Ｆ−１９８４８Ａ及びその製造方法
【課題】ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有する新規な化合物を提供すること。
【解決手段】
下記一般式［１］
【化１】
で表される化合物又はその塩。
【解決手段】
下記一般式［１］
【化１】
で表される化合物又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４とヒアルロン酸の結合を阻害する新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ、該化合物生産菌及び該化合物の製造方法、該化合物及び／又はその塩を用いた、変形性関節症の治療及び／または予防薬の提供等に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は関節軟骨の老化と筋力の低下を基盤に機械的な刺激が加わり、関節にかかる負担に耐えられない軟骨の変性・破壊を生じる疾患である（例えば、非特許文献１参照。）。疼痛が主訴であることが多いため、主な治療には鎮痛薬として非ステロイド性抗炎症薬を投与する対症療法が広く行われている（例えば、非特許文献２参照。）。変形性関節症の根本的な原因である軟骨基質分解の抑制を目指したマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、非特許文献３参照。）は臨床の場で有効性を発揮するには至っていない。
【０００３】
ヒアルロン酸製剤アルツ（和研製薬株式会社商標：ヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液）は現在、変形性関節症に対して有効性を示す薬剤であり、滑液成分であるヒアルロン酸を関節内に直接投与し、補充することにより疼痛を抑制し、関節軟骨の保護作用をもたらす（例えば、非特許文献４及び５参照。）。しかしながらヒアルロン酸製剤には注射剤としての一般的な問題点である、投与の煩雑さ、患者の負担の大きさに加え、投与可能な部位が肩、膝などの比較的大きな関節に限定されるといった問題がある。
【０００４】
一方、生体内におけるヒアルロン酸の分解を阻害する薬剤は、滑液成分であるヒアルロン酸の生体内での減少を防ぐことによってヒアルロン酸を投与した場合と同様の効果を示し、更に、肩・膝関節のみならず、従来ヒアルロン酸製剤の投与が困難であった全身の関節炎への効果を持つことが期待される。
【０００５】
生体内におけるヒアルロン酸の分解は細胞表面に存在するリセプターであるＣＤ４４にヒアルロン酸が結合することによって開始されると考えられている（例えば、非特許文献６参照。）。すなわち、ＣＤ４４とヒアルロン酸の結合を阻害する物質はヒアルロン酸の分解を阻害し、生体内でのヒアルロン酸量を保持、あるいは増加させることにより関節機能改善作用を持つと考えられる。
【非特許文献１】「ランセット（Lancet）」、１９９９年、第３５３巻、ｐ．２１７７−２１７８
【非特許文献２】「アメリカン・ファミリー・フィジシャン（American Family. Physician）」、２００２年、第６５巻、ｐ．８４１−８４８
【非特許文献３】「オステオアスリティス・アンド・カーティリッジ（Osteoarthritis and Cartilage）」、２００２年、第１０巻、ｐ．７８５−７９１
【非特許文献４】「関節外科」、１９９６年、第１５巻、ｐ．１１７３−１１７９
【非特許文献５】「日本整形外科学会雑誌」、１９９５年、第６９巻、ｐ．７３５−７４３、
【非特許文献６】「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Journal of Cell Science）」、１９９３年、第１０６巻、ｐ．３６５−３７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの目的は、ヒアルロン酸とそのリセプターであるＣＤ４４の結合を阻害する物質を取得することである。
【０００７】
本発明の２つ目の目的は、ヒアルロン酸とそのリセプターであるＣＤ４４の結合を阻害する物質の製造方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、生体内でヒアルロン酸の分解を阻害し、疼痛抑制・軟骨保護作用を示す新しい変形性関節症治療薬を提供することである。
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行ったところ、土壌より分離した、ダクリマイセス エスピー（Dacrymyces sp.）ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養液中に、ヒアルロン酸とＣＤ４４の結合を阻害する、下記式（Ｉ）で示される新規化合物Ｆ−１９８４８Ａが産生されることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１０】
【化１】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）
下記一般式（Ｉ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
で表される新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩、
（２）下記の１）乃至８）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
１）性質：酸性、無色粉末；
２）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ４６Ｈ８２Ｏ２０（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
４）分子量：９５４（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより決定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λmax ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収のみである；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０９、２９２６、２８５４、１７３７、１３６９、１２４４、１０８１、１０５１；
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00ppmとした。）
0.91 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.20-1.38 (32H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.46-1.55 (4H, m), 1.63 (1H, m), 1.74 (1H, m), 2.06 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.14-3.28 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.42-3.55 (5H, m), 3.61 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.97 (1H, dd, J=11.7, 5.5 Hz), 4.08 (1H, dd, J=7.7, 4.4 Hz), 4.22 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz), 4.38 (1H, d, J=7.0 Hz), 4.46 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz), 4.62 (1H, d, J=7.3 Hz), 4.67 (1H, d, J=7.7 Hz), 4.71 (1H, m)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.0ppmとした。）
14.6 (q), 20.8 (q), 21.1 (q), 22.4 (t), 23.8 (t), 26.2 (t), 26.8 (t), 30.5-30.9 (12シグナル, t), 33.2 (t), 35.0 (t), 35.5 (t), 35.8 (t), 38.4 (t), 63.5 (t), 64.5 (t), 66.6 (t), 70.6 (d), 71.2 (d), 71.6 (d), 72.5 (d), 72.9 (d), 74.4 (d), 75.7 (d), 75.8 (d), 77.2 (d), 77.6 (d), 80.2 (d), 83.5 (d), 84.6 (d), 102.5 (d), 104.3 (d), 105.6 (d), 172.2 (s), 173.0 (s), 178.3 (s)、
（３）
ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物よりＦ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物を回収することを特徴とする、Ｆ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物の製造方法、
（４） ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物の生産菌がダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）であることを特徴とする、（３）に記載の製造方法、
（５） ダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）、
（６） Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、（２）に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを含むことからなる医薬組成物、
（７） Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、（２）に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを有効成分として含有する変形性関節症治療薬及び／または予防剤、
（８）
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、（２）に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有してなるヒアルロン酸とＣＤ４４の結合阻害剤、
等に関する。
本明細書において、「Ｆ−１９８４８Ａ」とは、下記式（Ｉ）、
【００１４】
【化３】
【００１５】
で表される化合物をいう。
【００１６】
Ｆ−１９８４８Ａは下記の物理化学的性質を示す。
１）性質：酸性、無色粉末；
２）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ４６Ｈ８２Ｏ２０（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
４）分子量：９５４（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより決定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λmax ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収のみである；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０９、２９２６、２８５４、１７３７、１３６９、１２４４、１０８１、１０５１；
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00ppmとした。）
0.91 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.20-1.38 (32H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.46-1.55 (4H, m), 1.63 (1H, m), 1.74 (1H, m), 2.06 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.14-3.28 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.42-3.55 (5H, m), 3.61 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.97 (1H, dd, J=11.7, 5.5 Hz), 4.08 (1H, dd, J=7.7, 4.4 Hz), 4.22 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz), 4.38 (1H, d, J=7.0 Hz), 4.46 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz), 4.62 (1H, d, J=7.3 Hz), 4.67 (1H, d, J=7.7 Hz), 4.71 (1H, m)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.0ppmとした。）
14.6 (q), 20.8 (q), 21.1 (q), 22.4 (t), 23.8 (t), 26.2 (t), 26.8 (t), 30.5-30.9 (12シグナル, t), 33.2 (t), 35.0 (t), 35.5 (t), 35.8 (t), 38.4 (t), 63.5 (t), 64.5 (t), 66.6 (t), 70.6 (d), 71.2 (d), 71.6 (d), 72.5 (d), 72.9 (d), 74.4 (d), 75.7 (d), 75.8 (d), 77.2 (d), 77.6 (d), 80.2 (d), 83.5 (d), 84.6 (d), 102.5 (d), 104.3 (d), 105.6 (d), 172.2 (s), 173.0 (s), 178.3 (s)。
【００１７】
本発明の新規化合物Ｆ−１９８４８Ａは、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で表されているが、ラセミ化合物等それらの異性体ならびにそれらの異性体の混合物も全て本発明のＦ−１９８４８Ａに含まれる。立体特異的合成法、あるいは光学活性化合物を原料化合物とする合成法により、本発明のＦ−１９８４８Ａの各異性体を直接製造することができる。また、先ず各異性体の混合物を製造し、次いで該混合物より所望の各異性体を分離することができる。
【００１８】
Ｆ−１９８４８Ａはカルボン酸基等を有し、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明にはＦ−１９８４８Ａ及びその塩も包含される。Ｆ−１９８４８Ａの塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。また、Ｆ−１９８４８Ａの塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として使用される場合には、該用途に用いることのできるものであれば特に限定されない。Ｆ−１９８４８Ａの塩としては、例えば、アンモニウム塩のような無機塩；ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。Ｆ−１９８４８Ａの好適な塩としては、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００１９】
また、Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩は溶剤和物になり得る。例えば、大気中での放置、再結晶などを経て、吸着水の付加、水和物化等が時に生じ得る。それらの溶剤和物も本発明に包含される。
【００２０】
さらに、本発明は、生体内において代謝されてＦ−１９８４８Ａ及び／又はその塩に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て包含する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４とヒアルロン酸の結合阻害活性を有する新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ及びその塩、その製造方法及びＦ−１９８４８Ａを製造する微生物ダクリマイセス エスピー（Dacrymyces sp.）が提供された。さらに、本発明によって、新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩を有効成分とする、変形性関節症の治療及び／又は予防薬が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．Ｆ−１９８４８Ａ生産菌
Ｆ−１９８４８Ａは、日本国滋賀県で採集した担子菌子実体の担子胞子より分離されたダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４株（以下、単に「ＳＡＮＫ ２０２０４株」ともいう。）の培養物中に見出された。
【００２３】
Ｆ−１９８４８Ａ生産菌としては、Ｆ−１９８４８Ａを生産する微生物であれば特に限定されるものではないが、好適にはＦ−１９８４８Ａを生産する菌であり、より好適にはＦ−１９８４８Ａを生産するダクリマイセス（Dacrymyces）属の菌であり、さらに好適には前記の特性を有し且つＦ−１９８４８Ａを生産するダクリマイセス（Dacrymyces）属の菌であり、最適にはダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４株である。
【００２４】
ＳＡＮＫ ２０２０４株について以下に記載する。
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
【００２５】
（表１）培地組成
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
＜ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天（Potato Dextrose Agar）培地）＞
ポテトデキストロース寒天培地「ニッスイ」（日水製薬（株）製） ３９ｇ
寒天 ５ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
＜ＭＥＡ培地（麦芽エキス寒天培地）＞
麦芽エキス １２．５ｇ
寒天 ２０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養下での菌学的性状は次の通りである。
ＰＤＡ培地上での成長は、２３℃、２週間の培養で３〜５ｍｍである。菌そうは綿毛状、白色である。裏面は変化なし。浸出液および匂いはない。気菌糸は幅１〜１．５μｍ、薄壁で平滑である。隔壁にかすがい連結はない。分生子は形成されない。
ＭＥＡ培地上での成長は、２３℃、２週間の培養で６〜７ｍｍである。菌そうは薄く圧伏、白色である。裏面は変化なし。浸出液および匂いはない。
【００２６】
ＳＡＮＫ ２０２０４株を同定するため、分離に供試した子実体乾燥標本の菌学的性状を観察した。その乾燥標本の菌学的性状は次の通りである。
子実体は群生、平らに広がり、径は０．６〜６ｍｍ、軟ゼラチン質、乾燥時は淡黄色である。担子器は（２０〜３３）×（４〜６μｍ）（小柄を除いた円筒部分）、Ｙ字型、基部にかすがい連結はない。小柄は１８以下×３μｍ。担子胞子は（９〜１５）×（５〜７μｍ）、（０〜）３隔壁、長楕円形〜豆形、厚壁、平滑である。分生子は観察されない。
【００２７】
本菌の以上のような菌学的性状は、マクナブ「タキソノミックスタディーインザダクリマイセタシー. VIII. ダクリマイセス」、ニュージーランドジャーナルオブボタニー、１９７３年、第１１巻、ｐ．４６１−５２４（ＭｃＮａｂｂ ＲＦＲ， “Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｔａｃｅａｅ ＶＩＩＩ． Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ Ｎｅｅｓ ｅｘ Ｆｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ １１， ｐ．４６１−５２４（１９７３））のアカキクラゲ属（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ）の記載に一致した。よって本菌株を、ダクリマイセス エスピー（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ ｓｐ．）と同定した。
なお、ＳＡＮＫ ２０２０４株は、ダクリマイセス エスピー（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ ｓｐ. ＳＡＮＫ ２０２０４株として、平成１６年９月１５日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４を付与された。
【００２８】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ ２０２０４株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ ２０２０４株はその全ての変異株を包含する。
【００２９】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ｆ−１９８４８Ａを生産するＳＡＮＫ ２０２０４株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ ２０２０４株に包含される。
【００３０】
２．培養
Ｆ−１９８４８Ａ生産菌は、微生物による発酵生産に通常使用されるような、微生物が同化できる炭素源、窒素源および無機塩を含有する培地を用いて培養することができる。
【００３１】
炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、押麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単独で用いるか、あるいは２つ以上を併用することができる。炭素源の含有量は、通常、培地量の１〜１０重量％で変量する。
【００３２】
窒素源としては、蛋白質もしくはその加水分解物を含有する物質、無機塩等を用いることができる。そのような窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等を例示することができる、それらは単独で用いるか、あるいは２つ以上を併用することができる。窒素源の含有量は、通常、培地量の０．１〜１０重量％の範囲で変量する。
【００３３】
栄養無機塩としては、イオンを得ることができる通常の塩類、金属等を用いることができる。塩類としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等を例示することができる。金属としては、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の金属を例示することができる。また、菌の資化しうるビタミンＢ１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質等も必要に応じて添加してもよい。
【００３４】
Ｆ−１９８４８Ａ生産菌を液体培養するに際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等を消泡剤として使用することができる。Ｆ−１９８４８Ａを製造する目的でＳＡＮＫ ２０２０４株を培養する際の培地のｐＨは、培地の成分、生育温度等により異なるが、通常発酵生成物を生産するために用いられるｐＨであればよい。
ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養温度は、培地の成分、ｐＨ等により異なるが、通常、１０℃〜３０℃であり、１８〜２８℃の範囲が生育に良好である。Ｆ−１９８４８Ａの生産には、２０〜２６℃が好適である。
【００３５】
Ｆ−１９８４８Ａ製造のための培養方法としては、特に制限はなく、微生物一般に用いられる培養方法であればよく、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法等を使用することができる。
【００３６】
以下にＳＡＮＫ ２０２０４株の培養法を示すが、Ｆ−１９８４８Ａを製造できる限りにおいて、本方法に限定されない。
ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養は、通常、１つ又は２つ以上の段階からなる種培養より開始し、ロータリー振盪培養機中で２０〜２６℃（好適には２３℃）で、５〜１０日間（好適には７日間）あるいは十分に生育するまで振とうして行う。
ＳＡＮＫ ２０２０４株を固体培養する場合、上記の種培養液を三角フラスコなどの固体培地培養容器中の本培養培地に接種することができる。培養は、接種した固体培地培養容器を２０〜２６℃（好適には２３℃）で１０〜２０日間（好適には１４日間）静置して、生産培養を行なう。このようにして得られた本培養培地（培養物）中に所望のＦ−１９８４８Ａを得ることができる。
ＳＡＮＫ ２０２０４株を比較的小さな規模で液体培養する場合、本培養培地を含む三角フラスコに種培養液を接種し、ロータリー振盪培養機中で、２０〜２６℃（好適には２３℃）で数日間振とうする。
【００３７】
一方、ＳＡＮＫ ２０２０４株を比較的大きな規模で液体培養する場合、攪拌機、通気装置、保温装置等をつけた適当なタンクを用いることが好ましい。該装置を用いることにより、培地を予め該タンクの中で作製することができる。例えば、本培養培地を１２１℃にて加熱滅菌し、冷却する。次いで、種培養物を接種し、２３℃にて通気攪拌しつつ本培養を行う。このような培養方法は、所望のＦ−１９８４８Ａを大量に製造するのに適している。
【００３８】
本発明のＦ−１９８４８Ａ生産菌を培養して該物質を製造する場合、該培養物中のＦ−１９８４８Ａの生産量は、後述する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、生物活性試験等により、経時的に追跡することができる。ＨＰＬＣ分析又は生物活性試験にて追跡する場合、予め、培養物をアセトン等の親水性溶媒で抽出し、該親水性溶媒を留去した後、ｎ−ブタノール等の水と混和しない溶媒で抽出する。次いで、該水と混和しない溶媒を留去した後、適当な溶媒に再溶解したものを分析又は試験に供することが好ましい。生物活性試験としては、ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験等を挙げることができる。
【００３９】
３．Ｆ−１９８４８Ａの回収
培養終了後、珪藻土等を助剤とするろ過操作又は遠心分離操作等により、培養物を可溶性画分（培養上清）および不溶性画分（菌体）に分別し、次いで得られた各画分中に存在するＦ−１９８４８Ａを、その物理化学的性状を利用して抽出精製することによってＦ−１９８４８Ａを回収することができる。
【００４０】
例えば、培養上清を、ｎ−ブタノール、酢酸エチルなど水と混和しない有機溶媒の１つ又は２つ以上の混合物を用いて抽出することにより、該抽出物より、Ｆ−１９８４８Ａを精製することができる。
【００４１】
得られた抽出物を、各種吸着用樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することができる。吸着剤としては、活性炭、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上三菱化学（株）社製）等を挙げることができる。前記の抽出物をこれらの吸着剤と接触させてＦ−１９８４８Ａを吸着せしめた後、メタノール水、アセトン水等の含水溶媒を用いて所望のＦ−１９８４８Ａを溶出することができる。反対に、前記の抽出物をこれらの吸着剤と接触させて不純物を吸着せしめ、所望のＦ−１９８４８Ａを素通り画分中に回収することもできる。
【００４２】
得られたＦ−１９８４８Ａ含有画分を、イオン交換クロマトグラフィーに供することができる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス ５０Ｗｘ４、ダウエックス１ｘ２、ダウエックス ＳＢＲ−Ｐ（以上、ダウ・ケミカル社製）等を挙げることができる。Ｆ−１９８４８Ａ含有画分をイオン交換樹脂と接触させてＦ−１９８４８Ａを吸着せしめた後、塩酸、アンモニア等の溶媒を用いて所望のＦ−１９８４８Ａを溶出することができる。反対に、前記の抽出物をこれらのイオン交換樹脂と接触させて不純物を吸着せしめ、所望のＦ−１９８４８Ａを素通り画分中に回収することもできる。
【００４３】
得られたＦ−１９８４８Ａ含有画分を、さらに、シリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジル等の担体を用いた吸着カラム・クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（登録商標、トーソー（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（登録商標、アマシャム バイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィー、コスモシール１４０Ｃ１８（登録商標、ナカライテスク社製）等を用いた逆相カラムクロマトグラフィー、順相もしくは逆相カラムを用いたＨＰＬＣ等により精製し、所望のＦ−１９８４８Ａを単離することができる。
【００４４】
本発明のＦ−１９８４８Ａを精製する際の、各精製工程における該物質の挙動は、例えば、次の条件によるＨＰＬＣにより追跡することができる。
【００４５】
（Ｆ−１９８４８Ａを検出するためのＨＰＬＣの条件）
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１３：７
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ５．６分
【００４６】
４．ヒアルロン酸ＣＤ−４４結合阻害試験
Ｆ−１９８４８Ａがヒアルロン酸とＣＤ４４が結合するのを阻害する活性を有することが本発明者らによって明らかにされた。ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害試験（「ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験」という。）はヒアルロン酸とＣＤ４４との結合に対する本発明のＦ−１９８４８Ａの影響を調べることができる限りにおいて特に制限されないが、例えば後の（試験例１）に詳述するように、ヒトＣＤ４４発現細胞懸濁液に蛍光ヒアルロン酸と被験化合物（Ｆ−１９８４８Ａ）を添加して、蛍光ヒアルロン酸のＣＤ４４への特異的吸着量を測定する方法を用いることができる。
【００４７】
５．Ｆ−１９８４８Ａの作用
本発明において「変形性関節症」とは慢性の関節炎を伴う関節疾患であり、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨及び／又は軟骨の増殖性変化をきたす疾患を意味する。変形性関節症としては変形性膝関節症、変形性肩関節症、変形性股関節症、変形性肘関節症、変形性足関節症、変形性手関節症、変形性指関節症等を例示することが出来る。
【００４８】
Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩は、ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有することが本発明者らによって明らかにされた。したがって、Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩は、変形性関節症の治療薬または予防薬の用途に有効であり、肩及び膝関節等の大きな関節のみならず、全身の関節炎の治療又は予防に好適である。すなわち、本発明は、Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩を含むことからなる医薬組成物、並びに、該物質を有効成分として含有する変形性関節症の治療又は予防剤を提供する。
【００４９】
本発明のＦ−１９８４８Ａ又はその塩は、医薬としてヒト又はヒト以外の動物に投与されるに際し、種々の形態をとり得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。軟膏等は外用剤として使用される。
【００５０】
Ｆ−１９８４８Ａを有効成分として含有する医薬製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。
【００５１】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を挙げることができる。錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。
【００５２】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤を挙げることができる。
【００５３】
注射剤として調製される場合、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤として当該分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。等張を維持するために充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有せしめてもよい。溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤糖、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有せしめてもよい。
【００５４】
なお、注射剤を静脈内投与する場合、単独で、ブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、又は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等とのエマルジョンとして投与される。
【００５５】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００５６】
軟膏等の外用剤の形態に成形するに際しては、賦型剤として、疎水性基剤（油脂性軟膏基剤）、吸水基剤、親水性基剤（クリーム）ならびに水溶性基剤（非グリース製軟膏基剤）のいずれか一つに属する、当該分野で公知のものを広く使用することができる。
【００５７】
上述の医薬製剤に含有せしめるＦ−１９８４８Ａ又はその塩の量は、特に限定されないが、上限は３０〜７０重量％、下限は１重量％であり、好適な範囲は１〜３０重量％である。
【００５８】
Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり投与するＦ−１９８４８Ａ又はその塩の量は、上限が１００〜１０００ｍｇ、下限が１〜１０ｍｇであり、好適な範囲は１０〜１００ｍｇである。
【００５９】
Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩の投与回数は、数日に１回、１日１回、又は１日複数回である。
【００６０】
本発明は、薬理上有効な量のＦ−１９８４８Ａ又はその塩を投与することからなる炎症性疾患、炎症又は感染症の治療又は予防方法、それら疾患の治療又は予防のためのＦ−１９８４８Ａ又はその塩の使用をも提供する。
【実施例】
【００６１】
次に、実施例、試験例、製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００６２】
（実施例１）．Ｆ−１９８４８Ａ生産菌の培養
ダクリマイセス エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４株（以下、「ＳＡＮＫ ２０２０４株」とする。）のスラントより約１ｃｍ角の菌糸片を切り取りあらかじめ滅菌水約３ｍｌで満たしたガラス製ホモジナイザー中に懸濁した。ガラス製ホモジナイザーを用いて菌糸片をホモジナイズし、全量を滅菌（１２１℃、２０分間）した後述の組成からなる種培養培地３０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコに接種した。同様の操作を行い、１５本の種培養フラスコを用意した。２３℃で２１０ｒｐｍのロータリー振とう培養機中で７日間培養した。このようにして得られた種培養液を、滅菌（１２１℃、４０分間）した後述の生産培養培地の培地組成を含む５００ｍｌ容固体培地培養容器（藤森工業 アグリフレックス）３０本にそれぞれ１５ｍｌ接種し、２３℃で静置して１４日間培養した。
【００６３】
（表２）種培養培地の培地組成
―――――――――――――――――――――――――――――――――
グルコース ４ｇ
マルトエキス（Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ４ｇ
寒天 ３ｇ
消泡剤＊ ０．０５ｍｌ
蒸留水 １０００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
＊ ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（登録商標、日本油脂（株）社製）
（表３）生産培養培地の培地組成（５００ｍｌ容固体培地培養容器1本あたり）
―――――――――――――――――――――――――――――――――
押麦（大麦） ６４ｇ
マンニトール １ｇ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物 ０．５ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ０．５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ
蒸留水 １００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
【００６４】
（実施例２）．Ｆ−１９８４８Ａの単離
実施例１で得られた培養物３Ｌにアセトン３Ｌを加えて抽出した後、これを遠心分離してアセトン抽出液を得た。このアセトン抽出液を減圧下濃縮してアセトンを留去し、ｐＨ３．０に調整後、酢酸エチル抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−１９８４８Ａを含む抽出物７．５ｇを得た。
次いで、コスモシルカラム・クロマトグラフィーを行った。すなわち、前記抽出物７．５ｇにアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝２：３、１００ｍｌを加え、予めアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝２：３で平衡化したコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ、容積２５０ｍｌ）に付した。該カラムを、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝２：３（９１０ｍｌ）、で洗浄した後、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１：１（４６０ｍｌ）、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１１：９（１１８０ｍｌ）を用いて吸着画分を段階的に溶出させ、溶出液を２０ｍｌずつ８２個の画分として回収した。
【００６５】
Ｆ−１９８４８Ａを含む溶出画分Ｎｏ．４０〜Ｎｏ．５７を合併し（３６０ｍｌ）、減圧下で濃縮することによりアセトニトリルを留去した後、酢酸エチル抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それをろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−１９８４８Ａ質を含む部分精製物４０２．８ｍｇを得た。
この部分精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）で分離した。部分精製物４０２．８ｍｇをアセトニトリル：０．６％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：２、３．３ｍｌに溶解したものを試料溶液とした。この試料溶液３００μｌを、あらかじめアセトニトリル：０．６％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：２で平衡化したカラムに注入後、アセトニトリル：０．６％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：２を溶媒として、流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニターし、保持時間１３．５から１７．３分までを分取した。残りの試料溶液についても同様の操作を行い、活性画分２５０ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それをろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−１９８４８Ａの無色粉末１８２ｍｇを得た。
【００６６】
このようにして得たＦ−１９８４８Ａを下記条件のＨＰＬＣにて分析した：
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１３：７
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ５．６分
【００６７】
（試験例１）．ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験
ヒトＣＤ４４のｃＤＮＡはヒトリンパ節由来ｃＤＮＡライブラリー（ＴＡＫＡＲＡ）を鋳型にＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーはデータベース（GenBank）より得られたＣＤ４４ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Accession number）： U40373：配列表の配列番号１）のアミノ酸コード領域のヌクレオチド番号６５乃至８５の５’側にSal I切断点とKozac配列（Nucleic Acids Research、15巻、8125‐8148頁、1987年）を導入したプライマー１：
5’-AGCTAGGTCGACACCATGGACAAGTTTTGGTGGCAC-3’（配列表の配列番号３）
と第1130塩基から第1150塩基の相補鎖の5’側にHind III切断点を導入したプライマー２：
5’-AGCTAGAAGCTTACACCCCAATCTTCATGTC-3’（配列表の配列番号４）
を用いた。ＰＣＲ増幅産物を制限酵素Sal I（ＴＡＫＡＲＡ）とHind III（ＴＡＫＡＲＡ）により切断し、この断片を発現ベクター、ｐＲＫ５（ファーミンジェン）に組み込んだ。これをリン酸カルシウム法によりｐＳＶ２ｎｅｏ（インビトロジェン）とともにコラーゲンコートシャーレ上で１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン）を用い培養したヒト腎臓上皮由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３、アメリカン タイプ カルチャー コレクション）に導入し、抗生物質Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）により遺伝子導入細胞を選択した。抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体（バイオメダ）を用い、ウエスタンブロッティングによりＣＤ４４の発現を確認した。このＣＤ４４発現細胞を４日間培養したあとカルシウムイオン、マグネシウムイオンフリーのダルベッコリン酸バッファー（以下、ＰＢＳと称する。）で洗浄し、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳでシャーレからはがした。遠心（１８００×ｇ、５分）により細胞を回収した後、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸バッファーｐＨ７．８（以下、「バッファーＡ」と称する。）で２度洗浄した。細胞を再度バッファーＡに懸濁し、２分間の超音波処理による破砕の後、４００×ｇで１０分間遠心した。この上清を２０,０００×ｇで１時間遠心し、沈殿をバッファーＡで１度洗浄後、バッファーＡ中で超音波処理し、均一化したものをＣＤ４４発現細胞膜懸濁液とした。
蛍光ヒアルロン酸はベルダーらの方法（Carbohydrate Research、44巻、251−257頁、1975年）に若干の修正を加え、以下のように調製した。５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業、鶏冠由来、分子量１．５８×１０６）を４０ｍｌの蒸留水に溶解し、２０ｍｌのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）と混合した。この混合液にアセトアルデヒド（２５μｌ、フルカ）とシクロヘキシルイソシアニド(２５μｌ、フルカ)を含むＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解したフルオロセインアミン−アイソタイプＩ（２５ｍｇ、アルドリッチ）を加えた。室温（約２５℃）で５時間攪拌した後、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、沈殿した蛍光ヒアルロン酸を遠心（１０００×ｇ、１５分）で回収した。これを６０ｍｌの蒸留水に溶解し、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールで沈殿させ、回収する作業を２度繰り返した後、１０ｍｌの蒸留水に溶解し、透析により脱塩を行い、蛍光ヒアルロン酸溶液とした。
上記ＣＤ４４発現細胞膜懸濁液（タンパク質濃度として１００μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルガラス繊維濾紙黒色プレート（ユニフィルター、疎水性ＧＦ／Ｃ膜、ワットマン）に１ウェルに対し２００μｌ分注し、ここへメタノールで溶解した被検化合物（Ｆ−１９８４８Ａ）を１μｌ添加した後、さらに蛍光ヒアルロン酸０．２μｇを添加した。室温で１時間インキュベートした後、液体をマルチスクリーン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて吸引濾過した。これにバッファーＡを１ウェルあたり２５０μｌ添加し、吸引濾過する操作を６回繰り返すことによりフィルターに吸着した細胞膜を洗浄した。洗浄後、１ウェルに対し０．３Ｎ 水酸化ナトリウムを１００μｌ添加し、アルボ（アマシャム−ファルマシア）により、励起光４８５ｎｍによる発光光５３５ｎｍを測定し、ＣＤ４４発現細胞膜への蛍光ヒアルロン酸の結合量を検出した。蛍光ヒアルロン酸の非特異的結合は過剰量の非標識ヒアルロン酸（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加えることにより検出した。蛍光ヒアルロン酸の全結合と非特異的結合の差を特異的結合とし、特異的結合に対する阻害率（％）を算出した。表４に、Ｆ−１９８４８Ａを終濃度でそれぞれ４０、３０、２０および１０μＭ添加した場合の阻害率（％）の平均値と標準偏差を示した。Ｆ−１９８４８Ａはヒアルロン酸とＣＤ４４との結合を顕著に阻害し、ＩＣ５０値は２３．５μＭであった（表４）。
【００６８】
（表４）
（製剤例１）．経口用カプセル剤
下記表５に記載の処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
（表５） Ｆ−１９８４８Ａ含有経口カプセル剤
―――――――――――――――――――――――――――――
Ｆ−１９８４８Ａ ３０ｍｇ
乳糖 １７０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――
合計 ３５２ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の提供するＦ−１９８４８Ａは、優れたヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有し、変形性関節症およびそれに起因する疾患の治療または予防に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号３：ＣＤ４４用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号４：ＣＤ４４用アンチセンスプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４とヒアルロン酸の結合を阻害する新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ、該化合物生産菌及び該化合物の製造方法、該化合物及び／又はその塩を用いた、変形性関節症の治療及び／または予防薬の提供等に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は関節軟骨の老化と筋力の低下を基盤に機械的な刺激が加わり、関節にかかる負担に耐えられない軟骨の変性・破壊を生じる疾患である（例えば、非特許文献１参照。）。疼痛が主訴であることが多いため、主な治療には鎮痛薬として非ステロイド性抗炎症薬を投与する対症療法が広く行われている（例えば、非特許文献２参照。）。変形性関節症の根本的な原因である軟骨基質分解の抑制を目指したマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、非特許文献３参照。）は臨床の場で有効性を発揮するには至っていない。
【０００３】
ヒアルロン酸製剤アルツ（和研製薬株式会社商標：ヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液）は現在、変形性関節症に対して有効性を示す薬剤であり、滑液成分であるヒアルロン酸を関節内に直接投与し、補充することにより疼痛を抑制し、関節軟骨の保護作用をもたらす（例えば、非特許文献４及び５参照。）。しかしながらヒアルロン酸製剤には注射剤としての一般的な問題点である、投与の煩雑さ、患者の負担の大きさに加え、投与可能な部位が肩、膝などの比較的大きな関節に限定されるといった問題がある。
【０００４】
一方、生体内におけるヒアルロン酸の分解を阻害する薬剤は、滑液成分であるヒアルロン酸の生体内での減少を防ぐことによってヒアルロン酸を投与した場合と同様の効果を示し、更に、肩・膝関節のみならず、従来ヒアルロン酸製剤の投与が困難であった全身の関節炎への効果を持つことが期待される。
【０００５】
生体内におけるヒアルロン酸の分解は細胞表面に存在するリセプターであるＣＤ４４にヒアルロン酸が結合することによって開始されると考えられている（例えば、非特許文献６参照。）。すなわち、ＣＤ４４とヒアルロン酸の結合を阻害する物質はヒアルロン酸の分解を阻害し、生体内でのヒアルロン酸量を保持、あるいは増加させることにより関節機能改善作用を持つと考えられる。
【非特許文献１】「ランセット（Lancet）」、１９９９年、第３５３巻、ｐ．２１７７−２１７８
【非特許文献２】「アメリカン・ファミリー・フィジシャン（American Family. Physician）」、２００２年、第６５巻、ｐ．８４１−８４８
【非特許文献３】「オステオアスリティス・アンド・カーティリッジ（Osteoarthritis and Cartilage）」、２００２年、第１０巻、ｐ．７８５−７９１
【非特許文献４】「関節外科」、１９９６年、第１５巻、ｐ．１１７３−１１７９
【非特許文献５】「日本整形外科学会雑誌」、１９９５年、第６９巻、ｐ．７３５−７４３、
【非特許文献６】「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Journal of Cell Science）」、１９９３年、第１０６巻、ｐ．３６５−３７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの目的は、ヒアルロン酸とそのリセプターであるＣＤ４４の結合を阻害する物質を取得することである。
【０００７】
本発明の２つ目の目的は、ヒアルロン酸とそのリセプターであるＣＤ４４の結合を阻害する物質の製造方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、生体内でヒアルロン酸の分解を阻害し、疼痛抑制・軟骨保護作用を示す新しい変形性関節症治療薬を提供することである。
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行ったところ、土壌より分離した、ダクリマイセス エスピー（Dacrymyces sp.）ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養液中に、ヒアルロン酸とＣＤ４４の結合を阻害する、下記式（Ｉ）で示される新規化合物Ｆ−１９８４８Ａが産生されることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１０】
【化１】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）
下記一般式（Ｉ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
で表される新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩、
（２）下記の１）乃至８）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
１）性質：酸性、無色粉末；
２）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ４６Ｈ８２Ｏ２０（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
４）分子量：９５４（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより決定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λmax ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収のみである；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０９、２９２６、２８５４、１７３７、１３６９、１２４４、１０８１、１０５１；
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00ppmとした。）
0.91 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.20-1.38 (32H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.46-1.55 (4H, m), 1.63 (1H, m), 1.74 (1H, m), 2.06 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.14-3.28 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.42-3.55 (5H, m), 3.61 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.97 (1H, dd, J=11.7, 5.5 Hz), 4.08 (1H, dd, J=7.7, 4.4 Hz), 4.22 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz), 4.38 (1H, d, J=7.0 Hz), 4.46 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz), 4.62 (1H, d, J=7.3 Hz), 4.67 (1H, d, J=7.7 Hz), 4.71 (1H, m)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.0ppmとした。）
14.6 (q), 20.8 (q), 21.1 (q), 22.4 (t), 23.8 (t), 26.2 (t), 26.8 (t), 30.5-30.9 (12シグナル, t), 33.2 (t), 35.0 (t), 35.5 (t), 35.8 (t), 38.4 (t), 63.5 (t), 64.5 (t), 66.6 (t), 70.6 (d), 71.2 (d), 71.6 (d), 72.5 (d), 72.9 (d), 74.4 (d), 75.7 (d), 75.8 (d), 77.2 (d), 77.6 (d), 80.2 (d), 83.5 (d), 84.6 (d), 102.5 (d), 104.3 (d), 105.6 (d), 172.2 (s), 173.0 (s), 178.3 (s)、
（３）
ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物よりＦ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物を回収することを特徴とする、Ｆ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物の製造方法、
（４） ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は（２）に記載の化合物の生産菌がダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）であることを特徴とする、（３）に記載の製造方法、
（５） ダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）、
（６） Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、（２）に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを含むことからなる医薬組成物、
（７） Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、（２）に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを有効成分として含有する変形性関節症治療薬及び／または予防剤、
（８）
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、（２）に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有してなるヒアルロン酸とＣＤ４４の結合阻害剤、
等に関する。
本明細書において、「Ｆ−１９８４８Ａ」とは、下記式（Ｉ）、
【００１４】
【化３】
【００１５】
で表される化合物をいう。
【００１６】
Ｆ−１９８４８Ａは下記の物理化学的性質を示す。
１）性質：酸性、無色粉末；
２）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ４６Ｈ８２Ｏ２０（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
４）分子量：９５４（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより決定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λmax ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収のみである；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０９、２９２６、２８５４、１７３７、１３６９、１２４４、１０８１、１０５１；
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00ppmとした。）
0.91 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.20-1.38 (32H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.46-1.55 (4H, m), 1.63 (1H, m), 1.74 (1H, m), 2.06 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.14-3.28 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.42-3.55 (5H, m), 3.61 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.97 (1H, dd, J=11.7, 5.5 Hz), 4.08 (1H, dd, J=7.7, 4.4 Hz), 4.22 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz), 4.38 (1H, d, J=7.0 Hz), 4.46 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz), 4.62 (1H, d, J=7.3 Hz), 4.67 (1H, d, J=7.7 Hz), 4.71 (1H, m)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.0ppmとした。）
14.6 (q), 20.8 (q), 21.1 (q), 22.4 (t), 23.8 (t), 26.2 (t), 26.8 (t), 30.5-30.9 (12シグナル, t), 33.2 (t), 35.0 (t), 35.5 (t), 35.8 (t), 38.4 (t), 63.5 (t), 64.5 (t), 66.6 (t), 70.6 (d), 71.2 (d), 71.6 (d), 72.5 (d), 72.9 (d), 74.4 (d), 75.7 (d), 75.8 (d), 77.2 (d), 77.6 (d), 80.2 (d), 83.5 (d), 84.6 (d), 102.5 (d), 104.3 (d), 105.6 (d), 172.2 (s), 173.0 (s), 178.3 (s)。
【００１７】
本発明の新規化合物Ｆ−１９８４８Ａは、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で表されているが、ラセミ化合物等それらの異性体ならびにそれらの異性体の混合物も全て本発明のＦ−１９８４８Ａに含まれる。立体特異的合成法、あるいは光学活性化合物を原料化合物とする合成法により、本発明のＦ−１９８４８Ａの各異性体を直接製造することができる。また、先ず各異性体の混合物を製造し、次いで該混合物より所望の各異性体を分離することができる。
【００１８】
Ｆ−１９８４８Ａはカルボン酸基等を有し、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明にはＦ−１９８４８Ａ及びその塩も包含される。Ｆ−１９８４８Ａの塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。また、Ｆ−１９８４８Ａの塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として使用される場合には、該用途に用いることのできるものであれば特に限定されない。Ｆ−１９８４８Ａの塩としては、例えば、アンモニウム塩のような無機塩；ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。Ｆ−１９８４８Ａの好適な塩としては、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００１９】
また、Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩は溶剤和物になり得る。例えば、大気中での放置、再結晶などを経て、吸着水の付加、水和物化等が時に生じ得る。それらの溶剤和物も本発明に包含される。
【００２０】
さらに、本発明は、生体内において代謝されてＦ−１９８４８Ａ及び／又はその塩に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て包含する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４とヒアルロン酸の結合阻害活性を有する新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ及びその塩、その製造方法及びＦ−１９８４８Ａを製造する微生物ダクリマイセス エスピー（Dacrymyces sp.）が提供された。さらに、本発明によって、新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩を有効成分とする、変形性関節症の治療及び／又は予防薬が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．Ｆ−１９８４８Ａ生産菌
Ｆ−１９８４８Ａは、日本国滋賀県で採集した担子菌子実体の担子胞子より分離されたダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４株（以下、単に「ＳＡＮＫ ２０２０４株」ともいう。）の培養物中に見出された。
【００２３】
Ｆ−１９８４８Ａ生産菌としては、Ｆ−１９８４８Ａを生産する微生物であれば特に限定されるものではないが、好適にはＦ−１９８４８Ａを生産する菌であり、より好適にはＦ−１９８４８Ａを生産するダクリマイセス（Dacrymyces）属の菌であり、さらに好適には前記の特性を有し且つＦ−１９８４８Ａを生産するダクリマイセス（Dacrymyces）属の菌であり、最適にはダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４株である。
【００２４】
ＳＡＮＫ ２０２０４株について以下に記載する。
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
【００２５】
（表１）培地組成
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
＜ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天（Potato Dextrose Agar）培地）＞
ポテトデキストロース寒天培地「ニッスイ」（日水製薬（株）製） ３９ｇ
寒天 ５ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
＜ＭＥＡ培地（麦芽エキス寒天培地）＞
麦芽エキス １２．５ｇ
寒天 ２０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養下での菌学的性状は次の通りである。
ＰＤＡ培地上での成長は、２３℃、２週間の培養で３〜５ｍｍである。菌そうは綿毛状、白色である。裏面は変化なし。浸出液および匂いはない。気菌糸は幅１〜１．５μｍ、薄壁で平滑である。隔壁にかすがい連結はない。分生子は形成されない。
ＭＥＡ培地上での成長は、２３℃、２週間の培養で６〜７ｍｍである。菌そうは薄く圧伏、白色である。裏面は変化なし。浸出液および匂いはない。
【００２６】
ＳＡＮＫ ２０２０４株を同定するため、分離に供試した子実体乾燥標本の菌学的性状を観察した。その乾燥標本の菌学的性状は次の通りである。
子実体は群生、平らに広がり、径は０．６〜６ｍｍ、軟ゼラチン質、乾燥時は淡黄色である。担子器は（２０〜３３）×（４〜６μｍ）（小柄を除いた円筒部分）、Ｙ字型、基部にかすがい連結はない。小柄は１８以下×３μｍ。担子胞子は（９〜１５）×（５〜７μｍ）、（０〜）３隔壁、長楕円形〜豆形、厚壁、平滑である。分生子は観察されない。
【００２７】
本菌の以上のような菌学的性状は、マクナブ「タキソノミックスタディーインザダクリマイセタシー. VIII. ダクリマイセス」、ニュージーランドジャーナルオブボタニー、１９７３年、第１１巻、ｐ．４６１−５２４（ＭｃＮａｂｂ ＲＦＲ， “Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｔａｃｅａｅ ＶＩＩＩ． Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ Ｎｅｅｓ ｅｘ Ｆｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ １１， ｐ．４６１−５２４（１９７３））のアカキクラゲ属（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ）の記載に一致した。よって本菌株を、ダクリマイセス エスピー（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ ｓｐ．）と同定した。
なお、ＳＡＮＫ ２０２０４株は、ダクリマイセス エスピー（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ ｓｐ. ＳＡＮＫ ２０２０４株として、平成１６年９月１５日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４を付与された。
【００２８】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ ２０２０４株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ ２０２０４株はその全ての変異株を包含する。
【００２９】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ｆ−１９８４８Ａを生産するＳＡＮＫ ２０２０４株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ ２０２０４株に包含される。
【００３０】
２．培養
Ｆ−１９８４８Ａ生産菌は、微生物による発酵生産に通常使用されるような、微生物が同化できる炭素源、窒素源および無機塩を含有する培地を用いて培養することができる。
【００３１】
炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、押麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単独で用いるか、あるいは２つ以上を併用することができる。炭素源の含有量は、通常、培地量の１〜１０重量％で変量する。
【００３２】
窒素源としては、蛋白質もしくはその加水分解物を含有する物質、無機塩等を用いることができる。そのような窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等を例示することができる、それらは単独で用いるか、あるいは２つ以上を併用することができる。窒素源の含有量は、通常、培地量の０．１〜１０重量％の範囲で変量する。
【００３３】
栄養無機塩としては、イオンを得ることができる通常の塩類、金属等を用いることができる。塩類としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等を例示することができる。金属としては、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の金属を例示することができる。また、菌の資化しうるビタミンＢ１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質等も必要に応じて添加してもよい。
【００３４】
Ｆ−１９８４８Ａ生産菌を液体培養するに際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等を消泡剤として使用することができる。Ｆ−１９８４８Ａを製造する目的でＳＡＮＫ ２０２０４株を培養する際の培地のｐＨは、培地の成分、生育温度等により異なるが、通常発酵生成物を生産するために用いられるｐＨであればよい。
ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養温度は、培地の成分、ｐＨ等により異なるが、通常、１０℃〜３０℃であり、１８〜２８℃の範囲が生育に良好である。Ｆ−１９８４８Ａの生産には、２０〜２６℃が好適である。
【００３５】
Ｆ−１９８４８Ａ製造のための培養方法としては、特に制限はなく、微生物一般に用いられる培養方法であればよく、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法等を使用することができる。
【００３６】
以下にＳＡＮＫ ２０２０４株の培養法を示すが、Ｆ−１９８４８Ａを製造できる限りにおいて、本方法に限定されない。
ＳＡＮＫ ２０２０４株の培養は、通常、１つ又は２つ以上の段階からなる種培養より開始し、ロータリー振盪培養機中で２０〜２６℃（好適には２３℃）で、５〜１０日間（好適には７日間）あるいは十分に生育するまで振とうして行う。
ＳＡＮＫ ２０２０４株を固体培養する場合、上記の種培養液を三角フラスコなどの固体培地培養容器中の本培養培地に接種することができる。培養は、接種した固体培地培養容器を２０〜２６℃（好適には２３℃）で１０〜２０日間（好適には１４日間）静置して、生産培養を行なう。このようにして得られた本培養培地（培養物）中に所望のＦ−１９８４８Ａを得ることができる。
ＳＡＮＫ ２０２０４株を比較的小さな規模で液体培養する場合、本培養培地を含む三角フラスコに種培養液を接種し、ロータリー振盪培養機中で、２０〜２６℃（好適には２３℃）で数日間振とうする。
【００３７】
一方、ＳＡＮＫ ２０２０４株を比較的大きな規模で液体培養する場合、攪拌機、通気装置、保温装置等をつけた適当なタンクを用いることが好ましい。該装置を用いることにより、培地を予め該タンクの中で作製することができる。例えば、本培養培地を１２１℃にて加熱滅菌し、冷却する。次いで、種培養物を接種し、２３℃にて通気攪拌しつつ本培養を行う。このような培養方法は、所望のＦ−１９８４８Ａを大量に製造するのに適している。
【００３８】
本発明のＦ−１９８４８Ａ生産菌を培養して該物質を製造する場合、該培養物中のＦ−１９８４８Ａの生産量は、後述する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、生物活性試験等により、経時的に追跡することができる。ＨＰＬＣ分析又は生物活性試験にて追跡する場合、予め、培養物をアセトン等の親水性溶媒で抽出し、該親水性溶媒を留去した後、ｎ−ブタノール等の水と混和しない溶媒で抽出する。次いで、該水と混和しない溶媒を留去した後、適当な溶媒に再溶解したものを分析又は試験に供することが好ましい。生物活性試験としては、ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験等を挙げることができる。
【００３９】
３．Ｆ−１９８４８Ａの回収
培養終了後、珪藻土等を助剤とするろ過操作又は遠心分離操作等により、培養物を可溶性画分（培養上清）および不溶性画分（菌体）に分別し、次いで得られた各画分中に存在するＦ−１９８４８Ａを、その物理化学的性状を利用して抽出精製することによってＦ−１９８４８Ａを回収することができる。
【００４０】
例えば、培養上清を、ｎ−ブタノール、酢酸エチルなど水と混和しない有機溶媒の１つ又は２つ以上の混合物を用いて抽出することにより、該抽出物より、Ｆ−１９８４８Ａを精製することができる。
【００４１】
得られた抽出物を、各種吸着用樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することができる。吸着剤としては、活性炭、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上三菱化学（株）社製）等を挙げることができる。前記の抽出物をこれらの吸着剤と接触させてＦ−１９８４８Ａを吸着せしめた後、メタノール水、アセトン水等の含水溶媒を用いて所望のＦ−１９８４８Ａを溶出することができる。反対に、前記の抽出物をこれらの吸着剤と接触させて不純物を吸着せしめ、所望のＦ−１９８４８Ａを素通り画分中に回収することもできる。
【００４２】
得られたＦ−１９８４８Ａ含有画分を、イオン交換クロマトグラフィーに供することができる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス ５０Ｗｘ４、ダウエックス１ｘ２、ダウエックス ＳＢＲ−Ｐ（以上、ダウ・ケミカル社製）等を挙げることができる。Ｆ−１９８４８Ａ含有画分をイオン交換樹脂と接触させてＦ−１９８４８Ａを吸着せしめた後、塩酸、アンモニア等の溶媒を用いて所望のＦ−１９８４８Ａを溶出することができる。反対に、前記の抽出物をこれらのイオン交換樹脂と接触させて不純物を吸着せしめ、所望のＦ−１９８４８Ａを素通り画分中に回収することもできる。
【００４３】
得られたＦ−１９８４８Ａ含有画分を、さらに、シリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジル等の担体を用いた吸着カラム・クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（登録商標、トーソー（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（登録商標、アマシャム バイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィー、コスモシール１４０Ｃ１８（登録商標、ナカライテスク社製）等を用いた逆相カラムクロマトグラフィー、順相もしくは逆相カラムを用いたＨＰＬＣ等により精製し、所望のＦ−１９８４８Ａを単離することができる。
【００４４】
本発明のＦ−１９８４８Ａを精製する際の、各精製工程における該物質の挙動は、例えば、次の条件によるＨＰＬＣにより追跡することができる。
【００４５】
（Ｆ−１９８４８Ａを検出するためのＨＰＬＣの条件）
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１３：７
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ５．６分
【００４６】
４．ヒアルロン酸ＣＤ−４４結合阻害試験
Ｆ−１９８４８Ａがヒアルロン酸とＣＤ４４が結合するのを阻害する活性を有することが本発明者らによって明らかにされた。ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害試験（「ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験」という。）はヒアルロン酸とＣＤ４４との結合に対する本発明のＦ−１９８４８Ａの影響を調べることができる限りにおいて特に制限されないが、例えば後の（試験例１）に詳述するように、ヒトＣＤ４４発現細胞懸濁液に蛍光ヒアルロン酸と被験化合物（Ｆ−１９８４８Ａ）を添加して、蛍光ヒアルロン酸のＣＤ４４への特異的吸着量を測定する方法を用いることができる。
【００４７】
５．Ｆ−１９８４８Ａの作用
本発明において「変形性関節症」とは慢性の関節炎を伴う関節疾患であり、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨及び／又は軟骨の増殖性変化をきたす疾患を意味する。変形性関節症としては変形性膝関節症、変形性肩関節症、変形性股関節症、変形性肘関節症、変形性足関節症、変形性手関節症、変形性指関節症等を例示することが出来る。
【００４８】
Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩は、ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有することが本発明者らによって明らかにされた。したがって、Ｆ−１９８４８Ａ及び／又はその塩は、変形性関節症の治療薬または予防薬の用途に有効であり、肩及び膝関節等の大きな関節のみならず、全身の関節炎の治療又は予防に好適である。すなわち、本発明は、Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩を含むことからなる医薬組成物、並びに、該物質を有効成分として含有する変形性関節症の治療又は予防剤を提供する。
【００４９】
本発明のＦ−１９８４８Ａ又はその塩は、医薬としてヒト又はヒト以外の動物に投与されるに際し、種々の形態をとり得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。軟膏等は外用剤として使用される。
【００５０】
Ｆ−１９８４８Ａを有効成分として含有する医薬製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。
【００５１】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を挙げることができる。錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。
【００５２】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤を挙げることができる。
【００５３】
注射剤として調製される場合、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤として当該分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。等張を維持するために充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有せしめてもよい。溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤糖、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有せしめてもよい。
【００５４】
なお、注射剤を静脈内投与する場合、単独で、ブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、又は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等とのエマルジョンとして投与される。
【００５５】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００５６】
軟膏等の外用剤の形態に成形するに際しては、賦型剤として、疎水性基剤（油脂性軟膏基剤）、吸水基剤、親水性基剤（クリーム）ならびに水溶性基剤（非グリース製軟膏基剤）のいずれか一つに属する、当該分野で公知のものを広く使用することができる。
【００５７】
上述の医薬製剤に含有せしめるＦ−１９８４８Ａ又はその塩の量は、特に限定されないが、上限は３０〜７０重量％、下限は１重量％であり、好適な範囲は１〜３０重量％である。
【００５８】
Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり投与するＦ−１９８４８Ａ又はその塩の量は、上限が１００〜１０００ｍｇ、下限が１〜１０ｍｇであり、好適な範囲は１０〜１００ｍｇである。
【００５９】
Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩の投与回数は、数日に１回、１日１回、又は１日複数回である。
【００６０】
本発明は、薬理上有効な量のＦ−１９８４８Ａ又はその塩を投与することからなる炎症性疾患、炎症又は感染症の治療又は予防方法、それら疾患の治療又は予防のためのＦ−１９８４８Ａ又はその塩の使用をも提供する。
【実施例】
【００６１】
次に、実施例、試験例、製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００６２】
（実施例１）．Ｆ−１９８４８Ａ生産菌の培養
ダクリマイセス エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４株（以下、「ＳＡＮＫ ２０２０４株」とする。）のスラントより約１ｃｍ角の菌糸片を切り取りあらかじめ滅菌水約３ｍｌで満たしたガラス製ホモジナイザー中に懸濁した。ガラス製ホモジナイザーを用いて菌糸片をホモジナイズし、全量を滅菌（１２１℃、２０分間）した後述の組成からなる種培養培地３０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコに接種した。同様の操作を行い、１５本の種培養フラスコを用意した。２３℃で２１０ｒｐｍのロータリー振とう培養機中で７日間培養した。このようにして得られた種培養液を、滅菌（１２１℃、４０分間）した後述の生産培養培地の培地組成を含む５００ｍｌ容固体培地培養容器（藤森工業 アグリフレックス）３０本にそれぞれ１５ｍｌ接種し、２３℃で静置して１４日間培養した。
【００６３】
（表２）種培養培地の培地組成
―――――――――――――――――――――――――――――――――
グルコース ４ｇ
マルトエキス（Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ４ｇ
寒天 ３ｇ
消泡剤＊ ０．０５ｍｌ
蒸留水 １０００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
＊ ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（登録商標、日本油脂（株）社製）
（表３）生産培養培地の培地組成（５００ｍｌ容固体培地培養容器1本あたり）
―――――――――――――――――――――――――――――――――
押麦（大麦） ６４ｇ
マンニトール １ｇ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物 ０．５ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ０．５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ
蒸留水 １００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
【００６４】
（実施例２）．Ｆ−１９８４８Ａの単離
実施例１で得られた培養物３Ｌにアセトン３Ｌを加えて抽出した後、これを遠心分離してアセトン抽出液を得た。このアセトン抽出液を減圧下濃縮してアセトンを留去し、ｐＨ３．０に調整後、酢酸エチル抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−１９８４８Ａを含む抽出物７．５ｇを得た。
次いで、コスモシルカラム・クロマトグラフィーを行った。すなわち、前記抽出物７．５ｇにアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝２：３、１００ｍｌを加え、予めアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝２：３で平衡化したコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ、容積２５０ｍｌ）に付した。該カラムを、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝２：３（９１０ｍｌ）、で洗浄した後、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１：１（４６０ｍｌ）、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１１：９（１１８０ｍｌ）を用いて吸着画分を段階的に溶出させ、溶出液を２０ｍｌずつ８２個の画分として回収した。
【００６５】
Ｆ−１９８４８Ａを含む溶出画分Ｎｏ．４０〜Ｎｏ．５７を合併し（３６０ｍｌ）、減圧下で濃縮することによりアセトニトリルを留去した後、酢酸エチル抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それをろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−１９８４８Ａ質を含む部分精製物４０２．８ｍｇを得た。
この部分精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）で分離した。部分精製物４０２．８ｍｇをアセトニトリル：０．６％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：２、３．３ｍｌに溶解したものを試料溶液とした。この試料溶液３００μｌを、あらかじめアセトニトリル：０．６％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：２で平衡化したカラムに注入後、アセトニトリル：０．６％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：２を溶媒として、流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニターし、保持時間１３．５から１７．３分までを分取した。残りの試料溶液についても同様の操作を行い、活性画分２５０ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それをろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−１９８４８Ａの無色粉末１８２ｍｇを得た。
【００６６】
このようにして得たＦ−１９８４８Ａを下記条件のＨＰＬＣにて分析した：
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１３：７
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ５．６分
【００６７】
（試験例１）．ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験
ヒトＣＤ４４のｃＤＮＡはヒトリンパ節由来ｃＤＮＡライブラリー（ＴＡＫＡＲＡ）を鋳型にＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーはデータベース（GenBank）より得られたＣＤ４４ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Accession number）： U40373：配列表の配列番号１）のアミノ酸コード領域のヌクレオチド番号６５乃至８５の５’側にSal I切断点とKozac配列（Nucleic Acids Research、15巻、8125‐8148頁、1987年）を導入したプライマー１：
5’-AGCTAGGTCGACACCATGGACAAGTTTTGGTGGCAC-3’（配列表の配列番号３）
と第1130塩基から第1150塩基の相補鎖の5’側にHind III切断点を導入したプライマー２：
5’-AGCTAGAAGCTTACACCCCAATCTTCATGTC-3’（配列表の配列番号４）
を用いた。ＰＣＲ増幅産物を制限酵素Sal I（ＴＡＫＡＲＡ）とHind III（ＴＡＫＡＲＡ）により切断し、この断片を発現ベクター、ｐＲＫ５（ファーミンジェン）に組み込んだ。これをリン酸カルシウム法によりｐＳＶ２ｎｅｏ（インビトロジェン）とともにコラーゲンコートシャーレ上で１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン）を用い培養したヒト腎臓上皮由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３、アメリカン タイプ カルチャー コレクション）に導入し、抗生物質Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）により遺伝子導入細胞を選択した。抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体（バイオメダ）を用い、ウエスタンブロッティングによりＣＤ４４の発現を確認した。このＣＤ４４発現細胞を４日間培養したあとカルシウムイオン、マグネシウムイオンフリーのダルベッコリン酸バッファー（以下、ＰＢＳと称する。）で洗浄し、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳでシャーレからはがした。遠心（１８００×ｇ、５分）により細胞を回収した後、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸バッファーｐＨ７．８（以下、「バッファーＡ」と称する。）で２度洗浄した。細胞を再度バッファーＡに懸濁し、２分間の超音波処理による破砕の後、４００×ｇで１０分間遠心した。この上清を２０,０００×ｇで１時間遠心し、沈殿をバッファーＡで１度洗浄後、バッファーＡ中で超音波処理し、均一化したものをＣＤ４４発現細胞膜懸濁液とした。
蛍光ヒアルロン酸はベルダーらの方法（Carbohydrate Research、44巻、251−257頁、1975年）に若干の修正を加え、以下のように調製した。５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業、鶏冠由来、分子量１．５８×１０６）を４０ｍｌの蒸留水に溶解し、２０ｍｌのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）と混合した。この混合液にアセトアルデヒド（２５μｌ、フルカ）とシクロヘキシルイソシアニド(２５μｌ、フルカ)を含むＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解したフルオロセインアミン−アイソタイプＩ（２５ｍｇ、アルドリッチ）を加えた。室温（約２５℃）で５時間攪拌した後、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、沈殿した蛍光ヒアルロン酸を遠心（１０００×ｇ、１５分）で回収した。これを６０ｍｌの蒸留水に溶解し、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールで沈殿させ、回収する作業を２度繰り返した後、１０ｍｌの蒸留水に溶解し、透析により脱塩を行い、蛍光ヒアルロン酸溶液とした。
上記ＣＤ４４発現細胞膜懸濁液（タンパク質濃度として１００μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルガラス繊維濾紙黒色プレート（ユニフィルター、疎水性ＧＦ／Ｃ膜、ワットマン）に１ウェルに対し２００μｌ分注し、ここへメタノールで溶解した被検化合物（Ｆ−１９８４８Ａ）を１μｌ添加した後、さらに蛍光ヒアルロン酸０．２μｇを添加した。室温で１時間インキュベートした後、液体をマルチスクリーン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて吸引濾過した。これにバッファーＡを１ウェルあたり２５０μｌ添加し、吸引濾過する操作を６回繰り返すことによりフィルターに吸着した細胞膜を洗浄した。洗浄後、１ウェルに対し０．３Ｎ 水酸化ナトリウムを１００μｌ添加し、アルボ（アマシャム−ファルマシア）により、励起光４８５ｎｍによる発光光５３５ｎｍを測定し、ＣＤ４４発現細胞膜への蛍光ヒアルロン酸の結合量を検出した。蛍光ヒアルロン酸の非特異的結合は過剰量の非標識ヒアルロン酸（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加えることにより検出した。蛍光ヒアルロン酸の全結合と非特異的結合の差を特異的結合とし、特異的結合に対する阻害率（％）を算出した。表４に、Ｆ−１９８４８Ａを終濃度でそれぞれ４０、３０、２０および１０μＭ添加した場合の阻害率（％）の平均値と標準偏差を示した。Ｆ−１９８４８Ａはヒアルロン酸とＣＤ４４との結合を顕著に阻害し、ＩＣ５０値は２３．５μＭであった（表４）。
【００６８】
（表４）
（製剤例１）．経口用カプセル剤
下記表５に記載の処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
（表５） Ｆ−１９８４８Ａ含有経口カプセル剤
―――――――――――――――――――――――――――――
Ｆ−１９８４８Ａ ３０ｍｇ
乳糖 １７０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――
合計 ３５２ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の提供するＦ−１９８４８Ａは、優れたヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有し、変形性関節症およびそれに起因する疾患の治療または予防に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号３：ＣＤ４４用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号４：ＣＤ４４用アンチセンスプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
（Ｉ）
で表される新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩。
【請求項２】
下記の１）乃至８）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
１）性質：酸性、無色粉末；
２）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ４６Ｈ８２Ｏ２０（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
４）分子量：９５４（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより決定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λmax ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収のみである；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０９、２９２６、２８５４、１７３７、１３６９、１２４４、１０８１、１０５１；
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00ppmとした。）
0.91 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.20-1.38 (32H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.46-1.55 (4H, m), 1.63 (1H, m), 1.74 (1H, m), 2.06 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.14-3.28 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.42-3.55 (5H, m), 3.61 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.97 (1H, dd, J=11.7, 5.5 Hz), 4.08 (1H, dd, J=7.7, 4.4 Hz), 4.22 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz), 4.38 (1H, d, J=7.0 Hz), 4.46 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz), 4.62 (1H, d, J=7.3 Hz), 4.67 (1H, d, J=7.7 Hz), 4.71 (1H, m)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.0ppmとした。）
14.6 (q), 20.8 (q), 21.1 (q), 22.4 (t), 23.8 (t), 26.2 (t), 26.8 (t), 30.5-30.9 (12シグナル, t), 33.2 (t), 35.0 (t), 35.5 (t), 35.8 (t), 38.4 (t), 63.5 (t), 64.5 (t), 66.6 (t), 70.6 (d), 71.2 (d), 71.6 (d), 72.5 (d), 72.9 (d), 74.4 (d), 75.7 (d), 75.8 (d), 77.2 (d), 77.6 (d), 80.2 (d), 83.5 (d), 84.6 (d), 102.5 (d), 104.3 (d), 105.6 (d), 172.2 (s), 173.0 (s), 178.3 (s)。
【請求項３】
ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物よりＦ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物を回収することを特徴とする、Ｆ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物の生産菌がダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
ダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）。
【請求項６】
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、請求項２に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを含むことからなる医薬組成物。
【請求項７】
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、請求項２に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを有効成分として含有する変形性関節症治療薬及び／または予防剤。
【請求項８】
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、請求項２に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有してなるヒアルロン酸とＣＤ４４の結合阻害剤。
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
（Ｉ）
で表される新規化合物Ｆ−１９８４８Ａ又はその塩。
【請求項２】
下記の１）乃至８）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
１）性質：酸性、無色粉末；
２）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ４６Ｈ８２Ｏ２０（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
４）分子量：９５４（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより決定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λmax ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収のみである；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０９、２９２６、２８５４、１７３７、１３６９、１２４４、１０８１、１０５１；
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00ppmとした。）
0.91 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.20-1.38 (32H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.46-1.55 (4H, m), 1.63 (1H, m), 1.74 (1H, m), 2.06 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.14-3.28 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.42-3.55 (5H, m), 3.61 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.97 (1H, dd, J=11.7, 5.5 Hz), 4.08 (1H, dd, J=7.7, 4.4 Hz), 4.22 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz), 4.38 (1H, d, J=7.0 Hz), 4.46 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz), 4.62 (1H, d, J=7.3 Hz), 4.67 (1H, d, J=7.7 Hz), 4.71 (1H, m)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.0ppmとした。）
14.6 (q), 20.8 (q), 21.1 (q), 22.4 (t), 23.8 (t), 26.2 (t), 26.8 (t), 30.5-30.9 (12シグナル, t), 33.2 (t), 35.0 (t), 35.5 (t), 35.8 (t), 38.4 (t), 63.5 (t), 64.5 (t), 66.6 (t), 70.6 (d), 71.2 (d), 71.6 (d), 72.5 (d), 72.9 (d), 74.4 (d), 75.7 (d), 75.8 (d), 77.2 (d), 77.6 (d), 80.2 (d), 83.5 (d), 84.6 (d), 102.5 (d), 104.3 (d), 105.6 (d), 172.2 (s), 173.0 (s), 178.3 (s)。
【請求項３】
ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物よりＦ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物を回収することを特徴とする、Ｆ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
ダクリマイセス（Dacrymyces）属に属するＦ−１９８４８Ａ又は請求項２に記載の化合物の生産菌がダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
ダクリマイセス・エスピー（Dacrymyces sp.） ＳＡＮＫ ２０２０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２４）。
【請求項６】
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、請求項２に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを含むことからなる医薬組成物。
【請求項７】
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、請求項２に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される、少なくともいずれか一つを有効成分として含有する変形性関節症治療薬及び／または予防剤。
【請求項８】
Ｆ−１９８４８Ａ、その塩、請求項２に記載の化合物及びその塩からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有してなるヒアルロン酸とＣＤ４４の結合阻害剤。
【公開番号】特開２００６−１７６４３８（Ｐ２００６−１７６４３８Ａ）
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３７０９９４（Ｐ２００４−３７０９９４）
【出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（０００００１８５６）三共株式会社 (98)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（０００００１８５６）三共株式会社 (98)
【Ｆターム（参考）】
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