ＤＮＡ解析方法
【課題】サンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡの抑制を行い、精度の高いＤＮＡ解析方法を提供する。
【解決手段】標識剤により修飾された第１の一本鎖ＤＮＡを含む第１の二本鎖ＤＮＡ及び／または標識剤により修飾された前記第1のＤＮＡに対して１塩基以上配列の異なる第２の一本鎖ＤＮＡを含む第２の二本鎖ＤＮＡとからなる試料ＤＮＡを作製する調整ステップと、前記第１及び／または第２の一本鎖ＤＮＡと同一の塩基配列を持つ各々第１及び／又は第２のコンペティションＤＮＡの量を各々前記試料ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡのモル数よりも多く加えて混合する混合ステップと、前記混合ステップにより得られた混合液に変性剤を加えた後に所定の値で加熱する加熱ステップと、を行いＤＮＡ変性液を作製する。
【解決手段】標識剤により修飾された第１の一本鎖ＤＮＡを含む第１の二本鎖ＤＮＡ及び／または標識剤により修飾された前記第1のＤＮＡに対して１塩基以上配列の異なる第２の一本鎖ＤＮＡを含む第２の二本鎖ＤＮＡとからなる試料ＤＮＡを作製する調整ステップと、前記第１及び／または第２の一本鎖ＤＮＡと同一の塩基配列を持つ各々第１及び／又は第２のコンペティションＤＮＡの量を各々前記試料ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡのモル数よりも多く加えて混合する混合ステップと、前記混合ステップにより得られた混合液に変性剤を加えた後に所定の値で加熱する加熱ステップと、を行いＤＮＡ変性液を作製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出するＤＮＡ解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展により、様々な疾患における遺伝子の関与が明らかになってきた。そのため、遺伝子に着目した遺伝子治療が注目されている。
【０００３】
現在、ＤＮＡのＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療を行うことが出来る。さらには、ヒトや動物の親子関係の特定ができると考えられる。
【０００４】
ＳＮＰや一部の塩基配列が異なるＤＮＡを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断方法がある。この方法は、まず目的配列に相補的なプローブＤＮＡに高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを作製する。このコンジュゲートＤＮＡは、高分子化合物のため、キャピラリー内で移動し難くなる性質を持つ。このコンジュゲートＤＮＡを電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填し、陰極側から一本鎖のサンプルＤＮＡを注入して電圧を印加する。その際に、コンジュゲートＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡは、充填したコンジュゲートＤＮＡとの相互作用により泳動が妨げられる。このときＳＮＰをもったサンプルＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡとでコンジュゲートＤＮＡとのハイブリダイゼーションにおける親和性の差を電気泳動の移動度で比較することにより、ＳＮＰを持つＤＮＡを明瞭に識別出来る（例えば非特許文献１を参照。）。
【０００５】
高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを用いて、サンプルＤＮＡのＳＮＰを判別するときは、サンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡを結合（以下、ハイブリという）させるために一本鎖の状態にする。サンプルＤＮＡは生体試料からゲノムＤＮＡを抽出し、蛍光色素を標識したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した後、一本鎖に変性する（サンプルＤＮＡ調整と呼ぶ。）。調整したサンプルＤＮＡをコンジュゲートＤＮＡが充填されたキャピラリー管内に注入し、電気泳動により増幅されたＰＣＲ産物を検出部で光学的に検出するが、キャピラリー管内でサンプルＤＮＡがＰＣＲ産物を変性して相補鎖とサンプルＤＮＡが再結合して二本鎖に戻ることがあった。この状態で、電気泳動を行うと、コンジュゲートＤＮＡに結合しない非結合型ＤＮＡ、二本鎖に再結合した二本鎖になった再結合ＤＮＡ、コンジュゲートＤＮＡに結合する結合型ＤＮＡの順番でピークが検出される。再結合ＤＮＡのピークは条件により非結合型あるいは結合型ＤＮＡのピークのいずれかと重なるので、ピーク面積から定量分析する場合には、正確な定量が出来ない。そこで、再結合ＤＮＡを抑制するために、キャピラリー管内に相補鎖除去用のコンジュゲートＤＮＡを用いる方法が用いられている（例えば特許文献１を参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５７号公報
【非特許文献１】Detection of single-base mutation by affinity capillary electrophoresis using a DNA-polyacrylamide conjugate; Kae Sato, Akira Inoue, Kazuo Hosokawa, Mizuo Maeda; Electrophoresis 2005, (26) 3076-3080
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再結合ＤＮＡは、サンプルＤＮＡがキャピラリー管内を電気泳動中に起こるだけでなく、サンプルＤＮＡの調整段階でも変性したサンプルＤＮＡの一部により生じる。前記従来の方法ではこのサンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡを抑制することができないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記課題に檻みてなされたものであり、サンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡの抑制を行い、精度の高いＤＮＡ解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために本発明のＤＮＡ解析方法は、標識剤により修飾された第１の一本鎖ＤＮＡを含む第１の二本鎖ＤＮＡ及び／または標識剤により修飾された前記第1のＤＮＡに対して１塩基以上配列の異なる第２の一本鎖ＤＮＡを含む第２の二本鎖ＤＮＡとからなる試料ＤＮＡを作製する調整ステップと、前記第１及び／または第２の一本鎖ＤＮＡと同一の塩基配列を持つ各々第１及び／又は第２のコンペティションＤＮＡの量を各々前記試料ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡのモル数よりも多く加えて混合する混合ステップと、前記混合ステップにより得られた混合液に変性剤を加えた後に所定の値で加熱する加熱ステップと、前記第１の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列をもつプローブＤＮＡにその電気泳動を遅らせる電気非泳動物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、前記加熱ステップを通した後のＤＮＡ変性液と前記コンジュゲートＤＮＡとを用いて電気泳動させることにより前記第１あるいは第２の一本鎖ＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップとから成ることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
サンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡを抑制することで、ノイズとなるピークの発生を抑え、非結合型ＤＮＡのピークと結合型ＤＮＡのピークを独立して計測でき、定量測定を行うことが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明のＤＮＡ解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
(実施の形態１)
図１を用いて本発明のコンペティションＤＮＡとコンペティションＤＮＡを用いた再結合ＤＮＡ防止の方法を説明する。
【００１１】
＜調製ステップ＞
まず本発明の実施の形態１における試料ＤＮＡを作製する調製ステップの詳細を説明する。本実施の形態１で解析する試料ＤＮＡは、植物、動物、または人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型にＰＣＲや大腸菌を使い既知のＰＣＲ法によって増幅する。ＰＣＲ産物である試料ＤＮＡは、次ステップでの一本鎖変性時に絡み合わないような長さが良く、両末端に結合するプライマーＤＮＡの長さを考慮すると４０ｂｐから２００ｂｐ程度が好ましい。
【００１２】
図１に示す２０１は第１のサンプルＤＮＡ、２０２はＳＮＰを含む第２のサンプルＤＮＡである。本実施例では、第１および第２のサンプルＤＮＡの長さ（塩基数）を４０塩基、ＧＣ含量が５０％であるのものを用いた。また、ＰＣＲを行うフォワード側のプライマーＤＮＡには５'末端に蛍光標識の標識剤Ｃｙ５が付加されたものを使用したので、ＰＣＲでＤＮＡを増幅した際、片方の鎖の５’末端に標識剤Ｃｙ５が結合したＰＣＲ産物２２１及び２２２が作製される。このＰＣＲ産物は第１のサンプルＤＮＡ２０１からなる第１のＰＣＲ産物２２１とＳＮＰを含む第２のサンプルＤＮＡ２０２からなる第２のＰＣＲ産物２２２の両方もしくはどちらか一方を含んでいる。
【００１３】
＜混合ステップ＞
次に混合ステップの詳細を説明する。まず、本発明の第１のコンペティションＤＮＡ２３１と第２のコンペティションＤＮＡ２３２の詳細を説明する。なお、第１のコンペティションＤＮＡ２３１は、第１のサンプルＤＮＡ２０１と同じ塩基配列を持ち、第２のコンペティションＤＮＡ２３２は第２のサンプルＤＮＡ２０２と同じ塩基配列を持つ。なお、図１中の２５１及び２５２は、それぞれ第１及び第２のサンプルＤＮＡに対する相補鎖ＤＮＡである。また、第１および第２のコンペティションＤＮＡは、それぞれ第１及び第２のサンプルＤＮＡの配列を元に作るので、第１および第２のコンペティションＤＮＡの長さは、元となる第１及び第２のサンプルＤＮＡの長さよりも長くならない。まず、第１のコンペティションＤＮＡ２３１の作製について以下に説明する。
【００１４】
先に説明した通り、第１のサンプルＤＮＡが４０塩基でＧＣ含量が５０％なので、ＡとＴの塩基は水素結合が２本、ＧとＣの塩基は水素結合が３本となる。そのため、第１のサンプルＤＮＡ２０１と相補鎖ＤＮＡ２５１との結合強度は、｛（２（ＡＴの水素結合）×２０塩基）＋（３（ＧＣの水素結合）×２０塩基）｝×１（モル数）＝１００となる。ここで、第１のコンペティションＤＮＡ２３１の長さを第１のサンプルＤＮＡ２０１の長さより３０塩基短い１０塩基でＧＣ含量が５０％でありモル数が第１のサンプルＤＮＡ２０１の５倍とすると、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第１のコンペティションＤＮＡ２３１との結合強度は、｛（２（ＡＴの水素結合）×５塩基）＋（３（ＧＣの水素結合）×５塩基）｝×５（モル数）＝１２５となる。すなわち、相補鎖ＤＮＡ２５１は第１のサンプルＤＮＡ２０１よりも、第１のコンペティションＤＮＡ２３１と優先的に結合することができる。
【００１５】
第１のコンペティションＤＮＡ２３１の長さを３０塩基以上短くした場合は、このような相補鎖ＤＮＡ２５１との優先的結合が生じない。例えば、第１のサンプルＤＮＡの条件を同一にして第１のコンペティションＤＮＡ２３１の長さを８塩基にした場合は結合強度は１００となり、第１のサンプルＤＮＡの結合強度と同等となり、相補鎖ＤＮＡ２５１との優先的結合は生じないので好ましくない。また、第１のコンペティションＤＮＡの長さ（塩基数）の上限は第１のサンプルＤＮＡの長さ（塩基数）と同一になる。
【００１６】
次に、第１のコンペティションＤＮＡ２３１のモル数が第１のサンプルＤＮＡ２０１とのモル数よりも十分大きいことが重要である。仮に、第１のコンペティションＤＮＡのモル数を下げて第１のサンプルＤＮＡのモル数に対し４倍とすると、相補鎖ＤＮＡ２５１と第１のコンペティションＤＮＡ２３１との結合強度は８０に低下し、相補鎖ＤＮＡ２５１は第１のサンプルＤＮＡ２０１と結合して再結合ＤＮＡを生じる確率が増大するので、好ましくない。
【００１７】
以上、第１のコンペティションＤＮＡ２３１についてその詳細を説明したが、第２のコンペティションＤＮＡ２３２についても同様であるので割愛する。
【００１８】
以上のようにして本実施例では、第１のコンペティションＤＮＡ２３１と第２のコンペティションＤＮＡ２３２を作製し、第１と第２のＰＣＲ産物に加えて混合液を作製した。
【００１９】
＜加熱ステップ＞
上述の混合ステップにて作製された混合液に、変性剤としてＰＣＲ産物に対して１０倍量の体積のホルムアミドまたは終濃度０．３〜７Ｍの尿素を加える。ホルムアミドが１０倍以下の場合、ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡにする処理が不十分であることがあり、好ましくない。１０倍以上だとサンプルの濃度が薄まってしまい、光学的な検出が困難となり、好ましくない。また、尿素が０．３Ｍ以下だと変性処理が不十分であり、７Ｍ以上だと高濃度の尿素を調整することが難しく、好ましくない。
【００２０】
上記の変性剤が加えられた混合溶液を９５℃で１〜１０分間、熱した後、急冷してＤＮＡ変性液を作製した。この変性液中には、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第１のサンプルＤＮＡの相補鎖２５１と第２のサンプルＤＮＡ２０２と第２のサンプルＤＮＡの相補鎖２５２の全てあるいはいずれか含んでいる。上述の混合ステップで説明した通り、この変性液中には、第１のコンペティションＤＮＡ２３１もしくは第２のコンペティションＤＮＡ２３２は、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２よりも大量に含まれているので、第１あるいは第２のコンペティションＤＮＡは、それぞれ第１あるいは第２の相補鎖と優先的に結合するので、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２は一本鎖の状態で存在することができる。
【００２１】
＜コンジュゲートＤＮＡ作製ステップ＞
次にコンジュゲートＤＮＡの作製について詳細に説明する。図２にコンジュゲートＤＮＡ２１０の構造を示す。図中の２０３はサンプルＤＮＡであり、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２とを含んでいる。本実施例では、第１のサンプルＤＮＡ２０１に特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡの作製方法を示すが、第２のサンプルＤＮＡ２０２に特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡの作製も同様に方法で行うことが出来る。
【００２２】
さて、生体のＤＮＡと特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡのプローブＤＮＡ２１２の配列は、本実施例では第１のサンプルＤＮＡ２０１に結合する配列を用いる。このプローブＤＮＡに電気非泳動物質２１１を結合させることにより、第１のサンプルＤＮＡ２０１に特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡが作製できる。ここで、
電気非泳動物質２１１は電気泳動時のサンプルＤＮＡの速度に対して遅い速度で電気泳動する物質で構成されるものであり、電荷を持たず、また高分子物質であれば良い。例えば一般的に使用されるリニアポリマーである、アクリルアミドやポリエチレングリコールが挙げられる。またマイクロビーズとしてはガラスビーズや磁気ビーズなどが挙げられる。そして前記プローブＤＮＡ２１２はサンプルＤＮＡのＳＮＰ部位を含む一部の配列に対して相補的な配列であれば良く、６塩基以上１８塩基以下の長さで任意の塩基配列を設定する。プローブＤＮＡが５塩基以下の場合、サンプルＤＮＡとの結合能力が不十分でなく、１８塩基以上の場合、サンプルＤＮＡとの結合力が強すぎて、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡの両方と非特異的に結合する場合があり、好ましくない。
【００２３】
＜測定ステップ＞
続いて、キャピラリー電気泳動装置を用いて行う測定ステップを説明する。図３に本実施例で用いたキャピラリー電気泳動装置の構成を示す。主な構成は、正電極１３３を配置した第１容器１３１と負電極１３４を配置した第２容器１３２との間に密閉流路１３０で介しており、この密閉流路１３０にコンジュゲートＤＮＡを充填した後、測定すべきサンプルＤＮＡを第２容器１３２側の密閉流路１３０に入れて電気泳動のための電圧を可変電源部１３６により正電極１３３と負電極１３４とに与える。サンプルＤＮＡに標識された蛍光色素による蛍光を検出部１５０で測定することにより、サンプルＤＮＡの蛍光強度を測定する。検出部１５０はスリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３でレーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、蛍光色素から発生した６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む仕様になっている。
【００２４】
さて、密閉流路１３０はコーティングされた内径５０〜１００μｍのキャピラリー管やマイクロプレート上に微細加工で溝加工されている。図４に、本実施例で用いたキャピラリー管内部を示す。本実施例では、２５ｃｍのキャピラリー管を使用した。１１は緩衝液である。密閉流路１３０の内部にコンジュゲートＤＮＡ２１０を充填した後、密閉流路１３０の一端に変性した試料ＤＮＡ２００を注入する。ここで、コンジュゲートＤＮＡ２１０の濃度は試料ＤＮＡ２００の濃度に対して１０〜６００倍とするのが好ましい。１０倍以下だとサンプルＤＮＡがコンジュゲートＤＮＡと十分に結合出来なくなり、６００倍以上であれば高濃度プローブが必要になるので高価なコンジュゲートの作製が必要となる。
【００２５】
この後、図３に示すように、密閉流路１３０の両端を第１容器１３１及び第２容器１３２に入れ緩衝液１１で満たし電気泳動を行う。本実施例のキャピラリー管を使用した場合には、可変電源部１３５より６ｋＶの電圧を印加し、およそ３〜１６μＡの電流を流して試料ＤＮＡ２００の電気泳動を行った。
【００２６】
次に、電気泳動中の試料ＤＮＡ２００の測定手法を示す。フォワード側の５'末端に標識された蛍光色素Ｃｙ５に、検出部１５０内部のレーザー１５１（６３０ｎｍ）を照射して６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出する。試料ＤＮＡ２００に電気泳動を行うことにより、最初に余剰のプライマーＤＮＡに標識された蛍光色素のピークが検出され、その次にコンジュゲートＤＮＡ２１０に結合しない第２のサンプルＤＮＡ２０２のピークが検出され、最後にコンジュゲートＤＮＡ２１０に結合する第１のサンプルＤＮＡ２０１のピークが検出される。このピークの状態を観測することで試料ＤＮＡ２００のＤＮＡ分析が出来る。
【００２７】
以下、具体的な条件や試料を示して本発明の実施の形態をより詳細に説明するが、本発明はこれに記載した試料ＤＮＡや調製条件その他に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１の作製）
〔ＰＣＲ産物の調整〕
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５’−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３’（フォワードプライマー、配列表２）を、リバース側のプライマーは５’−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３’（リバースプライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように加えた。反応サイクルは以下のとおりである。９５℃―１０分、（９５℃ー３０秒、５５℃―３０秒、７２℃―３０秒）３０サイクル、７２℃―５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００２９】
〔ＰＣＲ産物の変性〕
ＰＣＲ産物を２μｌと変性剤としてホルムアミドを４０μｌ、第１のコンペティションＤＮＡ（配列表４）と第２のコンペティションＤＮＡ（配列表５）とを各々１００μＭに調整したものを1μｌずつ加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷した。
【００３０】
〔緩衝液の調整〕
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）を終濃度５０ｍＭで使用した。
【００３１】
〔コンジュゲートＤＮＡの作製〕
第1のサンプルＤＮＡに相補的な配列をもつアミノ化ＤＮＡを１ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７．４）を加えて調整した。アミノ化ＤＮＡの配列は５’−ＡＣＣＡＧＣ−３’（配列表１）である。分子量２０，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５μｌ加え、撹拌した。溶かしたＰＥＧ−ＮＨＳにアミノ化ＤＮＡを５０μｌと１Ｍの炭酸水素ナトリウムを５μｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲートＤＮＡ２１０は１００μＭになるように緩衝液で溶かした。
【００３２】
〔キャピラリー電気泳動装置によるＳＮＰ測定〕
前述した図３に示すキャピラリー電気泳動装置にてＳＮＰの測定を行った。前記密閉流路１３０はコーティングされた内径１００μｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。そして、緩衝液１１を含むコンジュゲートＤＮＡを充たした密閉流路１３０に、図４に示すように試料ＤＮＡ２００を注入する。そしてこの後、両電極１３３，１３４間に可変電源部１３５により６ｋＶの電圧を印加して、密閉流路１３０内の試料ＤＮＡ２００を電気泳動させ、該試料ＤＮＡ２００中の第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２それぞれの、前記コンジュゲートＤＮＡ２１０に対する親和性の差によって、該試料ＤＮＡ２００を分離する。なお、検出部１５０において、前述したように、プライマーＤＮＡに蛍光色素を標識して、該蛍光色素から発せられる蛍光だけを検出するようにしておけば、前記第１のサンプルＤＮＡ２０１と前記第２のサンプルＤＮＡ２０２のみを検出することができる。
【００３３】
検出部では、スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記レーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、サンプルＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。
【００３４】
第１のサンプルＤＮＡ２０１に相補的な配列を持つコンジュゲートＤＮＡ２１０を用いてキャピラリー電気泳動装置で測定した結果、フォワード側のプライマーが検出された後、第２のサンプルＤＮＡ２０２、そして第１のサンプルＤＮＡ２０１の順番でピークを検出した。この結果を図５に示す。
【００３５】
（比較例の作製）
比較例として、従来のサンプルＤＮＡ調整法により作製された試料ＤＮＡを用いた。これは、実施例１と同一のサンプルＤＮＡに蛍光標識されたＰＣＲ産物に１０倍量の体積の変性剤を加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷し、一本鎖ＤＮＡを得たものである。測定装置も実施例１と同一のものを用いて測定した。その結果を図６に示す。
【００３６】
（実施例１と比較例との蛍光スペクトルの対比）
図５に示すように、実施例１では、時間の早い方から、プライマーのピーク、非結合型ＤＮＡである第２のサンプルＤＮＡ２０２のピーク、結合型ＤＮＡである第１のサンプルＤＮＡ２０１のピークが検出されている。ところが、従来法で見られる二本鎖ＤＮＡのピークはバックグランドノイズに近いレベルまで減少している。一方、比較例での測定結果である図６では、非結合型ＤＮＡと結合型ＤＮＡのピークとの間に二本鎖ＤＮＡによる大きなピークが生じている。この結果から明らかなように、本発明によるコンペティションＤＮＡの長さをサンプルＤＮＡに対して調製し、且つサンプルＤＮＡに対して過剰に投与することで、従来、ＤＮＡ解析の際の課題となっていた二本鎖ＤＮＡを大幅に抑制することが出来る。
【００３７】
以上、説明したように、本発明による遺伝子解析法を用いてＳＮＰ解析を行えば、再結合ＤＮＡのピークを除去でき、第1のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２の定量性を精度よく測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明にかかるＤＮＡ解析方法は、ＳＮＰ測定においてノイズピークとなる再結合ＤＮＡの形成を防止してピークの定量性や感度を向上させることが出来るので精度の高い遺伝子解析手法や装置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施の形態１におけるサンプル調整の方法を示す図
【図２】コンジュゲートＤＮＡを示す図
【図３】キャピラリー電気泳動装置の構成を示す図
【図４】キャピラリー電気泳動装置でのキャピラリー管内を示す図
【図５】本実施の形態１の方法を適用した時の試料ＤＮＡ（実施例１）を測定したときに検出される波形を示したグラフ
【図６】従来の方法で調整した試料ＤＮＡ（比較例）を測定したときに検出される波形を示したグラフ
【符号の説明】
【００４０】
１１ 緩衝液
２１０ コンジュゲートＤＮＡ
１３０ 密閉流路
１３１ 第１の容器
１３２ 第２の容器
１３３ 正電極
１３４ 負電極
１３５ 可変電源部
１４０ 制御部
１５０ 検出部
１５１ レーザー
１５２ スリット
１５３ フィルター
１５４ フォトマルチプライヤー
１５５ プリアンプ
１５６ Ａ／Ｄコンバータ
２００ 試料ＤＮＡ
２０１ 第１サンプルＤＮＡ
２０２ 第２サンプルＤＮＡ
２０３ サンプルＤＮＡ
２１０ コンジュゲートＤＮＡ
２１１ 電気非泳動物質
２１２ プローブＤＮＡ
２２１ 第１のサンプルＤＮＡからなるＰＣＲ産物
２２２ 第２のサンプルＤＮＡからなるＰＣＲ産物
２３０ コンペティションＤＮＡ
２３１ 第１コンペティションＤＮＡ
２３２ 第２コンペティションＤＮＡ
２４１ 第１コンペティションＤＮＡと結合した二本鎖
２４２ 第２コンペティションＤＮＡと結合した二本鎖
２５１ 第１サンプルＤＮＡの相補鎖
２５２ 第２サンプルＤＮＡの相補鎖
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出するＤＮＡ解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展により、様々な疾患における遺伝子の関与が明らかになってきた。そのため、遺伝子に着目した遺伝子治療が注目されている。
【０００３】
現在、ＤＮＡのＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療を行うことが出来る。さらには、ヒトや動物の親子関係の特定ができると考えられる。
【０００４】
ＳＮＰや一部の塩基配列が異なるＤＮＡを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断方法がある。この方法は、まず目的配列に相補的なプローブＤＮＡに高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを作製する。このコンジュゲートＤＮＡは、高分子化合物のため、キャピラリー内で移動し難くなる性質を持つ。このコンジュゲートＤＮＡを電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填し、陰極側から一本鎖のサンプルＤＮＡを注入して電圧を印加する。その際に、コンジュゲートＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡは、充填したコンジュゲートＤＮＡとの相互作用により泳動が妨げられる。このときＳＮＰをもったサンプルＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡとでコンジュゲートＤＮＡとのハイブリダイゼーションにおける親和性の差を電気泳動の移動度で比較することにより、ＳＮＰを持つＤＮＡを明瞭に識別出来る（例えば非特許文献１を参照。）。
【０００５】
高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを用いて、サンプルＤＮＡのＳＮＰを判別するときは、サンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡを結合（以下、ハイブリという）させるために一本鎖の状態にする。サンプルＤＮＡは生体試料からゲノムＤＮＡを抽出し、蛍光色素を標識したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した後、一本鎖に変性する（サンプルＤＮＡ調整と呼ぶ。）。調整したサンプルＤＮＡをコンジュゲートＤＮＡが充填されたキャピラリー管内に注入し、電気泳動により増幅されたＰＣＲ産物を検出部で光学的に検出するが、キャピラリー管内でサンプルＤＮＡがＰＣＲ産物を変性して相補鎖とサンプルＤＮＡが再結合して二本鎖に戻ることがあった。この状態で、電気泳動を行うと、コンジュゲートＤＮＡに結合しない非結合型ＤＮＡ、二本鎖に再結合した二本鎖になった再結合ＤＮＡ、コンジュゲートＤＮＡに結合する結合型ＤＮＡの順番でピークが検出される。再結合ＤＮＡのピークは条件により非結合型あるいは結合型ＤＮＡのピークのいずれかと重なるので、ピーク面積から定量分析する場合には、正確な定量が出来ない。そこで、再結合ＤＮＡを抑制するために、キャピラリー管内に相補鎖除去用のコンジュゲートＤＮＡを用いる方法が用いられている（例えば特許文献１を参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５７号公報
【非特許文献１】Detection of single-base mutation by affinity capillary electrophoresis using a DNA-polyacrylamide conjugate; Kae Sato, Akira Inoue, Kazuo Hosokawa, Mizuo Maeda; Electrophoresis 2005, (26) 3076-3080
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再結合ＤＮＡは、サンプルＤＮＡがキャピラリー管内を電気泳動中に起こるだけでなく、サンプルＤＮＡの調整段階でも変性したサンプルＤＮＡの一部により生じる。前記従来の方法ではこのサンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡを抑制することができないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記課題に檻みてなされたものであり、サンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡの抑制を行い、精度の高いＤＮＡ解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために本発明のＤＮＡ解析方法は、標識剤により修飾された第１の一本鎖ＤＮＡを含む第１の二本鎖ＤＮＡ及び／または標識剤により修飾された前記第1のＤＮＡに対して１塩基以上配列の異なる第２の一本鎖ＤＮＡを含む第２の二本鎖ＤＮＡとからなる試料ＤＮＡを作製する調整ステップと、前記第１及び／または第２の一本鎖ＤＮＡと同一の塩基配列を持つ各々第１及び／又は第２のコンペティションＤＮＡの量を各々前記試料ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡのモル数よりも多く加えて混合する混合ステップと、前記混合ステップにより得られた混合液に変性剤を加えた後に所定の値で加熱する加熱ステップと、前記第１の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列をもつプローブＤＮＡにその電気泳動を遅らせる電気非泳動物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、前記加熱ステップを通した後のＤＮＡ変性液と前記コンジュゲートＤＮＡとを用いて電気泳動させることにより前記第１あるいは第２の一本鎖ＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップとから成ることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
サンプルＤＮＡ調整時に生じる再結合ＤＮＡを抑制することで、ノイズとなるピークの発生を抑え、非結合型ＤＮＡのピークと結合型ＤＮＡのピークを独立して計測でき、定量測定を行うことが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明のＤＮＡ解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
(実施の形態１)
図１を用いて本発明のコンペティションＤＮＡとコンペティションＤＮＡを用いた再結合ＤＮＡ防止の方法を説明する。
【００１１】
＜調製ステップ＞
まず本発明の実施の形態１における試料ＤＮＡを作製する調製ステップの詳細を説明する。本実施の形態１で解析する試料ＤＮＡは、植物、動物、または人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型にＰＣＲや大腸菌を使い既知のＰＣＲ法によって増幅する。ＰＣＲ産物である試料ＤＮＡは、次ステップでの一本鎖変性時に絡み合わないような長さが良く、両末端に結合するプライマーＤＮＡの長さを考慮すると４０ｂｐから２００ｂｐ程度が好ましい。
【００１２】
図１に示す２０１は第１のサンプルＤＮＡ、２０２はＳＮＰを含む第２のサンプルＤＮＡである。本実施例では、第１および第２のサンプルＤＮＡの長さ（塩基数）を４０塩基、ＧＣ含量が５０％であるのものを用いた。また、ＰＣＲを行うフォワード側のプライマーＤＮＡには５'末端に蛍光標識の標識剤Ｃｙ５が付加されたものを使用したので、ＰＣＲでＤＮＡを増幅した際、片方の鎖の５’末端に標識剤Ｃｙ５が結合したＰＣＲ産物２２１及び２２２が作製される。このＰＣＲ産物は第１のサンプルＤＮＡ２０１からなる第１のＰＣＲ産物２２１とＳＮＰを含む第２のサンプルＤＮＡ２０２からなる第２のＰＣＲ産物２２２の両方もしくはどちらか一方を含んでいる。
【００１３】
＜混合ステップ＞
次に混合ステップの詳細を説明する。まず、本発明の第１のコンペティションＤＮＡ２３１と第２のコンペティションＤＮＡ２３２の詳細を説明する。なお、第１のコンペティションＤＮＡ２３１は、第１のサンプルＤＮＡ２０１と同じ塩基配列を持ち、第２のコンペティションＤＮＡ２３２は第２のサンプルＤＮＡ２０２と同じ塩基配列を持つ。なお、図１中の２５１及び２５２は、それぞれ第１及び第２のサンプルＤＮＡに対する相補鎖ＤＮＡである。また、第１および第２のコンペティションＤＮＡは、それぞれ第１及び第２のサンプルＤＮＡの配列を元に作るので、第１および第２のコンペティションＤＮＡの長さは、元となる第１及び第２のサンプルＤＮＡの長さよりも長くならない。まず、第１のコンペティションＤＮＡ２３１の作製について以下に説明する。
【００１４】
先に説明した通り、第１のサンプルＤＮＡが４０塩基でＧＣ含量が５０％なので、ＡとＴの塩基は水素結合が２本、ＧとＣの塩基は水素結合が３本となる。そのため、第１のサンプルＤＮＡ２０１と相補鎖ＤＮＡ２５１との結合強度は、｛（２（ＡＴの水素結合）×２０塩基）＋（３（ＧＣの水素結合）×２０塩基）｝×１（モル数）＝１００となる。ここで、第１のコンペティションＤＮＡ２３１の長さを第１のサンプルＤＮＡ２０１の長さより３０塩基短い１０塩基でＧＣ含量が５０％でありモル数が第１のサンプルＤＮＡ２０１の５倍とすると、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第１のコンペティションＤＮＡ２３１との結合強度は、｛（２（ＡＴの水素結合）×５塩基）＋（３（ＧＣの水素結合）×５塩基）｝×５（モル数）＝１２５となる。すなわち、相補鎖ＤＮＡ２５１は第１のサンプルＤＮＡ２０１よりも、第１のコンペティションＤＮＡ２３１と優先的に結合することができる。
【００１５】
第１のコンペティションＤＮＡ２３１の長さを３０塩基以上短くした場合は、このような相補鎖ＤＮＡ２５１との優先的結合が生じない。例えば、第１のサンプルＤＮＡの条件を同一にして第１のコンペティションＤＮＡ２３１の長さを８塩基にした場合は結合強度は１００となり、第１のサンプルＤＮＡの結合強度と同等となり、相補鎖ＤＮＡ２５１との優先的結合は生じないので好ましくない。また、第１のコンペティションＤＮＡの長さ（塩基数）の上限は第１のサンプルＤＮＡの長さ（塩基数）と同一になる。
【００１６】
次に、第１のコンペティションＤＮＡ２３１のモル数が第１のサンプルＤＮＡ２０１とのモル数よりも十分大きいことが重要である。仮に、第１のコンペティションＤＮＡのモル数を下げて第１のサンプルＤＮＡのモル数に対し４倍とすると、相補鎖ＤＮＡ２５１と第１のコンペティションＤＮＡ２３１との結合強度は８０に低下し、相補鎖ＤＮＡ２５１は第１のサンプルＤＮＡ２０１と結合して再結合ＤＮＡを生じる確率が増大するので、好ましくない。
【００１７】
以上、第１のコンペティションＤＮＡ２３１についてその詳細を説明したが、第２のコンペティションＤＮＡ２３２についても同様であるので割愛する。
【００１８】
以上のようにして本実施例では、第１のコンペティションＤＮＡ２３１と第２のコンペティションＤＮＡ２３２を作製し、第１と第２のＰＣＲ産物に加えて混合液を作製した。
【００１９】
＜加熱ステップ＞
上述の混合ステップにて作製された混合液に、変性剤としてＰＣＲ産物に対して１０倍量の体積のホルムアミドまたは終濃度０．３〜７Ｍの尿素を加える。ホルムアミドが１０倍以下の場合、ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡにする処理が不十分であることがあり、好ましくない。１０倍以上だとサンプルの濃度が薄まってしまい、光学的な検出が困難となり、好ましくない。また、尿素が０．３Ｍ以下だと変性処理が不十分であり、７Ｍ以上だと高濃度の尿素を調整することが難しく、好ましくない。
【００２０】
上記の変性剤が加えられた混合溶液を９５℃で１〜１０分間、熱した後、急冷してＤＮＡ変性液を作製した。この変性液中には、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第１のサンプルＤＮＡの相補鎖２５１と第２のサンプルＤＮＡ２０２と第２のサンプルＤＮＡの相補鎖２５２の全てあるいはいずれか含んでいる。上述の混合ステップで説明した通り、この変性液中には、第１のコンペティションＤＮＡ２３１もしくは第２のコンペティションＤＮＡ２３２は、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２よりも大量に含まれているので、第１あるいは第２のコンペティションＤＮＡは、それぞれ第１あるいは第２の相補鎖と優先的に結合するので、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２は一本鎖の状態で存在することができる。
【００２１】
＜コンジュゲートＤＮＡ作製ステップ＞
次にコンジュゲートＤＮＡの作製について詳細に説明する。図２にコンジュゲートＤＮＡ２１０の構造を示す。図中の２０３はサンプルＤＮＡであり、第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２とを含んでいる。本実施例では、第１のサンプルＤＮＡ２０１に特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡの作製方法を示すが、第２のサンプルＤＮＡ２０２に特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡの作製も同様に方法で行うことが出来る。
【００２２】
さて、生体のＤＮＡと特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡのプローブＤＮＡ２１２の配列は、本実施例では第１のサンプルＤＮＡ２０１に結合する配列を用いる。このプローブＤＮＡに電気非泳動物質２１１を結合させることにより、第１のサンプルＤＮＡ２０１に特異的に結合するコンジュゲートＤＮＡが作製できる。ここで、
電気非泳動物質２１１は電気泳動時のサンプルＤＮＡの速度に対して遅い速度で電気泳動する物質で構成されるものであり、電荷を持たず、また高分子物質であれば良い。例えば一般的に使用されるリニアポリマーである、アクリルアミドやポリエチレングリコールが挙げられる。またマイクロビーズとしてはガラスビーズや磁気ビーズなどが挙げられる。そして前記プローブＤＮＡ２１２はサンプルＤＮＡのＳＮＰ部位を含む一部の配列に対して相補的な配列であれば良く、６塩基以上１８塩基以下の長さで任意の塩基配列を設定する。プローブＤＮＡが５塩基以下の場合、サンプルＤＮＡとの結合能力が不十分でなく、１８塩基以上の場合、サンプルＤＮＡとの結合力が強すぎて、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡの両方と非特異的に結合する場合があり、好ましくない。
【００２３】
＜測定ステップ＞
続いて、キャピラリー電気泳動装置を用いて行う測定ステップを説明する。図３に本実施例で用いたキャピラリー電気泳動装置の構成を示す。主な構成は、正電極１３３を配置した第１容器１３１と負電極１３４を配置した第２容器１３２との間に密閉流路１３０で介しており、この密閉流路１３０にコンジュゲートＤＮＡを充填した後、測定すべきサンプルＤＮＡを第２容器１３２側の密閉流路１３０に入れて電気泳動のための電圧を可変電源部１３６により正電極１３３と負電極１３４とに与える。サンプルＤＮＡに標識された蛍光色素による蛍光を検出部１５０で測定することにより、サンプルＤＮＡの蛍光強度を測定する。検出部１５０はスリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３でレーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、蛍光色素から発生した６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む仕様になっている。
【００２４】
さて、密閉流路１３０はコーティングされた内径５０〜１００μｍのキャピラリー管やマイクロプレート上に微細加工で溝加工されている。図４に、本実施例で用いたキャピラリー管内部を示す。本実施例では、２５ｃｍのキャピラリー管を使用した。１１は緩衝液である。密閉流路１３０の内部にコンジュゲートＤＮＡ２１０を充填した後、密閉流路１３０の一端に変性した試料ＤＮＡ２００を注入する。ここで、コンジュゲートＤＮＡ２１０の濃度は試料ＤＮＡ２００の濃度に対して１０〜６００倍とするのが好ましい。１０倍以下だとサンプルＤＮＡがコンジュゲートＤＮＡと十分に結合出来なくなり、６００倍以上であれば高濃度プローブが必要になるので高価なコンジュゲートの作製が必要となる。
【００２５】
この後、図３に示すように、密閉流路１３０の両端を第１容器１３１及び第２容器１３２に入れ緩衝液１１で満たし電気泳動を行う。本実施例のキャピラリー管を使用した場合には、可変電源部１３５より６ｋＶの電圧を印加し、およそ３〜１６μＡの電流を流して試料ＤＮＡ２００の電気泳動を行った。
【００２６】
次に、電気泳動中の試料ＤＮＡ２００の測定手法を示す。フォワード側の５'末端に標識された蛍光色素Ｃｙ５に、検出部１５０内部のレーザー１５１（６３０ｎｍ）を照射して６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出する。試料ＤＮＡ２００に電気泳動を行うことにより、最初に余剰のプライマーＤＮＡに標識された蛍光色素のピークが検出され、その次にコンジュゲートＤＮＡ２１０に結合しない第２のサンプルＤＮＡ２０２のピークが検出され、最後にコンジュゲートＤＮＡ２１０に結合する第１のサンプルＤＮＡ２０１のピークが検出される。このピークの状態を観測することで試料ＤＮＡ２００のＤＮＡ分析が出来る。
【００２７】
以下、具体的な条件や試料を示して本発明の実施の形態をより詳細に説明するが、本発明はこれに記載した試料ＤＮＡや調製条件その他に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１の作製）
〔ＰＣＲ産物の調整〕
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５’−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３’（フォワードプライマー、配列表２）を、リバース側のプライマーは５’−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３’（リバースプライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように加えた。反応サイクルは以下のとおりである。９５℃―１０分、（９５℃ー３０秒、５５℃―３０秒、７２℃―３０秒）３０サイクル、７２℃―５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００２９】
〔ＰＣＲ産物の変性〕
ＰＣＲ産物を２μｌと変性剤としてホルムアミドを４０μｌ、第１のコンペティションＤＮＡ（配列表４）と第２のコンペティションＤＮＡ（配列表５）とを各々１００μＭに調整したものを1μｌずつ加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷した。
【００３０】
〔緩衝液の調整〕
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）を終濃度５０ｍＭで使用した。
【００３１】
〔コンジュゲートＤＮＡの作製〕
第1のサンプルＤＮＡに相補的な配列をもつアミノ化ＤＮＡを１ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７．４）を加えて調整した。アミノ化ＤＮＡの配列は５’−ＡＣＣＡＧＣ−３’（配列表１）である。分子量２０，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５μｌ加え、撹拌した。溶かしたＰＥＧ−ＮＨＳにアミノ化ＤＮＡを５０μｌと１Ｍの炭酸水素ナトリウムを５μｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲートＤＮＡ２１０は１００μＭになるように緩衝液で溶かした。
【００３２】
〔キャピラリー電気泳動装置によるＳＮＰ測定〕
前述した図３に示すキャピラリー電気泳動装置にてＳＮＰの測定を行った。前記密閉流路１３０はコーティングされた内径１００μｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。そして、緩衝液１１を含むコンジュゲートＤＮＡを充たした密閉流路１３０に、図４に示すように試料ＤＮＡ２００を注入する。そしてこの後、両電極１３３，１３４間に可変電源部１３５により６ｋＶの電圧を印加して、密閉流路１３０内の試料ＤＮＡ２００を電気泳動させ、該試料ＤＮＡ２００中の第１のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２それぞれの、前記コンジュゲートＤＮＡ２１０に対する親和性の差によって、該試料ＤＮＡ２００を分離する。なお、検出部１５０において、前述したように、プライマーＤＮＡに蛍光色素を標識して、該蛍光色素から発せられる蛍光だけを検出するようにしておけば、前記第１のサンプルＤＮＡ２０１と前記第２のサンプルＤＮＡ２０２のみを検出することができる。
【００３３】
検出部では、スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記レーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、サンプルＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。
【００３４】
第１のサンプルＤＮＡ２０１に相補的な配列を持つコンジュゲートＤＮＡ２１０を用いてキャピラリー電気泳動装置で測定した結果、フォワード側のプライマーが検出された後、第２のサンプルＤＮＡ２０２、そして第１のサンプルＤＮＡ２０１の順番でピークを検出した。この結果を図５に示す。
【００３５】
（比較例の作製）
比較例として、従来のサンプルＤＮＡ調整法により作製された試料ＤＮＡを用いた。これは、実施例１と同一のサンプルＤＮＡに蛍光標識されたＰＣＲ産物に１０倍量の体積の変性剤を加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷し、一本鎖ＤＮＡを得たものである。測定装置も実施例１と同一のものを用いて測定した。その結果を図６に示す。
【００３６】
（実施例１と比較例との蛍光スペクトルの対比）
図５に示すように、実施例１では、時間の早い方から、プライマーのピーク、非結合型ＤＮＡである第２のサンプルＤＮＡ２０２のピーク、結合型ＤＮＡである第１のサンプルＤＮＡ２０１のピークが検出されている。ところが、従来法で見られる二本鎖ＤＮＡのピークはバックグランドノイズに近いレベルまで減少している。一方、比較例での測定結果である図６では、非結合型ＤＮＡと結合型ＤＮＡのピークとの間に二本鎖ＤＮＡによる大きなピークが生じている。この結果から明らかなように、本発明によるコンペティションＤＮＡの長さをサンプルＤＮＡに対して調製し、且つサンプルＤＮＡに対して過剰に投与することで、従来、ＤＮＡ解析の際の課題となっていた二本鎖ＤＮＡを大幅に抑制することが出来る。
【００３７】
以上、説明したように、本発明による遺伝子解析法を用いてＳＮＰ解析を行えば、再結合ＤＮＡのピークを除去でき、第1のサンプルＤＮＡ２０１と第２のサンプルＤＮＡ２０２の定量性を精度よく測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明にかかるＤＮＡ解析方法は、ＳＮＰ測定においてノイズピークとなる再結合ＤＮＡの形成を防止してピークの定量性や感度を向上させることが出来るので精度の高い遺伝子解析手法や装置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施の形態１におけるサンプル調整の方法を示す図
【図２】コンジュゲートＤＮＡを示す図
【図３】キャピラリー電気泳動装置の構成を示す図
【図４】キャピラリー電気泳動装置でのキャピラリー管内を示す図
【図５】本実施の形態１の方法を適用した時の試料ＤＮＡ（実施例１）を測定したときに検出される波形を示したグラフ
【図６】従来の方法で調整した試料ＤＮＡ（比較例）を測定したときに検出される波形を示したグラフ
【符号の説明】
【００４０】
１１ 緩衝液
２１０ コンジュゲートＤＮＡ
１３０ 密閉流路
１３１ 第１の容器
１３２ 第２の容器
１３３ 正電極
１３４ 負電極
１３５ 可変電源部
１４０ 制御部
１５０ 検出部
１５１ レーザー
１５２ スリット
１５３ フィルター
１５４ フォトマルチプライヤー
１５５ プリアンプ
１５６ Ａ／Ｄコンバータ
２００ 試料ＤＮＡ
２０１ 第１サンプルＤＮＡ
２０２ 第２サンプルＤＮＡ
２０３ サンプルＤＮＡ
２１０ コンジュゲートＤＮＡ
２１１ 電気非泳動物質
２１２ プローブＤＮＡ
２２１ 第１のサンプルＤＮＡからなるＰＣＲ産物
２２２ 第２のサンプルＤＮＡからなるＰＣＲ産物
２３０ コンペティションＤＮＡ
２３１ 第１コンペティションＤＮＡ
２３２ 第２コンペティションＤＮＡ
２４１ 第１コンペティションＤＮＡと結合した二本鎖
２４２ 第２コンペティションＤＮＡと結合した二本鎖
２５１ 第１サンプルＤＮＡの相補鎖
２５２ 第２サンプルＤＮＡの相補鎖
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識剤により修飾された第１の一本鎖ＤＮＡを含む第１の二本鎖ＤＮＡ及び／または標識剤により修飾された前記第1のＤＮＡに対して１塩基以上配列の異なる第２の一本鎖ＤＮＡを含む第２の二本鎖ＤＮＡとからなる試料ＤＮＡを作製する調整ステップと、
前記第１及び／または第２の一本鎖ＤＮＡと同一の塩基配列を持つ各々第１及び／又は第２のコンペティションＤＮＡの量を各々前記試料ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡのモル数よりも多く加えて混合する混合ステップと、
前記混合ステップにより得られた混合液に変性剤を加えた後に所定の値で加熱する加熱ステップと、
前記第１の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列をもつプローブＤＮＡにその電気泳動を遅らせる電気非泳動物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、
前記加熱ステップを通した後のＤＮＡ変性液と前記コンジュゲートＤＮＡとを用いて電気泳動させることにより前記第１あるいは第２の一本鎖ＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップと、を含むＤＮＡ解析方法。
【請求項２】
前記第１の一本鎖ＤＮＡの長さをａ、前記第２の一本鎖ＤＮＡの長さをｂ、前記第１のコンペティションＤＮＡの長さをｃ、前記第２のコンペティションＤＮＡの長さをｄとすると、前記ａ、ｂ、ｃ及びｄは、以下の式を満たす請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
ａ−３０≦ｃ≦ａ， ａ≧４０
ｂ−３０≦ｄ≦ｂ， ｂ≧４０
【請求項３】
前記第１のコンペティションＤＮＡまたは前記第２のコンペティションＤＮＡのモル数は第一と第二の二本鎖ＤＮＡに対して５倍以上である請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項４】
前記測定ステップは、さらに前記コンジュゲートＤＮＡを密閉流路に充填する充填ステップと、
前記加熱ステップによって得られたＤＮＡ変性液を前記密閉流路に注入する注入ステップと、
前記密閉流路中で前記混合液を前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとを分離するために電気泳動させる分離ステップと、
前記密閉流路上に備えた検出部によって前記第1の一本鎖ＤＮＡの標識剤もしくは前記第２の一本鎖ＤＮＡの標識剤の少なくとも一つを検知する検知ステップと、を含む請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項５】
前記プローブＤＮＡが６塩基以上１８塩基以下である請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項６】
前記充填ステップにおいて用いられる緩衝液は、トリスボレート緩衝液（ＴＢ緩衝液）、トリス塩酸緩衝液、トリスアセテートエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＡＥ緩衝液）もしくは、トリスボレートエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＢＥ緩衝液）のいずれかである請求項４記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項７】
前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作られたリニアポリマーである請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項８】
前記電気非泳動物質は、マイクロビーズである請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項９】
前記マイクロビーズは磁性体、二酸化ケイ素、もしくはポリスチレンのいずれかを有する請求項８記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項１】
標識剤により修飾された第１の一本鎖ＤＮＡを含む第１の二本鎖ＤＮＡ及び／または標識剤により修飾された前記第1のＤＮＡに対して１塩基以上配列の異なる第２の一本鎖ＤＮＡを含む第２の二本鎖ＤＮＡとからなる試料ＤＮＡを作製する調整ステップと、
前記第１及び／または第２の一本鎖ＤＮＡと同一の塩基配列を持つ各々第１及び／又は第２のコンペティションＤＮＡの量を各々前記試料ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡのモル数よりも多く加えて混合する混合ステップと、
前記混合ステップにより得られた混合液に変性剤を加えた後に所定の値で加熱する加熱ステップと、
前記第１の一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列をもつプローブＤＮＡにその電気泳動を遅らせる電気非泳動物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、
前記加熱ステップを通した後のＤＮＡ変性液と前記コンジュゲートＤＮＡとを用いて電気泳動させることにより前記第１あるいは第２の一本鎖ＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップと、を含むＤＮＡ解析方法。
【請求項２】
前記第１の一本鎖ＤＮＡの長さをａ、前記第２の一本鎖ＤＮＡの長さをｂ、前記第１のコンペティションＤＮＡの長さをｃ、前記第２のコンペティションＤＮＡの長さをｄとすると、前記ａ、ｂ、ｃ及びｄは、以下の式を満たす請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
ａ−３０≦ｃ≦ａ， ａ≧４０
ｂ−３０≦ｄ≦ｂ， ｂ≧４０
【請求項３】
前記第１のコンペティションＤＮＡまたは前記第２のコンペティションＤＮＡのモル数は第一と第二の二本鎖ＤＮＡに対して５倍以上である請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項４】
前記測定ステップは、さらに前記コンジュゲートＤＮＡを密閉流路に充填する充填ステップと、
前記加熱ステップによって得られたＤＮＡ変性液を前記密閉流路に注入する注入ステップと、
前記密閉流路中で前記混合液を前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとを分離するために電気泳動させる分離ステップと、
前記密閉流路上に備えた検出部によって前記第1の一本鎖ＤＮＡの標識剤もしくは前記第２の一本鎖ＤＮＡの標識剤の少なくとも一つを検知する検知ステップと、を含む請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項５】
前記プローブＤＮＡが６塩基以上１８塩基以下である請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項６】
前記充填ステップにおいて用いられる緩衝液は、トリスボレート緩衝液（ＴＢ緩衝液）、トリス塩酸緩衝液、トリスアセテートエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＡＥ緩衝液）もしくは、トリスボレートエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＢＥ緩衝液）のいずれかである請求項４記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項７】
前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作られたリニアポリマーである請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項８】
前記電気非泳動物質は、マイクロビーズである請求項１記載のＤＮＡ解析方法。
【請求項９】
前記マイクロビーズは磁性体、二酸化ケイ素、もしくはポリスチレンのいずれかを有する請求項８記載のＤＮＡ解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１１２４１（Ｐ２００９−１１２４１Ａ）
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７６９１７（Ｐ２００７−１７６９１７）
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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