ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ変異
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＫＲＡＳにおける変異ならびに上記変異を検出するための方法ならびに化学療法および／またはキナーゼ阻害剤治療等の抗癌療法に対して感受性である腫瘍を同定するための予後予測方法に関する。この方法は、腫瘍試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子もしくは変異ＥＧＦＲタンパク質および／または変異ＫＲＡＳ遺伝子もしくは変異ＫＲＡＳタンパク質の存在を決定することを含む。この変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１に位置し、それによって、変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在は、腫瘍が治療に対して感受性であることを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、癌診断法および癌療法ならびに、特に、特徴および／または予後兆候となる変異の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、成長因子受容体の１型チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、これら成長因子受容体は、細胞の成長、分化、および生存に重要な役割を果たしている。これらの受容体の活性化は、通常、特異的なリガンド結合を介して起こり、受容体ファミリーメンバー間でのヘテロ二量体化またはホモ二量体化をもたらし、続いて、チロシンキナーゼドメインが自己リン酸化する。この活性化は、細胞の増殖（ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼ経路）および生存（ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路）の両方に関係がある細胞内シグナル伝達経路のカスケードを引き起こす。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を含むこのファミリーのメンバーは細胞形質転換に直接関連した。
【０００３】
多くのヒト悪性腫瘍は、ＥＧＦＲの異常もしくは過剰発現および／またはその特異的なリガンド、たとえば形質転換成長因子αの過剰発現に関連する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ＥＧＦＲ過剰発現は、ＮＳＣＬＣを含む多くのヒト癌における有害な予後と関連した。いくつかの事例では、腫瘍ＥＧＦＲの過剰発現は、化学療法抵抗性および予後不良の両方と関連した。（非特許文献４；非特許文献５）。これらの観察は、ＥＧＦＲ受容体の活性化および続く下流のシグナル伝達を有効に阻害する作用物質がＮＳＣＬＣを含む様々なヒト癌における臨床活性を有するかもしれないということ示唆する。
【０００４】
キナゾリン誘導体であるＴａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブとしても知られている；ＯＳＩ−７７４）は、経口的に活性な、効力のある、選択的なＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤である。エルロチニブは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイにおいて２ｎＭ（０．７８６ｍｇ／ｍＬ）のＩＣ５０でヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する。この阻害は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対して選択的であり、Ｇ１での細胞周期停止をもたらし、可逆的である。マウスにおけるエルロチニブの経口投与により、ヒト異種移植片におけるＥＧＦＲ自己リン酸化が＞７０％低下することが実証され、ヌードマウスにおけるＨＮ５異種移植片およびＡ４３１異種移植片の著しい成長阻害が実証された。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系における単一作用物質の活性の他に、可能性として考えられる相互作用を決定するために多くの化学療法の作用物質と組み合わせてエルロチニブを評価した。エルロチニブならびにパクリタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、およびドキソルビシンの間に付加的な相互作用があった。
【０００５】
肺癌は、米国の男性および女性の両者にとっての癌関連死の主な原因である。２０００年には、１６４，０００例の新たな症例が診断され、１５７，０００人の患者がこの疾患で死ぬであろうと推定された（非特許文献６）。これらの患者の約７５％が非小細胞の組織像を有し、その大多数が、手術不能な第ＩＩＩＢ期または第ＩＶ期の疾患を示していたであろう。より限局性の疾患を提示時に有するそれらの患者（第Ｉ期〜ＩＩＩＡ期）については、アジュバント化学療法もしくはネオアジュバント化学療法および／またはアジュバント放射線療法もしくはネオアジュバント放射線療法を伴うまたは伴わない標準的な手術療法後の再発が一般的である。これらの発見は、〜１２％の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における最大５年の生存をもたらし、この疾患における未だ対処されていない医療の必要性を強調するのに役立っている。
【０００６】
白金化合物であるシスプラチンは、局所進行ＮＳＣＬＣまたは転移ＮＳＣＬＣの処置における臨床的有用性を示した最初の化学療法作用物質であった。無作為臨床試験は、最善の支持療法（Ｒａｐｐら１９８８年）と比較して、反応率、生存の質、および生存が改善されたことを実証した。しかしながら、この改善の大きさは中程度であり、数週間に限られた。その後、多くのより新しい化学療法作用物質を、単一の作用物質としておよび第１選択の状況で白金塩と組み合わせて評価した。これらの研究からの結論として、その最新の「二重」化学療法は、１５％〜２０％の反応率、３〜４か月の疾患進行の期間の中央値、および７〜８か月の生存の中央値を達成しているように思われる。シスプラチンで得られた結果に関した併用療法での効力における中程度の改善により、これらの療法が、進行ＮＳＣＬＣおよび良好な全身状態を有する患者に対する医療の標準として確立された（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【非特許文献１】Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ １９９１年，４７：８７〜９８頁
【非特許文献２】ＭｏｄｉｊｔａｈｅｄｉおよびＤｅａｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ １９９４年，４：２７７〜９６頁
【非特許文献３】Ｓａｌｏｍｏｎら，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９５年；１９：１８３〜２３２頁
【非特許文献４】Ｌｅｉら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９年；１９：２２１〜８頁
【非特許文献５】Ｖｅａｌｅら，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９３年；６８：１６２〜５頁
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎｌｅｅら，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２００１年，５１：１５〜３６頁
【非特許文献７】Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ， Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ １９９５年，３１１：８９９〜９０９頁
【非特許文献８】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９７年，１５：２９９６〜３０１８頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の態様によれば、治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、上述の腫瘍の試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上述の変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１に位置し、それによって、変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在は、腫瘍が治療に対して感受性であることを示す方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の態様では、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、上述の腫瘍におけるＥＧＦＲ変異の存在を同定することおよび抗癌剤で上述の哺乳動物を治療することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の他の態様では、試料におけるＥＧＦＲ変異を同定するための方法であって、上述の試料からの核酸を、変異ＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸または変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズすることができるプローブと接触させることおよびハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様では、変異ＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸または変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを提供する。
【００１１】
本発明の他の態様では、試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子を検出するための方法であって、上述のＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する上述の試料の核酸または変異を含むと思われるその断片から増幅することおよび増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野性型ＥＧＦＲ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の態様では、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）上述の腫瘍の試料における野性型ＫＲＡＳタンパク質または野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、野性型ＫＲＡＳタンパク質または野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示す、または（ｉｉ）上述の腫瘍の試料における変異ＫＲＡＳタンパク質または変異ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、変異ＫＲＡＳタンパク質または変異ＫＲＡＳ遺伝子の非存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示すことを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
腫瘍形成に関連する変異現象が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）で起こることは本発明の発見である。異常なＥＧＦＲ活性が様々な癌と関連していることが以前より知られていたが、ＥＧＦＲキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）における変異が存在し、いくつかの癌に関連する異常なシグナル伝達活性を引き起こすことは知られていなかった。驚いたことに、ＥＧＦＲ ＫＤＲ変異を有する腫瘍を患う患者は、野性型ＥＧＦＲを有する患者よりも良好な予後を有している。ＥＧＦＲ遺伝子のＫＤＲ変異は、挿入および欠失等の再配列ならびに点変異を含み得る。
【００１４】
トリビュート（Ｔｒｉｂｕｔｅ）と称される無作為二重盲検第ＩＩＩ相臨床試験に参加した約２５０人の患者からの試料を、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１で起きている変異について配列決定した。トリビュートは、米国における約１５０箇所の施設の、組織学的に確認したＮＳＣＬＣを有する、前に化学療法を受けたことがない１，０７９人の患者について、エルロチニブ＋化学療法（カルボプラチン／パクリタキセル）を化学療法のみと比較して調査した。患者は、パクリタキセル（２００ｍｇ／ｍ２、３時間、ｉ．ｖ．注入）、次に、エルロチニブありまたはなしで（経口で１００ｍｇ／日、耐性のある患者については１５０ｍｇ／日まで段階的に上昇）、カルボプラチン（ＡＵＣ＝６ｍｇ／ｍｌ×分、１５〜３０分間注入、カルバートの式を使用）を受けた。トリビュート試験から収集した約２５０人の患者からの腫瘍試料、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロック、または未染色スライドは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション後にＤＮＡ抽出したところ腫瘍細胞で豊富であった。エキソン１８〜２１をネステッドＰＣＲにより増幅し、蛍光ダイターミネーター化学を使用して各ＰＣＲ産物から双方向の配列を得た。配列決定から発見した変異を表１に示す。
【００１５】
【表１−１】
【００１６】
【表１−２】
変異に対するヌクレオチドの番号付けは図２ａ〜２ｄに示す参照配列に基づく。
【００１７】
ＥＧＦＲ変異および野性型ＥＧＦＲを有する腫瘍を有する患者の臨床結果を反応（完全＋部分）、利益（反応＋安定）、および進行に従って分析した。「完全反応」（ＣＲ）を、すべての標的病変の消失と定義し、「部分反応」（ＰＲ）を、ベースライン長径和を基準として、標的病変の最長径の和の少なくとも３０％の減少と定義し、「進行」（ＰＤ）を、治療の開始または１つまたは複数の新しい病変の出現から記録された最小の最長径の和を基準として、標的病変の最長径の和の少なくとも２０％の増加と定義し、「安定」（ＳＤ）を、治療の開始からの最小の最長径の和を基準として、部分反応とみなすには縮小が十分ではなく、進行とみなすには増加が十分ではないと定義する固形癌反応評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）という基準を使用して病変を評価した。
【００１８】
分析の結果を表２にまとめる。
【００１９】
【表２】
臨床結果の分析により、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１における変異を発現する腫瘍を有する患者は、野性型ＥＧＦＲを発現する腫瘍を有する患者よりも良好な予後を有していることが明らかにされた。変異体ＥＧＦＲ患者は、化学療法または化学療法およびエルロチニブで治療すると、より大きな反応率、利益率、および生存を示した。これらの結果は、エキソン１８〜２１のいずれかまたはすべてにおけるＥＧＦＲ変異を腫瘍が有している患者が、腫瘍が上記変異を有していない患者よりも、より良好な予後を有するというような結果を予測するのに有用である。
【００２０】
したがって、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定するための方法であって、上述の腫瘍の試料において、エキソン１８〜２１（またはエキソン１８〜２１に対応するアミノ酸配列）における１つまたは複数のＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の１つまたは複数のＥＧＦＲ変異の存在は、上述の１つまたは複数のＥＧＦＲ変異の非存在と比較して、より良好な予後を示す方法を提供する。「予後」により、反応および／または利益および／または生存が意味される。「ＥＧＦＲ変異」は、一方の対立遺伝子（ヘテロ接合）または両方の対立遺伝子（ホモ接合）に見つけられる、野性型ＥＧＦＲタンパク質または野性型ＥＧＦＲ核酸とそれぞれ異なるアミノ酸配列または核酸配列を意味し、体細胞系列または生殖細胞系列であってもよい。特定の実施形態では、上述の変異は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）中に見つけられる。他の特定の実施形態では、変異は、表１に示すように、アミノ酸の置換、欠失、または挿入である。一実施形態では、アミノ酸変異は１つまたは複数の次のものである：
【００２１】
【数１】
他の特定の実施形態では、変異は、表１に示すように、核酸の点変異、欠失、または挿入である。一実施形態では、核酸変異は１つまたは複数の次のものである。
【００２２】
【数２】
エルロチニブでの治療に対する抵抗性を示したＨ１９７５腫瘍細胞株からのＥＧＦＲエキソン１８〜２１を配列決定し、Ｌ８５８Ｒ変異と組み合わさった変異Ｔ７９０Ｍを含むことがわかった。したがって、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定するための方法であって、上述の腫瘍の試料において、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述のＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在は、上述のＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の非存在と比較して、より不良な予後を示す方法をさらに提供する。さらに、化学療法と組み合わせても組み合わせなくてもエルロチニブまたはゲフィチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤の療法に対して反応性が低い腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、患者の腫瘍におけるＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の変異の存在は、患者が、上述のＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を有していない腫瘍を有する患者と比較して、上述の療法に対する反応が低いことを示す方法を提供する。さらに、化学療法と組み合わせても組み合わせなくてもキナーゼドメイン結合阻害剤（たとえばエルロチニブまたはゲフィチニブ）等のＥＧＦＲ阻害剤での治療に対する抵抗性のある腫瘍を同定するための方法であって、腫瘍の試料におけるＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の変異の存在は、腫瘍が、上述の治療に対して抵抗性があることを示す方法を提供する。変異の決定は、タンパク質レベルまたは核酸レベル（ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ）であり、本明細書中に記載される技術等の技術を使用して達成されることが理解される。特定の実施形態では、上述のＥＧＦＲ阻害剤はＥＧＦＲキナーゼドメインにおいてＡＴＰと競合する。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブである。
【００２３】
他の態様では、Ｔ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲタンパク質もしくはＥＧＦＲ遺伝子を含む腫瘍を有する患者を治療するための（またはＴ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲタンパク質もしくはＥＧＦＲ遺伝子を含む腫瘍を治療するための）方法であって、上述のＴ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲに結合するおよび／またはそのシグナル伝達を阻害する第１の化合物を、野性型ＥＧＦＲまたは活性化変異を含むＥＧＦＲに結合するおよび／またはそのシグナル伝達を阻害する第２の化合物と組み合わせて、上述の患者に同時投与すること（または上述の腫瘍と接触させること）を含む方法を提供する。特定の実施形態では、上述の活性化変異は、表１（Ｔ７９０Ｍ以外）に記載された１つまたは複数の活性化変異である。特定の実施形態では、上述の第１の化合物および第２の化合物は連続してまたは同時に投与される。特定の実施形態では、上述の第２の化合物はエルロチニブである。
【００２４】
本発明の他の態様では、Ｔ７９０Ｍ変異を含む変異体ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、リン酸化基質およびＡＴＰの存在下で上述の変異体ＥＧＦＲを試験化合物と接触させることおよび上述の基質のリン酸化の量の変化を検出することを含み、それによって、対照と比較したまたは試験化合物非存在下での基質のリン酸化と比較した上述の基質のリン酸化の低下は、上述の試験化合物が、変異体ＥＧＦＲのシグナル伝達の阻害剤であることを示す方法を提供する。一実施形態では、上述の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＥＧＦまたはＴＧＦ−アルファ等の上述の変異体ＥＧＦＲに対するリガンドの存在下で行われる。
【００２５】
特定の実施形態では、試験化合物の阻害活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、外来基質（たとえば、Ｌｙｓ３−ガストリンまたはポリＧｌｕＴｙｒ（４：１）ランダム共重合体）（Ｉ． Ｐｏｓｎｅｒら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７（２９），２０６３８〜４７頁（１９９２））の上皮成長因子受容体キナーゼによるチロシンに対するリン酸化の試験化合物による阻害の対照に対する量により決定することができる。精製した可溶性ヒトＴ７９０Ｍ変異体ＥＧＦＲ（９６ｎｇ）を、微量遠心チューブ中で、リン酸化バッファー＋バナジン酸（ＰＢＶ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４；１２５ｍＭ ＮａＣｌ；２４ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００μＭ オルトバナジン酸ナトリウム）中のＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ）と共に全容量１０μｌで２０〜３０分間室温でプレインキュベートする。試験化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させ、ＰＢＶ中に希釈し、１０μｌを、変異体ＥＧＦＲ／ＥＧＦ混合物と混合し、１０〜３０分間３０℃でインキュベートする。リン酸化反応を、２０μｌ ３３Ｐ−ＡＴＰ／基質混合物（１２０μＭ Ｌｙｓ３−ガストリン（アミノ酸に対する単一文字コードでの配列、ＫＫＫＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＬＤＦ−配列番号３８）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、４０μＭ ＡＴＰ、２μＣｉ γ−［３３Ｐ］−ＡＴＰ）の変異体ＥＧＦＲ／ＥＧＦ混合物への添加により開始し、２０分間室温でインキュベートする。反応を、１０μｌ停止液（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８；２ｍＭ ＡＴＰ）および６μｌ ２Ｎ ＨＣｌの添加により停止する。チューブを、１４，０００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離する。各チューブからの上清３５μｌを２．５ｃｍの円のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｐ８１紙上にピペットで移し、１回の洗浄当たり１リットルの５％酢酸中で４回大量洗浄し、次いで風乾する。これは、洗浄で遊離ＡＴＰを失った紙への基質の結合をもたらす。取り込まれた［３３Ｐ］を、液体シンチレーションカウンターで測定する。基質（たとえばｌｙｓ３−ガストリン）非存在下での取り込みはバックグラウンドとしてすべての値から差し引き、試験化合物が存在しない対照に対して、阻害百分率を算出する。様々な用量の試験化合物で実行した上記アッセイにより、Ｔ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲキナーゼ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害についてのおおよそのＩＣ５０値の決定が可能になる。
【００２６】
本発明の他の態様では、治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、上述の腫瘍の試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上述の変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１に位置し、それによって、変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在は、腫瘍が抗癌剤での治療に対して感受性であることを示す方法を提供する。特定の実施形態では、抗癌剤は、細胞障害性または細胞増殖抑止剤であってもよい化学療法剤である。腫瘍は、神経芽細胞腫、直腸癌、結腸癌、家族性大腸腺腫症の癌、および遺伝性非ポリポーシス大腸癌等の腸癌、食道癌、唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、骨髄甲状腺癌、乳頭甲状腺癌、腎癌、腎実質癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛膜癌、膵癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、泌尿器癌、黒色腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、および末梢性神経外胚葉腫瘍等の脳腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、ユーイング肉腫、ならびに形質細胞腫を含む。特定の腫瘍は、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰、甲状腺、結腸直腸、食道、肝癌、肉腫、神経膠芽腫、頭頚部、白血病、およびリンパ性悪性腫瘍といった腫瘍を含む。
【００２７】
特定の化学療法剤は、（ｉ）シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウイリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、またはメトトレキサート等の代謝拮抗剤、（ｉｉ）ブレオマイシン等のＤＮＡ断片化剤、（ｉｉｉ）クロラムブチル、シスプラチン、シクロホスファミド、またはナイトロジェンマスタード等のＤＮＡ架橋剤、（ｉｖ）アドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロン等の挿入剤、（ｖ）Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、またはジフテリア毒素等のタンパク質合成阻害剤、（Ｖｉ）カンプトテシンまたはトポテカン等のトポイソメラーゼＩ毒、（ｖｉｉ）エトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド等のトポイソメラーゼＩＩ毒；（ｖｉｉｉ）コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、またはビンクリスチン等の微小管制御剤、（ｉｘ）フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ ５７１４８Ｂ）、またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）等のキナーゼ阻害剤、（ｘ）チオプラチン（ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）、ＰＳ−３４１、フェニル酪酸、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９、Ｌ−７４４８３２）等の様々な治験薬ならびにケルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、エピガロカテキンガレート、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸、およびそれらの誘導体等のポリフェノール、（ｘｉ）グルココルチコイドまたはフェンレチニド等のホルモン、ならびに（ｘｉｉ）タモキシフェン、フィナステリド、またはＬＨＲＨ拮抗剤等のホルモン拮抗剤を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、化学療法化合物は、１つまたは複数のゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン、ダウナルビシン（ｄａｕｎａｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリテキセル、タキソテール、およびマイトマイシンＣである。特定の実施形態では、化学療法化合物は、１つまたは複数のゲムシタビン、シスプラチン、およびパクリタキセルである。他の実施形態では、治療薬はＥＧＦＲの阻害剤である。一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｅｒｂｉｔｕｔｕｘ（商標）（セツキシマブ、イムクローン システムズ社（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．））およびＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ、アブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））等の抗体である。他の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブ、ＯＳＩファーマシューティカルズ社（ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、Ｉｒｅｓｓａ（商標）（ゲフィチニブ、アストラゼネカ社（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ））、Ｄｖｉｒら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１３：８５７〜８６５頁（１９９１年）により記載されるチロホスチン、米国特許第５６７９６８３号に開示される三環系ピリミジン化合物、およびＰａｎｅｋら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２８３，１４３３〜１４４４頁（１９９７年）に開示される化合物６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチルアイニノエトキシ）フェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−１）（６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−（２−ｄｉｅｔｈｙｌａｉｎｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）−８−ｍｅｔｈｙｌ−８Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ（２，３−ｄ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｏｎｅ）（ＰＤ１６６２８５として知られている）等のＡＴＰと競合する低分子である。
【００２８】
本発明の他の態様では、試料におけるＥＧＦＲ変異を同定するための方法であって、上述の試料からの核酸を、変異ＥＧＦＲタンパク質または変異を含むその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させることおよび上述のハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、上述のプローブを、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン蛍光等）、または色素剤等で検出可能に標識する。特定の実施形態では、プローブはアンチセンスオリゴマー、たとえばＰＮＡ、モルホリノホスホロアミダート、ＬＮＡ、または２’−アルコキシアルコキシである。プローブは、約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチドまたは約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドまたは約２０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドであってもよい。他の態様では、本発明の上述のプローブは、試料におけるＥＧＦＲ変異を同定するためのキットであって、上述のキットは、ＥＧＦＲ遺伝子における変異の部位に特異的にハイブリダイズするまたは特異的にハイブリダイズして近接するオリゴヌクレオチドを含むキットにおいて提供される。キットは、キットを使用したハイブリダイゼーション試験の結果に基づき、ＥＧＦＲ阻害剤で、ＥＧＦＲ変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための使用説明書をさらに含む。
【００２９】
本発明の他の態様では、試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子を検出するための方法であって、上述のＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する上述の試料の核酸またはエキソン１８〜２１または変異を含むと思われるそれらの断片から増幅することおよび増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野性型ＥＧＦＲ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法を提供する。移動度の差異は、増幅した核酸配列における変異の存在を示す。電気泳動移動度はポリアクリルアミドゲル上で決定してもよい。
【００３０】
あるいは、増幅したＥＧＦＲ遺伝子または核酸断片は、変異の検出のために、酵素による変異検出（ＥＭＤ）を使用して分析してもよい（Ｄｅｌ Ｔｉｔｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：７３１〜７３９頁，１９９８年）。ＥＭＤは、点変異、挿入、および欠失に起因する塩基対のミスマッチにより引き起こされる構造的な変形を検出し、切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンするバクテリオファージ リゾルベース Ｔ４ エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用する。リゾルベース切断により形成された２つの短い断片のたとえばゲル電気泳動による検出は変異の存在を示す。ＥＭＤ法の有用性は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされた点変異、欠失、および挿入を同定するための単一プロトコールであり、試料精製の必要性をなくし、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、シグナル対ノイズ比を上昇させる。正常なＤＮＡを２０倍超まで含む混合試料およびサイズが４ｋｂまでの断片をアッセイすることができる。しかしながら、ＥＭＤスキャニングは、変異陽性試料において起こる特定の塩基の変化を同定せず、必要であれば変異の識別に対するさらなる配列決定手順を必要とする。ＣＥＬ Ｉ酵素は、米国特許第５８６９２４５号で実証されるように、リゾルベース Ｔ４ エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様に使用することができる。
【００３１】
本発明のＥＧＦＲ変異を検出するための他の簡易なキットは、血色素症を引き起こすＨＦＥ遺伝子、ＴＦＲ２遺伝子、およびＦＰＮ１遺伝子における多重変異の検出のための血色素症ＳｔｒｉｐＡｓｓａｙ（商標）（ウィーンラボ社製（Ｖｉｅｎｎａｌａｂ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｍｂｕｒｇｈｍａｒｒｓｈ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／４２２０．ｐｄｆ）に類似する逆ハイブリダイゼーション試験ストリップである。上記アッセイは、ＰＣＲによる増幅後の配列特異的ハイブリダイゼーションに基づく。単一変異アッセイについては、マイクロプレートベースの検出システムを用いてもよいのに対して、多重変異アッセイについては、テストストリップを「マクロアレイ」として使用してもよい。キットは、試料の準備、増幅、および変異検出のための使用する準備ができている試薬を含んでいてもよい。多重増幅プロトコールは利便性を提供し、非常にわずかな容量の試料の試験を可能にする。簡単なＳｔｒｉｐＡｓｓａｙ方式を使用して、２０個以上の変異に対する試験を５時間未満で高価な装置なしで完了することが可能である。ＤＮＡを試料から単離し、ＥＧＦＲ遺伝子（またはエキソン１８〜２１またはＫＤＲまたはそれらのセグメント）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、好ましくは単一（「多重」）増幅反応で増幅し（たとえばＰＣＲ）、ビオチン標識する。ＰＣＲ産物は、プローブが平行なラインまたはバンドとして固定されたテストストリップ等の固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ（野性型および変異体特異的）に選択的にハイブリダイズする。結合したビオチン化単位複製配列を、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび発色基質を使用して検出する。上記アッセイは、表１の変異のすべてまたは任意のサブセットを検出することができる。特定の変異体プローブバンドに関して、３つのシグナルパターンのうちの１つが可能である：（ｉ）正常ＥＧＦＲを示す野性型プローブに対してのみのバンド（ｉｉ）ヘテロ接合遺伝子型を示す野性型および変異体プローブの両方に対するバンド（ｉｉｉ）ホモ接合変異体ＥＧＦＲ遺伝子型を示す変異体プローブに対してのみのバンド。したがって、本発明のＥＧＦＲ変異を検出するための方法であって、核酸を試料から単離すること、ＥＧＦＲ遺伝子またはその断片（たとえば、ＫＤＲまたはエキソン１８〜２１以下のもの）を、増幅した核酸がリガンドを含むように増幅すること、増幅したＥＧＦＲ遺伝子または断片を、リガンドに対する検出可能な結合パートナーを含むプローブと接触させること、プローブは、ＥＧＦＲ突然変異体に特異的にハイブリダイズすることができ、次いで、上述の増幅したＥＧＦＲ遺伝子または断片への上述のプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、リガンドはビオチンであり、結合パートナーはアビジンまたはストレプトアビジンを含む。特定の実施形態では、結合パートナーは、発色基質で検出可能なストレプトアビジン−アルカリである。特定の実施形態では、プローブは、たとえばテストストリップ上に固定されており、異なる変異に対して相補的なプローブは互いに分離する。あるいは、増幅した核酸を放射性同位体で標識し、その場合には、プローブはリガンドを含む必要はない。
【００３２】
腫瘍試料を、ＫＲＡＳ（ｐ２１ａと称される）における変異についても分析した。エキソン１において検知された特定の変異は、化学療法およびエルロチニブ療法を含む化学療法に対する予後不良と関連するＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄである。したがって、本発明は、エルロチニブまたは化学療法と組み合わせたエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤の療法に対して反応性でない患者を同定するための方法であって、ＫＲＡＳ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の変異の存在は、患者が、上述の療法に対して反応しないことを示す方法をさらに提供する。あるいは、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）上述の腫瘍の試料における野性型ＫＲＡＳタンパク質もしくは野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、野性型ＫＲＡＳタンパク質もしくは野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示す、または（ｉｉ）上述の腫瘍の試料における変異ＫＲＡＳタンパク質もしくは変異ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、変異ＫＲＡＳタンパク質もしくは変異ＫＲＡＳ遺伝子の非存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示す方法を提供する。特定の実施形態では、ＫＲＡＳ変異は活性化変異である。特定の実施形態では、変異は、ＫＲＡＳのエキソン１にある。他の実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄのうちの少なくとも１つである。あるいは、変異体ＫＲＡＳを含む腫瘍を有する個人は、ＥＧＦＲ阻害剤での治療の前、後、または間のいずれかにＫＲＡＳ阻害剤でも治療する場合、ＥＧＦＲ阻害剤で治療してもよい。ＫＲＡＳ変異の存在を決定するための方法は、本明細書中に詳細に記載した、ＥＧＦＲ変異を同定するために使用する方法と類似する。
【００３３】
ＫＲＡＳ変異を呈していたことがわかった、ＩＨＣによりＥＧＦＲについて陽性に染色された腫瘍の患者は、化学療法と組み合わせてエルロチニブで治療した場合、化学療法のみで治療した患者と比較して、生存が非常に短かったことがさらに観察された。以下の表３および４にこれらの結果をまとめる。したがって、ＥＧＦＲ阻害剤のみまたは化学療法剤と組み合わせたいずれかの、エルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤の治療に対して非反応性である患者を同定するための方法であって、上述の患者の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの両方の存在は、患者が、ＥＧＦＲ阻害剤のみまたは化学療法と組み合わせたいずれかの上述のＥＧＦＲ阻害剤療法に対して反応しないことを示す方法を提供する。この文脈では、「非反応性」は、患者が、ＲＥＣＩＳＴ基準による反応を有さないであろうまたは化学療法のみで治療した同様の患者（腫瘍にＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在を有する）よりも生存が低下することを意味する。上述のＥＧＦＲは、変異体ＥＧＦＲまたは野性型ＥＧＦＲのいずれであってもよく、本明細書中に記載する技術を含むがこれらに限定されない任意の技術により決定してもよい。ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳタンパク質またはＫＲＡＳ核酸における変異のことを言い、ＥＧＦＲ変異を検出するための手順と類似する手順を使用して検出される。一実施形態では、ＥＧＦＲの存在は免疫組織化学（ＩＨＣ）により決定する。他の実施形態では、ＥＧＦＲの存在は、正常細胞と比較して上昇したレベルのＥＧＦＲ核酸の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出により決定する。他の実施形態では、ＥＧＦＲは野性型ＥＧＦＲである。他の実施形態では、ＥＧＦＲは変異体ＥＧＦＲである。特定の実施形態では、非反応は、ＲＥＣＩＳＴ基準による完全反応（ＣＲ）の非存在である。他の実施形態では、非反応は、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分反応（ＰＲ）の非存在である。他の実施形態では、非反応は、ＲＥＣＩＳＴ基準による安定（ＳＤ）の非存在である。他の実施形態では、非反応は、生存期間の低下である。
【００３４】
あるいは、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤のみまたは化学療法剤と組み合わせたいずれかの、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応するかどうかを決定するための方法であって、上述の腫瘍の試料において変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ核酸およびＥＧＦＲの存在を決定することを含み、それによって、変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ核酸およびＥＧＦＲの両方の存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応しないことを示す方法を提供する。この文脈では、「反応する」は、腫瘍のサイズまたは容積が縮小するであろうまたはサイズまたは容積の増加率が低下することを意味する。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤での上述の治療は、化学療法での治療より前、と同時、またはの続きとなる。
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
本発明の診断方法および予後予測方法によれば、野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化が検出される。本発明による野性型遺伝子の変化は、挿入、逆位、欠失、および／または点変異等の変異の形態をすべて包含する。体細胞変異は、ある種の組織でのみ、たとえば腫瘍組織で起こり、生殖細胞系列において遺伝しない変異である。生殖細胞系列変異は、任意の体の組織中に見つけることができる。単一の対立遺伝子のみが体細胞性変異している場合、早期の腫瘍性の状態を示す。しかしながら、両方の対立遺伝子が変異している場合、末期の腫瘍性の状態を示す。したがって、ＥＧＦＲ変異の発見は、本明細書中に記載する診断のおよび予後予測の指標となる。
【００３７】
腫瘍組織で見つけられたＥＧＦＲ変異は、野性型ＥＧＦＲに比べて、シグナル伝達活性の上昇をもたらし、癌性状態につながる可能性がある。野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出するために、腫瘍の試料または生検材料を、当技術分野でよく知られており腫瘍の特定の型および部位に適切な方法により得る。たとえば、肺癌病変の試料を、切除、気管支鏡、細針吸引、もしくは気管支擦過によりまたは痰、胸水、もしくは血液から得てもよい。腫瘍細胞についての組織標本を豊富にするための手段は当技術分野で知られている。たとえば、組織を、パラフィン切片またはクリオスタット切片から単離してもよい。癌細胞を、正常細胞から、フローサイトメトリーまたはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより分離してもよい。腫瘍を正常細胞から分離するためのこれらの技術および他の技術は当技術分野でよく知られている。腫瘍組織が正常細胞と高度に混入している場合、変異の検出はより困難となる。
【００３８】
点変異の検出は、ＥＧＦＲ対立遺伝子（複数可）の分子クローニングおよび当技術分野でよく知られている技術を使用してその対立遺伝子（複数可）を配列決定することにより達成してもよい。あるいは、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から遺伝子配列を直接増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することができる。次いで、増幅した配列のＤＮＡ配列を決定し、変異をＤＮＡ配列から同定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は当技術分野でよく知られており、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７頁，１９８８年、米国特許第４６８３２０３号、および米国特許第４６８３１９５号に記載されている。
【００３９】
ＥＧＦＲエキソン１８〜２１のＰＣＲ増幅に使用することができる特異的なプライマー対は次のものを含む。
【００４０】
【数３】
Ｋ−Ｒａｓエキソン１のＰＣＲ増幅に使用することができる特異的なプライマー対は次のものを含む。
【００４１】
【数４】
当技術分野で知られているリガーゼ連鎖反応はＥＧＦＲ配列を増幅するために使用することができる。Ｗｕら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４巻，５６０〜５６９頁（１９８９年）を参照。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することができる。（ＲｕａｎｏおよびＫｉｄｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７巻，８３９２頁，１９８９年を参照）。この技術によれば、それらの３’末端で特定のＥＧＦＲ突然変異体にハイブリダイズするプライマーを使用する。特定のＥＧＦＲ突然変異体が存在しない場合、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号およびＮｅｗｔｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７巻，７頁，１９８９年に開示されるように、増幅不応性変異系（ＡＲＭＳ）を使用することができる。遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定、および増幅により検出することもできる。さらに、遺伝子または周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、対立遺伝子の変化または多型断片における挿入を調べるために使用することができる。一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析を、対立遺伝子の塩基変化変異形を検出するために使用することもできる。（Ｏｒｉｔａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６巻，２７６６〜２７７０頁，１９８９年，およびＧｅｎｏｍｉｃｓ，５巻，８７４〜８７９頁，１９８９年）。当技術分野で知られている挿入および欠失を検出するための他の技術を使用することができる。
【００４２】
野性型遺伝子の変化を、遺伝子の野性型発現産物の変化に基づき検出することもできる。上記発現産物は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡおよびＥＧＦＲタンパク質産物の両方を含む。ｍＲＮＡの増幅および配列決定によりまたはｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡの分子クローニングを介して点変異を検出してもよい。当技術分野でよく知られているＤＮＡ配列決定技術を使用してクローニングしたｃＤＮＡの配列を決定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してｃＤＮＡを配列決定することもできる。
【００４３】
本発明によれば、ミスマッチ塩基対は、１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸二重鎖である。完全な相補性の非存在は、欠失、挿入、逆位、置換、またはフレームシフト変異によるものであってもよい。遺伝子またはそのｍＲＮＡ産物における点変異を検出するためにミスマッチ検出を使用することができる。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、多くの腫瘍試料に対して行うのに、より簡易である。ミスマッチ切断技術の例は、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８２巻，７５７５頁，１９８５年およびＭｅｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０巻，１２４２頁，１９８５年に詳細に記載されるＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実行において、方法は、ヒト野性型ＥＧＦＲ遺伝子コード配列（またはエキソン１８〜２１またはそのＫＤＲ）に対して相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボプローブおよび腫瘍組織から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡを共にアニールし（ハイブリダイズし）、続いて、二重鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチ塩基対を検出することができる酵素ＲＮａｓｅ Ａで消化する。ミスマッチ塩基対がＲＮａｓｅ Ａにより検出されると、二重鎖ＲＮＡ構造はミスマッチ塩基対の部位で切断される。したがって、アニールしたＲＮＡ調製物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離する場合、ミスマッチ塩基対がＲＮａｓｅ Ａにより検出され、切断されていれば、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについての完全長二重鎖ＲＮＡより小さいＲＮＡ産物が見られるであろう。リボプローブは、完全長のＥＧＦＲ ｍＲＮＡまたはＥＧＦＲ遺伝子である必要はないが、エキソン１８〜２１またはＥＧＦＲ ＫＤＲまたはそれらのセグメントとすることができる。リボプローブがＥＧＦＲ ｍＲＮＡまたはＥＧＦＲ遺伝子のセグメントのみを含む場合、多くのこれらのプローブを使用して、ミスマッチ塩基対に対する全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングすることが望ましいであろう。
【００４４】
同様の方法で、ＤＮＡプローブを使用して、酵素による切断または化学的切断によってミスマッチ塩基対を検出することができる。たとえば、Ｃｏｔｔｏｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８５巻，４３９７頁，１９８８年およびＳｈｅｎｋら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７２巻，９８９頁，１９７５年を参照。あるいは、マッチした二重鎖に比べた、ミスマッチした二重鎖の電気泳動移動度のシフトによりミスマッチ塩基対を検出することができる。たとえば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２巻，７２６頁，１９８８年を参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用い、変異を含むかもしれない細胞ｍＲＮＡまたは細胞ＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、ハイブリダイゼーションの前に増幅することができる。特に変化が欠失および挿入等の全体の再配列である場合、ＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡの変化を、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【００４５】
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅したＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡ配列はまた、対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングしてもよい。これらのプローブは、それぞれが知られている変異を含むＥＧＦＲ遺伝子配列の領域を含む核酸オリゴマーである。たとえば、あるオリゴマーは、ＥＧＦＲ遺伝子配列の一部に対応する、長さが約３０のヌクレオチドであってもよい。一連の上記対立遺伝子特異的プローブの使用により、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、ＥＧＦＲ遺伝子における前に同定した変異の存在を識別することができる。増幅したＥＧＦＲ配列と対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションをたとえばナイロンフィルター上で行うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブへのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおける変異と同様の腫瘍組織における変異の存在を示す。
【００４６】
ポリメラーゼ連鎖反応の使用により増幅したＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡ配列については、変異を質量分析技術によりスクリーニングしてもよい。変異を有する遺伝子の増幅された領域は変異のない同一の領域とは異なる質量スペックシグネチャを有するであろう。
【００４７】
野性型ＥＧＦＲタンパク質の変化をスクリーニングすることにより野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出することができる。たとえば、ＥＧＦＲと免疫反応性のモノクローナル抗体を使用して組織をスクリーニングすることができる。関連する抗原の非存在はＥＧＦＲ変異を示すであろう。変異体対立遺伝子の産物に特異的な抗体を使用して、変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物を検出することもできる。抗体を、ファージディスプレイライブラリーから同定してもよい。上記免疫学的アッセイは、当技術分野で知られている任意の好都合な方式で行うことができる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織化学アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。変化したＥＧＦＲタンパク質を検出するための任意の手段を使用して、野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出することができる。
【００４８】
変異体ＥＧＦＲ遺伝子または変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物は、腫瘍からまたは尿、痰、もしくは血清等の他の体の試料から検出することができる。腫瘍試料における変異体ＥＧＦＲ遺伝子または変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物の検出のための上記に取り上げた同様の技術は、他の体の試料に用いることができる。癌細胞は腫瘍から脱落し、上記体の試料中に出現する。上記体の試料をスクリーニングすることにより、簡易な早期診断を多数の型の癌に対して達成することができる。さらに、化学療法または放射線療法の経過は、上記体の試料を変異体ＥＧＦＲ遺伝子または変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物について試験することにより、より容易に監視することができる。
【００４９】
本発明の診断の方法は、ＥＧＦＲが、腫瘍形成における役割を有する任意の腫瘍、たとえば肺、乳房、結腸、神経膠腫、膀胱、肝臓、胃、および前立腺に適用可能である。本発明の診断方法は、臨床医が治療の適切なコースを決めることができるように臨床医にとって有用となる。たとえば、両方のＥＧＦＲ対立遺伝子の変化を呈する腫瘍は、一方のＥＧＦＲ対立遺伝子のみの変化を呈する腫瘍よりも集中的な治療上の投与計画を示唆する可能性がある。
【００５０】
本発明のプライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する、特定のＥＧＦＲ対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は、ＥＧＦＲ遺伝子自体のＤＮＡ合成の増幅を準備をするために、ＥＧＦＲ遺伝子におけるまたはＥＧＦＲ遺伝子を包囲する配列にアニールすることができる。これらのプライマーのセットは、ＥＧＦＲエキソン１８〜２１のヌクレオチドのすべての合成を可能にする。対立遺伝子特異的プライマーもまた使用することができる。上記プライマーは特定のＥＧＦＲ変異体対立遺伝子にのみアニールし、したがって、鋳型としての変異体対立遺伝子の存在下でのみ産物を増幅するであろう。続く増幅した配列のクローニングを促進するために、プライマーは、それらの末端に追加した制限酵素部位配列を有していてもよい。したがって、プライマーのヌクレオチドはすべて、制限酵素部位を形成するのに必要な少数のヌクレオチド以外は、ＥＧＦＲエキソン１８〜２１またはそれらに近接する配列に由来する。上記酵素および部位は当技術分野でよく知られている。プライマー自体は、当技術分野でよく知られている技術を使用して合成することができる。一般に、プライマーは、市販されているオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製することができる。特定のプライマーの設計は、十分に、当技術分野の技術の範囲内である。
【００５１】
本発明により提供された核酸プローブは多くの目的に有用である。核酸プローブは、ゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションおよび既に上記に取り上げた点変異を検出するためのＲＮａｓｅ保護法に使用することができる。プローブを使用して、ＰＣＲ増幅産物を検出することができる。他の技術を使用してＥＧＦＲ遺伝子またはＥＧＦＲ ｍＲＮＡとのミスマッチ塩基対を検出するためにプローブを使用してもよい。ミスマッチ塩基対は、酵素（たとえばＳ１ヌクレアーゼ）、化学物質（たとえばヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジン）、または完全にマッチしたハイブリッドと比較したミスマッチしたハイブリッドの電気泳動移動度の変化を利用して検出することができる。これらの技術は当技術分野で知られている。Ｎｏｖａｃｋら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８３巻，５８６頁，１９８６年を参照。一般に、キナーゼドメインに対するプローブおよびそれらのセグメントも企図されるが、一般に、プローブは、ＥＧＦＲエキソン１８〜２１配列に対して相補的である。全体の一連の核酸プローブは、野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出するためのキットを構成するために使用してもよい。キットは、ＥＧＦＲ遺伝子の全エキソン１８〜２１配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする。プローブは、互いに重複または隣接していてもよい。
【００５２】
リボプローブを、ｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、リボプローブはＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。したがって、リボプローブは、センス鎖に相補的であるので、ＥＧＦＲタンパク質をコードしないという点でアンチセンスプローブである。一般に、リボプローブは、放射性物質、比色定量物質、蛍光定量的物質で標識され、これは、当技術分野で知られている任意の手段により達成することができる。リボプローブを、ＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、リボプローブは、極性のセンスまたはアンチセンスとすることができる。同様に、ＤＮＡプローブもまたミスマッチを検出するために使用してもよい。
【００５３】
ＥＧＦＲ遺伝子の変異についてヒトの任意の組織を試験することにより癌に対する素因を確認することができる。たとえば、生殖細胞系列ＥＧＦＲ変異が遺伝した人は癌になりやすいと思われる。これは、体の任意の組織からのＤＮＡを試験することにより決定することができる。たとえば、血液を取り出し、ＤＮＡを、血液の細胞から抽出することができる。さらに、出生前診断は、ＥＧＦＲ遺伝子の変異について、胎児の細胞、胎盤の細胞、または羊水を試験することにより達成することができる。野性型ＥＧＦＲ対立遺伝子の変化は、たとえば点変異によるものまたは欠失によるもののいずれにせよ、上記に取り上げた任意の手段により検出することができる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
スライド標本−脱パラフィンおよび染色
以下の溶液中に切片を沈めた。
【００５５】
新鮮なキシレン（切片を脱パラフィンするため）−５分間
新鮮なキシレン−５分間
１００％エタノール−１５秒間
９５％エタノール−１５秒間
７０％エタノール−１５秒間
脱イオン水−１５秒間
マイヤーのヘマトキシリン−３０秒間
脱イオン水−すすぎ（×２）−１５秒間
７０％エタノール−１５秒間
エオシンＹ−５秒間
９５％エタノール−１５秒間
９５％エタノール−１５秒間
１００％エタノール−１５秒間
１００％エタノール−１５秒間
キシレン（切片の脱水を確実にするため）−６０秒間
キシレンを完全に除去するために約２分間風乾するまたはエアガンを静かに使用した。
【００５６】
次いで、組織についてＬＣＭの準備をした。
【００５７】
（実施例２）
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションおよびＤＮＡ抽出
材料：
ＰｉｘＣｅｌｌ ＩＩ ＬＣＭシステム
ＣａｐＳｕｒｅ ＨＳ ＬＣＭキャップまたはＣａｐＳｕｒｅ Ｍａｃｒｏ ＬＣＭキャップ
ＥｘｔｒａｃｔＳｕｒｅ装置（ＨＳのみ）
カミソリ刀（工場で殺菌）
０．５ｍｌチューブ
０．２ｍｌチューブ
ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＤＮＡ抽出キット
６５℃インキュベータ
手順：
収集する組織の領域上にＣａｐＳｕｒｅキャップを配置した
２．所望の領域一帯をレーザー処理した
キャップを組織から持ち上げた。
【００５８】
ＰｉｃｏＰｕｒｅ消化バッファー２０μｌをプロテイナーゼＫと共に０．５ｍｌチューブ中に分注した。
【００５９】
キャップを、切り分けた材料と共にチューブ中に置き、密封した。
【００６０】
消化バッファーがキャップを覆うようにチューブを逆にした。
【００６１】
６５℃で２４時間インキュベートした。
【００６２】
キャップと共にチューブを回転させ、チューブの底の消化された物質を収集した。
【００６３】
消化物を、０．２ｍｌストリップチューブに移した。
【００６４】
９５℃、１０分間、蓋を加熱したサーモサイクラー中でプロテイナーゼＫを不活性化した。
【００６５】
１０．５０μｌ ＰＣＲ反応において１〜２μｌの試料を使用した。クリーンアップは必要ではなかった。
【００６６】
（実施例３）
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー：
プライマー対を、配列決定する各エキソン用に設計した（ＥＧＦＲエキソン１８、１９、２０、および２１）。使用したプライマー配列は以下のとおりであった。
【００６７】
【数５】
最初のＰＣＲ産物のネステッド増幅を、最初のＰＣＲ産物内に位置するイントロン特異的プライマー対を使用して行った。これらのネステッドプライマー対はＭ１３ｆ配列およびＭ１３ｒｅｖ配列のタグ付きである。
ＰＣＲの第１ラウンド：
ＰＣＲ反応：
ＤＮＡ ０．５〜３０ｎｇ
プライマー ２５０ｎＭ／各外側のプライマー
ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）カタログ＃１５８１２９５）
ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ（１５ｍＭ １０×バッファー）
酵素 １．５Ｕ／ＲＸ拡張高忠実度Ｔａｑ（ロシュ社 カタログ＃１７５９０７８）
５０μｌ反応容量
サーモサイクラー条件：
９５℃、３分間
９４℃、３０秒間、３５回の繰り返し
５８℃、３０秒間
７２℃、１分間
７２℃、８分間
４℃、常時
ＰＣＲの第２ラウンド：
ＰＣＲ反応：
ＤＮＡ 第１ラウンドＰＣＲ反応からの１μｌ
プライマー ２５０ｎＭ／各内側のプライマー
ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）カタログ＃１５８１２９５）
ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ（１５ｍＭ １０×バッファー）
酵素 １．５Ｕ／ＲＸ拡張高忠実度Ｔａｑ（ロシュ社 カタログ＃１７５９０７８）
５０μｌ反応容量
サーモサイクラー条件：
９５℃、３分間
９４℃、３０秒間、３０回の繰り返し
５８℃、３０秒間
７２℃、１分間
７２℃、８分間
４℃、常時
ＰＣＲ産物の単離：
ＰＣＲ反応産物を、Ｅ−ゲル２％アガロースゲル（インビトロジェン社、カタログ＃Ｇ６０１８−０２）上で品質管理のために走らせた。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ＃２８１８１）を直接使用して精製したまたはゲルを必要に応じて精製した。ゲル精製については、ＰＣＲ産物をＥ−ゲルから切除し、ＤＮＡを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ精製キットを使用し、ゲル抽出プロトコール（キアゲン社、カタログ＃２８１８１）を用いて精製した。
【００６８】
（実施例４）
配列決定
標識ＰＣＲ産物に対するネステッド配列決定プライマーまたは標準的なＭ１３ｆ配列決定プライマーおよびＭ１３ｒｅｖ配列決定プライマーを使用して、精製したＰＣＲ産物を配列決定した。配列は以下のとおりであった。
【００６９】
【数６】
精製したＰＣＲ産物は、ＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（ＡＢＩ社、フォスターシティ、ＣＡ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って、希釈し、サイクルシーケンスした。
反応混合物：
ＤＮＡ ５μｌ（２５〜１００ｎｇ ＰＣＲ産物）
水 ６μｌ
．２５ＯＤ／１００μｌに水で希釈したプライマー １μｌ（ｍ１３ｆプライマーまたはｍ１３ｒプライマーまたは配列特異的プライマー）
ＢｉｇＤｙｅ ｖ３．１ ２μｌ
希釈バッファー ６μｌ（ＡＢＩ社製５×希釈バッファーの均等物）
サイクルシーケンシング：
条件：
９６℃、２．５分間−最初の変性
９６℃、１０秒間
５０℃、５秒間
６０℃、４分間
全サイクルを２５〜５０回繰り返した
反応のクリーンアップ：
次のものを使用して、取り込まれなかったヌクレオチド除去した。
【００７０】
８％セファデックス
エッジバイオシステム社製（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）９６ウェルブロック中５００μｌ
回転＠７５０ｇ、２分間
解析：
反応産物を、ＡＢＩ３７００またはＡＢ１３７３０の配列決定機で電気泳動にかけた。
【００７１】
Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ジーンコード社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ，Ｃｏｒｐ））等の市販されている分析プログラムを使用し、カスタムツールを用いて電気泳動図を変異について分析した。
【００７２】
（実施例５）
用量反応
本研究で使用したヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）野性型および変異体の構築物は、内在性ＥＧＦＲシグナル配列に取って代わる単純ヘルペスウイルスシグナル配列ｇＤのＮ末端におけるエピトープタグ付きである（Ｓｃｈａｅｆｅｒら１９９９年Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７４，８５９〜８６６頁）。Ｃｏｓ７細胞を、１２ウェルディッシュ中、正常増殖培地に、トランスフェクション前の２４時間接種した。細胞を、ウェル当たり０．２５ｕｇで発現プラスミドＤＮＡ（ｐＲＫ５．ｇＤ．ＥＧＦＲ野性型、ｐＲＫ５．ｇＤ．ＥＧＦＲ．Ｌ８５８Ｒ、またはｐＲＫ５．ｇＤ．ＥＧＦＲ．ｄｅｌ（Ｅ７４６−Ｓ７５２））を用い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭｌＮＥ ２０００を使用して、メーカー推奨のプロトコール（インビトロジェン社）に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間、細胞は、６時間、無血清ＤＭＥＭ中で血清不足であった。刺激前の１時間、トランスフェクトした細胞を、示した濃度のエルロチニブでプレインキュベートした。トランスフェクトした細胞を１ｎＭ ＴＧＦαで１０分間刺激した。細胞を、ウェル中で、還元ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファーを使用して直接溶解した。成長因子刺激によるＥＧＦＲ受容体活性化の指標である受容体自己リン酸化をウェスタンブロッティングにより、ＨＲＰ結合抗ホスホチロシン抗体（オンコジーンサイエンス社製（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＢ−４）を使用して検出した。トランスフェクション効率をｇＤエピトープタグ（５Ｂ６）に対する抗体特異性を使用して評価した。受容体活性化のレベルをオートラジオグラムからＮＩＨ画像ソフトウェアを使用して評価した。次いで、４パラメータフィット機能を使用してＩＣ５０を算出したグラフを生成するためにこれらのデータを使用した。以下に結果により示すように、エルロチニブは、変異を含むＥＧＦＲに対して、野性型ＥＧＦＲと比較して、より大きな親和性を有している。
【００７３】
【数７】
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、野性型ＥＧＦＲ１（配列番号１）のアミノ酸配列を示し、このアミノ酸配列において、シグナル配列は残基１〜２４であり、細胞外ドメインは残基２４〜６４５を含み、膜貫通ドメインは残基６４６〜６６８を含み、細胞質ドメインは残基６６９〜１２１０を含む。チロシンキナーゼドメイン領域は残基７１８〜９６４であり、トレオニンリン酸化部位は残基６７８である。
【図２】図２ａ〜２ｄは、野性型ＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列（配列番号２）であり、エキソン１８は、ヌクレオチド２３０８〜２４３０に対応し、エキソン１９は、ヌクレオチド２４３１〜２５２９に対応し、エキソン２０は、ヌクレオチド２５３０〜２７１５に対応し、エキソン２１は、２７１６〜２８７１に対応する。
【図３】図３は、ＥＧＦＲの細胞外（上）および細胞内（下）領域の図示である。
【図４】図４は、野性型ＥＧＦＲ（実線）および変異体ＥＧＦＲ（破線）を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍を有する患者の進行に対する時間を示すカプラン−マイアー曲線である。
【図５】図５は、野性型ＥＧＦＲ（実線）および変異体ＥＧＦＲ（破線）を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍を有する患者の生存を示すカプラン−マイアー曲線である。
【図６】図６は、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞における様々な濃度のエルロチニブでの野性型ＥＧＦＲおよび変異体ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒおよびｄｅｌ７４６−７５２）の自己リン酸化の阻害を示すオートラジオグラフである。
【図７】図７は、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞における様々な濃度のエルロチニブでの野性型ＥＧＦＲおよび変異体ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒおよびｄｅｌ７４６−７５２）の自己リン酸化の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、ＥＧＦＲ遺伝子配列およびＥＧＦＲタンパク質配列のエキソン１８および１９における変異を示す。アミノ酸およびヌクレオチドの変更ならびに挿入は太字の下線を引いたフォントであり、欠失をダッシュ（−）で示す。
【図９】図９は、ＥＧＦＲ遺伝子配列およびＥＧＦＲタンパク質配列のエキソン２０および２１における変異を示す。アミノ酸およびヌクレオチドの変更ならびに挿入は太字の下線を引いたフォントであり、欠失をダッシュ（−）で示す。
【図１０】記載なし。
【図１１】記載なし。
【図１２】記載なし。
【図１３】記載なし。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、癌診断法および癌療法ならびに、特に、特徴および／または予後兆候となる変異の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、成長因子受容体の１型チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、これら成長因子受容体は、細胞の成長、分化、および生存に重要な役割を果たしている。これらの受容体の活性化は、通常、特異的なリガンド結合を介して起こり、受容体ファミリーメンバー間でのヘテロ二量体化またはホモ二量体化をもたらし、続いて、チロシンキナーゼドメインが自己リン酸化する。この活性化は、細胞の増殖（ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼ経路）および生存（ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路）の両方に関係がある細胞内シグナル伝達経路のカスケードを引き起こす。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を含むこのファミリーのメンバーは細胞形質転換に直接関連した。
【０００３】
多くのヒト悪性腫瘍は、ＥＧＦＲの異常もしくは過剰発現および／またはその特異的なリガンド、たとえば形質転換成長因子αの過剰発現に関連する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ＥＧＦＲ過剰発現は、ＮＳＣＬＣを含む多くのヒト癌における有害な予後と関連した。いくつかの事例では、腫瘍ＥＧＦＲの過剰発現は、化学療法抵抗性および予後不良の両方と関連した。（非特許文献４；非特許文献５）。これらの観察は、ＥＧＦＲ受容体の活性化および続く下流のシグナル伝達を有効に阻害する作用物質がＮＳＣＬＣを含む様々なヒト癌における臨床活性を有するかもしれないということ示唆する。
【０００４】
キナゾリン誘導体であるＴａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブとしても知られている；ＯＳＩ−７７４）は、経口的に活性な、効力のある、選択的なＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤である。エルロチニブは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイにおいて２ｎＭ（０．７８６ｍｇ／ｍＬ）のＩＣ５０でヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する。この阻害は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対して選択的であり、Ｇ１での細胞周期停止をもたらし、可逆的である。マウスにおけるエルロチニブの経口投与により、ヒト異種移植片におけるＥＧＦＲ自己リン酸化が＞７０％低下することが実証され、ヌードマウスにおけるＨＮ５異種移植片およびＡ４３１異種移植片の著しい成長阻害が実証された。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系における単一作用物質の活性の他に、可能性として考えられる相互作用を決定するために多くの化学療法の作用物質と組み合わせてエルロチニブを評価した。エルロチニブならびにパクリタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、およびドキソルビシンの間に付加的な相互作用があった。
【０００５】
肺癌は、米国の男性および女性の両者にとっての癌関連死の主な原因である。２０００年には、１６４，０００例の新たな症例が診断され、１５７，０００人の患者がこの疾患で死ぬであろうと推定された（非特許文献６）。これらの患者の約７５％が非小細胞の組織像を有し、その大多数が、手術不能な第ＩＩＩＢ期または第ＩＶ期の疾患を示していたであろう。より限局性の疾患を提示時に有するそれらの患者（第Ｉ期〜ＩＩＩＡ期）については、アジュバント化学療法もしくはネオアジュバント化学療法および／またはアジュバント放射線療法もしくはネオアジュバント放射線療法を伴うまたは伴わない標準的な手術療法後の再発が一般的である。これらの発見は、〜１２％の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における最大５年の生存をもたらし、この疾患における未だ対処されていない医療の必要性を強調するのに役立っている。
【０００６】
白金化合物であるシスプラチンは、局所進行ＮＳＣＬＣまたは転移ＮＳＣＬＣの処置における臨床的有用性を示した最初の化学療法作用物質であった。無作為臨床試験は、最善の支持療法（Ｒａｐｐら１９８８年）と比較して、反応率、生存の質、および生存が改善されたことを実証した。しかしながら、この改善の大きさは中程度であり、数週間に限られた。その後、多くのより新しい化学療法作用物質を、単一の作用物質としておよび第１選択の状況で白金塩と組み合わせて評価した。これらの研究からの結論として、その最新の「二重」化学療法は、１５％〜２０％の反応率、３〜４か月の疾患進行の期間の中央値、および７〜８か月の生存の中央値を達成しているように思われる。シスプラチンで得られた結果に関した併用療法での効力における中程度の改善により、これらの療法が、進行ＮＳＣＬＣおよび良好な全身状態を有する患者に対する医療の標準として確立された（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【非特許文献１】Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ １９９１年，４７：８７〜９８頁
【非特許文献２】ＭｏｄｉｊｔａｈｅｄｉおよびＤｅａｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ １９９４年，４：２７７〜９６頁
【非特許文献３】Ｓａｌｏｍｏｎら，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９５年；１９：１８３〜２３２頁
【非特許文献４】Ｌｅｉら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９年；１９：２２１〜８頁
【非特許文献５】Ｖｅａｌｅら，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９３年；６８：１６２〜５頁
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎｌｅｅら，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２００１年，５１：１５〜３６頁
【非特許文献７】Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ， Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ １９９５年，３１１：８９９〜９０９頁
【非特許文献８】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９７年，１５：２９９６〜３０１８頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の態様によれば、治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、上述の腫瘍の試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上述の変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１に位置し、それによって、変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在は、腫瘍が治療に対して感受性であることを示す方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の態様では、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、上述の腫瘍におけるＥＧＦＲ変異の存在を同定することおよび抗癌剤で上述の哺乳動物を治療することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の他の態様では、試料におけるＥＧＦＲ変異を同定するための方法であって、上述の試料からの核酸を、変異ＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸または変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズすることができるプローブと接触させることおよびハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様では、変異ＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸または変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを提供する。
【００１１】
本発明の他の態様では、試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子を検出するための方法であって、上述のＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する上述の試料の核酸または変異を含むと思われるその断片から増幅することおよび増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野性型ＥＧＦＲ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の態様では、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）上述の腫瘍の試料における野性型ＫＲＡＳタンパク質または野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、野性型ＫＲＡＳタンパク質または野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示す、または（ｉｉ）上述の腫瘍の試料における変異ＫＲＡＳタンパク質または変異ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、変異ＫＲＡＳタンパク質または変異ＫＲＡＳ遺伝子の非存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示すことを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
腫瘍形成に関連する変異現象が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）で起こることは本発明の発見である。異常なＥＧＦＲ活性が様々な癌と関連していることが以前より知られていたが、ＥＧＦＲキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）における変異が存在し、いくつかの癌に関連する異常なシグナル伝達活性を引き起こすことは知られていなかった。驚いたことに、ＥＧＦＲ ＫＤＲ変異を有する腫瘍を患う患者は、野性型ＥＧＦＲを有する患者よりも良好な予後を有している。ＥＧＦＲ遺伝子のＫＤＲ変異は、挿入および欠失等の再配列ならびに点変異を含み得る。
【００１４】
トリビュート（Ｔｒｉｂｕｔｅ）と称される無作為二重盲検第ＩＩＩ相臨床試験に参加した約２５０人の患者からの試料を、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１で起きている変異について配列決定した。トリビュートは、米国における約１５０箇所の施設の、組織学的に確認したＮＳＣＬＣを有する、前に化学療法を受けたことがない１，０７９人の患者について、エルロチニブ＋化学療法（カルボプラチン／パクリタキセル）を化学療法のみと比較して調査した。患者は、パクリタキセル（２００ｍｇ／ｍ２、３時間、ｉ．ｖ．注入）、次に、エルロチニブありまたはなしで（経口で１００ｍｇ／日、耐性のある患者については１５０ｍｇ／日まで段階的に上昇）、カルボプラチン（ＡＵＣ＝６ｍｇ／ｍｌ×分、１５〜３０分間注入、カルバートの式を使用）を受けた。トリビュート試験から収集した約２５０人の患者からの腫瘍試料、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロック、または未染色スライドは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション後にＤＮＡ抽出したところ腫瘍細胞で豊富であった。エキソン１８〜２１をネステッドＰＣＲにより増幅し、蛍光ダイターミネーター化学を使用して各ＰＣＲ産物から双方向の配列を得た。配列決定から発見した変異を表１に示す。
【００１５】
【表１−１】
【００１６】
【表１−２】
変異に対するヌクレオチドの番号付けは図２ａ〜２ｄに示す参照配列に基づく。
【００１７】
ＥＧＦＲ変異および野性型ＥＧＦＲを有する腫瘍を有する患者の臨床結果を反応（完全＋部分）、利益（反応＋安定）、および進行に従って分析した。「完全反応」（ＣＲ）を、すべての標的病変の消失と定義し、「部分反応」（ＰＲ）を、ベースライン長径和を基準として、標的病変の最長径の和の少なくとも３０％の減少と定義し、「進行」（ＰＤ）を、治療の開始または１つまたは複数の新しい病変の出現から記録された最小の最長径の和を基準として、標的病変の最長径の和の少なくとも２０％の増加と定義し、「安定」（ＳＤ）を、治療の開始からの最小の最長径の和を基準として、部分反応とみなすには縮小が十分ではなく、進行とみなすには増加が十分ではないと定義する固形癌反応評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）という基準を使用して病変を評価した。
【００１８】
分析の結果を表２にまとめる。
【００１９】
【表２】
臨床結果の分析により、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１における変異を発現する腫瘍を有する患者は、野性型ＥＧＦＲを発現する腫瘍を有する患者よりも良好な予後を有していることが明らかにされた。変異体ＥＧＦＲ患者は、化学療法または化学療法およびエルロチニブで治療すると、より大きな反応率、利益率、および生存を示した。これらの結果は、エキソン１８〜２１のいずれかまたはすべてにおけるＥＧＦＲ変異を腫瘍が有している患者が、腫瘍が上記変異を有していない患者よりも、より良好な予後を有するというような結果を予測するのに有用である。
【００２０】
したがって、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定するための方法であって、上述の腫瘍の試料において、エキソン１８〜２１（またはエキソン１８〜２１に対応するアミノ酸配列）における１つまたは複数のＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の１つまたは複数のＥＧＦＲ変異の存在は、上述の１つまたは複数のＥＧＦＲ変異の非存在と比較して、より良好な予後を示す方法を提供する。「予後」により、反応および／または利益および／または生存が意味される。「ＥＧＦＲ変異」は、一方の対立遺伝子（ヘテロ接合）または両方の対立遺伝子（ホモ接合）に見つけられる、野性型ＥＧＦＲタンパク質または野性型ＥＧＦＲ核酸とそれぞれ異なるアミノ酸配列または核酸配列を意味し、体細胞系列または生殖細胞系列であってもよい。特定の実施形態では、上述の変異は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）中に見つけられる。他の特定の実施形態では、変異は、表１に示すように、アミノ酸の置換、欠失、または挿入である。一実施形態では、アミノ酸変異は１つまたは複数の次のものである：
【００２１】
【数１】
他の特定の実施形態では、変異は、表１に示すように、核酸の点変異、欠失、または挿入である。一実施形態では、核酸変異は１つまたは複数の次のものである。
【００２２】
【数２】
エルロチニブでの治療に対する抵抗性を示したＨ１９７５腫瘍細胞株からのＥＧＦＲエキソン１８〜２１を配列決定し、Ｌ８５８Ｒ変異と組み合わさった変異Ｔ７９０Ｍを含むことがわかった。したがって、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定するための方法であって、上述の腫瘍の試料において、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述のＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在は、上述のＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の非存在と比較して、より不良な予後を示す方法をさらに提供する。さらに、化学療法と組み合わせても組み合わせなくてもエルロチニブまたはゲフィチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤の療法に対して反応性が低い腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、患者の腫瘍におけるＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の変異の存在は、患者が、上述のＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を有していない腫瘍を有する患者と比較して、上述の療法に対する反応が低いことを示す方法を提供する。さらに、化学療法と組み合わせても組み合わせなくてもキナーゼドメイン結合阻害剤（たとえばエルロチニブまたはゲフィチニブ）等のＥＧＦＲ阻害剤での治療に対する抵抗性のある腫瘍を同定するための方法であって、腫瘍の試料におけるＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の変異の存在は、腫瘍が、上述の治療に対して抵抗性があることを示す方法を提供する。変異の決定は、タンパク質レベルまたは核酸レベル（ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ）であり、本明細書中に記載される技術等の技術を使用して達成されることが理解される。特定の実施形態では、上述のＥＧＦＲ阻害剤はＥＧＦＲキナーゼドメインにおいてＡＴＰと競合する。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブである。
【００２３】
他の態様では、Ｔ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲタンパク質もしくはＥＧＦＲ遺伝子を含む腫瘍を有する患者を治療するための（またはＴ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲタンパク質もしくはＥＧＦＲ遺伝子を含む腫瘍を治療するための）方法であって、上述のＴ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲに結合するおよび／またはそのシグナル伝達を阻害する第１の化合物を、野性型ＥＧＦＲまたは活性化変異を含むＥＧＦＲに結合するおよび／またはそのシグナル伝達を阻害する第２の化合物と組み合わせて、上述の患者に同時投与すること（または上述の腫瘍と接触させること）を含む方法を提供する。特定の実施形態では、上述の活性化変異は、表１（Ｔ７９０Ｍ以外）に記載された１つまたは複数の活性化変異である。特定の実施形態では、上述の第１の化合物および第２の化合物は連続してまたは同時に投与される。特定の実施形態では、上述の第２の化合物はエルロチニブである。
【００２４】
本発明の他の態様では、Ｔ７９０Ｍ変異を含む変異体ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、リン酸化基質およびＡＴＰの存在下で上述の変異体ＥＧＦＲを試験化合物と接触させることおよび上述の基質のリン酸化の量の変化を検出することを含み、それによって、対照と比較したまたは試験化合物非存在下での基質のリン酸化と比較した上述の基質のリン酸化の低下は、上述の試験化合物が、変異体ＥＧＦＲのシグナル伝達の阻害剤であることを示す方法を提供する。一実施形態では、上述の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ＥＧＦまたはＴＧＦ−アルファ等の上述の変異体ＥＧＦＲに対するリガンドの存在下で行われる。
【００２５】
特定の実施形態では、試験化合物の阻害活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、外来基質（たとえば、Ｌｙｓ３−ガストリンまたはポリＧｌｕＴｙｒ（４：１）ランダム共重合体）（Ｉ． Ｐｏｓｎｅｒら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７（２９），２０６３８〜４７頁（１９９２））の上皮成長因子受容体キナーゼによるチロシンに対するリン酸化の試験化合物による阻害の対照に対する量により決定することができる。精製した可溶性ヒトＴ７９０Ｍ変異体ＥＧＦＲ（９６ｎｇ）を、微量遠心チューブ中で、リン酸化バッファー＋バナジン酸（ＰＢＶ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４；１２５ｍＭ ＮａＣｌ；２４ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００μＭ オルトバナジン酸ナトリウム）中のＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ）と共に全容量１０μｌで２０〜３０分間室温でプレインキュベートする。試験化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させ、ＰＢＶ中に希釈し、１０μｌを、変異体ＥＧＦＲ／ＥＧＦ混合物と混合し、１０〜３０分間３０℃でインキュベートする。リン酸化反応を、２０μｌ ３３Ｐ−ＡＴＰ／基質混合物（１２０μＭ Ｌｙｓ３−ガストリン（アミノ酸に対する単一文字コードでの配列、ＫＫＫＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＬＤＦ−配列番号３８）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、４０μＭ ＡＴＰ、２μＣｉ γ−［３３Ｐ］−ＡＴＰ）の変異体ＥＧＦＲ／ＥＧＦ混合物への添加により開始し、２０分間室温でインキュベートする。反応を、１０μｌ停止液（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８；２ｍＭ ＡＴＰ）および６μｌ ２Ｎ ＨＣｌの添加により停止する。チューブを、１４，０００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離する。各チューブからの上清３５μｌを２．５ｃｍの円のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｐ８１紙上にピペットで移し、１回の洗浄当たり１リットルの５％酢酸中で４回大量洗浄し、次いで風乾する。これは、洗浄で遊離ＡＴＰを失った紙への基質の結合をもたらす。取り込まれた［３３Ｐ］を、液体シンチレーションカウンターで測定する。基質（たとえばｌｙｓ３−ガストリン）非存在下での取り込みはバックグラウンドとしてすべての値から差し引き、試験化合物が存在しない対照に対して、阻害百分率を算出する。様々な用量の試験化合物で実行した上記アッセイにより、Ｔ７９０Ｍ変異体のＥＧＦＲキナーゼ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害についてのおおよそのＩＣ５０値の決定が可能になる。
【００２６】
本発明の他の態様では、治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、上述の腫瘍の試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上述の変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１に位置し、それによって、変異ＥＧＦＲ遺伝子または変異ＥＧＦＲタンパク質の存在は、腫瘍が抗癌剤での治療に対して感受性であることを示す方法を提供する。特定の実施形態では、抗癌剤は、細胞障害性または細胞増殖抑止剤であってもよい化学療法剤である。腫瘍は、神経芽細胞腫、直腸癌、結腸癌、家族性大腸腺腫症の癌、および遺伝性非ポリポーシス大腸癌等の腸癌、食道癌、唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、骨髄甲状腺癌、乳頭甲状腺癌、腎癌、腎実質癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛膜癌、膵癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、泌尿器癌、黒色腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、および末梢性神経外胚葉腫瘍等の脳腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、ユーイング肉腫、ならびに形質細胞腫を含む。特定の腫瘍は、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰、甲状腺、結腸直腸、食道、肝癌、肉腫、神経膠芽腫、頭頚部、白血病、およびリンパ性悪性腫瘍といった腫瘍を含む。
【００２７】
特定の化学療法剤は、（ｉ）シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウイリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、またはメトトレキサート等の代謝拮抗剤、（ｉｉ）ブレオマイシン等のＤＮＡ断片化剤、（ｉｉｉ）クロラムブチル、シスプラチン、シクロホスファミド、またはナイトロジェンマスタード等のＤＮＡ架橋剤、（ｉｖ）アドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロン等の挿入剤、（ｖ）Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、またはジフテリア毒素等のタンパク質合成阻害剤、（Ｖｉ）カンプトテシンまたはトポテカン等のトポイソメラーゼＩ毒、（ｖｉｉ）エトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド等のトポイソメラーゼＩＩ毒；（ｖｉｉｉ）コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、またはビンクリスチン等の微小管制御剤、（ｉｘ）フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ ５７１４８Ｂ）、またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）等のキナーゼ阻害剤、（ｘ）チオプラチン（ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）、ＰＳ−３４１、フェニル酪酸、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９、Ｌ−７４４８３２）等の様々な治験薬ならびにケルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、エピガロカテキンガレート、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸、およびそれらの誘導体等のポリフェノール、（ｘｉ）グルココルチコイドまたはフェンレチニド等のホルモン、ならびに（ｘｉｉ）タモキシフェン、フィナステリド、またはＬＨＲＨ拮抗剤等のホルモン拮抗剤を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、化学療法化合物は、１つまたは複数のゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン、ダウナルビシン（ｄａｕｎａｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリテキセル、タキソテール、およびマイトマイシンＣである。特定の実施形態では、化学療法化合物は、１つまたは複数のゲムシタビン、シスプラチン、およびパクリタキセルである。他の実施形態では、治療薬はＥＧＦＲの阻害剤である。一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｅｒｂｉｔｕｔｕｘ（商標）（セツキシマブ、イムクローン システムズ社（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．））およびＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ、アブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））等の抗体である。他の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブ、ＯＳＩファーマシューティカルズ社（ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、Ｉｒｅｓｓａ（商標）（ゲフィチニブ、アストラゼネカ社（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ））、Ｄｖｉｒら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１３：８５７〜８６５頁（１９９１年）により記載されるチロホスチン、米国特許第５６７９６８３号に開示される三環系ピリミジン化合物、およびＰａｎｅｋら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２８３，１４３３〜１４４４頁（１９９７年）に開示される化合物６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチルアイニノエトキシ）フェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−１）（６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−（２−ｄｉｅｔｈｙｌａｉｎｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）−８−ｍｅｔｈｙｌ−８Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ（２，３−ｄ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｏｎｅ）（ＰＤ１６６２８５として知られている）等のＡＴＰと競合する低分子である。
【００２８】
本発明の他の態様では、試料におけるＥＧＦＲ変異を同定するための方法であって、上述の試料からの核酸を、変異ＥＧＦＲタンパク質または変異を含むその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させることおよび上述のハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、上述のプローブを、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン蛍光等）、または色素剤等で検出可能に標識する。特定の実施形態では、プローブはアンチセンスオリゴマー、たとえばＰＮＡ、モルホリノホスホロアミダート、ＬＮＡ、または２’−アルコキシアルコキシである。プローブは、約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチドまたは約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドまたは約２０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドであってもよい。他の態様では、本発明の上述のプローブは、試料におけるＥＧＦＲ変異を同定するためのキットであって、上述のキットは、ＥＧＦＲ遺伝子における変異の部位に特異的にハイブリダイズするまたは特異的にハイブリダイズして近接するオリゴヌクレオチドを含むキットにおいて提供される。キットは、キットを使用したハイブリダイゼーション試験の結果に基づき、ＥＧＦＲ阻害剤で、ＥＧＦＲ変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための使用説明書をさらに含む。
【００２９】
本発明の他の態様では、試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子を検出するための方法であって、上述のＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する上述の試料の核酸またはエキソン１８〜２１または変異を含むと思われるそれらの断片から増幅することおよび増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野性型ＥＧＦＲ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法を提供する。移動度の差異は、増幅した核酸配列における変異の存在を示す。電気泳動移動度はポリアクリルアミドゲル上で決定してもよい。
【００３０】
あるいは、増幅したＥＧＦＲ遺伝子または核酸断片は、変異の検出のために、酵素による変異検出（ＥＭＤ）を使用して分析してもよい（Ｄｅｌ Ｔｉｔｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：７３１〜７３９頁，１９９８年）。ＥＭＤは、点変異、挿入、および欠失に起因する塩基対のミスマッチにより引き起こされる構造的な変形を検出し、切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンするバクテリオファージ リゾルベース Ｔ４ エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用する。リゾルベース切断により形成された２つの短い断片のたとえばゲル電気泳動による検出は変異の存在を示す。ＥＭＤ法の有用性は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされた点変異、欠失、および挿入を同定するための単一プロトコールであり、試料精製の必要性をなくし、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、シグナル対ノイズ比を上昇させる。正常なＤＮＡを２０倍超まで含む混合試料およびサイズが４ｋｂまでの断片をアッセイすることができる。しかしながら、ＥＭＤスキャニングは、変異陽性試料において起こる特定の塩基の変化を同定せず、必要であれば変異の識別に対するさらなる配列決定手順を必要とする。ＣＥＬ Ｉ酵素は、米国特許第５８６９２４５号で実証されるように、リゾルベース Ｔ４ エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様に使用することができる。
【００３１】
本発明のＥＧＦＲ変異を検出するための他の簡易なキットは、血色素症を引き起こすＨＦＥ遺伝子、ＴＦＲ２遺伝子、およびＦＰＮ１遺伝子における多重変異の検出のための血色素症ＳｔｒｉｐＡｓｓａｙ（商標）（ウィーンラボ社製（Ｖｉｅｎｎａｌａｂ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｍｂｕｒｇｈｍａｒｒｓｈ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／４２２０．ｐｄｆ）に類似する逆ハイブリダイゼーション試験ストリップである。上記アッセイは、ＰＣＲによる増幅後の配列特異的ハイブリダイゼーションに基づく。単一変異アッセイについては、マイクロプレートベースの検出システムを用いてもよいのに対して、多重変異アッセイについては、テストストリップを「マクロアレイ」として使用してもよい。キットは、試料の準備、増幅、および変異検出のための使用する準備ができている試薬を含んでいてもよい。多重増幅プロトコールは利便性を提供し、非常にわずかな容量の試料の試験を可能にする。簡単なＳｔｒｉｐＡｓｓａｙ方式を使用して、２０個以上の変異に対する試験を５時間未満で高価な装置なしで完了することが可能である。ＤＮＡを試料から単離し、ＥＧＦＲ遺伝子（またはエキソン１８〜２１またはＫＤＲまたはそれらのセグメント）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、好ましくは単一（「多重」）増幅反応で増幅し（たとえばＰＣＲ）、ビオチン標識する。ＰＣＲ産物は、プローブが平行なラインまたはバンドとして固定されたテストストリップ等の固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ（野性型および変異体特異的）に選択的にハイブリダイズする。結合したビオチン化単位複製配列を、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび発色基質を使用して検出する。上記アッセイは、表１の変異のすべてまたは任意のサブセットを検出することができる。特定の変異体プローブバンドに関して、３つのシグナルパターンのうちの１つが可能である：（ｉ）正常ＥＧＦＲを示す野性型プローブに対してのみのバンド（ｉｉ）ヘテロ接合遺伝子型を示す野性型および変異体プローブの両方に対するバンド（ｉｉｉ）ホモ接合変異体ＥＧＦＲ遺伝子型を示す変異体プローブに対してのみのバンド。したがって、本発明のＥＧＦＲ変異を検出するための方法であって、核酸を試料から単離すること、ＥＧＦＲ遺伝子またはその断片（たとえば、ＫＤＲまたはエキソン１８〜２１以下のもの）を、増幅した核酸がリガンドを含むように増幅すること、増幅したＥＧＦＲ遺伝子または断片を、リガンドに対する検出可能な結合パートナーを含むプローブと接触させること、プローブは、ＥＧＦＲ突然変異体に特異的にハイブリダイズすることができ、次いで、上述の増幅したＥＧＦＲ遺伝子または断片への上述のプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、リガンドはビオチンであり、結合パートナーはアビジンまたはストレプトアビジンを含む。特定の実施形態では、結合パートナーは、発色基質で検出可能なストレプトアビジン−アルカリである。特定の実施形態では、プローブは、たとえばテストストリップ上に固定されており、異なる変異に対して相補的なプローブは互いに分離する。あるいは、増幅した核酸を放射性同位体で標識し、その場合には、プローブはリガンドを含む必要はない。
【００３２】
腫瘍試料を、ＫＲＡＳ（ｐ２１ａと称される）における変異についても分析した。エキソン１において検知された特定の変異は、化学療法およびエルロチニブ療法を含む化学療法に対する予後不良と関連するＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄである。したがって、本発明は、エルロチニブまたは化学療法と組み合わせたエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤の療法に対して反応性でない患者を同定するための方法であって、ＫＲＡＳ変異の存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の変異の存在は、患者が、上述の療法に対して反応しないことを示す方法をさらに提供する。あるいは、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であるヒト対象における腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）上述の腫瘍の試料における野性型ＫＲＡＳタンパク質もしくは野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、野性型ＫＲＡＳタンパク質もしくは野性型ＫＲＡＳ遺伝子の存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示す、または（ｉｉ）上述の腫瘍の試料における変異ＫＲＡＳタンパク質もしくは変異ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、変異ＫＲＡＳタンパク質もしくは変異ＫＲＡＳ遺伝子の非存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることを示す方法を提供する。特定の実施形態では、ＫＲＡＳ変異は活性化変異である。特定の実施形態では、変異は、ＫＲＡＳのエキソン１にある。他の実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄのうちの少なくとも１つである。あるいは、変異体ＫＲＡＳを含む腫瘍を有する個人は、ＥＧＦＲ阻害剤での治療の前、後、または間のいずれかにＫＲＡＳ阻害剤でも治療する場合、ＥＧＦＲ阻害剤で治療してもよい。ＫＲＡＳ変異の存在を決定するための方法は、本明細書中に詳細に記載した、ＥＧＦＲ変異を同定するために使用する方法と類似する。
【００３３】
ＫＲＡＳ変異を呈していたことがわかった、ＩＨＣによりＥＧＦＲについて陽性に染色された腫瘍の患者は、化学療法と組み合わせてエルロチニブで治療した場合、化学療法のみで治療した患者と比較して、生存が非常に短かったことがさらに観察された。以下の表３および４にこれらの結果をまとめる。したがって、ＥＧＦＲ阻害剤のみまたは化学療法剤と組み合わせたいずれかの、エルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤の治療に対して非反応性である患者を同定するための方法であって、上述の患者の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在または非存在を決定することを含み、それによって、上述の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの両方の存在は、患者が、ＥＧＦＲ阻害剤のみまたは化学療法と組み合わせたいずれかの上述のＥＧＦＲ阻害剤療法に対して反応しないことを示す方法を提供する。この文脈では、「非反応性」は、患者が、ＲＥＣＩＳＴ基準による反応を有さないであろうまたは化学療法のみで治療した同様の患者（腫瘍にＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在を有する）よりも生存が低下することを意味する。上述のＥＧＦＲは、変異体ＥＧＦＲまたは野性型ＥＧＦＲのいずれであってもよく、本明細書中に記載する技術を含むがこれらに限定されない任意の技術により決定してもよい。ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳタンパク質またはＫＲＡＳ核酸における変異のことを言い、ＥＧＦＲ変異を検出するための手順と類似する手順を使用して検出される。一実施形態では、ＥＧＦＲの存在は免疫組織化学（ＩＨＣ）により決定する。他の実施形態では、ＥＧＦＲの存在は、正常細胞と比較して上昇したレベルのＥＧＦＲ核酸の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出により決定する。他の実施形態では、ＥＧＦＲは野性型ＥＧＦＲである。他の実施形態では、ＥＧＦＲは変異体ＥＧＦＲである。特定の実施形態では、非反応は、ＲＥＣＩＳＴ基準による完全反応（ＣＲ）の非存在である。他の実施形態では、非反応は、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分反応（ＰＲ）の非存在である。他の実施形態では、非反応は、ＲＥＣＩＳＴ基準による安定（ＳＤ）の非存在である。他の実施形態では、非反応は、生存期間の低下である。
【００３４】
あるいは、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤のみまたは化学療法剤と組み合わせたいずれかの、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応するかどうかを決定するための方法であって、上述の腫瘍の試料において変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ核酸およびＥＧＦＲの存在を決定することを含み、それによって、変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ核酸およびＥＧＦＲの両方の存在は、腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応しないことを示す方法を提供する。この文脈では、「反応する」は、腫瘍のサイズまたは容積が縮小するであろうまたはサイズまたは容積の増加率が低下することを意味する。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤での上述の治療は、化学療法での治療より前、と同時、またはの続きとなる。
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
本発明の診断方法および予後予測方法によれば、野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化が検出される。本発明による野性型遺伝子の変化は、挿入、逆位、欠失、および／または点変異等の変異の形態をすべて包含する。体細胞変異は、ある種の組織でのみ、たとえば腫瘍組織で起こり、生殖細胞系列において遺伝しない変異である。生殖細胞系列変異は、任意の体の組織中に見つけることができる。単一の対立遺伝子のみが体細胞性変異している場合、早期の腫瘍性の状態を示す。しかしながら、両方の対立遺伝子が変異している場合、末期の腫瘍性の状態を示す。したがって、ＥＧＦＲ変異の発見は、本明細書中に記載する診断のおよび予後予測の指標となる。
【００３７】
腫瘍組織で見つけられたＥＧＦＲ変異は、野性型ＥＧＦＲに比べて、シグナル伝達活性の上昇をもたらし、癌性状態につながる可能性がある。野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出するために、腫瘍の試料または生検材料を、当技術分野でよく知られており腫瘍の特定の型および部位に適切な方法により得る。たとえば、肺癌病変の試料を、切除、気管支鏡、細針吸引、もしくは気管支擦過によりまたは痰、胸水、もしくは血液から得てもよい。腫瘍細胞についての組織標本を豊富にするための手段は当技術分野で知られている。たとえば、組織を、パラフィン切片またはクリオスタット切片から単離してもよい。癌細胞を、正常細胞から、フローサイトメトリーまたはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより分離してもよい。腫瘍を正常細胞から分離するためのこれらの技術および他の技術は当技術分野でよく知られている。腫瘍組織が正常細胞と高度に混入している場合、変異の検出はより困難となる。
【００３８】
点変異の検出は、ＥＧＦＲ対立遺伝子（複数可）の分子クローニングおよび当技術分野でよく知られている技術を使用してその対立遺伝子（複数可）を配列決定することにより達成してもよい。あるいは、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から遺伝子配列を直接増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することができる。次いで、増幅した配列のＤＮＡ配列を決定し、変異をＤＮＡ配列から同定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は当技術分野でよく知られており、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７頁，１９８８年、米国特許第４６８３２０３号、および米国特許第４６８３１９５号に記載されている。
【００３９】
ＥＧＦＲエキソン１８〜２１のＰＣＲ増幅に使用することができる特異的なプライマー対は次のものを含む。
【００４０】
【数３】
Ｋ−Ｒａｓエキソン１のＰＣＲ増幅に使用することができる特異的なプライマー対は次のものを含む。
【００４１】
【数４】
当技術分野で知られているリガーゼ連鎖反応はＥＧＦＲ配列を増幅するために使用することができる。Ｗｕら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４巻，５６０〜５６９頁（１９８９年）を参照。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することができる。（ＲｕａｎｏおよびＫｉｄｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７巻，８３９２頁，１９８９年を参照）。この技術によれば、それらの３’末端で特定のＥＧＦＲ突然変異体にハイブリダイズするプライマーを使用する。特定のＥＧＦＲ突然変異体が存在しない場合、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号およびＮｅｗｔｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７巻，７頁，１９８９年に開示されるように、増幅不応性変異系（ＡＲＭＳ）を使用することができる。遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定、および増幅により検出することもできる。さらに、遺伝子または周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、対立遺伝子の変化または多型断片における挿入を調べるために使用することができる。一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析を、対立遺伝子の塩基変化変異形を検出するために使用することもできる。（Ｏｒｉｔａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６巻，２７６６〜２７７０頁，１９８９年，およびＧｅｎｏｍｉｃｓ，５巻，８７４〜８７９頁，１９８９年）。当技術分野で知られている挿入および欠失を検出するための他の技術を使用することができる。
【００４２】
野性型遺伝子の変化を、遺伝子の野性型発現産物の変化に基づき検出することもできる。上記発現産物は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡおよびＥＧＦＲタンパク質産物の両方を含む。ｍＲＮＡの増幅および配列決定によりまたはｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡの分子クローニングを介して点変異を検出してもよい。当技術分野でよく知られているＤＮＡ配列決定技術を使用してクローニングしたｃＤＮＡの配列を決定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してｃＤＮＡを配列決定することもできる。
【００４３】
本発明によれば、ミスマッチ塩基対は、１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸二重鎖である。完全な相補性の非存在は、欠失、挿入、逆位、置換、またはフレームシフト変異によるものであってもよい。遺伝子またはそのｍＲＮＡ産物における点変異を検出するためにミスマッチ検出を使用することができる。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、多くの腫瘍試料に対して行うのに、より簡易である。ミスマッチ切断技術の例は、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８２巻，７５７５頁，１９８５年およびＭｅｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０巻，１２４２頁，１９８５年に詳細に記載されるＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実行において、方法は、ヒト野性型ＥＧＦＲ遺伝子コード配列（またはエキソン１８〜２１またはそのＫＤＲ）に対して相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボプローブおよび腫瘍組織から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡを共にアニールし（ハイブリダイズし）、続いて、二重鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチ塩基対を検出することができる酵素ＲＮａｓｅ Ａで消化する。ミスマッチ塩基対がＲＮａｓｅ Ａにより検出されると、二重鎖ＲＮＡ構造はミスマッチ塩基対の部位で切断される。したがって、アニールしたＲＮＡ調製物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離する場合、ミスマッチ塩基対がＲＮａｓｅ Ａにより検出され、切断されていれば、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについての完全長二重鎖ＲＮＡより小さいＲＮＡ産物が見られるであろう。リボプローブは、完全長のＥＧＦＲ ｍＲＮＡまたはＥＧＦＲ遺伝子である必要はないが、エキソン１８〜２１またはＥＧＦＲ ＫＤＲまたはそれらのセグメントとすることができる。リボプローブがＥＧＦＲ ｍＲＮＡまたはＥＧＦＲ遺伝子のセグメントのみを含む場合、多くのこれらのプローブを使用して、ミスマッチ塩基対に対する全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングすることが望ましいであろう。
【００４４】
同様の方法で、ＤＮＡプローブを使用して、酵素による切断または化学的切断によってミスマッチ塩基対を検出することができる。たとえば、Ｃｏｔｔｏｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８５巻，４３９７頁，１９８８年およびＳｈｅｎｋら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７２巻，９８９頁，１９７５年を参照。あるいは、マッチした二重鎖に比べた、ミスマッチした二重鎖の電気泳動移動度のシフトによりミスマッチ塩基対を検出することができる。たとえば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２巻，７２６頁，１９８８年を参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用い、変異を含むかもしれない細胞ｍＲＮＡまたは細胞ＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、ハイブリダイゼーションの前に増幅することができる。特に変化が欠失および挿入等の全体の再配列である場合、ＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡの変化を、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【００４５】
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅したＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡ配列はまた、対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングしてもよい。これらのプローブは、それぞれが知られている変異を含むＥＧＦＲ遺伝子配列の領域を含む核酸オリゴマーである。たとえば、あるオリゴマーは、ＥＧＦＲ遺伝子配列の一部に対応する、長さが約３０のヌクレオチドであってもよい。一連の上記対立遺伝子特異的プローブの使用により、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、ＥＧＦＲ遺伝子における前に同定した変異の存在を識別することができる。増幅したＥＧＦＲ配列と対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションをたとえばナイロンフィルター上で行うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブへのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおける変異と同様の腫瘍組織における変異の存在を示す。
【００４６】
ポリメラーゼ連鎖反応の使用により増幅したＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡ配列については、変異を質量分析技術によりスクリーニングしてもよい。変異を有する遺伝子の増幅された領域は変異のない同一の領域とは異なる質量スペックシグネチャを有するであろう。
【００４７】
野性型ＥＧＦＲタンパク質の変化をスクリーニングすることにより野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出することができる。たとえば、ＥＧＦＲと免疫反応性のモノクローナル抗体を使用して組織をスクリーニングすることができる。関連する抗原の非存在はＥＧＦＲ変異を示すであろう。変異体対立遺伝子の産物に特異的な抗体を使用して、変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物を検出することもできる。抗体を、ファージディスプレイライブラリーから同定してもよい。上記免疫学的アッセイは、当技術分野で知られている任意の好都合な方式で行うことができる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織化学アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。変化したＥＧＦＲタンパク質を検出するための任意の手段を使用して、野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出することができる。
【００４８】
変異体ＥＧＦＲ遺伝子または変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物は、腫瘍からまたは尿、痰、もしくは血清等の他の体の試料から検出することができる。腫瘍試料における変異体ＥＧＦＲ遺伝子または変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物の検出のための上記に取り上げた同様の技術は、他の体の試料に用いることができる。癌細胞は腫瘍から脱落し、上記体の試料中に出現する。上記体の試料をスクリーニングすることにより、簡易な早期診断を多数の型の癌に対して達成することができる。さらに、化学療法または放射線療法の経過は、上記体の試料を変異体ＥＧＦＲ遺伝子または変異体ＥＧＦＲ遺伝子産物について試験することにより、より容易に監視することができる。
【００４９】
本発明の診断の方法は、ＥＧＦＲが、腫瘍形成における役割を有する任意の腫瘍、たとえば肺、乳房、結腸、神経膠腫、膀胱、肝臓、胃、および前立腺に適用可能である。本発明の診断方法は、臨床医が治療の適切なコースを決めることができるように臨床医にとって有用となる。たとえば、両方のＥＧＦＲ対立遺伝子の変化を呈する腫瘍は、一方のＥＧＦＲ対立遺伝子のみの変化を呈する腫瘍よりも集中的な治療上の投与計画を示唆する可能性がある。
【００５０】
本発明のプライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する、特定のＥＧＦＲ対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は、ＥＧＦＲ遺伝子自体のＤＮＡ合成の増幅を準備をするために、ＥＧＦＲ遺伝子におけるまたはＥＧＦＲ遺伝子を包囲する配列にアニールすることができる。これらのプライマーのセットは、ＥＧＦＲエキソン１８〜２１のヌクレオチドのすべての合成を可能にする。対立遺伝子特異的プライマーもまた使用することができる。上記プライマーは特定のＥＧＦＲ変異体対立遺伝子にのみアニールし、したがって、鋳型としての変異体対立遺伝子の存在下でのみ産物を増幅するであろう。続く増幅した配列のクローニングを促進するために、プライマーは、それらの末端に追加した制限酵素部位配列を有していてもよい。したがって、プライマーのヌクレオチドはすべて、制限酵素部位を形成するのに必要な少数のヌクレオチド以外は、ＥＧＦＲエキソン１８〜２１またはそれらに近接する配列に由来する。上記酵素および部位は当技術分野でよく知られている。プライマー自体は、当技術分野でよく知られている技術を使用して合成することができる。一般に、プライマーは、市販されているオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製することができる。特定のプライマーの設計は、十分に、当技術分野の技術の範囲内である。
【００５１】
本発明により提供された核酸プローブは多くの目的に有用である。核酸プローブは、ゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションおよび既に上記に取り上げた点変異を検出するためのＲＮａｓｅ保護法に使用することができる。プローブを使用して、ＰＣＲ増幅産物を検出することができる。他の技術を使用してＥＧＦＲ遺伝子またはＥＧＦＲ ｍＲＮＡとのミスマッチ塩基対を検出するためにプローブを使用してもよい。ミスマッチ塩基対は、酵素（たとえばＳ１ヌクレアーゼ）、化学物質（たとえばヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジン）、または完全にマッチしたハイブリッドと比較したミスマッチしたハイブリッドの電気泳動移動度の変化を利用して検出することができる。これらの技術は当技術分野で知られている。Ｎｏｖａｃｋら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８３巻，５８６頁，１９８６年を参照。一般に、キナーゼドメインに対するプローブおよびそれらのセグメントも企図されるが、一般に、プローブは、ＥＧＦＲエキソン１８〜２１配列に対して相補的である。全体の一連の核酸プローブは、野性型ＥＧＦＲ遺伝子の変化を検出するためのキットを構成するために使用してもよい。キットは、ＥＧＦＲ遺伝子の全エキソン１８〜２１配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする。プローブは、互いに重複または隣接していてもよい。
【００５２】
リボプローブを、ｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、リボプローブはＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。したがって、リボプローブは、センス鎖に相補的であるので、ＥＧＦＲタンパク質をコードしないという点でアンチセンスプローブである。一般に、リボプローブは、放射性物質、比色定量物質、蛍光定量的物質で標識され、これは、当技術分野で知られている任意の手段により達成することができる。リボプローブを、ＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、リボプローブは、極性のセンスまたはアンチセンスとすることができる。同様に、ＤＮＡプローブもまたミスマッチを検出するために使用してもよい。
【００５３】
ＥＧＦＲ遺伝子の変異についてヒトの任意の組織を試験することにより癌に対する素因を確認することができる。たとえば、生殖細胞系列ＥＧＦＲ変異が遺伝した人は癌になりやすいと思われる。これは、体の任意の組織からのＤＮＡを試験することにより決定することができる。たとえば、血液を取り出し、ＤＮＡを、血液の細胞から抽出することができる。さらに、出生前診断は、ＥＧＦＲ遺伝子の変異について、胎児の細胞、胎盤の細胞、または羊水を試験することにより達成することができる。野性型ＥＧＦＲ対立遺伝子の変化は、たとえば点変異によるものまたは欠失によるもののいずれにせよ、上記に取り上げた任意の手段により検出することができる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
スライド標本−脱パラフィンおよび染色
以下の溶液中に切片を沈めた。
【００５５】
新鮮なキシレン（切片を脱パラフィンするため）−５分間
新鮮なキシレン−５分間
１００％エタノール−１５秒間
９５％エタノール−１５秒間
７０％エタノール−１５秒間
脱イオン水−１５秒間
マイヤーのヘマトキシリン−３０秒間
脱イオン水−すすぎ（×２）−１５秒間
７０％エタノール−１５秒間
エオシンＹ−５秒間
９５％エタノール−１５秒間
９５％エタノール−１５秒間
１００％エタノール−１５秒間
１００％エタノール−１５秒間
キシレン（切片の脱水を確実にするため）−６０秒間
キシレンを完全に除去するために約２分間風乾するまたはエアガンを静かに使用した。
【００５６】
次いで、組織についてＬＣＭの準備をした。
【００５７】
（実施例２）
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションおよびＤＮＡ抽出
材料：
ＰｉｘＣｅｌｌ ＩＩ ＬＣＭシステム
ＣａｐＳｕｒｅ ＨＳ ＬＣＭキャップまたはＣａｐＳｕｒｅ Ｍａｃｒｏ ＬＣＭキャップ
ＥｘｔｒａｃｔＳｕｒｅ装置（ＨＳのみ）
カミソリ刀（工場で殺菌）
０．５ｍｌチューブ
０．２ｍｌチューブ
ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＤＮＡ抽出キット
６５℃インキュベータ
手順：
収集する組織の領域上にＣａｐＳｕｒｅキャップを配置した
２．所望の領域一帯をレーザー処理した
キャップを組織から持ち上げた。
【００５８】
ＰｉｃｏＰｕｒｅ消化バッファー２０μｌをプロテイナーゼＫと共に０．５ｍｌチューブ中に分注した。
【００５９】
キャップを、切り分けた材料と共にチューブ中に置き、密封した。
【００６０】
消化バッファーがキャップを覆うようにチューブを逆にした。
【００６１】
６５℃で２４時間インキュベートした。
【００６２】
キャップと共にチューブを回転させ、チューブの底の消化された物質を収集した。
【００６３】
消化物を、０．２ｍｌストリップチューブに移した。
【００６４】
９５℃、１０分間、蓋を加熱したサーモサイクラー中でプロテイナーゼＫを不活性化した。
【００６５】
１０．５０μｌ ＰＣＲ反応において１〜２μｌの試料を使用した。クリーンアップは必要ではなかった。
【００６６】
（実施例３）
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー：
プライマー対を、配列決定する各エキソン用に設計した（ＥＧＦＲエキソン１８、１９、２０、および２１）。使用したプライマー配列は以下のとおりであった。
【００６７】
【数５】
最初のＰＣＲ産物のネステッド増幅を、最初のＰＣＲ産物内に位置するイントロン特異的プライマー対を使用して行った。これらのネステッドプライマー対はＭ１３ｆ配列およびＭ１３ｒｅｖ配列のタグ付きである。
ＰＣＲの第１ラウンド：
ＰＣＲ反応：
ＤＮＡ ０．５〜３０ｎｇ
プライマー ２５０ｎＭ／各外側のプライマー
ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）カタログ＃１５８１２９５）
ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ（１５ｍＭ １０×バッファー）
酵素 １．５Ｕ／ＲＸ拡張高忠実度Ｔａｑ（ロシュ社 カタログ＃１７５９０７８）
５０μｌ反応容量
サーモサイクラー条件：
９５℃、３分間
９４℃、３０秒間、３５回の繰り返し
５８℃、３０秒間
７２℃、１分間
７２℃、８分間
４℃、常時
ＰＣＲの第２ラウンド：
ＰＣＲ反応：
ＤＮＡ 第１ラウンドＰＣＲ反応からの１μｌ
プライマー ２５０ｎＭ／各内側のプライマー
ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）カタログ＃１５８１２９５）
ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ（１５ｍＭ １０×バッファー）
酵素 １．５Ｕ／ＲＸ拡張高忠実度Ｔａｑ（ロシュ社 カタログ＃１７５９０７８）
５０μｌ反応容量
サーモサイクラー条件：
９５℃、３分間
９４℃、３０秒間、３０回の繰り返し
５８℃、３０秒間
７２℃、１分間
７２℃、８分間
４℃、常時
ＰＣＲ産物の単離：
ＰＣＲ反応産物を、Ｅ−ゲル２％アガロースゲル（インビトロジェン社、カタログ＃Ｇ６０１８−０２）上で品質管理のために走らせた。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ＃２８１８１）を直接使用して精製したまたはゲルを必要に応じて精製した。ゲル精製については、ＰＣＲ産物をＥ−ゲルから切除し、ＤＮＡを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ精製キットを使用し、ゲル抽出プロトコール（キアゲン社、カタログ＃２８１８１）を用いて精製した。
【００６８】
（実施例４）
配列決定
標識ＰＣＲ産物に対するネステッド配列決定プライマーまたは標準的なＭ１３ｆ配列決定プライマーおよびＭ１３ｒｅｖ配列決定プライマーを使用して、精製したＰＣＲ産物を配列決定した。配列は以下のとおりであった。
【００６９】
【数６】
精製したＰＣＲ産物は、ＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（ＡＢＩ社、フォスターシティ、ＣＡ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って、希釈し、サイクルシーケンスした。
反応混合物：
ＤＮＡ ５μｌ（２５〜１００ｎｇ ＰＣＲ産物）
水 ６μｌ
．２５ＯＤ／１００μｌに水で希釈したプライマー １μｌ（ｍ１３ｆプライマーまたはｍ１３ｒプライマーまたは配列特異的プライマー）
ＢｉｇＤｙｅ ｖ３．１ ２μｌ
希釈バッファー ６μｌ（ＡＢＩ社製５×希釈バッファーの均等物）
サイクルシーケンシング：
条件：
９６℃、２．５分間−最初の変性
９６℃、１０秒間
５０℃、５秒間
６０℃、４分間
全サイクルを２５〜５０回繰り返した
反応のクリーンアップ：
次のものを使用して、取り込まれなかったヌクレオチド除去した。
【００７０】
８％セファデックス
エッジバイオシステム社製（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）９６ウェルブロック中５００μｌ
回転＠７５０ｇ、２分間
解析：
反応産物を、ＡＢＩ３７００またはＡＢ１３７３０の配列決定機で電気泳動にかけた。
【００７１】
Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ジーンコード社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ，Ｃｏｒｐ））等の市販されている分析プログラムを使用し、カスタムツールを用いて電気泳動図を変異について分析した。
【００７２】
（実施例５）
用量反応
本研究で使用したヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）野性型および変異体の構築物は、内在性ＥＧＦＲシグナル配列に取って代わる単純ヘルペスウイルスシグナル配列ｇＤのＮ末端におけるエピトープタグ付きである（Ｓｃｈａｅｆｅｒら１９９９年Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７４，８５９〜８６６頁）。Ｃｏｓ７細胞を、１２ウェルディッシュ中、正常増殖培地に、トランスフェクション前の２４時間接種した。細胞を、ウェル当たり０．２５ｕｇで発現プラスミドＤＮＡ（ｐＲＫ５．ｇＤ．ＥＧＦＲ野性型、ｐＲＫ５．ｇＤ．ＥＧＦＲ．Ｌ８５８Ｒ、またはｐＲＫ５．ｇＤ．ＥＧＦＲ．ｄｅｌ（Ｅ７４６−Ｓ７５２））を用い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭｌＮＥ ２０００を使用して、メーカー推奨のプロトコール（インビトロジェン社）に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間、細胞は、６時間、無血清ＤＭＥＭ中で血清不足であった。刺激前の１時間、トランスフェクトした細胞を、示した濃度のエルロチニブでプレインキュベートした。トランスフェクトした細胞を１ｎＭ ＴＧＦαで１０分間刺激した。細胞を、ウェル中で、還元ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファーを使用して直接溶解した。成長因子刺激によるＥＧＦＲ受容体活性化の指標である受容体自己リン酸化をウェスタンブロッティングにより、ＨＲＰ結合抗ホスホチロシン抗体（オンコジーンサイエンス社製（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＢ−４）を使用して検出した。トランスフェクション効率をｇＤエピトープタグ（５Ｂ６）に対する抗体特異性を使用して評価した。受容体活性化のレベルをオートラジオグラムからＮＩＨ画像ソフトウェアを使用して評価した。次いで、４パラメータフィット機能を使用してＩＣ５０を算出したグラフを生成するためにこれらのデータを使用した。以下に結果により示すように、エルロチニブは、変異を含むＥＧＦＲに対して、野性型ＥＧＦＲと比較して、より大きな親和性を有している。
【００７３】
【数７】
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、野性型ＥＧＦＲ１（配列番号１）のアミノ酸配列を示し、このアミノ酸配列において、シグナル配列は残基１〜２４であり、細胞外ドメインは残基２４〜６４５を含み、膜貫通ドメインは残基６４６〜６６８を含み、細胞質ドメインは残基６６９〜１２１０を含む。チロシンキナーゼドメイン領域は残基７１８〜９６４であり、トレオニンリン酸化部位は残基６７８である。
【図２】図２ａ〜２ｄは、野性型ＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列（配列番号２）であり、エキソン１８は、ヌクレオチド２３０８〜２４３０に対応し、エキソン１９は、ヌクレオチド２４３１〜２５２９に対応し、エキソン２０は、ヌクレオチド２５３０〜２７１５に対応し、エキソン２１は、２７１６〜２８７１に対応する。
【図３】図３は、ＥＧＦＲの細胞外（上）および細胞内（下）領域の図示である。
【図４】図４は、野性型ＥＧＦＲ（実線）および変異体ＥＧＦＲ（破線）を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍を有する患者の進行に対する時間を示すカプラン−マイアー曲線である。
【図５】図５は、野性型ＥＧＦＲ（実線）および変異体ＥＧＦＲ（破線）を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍を有する患者の生存を示すカプラン−マイアー曲線である。
【図６】図６は、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞における様々な濃度のエルロチニブでの野性型ＥＧＦＲおよび変異体ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒおよびｄｅｌ７４６−７５２）の自己リン酸化の阻害を示すオートラジオグラフである。
【図７】図７は、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞における様々な濃度のエルロチニブでの野性型ＥＧＦＲおよび変異体ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒおよびｄｅｌ７４６−７５２）の自己リン酸化の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、ＥＧＦＲ遺伝子配列およびＥＧＦＲタンパク質配列のエキソン１８および１９における変異を示す。アミノ酸およびヌクレオチドの変更ならびに挿入は太字の下線を引いたフォントであり、欠失をダッシュ（−）で示す。
【図９】図９は、ＥＧＦＲ遺伝子配列およびＥＧＦＲタンパク質配列のエキソン２０および２１における変異を示す。アミノ酸およびヌクレオチドの変更ならびに挿入は太字の下線を引いたフォントであり、欠失をダッシュ（−）で示す。
【図１０】記載なし。
【図１１】記載なし。
【図１２】記載なし。
【図１３】記載なし。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して非反応性である患者を同定するための方法であって、該患者の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在または非存在を決定することを含み、それによって、ＫＲＡＳ変異とＥＧＦＲとの両方の存在が、患者が該ＥＧＦＲ阻害剤の治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項２】
化学療法剤と組み合わせたＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して非反応性である患者を同定するための方法であって、該患者の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在または非存在を決定することを含み、それによって、該腫瘍におけるＫＲＡＳ変異とＥＧＦＲとの両方の存在が、患者が化学療法と組み合わせた該ＥＧＦＲ阻害剤の治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項３】
腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応するかどうかを決定するための方法であって、該腫瘍の試料においてＥＧＦＲタンパク質またはＥＧＦＲ遺伝子および変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、ＥＧＦＲタンパク質またはＥＧＦＲ遺伝子と変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ遺伝子との両方の存在は、該腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項４】
腫瘍が化学療法剤と組み合わせたＥＧＦＲでの治療に対して反応するかどうかを決定するための方法であって、該腫瘍の試料においてＥＧＦＲおよび変異体ＫＲＡＳの存在を決定することを含み、それによって、ＥＧＦＲタンパク質またはＥＧＦＲ遺伝子と変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ遺伝子との両方の存在が、該腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項５】
前記ＫＲＡＳ変異が活性化変異である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；およびＧ１３Ｄの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、１つまたは複数のセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、またはゲフィチニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤がエルロチニブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学療法剤が、１つまたは複数のシタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウイリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ブレオマイシン、クロラムブチル、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはタモキシフェンである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学療法剤が、カルボプラチンおよび／またはパクリタキセルである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＧＦＲが野性型ＥＧＦＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＧＦＲが変異ＥＧＦＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲの存在が免疫組織化学により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＫＲＡＳ変異の存在が、前記腫瘍由来のＫＲＡＳ核酸または変異を含むと思われるその断片を増幅し、該増幅した核酸を配列決定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＫＲＡＳ変異の存在が、前記腫瘍由来のＫＲＡＳ核酸または変異を含むと思われるその断片を増幅し、増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野性型ＫＲＡＳ核酸または野性型ＫＲＡＳ断片の電気泳動移動度と比較することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項１】
ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して非反応性である患者を同定するための方法であって、該患者の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在または非存在を決定することを含み、それによって、ＫＲＡＳ変異とＥＧＦＲとの両方の存在が、患者が該ＥＧＦＲ阻害剤の治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項２】
化学療法剤と組み合わせたＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して非反応性である患者を同定するための方法であって、該患者の腫瘍におけるＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲの存在または非存在を決定することを含み、それによって、該腫瘍におけるＫＲＡＳ変異とＥＧＦＲとの両方の存在が、患者が化学療法と組み合わせた該ＥＧＦＲ阻害剤の治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項３】
腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応するかどうかを決定するための方法であって、該腫瘍の試料においてＥＧＦＲタンパク質またはＥＧＦＲ遺伝子および変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ遺伝子の存在を決定することを含み、それによって、ＥＧＦＲタンパク質またはＥＧＦＲ遺伝子と変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ遺伝子との両方の存在は、該腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項４】
腫瘍が化学療法剤と組み合わせたＥＧＦＲでの治療に対して反応するかどうかを決定するための方法であって、該腫瘍の試料においてＥＧＦＲおよび変異体ＫＲＡＳの存在を決定することを含み、それによって、ＥＧＦＲタンパク質またはＥＧＦＲ遺伝子と変異体ＫＲＡＳタンパク質または変異体ＫＲＡＳ遺伝子との両方の存在が、該腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して反応しないことを示す、方法。
【請求項５】
前記ＫＲＡＳ変異が活性化変異である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；およびＧ１３Ｄの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、１つまたは複数のセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、またはゲフィチニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤がエルロチニブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学療法剤が、１つまたは複数のシタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウイリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ブレオマイシン、クロラムブチル、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはタモキシフェンである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学療法剤が、カルボプラチンおよび／またはパクリタキセルである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＧＦＲが野性型ＥＧＦＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＧＦＲが変異ＥＧＦＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲの存在が免疫組織化学により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＫＲＡＳ変異の存在が、前記腫瘍由来のＫＲＡＳ核酸または変異を含むと思われるその断片を増幅し、該増幅した核酸を配列決定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＫＲＡＳ変異の存在が、前記腫瘍由来のＫＲＡＳ核酸または変異を含むと思われるその断片を増幅し、増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野性型ＫＲＡＳ核酸または野性型ＫＲＡＳ断片の電気泳動移動度と比較することにより決定される請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５４６４２１（Ｐ２００８−５４６４２１Ａ）
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９３４７（Ｐ２００８−５１９３４７）
【出願日】平成１８年６月１３日（２００６．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３２３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００１８６８
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１３日（２００６．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３２３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００１８６８
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]