ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、混合物、および開裂方法
【課題】核酸配列および核酸配列の変化を検出し特徴づけるための手段、および核酸配列を検出し特徴づけるための改良された開裂手段を提供する。
【解決手段】種々の耐熱性生物から得られる構造特異的ヌクレアーゼであるＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼおよびキメラＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを提供することからなる。これらの構造特異的ヌクレアーゼは、標的依存性の開裂構造体を開裂し、それにより特異的核酸配列またはその特異的変異の存在を示すために使用される。
【解決手段】種々の耐熱性生物から得られる構造特異的ヌクレアーゼであるＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼおよびキメラＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを提供することからなる。これらの構造特異的ヌクレアーゼは、標的依存性の開裂構造体を開裂し、それにより特異的核酸配列またはその特異的変異の存在を示すために使用される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号102、107、130、132、179、181、183、184、185、186、187および188よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する耐熱性構造特異的ヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが配列番号101、106、129、131、178、180および182よりなる群から選択されるＤＮＡ配列によりコードされる、請求項１に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３】
構造特異的ヌクレアーゼをコードする、配列番号101、106、129、131、137、140、141、142、143、144、145、147、150、151、153、155、156、157、158、161、163、178、180および182よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を有するＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1およびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記エンドヌクレアーゼが約38.7キロダルトンの分子量をもつ、請求項６に記載の精製エンドヌクレアーゼ。
【請求項８】
配列番号108、109、112、113、116-119、170、171、172および173よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできる領域を有する、FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オリゴヌクレオチドが異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項８に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記異種プロモーターが誘導プロモーターである、請求項９に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記誘導プロモーターがλ-PLプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターよりなる群から選択される、請求項10に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号108、109、112、113、116-119、170、171、172および173よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできる領域を有する、FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする単離されたオリゴヌクレオチドを含有する組換えＤＮＡベクター。
【請求項１３】
請求項12に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
約38.7キロダルトンの分子量をもつピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする前記遺伝子が異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項15に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記異種プロモーターが誘導プロモーターである、請求項16に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記誘導プロモーターがλ-PLプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターよりなる群から選択される、請求項17に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
約38.7キロダルトンの分子量をもつピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項20に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
i)精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼからなる第１の構造特異的ヌクレアーゼ、およびii) 第２の構造特異的ヌクレアーゼ、を含んでなる混合物。
【請求項２３】
前記第２の構造特異的ヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1およびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項22に記載の混合物。
【請求項２４】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項22に記載の混合物。
【請求項２５】
前記第２のヌクレアーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる5'ヌクレアーゼである、請求項22に記載の混合物。
【請求項２６】
前記第２のヌクレアーゼがCleavaseＲBN酵素、テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌(Escherichia coli)Exo III、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Rad1/Rad10複合体よりなる群から選択される、請求項22に記載の混合物。
【請求項２７】
核酸を処理する方法であって、
a) i) 精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ、および
ii) 核酸基質、
を用意し、
b) 前記基質が１以上の開裂構造体を形成する条件下で前記核酸基質を処理し、そして
c) 前記エンドヌクレアーゼを前記開裂構造体と反応させて１以上の開裂産物を生成させる、
ことを含んでなる方法。
【請求項２８】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる構造特異的ヌクレアーゼを用意することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のヌクレアーゼのアミノ酸配列の一部が、テルムス(Thermus)属の真性高温細菌から得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一部に対して相同である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記高温細菌がテルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、テルムス・フラバス(Thermus flavus)およびテルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)よりなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記構造特異的ヌクレアーゼがCleavaseＲBNヌクレアーゼである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ(a)の前記核酸が実質的に一本鎖である、請求項27に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸がＲＮＡおよびＤＮＡよりなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ(a)の前記核酸が二本鎖である、請求項27に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ(b)の前記処理が、
i) 前記二本鎖核酸を実質的に一本鎖となし、そして
ii) 前記一本鎖核酸を、前記一本鎖核酸が二次構造をとるような条件にさらす、
ことを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
温度を高めることで前記二本鎖核酸を実質的に一本鎖とする、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記１以上の開裂産物を検出するステップをさらに含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
核酸を処理する方法であって、
a) i) マンガン含有溶液中の精製FEN-1エンドヌクレアーゼからなる第１の構造特異的ヌクレアーゼ、および
ii) 核酸基質、
を用意し、
b) 前記核酸基質を昇温で処理して前記基質を実質的に一本鎖となし、
c) 前記一本鎖基質が１以上の開裂構造体を形成する条件下で前記温度を低下させ、
d) 前記開裂手段を前記開裂構造体と反応させて１以上の開裂産物を生成させ、そして
e) 前記１以上の開裂産物を検出する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４０】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
第２の構造特異的ヌクレアーゼを用意することを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２のヌクレアーゼがCleavaseＲBN酵素、テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌(Escherichia coli)Exo III、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Rad1/Rad10複合体よりなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のヌクレアーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる5'ヌクレアーゼである、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸がＲＮＡおよびＤＮＡよりなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ(a)の前記核酸が二本鎖である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
核酸処理キットであって、
a) 精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物、および
b) マンガンを含有する溶液、
を含んでなるキット。
【請求項４７】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項46に記載のキット。
【請求項４８】
第２の構造特異的ヌクレアーゼをさらに含む、請求項46に記載のキット。
【請求項４９】
前記第２のヌクレアーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる5'ヌクレアーゼである、請求項46に記載のキット。
【請求項５０】
前記第２のヌクレアーゼのアミノ酸配列の一部が、テルムス(Thermus)属の真性高温細菌から得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一部に対して相同である、請求項48に記載のキット。
【請求項５１】
前記高温細菌がテルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、テルムス・フラバス(Thermus flavus)およびテルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)よりなる群から選択される、請求項50に記載のキット。
【請求項５２】
前記開裂産物を検出する試薬をさらに含む、請求項48に記載のキット。
【請求項１】
配列番号102、107、130、132、179、181、183、184、185、186、187および188よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する耐熱性構造特異的ヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが配列番号101、106、129、131、178、180および182よりなる群から選択されるＤＮＡ配列によりコードされる、請求項１に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３】
構造特異的ヌクレアーゼをコードする、配列番号101、106、129、131、137、140、141、142、143、144、145、147、150、151、153、155、156、157、158、161、163、178、180および182よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を有するＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1およびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記エンドヌクレアーゼが約38.7キロダルトンの分子量をもつ、請求項６に記載の精製エンドヌクレアーゼ。
【請求項８】
配列番号108、109、112、113、116-119、170、171、172および173よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできる領域を有する、FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オリゴヌクレオチドが異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項８に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記異種プロモーターが誘導プロモーターである、請求項９に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記誘導プロモーターがλ-PLプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターよりなる群から選択される、請求項10に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号108、109、112、113、116-119、170、171、172および173よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできる領域を有する、FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする単離されたオリゴヌクレオチドを含有する組換えＤＮＡベクター。
【請求項１３】
請求項12に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
約38.7キロダルトンの分子量をもつピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼをコードする前記遺伝子が異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項15に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記異種プロモーターが誘導プロモーターである、請求項16に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記誘導プロモーターがλ-PLプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターよりなる群から選択される、請求項17に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
約38.7キロダルトンの分子量をもつピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項20に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
i)精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼからなる第１の構造特異的ヌクレアーゼ、およびii) 第２の構造特異的ヌクレアーゼ、を含んでなる混合物。
【請求項２３】
前記第２の構造特異的ヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1およびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項22に記載の混合物。
【請求項２４】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項22に記載の混合物。
【請求項２５】
前記第２のヌクレアーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる5'ヌクレアーゼである、請求項22に記載の混合物。
【請求項２６】
前記第２のヌクレアーゼがCleavaseＲBN酵素、テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌(Escherichia coli)Exo III、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Rad1/Rad10複合体よりなる群から選択される、請求項22に記載の混合物。
【請求項２７】
核酸を処理する方法であって、
a) i) 精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ、および
ii) 核酸基質、
を用意し、
b) 前記基質が１以上の開裂構造体を形成する条件下で前記核酸基質を処理し、そして
c) 前記エンドヌクレアーゼを前記開裂構造体と反応させて１以上の開裂産物を生成させる、
ことを含んでなる方法。
【請求項２８】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる構造特異的ヌクレアーゼを用意することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のヌクレアーゼのアミノ酸配列の一部が、テルムス(Thermus)属の真性高温細菌から得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一部に対して相同である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記高温細菌がテルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、テルムス・フラバス(Thermus flavus)およびテルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)よりなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記構造特異的ヌクレアーゼがCleavaseＲBNヌクレアーゼである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ(a)の前記核酸が実質的に一本鎖である、請求項27に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸がＲＮＡおよびＤＮＡよりなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ(a)の前記核酸が二本鎖である、請求項27に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ(b)の前記処理が、
i) 前記二本鎖核酸を実質的に一本鎖となし、そして
ii) 前記一本鎖核酸を、前記一本鎖核酸が二次構造をとるような条件にさらす、
ことを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
温度を高めることで前記二本鎖核酸を実質的に一本鎖とする、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記１以上の開裂産物を検出するステップをさらに含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
核酸を処理する方法であって、
a) i) マンガン含有溶液中の精製FEN-1エンドヌクレアーゼからなる第１の構造特異的ヌクレアーゼ、および
ii) 核酸基質、
を用意し、
b) 前記核酸基質を昇温で処理して前記基質を実質的に一本鎖となし、
c) 前記一本鎖基質が１以上の開裂構造体を形成する条件下で前記温度を低下させ、
d) 前記開裂手段を前記開裂構造体と反応させて１以上の開裂産物を生成させ、そして
e) 前記１以上の開裂産物を検出する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４０】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
第２の構造特異的ヌクレアーゼを用意することを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２のヌクレアーゼがCleavaseＲBN酵素、テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌(Escherichia coli)Exo III、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Rad1/Rad10複合体よりなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のヌクレアーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる5'ヌクレアーゼである、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸がＲＮＡおよびＤＮＡよりなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ(a)の前記核酸が二本鎖である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
核酸処理キットであって、
a) 精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物、および
b) マンガンを含有する溶液、
を含んでなるキット。
【請求項４７】
前記精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼがピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)FEN-1エンドヌクレアーゼ、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1エンドヌクレアーゼおよびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項46に記載のキット。
【請求項４８】
第２の構造特異的ヌクレアーゼをさらに含む、請求項46に記載のキット。
【請求項４９】
前記第２のヌクレアーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性より低減したＤＮＡ合成活性を示すが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性と実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから得られる5'ヌクレアーゼである、請求項46に記載のキット。
【請求項５０】
前記第２のヌクレアーゼのアミノ酸配列の一部が、テルムス(Thermus)属の真性高温細菌から得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一部に対して相同である、請求項48に記載のキット。
【請求項５１】
前記高温細菌がテルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、テルムス・フラバス(Thermus flavus)およびテルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)よりなる群から選択される、請求項50に記載のキット。
【請求項５２】
前記開裂産物を検出する試薬をさらに含む、請求項48に記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０Ａ】
【図７０Ｂ】
【図７０Ｃ】
【図７０Ｄ】
【図７０Ｅ】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８Ａ】
【図９８Ｂ】
【図９９】
【図１００−１】
【図１００−２】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４−１】
【図１０４−２】
【図１０５】
【図１０６−１】
【図１０６−２】
【図１０７】
【図１Ｂ】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０Ａ】
【図７０Ｂ】
【図７０Ｃ】
【図７０Ｄ】
【図７０Ｅ】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８Ａ】
【図９８Ｂ】
【図９９】
【図１００−１】
【図１００−２】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４−１】
【図１０４−２】
【図１０５】
【図１０６−１】
【図１０６−２】
【図１０７】
【公開番号】特開２００８−２０６５２１（Ｐ２００８−２０６５２１Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７７９３２（Ｐ２００８−７７９３２）
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【分割の表示】特願２００７−１８４４５３（Ｐ２００７−１８４４５３）の分割
【原出願日】平成９年１１月２６日（１９９７．１１．２６）
【出願人】（５０７２３８１９３）サード ウェーブ テクノロジーズ，インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【分割の表示】特願２００７−１８４４５３（Ｐ２００７−１８４４５３）の分割
【原出願日】平成９年１１月２６日（１９９７．１１．２６）
【出願人】（５０７２３８１９３）サード ウェーブ テクノロジーズ，インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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