ＤＮＡコンジュゲート、及びＤＮＡ検出方法
【課題】 検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、前記ＤＮＡサンプルを適切に分離可能なＤＮＡコンジュゲートを提供する。
【解決手段】 ＤＮＡサンプルを電気泳動により分離するためのＤＮＡコンジュゲートを、前記ＤＮＡサンプルの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質に結合されたＤＮＡプローブとで構成し、該ＤＮＡプローブをＤＮＡサンプルのＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部に結合された、前記ＤＮＡサンプル中の検出対象の目的ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とで構成する。
【解決手段】 ＤＮＡサンプルを電気泳動により分離するためのＤＮＡコンジュゲートを、前記ＤＮＡサンプルの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質に結合されたＤＮＡプローブとで構成し、該ＤＮＡプローブをＤＮＡサンプルのＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部に結合された、前記ＤＮＡサンプル中の検出対象の目的ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とで構成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出してＤＮＡサンプルを判別するＤＮＡコンジュゲート、及び該ＤＮＡコンジュゲートを用いたＤＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。 ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphismの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００３】
前記ＳＮＰｓを調べる方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法がある（特許文献１参照）。前記アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドとして、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖をキャピラリー壁面に固定し、該キャピラリーに固定されたアフィニティリガンドと被検体ＤＮＡとが相互作用して、該被検体ＤＮＡが前記キャピラリーに吸着されることを利用し、前記被検体ＤＮＡを検出するものである。しかしこの方法だと、前記アフィニティリガンドと前記被検体ＤＮＡとの相互作用がキャピラリーの壁面近傍に限られてしまうという問題があった。
【０００４】
これを解決するため、本出願人は、前記ＳＮＰｓを調べる一つの方法として、前記アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、その方法を利用して被検体ＤＮＡを分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
【０００５】
以下、図４〜６を用いて従来方法について説明する。図４は、一般的なキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図であり、図５は、キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー内の状態図であり、図６は、従来におけるＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの関係を示す図である。
【０００６】
図４に示すように、キャピラリー電気泳動装置１００は、それぞれに正電極１３３，負電極１３４を配置した第１容器１３１と第２容器１３２との間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液１１を充たしたキャピラリー１３０で連絡している。そして、図５に示すように、このキャピラリー１３０の緩衝液１１の中に、図６に示す前記ＤＮＡサンプル２０に含まれる検出対象である目的ＤＮＡに対し水素結合可能な塩基配列２１２（以下、「ＤＮＡプローブ」と称す。）と、電気泳動時にほとんど泳動しないリニアポリマーなど電気非泳動物質２１１とを結合してなるＤＮＡコンジュゲート２１０を充填した後、続いて被検体であるＤＮＡサンプル２０を充填する。その後、両電極１３３，１３４間に可変電源部１３５により電圧を印加して、キャピラリー１３０内の被検体であるＤＮＡサンプルを電気泳動させ、該ＤＮＡサンプルに含まれる検出対象である目的ＤＮＡをキャピラリー内でＤＮＡコンジュゲートと水素結合させることでキャピラリー内に擬似的に固定し、該ＤＮＡサンプル中から目的ＤＮＡを分離する。
【０００７】
ここで、図６を用いて、アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法についてより詳細に説明する。
【０００８】
ＤＮＡには、二重鎖を形成するものと一重鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつアデニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合し易くなっており、ＤＮＡの二重鎖においてもＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃで対をなしている。
【０００９】
従って、一方のＤＮＡが５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’と配列されている場合、他方のＤＮＡは３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’という塩基配列をもっている。
【００１０】
ＤＮＡサンプルを分離するＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡサンプルの目的ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡサンプルの検出対象がミュータントＤＮＡであるとし、該ミュータントＤＮＡのＤＮＡ配列が５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’を含み、前記ＤＮＡサンプルに含まれるワイルドＤＮＡが５’−ＡＴＣＡＣＧＴ−３’を含む場合、下線で示した部分でミュータントＤＮＡとワイルドＤＮＡの塩基が異なっている。このとき、ＤＮＡコンジュゲート２１０のＤＮＡプローブ２１２の配列を３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’とすると、ワイルドＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲート２１０のＤＮＡプローブ２１２と相補的ではなくなる。これにより、ＤＮＡコンジュゲートと結合したＤＮＡサンプルのうち、ミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより該ＤＮＡサンプルとの全体の結合力が大きくなり、電気泳動時にミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより遅延して泳動される。
【００１１】
そして、前記ＤＮＡサンプルは、血液などから細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などによって目的のＤＮＡの塩基配列を含む部分を増幅して作製する。このとき、増幅する部分の塩基数と塩基配列パターンに応じて、ＤＮＡコンジュゲートの塩基数が決定されるが、ＰＣＲなどで増幅する目的のＤＮＡの塩基数は、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡの中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数の５０個程度である。
【００１２】
このようして作製された負に帯電したＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルとを、電気泳動で第２容器１３２から第１容器１３１へ移動させると、アフィニティーリガンドを前記キャピラリーの壁面近傍に限らず、該キャピラリー中に擬似的に固定することができる。これにより、前記アフィニティリガンドと被検体ＤＮＡとの相互作用が前記キャピラリーの壁面近傍に限らず該キャピラリー中で作用し、該相互作用により前記ＤＮＡコンジュゲートと結合したＤＮＡサンプルの移動速度差から、ＤＮＡサンプルを前記ワイルドＤＮＡと前記ミュータントＤＮＡとに分離可能となり、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することができる。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上説明したように、従来のＤＮＡコンジュゲート２１０は、ＤＮＡサンプルとの相補的な水素結合による結合力によって、分離性能が決定づけられている。
【００１４】
図７は、４種類の塩基であるチミンＴ、アデニンＡ、シトシンＣ、グアニンＧの中で相補的な関係にあるチミンＴとアデニンＡ、シトシンＣとグアニンＧの水素結合の状態を示した図であるが、図から明らかなように、ＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の場合は２個の水素結合で結合され（図（ａ）参照）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の場合は３個の水素結合で結合されている（図（ｂ）参照）。
【００１５】
よって、塩基配列の長さが同じであっても、ＤＮＡサンプルと該各ＤＮＡサンプルと相補的な配列をもつＤＮＡコンジュゲートとの結合力は、被検体であるＤＮＡサンプルの配列パターンによって異なってくる。例えば、相補的な結合部分であるＤＮＡプローブ２１２の塩基配列が６個の場合、水素結合が最低１２個（すべてＡ−Ｔの場合）から最高１８個（すべてＣ−Ｇの場合）まで存在することとなり、相補的な結合部分の塩基配列の長さが同じであっても、その結合力はかなり異なる。
【００１６】
ここで、ＤＮＡサンプルの分離を行なう場合に、試料を調製した後、装置として制御できる項目は電気泳動時の電圧と、測定温度のみである。従って、ＤＮＡコンジュゲートを作製する際に、該ＤＮＡサンプルに含まれる目的ＤＮＡと、該目的ＤＮＡと相補的な配列をもつＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブとの結合力を適当なものにするようにする必要がある。
【００１７】
従来においては、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡサンプルとの相補的な結合部分の長さを変化させる、すなわちＤＮＡプローブ２１２の塩基配列を長くしたり短くしたりすることで、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブとの結合力をコントロールしていたが、この方法では、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２１２との細かい結合力をコントロールすることはできない。
【００１８】
そこで、従来では、ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルとの結合力に関係する他の項目、例えば、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプルの量、ＤＮＡコンジュゲートの量をＤＮＡサンプルに応じて最適な条件になるよう制御して、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの結合力をコントロールする必要があった。
【００１９】
前記結合制御剤の量が多いほど、またリニアポリマーの粘度が高いほど、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量が多いほど、電気泳動時の電圧が低いほど、測定温度が低いほど、ＤＮＡサンプルがＤＮＡコンジュゲート内を通過するスピードが遅くなり、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの結合力は増加する。
【００２０】
しかしながら、ＤＮＡサンプル毎に、ＤＮＡコンジュゲートに含有させる結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、あるいはＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量の様々なパターンを多数推測して実験し、最適な条件を探索するには多大な労力と時間がかかるという課題があった。
【００２１】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡの配列毎に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、前記ＤＮＡサンプルを適切に分離可能なＤＮＡコンジュゲート、及び該ＤＮＡコンジュゲートを用いたＤＮＡ検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
前記課題を解決するために、本発明の請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートは、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するためのＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記ＤＮＡコンジュゲートは、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、前記ＤＮＡプローブは、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、前記目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合力をコントロールでき、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能なＤＮＡコンジュゲートを提供することができる。
【００２３】
また、本発明の請求項２に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記ＤＮＡプローブのスペーサ部は、１個以上２０個以下の同じ種類の塩基配列を有するものである。
これにより、前記スペーサ部の塩基配列は、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡの電気泳動速度を適度に遅延させて、ＤＮＡサンプルを適切に分離させることができる。
【００２４】
また、本発明の請求項３に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記電気非泳動物質は、リニアポリマーであるものである。
これにより、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブと電気非泳動物質との結合を容易に行うことができ、ＤＮＡコンジュゲートを作製しやすい効果がある。
【００２５】
また、本発明の請求項４に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記リニアポリマーは、アクリルアミドであるものである。
これにより、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブと電気非泳動物質との結合を容易に行うことができる。
【００２６】
また、本発明の請求項５に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記電気非泳動物質は、微粒子もしくは、磁気ビーズであるものである。
これにより、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブと電気非泳動物質との結合を容易に行うことができる。
【００２７】
また、本発明の請求項６に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記ＤＮＡプローブのプローブ部は、６個以上の塩基配列を有するものである。
これにより、前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部と、検出対象である目的ＤＮＡとを適度に結合させることができ、この結果、前記目的ＤＮＡの電気泳動速度を適切に遅延させて、ＤＮＡサンプルの分離を適切に行なうことができる。
【００２８】
本発明の請求項７に記載のＤＮＡ検出方法は、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、該ＤＮＡプローブが、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに充填し、前記ＤＮＡコンジュゲートが充填されたキャピラリー中に、前記ＤＮＡサンプルを注入し、前記キャピラリーの両端に電圧を印加して電気泳動させるものである。
これにより、ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくとも、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となり、この結果、検出対象が多種の場合におけるＤＮＡ検出条件の設定にかかる時間を短縮することが可能となる。
【００２９】
また、本発明の請求項８に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記スペーサ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合を細かくコントロールできる。
【００３０】
また、本発明の請求項９に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記プローブ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合をコントロールできる。
【００３１】
また、本発明の請求項１０に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項８に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強いと思われる場合、前記スペーサ部の塩基配列が長いＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合をコントロールでき、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【００３２】
また、本発明の請求項１１に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項９に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強すぎると思われる場合、前記プローブ部の塩基配列が短いＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとの結合をコントロールでき、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のＤＮＡコンジュゲートによれば、電気非泳動物質と、特定の塩基配列を含む目的ＤＮＡの特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部との間に、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部を設けるようにしたので、前記スペーサ部の塩基配列の長さを変化させることで、前記目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合力をコントロールすることが可能となり、前記目的ＤＮＡの塩基配列が変わるたびに、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などの電気泳動条件を探索せずとも、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能なＤＮＡコンジュゲートを提供することができる。
また、本発明のＤＮＡコンジュゲートによれば、前記スペーサ部が塩基を１〜２０個重ねた配列であるようにしたので、被検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとの結合力をコントロールすることが可能となり、前記目的ＤＮＡの電気泳動速度を適度に遅延させて、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【００３４】
また、本発明のＤＮＡ検出方法によれば、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、該ＤＮＡプローブが、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに充填し、前記ＤＮＡコンジュゲートが充填されたキャピラリー中に、前記ＤＮＡサンプルを注入し、前記キャピラリーの両端に電圧を印加して電気泳動させるようにしたので、前記ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となり、この結果、ＤＮＡ検出条件を短時間で設定することが可能となる。
【００３５】
また、本発明のＤＮＡ検出方法によれば、前記ＤＮＡサンプル中に存在する、塩基配列が特定の配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記ＤＮＡプローブ中の前記スペーサ部の塩基配列の長さ、あるいは前記プローブ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いるようにしたので、前記スペーサ部あるいはプローブ部の塩基配列の長さのみを変更して分離を行なうことが可能となり、ＤＮＡ検出の条件設定にかかる時間を短縮できる。
【００３６】
また、本発明のＤＮＡ検出方法によれば、前記ＤＮＡサンプルと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強すぎると思われる場合は、前記スペーサ部の塩基配列を長く、あるいは前記プローブ部の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲートを用い、前記ＤＮＡサンプルと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が弱すぎると思われる場合は、前記スペーサ部の塩基配列を短く、あるいは前記プローブ部の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲートを用いるようにしたので、前記ＤＮＡサンプルを電気泳動により分離する際に、該ＤＮＡサンプル中の被検出対象となる目的ＤＮＡの塩基配列にかかわらず、該目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとの結合力を適切にコントロールすることができ、この結果、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下に、本発明のＤＮＡコンジュゲート及びＤＮＡ検出方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００３８】
（実施の形態１）
以下、図１〜図３を用いて、本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲートについて説明する。
本実施の形態１では、ＤＮＡコンジュゲートの電気非泳動物質とプローブ部との間に、所定の塩基配列を有するスペーサ部を設け、ＤＮＡサンプルに含まれる被検出対象の目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合を細かく制御可能にしたものである。
【００３９】
まず、図１を用いて、本実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートの構成を説明する。
図１は、本実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートの構成を示す概略図であり、図２は本発明のＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルの関係を示す図である。
【００４０】
なお、本願におけるＤＮＡサンプルは、従来と同様、血液などから細胞を破砕してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡの塩基配列を含む部分を増幅して作製される。また、前記ＰＣＲ時に、前記目的のＤＮＡには、蛍光色素や別の標識となりうるタグが付加される。
【００４１】
図１において、本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲート１０は、電気非泳動物質１と、ＤＮＡプローブ２とからなり、該ＤＮＡプローブ２は、前記ＤＮＡサンプル中の目的ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列と相補的な配列を有するプローブ部４と、前記電気非泳動物質１と前記プローブ部４との間に挿入され、前記目的ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブ２との結合力を制御するスペーサ部３とで構成される。
【００４２】
前記電気非泳動物質1は、電気泳動時のＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する物質で構成されている。本願でいう「ＤＮＡサンプルの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する」とは、例えば内径が７５μｍ、距離３８センチメートルのキャピラリー内を電気泳動する場合、ＤＮＡサンプルが８分で移動するのに対して、前記ＤＮＡコンジュゲートは６０分以上で移動するというレベルを意味し、電気泳動時にほとんど泳動しないといえるものである。
【００４３】
前記電気非泳動物質１は、電気泳動時にほとんど泳動しない物質であればよく、例えば、ポリマーやガラス、磁気ビーズなどが例として挙げられる。本実施の形態１では、前記電気非泳動物質１が、一般的に使用されるリニアポリマーである、アクリルアミドである場合を例に挙げて説明する。
【００４４】
前記ＤＮＡプローブ２のプローブ部４は、図２に示したように、ＤＮＡサンプルに含まれる、検出対象となる目的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するものである。前記プローブ部４の塩基配列は、６塩基以上１２塩基以下が良く、７塩基程度が望ましい。これは、ＤＮＡプローブ２のプローブ部４が６塩基より少ないと、ＤＮＡコンジュゲート１０のプローブ部４と前記目的ＤＮＡの塩基配列との結合が弱すぎて、目的ＤＮＡの電気泳動速度を遅らすことができず、一方、前記プローブ部４が１２塩基より多いと、逆にＤＮＡコンジュゲートのプローブ部４と目的ＤＮＡの塩基配列との結合が強すぎ、前記目的ＤＮＡがＤＮＡコンジュゲートに結合したままとなってしまうからである。
【００４５】
そして、前記ＤＮＡプローブ２のスペーサ部３は、ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するものであり、例えばここでは、スペーサ部の塩基配列が、図１に示すように、３塩基の“Ｔ（チミン）”であるものとする。前記スペーサ部３は、１塩基〜２０塩基が良く、５〜７塩基程度が望ましい。これは、スペーサ部３の塩基配列が１塩基の場合でも、目的ＤＮＡとプローブ部４との結合力に影響を与えることができ、一方、スペーサ部３が２０塩基より多くなると、スペーサ部３部分で高次構造をとるため、スペーサ部３でプローブ部４が隠れてしまい、目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとが結合できなくなるという不具合が生じる可能性があるからである。
【００４６】
また、前記ＤＮＡプローブ２のスペーサ部３は、その塩基配列が長いほど、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２との結合力が弱くなり、逆にその塩基配列が短いほど、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２との結合力が強くなる。これは、前記ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２との結合に関与しないスペーサ部３が持つマイナスの電荷が、前記ＤＮＡプローブ２に結合するために近づいてくるマイナスの電荷を持つＤＮＡサンプルを遠ざけるためである。
【００４７】
しかし、通常の測定温度、及び印加電圧の条件では、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲート１０とは緩衝液中で電気泳動しており、該緩衝液中には結合制御剤である塩化マグネシウムの陽イオンが含まれているため、目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲート１０のＤＮＡプローブ２とは、前記塩化マグネシウム陽イオンに近づいて、相補的な関係の場合に結合するという性質を持っている。
【００４８】
従って、目的ＤＮＡの塩基配列に応じて、スペーサ部３の塩基配列の長さ、あるいはプローブ部４の塩基配列の長さを制御することで、ＤＮＡサンプルとプローブ部４の結合力を細かくコントロールすることが可能となる。この結果、従来のように目的ＤＮＡの塩基配列が異なるたびに、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプルの量、ＤＮＡコンジュゲートの量を複雑に組み合わせて最適な条件を探索せずとも、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となる。
【００４９】
具体的な制御としては、前記ＤＮＡサンプルに含まれる、被検出対象となる目的ＤＮＡの塩基配列を考慮し、前記ＤＮＡサンプルの目的ＤＮＡとプローブ部４との結合が強すぎると思われる場合は、スペーサ部３の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲートを作製し、さらに該スペーサ部３の長さをかえるだけでは対応しきれないと思われる場合は、前記プローブ部４の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲートを作製する。
【００５０】
逆に、前記ＤＮＡサンプルの目的ＤＮＡとプローブ部４との結合が弱すぎると思われる場合は、前記スペーサ部３の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲートを作製し、さらに該スペーサ部３の長さをかえるだけでは対応しきれないと思われる場合は、前記プローブ部４の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲートを作製する。
【００５１】
次に、本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲートの作製方法について説明する。
まず、ＤＮＡサンプル中に含まれる、検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列を考慮し、該目的ＤＮＡの塩基配列に応じた長さを有するスペーサ部３を含むＤＮＡプローブ２を作製し、該ＤＮＡプローブ２を電気非泳動物質１に結合させる。
【００５２】
ＤＮＡプローブ２と電気非泳動物質１との結合は、例えば、前記電気非泳動物質１がアクリルアミドで作られたリニアポリマーの場合は、ＤＮＡプローブ２の５’末端をビニル化した後、該ビニル化したＤＮＡプローブ２を、アクリルアミドモノマーに所定の比率で混入し、前記ＤＮＡプローブ２が混入されたアクリルアミドモノマーに、重合開始剤である過硫酸アンモニウムと、重合剤であるテトラ・エチレン・ジアミンとを混ぜて２時間振動させて結合させる。
【００５３】
以上のようにして作製されたＤＮＡコンジュゲートを用いた、ＤＮＡサンプルの分離方法について、説明する。
本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲートを用いてＤＮＡサンプルを分離するキャピラリー電気泳動装置としては、図４を用いて既に説明した一般的なキャピラリー電気泳動装置１００を用いる。
【００５４】
キャピラリー電気泳動装置１００は、ＤＮＡサンプルを分離するためのカラムであるキャピラリー１３０と、ｐＨを特定の値に調整し、且つ緩衝作用を有し、さらに支持電解質も有している緩衝液１１を保持する第１，第２の容器１３１，１３２と、前記キャピラリー１３０の両端に電圧を印加する陽電極１３３，陰電極１３４と、その両電極１３３，１３４に電圧を印加する可変電源部１３５と、ＤＮＡサンプル中の目的ＤＮＡを検出する検出部１５０と、前記可変電源部１３５の電圧印加、あるいは前記検出部１５０を制御する制御部１４０とで構成される。
【００５５】
そして、前記検出部１５０は、キャピラリー１３０内のＤＮＡサンプルに付加されている蛍光色素への励起光を発生するレーザー１５１と、前記蛍光色素の発光をみるために、光の量を制御するスリット１５２と、該スリット１５２を通過してきた光のうち励起光をカットするフィルター１５３と、該フィルター１５３を通過してきた光を検出するフォトマルチプライヤー１５４と、前記フォトマルチプライヤー１５４で検出された検出信号を電気的に増幅するプリアンプ１５５と、アナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ１５６とを備える。
【００５６】
次に、動作について説明する。
ＤＮＡサンプル中に存在する、塩基配列が特定の配列を含むＤＮＡと、その特定の配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡの一例として、ＳＮＰｓ（一塩基多型）が有るＤＮＡとＳＮＰｓが無いＤＮＡとを分離する場合について説明する。
【００５７】
まず、図１に示すようにＤＮＡプローブ２のプローブ部４が６塩基であるＤＮＡコンジュゲート１０を、ＤＮＡ濃度５０μＭ、ＴＢ（トリスボーレート）バッファ５０ｍＭ、塩化マグネシウム２５０μＭを混合して調製し、図５に示すような内径７５μＭの全長５０センチメートル（有効長４０センチメートル）のキャピラリー１３０中に充填する。
【００５８】
次に、１８塩基のＳＮＰｓ有りのＤＮＡサンプルと１８塩基のＳＮＰｓ無しのＤＮＡサンプルとを各々５０ｎＭで混合したＤＮＡサンプルを、前記キャピラリー１３０の端部に１センチメートル注入する。
【００５９】
ＴＢ（トリスボーレート）バッファ５０ｍＭ、塩化マグネシウム２５０μＭに調整した緩衝液１１に前記キャピラリー１３０の両端部を浸し、更に陽電極１３３，陰電極１３４を緩衝液１１に浸す。
【００６０】
可変電源部１３５より、印加電圧１５ｋＶを陽電極１３３と陰電極１３４間に印加し、測定温度２５℃で、ＤＮＡサンプルを電気泳動させる。
ＤＮＡサンプルには、ＦＩＴＣの蛍光色素が付加されているため、レーザー１５１より４８８ｎｍの励起光を出力して、該ＤＮＡサンプルに光を照射すると、５２０ｎｍの蛍光を発する。
【００６１】
スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記４８８ｎｍの励起光をカットして、ＤＮＡサンプルから発生した５２０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出し、プリアンプ１５５で増幅して、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。
【００６２】
以下、ＤＮＡコンジュゲートの構成の違いから生じる、ＤＮＡサンプルとプローブ部４との結合力への影響について説明する。
例えば、前記１８塩基のＳＮＰｓ無しのＤＮＡサンプル（ＷＴ）として、ＦＩＴＣ−５’−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣ−３’を、前記１８塩基のＳＮＰｓ有りのＤＮＡサンプル（Ｍ）として、ＦＩＴＣ−５’−ＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣ−３’を用意する。
【００６３】
そして、前記ＤＮＡコンジュゲート１０として、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート１）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−Ｔ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート２）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＴＴＴ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート３）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＴＴＴＴＴ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート４）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート５）の５つを用意する。
【００６４】
ＤＮＡコンジュゲートの５つサンプルのうち、ＤＮＡコンジュゲート１はスペーサ部３が設けられていない従来のＤＮＡコンジュゲートであり、ＤＮＡコンジュゲート２〜５はスペーサ部３の塩基配列が１塩基、３塩基、５塩基、１０塩基とそれぞれ異なるＤＮＡコンジュゲートである。
【００６５】
図３は、前述した５つのＤＮＡコンジュゲートそれぞれに、前記ＤＮＡサンプルを挿入して、前記ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）とを分離した時の、それぞれの移動速度差を示す図である。
【００６６】
図３から明らかなように、スペーサ部３として１塩基を挿入すると、ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）との移動速度差の間隔が短くなり、さらに、ＤＮＡコンジュゲートのスペーサ部３の塩基配列が長くなればなるほど、前記移動速度差の間隔がより短くなっていくのが分かる。これは、スペーサ部３がマイナスにチャージしているため、ＤＮＡコンジュゲート１０のプローブ部４と該プローブ部４と相補的な塩基配列を含むＤＮＡの全体としての結合力が弱くなったためと考えられる。
【００６７】
つまり、スペーサ部３の塩基配列が長くなると、プローブ部４と前記ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）との結合力が弱くなり、この結果、ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）の波形とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の波形の間隔、すなわちＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）との移動速度差が縮まってきて、最終的にはＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）の波形とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の波形を分離できなくなる。
【００６８】
逆に、スペーサ部３の塩基配列が短くなると、プローブ部４と該プローブ部４と相補的な塩基配列を含むＤＮＡの間の結合力が強くなり、この結果、ＤＮＡサンプルに含まれる目的ＤＮＡの塩基配列がプローブ部４と結合したまま離れないため、前記ＤＮＡサンプルに含まれる前記プローブ部４と結合しづらいＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の波形だけが現れることになる。
【００６９】
そして、スペーサ部３でなく、プローブ部４の塩基配列を長くすると、プローブ部４とＤＮＡサンプルとの間の結合力が更に強くなり、このときプローブ部４の塩基配列を長くしすぎると、ＤＮＡサンプルは全てＤＮＡコンジュゲートと結合してしまい、ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の両方の波形がまったく現れなくなってしまう。
【００７０】
以上のように、本実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートは、電気非泳動物質１と、ＤＮＡサンプル中の被検出対象である目的ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部４との間に、該ＤＮＡの塩基配列と相補的でない塩基配列からなるスペーサ部３を備えるようにしたので、前記スペーサ部の塩基配列の長さを制御することで、ＤＮＡサンプルとプローブ部４との結合力を細かくコントロールして、ＤＮＡサンプルに含まれる、被検出対象の目的ＤＮＡと検出対象でないＤＮＡとを適切に分離することが可能となる。
【００７１】
また、本実施の形態１によれば、前記目的ＤＮＡの塩基配列に応じて、前記スペーサ部３の塩基配列の長さ、あるいは前記プローブ部４の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲート１０を用いるようにしたので、前記目的ＤＮＡの塩基配列がかわる度に、ＤＮＡコンジュゲートに含める結合制御剤の量やリニアポリマーの粘度、あるいはＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、ＤＮＡプローブ２とＤＮＡサンプルとの結合力を上手く制御することが可能となり、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【００７２】
また、本実施の形態１によれば、多種類のＤＮＡサンプルを検出する必要がある場合に、各ＤＮＡサンプル毎に、ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルとの結合に影響を与えるその他の複雑な条件を変更することなく、前記スペーサ部３の塩基配列の長さ、あるいは前記プローブ部４の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲート１０を用いることで、被検出対象の目的ＤＮＡと検出対象でないＤＮＡとを適切に分離することが可能となるため、多種類のＤＮＡサンプルのＤＮＡ検出の条件設定にかかる時間を短縮できる効果も得られる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明にかかるＤＮＡコンジュゲートは生体物質の状態を電気泳動で調査する際に、適正な分離状態を発生させる測定に必要なＤＮＡコンジュゲートを作製するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートの構成を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルの関係を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態１におけるキャピラリー電気泳動装置において、構成の異なる５つのＤＮＡコンジュゲートを用いた際のＤＮＡサンプルの分離状態を示す図である。
【図４】一般的なキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図である。
【図５】キャピラリー電気泳動装置のキャピラリーを詳細に示す図である。
【図６】従来のＤＮＡコンジュゲートにより、ＤＮＡサンプルが分離される状態を示した図である。
【図７】チミンＴとアデニンＡ、シトシンＣとグアニンＧの水素結合の状態を示した図である。
【符号の説明】
【００７５】
１，２１１ 電気非泳動物質
２，２１２ ＤＮＡプローブ
３ スペーサ部
４ プローブ部
１０，２１０ ＤＮＡコンジュゲート
１１ 緩衝液
２０ ＤＮＡサンプル
１３０ キャピラリー
１３１ 第１の容器
１３２ 第２の容器
１３３ 陽電極
１３４ 陰電極
１３５ 可変電源部
１４０ 制御部
１５０ 検出部
１５１ レーザー
１５２ スリット
１５３ フィルター
１５４ フォトマルチプライヤー
１５５ プリアンプ
１５６ Ａ／Ｄコンバータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出してＤＮＡサンプルを判別するＤＮＡコンジュゲート、及び該ＤＮＡコンジュゲートを用いたＤＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。 ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphismの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００３】
前記ＳＮＰｓを調べる方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法がある（特許文献１参照）。前記アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドとして、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖をキャピラリー壁面に固定し、該キャピラリーに固定されたアフィニティリガンドと被検体ＤＮＡとが相互作用して、該被検体ＤＮＡが前記キャピラリーに吸着されることを利用し、前記被検体ＤＮＡを検出するものである。しかしこの方法だと、前記アフィニティリガンドと前記被検体ＤＮＡとの相互作用がキャピラリーの壁面近傍に限られてしまうという問題があった。
【０００４】
これを解決するため、本出願人は、前記ＳＮＰｓを調べる一つの方法として、前記アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、その方法を利用して被検体ＤＮＡを分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
【０００５】
以下、図４〜６を用いて従来方法について説明する。図４は、一般的なキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図であり、図５は、キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー内の状態図であり、図６は、従来におけるＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの関係を示す図である。
【０００６】
図４に示すように、キャピラリー電気泳動装置１００は、それぞれに正電極１３３，負電極１３４を配置した第１容器１３１と第２容器１３２との間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液１１を充たしたキャピラリー１３０で連絡している。そして、図５に示すように、このキャピラリー１３０の緩衝液１１の中に、図６に示す前記ＤＮＡサンプル２０に含まれる検出対象である目的ＤＮＡに対し水素結合可能な塩基配列２１２（以下、「ＤＮＡプローブ」と称す。）と、電気泳動時にほとんど泳動しないリニアポリマーなど電気非泳動物質２１１とを結合してなるＤＮＡコンジュゲート２１０を充填した後、続いて被検体であるＤＮＡサンプル２０を充填する。その後、両電極１３３，１３４間に可変電源部１３５により電圧を印加して、キャピラリー１３０内の被検体であるＤＮＡサンプルを電気泳動させ、該ＤＮＡサンプルに含まれる検出対象である目的ＤＮＡをキャピラリー内でＤＮＡコンジュゲートと水素結合させることでキャピラリー内に擬似的に固定し、該ＤＮＡサンプル中から目的ＤＮＡを分離する。
【０００７】
ここで、図６を用いて、アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法についてより詳細に説明する。
【０００８】
ＤＮＡには、二重鎖を形成するものと一重鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつアデニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合し易くなっており、ＤＮＡの二重鎖においてもＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃで対をなしている。
【０００９】
従って、一方のＤＮＡが５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’と配列されている場合、他方のＤＮＡは３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’という塩基配列をもっている。
【００１０】
ＤＮＡサンプルを分離するＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡサンプルの目的ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡサンプルの検出対象がミュータントＤＮＡであるとし、該ミュータントＤＮＡのＤＮＡ配列が５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’を含み、前記ＤＮＡサンプルに含まれるワイルドＤＮＡが５’−ＡＴＣＡＣＧＴ−３’を含む場合、下線で示した部分でミュータントＤＮＡとワイルドＤＮＡの塩基が異なっている。このとき、ＤＮＡコンジュゲート２１０のＤＮＡプローブ２１２の配列を３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’とすると、ワイルドＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲート２１０のＤＮＡプローブ２１２と相補的ではなくなる。これにより、ＤＮＡコンジュゲートと結合したＤＮＡサンプルのうち、ミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより該ＤＮＡサンプルとの全体の結合力が大きくなり、電気泳動時にミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより遅延して泳動される。
【００１１】
そして、前記ＤＮＡサンプルは、血液などから細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などによって目的のＤＮＡの塩基配列を含む部分を増幅して作製する。このとき、増幅する部分の塩基数と塩基配列パターンに応じて、ＤＮＡコンジュゲートの塩基数が決定されるが、ＰＣＲなどで増幅する目的のＤＮＡの塩基数は、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡの中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数の５０個程度である。
【００１２】
このようして作製された負に帯電したＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルとを、電気泳動で第２容器１３２から第１容器１３１へ移動させると、アフィニティーリガンドを前記キャピラリーの壁面近傍に限らず、該キャピラリー中に擬似的に固定することができる。これにより、前記アフィニティリガンドと被検体ＤＮＡとの相互作用が前記キャピラリーの壁面近傍に限らず該キャピラリー中で作用し、該相互作用により前記ＤＮＡコンジュゲートと結合したＤＮＡサンプルの移動速度差から、ＤＮＡサンプルを前記ワイルドＤＮＡと前記ミュータントＤＮＡとに分離可能となり、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することができる。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上説明したように、従来のＤＮＡコンジュゲート２１０は、ＤＮＡサンプルとの相補的な水素結合による結合力によって、分離性能が決定づけられている。
【００１４】
図７は、４種類の塩基であるチミンＴ、アデニンＡ、シトシンＣ、グアニンＧの中で相補的な関係にあるチミンＴとアデニンＡ、シトシンＣとグアニンＧの水素結合の状態を示した図であるが、図から明らかなように、ＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の場合は２個の水素結合で結合され（図（ａ）参照）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の場合は３個の水素結合で結合されている（図（ｂ）参照）。
【００１５】
よって、塩基配列の長さが同じであっても、ＤＮＡサンプルと該各ＤＮＡサンプルと相補的な配列をもつＤＮＡコンジュゲートとの結合力は、被検体であるＤＮＡサンプルの配列パターンによって異なってくる。例えば、相補的な結合部分であるＤＮＡプローブ２１２の塩基配列が６個の場合、水素結合が最低１２個（すべてＡ−Ｔの場合）から最高１８個（すべてＣ−Ｇの場合）まで存在することとなり、相補的な結合部分の塩基配列の長さが同じであっても、その結合力はかなり異なる。
【００１６】
ここで、ＤＮＡサンプルの分離を行なう場合に、試料を調製した後、装置として制御できる項目は電気泳動時の電圧と、測定温度のみである。従って、ＤＮＡコンジュゲートを作製する際に、該ＤＮＡサンプルに含まれる目的ＤＮＡと、該目的ＤＮＡと相補的な配列をもつＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブとの結合力を適当なものにするようにする必要がある。
【００１７】
従来においては、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡサンプルとの相補的な結合部分の長さを変化させる、すなわちＤＮＡプローブ２１２の塩基配列を長くしたり短くしたりすることで、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブとの結合力をコントロールしていたが、この方法では、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２１２との細かい結合力をコントロールすることはできない。
【００１８】
そこで、従来では、ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルとの結合力に関係する他の項目、例えば、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプルの量、ＤＮＡコンジュゲートの量をＤＮＡサンプルに応じて最適な条件になるよう制御して、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの結合力をコントロールする必要があった。
【００１９】
前記結合制御剤の量が多いほど、またリニアポリマーの粘度が高いほど、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量が多いほど、電気泳動時の電圧が低いほど、測定温度が低いほど、ＤＮＡサンプルがＤＮＡコンジュゲート内を通過するスピードが遅くなり、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの結合力は増加する。
【００２０】
しかしながら、ＤＮＡサンプル毎に、ＤＮＡコンジュゲートに含有させる結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、あるいはＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量の様々なパターンを多数推測して実験し、最適な条件を探索するには多大な労力と時間がかかるという課題があった。
【００２１】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡの配列毎に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、前記ＤＮＡサンプルを適切に分離可能なＤＮＡコンジュゲート、及び該ＤＮＡコンジュゲートを用いたＤＮＡ検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
前記課題を解決するために、本発明の請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートは、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するためのＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記ＤＮＡコンジュゲートは、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、前記ＤＮＡプローブは、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、前記目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合力をコントロールでき、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能なＤＮＡコンジュゲートを提供することができる。
【００２３】
また、本発明の請求項２に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記ＤＮＡプローブのスペーサ部は、１個以上２０個以下の同じ種類の塩基配列を有するものである。
これにより、前記スペーサ部の塩基配列は、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡの電気泳動速度を適度に遅延させて、ＤＮＡサンプルを適切に分離させることができる。
【００２４】
また、本発明の請求項３に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記電気非泳動物質は、リニアポリマーであるものである。
これにより、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブと電気非泳動物質との結合を容易に行うことができ、ＤＮＡコンジュゲートを作製しやすい効果がある。
【００２５】
また、本発明の請求項４に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記リニアポリマーは、アクリルアミドであるものである。
これにより、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブと電気非泳動物質との結合を容易に行うことができる。
【００２６】
また、本発明の請求項５に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記電気非泳動物質は、微粒子もしくは、磁気ビーズであるものである。
これにより、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブと電気非泳動物質との結合を容易に行うことができる。
【００２７】
また、本発明の請求項６に記載のＤＮＡコンジュゲートは、請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、前記ＤＮＡプローブのプローブ部は、６個以上の塩基配列を有するものである。
これにより、前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部と、検出対象である目的ＤＮＡとを適度に結合させることができ、この結果、前記目的ＤＮＡの電気泳動速度を適切に遅延させて、ＤＮＡサンプルの分離を適切に行なうことができる。
【００２８】
本発明の請求項７に記載のＤＮＡ検出方法は、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、該ＤＮＡプローブが、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに充填し、前記ＤＮＡコンジュゲートが充填されたキャピラリー中に、前記ＤＮＡサンプルを注入し、前記キャピラリーの両端に電圧を印加して電気泳動させるものである。
これにより、ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくとも、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となり、この結果、検出対象が多種の場合におけるＤＮＡ検出条件の設定にかかる時間を短縮することが可能となる。
【００２９】
また、本発明の請求項８に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記スペーサ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合を細かくコントロールできる。
【００３０】
また、本発明の請求項９に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記プローブ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合をコントロールできる。
【００３１】
また、本発明の請求項１０に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項８に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強いと思われる場合、前記スペーサ部の塩基配列が長いＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合をコントロールでき、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【００３２】
また、本発明の請求項１１に記載のＤＮＡ検出方法は、請求項９に記載のＤＮＡ検出方法において、前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強すぎると思われる場合、前記プローブ部の塩基配列が短いＤＮＡコンジュゲートを用いるものである。
これにより、ＤＮＡサンプル中の検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとの結合をコントロールでき、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のＤＮＡコンジュゲートによれば、電気非泳動物質と、特定の塩基配列を含む目的ＤＮＡの特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部との間に、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部を設けるようにしたので、前記スペーサ部の塩基配列の長さを変化させることで、前記目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合力をコントロールすることが可能となり、前記目的ＤＮＡの塩基配列が変わるたびに、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などの電気泳動条件を探索せずとも、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能なＤＮＡコンジュゲートを提供することができる。
また、本発明のＤＮＡコンジュゲートによれば、前記スペーサ部が塩基を１〜２０個重ねた配列であるようにしたので、被検出対象である目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとの結合力をコントロールすることが可能となり、前記目的ＤＮＡの電気泳動速度を適度に遅延させて、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【００３４】
また、本発明のＤＮＡ検出方法によれば、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、該ＤＮＡプローブが、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに充填し、前記ＤＮＡコンジュゲートが充填されたキャピラリー中に、前記ＤＮＡサンプルを注入し、前記キャピラリーの両端に電圧を印加して電気泳動させるようにしたので、前記ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わる度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となり、この結果、ＤＮＡ検出条件を短時間で設定することが可能となる。
【００３５】
また、本発明のＤＮＡ検出方法によれば、前記ＤＮＡサンプル中に存在する、塩基配列が特定の配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記ＤＮＡプローブ中の前記スペーサ部の塩基配列の長さ、あるいは前記プローブ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いるようにしたので、前記スペーサ部あるいはプローブ部の塩基配列の長さのみを変更して分離を行なうことが可能となり、ＤＮＡ検出の条件設定にかかる時間を短縮できる。
【００３６】
また、本発明のＤＮＡ検出方法によれば、前記ＤＮＡサンプルと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強すぎると思われる場合は、前記スペーサ部の塩基配列を長く、あるいは前記プローブ部の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲートを用い、前記ＤＮＡサンプルと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が弱すぎると思われる場合は、前記スペーサ部の塩基配列を短く、あるいは前記プローブ部の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲートを用いるようにしたので、前記ＤＮＡサンプルを電気泳動により分離する際に、該ＤＮＡサンプル中の被検出対象となる目的ＤＮＡの塩基配列にかかわらず、該目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとの結合力を適切にコントロールすることができ、この結果、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下に、本発明のＤＮＡコンジュゲート及びＤＮＡ検出方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００３８】
（実施の形態１）
以下、図１〜図３を用いて、本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲートについて説明する。
本実施の形態１では、ＤＮＡコンジュゲートの電気非泳動物質とプローブ部との間に、所定の塩基配列を有するスペーサ部を設け、ＤＮＡサンプルに含まれる被検出対象の目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合を細かく制御可能にしたものである。
【００３９】
まず、図１を用いて、本実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートの構成を説明する。
図１は、本実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートの構成を示す概略図であり、図２は本発明のＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルの関係を示す図である。
【００４０】
なお、本願におけるＤＮＡサンプルは、従来と同様、血液などから細胞を破砕してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡの塩基配列を含む部分を増幅して作製される。また、前記ＰＣＲ時に、前記目的のＤＮＡには、蛍光色素や別の標識となりうるタグが付加される。
【００４１】
図１において、本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲート１０は、電気非泳動物質１と、ＤＮＡプローブ２とからなり、該ＤＮＡプローブ２は、前記ＤＮＡサンプル中の目的ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列と相補的な配列を有するプローブ部４と、前記電気非泳動物質１と前記プローブ部４との間に挿入され、前記目的ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブ２との結合力を制御するスペーサ部３とで構成される。
【００４２】
前記電気非泳動物質1は、電気泳動時のＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する物質で構成されている。本願でいう「ＤＮＡサンプルの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する」とは、例えば内径が７５μｍ、距離３８センチメートルのキャピラリー内を電気泳動する場合、ＤＮＡサンプルが８分で移動するのに対して、前記ＤＮＡコンジュゲートは６０分以上で移動するというレベルを意味し、電気泳動時にほとんど泳動しないといえるものである。
【００４３】
前記電気非泳動物質１は、電気泳動時にほとんど泳動しない物質であればよく、例えば、ポリマーやガラス、磁気ビーズなどが例として挙げられる。本実施の形態１では、前記電気非泳動物質１が、一般的に使用されるリニアポリマーである、アクリルアミドである場合を例に挙げて説明する。
【００４４】
前記ＤＮＡプローブ２のプローブ部４は、図２に示したように、ＤＮＡサンプルに含まれる、検出対象となる目的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するものである。前記プローブ部４の塩基配列は、６塩基以上１２塩基以下が良く、７塩基程度が望ましい。これは、ＤＮＡプローブ２のプローブ部４が６塩基より少ないと、ＤＮＡコンジュゲート１０のプローブ部４と前記目的ＤＮＡの塩基配列との結合が弱すぎて、目的ＤＮＡの電気泳動速度を遅らすことができず、一方、前記プローブ部４が１２塩基より多いと、逆にＤＮＡコンジュゲートのプローブ部４と目的ＤＮＡの塩基配列との結合が強すぎ、前記目的ＤＮＡがＤＮＡコンジュゲートに結合したままとなってしまうからである。
【００４５】
そして、前記ＤＮＡプローブ２のスペーサ部３は、ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するものであり、例えばここでは、スペーサ部の塩基配列が、図１に示すように、３塩基の“Ｔ（チミン）”であるものとする。前記スペーサ部３は、１塩基〜２０塩基が良く、５〜７塩基程度が望ましい。これは、スペーサ部３の塩基配列が１塩基の場合でも、目的ＤＮＡとプローブ部４との結合力に影響を与えることができ、一方、スペーサ部３が２０塩基より多くなると、スペーサ部３部分で高次構造をとるため、スペーサ部３でプローブ部４が隠れてしまい、目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲートとが結合できなくなるという不具合が生じる可能性があるからである。
【００４６】
また、前記ＤＮＡプローブ２のスペーサ部３は、その塩基配列が長いほど、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２との結合力が弱くなり、逆にその塩基配列が短いほど、ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２との結合力が強くなる。これは、前記ＤＮＡサンプルとＤＮＡプローブ２との結合に関与しないスペーサ部３が持つマイナスの電荷が、前記ＤＮＡプローブ２に結合するために近づいてくるマイナスの電荷を持つＤＮＡサンプルを遠ざけるためである。
【００４７】
しかし、通常の測定温度、及び印加電圧の条件では、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲート１０とは緩衝液中で電気泳動しており、該緩衝液中には結合制御剤である塩化マグネシウムの陽イオンが含まれているため、目的ＤＮＡとＤＮＡコンジュゲート１０のＤＮＡプローブ２とは、前記塩化マグネシウム陽イオンに近づいて、相補的な関係の場合に結合するという性質を持っている。
【００４８】
従って、目的ＤＮＡの塩基配列に応じて、スペーサ部３の塩基配列の長さ、あるいはプローブ部４の塩基配列の長さを制御することで、ＤＮＡサンプルとプローブ部４の結合力を細かくコントロールすることが可能となる。この結果、従来のように目的ＤＮＡの塩基配列が異なるたびに、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、ＤＮＡサンプルの量、ＤＮＡコンジュゲートの量を複雑に組み合わせて最適な条件を探索せずとも、ＤＮＡサンプルを適切に分離することが可能となる。
【００４９】
具体的な制御としては、前記ＤＮＡサンプルに含まれる、被検出対象となる目的ＤＮＡの塩基配列を考慮し、前記ＤＮＡサンプルの目的ＤＮＡとプローブ部４との結合が強すぎると思われる場合は、スペーサ部３の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲートを作製し、さらに該スペーサ部３の長さをかえるだけでは対応しきれないと思われる場合は、前記プローブ部４の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲートを作製する。
【００５０】
逆に、前記ＤＮＡサンプルの目的ＤＮＡとプローブ部４との結合が弱すぎると思われる場合は、前記スペーサ部３の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲートを作製し、さらに該スペーサ部３の長さをかえるだけでは対応しきれないと思われる場合は、前記プローブ部４の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲートを作製する。
【００５１】
次に、本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲートの作製方法について説明する。
まず、ＤＮＡサンプル中に含まれる、検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列を考慮し、該目的ＤＮＡの塩基配列に応じた長さを有するスペーサ部３を含むＤＮＡプローブ２を作製し、該ＤＮＡプローブ２を電気非泳動物質１に結合させる。
【００５２】
ＤＮＡプローブ２と電気非泳動物質１との結合は、例えば、前記電気非泳動物質１がアクリルアミドで作られたリニアポリマーの場合は、ＤＮＡプローブ２の５’末端をビニル化した後、該ビニル化したＤＮＡプローブ２を、アクリルアミドモノマーに所定の比率で混入し、前記ＤＮＡプローブ２が混入されたアクリルアミドモノマーに、重合開始剤である過硫酸アンモニウムと、重合剤であるテトラ・エチレン・ジアミンとを混ぜて２時間振動させて結合させる。
【００５３】
以上のようにして作製されたＤＮＡコンジュゲートを用いた、ＤＮＡサンプルの分離方法について、説明する。
本実施の形態１のＤＮＡコンジュゲートを用いてＤＮＡサンプルを分離するキャピラリー電気泳動装置としては、図４を用いて既に説明した一般的なキャピラリー電気泳動装置１００を用いる。
【００５４】
キャピラリー電気泳動装置１００は、ＤＮＡサンプルを分離するためのカラムであるキャピラリー１３０と、ｐＨを特定の値に調整し、且つ緩衝作用を有し、さらに支持電解質も有している緩衝液１１を保持する第１，第２の容器１３１，１３２と、前記キャピラリー１３０の両端に電圧を印加する陽電極１３３，陰電極１３４と、その両電極１３３，１３４に電圧を印加する可変電源部１３５と、ＤＮＡサンプル中の目的ＤＮＡを検出する検出部１５０と、前記可変電源部１３５の電圧印加、あるいは前記検出部１５０を制御する制御部１４０とで構成される。
【００５５】
そして、前記検出部１５０は、キャピラリー１３０内のＤＮＡサンプルに付加されている蛍光色素への励起光を発生するレーザー１５１と、前記蛍光色素の発光をみるために、光の量を制御するスリット１５２と、該スリット１５２を通過してきた光のうち励起光をカットするフィルター１５３と、該フィルター１５３を通過してきた光を検出するフォトマルチプライヤー１５４と、前記フォトマルチプライヤー１５４で検出された検出信号を電気的に増幅するプリアンプ１５５と、アナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ１５６とを備える。
【００５６】
次に、動作について説明する。
ＤＮＡサンプル中に存在する、塩基配列が特定の配列を含むＤＮＡと、その特定の配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡの一例として、ＳＮＰｓ（一塩基多型）が有るＤＮＡとＳＮＰｓが無いＤＮＡとを分離する場合について説明する。
【００５７】
まず、図１に示すようにＤＮＡプローブ２のプローブ部４が６塩基であるＤＮＡコンジュゲート１０を、ＤＮＡ濃度５０μＭ、ＴＢ（トリスボーレート）バッファ５０ｍＭ、塩化マグネシウム２５０μＭを混合して調製し、図５に示すような内径７５μＭの全長５０センチメートル（有効長４０センチメートル）のキャピラリー１３０中に充填する。
【００５８】
次に、１８塩基のＳＮＰｓ有りのＤＮＡサンプルと１８塩基のＳＮＰｓ無しのＤＮＡサンプルとを各々５０ｎＭで混合したＤＮＡサンプルを、前記キャピラリー１３０の端部に１センチメートル注入する。
【００５９】
ＴＢ（トリスボーレート）バッファ５０ｍＭ、塩化マグネシウム２５０μＭに調整した緩衝液１１に前記キャピラリー１３０の両端部を浸し、更に陽電極１３３，陰電極１３４を緩衝液１１に浸す。
【００６０】
可変電源部１３５より、印加電圧１５ｋＶを陽電極１３３と陰電極１３４間に印加し、測定温度２５℃で、ＤＮＡサンプルを電気泳動させる。
ＤＮＡサンプルには、ＦＩＴＣの蛍光色素が付加されているため、レーザー１５１より４８８ｎｍの励起光を出力して、該ＤＮＡサンプルに光を照射すると、５２０ｎｍの蛍光を発する。
【００６１】
スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記４８８ｎｍの励起光をカットして、ＤＮＡサンプルから発生した５２０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出し、プリアンプ１５５で増幅して、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。
【００６２】
以下、ＤＮＡコンジュゲートの構成の違いから生じる、ＤＮＡサンプルとプローブ部４との結合力への影響について説明する。
例えば、前記１８塩基のＳＮＰｓ無しのＤＮＡサンプル（ＷＴ）として、ＦＩＴＣ−５’−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣ−３’を、前記１８塩基のＳＮＰｓ有りのＤＮＡサンプル（Ｍ）として、ＦＩＴＣ−５’−ＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣ−３’を用意する。
【００６３】
そして、前記ＤＮＡコンジュゲート１０として、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート１）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−Ｔ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート２）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＴＴＴ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート３）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＴＴＴＴＴ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート４）、ｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＡＣＣＡＧＣ−３’（ＤＮＡコンジュゲート５）の５つを用意する。
【００６４】
ＤＮＡコンジュゲートの５つサンプルのうち、ＤＮＡコンジュゲート１はスペーサ部３が設けられていない従来のＤＮＡコンジュゲートであり、ＤＮＡコンジュゲート２〜５はスペーサ部３の塩基配列が１塩基、３塩基、５塩基、１０塩基とそれぞれ異なるＤＮＡコンジュゲートである。
【００６５】
図３は、前述した５つのＤＮＡコンジュゲートそれぞれに、前記ＤＮＡサンプルを挿入して、前記ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）とを分離した時の、それぞれの移動速度差を示す図である。
【００６６】
図３から明らかなように、スペーサ部３として１塩基を挿入すると、ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）との移動速度差の間隔が短くなり、さらに、ＤＮＡコンジュゲートのスペーサ部３の塩基配列が長くなればなるほど、前記移動速度差の間隔がより短くなっていくのが分かる。これは、スペーサ部３がマイナスにチャージしているため、ＤＮＡコンジュゲート１０のプローブ部４と該プローブ部４と相補的な塩基配列を含むＤＮＡの全体としての結合力が弱くなったためと考えられる。
【００６７】
つまり、スペーサ部３の塩基配列が長くなると、プローブ部４と前記ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）との結合力が弱くなり、この結果、ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）の波形とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の波形の間隔、すなわちＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）との移動速度差が縮まってきて、最終的にはＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）の波形とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の波形を分離できなくなる。
【００６８】
逆に、スペーサ部３の塩基配列が短くなると、プローブ部４と該プローブ部４と相補的な塩基配列を含むＤＮＡの間の結合力が強くなり、この結果、ＤＮＡサンプルに含まれる目的ＤＮＡの塩基配列がプローブ部４と結合したまま離れないため、前記ＤＮＡサンプルに含まれる前記プローブ部４と結合しづらいＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の波形だけが現れることになる。
【００６９】
そして、スペーサ部３でなく、プローブ部４の塩基配列を長くすると、プローブ部４とＤＮＡサンプルとの間の結合力が更に強くなり、このときプローブ部４の塩基配列を長くしすぎると、ＤＮＡサンプルは全てＤＮＡコンジュゲートと結合してしまい、ＳＮＰｓ無しのＤＮＡ（ＷＴ）とＳＮＰｓ有りのＤＮＡ（Ｍ）の両方の波形がまったく現れなくなってしまう。
【００７０】
以上のように、本実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートは、電気非泳動物質１と、ＤＮＡサンプル中の被検出対象である目的ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部４との間に、該ＤＮＡの塩基配列と相補的でない塩基配列からなるスペーサ部３を備えるようにしたので、前記スペーサ部の塩基配列の長さを制御することで、ＤＮＡサンプルとプローブ部４との結合力を細かくコントロールして、ＤＮＡサンプルに含まれる、被検出対象の目的ＤＮＡと検出対象でないＤＮＡとを適切に分離することが可能となる。
【００７１】
また、本実施の形態１によれば、前記目的ＤＮＡの塩基配列に応じて、前記スペーサ部３の塩基配列の長さ、あるいは前記プローブ部４の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲート１０を用いるようにしたので、前記目的ＤＮＡの塩基配列がかわる度に、ＤＮＡコンジュゲートに含める結合制御剤の量やリニアポリマーの粘度、あるいはＤＮＡサンプル及びＤＮＡコンジュゲートの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、ＤＮＡプローブ２とＤＮＡサンプルとの結合力を上手く制御することが可能となり、ＤＮＡサンプルを適切に分離することができる。
【００７２】
また、本実施の形態１によれば、多種類のＤＮＡサンプルを検出する必要がある場合に、各ＤＮＡサンプル毎に、ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルとの結合に影響を与えるその他の複雑な条件を変更することなく、前記スペーサ部３の塩基配列の長さ、あるいは前記プローブ部４の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲート１０を用いることで、被検出対象の目的ＤＮＡと検出対象でないＤＮＡとを適切に分離することが可能となるため、多種類のＤＮＡサンプルのＤＮＡ検出の条件設定にかかる時間を短縮できる効果も得られる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明にかかるＤＮＡコンジュゲートは生体物質の状態を電気泳動で調査する際に、適正な分離状態を発生させる測定に必要なＤＮＡコンジュゲートを作製するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートの構成を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態１におけるＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルの関係を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態１におけるキャピラリー電気泳動装置において、構成の異なる５つのＤＮＡコンジュゲートを用いた際のＤＮＡサンプルの分離状態を示す図である。
【図４】一般的なキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図である。
【図５】キャピラリー電気泳動装置のキャピラリーを詳細に示す図である。
【図６】従来のＤＮＡコンジュゲートにより、ＤＮＡサンプルが分離される状態を示した図である。
【図７】チミンＴとアデニンＡ、シトシンＣとグアニンＧの水素結合の状態を示した図である。
【符号の説明】
【００７５】
１，２１１ 電気非泳動物質
２，２１２ ＤＮＡプローブ
３ スペーサ部
４ プローブ部
１０，２１０ ＤＮＡコンジュゲート
１１ 緩衝液
２０ ＤＮＡサンプル
１３０ キャピラリー
１３１ 第１の容器
１３２ 第２の容器
１３３ 陽電極
１３４ 陰電極
１３５ 可変電源部
１４０ 制御部
１５０ 検出部
１５１ レーザー
１５２ スリット
１５３ フィルター
１５４ フォトマルチプライヤー
１５５ プリアンプ
１５６ Ａ／Ｄコンバータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するためのＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記ＤＮＡコンジュゲートは、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、
該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、
前記ＤＮＡプローブは、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、
該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなる、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記ＤＮＡプローブのスペーサ部は、１個以上２０個以下の同じ種類の塩基配列を有する、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記電気非泳動物質は、リニアポリマーである、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記リニアポリマーは、アクリルアミドである、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記電気非泳動物質は、微粒子もしくは、磁気ビーズである、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記ＤＮＡプローブのプローブ部は、６個以上の塩基配列を有する、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項７】
ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、
前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、該ＤＮＡプローブが、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに充填し、
前記ＤＮＡコンジュゲートが充填されたキャピラリー中に、前記ＤＮＡサンプルを注入し、
前記キャピラリーの両端に電圧を印加して電気泳動させる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記スペーサ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記プローブ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強いと思われる場合、前記スペーサ部の塩基配列が長いＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強すぎると思われる場合、前記プローブ部の塩基配列が短いＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するためのＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記ＤＮＡコンジュゲートは、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、
該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、
前記ＤＮＡプローブは、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、
該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなる、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記ＤＮＡプローブのスペーサ部は、１個以上２０個以下の同じ種類の塩基配列を有する、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記電気非泳動物質は、リニアポリマーである、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記リニアポリマーは、アクリルアミドである、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記電気非泳動物質は、微粒子もしくは、磁気ビーズである、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡコンジュゲートにおいて、
前記ＤＮＡプローブのプローブ部は、６個以上の塩基配列を有する、
ことを特徴とするＤＮＡコンジュゲート。
【請求項７】
ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の塩基配列を含むＤＮＡと、該特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含むＤＮＡとを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、
前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質と、該電気非泳動物質と結合されたＤＮＡプローブとからなり、該ＤＮＡプローブが、前記電気非泳動物質と結合された、前記ＤＮＡサンプル中のＤＮＡの塩基配列の一部と相補的でない塩基配列を有するスペーサ部と、該スペーサ部と結合された、前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ部とからなるＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに充填し、
前記ＤＮＡコンジュゲートが充填されたキャピラリー中に、前記ＤＮＡサンプルを注入し、
前記キャピラリーの両端に電圧を印加して電気泳動させる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記スペーサ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
請求項７に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に応じて、前記プローブ部の塩基配列の長さの異なるＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強いと思われる場合、前記スペーサ部の塩基配列が長いＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡ検出方法において、
前記特定の塩基配列を有するＤＮＡと前記ＤＮＡコンジュゲートのプローブ部との結合が強すぎると思われる場合、前記プローブ部の塩基配列が短いＤＮＡコンジュゲートを用いる、
ことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１５８２７５（Ｐ２００６−１５８２７５Ａ）
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３５３１４８（Ｐ２００４−３５３１４８）
【出願日】平成１６年１２月６日（２００４．１２．６）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月６日（２００４．１２．６）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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