Ｇタンパク質に結合する受容体（ＲＣＰＧ）とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つとの相互作用の検出方法
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に特異的なリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）の検出方法であって、以下のステップ：
１）ドナー／アクセプター対のメンバーで標識された受容体を当該ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットと接触させ；
２）前記ドナーと前記アクセプターとの近接効果による伝達を測定する、
を含む、前記方法に関する。
１）ドナー／アクセプター対のメンバーで標識された受容体を当該ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットと接触させ；
２）前記ドナーと前記アクセプターとの近接効果による伝達を測定する、
を含む、前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー／アクセプター対の２つのメンバー間の近接効果による伝達によりそのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つとの相互作用の検出する方法、及び特に新規薬剤、及びオーファン受容体の同定のスクリーニングの如き活用に関する。
【０００２】
本明細書中において、「近接効果による伝達」なる表現は、ＦＲＥＴシグナル｛ＨＴＲＦ（登録商標）技術、ＣＩＳ ＢＩＯ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ｝、一重項酸素の伝達｛Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）技術、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、例えば、Ｂｅａｕｄｅｔら、Ｇｅｎｏｍｕ Ｒｅｓ．，２００１ Ａｐｒ．１１（４）、６００−８を参照のこと。｝、電子伝達｛ＳＰＡ技術、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、例えば、Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，Ｍａｒ．，１６１（２），４９４−５００を参照のこと。｝により特徴付けられるエネルギー伝達を意味する。
【０００３】
一般的にＦＲＥＴ技術と呼ばれる蛍光発光非放射エネルギーのための技術において、ＴＲ−ＦＲＥＴ技術（時間分解蛍光共鳴エネルギー伝達）は、均質媒質における時間分解蛍光の測定を可能とする。希土類キレート又はクリプテートでのこの技術、特にＧ．Ｍａｔｈｉｓら（特に、「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ｒａｒｅ ｅａｒｔｈ ｃｒｙｐｔａｔｅｓ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ」、Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ Ｐａｒｔ Ａ ５７（２００１）２１９７−２２１１を参照のこと。）により開発された当該技術の使用は、生体外診断の分野及び製薬産業におけるハイスループットのスクリーニングの分野において、既にいくつかの適用を許容されている多くの有利点を有する。
【０００４】
この技術は、ＨＴＲＦ（登録商標）（均質時間分解蛍光）の名としても知られ、第１ドナー蛍光化合物、及び第２アクセプター蛍光化合物を使用する。
【０００５】
ドナーの波長での光励起後、エネルギー伝達は、当該ドナーとアクセプターが互いに近接するならば、それらの間に生ずる。このエネルギー伝達は、蛍光光度計を用いて測定され得るアクセプターによる光の放出（ＦＲＥＴシグナル）により特徴付けられる。
【０００６】
特にＧタンパク質に結合する７回膜貫通型ドメインを有する受容体である受容体（以後ＧＰＣＲという）は、多数の病理経路に関する。ＧＰＣＲは、細胞の外から内での情報の認識、及び伝達に関与する。これらのタンパク質は、主な治療標的を示し、そして現在の薬剤の５０％超は、これらの受容体又はそれらの伝達カスケードを標的とする。
【０００７】
リガンドの存在下におけるＧＰＣＲの活性化の機構を、付随の図１に図式的に示す。
【０００８】
ＧＰＣＲへのアゴニストリガンドの結合は、その三次構造を変更し、そして順々に、ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質を活性化する。当該Ｇタンパク質の活性化は、その場合に依存し、ｃＡＭＰ又はＩＰ３の如き二次細胞内伝達物質を産生するエフェクターの活性又は阻害を引き起こす。
【０００９】
本明細書中において、「オーファン受容体」なる表現は、そのＤＮＡ配列がＧＰＣＲの配列と一致するがその特異的天然リガンドがわからないことを提示する膜貫通型受容体を意味する。
【００１０】
シグナル伝達経路（二次伝達物質、及びエフェクター）の特徴、及び「オーファン受容体」と呼ばれるＧＰＣＲのためのリガンドの同定は、これらのＧＰＣＲの生理学的役割を理解する上で、並びに新たな薬剤の製造のために、非常に重要である。
【背景技術】
【００１１】
様々な方法が、ＧＰＣＲの活性化経路の構成成分の内の１つを使用する受容体／Ｇタンパク質相互作用の検出のために、特に特異的リガンドの検出のために存在する。
【００１２】
例えば、リガンド検出のためのある方法は、非加水分解性放射性ＧＴＰの誘導体、すなわちＧＰＣＲが活性化したときにＧαタンパク質に結合する[３５Ｓ]ＧＴＰγを使用する。当該ＧＴＰ類似体の結合のための速度パラメータは、Ｇタンパク質の型に依存する。この放射性方法は、ハイスループットでの薬剤のスクリーニングのためには適さない。
【００１３】
他の慣習的方法は、活性化された三量体Ｇタンパク質のサブユニットによるエフェクターの活性に基づく。
【００１４】
図１に示されるように、エフェクターの活性化、及びｃＡＭＰ又はＩＰ３の如き二次伝達物質の産生は、ＧＰＣＲ及びＧタンパク質の刺激の後に産生される。それ故、この方法は、ＧＰＣＲの活性化経路の下流を産生する物質に関する。
【００１５】
ハイスループットでの薬剤のスクリーニングに適した方法は、酵素活性の測定に基づく組換え系を使用し、当該酵素活性はβガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼの活性の如き酵素活性であってその発現はＧＰＣＲの活性化により産生される二次伝達物質により制御される。これらは、ＧＰＣＲの活性を測定する間接的方法であり、当該ＧＰＣＲ活性経路の下流を産生する物質にも関する。
【００１６】
リガンドの検出のための別の方法は、アレスチン−ＧＦＰの転移に焦点を当てる。
【００１７】
アレスチンは、ＧＰＣＲへのリガンドの結合により誘発される活性経路を止める調節機構に関する。それは細胞内における受容体の内在化経路を誘発することを可能とし、そしてそのステップは、細胞膜における受容体の分解又はリサイクルのために必要である。ＮＯＲＡＫ ＢＩＯＳＣＩにより開発された技術（Ｔｒａｎｓｆｌｕｏｒ）は、細胞内で発現される蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合するアレスチン（アレスチン−ＧＦＰ）を使用する。通常条件下、アレスチン−ＧＦＰはサイトゾルに分配される。ＧＰＣＲの活性化後、アレスチン−ＧＦＰは、膜に存在するＧＰＣＲと相互作用し、そしてアゴニストにより刺激されるだろう。それ故、その細胞分布は変更されるだろう。それは、サイトゾルから離れ、原形質膜に再分布され（転移現象）、そして内在化現象（細胞表面からの受容体の消失）に関与する。時間とともに、その受容体に結合するアレスチン−ＧＦＰの蛍光発光は、特定の受容体のエンドサイトーシスの現象を示す細胞で内部小胞（エンドソーム）付近にも測定され得る。アレスチン−ＧＦＰの分布におけるこれらの変化は、顕微鏡使用、及び画像処理技術により達成される。これらの理由により、この技術は、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）に好適なものではない。
【００１８】
Ｊａｎｅｔｏｐｏｕｌｏｓら｛Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９１：２４０８−２４１１；Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２７：３６６−３７３｝による最近の研究は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍにおいて、Ｇα２−ＣＦＰとＧβ−ＹＥＰサブユニットとの間のＦＲＥＴシグナルを視覚化することを可能としている。ＡｚｐｉａｚｕとＧａｕｔａｍ｛ＪＢＣ（２００４）２７９（２６）：２７７０９−２７７１８｝の研究は、ＣＨＯ細胞に発現されるムスカリン様受容体Ｍ２及びＭ３の刺激のためのモデルにおいて、Ｇα−ＣＦＰとＧβ−ＹＥＰとのＦＲＥＴシグナルにおける変化の似たような結果を示す。Ｂｅｒｌｏｔ ｔｅａｍ｛ＪＢＣ（２００４）２７９（２９）：３０２７９−３０２８６｝は、蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の断片で標識されたＧβとＧγとの相互作用を生体内でかつ顕微鏡により示している。Ｇβγの結合は当該ＹＦＰタンパク質の蛍光発光を元の状態に戻す。
【００１９】
これらの観察結果は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化がＦＲＥＴ技術により分析され得ることを提示する。これらの技術は、Ｇタンパク質のサブユニット間のＦＲＥＴの測定により受容体の活性化を間接的に示すが、それ自身、着目の受容体と結合するＧタンパク質のサブユニットのいずれかとの間の特異的ＦＲＥＴシグナルにより測定されるＧＰＣＲの活性化の状態を少しも示さず、かつ直接的に示さない。
【００２０】
他の方法は、分子生物学により第３細胞内ループ及びＣ末端部分の各々のレベルで蛍光タンパク質（ＣＦＰ及びＹＥＰ）をＧＰＣＲに挿入すること、ＦＲＥＴシグナルの変化により受容体の活性化を測定することにある。この方法は、Ｖｉｌａｒｄａｇａら｛Ｎａｔ．Ｂｉｏｃｈｅｎｏｌ．（２００３）２１：８０７−８１２；国際特許公開第２００４／０５７３３３号｝に記載されている。それは、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用、及びＧＰＣＲの活性化後のこれらの相互作用の調節を直接的に考慮しない。
【００２１】
他の方法は、ＦＲＥＴ技術によりＧＰＣＲのオリゴマー化を検出することにある（米国特許第６８２４９９０Ｂ１号）。
【００２２】
これらの方法の内、ＦＲＥＴシグナルを測定することにより、着目の受容体であるＧＰＣＲ受容体の早期活性化の状態、及び結合するＧタンパク質のサブユニットのいずれかを説明することができるものは無い。
【発明の開示】
【００２３】
本発明の概要
受容体とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つとの近接効果の伝達に基づく蛍光シグナルを測定することにより活性経路の初期段階でＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を検出することが可能であることを、驚くべきことに見出した。
【００２４】
近接効果の伝達のためのシグナルの測定は、与えられたＧＰＣＲ／Ｇα対又はＲＣＰＧ／Ｇβγ対の活性化状態に基づく。着目のＧＰＣＲ、及び対応するＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つから必ずなる唯一の対により産生されることより、このシグナルは高い特異性を有する。近接効果の伝達のためのこのシグナルは、受容体が薬剤（アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト又はアロステリック調節剤）により特異的に刺激されたときに、陽性に又は陰性に調節され得る。
【００２５】
本発明は、着目のＧＰＣＲの活性化のための経路における初期変化を考慮するので、反応の特異性の観点からも有利であることを提示する。既に知られた方法と異なり、ＧＰＣＲのシグナル経路のかなり上流に位置するので、潜在的薬剤の非存在又は存在下において、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質間の密接な相互作用を考慮する。
【００２６】
それ故、本発明の本質は、受容体とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つとの相互作用の検出方法であって、以下のステップ：
１）ドナー／アクセプター対のメンバーで標識された受容体を当該ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットと、生体媒質中で接触させ；
２）前記ドナーと前記アクセプターとの近接効果による伝達を測定する、
を含む、前記方法である。
【００２７】
受容体とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つとの相互作用を検出することを可能とする本発明の方法は、以下の
１）受容体／Ｇタンパク質の結合の立証；
２）受容体特性の研究；
３）受容体に対するアゴニスト又はアンタゴニストリガンドの検出、及び新規薬剤のスクリーニング；
４）オーファン受容体の同定、
に特に好適である。
【００２８】
標識された受容体をＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つと接触させることは、様々な方法により実施され得、例えば、当該受容体、一方ではＧα又はＧβγサブユニットの１つをコードする核酸を細胞内に共発現させることにより、あるいは当該受容体、一方では当該Ｇタンパク質のサブユニットをコードするサブユニットを形成するサブユニットをコードする核酸の異種発現により得られた機能的ＧＰＣＲ（ＧＰＣＲを形成するサブユニット、及びＧタンパク質のサブユニットを含む）を再構成することにより、あるいは人工原形質膜における組織抽出液からの精製の後に（例えば、Ｆｌｏｒｉｏら ＪＢＣ １９８５，Ｖｏｌ．２６０ Ｎｏ．８，３４７７〜３４８３頁；Ｈａｇａ Ｋ．ら ＪＢＣ １９８６，Ｖｏｌ．２６１ Ｎｏ．２２，１０１０３〜１０１４０頁；Ｄｅｖｅｓａ Ｆ．ら ２００２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６９，５１６３〜５１７４頁；Ｓｔｅｎｌｕｎｄら Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，３１６，２４３−２５０、及びＰａｒｋ ＰＳＨ．２００４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５６７，３４４−３４８を参照のこと。）実施され得る。
【００２９】
有利に、使用されたＧＰＣＲが既知の受容体であるとき、接触させることは、第一に、当該受容体の活性化を誘発するＧＰＣＲのための天然リガンドの存在下で実施され、次いで、潜在的薬剤又は上記受容体の活性を調節することが可能な他の試験分子の存在下で実施される。
【００３０】
ＧＰＣＲがオーファン受容体であるとき、接触は、もし相互作用があるのならば当該オーファン受容体を同定することを可能とさせ得る既知の受容体のための天然リガンドの存在下で、実施される。
【００３１】
上記オーファン受容体の活性を調節することが可能な潜在的薬剤又は他の試験化合物の検出は、既知の受容体について上記されるように実施される。
【００３２】
本発明の方法に使用されるドナー／アクセプター対のメンバーは、測定することが所望される近接効果による伝達の方法に従って選択される。
【００３３】
それ故、もし近接効果による伝達が蛍光発光によるエネルギーの伝達であるならば、当該ドナー／アクセプター対はエネルギーを供与する蛍光色素分子、及びエネルギーを受容する蛍光色素分子からなる。
【００３４】
本発明の目的のための適切な蛍光色素分子は、蛍光タンパク質又は有機蛍光色素分子から選択された蛍光色素分子である。これらの蛍光色素分子の例は、ローダミン、シアニン、スクアライン、ジフルオロボラジアザインダセン誘導体の如きＢＯＤＩＰＹとして知られる蛍光色素分子、蛍光色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとして知られる化合物、希土類金属キレート、希土類金属クリプテート、量子ドット型のナノ結晶、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の如き蛍光タンパク質又はその変異体、サンゴから抽出される蛍光タンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンの如きフィコビリタンパク質、特にＸＬ６６５として知られるフィコビリタンパク質、又は国際特許公開第２００３／１０４６８５号に記載される蛍光色素化合物である。当業者は、ＦＲＥＴ又はＴＲ−ＦＲＥＴの測定のための好適なドナー／アクセプター対を選択することができる。
【００３５】
一重項酸素の伝達の場合、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社により販売されるＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）技術に関する試薬は、例えば、ドナー／アクセプター対のために使用されるだろう（Ｂｅａｕｄｅｔら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００１ Ａｐｒ．１１（４），６００−８を参照のこと。）
【００３６】
もし近接効果による伝達が電子の移動であるならば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，Ｍａｒ．，１６１（２），４９４−５００に記載のものは、ドナー／アクセプター対として使用されるだろう。
【００３７】
本発明の方法に使用される受容体は、有利に、既知のＧＰＣＲであり、例えば、ムスカリン様受容体、バソプレシン受容体、ＧＡＢＡ（ガンマ−アミノ酪酸）受容体、又はその機能を特徴付けることが望まれるＧＰＣＲ、つまりはオーファン受容体である。
【００３８】
これらの受容体をコードするＤＮＡ配列は、当業者に知られた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら 下記を参照のこと）又は商業的に入手可能な（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）慣習的分子生物学技術に従い、ＰＣＲにより増幅され得る。
【００３９】
本発明の方法において使用されるＧα及びＧβγサブユニットは、Ｇｉ、Ｇｓ、Ｇｑ又はＧ１２／Ｇ１３、Ｇ１４、Ｇ１５又はＧ１６サブユニット、あるいはＧｑｘ型構造（Ｘは主にｓ、ｉ、ｏとなり得る。）を有するキメラＧタンパク質となり得（Ｃｏｎｋｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，ｖ３６３ ２７４−６頁：Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｒｅｅｓ Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．，１９９９，ｖ２０ １１８−２４頁を参照のこと。）、その配列、及び特性は当業者に知られている。
【００４０】
サブユニットをコードするＤＮＡ配列は、当業者に知られた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら 下記を参照のこと）又は商業的に入手可能な（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）慣習的分子生物学技術に従い、ＰＣＲにより増幅され得る。
【００４１】
受容体の、及びＧα又はＧβγサブユニットの内の１つの標識は、当業者によく知られた技術｛例えば、Ｊａｎｅｔｏｐｏｕｌｏｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２７：３６６−３７３、及びＶｉｌａｒｄａｇａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１：８０７−８１２｝に従い１又は複数の共有結合により直接的に、あるいは標識／抗標識抗体、抗原／抗体、アビジン又はストレプトアビジン／ビオチン、ハプテン／抗体型の結合パートナーを経由した間接的のいずれかで実施される。
【００４２】
近接効果の伝達のためのシグナルの測定は、当業者によく知られ、及び上記の例に記載された慣習的方法に従って実施される。
【００４３】
例えば、様々なＦＲＥＴシグナルは、ハイスループット・スクリーニング（ＲＵＢＹＳＴＡＲ、ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ）において特徴付けられる、研究所において当業者に一般的に使用される慣習的な蛍光検出器により定量的に測定され得る。様々なＦＲＥＴシグナルの測定はＧＰＣＲの活性状態又は非活性状態を直接的に説明することを可能とし、それ故、ハイスループット・スクリーニングにおいてこれらの受容体の機能を調節する分子を検索する好適な解決法を与える。
【００４４】
有利に、本発明のステップ１）は、細胞を、受容体をコードする核酸で、及びＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸でトランスフェクトすることにより実施され、ここで当該受容体、及びＧα又はＧβγサブユニットは、一方がドナー／アクセプター対のメンバーと、もう一方が当該ドナー／アクセプター対の第２メンバーと結合する。
【００４５】
異なる態様の１つにおいて、本発明のステップ１）は、受容体をコードする核酸、及びＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞の調製品を試験物質と接触させることにあり、ここで当該受容体、及び当該Ｇα又はＧβγサブユニットは、一方がドナー／アクセプター対のメンバーと結合し、他方がドナー／アクセプター対の第２メンバーと結合する。
【００４６】
有利に、本発明の方法のステップ２）は、以下のように実施される：
１）前記ドナーとアクセプターとの近接効果による伝達が、リガンド、前記受容体に対する薬剤、及び試験分子の無い条件下で測定され（基礎シグナル）；
２）受容体の活性化を誘発するだろう前記ＧＰＣＲに特異的なリガンドの存在下で得られたシグナル（参照シグナル）が、場合により前記基礎シグナルと比較され、
３）薬剤、又は前記受容体の活性を調節することが可能な化学分子の存在下で得られたシグナルが、前記基礎シグナル、及び前記参照シグナルと比較される。
【００４７】
本発明の方法の好ましい異なる態様において、ドナー／アクセプター対は、ドナー蛍光色素分子及びアクセプター蛍光色素分子からなる対であり、そして測定されたシグナルは、ドナー蛍光色素分子の励起波長で測定媒体の光励起後に放出されたＦＲＥＴシグナルである。
【００４８】
本発明の対象は、ＧＰＣＲをコードする核酸配列、及び対応するＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸配列でトランスフェクトされた細胞でもある、ここで、当該ＧＰＣＲ受容体、及びＧα又はＧβγサブユニットは、一方がドナー蛍光色素分子と、他方がアクセプター蛍光色素分子と結合する。
【００４９】
本発明の対象は、当業者によく知られた慣習的方法により得られた上記のようなトランスフェクトされた細胞の膜画分でもある。
【００５０】
最後に、本発明の対象は、上記のようなトランスフェクトされた細胞の調製品、及びＦＲＥＴシグナルを測定するために必要な手段を含むキットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明の詳細な説明
本発明は、ＦＲＥＴ技術に関するさらなる詳細について記載するが、結果として、この１つの技術に本出願を制限することはない。
【００５２】
ａ）トランスフェクトされた細胞の製造
本明細書中において、「トランスフェクトされた細胞の調製品」なる表現は、トランスフェクトされた細胞自体、当業者に知られた及び実施例１に示された方法により透過処理されたトランスフェクトされた細胞、トランスフェクトされた細胞の膜画分又は再構成により得られた膜画分、Ｇαサブユニット及びＧβγサブユニット、並びに人工原形質膜における受容体を意味する。
【００５３】
細胞は、安定的にトランスフェクトされ得る、換言すると、受容体、あるいはＧα又はＧβγサブユニットの受容体をコードする配列は、当該細胞のゲノムＤＮＡに一体化される。
【００５４】
細胞は、受容体をコードする核酸配列、及びＧα又はＧβγサブユニットの内の１つをコードする核酸配列を含むプラスミド型発現ベクターを用いても一過性にトランスフェクトされ得る。
【００５５】
当業者によく知られる、細胞をトランスフェクトするための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）による説明中の例に記載される。使用される細胞は真核細胞であり、例えば、ＨＥＫ２９３又はＣＯＳ細胞である。
【００５６】
トランスフェクションは、人工原形質膜における異種発現によっても実施され得る。
【００５７】
最後に、本発明は、トランスフェクトされた細胞の膜画分に関して実施され得、その製造は当業者の一般的知識の範囲内であり、低浸透圧緩衝液、超音波処理、ポリトロンを使用して細胞を壊すこと、及び着目の膜画分を回収することのステップを本質的に含む。これらの膜画分は、分画遠心法のさらなるステップにより又は勾配沈降によりさらに豊富となり得る。
【００５８】
ｂ）蛍光色素分子
本発明のために好適なドナー又はアクセプター蛍光色素分子は、ローダミン、シアニン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹとして知られる蛍光色素分子、蛍光色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとして知られる蛍光色素分子、希土類金属キレート、希土類金属クリプテート、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の如き蛍光タンパク質又はその変異体、サンゴから抽出される蛍光タンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンの如きフィコビリタンパク質、特にＸＬ６６５として知られるフィコシビリタンパク質から選択される、蛍光物質である。
【００５９】
ドナー蛍光色素分子は、与えられた波長で放出されるとき、アクセプター蛍光色素分子へエネルギーを伝達する上記蛍光色素分子のいずれかとなり得る。
【００６０】
アクセプター蛍光色素分子は、ドナー蛍光色素分子からのエネルギー伝達の間、ＦＲＥＴシグナルを放出することが可能な蛍光色素分子のいずれかとなり得る。
【００６１】
ＦＲＥＴシグナルを得るためのドナー／アクセプター蛍光色素分子対の選択は、当業者の可能性の範囲内である。一般的に、ＦＲＥＴを生じさせるために、当該アクセプターの励起スペクトルは、少なくとも部分的に当該ドナー化合物の放出スペクトルを覆う必要があり、そして当該ドナー及びアクセプター化合物の遷移双極子は平行でなければならない。
【００６２】
ＦＲＥＴ現象を研究するために使用され得るドナー／アクセプター対は、特に、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，第２版 ３３８）による説明に記載され、当業者に参考となっている。
【００６３】
好ましくは、ドナー蛍光色素分子は、希土類金属、特にテルビウム又はユーロピウムの複合体である。
【００６４】
有利に、希土類金属複合体は、キレート又はクリプテート、好ましくはピリジンユニットを有するクリプテートである。
【００６５】
希土類金属キレートは、特に、米国特許第４７６１４８１号、同第５０３２６７７号、同第５０５５５７８号、同第５１０６９５７号、同第５１１６９８９号、同第４７６１４８１号、同第４８０１７２２号、同第４７９４１９１号、同第４６３７９８８号、同第４６７０５７２号、同第４８３７１６９号、同第４８５９７７７号に記載される。他のキレートは、テルピリジンの如き非アデンテート（ｎｏｎａｄｅｎｔａｔｅ）リガンドからなる（欧州特許第４０３５９３号、米国特許第５３２４８２５号、同第５２０２４２３号、同第５３１６９０９号）。
【００６６】
希土類金属クリプテートは、特に、欧州特許第０１８０４９２号、同第０６０１１１３号、及び国際特許公開第ＷＯ０１／９６８７７号に記載される。
【００６７】
これらのクリプテートの間で、特に最も好ましいものは、場合によりカルボキシレートユニットで置換される、トリスビピリジンユニットを有するクリプテート、又は以下の化学式のピリジン・ビスビピリジン・クリプテートである。
【化１】
【００６８】
ドナー蛍光色素分子が希土類金属複合体であるとき、当該アクセプター蛍光色素分子は有利にシアニン又はアロフィコシアニンから選択され、場合により、架橋される。
【００６９】
ｃ）蛍光色素分子の結合
上記のように、蛍光色素分子は受容体、あるいはＧα又はＧβγサブユニットと、１又は複数の共有結合による直接的か、標識／抗標識抗体、抗原／抗体、アビジン又はストレプトアビジン／ビオチン、ハプテン／抗体型の結合パートナーを経由する間接的かのいずれかで結合される。
【００７０】
蛍光色素分子の直接的結合は、以下の：
１）上記受容体、上記Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットと蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現すること；
２）上記受容体、上記Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットと、不可逆酵素活性（一般的に自殺酵素と呼ばれる）を有するタンパク質であって、ＧＰＣＲ、Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニット上の蛍光色素分子を伝達する当該タンパク質との融合タンパク質を発現すること；
３）インテインでスプライシングすること、
により、実施され得る。
【００７１】
インテインでスプライシングすることによる結合技術は、例えば、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．２６，１５８８７−１５８９０頁，２６ Ｊｕｎｅ １９８８、及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，７１８０−７１８１に記載される。
【００７２】
蛍光色素分子の間接的結合は、以下の：
１）「リガンド−受容体」対又は「標識／抗標識」対を経由すること；
２）「天然」Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニット受容体を発現すること；この場合、蛍光化合物は、上記受容体Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットを特異的に認識する抗体と結合する；あるいは、
３）蛍光タンパク質に結合する、又は上記ＧＰＣＲ、Ｇαサブユニット若しくはＧβγサブユニット上の蛍光色素分子を伝達する自殺酵素に結合するＧαサブユニット又はＧβγサブユニット受容体を発現すること；
４）様々なＴＡＧを有するＧαサブユニット又はＧβγサブユニット受容体を発現すること；この場合、蛍光化合物は上記ＴＡＧに対して特異的に作用する抗体と結合する、
により実施され得る。
【００７３】
蛍光色素分子を結合するこれらの直接的及び間接的方法は、当業者によく知られた組換えＤＮＡ技術を使用する。
【００７４】
ＧＰＣＲ、Ｇαサブユニット又はＧβサブユニットと不可逆的酵素活性を有するタンパク質との融合タンパク質を発現することによる蛍光色素分子の直接結合は、不可逆的酵素活性を有するタンパク質として、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）（国際特許公開第ＷＯ０２／０８３９３７号を参照のこと。）又は脱ハロゲン酵素を有利に使用する。
【００７５】
この場合、細胞は、ＧＰＣＲをコードする核酸で、Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットをコードする核酸で、及び不可逆的酵素活性を有する上記タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされる。次いで、それらは、酵素活性を有する上記タンパク質に特異的な基質にさらされ、そして、受容体又はＧα若しくはＧβγサブユニットの内の１つに結合することが望まれる蛍光色素分子に共有結合される。
【００７６】
「リガンド−受容体」又は「標識／抗標識」対を用いる蛍光色素分子の間接的結合において、融合タンパク質は、受容体、Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットと標識と呼ばれるペプチド配列との間で発現される、この場合、蛍光化合物は、当該標識を特異的に認識する抗体と結合する。下記の「Ｍｙｃ」又は「ＦＬＡＧ」標識の如き、分子生物学において通常使用されるペプチド配列を使用する。
【００７７】
用語「リガンド−受容体対」は、例えば、以下の２つの結合パートナーを意味する：ハプテン／抗体；ＤＮＰ／抗ＤＮＰ抗体、ここでＤＮＰはジニトロフェノールを示す；ＧＳＴ／抗ＧＳＴ抗体、ここでＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを示す；ビオチン／アビジン；６ＨＩＳ／抗６ＨＩＳ抗体、ここで６ＨＩＳは６つのヒスチジンからなるペプチドである；Ｍｙｃ／抗Ｍｙｃ抗体、ここでＭｙｃはヒトＭｙｃタンパク質の４１０〜４１９アミノ酸からなるペプチドである；ＦＬＡＧ（登録商標）／抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体、ここでＦＬＡＧ（登録商標）はＤＹＫＤＤＤＤＫの８アミノ酸を有するペプチドである；ＨＡ／ＨＡ抗体、ここでＨＡはＹＰＹＤＶＰＤＹＡの９アミノ酸からなるインフルエンザの血球凝集素のエピトープである。他の対も使用され得る。
【００７８】
「標識／抗標識」と一般的に呼ばれる対のＤＮＡ配列は、当業者によく知られる。これらの配列は、プラスミドに組み込まれるか、ＰＣＲにより着目のタンパク質をコードするＤＮＡと融合される。
【００７９】
ｄ）ＦＲＥＴシグナルの測定
ＦＲＥＴシグナルは様々な方法：ドナーだけにより、ドナーとアクセプターにより放出される蛍光発光の測定、あるいはＦＲＥＴに起因する媒体中に伝送される光の偏光における偏差の測定で測定され得る。ドナーの値での存続期間における偏差を観察することによりＦＲＥＴの測定を組み入れることも可能であり、それは、希土類金属複合体の如き長い蛍光発光の存続期間を有するドナーの使用（特にプレートリーダーの如き単純な装置に関する）により促進される。
【００８０】
好ましくは、時間分解されたＦＲＥＴシグナル（ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル）が測定されるだろう。
【００８１】
ＦＲＥＴシグナル又はＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの測定の対象に関して、以下の文献を参照することにより本出願の明細書に援用する：
Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．「Ｒａｒｅ Ｅａｒｔｈ Ｃｒｙｐｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒａ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）３９，Ｎｏ．９，１９５３−１９５９；
Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．「Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｒａｒｅ Ｅａｒｔｈ Ｃｒｙｐｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）４１，Ｎｏ．９，１３９１−１３９７；
Ｈ．Ｂａｚｉｎら「Ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔａｔｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ，ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）８２，２３３−２５０；及び
ＥＰ第３２１３５３号；同第２３２３４８号；同第５３９４７７号；同第５３９４３５号；同第５６９４９６号；同第１１６１６８５号；同第１１６６１１９号；国際特許公開第ＷＯ２００４４０１３３４８号。
【００８２】
最後に、エネルギー伝達の測定の選択は、ドナー及びアクセプター蛍光色素分子の偏光の特性を使用して、改良され得ることに留意すべきである。
【００８３】
それ故、ドナー及びアクセプター蛍光色素分子の偏光の特性が使用されるとき、手順は以下のように実施される：
（ｉ）波長λ１で偏光された光線で測定媒体が励起される、ここでλ１は前記ドナー蛍光色素分子が励起される波長である；及び
（ｉｉ）放出された蛍光発光が、励起光の偏光平面と異なる偏光平面における波長λ３で測定される、ここでλ３は光が前記アクセプター蛍光色素分子から放出される波長である。
【００８４】
励起光の偏光平面と異なる平面（換言すると非平行）におけるアクセプター蛍光色素分子の放出波長で放出されたシグナルの測定は、高い偏光解消種により放出されるシグナル、特にエネルギーの伝達に使用されるアクセプターのためのシグナルの測定を促進することを可能とする。当該測定が実施される平面は、好ましくは、励起光の偏光平面と直交する平面である。他の平面における測定もまた適し得る。
【００８５】
好ましい態様において、偏光特性を使用する技術は、以下のステップをさらに含む：
（ｉｉｉ）波長λ２で放出される蛍光発光の測定、ここでλ２は、光がドナー蛍光色素分子から放出される波長である；及び
（ｉｖ）波長λ２でドナー蛍光色素分子により放出されるシグナルにより、波長λ３でアクセプター蛍光色素分子により放出されるシグナルの回収。
【００８６】
この回収は、例えば、波長λ３で測定される蛍光発光の強度対波長λ２で測定される蛍光発光の強度の比率の計算にある。
【００８７】
蛍光発光の測定がドナーの放出波長（λ２）で実施される場合、この測定は、平行又は異なる平面、好ましくは励起光の平面と直交する平面において実施され得る。
【００８８】
第２態様において、エネルギーの伝達に起因する偏光の変化を測定するための方法において、ドナー及びアクセプター蛍光色素分子の偏光特性が使用され、エネルギー伝達の測定の選択性を改良する。上記第１方法のように、この方法は測定の選択性を改善することを可能とし、そしてそれ故、検出が望まれるエネルギー伝達現象にさらによく関係するだろう。
【００８９】
この第２態様は、以下のステップ：
（ｉ）波長λ１で、偏光光線により測定媒体を励起し、ここでλ１は上記ドナー蛍光色素分子を励起する波長である；
（ｉｉ）前記励起光の平面と平行な平面において波長λ２で放出される蛍光発光の総強度（Ｉｔ／／）λ２を測定し、ここでλ２は、光がドナー蛍光色素分子から放出される波長である；
（ｉｉｉ）前記励起光の偏光平面と異なる平面において波長λ２で放出される総蛍光発光強度（Ｉｔ⊥）λ２を測定し；
（ｉｖ）前記励起光の平面と平行な平面において波長λ３で放出される蛍光発光の総強度（Ｉｔ／／）λ３を測定し、ここでλ３は、光がアクセプター蛍光色素分子から放出される波長である；
（ｖ）前記励起光の偏光平面と異なる平面において波長λ３で放出される総蛍光発光強度（Ｉｔ⊥）λ３を測定し；
（ｖｉ）以下の式：
【化２】
｛式中、
Ａは、励起光の平面と平行な平面における、ドナーのみにより波長λ２と波長λ３で放出された蛍光発光の比例定数を示し、
Ｂは、励起光の平面と異なる平面における、ドナーのみにより波長λ２と波長λ３で放出された蛍光発光の比例定数を示し、
ｎ＝１又は２であり、ここで、ｎ＝１のとき偏光の測定が生じるといわれ、ｎ＝２のとき異方性が関与し、
Ｇは、平行、及び直交平面において検出の感受性における差分を正すことを可能とする因子であり、この因子は、製造業者により提供されるか、既知の偏光物質の偏光を測定することによって当業者により容易に決定され得るかのいずれかである。特定の態様において、Ｇは０．１〜２であり、好ましくは０．８〜１．２であり、特にＧ＝１である。｝
により、前記ドナー蛍光色素分子とアクセプター蛍光色素分子との間のエネルギーの伝達に起因する偏光Ｐを計算し；そして
（ｖｉｉ）計算されたＰ値と、エネルギー伝達の生じない対照測定媒体で得られた値とを比較する、ここでＰの低減はエネルギー伝達を示す、
を含む。
【００９０】
好ましい態様において、Ａ、及びＢは、以下の方法：
Ａ＝（Ｉｄ／／）λ３／（Ｉｄ／／）λ２
Ｂ＝（Ｉｄ⊥）λ３／（Ｉｄ⊥）λ２
｛式中、（Ｉｄ／／）λ３、（Ｉｄ／／）λ２、（Ｉｄ⊥）λ３、（Ｉｄ⊥）λ２は、上記ドナー蛍光色素分子を含むがアクセプター蛍光色素分子を含まない測定媒体による、励起光の偏光平面と平行又は異なる平面における、波長λ２又はλ３で放出される蛍光発光の強度に対応する｝に従って計算される。
【００９１】
記載された第１方法のように、励起光の偏光平面と異なる平面において実施された測定は、当該励起光の偏光平面と直交する平面において好ましくは実施される。選択された平面が励起光の偏光平面と平行な平面でない限り、他の平面における測定も適し得る。
【００９２】
それ故、本発明の方法は、ドナー化合物とアクセプター化合物間のエネルギー伝達現象の測定の選択性を改良することを可能とする。このことは、当該ドナーと当該アクセプターとのスペクトル選択性が最適条件ではない場合に有利となる。その場合とは、換言すると、以下の：
・当該ドナーと当該アクセプターの発光スペクトルが重なっている場合であり、本発明の方法は５ｎｍ＜λ３−λ２＜１００ｎｍの場合に特に効果的である、ここでλ３−λ２は、波長λ３とλ２との差異を示す；
・アクセプターの直接的非励振励起が、ドナーの励起波長（λ１）で可能である場合、
である。
【００９３】
好ましい態様において、ドナー、及びアクセプター蛍光色素分子は、高い偏光を有し、特に５０ｍＰ超、好ましくは１００ｍＰ超である。本来のその偏光が５０ｍＰ未満であるドナー、及びアクセプター化合物は、担体分子（有機分子、タンパク質、ペプチド、抗体又は下記のような他の分子）に結合又は吸収され得、そしてそれは、蛍光色素分子の視覚的偏光を増大する効果を有し、そして本発明の方法においてそれを使用することを可能とする。
【００９４】
好ましい他の態様において、ドナー、及びアクセプター蛍光色素分子は、ドナーの励起波長λ１での励起後、ドナーの放出波長λ２でアクセプターの放出が検出されないように選択される。
【００９５】
本発明は、例証によりさらに詳細に記載されるだろうが、以下の実施例に限定するものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例１
機能的受容体ＧＡＢＡＢを形成する２つのサブユニットＧＢ１とＧＢ２のＣ末端部分、ＧＢ１のＥ９１６残基の後、及びＧＢ２のＥ７９３残基の後に標識（Ｍｙｃタグ：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を、並びにＧｏタンパク質のαサブユニット中のＶ９３とＥ９４残基の間に標識（ＦＬＡＧタグ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を、ＰＣＲによりに挿入した。
【００９７】
１ｍＦの電気容量のための２６０ボルトでの電気ショックである一実験条件あたり、１０００万個の細胞の比率でのエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄエレクトロポレーター）によりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、様々なコンストラクトを一過性発現させる。次いで、当該細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む完全ＤＭＥＭ培地中で二次培養する。次いで、当該細胞を９６ウェルプレートに１０００００細胞個／ウェルの比率で分配する。
【００９８】
エレクトロポレーションの２４時間後、ＰＢＳ緩衝液でリンスした後、次いで、当該細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（分子プローブ）（アクセプター）で、及びユーロピウムクリプテート（ピリジンビスピリジン ＰＢＰ）（ドナー）で各々標識された抗Ｍｙｃ抗体（最終３ｎＭ）及び抗ＦＬＡＧ抗体（最終１ｎＭ）の混合物とともに（平衡状態に達するために）４℃で少なくとも５時間インキュベートする。当該抗体を含む反応培地は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．３、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）×１００の０．０１％である。この培地は、細胞内媒体と比較して等浸透圧組成物を有する。低いトリトン×１００濃度は、細胞の制御された透過性をもたらし、あらかじめ細胞を固定する必要なしに抗体が細胞内エピトープに達することを可能とする。
【００９９】
得られた結果を添付の図２に示す。
【０１００】
ＧＢ１又はＧＢ２のＣ末端でのＭｙｃタグとＧｏ−ＦＬＡＧタンパク質との間の△６６５シグナル（バックグラウンド・ノイズに対して補正されたアクセプターの６６５ｎｍでの放出）により示されるＦＲＥＴシグナルの測定は、当該２つのタンパク質間の特異的相互作用を示す。ＦＲＥＴシグナルは、蛍光発光リーダー（Ｒｕｂｙｓｔａｒ）に関して定量的に測定され得る。
【０１０１】
比較目的で、ＦＲＥＴシグナルも、実験時点と同じ最終プラスミド量でトランスフェクトされた細胞について測定した。この条件下、モック（ｍｏｃｋ）と呼ばれるプラスミドは、ＧＢ１、ＧＢ２又はＧｏタンパク質のいずれのコード配列も含まない。
【０１０２】
実施例２
ＳＮＡＰタグ、及びＨａｌｏタグ酵素のコード配列を、ＧＢ１又はＧＢ２サブユニットのＣ末端に、及びＧｏタンパク質のＧβγサブユニットにおいて同定されたループに、各々、分子生物学により挿入した。これらのコンストラクトを、実施例１に記載のように一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に発現させた。
【０１０３】
トランスフェクションから２４時間後、各々、アクセプター蛍光色素分子（Ａ）で標識された、及びドナー蛍光色素分子（Ｄ）で標識されたＳＮＡＰタグ、及びＨａｌｏタグ酵素に特異的な物質の５μＭを含む培地と共に、当該細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター内でインキュベートした。洗浄後、当該細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター内において培地内に再度インキュベートし、その後シグナルの検出を実施する。
【０１０４】
ＳＮＡＰタグとＨａｌｏタグの酵素活性の結果は、着目の機能性ＧＰＣＲ、Ｇｏタンパク質のＧβγサブユニットの各々へのドナー及びアクセプター蛍光色素分子の共有結合である。当該シグナルの測定は、蛍光発光リーダー（ＲｕｄｙＳｔａｒ）定量的に実施され、又は落射蛍光顕微鏡を用いて定性的かつ半定量的に実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、リガンドの存在下におけるＧＰＣＲの活性化の機構を図式的に示した図である。
【図２】図２は、ＧＢ１又はＧＢ２のＣ末端でのＭｙｃタグとＧｏ−ＦＬＡＧタンパク質との間の△６６５シグナル（バックグラウンド・ノイズに対して補正されたアクセプターの６６５ｎｍでの放出）により示されるＦＲＥＴシグナルの測定を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー／アクセプター対の２つのメンバー間の近接効果による伝達によりそのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つとの相互作用の検出する方法、及び特に新規薬剤、及びオーファン受容体の同定のスクリーニングの如き活用に関する。
【０００２】
本明細書中において、「近接効果による伝達」なる表現は、ＦＲＥＴシグナル｛ＨＴＲＦ（登録商標）技術、ＣＩＳ ＢＩＯ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ｝、一重項酸素の伝達｛Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）技術、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、例えば、Ｂｅａｕｄｅｔら、Ｇｅｎｏｍｕ Ｒｅｓ．，２００１ Ａｐｒ．１１（４）、６００−８を参照のこと。｝、電子伝達｛ＳＰＡ技術、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、例えば、Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，Ｍａｒ．，１６１（２），４９４−５００を参照のこと。｝により特徴付けられるエネルギー伝達を意味する。
【０００３】
一般的にＦＲＥＴ技術と呼ばれる蛍光発光非放射エネルギーのための技術において、ＴＲ−ＦＲＥＴ技術（時間分解蛍光共鳴エネルギー伝達）は、均質媒質における時間分解蛍光の測定を可能とする。希土類キレート又はクリプテートでのこの技術、特にＧ．Ｍａｔｈｉｓら（特に、「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ｒａｒｅ ｅａｒｔｈ ｃｒｙｐｔａｔｅｓ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ」、Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ Ｐａｒｔ Ａ ５７（２００１）２１９７−２２１１を参照のこと。）により開発された当該技術の使用は、生体外診断の分野及び製薬産業におけるハイスループットのスクリーニングの分野において、既にいくつかの適用を許容されている多くの有利点を有する。
【０００４】
この技術は、ＨＴＲＦ（登録商標）（均質時間分解蛍光）の名としても知られ、第１ドナー蛍光化合物、及び第２アクセプター蛍光化合物を使用する。
【０００５】
ドナーの波長での光励起後、エネルギー伝達は、当該ドナーとアクセプターが互いに近接するならば、それらの間に生ずる。このエネルギー伝達は、蛍光光度計を用いて測定され得るアクセプターによる光の放出（ＦＲＥＴシグナル）により特徴付けられる。
【０００６】
特にＧタンパク質に結合する７回膜貫通型ドメインを有する受容体である受容体（以後ＧＰＣＲという）は、多数の病理経路に関する。ＧＰＣＲは、細胞の外から内での情報の認識、及び伝達に関与する。これらのタンパク質は、主な治療標的を示し、そして現在の薬剤の５０％超は、これらの受容体又はそれらの伝達カスケードを標的とする。
【０００７】
リガンドの存在下におけるＧＰＣＲの活性化の機構を、付随の図１に図式的に示す。
【０００８】
ＧＰＣＲへのアゴニストリガンドの結合は、その三次構造を変更し、そして順々に、ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質を活性化する。当該Ｇタンパク質の活性化は、その場合に依存し、ｃＡＭＰ又はＩＰ３の如き二次細胞内伝達物質を産生するエフェクターの活性又は阻害を引き起こす。
【０００９】
本明細書中において、「オーファン受容体」なる表現は、そのＤＮＡ配列がＧＰＣＲの配列と一致するがその特異的天然リガンドがわからないことを提示する膜貫通型受容体を意味する。
【００１０】
シグナル伝達経路（二次伝達物質、及びエフェクター）の特徴、及び「オーファン受容体」と呼ばれるＧＰＣＲのためのリガンドの同定は、これらのＧＰＣＲの生理学的役割を理解する上で、並びに新たな薬剤の製造のために、非常に重要である。
【背景技術】
【００１１】
様々な方法が、ＧＰＣＲの活性化経路の構成成分の内の１つを使用する受容体／Ｇタンパク質相互作用の検出のために、特に特異的リガンドの検出のために存在する。
【００１２】
例えば、リガンド検出のためのある方法は、非加水分解性放射性ＧＴＰの誘導体、すなわちＧＰＣＲが活性化したときにＧαタンパク質に結合する[３５Ｓ]ＧＴＰγを使用する。当該ＧＴＰ類似体の結合のための速度パラメータは、Ｇタンパク質の型に依存する。この放射性方法は、ハイスループットでの薬剤のスクリーニングのためには適さない。
【００１３】
他の慣習的方法は、活性化された三量体Ｇタンパク質のサブユニットによるエフェクターの活性に基づく。
【００１４】
図１に示されるように、エフェクターの活性化、及びｃＡＭＰ又はＩＰ３の如き二次伝達物質の産生は、ＧＰＣＲ及びＧタンパク質の刺激の後に産生される。それ故、この方法は、ＧＰＣＲの活性化経路の下流を産生する物質に関する。
【００１５】
ハイスループットでの薬剤のスクリーニングに適した方法は、酵素活性の測定に基づく組換え系を使用し、当該酵素活性はβガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼの活性の如き酵素活性であってその発現はＧＰＣＲの活性化により産生される二次伝達物質により制御される。これらは、ＧＰＣＲの活性を測定する間接的方法であり、当該ＧＰＣＲ活性経路の下流を産生する物質にも関する。
【００１６】
リガンドの検出のための別の方法は、アレスチン−ＧＦＰの転移に焦点を当てる。
【００１７】
アレスチンは、ＧＰＣＲへのリガンドの結合により誘発される活性経路を止める調節機構に関する。それは細胞内における受容体の内在化経路を誘発することを可能とし、そしてそのステップは、細胞膜における受容体の分解又はリサイクルのために必要である。ＮＯＲＡＫ ＢＩＯＳＣＩにより開発された技術（Ｔｒａｎｓｆｌｕｏｒ）は、細胞内で発現される蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合するアレスチン（アレスチン−ＧＦＰ）を使用する。通常条件下、アレスチン−ＧＦＰはサイトゾルに分配される。ＧＰＣＲの活性化後、アレスチン−ＧＦＰは、膜に存在するＧＰＣＲと相互作用し、そしてアゴニストにより刺激されるだろう。それ故、その細胞分布は変更されるだろう。それは、サイトゾルから離れ、原形質膜に再分布され（転移現象）、そして内在化現象（細胞表面からの受容体の消失）に関与する。時間とともに、その受容体に結合するアレスチン−ＧＦＰの蛍光発光は、特定の受容体のエンドサイトーシスの現象を示す細胞で内部小胞（エンドソーム）付近にも測定され得る。アレスチン−ＧＦＰの分布におけるこれらの変化は、顕微鏡使用、及び画像処理技術により達成される。これらの理由により、この技術は、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）に好適なものではない。
【００１８】
Ｊａｎｅｔｏｐｏｕｌｏｓら｛Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９１：２４０８−２４１１；Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２７：３６６−３７３｝による最近の研究は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍにおいて、Ｇα２−ＣＦＰとＧβ−ＹＥＰサブユニットとの間のＦＲＥＴシグナルを視覚化することを可能としている。ＡｚｐｉａｚｕとＧａｕｔａｍ｛ＪＢＣ（２００４）２７９（２６）：２７７０９−２７７１８｝の研究は、ＣＨＯ細胞に発現されるムスカリン様受容体Ｍ２及びＭ３の刺激のためのモデルにおいて、Ｇα−ＣＦＰとＧβ−ＹＥＰとのＦＲＥＴシグナルにおける変化の似たような結果を示す。Ｂｅｒｌｏｔ ｔｅａｍ｛ＪＢＣ（２００４）２７９（２９）：３０２７９−３０２８６｝は、蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の断片で標識されたＧβとＧγとの相互作用を生体内でかつ顕微鏡により示している。Ｇβγの結合は当該ＹＦＰタンパク質の蛍光発光を元の状態に戻す。
【００１９】
これらの観察結果は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化がＦＲＥＴ技術により分析され得ることを提示する。これらの技術は、Ｇタンパク質のサブユニット間のＦＲＥＴの測定により受容体の活性化を間接的に示すが、それ自身、着目の受容体と結合するＧタンパク質のサブユニットのいずれかとの間の特異的ＦＲＥＴシグナルにより測定されるＧＰＣＲの活性化の状態を少しも示さず、かつ直接的に示さない。
【００２０】
他の方法は、分子生物学により第３細胞内ループ及びＣ末端部分の各々のレベルで蛍光タンパク質（ＣＦＰ及びＹＥＰ）をＧＰＣＲに挿入すること、ＦＲＥＴシグナルの変化により受容体の活性化を測定することにある。この方法は、Ｖｉｌａｒｄａｇａら｛Ｎａｔ．Ｂｉｏｃｈｅｎｏｌ．（２００３）２１：８０７−８１２；国際特許公開第２００４／０５７３３３号｝に記載されている。それは、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用、及びＧＰＣＲの活性化後のこれらの相互作用の調節を直接的に考慮しない。
【００２１】
他の方法は、ＦＲＥＴ技術によりＧＰＣＲのオリゴマー化を検出することにある（米国特許第６８２４９９０Ｂ１号）。
【００２２】
これらの方法の内、ＦＲＥＴシグナルを測定することにより、着目の受容体であるＧＰＣＲ受容体の早期活性化の状態、及び結合するＧタンパク質のサブユニットのいずれかを説明することができるものは無い。
【発明の開示】
【００２３】
本発明の概要
受容体とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つとの近接効果の伝達に基づく蛍光シグナルを測定することにより活性経路の初期段階でＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を検出することが可能であることを、驚くべきことに見出した。
【００２４】
近接効果の伝達のためのシグナルの測定は、与えられたＧＰＣＲ／Ｇα対又はＲＣＰＧ／Ｇβγ対の活性化状態に基づく。着目のＧＰＣＲ、及び対応するＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの内の１つから必ずなる唯一の対により産生されることより、このシグナルは高い特異性を有する。近接効果の伝達のためのこのシグナルは、受容体が薬剤（アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト又はアロステリック調節剤）により特異的に刺激されたときに、陽性に又は陰性に調節され得る。
【００２５】
本発明は、着目のＧＰＣＲの活性化のための経路における初期変化を考慮するので、反応の特異性の観点からも有利であることを提示する。既に知られた方法と異なり、ＧＰＣＲのシグナル経路のかなり上流に位置するので、潜在的薬剤の非存在又は存在下において、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質間の密接な相互作用を考慮する。
【００２６】
それ故、本発明の本質は、受容体とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つとの相互作用の検出方法であって、以下のステップ：
１）ドナー／アクセプター対のメンバーで標識された受容体を当該ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットと、生体媒質中で接触させ；
２）前記ドナーと前記アクセプターとの近接効果による伝達を測定する、
を含む、前記方法である。
【００２７】
受容体とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つとの相互作用を検出することを可能とする本発明の方法は、以下の
１）受容体／Ｇタンパク質の結合の立証；
２）受容体特性の研究；
３）受容体に対するアゴニスト又はアンタゴニストリガンドの検出、及び新規薬剤のスクリーニング；
４）オーファン受容体の同定、
に特に好適である。
【００２８】
標識された受容体をＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つと接触させることは、様々な方法により実施され得、例えば、当該受容体、一方ではＧα又はＧβγサブユニットの１つをコードする核酸を細胞内に共発現させることにより、あるいは当該受容体、一方では当該Ｇタンパク質のサブユニットをコードするサブユニットを形成するサブユニットをコードする核酸の異種発現により得られた機能的ＧＰＣＲ（ＧＰＣＲを形成するサブユニット、及びＧタンパク質のサブユニットを含む）を再構成することにより、あるいは人工原形質膜における組織抽出液からの精製の後に（例えば、Ｆｌｏｒｉｏら ＪＢＣ １９８５，Ｖｏｌ．２６０ Ｎｏ．８，３４７７〜３４８３頁；Ｈａｇａ Ｋ．ら ＪＢＣ １９８６，Ｖｏｌ．２６１ Ｎｏ．２２，１０１０３〜１０１４０頁；Ｄｅｖｅｓａ Ｆ．ら ２００２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６９，５１６３〜５１７４頁；Ｓｔｅｎｌｕｎｄら Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，３１６，２４３−２５０、及びＰａｒｋ ＰＳＨ．２００４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５６７，３４４−３４８を参照のこと。）実施され得る。
【００２９】
有利に、使用されたＧＰＣＲが既知の受容体であるとき、接触させることは、第一に、当該受容体の活性化を誘発するＧＰＣＲのための天然リガンドの存在下で実施され、次いで、潜在的薬剤又は上記受容体の活性を調節することが可能な他の試験分子の存在下で実施される。
【００３０】
ＧＰＣＲがオーファン受容体であるとき、接触は、もし相互作用があるのならば当該オーファン受容体を同定することを可能とさせ得る既知の受容体のための天然リガンドの存在下で、実施される。
【００３１】
上記オーファン受容体の活性を調節することが可能な潜在的薬剤又は他の試験化合物の検出は、既知の受容体について上記されるように実施される。
【００３２】
本発明の方法に使用されるドナー／アクセプター対のメンバーは、測定することが所望される近接効果による伝達の方法に従って選択される。
【００３３】
それ故、もし近接効果による伝達が蛍光発光によるエネルギーの伝達であるならば、当該ドナー／アクセプター対はエネルギーを供与する蛍光色素分子、及びエネルギーを受容する蛍光色素分子からなる。
【００３４】
本発明の目的のための適切な蛍光色素分子は、蛍光タンパク質又は有機蛍光色素分子から選択された蛍光色素分子である。これらの蛍光色素分子の例は、ローダミン、シアニン、スクアライン、ジフルオロボラジアザインダセン誘導体の如きＢＯＤＩＰＹとして知られる蛍光色素分子、蛍光色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとして知られる化合物、希土類金属キレート、希土類金属クリプテート、量子ドット型のナノ結晶、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の如き蛍光タンパク質又はその変異体、サンゴから抽出される蛍光タンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンの如きフィコビリタンパク質、特にＸＬ６６５として知られるフィコビリタンパク質、又は国際特許公開第２００３／１０４６８５号に記載される蛍光色素化合物である。当業者は、ＦＲＥＴ又はＴＲ−ＦＲＥＴの測定のための好適なドナー／アクセプター対を選択することができる。
【００３５】
一重項酸素の伝達の場合、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社により販売されるＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）技術に関する試薬は、例えば、ドナー／アクセプター対のために使用されるだろう（Ｂｅａｕｄｅｔら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００１ Ａｐｒ．１１（４），６００−８を参照のこと。）
【００３６】
もし近接効果による伝達が電子の移動であるならば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，Ｍａｒ．，１６１（２），４９４−５００に記載のものは、ドナー／アクセプター対として使用されるだろう。
【００３７】
本発明の方法に使用される受容体は、有利に、既知のＧＰＣＲであり、例えば、ムスカリン様受容体、バソプレシン受容体、ＧＡＢＡ（ガンマ−アミノ酪酸）受容体、又はその機能を特徴付けることが望まれるＧＰＣＲ、つまりはオーファン受容体である。
【００３８】
これらの受容体をコードするＤＮＡ配列は、当業者に知られた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら 下記を参照のこと）又は商業的に入手可能な（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）慣習的分子生物学技術に従い、ＰＣＲにより増幅され得る。
【００３９】
本発明の方法において使用されるＧα及びＧβγサブユニットは、Ｇｉ、Ｇｓ、Ｇｑ又はＧ１２／Ｇ１３、Ｇ１４、Ｇ１５又はＧ１６サブユニット、あるいはＧｑｘ型構造（Ｘは主にｓ、ｉ、ｏとなり得る。）を有するキメラＧタンパク質となり得（Ｃｏｎｋｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，ｖ３６３ ２７４−６頁：Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｒｅｅｓ Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．，１９９９，ｖ２０ １１８−２４頁を参照のこと。）、その配列、及び特性は当業者に知られている。
【００４０】
サブユニットをコードするＤＮＡ配列は、当業者に知られた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら 下記を参照のこと）又は商業的に入手可能な（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）慣習的分子生物学技術に従い、ＰＣＲにより増幅され得る。
【００４１】
受容体の、及びＧα又はＧβγサブユニットの内の１つの標識は、当業者によく知られた技術｛例えば、Ｊａｎｅｔｏｐｏｕｌｏｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２７：３６６−３７３、及びＶｉｌａｒｄａｇａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１：８０７−８１２｝に従い１又は複数の共有結合により直接的に、あるいは標識／抗標識抗体、抗原／抗体、アビジン又はストレプトアビジン／ビオチン、ハプテン／抗体型の結合パートナーを経由した間接的のいずれかで実施される。
【００４２】
近接効果の伝達のためのシグナルの測定は、当業者によく知られ、及び上記の例に記載された慣習的方法に従って実施される。
【００４３】
例えば、様々なＦＲＥＴシグナルは、ハイスループット・スクリーニング（ＲＵＢＹＳＴＡＲ、ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ）において特徴付けられる、研究所において当業者に一般的に使用される慣習的な蛍光検出器により定量的に測定され得る。様々なＦＲＥＴシグナルの測定はＧＰＣＲの活性状態又は非活性状態を直接的に説明することを可能とし、それ故、ハイスループット・スクリーニングにおいてこれらの受容体の機能を調節する分子を検索する好適な解決法を与える。
【００４４】
有利に、本発明のステップ１）は、細胞を、受容体をコードする核酸で、及びＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸でトランスフェクトすることにより実施され、ここで当該受容体、及びＧα又はＧβγサブユニットは、一方がドナー／アクセプター対のメンバーと、もう一方が当該ドナー／アクセプター対の第２メンバーと結合する。
【００４５】
異なる態様の１つにおいて、本発明のステップ１）は、受容体をコードする核酸、及びＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞の調製品を試験物質と接触させることにあり、ここで当該受容体、及び当該Ｇα又はＧβγサブユニットは、一方がドナー／アクセプター対のメンバーと結合し、他方がドナー／アクセプター対の第２メンバーと結合する。
【００４６】
有利に、本発明の方法のステップ２）は、以下のように実施される：
１）前記ドナーとアクセプターとの近接効果による伝達が、リガンド、前記受容体に対する薬剤、及び試験分子の無い条件下で測定され（基礎シグナル）；
２）受容体の活性化を誘発するだろう前記ＧＰＣＲに特異的なリガンドの存在下で得られたシグナル（参照シグナル）が、場合により前記基礎シグナルと比較され、
３）薬剤、又は前記受容体の活性を調節することが可能な化学分子の存在下で得られたシグナルが、前記基礎シグナル、及び前記参照シグナルと比較される。
【００４７】
本発明の方法の好ましい異なる態様において、ドナー／アクセプター対は、ドナー蛍光色素分子及びアクセプター蛍光色素分子からなる対であり、そして測定されたシグナルは、ドナー蛍光色素分子の励起波長で測定媒体の光励起後に放出されたＦＲＥＴシグナルである。
【００４８】
本発明の対象は、ＧＰＣＲをコードする核酸配列、及び対応するＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸配列でトランスフェクトされた細胞でもある、ここで、当該ＧＰＣＲ受容体、及びＧα又はＧβγサブユニットは、一方がドナー蛍光色素分子と、他方がアクセプター蛍光色素分子と結合する。
【００４９】
本発明の対象は、当業者によく知られた慣習的方法により得られた上記のようなトランスフェクトされた細胞の膜画分でもある。
【００５０】
最後に、本発明の対象は、上記のようなトランスフェクトされた細胞の調製品、及びＦＲＥＴシグナルを測定するために必要な手段を含むキットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明の詳細な説明
本発明は、ＦＲＥＴ技術に関するさらなる詳細について記載するが、結果として、この１つの技術に本出願を制限することはない。
【００５２】
ａ）トランスフェクトされた細胞の製造
本明細書中において、「トランスフェクトされた細胞の調製品」なる表現は、トランスフェクトされた細胞自体、当業者に知られた及び実施例１に示された方法により透過処理されたトランスフェクトされた細胞、トランスフェクトされた細胞の膜画分又は再構成により得られた膜画分、Ｇαサブユニット及びＧβγサブユニット、並びに人工原形質膜における受容体を意味する。
【００５３】
細胞は、安定的にトランスフェクトされ得る、換言すると、受容体、あるいはＧα又はＧβγサブユニットの受容体をコードする配列は、当該細胞のゲノムＤＮＡに一体化される。
【００５４】
細胞は、受容体をコードする核酸配列、及びＧα又はＧβγサブユニットの内の１つをコードする核酸配列を含むプラスミド型発現ベクターを用いても一過性にトランスフェクトされ得る。
【００５５】
当業者によく知られる、細胞をトランスフェクトするための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）による説明中の例に記載される。使用される細胞は真核細胞であり、例えば、ＨＥＫ２９３又はＣＯＳ細胞である。
【００５６】
トランスフェクションは、人工原形質膜における異種発現によっても実施され得る。
【００５７】
最後に、本発明は、トランスフェクトされた細胞の膜画分に関して実施され得、その製造は当業者の一般的知識の範囲内であり、低浸透圧緩衝液、超音波処理、ポリトロンを使用して細胞を壊すこと、及び着目の膜画分を回収することのステップを本質的に含む。これらの膜画分は、分画遠心法のさらなるステップにより又は勾配沈降によりさらに豊富となり得る。
【００５８】
ｂ）蛍光色素分子
本発明のために好適なドナー又はアクセプター蛍光色素分子は、ローダミン、シアニン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹとして知られる蛍光色素分子、蛍光色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとして知られる蛍光色素分子、希土類金属キレート、希土類金属クリプテート、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の如き蛍光タンパク質又はその変異体、サンゴから抽出される蛍光タンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンの如きフィコビリタンパク質、特にＸＬ６６５として知られるフィコシビリタンパク質から選択される、蛍光物質である。
【００５９】
ドナー蛍光色素分子は、与えられた波長で放出されるとき、アクセプター蛍光色素分子へエネルギーを伝達する上記蛍光色素分子のいずれかとなり得る。
【００６０】
アクセプター蛍光色素分子は、ドナー蛍光色素分子からのエネルギー伝達の間、ＦＲＥＴシグナルを放出することが可能な蛍光色素分子のいずれかとなり得る。
【００６１】
ＦＲＥＴシグナルを得るためのドナー／アクセプター蛍光色素分子対の選択は、当業者の可能性の範囲内である。一般的に、ＦＲＥＴを生じさせるために、当該アクセプターの励起スペクトルは、少なくとも部分的に当該ドナー化合物の放出スペクトルを覆う必要があり、そして当該ドナー及びアクセプター化合物の遷移双極子は平行でなければならない。
【００６２】
ＦＲＥＴ現象を研究するために使用され得るドナー／アクセプター対は、特に、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，第２版 ３３８）による説明に記載され、当業者に参考となっている。
【００６３】
好ましくは、ドナー蛍光色素分子は、希土類金属、特にテルビウム又はユーロピウムの複合体である。
【００６４】
有利に、希土類金属複合体は、キレート又はクリプテート、好ましくはピリジンユニットを有するクリプテートである。
【００６５】
希土類金属キレートは、特に、米国特許第４７６１４８１号、同第５０３２６７７号、同第５０５５５７８号、同第５１０６９５７号、同第５１１６９８９号、同第４７６１４８１号、同第４８０１７２２号、同第４７９４１９１号、同第４６３７９８８号、同第４６７０５７２号、同第４８３７１６９号、同第４８５９７７７号に記載される。他のキレートは、テルピリジンの如き非アデンテート（ｎｏｎａｄｅｎｔａｔｅ）リガンドからなる（欧州特許第４０３５９３号、米国特許第５３２４８２５号、同第５２０２４２３号、同第５３１６９０９号）。
【００６６】
希土類金属クリプテートは、特に、欧州特許第０１８０４９２号、同第０６０１１１３号、及び国際特許公開第ＷＯ０１／９６８７７号に記載される。
【００６７】
これらのクリプテートの間で、特に最も好ましいものは、場合によりカルボキシレートユニットで置換される、トリスビピリジンユニットを有するクリプテート、又は以下の化学式のピリジン・ビスビピリジン・クリプテートである。
【化１】
【００６８】
ドナー蛍光色素分子が希土類金属複合体であるとき、当該アクセプター蛍光色素分子は有利にシアニン又はアロフィコシアニンから選択され、場合により、架橋される。
【００６９】
ｃ）蛍光色素分子の結合
上記のように、蛍光色素分子は受容体、あるいはＧα又はＧβγサブユニットと、１又は複数の共有結合による直接的か、標識／抗標識抗体、抗原／抗体、アビジン又はストレプトアビジン／ビオチン、ハプテン／抗体型の結合パートナーを経由する間接的かのいずれかで結合される。
【００７０】
蛍光色素分子の直接的結合は、以下の：
１）上記受容体、上記Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットと蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現すること；
２）上記受容体、上記Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットと、不可逆酵素活性（一般的に自殺酵素と呼ばれる）を有するタンパク質であって、ＧＰＣＲ、Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニット上の蛍光色素分子を伝達する当該タンパク質との融合タンパク質を発現すること；
３）インテインでスプライシングすること、
により、実施され得る。
【００７１】
インテインでスプライシングすることによる結合技術は、例えば、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．２６，１５８８７−１５８９０頁，２６ Ｊｕｎｅ １９８８、及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，７１８０−７１８１に記載される。
【００７２】
蛍光色素分子の間接的結合は、以下の：
１）「リガンド−受容体」対又は「標識／抗標識」対を経由すること；
２）「天然」Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニット受容体を発現すること；この場合、蛍光化合物は、上記受容体Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットを特異的に認識する抗体と結合する；あるいは、
３）蛍光タンパク質に結合する、又は上記ＧＰＣＲ、Ｇαサブユニット若しくはＧβγサブユニット上の蛍光色素分子を伝達する自殺酵素に結合するＧαサブユニット又はＧβγサブユニット受容体を発現すること；
４）様々なＴＡＧを有するＧαサブユニット又はＧβγサブユニット受容体を発現すること；この場合、蛍光化合物は上記ＴＡＧに対して特異的に作用する抗体と結合する、
により実施され得る。
【００７３】
蛍光色素分子を結合するこれらの直接的及び間接的方法は、当業者によく知られた組換えＤＮＡ技術を使用する。
【００７４】
ＧＰＣＲ、Ｇαサブユニット又はＧβサブユニットと不可逆的酵素活性を有するタンパク質との融合タンパク質を発現することによる蛍光色素分子の直接結合は、不可逆的酵素活性を有するタンパク質として、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）（国際特許公開第ＷＯ０２／０８３９３７号を参照のこと。）又は脱ハロゲン酵素を有利に使用する。
【００７５】
この場合、細胞は、ＧＰＣＲをコードする核酸で、Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットをコードする核酸で、及び不可逆的酵素活性を有する上記タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされる。次いで、それらは、酵素活性を有する上記タンパク質に特異的な基質にさらされ、そして、受容体又はＧα若しくはＧβγサブユニットの内の１つに結合することが望まれる蛍光色素分子に共有結合される。
【００７６】
「リガンド−受容体」又は「標識／抗標識」対を用いる蛍光色素分子の間接的結合において、融合タンパク質は、受容体、Ｇαサブユニット又はＧβγサブユニットと標識と呼ばれるペプチド配列との間で発現される、この場合、蛍光化合物は、当該標識を特異的に認識する抗体と結合する。下記の「Ｍｙｃ」又は「ＦＬＡＧ」標識の如き、分子生物学において通常使用されるペプチド配列を使用する。
【００７７】
用語「リガンド−受容体対」は、例えば、以下の２つの結合パートナーを意味する：ハプテン／抗体；ＤＮＰ／抗ＤＮＰ抗体、ここでＤＮＰはジニトロフェノールを示す；ＧＳＴ／抗ＧＳＴ抗体、ここでＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを示す；ビオチン／アビジン；６ＨＩＳ／抗６ＨＩＳ抗体、ここで６ＨＩＳは６つのヒスチジンからなるペプチドである；Ｍｙｃ／抗Ｍｙｃ抗体、ここでＭｙｃはヒトＭｙｃタンパク質の４１０〜４１９アミノ酸からなるペプチドである；ＦＬＡＧ（登録商標）／抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体、ここでＦＬＡＧ（登録商標）はＤＹＫＤＤＤＤＫの８アミノ酸を有するペプチドである；ＨＡ／ＨＡ抗体、ここでＨＡはＹＰＹＤＶＰＤＹＡの９アミノ酸からなるインフルエンザの血球凝集素のエピトープである。他の対も使用され得る。
【００７８】
「標識／抗標識」と一般的に呼ばれる対のＤＮＡ配列は、当業者によく知られる。これらの配列は、プラスミドに組み込まれるか、ＰＣＲにより着目のタンパク質をコードするＤＮＡと融合される。
【００７９】
ｄ）ＦＲＥＴシグナルの測定
ＦＲＥＴシグナルは様々な方法：ドナーだけにより、ドナーとアクセプターにより放出される蛍光発光の測定、あるいはＦＲＥＴに起因する媒体中に伝送される光の偏光における偏差の測定で測定され得る。ドナーの値での存続期間における偏差を観察することによりＦＲＥＴの測定を組み入れることも可能であり、それは、希土類金属複合体の如き長い蛍光発光の存続期間を有するドナーの使用（特にプレートリーダーの如き単純な装置に関する）により促進される。
【００８０】
好ましくは、時間分解されたＦＲＥＴシグナル（ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル）が測定されるだろう。
【００８１】
ＦＲＥＴシグナル又はＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの測定の対象に関して、以下の文献を参照することにより本出願の明細書に援用する：
Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．「Ｒａｒｅ Ｅａｒｔｈ Ｃｒｙｐｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒａ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）３９，Ｎｏ．９，１９５３−１９５９；
Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．「Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｒａｒｅ Ｅａｒｔｈ Ｃｒｙｐｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）４１，Ｎｏ．９，１３９１−１３９７；
Ｈ．Ｂａｚｉｎら「Ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔａｔｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ，ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）８２，２３３−２５０；及び
ＥＰ第３２１３５３号；同第２３２３４８号；同第５３９４７７号；同第５３９４３５号；同第５６９４９６号；同第１１６１６８５号；同第１１６６１１９号；国際特許公開第ＷＯ２００４４０１３３４８号。
【００８２】
最後に、エネルギー伝達の測定の選択は、ドナー及びアクセプター蛍光色素分子の偏光の特性を使用して、改良され得ることに留意すべきである。
【００８３】
それ故、ドナー及びアクセプター蛍光色素分子の偏光の特性が使用されるとき、手順は以下のように実施される：
（ｉ）波長λ１で偏光された光線で測定媒体が励起される、ここでλ１は前記ドナー蛍光色素分子が励起される波長である；及び
（ｉｉ）放出された蛍光発光が、励起光の偏光平面と異なる偏光平面における波長λ３で測定される、ここでλ３は光が前記アクセプター蛍光色素分子から放出される波長である。
【００８４】
励起光の偏光平面と異なる平面（換言すると非平行）におけるアクセプター蛍光色素分子の放出波長で放出されたシグナルの測定は、高い偏光解消種により放出されるシグナル、特にエネルギーの伝達に使用されるアクセプターのためのシグナルの測定を促進することを可能とする。当該測定が実施される平面は、好ましくは、励起光の偏光平面と直交する平面である。他の平面における測定もまた適し得る。
【００８５】
好ましい態様において、偏光特性を使用する技術は、以下のステップをさらに含む：
（ｉｉｉ）波長λ２で放出される蛍光発光の測定、ここでλ２は、光がドナー蛍光色素分子から放出される波長である；及び
（ｉｖ）波長λ２でドナー蛍光色素分子により放出されるシグナルにより、波長λ３でアクセプター蛍光色素分子により放出されるシグナルの回収。
【００８６】
この回収は、例えば、波長λ３で測定される蛍光発光の強度対波長λ２で測定される蛍光発光の強度の比率の計算にある。
【００８７】
蛍光発光の測定がドナーの放出波長（λ２）で実施される場合、この測定は、平行又は異なる平面、好ましくは励起光の平面と直交する平面において実施され得る。
【００８８】
第２態様において、エネルギーの伝達に起因する偏光の変化を測定するための方法において、ドナー及びアクセプター蛍光色素分子の偏光特性が使用され、エネルギー伝達の測定の選択性を改良する。上記第１方法のように、この方法は測定の選択性を改善することを可能とし、そしてそれ故、検出が望まれるエネルギー伝達現象にさらによく関係するだろう。
【００８９】
この第２態様は、以下のステップ：
（ｉ）波長λ１で、偏光光線により測定媒体を励起し、ここでλ１は上記ドナー蛍光色素分子を励起する波長である；
（ｉｉ）前記励起光の平面と平行な平面において波長λ２で放出される蛍光発光の総強度（Ｉｔ／／）λ２を測定し、ここでλ２は、光がドナー蛍光色素分子から放出される波長である；
（ｉｉｉ）前記励起光の偏光平面と異なる平面において波長λ２で放出される総蛍光発光強度（Ｉｔ⊥）λ２を測定し；
（ｉｖ）前記励起光の平面と平行な平面において波長λ３で放出される蛍光発光の総強度（Ｉｔ／／）λ３を測定し、ここでλ３は、光がアクセプター蛍光色素分子から放出される波長である；
（ｖ）前記励起光の偏光平面と異なる平面において波長λ３で放出される総蛍光発光強度（Ｉｔ⊥）λ３を測定し；
（ｖｉ）以下の式：
【化２】
｛式中、
Ａは、励起光の平面と平行な平面における、ドナーのみにより波長λ２と波長λ３で放出された蛍光発光の比例定数を示し、
Ｂは、励起光の平面と異なる平面における、ドナーのみにより波長λ２と波長λ３で放出された蛍光発光の比例定数を示し、
ｎ＝１又は２であり、ここで、ｎ＝１のとき偏光の測定が生じるといわれ、ｎ＝２のとき異方性が関与し、
Ｇは、平行、及び直交平面において検出の感受性における差分を正すことを可能とする因子であり、この因子は、製造業者により提供されるか、既知の偏光物質の偏光を測定することによって当業者により容易に決定され得るかのいずれかである。特定の態様において、Ｇは０．１〜２であり、好ましくは０．８〜１．２であり、特にＧ＝１である。｝
により、前記ドナー蛍光色素分子とアクセプター蛍光色素分子との間のエネルギーの伝達に起因する偏光Ｐを計算し；そして
（ｖｉｉ）計算されたＰ値と、エネルギー伝達の生じない対照測定媒体で得られた値とを比較する、ここでＰの低減はエネルギー伝達を示す、
を含む。
【００９０】
好ましい態様において、Ａ、及びＢは、以下の方法：
Ａ＝（Ｉｄ／／）λ３／（Ｉｄ／／）λ２
Ｂ＝（Ｉｄ⊥）λ３／（Ｉｄ⊥）λ２
｛式中、（Ｉｄ／／）λ３、（Ｉｄ／／）λ２、（Ｉｄ⊥）λ３、（Ｉｄ⊥）λ２は、上記ドナー蛍光色素分子を含むがアクセプター蛍光色素分子を含まない測定媒体による、励起光の偏光平面と平行又は異なる平面における、波長λ２又はλ３で放出される蛍光発光の強度に対応する｝に従って計算される。
【００９１】
記載された第１方法のように、励起光の偏光平面と異なる平面において実施された測定は、当該励起光の偏光平面と直交する平面において好ましくは実施される。選択された平面が励起光の偏光平面と平行な平面でない限り、他の平面における測定も適し得る。
【００９２】
それ故、本発明の方法は、ドナー化合物とアクセプター化合物間のエネルギー伝達現象の測定の選択性を改良することを可能とする。このことは、当該ドナーと当該アクセプターとのスペクトル選択性が最適条件ではない場合に有利となる。その場合とは、換言すると、以下の：
・当該ドナーと当該アクセプターの発光スペクトルが重なっている場合であり、本発明の方法は５ｎｍ＜λ３−λ２＜１００ｎｍの場合に特に効果的である、ここでλ３−λ２は、波長λ３とλ２との差異を示す；
・アクセプターの直接的非励振励起が、ドナーの励起波長（λ１）で可能である場合、
である。
【００９３】
好ましい態様において、ドナー、及びアクセプター蛍光色素分子は、高い偏光を有し、特に５０ｍＰ超、好ましくは１００ｍＰ超である。本来のその偏光が５０ｍＰ未満であるドナー、及びアクセプター化合物は、担体分子（有機分子、タンパク質、ペプチド、抗体又は下記のような他の分子）に結合又は吸収され得、そしてそれは、蛍光色素分子の視覚的偏光を増大する効果を有し、そして本発明の方法においてそれを使用することを可能とする。
【００９４】
好ましい他の態様において、ドナー、及びアクセプター蛍光色素分子は、ドナーの励起波長λ１での励起後、ドナーの放出波長λ２でアクセプターの放出が検出されないように選択される。
【００９５】
本発明は、例証によりさらに詳細に記載されるだろうが、以下の実施例に限定するものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例１
機能的受容体ＧＡＢＡＢを形成する２つのサブユニットＧＢ１とＧＢ２のＣ末端部分、ＧＢ１のＥ９１６残基の後、及びＧＢ２のＥ７９３残基の後に標識（Ｍｙｃタグ：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を、並びにＧｏタンパク質のαサブユニット中のＶ９３とＥ９４残基の間に標識（ＦＬＡＧタグ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を、ＰＣＲによりに挿入した。
【００９７】
１ｍＦの電気容量のための２６０ボルトでの電気ショックである一実験条件あたり、１０００万個の細胞の比率でのエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄエレクトロポレーター）によりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、様々なコンストラクトを一過性発現させる。次いで、当該細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む完全ＤＭＥＭ培地中で二次培養する。次いで、当該細胞を９６ウェルプレートに１０００００細胞個／ウェルの比率で分配する。
【００９８】
エレクトロポレーションの２４時間後、ＰＢＳ緩衝液でリンスした後、次いで、当該細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（分子プローブ）（アクセプター）で、及びユーロピウムクリプテート（ピリジンビスピリジン ＰＢＰ）（ドナー）で各々標識された抗Ｍｙｃ抗体（最終３ｎＭ）及び抗ＦＬＡＧ抗体（最終１ｎＭ）の混合物とともに（平衡状態に達するために）４℃で少なくとも５時間インキュベートする。当該抗体を含む反応培地は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．３、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）×１００の０．０１％である。この培地は、細胞内媒体と比較して等浸透圧組成物を有する。低いトリトン×１００濃度は、細胞の制御された透過性をもたらし、あらかじめ細胞を固定する必要なしに抗体が細胞内エピトープに達することを可能とする。
【００９９】
得られた結果を添付の図２に示す。
【０１００】
ＧＢ１又はＧＢ２のＣ末端でのＭｙｃタグとＧｏ−ＦＬＡＧタンパク質との間の△６６５シグナル（バックグラウンド・ノイズに対して補正されたアクセプターの６６５ｎｍでの放出）により示されるＦＲＥＴシグナルの測定は、当該２つのタンパク質間の特異的相互作用を示す。ＦＲＥＴシグナルは、蛍光発光リーダー（Ｒｕｂｙｓｔａｒ）に関して定量的に測定され得る。
【０１０１】
比較目的で、ＦＲＥＴシグナルも、実験時点と同じ最終プラスミド量でトランスフェクトされた細胞について測定した。この条件下、モック（ｍｏｃｋ）と呼ばれるプラスミドは、ＧＢ１、ＧＢ２又はＧｏタンパク質のいずれのコード配列も含まない。
【０１０２】
実施例２
ＳＮＡＰタグ、及びＨａｌｏタグ酵素のコード配列を、ＧＢ１又はＧＢ２サブユニットのＣ末端に、及びＧｏタンパク質のＧβγサブユニットにおいて同定されたループに、各々、分子生物学により挿入した。これらのコンストラクトを、実施例１に記載のように一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に発現させた。
【０１０３】
トランスフェクションから２４時間後、各々、アクセプター蛍光色素分子（Ａ）で標識された、及びドナー蛍光色素分子（Ｄ）で標識されたＳＮＡＰタグ、及びＨａｌｏタグ酵素に特異的な物質の５μＭを含む培地と共に、当該細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター内でインキュベートした。洗浄後、当該細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター内において培地内に再度インキュベートし、その後シグナルの検出を実施する。
【０１０４】
ＳＮＡＰタグとＨａｌｏタグの酵素活性の結果は、着目の機能性ＧＰＣＲ、Ｇｏタンパク質のＧβγサブユニットの各々へのドナー及びアクセプター蛍光色素分子の共有結合である。当該シグナルの測定は、蛍光発光リーダー（ＲｕｄｙＳｔａｒ）定量的に実施され、又は落射蛍光顕微鏡を用いて定性的かつ半定量的に実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、リガンドの存在下におけるＧＰＣＲの活性化の機構を図式的に示した図である。
【図２】図２は、ＧＢ１又はＧＢ２のＣ末端でのＭｙｃタグとＧｏ−ＦＬＡＧタンパク質との間の△６６５シグナル（バックグラウンド・ノイズに対して補正されたアクセプターの６６５ｎｍでの放出）により示されるＦＲＥＴシグナルの測定を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つとの相互作用の検出方法であって、以下のステップ：
１）ドナー／アクセプター対のメンバーで標識された受容体を当該ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットと接触させ；
２）前記ドナーと前記アクセプターとの近接効果による伝達を測定する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記接触が、受容体をコードする核酸、及びＧタンパク質のＧα又はＧβサブユニットをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることにより実施され、当該受容体及び当該Ｇα又はＧβサブユニットが、一方はドナー／アクセプター対のメンバーと、もう一方は当該ドナー／アクセプター対の第２メンバーと結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触が、ＧＰＣＲの天然リガンドの存在下、又は潜在的薬剤若しくは試験分子の存在下のいずれかで実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記近接効果による伝達の測定が実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、当該測定が以下のステップ：
１）前記ドナーとアクセプターとの近接効果による伝達が、前記リガンド、前記受容体に対する薬剤、及び前記試験分子の無い条件下で測定され（基礎シグナル）；
２）前記受容体の活性化を誘発するだろうＧＰＣＲに特異的なリガンドの存在下で得られたシグナル（参照シグナル）が、場合により前記基礎シグナルと比較され；
３）薬剤、又は前記受容体の活性を調節することが可能な化学分子の存在下で得られたシグナルが、前記基礎シグナル、及び前記参照シグナルと比較される、
により実施される、上記方法。
【請求項５】
前記ドナー／アクセプター対のメンバーが蛍光色素分子であること、前記近接伝達が蛍光エネルギーの伝達であること、及び前記エネルギー伝達の測定が前記ドナーとアクセプターとの間の伝達から生ずる蛍光シグナル（ＦＲＥＴシグナル）を測定することにより実施されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナー蛍光色素分子、及び前記アクセプター蛍光色素分子が、ローダミン、シアニン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹとして知られる蛍光色素分子、蛍光色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとして知られる化合物、希土類金属キレート、希土類金属クリプテート、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の如き蛍光タンパク質又はその変異体、サンゴから抽出される蛍光タンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンの如きフィコビリタンパク質、特にＸＬ６６５として知られるフィコビリタンパク質から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ドナー蛍光色素分子が、希土類金属複合体である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記希土類金属複合体が、テルビウム又はユウロピウム錯体であることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記希土類金属複合体が、キレート又はクリプテートである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記希土類金属複合体が、ピリジンユニットを有するクリプテートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クリプテートが、ピリジンユニットを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アクセプター蛍光色素分子が、アロフィコシアニン、シアニン、ローダミン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹ、蛍光色素、Ａｌｅｘａｓから選択される、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アクセプター蛍光色素分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体の１つ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＣＥＰ）、サンゴから抽出された蛍光タンパク質である、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＣＲ受容体又は前記Ｇα若しくＧβサブユニットと、前記ドナー蛍光色素分子又は前記アクセプター蛍光色素分子との結合が、共有結合による直接結合又は間接結合である、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記共有結合による結合が、不可逆（自殺）酵素活性を有するタンパク質配列との融合により又はインテインを用いたスプライシングにより実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＰＣＲ受容体、前記Ｇαサブユニット又は前記Ｇβγサブユニットが、ＧＰＣＲに対する細胞外又は細胞内標識、及びＧαサブユニット又はＧβγサブユニットに対する細胞内標識と呼ばれるペプチド配列を融合として含み、かつ、前記間接結合による結合が、前記ＧＰＣＲ受容体、前記Ｇαサブユニット又は前記Ｇβγサブユニットにより運ばれる標識を特異的に認識する抗体により実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＰＣＲをコードする核酸、及び対応するＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸で安定的に又は一過性にトランスフェクトされた細胞の調製品であって、前記ＧＰＣＲ受容体、及び前記Ｇα又は前記Ｇβγサブユニットが、一方はドナー蛍光色素分子、もう一方がアクセプター蛍光色素分子と結合する、前記調製品。
【請求項１８】
前記ドナー蛍光色素分子が、希土類金属複合体である、請求項１７に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項１９】
前記希土類金属複合体が、テルビウム又はユウロピウム錯体である、請求項１８に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２０】
前記希土類金属複合体が、キレート又はクリプテートである、請求項１８又は１９に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２１】
前記希土類金属クリプテートが、ピリジンユニットを有するクリプテートである、請求項２０に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２２】
前記アクセプター蛍光色素分子が、アロフィコシアニン、シアニン、ローダミン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹ、蛍光色素、Ａｌｅｘａｓから選択される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２３】
前記アクセプター蛍光色素分子が、黄色蛍光タンパク質（ＹＥＰ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項２２に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２４】
前記ＧＰＣＲ受容体、又は前記Ｇα若しくは前記Ｇβγサブユニットと、前記ドナー蛍光色素分子又は前記アクセプター蛍光色素分子との結合が、共有結合による直接結合である、請求項２３に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２５】
前記共有結合による結合が融合により実施される、請求項２４に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２６】
前記ＧＰＣＲ受容体が細胞外又は細胞内標識を含み、かつ前記共有結合による結合が前記受容体の細胞外又は細胞内標識を認識する抗体を用いて実施される、請求項２５に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項１】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットの１つとの相互作用の検出方法であって、以下のステップ：
１）ドナー／アクセプター対のメンバーで標識された受容体を当該ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットと接触させ；
２）前記ドナーと前記アクセプターとの近接効果による伝達を測定する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記接触が、受容体をコードする核酸、及びＧタンパク質のＧα又はＧβサブユニットをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることにより実施され、当該受容体及び当該Ｇα又はＧβサブユニットが、一方はドナー／アクセプター対のメンバーと、もう一方は当該ドナー／アクセプター対の第２メンバーと結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触が、ＧＰＣＲの天然リガンドの存在下、又は潜在的薬剤若しくは試験分子の存在下のいずれかで実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記近接効果による伝達の測定が実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、当該測定が以下のステップ：
１）前記ドナーとアクセプターとの近接効果による伝達が、前記リガンド、前記受容体に対する薬剤、及び前記試験分子の無い条件下で測定され（基礎シグナル）；
２）前記受容体の活性化を誘発するだろうＧＰＣＲに特異的なリガンドの存在下で得られたシグナル（参照シグナル）が、場合により前記基礎シグナルと比較され；
３）薬剤、又は前記受容体の活性を調節することが可能な化学分子の存在下で得られたシグナルが、前記基礎シグナル、及び前記参照シグナルと比較される、
により実施される、上記方法。
【請求項５】
前記ドナー／アクセプター対のメンバーが蛍光色素分子であること、前記近接伝達が蛍光エネルギーの伝達であること、及び前記エネルギー伝達の測定が前記ドナーとアクセプターとの間の伝達から生ずる蛍光シグナル（ＦＲＥＴシグナル）を測定することにより実施されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナー蛍光色素分子、及び前記アクセプター蛍光色素分子が、ローダミン、シアニン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹとして知られる蛍光色素分子、蛍光色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとして知られる化合物、希土類金属キレート、希土類金属クリプテート、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の如き蛍光タンパク質又はその変異体、サンゴから抽出される蛍光タンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンの如きフィコビリタンパク質、特にＸＬ６６５として知られるフィコビリタンパク質から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ドナー蛍光色素分子が、希土類金属複合体である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記希土類金属複合体が、テルビウム又はユウロピウム錯体であることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記希土類金属複合体が、キレート又はクリプテートである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記希土類金属複合体が、ピリジンユニットを有するクリプテートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クリプテートが、ピリジンユニットを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アクセプター蛍光色素分子が、アロフィコシアニン、シアニン、ローダミン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹ、蛍光色素、Ａｌｅｘａｓから選択される、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アクセプター蛍光色素分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体の１つ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＣＥＰ）、サンゴから抽出された蛍光タンパク質である、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＣＲ受容体又は前記Ｇα若しくＧβサブユニットと、前記ドナー蛍光色素分子又は前記アクセプター蛍光色素分子との結合が、共有結合による直接結合又は間接結合である、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記共有結合による結合が、不可逆（自殺）酵素活性を有するタンパク質配列との融合により又はインテインを用いたスプライシングにより実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＰＣＲ受容体、前記Ｇαサブユニット又は前記Ｇβγサブユニットが、ＧＰＣＲに対する細胞外又は細胞内標識、及びＧαサブユニット又はＧβγサブユニットに対する細胞内標識と呼ばれるペプチド配列を融合として含み、かつ、前記間接結合による結合が、前記ＧＰＣＲ受容体、前記Ｇαサブユニット又は前記Ｇβγサブユニットにより運ばれる標識を特異的に認識する抗体により実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＰＣＲをコードする核酸、及び対応するＧタンパク質のＧα又はＧβγサブユニットをコードする核酸で安定的に又は一過性にトランスフェクトされた細胞の調製品であって、前記ＧＰＣＲ受容体、及び前記Ｇα又は前記Ｇβγサブユニットが、一方はドナー蛍光色素分子、もう一方がアクセプター蛍光色素分子と結合する、前記調製品。
【請求項１８】
前記ドナー蛍光色素分子が、希土類金属複合体である、請求項１７に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項１９】
前記希土類金属複合体が、テルビウム又はユウロピウム錯体である、請求項１８に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２０】
前記希土類金属複合体が、キレート又はクリプテートである、請求項１８又は１９に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２１】
前記希土類金属クリプテートが、ピリジンユニットを有するクリプテートである、請求項２０に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２２】
前記アクセプター蛍光色素分子が、アロフィコシアニン、シアニン、ローダミン、スクアライン、ＢＯＤＩＰＹ、蛍光色素、Ａｌｅｘａｓから選択される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２３】
前記アクセプター蛍光色素分子が、黄色蛍光タンパク質（ＹＥＰ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項２２に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２４】
前記ＧＰＣＲ受容体、又は前記Ｇα若しくは前記Ｇβγサブユニットと、前記ドナー蛍光色素分子又は前記アクセプター蛍光色素分子との結合が、共有結合による直接結合である、請求項２３に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２５】
前記共有結合による結合が融合により実施される、請求項２４に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【請求項２６】
前記ＧＰＣＲ受容体が細胞外又は細胞内標識を含み、かつ前記共有結合による結合が前記受容体の細胞外又は細胞内標識を認識する抗体を用いて実施される、請求項２５に記載のトランスフェクトされた細胞の調製品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５３４９１７（Ｐ２００８−５３４９１７Ａ）
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４６２０（Ｐ２００７−５５４６２０）
【出願日】平成１８年２月１３日（２００６．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０５０１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５０４０
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０７１７９７２６）シ ビオ アンテルナショナル (9)
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１３日（２００６．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０５０１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５０４０
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０７１７９７２６）シ ビオ アンテルナショナル (9)
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
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