ＤＮＡ構築物並びに融合タンパク質の発酵的製造方法
【課題】Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にし、加えて前記の従来技術の欠点のないＤＮＡ構築物を提供する。
【解決手段】シグナルペプチドをコードする核酸配列と、それと機能的に結合されているキャリヤータンパク質をコードする遺伝子と、それと開裂可能な配列Ｓをコードする遺伝子を介して結合されている標的タンパク質をコードする遺伝子とからなる、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にするＤＮＡ構築物であって、キャリヤータンパク質をコードする遺伝子がＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物によって解決される。
【解決手段】シグナルペプチドをコードする核酸配列と、それと機能的に結合されているキャリヤータンパク質をコードする遺伝子と、それと開裂可能な配列Ｓをコードする遺伝子を介して結合されている標的タンパク質をコードする遺伝子とからなる、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にするＤＮＡ構築物であって、キャリヤータンパク質をコードする遺伝子がＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物によって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ構築物並びに該構築物を使用した融合タンパク質の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質医薬（"バイオロジクス"）に関する市場は、近年に大きく成長している。タンパク質を基礎とする医薬作用物質に関して生産費用が依然として非常に高いことに基づき、効率化されたことで廉価となった製造のための方法及び系が絶え間なく探求されている。タンパク質の生産体としては、種々の微生物、例えば細菌、酵母等の糸状菌又は植物細胞もしくは動物細胞も使用することができる。それらの非常に良好に調査された遺伝学及び生態学と、短い発生時間と、簡単な取り扱いとに基づき、もちろん目下、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリ（Ｅ．コリ）が、組み換えタンパク質の生産のために最も頻繁に使用される生物である。
【０００３】
Ｅ．コリにおける組み換えタンパク質の製造に際して、しばしば該細胞の細胞質内での"封入体"形成の問題に悩まされている。前記困難は、しばしば、該細胞が、その都度生産されるべき組み換えタンパク質（以下に標的タンパク質とも呼称する）を、細胞質内に蓄えずに、能動的にペリプラズムへと、理想的にはその上さらに培養培地にまで分泌するように生産系を設計することによって回避することができる。このことは、細胞からの標的タンパク質をまず、細胞質性の前駆体−融合タンパク質として合成する（図１Ａ及び図１Ｂ）によって達成でき、その際、シグナルペプチド（ＳＰ）は、分泌過程の間にペリプラズムにおいてインビボで開裂されて、融合タンパク質を生成する（図１Ｃ及び図１Ｄ）。Ｅ．コリにおいては、シグナルペプチドの輸送と開裂をＳｅｃ系が担っている。原則的に、標的タンパク質の細胞外生産の場合に、Ｅ．コリの細胞質もしくは細胞外のタンパク質のシグナルペプチドが使用される。前記のＥ．コリ固有のタンパク質は、Ｓｅｃ経路を介して分泌される。例えば、ここでＥ．コリのタンパク質のシグナルペプチドとして、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＳｔＩＩ、Ｌｐｐ及びＭａｌＥが挙げられる。Ｓｅｃ系の場合に、該タンパク質は折り畳まれていない状態で細胞質膜を通って輸送され、引き続きペリプラズムで折り畳まれる。それに対して、ＴＡＴ系（双方アルギニン転座（Ｔｗｉｎ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ））を用いると、既に細胞質内で折り畳まれたタンパク質をペリプラズムへと分泌させることができるが、その際、特殊なシグナルペプチドが必要となる（例えばタンパク質ＴｏｒＡ又はＴａｐのシグナルペプチド）。ＣｈｏｉとＬｅｅとによる概要文献（２００４年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４，６２５−６３５）において、組み換えタンパク質の分泌的かつ細胞外の生産についての先行技術が代表的な例をもとに表されている。
【０００４】
ペリプラズム又は培養培地中での標的タンパク質の集積は、細胞内生産に対して以下の利点を有する：
とりわけ
１）分泌された標的タンパク質のＮ末端アミノ酸残基が必ずしもメチオニンである必要がなく、産物の天然の開始メチオニンと同一であってよいこと、
２）ペリプラズム内でのプロテアーゼ活性が細胞質内よりも明らかに低いこと、
３）ペリプラズムあるいは培養培地からのタンパク質の精製が、細胞質からよりも容易であること、それというのもそこでは不純物の少ない宿主タンパク質が含まれているからである、
４）場合により必要とされるジスルフィド結合の形成が、ペリプラズムの酸化的条件下で可能であること
である。
【０００５】
多くの場合に、例えば特にタンパク質分解に対して感受性であるか又は"封入体"の形成傾向にある組み換えタンパク質もしくはペプチドの分泌的生産の場合には、組み換えタンパク質をシグナルペプチドに直接的に結合させずに、更なるタンパク質、つまりキャリヤータンパク質のＣ末端へと結合させる（図１Ａ：前駆体−融合タンパク質及び図１Ｃ：融合タンパク質を参照のこと）ことが合理的であり、あるいは効率的な生産のためにはむしろ必要条件である。分泌可能な融合タンパク質の部分として、しばしば、標的タンパク質の発酵培地中での可溶性を高めることができる。同様に、キャリヤータンパク質への結合と、全ての前駆体−融合タンパク質が細胞質から迅速に排出されることによって、タンパク質分解に感受性の標的タンパク質あるいは標的ペプチドを、細胞内分解から保護することができる。分解に対して感受性の遺伝子産物を保護し、それにより安定化させるためには、標的タンパク質のＣ末端にキャリヤータンパク質を融合させる可能性もある（図１Ｂ：前駆体−融合タンパク質及び図１Ｄ：融合タンパク質を参照のこと）。そのための一例は、タンパク質であるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼであり、それは標的タンパク質としての組み換えプロテアーゼインヒビターの分泌に際して、キャリヤータンパク質としても、二量体化ドメインとしても使用される（Ｔｕｄｙｋａ及びＳｋｅｒｒａ著、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，２１８０−２１８７）。
【０００６】
標的タンパク質とは、以下で、組み換えタンパク質、タンパク質断片又はペプチドを表し、それは細胞外又はペリプラズムで、５０ｍｇ／ｌより高い収率で生産されることが望ましい。
【０００７】
前駆体−融合タンパク質とは、以下で、キャリヤータンパク質と標的タンパク質とシグナルペプチド（ＳＰ）とからなるタンパク質を表す。キャリヤータンパク質と標的タンパク質は、酵素的又は化学的に開裂可能な配列Ｓによって互いに結合されている。該シグナルペプチドは、細胞質膜を通過する融合タンパク質の移動のために必要である。前記のシグナルペプチドは、ペリプラズムへの分泌過程の間に融合タンパク質から分離され、それによって融合タンパク質が生成する。
【０００８】
融合タンパク質とは、以下で、キャリヤータンパク質と標的タンパク質とからなるタンパク質を表す。キャリヤータンパク質と標的タンパク質は、酵素的又は化学的に開裂可能な配列Ｓによって互いに結合されている。
【０００９】
キャリヤータンパク質とは、前駆体−融合タンパク質もしくは融合タンパク質の部分であって、標的タンパク質の安定化のために使用される部分を表す。
【００１０】
シグナルペプチドの前駆体−融合タンパク質からの開裂の後に、該融合タンパク質は、ペリプラズム又は培養培地中に集積される。有利には、標的タンパク質は、アミノ酸配列である開裂可能な配列Ｓを介してキャリヤータンパク質と結合されており（図１を参照のこと）、そこで後続工程において標的タンパク質を、インビトロで、酵素的もしくは化学的に開裂させて、こうして遊離させることができる。
【００１１】
キャリヤータンパク質としては、例えばＥ．コリ−タンパク質であるＹｅｂＦ（Ｚｈａｎｇ他著、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１００−１０４及びＷＯ２００６０１７９２９号Ａ１）が、タンパク質の細胞外生産のために記載されている。
【００１２】
ＹｅｂＦ−タンパク質は、１１８個のアミノ酸の一次構造を有し、かつ１０．８ｋＤａの分子量を有しており、今までで最小のキャリヤータンパク質であって、Ｅ．コリにおけるタンパク質の異種発現のために記載されている。キャリヤータンパク質としてＹｅｂＦ−タンパク質を使用する場合の欠点は、該タンパク質が、全体で３個のシステイン残基を有し、その中の２個が該タンパク質の成熟部分に局在化されていることである。これらの２個のシステイン残基は、その際、ペリプラズムの酸化性環境で標的タンパク質とジスルフィド結合を形成することがあり、それによって標的タンパク質の折り畳み不全となりうるからである。このことは、最悪の場合には役に立たない標的タンパク質をもたらす。誤ったジスルフィド結合の形成は、標的タンパク質とＹｅｂＦ−タンパク質との開裂前にも後にも可能性がある。
【００１３】
他のキャリヤータンパク質は、Ｅ．コリのＯｍｐＦ−タンパク質である。ＪｅｏｎｇとＬｅｅとは、ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン−融合タンパク質を、Ｅ．コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（２００２年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４９７９−８５）の派生物を用いて細胞外産生することを記載している。３６２個のアミノ酸の一次構造と、そこから得られる３６ｋＤａの分子量とをもって、ＯｍｐＦ−キャリヤータンパク質は、キャリヤータンパク質ＹｅｂＦよりもかなり大きく、かつ重たい。このことは、Ｅ．コリ細胞が、標的タンパク質の産生に際して、ＹｅｂＦの代わりにＯｍｐＦをキャリヤータンパク質として使用すると、明らかに代謝的により高い負荷がかかることを意味する。前記のＪｅｏｎｇとＬｅｅによる刊行物において、このことは特に明らかである：５．６ｇ／ｌの融合タンパク質の生産力で、０．３３ｇ／ｌのβ−エンドルフィンしか得られない。
【００１４】
他のキャリヤータンパク質は、Ｅ．コリのＨｌｙＡ−タンパク質のＣ末端断片である。Ｅ．コリ由来の溶血素（ＨｌｙＡ−タンパク質）は、１１０ｋＤａの分子量を有する小孔形成性の外毒素であり、それは病原性Ｅ．コリ株で存在し、例えば尿路感染を引き起こす。ＨｌｙＡ−タンパク質は、固有の溶血素輸送系を介して、内膜と外膜を通じて細胞から排出される。融合タンパク質の製造のために、該タンパク質の２３ｋＤａの分子量を有する２１８個のアミノ酸のＣ末端ドメインが用いられる。該ドメインは、両方の膜を通過する移動のために必要である。ヒトのインターロイキン−６は、ＨｌｙＡ−キャリヤータンパク質を用いて細胞外で培養上清において生産することができる。その収率は、７０μｇ／ｌと極めて低い（Ｌｉ他著、２００２年、Ｇｅｎｅ ２５，４３７−４４７）。しかしながら毒性のＥ．コリ−タンパク質の断片として、前記断片は、医薬品に有効なタンパク質の製造のためには不適である。
【００１５】
更に、真核性タンパク質である薬用蛭由来のヒルジンは、標的タンパク質の細胞外産生のためのキャリヤータンパク質として知られている。ヒルジンは、トロンビンインヒビターであり、極めて高い親和性（Ｋｉ＝２０ｆＭ）でプロテアーゼのトロンビンに結合する。６５個のアミノ酸からなる該ペプチドは、その６個のシステイン残基で３個の内部ジスルフィド結合を形成する。キャリヤータンパク質のヒルジンは、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の細胞外産生のために、細菌性シグナルペプチドと融合される。シグナルペプチドとしては、例えばＥ．コリ−タンパク質であるＰｈｏＡもしくはＯｍｐＣ（ＥＰ１３６４０２９号Ｂ１）の配列又はα−シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１）のシグナルペプチドも使用される。そのトロンビンインヒビターとしての生物学的活性に基づき、ヒルジンは、医薬タンパク質の生産のために不適である。それというのも標的タンパク質の生産工程において、キャリヤータンパク質であるヒルジンによる汚染が存在しないことを保証せねばならないからである。このことは、標的タンパク質の精製工程を非常に費用のかかるものにし、それにより高価なものとなる。
【特許文献１】ＷＯ２００６０１７９２９号Ａ１
【特許文献２】ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１
【非特許文献１】ＣｈｏｉとＬｅｅ著、２００４年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４，６２５−６３５
【非特許文献２】Ｔｕｄｙｋａ及びＳｋｅｒｒａ著、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，２１８０−２１８７
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ他著、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１００−１０４
【非特許文献４】ＪｅｏｎｇとＬｅｅ著、２００２年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４９７９−８５
【非特許文献５】Ｌｉ他著、２００２年、Ｇｅｎｅ ２５，４３７−４４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にし、加えて前記の従来技術の欠点のないＤＮＡ構築物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記課題は、シグナルペプチドをコードする核酸配列であってキャリヤータンパク質をコードする遺伝子と機能的に結合され、かつ開裂可能な配列Ｓをコードする遺伝子を介して標的タンパク質をコードする遺伝子と結合されている核酸配列からなるＤＮＡ構築物であって、キャリヤータンパク質をコードする遺伝子がＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物によって解決される。
【００１８】
そのｓｐｙ遺伝子は、配列番号１によって特徴付けられ、もしくは縮重された遺伝子コードによって引き起こされた類似配列であってＳｐｙタンパク質をコードする配列によって特徴付けられる。
【００１９】
Ｓｐｙタンパク質は、配列番号２によってコードされたペリプラズム性タンパク質である。この配列は、ペリプラズム中での分泌とそのシグナル配列の開裂の後に存在するような成熟Ｓｐｙタンパク質に相当する。Ｓｐｙタンパク質の形成は、スフェロプラストの製造において誘導される（Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ他著のＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，２０７３−２０７６）。また、Ｅ．コリ細胞のインドール処理は、Ｓｐｙタンパク質形成を誘導する（Ｇａｒｂｅ他著、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７３，７８−８２）。従来技術のキャリヤータンパク質と比較して、キャリヤータンパク質としての該Ｓｐｙタンパク質は、以下の利点を有する：
ａ）小さい細胞外性のＥ．コリ−タンパク質であること、
ｂ）システイン残基を有さないこと、
ｃ）非病原性Ｅ．コリ株に由来すること、
ｄ）真核生物中で活性を有さない真核生物由来のキャリヤータンパク質であること、
ｅ）組み換え標的タンパク質の産生を、高い収率で、その活性を保持しつつ培養上清中で廉価で可能にすること
である。
【００２０】
シグナルペプチドの核酸配列は、有利には、組み換えタンパク質の細胞外製造のために有効であると示されたシグナルペプチドをコードする配列である。有利には、Ｅ．コリ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列であるｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＴ、ｌｐｐ、ｐｈｏＥ、ｏｍｐＦ、ｌａｍＢ、ｏｍｐＣ及びｍａｌＥ並びにＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号３）である。特に、Ｅ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列が好ましい。
【００２１】
標的タンパク質をコードする核酸配列は、組み換えタンパク質、タンパク質断片又はペプチドをコードする。
【００２２】
有利には、該核酸配列は、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、組み換え成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害剤、プロウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼ、レニン、リゾチームＰ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチン、イムノグロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブミン、低酸素症に誘発されるストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、癌原遺伝子産物、転写因子、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ及びウイルス構成タンパク質の群から選択される標的タンパク質をコードする。
【００２３】
特に好ましくは、該核酸配列は、インターフェロン及びペプチドの群から選択される標的タンパク質をコードする。
【００２４】
キャリヤータンパク質と標的タンパク質との共有結合のための開裂可能な配列Ｓは、有利には、翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質とキャリヤータンパク質との酵素分解が可能である核酸配列である。従来技術において、相応の配列が知られており、該配列は、融合タンパク質の開裂を、化学的に（例えばブロモシアン、ヒドロキシルアミン、Ｎ−ブロモスクシンイミド又は酸加水分解）又は特異的なプロテアーゼ（例えば第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、フリン、Ｉｇａｓｅ、セリン−エンドプロテイナーゼＫｅｘ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ Ｉ又はＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ）によって酵素的に可能とする。
【００２５】
翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質の酵素的開裂を、有利にはプロテアーゼによって可能にする核酸配列が好ましい。特に、翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質の開裂を、真核性のプロテアーゼ第Ｘａ因子によって可能にする核酸配列が好ましい。
【００２６】
本発明によるＤＮＡ構築物の製造のために、Ｓｐｙタンパク質、標的タンパク質、シグナルペプチド並びに開裂可能な配列Ｓをコードする核酸配列を、任意の時間的順序で標的タンパク質を遊離するために、プラスミド中にクローニングを行う。標的タンパク質とＳｐｙタンパク質の方位は、その際、図１Ａ及び図１Ｂに示されるように変更可能である。
【００２７】
ｓｐｙ遺伝子のクローニングは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特異的増幅によって、配列番号１から誘導できる特異的なオリゴヌクレオチドを使用して行われ、その際、生ずるＰＣＲ断片は、適切なライゲーションによってプラスミド中に導入することができる。
【００２８】
プラスミドとしては、あらゆる使用可能なかつ遺伝子工学的に入手できるＤＮＡ分子であって、染色体外で微生物において複製され、かつ分泌マーカーを含むＤＮＡ分子を使用することができる。ここで例えば、Ｅ．コリにおいて高い細胞性コピー数を有するプラスミド（例えばｐＵＣシリーズのプラスミド、ｐＱＥシリーズのプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズのプラスミド）、Ｅ．コリにおいて中程度のコピー数を有するプラスミド（例えばｐＢＲシリーズのプラスミド、ｐＡＣＹＣシリーズのプラスミド）又はＥ．コリにおいて低いコピー数を有するプラスミド（例えばｐＳＣ１０１又はｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）を使用することができる。有利には、Ｅ．コリにおいて高い細胞性コピー数を有するプラスミドが使用される。有利には、融合タンパク質の製造のための要素、例えばシグナルペプチドをコードする核酸配列と、キャリヤータンパク質と標的タンパク質との分離を可能にする開裂可能な配列Ｓとを既に含むプラスミドが使用される。これらの融合タンパク質の製造のための要素がまだプラスミドに存在しない場合には、これらの要素は、当業者に公知のクローニング技術によって、個々の要素が互いに機能的に結合されるようにプラスミド中に導入される。引き続き、本発明による構築物を、プラスミドから、例えば好適な制限エンドヌクレアーゼによって切り出すことができる。しかしながら好ましくは、本発明によるＤＮＡ構築物を含むプラスミドは、微生物の形質転換のために使用される。
【００２９】
従って、本発明は、本発明によるＤＮＡ構築物を含むプラスミドにも関する。
【００３０】
例えばエレクトロポレーション法又は熱ショック法のような形質転換法によって、本発明によるプラスミドは、微生物株の細胞中に導入される。プラスミドを有するクローンは、引き続き選択される。その選択は、規定の抗生物質に対する耐性を媒介する、プラスミドに存在する分泌マーカーをもとに行われる。有利には、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を媒介する選択マーカーが使用される。特に有利には、テトラサイクリンに対する耐性を媒介する選択マーカーが使用される。
【００３１】
プラスミド中でのクローニングの代わりに、本発明によるＤＮＡ構築物を、組み換え標的タンパク質の生産のために使用される微生物株の染色体中に組み込むこともできる。組み込み法としては、有利にはテンペレートバクテリオファージを用いた公知の系、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みが用いられる。
【００３２】
従って、本発明は、融合タンパク質を分泌する微生物株の製造方法において、腸内細菌科由来の微生物株中に本発明によるＤＮＡ構築物を導入することを特徴とする方法にも関する。有利には、本発明によるＤＮＡ構築物は、その際、本発明によるプラスミドの形態で使用される。
【００３３】
有利には、エシェリキア・コリ（大腸菌）の種の菌株（例えばＥ．コリＷ３１１０ ＡＴＣＣ ２７３２５）が使用される。特に有利には、組み換え融合タンパク質の細胞外生産のためのＥ．コリ株であって、Ｅ．コリＷ３１１０と比較して、少なくとも２倍だけ組み換え融合タンパク質の分泌能力が改善された菌株が使用される。
【００３４】
それは、有利には以下のＥ．コリ株である：
ａ）ＢＬＲ；Ｒａｙ他（２００２年）；Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，６５７９６ Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ，ドイツ）から購入できる
ｂ）Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ５６１０；Ｙａｎｇ他（１９９８年）；大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３、エール大学、ニューヘイブン、米国）から購入できる
ｃ）ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
ｄ）ＭＭ２８＝ＣＧＳＣ５８９２；Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）；大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３、エール大学、ニューヘイブン、米国）から購入できる
ｅ）ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１；ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ）から購入できる
ｆ）ＲＲ１：ＡＴＣＣ３１４３４；Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）；ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ）から購入できる
ｇ）ＫＧ１００５ ｏｍｐＴ：Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ他（１９９１年）に従って製造できる
である。
【００３５】
更に、本発明は、本方法により製造される微生物株に関する。これらの微生物株は、本発明によるＤＮＡ構築物又は本発明によるプラスミドを含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明による微生物株は、Ｓｐｙタンパク質と、標的タンパク質と、開裂可能な配列（Ｓ）とからなる融合タンパク質の細胞外産生を可能にする。従って、本発明は、同様に、Ｓｐｙタンパク質と、標的タンパク質と、開裂可能な配列（Ｓ）とからなる融合タンパク質に関する。
【００３７】
細胞外産生とは、本発明の範囲においては、微生物細胞の細胞質外部に５０ｍｇ／ｌ以上の組み換え融合タンパク質が集積していることを表す。培養培地中で５０ｍｇ／ｌ以上の組み換え融合タンパク質が集積していることが好ましい。
【００３８】
従って、本発明はまた、微生物株による融合タンパク質の発酵的製造方法において、本発明による微生物株を、発酵培地中で培養し、その際、本発明による融合タンパク質を産生させ、そして発酵培地を該微生物株の細胞による発酵後に分離することを特徴とする方法に関する。
【００３９】
ペリプラズムもしくは培養培地からの融合タンパク質の精製は、公知の方法に従って、例えば培地の遠心分離により細胞を分離し、場合により細胞を分解し、濾過し、引き続きクロマトグラフィー的精製により分離し、タンパク質を複合体化又は沈殿させることによって行うことができる。
【００４０】
発酵培地の分離後に、標的タンパク質を細胞のペリプラズムから精製し、その際、まずキャリヤータンパク質を化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から分離し、そして引き続き標的タンパク質を精製する方法が好ましい。
【００４１】
特に、発酵培地の分離後に、標的タンパク質を発酵培地から精製できる方法が好ましい。その際、まず、キャリヤータンパク質を、化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から、既に挙げたようにして分離する。引き続き、標的タンパク質を、公知の方法に従って精製することができる。
【００４２】
本発明による融合タンパク質の製造方法は、培養上清中での融合タンパク質の廉価でかつ効率的な生産を可能にする。
【００４３】
本発明による融合タンパク質の生産のための細菌株の発酵は、有利には完全培地又は最少塩培地中で行われる。これらの培地は、文献から公知である。
【００４４】
炭素源としては、原則的に、あらゆる使用可能な糖類、糖アルコール、有機酸もしくはそれらの塩、デンプン加水分解物、糖蜜もしくは別の物質を使用することができる。その際、有利にはグルコース又はグリセリンが使用される。また、多くの種々異なる炭素源の組み合わされた投入も可能である。窒素源としては、尿素、アンモニア及びそれらの塩、硝酸塩並びに別のＮ源を用いることができる。可能な窒素源には、また、複合アミノ酸混合物、例えば酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー及びＮＺアミン（例えばＫｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）が該当する。
【００４５】
更に、培地に更なる成分、例えばビタミン、塩、酵母エキス、アミノ酸及び微量元素を添加することができ、それによって細胞増殖は向上する。
【００４６】
該微生物株のインキュベートは、有利には好気性培養条件下で、１６〜１５０時間にわたって、かつその都度の微生物株に最適な増殖温度の範囲で行われる。
【００４７】
最適な温度範囲としては、１５〜５５℃が好ましい。特に、３０〜３７℃の温度が好ましい。
【００４８】
該微生物株の培養は、振盪フラスコ又は発酵器において行われ、その際、容量に関する制限は与えられない。その培養は、回分法で、半回分法又は連続法で実施することができる。
【００４９】
更に、本発明は、Ｅ．コリ由来のＳｐｙタンパク質を、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の発現に際してのキャリヤータンパク質として用いる使用に関する。
【００５０】
そのキャリヤータンパク質としてのＳｐｙタンパク質の使用は、公知のキャリヤータンパク質を使用するのに対して、以下の利点を有する：
ａ）融合タンパク質が安定化されること、
ｂ）標的タンパク質の誤った折り畳みが回避されること、
ｃ）標的タンパク質の高い細胞外収率が可能となること
である。
【００５１】
以下の実施例は、本発明を更に説明するために役立つものである。
【実施例】
【００５２】
実施例１：プラスミドｐＫＰ６８９の構築
ａ）ｓｐｙ遺伝子の増幅
Ｅ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、Ｅ．コリ野生株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の染色体ＤＮＡを使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドであるｓｐｙ−ｆｗ（配列番号４）（配列５′−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧ−３′）とｓｐｙ−ｒｅｖ（配列番号５）（５′−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡ−３′）を使用した。
【００５３】
ＰＣＲで得られる約６５１塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５４】
ｂ）プラスミドベクターｐＥＸ２２００へのｓｐｙ遺伝子のクローニング
該ＰＣＲ断片に、プライマーのｓｐｙ−ｆｗとｓｐｙ−ｒｅｖを介して、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩについての２箇所の切断部位を挿入した。精製されたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ロシュ，マンハイム在）及びＸｂａＩ（ロシュ，マンハイム在）を用いて、製造元によって指示される条件下で切断し、アガロースゲルを介して分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。ｓｐｙ遺伝子のクローニングのために、ベクターｐＥＸ２２００を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩによって、製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示される条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。該ＰＣＲ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＫＰ６８９（図２）では、ｓｐｙ遺伝子は、誘導可能なｔａｃ−プロモーターの制御下にある。更なる実施例の構成に使用されたプラスミドｐＫＰ６８９は、２００６年６月２６日にＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ），Ｄ−３８１４２ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で、番号ＤＳＭ１８３８１としてブタペスト条約に従って寄託された。
【００５５】
ペプチドＴ１２４９は、ＨＩＶが宿主細胞膜と融合するのを抑制する融合インヒビターである。該ペプチドは、その活性形においてＣ末端でアミノ化され、かつＮ末端でアセチル化されている。実施例２〜６において、未修飾のＴ１２４９ペプチドの産生が記載されている。
【００５６】
実施例２：Ｔ１２４９のクローニング
ａ）ベクターｐＣＭＴ２０３の予備調製
プラスミドベクターｐＣＭＴ２０３（ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１の実施例６に従って製造できる）を、Ｔ１２４９のＤＮＡのクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼＳｆｕＩ及びＰｓｔＩを用いて製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示された条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。
【００５７】
ｂ）Ｔ１２４９のＤＮＡ断片のリン酸化
ペプチドＴ１２４９のための核酸配列を、オリゴヌクレオチドを用いて合成的に製造した。オリゴヌクレオチドのＴ１（配列番号６）と、Ｔ２（配列番号７）と、Ｔ３（配列番号８）と、Ｔ４（配列番号９）と、Ｔ５（配列番号１０）とを、ポリヌクレオチド−キナーゼ（ロシュ，マンハイム在）を用いて製造元の指示に従ってリン酸化した。
【００５８】
ｃ）ライゲーション
リン酸化されたＴ１２４９のＤＮＡ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５９】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＴ１２４９ｆｕｓにおいて、Ｔ１２４９のＤＮＡを、プロテアーゼの第Ｘａ因子によって開裂可能なＤＮＡ配列によって、ヒルジン断片から隔離した。
【００６０】
実施例３：ｐＴ１２４９の構築
ａ）ベクターｐＢａＢＩＦＮ１の予備調製
プラスミドベクターｐＢａＢＩＦＮ１（ブタペスト条約に従ってＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養収集館、Ｄ−３８１４２ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８３４３として寄託された菌株ＤＨ５α／ｐＢａＢＩＦＮ１から単離できる）を、Ｔ１２４９のＤＮＡのクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩによって製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示された条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。
【００６１】
ｂ）Ｔ１２４９のＤＮＡ断片のリン酸化
ペプチドＴ１２４９のための核酸配列を、オリゴヌクレオチドを用いて合成的に製造した。オリゴヌクレオチドのＴ６（配列番号１１）と、Ｔ７（配列番号１２）と、Ｔ８（配列番号１３）と、Ｔ９（配列番号１４）と、Ｔ１０（配列番号１５）とを、ポリヌクレオチド−キナーゼ（ロシュ，マンハイム在）を用いて製造元の指示に従ってリン酸化した。
【００６２】
ｃ）ライゲーション
リン酸化されたＴ１２４９のＤＮＡ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６３】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。
【００６４】
プラスミドｐＴ１２４９のプラスミド地図を、図３に示す。
【００６５】
実施例４：ｓｐｙ−Ｔ１２４９融合物の構築
ａ）ｓｐｙ遺伝子の増幅
ｓｐｙ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、プラスミドｐＫＰ６８９を使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのｐＪＦ１１８−ｓｅｑｆｗ（配列番号１６）（配列５′−ＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧ−３′）とｓｐｙ−Ｔ１２４９ｆｕｓ（配列番号１７）（配列５′−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣ−３′）とを使用した。
【００６６】
ＰＣＲで得られる約５８６塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００６７】
ｂ）Ｔ１２４９遺伝子の増幅
Ｔ１２４９遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、プラスミドｐＴ１２４９ｆｕｓを使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのＴ１２４９−ｆｕｓ２（配列番号１８）（配列５′−ＡＧＴＡＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＧ−３′）とＴ１２４９−ＢｆｒＩ（配列番号１９）（配列５′−ＴＡＧＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣ−３′）とを使用した。ＰＣＲで得られる約１５１塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００６８】
ｃ）ｓｐｙ遺伝子とＴ１２４９遺伝子との融合
ｓｐｙ遺伝子とＴ１２４９遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、同時に、精製された実施例４ａ及び実施例４ｂ（上記参照）からのＰＣＲ断片を使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのｐＪＦ１１８−ｓｅｑｆｗ（配列番号１６）（配列５′−ＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧ−３′）とＴ１２４９−ＢｆｒＩ（配列番号１９）（配列５′−ＴＡＧＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣ−３′）とを使用した。ＰＣＲで得られる約７１７塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００６９】
ｄ）ｓｐｙ−Ｔ１２４９の融合物のプラスミドベクターｐＫＰ６８９へのクローニング
精製された実施例４ｃ（上記参照）からのＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ロシュ，マンハイム在）及びＢｆｒＩ（ロシュ，マンハイム在）を用いて、製造元によって指示される条件下で切断し、アガロースゲルを介して分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。ｓｐｙ−Ｔ１２４９の融合物のクローニングのために、ベクターｐＫＰ６８９を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＢｆｒＩによって、製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示される条件下で切断した。該プラスミドの大きい方の部分（約６０５３塩基対）を、アガロースゲルを介してプラスミドの残部から分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。そのＤＮＡ断片を引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。該ＰＣＲ断片と切断されかつ脱リン酸化されたＤＮＡ断片とのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＫＰ７００（図４）では、ｓｐｙ−Ｔ１２４９の融合物は、誘導可能なｔａｃ−プロモーターの制御下にある。
【００７０】
実施例５：未修飾のＴ１２４９−ペプチドの培養上清への分泌
培養上清中でのＳｐｙ−Ｔ１２４９−融合タンパク質の分泌を、培養上清中での未修飾のＴ１２４９−ペプチドの分泌と比較した。このために、両方の微生物株ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ７００とＷＣＭ１０５／ｐＴ１２４９とを、１０ｍｌのＬＢ培地で、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１０ｇ／ｌのグルコースと一緒に３０℃で培養した。Ｅ．コリ菌株ＷＣＭ１０５は、ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる。
【００７１】
ＯＤ600が０．５になったら、Ｔ１２４９もしくは融合タンパク質の産生を、イソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ）の添加によって誘導した。培養上清において、２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、形成されかつ分泌されたＴ１２４９もしくは融合タンパク質の量を、該タンパク質もしくはペプチドをＳＤＳゲルにおいて分離し、クーマシー染色による検出によって調査した。その結果を、図６に表す。明らかに確認できることは、ｓｐｙ−Ｔ１２４９−融合タンパク質が培養上清中に集積されることである（ゲル中の楕円形の印を参照）。Ｓｐｙ−ペプチドは、培養上清中には集積されない（ゲル中の点線の楕円形の印を参照）。
【００７２】
実施例６：未修飾のＴ１２４９−ペプチドの産生
未修飾のＴ１２４９−ペプチドの産生を、微生物株ＷＣＭ１０５／ｐＴ１２４９とＷＣＭ１０５／ｐＫＰ７００とにおいて調査した。そのために、それらの菌株を、１０ｍｌのＬＢ培地で、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１０ｇ／ｌのグルコースと一緒に３０℃で培養した。ＯＤ600が０．５になったら、未修飾のＴ１２４９−ペプチドの産生を、イソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ）の添加によって誘導した。
【００７３】
培養上清において、２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、形成された未修飾のＴ１２４９−ペプチドの量を、ＡＱＵＡ法（Ｇｅｒｂｅｒ他著、２００３年、ＰＮＡＳ １００，６９４０−６９４５；Ｈｏｃｈｌｅｉｔｎｅｒ他著、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２５３６−２５４２）によって検出した。
【００７４】
未修飾のＴ１２４９−ペプチドの配列からの参照ペプチドであって、このペプチドのトリプシン分解産物に相当する３種のペプチド（配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４）を選択した。これらのペプチドを合成し、その絶対量を秤量によって測定した。次いで、それらの参照ペプチドを、アセチル−Ｎ−オキシスクシンイミドの重水素化されたもの（Ｄ3−アセチル−Ｎ−オキシスクシンイミド）で誘導体化した。その発酵上清を、６Ｍのグアニジウム塩酸で変性させ、還元（ＤＴＴ）させ、そしてアルキル化（ヨードアセトアミド）し、そしてトリプシンで消化した。その消化物を、アセチル−Ｎ−オキシスクシンイミドで誘導体化させた。参照ペプチドの定義された量を添加し、そして次いで該消化物を、ＨＰＬＣによって分離した。回収されたフラクションを、質量分光分析法によって調査した。参照ペプチドと、消化物に由来するペプチドとのアイソトープ対を観察した。これらのアイソトープ対は、３ダルトンの質量差を有していた。消化物からのペプチドと参照ペプチドとの強度比から、Ｔ１２４９ペプチドの絶対量を測定することができた。
【００７５】
菌株ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ７００を使用した場合には、ＡＱＵＡ法による検出前に第Ｘａ因子による消化を実施して、未修飾のＴ１２４９ペプチドをキャリヤータンパク質から分離した。５０μｌのバッチは、１０μｌの５×バッファー（２５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）；０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2）と、１５μｌの培養上清と、１μｌの第Ｘａ因子（５μｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、カタログ番号Ｆ９３０２）と、２４μｌのＨ2Ｏとから成っていた。第Ｘａ因子による消化は、２２℃で１６時間にわたり実施した。
【００７６】
第１表において、未修飾のＴ１２４９−ペプチドの定量化された収率を列記する。
【００７７】
第１表
【表１】
【００７８】
実施例７：ｓｐｙ−インターフェロンα２ｂの融合物の構築
ａ）インターフェロンα２ｂ遺伝子の増幅
インターフェロンα２ｂ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、プラスミドｐＢａＢＩＦＮ１（ＤＳＭ１８３４３から単離できる）を使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのＩＦＮａ２ｂ−ｆｗ（配列番号２０）（配列５′−Ｐ[1]−ＡＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＣＣ−３′（[1]オリゴヌクレオチドは、５′末端でリン酸化されている））とＩＦＮａ２ｂ−ｒｅｖ（配列番号２１）（配列５′−ＡＣＣＴＣＴＴＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＧ−３′）とを使用した。
【００７９】
ＰＣＲで得られる約５２６塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００８０】
ｂ）プラスミドベクターｐＫＰ７００へのインターフェロンα２ｂ遺伝子のクローニング
該ＰＣＲ断片において、プライマーＩＦＮａ２ｂ−ｒｅｖを介して、制限エンドヌクレアーゼＢｆｒＩについての末端切断部位を挿入した。精製されたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＢｆｒＩ（ロシュ，マンハイム在）を用いて、製造元によって指示される条件下で切断し、アガロースゲルを介して分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。
【００８１】
ｓｐｙ遺伝子のクローニングのために、ベクターｐＫＰ７００を、制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩとＢｆｒＩによって、製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示される条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。該ＰＣＲ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂ（図５）では、インターフェロンα２ｂ遺伝子は、誘導可能なｔａｃ−プロモーターの制御下にある。
【００８２】
実施例８：インターフェロンα２ｂの産生
得られた菌株におけるインターフェロンα２ｂの産生を調査した。そのために、それらの菌株を、１０ｍｌのＬＢ培地で、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１０ｇ／ｌのグルコースと一緒に３０℃で培養した。ＯＤ600が０．５になったら、インターフェロンα２ｂの産生を、イソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ）の添加によって誘導した。培養上清において、２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、形成されかつ分泌されたインターフェロンα２ｂの量を、ＳＤＳゲル中でのタンパク質の分離と、抗インターフェロン特異抗体でのイムノブロットにおける検出とによって検出した。菌株ＷＣＭ１０５／ｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂを使用した場合に、ＳＤＳゲルの前に、第Ｘａ因子による消化を実施して、インターフェロンα２ｂをキャリヤータンパク質から分離した。５０μｌのバッチは、１０μｌの５×バッファー（２５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）；０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2）と、１５μｌの培養上清と、１μｌの第Ｘａ因子（５μｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、カタログ番号Ｆ９３０２）と、２４μｌのＨ2Ｏとから成っていた。第Ｘａ因子による消化は、２２℃で１６時間にわたり実施した。
【００８３】
５μｌ（菌株ＷＣＭ１０５／ｐＢａＢＩＦＮ１）もしくは１６．５μｌ（菌株ＷＣＭ１０５／ｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂ）の上清ごとに、サンプルバッファー（２×トリスＳＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）；４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ；２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン；０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー；５％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール）を混合した。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性は、５分間にわたり１００℃に加熱することによって実施した。氷上で２分間冷却し、引き続き遠心分離した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いて分離した（電気泳動パラメータ：２００Ｖで４０分間）。イムノブロットによる検出と定量化を、以下の仕様に従って実施した：
ａ）湿式ブロッティング法での転写
モジュール：Ａｍｅｒｓｈａｍ：Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６。
【００８４】
メンブレン：ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ；ＢＡ８５；硝酸セルロース（Ｅ）；０．４５（孔サイズ））
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）に気泡なく染み込ませた。
【００８５】
積層の構成：黒い格子（ｓｃｈｗａｒｚｅｓ Ｇｉｔｔｅｒ）、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ニトロセルロースメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子（ｗｅｉｓｓｅｓ Ｇｉｔｔｅｒ）、アノードとの接続
転写条件：Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流強度、Ｕ＝無制限、運転時間＝６０分
ｂ）プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする；
２０℃で３０分間振り動かす
ｃ）一次抗体のハイブリダイゼーション
０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮα抗体（Ｂｉｏｚｏｌ（Ｅｃｈｉｎｇ）を経由したＰｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ；カタログ番号５００−Ｐ３２Ａ）と一緒に２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする；
２０℃で９０分間又は一晩振り動かす。
【００８６】
ｄ）洗浄
１×ＰＢＳで２０℃において１０秒間振り動かす；バッファーを捨てる；
１×ＰＢＳで２０℃で２回１５分振り動かす；バッファーを捨てる。
【００８７】
ｅ）二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌ（１：１０００希釈）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｂｉｏｚｏｌ（Ｅｃｈｉｎｇ）を経由したＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号４０５０−０５）を有する２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベート；２０℃で６０分間振り動かす。
【００８８】
ｆ）洗浄
１×ＰＢＳで２０℃において１０秒間振り動かす；バッファーを捨てる；
１×ＰＢＳで２０℃で２回１５分振り動かす；バッファーを捨てる。
【００８９】
ｇ）化学発光を介した検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（ロシュ，マンハイム在）を準備：Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合：ニトロセルロースメンブレン当たり３ｍｌ。
【００９０】
ブロットを２０℃でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒にインキュベート、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【００９１】
ｈ）バッファー
プリハイブリダイゼーションバッファー：１×ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳；
１０×ＰＢＳ：１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4；１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ１００；
１×ＰＢＳ：１０×ＰＢＳを、完全脱塩水で１：１０希釈したもの
ｉ）定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ）を用いて、プロットされたスタンダードと比較することによって実施した。
【００９２】
第２表に、定量化されたインターフェロンα２ｂの収率を列記する。
【００９３】
第２表
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、以下のＡ）（シグナルペプチド（ＳＰ）とキャリヤータンパク質とから構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介して組み換え標的タンパク質が結合されている前駆体−融合タンパク質）、Ｂ）（シグナルペプチド（ＳＰ）と組み換え標的タンパク質とから構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介してキャリヤータンパク質が結合されている前駆体−融合タンパク質）、Ｃ）（キャリヤータンパク質から構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介して組み換え標的タンパク質が結合されている融合タンパク質）、Ｄ）（組み換え標的タンパク質から構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介してキャリヤータンパク質が結合されている融合タンパク質）の概略図を示している。
【図２】図２は、プラスミドｐＫＰ６８９を示している。
【図３】図３は、プラスミドｐＴ１２４９を示している。
【図４】図４は、プラスミドｐＫＰ７００を示している。
【図５】図５は、プラスミドｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂを示している。
【図６】図６は、クーマシー染色によって着色された実施例５からのＳＤＳゲルを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ構築物並びに該構築物を使用した融合タンパク質の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質医薬（"バイオロジクス"）に関する市場は、近年に大きく成長している。タンパク質を基礎とする医薬作用物質に関して生産費用が依然として非常に高いことに基づき、効率化されたことで廉価となった製造のための方法及び系が絶え間なく探求されている。タンパク質の生産体としては、種々の微生物、例えば細菌、酵母等の糸状菌又は植物細胞もしくは動物細胞も使用することができる。それらの非常に良好に調査された遺伝学及び生態学と、短い発生時間と、簡単な取り扱いとに基づき、もちろん目下、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリ（Ｅ．コリ）が、組み換えタンパク質の生産のために最も頻繁に使用される生物である。
【０００３】
Ｅ．コリにおける組み換えタンパク質の製造に際して、しばしば該細胞の細胞質内での"封入体"形成の問題に悩まされている。前記困難は、しばしば、該細胞が、その都度生産されるべき組み換えタンパク質（以下に標的タンパク質とも呼称する）を、細胞質内に蓄えずに、能動的にペリプラズムへと、理想的にはその上さらに培養培地にまで分泌するように生産系を設計することによって回避することができる。このことは、細胞からの標的タンパク質をまず、細胞質性の前駆体−融合タンパク質として合成する（図１Ａ及び図１Ｂ）によって達成でき、その際、シグナルペプチド（ＳＰ）は、分泌過程の間にペリプラズムにおいてインビボで開裂されて、融合タンパク質を生成する（図１Ｃ及び図１Ｄ）。Ｅ．コリにおいては、シグナルペプチドの輸送と開裂をＳｅｃ系が担っている。原則的に、標的タンパク質の細胞外生産の場合に、Ｅ．コリの細胞質もしくは細胞外のタンパク質のシグナルペプチドが使用される。前記のＥ．コリ固有のタンパク質は、Ｓｅｃ経路を介して分泌される。例えば、ここでＥ．コリのタンパク質のシグナルペプチドとして、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＳｔＩＩ、Ｌｐｐ及びＭａｌＥが挙げられる。Ｓｅｃ系の場合に、該タンパク質は折り畳まれていない状態で細胞質膜を通って輸送され、引き続きペリプラズムで折り畳まれる。それに対して、ＴＡＴ系（双方アルギニン転座（Ｔｗｉｎ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ））を用いると、既に細胞質内で折り畳まれたタンパク質をペリプラズムへと分泌させることができるが、その際、特殊なシグナルペプチドが必要となる（例えばタンパク質ＴｏｒＡ又はＴａｐのシグナルペプチド）。ＣｈｏｉとＬｅｅとによる概要文献（２００４年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４，６２５−６３５）において、組み換えタンパク質の分泌的かつ細胞外の生産についての先行技術が代表的な例をもとに表されている。
【０００４】
ペリプラズム又は培養培地中での標的タンパク質の集積は、細胞内生産に対して以下の利点を有する：
とりわけ
１）分泌された標的タンパク質のＮ末端アミノ酸残基が必ずしもメチオニンである必要がなく、産物の天然の開始メチオニンと同一であってよいこと、
２）ペリプラズム内でのプロテアーゼ活性が細胞質内よりも明らかに低いこと、
３）ペリプラズムあるいは培養培地からのタンパク質の精製が、細胞質からよりも容易であること、それというのもそこでは不純物の少ない宿主タンパク質が含まれているからである、
４）場合により必要とされるジスルフィド結合の形成が、ペリプラズムの酸化的条件下で可能であること
である。
【０００５】
多くの場合に、例えば特にタンパク質分解に対して感受性であるか又は"封入体"の形成傾向にある組み換えタンパク質もしくはペプチドの分泌的生産の場合には、組み換えタンパク質をシグナルペプチドに直接的に結合させずに、更なるタンパク質、つまりキャリヤータンパク質のＣ末端へと結合させる（図１Ａ：前駆体−融合タンパク質及び図１Ｃ：融合タンパク質を参照のこと）ことが合理的であり、あるいは効率的な生産のためにはむしろ必要条件である。分泌可能な融合タンパク質の部分として、しばしば、標的タンパク質の発酵培地中での可溶性を高めることができる。同様に、キャリヤータンパク質への結合と、全ての前駆体−融合タンパク質が細胞質から迅速に排出されることによって、タンパク質分解に感受性の標的タンパク質あるいは標的ペプチドを、細胞内分解から保護することができる。分解に対して感受性の遺伝子産物を保護し、それにより安定化させるためには、標的タンパク質のＣ末端にキャリヤータンパク質を融合させる可能性もある（図１Ｂ：前駆体−融合タンパク質及び図１Ｄ：融合タンパク質を参照のこと）。そのための一例は、タンパク質であるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼであり、それは標的タンパク質としての組み換えプロテアーゼインヒビターの分泌に際して、キャリヤータンパク質としても、二量体化ドメインとしても使用される（Ｔｕｄｙｋａ及びＳｋｅｒｒａ著、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，２１８０−２１８７）。
【０００６】
標的タンパク質とは、以下で、組み換えタンパク質、タンパク質断片又はペプチドを表し、それは細胞外又はペリプラズムで、５０ｍｇ／ｌより高い収率で生産されることが望ましい。
【０００７】
前駆体−融合タンパク質とは、以下で、キャリヤータンパク質と標的タンパク質とシグナルペプチド（ＳＰ）とからなるタンパク質を表す。キャリヤータンパク質と標的タンパク質は、酵素的又は化学的に開裂可能な配列Ｓによって互いに結合されている。該シグナルペプチドは、細胞質膜を通過する融合タンパク質の移動のために必要である。前記のシグナルペプチドは、ペリプラズムへの分泌過程の間に融合タンパク質から分離され、それによって融合タンパク質が生成する。
【０００８】
融合タンパク質とは、以下で、キャリヤータンパク質と標的タンパク質とからなるタンパク質を表す。キャリヤータンパク質と標的タンパク質は、酵素的又は化学的に開裂可能な配列Ｓによって互いに結合されている。
【０００９】
キャリヤータンパク質とは、前駆体−融合タンパク質もしくは融合タンパク質の部分であって、標的タンパク質の安定化のために使用される部分を表す。
【００１０】
シグナルペプチドの前駆体−融合タンパク質からの開裂の後に、該融合タンパク質は、ペリプラズム又は培養培地中に集積される。有利には、標的タンパク質は、アミノ酸配列である開裂可能な配列Ｓを介してキャリヤータンパク質と結合されており（図１を参照のこと）、そこで後続工程において標的タンパク質を、インビトロで、酵素的もしくは化学的に開裂させて、こうして遊離させることができる。
【００１１】
キャリヤータンパク質としては、例えばＥ．コリ−タンパク質であるＹｅｂＦ（Ｚｈａｎｇ他著、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１００−１０４及びＷＯ２００６０１７９２９号Ａ１）が、タンパク質の細胞外生産のために記載されている。
【００１２】
ＹｅｂＦ−タンパク質は、１１８個のアミノ酸の一次構造を有し、かつ１０．８ｋＤａの分子量を有しており、今までで最小のキャリヤータンパク質であって、Ｅ．コリにおけるタンパク質の異種発現のために記載されている。キャリヤータンパク質としてＹｅｂＦ−タンパク質を使用する場合の欠点は、該タンパク質が、全体で３個のシステイン残基を有し、その中の２個が該タンパク質の成熟部分に局在化されていることである。これらの２個のシステイン残基は、その際、ペリプラズムの酸化性環境で標的タンパク質とジスルフィド結合を形成することがあり、それによって標的タンパク質の折り畳み不全となりうるからである。このことは、最悪の場合には役に立たない標的タンパク質をもたらす。誤ったジスルフィド結合の形成は、標的タンパク質とＹｅｂＦ−タンパク質との開裂前にも後にも可能性がある。
【００１３】
他のキャリヤータンパク質は、Ｅ．コリのＯｍｐＦ−タンパク質である。ＪｅｏｎｇとＬｅｅとは、ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン−融合タンパク質を、Ｅ．コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（２００２年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４９７９−８５）の派生物を用いて細胞外産生することを記載している。３６２個のアミノ酸の一次構造と、そこから得られる３６ｋＤａの分子量とをもって、ＯｍｐＦ−キャリヤータンパク質は、キャリヤータンパク質ＹｅｂＦよりもかなり大きく、かつ重たい。このことは、Ｅ．コリ細胞が、標的タンパク質の産生に際して、ＹｅｂＦの代わりにＯｍｐＦをキャリヤータンパク質として使用すると、明らかに代謝的により高い負荷がかかることを意味する。前記のＪｅｏｎｇとＬｅｅによる刊行物において、このことは特に明らかである：５．６ｇ／ｌの融合タンパク質の生産力で、０．３３ｇ／ｌのβ−エンドルフィンしか得られない。
【００１４】
他のキャリヤータンパク質は、Ｅ．コリのＨｌｙＡ−タンパク質のＣ末端断片である。Ｅ．コリ由来の溶血素（ＨｌｙＡ−タンパク質）は、１１０ｋＤａの分子量を有する小孔形成性の外毒素であり、それは病原性Ｅ．コリ株で存在し、例えば尿路感染を引き起こす。ＨｌｙＡ−タンパク質は、固有の溶血素輸送系を介して、内膜と外膜を通じて細胞から排出される。融合タンパク質の製造のために、該タンパク質の２３ｋＤａの分子量を有する２１８個のアミノ酸のＣ末端ドメインが用いられる。該ドメインは、両方の膜を通過する移動のために必要である。ヒトのインターロイキン−６は、ＨｌｙＡ−キャリヤータンパク質を用いて細胞外で培養上清において生産することができる。その収率は、７０μｇ／ｌと極めて低い（Ｌｉ他著、２００２年、Ｇｅｎｅ ２５，４３７−４４７）。しかしながら毒性のＥ．コリ−タンパク質の断片として、前記断片は、医薬品に有効なタンパク質の製造のためには不適である。
【００１５】
更に、真核性タンパク質である薬用蛭由来のヒルジンは、標的タンパク質の細胞外産生のためのキャリヤータンパク質として知られている。ヒルジンは、トロンビンインヒビターであり、極めて高い親和性（Ｋｉ＝２０ｆＭ）でプロテアーゼのトロンビンに結合する。６５個のアミノ酸からなる該ペプチドは、その６個のシステイン残基で３個の内部ジスルフィド結合を形成する。キャリヤータンパク質のヒルジンは、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の細胞外産生のために、細菌性シグナルペプチドと融合される。シグナルペプチドとしては、例えばＥ．コリ−タンパク質であるＰｈｏＡもしくはＯｍｐＣ（ＥＰ１３６４０２９号Ｂ１）の配列又はα−シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１）のシグナルペプチドも使用される。そのトロンビンインヒビターとしての生物学的活性に基づき、ヒルジンは、医薬タンパク質の生産のために不適である。それというのも標的タンパク質の生産工程において、キャリヤータンパク質であるヒルジンによる汚染が存在しないことを保証せねばならないからである。このことは、標的タンパク質の精製工程を非常に費用のかかるものにし、それにより高価なものとなる。
【特許文献１】ＷＯ２００６０１７９２９号Ａ１
【特許文献２】ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１
【非特許文献１】ＣｈｏｉとＬｅｅ著、２００４年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４，６２５−６３５
【非特許文献２】Ｔｕｄｙｋａ及びＳｋｅｒｒａ著、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，２１８０−２１８７
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ他著、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１００−１０４
【非特許文献４】ＪｅｏｎｇとＬｅｅ著、２００２年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４９７９−８５
【非特許文献５】Ｌｉ他著、２００２年、Ｇｅｎｅ ２５，４３７−４４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にし、加えて前記の従来技術の欠点のないＤＮＡ構築物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記課題は、シグナルペプチドをコードする核酸配列であってキャリヤータンパク質をコードする遺伝子と機能的に結合され、かつ開裂可能な配列Ｓをコードする遺伝子を介して標的タンパク質をコードする遺伝子と結合されている核酸配列からなるＤＮＡ構築物であって、キャリヤータンパク質をコードする遺伝子がＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物によって解決される。
【００１８】
そのｓｐｙ遺伝子は、配列番号１によって特徴付けられ、もしくは縮重された遺伝子コードによって引き起こされた類似配列であってＳｐｙタンパク質をコードする配列によって特徴付けられる。
【００１９】
Ｓｐｙタンパク質は、配列番号２によってコードされたペリプラズム性タンパク質である。この配列は、ペリプラズム中での分泌とそのシグナル配列の開裂の後に存在するような成熟Ｓｐｙタンパク質に相当する。Ｓｐｙタンパク質の形成は、スフェロプラストの製造において誘導される（Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ他著のＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，２０７３−２０７６）。また、Ｅ．コリ細胞のインドール処理は、Ｓｐｙタンパク質形成を誘導する（Ｇａｒｂｅ他著、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７３，７８−８２）。従来技術のキャリヤータンパク質と比較して、キャリヤータンパク質としての該Ｓｐｙタンパク質は、以下の利点を有する：
ａ）小さい細胞外性のＥ．コリ−タンパク質であること、
ｂ）システイン残基を有さないこと、
ｃ）非病原性Ｅ．コリ株に由来すること、
ｄ）真核生物中で活性を有さない真核生物由来のキャリヤータンパク質であること、
ｅ）組み換え標的タンパク質の産生を、高い収率で、その活性を保持しつつ培養上清中で廉価で可能にすること
である。
【００２０】
シグナルペプチドの核酸配列は、有利には、組み換えタンパク質の細胞外製造のために有効であると示されたシグナルペプチドをコードする配列である。有利には、Ｅ．コリ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列であるｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＴ、ｌｐｐ、ｐｈｏＥ、ｏｍｐＦ、ｌａｍＢ、ｏｍｐＣ及びｍａｌＥ並びにＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号３）である。特に、Ｅ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列が好ましい。
【００２１】
標的タンパク質をコードする核酸配列は、組み換えタンパク質、タンパク質断片又はペプチドをコードする。
【００２２】
有利には、該核酸配列は、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、組み換え成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害剤、プロウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼ、レニン、リゾチームＰ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチン、イムノグロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブミン、低酸素症に誘発されるストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、癌原遺伝子産物、転写因子、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ及びウイルス構成タンパク質の群から選択される標的タンパク質をコードする。
【００２３】
特に好ましくは、該核酸配列は、インターフェロン及びペプチドの群から選択される標的タンパク質をコードする。
【００２４】
キャリヤータンパク質と標的タンパク質との共有結合のための開裂可能な配列Ｓは、有利には、翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質とキャリヤータンパク質との酵素分解が可能である核酸配列である。従来技術において、相応の配列が知られており、該配列は、融合タンパク質の開裂を、化学的に（例えばブロモシアン、ヒドロキシルアミン、Ｎ−ブロモスクシンイミド又は酸加水分解）又は特異的なプロテアーゼ（例えば第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、フリン、Ｉｇａｓｅ、セリン−エンドプロテイナーゼＫｅｘ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ Ｉ又はＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ）によって酵素的に可能とする。
【００２５】
翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質の酵素的開裂を、有利にはプロテアーゼによって可能にする核酸配列が好ましい。特に、翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質の開裂を、真核性のプロテアーゼ第Ｘａ因子によって可能にする核酸配列が好ましい。
【００２６】
本発明によるＤＮＡ構築物の製造のために、Ｓｐｙタンパク質、標的タンパク質、シグナルペプチド並びに開裂可能な配列Ｓをコードする核酸配列を、任意の時間的順序で標的タンパク質を遊離するために、プラスミド中にクローニングを行う。標的タンパク質とＳｐｙタンパク質の方位は、その際、図１Ａ及び図１Ｂに示されるように変更可能である。
【００２７】
ｓｐｙ遺伝子のクローニングは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特異的増幅によって、配列番号１から誘導できる特異的なオリゴヌクレオチドを使用して行われ、その際、生ずるＰＣＲ断片は、適切なライゲーションによってプラスミド中に導入することができる。
【００２８】
プラスミドとしては、あらゆる使用可能なかつ遺伝子工学的に入手できるＤＮＡ分子であって、染色体外で微生物において複製され、かつ分泌マーカーを含むＤＮＡ分子を使用することができる。ここで例えば、Ｅ．コリにおいて高い細胞性コピー数を有するプラスミド（例えばｐＵＣシリーズのプラスミド、ｐＱＥシリーズのプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズのプラスミド）、Ｅ．コリにおいて中程度のコピー数を有するプラスミド（例えばｐＢＲシリーズのプラスミド、ｐＡＣＹＣシリーズのプラスミド）又はＥ．コリにおいて低いコピー数を有するプラスミド（例えばｐＳＣ１０１又はｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）を使用することができる。有利には、Ｅ．コリにおいて高い細胞性コピー数を有するプラスミドが使用される。有利には、融合タンパク質の製造のための要素、例えばシグナルペプチドをコードする核酸配列と、キャリヤータンパク質と標的タンパク質との分離を可能にする開裂可能な配列Ｓとを既に含むプラスミドが使用される。これらの融合タンパク質の製造のための要素がまだプラスミドに存在しない場合には、これらの要素は、当業者に公知のクローニング技術によって、個々の要素が互いに機能的に結合されるようにプラスミド中に導入される。引き続き、本発明による構築物を、プラスミドから、例えば好適な制限エンドヌクレアーゼによって切り出すことができる。しかしながら好ましくは、本発明によるＤＮＡ構築物を含むプラスミドは、微生物の形質転換のために使用される。
【００２９】
従って、本発明は、本発明によるＤＮＡ構築物を含むプラスミドにも関する。
【００３０】
例えばエレクトロポレーション法又は熱ショック法のような形質転換法によって、本発明によるプラスミドは、微生物株の細胞中に導入される。プラスミドを有するクローンは、引き続き選択される。その選択は、規定の抗生物質に対する耐性を媒介する、プラスミドに存在する分泌マーカーをもとに行われる。有利には、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を媒介する選択マーカーが使用される。特に有利には、テトラサイクリンに対する耐性を媒介する選択マーカーが使用される。
【００３１】
プラスミド中でのクローニングの代わりに、本発明によるＤＮＡ構築物を、組み換え標的タンパク質の生産のために使用される微生物株の染色体中に組み込むこともできる。組み込み法としては、有利にはテンペレートバクテリオファージを用いた公知の系、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みが用いられる。
【００３２】
従って、本発明は、融合タンパク質を分泌する微生物株の製造方法において、腸内細菌科由来の微生物株中に本発明によるＤＮＡ構築物を導入することを特徴とする方法にも関する。有利には、本発明によるＤＮＡ構築物は、その際、本発明によるプラスミドの形態で使用される。
【００３３】
有利には、エシェリキア・コリ（大腸菌）の種の菌株（例えばＥ．コリＷ３１１０ ＡＴＣＣ ２７３２５）が使用される。特に有利には、組み換え融合タンパク質の細胞外生産のためのＥ．コリ株であって、Ｅ．コリＷ３１１０と比較して、少なくとも２倍だけ組み換え融合タンパク質の分泌能力が改善された菌株が使用される。
【００３４】
それは、有利には以下のＥ．コリ株である：
ａ）ＢＬＲ；Ｒａｙ他（２００２年）；Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，６５７９６ Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ，ドイツ）から購入できる
ｂ）Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ５６１０；Ｙａｎｇ他（１９９８年）；大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３、エール大学、ニューヘイブン、米国）から購入できる
ｃ）ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
ｄ）ＭＭ２８＝ＣＧＳＣ５８９２；Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）；大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３、エール大学、ニューヘイブン、米国）から購入できる
ｅ）ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１；ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ）から購入できる
ｆ）ＲＲ１：ＡＴＣＣ３１４３４；Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）；ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ）から購入できる
ｇ）ＫＧ１００５ ｏｍｐＴ：Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ他（１９９１年）に従って製造できる
である。
【００３５】
更に、本発明は、本方法により製造される微生物株に関する。これらの微生物株は、本発明によるＤＮＡ構築物又は本発明によるプラスミドを含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明による微生物株は、Ｓｐｙタンパク質と、標的タンパク質と、開裂可能な配列（Ｓ）とからなる融合タンパク質の細胞外産生を可能にする。従って、本発明は、同様に、Ｓｐｙタンパク質と、標的タンパク質と、開裂可能な配列（Ｓ）とからなる融合タンパク質に関する。
【００３７】
細胞外産生とは、本発明の範囲においては、微生物細胞の細胞質外部に５０ｍｇ／ｌ以上の組み換え融合タンパク質が集積していることを表す。培養培地中で５０ｍｇ／ｌ以上の組み換え融合タンパク質が集積していることが好ましい。
【００３８】
従って、本発明はまた、微生物株による融合タンパク質の発酵的製造方法において、本発明による微生物株を、発酵培地中で培養し、その際、本発明による融合タンパク質を産生させ、そして発酵培地を該微生物株の細胞による発酵後に分離することを特徴とする方法に関する。
【００３９】
ペリプラズムもしくは培養培地からの融合タンパク質の精製は、公知の方法に従って、例えば培地の遠心分離により細胞を分離し、場合により細胞を分解し、濾過し、引き続きクロマトグラフィー的精製により分離し、タンパク質を複合体化又は沈殿させることによって行うことができる。
【００４０】
発酵培地の分離後に、標的タンパク質を細胞のペリプラズムから精製し、その際、まずキャリヤータンパク質を化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から分離し、そして引き続き標的タンパク質を精製する方法が好ましい。
【００４１】
特に、発酵培地の分離後に、標的タンパク質を発酵培地から精製できる方法が好ましい。その際、まず、キャリヤータンパク質を、化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から、既に挙げたようにして分離する。引き続き、標的タンパク質を、公知の方法に従って精製することができる。
【００４２】
本発明による融合タンパク質の製造方法は、培養上清中での融合タンパク質の廉価でかつ効率的な生産を可能にする。
【００４３】
本発明による融合タンパク質の生産のための細菌株の発酵は、有利には完全培地又は最少塩培地中で行われる。これらの培地は、文献から公知である。
【００４４】
炭素源としては、原則的に、あらゆる使用可能な糖類、糖アルコール、有機酸もしくはそれらの塩、デンプン加水分解物、糖蜜もしくは別の物質を使用することができる。その際、有利にはグルコース又はグリセリンが使用される。また、多くの種々異なる炭素源の組み合わされた投入も可能である。窒素源としては、尿素、アンモニア及びそれらの塩、硝酸塩並びに別のＮ源を用いることができる。可能な窒素源には、また、複合アミノ酸混合物、例えば酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー及びＮＺアミン（例えばＫｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）が該当する。
【００４５】
更に、培地に更なる成分、例えばビタミン、塩、酵母エキス、アミノ酸及び微量元素を添加することができ、それによって細胞増殖は向上する。
【００４６】
該微生物株のインキュベートは、有利には好気性培養条件下で、１６〜１５０時間にわたって、かつその都度の微生物株に最適な増殖温度の範囲で行われる。
【００４７】
最適な温度範囲としては、１５〜５５℃が好ましい。特に、３０〜３７℃の温度が好ましい。
【００４８】
該微生物株の培養は、振盪フラスコ又は発酵器において行われ、その際、容量に関する制限は与えられない。その培養は、回分法で、半回分法又は連続法で実施することができる。
【００４９】
更に、本発明は、Ｅ．コリ由来のＳｐｙタンパク質を、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の発現に際してのキャリヤータンパク質として用いる使用に関する。
【００５０】
そのキャリヤータンパク質としてのＳｐｙタンパク質の使用は、公知のキャリヤータンパク質を使用するのに対して、以下の利点を有する：
ａ）融合タンパク質が安定化されること、
ｂ）標的タンパク質の誤った折り畳みが回避されること、
ｃ）標的タンパク質の高い細胞外収率が可能となること
である。
【００５１】
以下の実施例は、本発明を更に説明するために役立つものである。
【実施例】
【００５２】
実施例１：プラスミドｐＫＰ６８９の構築
ａ）ｓｐｙ遺伝子の増幅
Ｅ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、Ｅ．コリ野生株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の染色体ＤＮＡを使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドであるｓｐｙ−ｆｗ（配列番号４）（配列５′−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧ−３′）とｓｐｙ−ｒｅｖ（配列番号５）（５′−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡ−３′）を使用した。
【００５３】
ＰＣＲで得られる約６５１塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５４】
ｂ）プラスミドベクターｐＥＸ２２００へのｓｐｙ遺伝子のクローニング
該ＰＣＲ断片に、プライマーのｓｐｙ−ｆｗとｓｐｙ−ｒｅｖを介して、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩについての２箇所の切断部位を挿入した。精製されたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ロシュ，マンハイム在）及びＸｂａＩ（ロシュ，マンハイム在）を用いて、製造元によって指示される条件下で切断し、アガロースゲルを介して分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。ｓｐｙ遺伝子のクローニングのために、ベクターｐＥＸ２２００を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩによって、製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示される条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。該ＰＣＲ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＫＰ６８９（図２）では、ｓｐｙ遺伝子は、誘導可能なｔａｃ−プロモーターの制御下にある。更なる実施例の構成に使用されたプラスミドｐＫＰ６８９は、２００６年６月２６日にＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ），Ｄ−３８１４２ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で、番号ＤＳＭ１８３８１としてブタペスト条約に従って寄託された。
【００５５】
ペプチドＴ１２４９は、ＨＩＶが宿主細胞膜と融合するのを抑制する融合インヒビターである。該ペプチドは、その活性形においてＣ末端でアミノ化され、かつＮ末端でアセチル化されている。実施例２〜６において、未修飾のＴ１２４９ペプチドの産生が記載されている。
【００５６】
実施例２：Ｔ１２４９のクローニング
ａ）ベクターｐＣＭＴ２０３の予備調製
プラスミドベクターｐＣＭＴ２０３（ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１の実施例６に従って製造できる）を、Ｔ１２４９のＤＮＡのクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼＳｆｕＩ及びＰｓｔＩを用いて製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示された条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。
【００５７】
ｂ）Ｔ１２４９のＤＮＡ断片のリン酸化
ペプチドＴ１２４９のための核酸配列を、オリゴヌクレオチドを用いて合成的に製造した。オリゴヌクレオチドのＴ１（配列番号６）と、Ｔ２（配列番号７）と、Ｔ３（配列番号８）と、Ｔ４（配列番号９）と、Ｔ５（配列番号１０）とを、ポリヌクレオチド−キナーゼ（ロシュ，マンハイム在）を用いて製造元の指示に従ってリン酸化した。
【００５８】
ｃ）ライゲーション
リン酸化されたＴ１２４９のＤＮＡ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５９】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＴ１２４９ｆｕｓにおいて、Ｔ１２４９のＤＮＡを、プロテアーゼの第Ｘａ因子によって開裂可能なＤＮＡ配列によって、ヒルジン断片から隔離した。
【００６０】
実施例３：ｐＴ１２４９の構築
ａ）ベクターｐＢａＢＩＦＮ１の予備調製
プラスミドベクターｐＢａＢＩＦＮ１（ブタペスト条約に従ってＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養収集館、Ｄ−３８１４２ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８３４３として寄託された菌株ＤＨ５α／ｐＢａＢＩＦＮ１から単離できる）を、Ｔ１２４９のＤＮＡのクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩによって製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示された条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。
【００６１】
ｂ）Ｔ１２４９のＤＮＡ断片のリン酸化
ペプチドＴ１２４９のための核酸配列を、オリゴヌクレオチドを用いて合成的に製造した。オリゴヌクレオチドのＴ６（配列番号１１）と、Ｔ７（配列番号１２）と、Ｔ８（配列番号１３）と、Ｔ９（配列番号１４）と、Ｔ１０（配列番号１５）とを、ポリヌクレオチド−キナーゼ（ロシュ，マンハイム在）を用いて製造元の指示に従ってリン酸化した。
【００６２】
ｃ）ライゲーション
リン酸化されたＴ１２４９のＤＮＡ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６３】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。
【００６４】
プラスミドｐＴ１２４９のプラスミド地図を、図３に示す。
【００６５】
実施例４：ｓｐｙ−Ｔ１２４９融合物の構築
ａ）ｓｐｙ遺伝子の増幅
ｓｐｙ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、プラスミドｐＫＰ６８９を使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのｐＪＦ１１８−ｓｅｑｆｗ（配列番号１６）（配列５′−ＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧ−３′）とｓｐｙ−Ｔ１２４９ｆｕｓ（配列番号１７）（配列５′−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣ−３′）とを使用した。
【００６６】
ＰＣＲで得られる約５８６塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００６７】
ｂ）Ｔ１２４９遺伝子の増幅
Ｔ１２４９遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、プラスミドｐＴ１２４９ｆｕｓを使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのＴ１２４９−ｆｕｓ２（配列番号１８）（配列５′−ＡＧＴＡＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＧ−３′）とＴ１２４９−ＢｆｒＩ（配列番号１９）（配列５′−ＴＡＧＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣ−３′）とを使用した。ＰＣＲで得られる約１５１塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００６８】
ｃ）ｓｐｙ遺伝子とＴ１２４９遺伝子との融合
ｓｐｙ遺伝子とＴ１２４９遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、同時に、精製された実施例４ａ及び実施例４ｂ（上記参照）からのＰＣＲ断片を使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのｐＪＦ１１８−ｓｅｑｆｗ（配列番号１６）（配列５′−ＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧ−３′）とＴ１２４９−ＢｆｒＩ（配列番号１９）（配列５′−ＴＡＧＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣ−３′）とを使用した。ＰＣＲで得られる約７１７塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００６９】
ｄ）ｓｐｙ−Ｔ１２４９の融合物のプラスミドベクターｐＫＰ６８９へのクローニング
精製された実施例４ｃ（上記参照）からのＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ロシュ，マンハイム在）及びＢｆｒＩ（ロシュ，マンハイム在）を用いて、製造元によって指示される条件下で切断し、アガロースゲルを介して分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。ｓｐｙ−Ｔ１２４９の融合物のクローニングのために、ベクターｐＫＰ６８９を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＢｆｒＩによって、製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示される条件下で切断した。該プラスミドの大きい方の部分（約６０５３塩基対）を、アガロースゲルを介してプラスミドの残部から分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。そのＤＮＡ断片を引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。該ＰＣＲ断片と切断されかつ脱リン酸化されたＤＮＡ断片とのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＫＰ７００（図４）では、ｓｐｙ−Ｔ１２４９の融合物は、誘導可能なｔａｃ−プロモーターの制御下にある。
【００７０】
実施例５：未修飾のＴ１２４９−ペプチドの培養上清への分泌
培養上清中でのＳｐｙ−Ｔ１２４９−融合タンパク質の分泌を、培養上清中での未修飾のＴ１２４９−ペプチドの分泌と比較した。このために、両方の微生物株ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ７００とＷＣＭ１０５／ｐＴ１２４９とを、１０ｍｌのＬＢ培地で、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１０ｇ／ｌのグルコースと一緒に３０℃で培養した。Ｅ．コリ菌株ＷＣＭ１０５は、ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる。
【００７１】
ＯＤ600が０．５になったら、Ｔ１２４９もしくは融合タンパク質の産生を、イソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ）の添加によって誘導した。培養上清において、２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、形成されかつ分泌されたＴ１２４９もしくは融合タンパク質の量を、該タンパク質もしくはペプチドをＳＤＳゲルにおいて分離し、クーマシー染色による検出によって調査した。その結果を、図６に表す。明らかに確認できることは、ｓｐｙ−Ｔ１２４９−融合タンパク質が培養上清中に集積されることである（ゲル中の楕円形の印を参照）。Ｓｐｙ−ペプチドは、培養上清中には集積されない（ゲル中の点線の楕円形の印を参照）。
【００７２】
実施例６：未修飾のＴ１２４９−ペプチドの産生
未修飾のＴ１２４９−ペプチドの産生を、微生物株ＷＣＭ１０５／ｐＴ１２４９とＷＣＭ１０５／ｐＫＰ７００とにおいて調査した。そのために、それらの菌株を、１０ｍｌのＬＢ培地で、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１０ｇ／ｌのグルコースと一緒に３０℃で培養した。ＯＤ600が０．５になったら、未修飾のＴ１２４９−ペプチドの産生を、イソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ）の添加によって誘導した。
【００７３】
培養上清において、２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、形成された未修飾のＴ１２４９−ペプチドの量を、ＡＱＵＡ法（Ｇｅｒｂｅｒ他著、２００３年、ＰＮＡＳ １００，６９４０−６９４５；Ｈｏｃｈｌｅｉｔｎｅｒ他著、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２５３６−２５４２）によって検出した。
【００７４】
未修飾のＴ１２４９−ペプチドの配列からの参照ペプチドであって、このペプチドのトリプシン分解産物に相当する３種のペプチド（配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４）を選択した。これらのペプチドを合成し、その絶対量を秤量によって測定した。次いで、それらの参照ペプチドを、アセチル−Ｎ−オキシスクシンイミドの重水素化されたもの（Ｄ3−アセチル−Ｎ−オキシスクシンイミド）で誘導体化した。その発酵上清を、６Ｍのグアニジウム塩酸で変性させ、還元（ＤＴＴ）させ、そしてアルキル化（ヨードアセトアミド）し、そしてトリプシンで消化した。その消化物を、アセチル−Ｎ−オキシスクシンイミドで誘導体化させた。参照ペプチドの定義された量を添加し、そして次いで該消化物を、ＨＰＬＣによって分離した。回収されたフラクションを、質量分光分析法によって調査した。参照ペプチドと、消化物に由来するペプチドとのアイソトープ対を観察した。これらのアイソトープ対は、３ダルトンの質量差を有していた。消化物からのペプチドと参照ペプチドとの強度比から、Ｔ１２４９ペプチドの絶対量を測定することができた。
【００７５】
菌株ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ７００を使用した場合には、ＡＱＵＡ法による検出前に第Ｘａ因子による消化を実施して、未修飾のＴ１２４９ペプチドをキャリヤータンパク質から分離した。５０μｌのバッチは、１０μｌの５×バッファー（２５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）；０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2）と、１５μｌの培養上清と、１μｌの第Ｘａ因子（５μｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、カタログ番号Ｆ９３０２）と、２４μｌのＨ2Ｏとから成っていた。第Ｘａ因子による消化は、２２℃で１６時間にわたり実施した。
【００７６】
第１表において、未修飾のＴ１２４９−ペプチドの定量化された収率を列記する。
【００７７】
第１表
【表１】
【００７８】
実施例７：ｓｐｙ−インターフェロンα２ｂの融合物の構築
ａ）インターフェロンα２ｂ遺伝子の増幅
インターフェロンα２ｂ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム在）を使用して、通常の当業者に公知の作業に従って増幅させた。鋳型として、プラスミドｐＢａＢＩＦＮ１（ＤＳＭ１８３４３から単離できる）を使用した。プライマーとして、オリゴヌクレオチドのＩＦＮａ２ｂ−ｆｗ（配列番号２０）（配列５′−Ｐ[1]−ＡＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＣＣ−３′（[1]オリゴヌクレオチドは、５′末端でリン酸化されている））とＩＦＮａ２ｂ−ｒｅｖ（配列番号２１）（配列５′−ＡＣＣＴＣＴＴＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＧ−３′）とを使用した。
【００７９】
ＰＣＲで得られる約５２６塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００８０】
ｂ）プラスミドベクターｐＫＰ７００へのインターフェロンα２ｂ遺伝子のクローニング
該ＰＣＲ断片において、プライマーＩＦＮａ２ｂ−ｒｅｖを介して、制限エンドヌクレアーゼＢｆｒＩについての末端切断部位を挿入した。精製されたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＢｆｒＩ（ロシュ，マンハイム在）を用いて、製造元によって指示される条件下で切断し、アガロースゲルを介して分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。
【００８１】
ｓｐｙ遺伝子のクローニングのために、ベクターｐＫＰ７００を、制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩとＢｆｒＩによって、製造元（ロシュ，マンハイム在）によって示される条件下で切断した。そのプラスミドを引き続き、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ，マンハイム在）での処理によって５′末端で脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製した。該ＰＣＲ断片と切断されかつ脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ，マンハイム在）を使用して行った。該ライゲーションバッチによる菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のＥ．コリ細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によるプラスミド単離の後に、制限分析によって同定し、そして欠陥が無いことを配列分析によって確認した。前記のようにして得られたプラスミドｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂ（図５）では、インターフェロンα２ｂ遺伝子は、誘導可能なｔａｃ−プロモーターの制御下にある。
【００８２】
実施例８：インターフェロンα２ｂの産生
得られた菌株におけるインターフェロンα２ｂの産生を調査した。そのために、それらの菌株を、１０ｍｌのＬＢ培地で、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１０ｇ／ｌのグルコースと一緒に３０℃で培養した。ＯＤ600が０．５になったら、インターフェロンα２ｂの産生を、イソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ）の添加によって誘導した。培養上清において、２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、形成されかつ分泌されたインターフェロンα２ｂの量を、ＳＤＳゲル中でのタンパク質の分離と、抗インターフェロン特異抗体でのイムノブロットにおける検出とによって検出した。菌株ＷＣＭ１０５／ｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂを使用した場合に、ＳＤＳゲルの前に、第Ｘａ因子による消化を実施して、インターフェロンα２ｂをキャリヤータンパク質から分離した。５０μｌのバッチは、１０μｌの５×バッファー（２５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）；０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2）と、１５μｌの培養上清と、１μｌの第Ｘａ因子（５μｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、カタログ番号Ｆ９３０２）と、２４μｌのＨ2Ｏとから成っていた。第Ｘａ因子による消化は、２２℃で１６時間にわたり実施した。
【００８３】
５μｌ（菌株ＷＣＭ１０５／ｐＢａＢＩＦＮ１）もしくは１６．５μｌ（菌株ＷＣＭ１０５／ｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂ）の上清ごとに、サンプルバッファー（２×トリスＳＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）；４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ；２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン；０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー；５％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール）を混合した。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性は、５分間にわたり１００℃に加熱することによって実施した。氷上で２分間冷却し、引き続き遠心分離した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いて分離した（電気泳動パラメータ：２００Ｖで４０分間）。イムノブロットによる検出と定量化を、以下の仕様に従って実施した：
ａ）湿式ブロッティング法での転写
モジュール：Ａｍｅｒｓｈａｍ：Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６。
【００８４】
メンブレン：ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ；ＢＡ８５；硝酸セルロース（Ｅ）；０．４５（孔サイズ））
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）に気泡なく染み込ませた。
【００８５】
積層の構成：黒い格子（ｓｃｈｗａｒｚｅｓ Ｇｉｔｔｅｒ）、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ニトロセルロースメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子（ｗｅｉｓｓｅｓ Ｇｉｔｔｅｒ）、アノードとの接続
転写条件：Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流強度、Ｕ＝無制限、運転時間＝６０分
ｂ）プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする；
２０℃で３０分間振り動かす
ｃ）一次抗体のハイブリダイゼーション
０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮα抗体（Ｂｉｏｚｏｌ（Ｅｃｈｉｎｇ）を経由したＰｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ；カタログ番号５００−Ｐ３２Ａ）と一緒に２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする；
２０℃で９０分間又は一晩振り動かす。
【００８６】
ｄ）洗浄
１×ＰＢＳで２０℃において１０秒間振り動かす；バッファーを捨てる；
１×ＰＢＳで２０℃で２回１５分振り動かす；バッファーを捨てる。
【００８７】
ｅ）二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌ（１：１０００希釈）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｂｉｏｚｏｌ（Ｅｃｈｉｎｇ）を経由したＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号４０５０−０５）を有する２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベート；２０℃で６０分間振り動かす。
【００８８】
ｆ）洗浄
１×ＰＢＳで２０℃において１０秒間振り動かす；バッファーを捨てる；
１×ＰＢＳで２０℃で２回１５分振り動かす；バッファーを捨てる。
【００８９】
ｇ）化学発光を介した検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（ロシュ，マンハイム在）を準備：Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合：ニトロセルロースメンブレン当たり３ｍｌ。
【００９０】
ブロットを２０℃でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒にインキュベート、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【００９１】
ｈ）バッファー
プリハイブリダイゼーションバッファー：１×ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳；
１０×ＰＢＳ：１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4；１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ１００；
１×ＰＢＳ：１０×ＰＢＳを、完全脱塩水で１：１０希釈したもの
ｉ）定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ）を用いて、プロットされたスタンダードと比較することによって実施した。
【００９２】
第２表に、定量化されたインターフェロンα２ｂの収率を列記する。
【００９３】
第２表
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、以下のＡ）（シグナルペプチド（ＳＰ）とキャリヤータンパク質とから構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介して組み換え標的タンパク質が結合されている前駆体−融合タンパク質）、Ｂ）（シグナルペプチド（ＳＰ）と組み換え標的タンパク質とから構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介してキャリヤータンパク質が結合されている前駆体−融合タンパク質）、Ｃ）（キャリヤータンパク質から構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介して組み換え標的タンパク質が結合されている融合タンパク質）、Ｄ）（組み換え標的タンパク質から構成され、該タンパク質に化学的もしくは酵素的に開裂可能な配列（Ｓ）を介してキャリヤータンパク質が結合されている融合タンパク質）の概略図を示している。
【図２】図２は、プラスミドｐＫＰ６８９を示している。
【図３】図３は、プラスミドｐＴ１２４９を示している。
【図４】図４は、プラスミドｐＫＰ７００を示している。
【図５】図５は、プラスミドｐＥＸ−ｓｐｙ−ＩＦＮａ２ｂを示している。
【図６】図６は、クーマシー染色によって着色された実施例５からのＳＤＳゲルを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチドをコードする核酸配列と、それと機能的に結合されているキャリヤータンパク質をコードする遺伝子と、それと開裂可能な配列Ｓをコードする遺伝子を介して結合されている標的タンパク質をコードする遺伝子とからなる、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にするＤＮＡ構築物であって、キャリヤータンパク質をコードする遺伝子がＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ構築物であって、ｓｐｙ遺伝子が、配列番号１を有するか、あるいは縮重された遺伝子コードによって引き起こされた類似配列であってＳｐｙタンパク質をコードする配列を有することを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡ構築物であって、シグナルペプチドをコードする核酸配列が、Ｅ．コリ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列であるｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＴ、ｌｐｐ、ｐｈｏＥ、ｏｍｐＦ、ｌａｍＢ、ｏｍｐＣ、ｍａｌＥ、ｓｐｙの群から選択されることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物であって、標的タンパク質のための核酸配列が、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、白血病抑制因子、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、組み換え成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子、血管新生阻害剤、組織プラスミノゲンアクチベーター、血液凝固因子、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、イムノグロブリン、単鎖抗体、補体成分、低酸素症に誘発されるストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、癌原遺伝子産物、転写因子、ウイルス構成タンパク質、プロインスリン、プロウロキナーゼ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ニューロトロフィン、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、リポコルチン、レプチン、血清アルブミン、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ及びＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）の群から選択されることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物であって、開裂可能な配列Ｓが、翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質とキャリヤータンパク質との化学的もしくは酵素的な分解を可能にすることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡ構築物であって、開裂可能な配列Ｓが、融合タンパク質の開裂をプロテアーゼによって酵素的に可能にすることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡ構築物であって、開裂可能な配列Ｓが、標的タンパク質の開裂を真核性のプロテアーゼである第Ｘａ因子によって可能にすることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
【請求項９】
融合タンパク質を分泌する微生物株の製造方法において、腸内細菌科からの微生物株に、請求項１から７までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物又は請求項８記載のプラスミドを導入することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から７までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物又は請求項８記載のプラスミドを含む微生物株。
【請求項１１】
Ｓｐｙタンパク質と、標的タンパク質と、開裂可能な配列（Ｓ）とからなる融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質を微生物株によって発酵的に製造する方法において、請求項１０記載の微生物株を発酵培地中で培養し、その際、請求項１１記載の融合タンパク質が形成され、その発酵培地を、該微生物株の細胞による発酵後に分離することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、発酵培地の分離後に、標的タンパク質を細胞のペリプラズムから精製し、その際、まずキャリヤータンパク質を化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から分離し、そして引き続き標的タンパク質を精製することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、発酵培地の分離後に、標的タンパク質を発酵培地から精製し、その際、まずキャリヤータンパク質を化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から分離し、そして引き続き標的タンパク質を精製することを特徴とする方法。
【請求項１５】
Ｅ．コリ由来のＳｐｙタンパク質を、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の発現に際してのキャリヤータンパク質として用いる使用。
【請求項１】
シグナルペプチドをコードする核酸配列と、それと機能的に結合されているキャリヤータンパク質をコードする遺伝子と、それと開裂可能な配列Ｓをコードする遺伝子を介して結合されている標的タンパク質をコードする遺伝子とからなる、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の廉価な製造を可能にするＤＮＡ構築物であって、キャリヤータンパク質をコードする遺伝子がＥ．コリ由来のｓｐｙ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ構築物であって、ｓｐｙ遺伝子が、配列番号１を有するか、あるいは縮重された遺伝子コードによって引き起こされた類似配列であってＳｐｙタンパク質をコードする配列を有することを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡ構築物であって、シグナルペプチドをコードする核酸配列が、Ｅ．コリ遺伝子のシグナルペプチドをコードする核酸配列であるｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＴ、ｌｐｐ、ｐｈｏＥ、ｏｍｐＦ、ｌａｍＢ、ｏｍｐＣ、ｍａｌＥ、ｓｐｙの群から選択されることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物であって、標的タンパク質のための核酸配列が、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、白血病抑制因子、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、組み換え成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子、血管新生阻害剤、組織プラスミノゲンアクチベーター、血液凝固因子、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、イムノグロブリン、単鎖抗体、補体成分、低酸素症に誘発されるストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、癌原遺伝子産物、転写因子、ウイルス構成タンパク質、プロインスリン、プロウロキナーゼ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ニューロトロフィン、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、リポコルチン、レプチン、血清アルブミン、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ及びＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）の群から選択されることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物であって、開裂可能な配列Ｓが、翻訳された融合タンパク質において、標的タンパク質とキャリヤータンパク質との化学的もしくは酵素的な分解を可能にすることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡ構築物であって、開裂可能な配列Ｓが、融合タンパク質の開裂をプロテアーゼによって酵素的に可能にすることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡ構築物であって、開裂可能な配列Ｓが、標的タンパク質の開裂を真核性のプロテアーゼである第Ｘａ因子によって可能にすることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
【請求項９】
融合タンパク質を分泌する微生物株の製造方法において、腸内細菌科からの微生物株に、請求項１から７までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物又は請求項８記載のプラスミドを導入することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から７までのいずれか１項記載のＤＮＡ構築物又は請求項８記載のプラスミドを含む微生物株。
【請求項１１】
Ｓｐｙタンパク質と、標的タンパク質と、開裂可能な配列（Ｓ）とからなる融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質を微生物株によって発酵的に製造する方法において、請求項１０記載の微生物株を発酵培地中で培養し、その際、請求項１１記載の融合タンパク質が形成され、その発酵培地を、該微生物株の細胞による発酵後に分離することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、発酵培地の分離後に、標的タンパク質を細胞のペリプラズムから精製し、その際、まずキャリヤータンパク質を化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から分離し、そして引き続き標的タンパク質を精製することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、発酵培地の分離後に、標的タンパク質を発酵培地から精製し、その際、まずキャリヤータンパク質を化学的もしくは酵素的に標的タンパク質から分離し、そして引き続き標的タンパク質を精製することを特徴とする方法。
【請求項１５】
Ｅ．コリ由来のＳｐｙタンパク質を、Ｅ．コリにおける標的タンパク質の発現に際してのキャリヤータンパク質として用いる使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１０４４６２（Ｐ２００８−１０４４６２Ａ）
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７８０６４（Ｐ２００７−２７８０６４）
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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