ＧＤＦ−８モジュレート物質の検出
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、ＧＤＦ−８阻害物質の存在を検出するための方法を含む、ヒトを含む動物においてＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が、本出願で提供される。特に、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在および／または量を評価する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月２３日に出願された米国仮出願番号第60/664,400号の利益を主張し、その内容は出典明示により完全に本明細書の一部とされる。
本発明はＧＤＦ−８モジュレート物質の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオスタチンとしても知られる、増殖・分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、骨格筋量の負の調節因子である分泌蛋白質である。ＧＤＦ−８の阻害剤は、筋成長を増進するため、骨格筋減少症、悪液質および筋ジストロフィーを含む様々な状態の処置に潜在的な利益をもたらす。
【０００３】
ＧＤＦ−８は、構造的に関係する成長因子であるトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの一員である。このスーパーファミリーのメンバーは、生理学的に重要な成長−調節および形態形成の特徴を有する（Kingsleyら、Genes Dev. 8:133-146 (1994)；Hoodlessら、Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-272 (1998))。同様に、これらは共通の構造構成を共有しており、分泌のための短ペプチドシグナルおよび非常に保存された蛋白質分解の開裂部位により生物活性のあるカルボキシ−末端部分から分離されるアミノ−末端部分を含む。
【０００４】
ヒトＧＤＦ−８は、アミノ−末端プロペプチド部分とカルボキシ−末端の成熟部分を含む、３７５個のアミノ酸からなる前駆蛋白質として合成される。プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８からＡｒｇ−２６６で切り離される。成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、ジスルフィド結合されたホモ二量体として活性を有する。蛋白質分解過程に続いて、２つのＧＤＦ−８プロペプチドは、ＧＤＦ−８の成熟ドメイン二量体と非共有結合で複合体形成し、潜在的に不活性な状態でＧＤＦ−８を維持すると考えられる（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:9306-9311 (2001）；Thiesら、Growth Factors 18:251-259 (2001)）。他の蛋白質もまた、成熟ＧＤＦ−８と結合し、その生物活性を阻害することが知られている。このような阻害性の蛋白質には、フォリスタチンおよびＧＡＳＰ−１を含むフォリスタチン関連蛋白質が含まれる（Gamerら、Dev. Biol. 208:222-232 (1999)）；米国特許公報第2003-0180306-A1号；米国特許公報第2003-0162714-A1号）。
【０００５】
様々な種から推定されるアミノ酸配列のアライメントは、ＧＤＦ−８が進化を通じて非常に保存されていることを示す（McPherronら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461 (1997)）。実際に、ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリのＧＤＦ−８配列は、そのカルボキシ−末端領域で１００％一致し、また、ヒヒ、ウシ、およびヒツジにおいては、この領域はわずかに３アミノ酸異なるのみである。ゼブラフィッシュのＧＤＦ−８は、より以前から分岐しているが、そのカルボキシ−末端領域はヒト配列と８８％も一致する。
【０００６】
ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子であるため、ＧＤＦ−８の生物活性を調節する因子を包含する治療方法を究明し開発することは、大きな関心事である。例えば、ＧＤＦ−８遺伝子に変異を有するマウスおよび畜牛は、体重と筋量に顕著な増加が見られる（McPherronら、Nature 387:83-90 (1997）；Zhuら、FEBS Letters 474:71-75 (2000）；Grobetら、Nature Genet. 17:71-74 (1997)）。マウスモノクローナルＧＤＦ−８モジュレート抗体の投与は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のｍｄｘマウスモデルにおいて、筋肉変性および血清中クレアチンキナーゼ濃度を低下させる一方で、ｍｄｘマウスの体重、筋量、筋サイズおよび絶対的な筋力を増大させる（Bodanovichら、Nature 420:418-421 (2002)）。さらに、ＧＤＦ−８の薬理学的阻害は、生体のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、筋サイズおよび握力の増大をもたらす（Whittemoreら、BBRC 300:965-971 (2003)）。
【０００７】
多くの重大な生物過程を調節するその重要な機能により、ＧＤＦ−８は、多くの障害の治療介入の望ましい標的である。ＧＤＦ−８活性を阻害する治療物質は、筋組織の増加が治療上有利となるであろうヒトまたは動物の障害を処置するために用いることがでるであろうし、ＧＤＦ−８活性をモジュレートする物質は、脂肪組織、グルコース恒常性または骨低下と関連する障害を処置するのに用いることができるであろう。さらに、正常な個体に投与されたＧＤＦ−８阻害剤は、例えば、その個体の筋量を増加させるであろう。
【０００８】
１つのＧＤＦ−８阻害物質は、完全なヒト抗体のＭＹＯ−０２９であり、これは、米国特許公報第2004-0142382号にさらに詳しく記載されている。ＭＹＯ−０２９は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８を結合して、試験管内（インビトロ）および生体内（インビボ）でＧＤＦ−８活性を阻害することができ、そして、骨格筋量の負の調節因子と関係するＧＤＦ−８活性を阻害することができる。ＭＹＯ−０２９をマウスに投与した場合、増加する筋量を促進する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＧＤＦ−８モジュレート物質は、種々の治療への応用に有用であり、かくして、個体の生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出および／または定量する方法が望まれる。ヒト血清中の治療上のＧＤＦ−８モジュレート物質レベルの測定は、治療上重要である。このような方法は、例えば、治療の進行を追跡すること、試薬の薬物動力学もしくは生物学的利用能を評価すること、個体の生体試料中の試薬のレベルを測定すること、および／またはＧＤＦ−８活性をモジュレートする試薬の投与を検出することを可能にする。
【００１０】
さらに、治療に応用するために開発されたＧＤＦ−８活性の阻害剤が筋量を増加させるために、運動性の向上を目的とした乱用の標的となり得る。治療以外の目的でのＧＤＦ−８モジュレート物質の違法な使用の危険性は、この薬物が治療として利用できるようになるほど高まる。個体の運動能力を向上させるために、または家畜動物の成長速度もしくは食材としての特徴を向上させるために投与される薬物は、多くの場合、規制および／または禁止される。従って、適法な医薬適用性のあるＧＤＦ−８モジュレート物質の乱用を検出する能力は、ますます重要になる。従って、運動による、または食材としての動物におけるＧＤＦ−８阻害物質の使用を検出するための方法、例えば、個体におけるＧＤＦ−８モジュレート物質の使用をモニタする方法を開発することが望まれる。
【００１１】
ＧＤＦ−８モジュレート物質、ＭＹＯ−０２９の事前の薬物動力学研究には、ＭＹＯ−０２９抗体に放射性同位体、１２５Ｉを直接標識化することが含まれる。しかしながら、直接検出は、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与される個体に潜在的に危険性もしくは毒性のある物質を導入する可能性があり得るので、扱いにくく、また不都合である（米国特許公報第2004/0142382-A1号）。生体試料中でＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する改良方法が必要である。
【００１２】
従って、ＧＤＦ−８モジュレート物質の治療をモニタし、もしくは評価し、または乱用を検出するため、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出するアッセイおよび方法、並びに、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質をモニタおよび／または定量する方法を開発することは重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性をモジュレートすることができる、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法を、本明細書に記載する。具体的には、生体試料中のＧＤＦ−８阻害物質を検出するための方法を提供する。これらの方法は、複雑な生体試料、例えば、血清、血液、血漿または尿などにおける、低レベルのＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する。本方法は、種々のＧＤＦ−８物質を検出するのに用いることができ、例えば、無症候性の、症候性のまたは健康な個体に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１つの実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は：（ａ）試験されるべき個体からの生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；（ｂ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および（ｃ）生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、試験管内のアッセイは、（ａ）成熟したＧＤＦ−８蛋白質二量体であるＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体試料を、反応容器に加える工程；（ｃ）検出試薬を加える工程；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む。１つの実施形態において、ＧＤＦ−８蛋白質は、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して表面と接触する。さらなる実施形態において、ＧＤＦ−８はリジン残基でビオチン化され、そのビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約５：１より小さく、および／またはビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から約４：１の間にある。本方法の他の実施形態において、ＧＤＦ−８蛋白質を加える前に、アビジンまたはストレプトアビジンが、反応容器の表面に吸着される。
【００１６】
さらなる実施形態において、試験管内アッセイは、（ａ）可溶性のＧＤＦ−８受容体を、反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体試料を、反応容器に添加する工程；（ｃ）標識化ＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器に加える工程；および（ｄ）生体試料の存在下と不在下の表面と会合した標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量を検出し、生体試料の存在下での標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量における減少により、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む。１つの実施形態において、本方法は、反応容器に試料を加える前に、標識化ＧＤＦ−８蛋白質と共に生体試料をインキュベートする工程をさらに含む。
【００１７】
さらなる付加的な実施形態において、本方法は、（ａ）ＧＤＦ−８−応答調節因子およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞を、反応容器に供する工程；（ｂ）生体試料を反応容器に加える工程；および（ｃ）生体試料の存在下および不在下で、細胞内でレポーター遺伝子の発現を検出し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む、細胞に基づく試験管内レポーター遺伝子アッセイを包含する。
【００１８】
ある実施形態において、本方法は、個体からの生体試料によるＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、それぞれが既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより定量して、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量することさらに含む。他の好ましい実施形態において、生体試料は、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの試料を含む。他の実施形態において、生体試料は、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液、または粘液から選択される。
【００１９】
本明細書で提供される方法は、例えば：ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体；ＧＤＦ−８受容体；ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質；フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質；フォリスタチン蛋白質；ＧＡＳＰ−１蛋白質；ＧＤＦ−８蛋白質；ＧＤＦ−８プロペプチド；非−蛋白質阻害物質（proteinacious inhibitor）；または小分子から選択されるＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いることができる。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８阻害物質である。他の実施形態において、該物質は、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する抗体である。１つの好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８と特異的に結合するヒト中和抗体、ＭＹＯ−０２９である。
【００２０】
さらなる実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。本方法の好ましい実施形態において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して表面と接触する。さらなる実施形態において、ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約５：１より小さいか、またはビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から約４：１の間である。
【００２１】
ＧＤＦ−８モジュレート物質、例えばＧＤＦ−８阻害剤は、本明細書で提示される方法により検出することができ、それらはまた、本発明の方法に用いることもできる。従って、幾つかの実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８阻害物質である。ある実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体または標識化ＧＤＦ−８蛋白質から選択される。さらなる実施形態において、検出試薬は、ヒトの免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合する抗体である。
【００２２】
他の実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質から選択される捕捉物質を、反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。
【００２３】
さらに、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）ＧＤＦ−８受容体を、少なくとも第一および第二の反応容器と接触させること；（ｂ）生体試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、第一の反応容器に加えること；（ｃ）対照試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、第二の反応容器に加えること；（ｄ）検出標識を、第一および第二の反応容器に加えること；および（ｅ）第一の反応容器中の検出可能な標識信号を第二の反応容器中の信号と比較し、それにより生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。
【００２４】
別の実施形態において、ヒト生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供される。この実施形態は、（ａ）生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；（ｂ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および（ｃ）候補体からの試験生体試料の存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、（ａ）５：１より小さいビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する平均の比を有する、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８蛋白質の二量体を、反応容器の表面に接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）ヒト免疫グロブリンと特異的に結合する標識化抗体を、反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＭＹＯ−０２９／ビオチン化ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＭＹＯ−０２９を検出することを含む、生体試料中のＭＹＯ−０２９を検出するための方法が記載される。
【００２６】
本発明のさらなる対象および利点を、以下の詳細な説明部分に記載し、それにより幾分、本発明は明確になるであろう、または本発明の実地により理解することがでよう。本発明の対象および利点は、添付する請求の範囲に特に指摘される要素および組み合わせにより、理解され、達成することができよう。
【００２７】
上記の要約おｙび以下の詳しい記載は、特許請求する本発明を制限するものではない。
【００２８】
（配列の簡単な説明）
ＧＤＦ−８、ＭＹＯ−０２９および関連するｓｃＦｖ断片、ＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）のＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列を、配列表に記載し、表１に一覧として列挙する。
【表１】
【００２９】
（詳しい記載）
本発明は、ヒトを含む動物においてＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法に関し、この方法は、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性をモジュレーションすることによるいくつかの利益をもたらす。外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、ＧＤＦ−８阻害物質の存在を検出する方法が、本明細書で提供される。特に、ＧＤＦ−８阻害物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの生体試料中のＧＤＦ−８阻害物質の存在および／または量を評価する方法が提供される。
【００３０】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が個体に投与された場合、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、生体試料中のその物質の存在および／または量を決定するのに有用である。この方法はまた、例えば、治療計画を評価するのに、試薬の投薬量を調整するのに、または試薬の薬物動力学または生物学的利用能を評価することを可能にし得る。
【００３１】
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳しい説明を通じて記載する。
【００３２】
用語「ＧＤＦ−８」は、特異的な成長・分化因子−８を意味する。この用語は、全長で未処理のＧＤＦ−８である前駆体型、並びに翻訳後の切断により生じる成熟型およびプロペプチド型を示す。「不活性」と特に記載しない限り、「ＧＤＦ−８蛋白質」は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８の生物活性を保持する。この用語はまた、本明細書で論じられるように、改変された配列を含む、成熟ＧＤＦ−８と関係する少なくとも１つの生物活性を保持するＧＤＦ−８の断片および変異型のすべてを意味する。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は、配列番号：１で示され、その前駆体の全長ヒトＧＤＦ−８配列は、配列番号：２で示される。本発明は、限定されるものではないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、七面鳥、ヒヒ、およびサカナを含む全ての脊椎動物種のＧＤＦ−８に関する（配列情報に関しては、例えば、McPherronら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461 (1997)を参照のこと）。
【００３３】
用語「成熟ＧＤＦ−８」は、ＧＤＦ−８前駆蛋白質のカルボキシ−末端部分を意味する。条件に応じて、成熟ＧＤＦ−８は、例えば、単量体、ホモ二量体および／またはＧＤＦ−８の潜在的な複合体として存在し得る。生物学的な活性型の成熟ＧＤＦ−８は、「活性ＧＤＦ−８」とも称される。この用語はまた、本明細書で論じられるように、成熟ＧＤＦ−８と関係する少なくとも１つの生物活性を保持するＧＤＦ−８の断片および改変された配列を含む変異型のすべてを意味する。
【００３４】
用語「ＧＤＦ−８プロペプチド」は、ＧＤＦ−８前駆蛋白質のアミノ−末端部分を意味する。このＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８上のプロペプチド結合ドメインと結合し得る。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体と複合体を形成する。２つのＧＤＦ−８プロペプチドが、ホモ二量体の成熟ＧＤＦ−８の２分子と会合し、潜在的な複合体と称される、不活性な四量体の複合体を形成すると考えられる。この潜在的な複合体は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８プロペプチドに換えて、または加えて他のＧＤＦ阻害物質を含んでいてもよい。
【００３５】
用語「ＧＤＦ−８活性」は、活性ＧＤＦ−８蛋白質と関係する生理学上の成長調節活性または形態形成活性を意味する。例えば、活性ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子である。活性ＧＤＦ−８はまた、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートし、筋芽細胞増殖を刺激し、および前脂肪細胞の脂肪細胞への分化をモジュレートすることもできる。「ＧＤＦ−８活性」には、「ＧＤＦ−８結合活性」が含まる。例えば、成熟ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−８のプロペプチド部分と、ＡｃｔＲＩＩＢと、ＧＤＦ−８受容体と、アクチビンと、フォリスタチンと、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質と、ＧＡＳＰ−１と、および他の蛋白質と特異的に結合する。ＧＤＦ−８阻害物質、例えば抗体もしくはその一部は、１つまたはそれ以上のその結合活性を低下させることができる。生体内および試験管内でＧＤＦ−８活性を測定するための例示的な手順を以下に記載する。
【００３６】
用語「ＧＤＦ−８モジュレート物質」には、ＧＤＦ−８または医薬上許容されるその誘導体の活性、発現、プロセッシングまたは分泌をモジュレートし得るすべての物質が含まれる。１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を増大させる物質、および１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を低下させる物質は、この用語に包含される。用語「ＧＤＦ−８阻害物質」には、ＧＤＦ−８または医薬上許容されるその誘導体の活性、発現、プロセッシングまたは分泌に影響を及ぼすことができるすべての物質が含まれる。ＧＤＦ−８阻害物質は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性と関係する活性を低下させる。ある実施形態において、ＧＤＦ−８阻害物質は、限定されるものではないが、受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質（例えば、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＧＡＳＰ−１、ＧＡＳＰ−２）またはＧＤＦ−８プロペプチドおよびその変異体や誘導体などのＧＤＦ−８蛋白質を含む、１つまたはそれ以上のその生理学的な結合パートナーに対するＧＤＦ−８の結合に影響を及ぼし得る。そのようなＧＤＦ−８阻害物質には、例えば、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、ＪＡ−１６ならびにその断片および誘導体を含む）、ＧＤＦ−８受容体と特異的に結合する抗体、モジュレートされた可溶性の受容体（受容体融合蛋白質、例えばＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合体を含む）、またはＧＤＦ−８と特異的に結合する他の蛋白質（例えば、ＧＤＦ−８プロペプチド、ＧＤＦ−８プロペプチドの変異体および誘導体、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質、およびこれらの蛋白質のＦｃ融合体）、ＧＤＦ−８受容体と結合する蛋白質およびこれらの蛋白質のＦｃ融合体、ならびに模倣体が含まれる。非蛋白質性阻害物質（例えば、核酸）もまた、用語ＧＤＦ−８阻害物質に包含される。ＧＤＦ−８阻害物質には、ＧＤＦ−８を特異的に阻害する、蛋白質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、リボザイム、抗−センスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ）および他の小分子が含まれる。そのような阻害物質は、ＧＤＦ−８の生物活性を「阻害」、「低下」または「中和」すると記載され、より詳しくは以下に記載される。
【００３７】
ＧＤＦ−８阻害物質は、少なくとも１つのＧＤＦ−８生物活性、例えば活性ＧＤＦ−８蛋白質に関係する生理学的な、成長調節活性または形態形成活性を「阻害」、「中和」または「低下」させるであろう。例えば、ＧＤＦ−８は、骨格筋成長の負の調節因子である。ＧＤＦ−８阻害物質は、筋量を増加させ、筋力を増大させ、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）のレベルをモジュレートし、筋芽細胞の増殖を刺激し、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化をモジュレートし、脂肪の蓄積を減少させ、血清トリグリセリドレベルを低下させ、血清コレステロールレベルを低下させ、グルコース代謝をモジュレートし、および／または高血糖を減少させることができる。
【００３８】
用語「阻害する」、「阻害」およびその同語源語は、ＧＤＦ−８阻害物質が不在の場合のＧＤＦ−８活性に比べて、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性がＧＤＦ−８阻害物質により低下されることを示す。この活性の低下は、好ましくは少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。ある実施形態において、ＧＤＦ−８の活性は、ここで開示される阻害物質の１つまたはそれ以上から影響を受けて、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％または８８％、より好ましくは、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％から１００％低下される。用語「中和する」、「中和」およびその同語源語は、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％までの１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を低下させることを意味する。ＧＤＦ−８活性の阻害は、例えば、Thiesら、Growth Factors 18:251-259 (2001)において記載されるように、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）または以下で示されるＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイにおいて測定することができる。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原結合部位を有するすべてのポリペプチド、例えば、免疫グロブリンもしくはその断片であり、供給源、生物種、精製方法および特徴に関わらず抗原結合部位を有するすべてのポリペプチドを包含する。非限定的な例として、用語「抗体」は、合成抗体、ヒト、オラウータン、サル、霊長類、マウス、ラット、ヤギ、イヌ、ヒツジおよびニワトリの抗体を含む。この用語には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体、非特異抗体、変異抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、およびＣＤＲグラフト抗体が含まれる。本発明の目的に関し、「抗体」はまた、特に記載しない限り（例えば、「完全な」という語を示した場合）、抗体断片が含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂおよび抗原結合機能を保持する他の抗体断片が含まれる。典型的には、そのような断片は、抗原結合ドメインを含む。当業者には認められるように、そのような分子、例えば「ヒト」抗体はいずれも、その免疫原性を低下させ、その親和力を高め、その特異性を改変し、または他の目的のため作り出すことができる（例えば、生殖細胞系）。
【００４０】
抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature 256:495-499 (1975)）、組み換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、または抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ技術（Clacksonら、Nature 352:624-628 (1991）；Marksら、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)）を介して作製することができる。他の様々な抗体産生技術については、Antibody Engineering（Borrebaeckら、Oxford University Press 1995)およびAntibodies：A Laboratory Manual（Harlowら、編、Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）を参照のこと。
【００４１】
用語「抗原−結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合する領域または抗原の一部もしくは全部に補完的な領域を含む、抗体分子の一部分を意味する。抗原が大きい場合、抗体は、その抗原の特定の部分とのみ結合することができる。「エピトープ」または「抗原決定基」は抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用に関係する抗原分子の一部である。抗原結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体の可変領域により提供され得る（例えば、ＶＨドメインを含むＦｄ抗体断片）。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（米国特許第5,565,332号明細書）。
【００４２】
用語「特異的な結合」、「特異的に結合する」またはその類似語は、２つまたはそれ以上の分子が、生理学的な条件もしくはアッセイ条件下で測定でき、そして選択的な複合体を形成することを意味する。抗体または他の阻害物質は、結合が実質的に阻害されず、一方で非特異的な結合が阻害されるような適当な選択条件下にある場合、ある蛋白質に「特異的に結合する」ことを示す。特異的な結合は、比較的高い親和力により特徴付けられ、化合物または蛋白質に選択的であり得る。非特異的な結合は、通常、低い親和力である。典型的に、結合は、その親和性定数Ｋａが少なくとも約１０６Ｍ−１、または好ましくは少なくとも約１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１である場合、特異的と考えられる。特定の方法は、特異的な結合のために高親和力を要求するが、他の方法、例えば表面プラズモン共鳴アッセイは、安定な複合体とならない、低親和力相互作用も検出することができる。必要に応じて、非特異的な結合は、結合条件を変えることにより、特異的な結合に実質的に影響を及ぼすことなく低下させることができる。そのよな条件は、当業者に周知であり、当業者は慣用技術を用い、適当な条件を選び出すことができる。通常、その条件は、結合パートナーの濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、無関係の分子（例えば、浄化剤、界面活性剤、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して定められる。例示的な結合条件を以下に記載する。
【００４３】
用語「単離された」は、その天然の環境から実質的に切り離された分子を意味する。例えば、単離された蛋白質は、細胞物質または誘導された細胞もしくは組織供給源に由来する他の蛋白質を実質的に含まない。この用語は、単離された蛋白質が、治療組成物として投与されるのに十分に純粋、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは９０−９５％純粋；そして、最も好ましくは，少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋な調製物を意味する。
【００４４】
用語「個体」は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類または魚類を含む、すべての脊椎動物を意味する。用語、哺乳類には、ヒト、ヒト以外の霊長類、サル、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシなどを含む、雄もしくは雌のように分類されるすべての動物が含まれる。哺乳類以外の動物の例としては、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、サカナ、サケ、ナマズ、バス、カエルおよびマスが挙げられる。個体は、ヒト、運動選手または家畜化動物、牧畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、レース用の動物もしくはペット動物から選択されてよい。
【００４５】
用語「有効な用量」または「有効量」は、ＧＤＦ−８に関係する障害に罹患した個体を含む個体の臨床症状を緩和するのに十分な、または所望の生物学的な結果（例えば、筋量、筋力および／または骨密度の増大）を達成するのに十分な投薬量または投薬レベルを意味する。そのような量は、例えば、骨格筋量および骨密度の負の調節に関係するＧＤＦ−８の活性を低下させるのに十分であるべきである。治療結果および臨床症状には、体脂肪の減少、筋量の増加、改善された心臓血管指標、または改善されたグルコース代謝調節が含まれ得る。ＧＤＦ−８阻害物質は、例えば、筋量を増加させ、筋力を増大させ、体重を増加させ、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）のレベルをモジュレートし、および／または筋芽細胞の増殖を刺激することができる。好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８に関係する障害の臨床所見を軽減する。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化に影響を及ぼし、脂肪の蓄積もしくは体脂肪含有量を減少させ、血清トリグリセリドレベルを低下させ、血清コレステロールレベルを低下させ、グルコース代謝をモジュレートし、骨密度をモジュレートし、個体における筋肉の脂肪に対する割合を変化させ、および／または高血糖を低下させることができる。ＧＤＦ−８阻害物質はまた、筋量を増加させるために、運動能力を向上させるために、または筋肉の成長を含め、成長を増進もしくは加速させるために、個体に投与することができる。その有効な量は、次の章で記載されるように決定され得る。ＧＤＦ−８阻害物質の「治療上有効な量」は、個体に単回または複数回の用量投与で、障害または再発性障害を処置する、予防する、治癒する、遅延する、その重篤度を軽減する、または少なくとも１つの症状を改善する、あるいは、その処置を行わない場合に期待される対象の生存を越えて、その生存を延長するのに有効な量を意味する。
【００４６】
「ＧＤＦ−８に関係する障害」は、対象がＧＤＦ−８モジュレート、例えばＧＤＦ−８阻害物質の投与により利益を得るであろう障害または状態である。ＧＤＦ−８に関係する障害には、内科的疾患、例えば、筋肉に関係する障害、神経筋障害、脂肪組織障害、代謝性障害または骨に関係する障害が含まれる。
【００４７】
ＧＤＦ−８阻害物質の投与は、その阻害物質が症状のもしくは障害の改善および／または予防を含み、障害を処置するために個体に投与される場合に、「治療的」であり得る。治療上の使用には、内科的疾患を有する個体、または最終的に障害に罹患し得る個体に対して、障害または再発性障害を処置し、予防し、治癒し、遅延し、その重篤度を軽減し、または少なくとも１つの症状を改善する、あるいは、その処置を行わない場合に期待される対象の生存を越えて、その生存を延長するために、ＧＤＦ−８阻害物質を投与することを含む。ＧＤＦ−８阻害物質はまた、筋量を増加させ、運動能力を改善させ、または筋成長を含む成長を増進もしくは促進するために、個体に投与できる。ＧＤＦ−８に関係する内科的疾患の存在または危険性がない場合に、個体にＧＤＦ−８阻害物質を投与することに関し、前記能力を向上させる方法は、本明細書で定義されるように、一般に「治療ではない」と考えられる。
【００４８】
「生体試料」は、個体から集められた生物学的物質、例えば、細胞、組織、器官、体液および他の臨床材料および試料である。例示的な生体試料には、血清、血液および血漿が挙げられる。
【００４９】
用語「反応容器」は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と抗体との間の結合が生じ、検出され得る容器を意味する。「表面」は、いずれかの固体（例えば、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、硫酸デキストラン、または処理されたポリプロピレン）の外側であり、そこに、ＧＤＦ−８モジュレート物質が直接的にもしくは間接的に「接触」、「固定化」または「被覆」され得る。「反応容器の表面」は、その容器自体の一部であってもよいし、または該表面は反応容器中にあってもよい。例えばポリスチレンなどの表面は、化学処理もしくは放射線処理して、その表面の結合特性を変化させることができる。低結合、媒体結合、高結合、アミン化、および活性化表面は、この用語に含まれる。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、その表面に物理的な吸着もしくは共有結合により、表面を直接被覆させることができるし、あるいは、例えば、表面に直接被覆された基質もしくはその一部との相互作用を通じて間接的に被覆させてもよい。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「捕捉物質」は、免疫学的検定に用いられ、標的蛋白質、例えばＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８自体と特異的に結合する蛋白質などの分子を意味する。本方法に適切な捕捉剤は、ＧＤＦ−８モジュレート物質および／またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する。例えば、捕捉物質は、成熟ＧＤＦ−８二量体を含むＧＤＦ−８蛋白質、またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質であってよい。同様に、捕捉物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する蛋白質であってよい。
【００５１】
「検出試薬」は、ＧＤＦ−８モジュレート物質または複合体の検出を可能にする蛋白質または小分子である。好ましい実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する。検出試薬は、検出可能な標識を含んでいてもよい。検出試薬はまた、それ自体が検出可能な標識を含む物質により検出される。本明細書で提供される方法により検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、他のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法に用いることもできる。
【００５２】
用語「標識」は、その化学的性質により、分子の相互作用の検出を可能にする検出できる識別可能な信号を発する分子を意味する。抗体を含む蛋白質が、直接的に（例えば、発色団、蛍光団、または放射性同位体の手段により）または間接的に（例えば、発色、ルミネセンスまたは蛍光発光を生じさせる反応を触媒する手段により）検出できる分子と共有結合によりもしくは非共有結合により結合されている場合、該蛋白質は検出可能な標識を有する。
【００５３】
１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性をモジュレートすることができる、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法が、本明細書に記載される。具体的には、生体試料中のGDF-８阻害物質を検出する方法が提供される。ＧＤＦ−８に関係する障害に罹患しているまたは発症する危険性のある個体の生体試料中の、またはそれを潜在的に乱用している健康な個体の試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の検出を包含する方法を提供される。本明細書で提供される技術はまた、例えば、ＧＤＦ−８に関係する障害を診断するため、特定の内因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出すること、または定量することもできる。
【００５４】
これらの方法は、特に、複雑な生体試料、例えば血清、血液または血漿中の低レベルのＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することに適している。本方法は、種々のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いてもよいし、また例えば非−症候性の、症候性の、または健康な個体に用いてもよい。
【００５５】
外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質
本明細書で提供されるＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８または医薬上許容されるその誘導体の活性、発現、プロセッシングまたは分泌をモジュレートすることができる。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を増大もしくは低下させることができる。１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を低下させる物質は、ＧＤＦ−８阻害物質である。ＧＤＦ−８阻害物質が、筋量を増加させるために、および筋肉に関連する障害もしくは状態を処置するために投与されるが、ＧＤＦ−８阻害物質を含むＧＤＦ−８モジュレーターは、例えば、脂肪細胞障害、グルコース代謝に関連する障害、または骨疾患を処置するのに用いることができる。天然の成熟ＧＤＦ−８二量体が、本明細書で記載されるように、ＧＤＦ−８モジュレート物質の定義には含まれない。しかしながら、天然ＧＤＦ−８の改変型、およびＧＤＦ−８活性をモジュレートするＧＤＦ−８の変異型およびモジュレート型は、用語ＧＤＦ−８モジュレート物質の意味に含まれる。この応用例には、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）の検出は含まれない。
【００５６】
ＧＤＦ−８モジュレート物質の生物学的誘導体、例えば、物質を個体に投与した後の生体試料中に存在する物質のモディファイ型は、この用語に包含される。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の１つまたはそれ以上の生物学的な誘導体、代謝産物、または代謝生成物の存在を評価することにより、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出する方法を含む。
【００５７】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、生体試料または生物学的物質を得る生体の外部から導入され、産生される場合、ＧＤＦ−８モジュレート物質は「外因性」である。外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、個体に該物質を投与することにより、個体に直接導入してもよいし、または生体に間接的に導入してもよい。外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えばそれが前駆体型で投与された場合、またはそれが動物もしくはその祖先に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡから、その生体内で合成された蛋白質である場合、間接的に生体に導入される。
【００５８】
外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、本明細書で開示される方法および当分野で既知の方法に従って、内因性の因子に存在しないＧＤＦ−８物質の特徴を巧みに利用する方法により、内因性のＧＤＦ−８モジュレート物質と区別できる。例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、その構造、親和力または活性により同定することができる。例えば、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、ＪＡ−１６およびＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する他のモノクローナル抗体は、特定のアミノ酸配列を含み、ＧＤＦ−８の区別可能なエピトープを１つまたはそれ以上の認識する。これらの物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質により特異的に結合される標識化ペプチドエピトープ、例えばビオチン化ペプチドの添加により同定することができる。例えば、ＭＹＯ−０２９に対するペプチドエピトープは、米国特許公報第2004/0142382 A1号に開示されており、本明細書で提供される方法により検出される外因性のＭＹＯ−０２９物質を同定するのに用いることができる。同様に、ＪＡ−１６のペプチドエピトープは、米国特許公報第2003/0138422 A1号に記載されている。抗−イディオタイプ抗体は、例えば、外因性の抗体物質を区別するために用いることもできる。また、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質に特異的な抗体は、周知の免疫感作またはファージディスプレイ技術により作製することができる。ＭＹＯ−０２９特異抗体は、本明細書で提供され、例えば実施例５において、これを作製する方法が示される。
【００５９】
さらに、外因で投与される物質は、蛍光分析（例えば、米国特許第6,680,207号明細書を参照のこと）を用いることで、その天然の対応物質から区別できる。加えて、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、米国特許第6,573,055号明細書に記載の方法により、例えば、元の細胞型に基づく糖付加パターンの違いを認識して、内因性の因子から区別できる。組み換え技術により産生される生物学的産物、例えば、抗体治療蛋白質（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２またはＪＡ−１６を含む）または他の糖付加蛋白質は、蛋白質が産生される細胞系または培養条件に応じて、炭化水素側鎖、糖鎖構造または糖ペプチドを含むであろう。また、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の際立った特徴の検出を可能にするモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ヌクレオチドまたは他の物質は、外因性の物質を同定するのに用い得る。
【００６０】
ＧＤＦ−８モジュレート物質は、有効量の試薬の投与を含む試薬の投与後に、本発明の方法により検出される。試薬は、疾病症状の重篤度および進行に応じて、約２．５ｍｇ／ｋｇを含み、約５０ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されてよく、２００ｍｇ／ｋｇであってもよい。医師は、ＧＤＦ−８蛋白質の活性を低下させ、所望の生物学的結果を達成するのに、例えば骨格筋量を増加させるのに、力を増大させるのに、またはＧＤＦ−８に関連する疾病の１つまたはそれ以上の症状を軽減させるのに十分な投薬量を選択しよう。一般に、治療上の有効量は、対象の年齢、体重、身体状態および性別、ならびに対象の病状の重篤度に応じて変更し得る。投薬量は、医師により決定されるであろうし、また細胞培養もしくは実験動物の標準的な医薬手順を用いた毒性分析および治療効果分析（例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、治療指標）により決定されてもよく、処置の観察効果を適切なものとするため、必要に応じて調整され得る。適当な有効用量は、次の例示的な範囲：約５０ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇおよび約５００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇから、処置する臨床医により選択される。単回投与を用いてもよいし、または投薬は、連続的、周期的または断続的であってよい。投薬は、例えば、毎日、週二回、毎週、隔週、毎月または隔月の間隔で与えられてよい。検出されるべきＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば局所、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、膣内、皮下または経皮手段を介して投与される。
【００６１】
種々のＧＤＦ−８モジュレート物質、例えばＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する本発明の方法に用いることができるため、既知のＧＤＦ−８阻害物質は、特許請求する方法の記載の後に、さらに詳しく記載される。さらに、当業者には認められるように、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いられる検出試薬は、その試薬の構造によって変更される。従って、ＧＤＦ−８阻害物質を含む、既知のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するためのさらなる方法が提供され、また、その詳しい記載から明らかになろう。
【００６２】
本発明は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出するための方法、より具体的には、個体の生体試料中のＧＤＦ−８阻害物質を含むＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量する方法に関する。本方法は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた治療の経過を評価することに、試薬の薬物動力学または生物学的利用能を評価することに、個体の生体試料中の試薬レベルを測定することに、および／またはＧＤＦ−８活性をモジュレートする試薬の個体への投与を検出することに特に適している。１つの実施形態において、本方法は、生体試料中のＭＹＯ−０２９、ＧＤＦ−８と特異的に結合する中和抗体の存在を検出する。
【００６３】
候補体の認定
ＧＤＦ−８に関係する障害に関して、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた処置を受けている個体は、その個体の生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために本明細書中で提供される方法の候補体である。さらに、ＧＤＦ−８に関係する障害に罹患した個体、またはＧＤＦ−８に関係する障害または筋肉関連障害を発症する危険性のある個体は、本明細書で提供される方法の候補体であり得る。
【００６４】
ある実施形態において、例えば有効量でＧＤＦ−８モジュレート物質を受けていると認定された個体は、本明細書に記載の方法の候補体であろう。ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた治療を受けている個体は、治療期間中にＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルが変化し、それにより、治療の効果に不利な影響を被り得る。さらに、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与に関係する薬物クリアランスまたは生物学的利用能における個体差を検出し、制御することが望ましい場合があり得るため、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いたＧＤＦ−８に関係する障害の処置の前に、ＧＤＦ−８モジュレート物質投与について適切な候補体が、本明細書で提供される方法を用いて認定される。
【００６５】
筋肉関連障害を有する、または発症する危険性のある個体は、本明細書で提供される方法についての候補体である。ＧＤＦ−８活性の阻害は、筋肉関連障害に罹患した個体を含む個体において筋組織を増大させる。多くの障害、例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮症、器官萎縮症（organ atrophy）、虚弱症、鬱血性閉塞性肺疾患、心不全、骨格筋減少症、悪液質、および他の疾病および病状により生じる筋肉の疲労症候群は、機能的に損なわれた筋組織に関係している。
【００６６】
筋肉関連障害には、例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、骨格筋減少症、悪液質、筋肉の疲労、筋萎縮症、または疲労、萎縮または衰弱を含む筋肉変性が含まれる。筋ジストロフィーには、例えば、偽肥大性肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型肢帯筋ジストロフィーおよび肢帯型筋ジストロフィーが含まれる。例示的な筋ジストロフィーには、デュシェンヌ型の筋ジストロフィー（Leyden-Mobius）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフェス（Emery Dreifuss）型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、強直性脊椎症候群、ウールリッヒ型症候群、福山型筋ジストロフィー、ウォーカー・ワークブルグ症候群、筋・眼・脳病、顔面肩甲上腕型（Landouzy-Dejerine型）筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、筋硬直性ジストロフィー（スタイナート病）、先天性筋緊張症、およびガウアーズ病が挙げられる。例えば、心臓血管疾患、器官萎縮症、臓器不全、癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、床上安静、不動化、長期にわたる不使用、または他の疾病など、他の疾病もしくは病状と関係するまたは派生的な筋肉変性もまた、この用語に含まれる。
【００６７】
心血管障害と関係する筋肉喪失または筋肉疲労を有する個体もまた、本明細書で提供される方法の候補体である。心血管障害の例には、冠状動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）、アンギナ（急性アンギナおよび不安定狭心症を含む）、心臓発作、卒中（虚血性卒中を含む）、高血圧に関係する心臓血管疾患、心不全、鬱血性心不全、冠状動脈疾患、高血圧、高脂血症、末梢動脈疾患および末梢血管疾患もまた挙げられる。インスリン代謝障害の例には、異常なグルコース恒常性、２型糖尿病、前糖尿病、耐糖能異常、脂質異常症、メタボリック症候群（例えば、Ｘ症候群）および外傷、例えば火傷または窒素平衡失調症（nitrogen imbalance）により誘発されるインスリン抵抗性が挙げられる。
【００６８】
脂肪組織、メタボリックもしくは骨に関係する障害または状態に罹患している、またはその危険性のある個体は、特許請求する方法の候補体でもある。前記障害または状態は、異常なグルコース恒常性に関係するもの、例えば、2 糖尿病の発症、耐糖能異常、メタボリック症候群（例えば、Ｘ症候群）、例えば火傷または窒素平衡失調症により誘発されるインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（例えば、肥満症）が挙げられる (Kimら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-906 (2001)）。例えば、ＧＤＦ−８は、脂肪細胞（Ｉｄ）への前脂肪細胞の分化をモジュレートし、間葉前駆細胞および前脂肪細胞からの脂肪細胞形成を阻害する（Rebbapragadaら、Mol. Cell Bio. 23:7230-7242 (2003)）。脂肪の蓄積は、ＧＤＦ−８ノックアウトマウスおよびＧＤＦ−８蛋白質を全身投与された野生型の生体マウスの両方で減少した（McPherronら、J. Clinical Invest. 109:595-601 (2002）；Zimmersら、Science 296:1486-1488 (2002)）。骨量の減少と関係する障害または状態には、骨粗鬆症および骨減少症が含まれ、特に、早期および／または閉経後の女性において、グルココルチコイド−誘導骨粗鬆症、骨減少症、骨関節症、および骨粗鬆症に関係する骨折が含まれる。加えて、低い骨量により特徴付けられるメタボリック性の骨疾患および障害には、例えば、慢性的なグルココルチコイド治療、早産児性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進病、栄養欠乏症、および神経性無食欲症が含まれる。
【００６９】
さらに、筋量の増大、例えば、筋肉細胞サイズの増大（肥大）または筋肉細胞数の増加（過形成）を示す個体は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法の候補体であろう。この増大は、哺乳動物または他の動物の１型および／または２型の筋肉繊維であり得る。筋量の増大を測定する方法は、当分野で周知である。例えば、筋肉は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与前後に、標準技術、例えば水中での計量を用いて測定できる。筋サイズの増大は、重量増加の少なくとも約５％、１０％、２０％またはそれ以上で明らかにされ得る。例えば、磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）または二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）技術を含む、他の非侵襲技術を用いてもよい。プロのスポーツ選手を含む運動選手は、本方法の候補体である。
【００７０】
運動能力の向上を理由に、ＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、ＭＹＯ−０２９を摂取している、または摂取した疑いのある個体は、本方法の候補体である。他の実施形態において、例えば、ウシまたは他の家畜動物などの個体は、その動物の生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の投与を検出することが望ましい場合、本明細書で提供される方法の候補体である。例えば、外因性の試薬は、成長または筋組織量を増大させるため（または、肉の脂肪含有量を下げるため）家畜動物に投与され得る。
【００７１】
第一の実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法が提供され、前記方法は、個体からの試験生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加え、ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出し、そして試験生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較して、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む。ある実施形態において、本方法は、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを、それぞれ既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより定量することをさらに含む。
【００７２】
ある実施形態において、試験管内アッセイは、活性なＧＤＦ−８蛋白質と関係する１つまたはそれ以上の生理学的な成長調節活性または形態形成活性を測定する。ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出するための試験管内アッセイは、当分野で周知であり、細胞に基づくアッセイもしくは無細胞アッセイ（例えば、転写、複製または細胞周期停止を測定するアッセイ）、または結合アッセイ（例えば、免疫学的検定、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降、または放射免疫アッセイ）から選択され得る。例えば、活性なＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子であり、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートし、筋芽細胞増殖を刺激し、および前脂肪細胞の脂肪細胞への分化をモジュレートする。幾つかの方法において、ＢＭＰ−１１モジュレート物質からＧＤＦ−８モジュレート物質の選択が行われる。ＧＤＦ−８活性についての細胞に基づくアッセイおよび無細胞アッセイは、当分野で既知であり、以下に記載される。
【００７３】
生体試料、例えば試験生体試料は、少なくとも１体の個体からの生物学的な物質を含む。好ましい実施形態において、個体は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた治療を受ける。他の好ましい実施形態において、個体は、ＧＤＦ−８モジュレート物質投与の候補体である。さらなる実施形態において、個体は、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類である。特定の実施形態において、生体試料は、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択される。好ましい実施形態において、生体試料は液体でる。幾つかの好ましい実施形態において、生体試料は、血液、血清または血漿から選択される。特定の実施形態において、生体試料は、血清、例えばヒト、霊長類、サル、ラット、またはマウスの血清である。
【００７４】
他の実施形態において、生体試料は、個体または個体群から単離され、試験に先立って選択的に試験されてもよい。例えば、生体試料は、集められて、または適切な希釈剤で希釈された後に用いてもよい。希釈は、アッセイに関するマトリックス干渉を低下および／またはなくすために最適化される。希釈剤は、特に制限されるものではないが、血清を含んでいてもよく、例えばヒト血清、脱イオン水、または約ｐＨ５〜約ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の範囲で緩衝作用を有する様々な緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液またはホウ酸緩衝液）が挙げられる。幾つかの好ましい実施形態において、希釈剤は、正常なヒト血清を含む。希釈剤は、例えば、試験生体試料の増加する希釈液のマトリックス効果による変動を軽減するため、一定の濃度の対照生体試料を含んでいてもよい。
【００７５】
希釈緩衝液は、試験生体試料に対応させるため、例えば、試料マトリクスのバックグラウンド効果または干渉を調節するため選択された対照生体試料を一定量含んでいてもよい。１つの実施形態において、ヒト血清の試験試料は、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）（１．０ｍＭ グリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％ｖ／ｖ／Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（J.T. Baker）を含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で１：８倍に希釈され、８倍を超える試験試料の希釈液は、１２．５％のヒト血清を含むＴＨＳＴで調製される。また、試料は、約２、４、８、１６、３２、６４もしくは１２８倍、またはそれ以上希釈されてよい。他の実施形態において、試験試料は、１：１．５または１：１．６で連続希釈され、希釈の直線性およびマトリクス効果の検証を可能にするデータ点の範囲を得る。好ましい生体試料マトリクスについて、希釈は、マトリクス干渉およびアッセイ感受性が最適となる条件が選択され得る。
【００７６】
幾つかの実施形態において、試料は、周知の方法を用いて分画され、濃縮されてもよく、次に、本明細書で提供されるＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法に加えられる。分画（精製を含む）または濃縮は、マトリクス干渉がアッセイにおいてＧＤＦ−８モジュレート物質の検出を制限する場合に用い得る。分画および濃縮技術は、制限されるものではないが、遠心分離法、硫酸アンモニウム沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、親和性技術（例えば、特異的な結合パートナー、例えば抗体、すなわち、例えば、抗−ヒトＦｃ抗体、プロテインＡまたはプロテインＧと結合された樹脂を用いた免疫沈澱法）、クロマトグラフィー技術、および他の分離技術が含まれる。好ましい実施形態において、生体試料は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の検出前には分画され、濃縮されない。
【００７７】
生体試料はまた、天然の個体から集められてもよく、またはＧＤＦ−８モジュレート物質の投与前、その間、もしくはその後に採取してもよい。例えば、試料は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与後１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１５日、２０日、２５日、３０日またはそれ以降の日に個体から得てもよい。試料はまた、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与後、１週、２週、３週、４週、６週、８週、１０週、１２週、１６週またはそれ以降の週に得てもよい。試料採取の時期は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の検出を高めるため、または物質の改変された生物学的利用能を検出するため、最適化され得る。
【００７８】
本明細書で提供される方法により検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する抗体であってよく、好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＭＹＯ−０２９である。ある実施形態において、検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質は：抗体、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；ＧＤＦ−８結合パートナーＧＤＦ−８受容体、ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質、フォリスタチン蛋白質、ＧＡＳＰ−１蛋白質、ＧＤＦ−８蛋白質、ＧＤＦ−８プロペプチド、非−蛋白質阻害物質、および小分子から選択される（さらなる詳細は以上に記載される）。
【００７９】
当業者には容易に認められるように、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、試験管内アッセイに基づいて選択された検出試薬および検出されたＧＤＦ−８モジュレート物質を用いて検出することができる（以下を参照のこと）。試験管内アッセイがレポーター遺伝子アッセイである場合、検出試薬は、好ましくはレポーター遺伝子産物、例えば酵素またはエピトープタグなどの標識を含む蛋白質である。適切な酵素には、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、ブドウ糖酸化酵素（β−ガラクトシダーゼ）、および、例えば発色、ルミネセンスまたは蛍光発光を生成する反応を触媒することができる他の蛋白質が含まれる。試験管内アッセイが、結合アッセイ、例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）である場合、検出試薬は、捕捉蛋白質と本明細書で提供される方法により検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複合体中の捕捉蛋白質とを区別して会合するであろう。検出試薬は、蛋白質であってよく、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質と、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体：捕捉蛋白質の複合体であってよい。別には、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の捕捉蛋白質に対する結合に影響を与える蛋白質であってよい。
【００８０】
レポーター遺伝子アッセイ
ある態様において、試験管内アッセイは、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）である（Thiesら、Growth Factors 18:251-259 (2001)を参照のこと）。ある実施形態において、ＲＧＡは、（ａ）ＧＤＦ−８−応答調節因子およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞を、反応容器に供すること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；および（ｃ）生体試料の存在下および不在下で、細胞内でレポーター遺伝子の発現を検出し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。ある実施形態において、本方法は、レポーター遺伝子の存在下で発色、ルミネセンスまたは蛍光が変化する基質を加える工程をさらに含む。
【００８１】
宿主細胞は、真核細胞、例えば、ヒト、哺乳類または他の動物由来の細胞であってよい。好ましい実施形態において、宿主細胞は、真核細胞系、哺乳類の細胞系、または横紋筋肉腫を含む癌細胞系などの細胞系である。レポーター遺伝子構築物は、トランスフェクション、電気穿孔法などを含む当分野で既知の手段により、一過性にもしくは安定に宿主細胞に導入されてよい。レポーター遺伝子構築物は、調節エレメントと作動可能に組み合わされた、ＧＤＦ−８応答調節因子(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列）およびレポーター遺伝子を含む（例えば、米国特許公報第2003/0138422号およびそこに記載される文献を参照のこと）。
【００８２】
例えば、ＧＤＦ−８の活性を明らかにするため、ルシフェラーゼを発現するレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を用いた、レポーター遺伝子アッセイが開発された。このアッセイに加えられるＧＤＦ−８蛋白質の量は、レポーター構築物の最大活性の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を生じるのに十分な量が選択される。例えば、ＧＤＦ−８蛋白質は、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ｎｇ／ｍＬで加えられる。一定量のＧＤＦ−８蛋白質を用いて、ＧＤＦ−８モジュレート物質を滴定し、ＧＤＦ−８活性のモジュレーションの対照となる滴定を調製する。例えば、ＭＹＯ−０２９などのＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１，０００ｎｇ／ｍＬから選択される濃度で試験できる。好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質滴定は、このアッセイの直線性のある阻害範囲に及ぶ。
【００８３】
その後、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８で処理する、もしくは処理しない、また、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリンおよび１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地中の試験生体試料で、３７℃で６時間処理する、もしくは処理しない。ある実施形態において、既知のＧＤＦ−８モジュレート物質対象は、約１０ｐＭ〜５０μＭの濃度を用いて平行して行われる。例示的な濃度には、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭおよび５０μＭのＧＤＦ−８モジュレート物質が含まれる。好ましい実施形態において、試験試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の量は、既知量の試薬を用いた対象摘定と比較され、それにより定量される。レポーター遺伝子蛋白質、例えば基質の比色性分子、蛍光性分子またはルミネセンス分子への変換を触媒する酵素は、周知技術を用いて標的細胞中で定量され得る。
【００８４】
結合アッセイ
ある実施形態において、試験管内アッセイは、ＧＤＦ−８結合活性を測定する。試験管内アッセイは、ＧＤＦ−８蛋白質と結合するＧＤＦ−８モジュレート物質、またはＧＤＦ−８結合パートナーと結合する物質、例えば、ＧＤＦ−８と特異的に結合する蛋白質を検出することができる。例えば、成熟ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−８のプロペプチド領域と、ＡｃｔＲＩＩＢと、ＧＤＦ−８受容体と、フォリスタチンと、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質と、ＧＡＳＰ−１と、および他の蛋白質と特異的に結合する。特定の実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、抗体またはその一部は、１つまたはそれ以上のこれらの結合活性を減少させ、この結合における効果を検出する。ある実施形態において、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質のＧＤＦ−８蛋白質に対する特異的な結合が検出される。幾つかの実施形態において、試験管内結合アッセイのための捕捉蛋白質は、ＧＤＦ−８蛋白質、またはＧＤＦ−８と特異的に結合する蛋白質から選択される。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質の捕捉蛋白質に対する結合は、ＥＬＩＳＡで測定される。幾つかの実施形態において、捕捉蛋白質の第二の蛋白質（例えば、ＧＤＦ−８）に対する結合は、試験生体試料の存在下または不在下で測定される。結合は、検出試薬を用いて観察することができる。ある好ましい実施形態において、検出は、表面プラズモン共鳴技術を含み、例えば、表面プラズモン分光法（ＳＰＳ）を用いた表面プラズモン蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を含んでいてよい。ＳＰＳ反射能に加えて、標識化分子、例えば、蛍光標識化検出試薬の蛍光強度を検出することで、ＳＰＳ検出に関係する特定の実施形態で、その感度は改善される。標準的なＳＰＳ手順もまた含まれる。幾つかの実施形態において、直接結合アッセイ形式、ブリッジ形式（ＧＤＦ−８モジュレート物質が、固相のＧＤＦ−８および例えば液相のビオチン化ＧＤＦ−８を同時に結合する場合）または競合形式のアッセイを含むＥＬＩＳＡが、行われる。
【００８５】
結合アッセイにおいて、検出試薬は、例えば、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を認識して結合するであろうし、また、単独で用いてもよいし、あるいは、例えばＧＤＦ−８の阻害物質を検出するために利用され得る特定の用量応答信号を生成する他の試薬と組み合わせて用いてもよい。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いられる検出試薬は、特定のＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８モジュレート物質の基に対して特異的である。例えば、好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリン配列と特異的に結合する抗体は、ヒト抗体に基づくＧＤＦ−８モジュレート物質、ＭＹＯ−０２９を検出するために用いられる。
【００８６】
特定の実施例において（例えば、実施例１を参照のこと）、好ましい検出試薬は、マウスの抗−ＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体であるが；しかしながら、一般的にヒトＩｇＧ、もしくはラムダ軽鎖を有するヒトＩｇＧ１、または特異的にＭＹＯ−０２９のアイソタイプまたはアロタイプを認識し、結合することができるいずれの試薬も、ＭＹＯ−０２９の検出を基礎として使用し得る。
【００８７】
他の実施形態において、例えば、試験管内アッセイが、競合結合を測定する場合（例えば、競合ＥＬＩＳＡ）、検出試薬は、ビオチン化成熟ＧＤＦ−８二量体を含む標識化ＧＤＦ−８蛋白質であってよい。標識化ＧＤＦ−８蛋白質はまた、例えば、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８結合部分を含むＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための検出試薬（例えば、ＭＹＯ−０２９抗体）であってよい。
【００８８】
他の実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体である。幾つかの実施形態において、検出試薬は、成熟ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体、例えば、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２またはＪＡ−１６である。ＧＤＦ−８モジュレート物質がヒト抗体である実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体、例えば、マウス抗−ヒトＦｃ抗体を含む抗−ヒトＩｇであってよい。ＥＬＩＳＡの場合、複合体は、酵素標識で検出されよう。
【００８９】
免疫学的検定
１つの実施形態において、本発明は、ＧＤＦ−８蛋白質、例えば成熟ＧＤＦ−８二量体または他の捕捉物質を、反応容器の表面に接触させ、生体試料を加え、そして検出試薬を加えて、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、結合アッセイを含む。
【００９０】
より具体的には、本発明は、生体試料、例えば血清中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法を含み、前記方法は、（ａ）捕捉物質を反応容器の表面と接触させる工程、（ｂ）生体試料を反応容器に加える工程、（ｃ）検出試薬を反応容器に加える工程、（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出する工程を含む。
【００９１】
（ａ）工程にいおて、捕捉蛋白質、例えばＧＤＦ−８蛋白質は、固体反応容器の表面に、共有結合または非共有結合のいずれかにより固定化されている。固体表面は、典型的にはガラス、またはポリマー、例えばセルロース、硫酸デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルもしくはポリプロピレンであり、それらは、磁性体ビーズもしくは常磁性体ビーズを含む、ビーズの形態であってもよい。表面上へのリガンドの固定化は、共有結合によって、または非共有的相互作用、例えば、物理的吸着によって達成され得る。共有結合の方法には、架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアネート、スルホ含有試薬、ペプチド、アルキル化剤、または類似の試薬を用いてカップリングすることが含まれる。好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８は、成熟ＧＤＦ−８二量体である。他の好ましい態様において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質はビオチン化されており、反応容器の表面は、（例えば、吸着を介して）アビジンまたはストレプトアビジンで被覆されている。ある実施形態において、本明細書中で提供される方法は、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性を保持するビオチン化された成熟ＧＤＦ−８二量体の使用を含む。
【００９２】
これらの方法は、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８が、反応容器の表面に吸着された成熟ＧＤＦ−８蛋白質よりも、より有効な捕捉物質であるという知見によるものである。さらに、成熟ＧＤＦ−８は、第一級アミン基、例えばリジン残基のビオチン化に対して当初予想されたよりも感度がよかった。アミン特異的なビオチン化試薬を用いてビオチン化したハイパービオチン化ＧＤＦ−８は、ビオチンを含まないＧＤＦ−８と比較して、活性が損なわれるか、または不活性化される。成熟ＧＤＦ−８二量体あたり、アミン基に組み込まれるビオチン分子の数は、ＧＤＦ−８活性を保持した調製に重要であることが見出された。例えば、ＭＹＯ−０２９およびＡｃｔＲＩＩＢ結合活性は、ハイパービオチン化調製物では低下した。従って、ＧＤＦ−８二量体のモルあたりの５個以下のビオチンの分子を有するアミンビオチン化された成熟ＧＤＦ−８調製物が好ましい。別の実施形態において、蛋白質は、スルフヒドリル、カルボキシルおよび／または炭水化物にてビオチン化され得る。非特異的に結合するか、光活性化により反応する光反応性ビオチン化合物もまた利用できる。
【００９３】
本明細書で提供される特定の実施形態において、潜在的な複合体としてのＧＤＦ−８は、アミン特異的ビオチン化試薬によりビオチン化され、次に、成熟ＧＤＦ−８をその複合体から単離する。この方法では、成熟ＧＤＦ−８二量体に組み込まれるビオチンの量は、例えば、受容体結合部位を不活性化することを避けて、生物活性を保持するよう最適化される。ＧＤＦ−８蛋白質はまた、スルフヒドリル特異的ビオチン化試薬を用いて、表面のシステイン残基（または、表面のチオール基）をビオンチン化してもよい。加えて、例えば、反応性アルデヒドを生成するための酸化前処理およびビオチンヒドラジド試薬の使用を含む、炭水化物をビオチン化する方法は、当分野で既知であり、最適にモディファイされた形式の成熟ＧＤＦ−８蛋白質を含む、本明細書で記載される蛋白質について最適化され得る。さらに、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を介したビオチン化を可能にするカルボキシル反応ビオチン化試薬および反応を用いてもよい。当業者には明らかなように、ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する最適なモル比は、ビオチン化手順および用いられる試薬により変更し得る。例えば、当業者であれば、本明細書に記載される方法を既知のビオチン化手順と組み合わせて用い、活性なビオチン化ＧＤＦ−８の調製を最適化し、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性を有する、ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する種々の最適なモル比のビオチン化成熟ＧＤＦ−８蛋白質を生成する方法は認められよう。
【００９４】
幾つかの実施形態において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、アミン特異的ビオチン化試薬を用いてビオチン化される。例えば、ＧＤＦ−８調製物は、リジン残基および／またはアミノ末端でビオチン化され得る。機能的な、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、例えば実施例３に記載されるように、潜在的な複合体の一部としてビオチン化することができ、続いて、成熟ＧＤＦ−８をその複合体から単離してもよい。別の調製法においては、潜在的な複合体中のＧＤＦ−８蛋白質は、米国特許公報第2004/0142382 A1号に記載の実施例１に従って、生成され、単離される。次に、潜在的な複合体は周知の技術を用いて、および／または本明細書で記載されるように、ビオチン化される。
【００９５】
様々なビオチン化試薬は、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体を含む蛋白質の効率的な標識化を可能にする。反応におけるビオチン誘導体のＧＤＦ−８の潜在的な複合体に対するモル比は、約１０、１５、２０、４０または８０対１であり、試薬組成および濃度、反応時間、および温度は、反応中に組み込まれるビオチンの量を調整するために変更し得る。例えば、塩および他の試薬は、最適化されてもよい。ある実施形態において、成熟ＧＤＦ−８二量体は、ビオチン化反応中に成熟二量体を不活性化することを避けるため、ＧＤＦ−８のアミノ末端プロペプチド部分と関係してビオチン化される。
【００９６】
ビオチン誘導体は、周知であり、当分野で利用可能である。ビオチンのモディフィケーションは、様々なスペーサーアーム、安定性に作用するモディフィケーションおよび／または、例えば、ビオチン部分の開裂を可能にする反応基が含まれる。水溶性のスルホスクシンイミジルエステルを含む、ビオチンのスクシンイミジルエステルおよびその誘導体は、例えばリジン残基におけるＧＤＦ−８のビオチン化に使用することができる。組み込まれたビオチンの量を定量するため、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、質量分析法などを含む周知の分析法およびサイジング技術が用いられる。加えて、例えば比色アッセイまたは蛍光アッセイによりビオチンを定量する商業的なキットを利用することができる（例えば、ＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）−安息香酸を利用するＥＺTMビオチン定量キット（Biotin Quantitation Kit）、Pierceを参照のこと）。
【００９７】
さらなる例示的なビオチン化手順は、１５モルまたは２０モルのＥＺ−リンク・スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Pierce、カタログ番号21217）対１モルのＧＤＦ−８複合体の割合で、２時間、２〜８℃で、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体をビオチン化することを含む（例えば、米国特許公報第2004/0142382 A1号に記載の実施例３を参照のこと）。この反応は、０．５％ ＴＦＡを用いてｐＨを下げることにより停止させ、次いで、複合体を、Ｃ４ジュピター２５０×４．６ｍｍカラム（Phenomenex）を用いたクロマトグラフィーにかけ、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離することができる。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配を用いて溶出されたビオチン化した成熟ＧＤＦ−８画分を集め、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（登録商標）プロテインアッセイ・リージェント・キット（Pierce、カタログ番号23235）により定量するか、または他の周知の単離および濃縮技術を用いる。
【００９８】
好ましい実施形態において、試験管内結合アッセイは、ビオチン化ＧＤＦ−８蛋白質捕捉物質を含み、ＧＤＦ−８蛋白質は、そのビオチン部分と反応容器の表面上のアビジンとの相互作用を通じて、ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させる。幾つかの実施形態において、ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から約４：１の間である。他の実施形態において、ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する平均の比は、約５：１以下、約２：１以下、または約１：１以下である。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対する割合は、大部分の分子は約１：１のモル比であるが、活性なＧＤＦ−８調製物においては０から３のモル比の混合物であることが測定された。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対する比率の形式は、例えば、約１、２、３、４または５以下であろう。幾つかの実施形態において、ビオチン化成熟ＧＤＦ−８調製物は、成熟ＧＤＦ−８二量体のモルあたり約１、２、３、４または５モル以下のビオチンが含まれる。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対する平均もしくは中央の比率は、例えば、約０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８または９以下であろう。他の検出物質および捕捉物質は、ビオチン化により標識化されていてもよい。例えば、ビオチン化ＭＹＯ−０２９は、少なくとも（または多くても）、例えば、１０：１、２０：１もしくはそれ以上の割合まででビオチン化され得る。場合により、他の捕捉物質を用いてもよい。
【００９９】
捕捉物質を反応容器の表面に接触させた後、反応容器を洗浄して、結合しなかった捕捉物質を取り除き、その後、生体試料を加える。幾つかの実施形態において、反応容器は、約５〜約９のｐＨの緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、または酢酸緩衝液で洗浄される。要すれば、浄化剤濃度またはイオン強度を加えてもよい。例えば、標的と特異的に結合しない蛋白質など、少なくとも１種のブロッキング試薬を含む緩衝液を反応容器に加えるブロッキング工程を用いて、非特異的な相互作用を最小にする。他の実施形態において、浄化剤、例えば、イオン性浄化剤もしくは非イオン性浄化剤を加えてもよい。ブロッキング緩衝液は、例えば、血清、ウシ血清アルブミン、ミルク、カゼイン、ゼラチンおよび/または非イオン浄化剤を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、反応容器は、ｐＨ約５〜約９の間の緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液または酢酸緩衝液を用いて洗浄される。
【０１００】
（ｂ）工程において、生体試料が反応容器に加えられる。本発明の幾つかの好ましい実施形態において、生体試料は、血液、血清および血漿から選択される。生体試料は、回収された状態で、または適切な希釈剤で希釈された後に用いることができる。希釈剤は、特に、制限されないが、脱イオン水および約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲で、好ましくは約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の範囲で緩衝作用を有する様々な緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液またはホウ酸緩衝液）が含まれる。
【０１０１】
試験されるべき試料の一部を、固定化された捕捉物質と接触させ、十分な時間（例えば、２〜１２０分）、適切な条件下（例えば、２３℃）でインキュベートし、試料中に存在するＧＤＦ−８モジュレート物質の固定化された蛋白質、例えば、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８二量体に対して結合させる。ＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の反応は、特に制限されないが、従来の免疫学的検定で慣用的に使用される条件下で行われ得る。典型的な手順としては、検出試薬とＧＤＦ−８モジュレート物質を含む反応系を、４５℃を超えない、好ましくは約４℃から約４０℃の間、より好ましくは約２０℃から約４０℃の間の穏やかな温度で、または約０．５時間から約２４時間の間、好ましくは約１時間から約２時間の間、インキュベートすること、または維持することを含む。溶媒は、反応に干渉しない限り特に制限されず、従って、限定されるものではないが、約ｐＨ５から約ｐＨ９の間の緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液および酢酸緩衝液が含まれる。浄化剤が存在していてもよい。
【０１０２】
（ｃ）工程は、検出試薬を反応容器に加えることを含む。インキュベーション期間に続いて、固定化されたＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体は、幾つかの実施形態で、（ｃ）工程の前に結合していない溶質を取り除くため、緩衝液で洗浄される。他の実施形態において、同時定量が行われ、それにより（ｂ）および（ｃ）工程が同時に行われる。
【０１０３】
（ｃ）工程を（ｂ）工程の後に行う場合、典型的な手順として、検出試薬とＧＤＦ−８モジュレート物質を含む反応系を、４５℃を超えない、好ましくは約４℃から約４０℃の間、より好ましくは約２５℃から約４０℃の間の穏やかな温度で、約０．５時間から約４０時間、好ましくは約１時間から約２０時間、インキュベートすること、または維持することを含む。溶媒は、反応に干渉しない限り特に制限されず、従って、限定されるものではないが、約ｐＨ５から約ｐＨ９の間の緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液および酢酸緩衝液が含まれる。
【０１０４】
検出試薬は、上記のように、検出可能な標識で標識化されていてもよい。検出試薬は、生体試料中に存在し得る本質的に全ての外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を結合するよう過剰であることが好ましい。検出は、定性的であっても、定量的であってもよい。幾つかの実施形態において、検出試薬は、機器の助けを借りない様々な手段により容易に検出し得る標識を含んでいよう。検出試薬はまた、機器を用いて検出されてもよい。例えば、表面プラズモン共鳴法においては、ＧＤＦ−８モジュレート物質の捕捉物質に対する結合は、例えば、標識を加えることなく検出される。
【０１０５】
検出試薬は、例えば外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合することにより固定される。１つの実施形態において、検出試薬は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体である。試料中の外因性試薬の存在または不在は、標識の活性を測定することにより評価されるが、これは、検出試薬を測定するために用いられる標識の種類に依存し得る。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、「直接」標識は、補助的な試薬を加えることなく、検出可能な信号を自発的に生成できる、特異的結合メンバーと結合された、または会合されたいずれかの分子であってよい。幾つかの例において、放射同位体（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、重金属、発色団（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、１−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシｌ−４−ピペリジル）−５−Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン）、色素（例えば、フィコシアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ｏ−フタルアルデヒド）、化学発光分子、生物発光分子を含む、発光性分子、コロイド金粒子、コロイド銀粒子、他のコロイド金属粒子、ユーロピウム、ポリスチレン色素粒子、わずかな着色性粒子、例えば色素ゾルおよび着色ラテックス粒子が挙げられる。そのような物質の多くは、当業者には周知である。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、標識は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ブドウ糖酸化酵素またはβ−ガラクトシダーゼなどの酵素である。特定の酵素に用いられる基質は、一般に、対応する酵素の存在下で、色、蛍光またはルミネセンスの検出可能な変化を生成することについて選択される。酵素は、一般に、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸架橋により検出試薬に連結される。ある実施形態において、検出試薬は、例えばＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合するモノクローナル抗体、またはモジュレート物質を含む複合体またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体などの、ペルオキシダーゼ結合抗体がある。しかしながら、容易に理解されるように、多種多様な連結技術が存在し、様々な検出試薬（上掲）に応用できることは、当業者であれば容易に利用できる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、酵素標識された抗体を、ＧＤＦ−８モジュレート物質/捕捉物質の複合体に加え、結合させる。過剰量の試薬は洗い流し、次に、適当な基質を含む溶液を反応容器に加える。基質は、酵素による分解反応を受けて、試料中に存在する物質の量の指標となる分光学的に測定できる変化を生じることとなる。
【０１０９】
可溶性の基質（例えば、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズチアゾリン］スルホナート（ＡＢＴＳ）、パラニトロフェニルホスフェート、ルミノール、ポリフェノール、アクリジネステルおよびルシフェリン）と共にインキュベートした場合、ペルオキシダーゼは、基質に分光学的に検出できる発色性もしくは蛍光性の変化を生じさせる。典型的には、基質を用いた一定のインキュベーション期間の後に、反応を停止させ（例えば、酸性化することにより）、その結果は、光学密度（吸光度）またはルミネセンスを測定することにより定量される。吸光度の結果は、発色反応の直線性のある範囲のＯＤ値と比較でき、ルミネセンス免疫学的検定は、相対発光量（ＲＬＵ）で測定される。さらに別には、結合し、特定の用量応答シグナルを生成することとなる試薬のいずれかの組み合わせを用いてもよい（例えば、放射標識試薬、酵素／基質試薬、または例えばビオチン／アビジンを利用した検出増幅系）。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、標識は、ビオチン、ハプテンまたはエピトープタグ（例えば、ヒスチジン−タグ、ＨＡ−タグ（血球凝集素ペプチド）、マルトース結合蛋白質、ＡｖｉＴａｇ（登録商標）、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーぜ）であり、それらは、ＧＤＦ−８モジュレート物質複合体と会合した標識と相互作用する、標識化された検出試薬を加えることによって検出することができる。ビオチン標識（「ビオチン化」）検出試薬は、アビジン−酵素、例えば、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と相互作用させ、次にそのアビジン−酵素結合体と適切な発色基質または蛍光発生基質と共にインキュベートすることを通じて検出され得る。
【０１１１】
（ｄ）工程において、反応容器の表面と会合しているＧＤＦ−８モジュレート物質の複合体は、標識の信号の定性的もしくは定量的評価により検出される。標識は、例えば、蛍光もしくはルミネセンスにより直接的に、あるいは、基質の添加を介して間接的に測定され得る。標識はまた、さらなる試薬とのインキュベーションに続いて測定することもできる。
【０１１２】
標識がビオチンである実施形態においては、アビジン結合酵素（酵素は、幾つかの好ましい実施形態においては、西洋ワサビペルオキシダーゼである）が、次の工程で加えられる。アビジン結合体は、固定化された検出試薬と結合する。過剰なアビジン結合体は、洗い流す。次いで、酵素の基質を加え、例えば発色、蛍光、ルミネセンスに測定可能な変化を生じさせる。幾つかの実施形態において、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【０１１３】
他の実施形態において、本方法は、フォリスタチンと、生体試料中の様々なＧＤＦ−８結合受容体と、アクチビンと、ＧＤＦ−８プロペプチドと、または他のＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合するＧＤＦ−８モジュレート物質を有する複雑な生体試料における検出を可能にする。ある実施形態において、ＧＤＦ−８と特異的に結合する蛋白質（例えば、上記の表から選択される）は、捕捉物質であり、捕捉物質は反応容器の表面に固定化される。好ましい実施形態において、本方法は、成熟ＧＤＦ−８と１つまたはそれ以上の特異的な結合パートナー（以下を参照のこと）との相互作用と競合するもしくは干渉することに基づき、個体からの生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の検出が可能となる。
【０１１４】
（ｃ）および（ｄ）工程の検出試薬は、幾つかの実施形態において、抗体、例えば実施例１に記載されるように、マウスの抗−ヒトＩｇ抗体である。好ましい実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を、反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出することを含む。好ましい態様において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して表面と接触する。好ましい態様において、ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から４：１の間である。さらに好ましい態様において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＭＹＯ−０２９である。
【０１１５】
さらなる実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、（ａ）ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質から選択される捕捉物質を、反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。さらなる別の実施形態において、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）ＧＤＦ−８受容体を、第一および第二の反応容器と接触させること；（ｂ）生体試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第一の反応容器に加えること；（ｃ）対照試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第二の反応容器に加えること；（ｄ）検出可能な標識を、第一および第二の反応容器に加えること；および（ｅ）第一の反応容器中の検出可能な標識信号を第二の反応容器中の信号と比較し、それにより生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。
【０１１６】
競合ＥＬＩＳＡ
本発明のさらなる実施形態において、試験管内免疫学的検定は、競合ＥＬＩＳＡである。本明細書により提供される１つの方法において、免疫学的検定には、（ａ）可溶性のＧＤＦ−８受容体を反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体試料を反応容器に加える工程；（ｃ）標識化ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器に加える工程；および（ｄ）生体試料の存在下および不在下で、該表面と会合している標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量を検出し、生体試料存在下での標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量の減少により、その生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む。ある実施形態において、本方法は、生体試料を反応容器に加える前に、生体試料を標識化ＧＤＦ−８蛋白質と共にインキュベートする工程をさらに含む。さらなる実施形態において、例えば、上記のようにビオチン化されたＧＤＦ−８蛋白質を、検出試薬として用いてもよい。
【０１１７】
ＧＤＦ−８阻害剤
ＧＤＦ−８阻害物質を含むＧＤＦ−８モジュレート物質は、本明細書で提供される方法により検出することができる。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、結合アッセイにおいて検出試薬として、本方法で用いることもできる。ＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８自体と相互作用することができる。あるいは、阻害物質は、ＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）または他の結合パートナーと相互作用することができるし、または間接的に作用することもできる。ＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の部分集合であり、抗体（例えばＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−８受容体に対するもの）、可溶性の受容体、他の蛋白質（ＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−８受容体と結合するものを含む）、モディファイされた形式のＧＤＦ−８もしくはその断片、プロペプチド、ペプチド、およびこれらのすべての阻害物質の模倣体が含まれる。非蛋白質性の阻害物質には、例えば核酸が含まれる。
【０１１８】
当業者であれば、いずれの蛋白質の配列中のあるアミノ酸が、その蛋白質の活性に不都合な影響を及ぼすことなく他のアミノ酸に置換されていてもよいことは理解されよう。従って、様々な変更が、その生物活性または有用性を大きく損なうことなく、本発明のＧＤＦ−８モジュレート物質およびＧＤＦ−８阻害物質のアミノ酸配列、またはそれをコードするＤＮＡ配列に生じていてもよいと考えられる。そのような変更は、限定されるものではないが、欠失、挿入、切断および置換が含まれ得る。
【０１１９】
アミノ酸の一次配列またはヌクレオチドに基づく試薬もしくは阻害物質は、参照配列と異なっていてもよい。例えば、ヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、「強い厳格な」または「強い厳格性」の条件の下、関連する配列と結合することができる。そのような条件は、当業者には知られており、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology,」John Wiley＆Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見出すことができる。当分野で記載されるように、水溶性および非水溶性の条件の両方を用いることができる。強い厳格なハイブリダイゼーション条件の１つの例として、約４５℃での６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次に、５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中での少なくとも１回の洗浄がある。強い厳格なハイブリダイゼーション条件の他の例には、約４５℃（または５０℃、６０℃もしくは６５℃）、６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、次に、約５５℃、６０℃もしくは６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での少なくとも１回の洗浄がある。強い厳格な条件には、６５℃、０．５Ｍ リン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次に、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの少なくとも１回の洗浄である。
【０１２０】
当業者であれば、蛋白質性のＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８阻害物質は、その生物学的な特徴を変えない、多くの保存的な変更をそのアミノ酸配列に含んでいてもよいことは認められよう。保存的なアミノ酸のモディフィケーションは、アミノ酸側鎖置換の関連する類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。例示的な保存的置換は、当業者には周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。さらに、蛋白質性のＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８阻害物質の機能断片が、本明細書で提供される。そのような断片は、ＧＤＦ−８と特異的に結合し、および／またはＧＤＦ−８活性を阻害し得ることが期待される。本発明の実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質またはその機能断片は、単量体型、活性な二量体型、またはＧＤＦ−８の潜在的な複合体中で複合体形成している、成熟ＧＤＦ−８またはその断片と特異的に結合する。
【０１２１】
アミノ酸配列または核酸配列に言及する場合、成句「実質的に同一」または「実質的に類似」は、例えば、本発明のＧＤＦ−８阻害物質の対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、開示された配列と比較して、同一であろうし、またはわずかな差（保存的なアミノ酸置換を通じて）しかないことを意味する。本発明のヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、開示される核酸分子およびポリペプチドに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するものを含む。
【０１２２】
ポリペプチドについては、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個またはそれ以上のアミノ酸が、元のポリペプチドと、その元のポリペプチドと実質的に同一の変異型のポリペプチドとの間で比較されよう。核酸については、少なくとも５０個、１００個、１５０個、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが、元の核酸と、その元の核酸と実質的に同一の変異型の核酸との間で比較されよう。あるいは、比較は、元のアミノ酸配列または核酸配列の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％で行うことができる。従って、変異型は、ある領域もしくは領域群で実質的に同一であるが、他の領域では互いに異なっていてもよい。２つの配列間の同一性（パーセント）は、標準的なアライメントアルゴリズム、例えば、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990）にて記載されるベイシック・ローカル・アライメントツール（Basic Local Alignment Tool）（ＢＬＡＳＴ）、またはMeyersら、Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988）のアルゴリズムにより決定される。
【０１２３】
用語「変異型」は、提供されるＧＤＦ−８阻害物質（同様に、ＧＤＦ−８自体）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と実質的に同一もしくは類似するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ意味する。変異型は、天然のものであってもよく、例えば、天然のヒトおよびヒト以外のヌクレオチド配列であってよく、または、それらは人工的に作製されてもよい。変異型の例には、ｍＲＮＡの択一的なスプライシングにより生じるものがあり、３’および５’スプライス変異型、点突然変異および他の突然変異、または蛋白質の蛋白質分解物が挙げられる。変異型は、他の核酸（または適当な挿入もしくは欠失を有するものを、最適にアライメントする場合には、その相補鎖）またはアミノ酸配列と、それぞれ実質的に同一のもしくは類似の、核酸分子またはその断片、およびアミノ酸配列およびその断片が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の核酸分子または蛋白質と、他の核酸分子または蛋白質との間に、最適にアライメントした場合、それぞれ少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性がある。あるいは、全エピトープが、相同でない分子中に挿入されていてもよい。加えて、変異型は、本明細書中で論じられるように、ＧＤＦ−８活性を示すか、またはＧＤＦ−８活性を阻害する蛋白質またはポリペプチドが含まれる。
【０１２４】
ＧＤＦ−８阻害物質は、糖付加、ペグ化（pegylated）、または別の非蛋白質性のポリマーと連結されていてもよい。本発明のＧＤＦ−８阻害物質は、改変されたグリコシル化パターン（すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンから改変されている）を有するようモディファイされていてもよい。本明細書で用いられる「改変された」は、１つまたはそれ以上のモディファイされた炭化水素部分を有すること、および／または元の阻害物質の変更された１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を含むことを意味する。グリコシル化部位をＧＤＦ−８阻害物質に加えることは、当分野で周知のグリコシル化部位の共通配列を含むようアミノ酸配列を改変することによって達成することができる。多くの炭水化物成分を増加させる他の手段には、阻害物質のアミノ酸配列にグリコシドを化学的にもしくは酵素的にカップリングさせることによる手段がある。これらの方法は、国際公開第87/05330号パンフレットおよびAplinら、Crit. Rev. Biochem. 22:259-306 (1981）に記載されている。受容体に存在するいずれかの炭化水素成分の除去は、Hakimuddinら、Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987）；Edgeら、Anal. Biochem. 118:131(1981）；およびThotakuraら、Meth. Enzymol. 138:350 (1987）により記載されるように、化学的にもしくは酵素的に行うことができる。
【０１２５】
１．抗体
ＧＤＦ−８活性を阻害する抗体は、本明細書で提供されるＧＤＦ−８モジュレート物質の目的の範囲内にある。抗体は、慣用のハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature, 256:495-499 (1975)）、組み換えＤＮＡ方法（米国特許第4,816,567号明細書)、または抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ技術（Clackson ら、Nature, 352:624-628 (1991）；Marksら、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)）により作製することができる。他の様々な抗体産生技術については、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, （Harlowら、編、Cold Spring Harbor Laboratory 1988）；およびAntibody Engineering（第２版）（Borrebaeck編、Oxford University Press 1995）を参照のこと。抗体は、完全にヒトのものであってもよいし、ヒト化されていてもよい。ある実施形態において、抗体は、次の章で記載されるように改変されたもしくは変異されたＦｃ領域を有していてもよい。
【０１２６】
本発明に関する抗体の親和力は、１０６Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１の間であろうし、例えば１０８Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１の間であろう。本発明の抗体は、試験管内もしくは生体内でＧＤＦ−８活性を阻害し得る。開示された抗体は、骨格筋量および骨密度の負の調節と関係するＧＤＦ−８活性を阻害し得るし、および／またはＧＤＦ−８のクリアランスもしくは生物学的利用能に影響を及ぼし得る。
【０１２７】
２．ＧＤＦ−８に対する抗体
ＧＤＦ−８モジュレート物質である抗体は、ＧＤＦ−８蛋白質自体と結合することができる。特定の実施形態において、ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８／ＧＤＦ−８受容体の複合体と特異的に結合する。そのような抗体は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８を結合することができ、成熟蛋白質が単量体型であっても、活性な二量体型であっても、あるいは、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体にて複合体形成しているても、成熟蛋白質を結合することができる。好ましい実施形態にいおいて、ＧＤＦ−８蛋白質と結合する抗体は、中和抗体である。ある実施形態において、ＧＤＦ−８抗体は、例えば、競合結合アッセイにおいて測定した場合、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合を阻害する。ＧＤＦ−８配列に対する抗体は、例えば米国特許第5,827,733号および第6,096,506号において論じられている。
【０１２８】
Ａ．ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２
ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２抗体は、本発明の方法に用いることができ、これらの抗体は、米国特許公報第2004/0142382-A1号にさらに詳しく記載されており、その対応する部分、例えば配列、構造、断片、結合、生物活性および抗原エピトープ情報を含む部分は出典明示により本明細書の一部とされる。例えば、ＭＹＯ−０２９を含む、特定の中和抗体の特徴は、米国特許公報第2004/0142382-A1の５４−９０段落、および請求項１〜４２に記載されている。これらの抗体は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８を結合することができ、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイにより示されるように、試験管内および生体内でＧＤＦ−８活性を阻害すること、ならびに骨格筋量および骨密度の負の調節と関係するＧＤＦ−８活性を阻害することができる。
【０１２９】
ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２抗体、これらのｓｃＦｖ断片、ＶＨおよびＶＬドメイン、およびＣＤＲのＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列は、配列表(MYO-029) および米国特許公報第2004/0142382-A1号（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２）に記載されている。ＶＨおよびＶＬドメインを除く重鎖および軽鎖の配列は、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２と同一である。１つの好ましい実施形態において、ＭＹＯ−０２９の配列は、配列番号：３〜２０に記載されている。
【０１３０】
Ｂ．ＪＡ−１６
ＪＡ−１６抗体は、配列番号：１に記載される成熟ＧＤＦ−８蛋白質と結合し、L-A Whittemoreら、Biochem. and Biophys. Res. Commun. 300:965-971 (2003)ならびに米国特許公報第2003/0138422-A1号にさらに詳しく記載され、それぞれの対応部分（例えば、配列、構造、断片、結合、生物活性および抗原エピトープ）は出典明示により本明細書中の一部とされる。具体的には、米国特許公報第2003/0138422-A1号に記載の抗体阻害物質は、例えば、５６〜７０段落、９３〜１１０段落、および請求項１〜５４に記載されている。
【０１３１】
３．ＧＤＦ−８受容体に対する抗体
ＧＤＦ−８受容体と結合する抗体は、本発明の方法を用いて検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質の範囲内にある。これらの抗体は、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合に影響を及ぼすか、またはそれらはＧＤＦ−８の結合の後にその受容体の活性を阻害し得る。抗体は、完全な受容体蛋白質に対して、または細胞外ドメインのみに対して作製できる。抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＢ変異型、およびＧＤＦ−８の他の受容体に対して作製できる（例えば、米国特許公報第2004/0223966-A1号；米国特許公報第2004/0077053-A1号；国際公開第00/43781号パンフレットを参照のこと）。
【０１３２】
４．モディファイされた可溶性受容体
モディファイされた可溶性ＧＤＦ−８受容体は、それ自体がＧＤＦ−８モジュレート物質であり、それらは、他のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するため、本発明で用いることができる。適切な受容体は、ＧＤＦ−８受容体の細胞外ドメインの全部または一部、例えば、当分野で既知のアッセイウェル中でＧＤＦ−８と結合するＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの全部または一部が含まれ得る（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:9306-9311 (2001)）。アクチビンＩＩ型受容体は、非常に保存されており、その組み換え体の可溶型は、例えば、Attisanoら、Mol. and Cell Biol. 16:1066 (1996）；Woodruff, Pharmacology 55:953 (1998）；およびR＆D Systems、カタログ番号３３９−Ｒ（ ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ）にて提供される。ＧＤＦ−８受容体の構造および機能特性、ならびにその活性についてのアッセイは、例えば、米国特許第6,656,475号明細書および第6,696,260号明細書、および米国特許公報第2004/0077053-A1号にて提供される。さらに、アクチビンＩＩ型受容体を含むアクチビン受容体は、例えばその細胞外リガンド結合ドメインを記載する、米国特許第6,835,544号明細書において提供される。
【０１３３】
そのような受容体は、組み換え技術により産生されてもよいし、または完全な受容体を化学的にもしくは酵素的に分解して調製してもよい。本方法のモディファイされた可溶性の受容体は、ＧＤＦ−８の活性を低下させ、体内で天然のＧＤＦ−８受容体を活性化し、またはＧＤＦ−８活性を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメイン、特定の断片およびこの受容体の変異型の記載を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の配列は、例えば、米国特許第6,656,475号明細書に記載されている。
【０１３４】
Ａ．受容体融合体
本発明のモディファイされた可溶性の受容体は、他の蛋白質または他の単の一部との融合によりより安定化させることができる。増大された安定性は、低用量または低頻度の投与を可能にし、治療に有利である。少なくとも免疫グロブリンの一部、例えば、抗体の定常領域、場合により、免疫グロブリンのＦｃ断片との融合は、本発明のモディファイされた可溶性受容体または他の蛋白質の安定性を増大させ得る（例えば、Spiekermannら、J. Exp. Med. 96:303-310 (2002を参照のこと)）。
【０１３５】
Ｂ．ＡｃｔＲＩＩＢのＦｃ融合体
米国特許公報第2004/0223966-A1号（その対応部分は出典明示により本明細書の一部とされる）にさらに詳しく記載される、ＡｃｔＲＩＩＢのＦｃ融合体の阻害物質は、ＧＤＦ−８を結合し、試験管内および生体内でその活性を阻害する、モディファイされたアクチビンＩＩ型受容体ＡｃｔＲＩＩＢを含む。特に、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、骨格筋量および骨密度の負の調節に関係するＧＤＦ−８活性を阻害する。治療的使用に適したものとされた、本明細書で提供される方法のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、可溶性であり、例えば、延長された循環半減期および／または改善された蛋白質分解からの保護などの薬物動力学的特徴を備える。
【０１３６】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための本発明の方法に用いることができる。これらのポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインから誘導された第一のアミノ酸配列と、安定化部分もしくは第二のアミノ酸配列を含む。第一のアミノ酸配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの全部または一部から誘導され、特異的にＧＤＦ−８を結合することができる。幾つかの実施形態において、そのようなＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部はまた、ＢＭＰ−１１および／またはアクチビン、または他の成長因子を特異的に結合する。ある実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＢは、その短い配列が特異的にＧＤＦ−８を結合できる限り、完全な受容体の断片もしくは切断型である。
【０１３７】
安定化部分は、抗体の定常領域、特にＦｃ領域から誘導されたアミノ酸配列、または該配列の変異型であってもよい。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部分から誘導される。関連する実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または他のＩｇＧイソタイプであるＩｇＧから誘導される。特定の実施形態において、第二のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含み、そのヒトＩｇＧのＦｃ部分は、そのＦｃ部分のエフェクター機能を最小にするためモディファイされる。そのようなモディフィケーションには、Ｆｃ受容体結合性などのエフェクター機能を改変し得る(Lundら、J. Immun., 147:2657-2662 (1991）；およびMorganら、Immunology, 86:319-324 (1995))、または定常領域が誘導された種を変更し得る、特定のアミノ酸残基の変更を含む。抗体は、その重鎖のＣＨ２領域に、エフェクター機能、すなわちＦｃ受容体結合性および補体活性化を低下させる変異を有していてもよい。例えば、抗体は、米国特許第5,624,821号明細書および第5,648,260号明細書に記載される変異を有していてもよい。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖において、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長の配列中２３４番と２３７番のアミノ酸に対応するアミノ酸残基に、そのような変異が生じていてもよい。抗体はまた、免疫グロブリンの２つの重鎖間のジスルフィド結合を安定化させる変異、例えば、Angalら、Mol. Immunol. 30:105-108 (1993）で開示されるようにＩｇＧ４のヒンジ領域中の変異を有していてもよい。
【０１３８】
ある実施形態において、安定化部分は、受容体配列のＣ末端もしくはＮ末端と、リンカー配列により、またはリンカー配列によらずに連結されている。リンカー配列により伸びる長さおよびその配列、および連結される配列に対する方向性は変更し得る。リンカーは、２個、１０個、２０個、３０個またはそれ以上のアミノ酸を含み、所望の特徴、例えば安定性、その長さや立体的距離、免疫原性などに基づいて選択される。ある実施形態において、リンカーは、蛋白質分解部位、例えば、エンテロキナーゼ開裂部位、またはその融合蛋白質の精製、検出もしくはモディフィケーションに有用な他の機能的配列を含んでいてよい。当業者であれば、様々な融合蛋白質を作り出すため、本明細書で記載される当該技術を、他のタンパク質性ＧＤＦ−８モジュレート物質に容易に応用できよう。
【０１３９】
５．他の蛋白質
ＧＤＦ−８活性を阻害する他の蛋白質は、本明細書で提供される方法で検出され得る。そのような蛋白質は、ＧＤＦ−８自体と相互作用し、その活性を阻害し、またはその受容体と結合することができる。あるいは、阻害物質は、ＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）と相互作用することができ、そのため、阻害物質がＧＤＦ−８とその受容体との結合を阻害し得る場合、または阻害物質がＧＤＦ−８の結合後に受容体の活性を阻害する場合、本発明の検出方法に有用であり得る。もちろん、阻害物質は、ＧＤＦ−８およびその受容体の両方と相互作用できる。阻害物質はまた、他の様式、例えばＧＤＦ−８プロペプチドを開裂して不活性にさせる金属プロテアーゼを阻害することにより、ＧＤＦ−８活性に影響を及ぼし得る（例えば、米国特許公報第2004/0138118-A1を参照のこと）。
【０１４０】
Ａ．ＧＤＦ−８に特異的に結合する蛋白質
ＧＤＦ−８に結合し、その活性を阻害するか、またはそのクリアランスに影響を与える蛋白質は、本発明の方法に使用することが可能である。幾つかの蛋白質が知られているが、さらなる蛋白質は、種々のアッセイ、例えば、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ、免疫学的検定またはレポーター遺伝子アッセイを用いて単離することができる。蛋白質試料は、蛋白質のライブラリーからスクリーニングし得る。
【０１４１】
Ｂ．ＧＤＦ−８プロペプチド
ＧＤＦ−８プロペプチドは、ＧＤＦ−８の阻害物質として使用することができる。天然のＧＤＦ−８プロペプチドは、生体内での半減期が短かく、それにより、そのＧＤＦ−８活性の薬理学的阻害剤としての効果が低下するため、ＧＤＦ−８プロペプチド阻害物質には、改良された薬物動力学的特徴、特に増大された循環半減期を有するＧＤＦ−８プロペプチドのモディファイ型および安定化型が含まれる。米国特許公報第2003/0104406-A1を参照のこと（対応する部分は、出典明示により本明細書の一部とされる）。
【０１４２】
そのようなモディファイされたＧＤＦ−８プロペプチドには、ＧＤＦ−８プロペプチドとＩｇＧ分子のＦｃ領域とを含む融合蛋白質（安定化蛋白質として）が含まれる。これらのＧＤＦ阻害物質には、ＧＤＦプロペプチド（例えば、配列番号：５または１１に記載の配列）、またはＧＤＦプロペプチドの１つまたはそれ以上の生物学的活性を保持する該プロペプチドの断片もしくは変異型を含み得る。本発明の方法に用いられるＧＤＦ−８プロペプチドは、合成されて産生されてもよく、天然の（ネイティブ）ＧＤＦ−８プロペプチドから誘導されてもよく、または遺伝子工学の分野で既知の様々な試薬、宿主細胞および方法のいずれかを用いて、組み換え技術により産生されてもよい。１つの実施形態において、モディファイされたＧＤＦ−８プロペプチドは、ＩｇＧ分子またはその断片と共有結合により連結されたヒトＧＤＦ−８プロペプチドを含む。ＧＤＦ−８プロペプチドはまた、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と直接連結されてもよく、またはリンカーペプチドを介してＩｇＧ分子のＦｃ領域と連結されていてもよい。さらにＧＤＦ−８のプロペプチドを含む、ＧＤＦ−８と結合する蛋白質は、国際公開第00/43781号パンフレットにて示される。
【０１４３】
Ｃ．フォリスタチンおよびフォリスタチンドメインを含有する蛋白質
少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質は、増殖・分化因子−８（ＧＤＦ−８）のレベルまたは活性をモジュレートし、そして、ＧＤＦ−８のレベルまたは活性のモジュレーションに関係する障害を処置するために用いることができる。フォリスタチン自体およびフォリスタチンドメインを含有する蛋白質の両方は（米国特許公報第2003/0162714-A1号および第2003/0180306-A1号に記載され、これらの対応する部分は、出展明示により本明細書の一部とされる）、本発明に用いることができる（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 98:9306-9311 (2001)もまた参照のこと）。これらの蛋白質のヒトまたは動物への投与は、本発明の方法を用いて検出することができる。
【０１４４】
少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質は、ＧＤＦ−８を結合し、阻害するであろう。少なくとも１つのフォリスタチンドメインを有する蛋白質の例としては、限定されるものではないが、フォリスタチン、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）、ＦＲＰ（flik、tsc36）、アグリン（agrin）、オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ、ＢＭ４０）、ヘビン（hevin）（ＳＣ１、ｍａｓｔ９、ＱＲ１）、ＩＧＦＢＰ７（mac25）、およびＵ１９８７８が含まれる。ＧＡＳＰ１およびＧＡＳＰ２は、少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質の他の例である。
【０１４５】
フォリスタチンドメインは、上記のように、システインに富む繰り返しにより特徴付けられる、アミノ酸ドメインまたはアミノ酸ドメインをコードする核酸ドメインとして定義される。フォリスタチンドメインは、典型的に６５〜９０アミノ酸長を有し、１０個の保存されたシステイン残基およびカザル（Ｋａｚａｌ）セリンプロテアーゼ阻害ドメインを含む。一般に、システイン残基間のループ領域は、フォリスタチンドメインの配列の多様性を示すが、幾分かの保存性が見られる。４番目と５番目のシステイン間のループは、わずか１個または２個のアミノ酸からなり、通常小さい。７番目と８番目のシステイン間のループ中のアミノ酸は、一般に非常によく保存されており、（Ｇ，Ａ）−（Ｓ，Ｎ）−（Ｓ，Ｎ，Ｔ）−（Ｄ，Ｎ）−（Ｇ，Ｎ）、続いて（Ｔ，Ｓ）−Ｙモチーフの共通配列を有する。９番目と１０番目のシステイン間の領域は、一般に、別のアミノ酸に隔てられた２個の疎水性の残基（具体的には、Ｖ、ＩまたはＬ）を含むモチーフからなる。
【０１４６】
フォリスタチンドメインを含有する蛋白質は、少なくとも１つの、場合により１つ以上のフォリスタチンドメインを含むであろう。この用語はまた、天然の蛋白質に関係する既知の生物学的活性、特にＧＤＦ−８結合活性に関係するものを保持し、その配列が保存的なもしくは非保存的な変化でアミノ酸がモディファイされている配列を含む、該蛋白質のすべての変異型（断片；置換、付加もしくは欠失変異を有する蛋白質；および融合蛋白質）を意味する。これらの蛋白質は、天然もしくは合成のいずれを起源として誘導されたものであってもよい。蛋白質は、ヒトのものであってもよく、または限定されるものではないが、ウシ、ニワトリ、ネズミ、ラット、ブタ、ヒツジ, 七面鳥、ヒヒ、およびサカナを含む動物供給源から誘導されたものであってもよい。
【０１４７】
ＧＤＦ−８を結合し得る、少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質は、様々な方法を用いて単離することができる。例えば、１つの方法は、ＧＤＦ−８を用いた親和力精製に使用できる。加えて、ｃＤＮＡライブラリーを弱い厳格なスクリーニング法を用いてもよいし、またはフォリスタチンドメインに対するプローブを用いたデジェネレイト（degenerate）ＰＣＲ技術を用いてもよい。ゲノムデータがより利用しやすくなれば、多くの配列特性および分析プログラム、例えば、MotifSearch（Genetics Computer Group, Madison, WI）、ProfileSearch（GCG）およびBLAST（NCBI）を用いた類似検索を用い、既知のフォリスタチンドメインと高い相同性を有する新たな蛋白質を見つけ出すことが可能となろう。
【０１４８】
Ｄ．ＧＤＦ−８受容体に結合する蛋白質
ＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）と結合し、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合およびその受容体自体の活性を阻害する蛋白質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための本発明の方法に適している。そのような蛋白質は、スクリーニング技術および本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイまたはレポーター遺伝子アッセイを用いて単離することができる。蛋白質試料は、蛋白質ライブラリーからスクリーニングし得る。
【０１４９】
Ｅ．ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体と結合するいずれかの蛋白質の融合体
ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体と結合するいずれかの蛋白質の融合蛋白質は、他の蛋白質もしくは他の蛋白質の一部との融合によりより安定化させ得る。安定性を増大させるためのＧＤＦ−８モジュレート物質のモディフィケーションは、それらを低用量でまたは少ない頻度で投与できるため、治療に関して利点がある。少なくとも免疫グロブリン、例えば定常領域、場合により免疫グロブリンのＦｃ断片との融合は、これらの蛋白質の安定性を増大させ得る。そのような融合蛋白質の調製は、当分野で周知であり、容易に実施することができる（例えば、Gerburg Spiekermann (2002) J. Exp. Med., 96:303-310を参照のこと）。
【０１５０】
ＧＤＦ−８プロペプチドＦｃ融合阻害物質（米国特許公報第2003/0104406-A1号により詳しく記載され、その対応部分は出典明示により本明細書の一部とされる）は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域またはその断片と共有結合で連結されたＧＤＦ−８前駆蛋白質のアミノ−末端ドメインから開裂されるポリペプチドを含む。
【０１５１】
ＧＤＦ−８プロペプチドＦｃ融合阻害物質は、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドまたはＧＤＦ−８プロペプチドの変異体と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または低下されたエフェクター機能のためにモディファイされたＩｇＧ１のＦｃ領域とを含む。ＧＤＦ−８プロペプチドは、安定化するモディフィケーションを含んでモディファイされ得る。
【０１５２】
Ｆ．ＧＤＦ−８の潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化の阻害物質
ＧＤＦ−８の潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化の阻害物質は、米国特許公報第2004/0138118 A1号に記載されている（その対応部分は出典明示により本明細書の一部とされる）。特定のプロテアーゼは、遊離している場合または成熟ＧＤＦ−８二量体と会合している場合に、プロペプチドを開裂させて、成熟ＧＤＦ−８二量体に結合できなくせ、その活性を阻害する。このように、プロテアーゼは、小さな潜在的複合体（成熟ＧＤＦ−８と関係し、プロペプチドにより阻害される）を、活性なＧＤＦ−８に変換できる。プロペプチドはひとたび開裂されると、成熟ＧＤＦ−８二量体に結合し、不活性化することができなくなる。ＧＤＦ−８の小さい潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化の阻害物質は、成熟ＧＤＦ−８二量体に対するプロペプチド結合特性を増大させ、ＧＤＦ−８活性を阻害するであろう。これらの阻害物質は、プロテアーゼと拮抗的に結合し、自然な潜在的な複合体を結合することを防ぐか、または、それらも成熟ＧＤＦ−８二量体に結合し、不活性な阻害物質−成熟二量体複合体を形成してもよい。
【０１５３】
金属プロテアーゼは、ＢＭＰ−１／ＴＬＤファミリーの金属プロテーゼに代表され、それらは、少なくとも４個の哺乳類の蛋白質、ＢＭＰ−１（Wozneyら、Science 242:1528-1534, 1988)、哺乳類のTolloid（トロイド）（mTLD；Takaharaら、J.Biol. Chem. 269:32572-32578, 1994）、哺乳類のTolloid様−１（mTLL-1；Takaharaら、Genomics 34:157-165, 1996）および哺乳類のTolloid様−２（mTLL-2；Scottら、Devel. Biol. 213:283-300, 1999）が含まれる（それぞれ、出典明示により本明細書の一部とされる）。
【０１５４】
抗体、核酸およびペプチドに基づく試薬を含む、様々な金属プロテアーゼ阻害物質、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、米国特許公報第2004/0138118 A1号に記載されている（出典明示により本明細書の一部とされる）。ＧＤＦ−８の小さい潜在的プロテアーゼ活性化の阻害物質、例えば金属プロテアーゼ活性を阻害する物質には、あらゆる形式の分子、例えば、ペプチド、ペプチド誘導体、例えばペプチドヒドロキシマートもしくはフォスフィン酸ペプチド、またはペプトイドが含まれてよく、米国特許公報第2004/0138118 A1号（米国特許公報第2005/0043232 A1もまた参照のこと）に記載のスクリーニングアッセイを通じて同定し得る。
【０１５５】
ＧＤＦ−８の小さい潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化を阻害する具体的な物質は、金属プロテアーゼ酵素に対してプロペプチドＧＤＦ−８と競合するペプチドが含まれる。これらのペプチドは、プロペプチドの一部、プロペプチド部分を含む全長のＧＤＦ−８プロペプチドの一部、金属プロテアーゼの開裂部分に突然変異を有するＧＤＦ−８プロペプチド誘導体が含まれ得る。上掲の米国特許公報に記載されるように、１つの実施形態において、ＧＤＦ−８のペプチド部分の誘導体は、ＧＤＦ−８プロペプチドに相当するペプチドである。この実施形態の１つの態様において、ペプチド試薬に関し、誘導体は、金属プロテアーゼが改変された開裂活性を有するよう、開裂部位にもしくはその十分近傍に、突然変異、例えば、アミノ酸置換、欠失、または挿入を有するプロペプチドである。誘導体またはモディファイされたペプチドは、生物学的環境に存在し得るプロテアーゼ、酸化剤、もしくは他の反応性の物質に対する改善された安定性を含み、例えば上記のモディフィケーションを含み得る。
【０１５６】
金属プロテアーゼ酵素に対する阻害性の抗体、ならびに該ペプチドおよび抗体に基づくＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体はまた、本発明に用いることができ、当分野で既知の技術により容易に作製することができる。
【０１５７】
ペプチド試薬は、野生型もしくは変異型のＧＤＦ−８モジュレート物質配列またはその誘導体を含む、約１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸残基長、またはそれ以上の長さであり得る。例えば、Ｐ１部位（金属プロテアーゼ開裂部位のすぐ上流）またはＰ１‘部位（金属プロテアーゼ開列部位のすぐ下流）に１つまたはそれ以上のアミノ酸交換を有するペプチドは変化し得る。あるＧＤＦ−８モジュレート物質において、Ｐ１’部位でのアスパラギン酸のアラニンへの置換（配列番号：２の７６番目に相当する）は、野生型のＧＤＦ−８プロペプチド配列に関する１０、２０、３０、４０および５０アミノ酸長のプロペプチドに含まれる（米国特許公報第2004/0138118 A1）。
【０１５８】
そのようなＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、本明細書で記載するように、レポーター遺伝子アッセイ、ＧＤＦ−８捕捉もしくは競合結合ＥＬＩＳＡにおいて、検出および／または同定することができる。ＧＤＦ−８の潜在的な複合体の金属プロテアーゼ活性化をモジュレートするＧＤＦ−８モジュレート物質を検出し得る例示的な検出試薬は、限定されるものではないが、プロペプチドに基づく試薬、および金属プロテアーゼＢＭＰ−１／ＴＬＤファミリーの１つまたはそれ以上の金属プロテアーゼの基質結合部分を含む金属プロテアーゼ配列と結合する試薬、成熟ＧＤＦ−８蛋白質、またはその一部に対する抗体が含まれ、これらは、競合アッセイに用いることができよう。
【０１５９】
６．ＧＤＦ−８阻害物質の模倣体
本発明の方法に使用されるＧＤＦ−８阻害物質の模倣体は、本明細書に記載される方法により検出することもできる。これらＧＤＦ−８阻害物質の合成類似物、特に、長い半減期を有するか、または分解系により容易に分解され難いよう改良された試験管内の特徴を有するものはいずれも、有用である。
【０１６０】
ＧＤＦ−８に対する抗体、ＧＤＦ−８受容体、モディファイされた可溶性の受容体および受容体融合体に対する抗体、およびＧＤＦ−８、例えば、ＧＤＦ−８プロペプチド、成熟ＧＤＦ−８プロペプチド、フォリスタチンおよびフォリスタチンドメインを含有する蛋白質と結合する他の蛋白質、ならびにそれらのＦｃ融合体の模倣体はすべて、本発明に用いることができる。
【０１６１】
これらの模倣体は、ＧＤＦ−８の活性を阻害する場合、特に、それらが、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合を阻害する場合、本発明において有効であろう。本発明の最も有効な模倣体は、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８／ＧＤＦ−８受容体の複合体と特異的に結合する特徴を有するであろう。そのような模倣体は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８と結合することができ、そして、その成熟蛋白質が単量体型であっても、活性な二量体型であっても、またはＧＤＦ−８の潜在的な複合体にて複合化していても、その成熟蛋白質と結合することができるであろう。本発明の模倣体は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ 結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイにより示されるように、試験管内および生体内でＧＤＦ−８活性を阻害することができる。さらに、開示される模倣体は、骨格筋量および骨密度の負の調節と関係するＧＤＦ−８活性を阻害し得る。
【０１６２】
７．非蛋白質性阻害物質
非蛋白質性阻害物質には、例えば、核酸が含まれる。
Ａ．核酸
用語「非蛋白質性」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味し、要すれば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。この用語は、核酸類似物、および一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含むものであると理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例としては、限定されるものではないが、プラスミドＤＮＡもしくはその断片、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが含まれる。用語「プラスミドＤＮＡ」は、環状の二本鎖ＤＮＡを意味する。本明細書で用いられる「アンチセンス」は、配列の相補性のため、ｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域の一部とハイブリダイズすることができ、それによりｍＲＮＡからの翻訳を干渉する核酸を意味する。用語「ｓｉＲＮＡ」および「ＲＮＡｉ」は、ｍＲＮＡの分解を誘導し、それにより、遺伝子発現を「サイレンシング」する能力を有する二本鎖ＲＮＡである核酸を意味する。典型的には、ｓｉＲＮＡは、１５−５０ヌクレオチド長であり、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。
【０１６３】
ＧＤＦ−８活性を阻害することができる核酸は、例えば、本明細書で提供される方法により検出することができる。そのような阻害物質は、ＧＤＦ−８自体と相互作用する蛋白質をコードし得る。あるいは、そのような阻害物質は、ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）と相互作用することができる蛋白質をコードし、本発明のＧＤＦ−８阻害物質を発現し得る。別法としては、アンチセンス核酸は、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）産生を阻害するために用いることができる。アンチセンス配列は、相補的なコード配列と相互作用して機能を損なわせ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体の産生を阻害するよう作用し得る。
【０１６４】
本発明に使用するための核酸は、例えば、上記のＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイを用いて同定される。ヌクレオチドに基づくＧＤＦ−８モジュレート物質についての検出試薬は、例えば、相補的なヌクレオチドまたは該物質と特異的に結合する抗体が含まれよう。
【０１６５】
本発明の開示内容は、ＧＤＦ−８蛋白質と結合することができるＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することについての好ましい実施例を示すが、他のＧＤＦ−８活性をモジュレートするＧＤＦ−８モジュレート物質は、本発明の方法を用いて検出することができることは認められる。同様に、本発明の開示内容は、診断もしくは治療調製物の生体内投与に関連して、ヒトおよび他の哺乳動物において、ＧＤＦ−８モジュレート物質レベルを検出することおよび／またはモニタすることに関するが、この方法論は、他の応用およびその種のものに使用するために適用できることは認められよう。
【０１６６】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施例を提供する。当業者であれば、本発明の精神または範囲を変えることなく実施することができる、多くの改良および改変が認められよう。そのような改良および改変は、本発明の範囲内に含まれる。実施例は、本発明をいかようにも限定するものではない。
【０１６７】
（実施例）
実施例１
ヒト血清試料中のＭＹＯ−０２９を検出するため、ＥＬＩＳＡを以下のように行った。最初に、ストレプトアビジン被覆用溶液（１００μＬ／ウェル）（０．１Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のイムノピュア・ストレプトアビジン（Pierce）５μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレート（高結合性の平底マイクロタイター）（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９０）のウェルに加えることで、ストレプトアビジンを吸着させた。このプレートを、シール性フィルムで覆い、２〜８℃で一晩インキュベートした。自動のプレート洗浄機を用いて、プレートを、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）（１．０ｍＭグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％ｖ／ｖ／Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（J.T. Baker）を含む、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した。ブロックのため、２００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ）中、１％ウシアルブミン（Sigma）、０．０２％アジ化ナトリウム）を、各ウェルに加えた。プレートを、シール性フィルムで覆い、室温で１〜２時間インキュベートした後、上記のように洗浄した。ビオチン化ＧＤＦ−８溶液（ビオチン：ＧＤＦ−８のモル比、０：１から３：１の間）（１００μＬ／ウェル）（ＴＨＳＴ緩衝液中、０．５μｇ／ｍＬ）を、プレートのウェルそれぞれに加えた。プレートをシールし、振盪しながら室温で２時間±１５分間インキュベートした。
【０１６８】
ＭＹＯ−０２９の較正標準を、ＴＨＳＴ緩衝液中に９０．０、６０．０、４０．０、２６．７、１７．８、１１．９、７．９０、５．２７および３．５１ｎｇ／ｍＬで調製した。ＭＹＯ−０２９の実際に使用する較正溶液は、正常なヒト血清（Bioreclamation, Inc.）中、１０８０ｎｇ／ｍＬ ＭＹＯ−０２９にて調製した。最初に、１０８０ｎｇ／ｍＬの保存液を、アッセイ緩衝液（ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳）に８倍に希釈し、次に、得られた１３５ｎｇ／ｍＬの標準液の１．５倍希釈系列を、ＴＨＳＴ＋４％脱脂粉乳＋１２．５％正常ヒト血清で調製し、較正標準濃度を得た。３．５１ｎｇ／ｍＬ〜１３５ｎｇ／ｍＬの範囲に及ぶよう調製されたＭＹＯ−０２９較正標準は、１００％ヒト血清中２８．１から１０８０ｎｇ／ｍＬに等しい。ヒト血清について、決定された最小希釈比は１：８であった。ＭＹＯ−０２９の品質管理基準は、ＴＨＳＴ＋４％脱脂粉乳＋１２．５％正常ヒト血清中、１３５、２７０および５４０ｎｇ／ｍＬで二重に別々に調製した。
【０１６９】
試験試料を、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳を用いて８倍に希釈した（４０μＬの試料と２８０μＬの緩衝液）。８倍より高い希釈物は、最初に、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳に１：８で希釈し、次に、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳＋１２．５％ヒト血清でさらに希釈した。
【０１７０】
固定化されたビオチン化ＧＤＦ−８を含むプレートを、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した。ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳＋１２．５％正常ヒト血清（１００μＬ／ウェル）の二重ブランクおよび二重の品質管理試料（１００μＬ／ウェル）を含み、較正標準（上記）を、プレートに二重に加えた（１００μＬ／ウェル）。試験試料（１００μＬ／ウェル）を、残りのプレートのウェルに二重に加えた。
【０１７１】
プレートをシール性フィルムで覆い、プレート振盪器上、室温で２時間±１０分間インキュベートした。結合していない蛋白質を取り除くため、プレートを、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した。
【０１７２】
マウス抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ溶液（１００μＬ／ウェル）（Southern Biotechnology Associates, Inc.）を、各バッチで決定された実際に使用される希釈率で加えた。例えば、ＴＨＳＴ中、検出試薬１：６０，０００希釈が、ある抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰロットに関しては最適であった。プレートを、プレート振盪器上、室温で１時間±１０分間インキュベートし、次いで、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した
【０１７３】
固定化された検出試薬を検出するため、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（１００μＬ／ウェル）（BioFX Laboratories）を、プレートの各ウェルに加えた。プレートを、暗所、室温で、約９〜１２分間インキュベートし、次に、０．１８Ｍ 硫酸（１００μＬ／ウェル）を、基質の添加と同じ順序でプレートの各ウェルに加えた。光学密度は、波長４５０ｎｍで記録した。
【０１７４】
品質管理および試験試料濃度は、ドラッグ・メタボリズム・ラボラトリー・マネージメント・システム（Drug Metabolism Laboratory Information Management System）(Watson)、バージョン7.0.1.を使用し、４−変数ロジスティック関数を用いてフィットし、標準曲線からの補完により決定した。試料濃度は、以下の式：
【化１】
［式中、ｙ＝シグナル（ＯＤ）；ｘ＝濃度；ａ＝濃度ゼロでのシグナル；ｄ＝無限濃度のシグナル；ｃ＝ａとｄとの間の、およその中間点のシグナルとなる濃度；ｂ＝ｃでの、もしくはｃ付近の傾き］を用いて決定した。品質管理曲線および標準曲線の例示的なデータを、表１に示す。これらのデータでは、試料濃度は、高Ｑ１，２の平均についてはｙ＝１．８２７；ｘ＝６７．８１８６；ａ＝０．１０１８０５；ｄ＝３．７４１３３；ｃ＝７２．８４４５；ｂ＝１．４５５１２を用いて計算された。
【０１７５】
希釈要素を記入し、試験試料の最終濃度を決定した。較正標準の分散（ＣＶ）は、１２．５％ヒト血清中、７．９０−９０．０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたって７．５％かもしくはそれ以下であり、外因性のＭＹＯ−０２９の定量分析の場合、１００％ヒト血清中、約７２０〜６０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７６】
マウス、ラット、サルおよびラビット血清試料を含む、ヒト以外の血清試料については、わずかな変更を加えてアッセイを行った。これらのデータは、複数のバックグラウンドマトリックス中でのＭＹＯ−０２９の免疫学的検定の感受性および特異性を示す。ヒト、マウス、ラット、サルおよびラビットの実用的な血清希釈レベルは、少なくとも１：８、１：４、１：４、１：８および１：４のそれぞれで決定した。
【表２】
【０１７７】
実施例２
希釈の直線性：本方法の希釈の直線性を、ＭＹＯ−０２９をスパイクしたヒト血清試料を１１個の異なる希釈物を分析することにより評価した。最初に、５４０００ｎｇ／ｍＬの試料を、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳で１：８に希釈し、続いて、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳＋１２．５％ヒト血清にて連続希釈（１：２）した。希釈は、アッセイ範囲以上、範囲内、範囲以下で行った。希釈の偏りは、アッセイの定量範囲、９．７％〜０．４％内にある試料の偏りを用いて決定した。偏りに傾向は見られなかった。観察された濃度は、期待されたものよりも小さく、阻止帯（ポロゾーン）効果の証拠はなかった。
【０１７８】
特異性：試料マトリクス（または、マトリクス効果）による潜在的な非特異的な干渉を、１０個の異なるヒト血清ロット（個々のドナー）を用い、ＭＹＯ−０２９のスパイク濃度０、１３５、および５４０ｎｇ／ｍＬでのスパイク／回復実験により調べた。内因性ミオスタチン（ＧＤＦ−８）による干渉は、０、１、２、１０および１０００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を、ＭＹＯ−０２９（１３２、２６５、および５２９ｎｇ／ｍＬ）を含む確認試料にスパイクすることで評価した。内因性のＧＤＦ−８のレベルは、１ｎｇ／ｍＬよりも低いと考えられる。ＭＹＯ−０２９をスパイクした、またしていない個々の血清試料についての結果は、表２に示す。スパイク濃度、５４０ｎｇ／ｍＬでは、１０個の血清中９個が、期待された濃度の２０％以内の平均観察濃度を示した。１番の血清の再分析で、その値は、期待された濃度の１５％以内であった。スパイク濃度、１３５ｎｇ／ｍＬでは、１０個の血清中８個は、期待された濃度の２０％以内の平均観察濃度を示した。３番の血清の再分析で、その値は、期待された濃度の１５％以内であった。１番の血清で観察された高いパーセントの偏りは、再分析により、その値は期待される濃度の２０％より大きいままであることが確認された。ＭＹＯ−０２９を加えない場合、１０個の血清全てで、ＭＹＯ−０２９の観察濃度は計測の検出限界以下であった（すなわち、１００％ヒト血清中、６３．２ｎｇ／ｍＬ未満）。データは、有意なマトリックス効果がないことを示す。
【表３】
【０１７９】
さらに、ＧＤＦ−８存在下でのＭＹＯ−０２９の回復の結果は二重に行い、定量した。ＭＹＯ−０２９を検出するＥＬＩＳＡの技能の影響は、ＭＹＯ−０２９試料を０、１、２もしくは１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８と共にインキュベートした場合、観察されなかった。観察された濃度は、期待された値の２０％以内にあった。ＭＹＯ−０２９試料を、１０００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８と共にインキュベートした場合、ＭＹＯ−０２９の観察される濃度は、期待される濃度の４０％であった（偏り）。しかしながら、ＧＤＦ−８は＜１ｎｇ／ｍＬで存在し得るため、このデータは、循環ＧＤＦ−８がアッセイの感度を乱すものではないことを示す。２ｍｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９をラットに皮下投与する実験では、ＭＹＯ−０２９は、以下のように検出され、定量された。
【表４】
【０１８０】
この実験では、以下の曲線変数を得た：最小値＝０．１１７１９５；最大値＝３．７３０７９；傾き＝１．５３１２６；Ｅｄ５０＝５８．７１３３；およびＲ−二乗＝９９８８。
【０１８１】
実施例３
ＧＤＦ−８は、次のようにビオチン化した。全長のＧＤＦ−８を、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体型を与える、フェドバッチＣＨＯ細胞培養生物反応器プロセスで発現させた。この細胞培養液回収物は、通常のフロー微視孔濾過を用いて不純物を取り除き、次に、濃縮して接線流（tangential flow）限外ろ過を用いて通過ろ過（diafilter）した。保持液のプールを、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ固定化された金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に通じ、そこにＧＤＦＦ−８複合体を補足させた。溶出は、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０−５００ｍＭ イミダゾール線形勾配を５カラム容量で行った。次に、得られたピークを、透析により緩衝液−交換を行い、ＩＭＡＣ−によるイミダゾールを取り除き、ビオチン化反応のための適当な緩衝液に置換した。
【０１８２】
次に、潜在的な複合体調製物をビオチン化した。反応には、標的スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのＧＤＦ−８複合体に対するモル比は１４：１を用いた。試薬の基質に対する割合は、１０：１、１５：１および２０：１もまた試した。例えば、固体ビオチン試薬（ＥＺ−リンク・スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、Pierce Biotechnology）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２００ｇ／Ｌで溶解した後、それをＧＤＦ−８複合体試料に加えた。反応は、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中、１．５ｇ／Ｌよりも低いＧＤＦ−８複合体濃度を用い、４℃で１２０分間行った。この反応混合物を、反応の開始時に穏やかに混合し、反応の間、光を遮断した。この反応は、０．５％（ｖ／ｖ）エタノールアミンまたは５．０％（ｖ／ｖ）１０００ｍＭ トリスを加えることにより停止させた。
【０１８３】
次に、このビオチン化ＧＤＦ−８複合体を、透析により緩衝液交換して、低ｐＨ、高カオトロピック濃度の緩衝液（６０００ｍＭ ウレア、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ＝２．５）にした。複合体の解離は、低ｐＨでのプロトン化により生じる。この緩衝液中で、複合体を、プロペプチドおよび成熟した二量体に解離し、可溶化する。また、遊離ビオチンも透析の間に取り除かれる。次に、保持液のプールを、高速サイズ排除クロマトグラフィーにかけ、ＧＤＦ−８の成熟二量体型を、プロペプチドおよび残存する単量体から分離した。
【０１８４】
ビオチン化されたＧＤＦ−８の成熟二量体型を含む画分を、０〜９０％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ＝２．０を用いた５カラム容量での線形勾配によるブチル高速逆相クロマトグラフィーでさらに処理した。この工程のピークを、透析して緩衝液交換し、低ｐＨフォーミュレーション緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ＝２．０）とした。
【０１８５】
ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８二量体は、機能、例えばその活性の維持について、結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイで評価された。ビオチン化成熟ＧＤＦ−８蛋白質はまた、逆相高速液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化四極子飛行時間型質量分析法（ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）により測定され、その調製物は、約０−３のモル比の、大部分の分子は１：１の混合物を含んだ。当業者に周知の条件調節により、高い標的モル比は９：１と高い測定結果を示した。
【０１８６】
ＭＹＯ−０２９は、同様のアッセイを用いてビオチン化され、本明細書に記載の方法に用いることができる。重要なことは、単離されたＭＹＯ−０２９を希釈し、緩衝液交換した後、ビオチン化することである。反応条件および保存条件は、２、３個のパラメータを除き、ＧＤＦ−８の場合と同じである。ＭＹＯ−０２９の濃度値は、１０〜２４ｇ／Ｌの範囲にある。ビオチン化反応における標的スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce）のＭＹＯ−０２９に対するモル比は、４０：１であり、測定されるモル比は、８−１１であった。これは、アビジン：ＨＡＢＡ Ａ６００ｎｍ分光アッセイ（イムノピュアアビジンおよびHABA, Pierce）により測定される。次に、透析を用いて、この試薬を緩衝液交換し低塩濃度、通常のｐＨフォーミュレーション緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２）にした。
【０１８７】
実施例４
本明細書で提供される方法の１つの実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、競合結合ＥＬＩＳＡを用いて検出される。このアッセイはでは、ＧＤＦ−８のＡｃｔＲＩＩＢ（または他のＧＤＦ−８結合パートナー、例えばＧＤＦ−８受容体）に対する結合を阻害する物質が、同定および定量される。このアッセイには、捕捉物質としてのＧＤＦ−８パートナーを表面に接触させる工程、生体試料の存在下および不在下でＧＤＦ−８を加える工程、および複合体形成を検出する工程を含む。
【０１８８】
ある実施形態において、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体は、２０分子のＥＺ−リンク・スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Pierce）に対して１分子のＧＤＦ−８の割合で、氷上で２時間ビオチン化した。この反応は、０．５％ＴＦＡを用いてｐＨを下げることにより停止させ、複合体を、Ｃ４ジュピター（Jupiter）２５０×４．６ｍｍカラム（Phenomenex）を用いたクロマトグラフィーにかけ、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配を用いて溶出したビオチン化成熟ＧＤＦ−８画分を集め、濃縮し、そしてマイクロＢＣＡプロテインアッセイ・リージェントキット（Pierce）により定量した。
【０１８９】
組み換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（R＆D Systems）を、９６ウェル平底アッセイプレート（Costar）に、０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍＬで４℃、一晩かけて被覆させた。次に、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従って、プレートを、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを用いてブロッキングし、洗浄した。ＧＤＦ−８阻害物質（例えば、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの濃度範囲）を含むもしくは含まない、種々の濃度（例えば、１０ｎｇ／ｍＬ）のビオチン化ＧＤＦ−８の一部、１００μｌを、ブロックしたＥＬＩＳＡプレオートに加え、１時間インキュベートして、洗浄し、そして結合したＧＤＦ−８の量を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP, BD PharMingen）に続いて、ＴＭＢ（KPL, Gaithersburg, MD、カタログ番号５０−７６−０４）を添加して検出した。測色測定は、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍで行うことができる。
【０１９０】
実施例５ レポーター遺伝子アッセイ
ＧＤＦ−８の生物活性に関し、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）で検出される。
ヒト横紋筋肉腫細胞系Ａ２０４を用い、そのＡ２０４（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を、周知の技術を用いて、レポーター遺伝子構築物、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（米国特許公報第2003/0138422 A1号および第2004/0142382 A1号に記載される）を安定にトランスフェクトした。あるいは、Ａ２０４細胞を、ＦｕＧＥＮＥ．ＴＭ．６トランスフェクション試薬(Boehringer Manheim, Germany）を用いて、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションに続き、細胞を９６ウェルプレート中、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１０％ウシ胎児血清を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地で１６時間培養した。細胞を、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリンおよび１０％ウシ胎児血清を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、一定量（７５ｎｇ／ｍＬ）の成熟ＧＤＦ−８蛋白質を用いて、または用いずに、また対照については３７℃で６時間、陽性対照希釈系列で処理した。場合により、ＧＤＦ−８の量は、ルシフェラーゼシグナルの最大の約８０％が得られる量が選択される。ＭＹＯ−０２９をＧＤＦ−８と共に室温で１時間予めインキュベートし、次に、その蛋白質をＲＧＡに加えた。ＭＹＯ−０２９は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の陽性対照滴定を生じるよう、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の濃度でアッセイした。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega）を用いて、標的細胞で定量した。このアッセイで、７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８は、８０％の活性化を示したが、４００ｎｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９は、レポーター遺伝子構築物の８０％の阻害を示した。
【０１９１】
併発反応について、細胞は、７５ｎｇ／ｍＬの成熟ＧＤＦ−８を用いる、また用いない、および試験生体試料を用いる、また用いずに処理した。ヒト血清は、ＭＹＯ−０２９処置を受けている個体から得て、緩衝液中で１：５、１：１０、１：１５、１：２０および１：４０に希釈した。１：１０よりも低い希釈に関しては、試験試料血清をさらに１０％ヒト血清（Bioreclamation, Inc.）を含む緩衝液で希釈した。
【０１９２】
実施例６：ＭＹＯ−０２９に対する抗体
ＭＹＯ−０２９の抗原結合部位に対する抗体を含む、ＭＹＯ−０２９に対する中和抗体は、以下のように作製した：ラビットを、完全なＭＹＯ−０２９またはＭＹＯ−０２９結合部位を含むＭＹＯ−０２９蛋白質部分のいずれかを用いて免疫した。ヒト抗体の定常領域に対するラビットの強い免疫応答の発生を防ぐため、蛋白質分解消化を行わせてＭＹＯ−０２９抗体のＦｃ部分を取り除いた。２匹のラビットを、完全ＭＹＯ−０２９もしくは消化されたＭＹＯ−０２９のいずれかを用いて免疫した。出血液を、リガンド結合アッセイを用いて、中和活性について試験した。この手順により、中和抗体を産生した。４匹の動物は、すべて優れた抗体力価の結果を示し、陽性対照ラビット血清は、４匹の動物すべてから出血液を集めて産生した。
【０１９３】
本開示内容において言及される、全ての刊行物、特許および生物配列は、完全に出典明示により一部とされる。その範囲で、出典明示により一部とされる物質が、本明細書に反するか、または不一致であれば、本明細書が、そのような物質のいずれについても代わって適用されよう。本明細書中で引用されるいかなる引例も、本発明の先行技術と認めるものではない。
【０１９４】
特に示さない限り、成分量、細胞培養、処置条件、および特許請求の範囲を含む、詳細な説明中に用いられるその他の記載を表す全ての数字は、用語「約」により、あらゆる事例で変更されるものと理解されるべきである。従って、そうではないと特に記載しない限り、数に関するパラメータは、およそのものであり、本発明により得られると考えられる所望の特徴に応じて変更し得る。特に記載しない限り、一連の要素に付随する、用語「少なくとも」は、一連の要素それぞれを言及すると理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態と均等なものを、一般以上の実験を要することなく、認められるであろうし、または認めることができる。そのような均等物は、添付する特許請求の範囲に包含されるものである。
【０１９５】
詳細な説明中の実施例は、本発明の実施の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。当業者であれば、多くの他の実施形態が本発明に包含されることは容易に認められる。本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の詳細および実施を考慮することで認められよう。詳細な説明および実施例は、添付の特許請求の範囲で示される発明の本来的な範囲および意図の単なる例と考えられるものである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月２３日に出願された米国仮出願番号第60/664,400号の利益を主張し、その内容は出典明示により完全に本明細書の一部とされる。
本発明はＧＤＦ−８モジュレート物質の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオスタチンとしても知られる、増殖・分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、骨格筋量の負の調節因子である分泌蛋白質である。ＧＤＦ−８の阻害剤は、筋成長を増進するため、骨格筋減少症、悪液質および筋ジストロフィーを含む様々な状態の処置に潜在的な利益をもたらす。
【０００３】
ＧＤＦ−８は、構造的に関係する成長因子であるトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの一員である。このスーパーファミリーのメンバーは、生理学的に重要な成長−調節および形態形成の特徴を有する（Kingsleyら、Genes Dev. 8:133-146 (1994)；Hoodlessら、Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-272 (1998))。同様に、これらは共通の構造構成を共有しており、分泌のための短ペプチドシグナルおよび非常に保存された蛋白質分解の開裂部位により生物活性のあるカルボキシ−末端部分から分離されるアミノ−末端部分を含む。
【０００４】
ヒトＧＤＦ−８は、アミノ−末端プロペプチド部分とカルボキシ−末端の成熟部分を含む、３７５個のアミノ酸からなる前駆蛋白質として合成される。プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８からＡｒｇ−２６６で切り離される。成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、ジスルフィド結合されたホモ二量体として活性を有する。蛋白質分解過程に続いて、２つのＧＤＦ−８プロペプチドは、ＧＤＦ−８の成熟ドメイン二量体と非共有結合で複合体形成し、潜在的に不活性な状態でＧＤＦ−８を維持すると考えられる（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:9306-9311 (2001）；Thiesら、Growth Factors 18:251-259 (2001)）。他の蛋白質もまた、成熟ＧＤＦ−８と結合し、その生物活性を阻害することが知られている。このような阻害性の蛋白質には、フォリスタチンおよびＧＡＳＰ−１を含むフォリスタチン関連蛋白質が含まれる（Gamerら、Dev. Biol. 208:222-232 (1999)）；米国特許公報第2003-0180306-A1号；米国特許公報第2003-0162714-A1号）。
【０００５】
様々な種から推定されるアミノ酸配列のアライメントは、ＧＤＦ−８が進化を通じて非常に保存されていることを示す（McPherronら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461 (1997)）。実際に、ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリのＧＤＦ−８配列は、そのカルボキシ−末端領域で１００％一致し、また、ヒヒ、ウシ、およびヒツジにおいては、この領域はわずかに３アミノ酸異なるのみである。ゼブラフィッシュのＧＤＦ−８は、より以前から分岐しているが、そのカルボキシ−末端領域はヒト配列と８８％も一致する。
【０００６】
ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子であるため、ＧＤＦ−８の生物活性を調節する因子を包含する治療方法を究明し開発することは、大きな関心事である。例えば、ＧＤＦ−８遺伝子に変異を有するマウスおよび畜牛は、体重と筋量に顕著な増加が見られる（McPherronら、Nature 387:83-90 (1997）；Zhuら、FEBS Letters 474:71-75 (2000）；Grobetら、Nature Genet. 17:71-74 (1997)）。マウスモノクローナルＧＤＦ−８モジュレート抗体の投与は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のｍｄｘマウスモデルにおいて、筋肉変性および血清中クレアチンキナーゼ濃度を低下させる一方で、ｍｄｘマウスの体重、筋量、筋サイズおよび絶対的な筋力を増大させる（Bodanovichら、Nature 420:418-421 (2002)）。さらに、ＧＤＦ−８の薬理学的阻害は、生体のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、筋サイズおよび握力の増大をもたらす（Whittemoreら、BBRC 300:965-971 (2003)）。
【０００７】
多くの重大な生物過程を調節するその重要な機能により、ＧＤＦ−８は、多くの障害の治療介入の望ましい標的である。ＧＤＦ−８活性を阻害する治療物質は、筋組織の増加が治療上有利となるであろうヒトまたは動物の障害を処置するために用いることがでるであろうし、ＧＤＦ−８活性をモジュレートする物質は、脂肪組織、グルコース恒常性または骨低下と関連する障害を処置するのに用いることができるであろう。さらに、正常な個体に投与されたＧＤＦ−８阻害剤は、例えば、その個体の筋量を増加させるであろう。
【０００８】
１つのＧＤＦ−８阻害物質は、完全なヒト抗体のＭＹＯ−０２９であり、これは、米国特許公報第2004-0142382号にさらに詳しく記載されている。ＭＹＯ−０２９は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８を結合して、試験管内（インビトロ）および生体内（インビボ）でＧＤＦ−８活性を阻害することができ、そして、骨格筋量の負の調節因子と関係するＧＤＦ−８活性を阻害することができる。ＭＹＯ−０２９をマウスに投与した場合、増加する筋量を促進する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＧＤＦ−８モジュレート物質は、種々の治療への応用に有用であり、かくして、個体の生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出および／または定量する方法が望まれる。ヒト血清中の治療上のＧＤＦ−８モジュレート物質レベルの測定は、治療上重要である。このような方法は、例えば、治療の進行を追跡すること、試薬の薬物動力学もしくは生物学的利用能を評価すること、個体の生体試料中の試薬のレベルを測定すること、および／またはＧＤＦ−８活性をモジュレートする試薬の投与を検出することを可能にする。
【００１０】
さらに、治療に応用するために開発されたＧＤＦ−８活性の阻害剤が筋量を増加させるために、運動性の向上を目的とした乱用の標的となり得る。治療以外の目的でのＧＤＦ−８モジュレート物質の違法な使用の危険性は、この薬物が治療として利用できるようになるほど高まる。個体の運動能力を向上させるために、または家畜動物の成長速度もしくは食材としての特徴を向上させるために投与される薬物は、多くの場合、規制および／または禁止される。従って、適法な医薬適用性のあるＧＤＦ−８モジュレート物質の乱用を検出する能力は、ますます重要になる。従って、運動による、または食材としての動物におけるＧＤＦ−８阻害物質の使用を検出するための方法、例えば、個体におけるＧＤＦ−８モジュレート物質の使用をモニタする方法を開発することが望まれる。
【００１１】
ＧＤＦ−８モジュレート物質、ＭＹＯ−０２９の事前の薬物動力学研究には、ＭＹＯ−０２９抗体に放射性同位体、１２５Ｉを直接標識化することが含まれる。しかしながら、直接検出は、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与される個体に潜在的に危険性もしくは毒性のある物質を導入する可能性があり得るので、扱いにくく、また不都合である（米国特許公報第2004/0142382-A1号）。生体試料中でＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する改良方法が必要である。
【００１２】
従って、ＧＤＦ−８モジュレート物質の治療をモニタし、もしくは評価し、または乱用を検出するため、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出するアッセイおよび方法、並びに、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質をモニタおよび／または定量する方法を開発することは重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性をモジュレートすることができる、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法を、本明細書に記載する。具体的には、生体試料中のＧＤＦ−８阻害物質を検出するための方法を提供する。これらの方法は、複雑な生体試料、例えば、血清、血液、血漿または尿などにおける、低レベルのＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する。本方法は、種々のＧＤＦ−８物質を検出するのに用いることができ、例えば、無症候性の、症候性のまたは健康な個体に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１つの実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は：（ａ）試験されるべき個体からの生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；（ｂ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および（ｃ）生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、試験管内のアッセイは、（ａ）成熟したＧＤＦ−８蛋白質二量体であるＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体試料を、反応容器に加える工程；（ｃ）検出試薬を加える工程；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む。１つの実施形態において、ＧＤＦ−８蛋白質は、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して表面と接触する。さらなる実施形態において、ＧＤＦ−８はリジン残基でビオチン化され、そのビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約５：１より小さく、および／またはビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から約４：１の間にある。本方法の他の実施形態において、ＧＤＦ−８蛋白質を加える前に、アビジンまたはストレプトアビジンが、反応容器の表面に吸着される。
【００１６】
さらなる実施形態において、試験管内アッセイは、（ａ）可溶性のＧＤＦ−８受容体を、反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体試料を、反応容器に添加する工程；（ｃ）標識化ＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器に加える工程；および（ｄ）生体試料の存在下と不在下の表面と会合した標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量を検出し、生体試料の存在下での標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量における減少により、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む。１つの実施形態において、本方法は、反応容器に試料を加える前に、標識化ＧＤＦ−８蛋白質と共に生体試料をインキュベートする工程をさらに含む。
【００１７】
さらなる付加的な実施形態において、本方法は、（ａ）ＧＤＦ−８−応答調節因子およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞を、反応容器に供する工程；（ｂ）生体試料を反応容器に加える工程；および（ｃ）生体試料の存在下および不在下で、細胞内でレポーター遺伝子の発現を検出し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む、細胞に基づく試験管内レポーター遺伝子アッセイを包含する。
【００１８】
ある実施形態において、本方法は、個体からの生体試料によるＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、それぞれが既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより定量して、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量することさらに含む。他の好ましい実施形態において、生体試料は、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの試料を含む。他の実施形態において、生体試料は、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液、または粘液から選択される。
【００１９】
本明細書で提供される方法は、例えば：ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体；ＧＤＦ−８受容体；ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質；フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質；フォリスタチン蛋白質；ＧＡＳＰ−１蛋白質；ＧＤＦ−８蛋白質；ＧＤＦ−８プロペプチド；非−蛋白質阻害物質（proteinacious inhibitor）；または小分子から選択されるＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いることができる。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８阻害物質である。他の実施形態において、該物質は、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する抗体である。１つの好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８と特異的に結合するヒト中和抗体、ＭＹＯ−０２９である。
【００２０】
さらなる実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。本方法の好ましい実施形態において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して表面と接触する。さらなる実施形態において、ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約５：１より小さいか、またはビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から約４：１の間である。
【００２１】
ＧＤＦ−８モジュレート物質、例えばＧＤＦ−８阻害剤は、本明細書で提示される方法により検出することができ、それらはまた、本発明の方法に用いることもできる。従って、幾つかの実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８阻害物質である。ある実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体または標識化ＧＤＦ−８蛋白質から選択される。さらなる実施形態において、検出試薬は、ヒトの免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合する抗体である。
【００２２】
他の実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質から選択される捕捉物質を、反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。
【００２３】
さらに、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）ＧＤＦ−８受容体を、少なくとも第一および第二の反応容器と接触させること；（ｂ）生体試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、第一の反応容器に加えること；（ｃ）対照試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、第二の反応容器に加えること；（ｄ）検出標識を、第一および第二の反応容器に加えること；および（ｅ）第一の反応容器中の検出可能な標識信号を第二の反応容器中の信号と比較し、それにより生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。
【００２４】
別の実施形態において、ヒト生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供される。この実施形態は、（ａ）生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；（ｂ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および（ｃ）候補体からの試験生体試料の存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、（ａ）５：１より小さいビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する平均の比を有する、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８蛋白質の二量体を、反応容器の表面に接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）ヒト免疫グロブリンと特異的に結合する標識化抗体を、反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＭＹＯ−０２９／ビオチン化ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＭＹＯ−０２９を検出することを含む、生体試料中のＭＹＯ−０２９を検出するための方法が記載される。
【００２６】
本発明のさらなる対象および利点を、以下の詳細な説明部分に記載し、それにより幾分、本発明は明確になるであろう、または本発明の実地により理解することがでよう。本発明の対象および利点は、添付する請求の範囲に特に指摘される要素および組み合わせにより、理解され、達成することができよう。
【００２７】
上記の要約おｙび以下の詳しい記載は、特許請求する本発明を制限するものではない。
【００２８】
（配列の簡単な説明）
ＧＤＦ−８、ＭＹＯ−０２９および関連するｓｃＦｖ断片、ＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）のＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列を、配列表に記載し、表１に一覧として列挙する。
【表１】
【００２９】
（詳しい記載）
本発明は、ヒトを含む動物においてＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法に関し、この方法は、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性をモジュレーションすることによるいくつかの利益をもたらす。外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、ＧＤＦ−８阻害物質の存在を検出する方法が、本明細書で提供される。特に、ＧＤＦ−８阻害物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの生体試料中のＧＤＦ−８阻害物質の存在および／または量を評価する方法が提供される。
【００３０】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が個体に投与された場合、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、生体試料中のその物質の存在および／または量を決定するのに有用である。この方法はまた、例えば、治療計画を評価するのに、試薬の投薬量を調整するのに、または試薬の薬物動力学または生物学的利用能を評価することを可能にし得る。
【００３１】
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳しい説明を通じて記載する。
【００３２】
用語「ＧＤＦ−８」は、特異的な成長・分化因子−８を意味する。この用語は、全長で未処理のＧＤＦ−８である前駆体型、並びに翻訳後の切断により生じる成熟型およびプロペプチド型を示す。「不活性」と特に記載しない限り、「ＧＤＦ−８蛋白質」は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８の生物活性を保持する。この用語はまた、本明細書で論じられるように、改変された配列を含む、成熟ＧＤＦ−８と関係する少なくとも１つの生物活性を保持するＧＤＦ−８の断片および変異型のすべてを意味する。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は、配列番号：１で示され、その前駆体の全長ヒトＧＤＦ−８配列は、配列番号：２で示される。本発明は、限定されるものではないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、七面鳥、ヒヒ、およびサカナを含む全ての脊椎動物種のＧＤＦ−８に関する（配列情報に関しては、例えば、McPherronら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461 (1997)を参照のこと）。
【００３３】
用語「成熟ＧＤＦ−８」は、ＧＤＦ−８前駆蛋白質のカルボキシ−末端部分を意味する。条件に応じて、成熟ＧＤＦ−８は、例えば、単量体、ホモ二量体および／またはＧＤＦ−８の潜在的な複合体として存在し得る。生物学的な活性型の成熟ＧＤＦ−８は、「活性ＧＤＦ−８」とも称される。この用語はまた、本明細書で論じられるように、成熟ＧＤＦ−８と関係する少なくとも１つの生物活性を保持するＧＤＦ−８の断片および改変された配列を含む変異型のすべてを意味する。
【００３４】
用語「ＧＤＦ−８プロペプチド」は、ＧＤＦ−８前駆蛋白質のアミノ−末端部分を意味する。このＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８上のプロペプチド結合ドメインと結合し得る。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体と複合体を形成する。２つのＧＤＦ−８プロペプチドが、ホモ二量体の成熟ＧＤＦ−８の２分子と会合し、潜在的な複合体と称される、不活性な四量体の複合体を形成すると考えられる。この潜在的な複合体は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８プロペプチドに換えて、または加えて他のＧＤＦ阻害物質を含んでいてもよい。
【００３５】
用語「ＧＤＦ−８活性」は、活性ＧＤＦ−８蛋白質と関係する生理学上の成長調節活性または形態形成活性を意味する。例えば、活性ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子である。活性ＧＤＦ−８はまた、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートし、筋芽細胞増殖を刺激し、および前脂肪細胞の脂肪細胞への分化をモジュレートすることもできる。「ＧＤＦ−８活性」には、「ＧＤＦ−８結合活性」が含まる。例えば、成熟ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−８のプロペプチド部分と、ＡｃｔＲＩＩＢと、ＧＤＦ−８受容体と、アクチビンと、フォリスタチンと、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質と、ＧＡＳＰ−１と、および他の蛋白質と特異的に結合する。ＧＤＦ−８阻害物質、例えば抗体もしくはその一部は、１つまたはそれ以上のその結合活性を低下させることができる。生体内および試験管内でＧＤＦ−８活性を測定するための例示的な手順を以下に記載する。
【００３６】
用語「ＧＤＦ−８モジュレート物質」には、ＧＤＦ−８または医薬上許容されるその誘導体の活性、発現、プロセッシングまたは分泌をモジュレートし得るすべての物質が含まれる。１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を増大させる物質、および１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を低下させる物質は、この用語に包含される。用語「ＧＤＦ−８阻害物質」には、ＧＤＦ−８または医薬上許容されるその誘導体の活性、発現、プロセッシングまたは分泌に影響を及ぼすことができるすべての物質が含まれる。ＧＤＦ−８阻害物質は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性と関係する活性を低下させる。ある実施形態において、ＧＤＦ−８阻害物質は、限定されるものではないが、受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質（例えば、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＧＡＳＰ−１、ＧＡＳＰ−２）またはＧＤＦ−８プロペプチドおよびその変異体や誘導体などのＧＤＦ−８蛋白質を含む、１つまたはそれ以上のその生理学的な結合パートナーに対するＧＤＦ−８の結合に影響を及ぼし得る。そのようなＧＤＦ−８阻害物質には、例えば、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、ＪＡ−１６ならびにその断片および誘導体を含む）、ＧＤＦ−８受容体と特異的に結合する抗体、モジュレートされた可溶性の受容体（受容体融合蛋白質、例えばＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合体を含む）、またはＧＤＦ−８と特異的に結合する他の蛋白質（例えば、ＧＤＦ−８プロペプチド、ＧＤＦ−８プロペプチドの変異体および誘導体、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質、およびこれらの蛋白質のＦｃ融合体）、ＧＤＦ−８受容体と結合する蛋白質およびこれらの蛋白質のＦｃ融合体、ならびに模倣体が含まれる。非蛋白質性阻害物質（例えば、核酸）もまた、用語ＧＤＦ−８阻害物質に包含される。ＧＤＦ−８阻害物質には、ＧＤＦ−８を特異的に阻害する、蛋白質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、リボザイム、抗−センスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ）および他の小分子が含まれる。そのような阻害物質は、ＧＤＦ−８の生物活性を「阻害」、「低下」または「中和」すると記載され、より詳しくは以下に記載される。
【００３７】
ＧＤＦ−８阻害物質は、少なくとも１つのＧＤＦ−８生物活性、例えば活性ＧＤＦ−８蛋白質に関係する生理学的な、成長調節活性または形態形成活性を「阻害」、「中和」または「低下」させるであろう。例えば、ＧＤＦ−８は、骨格筋成長の負の調節因子である。ＧＤＦ−８阻害物質は、筋量を増加させ、筋力を増大させ、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）のレベルをモジュレートし、筋芽細胞の増殖を刺激し、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化をモジュレートし、脂肪の蓄積を減少させ、血清トリグリセリドレベルを低下させ、血清コレステロールレベルを低下させ、グルコース代謝をモジュレートし、および／または高血糖を減少させることができる。
【００３８】
用語「阻害する」、「阻害」およびその同語源語は、ＧＤＦ−８阻害物質が不在の場合のＧＤＦ−８活性に比べて、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性がＧＤＦ−８阻害物質により低下されることを示す。この活性の低下は、好ましくは少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。ある実施形態において、ＧＤＦ−８の活性は、ここで開示される阻害物質の１つまたはそれ以上から影響を受けて、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％または８８％、より好ましくは、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％から１００％低下される。用語「中和する」、「中和」およびその同語源語は、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％までの１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を低下させることを意味する。ＧＤＦ−８活性の阻害は、例えば、Thiesら、Growth Factors 18:251-259 (2001)において記載されるように、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）または以下で示されるＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイにおいて測定することができる。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原結合部位を有するすべてのポリペプチド、例えば、免疫グロブリンもしくはその断片であり、供給源、生物種、精製方法および特徴に関わらず抗原結合部位を有するすべてのポリペプチドを包含する。非限定的な例として、用語「抗体」は、合成抗体、ヒト、オラウータン、サル、霊長類、マウス、ラット、ヤギ、イヌ、ヒツジおよびニワトリの抗体を含む。この用語には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体、非特異抗体、変異抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、およびＣＤＲグラフト抗体が含まれる。本発明の目的に関し、「抗体」はまた、特に記載しない限り（例えば、「完全な」という語を示した場合）、抗体断片が含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂおよび抗原結合機能を保持する他の抗体断片が含まれる。典型的には、そのような断片は、抗原結合ドメインを含む。当業者には認められるように、そのような分子、例えば「ヒト」抗体はいずれも、その免疫原性を低下させ、その親和力を高め、その特異性を改変し、または他の目的のため作り出すことができる（例えば、生殖細胞系）。
【００４０】
抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature 256:495-499 (1975)）、組み換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、または抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ技術（Clacksonら、Nature 352:624-628 (1991）；Marksら、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)）を介して作製することができる。他の様々な抗体産生技術については、Antibody Engineering（Borrebaeckら、Oxford University Press 1995)およびAntibodies：A Laboratory Manual（Harlowら、編、Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）を参照のこと。
【００４１】
用語「抗原−結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合する領域または抗原の一部もしくは全部に補完的な領域を含む、抗体分子の一部分を意味する。抗原が大きい場合、抗体は、その抗原の特定の部分とのみ結合することができる。「エピトープ」または「抗原決定基」は抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用に関係する抗原分子の一部である。抗原結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体の可変領域により提供され得る（例えば、ＶＨドメインを含むＦｄ抗体断片）。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（米国特許第5,565,332号明細書）。
【００４２】
用語「特異的な結合」、「特異的に結合する」またはその類似語は、２つまたはそれ以上の分子が、生理学的な条件もしくはアッセイ条件下で測定でき、そして選択的な複合体を形成することを意味する。抗体または他の阻害物質は、結合が実質的に阻害されず、一方で非特異的な結合が阻害されるような適当な選択条件下にある場合、ある蛋白質に「特異的に結合する」ことを示す。特異的な結合は、比較的高い親和力により特徴付けられ、化合物または蛋白質に選択的であり得る。非特異的な結合は、通常、低い親和力である。典型的に、結合は、その親和性定数Ｋａが少なくとも約１０６Ｍ−１、または好ましくは少なくとも約１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１である場合、特異的と考えられる。特定の方法は、特異的な結合のために高親和力を要求するが、他の方法、例えば表面プラズモン共鳴アッセイは、安定な複合体とならない、低親和力相互作用も検出することができる。必要に応じて、非特異的な結合は、結合条件を変えることにより、特異的な結合に実質的に影響を及ぼすことなく低下させることができる。そのよな条件は、当業者に周知であり、当業者は慣用技術を用い、適当な条件を選び出すことができる。通常、その条件は、結合パートナーの濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、無関係の分子（例えば、浄化剤、界面活性剤、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して定められる。例示的な結合条件を以下に記載する。
【００４３】
用語「単離された」は、その天然の環境から実質的に切り離された分子を意味する。例えば、単離された蛋白質は、細胞物質または誘導された細胞もしくは組織供給源に由来する他の蛋白質を実質的に含まない。この用語は、単離された蛋白質が、治療組成物として投与されるのに十分に純粋、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは９０−９５％純粋；そして、最も好ましくは，少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋な調製物を意味する。
【００４４】
用語「個体」は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類または魚類を含む、すべての脊椎動物を意味する。用語、哺乳類には、ヒト、ヒト以外の霊長類、サル、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシなどを含む、雄もしくは雌のように分類されるすべての動物が含まれる。哺乳類以外の動物の例としては、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、サカナ、サケ、ナマズ、バス、カエルおよびマスが挙げられる。個体は、ヒト、運動選手または家畜化動物、牧畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、レース用の動物もしくはペット動物から選択されてよい。
【００４５】
用語「有効な用量」または「有効量」は、ＧＤＦ−８に関係する障害に罹患した個体を含む個体の臨床症状を緩和するのに十分な、または所望の生物学的な結果（例えば、筋量、筋力および／または骨密度の増大）を達成するのに十分な投薬量または投薬レベルを意味する。そのような量は、例えば、骨格筋量および骨密度の負の調節に関係するＧＤＦ−８の活性を低下させるのに十分であるべきである。治療結果および臨床症状には、体脂肪の減少、筋量の増加、改善された心臓血管指標、または改善されたグルコース代謝調節が含まれ得る。ＧＤＦ−８阻害物質は、例えば、筋量を増加させ、筋力を増大させ、体重を増加させ、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）のレベルをモジュレートし、および／または筋芽細胞の増殖を刺激することができる。好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８に関係する障害の臨床所見を軽減する。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化に影響を及ぼし、脂肪の蓄積もしくは体脂肪含有量を減少させ、血清トリグリセリドレベルを低下させ、血清コレステロールレベルを低下させ、グルコース代謝をモジュレートし、骨密度をモジュレートし、個体における筋肉の脂肪に対する割合を変化させ、および／または高血糖を低下させることができる。ＧＤＦ−８阻害物質はまた、筋量を増加させるために、運動能力を向上させるために、または筋肉の成長を含め、成長を増進もしくは加速させるために、個体に投与することができる。その有効な量は、次の章で記載されるように決定され得る。ＧＤＦ−８阻害物質の「治療上有効な量」は、個体に単回または複数回の用量投与で、障害または再発性障害を処置する、予防する、治癒する、遅延する、その重篤度を軽減する、または少なくとも１つの症状を改善する、あるいは、その処置を行わない場合に期待される対象の生存を越えて、その生存を延長するのに有効な量を意味する。
【００４６】
「ＧＤＦ−８に関係する障害」は、対象がＧＤＦ−８モジュレート、例えばＧＤＦ−８阻害物質の投与により利益を得るであろう障害または状態である。ＧＤＦ−８に関係する障害には、内科的疾患、例えば、筋肉に関係する障害、神経筋障害、脂肪組織障害、代謝性障害または骨に関係する障害が含まれる。
【００４７】
ＧＤＦ−８阻害物質の投与は、その阻害物質が症状のもしくは障害の改善および／または予防を含み、障害を処置するために個体に投与される場合に、「治療的」であり得る。治療上の使用には、内科的疾患を有する個体、または最終的に障害に罹患し得る個体に対して、障害または再発性障害を処置し、予防し、治癒し、遅延し、その重篤度を軽減し、または少なくとも１つの症状を改善する、あるいは、その処置を行わない場合に期待される対象の生存を越えて、その生存を延長するために、ＧＤＦ−８阻害物質を投与することを含む。ＧＤＦ−８阻害物質はまた、筋量を増加させ、運動能力を改善させ、または筋成長を含む成長を増進もしくは促進するために、個体に投与できる。ＧＤＦ−８に関係する内科的疾患の存在または危険性がない場合に、個体にＧＤＦ−８阻害物質を投与することに関し、前記能力を向上させる方法は、本明細書で定義されるように、一般に「治療ではない」と考えられる。
【００４８】
「生体試料」は、個体から集められた生物学的物質、例えば、細胞、組織、器官、体液および他の臨床材料および試料である。例示的な生体試料には、血清、血液および血漿が挙げられる。
【００４９】
用語「反応容器」は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と抗体との間の結合が生じ、検出され得る容器を意味する。「表面」は、いずれかの固体（例えば、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、硫酸デキストラン、または処理されたポリプロピレン）の外側であり、そこに、ＧＤＦ−８モジュレート物質が直接的にもしくは間接的に「接触」、「固定化」または「被覆」され得る。「反応容器の表面」は、その容器自体の一部であってもよいし、または該表面は反応容器中にあってもよい。例えばポリスチレンなどの表面は、化学処理もしくは放射線処理して、その表面の結合特性を変化させることができる。低結合、媒体結合、高結合、アミン化、および活性化表面は、この用語に含まれる。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、その表面に物理的な吸着もしくは共有結合により、表面を直接被覆させることができるし、あるいは、例えば、表面に直接被覆された基質もしくはその一部との相互作用を通じて間接的に被覆させてもよい。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「捕捉物質」は、免疫学的検定に用いられ、標的蛋白質、例えばＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８自体と特異的に結合する蛋白質などの分子を意味する。本方法に適切な捕捉剤は、ＧＤＦ−８モジュレート物質および／またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する。例えば、捕捉物質は、成熟ＧＤＦ−８二量体を含むＧＤＦ−８蛋白質、またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質であってよい。同様に、捕捉物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する蛋白質であってよい。
【００５１】
「検出試薬」は、ＧＤＦ−８モジュレート物質または複合体の検出を可能にする蛋白質または小分子である。好ましい実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する。検出試薬は、検出可能な標識を含んでいてもよい。検出試薬はまた、それ自体が検出可能な標識を含む物質により検出される。本明細書で提供される方法により検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、他のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法に用いることもできる。
【００５２】
用語「標識」は、その化学的性質により、分子の相互作用の検出を可能にする検出できる識別可能な信号を発する分子を意味する。抗体を含む蛋白質が、直接的に（例えば、発色団、蛍光団、または放射性同位体の手段により）または間接的に（例えば、発色、ルミネセンスまたは蛍光発光を生じさせる反応を触媒する手段により）検出できる分子と共有結合によりもしくは非共有結合により結合されている場合、該蛋白質は検出可能な標識を有する。
【００５３】
１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性をモジュレートすることができる、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法が、本明細書に記載される。具体的には、生体試料中のGDF-８阻害物質を検出する方法が提供される。ＧＤＦ−８に関係する障害に罹患しているまたは発症する危険性のある個体の生体試料中の、またはそれを潜在的に乱用している健康な個体の試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の検出を包含する方法を提供される。本明細書で提供される技術はまた、例えば、ＧＤＦ−８に関係する障害を診断するため、特定の内因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出すること、または定量することもできる。
【００５４】
これらの方法は、特に、複雑な生体試料、例えば血清、血液または血漿中の低レベルのＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することに適している。本方法は、種々のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いてもよいし、また例えば非−症候性の、症候性の、または健康な個体に用いてもよい。
【００５５】
外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質
本明細書で提供されるＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８または医薬上許容されるその誘導体の活性、発現、プロセッシングまたは分泌をモジュレートすることができる。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を増大もしくは低下させることができる。１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８活性を低下させる物質は、ＧＤＦ−８阻害物質である。ＧＤＦ−８阻害物質が、筋量を増加させるために、および筋肉に関連する障害もしくは状態を処置するために投与されるが、ＧＤＦ−８阻害物質を含むＧＤＦ−８モジュレーターは、例えば、脂肪細胞障害、グルコース代謝に関連する障害、または骨疾患を処置するのに用いることができる。天然の成熟ＧＤＦ−８二量体が、本明細書で記載されるように、ＧＤＦ−８モジュレート物質の定義には含まれない。しかしながら、天然ＧＤＦ−８の改変型、およびＧＤＦ−８活性をモジュレートするＧＤＦ−８の変異型およびモジュレート型は、用語ＧＤＦ−８モジュレート物質の意味に含まれる。この応用例には、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）の検出は含まれない。
【００５６】
ＧＤＦ−８モジュレート物質の生物学的誘導体、例えば、物質を個体に投与した後の生体試料中に存在する物質のモディファイ型は、この用語に包含される。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の１つまたはそれ以上の生物学的な誘導体、代謝産物、または代謝生成物の存在を評価することにより、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出する方法を含む。
【００５７】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、生体試料または生物学的物質を得る生体の外部から導入され、産生される場合、ＧＤＦ−８モジュレート物質は「外因性」である。外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、個体に該物質を投与することにより、個体に直接導入してもよいし、または生体に間接的に導入してもよい。外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えばそれが前駆体型で投与された場合、またはそれが動物もしくはその祖先に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡから、その生体内で合成された蛋白質である場合、間接的に生体に導入される。
【００５８】
外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、本明細書で開示される方法および当分野で既知の方法に従って、内因性の因子に存在しないＧＤＦ−８物質の特徴を巧みに利用する方法により、内因性のＧＤＦ−８モジュレート物質と区別できる。例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、その構造、親和力または活性により同定することができる。例えば、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、ＪＡ−１６およびＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する他のモノクローナル抗体は、特定のアミノ酸配列を含み、ＧＤＦ−８の区別可能なエピトープを１つまたはそれ以上の認識する。これらの物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質により特異的に結合される標識化ペプチドエピトープ、例えばビオチン化ペプチドの添加により同定することができる。例えば、ＭＹＯ−０２９に対するペプチドエピトープは、米国特許公報第2004/0142382 A1号に開示されており、本明細書で提供される方法により検出される外因性のＭＹＯ−０２９物質を同定するのに用いることができる。同様に、ＪＡ−１６のペプチドエピトープは、米国特許公報第2003/0138422 A1号に記載されている。抗−イディオタイプ抗体は、例えば、外因性の抗体物質を区別するために用いることもできる。また、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質に特異的な抗体は、周知の免疫感作またはファージディスプレイ技術により作製することができる。ＭＹＯ−０２９特異抗体は、本明細書で提供され、例えば実施例５において、これを作製する方法が示される。
【００５９】
さらに、外因で投与される物質は、蛍光分析（例えば、米国特許第6,680,207号明細書を参照のこと）を用いることで、その天然の対応物質から区別できる。加えて、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質は、米国特許第6,573,055号明細書に記載の方法により、例えば、元の細胞型に基づく糖付加パターンの違いを認識して、内因性の因子から区別できる。組み換え技術により産生される生物学的産物、例えば、抗体治療蛋白質（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２またはＪＡ−１６を含む）または他の糖付加蛋白質は、蛋白質が産生される細胞系または培養条件に応じて、炭化水素側鎖、糖鎖構造または糖ペプチドを含むであろう。また、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の際立った特徴の検出を可能にするモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ヌクレオチドまたは他の物質は、外因性の物質を同定するのに用い得る。
【００６０】
ＧＤＦ−８モジュレート物質は、有効量の試薬の投与を含む試薬の投与後に、本発明の方法により検出される。試薬は、疾病症状の重篤度および進行に応じて、約２．５ｍｇ／ｋｇを含み、約５０ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されてよく、２００ｍｇ／ｋｇであってもよい。医師は、ＧＤＦ−８蛋白質の活性を低下させ、所望の生物学的結果を達成するのに、例えば骨格筋量を増加させるのに、力を増大させるのに、またはＧＤＦ−８に関連する疾病の１つまたはそれ以上の症状を軽減させるのに十分な投薬量を選択しよう。一般に、治療上の有効量は、対象の年齢、体重、身体状態および性別、ならびに対象の病状の重篤度に応じて変更し得る。投薬量は、医師により決定されるであろうし、また細胞培養もしくは実験動物の標準的な医薬手順を用いた毒性分析および治療効果分析（例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、治療指標）により決定されてもよく、処置の観察効果を適切なものとするため、必要に応じて調整され得る。適当な有効用量は、次の例示的な範囲：約５０ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇおよび約５００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇから、処置する臨床医により選択される。単回投与を用いてもよいし、または投薬は、連続的、周期的または断続的であってよい。投薬は、例えば、毎日、週二回、毎週、隔週、毎月または隔月の間隔で与えられてよい。検出されるべきＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば局所、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、膣内、皮下または経皮手段を介して投与される。
【００６１】
種々のＧＤＦ−８モジュレート物質、例えばＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する本発明の方法に用いることができるため、既知のＧＤＦ−８阻害物質は、特許請求する方法の記載の後に、さらに詳しく記載される。さらに、当業者には認められるように、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いられる検出試薬は、その試薬の構造によって変更される。従って、ＧＤＦ−８阻害物質を含む、既知のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するためのさらなる方法が提供され、また、その詳しい記載から明らかになろう。
【００６２】
本発明は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出するための方法、より具体的には、個体の生体試料中のＧＤＦ−８阻害物質を含むＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量する方法に関する。本方法は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた治療の経過を評価することに、試薬の薬物動力学または生物学的利用能を評価することに、個体の生体試料中の試薬レベルを測定することに、および／またはＧＤＦ−８活性をモジュレートする試薬の個体への投与を検出することに特に適している。１つの実施形態において、本方法は、生体試料中のＭＹＯ−０２９、ＧＤＦ−８と特異的に結合する中和抗体の存在を検出する。
【００６３】
候補体の認定
ＧＤＦ−８に関係する障害に関して、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた処置を受けている個体は、その個体の生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために本明細書中で提供される方法の候補体である。さらに、ＧＤＦ−８に関係する障害に罹患した個体、またはＧＤＦ−８に関係する障害または筋肉関連障害を発症する危険性のある個体は、本明細書で提供される方法の候補体であり得る。
【００６４】
ある実施形態において、例えば有効量でＧＤＦ−８モジュレート物質を受けていると認定された個体は、本明細書に記載の方法の候補体であろう。ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた治療を受けている個体は、治療期間中にＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルが変化し、それにより、治療の効果に不利な影響を被り得る。さらに、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与に関係する薬物クリアランスまたは生物学的利用能における個体差を検出し、制御することが望ましい場合があり得るため、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いたＧＤＦ−８に関係する障害の処置の前に、ＧＤＦ−８モジュレート物質投与について適切な候補体が、本明細書で提供される方法を用いて認定される。
【００６５】
筋肉関連障害を有する、または発症する危険性のある個体は、本明細書で提供される方法についての候補体である。ＧＤＦ−８活性の阻害は、筋肉関連障害に罹患した個体を含む個体において筋組織を増大させる。多くの障害、例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮症、器官萎縮症（organ atrophy）、虚弱症、鬱血性閉塞性肺疾患、心不全、骨格筋減少症、悪液質、および他の疾病および病状により生じる筋肉の疲労症候群は、機能的に損なわれた筋組織に関係している。
【００６６】
筋肉関連障害には、例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、骨格筋減少症、悪液質、筋肉の疲労、筋萎縮症、または疲労、萎縮または衰弱を含む筋肉変性が含まれる。筋ジストロフィーには、例えば、偽肥大性肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型肢帯筋ジストロフィーおよび肢帯型筋ジストロフィーが含まれる。例示的な筋ジストロフィーには、デュシェンヌ型の筋ジストロフィー（Leyden-Mobius）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフェス（Emery Dreifuss）型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、強直性脊椎症候群、ウールリッヒ型症候群、福山型筋ジストロフィー、ウォーカー・ワークブルグ症候群、筋・眼・脳病、顔面肩甲上腕型（Landouzy-Dejerine型）筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、筋硬直性ジストロフィー（スタイナート病）、先天性筋緊張症、およびガウアーズ病が挙げられる。例えば、心臓血管疾患、器官萎縮症、臓器不全、癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、床上安静、不動化、長期にわたる不使用、または他の疾病など、他の疾病もしくは病状と関係するまたは派生的な筋肉変性もまた、この用語に含まれる。
【００６７】
心血管障害と関係する筋肉喪失または筋肉疲労を有する個体もまた、本明細書で提供される方法の候補体である。心血管障害の例には、冠状動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）、アンギナ（急性アンギナおよび不安定狭心症を含む）、心臓発作、卒中（虚血性卒中を含む）、高血圧に関係する心臓血管疾患、心不全、鬱血性心不全、冠状動脈疾患、高血圧、高脂血症、末梢動脈疾患および末梢血管疾患もまた挙げられる。インスリン代謝障害の例には、異常なグルコース恒常性、２型糖尿病、前糖尿病、耐糖能異常、脂質異常症、メタボリック症候群（例えば、Ｘ症候群）および外傷、例えば火傷または窒素平衡失調症（nitrogen imbalance）により誘発されるインスリン抵抗性が挙げられる。
【００６８】
脂肪組織、メタボリックもしくは骨に関係する障害または状態に罹患している、またはその危険性のある個体は、特許請求する方法の候補体でもある。前記障害または状態は、異常なグルコース恒常性に関係するもの、例えば、2 糖尿病の発症、耐糖能異常、メタボリック症候群（例えば、Ｘ症候群）、例えば火傷または窒素平衡失調症により誘発されるインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（例えば、肥満症）が挙げられる (Kimら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-906 (2001)）。例えば、ＧＤＦ−８は、脂肪細胞（Ｉｄ）への前脂肪細胞の分化をモジュレートし、間葉前駆細胞および前脂肪細胞からの脂肪細胞形成を阻害する（Rebbapragadaら、Mol. Cell Bio. 23:7230-7242 (2003)）。脂肪の蓄積は、ＧＤＦ−８ノックアウトマウスおよびＧＤＦ−８蛋白質を全身投与された野生型の生体マウスの両方で減少した（McPherronら、J. Clinical Invest. 109:595-601 (2002）；Zimmersら、Science 296:1486-1488 (2002)）。骨量の減少と関係する障害または状態には、骨粗鬆症および骨減少症が含まれ、特に、早期および／または閉経後の女性において、グルココルチコイド−誘導骨粗鬆症、骨減少症、骨関節症、および骨粗鬆症に関係する骨折が含まれる。加えて、低い骨量により特徴付けられるメタボリック性の骨疾患および障害には、例えば、慢性的なグルココルチコイド治療、早産児性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進病、栄養欠乏症、および神経性無食欲症が含まれる。
【００６９】
さらに、筋量の増大、例えば、筋肉細胞サイズの増大（肥大）または筋肉細胞数の増加（過形成）を示す個体は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法の候補体であろう。この増大は、哺乳動物または他の動物の１型および／または２型の筋肉繊維であり得る。筋量の増大を測定する方法は、当分野で周知である。例えば、筋肉は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与前後に、標準技術、例えば水中での計量を用いて測定できる。筋サイズの増大は、重量増加の少なくとも約５％、１０％、２０％またはそれ以上で明らかにされ得る。例えば、磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）または二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）技術を含む、他の非侵襲技術を用いてもよい。プロのスポーツ選手を含む運動選手は、本方法の候補体である。
【００７０】
運動能力の向上を理由に、ＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、ＭＹＯ−０２９を摂取している、または摂取した疑いのある個体は、本方法の候補体である。他の実施形態において、例えば、ウシまたは他の家畜動物などの個体は、その動物の生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の投与を検出することが望ましい場合、本明細書で提供される方法の候補体である。例えば、外因性の試薬は、成長または筋組織量を増大させるため（または、肉の脂肪含有量を下げるため）家畜動物に投与され得る。
【００７１】
第一の実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法が提供され、前記方法は、個体からの試験生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加え、ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出し、そして試験生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較して、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む。ある実施形態において、本方法は、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを、それぞれ既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより定量することをさらに含む。
【００７２】
ある実施形態において、試験管内アッセイは、活性なＧＤＦ−８蛋白質と関係する１つまたはそれ以上の生理学的な成長調節活性または形態形成活性を測定する。ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出するための試験管内アッセイは、当分野で周知であり、細胞に基づくアッセイもしくは無細胞アッセイ（例えば、転写、複製または細胞周期停止を測定するアッセイ）、または結合アッセイ（例えば、免疫学的検定、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降、または放射免疫アッセイ）から選択され得る。例えば、活性なＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子であり、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートし、筋芽細胞増殖を刺激し、および前脂肪細胞の脂肪細胞への分化をモジュレートする。幾つかの方法において、ＢＭＰ−１１モジュレート物質からＧＤＦ−８モジュレート物質の選択が行われる。ＧＤＦ−８活性についての細胞に基づくアッセイおよび無細胞アッセイは、当分野で既知であり、以下に記載される。
【００７３】
生体試料、例えば試験生体試料は、少なくとも１体の個体からの生物学的な物質を含む。好ましい実施形態において、個体は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を用いた治療を受ける。他の好ましい実施形態において、個体は、ＧＤＦ−８モジュレート物質投与の候補体である。さらなる実施形態において、個体は、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類である。特定の実施形態において、生体試料は、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択される。好ましい実施形態において、生体試料は液体でる。幾つかの好ましい実施形態において、生体試料は、血液、血清または血漿から選択される。特定の実施形態において、生体試料は、血清、例えばヒト、霊長類、サル、ラット、またはマウスの血清である。
【００７４】
他の実施形態において、生体試料は、個体または個体群から単離され、試験に先立って選択的に試験されてもよい。例えば、生体試料は、集められて、または適切な希釈剤で希釈された後に用いてもよい。希釈は、アッセイに関するマトリックス干渉を低下および／またはなくすために最適化される。希釈剤は、特に制限されるものではないが、血清を含んでいてもよく、例えばヒト血清、脱イオン水、または約ｐＨ５〜約ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の範囲で緩衝作用を有する様々な緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液またはホウ酸緩衝液）が挙げられる。幾つかの好ましい実施形態において、希釈剤は、正常なヒト血清を含む。希釈剤は、例えば、試験生体試料の増加する希釈液のマトリックス効果による変動を軽減するため、一定の濃度の対照生体試料を含んでいてもよい。
【００７５】
希釈緩衝液は、試験生体試料に対応させるため、例えば、試料マトリクスのバックグラウンド効果または干渉を調節するため選択された対照生体試料を一定量含んでいてもよい。１つの実施形態において、ヒト血清の試験試料は、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）（１．０ｍＭ グリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％ｖ／ｖ／Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（J.T. Baker）を含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で１：８倍に希釈され、８倍を超える試験試料の希釈液は、１２．５％のヒト血清を含むＴＨＳＴで調製される。また、試料は、約２、４、８、１６、３２、６４もしくは１２８倍、またはそれ以上希釈されてよい。他の実施形態において、試験試料は、１：１．５または１：１．６で連続希釈され、希釈の直線性およびマトリクス効果の検証を可能にするデータ点の範囲を得る。好ましい生体試料マトリクスについて、希釈は、マトリクス干渉およびアッセイ感受性が最適となる条件が選択され得る。
【００７６】
幾つかの実施形態において、試料は、周知の方法を用いて分画され、濃縮されてもよく、次に、本明細書で提供されるＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法に加えられる。分画（精製を含む）または濃縮は、マトリクス干渉がアッセイにおいてＧＤＦ−８モジュレート物質の検出を制限する場合に用い得る。分画および濃縮技術は、制限されるものではないが、遠心分離法、硫酸アンモニウム沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、親和性技術（例えば、特異的な結合パートナー、例えば抗体、すなわち、例えば、抗−ヒトＦｃ抗体、プロテインＡまたはプロテインＧと結合された樹脂を用いた免疫沈澱法）、クロマトグラフィー技術、および他の分離技術が含まれる。好ましい実施形態において、生体試料は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の検出前には分画され、濃縮されない。
【００７７】
生体試料はまた、天然の個体から集められてもよく、またはＧＤＦ−８モジュレート物質の投与前、その間、もしくはその後に採取してもよい。例えば、試料は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与後１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１５日、２０日、２５日、３０日またはそれ以降の日に個体から得てもよい。試料はまた、ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与後、１週、２週、３週、４週、６週、８週、１０週、１２週、１６週またはそれ以降の週に得てもよい。試料採取の時期は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の検出を高めるため、または物質の改変された生物学的利用能を検出するため、最適化され得る。
【００７８】
本明細書で提供される方法により検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する抗体であってよく、好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＭＹＯ−０２９である。ある実施形態において、検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質は：抗体、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；ＧＤＦ−８結合パートナーＧＤＦ−８受容体、ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質、フォリスタチン蛋白質、ＧＡＳＰ−１蛋白質、ＧＤＦ−８蛋白質、ＧＤＦ−８プロペプチド、非−蛋白質阻害物質、および小分子から選択される（さらなる詳細は以上に記載される）。
【００７９】
当業者には容易に認められるように、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、試験管内アッセイに基づいて選択された検出試薬および検出されたＧＤＦ−８モジュレート物質を用いて検出することができる（以下を参照のこと）。試験管内アッセイがレポーター遺伝子アッセイである場合、検出試薬は、好ましくはレポーター遺伝子産物、例えば酵素またはエピトープタグなどの標識を含む蛋白質である。適切な酵素には、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、ブドウ糖酸化酵素（β−ガラクトシダーゼ）、および、例えば発色、ルミネセンスまたは蛍光発光を生成する反応を触媒することができる他の蛋白質が含まれる。試験管内アッセイが、結合アッセイ、例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）である場合、検出試薬は、捕捉蛋白質と本明細書で提供される方法により検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複合体中の捕捉蛋白質とを区別して会合するであろう。検出試薬は、蛋白質であってよく、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質と、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体：捕捉蛋白質の複合体であってよい。別には、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の捕捉蛋白質に対する結合に影響を与える蛋白質であってよい。
【００８０】
レポーター遺伝子アッセイ
ある態様において、試験管内アッセイは、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）である（Thiesら、Growth Factors 18:251-259 (2001)を参照のこと）。ある実施形態において、ＲＧＡは、（ａ）ＧＤＦ−８−応答調節因子およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞を、反応容器に供すること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；および（ｃ）生体試料の存在下および不在下で、細胞内でレポーター遺伝子の発現を検出し、それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。ある実施形態において、本方法は、レポーター遺伝子の存在下で発色、ルミネセンスまたは蛍光が変化する基質を加える工程をさらに含む。
【００８１】
宿主細胞は、真核細胞、例えば、ヒト、哺乳類または他の動物由来の細胞であってよい。好ましい実施形態において、宿主細胞は、真核細胞系、哺乳類の細胞系、または横紋筋肉腫を含む癌細胞系などの細胞系である。レポーター遺伝子構築物は、トランスフェクション、電気穿孔法などを含む当分野で既知の手段により、一過性にもしくは安定に宿主細胞に導入されてよい。レポーター遺伝子構築物は、調節エレメントと作動可能に組み合わされた、ＧＤＦ−８応答調節因子(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列）およびレポーター遺伝子を含む（例えば、米国特許公報第2003/0138422号およびそこに記載される文献を参照のこと）。
【００８２】
例えば、ＧＤＦ−８の活性を明らかにするため、ルシフェラーゼを発現するレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を用いた、レポーター遺伝子アッセイが開発された。このアッセイに加えられるＧＤＦ−８蛋白質の量は、レポーター構築物の最大活性の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を生じるのに十分な量が選択される。例えば、ＧＤＦ−８蛋白質は、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ｎｇ／ｍＬで加えられる。一定量のＧＤＦ−８蛋白質を用いて、ＧＤＦ−８モジュレート物質を滴定し、ＧＤＦ−８活性のモジュレーションの対照となる滴定を調製する。例えば、ＭＹＯ−０２９などのＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１，０００ｎｇ／ｍＬから選択される濃度で試験できる。好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質滴定は、このアッセイの直線性のある阻害範囲に及ぶ。
【００８３】
その後、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８で処理する、もしくは処理しない、また、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリンおよび１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地中の試験生体試料で、３７℃で６時間処理する、もしくは処理しない。ある実施形態において、既知のＧＤＦ−８モジュレート物質対象は、約１０ｐＭ〜５０μＭの濃度を用いて平行して行われる。例示的な濃度には、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭおよび５０μＭのＧＤＦ−８モジュレート物質が含まれる。好ましい実施形態において、試験試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質の量は、既知量の試薬を用いた対象摘定と比較され、それにより定量される。レポーター遺伝子蛋白質、例えば基質の比色性分子、蛍光性分子またはルミネセンス分子への変換を触媒する酵素は、周知技術を用いて標的細胞中で定量され得る。
【００８４】
結合アッセイ
ある実施形態において、試験管内アッセイは、ＧＤＦ−８結合活性を測定する。試験管内アッセイは、ＧＤＦ−８蛋白質と結合するＧＤＦ−８モジュレート物質、またはＧＤＦ−８結合パートナーと結合する物質、例えば、ＧＤＦ−８と特異的に結合する蛋白質を検出することができる。例えば、成熟ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−８のプロペプチド領域と、ＡｃｔＲＩＩＢと、ＧＤＦ−８受容体と、フォリスタチンと、フォリスタチンドメインを含有する蛋白質と、ＧＡＳＰ−１と、および他の蛋白質と特異的に結合する。特定の実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質、例えば、抗体またはその一部は、１つまたはそれ以上のこれらの結合活性を減少させ、この結合における効果を検出する。ある実施形態において、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質のＧＤＦ−８蛋白質に対する特異的な結合が検出される。幾つかの実施形態において、試験管内結合アッセイのための捕捉蛋白質は、ＧＤＦ−８蛋白質、またはＧＤＦ−８と特異的に結合する蛋白質から選択される。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質の捕捉蛋白質に対する結合は、ＥＬＩＳＡで測定される。幾つかの実施形態において、捕捉蛋白質の第二の蛋白質（例えば、ＧＤＦ−８）に対する結合は、試験生体試料の存在下または不在下で測定される。結合は、検出試薬を用いて観察することができる。ある好ましい実施形態において、検出は、表面プラズモン共鳴技術を含み、例えば、表面プラズモン分光法（ＳＰＳ）を用いた表面プラズモン蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を含んでいてよい。ＳＰＳ反射能に加えて、標識化分子、例えば、蛍光標識化検出試薬の蛍光強度を検出することで、ＳＰＳ検出に関係する特定の実施形態で、その感度は改善される。標準的なＳＰＳ手順もまた含まれる。幾つかの実施形態において、直接結合アッセイ形式、ブリッジ形式（ＧＤＦ−８モジュレート物質が、固相のＧＤＦ−８および例えば液相のビオチン化ＧＤＦ−８を同時に結合する場合）または競合形式のアッセイを含むＥＬＩＳＡが、行われる。
【００８５】
結合アッセイにおいて、検出試薬は、例えば、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を認識して結合するであろうし、また、単独で用いてもよいし、あるいは、例えばＧＤＦ−８の阻害物質を検出するために利用され得る特定の用量応答信号を生成する他の試薬と組み合わせて用いてもよい。ある実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するために用いられる検出試薬は、特定のＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８モジュレート物質の基に対して特異的である。例えば、好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリン配列と特異的に結合する抗体は、ヒト抗体に基づくＧＤＦ−８モジュレート物質、ＭＹＯ−０２９を検出するために用いられる。
【００８６】
特定の実施例において（例えば、実施例１を参照のこと）、好ましい検出試薬は、マウスの抗−ＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体であるが；しかしながら、一般的にヒトＩｇＧ、もしくはラムダ軽鎖を有するヒトＩｇＧ１、または特異的にＭＹＯ−０２９のアイソタイプまたはアロタイプを認識し、結合することができるいずれの試薬も、ＭＹＯ−０２９の検出を基礎として使用し得る。
【００８７】
他の実施形態において、例えば、試験管内アッセイが、競合結合を測定する場合（例えば、競合ＥＬＩＳＡ）、検出試薬は、ビオチン化成熟ＧＤＦ−８二量体を含む標識化ＧＤＦ−８蛋白質であってよい。標識化ＧＤＦ−８蛋白質はまた、例えば、１つまたはそれ以上のＧＤＦ−８結合部分を含むＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための検出試薬（例えば、ＭＹＯ−０２９抗体）であってよい。
【００８８】
他の実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体である。幾つかの実施形態において、検出試薬は、成熟ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体、例えば、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２またはＪＡ−１６である。ＧＤＦ−８モジュレート物質がヒト抗体である実施形態において、検出試薬は、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体、例えば、マウス抗−ヒトＦｃ抗体を含む抗−ヒトＩｇであってよい。ＥＬＩＳＡの場合、複合体は、酵素標識で検出されよう。
【００８９】
免疫学的検定
１つの実施形態において、本発明は、ＧＤＦ−８蛋白質、例えば成熟ＧＤＦ−８二量体または他の捕捉物質を、反応容器の表面に接触させ、生体試料を加え、そして検出試薬を加えて、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、結合アッセイを含む。
【００９０】
より具体的には、本発明は、生体試料、例えば血清中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法を含み、前記方法は、（ａ）捕捉物質を反応容器の表面と接触させる工程、（ｂ）生体試料を反応容器に加える工程、（ｃ）検出試薬を反応容器に加える工程、（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出する工程を含む。
【００９１】
（ａ）工程にいおて、捕捉蛋白質、例えばＧＤＦ−８蛋白質は、固体反応容器の表面に、共有結合または非共有結合のいずれかにより固定化されている。固体表面は、典型的にはガラス、またはポリマー、例えばセルロース、硫酸デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルもしくはポリプロピレンであり、それらは、磁性体ビーズもしくは常磁性体ビーズを含む、ビーズの形態であってもよい。表面上へのリガンドの固定化は、共有結合によって、または非共有的相互作用、例えば、物理的吸着によって達成され得る。共有結合の方法には、架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアネート、スルホ含有試薬、ペプチド、アルキル化剤、または類似の試薬を用いてカップリングすることが含まれる。好ましい実施形態において、ＧＤＦ−８は、成熟ＧＤＦ−８二量体である。他の好ましい態様において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質はビオチン化されており、反応容器の表面は、（例えば、吸着を介して）アビジンまたはストレプトアビジンで被覆されている。ある実施形態において、本明細書中で提供される方法は、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性を保持するビオチン化された成熟ＧＤＦ−８二量体の使用を含む。
【００９２】
これらの方法は、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８が、反応容器の表面に吸着された成熟ＧＤＦ−８蛋白質よりも、より有効な捕捉物質であるという知見によるものである。さらに、成熟ＧＤＦ−８は、第一級アミン基、例えばリジン残基のビオチン化に対して当初予想されたよりも感度がよかった。アミン特異的なビオチン化試薬を用いてビオチン化したハイパービオチン化ＧＤＦ−８は、ビオチンを含まないＧＤＦ−８と比較して、活性が損なわれるか、または不活性化される。成熟ＧＤＦ−８二量体あたり、アミン基に組み込まれるビオチン分子の数は、ＧＤＦ−８活性を保持した調製に重要であることが見出された。例えば、ＭＹＯ−０２９およびＡｃｔＲＩＩＢ結合活性は、ハイパービオチン化調製物では低下した。従って、ＧＤＦ−８二量体のモルあたりの５個以下のビオチンの分子を有するアミンビオチン化された成熟ＧＤＦ−８調製物が好ましい。別の実施形態において、蛋白質は、スルフヒドリル、カルボキシルおよび／または炭水化物にてビオチン化され得る。非特異的に結合するか、光活性化により反応する光反応性ビオチン化合物もまた利用できる。
【００９３】
本明細書で提供される特定の実施形態において、潜在的な複合体としてのＧＤＦ−８は、アミン特異的ビオチン化試薬によりビオチン化され、次に、成熟ＧＤＦ−８をその複合体から単離する。この方法では、成熟ＧＤＦ−８二量体に組み込まれるビオチンの量は、例えば、受容体結合部位を不活性化することを避けて、生物活性を保持するよう最適化される。ＧＤＦ−８蛋白質はまた、スルフヒドリル特異的ビオチン化試薬を用いて、表面のシステイン残基（または、表面のチオール基）をビオンチン化してもよい。加えて、例えば、反応性アルデヒドを生成するための酸化前処理およびビオチンヒドラジド試薬の使用を含む、炭水化物をビオチン化する方法は、当分野で既知であり、最適にモディファイされた形式の成熟ＧＤＦ−８蛋白質を含む、本明細書で記載される蛋白質について最適化され得る。さらに、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を介したビオチン化を可能にするカルボキシル反応ビオチン化試薬および反応を用いてもよい。当業者には明らかなように、ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する最適なモル比は、ビオチン化手順および用いられる試薬により変更し得る。例えば、当業者であれば、本明細書に記載される方法を既知のビオチン化手順と組み合わせて用い、活性なビオチン化ＧＤＦ−８の調製を最適化し、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性を有する、ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する種々の最適なモル比のビオチン化成熟ＧＤＦ−８蛋白質を生成する方法は認められよう。
【００９４】
幾つかの実施形態において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、アミン特異的ビオチン化試薬を用いてビオチン化される。例えば、ＧＤＦ−８調製物は、リジン残基および／またはアミノ末端でビオチン化され得る。機能的な、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、例えば実施例３に記載されるように、潜在的な複合体の一部としてビオチン化することができ、続いて、成熟ＧＤＦ−８をその複合体から単離してもよい。別の調製法においては、潜在的な複合体中のＧＤＦ−８蛋白質は、米国特許公報第2004/0142382 A1号に記載の実施例１に従って、生成され、単離される。次に、潜在的な複合体は周知の技術を用いて、および／または本明細書で記載されるように、ビオチン化される。
【００９５】
様々なビオチン化試薬は、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体を含む蛋白質の効率的な標識化を可能にする。反応におけるビオチン誘導体のＧＤＦ−８の潜在的な複合体に対するモル比は、約１０、１５、２０、４０または８０対１であり、試薬組成および濃度、反応時間、および温度は、反応中に組み込まれるビオチンの量を調整するために変更し得る。例えば、塩および他の試薬は、最適化されてもよい。ある実施形態において、成熟ＧＤＦ−８二量体は、ビオチン化反応中に成熟二量体を不活性化することを避けるため、ＧＤＦ−８のアミノ末端プロペプチド部分と関係してビオチン化される。
【００９６】
ビオチン誘導体は、周知であり、当分野で利用可能である。ビオチンのモディフィケーションは、様々なスペーサーアーム、安定性に作用するモディフィケーションおよび／または、例えば、ビオチン部分の開裂を可能にする反応基が含まれる。水溶性のスルホスクシンイミジルエステルを含む、ビオチンのスクシンイミジルエステルおよびその誘導体は、例えばリジン残基におけるＧＤＦ−８のビオチン化に使用することができる。組み込まれたビオチンの量を定量するため、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、質量分析法などを含む周知の分析法およびサイジング技術が用いられる。加えて、例えば比色アッセイまたは蛍光アッセイによりビオチンを定量する商業的なキットを利用することができる（例えば、ＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）−安息香酸を利用するＥＺTMビオチン定量キット（Biotin Quantitation Kit）、Pierceを参照のこと）。
【００９７】
さらなる例示的なビオチン化手順は、１５モルまたは２０モルのＥＺ−リンク・スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Pierce、カタログ番号21217）対１モルのＧＤＦ−８複合体の割合で、２時間、２〜８℃で、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体をビオチン化することを含む（例えば、米国特許公報第2004/0142382 A1号に記載の実施例３を参照のこと）。この反応は、０．５％ ＴＦＡを用いてｐＨを下げることにより停止させ、次いで、複合体を、Ｃ４ジュピター２５０×４．６ｍｍカラム（Phenomenex）を用いたクロマトグラフィーにかけ、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離することができる。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配を用いて溶出されたビオチン化した成熟ＧＤＦ−８画分を集め、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（登録商標）プロテインアッセイ・リージェント・キット（Pierce、カタログ番号23235）により定量するか、または他の周知の単離および濃縮技術を用いる。
【００９８】
好ましい実施形態において、試験管内結合アッセイは、ビオチン化ＧＤＦ−８蛋白質捕捉物質を含み、ＧＤＦ−８蛋白質は、そのビオチン部分と反応容器の表面上のアビジンとの相互作用を通じて、ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させる。幾つかの実施形態において、ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から約４：１の間である。他の実施形態において、ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する平均の比は、約５：１以下、約２：１以下、または約１：１以下である。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対する割合は、大部分の分子は約１：１のモル比であるが、活性なＧＤＦ−８調製物においては０から３のモル比の混合物であることが測定された。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対する比率の形式は、例えば、約１、２、３、４または５以下であろう。幾つかの実施形態において、ビオチン化成熟ＧＤＦ−８調製物は、成熟ＧＤＦ−８二量体のモルあたり約１、２、３、４または５モル以下のビオチンが含まれる。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対する平均もしくは中央の比率は、例えば、約０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８または９以下であろう。他の検出物質および捕捉物質は、ビオチン化により標識化されていてもよい。例えば、ビオチン化ＭＹＯ−０２９は、少なくとも（または多くても）、例えば、１０：１、２０：１もしくはそれ以上の割合まででビオチン化され得る。場合により、他の捕捉物質を用いてもよい。
【００９９】
捕捉物質を反応容器の表面に接触させた後、反応容器を洗浄して、結合しなかった捕捉物質を取り除き、その後、生体試料を加える。幾つかの実施形態において、反応容器は、約５〜約９のｐＨの緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、または酢酸緩衝液で洗浄される。要すれば、浄化剤濃度またはイオン強度を加えてもよい。例えば、標的と特異的に結合しない蛋白質など、少なくとも１種のブロッキング試薬を含む緩衝液を反応容器に加えるブロッキング工程を用いて、非特異的な相互作用を最小にする。他の実施形態において、浄化剤、例えば、イオン性浄化剤もしくは非イオン性浄化剤を加えてもよい。ブロッキング緩衝液は、例えば、血清、ウシ血清アルブミン、ミルク、カゼイン、ゼラチンおよび/または非イオン浄化剤を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、反応容器は、ｐＨ約５〜約９の間の緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液または酢酸緩衝液を用いて洗浄される。
【０１００】
（ｂ）工程において、生体試料が反応容器に加えられる。本発明の幾つかの好ましい実施形態において、生体試料は、血液、血清および血漿から選択される。生体試料は、回収された状態で、または適切な希釈剤で希釈された後に用いることができる。希釈剤は、特に、制限されないが、脱イオン水および約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲で、好ましくは約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の範囲で緩衝作用を有する様々な緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液またはホウ酸緩衝液）が含まれる。
【０１０１】
試験されるべき試料の一部を、固定化された捕捉物質と接触させ、十分な時間（例えば、２〜１２０分）、適切な条件下（例えば、２３℃）でインキュベートし、試料中に存在するＧＤＦ−８モジュレート物質の固定化された蛋白質、例えば、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８二量体に対して結合させる。ＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の反応は、特に制限されないが、従来の免疫学的検定で慣用的に使用される条件下で行われ得る。典型的な手順としては、検出試薬とＧＤＦ−８モジュレート物質を含む反応系を、４５℃を超えない、好ましくは約４℃から約４０℃の間、より好ましくは約２０℃から約４０℃の間の穏やかな温度で、または約０．５時間から約２４時間の間、好ましくは約１時間から約２時間の間、インキュベートすること、または維持することを含む。溶媒は、反応に干渉しない限り特に制限されず、従って、限定されるものではないが、約ｐＨ５から約ｐＨ９の間の緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液および酢酸緩衝液が含まれる。浄化剤が存在していてもよい。
【０１０２】
（ｃ）工程は、検出試薬を反応容器に加えることを含む。インキュベーション期間に続いて、固定化されたＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体は、幾つかの実施形態で、（ｃ）工程の前に結合していない溶質を取り除くため、緩衝液で洗浄される。他の実施形態において、同時定量が行われ、それにより（ｂ）および（ｃ）工程が同時に行われる。
【０１０３】
（ｃ）工程を（ｂ）工程の後に行う場合、典型的な手順として、検出試薬とＧＤＦ−８モジュレート物質を含む反応系を、４５℃を超えない、好ましくは約４℃から約４０℃の間、より好ましくは約２５℃から約４０℃の間の穏やかな温度で、約０．５時間から約４０時間、好ましくは約１時間から約２０時間、インキュベートすること、または維持することを含む。溶媒は、反応に干渉しない限り特に制限されず、従って、限定されるものではないが、約ｐＨ５から約ｐＨ９の間の緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液および酢酸緩衝液が含まれる。
【０１０４】
検出試薬は、上記のように、検出可能な標識で標識化されていてもよい。検出試薬は、生体試料中に存在し得る本質的に全ての外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を結合するよう過剰であることが好ましい。検出は、定性的であっても、定量的であってもよい。幾つかの実施形態において、検出試薬は、機器の助けを借りない様々な手段により容易に検出し得る標識を含んでいよう。検出試薬はまた、機器を用いて検出されてもよい。例えば、表面プラズモン共鳴法においては、ＧＤＦ−８モジュレート物質の捕捉物質に対する結合は、例えば、標識を加えることなく検出される。
【０１０５】
検出試薬は、例えば外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合することにより固定される。１つの実施形態において、検出試薬は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体である。試料中の外因性試薬の存在または不在は、標識の活性を測定することにより評価されるが、これは、検出試薬を測定するために用いられる標識の種類に依存し得る。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、「直接」標識は、補助的な試薬を加えることなく、検出可能な信号を自発的に生成できる、特異的結合メンバーと結合された、または会合されたいずれかの分子であってよい。幾つかの例において、放射同位体（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、重金属、発色団（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、１−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシｌ−４−ピペリジル）−５−Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン）、色素（例えば、フィコシアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ｏ−フタルアルデヒド）、化学発光分子、生物発光分子を含む、発光性分子、コロイド金粒子、コロイド銀粒子、他のコロイド金属粒子、ユーロピウム、ポリスチレン色素粒子、わずかな着色性粒子、例えば色素ゾルおよび着色ラテックス粒子が挙げられる。そのような物質の多くは、当業者には周知である。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、標識は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ブドウ糖酸化酵素またはβ−ガラクトシダーゼなどの酵素である。特定の酵素に用いられる基質は、一般に、対応する酵素の存在下で、色、蛍光またはルミネセンスの検出可能な変化を生成することについて選択される。酵素は、一般に、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸架橋により検出試薬に連結される。ある実施形態において、検出試薬は、例えばＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合するモノクローナル抗体、またはモジュレート物質を含む複合体またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体などの、ペルオキシダーゼ結合抗体がある。しかしながら、容易に理解されるように、多種多様な連結技術が存在し、様々な検出試薬（上掲）に応用できることは、当業者であれば容易に利用できる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、酵素標識された抗体を、ＧＤＦ−８モジュレート物質/捕捉物質の複合体に加え、結合させる。過剰量の試薬は洗い流し、次に、適当な基質を含む溶液を反応容器に加える。基質は、酵素による分解反応を受けて、試料中に存在する物質の量の指標となる分光学的に測定できる変化を生じることとなる。
【０１０９】
可溶性の基質（例えば、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズチアゾリン］スルホナート（ＡＢＴＳ）、パラニトロフェニルホスフェート、ルミノール、ポリフェノール、アクリジネステルおよびルシフェリン）と共にインキュベートした場合、ペルオキシダーゼは、基質に分光学的に検出できる発色性もしくは蛍光性の変化を生じさせる。典型的には、基質を用いた一定のインキュベーション期間の後に、反応を停止させ（例えば、酸性化することにより）、その結果は、光学密度（吸光度）またはルミネセンスを測定することにより定量される。吸光度の結果は、発色反応の直線性のある範囲のＯＤ値と比較でき、ルミネセンス免疫学的検定は、相対発光量（ＲＬＵ）で測定される。さらに別には、結合し、特定の用量応答シグナルを生成することとなる試薬のいずれかの組み合わせを用いてもよい（例えば、放射標識試薬、酵素／基質試薬、または例えばビオチン／アビジンを利用した検出増幅系）。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、標識は、ビオチン、ハプテンまたはエピトープタグ（例えば、ヒスチジン−タグ、ＨＡ−タグ（血球凝集素ペプチド）、マルトース結合蛋白質、ＡｖｉＴａｇ（登録商標）、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーぜ）であり、それらは、ＧＤＦ−８モジュレート物質複合体と会合した標識と相互作用する、標識化された検出試薬を加えることによって検出することができる。ビオチン標識（「ビオチン化」）検出試薬は、アビジン−酵素、例えば、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と相互作用させ、次にそのアビジン−酵素結合体と適切な発色基質または蛍光発生基質と共にインキュベートすることを通じて検出され得る。
【０１１１】
（ｄ）工程において、反応容器の表面と会合しているＧＤＦ−８モジュレート物質の複合体は、標識の信号の定性的もしくは定量的評価により検出される。標識は、例えば、蛍光もしくはルミネセンスにより直接的に、あるいは、基質の添加を介して間接的に測定され得る。標識はまた、さらなる試薬とのインキュベーションに続いて測定することもできる。
【０１１２】
標識がビオチンである実施形態においては、アビジン結合酵素（酵素は、幾つかの好ましい実施形態においては、西洋ワサビペルオキシダーゼである）が、次の工程で加えられる。アビジン結合体は、固定化された検出試薬と結合する。過剰なアビジン結合体は、洗い流す。次いで、酵素の基質を加え、例えば発色、蛍光、ルミネセンスに測定可能な変化を生じさせる。幾つかの実施形態において、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【０１１３】
他の実施形態において、本方法は、フォリスタチンと、生体試料中の様々なＧＤＦ−８結合受容体と、アクチビンと、ＧＤＦ−８プロペプチドと、または他のＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合するＧＤＦ−８モジュレート物質を有する複雑な生体試料における検出を可能にする。ある実施形態において、ＧＤＦ−８と特異的に結合する蛋白質（例えば、上記の表から選択される）は、捕捉物質であり、捕捉物質は反応容器の表面に固定化される。好ましい実施形態において、本方法は、成熟ＧＤＦ−８と１つまたはそれ以上の特異的な結合パートナー（以下を参照のこと）との相互作用と競合するもしくは干渉することに基づき、個体からの生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の検出が可能となる。
【０１１４】
（ｃ）および（ｄ）工程の検出試薬は、幾つかの実施形態において、抗体、例えば実施例１に記載されるように、マウスの抗−ヒトＩｇ抗体である。好ましい実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を、反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出することを含む。好ましい態様において、成熟ＧＤＦ−８蛋白質は、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して表面と接触する。好ましい態様において、ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比は、約０．５：１から４：１の間である。さらに好ましい態様において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、ＭＹＯ−０２９である。
【０１１５】
さらなる実施形態において、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する方法は、（ａ）ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質から選択される捕捉物質を、反応容器の表面と接触させること；（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出し、それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。さらなる別の実施形態において、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）ＧＤＦ−８受容体を、第一および第二の反応容器と接触させること；（ｂ）生体試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第一の反応容器に加えること；（ｃ）対照試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第二の反応容器に加えること；（ｄ）検出可能な標識を、第一および第二の反応容器に加えること；および（ｅ）第一の反応容器中の検出可能な標識信号を第二の反応容器中の信号と比較し、それにより生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む。
【０１１６】
競合ＥＬＩＳＡ
本発明のさらなる実施形態において、試験管内免疫学的検定は、競合ＥＬＩＳＡである。本明細書により提供される１つの方法において、免疫学的検定には、（ａ）可溶性のＧＤＦ−８受容体を反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体試料を反応容器に加える工程；（ｃ）標識化ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器に加える工程；および（ｄ）生体試料の存在下および不在下で、該表面と会合している標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量を検出し、生体試料存在下での標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量の減少により、その生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出する工程を含む。ある実施形態において、本方法は、生体試料を反応容器に加える前に、生体試料を標識化ＧＤＦ−８蛋白質と共にインキュベートする工程をさらに含む。さらなる実施形態において、例えば、上記のようにビオチン化されたＧＤＦ−８蛋白質を、検出試薬として用いてもよい。
【０１１７】
ＧＤＦ−８阻害剤
ＧＤＦ−８阻害物質を含むＧＤＦ−８モジュレート物質は、本明細書で提供される方法により検出することができる。ＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、結合アッセイにおいて検出試薬として、本方法で用いることもできる。ＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８自体と相互作用することができる。あるいは、阻害物質は、ＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）または他の結合パートナーと相互作用することができるし、または間接的に作用することもできる。ＧＤＦ−８阻害物質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の部分集合であり、抗体（例えばＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−８受容体に対するもの）、可溶性の受容体、他の蛋白質（ＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−８受容体と結合するものを含む）、モディファイされた形式のＧＤＦ−８もしくはその断片、プロペプチド、ペプチド、およびこれらのすべての阻害物質の模倣体が含まれる。非蛋白質性の阻害物質には、例えば核酸が含まれる。
【０１１８】
当業者であれば、いずれの蛋白質の配列中のあるアミノ酸が、その蛋白質の活性に不都合な影響を及ぼすことなく他のアミノ酸に置換されていてもよいことは理解されよう。従って、様々な変更が、その生物活性または有用性を大きく損なうことなく、本発明のＧＤＦ−８モジュレート物質およびＧＤＦ−８阻害物質のアミノ酸配列、またはそれをコードするＤＮＡ配列に生じていてもよいと考えられる。そのような変更は、限定されるものではないが、欠失、挿入、切断および置換が含まれ得る。
【０１１９】
アミノ酸の一次配列またはヌクレオチドに基づく試薬もしくは阻害物質は、参照配列と異なっていてもよい。例えば、ヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、「強い厳格な」または「強い厳格性」の条件の下、関連する配列と結合することができる。そのような条件は、当業者には知られており、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology,」John Wiley＆Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見出すことができる。当分野で記載されるように、水溶性および非水溶性の条件の両方を用いることができる。強い厳格なハイブリダイゼーション条件の１つの例として、約４５℃での６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次に、５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中での少なくとも１回の洗浄がある。強い厳格なハイブリダイゼーション条件の他の例には、約４５℃（または５０℃、６０℃もしくは６５℃）、６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、次に、約５５℃、６０℃もしくは６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での少なくとも１回の洗浄がある。強い厳格な条件には、６５℃、０．５Ｍ リン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次に、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの少なくとも１回の洗浄である。
【０１２０】
当業者であれば、蛋白質性のＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８阻害物質は、その生物学的な特徴を変えない、多くの保存的な変更をそのアミノ酸配列に含んでいてもよいことは認められよう。保存的なアミノ酸のモディフィケーションは、アミノ酸側鎖置換の関連する類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。例示的な保存的置換は、当業者には周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。さらに、蛋白質性のＧＤＦ−８モジュレート物質またはＧＤＦ−８阻害物質の機能断片が、本明細書で提供される。そのような断片は、ＧＤＦ−８と特異的に結合し、および／またはＧＤＦ−８活性を阻害し得ることが期待される。本発明の実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質またはその機能断片は、単量体型、活性な二量体型、またはＧＤＦ−８の潜在的な複合体中で複合体形成している、成熟ＧＤＦ−８またはその断片と特異的に結合する。
【０１２１】
アミノ酸配列または核酸配列に言及する場合、成句「実質的に同一」または「実質的に類似」は、例えば、本発明のＧＤＦ−８阻害物質の対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、開示された配列と比較して、同一であろうし、またはわずかな差（保存的なアミノ酸置換を通じて）しかないことを意味する。本発明のヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、開示される核酸分子およびポリペプチドに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するものを含む。
【０１２２】
ポリペプチドについては、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個またはそれ以上のアミノ酸が、元のポリペプチドと、その元のポリペプチドと実質的に同一の変異型のポリペプチドとの間で比較されよう。核酸については、少なくとも５０個、１００個、１５０個、３００個またはそれ以上のヌクレオチドが、元の核酸と、その元の核酸と実質的に同一の変異型の核酸との間で比較されよう。あるいは、比較は、元のアミノ酸配列または核酸配列の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％で行うことができる。従って、変異型は、ある領域もしくは領域群で実質的に同一であるが、他の領域では互いに異なっていてもよい。２つの配列間の同一性（パーセント）は、標準的なアライメントアルゴリズム、例えば、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990）にて記載されるベイシック・ローカル・アライメントツール（Basic Local Alignment Tool）（ＢＬＡＳＴ）、またはMeyersら、Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988）のアルゴリズムにより決定される。
【０１２３】
用語「変異型」は、提供されるＧＤＦ−８阻害物質（同様に、ＧＤＦ−８自体）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と実質的に同一もしくは類似するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ意味する。変異型は、天然のものであってもよく、例えば、天然のヒトおよびヒト以外のヌクレオチド配列であってよく、または、それらは人工的に作製されてもよい。変異型の例には、ｍＲＮＡの択一的なスプライシングにより生じるものがあり、３’および５’スプライス変異型、点突然変異および他の突然変異、または蛋白質の蛋白質分解物が挙げられる。変異型は、他の核酸（または適当な挿入もしくは欠失を有するものを、最適にアライメントする場合には、その相補鎖）またはアミノ酸配列と、それぞれ実質的に同一のもしくは類似の、核酸分子またはその断片、およびアミノ酸配列およびその断片が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の核酸分子または蛋白質と、他の核酸分子または蛋白質との間に、最適にアライメントした場合、それぞれ少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性がある。あるいは、全エピトープが、相同でない分子中に挿入されていてもよい。加えて、変異型は、本明細書中で論じられるように、ＧＤＦ−８活性を示すか、またはＧＤＦ−８活性を阻害する蛋白質またはポリペプチドが含まれる。
【０１２４】
ＧＤＦ−８阻害物質は、糖付加、ペグ化（pegylated）、または別の非蛋白質性のポリマーと連結されていてもよい。本発明のＧＤＦ−８阻害物質は、改変されたグリコシル化パターン（すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンから改変されている）を有するようモディファイされていてもよい。本明細書で用いられる「改変された」は、１つまたはそれ以上のモディファイされた炭化水素部分を有すること、および／または元の阻害物質の変更された１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を含むことを意味する。グリコシル化部位をＧＤＦ−８阻害物質に加えることは、当分野で周知のグリコシル化部位の共通配列を含むようアミノ酸配列を改変することによって達成することができる。多くの炭水化物成分を増加させる他の手段には、阻害物質のアミノ酸配列にグリコシドを化学的にもしくは酵素的にカップリングさせることによる手段がある。これらの方法は、国際公開第87/05330号パンフレットおよびAplinら、Crit. Rev. Biochem. 22:259-306 (1981）に記載されている。受容体に存在するいずれかの炭化水素成分の除去は、Hakimuddinら、Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987）；Edgeら、Anal. Biochem. 118:131(1981）；およびThotakuraら、Meth. Enzymol. 138:350 (1987）により記載されるように、化学的にもしくは酵素的に行うことができる。
【０１２５】
１．抗体
ＧＤＦ−８活性を阻害する抗体は、本明細書で提供されるＧＤＦ−８モジュレート物質の目的の範囲内にある。抗体は、慣用のハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature, 256:495-499 (1975)）、組み換えＤＮＡ方法（米国特許第4,816,567号明細書)、または抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ技術（Clackson ら、Nature, 352:624-628 (1991）；Marksら、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)）により作製することができる。他の様々な抗体産生技術については、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, （Harlowら、編、Cold Spring Harbor Laboratory 1988）；およびAntibody Engineering（第２版）（Borrebaeck編、Oxford University Press 1995）を参照のこと。抗体は、完全にヒトのものであってもよいし、ヒト化されていてもよい。ある実施形態において、抗体は、次の章で記載されるように改変されたもしくは変異されたＦｃ領域を有していてもよい。
【０１２６】
本発明に関する抗体の親和力は、１０６Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１の間であろうし、例えば１０８Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１の間であろう。本発明の抗体は、試験管内もしくは生体内でＧＤＦ−８活性を阻害し得る。開示された抗体は、骨格筋量および骨密度の負の調節と関係するＧＤＦ−８活性を阻害し得るし、および／またはＧＤＦ−８のクリアランスもしくは生物学的利用能に影響を及ぼし得る。
【０１２７】
２．ＧＤＦ−８に対する抗体
ＧＤＦ−８モジュレート物質である抗体は、ＧＤＦ−８蛋白質自体と結合することができる。特定の実施形態において、ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８／ＧＤＦ−８受容体の複合体と特異的に結合する。そのような抗体は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８を結合することができ、成熟蛋白質が単量体型であっても、活性な二量体型であっても、あるいは、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体にて複合体形成しているても、成熟蛋白質を結合することができる。好ましい実施形態にいおいて、ＧＤＦ−８蛋白質と結合する抗体は、中和抗体である。ある実施形態において、ＧＤＦ−８抗体は、例えば、競合結合アッセイにおいて測定した場合、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合を阻害する。ＧＤＦ−８配列に対する抗体は、例えば米国特許第5,827,733号および第6,096,506号において論じられている。
【０１２８】
Ａ．ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２
ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２抗体は、本発明の方法に用いることができ、これらの抗体は、米国特許公報第2004/0142382-A1号にさらに詳しく記載されており、その対応する部分、例えば配列、構造、断片、結合、生物活性および抗原エピトープ情報を含む部分は出典明示により本明細書の一部とされる。例えば、ＭＹＯ−０２９を含む、特定の中和抗体の特徴は、米国特許公報第2004/0142382-A1の５４−９０段落、および請求項１〜４２に記載されている。これらの抗体は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８を結合することができ、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイにより示されるように、試験管内および生体内でＧＤＦ−８活性を阻害すること、ならびに骨格筋量および骨密度の負の調節と関係するＧＤＦ−８活性を阻害することができる。
【０１２９】
ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２抗体、これらのｓｃＦｖ断片、ＶＨおよびＶＬドメイン、およびＣＤＲのＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列は、配列表(MYO-029) および米国特許公報第2004/0142382-A1号（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２）に記載されている。ＶＨおよびＶＬドメインを除く重鎖および軽鎖の配列は、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８およびＭＹＯ−０２２と同一である。１つの好ましい実施形態において、ＭＹＯ−０２９の配列は、配列番号：３〜２０に記載されている。
【０１３０】
Ｂ．ＪＡ−１６
ＪＡ−１６抗体は、配列番号：１に記載される成熟ＧＤＦ−８蛋白質と結合し、L-A Whittemoreら、Biochem. and Biophys. Res. Commun. 300:965-971 (2003)ならびに米国特許公報第2003/0138422-A1号にさらに詳しく記載され、それぞれの対応部分（例えば、配列、構造、断片、結合、生物活性および抗原エピトープ）は出典明示により本明細書中の一部とされる。具体的には、米国特許公報第2003/0138422-A1号に記載の抗体阻害物質は、例えば、５６〜７０段落、９３〜１１０段落、および請求項１〜５４に記載されている。
【０１３１】
３．ＧＤＦ−８受容体に対する抗体
ＧＤＦ−８受容体と結合する抗体は、本発明の方法を用いて検出されるＧＤＦ−８モジュレート物質の範囲内にある。これらの抗体は、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合に影響を及ぼすか、またはそれらはＧＤＦ−８の結合の後にその受容体の活性を阻害し得る。抗体は、完全な受容体蛋白質に対して、または細胞外ドメインのみに対して作製できる。抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＢ変異型、およびＧＤＦ−８の他の受容体に対して作製できる（例えば、米国特許公報第2004/0223966-A1号；米国特許公報第2004/0077053-A1号；国際公開第00/43781号パンフレットを参照のこと）。
【０１３２】
４．モディファイされた可溶性受容体
モディファイされた可溶性ＧＤＦ−８受容体は、それ自体がＧＤＦ−８モジュレート物質であり、それらは、他のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するため、本発明で用いることができる。適切な受容体は、ＧＤＦ−８受容体の細胞外ドメインの全部または一部、例えば、当分野で既知のアッセイウェル中でＧＤＦ−８と結合するＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの全部または一部が含まれ得る（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:9306-9311 (2001)）。アクチビンＩＩ型受容体は、非常に保存されており、その組み換え体の可溶型は、例えば、Attisanoら、Mol. and Cell Biol. 16:1066 (1996）；Woodruff, Pharmacology 55:953 (1998）；およびR＆D Systems、カタログ番号３３９−Ｒ（ ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ）にて提供される。ＧＤＦ−８受容体の構造および機能特性、ならびにその活性についてのアッセイは、例えば、米国特許第6,656,475号明細書および第6,696,260号明細書、および米国特許公報第2004/0077053-A1号にて提供される。さらに、アクチビンＩＩ型受容体を含むアクチビン受容体は、例えばその細胞外リガンド結合ドメインを記載する、米国特許第6,835,544号明細書において提供される。
【０１３３】
そのような受容体は、組み換え技術により産生されてもよいし、または完全な受容体を化学的にもしくは酵素的に分解して調製してもよい。本方法のモディファイされた可溶性の受容体は、ＧＤＦ−８の活性を低下させ、体内で天然のＧＤＦ−８受容体を活性化し、またはＧＤＦ−８活性を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメイン、特定の断片およびこの受容体の変異型の記載を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の配列は、例えば、米国特許第6,656,475号明細書に記載されている。
【０１３４】
Ａ．受容体融合体
本発明のモディファイされた可溶性の受容体は、他の蛋白質または他の単の一部との融合によりより安定化させることができる。増大された安定性は、低用量または低頻度の投与を可能にし、治療に有利である。少なくとも免疫グロブリンの一部、例えば、抗体の定常領域、場合により、免疫グロブリンのＦｃ断片との融合は、本発明のモディファイされた可溶性受容体または他の蛋白質の安定性を増大させ得る（例えば、Spiekermannら、J. Exp. Med. 96:303-310 (2002を参照のこと)）。
【０１３５】
Ｂ．ＡｃｔＲＩＩＢのＦｃ融合体
米国特許公報第2004/0223966-A1号（その対応部分は出典明示により本明細書の一部とされる）にさらに詳しく記載される、ＡｃｔＲＩＩＢのＦｃ融合体の阻害物質は、ＧＤＦ−８を結合し、試験管内および生体内でその活性を阻害する、モディファイされたアクチビンＩＩ型受容体ＡｃｔＲＩＩＢを含む。特に、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、骨格筋量および骨密度の負の調節に関係するＧＤＦ−８活性を阻害する。治療的使用に適したものとされた、本明細書で提供される方法のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、可溶性であり、例えば、延長された循環半減期および／または改善された蛋白質分解からの保護などの薬物動力学的特徴を備える。
【０１３６】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、例えば、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための本発明の方法に用いることができる。これらのポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインから誘導された第一のアミノ酸配列と、安定化部分もしくは第二のアミノ酸配列を含む。第一のアミノ酸配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの全部または一部から誘導され、特異的にＧＤＦ−８を結合することができる。幾つかの実施形態において、そのようなＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部はまた、ＢＭＰ−１１および／またはアクチビン、または他の成長因子を特異的に結合する。ある実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＢは、その短い配列が特異的にＧＤＦ−８を結合できる限り、完全な受容体の断片もしくは切断型である。
【０１３７】
安定化部分は、抗体の定常領域、特にＦｃ領域から誘導されたアミノ酸配列、または該配列の変異型であってもよい。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部分から誘導される。関連する実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または他のＩｇＧイソタイプであるＩｇＧから誘導される。特定の実施形態において、第二のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含み、そのヒトＩｇＧのＦｃ部分は、そのＦｃ部分のエフェクター機能を最小にするためモディファイされる。そのようなモディフィケーションには、Ｆｃ受容体結合性などのエフェクター機能を改変し得る(Lundら、J. Immun., 147:2657-2662 (1991）；およびMorganら、Immunology, 86:319-324 (1995))、または定常領域が誘導された種を変更し得る、特定のアミノ酸残基の変更を含む。抗体は、その重鎖のＣＨ２領域に、エフェクター機能、すなわちＦｃ受容体結合性および補体活性化を低下させる変異を有していてもよい。例えば、抗体は、米国特許第5,624,821号明細書および第5,648,260号明細書に記載される変異を有していてもよい。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖において、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長の配列中２３４番と２３７番のアミノ酸に対応するアミノ酸残基に、そのような変異が生じていてもよい。抗体はまた、免疫グロブリンの２つの重鎖間のジスルフィド結合を安定化させる変異、例えば、Angalら、Mol. Immunol. 30:105-108 (1993）で開示されるようにＩｇＧ４のヒンジ領域中の変異を有していてもよい。
【０１３８】
ある実施形態において、安定化部分は、受容体配列のＣ末端もしくはＮ末端と、リンカー配列により、またはリンカー配列によらずに連結されている。リンカー配列により伸びる長さおよびその配列、および連結される配列に対する方向性は変更し得る。リンカーは、２個、１０個、２０個、３０個またはそれ以上のアミノ酸を含み、所望の特徴、例えば安定性、その長さや立体的距離、免疫原性などに基づいて選択される。ある実施形態において、リンカーは、蛋白質分解部位、例えば、エンテロキナーゼ開裂部位、またはその融合蛋白質の精製、検出もしくはモディフィケーションに有用な他の機能的配列を含んでいてよい。当業者であれば、様々な融合蛋白質を作り出すため、本明細書で記載される当該技術を、他のタンパク質性ＧＤＦ−８モジュレート物質に容易に応用できよう。
【０１３９】
５．他の蛋白質
ＧＤＦ−８活性を阻害する他の蛋白質は、本明細書で提供される方法で検出され得る。そのような蛋白質は、ＧＤＦ−８自体と相互作用し、その活性を阻害し、またはその受容体と結合することができる。あるいは、阻害物質は、ＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）と相互作用することができ、そのため、阻害物質がＧＤＦ−８とその受容体との結合を阻害し得る場合、または阻害物質がＧＤＦ−８の結合後に受容体の活性を阻害する場合、本発明の検出方法に有用であり得る。もちろん、阻害物質は、ＧＤＦ−８およびその受容体の両方と相互作用できる。阻害物質はまた、他の様式、例えばＧＤＦ−８プロペプチドを開裂して不活性にさせる金属プロテアーゼを阻害することにより、ＧＤＦ−８活性に影響を及ぼし得る（例えば、米国特許公報第2004/0138118-A1を参照のこと）。
【０１４０】
Ａ．ＧＤＦ−８に特異的に結合する蛋白質
ＧＤＦ−８に結合し、その活性を阻害するか、またはそのクリアランスに影響を与える蛋白質は、本発明の方法に使用することが可能である。幾つかの蛋白質が知られているが、さらなる蛋白質は、種々のアッセイ、例えば、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ、免疫学的検定またはレポーター遺伝子アッセイを用いて単離することができる。蛋白質試料は、蛋白質のライブラリーからスクリーニングし得る。
【０１４１】
Ｂ．ＧＤＦ−８プロペプチド
ＧＤＦ−８プロペプチドは、ＧＤＦ−８の阻害物質として使用することができる。天然のＧＤＦ−８プロペプチドは、生体内での半減期が短かく、それにより、そのＧＤＦ−８活性の薬理学的阻害剤としての効果が低下するため、ＧＤＦ−８プロペプチド阻害物質には、改良された薬物動力学的特徴、特に増大された循環半減期を有するＧＤＦ−８プロペプチドのモディファイ型および安定化型が含まれる。米国特許公報第2003/0104406-A1を参照のこと（対応する部分は、出典明示により本明細書の一部とされる）。
【０１４２】
そのようなモディファイされたＧＤＦ−８プロペプチドには、ＧＤＦ−８プロペプチドとＩｇＧ分子のＦｃ領域とを含む融合蛋白質（安定化蛋白質として）が含まれる。これらのＧＤＦ阻害物質には、ＧＤＦプロペプチド（例えば、配列番号：５または１１に記載の配列）、またはＧＤＦプロペプチドの１つまたはそれ以上の生物学的活性を保持する該プロペプチドの断片もしくは変異型を含み得る。本発明の方法に用いられるＧＤＦ−８プロペプチドは、合成されて産生されてもよく、天然の（ネイティブ）ＧＤＦ−８プロペプチドから誘導されてもよく、または遺伝子工学の分野で既知の様々な試薬、宿主細胞および方法のいずれかを用いて、組み換え技術により産生されてもよい。１つの実施形態において、モディファイされたＧＤＦ−８プロペプチドは、ＩｇＧ分子またはその断片と共有結合により連結されたヒトＧＤＦ−８プロペプチドを含む。ＧＤＦ−８プロペプチドはまた、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と直接連結されてもよく、またはリンカーペプチドを介してＩｇＧ分子のＦｃ領域と連結されていてもよい。さらにＧＤＦ−８のプロペプチドを含む、ＧＤＦ−８と結合する蛋白質は、国際公開第00/43781号パンフレットにて示される。
【０１４３】
Ｃ．フォリスタチンおよびフォリスタチンドメインを含有する蛋白質
少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質は、増殖・分化因子−８（ＧＤＦ−８）のレベルまたは活性をモジュレートし、そして、ＧＤＦ−８のレベルまたは活性のモジュレーションに関係する障害を処置するために用いることができる。フォリスタチン自体およびフォリスタチンドメインを含有する蛋白質の両方は（米国特許公報第2003/0162714-A1号および第2003/0180306-A1号に記載され、これらの対応する部分は、出展明示により本明細書の一部とされる）、本発明に用いることができる（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 98:9306-9311 (2001)もまた参照のこと）。これらの蛋白質のヒトまたは動物への投与は、本発明の方法を用いて検出することができる。
【０１４４】
少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質は、ＧＤＦ−８を結合し、阻害するであろう。少なくとも１つのフォリスタチンドメインを有する蛋白質の例としては、限定されるものではないが、フォリスタチン、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）、ＦＲＰ（flik、tsc36）、アグリン（agrin）、オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ、ＢＭ４０）、ヘビン（hevin）（ＳＣ１、ｍａｓｔ９、ＱＲ１）、ＩＧＦＢＰ７（mac25）、およびＵ１９８７８が含まれる。ＧＡＳＰ１およびＧＡＳＰ２は、少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質の他の例である。
【０１４５】
フォリスタチンドメインは、上記のように、システインに富む繰り返しにより特徴付けられる、アミノ酸ドメインまたはアミノ酸ドメインをコードする核酸ドメインとして定義される。フォリスタチンドメインは、典型的に６５〜９０アミノ酸長を有し、１０個の保存されたシステイン残基およびカザル（Ｋａｚａｌ）セリンプロテアーゼ阻害ドメインを含む。一般に、システイン残基間のループ領域は、フォリスタチンドメインの配列の多様性を示すが、幾分かの保存性が見られる。４番目と５番目のシステイン間のループは、わずか１個または２個のアミノ酸からなり、通常小さい。７番目と８番目のシステイン間のループ中のアミノ酸は、一般に非常によく保存されており、（Ｇ，Ａ）−（Ｓ，Ｎ）−（Ｓ，Ｎ，Ｔ）−（Ｄ，Ｎ）−（Ｇ，Ｎ）、続いて（Ｔ，Ｓ）−Ｙモチーフの共通配列を有する。９番目と１０番目のシステイン間の領域は、一般に、別のアミノ酸に隔てられた２個の疎水性の残基（具体的には、Ｖ、ＩまたはＬ）を含むモチーフからなる。
【０１４６】
フォリスタチンドメインを含有する蛋白質は、少なくとも１つの、場合により１つ以上のフォリスタチンドメインを含むであろう。この用語はまた、天然の蛋白質に関係する既知の生物学的活性、特にＧＤＦ−８結合活性に関係するものを保持し、その配列が保存的なもしくは非保存的な変化でアミノ酸がモディファイされている配列を含む、該蛋白質のすべての変異型（断片；置換、付加もしくは欠失変異を有する蛋白質；および融合蛋白質）を意味する。これらの蛋白質は、天然もしくは合成のいずれを起源として誘導されたものであってもよい。蛋白質は、ヒトのものであってもよく、または限定されるものではないが、ウシ、ニワトリ、ネズミ、ラット、ブタ、ヒツジ, 七面鳥、ヒヒ、およびサカナを含む動物供給源から誘導されたものであってもよい。
【０１４７】
ＧＤＦ−８を結合し得る、少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含む蛋白質は、様々な方法を用いて単離することができる。例えば、１つの方法は、ＧＤＦ−８を用いた親和力精製に使用できる。加えて、ｃＤＮＡライブラリーを弱い厳格なスクリーニング法を用いてもよいし、またはフォリスタチンドメインに対するプローブを用いたデジェネレイト（degenerate）ＰＣＲ技術を用いてもよい。ゲノムデータがより利用しやすくなれば、多くの配列特性および分析プログラム、例えば、MotifSearch（Genetics Computer Group, Madison, WI）、ProfileSearch（GCG）およびBLAST（NCBI）を用いた類似検索を用い、既知のフォリスタチンドメインと高い相同性を有する新たな蛋白質を見つけ出すことが可能となろう。
【０１４８】
Ｄ．ＧＤＦ−８受容体に結合する蛋白質
ＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）と結合し、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合およびその受容体自体の活性を阻害する蛋白質は、ＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための本発明の方法に適している。そのような蛋白質は、スクリーニング技術および本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイまたはレポーター遺伝子アッセイを用いて単離することができる。蛋白質試料は、蛋白質ライブラリーからスクリーニングし得る。
【０１４９】
Ｅ．ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体と結合するいずれかの蛋白質の融合体
ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体と結合するいずれかの蛋白質の融合蛋白質は、他の蛋白質もしくは他の蛋白質の一部との融合によりより安定化させ得る。安定性を増大させるためのＧＤＦ−８モジュレート物質のモディフィケーションは、それらを低用量でまたは少ない頻度で投与できるため、治療に関して利点がある。少なくとも免疫グロブリン、例えば定常領域、場合により免疫グロブリンのＦｃ断片との融合は、これらの蛋白質の安定性を増大させ得る。そのような融合蛋白質の調製は、当分野で周知であり、容易に実施することができる（例えば、Gerburg Spiekermann (2002) J. Exp. Med., 96:303-310を参照のこと）。
【０１５０】
ＧＤＦ−８プロペプチドＦｃ融合阻害物質（米国特許公報第2003/0104406-A1号により詳しく記載され、その対応部分は出典明示により本明細書の一部とされる）は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域またはその断片と共有結合で連結されたＧＤＦ−８前駆蛋白質のアミノ−末端ドメインから開裂されるポリペプチドを含む。
【０１５１】
ＧＤＦ−８プロペプチドＦｃ融合阻害物質は、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドまたはＧＤＦ−８プロペプチドの変異体と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または低下されたエフェクター機能のためにモディファイされたＩｇＧ１のＦｃ領域とを含む。ＧＤＦ−８プロペプチドは、安定化するモディフィケーションを含んでモディファイされ得る。
【０１５２】
Ｆ．ＧＤＦ−８の潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化の阻害物質
ＧＤＦ−８の潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化の阻害物質は、米国特許公報第2004/0138118 A1号に記載されている（その対応部分は出典明示により本明細書の一部とされる）。特定のプロテアーゼは、遊離している場合または成熟ＧＤＦ−８二量体と会合している場合に、プロペプチドを開裂させて、成熟ＧＤＦ−８二量体に結合できなくせ、その活性を阻害する。このように、プロテアーゼは、小さな潜在的複合体（成熟ＧＤＦ−８と関係し、プロペプチドにより阻害される）を、活性なＧＤＦ−８に変換できる。プロペプチドはひとたび開裂されると、成熟ＧＤＦ−８二量体に結合し、不活性化することができなくなる。ＧＤＦ−８の小さい潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化の阻害物質は、成熟ＧＤＦ−８二量体に対するプロペプチド結合特性を増大させ、ＧＤＦ−８活性を阻害するであろう。これらの阻害物質は、プロテアーゼと拮抗的に結合し、自然な潜在的な複合体を結合することを防ぐか、または、それらも成熟ＧＤＦ−８二量体に結合し、不活性な阻害物質−成熟二量体複合体を形成してもよい。
【０１５３】
金属プロテアーゼは、ＢＭＰ−１／ＴＬＤファミリーの金属プロテーゼに代表され、それらは、少なくとも４個の哺乳類の蛋白質、ＢＭＰ−１（Wozneyら、Science 242:1528-1534, 1988)、哺乳類のTolloid（トロイド）（mTLD；Takaharaら、J.Biol. Chem. 269:32572-32578, 1994）、哺乳類のTolloid様−１（mTLL-1；Takaharaら、Genomics 34:157-165, 1996）および哺乳類のTolloid様−２（mTLL-2；Scottら、Devel. Biol. 213:283-300, 1999）が含まれる（それぞれ、出典明示により本明細書の一部とされる）。
【０１５４】
抗体、核酸およびペプチドに基づく試薬を含む、様々な金属プロテアーゼ阻害物質、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、米国特許公報第2004/0138118 A1号に記載されている（出典明示により本明細書の一部とされる）。ＧＤＦ−８の小さい潜在的プロテアーゼ活性化の阻害物質、例えば金属プロテアーゼ活性を阻害する物質には、あらゆる形式の分子、例えば、ペプチド、ペプチド誘導体、例えばペプチドヒドロキシマートもしくはフォスフィン酸ペプチド、またはペプトイドが含まれてよく、米国特許公報第2004/0138118 A1号（米国特許公報第2005/0043232 A1もまた参照のこと）に記載のスクリーニングアッセイを通じて同定し得る。
【０１５５】
ＧＤＦ−８の小さい潜在的な複合体のプロテアーゼ活性化を阻害する具体的な物質は、金属プロテアーゼ酵素に対してプロペプチドＧＤＦ−８と競合するペプチドが含まれる。これらのペプチドは、プロペプチドの一部、プロペプチド部分を含む全長のＧＤＦ−８プロペプチドの一部、金属プロテアーゼの開裂部分に突然変異を有するＧＤＦ−８プロペプチド誘導体が含まれ得る。上掲の米国特許公報に記載されるように、１つの実施形態において、ＧＤＦ−８のペプチド部分の誘導体は、ＧＤＦ−８プロペプチドに相当するペプチドである。この実施形態の１つの態様において、ペプチド試薬に関し、誘導体は、金属プロテアーゼが改変された開裂活性を有するよう、開裂部位にもしくはその十分近傍に、突然変異、例えば、アミノ酸置換、欠失、または挿入を有するプロペプチドである。誘導体またはモディファイされたペプチドは、生物学的環境に存在し得るプロテアーゼ、酸化剤、もしくは他の反応性の物質に対する改善された安定性を含み、例えば上記のモディフィケーションを含み得る。
【０１５６】
金属プロテアーゼ酵素に対する阻害性の抗体、ならびに該ペプチドおよび抗体に基づくＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体はまた、本発明に用いることができ、当分野で既知の技術により容易に作製することができる。
【０１５７】
ペプチド試薬は、野生型もしくは変異型のＧＤＦ−８モジュレート物質配列またはその誘導体を含む、約１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸残基長、またはそれ以上の長さであり得る。例えば、Ｐ１部位（金属プロテアーゼ開裂部位のすぐ上流）またはＰ１‘部位（金属プロテアーゼ開列部位のすぐ下流）に１つまたはそれ以上のアミノ酸交換を有するペプチドは変化し得る。あるＧＤＦ−８モジュレート物質において、Ｐ１’部位でのアスパラギン酸のアラニンへの置換（配列番号：２の７６番目に相当する）は、野生型のＧＤＦ−８プロペプチド配列に関する１０、２０、３０、４０および５０アミノ酸長のプロペプチドに含まれる（米国特許公報第2004/0138118 A1）。
【０１５８】
そのようなＧＤＦ−８モジュレート物質は、例えば、本明細書で記載するように、レポーター遺伝子アッセイ、ＧＤＦ−８捕捉もしくは競合結合ＥＬＩＳＡにおいて、検出および／または同定することができる。ＧＤＦ−８の潜在的な複合体の金属プロテアーゼ活性化をモジュレートするＧＤＦ−８モジュレート物質を検出し得る例示的な検出試薬は、限定されるものではないが、プロペプチドに基づく試薬、および金属プロテアーゼＢＭＰ−１／ＴＬＤファミリーの１つまたはそれ以上の金属プロテアーゼの基質結合部分を含む金属プロテアーゼ配列と結合する試薬、成熟ＧＤＦ−８蛋白質、またはその一部に対する抗体が含まれ、これらは、競合アッセイに用いることができよう。
【０１５９】
６．ＧＤＦ−８阻害物質の模倣体
本発明の方法に使用されるＧＤＦ−８阻害物質の模倣体は、本明細書に記載される方法により検出することもできる。これらＧＤＦ−８阻害物質の合成類似物、特に、長い半減期を有するか、または分解系により容易に分解され難いよう改良された試験管内の特徴を有するものはいずれも、有用である。
【０１６０】
ＧＤＦ−８に対する抗体、ＧＤＦ−８受容体、モディファイされた可溶性の受容体および受容体融合体に対する抗体、およびＧＤＦ−８、例えば、ＧＤＦ−８プロペプチド、成熟ＧＤＦ−８プロペプチド、フォリスタチンおよびフォリスタチンドメインを含有する蛋白質と結合する他の蛋白質、ならびにそれらのＦｃ融合体の模倣体はすべて、本発明に用いることができる。
【０１６１】
これらの模倣体は、ＧＤＦ−８の活性を阻害する場合、特に、それらが、ＧＤＦ−８のその受容体に対する結合を阻害する場合、本発明において有効であろう。本発明の最も有効な模倣体は、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８／ＧＤＦ−８受容体の複合体と特異的に結合する特徴を有するであろう。そのような模倣体は、高親和力で成熟ＧＤＦ−８と結合することができ、そして、その成熟蛋白質が単量体型であっても、活性な二量体型であっても、またはＧＤＦ−８の潜在的な複合体にて複合化していても、その成熟蛋白質と結合することができるであろう。本発明の模倣体は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ 結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイにより示されるように、試験管内および生体内でＧＤＦ−８活性を阻害することができる。さらに、開示される模倣体は、骨格筋量および骨密度の負の調節と関係するＧＤＦ−８活性を阻害し得る。
【０１６２】
７．非蛋白質性阻害物質
非蛋白質性阻害物質には、例えば、核酸が含まれる。
Ａ．核酸
用語「非蛋白質性」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味し、要すれば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。この用語は、核酸類似物、および一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含むものであると理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例としては、限定されるものではないが、プラスミドＤＮＡもしくはその断片、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが含まれる。用語「プラスミドＤＮＡ」は、環状の二本鎖ＤＮＡを意味する。本明細書で用いられる「アンチセンス」は、配列の相補性のため、ｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域の一部とハイブリダイズすることができ、それによりｍＲＮＡからの翻訳を干渉する核酸を意味する。用語「ｓｉＲＮＡ」および「ＲＮＡｉ」は、ｍＲＮＡの分解を誘導し、それにより、遺伝子発現を「サイレンシング」する能力を有する二本鎖ＲＮＡである核酸を意味する。典型的には、ｓｉＲＮＡは、１５−５０ヌクレオチド長であり、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。
【０１６３】
ＧＤＦ−８活性を阻害することができる核酸は、例えば、本明細書で提供される方法により検出することができる。そのような阻害物質は、ＧＤＦ−８自体と相互作用する蛋白質をコードし得る。あるいは、そのような阻害物質は、ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）と相互作用することができる蛋白質をコードし、本発明のＧＤＦ−８阻害物質を発現し得る。別法としては、アンチセンス核酸は、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）産生を阻害するために用いることができる。アンチセンス配列は、相補的なコード配列と相互作用して機能を損なわせ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８受容体の産生を阻害するよう作用し得る。
【０１６４】
本発明に使用するための核酸は、例えば、上記のＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイを用いて同定される。ヌクレオチドに基づくＧＤＦ−８モジュレート物質についての検出試薬は、例えば、相補的なヌクレオチドまたは該物質と特異的に結合する抗体が含まれよう。
【０１６５】
本発明の開示内容は、ＧＤＦ−８蛋白質と結合することができるＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することについての好ましい実施例を示すが、他のＧＤＦ−８活性をモジュレートするＧＤＦ−８モジュレート物質は、本発明の方法を用いて検出することができることは認められる。同様に、本発明の開示内容は、診断もしくは治療調製物の生体内投与に関連して、ヒトおよび他の哺乳動物において、ＧＤＦ−８モジュレート物質レベルを検出することおよび／またはモニタすることに関するが、この方法論は、他の応用およびその種のものに使用するために適用できることは認められよう。
【０１６６】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施例を提供する。当業者であれば、本発明の精神または範囲を変えることなく実施することができる、多くの改良および改変が認められよう。そのような改良および改変は、本発明の範囲内に含まれる。実施例は、本発明をいかようにも限定するものではない。
【０１６７】
（実施例）
実施例１
ヒト血清試料中のＭＹＯ−０２９を検出するため、ＥＬＩＳＡを以下のように行った。最初に、ストレプトアビジン被覆用溶液（１００μＬ／ウェル）（０．１Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のイムノピュア・ストレプトアビジン（Pierce）５μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレート（高結合性の平底マイクロタイター）（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９０）のウェルに加えることで、ストレプトアビジンを吸着させた。このプレートを、シール性フィルムで覆い、２〜８℃で一晩インキュベートした。自動のプレート洗浄機を用いて、プレートを、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）（１．０ｍＭグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％ｖ／ｖ／Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（J.T. Baker）を含む、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した。ブロックのため、２００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ）中、１％ウシアルブミン（Sigma）、０．０２％アジ化ナトリウム）を、各ウェルに加えた。プレートを、シール性フィルムで覆い、室温で１〜２時間インキュベートした後、上記のように洗浄した。ビオチン化ＧＤＦ−８溶液（ビオチン：ＧＤＦ−８のモル比、０：１から３：１の間）（１００μＬ／ウェル）（ＴＨＳＴ緩衝液中、０．５μｇ／ｍＬ）を、プレートのウェルそれぞれに加えた。プレートをシールし、振盪しながら室温で２時間±１５分間インキュベートした。
【０１６８】
ＭＹＯ−０２９の較正標準を、ＴＨＳＴ緩衝液中に９０．０、６０．０、４０．０、２６．７、１７．８、１１．９、７．９０、５．２７および３．５１ｎｇ／ｍＬで調製した。ＭＹＯ−０２９の実際に使用する較正溶液は、正常なヒト血清（Bioreclamation, Inc.）中、１０８０ｎｇ／ｍＬ ＭＹＯ−０２９にて調製した。最初に、１０８０ｎｇ／ｍＬの保存液を、アッセイ緩衝液（ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳）に８倍に希釈し、次に、得られた１３５ｎｇ／ｍＬの標準液の１．５倍希釈系列を、ＴＨＳＴ＋４％脱脂粉乳＋１２．５％正常ヒト血清で調製し、較正標準濃度を得た。３．５１ｎｇ／ｍＬ〜１３５ｎｇ／ｍＬの範囲に及ぶよう調製されたＭＹＯ−０２９較正標準は、１００％ヒト血清中２８．１から１０８０ｎｇ／ｍＬに等しい。ヒト血清について、決定された最小希釈比は１：８であった。ＭＹＯ−０２９の品質管理基準は、ＴＨＳＴ＋４％脱脂粉乳＋１２．５％正常ヒト血清中、１３５、２７０および５４０ｎｇ／ｍＬで二重に別々に調製した。
【０１６９】
試験試料を、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳を用いて８倍に希釈した（４０μＬの試料と２８０μＬの緩衝液）。８倍より高い希釈物は、最初に、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳に１：８で希釈し、次に、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳＋１２．５％ヒト血清でさらに希釈した。
【０１７０】
固定化されたビオチン化ＧＤＦ−８を含むプレートを、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した。ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳＋１２．５％正常ヒト血清（１００μＬ／ウェル）の二重ブランクおよび二重の品質管理試料（１００μＬ／ウェル）を含み、較正標準（上記）を、プレートに二重に加えた（１００μＬ／ウェル）。試験試料（１００μＬ／ウェル）を、残りのプレートのウェルに二重に加えた。
【０１７１】
プレートをシール性フィルムで覆い、プレート振盪器上、室温で２時間±１０分間インキュベートした。結合していない蛋白質を取り除くため、プレートを、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した。
【０１７２】
マウス抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ溶液（１００μＬ／ウェル）（Southern Biotechnology Associates, Inc.）を、各バッチで決定された実際に使用される希釈率で加えた。例えば、ＴＨＳＴ中、検出試薬１：６０，０００希釈が、ある抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰロットに関しては最適であった。プレートを、プレート振盪器上、室温で１時間±１０分間インキュベートし、次いで、ＴＨＳＴ緩衝液（３００μＬ／ウェル）で、２回目の洗浄後にプレートの向きを換えて４回（４×）洗浄した
【０１７３】
固定化された検出試薬を検出するため、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（１００μＬ／ウェル）（BioFX Laboratories）を、プレートの各ウェルに加えた。プレートを、暗所、室温で、約９〜１２分間インキュベートし、次に、０．１８Ｍ 硫酸（１００μＬ／ウェル）を、基質の添加と同じ順序でプレートの各ウェルに加えた。光学密度は、波長４５０ｎｍで記録した。
【０１７４】
品質管理および試験試料濃度は、ドラッグ・メタボリズム・ラボラトリー・マネージメント・システム（Drug Metabolism Laboratory Information Management System）(Watson)、バージョン7.0.1.を使用し、４−変数ロジスティック関数を用いてフィットし、標準曲線からの補完により決定した。試料濃度は、以下の式：
【化１】
［式中、ｙ＝シグナル（ＯＤ）；ｘ＝濃度；ａ＝濃度ゼロでのシグナル；ｄ＝無限濃度のシグナル；ｃ＝ａとｄとの間の、およその中間点のシグナルとなる濃度；ｂ＝ｃでの、もしくはｃ付近の傾き］を用いて決定した。品質管理曲線および標準曲線の例示的なデータを、表１に示す。これらのデータでは、試料濃度は、高Ｑ１，２の平均についてはｙ＝１．８２７；ｘ＝６７．８１８６；ａ＝０．１０１８０５；ｄ＝３．７４１３３；ｃ＝７２．８４４５；ｂ＝１．４５５１２を用いて計算された。
【０１７５】
希釈要素を記入し、試験試料の最終濃度を決定した。較正標準の分散（ＣＶ）は、１２．５％ヒト血清中、７．９０−９０．０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたって７．５％かもしくはそれ以下であり、外因性のＭＹＯ−０２９の定量分析の場合、１００％ヒト血清中、約７２０〜６０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７６】
マウス、ラット、サルおよびラビット血清試料を含む、ヒト以外の血清試料については、わずかな変更を加えてアッセイを行った。これらのデータは、複数のバックグラウンドマトリックス中でのＭＹＯ−０２９の免疫学的検定の感受性および特異性を示す。ヒト、マウス、ラット、サルおよびラビットの実用的な血清希釈レベルは、少なくとも１：８、１：４、１：４、１：８および１：４のそれぞれで決定した。
【表２】
【０１７７】
実施例２
希釈の直線性：本方法の希釈の直線性を、ＭＹＯ−０２９をスパイクしたヒト血清試料を１１個の異なる希釈物を分析することにより評価した。最初に、５４０００ｎｇ／ｍＬの試料を、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳で１：８に希釈し、続いて、ＴＨＳＴ緩衝液＋４％脱脂粉乳＋１２．５％ヒト血清にて連続希釈（１：２）した。希釈は、アッセイ範囲以上、範囲内、範囲以下で行った。希釈の偏りは、アッセイの定量範囲、９．７％〜０．４％内にある試料の偏りを用いて決定した。偏りに傾向は見られなかった。観察された濃度は、期待されたものよりも小さく、阻止帯（ポロゾーン）効果の証拠はなかった。
【０１７８】
特異性：試料マトリクス（または、マトリクス効果）による潜在的な非特異的な干渉を、１０個の異なるヒト血清ロット（個々のドナー）を用い、ＭＹＯ−０２９のスパイク濃度０、１３５、および５４０ｎｇ／ｍＬでのスパイク／回復実験により調べた。内因性ミオスタチン（ＧＤＦ−８）による干渉は、０、１、２、１０および１０００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を、ＭＹＯ−０２９（１３２、２６５、および５２９ｎｇ／ｍＬ）を含む確認試料にスパイクすることで評価した。内因性のＧＤＦ−８のレベルは、１ｎｇ／ｍＬよりも低いと考えられる。ＭＹＯ−０２９をスパイクした、またしていない個々の血清試料についての結果は、表２に示す。スパイク濃度、５４０ｎｇ／ｍＬでは、１０個の血清中９個が、期待された濃度の２０％以内の平均観察濃度を示した。１番の血清の再分析で、その値は、期待された濃度の１５％以内であった。スパイク濃度、１３５ｎｇ／ｍＬでは、１０個の血清中８個は、期待された濃度の２０％以内の平均観察濃度を示した。３番の血清の再分析で、その値は、期待された濃度の１５％以内であった。１番の血清で観察された高いパーセントの偏りは、再分析により、その値は期待される濃度の２０％より大きいままであることが確認された。ＭＹＯ−０２９を加えない場合、１０個の血清全てで、ＭＹＯ−０２９の観察濃度は計測の検出限界以下であった（すなわち、１００％ヒト血清中、６３．２ｎｇ／ｍＬ未満）。データは、有意なマトリックス効果がないことを示す。
【表３】
【０１７９】
さらに、ＧＤＦ−８存在下でのＭＹＯ−０２９の回復の結果は二重に行い、定量した。ＭＹＯ−０２９を検出するＥＬＩＳＡの技能の影響は、ＭＹＯ−０２９試料を０、１、２もしくは１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８と共にインキュベートした場合、観察されなかった。観察された濃度は、期待された値の２０％以内にあった。ＭＹＯ−０２９試料を、１０００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８と共にインキュベートした場合、ＭＹＯ−０２９の観察される濃度は、期待される濃度の４０％であった（偏り）。しかしながら、ＧＤＦ−８は＜１ｎｇ／ｍＬで存在し得るため、このデータは、循環ＧＤＦ−８がアッセイの感度を乱すものではないことを示す。２ｍｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９をラットに皮下投与する実験では、ＭＹＯ−０２９は、以下のように検出され、定量された。
【表４】
【０１８０】
この実験では、以下の曲線変数を得た：最小値＝０．１１７１９５；最大値＝３．７３０７９；傾き＝１．５３１２６；Ｅｄ５０＝５８．７１３３；およびＲ−二乗＝９９８８。
【０１８１】
実施例３
ＧＤＦ−８は、次のようにビオチン化した。全長のＧＤＦ−８を、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体型を与える、フェドバッチＣＨＯ細胞培養生物反応器プロセスで発現させた。この細胞培養液回収物は、通常のフロー微視孔濾過を用いて不純物を取り除き、次に、濃縮して接線流（tangential flow）限外ろ過を用いて通過ろ過（diafilter）した。保持液のプールを、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ固定化された金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に通じ、そこにＧＤＦＦ−８複合体を補足させた。溶出は、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０−５００ｍＭ イミダゾール線形勾配を５カラム容量で行った。次に、得られたピークを、透析により緩衝液−交換を行い、ＩＭＡＣ−によるイミダゾールを取り除き、ビオチン化反応のための適当な緩衝液に置換した。
【０１８２】
次に、潜在的な複合体調製物をビオチン化した。反応には、標的スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのＧＤＦ−８複合体に対するモル比は１４：１を用いた。試薬の基質に対する割合は、１０：１、１５：１および２０：１もまた試した。例えば、固体ビオチン試薬（ＥＺ−リンク・スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、Pierce Biotechnology）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２００ｇ／Ｌで溶解した後、それをＧＤＦ−８複合体試料に加えた。反応は、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中、１．５ｇ／Ｌよりも低いＧＤＦ−８複合体濃度を用い、４℃で１２０分間行った。この反応混合物を、反応の開始時に穏やかに混合し、反応の間、光を遮断した。この反応は、０．５％（ｖ／ｖ）エタノールアミンまたは５．０％（ｖ／ｖ）１０００ｍＭ トリスを加えることにより停止させた。
【０１８３】
次に、このビオチン化ＧＤＦ−８複合体を、透析により緩衝液交換して、低ｐＨ、高カオトロピック濃度の緩衝液（６０００ｍＭ ウレア、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ＝２．５）にした。複合体の解離は、低ｐＨでのプロトン化により生じる。この緩衝液中で、複合体を、プロペプチドおよび成熟した二量体に解離し、可溶化する。また、遊離ビオチンも透析の間に取り除かれる。次に、保持液のプールを、高速サイズ排除クロマトグラフィーにかけ、ＧＤＦ−８の成熟二量体型を、プロペプチドおよび残存する単量体から分離した。
【０１８４】
ビオチン化されたＧＤＦ−８の成熟二量体型を含む画分を、０〜９０％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ＝２．０を用いた５カラム容量での線形勾配によるブチル高速逆相クロマトグラフィーでさらに処理した。この工程のピークを、透析して緩衝液交換し、低ｐＨフォーミュレーション緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ＝２．０）とした。
【０１８５】
ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８二量体は、機能、例えばその活性の維持について、結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイで評価された。ビオチン化成熟ＧＤＦ−８蛋白質はまた、逆相高速液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化四極子飛行時間型質量分析法（ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）により測定され、その調製物は、約０−３のモル比の、大部分の分子は１：１の混合物を含んだ。当業者に周知の条件調節により、高い標的モル比は９：１と高い測定結果を示した。
【０１８６】
ＭＹＯ−０２９は、同様のアッセイを用いてビオチン化され、本明細書に記載の方法に用いることができる。重要なことは、単離されたＭＹＯ−０２９を希釈し、緩衝液交換した後、ビオチン化することである。反応条件および保存条件は、２、３個のパラメータを除き、ＧＤＦ−８の場合と同じである。ＭＹＯ−０２９の濃度値は、１０〜２４ｇ／Ｌの範囲にある。ビオチン化反応における標的スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce）のＭＹＯ−０２９に対するモル比は、４０：１であり、測定されるモル比は、８−１１であった。これは、アビジン：ＨＡＢＡ Ａ６００ｎｍ分光アッセイ（イムノピュアアビジンおよびHABA, Pierce）により測定される。次に、透析を用いて、この試薬を緩衝液交換し低塩濃度、通常のｐＨフォーミュレーション緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２）にした。
【０１８７】
実施例４
本明細書で提供される方法の１つの実施形態において、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、競合結合ＥＬＩＳＡを用いて検出される。このアッセイはでは、ＧＤＦ−８のＡｃｔＲＩＩＢ（または他のＧＤＦ−８結合パートナー、例えばＧＤＦ−８受容体）に対する結合を阻害する物質が、同定および定量される。このアッセイには、捕捉物質としてのＧＤＦ−８パートナーを表面に接触させる工程、生体試料の存在下および不在下でＧＤＦ−８を加える工程、および複合体形成を検出する工程を含む。
【０１８８】
ある実施形態において、ＧＤＦ−８の潜在的な複合体は、２０分子のＥＺ−リンク・スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Pierce）に対して１分子のＧＤＦ−８の割合で、氷上で２時間ビオチン化した。この反応は、０．５％ＴＦＡを用いてｐＨを下げることにより停止させ、複合体を、Ｃ４ジュピター（Jupiter）２５０×４．６ｍｍカラム（Phenomenex）を用いたクロマトグラフィーにかけ、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配を用いて溶出したビオチン化成熟ＧＤＦ−８画分を集め、濃縮し、そしてマイクロＢＣＡプロテインアッセイ・リージェントキット（Pierce）により定量した。
【０１８９】
組み換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（R＆D Systems）を、９６ウェル平底アッセイプレート（Costar）に、０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍＬで４℃、一晩かけて被覆させた。次に、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従って、プレートを、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを用いてブロッキングし、洗浄した。ＧＤＦ−８阻害物質（例えば、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの濃度範囲）を含むもしくは含まない、種々の濃度（例えば、１０ｎｇ／ｍＬ）のビオチン化ＧＤＦ−８の一部、１００μｌを、ブロックしたＥＬＩＳＡプレオートに加え、１時間インキュベートして、洗浄し、そして結合したＧＤＦ−８の量を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP, BD PharMingen）に続いて、ＴＭＢ（KPL, Gaithersburg, MD、カタログ番号５０−７６−０４）を添加して検出した。測色測定は、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍで行うことができる。
【０１９０】
実施例５ レポーター遺伝子アッセイ
ＧＤＦ−８の生物活性に関し、ＧＤＦ−８モジュレート物質は、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）で検出される。
ヒト横紋筋肉腫細胞系Ａ２０４を用い、そのＡ２０４（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を、周知の技術を用いて、レポーター遺伝子構築物、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（米国特許公報第2003/0138422 A1号および第2004/0142382 A1号に記載される）を安定にトランスフェクトした。あるいは、Ａ２０４細胞を、ＦｕＧＥＮＥ．ＴＭ．６トランスフェクション試薬(Boehringer Manheim, Germany）を用いて、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションに続き、細胞を９６ウェルプレート中、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１０％ウシ胎児血清を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地で１６時間培養した。細胞を、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリンおよび１０％ウシ胎児血清を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、一定量（７５ｎｇ／ｍＬ）の成熟ＧＤＦ−８蛋白質を用いて、または用いずに、また対照については３７℃で６時間、陽性対照希釈系列で処理した。場合により、ＧＤＦ−８の量は、ルシフェラーゼシグナルの最大の約８０％が得られる量が選択される。ＭＹＯ−０２９をＧＤＦ−８と共に室温で１時間予めインキュベートし、次に、その蛋白質をＲＧＡに加えた。ＭＹＯ−０２９は、ＧＤＦ−８モジュレート物質の陽性対照滴定を生じるよう、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の濃度でアッセイした。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega）を用いて、標的細胞で定量した。このアッセイで、７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８は、８０％の活性化を示したが、４００ｎｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９は、レポーター遺伝子構築物の８０％の阻害を示した。
【０１９１】
併発反応について、細胞は、７５ｎｇ／ｍＬの成熟ＧＤＦ−８を用いる、また用いない、および試験生体試料を用いる、また用いずに処理した。ヒト血清は、ＭＹＯ−０２９処置を受けている個体から得て、緩衝液中で１：５、１：１０、１：１５、１：２０および１：４０に希釈した。１：１０よりも低い希釈に関しては、試験試料血清をさらに１０％ヒト血清（Bioreclamation, Inc.）を含む緩衝液で希釈した。
【０１９２】
実施例６：ＭＹＯ−０２９に対する抗体
ＭＹＯ−０２９の抗原結合部位に対する抗体を含む、ＭＹＯ−０２９に対する中和抗体は、以下のように作製した：ラビットを、完全なＭＹＯ−０２９またはＭＹＯ−０２９結合部位を含むＭＹＯ−０２９蛋白質部分のいずれかを用いて免疫した。ヒト抗体の定常領域に対するラビットの強い免疫応答の発生を防ぐため、蛋白質分解消化を行わせてＭＹＯ−０２９抗体のＦｃ部分を取り除いた。２匹のラビットを、完全ＭＹＯ−０２９もしくは消化されたＭＹＯ−０２９のいずれかを用いて免疫した。出血液を、リガンド結合アッセイを用いて、中和活性について試験した。この手順により、中和抗体を産生した。４匹の動物は、すべて優れた抗体力価の結果を示し、陽性対照ラビット血清は、４匹の動物すべてから出血液を集めて産生した。
【０１９３】
本開示内容において言及される、全ての刊行物、特許および生物配列は、完全に出典明示により一部とされる。その範囲で、出典明示により一部とされる物質が、本明細書に反するか、または不一致であれば、本明細書が、そのような物質のいずれについても代わって適用されよう。本明細書中で引用されるいかなる引例も、本発明の先行技術と認めるものではない。
【０１９４】
特に示さない限り、成分量、細胞培養、処置条件、および特許請求の範囲を含む、詳細な説明中に用いられるその他の記載を表す全ての数字は、用語「約」により、あらゆる事例で変更されるものと理解されるべきである。従って、そうではないと特に記載しない限り、数に関するパラメータは、およそのものであり、本発明により得られると考えられる所望の特徴に応じて変更し得る。特に記載しない限り、一連の要素に付随する、用語「少なくとも」は、一連の要素それぞれを言及すると理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態と均等なものを、一般以上の実験を要することなく、認められるであろうし、または認めることができる。そのような均等物は、添付する特許請求の範囲に包含されるものである。
【０１９５】
詳細な説明中の実施例は、本発明の実施の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。当業者であれば、多くの他の実施形態が本発明に包含されることは容易に認められる。本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の詳細および実施を考慮することで認められよう。詳細な説明および実施例は、添付の特許請求の範囲で示される発明の本来的な範囲および意図の単なる例と考えられるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）試験されるべき個体からの生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；
（ｂ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および
（ｃ）生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し；
それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む、方法。
【請求項２】
個体からの生体試料によるＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、それぞれが既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されているか、または投与された疑いのある個体からの試料を含むところの、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個体が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類であるところの、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
個体が哺乳類であるところの、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類がヒトであるところの、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生体試料が、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択されるところの、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
生体試料が、血清、血液または血漿から選択されるところ、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する抗体であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＭＹＯ−０２９であるところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験管内アッセイが、免疫学的検定であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
免疫学的検定が、
（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質二量体であるＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を、反応容器に加えること；
（ｃ）検出試薬を加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出することを含むところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＤＦ−８蛋白質が、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して該表面と接触するところの、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が約５：１より小さく、成熟ＧＤＦ−８二量体が潜在的なＧＤＦ−８複合体の一部としてビオチン化されているところの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１の間であるところの、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＤＦ−８蛋白質の添加前に、アビジンまたはストレプトアビジンが反応容器の表面に吸着されるところの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的検定が、
（ａ）可溶性のＧＤＦ−８受容体を、反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を、反応容器に加えること；
（ｃ）標識化ＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器に加えること；および
（ｄ）生体試料の存在下および不在下の表面と会合した標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量を検出し、生体試料存在下での標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量の減少により、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
生体試料を反応容器に加える前に、生体試料を標識化ＧＤＦ−８蛋白質と共にインキュベートする工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標識化ＧＤＦ−８蛋白質が、ビオチン部分を含むところの、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約５：１より小さいとところの、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１の間であるところの、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試験管内アッセイが、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイであるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ＧＤＦ−８−応答調節因子およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞を、反応容器に供すること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；および
（ｃ）生体試料の存在下および不在下で、細胞内のレポーター遺伝子の発現を検出し、
それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
レポーター遺伝子の存在下で、色、ルミネセンスまたは蛍光を変化させる基質を加えることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、
（ａ）ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；
（ｂ）ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体；
（ｃ）ＧＤＦ−８受容体；
（ｄ）ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質；
（ｅ）フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質；
（ｆ）フォリスタチン蛋白質；
（ｇ）ＧＡＳＰ−１蛋白質；
（ｈ）ＧＤＦ−８蛋白質；
（ｉ）ＧＤＦ−８プロペプチド；
（ｊ）非−蛋白質性阻害物質；または
（ｋ）小分子
から選択されるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体であるところの、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＭＹＯ−０２９であるところの、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；
（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、
それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項２９】
成熟ＧＤＦ−８蛋白質が、ビオチン部分を有し、そのビオチン部分を介して該表面と接触するところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約５：１より小さいところの、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１までの間であるところの、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＧＤＦ−８蛋白質の添加前に、アビジンまたはストレプトアビジンが反応容器の表面に吸着されるところの、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体であるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
抗体がモノクローナル抗体であるところの、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体がＭＹＯ−０２９であるところの、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
検出試薬が、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体または標識化ＧＤＦ−８蛋白質から選択されるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
検出試薬が、免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合する抗体であるところの、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンであるところの、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試験生体試料によるＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、それぞれが既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を同定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
生体試料が、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの試料を含むところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
生体試料が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類からのものであるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
生体試料が哺乳類からのものであるところの、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳類がヒトであるところの、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
生体試料が、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択されるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
生体試料が、血清、血液または血漿から選択されるところの、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質から選択される捕捉物質を、反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；
（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出し、
それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項４８】
捕捉物質が、ビオチン部分を含む成熟ＧＤＦ−８蛋白質であるところの、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約５：１より小さいところの、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１までの間であるところの、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
捕捉物質が、
（ａ）ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；
（ｂ）可溶性のＧＤＦ−８受容体；
（ｃ）ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質；
（ｄ）フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質；
（ｅ）フォリスタチン蛋白質；
（ｆ）ＧＡＳＰ−１蛋白質；および
（ｇ）ＧＤＦ−８プロペプチド
から選択される、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質であるところの、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）ＧＤＦ−８受容体を、少なくとも第一および第二の反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第一の反応容器に加えること；
（ｃ）対照試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第二の反応容器に加えること；
（ｄ）検出標識を、第一および第二の反応容器に加えること；および
（ｅ）第一の反応容器中の検出可能な標識信号を第二の反応容器中の信号と比較し、
それにより生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項５３】
ヒト生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与のための、ヒトの候補体を同定すること；
（ｂ）候補体からの生体試料を準備すること；
（ｃ）生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；
（ｄ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および
（ｅ）候補体からの試験生体試料の存在下のＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下のＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し、
それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項５４】
生体試料中のＭＹＯ−０２９を検出するための方法であって、
（ａ）５：１より小さいビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する平均の比を有する、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８蛋白質の二量体を、反応容器の表面に接触させること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；
（ｃ）ヒト免疫グロブリンと特異的に結合する標識化抗体を、反応容器に加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＭＹＯ−０２９／ビオチン化ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、
それにより、生体試料中のＭＹＯ−０２９を検出することを含む、方法。
【請求項５５】
標識が、酵素、エピトープタグ、放射性標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識またはルミネセンス標識から選択されるところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する比が、約０．５：１から４：１であるところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
生体試料が、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの試料を含むところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
個体が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類であるところの、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
個体が哺乳類であるところの、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
哺乳類がヒトであるところの、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
生体試料が、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択されるところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
生体試料が、血清、血液または血漿から選択されるところの、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
標識化抗体が、ヒト免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合するところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項１】
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）試験されるべき個体からの生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；
（ｂ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および
（ｃ）生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下でのＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し；
それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質の存在を検出することを含む、方法。
【請求項２】
個体からの生体試料によるＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、それぞれが既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されているか、または投与された疑いのある個体からの試料を含むところの、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個体が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類であるところの、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
個体が哺乳類であるところの、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類がヒトであるところの、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生体試料が、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択されるところの、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
生体試料が、血清、血液または血漿から選択されるところ、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する抗体であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＭＹＯ−０２９であるところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験管内アッセイが、免疫学的検定であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
免疫学的検定が、
（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質二量体であるＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を、反応容器に加えること；
（ｃ）検出試薬を加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出することを含むところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＤＦ−８蛋白質が、ビオチン部分を含み、そのビオチン部分を介して該表面と接触するところの、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が約５：１より小さく、成熟ＧＤＦ−８二量体が潜在的なＧＤＦ−８複合体の一部としてビオチン化されているところの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１の間であるところの、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＤＦ−８蛋白質の添加前に、アビジンまたはストレプトアビジンが反応容器の表面に吸着されるところの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的検定が、
（ａ）可溶性のＧＤＦ−８受容体を、反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を、反応容器に加えること；
（ｃ）標識化ＧＤＦ−８蛋白質を、反応容器に加えること；および
（ｄ）生体試料の存在下および不在下の表面と会合した標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量を検出し、生体試料存在下での標識化ＧＤＦ−８蛋白質／ＧＤＦ−８受容体の複合体の量の減少により、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
生体試料を反応容器に加える前に、生体試料を標識化ＧＤＦ−８蛋白質と共にインキュベートする工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標識化ＧＤＦ−８蛋白質が、ビオチン部分を含むところの、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約５：１より小さいとところの、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１の間であるところの、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試験管内アッセイが、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイであるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ＧＤＦ−８−応答調節因子およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞を、反応容器に供すること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；および
（ｃ）生体試料の存在下および不在下で、細胞内のレポーター遺伝子の発現を検出し、
それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
レポーター遺伝子の存在下で、色、ルミネセンスまたは蛍光を変化させる基質を加えることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、
（ａ）ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；
（ｂ）ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体；
（ｃ）ＧＤＦ−８受容体；
（ｄ）ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質；
（ｅ）フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質；
（ｆ）フォリスタチン蛋白質；
（ｇ）ＧＡＳＰ−１蛋白質；
（ｈ）ＧＤＦ−８蛋白質；
（ｉ）ＧＤＦ−８プロペプチド；
（ｊ）非−蛋白質性阻害物質；または
（ｋ）小分子
から選択されるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体であるところの、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＭＹＯ−０２９であるところの、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）成熟ＧＤＦ−８蛋白質を反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；
（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、
それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項２９】
成熟ＧＤＦ−８蛋白質が、ビオチン部分を有し、そのビオチン部分を介して該表面と接触するところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約５：１より小さいところの、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１までの間であるところの、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＧＤＦ−８蛋白質の添加前に、アビジンまたはストレプトアビジンが反応容器の表面に吸着されるところの、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＧＤＦ−８モジュレート物質が、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体であるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
抗体がモノクローナル抗体であるところの、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体がＭＹＯ−０２９であるところの、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
検出試薬が、ＧＤＦ−８モジュレート物質と特異的に結合する抗体または標識化ＧＤＦ−８蛋白質から選択されるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
検出試薬が、免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合する抗体であるところの、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンであるところの、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試験生体試料によるＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、それぞれが既知濃度のＧＤＦ−８モジュレート物質を含む複数の対照試料と比較することにより、生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質のレベルを定量することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を同定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
生体試料が、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの試料を含むところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
生体試料が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類からのものであるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
生体試料が哺乳類からのものであるところの、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳類がヒトであるところの、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
生体試料が、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択されるところの、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
生体試料が、血清、血液または血漿から選択されるところの、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）ＧＤＦ−８蛋白質またはＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質から選択される捕捉物質を、反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；
（ｃ）検出試薬を反応容器に加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＧＤＦ−８モジュレート物質／捕捉物質の複合体を検出し、
それにより、生体試料中の外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項４８】
捕捉物質が、ビオチン部分を含む成熟ＧＤＦ−８蛋白質であるところの、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ビオチン部分のＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約５：１より小さいところの、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８蛋白質に対するモル比が、約０．５：１から約４：１までの間であるところの、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
捕捉物質が、
（ａ）ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；
（ｂ）可溶性のＧＤＦ−８受容体；
（ｃ）ＡｃｔＲＩＩＢ蛋白質；
（ｄ）フォリスタチン−ドメインを含有する蛋白質；
（ｅ）フォリスタチン蛋白質；
（ｆ）ＧＡＳＰ−１蛋白質；および
（ｇ）ＧＤＦ−８プロペプチド
から選択される、ＧＤＦ−８蛋白質と特異的に結合する蛋白質であるところの、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）ＧＤＦ−８受容体を、少なくとも第一および第二の反応容器の表面と接触させること；
（ｂ）生体試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第一の反応容器に加えること；
（ｃ）対照試料およびＧＤＦ−８蛋白質を、（ａ）工程の第二の反応容器に加えること；
（ｄ）検出標識を、第一および第二の反応容器に加えること；および
（ｅ）第一の反応容器中の検出可能な標識信号を第二の反応容器中の信号と比較し、
それにより生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項５３】
ヒト生体試料中のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出するための方法であって、
（ａ）ＧＤＦ−８モジュレート物質の投与のための、ヒトの候補体を同定すること；
（ｂ）候補体からの生体試料を準備すること；
（ｃ）生体試料を、ＧＤＦ−８活性についての試験管内アッセイに加えること；
（ｄ）ＧＤＦ−８活性のモジュレーションを検出すること；および
（ｅ）候補体からの試験生体試料の存在下のＧＤＦ−８活性のモジュレーションを、対照生体試料存在下のＧＤＦ−８活性のモジュレーションと比較し、
それにより、外因性のＧＤＦ−８モジュレート物質を検出することを含む、方法。
【請求項５４】
生体試料中のＭＹＯ−０２９を検出するための方法であって、
（ａ）５：１より小さいビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する平均の比を有する、ビオチン化された成熟ＧＤＦ−８蛋白質の二量体を、反応容器の表面に接触させること；
（ｂ）生体試料を反応容器に加えること；
（ｃ）ヒト免疫グロブリンと特異的に結合する標識化抗体を、反応容器に加えること；および
（ｄ）反応容器の表面と会合したＭＹＯ−０２９／ビオチン化ＧＤＦ−８蛋白質の複合体を検出し、
それにより、生体試料中のＭＹＯ−０２９を検出することを含む、方法。
【請求項５５】
標識が、酵素、エピトープタグ、放射性標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識またはルミネセンス標識から選択されるところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ビオチンのＧＤＦ−８二量体に対する比が、約０．５：１から４：１であるところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
生体試料が、ＧＤＦ−８モジュレート物質が投与されている、または投与された疑いのある個体からの試料を含むところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
個体が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類であるところの、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
個体が哺乳類であるところの、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
哺乳類がヒトであるところの、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
生体試料が、血清、血液、血漿、生検標本、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、ミルク、初乳、乳腺分泌液、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液または粘液から選択されるところの、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
生体試料が、血清、血液または血漿から選択されるところの、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
標識化抗体が、ヒト免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合するところの、請求項５４に記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５３７４８８（Ｐ２００８−５３７４８８Ａ）
【公表日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０３２１４（Ｐ２００８−５０３２１４）
【出願日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０７２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０２５７４
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０７２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０２５７４
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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