤＮＡを増幅する一つの方法である多置換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）が、Ｈｏｓｏｎｏ Ｓ，らＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：９５４−６４（２００３），ＤｅａｎらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１６；９９（８）：５２６１−６（２００２）および米国特許第６，６１７，１３７号に記載される。ＭＤＡは、生じる、ヒトゲノムＤＮＡのわずか１〜１０コピーから約２０μｍ〜３０μｍの産物を生じる、等温性鎖置換増幅である。増幅は、粗製全血および組織培養細胞を含む生物学的サンプルから直接的に実行され得る。
【００９３】
一つの実施形態において、種々のＸ染色体コピー（１Ｘ〜５Ｘ）を有するＤＮＡサンプルが、コピー数とハイブリダイゼーション強度との間の関係をモデル化するために使用される。
【００９４】
（欠失および増幅の検出）
クロスハイブリダイゼーションは、標的が存在しない場合に人工的に高い強度値を与え得、そして単独で強度測定を使用すると、複数の欠失を検出失敗することを生じ得る。一つの実施形態において、判別比（ＤＲ）が、単独でか、またはＰＭ強度平均の比を使用する方法と組み合せていずれかで欠失を検出するのに使用され得る。一つの実施形態において、その判別比のデータは、欠失の検出において強度データよりも重み付けされる。
【００９５】
ＳＮＰが欠失した場合、実験サンプルの判別比は、正常参照サンプルと比較してセンス鎖とアンチセンス鎖の両方で非常に低いことと予期される。従って、非常に有意なｐ値が得られるはずであり、そのＳＮＰが欠失されているとして標識される。増幅したＳＮＰについて、実験サンプルは、両片の鎖上で正常サンプルと比較して高い強度を有し（ＰＭにより測定）、増幅しているとして標識され得る。この分析は、推定上の欠失および増幅を同定するのに近傍のＳＮＰからの情報を必要とせず、その結果、分解能は、個々のＳＮＰレベルである。
【００９６】
一つの実施形態において、ｐ値は、染色体の位置に対してプロットされ得、増幅または欠失した関心のある領域を同定する。アレイによってアッセイされる近隣のＳＮＰによって表わされる別個の有意な増幅領域もしくは欠失領域が、この方法で同定され得る。ＳＮＰ分解能が高ければ高いほど、同定され得る増幅領域または欠失領域はより洗練され得る。
【００９７】
（コピー数変化の推定）
好ましい実施形態において、直線関係は、既知のコピー数のサンプルを使用して同定される。好ましい実施形態において、強度比の対数が、コピー数変化の対数と直線的に関係する。別の実施形態において、直線関係が、コピー数と強度比との間で確認される。好ましい実施形態において、コピー数は、約５０までであるが、１０００程度の多さのコピー数が、開示された方法を使用して対数強度と相関付けられることが示されている。
【００９８】
一つの実施形態において、高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用してゲノム全体のコピー数を推定するための方法が、開示される。ＬＯＨの分析は、ＤＮＡの獲得及び喪失と合わせられ、新規の構造が同定され得る。１００人より多い正常個体からなる参照セットに対する比較により、ｐ値を計算することが可能になり、統計的に有意な獲得及び喪失が確認され得る。ＳＮＰ特異的な参照分布が、プローブセットと全体にわたる正規化シグナル強度における固有の分解を説明するために使用される。
【００９９】
一つの実施形態において、個別のＳＮＰ分析が、最初のアプローチとして使用される。別の実施形態において、メタアナリシスが使用される。メタアナリシスにおいて獲得または喪失に向かう一貫した傾向を示す連続したＳＮＰに、さらなる重みおよび有意性が、与えられる。メタアナリシスは、Ｘ染色体のコピー数変化の例における感度、ならびに常染色体のＳＮＰの場合におけるシグナル対ノイズ比を改善し得る。しかし、メタアナリシスは、コピー数変化の長い領域に対して偏っていることに起因して注意を必要とし得、長距離に広がらない複雑な構造を過小評価し得る。また、軽度であるか一貫したシグナルが検出されるコピー数変化の境界付近の領域は、メタアナリシスによるその変化の絶対長の過大評価をもたらし得る。従って、個別の分析を使用する所定のｐ値閾値についての完全に偽陽性率は、Ｘ染色体と常染色体の両方についてのメタアナリシスよりも低い。両アプローチは、正常な参照セットを使用し、その結果、１０，０００個より多いマーカーに関する不可避の問題は、複数の仮説を試験するという問題である。部分的解決策として、そのｐ値閾値は、獲得および喪失に関連する一貫により低い感度（より高い陰性比）を使う高い特異性（低い陽性比）を保証するように厳密に設定され得る。
【０１００】
一つの実施形態において、個別の分析が、高い特異性に起因して診断ツールについての好ましい実施形態であり得るのに対し、メタアナリシスは、全ての推定上の軽度の変化（高い陽性率）の同定が必要とされる場合の、スクリーニングツールについての好ましい実施形態であり得る。遺伝子増幅は、神経芽細胞腫において１Ｋｂ〜数百Ｋｂの範囲の比較的単純な連続した領域であり得る（Ａｍｌｅｒ，Ｌ．Ｃ．，およびＳｃｈｗａｂ，Ｍ．，（１９８９），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．４９０３−１３）か、または乳癌において見られるように２０Ｍｂまでの複雑な異常領域であり得る（Ｇｕａｎら（１９９４），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．１５５−６１およびＳｚｅｐｅｔｏｗｓｋｉら（１９９３），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７４５−５０）ので、１点分析が、必要であり得る。平均近隣点に対するカーネル平滑化、変化点法および隠れマルコフ鎖モデルといった、アレイデータを分析するのに使用され得る複数の代替的な統計学的方法が存在する。一つの実施形態においてこれらのアプローチは、そのモデルを養成するための長さおよびコピー数に関して一定範囲の定義された変化を含む真の正のコントロールサンプルを使用して、開発される。
【０１０１】
一つの実施形態において、ＬＯＨを起こし得る領域が、対のサンプルを使用する従来の方法の代わりに確率ベースモデルを使用して同定され、一致しない癌サンプルの分析を可能にする。このアプローチは、正常な参照セットに由来する対立遺伝子頻度を使用することによりホモ接合性遺伝子型呼出しの広がりの確率を計算する。その結果、このモデルベースアプローチは、正常コントロールサンプルが利用可能でない場合にＬＯＨ領域に対する指針として役立ち得る。連鎖不均衡領域は、ゲノム全体にわたって変化し得るので、この確率モデルは、各ＳＮＰを独立して処理することにより、ＬＯＨ領域の有意性を過大評価する傾向があり得る。一旦、ホモ接合性の有意な広がりが、同定されると、それが本当にＬＯＨを表すかどうかを解釈することは、ヒトゲノムにおけるホモ接合性のセグメントの存在に起因して困難となり得る（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ら（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１０４−１４）。８，０００個の短い直列反復多型を使用して、複数のＣＥＰＨファミリーは、１０ｃＭより大きいホモ接合性セグメントを示した（Ｂｒｏｍａｎ，Ｋ．Ｗ．，およびＷｅｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．，（１９９９），Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．６５，ｐｐ．１４９３−５００）。
【０１０２】
一つの実施形態において、ＬＯＨが、腫瘍細胞と正常細胞との混合物において同定される。例えば、その混合物は、３０％までの正常ＤＮＡと７０％以上の腫瘍ＤＮＡとを含み得、およびＬＯＨを起こすＳＮＰのうちの７５％より多くが同定され得る。一つの実施形態において、正常ＤＮＡは、そのＤＮＡの５０％までであり、腫瘍ＤＮＡは、そのＤＮＡの５０％以上である。
【０１０３】
複数の実施形態において、ＤＮＡは、多重座特異的ＰＣＲによって増幅される。好ましい実施形態において、ＤＮＡは、アダプターライゲーションおよびシングルプライマーＰＣＲを使用して増幅される。平衡ＰＣＲ（ｂａｌａｎｃｅｄ ＰＣＲ）（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ，ら（２００２），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．９３６−９）といった他の利用可能な増幅方法もまた、使用され得る。
【０１０４】
別の実施形態において、サンプルの転写プロフィールが、対立遺伝子の不均衡を有するゲノム領域についての機能的役割を同定するために、コピー数変化と組み合わせられる。
【０１０５】
別の実施形態において、その方法は、１００，０００、２００，０００、５００，０００、または１，０００，０００個より多いのＳＮＰからのＳＮＰの情報に適応するより拡大され、ゲノム全体にわたる高分解分析により腫瘍細胞の複雑な染色体構成の基礎となるゲノムの変化を解明するのを可能にする。
【０１０６】
特徴の抽出：Ｍａｐｐｉｎｇ １０ｋ Ａｒｒａｙは、各ＳＮＰについてセンス鎖とアンチセンス鎖との間で等しく分割された２０個のプローブ対（２５マー）、対立遺伝子Ａについての１０プローブ対および対立遺伝子Ｂについての１０プローブ対を有する。一つのプローブ対は、完全一致セルおよび一塩基ミスマッチセルを含む。２０プローブ（Ｓ）にわたるＰＭ強度の相加平均の対数が、所定の任意のＳＮＰについての基本的な測定値として使用される。これは、近似のガウシアン（Ｇａｕｓｓｉａｎ）分布を各サンプルに関して有し、以下：
【０１０７】
【数４４】
ここで、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度である。Ｓが計算された後、サンプルにわたってその比較性を増大するために全ての常染色体ＳＮＰについての平均０ならびに分散、を有する規模にされる。
【０１０８】
【数４５】
ｊ＝１，．．．，Ｊは、チップ上の全ての常染色体ＳＮＰである。
【０１０９】
強度は、非特異的クロスハイブリダイゼーションに起因して、ホモ接合性欠失について高くなるものであり得る。対数平均強度（Ｓ）に加えて、完全一致プローブとミスマッチプローブの間の差を測定する判別比（ＤＲ）が、補助的基準として使用される（Ｌｉｕら ２００３）。
【０１１０】
【数４６】
好ましい実施形態において、標的癌細胞株におけるコピー数変化の有意性が、正常参照セットとの比較によって推定される。その標的細胞株の遺伝子型は、好ましくは、各ＳＮＰについて、癌細胞株が同じ遺伝子型を共有する正常サンプルとのみ比較されるように、そのような比較の前に考慮される。これは、比較が、複数のサブタイプの混合物の代わりに、均一な分布内でなされ得ることを可能にする。標的細胞株の遺伝子型が不明である場合、もしくは特定の遺伝子型を有する参照サンプルの数が小さい場合、全ての参照サンプルが、その分布を推定するために使用され得る（例えば、１０未満である）。塩基の想定は、所定の任意のＳＮＰｊ、およびその遺伝子型ｇ（ｇ＝ＡＡ、ＡＢまたはＢＢ）について
【０１１１】
【数４７】
が、ガウシアン分布に従い（正規性についてＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ’ｓ Ｗ試験に基づいて、一つの例においては、そのＳＮＰの３．３％のみが、それらの参照分布において上で０．００１未満のｐ値を有し、より厳密な０．０００１のカットオフが使用される場合、これは、さらに０．７％に減少する（Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｐ．，（１９８２），Ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１１５−１２４を参照のこと）；そのような分布の平均および分散が、正常参照サンプルを使用して推定されることである。
【０１１２】
【数４８】
ここでｋ＝１，．．．，Ｋｇは、標的細胞株と同じ、遺伝子型ｇを有する正常サンプルを表す。正常サンプルが、分離した獲得領域および喪失領域を含み得ることに対し、好ましい実施形態において、平均から３標準偏差より多く離れた値を有するように定義されるアウトライアーデータポイントは、その参照分布の平均および分散の推定から除外される。１１０個の参照サンプルに由来する１つの例示的分布において、そのＳＮＰ分布の９０％より多くは、アウトライアーを有さず、約９％が１つのアウトライア−を有し、０．５％未満が２つのアウトライアーを有し、０．０１％未満が、３より多くアウトライアーを有する、このことから、取り除かれるアウトライアーの総数は低いことが予期される。
【０１１３】
実験サンプルが、ＳＮＰｊに関して、遺伝子型ｇおよび値
【０１１４】
【数４９】
を有すると仮定すると、正常の参照分布からの
【０１１５】
【数５０】
の差の有意性は、
【０１１６】
【数５１】
のｐ値によって測定される。
【０１１７】
（メタアナリシス）
各ＳＮＰｊについて、遺伝子型ｇにて、有意性の計算についての個体テストの統計量は、
【０１１８】
【数５２】
でり、ここで、
【０１１９】
【数５３】
は参照サンプルの平均であり、
【０１２０】
【数５４】
は参照サンプルの標準偏差である。以前に説明されたように、
【０１２１】
【数５５】
は、標準正常分布を有すると想定され、ＳＮＰは独立していると想定されている。従って、ゲノムにおける、点ｍで開始して点ｎで終了する所定の任意の広がりについて、
【０１２２】
【数５６】
である。このスコア
【０１２３】
【数５７】
のスコアは、標準Φ関数を使用することにより確率に変換され得、このスコアはメタｐ値と称され、適切な場合、各ＳＮＰの個別のｐ値について置換され得る。メタアナリシスは、連続したマーカーが同じ変化方向を示す場合にもっとも適切である。従って、点ｍで開始して点ｎで終了する候補の広がりは、
【０１２４】
【数５８】
といったとして定義される。開始点はｊ＝１から、すなわち、染色体の始まりであり、探索は、その染色体の終点までそのような候補広がりについて実施される。個別のｐ値が、所定の任意のＳＮＰについてのメタｐ値よりも有意でない場合、前者は、後者によって置換される。
【０１２５】
（ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ））
一つの実施形態において、ヘテロ接合性喪失は、ホモ接合性の観察される広がりと比較することより推定される。二つ以上連続するＳＮＰが、ホモ接合性であり、それらのＳＮＰの各々が、観察される対立遺伝子頻度によって決定されるホモ接合性である確率の積である。遺伝子型の情報を使用して、ＬＯＨを示す統計的に有意なゲノムの間隔は、正常個体の同じ参照セットを使用して、既知の対立遺伝子頻度に基づいてホモ接合性マーカーの連続した広がりの確率を計算することにより、同定され得る。ホモ接合性である確率は、各個別のＳＮＰｉについて、以下の式、
【０１２６】
【数５９】
で計算され得る。
【０１２７】
各ＳＮＰが独立して扱われる場合、全てホモ接合性である連続したＳＮＰ（点ｍから点ｎまで）の広がりの確率は、
【０１２８】
【数６０】
である。そのようなホモ接合性の広がりが定義された後、その強度情報、（すなわち、ｐ値および傍数変化推定）が、ＬＯＨ領域のコピー数変化（喪失または増幅）を決定するために、分析され得る。ＬＯＨの極端な場合である完全な欠失について、有意なｐ値を有する低い判別比は、確認測定として使用され得る。
【０１２９】
別の実施形態において、アレイは、ＷＧＳＡといったゲノムサンプルの複雑性減少増幅から生じる増幅サンプルにおいて存在すると予測されるフラグメントの存在または不在を検出するために設計され得る。２５マーのプローブが、増幅サンプルにおいて存在すると推定される各領域について設計され得る。減少した複雑性のサンプルが、生成され、そのアレイにハイブリダイズされ、そのハイブリダイゼーションパターンは、欠失している領域を同定するために分析される。一つの実施形態において、プローブは、減少した複雑性のサンプルにおいて存在すると推定される、１００塩基対領域毎について設計される。実験サンプルは、増幅され、そのアレイにハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーションがおこらないかまたは減少する領域は、そのゲノムサンプル由来の領域の喪失を示している。
【０１３０】
一つの実施形態において、ゲノムサンプルは、ヒトゲノムＤＮＡであり、そのサンプルは、ＸｂａＩを使用して消化され、フラグメントが一般的なアダプターに連結され、ＰＣＲによって増幅される。生じる増幅された減少した複雑性のサンプルの複雑性は、約４０メガベースであると推定される。１つの２５マープローブが、その減少した複雑性のサンプルにおいて１００塩基対ごとに設計され得る、約４００，０００個の完全一致プローブおよび別の４００，０００個のミスマッチコントロールプローブを生じる。プローブ長は変化し得、例えば、プローブは、１５ｎｔ長、１７ｎｔ長、２１ｎｔ長、２５ｎｔ長、または３０〜６０ｎｔ長であり得る。
【０１３１】
ゲノムにおける再配列もまた検出され得る。一つの実施形態において、プローブは、増幅された減少した複雑性のサンプルにおける特定のフラグメントの存在または不在を検出するために設計される。この実施形態において、選択された制限部位の付近にあり選択されたサイズ範囲であるフラグメントを検出するために設計されたアレイが、使用され得る。遺伝的再配列は、選択されたフラグメントが選択された条件下でもはや効率的に増幅しないように、フラグメントのサイズにおける変化を生じ得る。これらのフラグメントに対するプローブは、ハイブリダイゼーション後にシグナル強度を減少する。これは、再配列を示し得る。
【０１３２】
開示された方法は、複数の適用のために使用され得る。例えば、この方法は、細胞分裂を追跡するために使用され得る。細胞分裂の間、ＤＮＡは複製され、その結果、常に複数の染色体領域が余分なコピーとして存在する。その方法は、細胞分裂の選択された段階においてどのゲノム領域が複製されたかを決定するのに使用され得る。その方法は、癌または他の疾患状態にしばしば関連するクロスオーバーハイブリダイゼーションおよび遺伝する再配列を追跡するために使用され得る。その方法は、開示された方法によって増幅が検出された場合、患者の結果または予後を予測するため、患者のための処置レジメンを選択するため、またはサンプルを癌性であるような細胞を分類するために、使用され得る。異なる種類の癌が、ゲノムの異なる領域の増幅および異なる程度への対する領域の増幅によって、特徴付けられ得る。その方法は、そのような分類についての基準を確立するのに使用され得、および確率された基準に従って、サンプルを分類するために、使用され得る。
【０１３３】
好ましい実施形態において、上記の方法は、癌を診断するのに使用される。癌は、組織サンプルにおける一つ以上のゲノム領域の喪失、一つ以上のゲノム領域の増幅または一つ以上のゲノム領域の再配列にしばしば関係する。これらのゲノムの変化の検出は、癌を診断するためまたは腫瘍の悪性度をモニターするために使用され得る。一つの実施形態において、遺伝子増幅の量は、その組織が、前癌性または癌性であるか否かを同定するために決定され得る。
【０１３４】
一つの実施形態において、プローブは、そのプローブセットが、増幅された減少した複雑性のサンプルにおいて存在すると予測されるフラグメントの存在または不在の区別のために最適であるように、プローブハイブリダイゼーションモデルによって選択される。インシリコ消化を使用して、ゲノムが、所定の酵素または複数の酵素の組み合せにより消化される場合に生じるフラグメントの予測が可能であり、プローブが、インシリコ消化を使用して存在すると予測されるフラグメントの存在または不在を検出するのに使用される。複数の実施形態において、コンピュータシステムが、どの配列が減少した複雑性のサンプルにおいて存在するのかを予測するのに使用され、その複雑性は、選択された方法によって減少する。
【０１３５】
フラグメントの予測可能なサブセットの増幅を生じる複雑性を減少する任意の方法が、減少した複雑性のサンプルを生成するのに使用され得る。そのアレイは、使用される複雑性の減少方法、および減少した複雑性のサンプルにおいて存在すると予測されるフラグメントに依存して、設計され得る。例えば、複雑性を減少する他の方法としては、ＡＦＬＰ（本明細書中に参考として援用される、米国特許第６，０４５，９９４号を参照のこと）および任意配列プライマーＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ、本明細書中にその全体において参考文献として援用される、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄおよびＷｅｌｓｈ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９９５）編、Ｃ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，ｐ２０３を参照のこと）が挙げられる。サンプル調製のさらなる方法、および核サンプルの複雑性の減少のための技術は、Ｄｏｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号および米国特許出願第０９／５１２，３００号、同第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号、同第１０／０１３，５９８号、および同第１０／２６４，９４５号（これらは本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。
【０１３６】
増幅方法は、これらのフラグメント、（例えば、４００塩基対〜８００塩基対のフラグメント）のサブセットを増幅するために最適化され得る。アレイが、選択された断片化および増幅条件のセット下のセットで増幅されると予測されるフラグメントの存在または不在を検出するために設計され得る。そのアレイ上のプローブは、各フラグメント内の選択された領域にハイブリダイズするように設計され得る。一つ以上のプローブが、各フラグメントについて設計され得る。そのプローブは、経験上の基準を使用して、ハイブリダイゼーションについて最適化され得る（例えば、米国特許出願第１０／０１７，０３４号（本明細書中で、その全体が参考として援用される））を参照のこと。異なるアレイが、複雑性の減少したサンプルを生じるように使用される方法に依存して設計され得る。
【０１３７】
ハイブリダイゼーションの前に、減少した複雑性のサンプルにおけるそのフラグメントが、標識され得る。別の実施形態において、そのフラグメントは、ハイブリダイゼーションの前にさらに増幅される。複数の実施形態において、そのフラグメントは、ＤＮＡであり、ＲＮＡが、そのフラグメントから合成され、そして、アレイにハイブリダイズされる。
【０１３８】
別の実施形態において、複雑性の減少したサンプルはゲノムの全領域を問合わせるように設計された配列にハイブリダイズされる。プローブは、ゲノム全体を通して均一に配置され得る（例えば、約１００塩基毎、２００塩基毎、１０００塩基毎、２５００塩基毎、１０，０００塩基毎および１００，０００塩基毎に１つのプローブ）。
【０１３９】
一つの実施形態において、サンプルは、ハイブリダイゼーションの前にサンプルの複雑性を減少することなくアレイへ直接的にハイブリダイズされる。アレイは、ゲノムの各領域について代表的なプローブを使用してゲノムの全領域の存在または不在を検出するように設計され得るか、またはゲノムの選択された領域を検出するように設計され得る。
【０１４０】
シングルプライマーが、ゲノムの代表的な部分を増幅するの使用され得、次に、そのＤＮＡの一本鎖または二本鎖由来の完全一致（ＰＭ）プローブおよびミスマッチ（ＭＭ）プローブのセットを含む高密度オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションを介してＳＮＰ遺伝子型決定され得る。例えば、対のＰＭ強度値とＭＭ強度値との間の判別比を使用するアルゴリズムが、ホモ接合性の欠失領域を同定するのに使用され得るか、または中間値ＰＭ強度が、遺伝子増幅領域を同定するのに使用され得る。チップ強度の正規化の後、実験サンプルに起因するＳＮＰの判別比、およびＰＭ強度値は、正常な個体を含む参照セットから誘導される分布と比較され得る。一つの実施形態において、サンプルセットは、４００よりも多い、５００よりも多い、または１０００よりも多い個体を含み、ＤＮＡのコピー数変化を有する共に統計的に有意な領域が同定されることを可能にする。この方法は、任意の癌性組織（例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、骨癌、皮膚癌、胃癌および結腸癌）におけるコピー数変化を検出するのに使用され得る。
【０１４１】
特定の遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子）のホモ接合性の欠失が、腫瘍形成性であることが公知である。ｐ５３のホモ接合性の欠失は、種々の腫瘍の型と関連することに対して公知である。特定の遺伝子（例えば、発癌遺伝子）の増幅は、腫瘍形成性でもあり得る遺伝子の過剰発現を生じ得る。種々の腫瘍において増幅される発癌遺伝子の例としては、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｅｒｂＢ、ｃ−Ｋ−ｒａｓおよびｍｄｍ２が挙げられる（Ｇｅｎｅｓ ＶＩ、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ（１９９７） １１４４（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。その方法は、癌、または別の疾患、もしくは表現型と関連する新規なホモ接合性欠失を同定するのに使用され得る。別の実施形態において、その方法は、実験サンプルが、癌または別の疾患もしくは表現型と関連することが公知であるかまたは考慮される一つ以上のホモ接合性欠失を有するか否かを決定するのに使用され得る。
【０１４２】
染色体領域のホモ接合性の欠失は、他の障害（例えば、男性の性腺機能低下症（Ｇｒｏｍｏｌｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８５：２２８１−２２８６，２０００）、遅発性筋ジストロフィー（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ Ｌら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９６：５（１０）：１５３９−１５４６））を発症することが、公知である。ホモ接合性の欠失はまた、親のＨＩＶ−１感染に対する防御といった有利な表現型を有することが、公知である（Ｋｕｐｆｅｒら，ＡＩＤＳ，１９９９年６月１８日；１３（９）：１０２５−８を参照のこと）。
【０１４３】
その方法は、発現することが公知のゲノムの領域または既知遺伝子もしくは疑わしい遺伝子を含む領域に、制限されない。プローブは、任意のゲノム領域に対して設計され得る。複数の実施形態において、さらなるアレイは、既知の反復配列の領域についてのプローブを除外するように設計される。
【０１４４】
一つの実施形態において、発現されるＲＮＡは、そのアレイにハイブリダイズされ、ＲＮＡに起因するハイブリダイゼーションパターンが、ゲノムサンプルに起因するハイブリダイゼーションパターンと比較される。複数の遺伝的領域が変異した発現は、ホモ接合性の欠失に類似した表現型において生じ得る。これらの遺伝子は、ゲノム物質がそのアレイににハイブリダイズされるが、その発現パターンは、正常なものから変異している場合において、正常であるように見える。
【０１４５】
開示された遺伝子量技術は、複数の疾患および適用のために遺伝子コピー数を測定するのに適用され得る。癌に加えて、巨大な遺伝子の複製および欠失が、α−サラセミア、およびデュシェーヌ型筋ジストロフィーならびにベッカー型筋ジストロフィーといった疾患と関連して見出されている（例えば、Ａｒｍｏｕｒら Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ ２０：３２５−３３７（２００２）を参照のこと）。その方法は、例えば、構成的異常、後天性異常、数的異常、構造的異常、およびモザイク現象を含む、複数の染色体異常を同定するのに使用され得る。構成的な異常は、全体にわたって個体に影響を及ぼす。その染色体のエラーは、胚に存在した。それは、受精前または受精した接合体において起こり得る。そのような障害としては、２１トリソミーといった染色体の先天的症候群、ターナー症候群等が挙げられる。後天性異常は、癌のように他の組織は正常なままで、一つの器官のみに影響を及ぼす。用語「構成的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）」および「後天性」は、本当に全く一般的な用語であり、臨床実務において遭遇する任意の持続性の変化に対して適用され得る。染色体異常はまた、均質であり得、その異常を有する研究された細胞全てを有する。正常細胞は存在し得るが、アッセイしない。複数の細胞のみがその異常を保有し、他が正常である（または別の異常を有する）場合のみ、そのサンプルまたは個体は、モザイクである。個体はまた、数的異常を有し、その場合、一つ以上の染色体は、正常な個体と異なる数で存在する。構造的変化が、染色体内で起こり得る。この変化は、遺伝物質の喪失または獲得がない場合に平衡になり得、染色体セグメントの欠失および／または複製が存在する場合に、不均衡になり得る。
【０１４６】
さらに、ＰＭ強度をコピー数に関連付けるために使用されるさらなる方法としては、近隣のＳＮＰを計上する確率論モデルを使用して、ＳＮＰに関する物理学的データをそのモデルに組み込む、アルゴリズムが挙げられる。さらに、隠れマルコフ鎖およびマルコフ鎖といった方法が使用され得る。隠れマルコフ鎖を使用する方法については、Ｒａｂｉｎｅｒ，Ｌ．Ｒ．およびＪｕａｎｇ，Ｂ．Ｈ．（１９８６）ＩＥＥＥ ＡＳＳＰ Ｍａｇ．３（１）４−１６およびＲａｂｉｎｅｒ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ．７７ ２５７−２８５を参照のこと。別の実施形態において、１つまたは小数のＰＭプローブが、増幅または欠失の検出のために使用される。一つの実施形態において、ＳＮＰの領域にハイブリダイズする４０プローブが、そのＳＮＰの遺伝子型決定のために使用される。特異的ハイブリダイゼーションと非特異的ハイブリダイゼーションとの間の区別においてよく機能するプローブが、遺伝子型決定アレイを使用して遺伝子量の解析のために使用され得る。使用されるプローブは、個別のプローブの経験的な性能によって選択され得る。プローブの振る舞いは、最も大きな区別および最も高いシグナルを与えるプローブを経験的に同定するために分析され得る。プローブ特異的モデルについては、Ｌｉ，Ｃ．およびＷｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２（８）：ｒｅｓｅａｒｃｈ００３２．１−００３２．１１，Ｌｉ，Ｃ．およびＷｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：３１−３６およびＭｅｉ，Ｒ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００：１１２３７−１１２４２を参照のこと。別の実施形態において、変化点分析が使用される。変化点分析の使用方法については、Ｏｌｓｈｅｎ，Ａ．Ｂ．およびＶｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｅ．Ｓ．（２００２）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇｓ，Ｓｅｎ，Ａ．およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍ．Ｓ．（１９７５）．Ａｎｎ Ｓｔａｔｉｓｔ．３ ９８−１０８およびＹａｏ，Ｙ−Ｃ．（１９８８）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＆ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．６ １８１−１８９を参照のこと。別の実施形態において、ＬＯＨ領域を同定する場合、連鎖不平衡（ＬＤ）についての情報が考慮される。二つの近接するＳＮＰがホモ接合性である確率は、それらＳＮＰ間のＬＤが原因となり、個別の確率の積よりも高い。なぜなら、これらの事象は独立していないからである。ＬＤおよびＬＯＨの推定については、Ｂａｌｄｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，ら Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＬＴＤを参照のこと。
【実施例】
【０１４７】
（細胞株および核酸の単離）
９種のヒト乳癌細胞株（ＢＴ−２０，ＭＣＦ−７，ＭＣＦ−１２Ａ，ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−３０）および二つの同系のヒト乳癌細胞株（Ｈｓ−５７８ＴおよびＨｓ−５７８Ｂｓｔ）（Ｈａｃｋｅｔｔら（１９７７）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，Ｖｏｌ．５８、ｐｐ．１７９５−８０６）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。正常なヒト乳房の上皮細胞株（ＨＭＥＣ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから得た。全ての細胞を、推奨される培養条件下で増殖させた。ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して単離した。３Ｘ染色体（ＮＡ０４６２６）、４Ｘ染色体（ＮＡ０１４１６）、ならびに５Ｘ染色体（ＮＡ０６０６１）を含む細胞株由来のＤＮＡおよび１１０個体の正常参照セット（雄４８個体および雌６２個体）のＤＮＡを、ＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から購入した。
【０１４８】
ＷＧＳＡアッセイを、標的増幅工程に対する改変およびＤＮＡ標識工程に対する改変を除いて、Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３）の記載のように実施した。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（ＡＢＩ）中の２５ｎｇのアダプター連続ゲノムＤＮＡ、０．７５μＭのプライマー、２５０μＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ））を含む各１００μｌの反応物の条件下で行った。サイクリング、９５℃／３分、次に（９５℃／３０秒、５９℃／３０秒、７２℃／３０秒）を３５サイクル、および７２℃で７分間の伸長のように実施した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製し濃縮し、ＤＮＡ濃度を、Ａ２６０ｎｍによって測定した。フラグメント化されたＤＮＡを、１０５単位のＴｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および０．１４２９ｍＭのＤＬＲ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を含む１×ＴｄＴ緩衝液中で、３７℃にて２時間標識し、次に９５℃で１５分間熱不活化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）の１０Ｋ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｘｂａ＿１３１ Ａｒｒａｙに対するＤＮＡハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびスキャニングを、製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の指示書に明示されるように実施した。正常参照セットを除く全てのサンプルを、二連で試験した。呼出し率は、全て８８％より高かった。再現性は、全ての複製データにおいて高かった。平均の遺伝子型の一致は、９９．７％であり、二つの鍵となる測定（対数強度（Ｓ）および判別比）はその両方が、複製間で０．９７より大きい平均相関関係を有した。
【０１４９】
ＷＧＳＡ ＤＮＡ混合実験を下記のように実施した：Ｈｓ−５７８ＴおよびＨｓ−５７８Ｂｓｔ由来のゲノムＤＮＡの濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって決定し、Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ ＤＮＡをＨｓ−５７８Ｔ ＤＮＡに対し、１０％ずつの増分で添加した。
【０１５０】
定量ＰＣＲを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を使用して実施した。ＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ソフトウェア（ＡＢＩ）を使用することにより設計し、ＱＩＡＧＥＮによって合成した。反応物（２５ｎｇ ＤＮＡを含む２５μｌ）を、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（ＡＢＩ）を使用して調製した。増幅のための条件は以下の通りであった。５０℃／２分間で１サイクル、９５℃／１０分間で１サイクル、次に（９５℃／２０秒、５６℃／３０秒、および７２℃／３０秒）を３５サイクル。閾値のサイクル数を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｖ１．７ａソフトウェアを使用することにより得た。ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を正常コントロールとして使用した。全ての反応を２重で実行し、サイクル数の閾値を平均した。ＤＮＡ量を、ＵＶ分光光度計により測定し、ＬＩＮＥ−１エレメントに対して（９）で正規化した。相対的定量を比較Ｃｔ法（ＡＢＩ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２，１９９７）を使用して実施した。ｃ−ＭＹＣ遺伝子およびｐ１６遺伝子についての定量ＰＣＲ反応を、アニーリング温度が６０℃であることを除いて、記載されるように実施した。
【０１５１】
（コピー数の推定および有意性の計算）
下記の実施例において、コピー数および有意性の推定に対する３つの主要な要素：（１）用量応答実験、（２）ＰＣＲを使用するアルゴリズム結果の独立した検証、および（３）癌細胞株群を使用する既知の真の正の領域の確認、が存在する。コピー数とチップ強度との間の用量応答を、種々のＸ染色体のコピー数（例えば１Ｘ〜５Ｘ）を有するサンプルを使用して、試験し得る。チップ強度を示すために（Ｉ）を使用すると、用量応答の想定は、
【０１５２】
【数６１】
であり、ここで、Ｉａは、コピー数ａの領域についての強度であり、Ｉｂは、コピー数ｂである同じ領域についての強度であり、Ｃａｂは、ａおよびｂによって決定される強度比である。
【０１５３】
【数６２】
は、対数強度の近似値である。従って、対数変換は、
【０１５４】
【数６３】
を導き、ここで、
【０１５５】
【数６４】
は、ａおよびｂによって決定される対数強度比である。
【０１５６】
対数コピー数は、対数のコピー数と対数強度比との間の直線関係を想定することにより、推定し得る。直線は、式ｙ＝ｍｘ＋ｂを有し、ここで、ｍは、直線の傾きであり、ｂはｙ切片である。好ましい実施形態において、ｙは対数のコピー数であり、Ｃは、強度比の対数である。傾きおよびｙ切片は、既知のコピー数の正常サンプルを使用して推定され得る。一つの実施形態において、傾きおよびｙ切片は、Ｘ染色体の既知のコピー数変化を伴うサンプルを使用して決定される。
【０１５７】
１Ｘ染色体、３Ｘ染色体、４Ｘ染色体および５Ｘ染色体を有するＤＮＡサンプルからの結果を、２Ｘのサンプルと比較した。高い直線の相関関係が、このサンプル対の間で観察された。任意の所定の対について、直線の傾きはＹ＝Ｘに対して平衡であり、式
【０１５８】
【数６５】
を確認した。２Ｘを基準として使用して、各サンプルについて推定された対数強度比、
【０１５９】
【数６６】
は、コピー数の対数強度と強力な直線関係を示した。このコピー数は、強度差を使用して、任意の所定の領域について推定され得る。好ましい実施形態において、Ｘ染色体の結果を、全ての常染色体に対して一般化するのに使用した。遺伝子型ｇおよび対数強度
【０１６０】
【数６７】
について、ＳＮＰｊ
【０１６１】
【数６８】
である。対数−対数直線モデルを、低範囲コピー数推定および高範囲コピー数推定の両方についての一般的な適合性が理由で、使用した。
【０１６２】
【数６９】
は、対数強度比（ｌｏｇ ｘ／ｙ＝ｌｏｇｘ−ｌｏｇｙ）である。高コピー数範囲において、シグナルの強度における増加が、プローブの飽和に起因するアッセイにおいてプラトーに達し、対数−対数の直線関係は、より適切になり得る（Ｂｉｇｎｅｌｌら（２００３）、Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ、Ｖｏｌ．，ｐｐ．，）。これらの結果は、強度比が、コピー数変化を表すのに使用され得ることを示し、対数−対数直線モデルが、広い範囲のコピー数に適応するのに最も適切であることを示す。
【０１６３】
ＤＮＡコピー数変化を測定するための独立した定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を、染色体の獲得または損失の観察される領域を確認するのに使用した。９９個の常染色体ＳＮＰのセットにおけるＰＣＲ反応を、ＳＫＢＲ３および正常な個体由来のゲノムＤＮＡテンプレートを使用して実施した。このＳＮＰセットは、完全には無作為ではなく、以前に既知であった獲得及び喪失、ならびに上記癌細胞株において同定された推定上の新規獲得および喪失の両方を含んだ。第一の定量ｇＰＣＲ確証実験を、７つの独立した染色体ＳＮＰに対するプライマー対を使用して実施し、１× ＤＮＡサンプルおよび５× ＤＮＡサンプルについてのΔＣｔ値を決定した。各プライマー対が、正規化後にΔＣｔの絶対値においてわずかな差を示す一方、１Ｘサンプルと５Ｘサンプルの間に２．２３サイクルの平均差が存在した（データは示されない）。増幅効率２．０を想定すると、このＣｔの差は、理論値２．３２に近接する。ＷＧＳＡを使用して推定されたコピー数は、ほぼΔＣｔの指数関数であり、ほぼ理論上の推定の式２ΔＣｔ＋１と付近にあてはまる。ΔＣｔ値が低く、かつΔＣｔの増加と共により散乱する場合、その傾向は、緊密である。ΔＣｔと計算された有意性レベルとの間の強力な正の相関関係が、上記アルゴリズムを使用して観測された。わずかな点を除いては、、大きなΔＣｔの差を有するＳＮＰの大部分は、非常に強大な有意性を示し、一方、わずかなΔＣｔ差を有するＳＮＰが、中程度〜低い統計学的有意性緩和を示す。その結果はまた、ＰＭ強度に対する補助的の測定基準として判別比の値を示す。一つのデータ点について、ΔＣｔ値は、−５未満であり、ホモ接合性欠失を示唆する。しかし、可能なクロスハイブリダイゼーションに起因して、ＰＭ強度に基づく有意性は、ほんの中程度である。このＳＮＰは、ＤＲが適用される場合に、１０−６未満のｐ値を有する大きな有意性を示し、その欠失の正確な同定を可能にする。推定されたコピー数と統計学的な有意性との間の関係も、また分析される。予期されるように、コピー数がホモ接合性の欠失を示す０に近づく場合、または高レベルの増幅を示す大きな正数に近づく場合、有意性は非常に大きくなる。これらの組み合せの結果は、その方法が定量技術において、染色体のコピー数変化を検出し得ることを示す。
【０１６４】
乳癌細胞株群を、二つの良好に特徴付けられた領域（すなわち、染色体８ｑおよび染色体９ｐ）におけるコピー数変化について調査した。３８個の乳癌細胞株のＣＧＨ分析は、サンプルの７５％において８ｑの獲得を示し（Ｆｏｒｏｚａｎら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．６０、ｐｐ．４５１９−２５）、染色体９ｐの喪失が、乳癌において報告されている（Ｓｔｒｕｓｋｉら（２００２），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１３５、ｐｐ．６３−９０）。特に、染色体８ｑ２４のｃ−ＭＹＣ癌遺伝子は、乳癌において共通に増幅されることが示されており（Ｅｓｃｏｔら（１９８６）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８３、ｐｐ．４３８４−８およびＲｕｍｍｕｋａｉｎｅｎら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｖｏｌ．１２６、ｐｐ．１−７）、一方、染色体９ｐ２１上のｐ１６腫瘍サプレッサーは、種々の腫瘍型において欠失されることが示されている（Ｋａｍｂら，（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６４、ｐｐ．４３６−４０およびＣａｉｒｎｓら（１９９５）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．２１０−２）。個別のＳＮＰについてのコピー数の推定は、一定領域（例えば染色体）にわたってマッピングされ得る。遺伝子型決定アレイは、ゲノム全体に広がるＳＮＰのサブセットに関する情報を提供し得る。そのアレイによって遺伝子型決定されるＳＮＰのセットにおいて最も近隣に存在するＳＮＰについてのコピー数の推定に注目することにより、より大きな領域のコピー数の推定がなされ得る。一つの実施形態において、推定値を、５０Ｍｂから１４０Ｍｂまでの第８染色体の領域についての４つのサンプルにわたって比較した。ｃ−ＭＹＣ付近のゲノム領域は、三つの癌細胞株において中程度〜非常に強い有意性で増幅されたようであり、正常コントロール（Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ）において増幅されなかったようであった。これは、３つ全ての細胞株が、８ｑ２３−ｑ２４における獲得を含むことを示す公表されたＣＧＨの結果と一致している（Ｋａｌｉｏｎｉｅｍｉら（１９９４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ Ｖｏｌ．９１、ｐｐ．２１５６−６０）。定量ＰＣＲを、ｃ−ＭＹＣプライマー対を使用して実施し、コピー数の増加を確認した。ＳＫ−ＢＲ３、ＭＣＦ−７、ＺＲ−７５−３０およびＨｓ−５７８ＢｓｔについてのｑＰＣＲにより推定したｃ−ＭＹＣコピー数は、それぞれ、２１、７．５、１０．６および３であった。実施例において使用されるアレイは、ｃ−ＭＹＣ遺伝子それ自体に由来するＳＮＰを含まないが、最も近接する二つのＳＮＰは、ｃ−ＭＹＣに対して３００Ｋｂ近位に位置するＳＮＰ５５１５０、およびｃ−ＭＹＣに対して１９６Ｋｂ遠位に位置するＳＮＰ５１１３１５である。これらのＳＮＰについてＷＧＳＡおよび定量ＰＣＲの結果を表１において要約する。これらは、ｃ−ＭＹＣを取り巻く領域が、上記の４つの細胞株の内３つにおいて増幅されることを確認した。
【０１６５】
また、上記の４つの細胞株を、０Ｍｂから４０Ｍｂの第９染色体の領域にわたって比較した。ＷＧＳＡの結果は、これら細胞株の内３つが、ｐ１６構造遺伝子内に位置するＳＮＰ１３９３６９によって決定されるようなｐ１６の領域における有意な欠失を有することを示す。このＳＮＰならびに両方のＳＮＰを、さらに定量ＰＣＲによって分析した。その結果を表１に要約する。ＰＣＲの結果は、独立してｐ１６の欠失を確認する。主に、ＰＣＲおよびコピー数のアルゴリズムは、既知の変化を有する二つのゲノム領域（すなわち、ｃ−ＭＹＣおよびｐ１６）について高度に相関した結果を示す。
【０１６６】
ＳＫ−ＢＲ−３ 第８染色体の分析およびＢＴ−２０ 第９染色体の分析はまた、開示された方法の高度な分解能を示す。ＳＫ−ＢＲ−３は、二つの近接する増幅セグメントをｃ−ＭＹＣ付近に示す。第一の長い方のセグメントは、１１８．９６Ｍｂから１２５．４２Ｍｂに広がる。第二の短い方のセグメントは１２７．５２Ｍｂから１２７．６５Ｍｂの範囲である。第一および第二のセグメント由来の１２個の代表的なＳＮＰを、ＰＣＲによって分析し、コピー数の増加を確認した。定量ＰＣＲ（ΔＣｔ＝−０．３）とコピー数のアルゴリズム（ｐ値＝０．４３）の両方を使用して増幅しないとスコア付けされるこれらの二つのセグメントを中断させるような、一つのＳＮＰ（７１９２９２）が存在する。ＢＴ−２０は、コピー数変化を示さないＳＮＰによって隣接される一点のホモ接合性の欠失（ｐ１６）を含む（表１）。これらの二つの例は、上記の方法が、一点分解で増幅または欠失を検出するのに使用され得、および種々のコピー数で存在するゲノム領域間の境界を示すのに使用され得ることを示す。
【０１６７】
Ｍａｐｐｉｎｇ １０Ｋ Ａｒｒａｙ上のプローブ配列が、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによってＳＮＰ遺伝子型について特異的に選択され得る一方、コピー数変化についての高感度および特異性に関しては最適化されないかもしれない。しかし、Ｘ染色体のＳＮＰのうちの９６％よりも多くが、対数（シグナル強度）と対数（コピー数）との間で０．８５よりも大きい相関関係を有する。別の実施形態において、コピー数変化の推定について最適化されるプローブとともにアレイが、設計され得る。
【０１６８】
（メタアナリシス）
複数の実施形態において、その方法は、大きなコピー数の増加を伴うホモ接合性の欠失および増幅を検出するのに使用される。しかし、わずかなコピー数の変化しか伴わない欠失領域の比は、相対的に低い。一つの例において、１％偽陽性率で、１Ｘサンプル、３Ｘサンプル、４Ｘサンプルおよび５Ｘサンプルについての検出比は、それぞれ２２．０３％。１２．３５％、３１．２７％および５４．８６％であった。この適度な検出比は、用量応答の欠失よりもむしろ複数のＳＮＰにおける参照セット分布の分散に起因する。全体的に、用量応答は、強力であり、３０２個全てのＸ染色体ＳＮＰについて、対数（強度）と対数（コピー数）の間に０．７２より大きい相関関係を有する。さらに、このグループ間の２９２個のＳＮＰ（９６．７％）は、０．８５よりも大きい相関関係を有する。メタアナリシスは、同じ型の変化（獲得または喪失）を示す連続したＳＮＰの数が多くなると、信頼性の増加を引き起こし（Ｓａｌａｍｏｎら（２０００），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．２０４４−５４）、その結果、検出率の改善に適用されることを想定する。メタアナリシスは、良く改善された感度および特異性を示す受信者動作特性分析（Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線を左上の角へと実質的にシフトする。その結果は、０．２％未満の偽陽性率とともに、１Ｘ、４Ｘおよび５Ｘについての真の陽性（検出）率は、それぞれ９１．０６％、９１．３９％および９８．３４％であることを示す。３Ｘについての真陽性率が、１％未満の偽陽性率を使用することにより、５０％より多くまで改善される。変化の範囲が連続しかつ大きいので、メタアナリシスは、これらのＸ染色体の例における個別の分析よりもよりかなり強大な効力を示し、上記ＳＮＰの大部分は、獲得または欠失へ向かう一貫した傾向を示すが、散在性の個別のシグナルは、参照セットの分散に起因して有意ではないかもしれない。
【０１６９】
一定範囲のｐ値の閾値の範囲にわたって常染色体を使用した個別の分析とメタアナリシス分析との比較を、表２にまとめる。所定のｐ値のカットオフについて、１０個の乳癌サンプルにおいて検出されたＳＮＰの平均数を、１１０個の正常サンプルで検出されたＳＮＰの平均数で除算した。この値は、任意の所定の信頼閾値について、癌サンプル対正常サンプルのおおよその比（シグナル対ノイズ比）として役立つ。メタアナリシスを使用して、この比は、実質的に改善される（任意の１０−１０のｐ値カットオフについて個別の分析およびメタアナリシスについての比、それぞれ、８．６および１４８．２）。高いノイズ対シグナル比はまた、十分なＳＮＰの密度を有する広範な領域に広がるゲノムの変化の数が、癌細胞株において比較的頻繁である一方、正常な集団においては、比較的まれであることを意味する。
【０１７０】
（ＬＯＨ）
一致したＨｓ５７８サンプルを、従来のＬＯＨ同定（一致したサンプル間のＷＧＳＡのＳＮＰ遺伝子型呼出しの比較）を、ＬＯＨ同定のための確率モデルの適用と比較するのに使用した。そのモデルは、参照セットについての対立遺伝子頻度の情報を使用し、ホモ接合性の遺伝子型の任意の所定の広がりがランダムな機会に起因して起こり得る確率を計算する。その有意性は、網羅された領域における、ホモ接合性ＳＮＰの数が増加すると増幅する。従って、厳密な有意性のカットオフの使用は、多くの連続したホモ接合性呼出しに関するゲノム領域が、ＬＯＨの慣習的に定義された領域についての代理として機能することを可能にする。分析のために利用可能な一致した正常コントロールサンプルが存在しない場合、この適用は特に有用であり得る。この方法を、従来的に定義されたＬＯＨマーカーを、この方法がどのように十分に捕捉するかに関して、一致したＨｓ５７８対を使用して評価した。比較の結果を図３において概説する。従来のＬＯＨ分析によって定義される常染色体ＳＮＰが、全１２９３個存在する。これらのＳＮＰは、正常コントロールにおいてヘテロ接合性であり、腫瘍サンプルにおいてホモ接合性である。これらのＳＮＰの間で、７０％より多くが、確率モデルを使用して１０−８未満の有意性（ｐ値）を有し、８０％より多くが、１０−６未満の有意性を有する。そのＳＮＰのうちのなお約１０％は、有意でないｐ値（＞０．０１）を有する。これは、従来的に定義されるＬＯＨのＳＮＰの大部分が、ホモ接合性呼出しの長い広がりに位置する一方、そのＳＮＰのうちの約１０％が、多くの連続したホモ接合性呼出しを伴なわずに存在する。対照的に、正常コントロールサンプルにおける１１，２０５個全ての常染色体ＳＮＰについて、１０−６未満のｐ値を有する広がりに属するＳＮＰは存在せず、１％未満が、１０−４の有意レベルを有する広がりに属する。従って、この特定のサンプル対について、１０−６のｐ値の閾値は、確率モデルを使用して、従来的に定義されたＬＯＨの８０％を超える獲得をもたらす一方、このレベルの有意性の領域を含まない。この結果は、確率モデルが、ＬＯＨを受けるゲノム領域を同定し得、特に正常な一致サンプルが利用可能ではない場合、ＬＯＨを同定に対する代替的アプローチとして機能し得ることを示す。腫瘍細胞株においてＬＯＨを受けるＳＮＰのコピー数の分析は、約３２％が１コピーを有し、５１％が２コピーを有し、１７％が中程度の増幅（８未満のコピー数）を有し、０．２％未満が、ホモ接合性の欠失または多倍数の増幅を示すことを示す。さらに、コピー数の分布は、ＬＯＨの同定のための二つのアプローチの使用の間で類似している。
【０１７１】
一旦ホモ接合性の広がりが定義されると、強度の情報は、その領域のコピー数変化およびその有意性を決定するのに使用され得る。興味深いことに、その一致した対は、明らかなコピー数変化が起こっていないＬＯＨの領域を同定する。腫瘍の遺伝子型呼出しと正常な遺伝子型呼出しとを比較することによって、第１２染色体および第１７染色体の全長ならびに第５染色体上の９０Ｍｂ〜１７０Ｍｂは、ＬＯＨとして定義され得るが、有意なコピー数変化は観察されなかった。このパターンはまた、ＭＣＦ−７において観察され、ここで、５７Ｍｂから７７Ｍｂまでの確率モデルで定義される７７個のＳＮＰを含むＬＯＨの推定上の広がり（ｐ値７．２Ｅ−１６）は、コピー数の減少を示さない。さらに、ＳＫ−ＢＲ−３およびＺＲ−７５−３０の両方は、３．８Ｅ−１８（８０ＳＮＰ）および１．８Ｅ−２４（１２０ＳＮＰ）というそれぞれのｐ値で１１０Ｍｂから１２５Ｍｂ〜１３５Ｍｂまでの推定ＬＯＨ領域を示すが、有意なコピー数の増加を示す。コピー数の減少も増加もないこれらのＬＯＨの例は、現在使用される多くの一分子アプローチによって容易には同定されないかもしれず、そしてゲノム範囲のコピー数のプロファイリングとＬＯＨの測定と合せることにおける力を示す。
【０１７２】
（混合実験）
腫瘍サンプルは、間質起源またはリンパ起源の正常細胞によってしばしば汚染され得る。レーザー捕獲顕微解剖またはフローサイトメトリ−といった方法が、腫瘍細胞について濃縮するために首尾よく使用されているが、生じた集団は、まれに、完全に純粋であり、その結果、ゲノム範囲のＤＮＡコピー数のプロファイリングのために使用される分子方法は、不均一サンプルに適用するのに十分頑強でなければならない。一致した対Ｈｓ−５７８は、癌サンプル（Ｈｓ−５７８Ｔ）中に混合される漸増量の正常ＤＮＡ（Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ）の影響を試験することによる混合ＤＮＡサンプルに対するＷＧＳＡアッセイ、およびアルゴリズムの許容性を評価するために使用した。混合サンプルを、ＬＯＨにおける変化およびコピー数変化の検出における変化について、分析した。癌細胞株から誘導したＤＮＡを、ＷＧＳＡアッセイの前に、０％（純粋な癌サンプル）、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、９０％および１００％（純粋な正常細胞サンプル）といった漸増する割合で、正常一致ＤＮＡと混合した。Ｈｓ−５７８ＢｓｔおよびＨｓ−５７８Ｔの様式的染色体数は、それぞれ４６（２倍体）および５９（低三倍体）であり、従って、ＤＮＡ量による混合は、細胞数による混合を近似する。従来のＬＯＨ ＳＮＰの同定における変化は、確率モデルを使用して推定上のＬＯＨ領域と同様に観察された。正常ＤＮＡの寄与が増加する、従来的に定義されるＬＯＨのＳＮＰ数が、減少する。同じ傾向に従って、上記確率モデルにより定義されるＬＯＨの総数もまた、減少する。全体的に正常ＤＮＡの割合が３０％以下である場合、ＬＯＨの変化の７０％より多くが保持される。混合ＤＮＡが全量の３０％〜５０％に達する場合、有意なシフトが発生し、ＬＯＨの検出の約６０％の喪失を生じる。正常ＤＮＡが６０％以上で存在する場合、ＬＯＨをおこすほとんどのＳＮＰ（＞９８％）が、検出不可能である。
【０１７３】
ＬＯＨ検出の遷移点とこれらのＳＮＰのコピー数の間の関係もまた、試験した。この比較は、全量の９９．８％を含む種々のコピー数を有するＬＯＨのＳＮＰの３つの群：１コピーの増加（（４０７ ＳＮＰ）、２コピーの増加（（６６３ ＳＮＰ）および中程度のコピー数（３〜８）の増加（２２１ ＳＮＰ）に関する。平均に、正常ＤＮＡの割合が、混合サンプルにおいて増加すると、ホモ接合性呼出しを検出不能なことが、１コピーのＳＮＰについて最初に起こり、次に２コピーのＳＮＰ、そして最後に中程度のコピーのＳＮＰについて起こった。３つの群の間の差は、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ試験を使用して、ｐ値３．２９２ｅ−０５で統計学的に有意である。順位和検定を各対を比較するのに使用した。群の間の差についての下記のｐ値：０．００７４２（１コピーおよび２コピー）、０．００４８７（２コピーおよび中程度のコピー）、および１．３４９ｅ−０５（１コピーおよび中程度のコピー）が見出された。全ての比較は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正して０．０５レベルで有意であり、１コピーおよび中程度のコピーの群が最も有意である。
【０１７４】
獲得および喪失の検出に対する混合サンプルの効果も試験した。メタアナリシスを用いて関して混合サンプルにおいて検出されるコピー数変化の相対的な割合は、個別のＳＮＰ分析よりも大きい。１０％、２０％および３０％の正常ＤＮＡの混合レベルで、最初の全量からの残りの検出可能なシグナルは、それぞれ、８９．０１％、８５．６５％、５７．５５％（メタアナリシス）および５０％、２５％、および２１．４３％（個別の分析）である。一旦、正常ＤＮＡの比率が、全サンプルの４０％に達すると、これらの増幅ＳＮＰおよび欠失ＳＮＰの検出において有意な減少が存在する；混合サンプルが６０％より多い正常ＤＮＡを含む場合、シグナルのほとんどは、検出不可能である。この傾向は、メタアナリシスおよび個別の分析についてあてはまる。これらの結果は、ＷＧＳＡアッセイおよびアルゴリズムを使用したＬＯＨの検出およびコピー数変化が、２０％〜３０％までの正常ＤＮＡを含む混合サンプルを許容し得ることを示す。
【０１７５】
（「正常」サンプルにおけるコピー数変化の測定）
１１０個の参照サンプルの参照セットを、増幅または欠失が、癌と診断されていない個体においてゲノム領域内において同定され得るかどうかを決定するために分析した。より具体的には、１点除外分析を１１０個サンプルの各々において実行した；一つのサンプルをこの分析から除外し、他の１０９サンプルを、参照分布を設計するのに使用し、各ＳＮＰの対立遺伝子の頻度を計算するのに使用した。「除外された」サンプルを、コピー数変化の頻度および有意性を評価するため、および除外されたサンプルにおけるホモ接合性呼出しの長い広がりを同定するために参照情報と比較した。その結果は、参照サンプルの実質的な割合が、有意なコピー数変化およびホモ接合性呼出しの長い広がりを有することを示した。１１０サンプルの間で、４３サンプルは、ｐ値が１０−６未満で１０個より多くの一点変化を有し、それらのうち１１サンプルが、２０個以上の有意な変化を有した。また、１１０サンプルの間で、８サンプルがｐ値が１０−１０未満で長いホモ接合性の広がりを有することが観察され、そのようなホモ接合性呼出しの長い広がりは、２１．３６Ｍｂの平均範囲を有する。
【０１７６】
ＷＧＳＡの実施例：ゲノムＤＮＡを、５μｌ中の５０ｎｇ／μｌのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）を、１０．５μｌのＨ２Ｏ（Ａｃｃｕｇｅｎｅ）、２μｌの１０×ＲＥ緩衝液２（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、２μｌ １０×ＢＳＡ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、および０．５μｌのＸｂａＩ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と混合することにより、ＸｂａＩで消化した。反応物を、３０℃で２時間インキュベートし、次いで、この酵素を７０℃で２０分インキュベートすることにより不活性化し、そして４℃にした。反応物は−２０℃で保管し得る
アダプターの連結のために、消化されたＤＮＡを、１．２５μｌの、ＴＥ（ｐＨ８．０）中の５μＭ アダプター、２．５μｌのＴ４ＤＮＡライゲーション緩衝液と混合し、そして１．２５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を最後に添加した。反応を、１６℃で２時間インキュベートし、次いで、７０℃で２０分インキュベートし、そして４℃にした。そして２５μｌのライゲーション混合物を、７５μｌのＨ２Ｏで希釈し、−２０℃で貯蔵し得る。
【０１７７】
ＰＣＲについて、希釈した連結ＤＮＡ １０μｌを、１０μｌのＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、１０μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＰａｎＶｅｒａ Ｔａｋａｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），１０μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７．５μｌの１０μＭプライマー（最終濃度０．７５Ｍ）、２μｌの５ユニット／μｌ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）および５０．５μｌのＨ２Ｏと混合する。各アレイについて、４つの１００μｌの反応物を調製した。増幅を、以下のプログラムを使用して行った：９５℃で３分間；９５℃で２０秒、５９℃で１５秒、７２℃で１５秒を３５サイクル；および７２℃で７分間の最終インキュベーション。その反応物を４℃で保持した。蓋加熱オプションを選択した。
【０１７８】
その後、ＰＣＲ反応を、１００μｌのＰＣＲ反応物を５００μｌのＰＢ緩衝液またはＰＭ緩衝液と混合し、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）へ導入することにより精製し、そのカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、エタノールを含む７５０μｌのＰＥ緩衝液をカラムに加えてサンプルを洗浄し、カラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、カラムを１３，０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、カラムを新しいコレクションチューブ内に配置した。４サンプルの内２サンプルについて、３０μｌのＥＢ溶出緩衝液（ｐＨ８．５）をＱＩＡｑｕｉｃｋ膜の中央へ添加し、サンプルを溶出させ、カラムを室温で５分間静置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。最初の２つのサンプル由来の溶出緩衝液を使用して、他の２サンプルを溶出させ、溶出液を混合した。ＤＮＡを定量し、４８μｌに２０μｇのＤＮＡが含まれるように希釈した。
【０１７９】
上記ＤＮＡを、４８μｌ ＤＮＡ（２０μｇ）、５μｌのＲＥ緩衝液４、および２μｌの０．０９ユニット／μｌのＤＮａｓｅを総量５５μｌ中に混合することでフラグメント化した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで９５℃で１５分間インキュベートし、そして、４℃で保持した。
【０１８０】
フラグメントを、５０μｌのフラグメント化されたＤＮＡ（２０μｇ）、１３μｌの５×ＴｄＴ緩衝液（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１μｌの １ｍＭのビオチン標識ｄｄＡＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、および１μｌのＴｄＴ（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とともに３７℃で一晩インキュベートし、次いで、９５℃で１分間インキュベートすることにより標識し、次いで、４℃で保持した。
【０１８１】
ハイブリダイゼーション混合物は１２μｌの１．２２Ｍ ＭＥＳ、１３μｌのＤＭＳＯ、１３μｌの５０×Ｄｅｎｈａｒｔ、３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、３μｌの１０ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、３μｌの１０ｎＭオリゴＢ２、３μｌの１ｍｇ／ｍｌヒトＣｏｔ−１、３μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、および１４０μｌの５Ｍ ＴＭＡＣＬである。７０μｌの標識ＤＮＡを、１９０μｌのハイブリダイゼーション混合物と混合した。その混合物を９５℃で１０分インキュベートし、短く回転させ、４７．５℃で保持した。２００μｌの変性した混合物を、アレイに４７．５℃で１６時間〜１８時間、６０ｒｐｍでハイブリダイズさせた。
【０１８２】
染色混合物は、９９０μｌのＨ２Ｏ、４５０μｌの２０×ＳＳＰＥ、１５μｌのＴｗｅｅｎ−２０、３０μｌの５０％のＤｅｎｈａｒｔであった。第一染色について、４９５μｌの染色混合物を５μｌの１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合し、第二染色について、４９５μｌの染色混合物を０．５ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）５μｌと混合し、第三染色について、４９５μｌの染色混合物を５μｌの１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と混合する。標準条件下で洗浄し、染色した。
【０１８３】
（結論）
ゲノムＤＮＡのコピー数における変化を同定する方法が開示される。ヘテロ接合性の喪失、ホモ接合性の欠失および遺伝増幅を同定する方法が開示される。その方法は、正常な組織と比較して癌性組織におけるコピー数変化を検出するのに使用され得る。１０，０００個より多いヒトＳＮＰについてのプローブを含む遺伝子型決定アレイ対するハイブリダイゼーションによって、ゲノム範囲のコピー数の獲得または喪失を同定するための方法が、開示される。ゲノム全体にわたって、コピー数変化の推定が、ＳＮＰ遺伝子型呼出しに関連する（ＬＯＨ分析）。全ての引用された参考文献は、全ての目的のために、本明細書中で参考として援用される。
【０１８４】
本発明は、ゲノムサンプルにおけるコピー数を推定するための方法及びコンピュータソフトウェア製品を提供する。上記は例示的であって、限定的ではないことが意図されることが理解されるべきである。本発明の多くの変形が、上記の説明を検討すると当業者にとって明白である。例として、本発明は、主に高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用に関して記載されているが、他の核酸アレイ、ゲノムＤＮＡから生じるシグナル強度を測定する他の方法が、使用され得ることが、当業者により認識される。それゆえに、本発明の範囲は、上記説明を参照することなく決定されるはずであるが、代わりに、添付の特許請求の範囲を、請求の範囲が権利付与される等価物の全範囲とともに、参照して決定されるべきである。
【０１８５】
本発明は、上の実施例に関して詳細に記載されているが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱すること無くなされ得ることが理解される。従って、本発明は、下記の特許請求の範囲によってのみ制限される。本出願において言及される全ての引用した特許、特許出願および刊行物は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】
【表２】
【０１８８】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する、添付の図面は、本発明の実施形態を図示し、本明細書の記載とともに、発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、本発明の実施形態のソフトウェアを実施するのに利用され得る、コンピュータシステムの例を図示する。
【図２】図２は、図１のコンピュータシステムのシステムブロック図を図示する。
【図３Ａ】図３は、２つのコピーＸ染色体を有する個体と比較して、Ｘ染色体の１、３、４、もしくは５コピーを有する個体からのＸ染色体上のＳＮＰの対数強度のプロットを示す。図３Ａは、個体のプロットを示し、図３Ｂは、実験値について観察される直線の関係を示す、コピー数の対数に対する強度比の対数のプロットを示す。
【図３Ｂ】図３は、２つのコピーＸ染色体を有する個体と比較して、Ｘ染色体の１、３、４、もしくは５コピーを有する個体からのＸ染色体上のＳＮＰの対数強度のプロットを示す。図３Ａは、個体のプロットを示し、図３Ｂは、実験値について観察される直線の関係を示す、コピー数の対数に対する強度比の対数のプロットを示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年４月３０日に出願された米国仮出願第６０／４６７，１０５号、２００２年１１月１１日に出願された第６０／３１９，６８５号、および２００２年１２月３日に出願された６０／３１９，７５０号の優先権を主張し、それらの開示は、その全体が参考として本明細書中で援用される。
（発明の分野）
本発明は、サンプル中に存在するゲノム領域のコピー数を推定する方法に関する。具体的には、本発明は、生物学的サンプルからの染色体の増幅領域および欠失領域を検出するための方法、コンピュータソフトウェア製品およびシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
正常細胞をガン細胞へと形質転換する遺伝的事象の基礎的進行は、二倍体状態から異数体状態へのシフトによって特徴付けられる（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎら（２００３），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．３６９−７６およびＬｅｎｇａｕｅｒら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９６，ｐｐ．６４３−９）。ゲノムの不安定性の結果として、ガン細胞は、点変異から全染色体異常までの複数のレベルで無作為な変異および原因がある変異を蓄積する。ＤＮＡのコピー数変化としては、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）およびホモ接合性の欠失、これは、腫瘍抑制遺伝子の喪失および遺伝子増幅事象、細胞内の癌原遺伝子の活性化を生じ得るがこれらに限定されない。腫瘍細胞の複雑な核型を解明するための連続したチャレンジの一つが、ＬＯＨの獲得及び喪失のリストを全体的に作成し得る、高い分解能と正確性の両方を有し改善された分子方法の開発である。
【０００３】
多くの分子アプローチが、腫瘍内でのゲノム全体のＬＯＨおよびコピー数変化を同定するために記載されている。腫瘍と血液サンプルのペアを使用して、対立遺伝子の喪失を同定するために設計された古典的なＬＯＨの研究は、制限断片長多型（ＲＥＬＰ）を使用し、多型のマイクロサテライトマーカー（ＳＴＲＳ、ＶＮＴＲ）を使用している。網膜芽細胞腫遺伝子であるＲｂ１のＬＯＨ分析を使用したＫｎｕｄｓｏｎツーヒット腫瘍形成モデルの実施により変異対立遺伝子のコピー数が、生物学的に異なる第二のヒットメカニズムの結果として１コピーから３コピーまで変化し得ることが示された（Ｃａｖｅｎｅｅら（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０５、ｐｐ．７７９〜８４）。従って、ＬＯＨを起こす領域は、必ずしもＤＮＡコピー数の変化を含むわけではない。ゲノム範囲の増加もしくは減少をＤＮＡコピー数において、測定するためのアプローチとしては、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５８，ｐｐ．８１８〜２１），スペクトル核型分析（ＳＫＹ）（Ｓｃｈｒｏｃｋら（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ．４９４〜７），蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｐｉｎｋｅｌら（１９８８），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．９１３８〜４２），ＲＤＡのような分子サブトラクション（Ｌｉｓｉｔｓｙｎら（１９９５），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．１５１〜５．；Ｌｕｃｉｔｏら（１９８８），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５，ｐｐ．４４８７〜９２），およびデジタル核型分析（Ｗａｎｇら（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１６１５６〜６１．）が挙げられる。おそらく最も広範に使用され、強力なアプローチであるＣＧＨは、蛍光色素でそれぞれ標識された正常細胞および腫瘍細胞由来のＤＮＡの混合物を使用する。標的ＤＮＡは、中期の染色体、または配列ＣＧＨにおいて、ｃＤＮＡクローン（Ｐｏｌｌａｃｋら（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１２９６３〜８）、または細菌性の人工染色体（ＢＡＣ）およびＰ１人工染色体（ＰＡＣ）（Ｓｎｉｊｄｅｒｓら（２００１），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２６３〜４，Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．２０７〜１１）に競合的にハイブリダイズされる。しかし、中期の染色体へのハイブリダイゼーションは、１０Ｍｂ〜２０Ｍｂに対する分解能を限定し、わずかな獲得および喪失の検出を不可能にする。整列したｃＤＮＡクローンの使用は、ゲノム内の転写的に活性な領域の解析を可能にする一方で、そのハイブリダイゼーションの反応速度論は、大きなゲノムクローンを使用する場合ほど均一ではないかもしれない。現在、ゲノムにわたるＢＡＣクローンの利用可能性によって、ＣＧＨの分解能は、１Ｍｂ〜２Ｍｂに制限されるが、最近のオリゴヌクレオチドの使用は、１５ｋｂにまで分解能を改善する（Ｌｕｃｉｔｏら（２００３），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．，ｐｐ．）。しかし、ＣＧＨは、一つの対立遺伝子が存在するようなＬＯＨを起こすゲノムの領域の同定には十分には適していないが、コピー数の減少は存在しない。
【０００４】
ヒトゲノムの完了とともに、個人間で最も代表的な配列多様性である１塩基多型（ＳＮＰ）が、その量、安定性ならびに相対的なスコアリングの容易さに起因して、大規模な遺伝的研究におけるマーカーの選択の対象として出現する。これらの同様の特性が、ＳＮＰをＬＯＨ研究についての強力なマーカーにする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、コピー数における変化を検出し、コピー数を評価するための核酸アレイからの分析に適切な方法、システムおよびコンピュータソフトウェア製品を提供する。例えば、プローブアレイは、個人のＳＮＰの遺伝子型を決定するために複数のＳＮＰの各々に対して複数のプローブを使用する遺伝子型決定アレイであり得るか、あるいはゲノムまたはゲノムの位置、例えば、全染色体にわたって１００塩基ごとの同じ距離で間隔をあけられるプローブのアレイであり得る。
【０００６】
一つの実施形態において、実験サンプル中のゲノムの増幅領域および欠失領域を同定する方法が、開示される。そのサンプルは、実験サンプル由来の核酸を単離する工程、核酸の少なくともいくつかの領域を増幅する工程；増幅産物を標識する工程によって調製される。標識増幅産物が、遺伝子型決定アレイにハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーションパターンを得る。その遺伝子型決定アレイは、複数のＳＮＰについての複数の遺伝子型決定プローブセットを含む。プローブセットは、ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、ＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、およびＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、を含む。ハイブリダイゼーションパターンは、実験サンプルにおけるＳＮＰについての測定値を得るために使用される。測定値Ｓは、ハイブリダイゼーションパターンにおけるＳＮＰについての完全一致プローブの強度の算術平均の対数である。Ｓ値は、遺伝子型呼出しにおける実験サンプルに一致する複数の参照サンプルの各々におけるＳＮＰについてもまた計算される。参照サンプルについての平均および標準偏差は、Ｓ値において得られた値を使用して計算され、対数強度差は、参照サンプルおよび実験サンプルについての平均値を減算することで計算される。ＳＮＰを含む領域のコピー数は、対数−対数直線モデルにおいて、参照サンプルにおけるＳＮＰについての平均値と実験サンプルにおけるＳＮＰについてのＳ値との間の差を使用することにより推定される。
【０００７】
一つの実施形態において、実験サンプルおよび各参照サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰについてのＳ値は、サンプルにおける全ての常染色体のＳＮＰについての平均が０であり、そしてその分散が１であるように正規化される。
【０００８】
別の実施形態においてｐ値は、推定したコピー数変化について推定され、そのｐ値が、ｐ値における閾値より小さい場合、コピー数変化の評価した方向は有意である。
【０００９】
好ましい実施形態において、Ｓ値は、
【００１０】
【数２８】
を使用して推定される。
ここにおいて、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であって、Ｘはある組おける完全一致プローブの数である。Ｓを計算するために使用される完全一致プローブの数は、１と３０の間であり得る。好ましい実施形態において、２０ＰＭプローブが、使用される。
【００１１】
一つの実施形態においてコピー数は、
【００１２】
【数２９】
を使用して推定され、ここで、
【００１３】
【数３０】
は、実験サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰのＳ値に対し正規化された、実験サンプルｃ中の遺伝子型ｇのＳＮＰｊについての完全一致プローブの強度平均の対数であって、
【００１４】
【数３１】
は、ＳＮＰｊでの遺伝子型ｇの複数の参照サンプル中のＳＮＰｊについて正規化されたＳ値の平均である。
【００１５】
別の実施形態において、ｐ値は、
【００１６】
【数３２】
を使用して推定されるコピー数変化の方向について計算される。得られたｐ値は、評価の方向が有意であるか否かを決定するのに使用される。
【００１７】
実験サンプルは、腫瘍、腫瘍細胞および正常細胞の混合物もしくは疾患を有すると推測される供給源由来であり得る非ガン細胞由来であり得る。
【００１８】
別の実施形態においてコピー数は、
【００１９】
【数３３】
を使用して評価され、ここで、
【００２０】
【数３４】
は、実験サンプルにおける遺伝子型決定された全てのＳＮＰのＳ値に対して正規化された、実験サンプルｃ中の遺伝子型ｇのＳＮＰｊについての完全一致プローブの強度の平均の対数であって、
【００２１】
【数３５】
は、ＳＮＰｊでの遺伝子型ｇの複数の参照サンプル中のＳＮＰｊについての正規化されたＳ値の平均であり、ｂは、ｙ切片であり、そしてｍは、既知のコピー数のＳＮＰに起因した強度値をプロットすることにより規定された直線の傾きである。一つの実施形態において、その直線は、異なる数のＸ染色体上の変化した数を有するコントロールサンプルを使用してＸ染色体上のそのＳＮＰからの強度値をプロットすることにより定義される。
【００２２】
別の実施形態においてコピー数の第二の推定は、参照サンプルに一致する複数の遺伝子型におけるそのＳＮＰからの平均ＤＲと実験サンプル中の、ＳＮＰの判別比であるＤＲとを比較することで得られ、ここにおいて、２０ＰＭ／ＭＭプローブ対を有するプローブセットについてのＤＲは、
【００２３】
【数３６】
を使用して計算される。
【００２４】
別の実施形態において、Ｓ値の平均よりも３標準偏差上で得られる各Ｓ値は、参照サンプルの平均および分散の推定から除外される。
【００２５】
別の実施形態において、少なくとも一つのヘテロ接合性を喪失する領域は以下の工程によって実験サンプル中で同定される：実験サンプルの遺伝子型におけるホモ接合性のＳＮＰの遺伝子型呼出しの少なくとも一つの連続した配列を同定する工程；連続した広がりにおける各ＳＮＰについてのホモ接合性の確率
【００２６】
【数３７】
を得る工程であって、ここで
【００２７】
【数３８】
である工程；
連続した配列におけるＳＮＰの各々がホモ接合性である確率を、
【００２８】
【数３９】
を使用することにより、計算する工程；および、
【００２９】
【数４０】
がｐ値における閾値より小さい場合、ヘテロ接合性を喪失する領域としてＳＮＰを含む領域を同定する工程。例えば、連続した配列におけるＳＮＰの数は、１０〜１００である。
【００３０】
別の実施形態において、コピー数が、
【００３１】
【数４１】
を使用して実験サンプルにおいて同定された領域内の少なくとも一つのＳＮＰについてのＳ値を計算することによりヘテロ接合性を喪失する領域として同定される領域について推定され、ここで、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であって、Ｘは、ある組におけるプローブ対の数であり、Ｓ値を正規化し；
正規化されたＳ値は、複数の一致した遺伝子型呼出しの参照サンプル由来の少なくとも一つのＳＮＰについて計算され、参照サンプルの正規化されたＳ値の平均は、ＳＮＰについて計算される。実験サンプルにおけるＳＮＰについての正規化されたＳ値は、参照サンプルにおけるＳＮＰについての正規化されたＳ値の平均と比較され、比を得る；実験サンプルにおけるＳＮＰのコピー数は、対数−対数直線モデルを使用して推定される。これは、サンプルにおける２つ以上のＳＮＰについてなされ得、ｐ値が、計算され得る。
【００３２】
別の実施形態において、二つ以上の連続したＳＮＰのコピー数の推定が、複数の以下により、その有意性について評価される；参照サンプルに対して、全てがコピー数の減少を示すか、または全てがコピー数増加を示すかのいずれかである二つ以上のＳＮＰの配列を同定する工程；
【００３３】
【数４２】
を計算する工程；
標準的なφ関数を使用して
【００３４】
【数４３】
を確率へと転換してｐ値を得る工程；および、
その推定値が、ｐ値の閾値を使用して有意であることを結論づける工程
別の実施形態において、一つ以上のヘテロ接合性を喪失する領域が、
上記実験サンプル由来の標的配列の収集物を増幅する以下の工程によって、実験サンプルで検出される；
増幅した標的配列を、設計されたプローブのアレイにハイブリダイズし、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによって標的配列の集合中の多型の集合を取り出し、実験サンプル由来のハイブリダイゼーションパターンを生じさせる工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションパターンは、複数のＳＮＰについての完全一致プローブおよびミスマッチプローブの強度測定を含む工程。実験サンプルにおける各ＳＮＰにおいての完全一致プローブの平均ハイブリダイゼーション強度が、計算され、アレイ上の全てのＳＮＰの平均ハイブリダイゼーション強度が、正規化される。アレイ上の各ＳＮＰについてのＳＮＰの判別比が、計算される。実験サンプルからの個別のＳＮＰの判別比およびハイブリダイゼーション強度が、複数の参照サンプルからの個別のＳＮＰについてのＳＮＰの判別比の平均ならびにハイブリダイゼーション強度である、ＳＮＰ判別比およびハイブリダイゼーション強度と比較され、ここで参照サンプル内での可変性が考慮され、実験サンプルにおけるＤＮＡコピー数変化を有する領域が、同定される。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
（（Ａ）概論）
本発明は、多くの好ましい実施形態を有し、当業者に公知の詳細について多くの特許、特許出願および他の参考文献に依存する。それゆえに、特許、特許出願もしくは他の参考文献が引用されるか、または下で繰り返される場合、それが、全ての目的のために、そして記載される主張のために、その全体が参考として援用されると理解されるべきである。
【００３６】
本出願で使用されるように、単数形式、「ａ」、「ａｎ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈に、他で明確な指示がない場合、複数の参照を含む。例えば、用語「薬剤」は、複数の薬剤（その混合物を含む）を含む。
【００３７】
個体は、ヒトに限定されないが、哺乳類、植物、細菌、もしくは上記のいずれかに由来する細胞を含むがこれに限定されないことを含む他の生物であり得る。
【００３８】
本開示を通して、本発明の種々の局面は、範囲を用いた形式において示され得る。範囲を用いた記載は、単に便利さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲について柔軟性のない限定として解釈されるべきでないと理解されるべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内で、可能な限りの全ての部分的な範囲および全ての個々の数値を具体的に開示するとして考慮されるべきである。例えば、１〜６といった範囲の記載は、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的な範囲、ならびに１、２、３、４、５および６というその範囲内での個別の数を具体的に開示すると考慮されるべきである。このことは範囲の広さにかかわらず適用される。その対数の関数に関する全ての参照は、他に規定されない場合（ｌｏｇ１０）、底としてｅ（自然対数）を採用する。
【００３９】
本発明の実施は、他に指示されない場合、当該分野の技術の範囲内である有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、生物化学および免疫学の通常の技術、および記載を使用し得る。そのような通常の技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の詳細な例示は、本明細書中で下記の実施例を参照してなされ得る。しかし、当然、他の等価な通常の手順もまた使用され得る。そのような通常の技術ならびに記載は、標準的な研究所のマニュアルに見出され得る。（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより），Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」 １９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹおよびＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、その全ては、本明細書中で、全ての目的のための参考として、その全体が援用される）。
【００４０】
本発明は、いくつかの好ましい実施形態におけるアレイを含む、固体の基材を使用し得る。（タンパク質を含む）ポリマーアレイ合成に適用可能な方法および技術は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、ＷＯ公開番号００／５８５１６号、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号および同第６，４２８，７５２号中、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０号（国際公開番号ＷＯ９９/３６７６０）および第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５号中に記載され、これらは全て本明細書中で、全ての目的のためにその全体が、参考としてその全体が援用される。
【００４１】
特定の実施形態における合成技術を説明する特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号、および同第５，９５９，０９８号が挙げられる。核酸配列は、上記特許の多くに記載されるが、同様の技術がポリペプチド配列に適用される。
【００４２】
本発明で有用である核酸アレイは、商標名ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から市販されるアレイが挙げられる。例示的なアレイは、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍでウェブサイト上に示される。
【００４３】
本発明はまた、固体基材に結合するポリマーについての多くの使用を意図する。これらの用途としては、遺伝子発現のモニタリング、プロファイリング、ライブラリスクリーニング、遺伝子型の決定ならびに診断が挙げられる。遺伝子発現のモニタリング法、およびプロファイリング法は、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，０１３，４４９号、同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１３８号、同第６，１７７，２４８号および同第６，３０９，８２２号で示され得る。従って、遺伝子型決定および使用は、米国特許出願同第６０／３１９，２５３号、同第１０／０１３，５９８号並びに米国特許第５，８５６，０９２号、同第６，３００，０６３号、同第５，８５８，６５９号、同第６，２８４，４６０号、同第６，３６１，９４７号、同第６，３６８，７９９号および同第６，３３３，１７９号で示される。他の用途は、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，９０２，７２３号、同第６，０４５，９９６号、同第５，５４１，０６１号および６，１９７，５０６号で具体化される。
【００４４】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるサンプルの調製方法を意図している。遺伝子型決定より前にまたはそれと同時に、遺伝子サンプルは、種々の機構によって増幅され得、そのいくつかはＰＣＲを使用し得る。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １，１７（１９９１）；ＰＣＲ（Ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号および同第５，３３３，６７５号を参照のこと。その各々は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中で援用される。サンプルは、アレイ上で増幅され得る。例えば、参考として援用される、米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願第０９／５１３，３００号、を参照のこと。
【００４５】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０）），転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ９０／０６９９５），標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号），相同配列プライマーＰＣＲ（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意配列プライマーＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号）および核酸に基づく配列の増幅（ＮＡＢＳＡ）が、挙げられる（米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号および同第６，０６３，６０３号を参照のこと。その各々は、本明細書中に参考として援用される）。使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号および米国特許出願第０９／８５４，３１７号に記載され、その各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００４６】
サンプル調製のさらなる方法（Ｄｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１））ならびに核サンプルの複雑性を減少させるための技術は、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号および米国特許出願第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号および同第１０／０１３，５９８号における、に記載される。
【００４７】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実行するための方法は、当該分野において十分に開発されしている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順ならびに条件は、適用によって変化し、Ｍａｎｉａｔｉｓら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８７）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）で言及されるような方法を含む、公知の一般的な結合方法に従って選択される。反復され、制御されたハイブリダイゼーション反応を実行するための方法ならびに装置が、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号に記載され、その各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００４８】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるリガンド間のハイブリダイゼーション信号の検出を考慮する。米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８３４，７５８号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（ＷＯ９９／４７９６４号として公開中の）を参照のこと。その各々はまた、全ての目的のためにその全体が、参考として本明細書中に援用される。
【００４９】
信号の検出および強度データの処理のための方法および装置が、例えば米国特許番号第５，１４３，８５４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８００，９９２号、同第５，８３４，７５８号、同第５，８５６，０９２号、同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号；および米国特許出願第６０／３６４，７３１号、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（ＷＯ９９／４７９６４号として公開）中に開示される。その各々はまた、全ての目的のためにその全体が、参考として本明細書中に援用される。
【００５０】
本発明の実施は、通常の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムを使用し得る。本発明のコンピュータソフトウェア製品は、通常、本発明の方法の論理的工程を実行するためのコンピュータが実行可能な命令を有するコンピュータの読出し可能な媒体を含む。適切なコンピュータの読出し可能媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。コンピュータが実行可能な命令は、適切なコンピュータ言語もしくは、複数の言語の組み合せにおいて記述され得る。基本的なコンピュータ生物学の方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ，（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）およびＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，２００１）に記載される。
【００５１】
本発明は、また、種々のコンピュータプログラム製品ならびにプローブの設計、データの管理、解析および機器の操作といった種々の目的のためのソフトウェアを利用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号を参照のこと。
【００５２】
さらに、本発明は、米国特許出願第１０／０６３，５５９号、同第６０／３４９，５４６号、同第６０／３７６，００３号、同第６０／３９４，５７４号、同第６０／４０３，３８１号において示されるように、インターネットのようなネットワークを介して遺伝的情報を提供するための方法を包含する好ましい実施形態を有し得る。
【００５３】
本発明は、米国特許出願第１０／２６４，９４５および米国の特許仮出願第６０／４１７，１９０号および同第６０／３１９，６８５号に関し、それらは、全ての目的のためにその全体が、参考として本明細書中に援用される。
（（Ｂ）定義）
本発明に従って、核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基（好ましくは、シトシン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニン）、任意のポリマー、またはオリゴマーをそれぞれ含み得る（Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９３〜８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）を参照のこと。この文献は、全ての目的のためにその全体が本明細書中で援用される）。実際に、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸成分、および任意の化学的改変体にこれらの塩基のメチル化様式、ヒドロメチル化様式またはグリコシル化様式などを意図する。ポリマーまたはオリゴマーは、組成において異質または同質であり得、および天然に発生する供給源から単離され得るか、もしくは人工的または合成的に生産され得る。さらに、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡもしくはその混合物であり得、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖およびそのハイブリッド状態を含む、シングルストランドもしくはダブルストラランド形態において、永久にまたは一過性に存在し得る。
【００５４】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、その長さにおいて少なくとも２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド，１５ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドの範囲にある核酸であるが、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチドもしくは５０００ヌクレオチド長までであり得るか、またはポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする化合物である。本発明のポリヌクレオチドとしては、天然の供給源から単離され得るか、組換え産生され得るか、または人工的に合成され得る、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列、またはその模倣物が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る（米国特許第６，１５６，５０１号を参照のこと。これは本明細書中に参考としてその全体が援用される）。本発明はまた、特定のｔＲＮＡ分子において同定され、三重へリックス中に存在すると仮定されるＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対のような伝統的でない塩基対が存在するような状態を包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本出願において、互換可能で使用される。
【００５５】
用語、フラグメントとは、より大きなＤＮＡポリヌクレオチドの一部またはＤＮＡをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、複数のフラグメントにバラバラにされ得るか、または断片化され得る。核酸を断片化する様々な方法は、当該分野において周知である。例えば、これらの方法は、本質的に、化学的または物理学的のどちらかであり得る。化学的断片化としては、ＤＮａｓｅによる部分的な分解；酸による部分的脱プリン化；制限酵素の使用；イントロンにコードされエンドヌクレアーゼ；核酸分子における特定の位置に対して切断薬剤を局在化するための核酸断片の特異的ハイブリダイゼーションに依存した、三重鎖形成法やハイブリッド形成法のようなＤＮＡ塩基切断方法；あるいはＤＮＡを既知または未知の位置で切断する他の酵素もしくは化合物、が挙げられ得る。物理学的断片化方法としては、ＤＮＡを高切断率に供する工程をが挙げられ得る。例えば、高切断率は、窪みやスパイクを有するチャンバーまたはチャネルを通してＤＮＡを移動する工程あるいは、例えばマイクロもしくはマイクロ未満のスケールでの断面積とを有する開口部のような、制限されたサイズの流動通過を通すように、ＤＮＡサンプルに力を加える工程によって実現され得る。他の物理学的な方法は、超音波処理および噴霧が挙げられる。熱およびイオン媒介加水分解による断片化のような物理学的に、片化方法および化学的断片化方法の組み合わせが、同様に使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」３ｒｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）（「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」）を参照のこと（全ての目的のために本明細書中にその全体が参考として援用される）。これらの方法は、核酸を選択されるサイズの範囲のフラグメントに消化するのに最適化され得る。有用なサイズ範囲は、１００塩基対，２００塩基対，４００塩基対、７００塩基対または１０００塩基対から、５００塩基対，８００塩基対，１５００塩基対，２０００塩基対，４０００塩基対または１０，０００塩基対であり得る。しかし、４０００塩基対、１０，０００塩基対または２０，０００塩基対から、１０，０００塩基対、２０，０００塩基対または５００，０００塩基対のようなより大きなサイズの範囲もまた、有用であり得る。
【００５６】
アダプター配列またはアダプターは、一般的に、少なくとも５、１０、または１５塩基長、好ましくは５０または６０塩基長以下のオリゴヌクレオチドであるが、それらは１００または２００塩基まで、より長くなり得る。アダプター配列は、当業者に公知の任意の方法を使用して合成され得る。本発明の目的のために、これらは、ＰＣＲのプライマーのためのテンプレート、制限酵素サイトおよびプロモーターを必要に応じて含み得る。アダプターは、全体的にまたは実質的にダブルストランドであり得る。アダプターは、一方の差においてか、または両方の差において、リン酸化されていても、されていなくても良い。アダプターは、それらが実質的に二本鎖領域、および制限酵素で消化されることにより作成される一本鎖領域に対して相補的である短い一本酸領域領域を含む場合、本発明の一つの実施形態において特に有用である。例えば、ＤＮＡが、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化され、生じた二本鎖フラグメントが、一本鎖化突出５’−ＡＡＴＴ−３’とどちらかの末端で隣接する場合、一本鎖突出５’−ＡＡＴＴ−３’を有するアダプターが、突出領域の間の相補性を介してフラグメントとハイブリダイズする。フラグメントへのアダプターの「粘着末端」ハイブリダイゼーションは、フラグメントに対するアダプターの連結を容易にし得るが、平滑末端ライゲーションもまた可能である。
【００５７】
「ゲノム」は、生物体のＤＮＡとしてコードされる、生物体についての遺伝的命令の、完全な、１コピーのセットを示すか、または意味する。ゲノムは、ＤＮＡが複数の個別の染色体中で、細胞内に分配されるような複数の染色体であり得る。例えば、ヒトにおいて、性別関連のＸＸ対またはＸＹ対に加え、２２対の染色体がある。
【００５８】
用語「染色体」は、クロマチン由来であり、ＤＮＡおよびタンパク質成分（特にヒストン）を含む生細胞の遺伝を保持する遺伝子のキャリアをいう。従来の国際的に認識された個人のヒトゲノム染色体の番号付けが、本明細書中で使用される。個々の染色体のサイズは、ある種類と所与の複数の染色体ゲノムを有する別の種類との間で、およびあるゲノムと別のゲノムとの間で変化する。ヒトゲノムの場合に、所与の染色体の全体のＤＮＡ量は、通常、約１００，０００，０００ｂｐより大きい。例えば、ヒトゲノム全体のサイズは、約３×１０９ｂｐである。最大の染色体である第１番染色体は、約２．４×１０８ｂｐを含む一方、最少の染色体である第２２番染色体は、約５．３×１０７ｂｐを含む。
【００５９】
「染色体領域」は、染色体の一部である。実際の物理学的サイズまたは任意の個々の染色体領域の範囲は、大きく変化し得る。用語「領域」は、領域が、個々の遺伝子の特定のコード断片（エキソン）を特に考慮に入れる必要がないことから、特定の一つ以上の遺伝子を必ずしも決定するわけではない。
【００６０】
用語サブセットまたは代表的なサブセットとは、ゲノムの画分をいう。サブセットは、ゲノムの０．１、１、３、５、１０、２５、５０または７５％であり得る。サブセットへのフラグメントの分配は、個々のフラグメントの物理学的特性の多様性に従ってなされ得る。例えば、フラグメントは、サイズに従って、フラグメントの終点での制限部位の特定の組み合わせに従ってか、または一つ以上の特定の配列の存在もしくは不在に基づいてサブセットへと分割され得る。
【００６１】
「アレイ」は、支持体と付着される核酸のプローブを有する支持体、好ましくは固体を包含する。好ましいアレイは、典型的に、それぞれの既知の位置において機材の表面と結合する複数の異なる核酸プローブを含む。「マイクロアレイ」もしくは、口語的に「チップ」として記載されるこれらのアレイは、一般的に当該分野において、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，４４５，９３４号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、同第５，８００，９９２号、同第６，０４０，１９３号、同第５，４２４，１８６号およびＦｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）に記載される。その各々は、全ての目的のために参考としてその全体が援用される。
【００６２】
アレイは、一般的に機械的な合成方法または写真平板法および固相合成法の組み合せを組み込む光指向性の合成法といった様々な技術を使用して製造され得る。機械的な合成法を使用したこれらの配列の合成のための技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号もしくは同第６，０４０，１９３号において記載され、これらは、全ての目的のためにその全体が、本明細書中で参考文献として援用される。平面アレイの表面が好ましいが、アレイは、実質的に任意の形状の表面上においてか、または多数の表面上においてさえも作成される。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマーの表面、光ファイバのような線維、ガラスもしくは任意の他の適切な基材上の核酸であり得る（米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、同第５，８００，９９２号を参照のこと、それらは全ての目的のための本明細書中でその全てが参考として援用される）。
【００６３】
アレイは、診断使用を考慮するような様式において包装され得るか、または全てを含む様式であり得る；例えば、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号、それらは全ての目的のために本明細書中でその全てが、参考として援用される。
【００６４】
好ましいアレイが、商標ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）のもとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘより市販され、種々の真核生物種および原核生物種のための遺伝子型の決定および遺伝子発現の観察を包含する種々の目的に向けられる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａおよびａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍでのそれらのウェブサイトを参照のこと）。
【００６５】
ハイブリダイゼーションプローブは、核酸の相補的な鎖に対し塩基特異的な様式における結合の可能なオリゴヌクレオチドである。そのようなプローブとしては、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載されるようなペプチド核酸、および他の核酸アナログおよび核酸の模倣物が挙げられる。１９９６年４月３日に出願された米国特許出願第０８／６３０，４２７号を参照のこと。
【００６６】
例えば、ハイブリダイゼーションは、通常、緊縮条件下、１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で実行される。例えば、５Ｘ ＳＳＰＥの条件（７５０ｍＭ 塩化ナトリウム，５０ｍＭ 燐酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ７．４）および２５℃〜３０℃の温度が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションについて適切である。例えば、緊縮条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈｅおよびＭａｎｉａｔｉｓ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。それらは上記の全ての目的のために本明細書中でその全てが、参考として援用される。
【００６７】
対立遺伝子とは、細胞内の、個体内のまたは集団内の（遺伝子といった）遺伝的配列（例えば、遺伝子）のある特定の形態、少なくとも一つの配列における同じ遺伝子の他の形態と異なるある特定の形態および頻繁には、一つよりも多くの遺伝子配列内の変異部位をいう。種々の対立遺伝子間で異なるこれらの変異部位の配列は、「多様性」、「多型」または「変異体」と呼ばれる。各常染色体の特定の染色体位置もしくは「座」で、個体は、一つの片親から遺伝した一つ、ならびにもう１人の親から遺伝した一つ、（例えば、母親からの一つおよび父親からの一つ）といった二つの対立遺伝子を保有する。ある座において２つの異なる対立遺伝子を有する場合、個体は、その座において「ヘテロ接合性」である。ある座において二つの同じ対立遺伝子を有する場合、個体は、その座において「ホモ接合性」である。
【００６８】
多型とは、集団における二つ以上の遺伝的に決定された代替的な配列もしくは対立遺伝子の出現をいう。多型のマーカーまたは部位は、分岐が起こる座である。好ましいマーカーは、少なくとも二つの対立遺伝子を有し、それぞれ、好ましくは１％より大きい頻度で、そしてより好ましくは選択した集団の１０％もしくは２０％より大きい頻度で起こる。多型は、ひとつ以上の塩基の変化、挿入、繰り返しまたは欠失を含み得る。多型の座は、一つの塩基対と同程度に小さくなり得る。多型のマーカーは、制限フラグメント長多型、多様な数の縦列反復配列（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純な配列の反復、およびＡｌｕのような挿入要素が挙げられる。第一の同定された対立遺伝子の形態は、参照の形態として任意に指定され、対立遺伝子形態は、代替的な対立遺伝子または改変対立遺伝子として命令される。選択された集合において最も頻繁に起こる他の対立遺伝子の形態は、時折、野生型形態として言及される。二倍体組織体は、対立遺伝子の形態についてホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。二つの対立遺伝子の多型は二つの形態を有する。三つの対立遺伝子の多型は、三つの形態を有する。二つの核酸の間の多型は、天然に起こり得るか、あるいは化学物質、酵素もしくは他の薬剤に曝露、もしくは接触することによって、あるいは核酸に対してダメージを生じる薬剤、例えば、紫外線照射、突然変異誘発物質、発癌物質に曝露することにより生じ得る。
【００６９】
用語、遺伝子型決定は、ゲノムにおける一つ以上の位置における個体が保有する遺伝情報の決定をいう。例えば、遺伝子型決定は、一つのＳＮＰについて個体が保有する対立遺伝子の決定または複数のＳＮＰについて個体が保有する対立遺伝子の決定を含む。例えば、ゲノムにおける特定のヌクレオチドは、いくつかの個体においてＡもであり、他の個体においてＣであり得る。その位置でＡを有する個体は、Ａ対立遺伝子を有し、Ｃを有する個体は、Ｃ対立遺伝子を有する。二倍体生物において、固体は、その個体がＡ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子、もしくは代わりに２コピーのＡ対立遺伝子のまたは２コピーのＣ対立遺伝子を有するように、多型位置を含む２コピーの配列を有する。２コピーのＣ対立遺伝子を有する個体は、Ｃ対立遺伝子においてホモ接合性であり、２コピーのＡ対立遺伝子を有する個体は、Ｃ対立遺伝子についてホモ接合性であり、１コピーの各対立遺伝子を有する個体は、ヘテロ接合性である。配列は、３つのあり得る結果の各々の間で識別するように設計され得る。多型位置は、二つ以上の可能な対立遺伝子を有し得、そのアレイは、全ての可能な組み合わせを区別するよう設計される。
【００７０】
連鎖不均衡もしくは対立遺伝子の関連とは、集合において何らかの特定の対立遺伝子の頻度についての偶然、期待されるよりも高い頻度で付近の染色体の位置での、特定の対立遺伝子もしくは遺伝的マーカーと、特定の対立遺伝子もしくは遺伝的マーカーとが優先的に関連することを意味する。例えば、座Ｘが、同じ頻度で起こる対立遺伝子ａおよびｂを有し、連鎖した座Ｙが、同じ頻度で起こる対立遺伝子ｃおよびｄを有する場合、組み合せａｃが、頻度０．２５で起こることが予期される。ａｃがより頻繁に起こる場合、対立遺伝子ａおよびｃは、連鎖不均衡である。例えば、連鎖不均衡は、それらの領域が物理的に近いので、もしくは対立遺伝子が連鎖した対立遺伝子と平衡状態に達するには新しく集団に導入されたので、対立遺伝子の特定の組み合わせの天然の選択により生じる。連鎖の不均衡に置けるマーカーは、そのマーカーが疾患を生じないにもかかわらずその疾患（または他の表現型）に対する感受性を検出するのに特に有効であり得る。例えば、それ自体は、疾患の原因要素ではないが、表現型の原因要素である遺伝子（Ｙ）（調節配列を含む）と連鎖不均衡である、マーカー（Ｘ）は、遺伝子Ｙが同定されていないかもしれないか、または容易には検出できないかもしれない状況でその疾患に対する感受性を示すために検出され得る。
【００７１】
一つ以上の座でヘテロ接合性である正常細胞は、その座でホモ接合性である腫瘍細胞を生じ得る。このヘテロ接合性の喪失は、正常遺伝子の構造欠失、または正常遺伝子を有する正常細胞の欠失、正常遺伝子と変異遺伝子の間の有糸分裂組み換えとその後の欠失または不活性化（変異）遺伝子についてホモ接合性である娘細胞の形成から生じえるか；あるいは正常遺伝子を有する染色体の喪失、および欠失もしくは不活性化された（変異）遺伝子を有する染色体の重複から生じる。
【００７２】
ホモ接合性の欠失は、遺伝子またはゲノム領域の両方のコピーの欠失である。２倍体生物は、２コピーの各常染色体を一般的に有し、従って、２コピーの任意の選択されたゲノム領域の二つのコピーを有する。ゲノム領域の両方のコピーが、存在しない場合、その細胞またはサンプルは、その領域のホモ接合性の欠失を有する。同様に、ヘミ接合性の欠失は、遺伝子またはゲノム領域の一つのコピーの欠失である。
【００７３】
遺伝的再配列は、ＤＮＡの複製においてエラーが起こる場合におこり、クロスオーバーが、ある染色体の位置から別の位置へ移動する遺伝的物質を生じる非相同性領域の間で起こる。再配列は、その再配列付近でその遺伝子の変化した発現を生じ得る。
【００７４】
異数体は、染色体の構成が真の二倍体から変化している細胞（例えば、染色体もしくは染色体領域の余分なコピー）であるような細胞である。
【００７５】
個体は、ヒトに限定されないが、他の生物（哺乳動物、植物、細菌もしくは上のどれかに由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない）もまた包含する。
【００７６】
全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）は、サンプルにおけるフラグメントのサブセットを増幅することにより核酸サンプルの複雑性を減少する。核酸サンプルは、一つ以上の制限酵素によって断片化され、アダプターは、それらのフラグメントの両末端と接続される。結合配列と相補的であるプライマーは、ＰＣＲを使用してそれらのフラグメントを増幅するのに使用される。ＰＣＲの間、選択されるサイズ範囲のフラグメントが、選択的に増幅される。そのサイズの範囲は、例えば、４００塩基対〜８００塩基対もしくは４００塩基対〜２０００塩基対であり得る。選択されるサイズの範囲外であるフラグメントは、効率的に増幅されない。
【００７７】
ＷＧＳＡにより増幅されるフラグメントは、インシリコ消化によって予測され得、アレイが、増幅されると予測されるＳＮＰを遺伝子型決定するように設計され得る。遺伝子型決定は、ＳＮＰの個別の対立遺伝子に対し完全に相補的であるプローブを使用した対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによってなされ得る。各ＳＮＰを囲む領域に対し相補的であるプローブのセットが、そのアレイ上に存在し得る。完全一致プローブは、そのプローブの全長にわたって標的に対し相補的である。ミスマッチプローブは、一つのミスマッチ塩基以外で、ＰＭプローブと、同一である。そのミスマッチの位置は、一般的には、中央の位置であり、そのため２５塩基のプローブについては、ミスマッチが１３位である。
【００７８】
上記方法は、他のゲノム解析方法および複雑性を減少する方法と組み合わされ得る。例えば、複雑度を減少する他の方法としては、例えば、ＡＦＬＰ（米国特許第６，０４５，９９４号（これらは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。任意配列プライマーＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）(ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄおよびＷｅｌｓｈ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９９５）Ｃ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，例えば、ｐ２０３，これらは、本明細書中で参考としてその全てが援用される）が挙げられる。サンプル調製のさらなる方法および核サンプルの複雑度の減少のための技術は、Ｄｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１），米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号、同第６，４５８，５３０号および米国特許出願第２００３００３９０６９号、同第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号、同第１０／２６４，９４５号に記載され、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。
【００７９】
多型を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３−１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ， ＥＰ ２３５，７２６，Ｓａｉｋｉ，および ＷＯ ８９／１１５４８によって記載される。対立遺伝子特異的プローブは、一つの個体由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体に由来する対応するセグメントには、その二つの個体由来のそれぞれのセグメントにおける異なる多型の形態の存在に起因してハイブリダイズしないように設計され得る。ハイブリダイゼーションの条件は、対立遺伝子の間でハイブリダイゼーション強度における有意差が存在するように、十分に厳密であるべきであり、好ましくは本質的に応答であり、それによってプローブは、それらの対立遺伝子の一つのみにハイブリダイズする。
【００８０】
（（Ｃ）コピー数における変化の検出）
ＤＮＡのコピー数における変化のような遺伝的不安定性は、多くのヒトの癌の１つである。高密度のＤＮＡアレイ技術は、腫瘍細胞におけるゲノム変異（最も著しくは）ＬＯＨの同定に対して適用される（Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ，ら（２０００），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１００１−５，Ｍｅｉ，Ｒ．，ら（２０００），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１１２６−３７，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ら（２００２），Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，Ｖｏｌ．１６０，ｐｐ．７３−９，およびＤｕｍｕｒら（２００３），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．２６０−９）。ＬＯＨならびにゲノムの増幅および欠失の検出のために高密度アレイを使用するための方法が、開示される。多くの実施形態において、高密度アレイは、遺伝子型決定アレイである。しかし、他のプローブのアレイ、例えば、ヒトゲノムの異なる領域に対して相補的なプローブのアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａから入手可能なＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０が使用され得る。一般的に、上記方法は、完全一致プローブに対する核酸のハイブリダイゼーション強度を比較し、より高い強度を、より高いコピー数と相関付ける。対数強度と対数コピー数の間の関係は、およそ直線にあることが見出された。既知のコピー数のコントロールサンプルを使用して、その直線の傾きおよびｙ切片が推定され得る。
【００８１】
並列に多型の遺伝子型決定する方法が、複数の染色体にわたってＤＮＡの獲得及び喪失を同定するために使用され得る。予測可能な接式でゲノムサンプルの複雑性を減少する方法が、生じる複雑性が減少したゲノムサンプルにおける多型を調べるために設計された一群のプローブ配列と組み合わせて使用され得る。米国特許出願第１０／２６４，９４５号で開示されるような方法が、遺伝子型を検出するために使用され得、その遺伝子型情報が、ホモ接合性欠失領域または遺伝子増幅領域を同定するのに使用され得る。一つのプライマーが、ゲノムの代表的な部分を増幅した後に、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖由来の完全一致（ＰＭ）プローブまたはミスマッチ（ＭＭ）プローブ、を含む高密度のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションを介してＳＮＰ遺伝子型決定するＳＮＰにされるのに使用され得る。例えば、対となるＰＭコピー強度値とＭＭ強度値との間の判別比を使用するアルゴリズムが、ホモ接合性欠失の領域を同定するのに使用され得るか、または中央値ＰＭ強度が、遺伝子増幅領域を同定するのに使用され得る。チップ強度の正規化の後、実験サンプルに由来するＳＮＰ判別比およびＰＭ強度は、正常個体を含む参照セットに由来する分布と比較され得る。一つの実施形態において、そのサンプルセットは、１００個体，４００個体，５００個体または１０００個体より多を含み、ＤＮＡコピー数変化を有する統計学的に有意な領域が同定されるのを可能にする。
【００８２】
さらに、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）を示す統計学的に有意なゲノムの間隔は、既知の対立遺伝子の頻度に基づいてホモ接合性マーカーの連続する広がりの確率を計算することにより同定され得る。そのＳＮＰは、使用されるアレイ上で遺伝子型決定されるＳＮＰであり、遺伝子型決定されない、遺伝子型決定済みのＳＮＰの間でＳＮＰが存在し得る。対立遺伝子の頻度が、例えば、参照サンプルセットを遺伝子型決定することにより、ｄｂＳＮＰといった公に利用可能なデータベースから、もしくは、対立遺伝子頻度についての任意の利用可能なデータベースから、得られ得る。一つのアレイに由来するデータセットを使用して、サンプルは、ＬＯＨ、欠失および増幅について分析され得る。一つの実施形態において、平均ＳＮＰ間距離および中央地ＤＮＰ間距離それぞれ約２５０ｋｂおよび約１２０ｋｂを有するアレイが、使用され得る。別の実施形態において、平均ＳＮＰ間距離および中間値ＳＮＰ間距離は、それぞれ１００ｋｂ未満および２０ｋｂ未満である。この方法は、任意のサンプルにおいてコピー数変化を検出するのに使用され得る。好ましい実施形態において、組織は、癌性組織（例えば、ヒトの乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌）であると疑われる組織である。
【００８３】
全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）といった高密度のマイクロアレイ遺伝子型決定法を使用して、高分解能で染色体の獲得および喪失を同定するための方法が、開示される（Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．，ｐｐ．１２３３−１２３７，および米国特許出願第０９／９２０，４９２、同第０９／９０４，０３９号、同第１０／６８１，７７３号、同第１０／３１６，５１７号、同第１０／４４２，０２１号、同第１０／４６３，９９１号、同第１０／３１６，６２９号および同第１０／２６４，９４５号ならびに米国特許第６，３６１，９４７号を参照のこと）。ＷＧＳＡは、アレイ上で合成される完全一致（ＰＭ）プローブおよびミスマッチ（ＭＭ）プローブに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによって、並列に１０，０００個をより多いＳＮＰと同時に遺伝子型決定する。
【００８４】
本発明のある局面において、ＤＮＡコピー数変化を同定するためにＳＮＰ遺伝子型決定を使用するための方法が、提供され得る。ＳＮＰ遺伝子型決定は、全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）を使用する（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡから入手可能な）１０Ｋ ＳＮＰアレイのような遺伝子型決定アレイ、もしくは複雑性の減少を含んでも含まなくてもよい他の増幅法を含む、多数の適切な方法を使用して実行される。より多数のＳＮＰを有するアレイはまた、利用可能な任意のゲノム増幅方法とともに使用され得る。その方法は、例としてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの１０Ｋ ＳＮＰアレイを使用して説明される。しかし、当業者は、その方法がこの１０ＫＳＮＰアレイに限定されないことを理解する。ゲノムの領域と相補的である完全一致プローブを有する任意のアレイが使用され得る。一つの実施形態において、アレイは、ゲノム全体を通して広がっている領域についての完全一致プローブを含むプローブセットを有するように設計される。例えば、そのアレイは、ゲノム全体を通して約２５ｂｐ、１００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ離れて間隔を空けたプローブセットを有し得る。そのアレイは、１つの生物についてのプローブ、または２つ以上の平均についてのプローブを含み得る。そのプローブセットは、１、２、５、１０、１５、２０または３０個以上の間の完全一致プローブを有し得る。プローブは、ＰＭプローブおよびＭＭプローブを含むプローブ対であり得、またはＭＭプローブは、そのアレイから離れてないかもしれない。
【００８５】
図１は、本発明の実施形態のソフトウェアを実行するのに使用され得るコンピュータシステムの例を示す。図１は、ディスプレイ１０３、スクリーン１０５、キャビネット１０７、キーボード１０９およびマウス１１１を含むコンピュータシステム１０１を示す。マウス１１１は、グラフィックユーザーインターフェースと相互作用するための一つ以上のボタンを有し得る。キャビネット１０７は、フロッピー（登録商標）ドライブ１１２、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ１０２、システムメモリ、ならびに利用され得るハードドライブ（１１３）（図２もまた参照のこと）本発明を実行するコンピュータコードを組み込むソフトウェアプログラムを格納および読出すために、本発明とともに使用するためのデータなどを収納する。ＣＤ１１４は、例示的なコンピュータ読出し可能媒体として示されるが、フレキシブルディスク、テープ、フラッシュメモリ、システムメモリ、およびハードドライブを含む、他のコンピュータ読出し可能格納媒体が利用され得る。さらに、搬送波（例えば、インターネットを含むネットワーク）において実施されるデータシグナルは、コンピュータ読出し可能格納媒体であり得る。
【００８６】
図２は、本発明の実施形態のソフトウェアを実行するのに使用されるコンピュータシステム１０１のシステムブロックダイアグラムを示す。図１のように、コンピュータシステム１０１は、モニター２０１およびキーボード２０９を含む。コンピュータシステム１０１は、さらに、（ＩｎｔｅｌのＰｅｎｔｉｕｍＴＭ ＩＩＩ プロセッサーといった）中央プロセッサ２０３、システムメモリ２０２、固定記憶装置２１０（例えば、ハードドライブ）、除去可能保存機２０８（例えば、フロッピー（登録商標）もしくはＣＤ−ＲＯＭ）、ディスプレイアダプタ２０６、スピーカー２０４、およびネットワークインターフェース２１１といった、サブシステムを含む。本発明を使用するために適切な他のコンピュータシステムは、さらなるサブシステム、もしくはより少ないサブシステムを含み得る。例えば、別のコンピュータシステムは、一つより多いくのプロセッサ２０３、もしくはキャッシュメモリを含み得る。本発明を使用するために適切であるコンピュータシステムはまた、測定機器において実施され得る。
【００８７】
好ましい実施形態において、コピー数は、実験サンプルにおけるＳＮＰについての強度測定を、複数の参照サンプルにおける同じＳＮＰに起因する強度測定の分布を比較することにより、推定される。一つの実施形態において、参照セットは、例えば、１０、１００、２００、３００または５００個より多くの正常な個体であり得、統計的に有意な領域の同定を可能にする。好ましい実施形態において、特定のＳＮＰについての正常な分布を計算するために使用される、複数の参照サンプルについて選択されるデータポイントは、実験サンプルに対する遺伝子型呼出しにおいて一致し、例えば、実験サンプルがＡＡの遺伝子型呼出しを有する場合、ＡＡ呼出しを有する参照サンプルは、このＳＮＰについての正常分布を生じるように選択される。遺伝子型呼出しにおける実験サンプルかつ一致する参照サンプルの数が、非常に小さい場合、もしくは、実験サンプルについての遺伝子型呼出しが、「呼出し無し」の場合、全ての参照サンプルは、遺伝子型の呼出しと無関係に使用され得る。
【００８８】
一般的に、その方法の工程は、実験サンプルにおけるＳＮＰについての強度測定を得ること、実験サンプルに一致する遺伝子型呼出しを有する複数のサンプルにおけるＳＮＰについての強度測定値を得ること、および複数の正常サンプルにおけるそのＳＮＰについての平均強度を計算すること、それらの測定値を比較して、その正常サンプルにおける強度測定値と実験サンプルにおける強度測定値との間の比を得ること、その強度の対数とコピー数の対数との間の直線関係を使用して実験サンプルにおけるコピー数を推定すること、推定されるコピー数についてのｐ値を計算してその推定値についての信頼レベルを決定すること、およびそのｐ値が選択された閾値よりも小さい場合にその信頼レベルは高いと結論付けることである。その閾値は、例えば、１０−４または１０−６であり得る。
【００８９】
その方法は、純粋な腫瘍サンプルまたは正常ＤＮＡと腫瘍ＤＮＡとを含む混合サンプルを用いて使用され得るが、その方法は任意のサンプルを用いて使用され得る。一つの実施形態において、その方法は、サンプルにおいてコピー数変化を検出して、そのサンプルが正常であるかまたはコピー数変化を有するかの否かを決定するのに使用される。例えば、その方法は、ゲノム領域の増幅または欠失と相関関係がある疾患の出産前診断のために使用され得る。
【００９０】
その方法は、癌ゲノムの改善された理解をもたらし得る、増幅領域とともに対立遺伝子の損失を一つの実験領域内で同定するために使用される分子アプローチを開示する。この方法は、疾患（例えば、癌、または対立遺伝子の不均衡から生じる疾患）を診断するのに使用され得る。この方法はまた、特定の処置がゲノム領域におけるコピー数変化を生じるか否かを決定するために、処置レジメンをモニターするのに使用され得る。
【００９１】
一つの実施形態において、参照セットからの既知の対立遺伝子頻度は、ホモ接合性マーカーの連続した広がりを含むゲノムの間隔を同定するのに使用され、一致した正常コントロールサンプルを必要とすることなく、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）領域の検出を可能にする。ゲノムの間隔が同定され得る確率を決定するための方法もまた開示される。
【００９２】
一つの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、複雑性が減少することなく直接増幅される。ゲノムＤＮＡを増幅する一つの方法である多置換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）が、Ｈｏｓｏｎｏ Ｓ，らＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：９５４−６４（２００３），ＤｅａｎらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１６；９９（８）：５２６１−６（２００２）および米国特許第６，６１７，１３７号に記載される。ＭＤＡは、生じる、ヒトゲノムＤＮＡのわずか１〜１０コピーから約２０μｍ〜３０μｍの産物を生じる、等温性鎖置換増幅である。増幅は、粗製全血および組織培養細胞を含む生物学的サンプルから直接的に実行され得る。
【００９３】
一つの実施形態において、種々のＸ染色体コピー（１Ｘ〜５Ｘ）を有するＤＮＡサンプルが、コピー数とハイブリダイゼーション強度との間の関係をモデル化するために使用される。
【００９４】
（欠失および増幅の検出）
クロスハイブリダイゼーションは、標的が存在しない場合に人工的に高い強度値を与え得、そして単独で強度測定を使用すると、複数の欠失を検出失敗することを生じ得る。一つの実施形態において、判別比（ＤＲ）が、単独でか、またはＰＭ強度平均の比を使用する方法と組み合せていずれかで欠失を検出するのに使用され得る。一つの実施形態において、その判別比のデータは、欠失の検出において強度データよりも重み付けされる。
【００９５】
ＳＮＰが欠失した場合、実験サンプルの判別比は、正常参照サンプルと比較してセンス鎖とアンチセンス鎖の両方で非常に低いことと予期される。従って、非常に有意なｐ値が得られるはずであり、そのＳＮＰが欠失されているとして標識される。増幅したＳＮＰについて、実験サンプルは、両片の鎖上で正常サンプルと比較して高い強度を有し（ＰＭにより測定）、増幅しているとして標識され得る。この分析は、推定上の欠失および増幅を同定するのに近傍のＳＮＰからの情報を必要とせず、その結果、分解能は、個々のＳＮＰレベルである。
【００９６】
一つの実施形態において、ｐ値は、染色体の位置に対してプロットされ得、増幅または欠失した関心のある領域を同定する。アレイによってアッセイされる近隣のＳＮＰによって表わされる別個の有意な増幅領域もしくは欠失領域が、この方法で同定され得る。ＳＮＰ分解能が高ければ高いほど、同定され得る増幅領域または欠失領域はより洗練され得る。
【００９７】
（コピー数変化の推定）
好ましい実施形態において、直線関係は、既知のコピー数のサンプルを使用して同定される。好ましい実施形態において、強度比の対数が、コピー数変化の対数と直線的に関係する。別の実施形態において、直線関係が、コピー数と強度比との間で確認される。好ましい実施形態において、コピー数は、約５０までであるが、１０００程度の多さのコピー数が、開示された方法を使用して対数強度と相関付けられることが示されている。
【００９８】
一つの実施形態において、高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用してゲノム全体のコピー数を推定するための方法が、開示される。ＬＯＨの分析は、ＤＮＡの獲得及び喪失と合わせられ、新規の構造が同定され得る。１００人より多い正常個体からなる参照セットに対する比較により、ｐ値を計算することが可能になり、統計的に有意な獲得及び喪失が確認され得る。ＳＮＰ特異的な参照分布が、プローブセットと全体にわたる正規化シグナル強度における固有の分解を説明するために使用される。
【００９９】
一つの実施形態において、個別のＳＮＰ分析が、最初のアプローチとして使用される。別の実施形態において、メタアナリシスが使用される。メタアナリシスにおいて獲得または喪失に向かう一貫した傾向を示す連続したＳＮＰに、さらなる重みおよび有意性が、与えられる。メタアナリシスは、Ｘ染色体のコピー数変化の例における感度、ならびに常染色体のＳＮＰの場合におけるシグナル対ノイズ比を改善し得る。しかし、メタアナリシスは、コピー数変化の長い領域に対して偏っていることに起因して注意を必要とし得、長距離に広がらない複雑な構造を過小評価し得る。また、軽度であるか一貫したシグナルが検出されるコピー数変化の境界付近の領域は、メタアナリシスによるその変化の絶対長の過大評価をもたらし得る。従って、個別の分析を使用する所定のｐ値閾値についての完全に偽陽性率は、Ｘ染色体と常染色体の両方についてのメタアナリシスよりも低い。両アプローチは、正常な参照セットを使用し、その結果、１０，０００個より多いマーカーに関する不可避の問題は、複数の仮説を試験するという問題である。部分的解決策として、そのｐ値閾値は、獲得および喪失に関連する一貫により低い感度（より高い陰性比）を使う高い特異性（低い陽性比）を保証するように厳密に設定され得る。
【０１００】
一つの実施形態において、個別の分析が、高い特異性に起因して診断ツールについての好ましい実施形態であり得るのに対し、メタアナリシスは、全ての推定上の軽度の変化（高い陽性率）の同定が必要とされる場合の、スクリーニングツールについての好ましい実施形態であり得る。遺伝子増幅は、神経芽細胞腫において１Ｋｂ〜数百Ｋｂの範囲の比較的単純な連続した領域であり得る（Ａｍｌｅｒ，Ｌ．Ｃ．，およびＳｃｈｗａｂ，Ｍ．，（１９８９），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．４９０３−１３）か、または乳癌において見られるように２０Ｍｂまでの複雑な異常領域であり得る（Ｇｕａｎら（１９９４），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．１５５−６１およびＳｚｅｐｅｔｏｗｓｋｉら（１９９３），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７４５−５０）ので、１点分析が、必要であり得る。平均近隣点に対するカーネル平滑化、変化点法および隠れマルコフ鎖モデルといった、アレイデータを分析するのに使用され得る複数の代替的な統計学的方法が存在する。一つの実施形態においてこれらのアプローチは、そのモデルを養成するための長さおよびコピー数に関して一定範囲の定義された変化を含む真の正のコントロールサンプルを使用して、開発される。
【０１０１】
一つの実施形態において、ＬＯＨを起こし得る領域が、対のサンプルを使用する従来の方法の代わりに確率ベースモデルを使用して同定され、一致しない癌サンプルの分析を可能にする。このアプローチは、正常な参照セットに由来する対立遺伝子頻度を使用することによりホモ接合性遺伝子型呼出しの広がりの確率を計算する。その結果、このモデルベースアプローチは、正常コントロールサンプルが利用可能でない場合にＬＯＨ領域に対する指針として役立ち得る。連鎖不均衡領域は、ゲノム全体にわたって変化し得るので、この確率モデルは、各ＳＮＰを独立して処理することにより、ＬＯＨ領域の有意性を過大評価する傾向があり得る。一旦、ホモ接合性の有意な広がりが、同定されると、それが本当にＬＯＨを表すかどうかを解釈することは、ヒトゲノムにおけるホモ接合性のセグメントの存在に起因して困難となり得る（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ら（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１０４−１４）。８，０００個の短い直列反復多型を使用して、複数のＣＥＰＨファミリーは、１０ｃＭより大きいホモ接合性セグメントを示した（Ｂｒｏｍａｎ，Ｋ．Ｗ．，およびＷｅｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．，（１９９９），Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．６５，ｐｐ．１４９３−５００）。
【０１０２】
一つの実施形態において、ＬＯＨが、腫瘍細胞と正常細胞との混合物において同定される。例えば、その混合物は、３０％までの正常ＤＮＡと７０％以上の腫瘍ＤＮＡとを含み得、およびＬＯＨを起こすＳＮＰのうちの７５％より多くが同定され得る。一つの実施形態において、正常ＤＮＡは、そのＤＮＡの５０％までであり、腫瘍ＤＮＡは、そのＤＮＡの５０％以上である。
【０１０３】
複数の実施形態において、ＤＮＡは、多重座特異的ＰＣＲによって増幅される。好ましい実施形態において、ＤＮＡは、アダプターライゲーションおよびシングルプライマーＰＣＲを使用して増幅される。平衡ＰＣＲ（ｂａｌａｎｃｅｄ ＰＣＲ）（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ，ら（２００２），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．９３６−９）といった他の利用可能な増幅方法もまた、使用され得る。
【０１０４】
別の実施形態において、サンプルの転写プロフィールが、対立遺伝子の不均衡を有するゲノム領域についての機能的役割を同定するために、コピー数変化と組み合わせられる。
【０１０５】
別の実施形態において、その方法は、１００，０００、２００，０００、５００，０００、または１，０００，０００個より多いのＳＮＰからのＳＮＰの情報に適応するより拡大され、ゲノム全体にわたる高分解分析により腫瘍細胞の複雑な染色体構成の基礎となるゲノムの変化を解明するのを可能にする。
【０１０６】
特徴の抽出：Ｍａｐｐｉｎｇ １０ｋ Ａｒｒａｙは、各ＳＮＰについてセンス鎖とアンチセンス鎖との間で等しく分割された２０個のプローブ対（２５マー）、対立遺伝子Ａについての１０プローブ対および対立遺伝子Ｂについての１０プローブ対を有する。一つのプローブ対は、完全一致セルおよび一塩基ミスマッチセルを含む。２０プローブ（Ｓ）にわたるＰＭ強度の相加平均の対数が、所定の任意のＳＮＰについての基本的な測定値として使用される。これは、近似のガウシアン（Ｇａｕｓｓｉａｎ）分布を各サンプルに関して有し、以下：
【０１０７】
【数４４】
ここで、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度である。Ｓが計算された後、サンプルにわたってその比較性を増大するために全ての常染色体ＳＮＰについての平均０ならびに分散、を有する規模にされる。
【０１０８】
【数４５】
ｊ＝１，．．．，Ｊは、チップ上の全ての常染色体ＳＮＰである。
【０１０９】
強度は、非特異的クロスハイブリダイゼーションに起因して、ホモ接合性欠失について高くなるものであり得る。対数平均強度（Ｓ）に加えて、完全一致プローブとミスマッチプローブの間の差を測定する判別比（ＤＲ）が、補助的基準として使用される（Ｌｉｕら ２００３）。
【０１１０】
【数４６】
好ましい実施形態において、標的癌細胞株におけるコピー数変化の有意性が、正常参照セットとの比較によって推定される。その標的細胞株の遺伝子型は、好ましくは、各ＳＮＰについて、癌細胞株が同じ遺伝子型を共有する正常サンプルとのみ比較されるように、そのような比較の前に考慮される。これは、比較が、複数のサブタイプの混合物の代わりに、均一な分布内でなされ得ることを可能にする。標的細胞株の遺伝子型が不明である場合、もしくは特定の遺伝子型を有する参照サンプルの数が小さい場合、全ての参照サンプルが、その分布を推定するために使用され得る（例えば、１０未満である）。塩基の想定は、所定の任意のＳＮＰｊ、およびその遺伝子型ｇ（ｇ＝ＡＡ、ＡＢまたはＢＢ）について
【０１１１】
【数４７】
が、ガウシアン分布に従い（正規性についてＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ’ｓ Ｗ試験に基づいて、一つの例においては、そのＳＮＰの３．３％のみが、それらの参照分布において上で０．００１未満のｐ値を有し、より厳密な０．０００１のカットオフが使用される場合、これは、さらに０．７％に減少する（Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｐ．，（１９８２），Ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１１５−１２４を参照のこと）；そのような分布の平均および分散が、正常参照サンプルを使用して推定されることである。
【０１１２】
【数４８】
ここでｋ＝１，．．．，Ｋｇは、標的細胞株と同じ、遺伝子型ｇを有する正常サンプルを表す。正常サンプルが、分離した獲得領域および喪失領域を含み得ることに対し、好ましい実施形態において、平均から３標準偏差より多く離れた値を有するように定義されるアウトライアーデータポイントは、その参照分布の平均および分散の推定から除外される。１１０個の参照サンプルに由来する１つの例示的分布において、そのＳＮＰ分布の９０％より多くは、アウトライアーを有さず、約９％が１つのアウトライア−を有し、０．５％未満が２つのアウトライアーを有し、０．０１％未満が、３より多くアウトライアーを有する、このことから、取り除かれるアウトライアーの総数は低いことが予期される。
【０１１３】
実験サンプルが、ＳＮＰｊに関して、遺伝子型ｇおよび値
【０１１４】
【数４９】
を有すると仮定すると、正常の参照分布からの
【０１１５】
【数５０】
の差の有意性は、
【０１１６】
【数５１】
のｐ値によって測定される。
【０１１７】
（メタアナリシス）
各ＳＮＰｊについて、遺伝子型ｇにて、有意性の計算についての個体テストの統計量は、
【０１１８】
【数５２】
でり、ここで、
【０１１９】
【数５３】
は参照サンプルの平均であり、
【０１２０】
【数５４】
は参照サンプルの標準偏差である。以前に説明されたように、
【０１２１】
【数５５】
は、標準正常分布を有すると想定され、ＳＮＰは独立していると想定されている。従って、ゲノムにおける、点ｍで開始して点ｎで終了する所定の任意の広がりについて、
【０１２２】
【数５６】
である。このスコア
【０１２３】
【数５７】
のスコアは、標準Φ関数を使用することにより確率に変換され得、このスコアはメタｐ値と称され、適切な場合、各ＳＮＰの個別のｐ値について置換され得る。メタアナリシスは、連続したマーカーが同じ変化方向を示す場合にもっとも適切である。従って、点ｍで開始して点ｎで終了する候補の広がりは、
【０１２４】
【数５８】
といったとして定義される。開始点はｊ＝１から、すなわち、染色体の始まりであり、探索は、その染色体の終点までそのような候補広がりについて実施される。個別のｐ値が、所定の任意のＳＮＰについてのメタｐ値よりも有意でない場合、前者は、後者によって置換される。
【０１２５】
（ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ））
一つの実施形態において、ヘテロ接合性喪失は、ホモ接合性の観察される広がりと比較することより推定される。二つ以上連続するＳＮＰが、ホモ接合性であり、それらのＳＮＰの各々が、観察される対立遺伝子頻度によって決定されるホモ接合性である確率の積である。遺伝子型の情報を使用して、ＬＯＨを示す統計的に有意なゲノムの間隔は、正常個体の同じ参照セットを使用して、既知の対立遺伝子頻度に基づいてホモ接合性マーカーの連続した広がりの確率を計算することにより、同定され得る。ホモ接合性である確率は、各個別のＳＮＰｉについて、以下の式、
【０１２６】
【数５９】
で計算され得る。
【０１２７】
各ＳＮＰが独立して扱われる場合、全てホモ接合性である連続したＳＮＰ（点ｍから点ｎまで）の広がりの確率は、
【０１２８】
【数６０】
である。そのようなホモ接合性の広がりが定義された後、その強度情報、（すなわち、ｐ値および傍数変化推定）が、ＬＯＨ領域のコピー数変化（喪失または増幅）を決定するために、分析され得る。ＬＯＨの極端な場合である完全な欠失について、有意なｐ値を有する低い判別比は、確認測定として使用され得る。
【０１２９】
別の実施形態において、アレイは、ＷＧＳＡといったゲノムサンプルの複雑性減少増幅から生じる増幅サンプルにおいて存在すると予測されるフラグメントの存在または不在を検出するために設計され得る。２５マーのプローブが、増幅サンプルにおいて存在すると推定される各領域について設計され得る。減少した複雑性のサンプルが、生成され、そのアレイにハイブリダイズされ、そのハイブリダイゼーションパターンは、欠失している領域を同定するために分析される。一つの実施形態において、プローブは、減少した複雑性のサンプルにおいて存在すると推定される、１００塩基対領域毎について設計される。実験サンプルは、増幅され、そのアレイにハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーションがおこらないかまたは減少する領域は、そのゲノムサンプル由来の領域の喪失を示している。
【０１３０】
一つの実施形態において、ゲノムサンプルは、ヒトゲノムＤＮＡであり、そのサンプルは、ＸｂａＩを使用して消化され、フラグメントが一般的なアダプターに連結され、ＰＣＲによって増幅される。生じる増幅された減少した複雑性のサンプルの複雑性は、約４０メガベースであると推定される。１つの２５マープローブが、その減少した複雑性のサンプルにおいて１００塩基対ごとに設計され得る、約４００，０００個の完全一致プローブおよび別の４００，０００個のミスマッチコントロールプローブを生じる。プローブ長は変化し得、例えば、プローブは、１５ｎｔ長、１７ｎｔ長、２１ｎｔ長、２５ｎｔ長、または３０〜６０ｎｔ長であり得る。
【０１３１】
ゲノムにおける再配列もまた検出され得る。一つの実施形態において、プローブは、増幅された減少した複雑性のサンプルにおける特定のフラグメントの存在または不在を検出するために設計される。この実施形態において、選択された制限部位の付近にあり選択されたサイズ範囲であるフラグメントを検出するために設計されたアレイが、使用され得る。遺伝的再配列は、選択されたフラグメントが選択された条件下でもはや効率的に増幅しないように、フラグメントのサイズにおける変化を生じ得る。これらのフラグメントに対するプローブは、ハイブリダイゼーション後にシグナル強度を減少する。これは、再配列を示し得る。
【０１３２】
開示された方法は、複数の適用のために使用され得る。例えば、この方法は、細胞分裂を追跡するために使用され得る。細胞分裂の間、ＤＮＡは複製され、その結果、常に複数の染色体領域が余分なコピーとして存在する。その方法は、細胞分裂の選択された段階においてどのゲノム領域が複製されたかを決定するのに使用され得る。その方法は、癌または他の疾患状態にしばしば関連するクロスオーバーハイブリダイゼーションおよび遺伝する再配列を追跡するために使用され得る。その方法は、開示された方法によって増幅が検出された場合、患者の結果または予後を予測するため、患者のための処置レジメンを選択するため、またはサンプルを癌性であるような細胞を分類するために、使用され得る。異なる種類の癌が、ゲノムの異なる領域の増幅および異なる程度への対する領域の増幅によって、特徴付けられ得る。その方法は、そのような分類についての基準を確立するのに使用され得、および確率された基準に従って、サンプルを分類するために、使用され得る。
【０１３３】
好ましい実施形態において、上記の方法は、癌を診断するのに使用される。癌は、組織サンプルにおける一つ以上のゲノム領域の喪失、一つ以上のゲノム領域の増幅または一つ以上のゲノム領域の再配列にしばしば関係する。これらのゲノムの変化の検出は、癌を診断するためまたは腫瘍の悪性度をモニターするために使用され得る。一つの実施形態において、遺伝子増幅の量は、その組織が、前癌性または癌性であるか否かを同定するために決定され得る。
【０１３４】
一つの実施形態において、プローブは、そのプローブセットが、増幅された減少した複雑性のサンプルにおいて存在すると予測されるフラグメントの存在または不在の区別のために最適であるように、プローブハイブリダイゼーションモデルによって選択される。インシリコ消化を使用して、ゲノムが、所定の酵素または複数の酵素の組み合せにより消化される場合に生じるフラグメントの予測が可能であり、プローブが、インシリコ消化を使用して存在すると予測されるフラグメントの存在または不在を検出するのに使用される。複数の実施形態において、コンピュータシステムが、どの配列が減少した複雑性のサンプルにおいて存在するのかを予測するのに使用され、その複雑性は、選択された方法によって減少する。
【０１３５】
フラグメントの予測可能なサブセットの増幅を生じる複雑性を減少する任意の方法が、減少した複雑性のサンプルを生成するのに使用され得る。そのアレイは、使用される複雑性の減少方法、および減少した複雑性のサンプルにおいて存在すると予測されるフラグメントに依存して、設計され得る。例えば、複雑性を減少する他の方法としては、ＡＦＬＰ（本明細書中に参考として援用される、米国特許第６，０４５，９９４号を参照のこと）および任意配列プライマーＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ、本明細書中にその全体において参考文献として援用される、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄおよびＷｅｌｓｈ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９９５）編、Ｃ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，ｐ２０３を参照のこと）が挙げられる。サンプル調製のさらなる方法、および核サンプルの複雑性の減少のための技術は、Ｄｏｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号および米国特許出願第０９／５１２，３００号、同第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号、同第１０／０１３，５９８号、および同第１０／２６４，９４５号（これらは本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。
【０１３６】
増幅方法は、これらのフラグメント、（例えば、４００塩基対〜８００塩基対のフラグメント）のサブセットを増幅するために最適化され得る。アレイが、選択された断片化および増幅条件のセット下のセットで増幅されると予測されるフラグメントの存在または不在を検出するために設計され得る。そのアレイ上のプローブは、各フラグメント内の選択された領域にハイブリダイズするように設計され得る。一つ以上のプローブが、各フラグメントについて設計され得る。そのプローブは、経験上の基準を使用して、ハイブリダイゼーションについて最適化され得る（例えば、米国特許出願第１０／０１７，０３４号（本明細書中で、その全体が参考として援用される））を参照のこと。異なるアレイが、複雑性の減少したサンプルを生じるように使用される方法に依存して設計され得る。
【０１３７】
ハイブリダイゼーションの前に、減少した複雑性のサンプルにおけるそのフラグメントが、標識され得る。別の実施形態において、そのフラグメントは、ハイブリダイゼーションの前にさらに増幅される。複数の実施形態において、そのフラグメントは、ＤＮＡであり、ＲＮＡが、そのフラグメントから合成され、そして、アレイにハイブリダイズされる。
【０１３８】
別の実施形態において、複雑性の減少したサンプルはゲノムの全領域を問合わせるように設計された配列にハイブリダイズされる。プローブは、ゲノム全体を通して均一に配置され得る（例えば、約１００塩基毎、２００塩基毎、１０００塩基毎、２５００塩基毎、１０，０００塩基毎および１００，０００塩基毎に１つのプローブ）。
【０１３９】
一つの実施形態において、サンプルは、ハイブリダイゼーションの前にサンプルの複雑性を減少することなくアレイへ直接的にハイブリダイズされる。アレイは、ゲノムの各領域について代表的なプローブを使用してゲノムの全領域の存在または不在を検出するように設計され得るか、またはゲノムの選択された領域を検出するように設計され得る。
【０１４０】
シングルプライマーが、ゲノムの代表的な部分を増幅するの使用され得、次に、そのＤＮＡの一本鎖または二本鎖由来の完全一致（ＰＭ）プローブおよびミスマッチ（ＭＭ）プローブのセットを含む高密度オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションを介してＳＮＰ遺伝子型決定され得る。例えば、対のＰＭ強度値とＭＭ強度値との間の判別比を使用するアルゴリズムが、ホモ接合性の欠失領域を同定するのに使用され得るか、または中間値ＰＭ強度が、遺伝子増幅領域を同定するのに使用され得る。チップ強度の正規化の後、実験サンプルに起因するＳＮＰの判別比、およびＰＭ強度値は、正常な個体を含む参照セットから誘導される分布と比較され得る。一つの実施形態において、サンプルセットは、４００よりも多い、５００よりも多い、または１０００よりも多い個体を含み、ＤＮＡのコピー数変化を有する共に統計的に有意な領域が同定されることを可能にする。この方法は、任意の癌性組織（例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、骨癌、皮膚癌、胃癌および結腸癌）におけるコピー数変化を検出するのに使用され得る。
【０１４１】
特定の遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子）のホモ接合性の欠失が、腫瘍形成性であることが公知である。ｐ５３のホモ接合性の欠失は、種々の腫瘍の型と関連することに対して公知である。特定の遺伝子（例えば、発癌遺伝子）の増幅は、腫瘍形成性でもあり得る遺伝子の過剰発現を生じ得る。種々の腫瘍において増幅される発癌遺伝子の例としては、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｅｒｂＢ、ｃ−Ｋ−ｒａｓおよびｍｄｍ２が挙げられる（Ｇｅｎｅｓ ＶＩ、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ（１９９７） １１４４（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。その方法は、癌、または別の疾患、もしくは表現型と関連する新規なホモ接合性欠失を同定するのに使用され得る。別の実施形態において、その方法は、実験サンプルが、癌または別の疾患もしくは表現型と関連することが公知であるかまたは考慮される一つ以上のホモ接合性欠失を有するか否かを決定するのに使用され得る。
【０１４２】
染色体領域のホモ接合性の欠失は、他の障害（例えば、男性の性腺機能低下症（Ｇｒｏｍｏｌｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８５：２２８１−２２８６，２０００）、遅発性筋ジストロフィー（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ Ｌら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９６：５（１０）：１５３９−１５４６））を発症することが、公知である。ホモ接合性の欠失はまた、親のＨＩＶ−１感染に対する防御といった有利な表現型を有することが、公知である（Ｋｕｐｆｅｒら，ＡＩＤＳ，１９９９年６月１８日；１３（９）：１０２５−８を参照のこと）。
【０１４３】
その方法は、発現することが公知のゲノムの領域または既知遺伝子もしくは疑わしい遺伝子を含む領域に、制限されない。プローブは、任意のゲノム領域に対して設計され得る。複数の実施形態において、さらなるアレイは、既知の反復配列の領域についてのプローブを除外するように設計される。
【０１４４】
一つの実施形態において、発現されるＲＮＡは、そのアレイにハイブリダイズされ、ＲＮＡに起因するハイブリダイゼーションパターンが、ゲノムサンプルに起因するハイブリダイゼーションパターンと比較される。複数の遺伝的領域が変異した発現は、ホモ接合性の欠失に類似した表現型において生じ得る。これらの遺伝子は、ゲノム物質がそのアレイににハイブリダイズされるが、その発現パターンは、正常なものから変異している場合において、正常であるように見える。
【０１４５】
開示された遺伝子量技術は、複数の疾患および適用のために遺伝子コピー数を測定するのに適用され得る。癌に加えて、巨大な遺伝子の複製および欠失が、α−サラセミア、およびデュシェーヌ型筋ジストロフィーならびにベッカー型筋ジストロフィーといった疾患と関連して見出されている（例えば、Ａｒｍｏｕｒら Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ ２０：３２５−３３７（２００２）を参照のこと）。その方法は、例えば、構成的異常、後天性異常、数的異常、構造的異常、およびモザイク現象を含む、複数の染色体異常を同定するのに使用され得る。構成的な異常は、全体にわたって個体に影響を及ぼす。その染色体のエラーは、胚に存在した。それは、受精前または受精した接合体において起こり得る。そのような障害としては、２１トリソミーといった染色体の先天的症候群、ターナー症候群等が挙げられる。後天性異常は、癌のように他の組織は正常なままで、一つの器官のみに影響を及ぼす。用語「構成的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）」および「後天性」は、本当に全く一般的な用語であり、臨床実務において遭遇する任意の持続性の変化に対して適用され得る。染色体異常はまた、均質であり得、その異常を有する研究された細胞全てを有する。正常細胞は存在し得るが、アッセイしない。複数の細胞のみがその異常を保有し、他が正常である（または別の異常を有する）場合のみ、そのサンプルまたは個体は、モザイクである。個体はまた、数的異常を有し、その場合、一つ以上の染色体は、正常な個体と異なる数で存在する。構造的変化が、染色体内で起こり得る。この変化は、遺伝物質の喪失または獲得がない場合に平衡になり得、染色体セグメントの欠失および／または複製が存在する場合に、不均衡になり得る。
【０１４６】
さらに、ＰＭ強度をコピー数に関連付けるために使用されるさらなる方法としては、近隣のＳＮＰを計上する確率論モデルを使用して、ＳＮＰに関する物理学的データをそのモデルに組み込む、アルゴリズムが挙げられる。さらに、隠れマルコフ鎖およびマルコフ鎖といった方法が使用され得る。隠れマルコフ鎖を使用する方法については、Ｒａｂｉｎｅｒ，Ｌ．Ｒ．およびＪｕａｎｇ，Ｂ．Ｈ．（１９８６）ＩＥＥＥ ＡＳＳＰ Ｍａｇ．３（１）４−１６およびＲａｂｉｎｅｒ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ．７７ ２５７−２８５を参照のこと。別の実施形態において、１つまたは小数のＰＭプローブが、増幅または欠失の検出のために使用される。一つの実施形態において、ＳＮＰの領域にハイブリダイズする４０プローブが、そのＳＮＰの遺伝子型決定のために使用される。特異的ハイブリダイゼーションと非特異的ハイブリダイゼーションとの間の区別においてよく機能するプローブが、遺伝子型決定アレイを使用して遺伝子量の解析のために使用され得る。使用されるプローブは、個別のプローブの経験的な性能によって選択され得る。プローブの振る舞いは、最も大きな区別および最も高いシグナルを与えるプローブを経験的に同定するために分析され得る。プローブ特異的モデルについては、Ｌｉ，Ｃ．およびＷｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２（８）：ｒｅｓｅａｒｃｈ００３２．１−００３２．１１，Ｌｉ，Ｃ．およびＷｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：３１−３６およびＭｅｉ，Ｒ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００：１１２３７−１１２４２を参照のこと。別の実施形態において、変化点分析が使用される。変化点分析の使用方法については、Ｏｌｓｈｅｎ，Ａ．Ｂ．およびＶｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｅ．Ｓ．（２００２）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇｓ，Ｓｅｎ，Ａ．およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍ．Ｓ．（１９７５）．Ａｎｎ Ｓｔａｔｉｓｔ．３ ９８−１０８およびＹａｏ，Ｙ−Ｃ．（１９８８）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＆ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．６ １８１−１８９を参照のこと。別の実施形態において、ＬＯＨ領域を同定する場合、連鎖不平衡（ＬＤ）についての情報が考慮される。二つの近接するＳＮＰがホモ接合性である確率は、それらＳＮＰ間のＬＤが原因となり、個別の確率の積よりも高い。なぜなら、これらの事象は独立していないからである。ＬＤおよびＬＯＨの推定については、Ｂａｌｄｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，ら Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＬＴＤを参照のこと。
【実施例】
【０１４７】
（細胞株および核酸の単離）
９種のヒト乳癌細胞株（ＢＴ−２０，ＭＣＦ−７，ＭＣＦ−１２Ａ，ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−３０）および二つの同系のヒト乳癌細胞株（Ｈｓ−５７８ＴおよびＨｓ−５７８Ｂｓｔ）（Ｈａｃｋｅｔｔら（１９７７）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，Ｖｏｌ．５８、ｐｐ．１７９５−８０６）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。正常なヒト乳房の上皮細胞株（ＨＭＥＣ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから得た。全ての細胞を、推奨される培養条件下で増殖させた。ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して単離した。３Ｘ染色体（ＮＡ０４６２６）、４Ｘ染色体（ＮＡ０１４１６）、ならびに５Ｘ染色体（ＮＡ０６０６１）を含む細胞株由来のＤＮＡおよび１１０個体の正常参照セット（雄４８個体および雌６２個体）のＤＮＡを、ＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から購入した。
【０１４８】
ＷＧＳＡアッセイを、標的増幅工程に対する改変およびＤＮＡ標識工程に対する改変を除いて、Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３）の記載のように実施した。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（ＡＢＩ）中の２５ｎｇのアダプター連続ゲノムＤＮＡ、０．７５μＭのプライマー、２５０μＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ））を含む各１００μｌの反応物の条件下で行った。サイクリング、９５℃／３分、次に（９５℃／３０秒、５９℃／３０秒、７２℃／３０秒）を３５サイクル、および７２℃で７分間の伸長のように実施した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製し濃縮し、ＤＮＡ濃度を、Ａ２６０ｎｍによって測定した。フラグメント化されたＤＮＡを、１０５単位のＴｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および０．１４２９ｍＭのＤＬＲ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を含む１×ＴｄＴ緩衝液中で、３７℃にて２時間標識し、次に９５℃で１５分間熱不活化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）の１０Ｋ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｘｂａ＿１３１ Ａｒｒａｙに対するＤＮＡハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびスキャニングを、製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の指示書に明示されるように実施した。正常参照セットを除く全てのサンプルを、二連で試験した。呼出し率は、全て８８％より高かった。再現性は、全ての複製データにおいて高かった。平均の遺伝子型の一致は、９９．７％であり、二つの鍵となる測定（対数強度（Ｓ）および判別比）はその両方が、複製間で０．９７より大きい平均相関関係を有した。
【０１４９】
ＷＧＳＡ ＤＮＡ混合実験を下記のように実施した：Ｈｓ−５７８ＴおよびＨｓ−５７８Ｂｓｔ由来のゲノムＤＮＡの濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって決定し、Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ ＤＮＡをＨｓ−５７８Ｔ ＤＮＡに対し、１０％ずつの増分で添加した。
【０１５０】
定量ＰＣＲを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を使用して実施した。ＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ソフトウェア（ＡＢＩ）を使用することにより設計し、ＱＩＡＧＥＮによって合成した。反応物（２５ｎｇ ＤＮＡを含む２５μｌ）を、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（ＡＢＩ）を使用して調製した。増幅のための条件は以下の通りであった。５０℃／２分間で１サイクル、９５℃／１０分間で１サイクル、次に（９５℃／２０秒、５６℃／３０秒、および７２℃／３０秒）を３５サイクル。閾値のサイクル数を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｖ１．７ａソフトウェアを使用することにより得た。ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を正常コントロールとして使用した。全ての反応を２重で実行し、サイクル数の閾値を平均した。ＤＮＡ量を、ＵＶ分光光度計により測定し、ＬＩＮＥ−１エレメントに対して（９）で正規化した。相対的定量を比較Ｃｔ法（ＡＢＩ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２，１９９７）を使用して実施した。ｃ−ＭＹＣ遺伝子およびｐ１６遺伝子についての定量ＰＣＲ反応を、アニーリング温度が６０℃であることを除いて、記載されるように実施した。
【０１５１】
（コピー数の推定および有意性の計算）
下記の実施例において、コピー数および有意性の推定に対する３つの主要な要素：（１）用量応答実験、（２）ＰＣＲを使用するアルゴリズム結果の独立した検証、および（３）癌細胞株群を使用する既知の真の正の領域の確認、が存在する。コピー数とチップ強度との間の用量応答を、種々のＸ染色体のコピー数（例えば１Ｘ〜５Ｘ）を有するサンプルを使用して、試験し得る。チップ強度を示すために（Ｉ）を使用すると、用量応答の想定は、
【０１５２】
【数６１】
であり、ここで、Ｉａは、コピー数ａの領域についての強度であり、Ｉｂは、コピー数ｂである同じ領域についての強度であり、Ｃａｂは、ａおよびｂによって決定される強度比である。
【０１５３】
【数６２】
は、対数強度の近似値である。従って、対数変換は、
【０１５４】
【数６３】
を導き、ここで、
【０１５５】
【数６４】
は、ａおよびｂによって決定される対数強度比である。
【０１５６】
対数コピー数は、対数のコピー数と対数強度比との間の直線関係を想定することにより、推定し得る。直線は、式ｙ＝ｍｘ＋ｂを有し、ここで、ｍは、直線の傾きであり、ｂはｙ切片である。好ましい実施形態において、ｙは対数のコピー数であり、Ｃは、強度比の対数である。傾きおよびｙ切片は、既知のコピー数の正常サンプルを使用して推定され得る。一つの実施形態において、傾きおよびｙ切片は、Ｘ染色体の既知のコピー数変化を伴うサンプルを使用して決定される。
【０１５７】
１Ｘ染色体、３Ｘ染色体、４Ｘ染色体および５Ｘ染色体を有するＤＮＡサンプルからの結果を、２Ｘのサンプルと比較した。高い直線の相関関係が、このサンプル対の間で観察された。任意の所定の対について、直線の傾きはＹ＝Ｘに対して平衡であり、式
【０１５８】
【数６５】
を確認した。２Ｘを基準として使用して、各サンプルについて推定された対数強度比、
【０１５９】
【数６６】
は、コピー数の対数強度と強力な直線関係を示した。このコピー数は、強度差を使用して、任意の所定の領域について推定され得る。好ましい実施形態において、Ｘ染色体の結果を、全ての常染色体に対して一般化するのに使用した。遺伝子型ｇおよび対数強度
【０１６０】
【数６７】
について、ＳＮＰｊ
【０１６１】
【数６８】
である。対数−対数直線モデルを、低範囲コピー数推定および高範囲コピー数推定の両方についての一般的な適合性が理由で、使用した。
【０１６２】
【数６９】
は、対数強度比（ｌｏｇ ｘ／ｙ＝ｌｏｇｘ−ｌｏｇｙ）である。高コピー数範囲において、シグナルの強度における増加が、プローブの飽和に起因するアッセイにおいてプラトーに達し、対数−対数の直線関係は、より適切になり得る（Ｂｉｇｎｅｌｌら（２００３）、Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ、Ｖｏｌ．，ｐｐ．，）。これらの結果は、強度比が、コピー数変化を表すのに使用され得ることを示し、対数−対数直線モデルが、広い範囲のコピー数に適応するのに最も適切であることを示す。
【０１６３】
ＤＮＡコピー数変化を測定するための独立した定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を、染色体の獲得または損失の観察される領域を確認するのに使用した。９９個の常染色体ＳＮＰのセットにおけるＰＣＲ反応を、ＳＫＢＲ３および正常な個体由来のゲノムＤＮＡテンプレートを使用して実施した。このＳＮＰセットは、完全には無作為ではなく、以前に既知であった獲得及び喪失、ならびに上記癌細胞株において同定された推定上の新規獲得および喪失の両方を含んだ。第一の定量ｇＰＣＲ確証実験を、７つの独立した染色体ＳＮＰに対するプライマー対を使用して実施し、１× ＤＮＡサンプルおよび５× ＤＮＡサンプルについてのΔＣｔ値を決定した。各プライマー対が、正規化後にΔＣｔの絶対値においてわずかな差を示す一方、１Ｘサンプルと５Ｘサンプルの間に２．２３サイクルの平均差が存在した（データは示されない）。増幅効率２．０を想定すると、このＣｔの差は、理論値２．３２に近接する。ＷＧＳＡを使用して推定されたコピー数は、ほぼΔＣｔの指数関数であり、ほぼ理論上の推定の式２ΔＣｔ＋１と付近にあてはまる。ΔＣｔ値が低く、かつΔＣｔの増加と共により散乱する場合、その傾向は、緊密である。ΔＣｔと計算された有意性レベルとの間の強力な正の相関関係が、上記アルゴリズムを使用して観測された。わずかな点を除いては、、大きなΔＣｔの差を有するＳＮＰの大部分は、非常に強大な有意性を示し、一方、わずかなΔＣｔ差を有するＳＮＰが、中程度〜低い統計学的有意性緩和を示す。その結果はまた、ＰＭ強度に対する補助的の測定基準として判別比の値を示す。一つのデータ点について、ΔＣｔ値は、−５未満であり、ホモ接合性欠失を示唆する。しかし、可能なクロスハイブリダイゼーションに起因して、ＰＭ強度に基づく有意性は、ほんの中程度である。このＳＮＰは、ＤＲが適用される場合に、１０−６未満のｐ値を有する大きな有意性を示し、その欠失の正確な同定を可能にする。推定されたコピー数と統計学的な有意性との間の関係も、また分析される。予期されるように、コピー数がホモ接合性の欠失を示す０に近づく場合、または高レベルの増幅を示す大きな正数に近づく場合、有意性は非常に大きくなる。これらの組み合せの結果は、その方法が定量技術において、染色体のコピー数変化を検出し得ることを示す。
【０１６４】
乳癌細胞株群を、二つの良好に特徴付けられた領域（すなわち、染色体８ｑおよび染色体９ｐ）におけるコピー数変化について調査した。３８個の乳癌細胞株のＣＧＨ分析は、サンプルの７５％において８ｑの獲得を示し（Ｆｏｒｏｚａｎら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．６０、ｐｐ．４５１９−２５）、染色体９ｐの喪失が、乳癌において報告されている（Ｓｔｒｕｓｋｉら（２００２），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１３５、ｐｐ．６３−９０）。特に、染色体８ｑ２４のｃ−ＭＹＣ癌遺伝子は、乳癌において共通に増幅されることが示されており（Ｅｓｃｏｔら（１９８６）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８３、ｐｐ．４３８４−８およびＲｕｍｍｕｋａｉｎｅｎら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｖｏｌ．１２６、ｐｐ．１−７）、一方、染色体９ｐ２１上のｐ１６腫瘍サプレッサーは、種々の腫瘍型において欠失されることが示されている（Ｋａｍｂら，（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６４、ｐｐ．４３６−４０およびＣａｉｒｎｓら（１９９５）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．２１０−２）。個別のＳＮＰについてのコピー数の推定は、一定領域（例えば染色体）にわたってマッピングされ得る。遺伝子型決定アレイは、ゲノム全体に広がるＳＮＰのサブセットに関する情報を提供し得る。そのアレイによって遺伝子型決定されるＳＮＰのセットにおいて最も近隣に存在するＳＮＰについてのコピー数の推定に注目することにより、より大きな領域のコピー数の推定がなされ得る。一つの実施形態において、推定値を、５０Ｍｂから１４０Ｍｂまでの第８染色体の領域についての４つのサンプルにわたって比較した。ｃ−ＭＹＣ付近のゲノム領域は、三つの癌細胞株において中程度〜非常に強い有意性で増幅されたようであり、正常コントロール（Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ）において増幅されなかったようであった。これは、３つ全ての細胞株が、８ｑ２３−ｑ２４における獲得を含むことを示す公表されたＣＧＨの結果と一致している（Ｋａｌｉｏｎｉｅｍｉら（１９９４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ Ｖｏｌ．９１、ｐｐ．２１５６−６０）。定量ＰＣＲを、ｃ−ＭＹＣプライマー対を使用して実施し、コピー数の増加を確認した。ＳＫ−ＢＲ３、ＭＣＦ−７、ＺＲ−７５−３０およびＨｓ−５７８ＢｓｔについてのｑＰＣＲにより推定したｃ−ＭＹＣコピー数は、それぞれ、２１、７．５、１０．６および３であった。実施例において使用されるアレイは、ｃ−ＭＹＣ遺伝子それ自体に由来するＳＮＰを含まないが、最も近接する二つのＳＮＰは、ｃ−ＭＹＣに対して３００Ｋｂ近位に位置するＳＮＰ５５１５０、およびｃ−ＭＹＣに対して１９６Ｋｂ遠位に位置するＳＮＰ５１１３１５である。これらのＳＮＰについてＷＧＳＡおよび定量ＰＣＲの結果を表１において要約する。これらは、ｃ−ＭＹＣを取り巻く領域が、上記の４つの細胞株の内３つにおいて増幅されることを確認した。
【０１６５】
また、上記の４つの細胞株を、０Ｍｂから４０Ｍｂの第９染色体の領域にわたって比較した。ＷＧＳＡの結果は、これら細胞株の内３つが、ｐ１６構造遺伝子内に位置するＳＮＰ１３９３６９によって決定されるようなｐ１６の領域における有意な欠失を有することを示す。このＳＮＰならびに両方のＳＮＰを、さらに定量ＰＣＲによって分析した。その結果を表１に要約する。ＰＣＲの結果は、独立してｐ１６の欠失を確認する。主に、ＰＣＲおよびコピー数のアルゴリズムは、既知の変化を有する二つのゲノム領域（すなわち、ｃ−ＭＹＣおよびｐ１６）について高度に相関した結果を示す。
【０１６６】
ＳＫ−ＢＲ−３ 第８染色体の分析およびＢＴ−２０ 第９染色体の分析はまた、開示された方法の高度な分解能を示す。ＳＫ−ＢＲ−３は、二つの近接する増幅セグメントをｃ−ＭＹＣ付近に示す。第一の長い方のセグメントは、１１８．９６Ｍｂから１２５．４２Ｍｂに広がる。第二の短い方のセグメントは１２７．５２Ｍｂから１２７．６５Ｍｂの範囲である。第一および第二のセグメント由来の１２個の代表的なＳＮＰを、ＰＣＲによって分析し、コピー数の増加を確認した。定量ＰＣＲ（ΔＣｔ＝−０．３）とコピー数のアルゴリズム（ｐ値＝０．４３）の両方を使用して増幅しないとスコア付けされるこれらの二つのセグメントを中断させるような、一つのＳＮＰ（７１９２９２）が存在する。ＢＴ−２０は、コピー数変化を示さないＳＮＰによって隣接される一点のホモ接合性の欠失（ｐ１６）を含む（表１）。これらの二つの例は、上記の方法が、一点分解で増幅または欠失を検出するのに使用され得、および種々のコピー数で存在するゲノム領域間の境界を示すのに使用され得ることを示す。
【０１６７】
Ｍａｐｐｉｎｇ １０Ｋ Ａｒｒａｙ上のプローブ配列が、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによってＳＮＰ遺伝子型について特異的に選択され得る一方、コピー数変化についての高感度および特異性に関しては最適化されないかもしれない。しかし、Ｘ染色体のＳＮＰのうちの９６％よりも多くが、対数（シグナル強度）と対数（コピー数）との間で０．８５よりも大きい相関関係を有する。別の実施形態において、コピー数変化の推定について最適化されるプローブとともにアレイが、設計され得る。
【０１６８】
（メタアナリシス）
複数の実施形態において、その方法は、大きなコピー数の増加を伴うホモ接合性の欠失および増幅を検出するのに使用される。しかし、わずかなコピー数の変化しか伴わない欠失領域の比は、相対的に低い。一つの例において、１％偽陽性率で、１Ｘサンプル、３Ｘサンプル、４Ｘサンプルおよび５Ｘサンプルについての検出比は、それぞれ２２．０３％。１２．３５％、３１．２７％および５４．８６％であった。この適度な検出比は、用量応答の欠失よりもむしろ複数のＳＮＰにおける参照セット分布の分散に起因する。全体的に、用量応答は、強力であり、３０２個全てのＸ染色体ＳＮＰについて、対数（強度）と対数（コピー数）の間に０．７２より大きい相関関係を有する。さらに、このグループ間の２９２個のＳＮＰ（９６．７％）は、０．８５よりも大きい相関関係を有する。メタアナリシスは、同じ型の変化（獲得または喪失）を示す連続したＳＮＰの数が多くなると、信頼性の増加を引き起こし（Ｓａｌａｍｏｎら（２０００），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．２０４４−５４）、その結果、検出率の改善に適用されることを想定する。メタアナリシスは、良く改善された感度および特異性を示す受信者動作特性分析（Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線を左上の角へと実質的にシフトする。その結果は、０．２％未満の偽陽性率とともに、１Ｘ、４Ｘおよび５Ｘについての真の陽性（検出）率は、それぞれ９１．０６％、９１．３９％および９８．３４％であることを示す。３Ｘについての真陽性率が、１％未満の偽陽性率を使用することにより、５０％より多くまで改善される。変化の範囲が連続しかつ大きいので、メタアナリシスは、これらのＸ染色体の例における個別の分析よりもよりかなり強大な効力を示し、上記ＳＮＰの大部分は、獲得または欠失へ向かう一貫した傾向を示すが、散在性の個別のシグナルは、参照セットの分散に起因して有意ではないかもしれない。
【０１６９】
一定範囲のｐ値の閾値の範囲にわたって常染色体を使用した個別の分析とメタアナリシス分析との比較を、表２にまとめる。所定のｐ値のカットオフについて、１０個の乳癌サンプルにおいて検出されたＳＮＰの平均数を、１１０個の正常サンプルで検出されたＳＮＰの平均数で除算した。この値は、任意の所定の信頼閾値について、癌サンプル対正常サンプルのおおよその比（シグナル対ノイズ比）として役立つ。メタアナリシスを使用して、この比は、実質的に改善される（任意の１０−１０のｐ値カットオフについて個別の分析およびメタアナリシスについての比、それぞれ、８．６および１４８．２）。高いノイズ対シグナル比はまた、十分なＳＮＰの密度を有する広範な領域に広がるゲノムの変化の数が、癌細胞株において比較的頻繁である一方、正常な集団においては、比較的まれであることを意味する。
【０１７０】
（ＬＯＨ）
一致したＨｓ５７８サンプルを、従来のＬＯＨ同定（一致したサンプル間のＷＧＳＡのＳＮＰ遺伝子型呼出しの比較）を、ＬＯＨ同定のための確率モデルの適用と比較するのに使用した。そのモデルは、参照セットについての対立遺伝子頻度の情報を使用し、ホモ接合性の遺伝子型の任意の所定の広がりがランダムな機会に起因して起こり得る確率を計算する。その有意性は、網羅された領域における、ホモ接合性ＳＮＰの数が増加すると増幅する。従って、厳密な有意性のカットオフの使用は、多くの連続したホモ接合性呼出しに関するゲノム領域が、ＬＯＨの慣習的に定義された領域についての代理として機能することを可能にする。分析のために利用可能な一致した正常コントロールサンプルが存在しない場合、この適用は特に有用であり得る。この方法を、従来的に定義されたＬＯＨマーカーを、この方法がどのように十分に捕捉するかに関して、一致したＨｓ５７８対を使用して評価した。比較の結果を図３において概説する。従来のＬＯＨ分析によって定義される常染色体ＳＮＰが、全１２９３個存在する。これらのＳＮＰは、正常コントロールにおいてヘテロ接合性であり、腫瘍サンプルにおいてホモ接合性である。これらのＳＮＰの間で、７０％より多くが、確率モデルを使用して１０−８未満の有意性（ｐ値）を有し、８０％より多くが、１０−６未満の有意性を有する。そのＳＮＰのうちのなお約１０％は、有意でないｐ値（＞０．０１）を有する。これは、従来的に定義されるＬＯＨのＳＮＰの大部分が、ホモ接合性呼出しの長い広がりに位置する一方、そのＳＮＰのうちの約１０％が、多くの連続したホモ接合性呼出しを伴なわずに存在する。対照的に、正常コントロールサンプルにおける１１，２０５個全ての常染色体ＳＮＰについて、１０−６未満のｐ値を有する広がりに属するＳＮＰは存在せず、１％未満が、１０−４の有意レベルを有する広がりに属する。従って、この特定のサンプル対について、１０−６のｐ値の閾値は、確率モデルを使用して、従来的に定義されたＬＯＨの８０％を超える獲得をもたらす一方、このレベルの有意性の領域を含まない。この結果は、確率モデルが、ＬＯＨを受けるゲノム領域を同定し得、特に正常な一致サンプルが利用可能ではない場合、ＬＯＨを同定に対する代替的アプローチとして機能し得ることを示す。腫瘍細胞株においてＬＯＨを受けるＳＮＰのコピー数の分析は、約３２％が１コピーを有し、５１％が２コピーを有し、１７％が中程度の増幅（８未満のコピー数）を有し、０．２％未満が、ホモ接合性の欠失または多倍数の増幅を示すことを示す。さらに、コピー数の分布は、ＬＯＨの同定のための二つのアプローチの使用の間で類似している。
【０１７１】
一旦ホモ接合性の広がりが定義されると、強度の情報は、その領域のコピー数変化およびその有意性を決定するのに使用され得る。興味深いことに、その一致した対は、明らかなコピー数変化が起こっていないＬＯＨの領域を同定する。腫瘍の遺伝子型呼出しと正常な遺伝子型呼出しとを比較することによって、第１２染色体および第１７染色体の全長ならびに第５染色体上の９０Ｍｂ〜１７０Ｍｂは、ＬＯＨとして定義され得るが、有意なコピー数変化は観察されなかった。このパターンはまた、ＭＣＦ−７において観察され、ここで、５７Ｍｂから７７Ｍｂまでの確率モデルで定義される７７個のＳＮＰを含むＬＯＨの推定上の広がり（ｐ値７．２Ｅ−１６）は、コピー数の減少を示さない。さらに、ＳＫ−ＢＲ−３およびＺＲ−７５−３０の両方は、３．８Ｅ−１８（８０ＳＮＰ）および１．８Ｅ−２４（１２０ＳＮＰ）というそれぞれのｐ値で１１０Ｍｂから１２５Ｍｂ〜１３５Ｍｂまでの推定ＬＯＨ領域を示すが、有意なコピー数の増加を示す。コピー数の減少も増加もないこれらのＬＯＨの例は、現在使用される多くの一分子アプローチによって容易には同定されないかもしれず、そしてゲノム範囲のコピー数のプロファイリングとＬＯＨの測定と合せることにおける力を示す。
【０１７２】
（混合実験）
腫瘍サンプルは、間質起源またはリンパ起源の正常細胞によってしばしば汚染され得る。レーザー捕獲顕微解剖またはフローサイトメトリ−といった方法が、腫瘍細胞について濃縮するために首尾よく使用されているが、生じた集団は、まれに、完全に純粋であり、その結果、ゲノム範囲のＤＮＡコピー数のプロファイリングのために使用される分子方法は、不均一サンプルに適用するのに十分頑強でなければならない。一致した対Ｈｓ−５７８は、癌サンプル（Ｈｓ−５７８Ｔ）中に混合される漸増量の正常ＤＮＡ（Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ）の影響を試験することによる混合ＤＮＡサンプルに対するＷＧＳＡアッセイ、およびアルゴリズムの許容性を評価するために使用した。混合サンプルを、ＬＯＨにおける変化およびコピー数変化の検出における変化について、分析した。癌細胞株から誘導したＤＮＡを、ＷＧＳＡアッセイの前に、０％（純粋な癌サンプル）、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、９０％および１００％（純粋な正常細胞サンプル）といった漸増する割合で、正常一致ＤＮＡと混合した。Ｈｓ−５７８ＢｓｔおよびＨｓ−５７８Ｔの様式的染色体数は、それぞれ４６（２倍体）および５９（低三倍体）であり、従って、ＤＮＡ量による混合は、細胞数による混合を近似する。従来のＬＯＨ ＳＮＰの同定における変化は、確率モデルを使用して推定上のＬＯＨ領域と同様に観察された。正常ＤＮＡの寄与が増加する、従来的に定義されるＬＯＨのＳＮＰ数が、減少する。同じ傾向に従って、上記確率モデルにより定義されるＬＯＨの総数もまた、減少する。全体的に正常ＤＮＡの割合が３０％以下である場合、ＬＯＨの変化の７０％より多くが保持される。混合ＤＮＡが全量の３０％〜５０％に達する場合、有意なシフトが発生し、ＬＯＨの検出の約６０％の喪失を生じる。正常ＤＮＡが６０％以上で存在する場合、ＬＯＨをおこすほとんどのＳＮＰ（＞９８％）が、検出不可能である。
【０１７３】
ＬＯＨ検出の遷移点とこれらのＳＮＰのコピー数の間の関係もまた、試験した。この比較は、全量の９９．８％を含む種々のコピー数を有するＬＯＨのＳＮＰの３つの群：１コピーの増加（（４０７ ＳＮＰ）、２コピーの増加（（６６３ ＳＮＰ）および中程度のコピー数（３〜８）の増加（２２１ ＳＮＰ）に関する。平均に、正常ＤＮＡの割合が、混合サンプルにおいて増加すると、ホモ接合性呼出しを検出不能なことが、１コピーのＳＮＰについて最初に起こり、次に２コピーのＳＮＰ、そして最後に中程度のコピーのＳＮＰについて起こった。３つの群の間の差は、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ試験を使用して、ｐ値３．２９２ｅ−０５で統計学的に有意である。順位和検定を各対を比較するのに使用した。群の間の差についての下記のｐ値：０．００７４２（１コピーおよび２コピー）、０．００４８７（２コピーおよび中程度のコピー）、および１．３４９ｅ−０５（１コピーおよび中程度のコピー）が見出された。全ての比較は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正して０．０５レベルで有意であり、１コピーおよび中程度のコピーの群が最も有意である。
【０１７４】
獲得および喪失の検出に対する混合サンプルの効果も試験した。メタアナリシスを用いて関して混合サンプルにおいて検出されるコピー数変化の相対的な割合は、個別のＳＮＰ分析よりも大きい。１０％、２０％および３０％の正常ＤＮＡの混合レベルで、最初の全量からの残りの検出可能なシグナルは、それぞれ、８９．０１％、８５．６５％、５７．５５％（メタアナリシス）および５０％、２５％、および２１．４３％（個別の分析）である。一旦、正常ＤＮＡの比率が、全サンプルの４０％に達すると、これらの増幅ＳＮＰおよび欠失ＳＮＰの検出において有意な減少が存在する；混合サンプルが６０％より多い正常ＤＮＡを含む場合、シグナルのほとんどは、検出不可能である。この傾向は、メタアナリシスおよび個別の分析についてあてはまる。これらの結果は、ＷＧＳＡアッセイおよびアルゴリズムを使用したＬＯＨの検出およびコピー数変化が、２０％〜３０％までの正常ＤＮＡを含む混合サンプルを許容し得ることを示す。
【０１７５】
（「正常」サンプルにおけるコピー数変化の測定）
１１０個の参照サンプルの参照セットを、増幅または欠失が、癌と診断されていない個体においてゲノム領域内において同定され得るかどうかを決定するために分析した。より具体的には、１点除外分析を１１０個サンプルの各々において実行した；一つのサンプルをこの分析から除外し、他の１０９サンプルを、参照分布を設計するのに使用し、各ＳＮＰの対立遺伝子の頻度を計算するのに使用した。「除外された」サンプルを、コピー数変化の頻度および有意性を評価するため、および除外されたサンプルにおけるホモ接合性呼出しの長い広がりを同定するために参照情報と比較した。その結果は、参照サンプルの実質的な割合が、有意なコピー数変化およびホモ接合性呼出しの長い広がりを有することを示した。１１０サンプルの間で、４３サンプルは、ｐ値が１０−６未満で１０個より多くの一点変化を有し、それらのうち１１サンプルが、２０個以上の有意な変化を有した。また、１１０サンプルの間で、８サンプルがｐ値が１０−１０未満で長いホモ接合性の広がりを有することが観察され、そのようなホモ接合性呼出しの長い広がりは、２１．３６Ｍｂの平均範囲を有する。
【０１７６】
ＷＧＳＡの実施例：ゲノムＤＮＡを、５μｌ中の５０ｎｇ／μｌのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）を、１０．５μｌのＨ２Ｏ（Ａｃｃｕｇｅｎｅ）、２μｌの１０×ＲＥ緩衝液２（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、２μｌ １０×ＢＳＡ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、および０．５μｌのＸｂａＩ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と混合することにより、ＸｂａＩで消化した。反応物を、３０℃で２時間インキュベートし、次いで、この酵素を７０℃で２０分インキュベートすることにより不活性化し、そして４℃にした。反応物は−２０℃で保管し得る
アダプターの連結のために、消化されたＤＮＡを、１．２５μｌの、ＴＥ（ｐＨ８．０）中の５μＭ アダプター、２．５μｌのＴ４ＤＮＡライゲーション緩衝液と混合し、そして１．２５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を最後に添加した。反応を、１６℃で２時間インキュベートし、次いで、７０℃で２０分インキュベートし、そして４℃にした。そして２５μｌのライゲーション混合物を、７５μｌのＨ２Ｏで希釈し、−２０℃で貯蔵し得る。
【０１７７】
ＰＣＲについて、希釈した連結ＤＮＡ １０μｌを、１０μｌのＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、１０μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＰａｎＶｅｒａ Ｔａｋａｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），１０μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７．５μｌの１０μＭプライマー（最終濃度０．７５Ｍ）、２μｌの５ユニット／μｌ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）および５０．５μｌのＨ２Ｏと混合する。各アレイについて、４つの１００μｌの反応物を調製した。増幅を、以下のプログラムを使用して行った：９５℃で３分間；９５℃で２０秒、５９℃で１５秒、７２℃で１５秒を３５サイクル；および７２℃で７分間の最終インキュベーション。その反応物を４℃で保持した。蓋加熱オプションを選択した。
【０１７８】
その後、ＰＣＲ反応を、１００μｌのＰＣＲ反応物を５００μｌのＰＢ緩衝液またはＰＭ緩衝液と混合し、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）へ導入することにより精製し、そのカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、エタノールを含む７５０μｌのＰＥ緩衝液をカラムに加えてサンプルを洗浄し、カラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、カラムを１３，０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、カラムを新しいコレクションチューブ内に配置した。４サンプルの内２サンプルについて、３０μｌのＥＢ溶出緩衝液（ｐＨ８．５）をＱＩＡｑｕｉｃｋ膜の中央へ添加し、サンプルを溶出させ、カラムを室温で５分間静置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。最初の２つのサンプル由来の溶出緩衝液を使用して、他の２サンプルを溶出させ、溶出液を混合した。ＤＮＡを定量し、４８μｌに２０μｇのＤＮＡが含まれるように希釈した。
【０１７９】
上記ＤＮＡを、４８μｌ ＤＮＡ（２０μｇ）、５μｌのＲＥ緩衝液４、および２μｌの０．０９ユニット／μｌのＤＮａｓｅを総量５５μｌ中に混合することでフラグメント化した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで９５℃で１５分間インキュベートし、そして、４℃で保持した。
【０１８０】
フラグメントを、５０μｌのフラグメント化されたＤＮＡ（２０μｇ）、１３μｌの５×ＴｄＴ緩衝液（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１μｌの １ｍＭのビオチン標識ｄｄＡＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、および１μｌのＴｄＴ（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とともに３７℃で一晩インキュベートし、次いで、９５℃で１分間インキュベートすることにより標識し、次いで、４℃で保持した。
【０１８１】
ハイブリダイゼーション混合物は１２μｌの１．２２Ｍ ＭＥＳ、１３μｌのＤＭＳＯ、１３μｌの５０×Ｄｅｎｈａｒｔ、３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、３μｌの１０ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、３μｌの１０ｎＭオリゴＢ２、３μｌの１ｍｇ／ｍｌヒトＣｏｔ−１、３μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、および１４０μｌの５Ｍ ＴＭＡＣＬである。７０μｌの標識ＤＮＡを、１９０μｌのハイブリダイゼーション混合物と混合した。その混合物を９５℃で１０分インキュベートし、短く回転させ、４７．５℃で保持した。２００μｌの変性した混合物を、アレイに４７．５℃で１６時間〜１８時間、６０ｒｐｍでハイブリダイズさせた。
【０１８２】
染色混合物は、９９０μｌのＨ２Ｏ、４５０μｌの２０×ＳＳＰＥ、１５μｌのＴｗｅｅｎ−２０、３０μｌの５０％のＤｅｎｈａｒｔであった。第一染色について、４９５μｌの染色混合物を５μｌの１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合し、第二染色について、４９５μｌの染色混合物を０．５ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）５μｌと混合し、第三染色について、４９５μｌの染色混合物を５μｌの１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と混合する。標準条件下で洗浄し、染色した。
【０１８３】
（結論）
ゲノムＤＮＡのコピー数における変化を同定する方法が開示される。ヘテロ接合性の喪失、ホモ接合性の欠失および遺伝増幅を同定する方法が開示される。その方法は、正常な組織と比較して癌性組織におけるコピー数変化を検出するのに使用され得る。１０，０００個より多いヒトＳＮＰについてのプローブを含む遺伝子型決定アレイ対するハイブリダイゼーションによって、ゲノム範囲のコピー数の獲得または喪失を同定するための方法が、開示される。ゲノム全体にわたって、コピー数変化の推定が、ＳＮＰ遺伝子型呼出しに関連する（ＬＯＨ分析）。全ての引用された参考文献は、全ての目的のために、本明細書中で参考として援用される。
【０１８４】
本発明は、ゲノムサンプルにおけるコピー数を推定するための方法及びコンピュータソフトウェア製品を提供する。上記は例示的であって、限定的ではないことが意図されることが理解されるべきである。本発明の多くの変形が、上記の説明を検討すると当業者にとって明白である。例として、本発明は、主に高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用に関して記載されているが、他の核酸アレイ、ゲノムＤＮＡから生じるシグナル強度を測定する他の方法が、使用され得ることが、当業者により認識される。それゆえに、本発明の範囲は、上記説明を参照することなく決定されるはずであるが、代わりに、添付の特許請求の範囲を、請求の範囲が権利付与される等価物の全範囲とともに、参照して決定されるべきである。
【０１８５】
本発明は、上の実施例に関して詳細に記載されているが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱すること無くなされ得ることが理解される。従って、本発明は、下記の特許請求の範囲によってのみ制限される。本出願において言及される全ての引用した特許、特許出願および刊行物は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】
【表２】
【０１８８】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する、添付の図面は、本発明の実施形態を図示し、本明細書の記載とともに、発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、本発明の実施形態のソフトウェアを実施するのに利用され得る、コンピュータシステムの例を図示する。
【図２】図２は、図１のコンピュータシステムのシステムブロック図を図示する。
【図３Ａ】図３は、２つのコピーＸ染色体を有する個体と比較して、Ｘ染色体の１、３、４、もしくは５コピーを有する個体からのＸ染色体上のＳＮＰの対数強度のプロットを示す。図３Ａは、個体のプロットを示し、図３Ｂは、実験値について観察される直線の関係を示す、コピー数の対数に対する強度比の対数のプロットを示す。
【図３Ｂ】図３は、２つのコピーＸ染色体を有する個体と比較して、Ｘ染色体の１、３、４、もしくは５コピーを有する個体からのＸ染色体上のＳＮＰの対数強度のプロットを示す。図３Ａは、個体のプロットを示し、図３Ｂは、実験値について観察される直線の関係を示す、コピー数の対数に対する強度比の対数のプロットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験サンプルにおけるゲノム領域のコピー数を推定するための方法であって：
（ａ）該実験サンプルから核酸を単離する工程；
（ｂ）該核酸の少なくとも複数の領域を増幅する工程；
（ｃ）該増幅産物を標識する工程；
（ｄ）ハイブリダイゼーションパターンを得るために、該標識した増幅産物をアレイにハイブリダイズする工程であって、ここで該アレイは、複数のＳＮＰについての複数の遺伝子型決定プローブセットを含み、ここでプローブセットは、
（ｉ）ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、
（ｉｉ）該ＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、
（ｉｉｉ）該ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、および
（ｉＶ）該ＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、
を含む、工程；
（ｅ）該実験サンプルにおける該ＳＮＰについての測定値を得る工程であって、ここで測定値Ｓは、該ハイブリダイゼーションパターンにおける該ＳＮＰについての完全一致プローブのうちの少なくとも二つの強度の相加平均の対数である、工程；
（ｆ）遺伝子型呼出しにおいて、実験サンプルに一致する複数の参照サンプルの各々における該ＳＮＰについてのＳ値を得る工程；
（ｇ）（ｆ）で得られた値を使用して、該参照サンプルのＳ値についての平均および標準偏差を計算する工程；
（ｈ）（ｅ）で得られた値から（ｇ）で得られた平均値を減算することにより対数強度差を得る工程；および
（ｉ）対数強度比と対数コピー数との間で直線関係を呈する該ＳＮＰを含む領域のコピー数を推定する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルおよび各参照サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰについての前記Ｓ値は、サンプル内の全ての常染色体のＳＮＰについての平均がゼロでありかつ分散が１であるように、正規化される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記推定されたコピー数変化についてのｐ値を計算する工程、ならびに該ｐ値が、ｐ値における閾値未満であるか否かを決定する工程をさらに包含し、該推定されたコピー数変化の方向は、該ｐ値が該閾値未満である場合に有意である、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記推定されたコピー数変化についてのｐ値を計算する工程、ならびに該ｐ値が、ｐ値における閾値未満であるか否かを決定する工程をさらに包含し、該推定されたコピー数変化の方向は、該ｐ値が該閾値未満である場合に有意である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記Ｓ値が：
【数１】
を使用して計算され、ここで、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であり、Ｘはある組における完全一致プローブの数である、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、Ｘは、１と３０との間である、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、Ｘは、２０である、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、コピー数が、
【数２】
を使用して推定され、
【数３】
は、実験サンプルｃにおける遺伝子型ｇのＳＮＰｊについての完全一致プローブの強度の平均の対数であり、該実験サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰのＳ値に対して正規化されており、
【数４】
は、ＳＮＰｊにおいて遺伝子型ｇの複数の参照サンプルにおけるＳＮＰｊについての正規化されたＳ値の平均値であり、ｂは、ｙ切片であり、ｍは、既知のコピー数のＳＮＰからの強度値をプロットすることにより定義される直線の傾きである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
【数５】
を使用して、推定されたコピー数変化の方向についてのｐ値を計算する工程、およびｐｊがｐ値における閾値以下であるか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、ｂは、約０．６９３に等しく、ｍは、約０．８９５に等しい、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって：
【数６】
を使用して、推定したコピー数変化の方向についてのｐ値を計算する工程、および
ｐｊがｐ値における閾値以下であるか否か決定する工程、
をさらに包含する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルは、腫瘍サンプルである、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルは腫瘍細胞と正常細胞との混合物である、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルは、非ガン性サンプル由来のサンプルである、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルが、構成的異常、後天性異常、数的異常、構造的異常およびモザイク現象からなる群より選択された染色体異常を有すると推測されるサンプルである、方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法であって、既知のコピー数の前記ＳＮＰのうちの少なくともいくつかは、Ｘ染色体におけるＳＮＰである、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで（ｆ）で得られた各Ｓ値であって、該Ｓ値の平均から３より大きい標準偏差である各Ｓ値は、（ｇ）で推定された参照分布の平均および標準偏差の評価から除外される、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、コピー数の第二の推定が、実験サンプルについてのＳＮＰの平均の判別比（ＤＲ）を、遺伝子型が一致している複数の参照サンプルにおける該ＳＮＰからの平均ＤＲと比較することにより得られ、ここで２０ＰＭ／ＭＭプローブ対を有するプローブの組についての該ＤＲは、
【数７】
を使用して計算される、方法。
【請求項１９】
実験サンプルにおいて増幅または欠失したゲノム領域を同定する方法であって：
該実験サンプルから誘導された核酸サンプルを遺伝子型決定アレイにハイブリダイズする工程；および
複数の完全一致プローブＰＭｉについてのハイブリダイゼーション強度を測定する工程；
【数８】
を使用して、該アレイによって遺伝子型を決定された各ＳＮＰについての値Ｓを計算する工程であって、ここでＸは、個別のＳＮＰについてのＰＭプローブの数である工程；
複数のＳ値を正規化して、該Ｓ値の平均が０でありかつ分散が１であるように工程；
複数の参照サンプルにおける該アレイによって遺伝子型を決定された各ＳＮＰについての正規化された平均のＳ値を得る工程；
該実験サンプルにおいて少なくとも一つのＳＮＰのコピー数を推定する工程；
該実験サンプルにおける該ＳＮＰについての変化の方向を決定する工程；および
該予測された変化の方向における信頼レベルを決定するためにｐ値を測定する工程；
を包含する、方法；
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、コピー数が、推定コピー数の対数と強度比の対数との間の直線関係を想定することにより推定される、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、コピー数は：
【数９】
を使用して推定され、ここでｂは約０．６９３であり、およびｍは約０．８９５である、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸サンプルが、全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）を使用して該実験サンプルから誘導される、方法。
【請求項２３】
二つ以上の連続したＳＮＰのコピー数の推定値が、有意であるか否かを決定する方法であって、
複数の参照サンプルに対して、全てが、コピー数の推定された減少を示すか、または全てがコピー数の推定された増加を示すかのいずれかである二つ以上の連続したＳＮＰを同定する工程；
【数１０】
を計算する工程；
標準φ関数を使用して
【数１１】
を確率へと転換してｐ値を得る工程；および
ｐ値の閾値を使用して該推定値が有意であることを結論付ける工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
少なくとも一つのヘテロ接合性の喪失領域を同定する方法であって、
実験サンプルのゲノムにおいてホモ接合性ＳＮＰ遺伝子型呼出しの少なくとも一つの連続した広がりを同定する工程；
該連続した広がりにおける各ＳＮＰについてホモ接合性の確率
【数１２】
を得る工程であって、ここで、
【数１３】
であり；
該連続した広がりにおける該ＳＮＰの各々がホモ接合性である確率を、
【数１４】
を使用することにより計算する工程；および、
【数１５】
が、ｐ値の閾値未満である場合、ホモ接合性の損失の領域として該ＳＮＰを含む領域を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記連続した広がりが、遺伝子型を決定される少なくとも１０個のＳＮＰである、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法によってホモ接合性喪失領域として同定される領域のコピー数を推定するための方法であって：
【数１６】
を使用して、前記実験サンプルにおける同定された領域における前記ＳＮＰのうちの少なくとも一つについてＳ値を計算して該Ｓ値を正規化する工程であって、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であり、Ｘは、ある組におけるプローブ対の数である、工程；
複数の一致した遺伝子型呼出しの参照サンプル由来の少なくとも一つのＳＮＰについて正規化したＳ値を計算する工程、および該ＳＮＰについて該参照サンプルの正規化したＳ値の平均を計算する工程；
該実験サンプルにおける該ＳＮＰについての正規化したＳ値を、該参照サンプルにおける該ＳＮＰについての正規化されたＳ値の平均と比較して、比を得る工程；および
該実験サンプルにおける該ＳＮＰのコピー数を推定する工程；
を包含する。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、コピー数が、前記領域における２つ以上の連続したＳＮＰについて推定される、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、ｐ値が、
【数１７】
を使用して、前記コピー数の推定値について計算される、方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、前記複数の一致した遺伝子型の参照サンプルが、少なくとも１０個のサンプルを含む、方法。
【請求項３０】
コンピュータソフトウェア製品であって：
実験サンプルまたは参照サンプルにおける複数のＳＮＰについての複数の完全一致強度値（ＰＭｉ）を入力するためのコンピュータプログラムコード；
各サンプルにおける個別のＳＮＰの各々についての該強度値の平均の対数を計算するためのコンピュータコードであって、複数の参照サンプルが存在するコンピュータコード；
個別の実験サンプル内の平均値および参照サンプル内の平均値を正規化するコンピュータコード；
個別のＳＮＰの各々についての該強度値の平均の対数を、該個別のＳＮＰでの一致した遺伝子型呼出しの全ての参照サンプルにおいて、計算するためのコンピュータプログラムコード；
実験サンプル由来のＳＮＰの対数平均強度と、該ＳＮＰでの遺伝子型呼出しにおける該実験サンプルと一致した参照サンプル由来の該ＳＮＰの対数平均強度との間の対数の強度差を計算するためのコンピュータプログラムコード；
対数−対数の直線モデルを使用して該ＳＮＰのコピー数を推定するためのコンピュータプログラムコード；
該推定されたコピー数によって示される変化の方向についてのｐ値を計算するためのコンピュータプログラムコード；
該計算されたｐ値が、選択された閾値未満であるか否かを決定するためのコンピュータプログラムコード；および
該コンピュータプログラムを格納するためのコンピュータ読出し可能媒体；
を含む、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３１】
請求項３０に記載のコンピュータソフトウェア製品であって、各ＳＮＰについての前期平均強度値の対数は、
【数１８】
を使用して計算され、Ｘは、ＳＮＰ一つ当たりのＰＭプローブの数である、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３２】
請求項３０に記載のコンピュータソフトウェア製品であって、ｐ値が、
【数１９】
を使用して計算される、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３３】
請求項３０に記載のコンピュータソフトウェア製品であって、コピー数は、
【数２０】
を使用して推定される、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３４】
少なくとも一つのヘテロ接合性の喪失領域を同定するためのコンピュータソフトウェア製品であって：
実験サンプルのゲノムにおいてホモ接合性ＳＮＰ遺伝子型呼出しの少なくとも一つの連続した広がりを同定するためのコンピュータプログラムコード；
該連続した広がりにおける各ＳＮＰについてホモ接合性の確率
【数２１】
を得るためのコンピュータプログラムコードであって、ここで、
【数２２】
であるコンピュータプログラムコード；
該連続した広がりにおける該ＳＮＰの各々がホモ接合性である確率を、
【数２３】
を使用することにより計算するためのコンピュータプログラムコード；
【数２４】
が、ｐ値の閾値未満である場合、該ＳＮＰを含む領域をヘテロ接合性喪失領域として同定するためのコンピュータプログラムコード；および
該コンピュータプログラムコードを格納するためのコンピュータ読出し可能媒体；
を含む、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３５】
生物学的実験サンプルにおけるコピー数を推定するためのシステムであって、
プロセッサー；および
該プロセッサーと接続されている
メモリを備え、
該メモリは、該プロセッサーによって実行される場合、該プロセッサーに複数の論理的工程を実施させる複数の機械語命令を格納し、該論理的工程は、
各サンプルにおける個別のＳＮＰの各々について、実験サンプルもしくは参照サンプルおける複数のＳＮＰについての複数の完全一致強度値（ＰＭｉ）の強度値の平均の対数を計算する工程であって、複数の参照サンプルが存在する、工程；
個別の実験サンプルの平均値および参照サンプル内の平均値を正規化する工程；
該個別のＳＮＰで一致した遺伝子型呼出しの全ての参照サンプルにおいて個別のＳＮＰの各々についての対数の平均の強度値を計算する工程；
実験サンプル由来のＳＮＰの対数平均強度と、該ＳＮＰでの遺伝子型呼出しにおける該実験サンプルと一致した参照サンプル由来の該ＳＮＰの対数平均強度との間の対数強度差を計算する工程；
対数−対数直線モデルを使用して該ＳＮＰのコピー数を推定する工程；
該推定したコピー数により示される変化の方向についてのｐ値を計算する工程；および
該計算したｐ値が、選択した閾値未満であるか否かを示す工程；
を包含する、システム。
【請求項３６】
請求項３５に記載のシステムであって、ここで、各ＳＮＰについての平均強度値の対数が、
【数２５】
を使用して計算され、Ｘは、ＳＮＰ一つ当たりのＰＭプローブの数である、システム。
【請求項３７】
請求項３５に記載のシステムであって、ｐ値が、
【数２６】
を使用して計算される、システム。
【請求項３８】
請求項３５に記載のシステムであって、ここでコピー数が、
【数２７】
を使用して推定される、システム。
【請求項３９】
請求項３８に記載のシステムであって、ｂが約０．６９３であり、ｍが約０．８９５である、システム。
【請求項１】
実験サンプルにおけるゲノム領域のコピー数を推定するための方法であって：
（ａ）該実験サンプルから核酸を単離する工程；
（ｂ）該核酸の少なくとも複数の領域を増幅する工程；
（ｃ）該増幅産物を標識する工程；
（ｄ）ハイブリダイゼーションパターンを得るために、該標識した増幅産物をアレイにハイブリダイズする工程であって、ここで該アレイは、複数のＳＮＰについての複数の遺伝子型決定プローブセットを含み、ここでプローブセットは、
（ｉ）ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、
（ｉｉ）該ＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数の完全一致プローブ、
（ｉｉｉ）該ＳＮＰの第一の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、および
（ｉＶ）該ＳＮＰの第二の対立遺伝子に対する複数のミスマッチプローブ、
を含む、工程；
（ｅ）該実験サンプルにおける該ＳＮＰについての測定値を得る工程であって、ここで測定値Ｓは、該ハイブリダイゼーションパターンにおける該ＳＮＰについての完全一致プローブのうちの少なくとも二つの強度の相加平均の対数である、工程；
（ｆ）遺伝子型呼出しにおいて、実験サンプルに一致する複数の参照サンプルの各々における該ＳＮＰについてのＳ値を得る工程；
（ｇ）（ｆ）で得られた値を使用して、該参照サンプルのＳ値についての平均および標準偏差を計算する工程；
（ｈ）（ｅ）で得られた値から（ｇ）で得られた平均値を減算することにより対数強度差を得る工程；および
（ｉ）対数強度比と対数コピー数との間で直線関係を呈する該ＳＮＰを含む領域のコピー数を推定する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルおよび各参照サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰについての前記Ｓ値は、サンプル内の全ての常染色体のＳＮＰについての平均がゼロでありかつ分散が１であるように、正規化される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記推定されたコピー数変化についてのｐ値を計算する工程、ならびに該ｐ値が、ｐ値における閾値未満であるか否かを決定する工程をさらに包含し、該推定されたコピー数変化の方向は、該ｐ値が該閾値未満である場合に有意である、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記推定されたコピー数変化についてのｐ値を計算する工程、ならびに該ｐ値が、ｐ値における閾値未満であるか否かを決定する工程をさらに包含し、該推定されたコピー数変化の方向は、該ｐ値が該閾値未満である場合に有意である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記Ｓ値が：
【数１】
を使用して計算され、ここで、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であり、Ｘはある組における完全一致プローブの数である、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、Ｘは、１と３０との間である、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、Ｘは、２０である、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、コピー数が、
【数２】
を使用して推定され、
【数３】
は、実験サンプルｃにおける遺伝子型ｇのＳＮＰｊについての完全一致プローブの強度の平均の対数であり、該実験サンプルにおいて遺伝子型決定された全てのＳＮＰのＳ値に対して正規化されており、
【数４】
は、ＳＮＰｊにおいて遺伝子型ｇの複数の参照サンプルにおけるＳＮＰｊについての正規化されたＳ値の平均値であり、ｂは、ｙ切片であり、ｍは、既知のコピー数のＳＮＰからの強度値をプロットすることにより定義される直線の傾きである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
【数５】
を使用して、推定されたコピー数変化の方向についてのｐ値を計算する工程、およびｐｊがｐ値における閾値以下であるか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、ｂは、約０．６９３に等しく、ｍは、約０．８９５に等しい、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって：
【数６】
を使用して、推定したコピー数変化の方向についてのｐ値を計算する工程、および
ｐｊがｐ値における閾値以下であるか否か決定する工程、
をさらに包含する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルは、腫瘍サンプルである、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルは腫瘍細胞と正常細胞との混合物である、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルは、非ガン性サンプル由来のサンプルである、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記実験サンプルが、構成的異常、後天性異常、数的異常、構造的異常およびモザイク現象からなる群より選択された染色体異常を有すると推測されるサンプルである、方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法であって、既知のコピー数の前記ＳＮＰのうちの少なくともいくつかは、Ｘ染色体におけるＳＮＰである、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで（ｆ）で得られた各Ｓ値であって、該Ｓ値の平均から３より大きい標準偏差である各Ｓ値は、（ｇ）で推定された参照分布の平均および標準偏差の評価から除外される、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、コピー数の第二の推定が、実験サンプルについてのＳＮＰの平均の判別比（ＤＲ）を、遺伝子型が一致している複数の参照サンプルにおける該ＳＮＰからの平均ＤＲと比較することにより得られ、ここで２０ＰＭ／ＭＭプローブ対を有するプローブの組についての該ＤＲは、
【数７】
を使用して計算される、方法。
【請求項１９】
実験サンプルにおいて増幅または欠失したゲノム領域を同定する方法であって：
該実験サンプルから誘導された核酸サンプルを遺伝子型決定アレイにハイブリダイズする工程；および
複数の完全一致プローブＰＭｉについてのハイブリダイゼーション強度を測定する工程；
【数８】
を使用して、該アレイによって遺伝子型を決定された各ＳＮＰについての値Ｓを計算する工程であって、ここでＸは、個別のＳＮＰについてのＰＭプローブの数である工程；
複数のＳ値を正規化して、該Ｓ値の平均が０でありかつ分散が１であるように工程；
複数の参照サンプルにおける該アレイによって遺伝子型を決定された各ＳＮＰについての正規化された平均のＳ値を得る工程；
該実験サンプルにおいて少なくとも一つのＳＮＰのコピー数を推定する工程；
該実験サンプルにおける該ＳＮＰについての変化の方向を決定する工程；および
該予測された変化の方向における信頼レベルを決定するためにｐ値を測定する工程；
を包含する、方法；
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、コピー数が、推定コピー数の対数と強度比の対数との間の直線関係を想定することにより推定される、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、コピー数は：
【数９】
を使用して推定され、ここでｂは約０．６９３であり、およびｍは約０．８９５である、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸サンプルが、全ゲノムサンプリングアッセイ（ＷＧＳＡ）を使用して該実験サンプルから誘導される、方法。
【請求項２３】
二つ以上の連続したＳＮＰのコピー数の推定値が、有意であるか否かを決定する方法であって、
複数の参照サンプルに対して、全てが、コピー数の推定された減少を示すか、または全てがコピー数の推定された増加を示すかのいずれかである二つ以上の連続したＳＮＰを同定する工程；
【数１０】
を計算する工程；
標準φ関数を使用して
【数１１】
を確率へと転換してｐ値を得る工程；および
ｐ値の閾値を使用して該推定値が有意であることを結論付ける工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
少なくとも一つのヘテロ接合性の喪失領域を同定する方法であって、
実験サンプルのゲノムにおいてホモ接合性ＳＮＰ遺伝子型呼出しの少なくとも一つの連続した広がりを同定する工程；
該連続した広がりにおける各ＳＮＰについてホモ接合性の確率
【数１２】
を得る工程であって、ここで、
【数１３】
であり；
該連続した広がりにおける該ＳＮＰの各々がホモ接合性である確率を、
【数１４】
を使用することにより計算する工程；および、
【数１５】
が、ｐ値の閾値未満である場合、ホモ接合性の損失の領域として該ＳＮＰを含む領域を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記連続した広がりが、遺伝子型を決定される少なくとも１０個のＳＮＰである、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法によってホモ接合性喪失領域として同定される領域のコピー数を推定するための方法であって：
【数１６】
を使用して、前記実験サンプルにおける同定された領域における前記ＳＮＰのうちの少なくとも一つについてＳ値を計算して該Ｓ値を正規化する工程であって、ＰＭｉは、プローブ対ｉの完全一致セルの強度であり、Ｘは、ある組におけるプローブ対の数である、工程；
複数の一致した遺伝子型呼出しの参照サンプル由来の少なくとも一つのＳＮＰについて正規化したＳ値を計算する工程、および該ＳＮＰについて該参照サンプルの正規化したＳ値の平均を計算する工程；
該実験サンプルにおける該ＳＮＰについての正規化したＳ値を、該参照サンプルにおける該ＳＮＰについての正規化されたＳ値の平均と比較して、比を得る工程；および
該実験サンプルにおける該ＳＮＰのコピー数を推定する工程；
を包含する。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、コピー数が、前記領域における２つ以上の連続したＳＮＰについて推定される、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、ｐ値が、
【数１７】
を使用して、前記コピー数の推定値について計算される、方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、前記複数の一致した遺伝子型の参照サンプルが、少なくとも１０個のサンプルを含む、方法。
【請求項３０】
コンピュータソフトウェア製品であって：
実験サンプルまたは参照サンプルにおける複数のＳＮＰについての複数の完全一致強度値（ＰＭｉ）を入力するためのコンピュータプログラムコード；
各サンプルにおける個別のＳＮＰの各々についての該強度値の平均の対数を計算するためのコンピュータコードであって、複数の参照サンプルが存在するコンピュータコード；
個別の実験サンプル内の平均値および参照サンプル内の平均値を正規化するコンピュータコード；
個別のＳＮＰの各々についての該強度値の平均の対数を、該個別のＳＮＰでの一致した遺伝子型呼出しの全ての参照サンプルにおいて、計算するためのコンピュータプログラムコード；
実験サンプル由来のＳＮＰの対数平均強度と、該ＳＮＰでの遺伝子型呼出しにおける該実験サンプルと一致した参照サンプル由来の該ＳＮＰの対数平均強度との間の対数の強度差を計算するためのコンピュータプログラムコード；
対数−対数の直線モデルを使用して該ＳＮＰのコピー数を推定するためのコンピュータプログラムコード；
該推定されたコピー数によって示される変化の方向についてのｐ値を計算するためのコンピュータプログラムコード；
該計算されたｐ値が、選択された閾値未満であるか否かを決定するためのコンピュータプログラムコード；および
該コンピュータプログラムを格納するためのコンピュータ読出し可能媒体；
を含む、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３１】
請求項３０に記載のコンピュータソフトウェア製品であって、各ＳＮＰについての前期平均強度値の対数は、
【数１８】
を使用して計算され、Ｘは、ＳＮＰ一つ当たりのＰＭプローブの数である、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３２】
請求項３０に記載のコンピュータソフトウェア製品であって、ｐ値が、
【数１９】
を使用して計算される、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３３】
請求項３０に記載のコンピュータソフトウェア製品であって、コピー数は、
【数２０】
を使用して推定される、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３４】
少なくとも一つのヘテロ接合性の喪失領域を同定するためのコンピュータソフトウェア製品であって：
実験サンプルのゲノムにおいてホモ接合性ＳＮＰ遺伝子型呼出しの少なくとも一つの連続した広がりを同定するためのコンピュータプログラムコード；
該連続した広がりにおける各ＳＮＰについてホモ接合性の確率
【数２１】
を得るためのコンピュータプログラムコードであって、ここで、
【数２２】
であるコンピュータプログラムコード；
該連続した広がりにおける該ＳＮＰの各々がホモ接合性である確率を、
【数２３】
を使用することにより計算するためのコンピュータプログラムコード；
【数２４】
が、ｐ値の閾値未満である場合、該ＳＮＰを含む領域をヘテロ接合性喪失領域として同定するためのコンピュータプログラムコード；および
該コンピュータプログラムコードを格納するためのコンピュータ読出し可能媒体；
を含む、コンピュータソフトウェア製品。
【請求項３５】
生物学的実験サンプルにおけるコピー数を推定するためのシステムであって、
プロセッサー；および
該プロセッサーと接続されている
メモリを備え、
該メモリは、該プロセッサーによって実行される場合、該プロセッサーに複数の論理的工程を実施させる複数の機械語命令を格納し、該論理的工程は、
各サンプルにおける個別のＳＮＰの各々について、実験サンプルもしくは参照サンプルおける複数のＳＮＰについての複数の完全一致強度値（ＰＭｉ）の強度値の平均の対数を計算する工程であって、複数の参照サンプルが存在する、工程；
個別の実験サンプルの平均値および参照サンプル内の平均値を正規化する工程；
該個別のＳＮＰで一致した遺伝子型呼出しの全ての参照サンプルにおいて個別のＳＮＰの各々についての対数の平均の強度値を計算する工程；
実験サンプル由来のＳＮＰの対数平均強度と、該ＳＮＰでの遺伝子型呼出しにおける該実験サンプルと一致した参照サンプル由来の該ＳＮＰの対数平均強度との間の対数強度差を計算する工程；
対数−対数直線モデルを使用して該ＳＮＰのコピー数を推定する工程；
該推定したコピー数により示される変化の方向についてのｐ値を計算する工程；および
該計算したｐ値が、選択した閾値未満であるか否かを示す工程；
を包含する、システム。
【請求項３６】
請求項３５に記載のシステムであって、ここで、各ＳＮＰについての平均強度値の対数が、
【数２５】
を使用して計算され、Ｘは、ＳＮＰ一つ当たりのＰＭプローブの数である、システム。
【請求項３７】
請求項３５に記載のシステムであって、ｐ値が、
【数２６】
を使用して計算される、システム。
【請求項３８】
請求項３５に記載のシステムであって、ここでコピー数が、
【数２７】
を使用して推定される、システム。
【請求項３９】
請求項３８に記載のシステムであって、ｂが約０．６９３であり、ｍが約０．８９５である、システム。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２００６−５１９９７７（Ｐ２００６−５１９９７７Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０７１４７（Ｐ２００５−５０７１４７）
【出願日】平成１５年１１月１２日（２００３．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６０１８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４２２５
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月１２日（２００３．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６０１８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４２２５
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
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