ＨＭ７４のオキシデカヒドロナフタレンモジュレーター
HM74を発現する宿主細胞を用いて以下の構造を有するアゴニスト活性を有するオキシデカリン様分子を得る。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｇタンパク質共役型受容体(ＧＰＣＲ)は、細胞のシグナル伝達に含まれる必須膜タンパク質である。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光を含む種々の細胞外シグナルに反応して、細胞中で第二メッセンジャー反応を開始するようにシグナルを変換することができる。多くの治療薬物は、ＧＰＣＲを標的にしており、その理由は、それらの受容体が炎症、血管拡張、心拍、気管支拡張、内分泌および蠕動を含む様々な生理反応に介在するからである。
【０００２】
喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、乾癬および関節リウマチ(ＲＡ)といったような疾患は、一般にＴヘルパー細胞、単球マクロファージおよび好酸球を含む炎症性の病因を有すると考えられる。コルチコステロイドを用いた現在の抗炎症治療は、喘息に有効であるが、代謝性のおよび内分泌の副作用を伴う。肺または鼻粘膜を通して吸収することができる吸入製剤についても、おそらく同じことが言える。ＲＡまたはＣＯＰＤについて満足な経口治療は、今のところない。
【０００３】
ヒト単球からのＨＭ74の分子クローニングでは、ＨＭ74はケモカイン受容体であることが予測される(Nomura et al., Int. Immunol. (1993) 5(10): 1239 1249)。ＨＭ74は、主として骨髄、脾臓、扁桃および気管で発現する。
【０００４】
また、ヒト細胞には、関連があるが異なる受容体ＨＭ74Ａが含まれる。ＨＭ74とＨＭ74Ａのアミノ酸配列は、約９５％が同一である。しかしながら、ＨＭ74Ａのリガンドは知られているが、ＨＭ74のリガンドが知られていない。ナイアシンまたはニコチン酸は、ＨＭ74Ａリガンドである(Wise et al., J. Biol. Chem. 278:9869-9874, 2003)。しかし、ナイアシンは、ＨＭ74の活性化因子としては劣る。
【０００５】
マウスゲノムはＨＭ74遺伝子でなくＨＭ74Ａ遺伝子を含む。
【０００６】
ある状況下では、ＨＭ74およびＨＭ74Ａは、同時制御を示す。出願人らは、Taqman ＰＣＲを用いて、ＨＭ74およびＨＭ74Ａの発現が、顆粒球ではＴＮＦαによって５０倍、そして単球ではＬＰＳまたはＴＮＦαによって１０〜２０倍誘発されることを見出した。また、ＨＭ74およびＨＭ74の発現は、喘息の病因に重要であることが知られているＴＨ２サイトカイン、ＩＬ４またはＩＬ１３によって正常なヒト気管支上皮細胞において４〜５倍誘発される。ＨＭ74およびＨＭ74Ａの発現は、ヒト一次好酸球(human primary eosinophil)においてＩＬ５によって上方制御される。最終的に、肺のＨＭ74Ａ発現は、ネズミの実験的な喘息モデルにおいて上方制御される。
【０００７】
ＨＭ74およびＨＭ74Ａの限定された組織分布およびそれらの制御は、喘息、ＣＯＰＤおよびＲＡのような炎症性プロセスにおけるＨＭ74およびＨＭ74Ａの役割を示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＧＰＣＲが疾患において役割があり、ＧＰＣＲの活性を調節することによって疾患を治療する能力があるとすれば、ＧＰＣＲの活性を含む疾患状態を治療する新しい組成物および方法を開発するためのＧＰＣＲリガンドの同定および特性評価を提供することができる。本発明は、ＨＭ74に関与する分子を同定および特性評価し、そして関連する疾患の同定および治療にその発見を適用するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＨＭ74ＡでなくＨＭ74を活性化する分子に関する。
【００１０】
本発明の別の態様において、ＨＭ74のモジュレーターの同定方法が開示されている。例えば、興味の方法は、化学的部分を設け、ＨＭ74を発現する細胞を供給し、そして化学的部分がＨＭ74のシグナル伝達活性を調節するかどうかを、このような調節が本発明のアゴニストの存在下でまたは欠如下で生じるかどうかを含めて測定する工程からなる。関連した態様において、化学的部分には、ペプチド、抗体、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストが含まれうるが、これらに制限されない。別の態様として、知られているモジュレーターは、競合アッセイにおいて他のモジュレーターを同定するために使用することができる。
【００１１】
縮合環ジヒドロピラン(別名オキシデカヒドロナフタレンおよびオキシデカリン)は、ＨＭ74を活性化する。その化合物は、ＨＭ74を発現する細胞、例えばＣＨＯ細胞、２９３細胞およびＬ１.２細胞において選択的用量−反応性のカルシウム動員を生じる。
【００１２】
興味のオキシデカリンは、以下の構造を有する：
【化１】
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルケニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルキニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ3−Ｃ18アリール、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはその組み合わせである；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基であるか；またはＲ2は、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである、であることができ；またはＸおよびＲ2は、環を形成することができ；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【００１３】
興味の化合物は、一般にアゴニストである。従って、興味の化合物は、候補薬として開発することができる。また、興味の化合物は、例えば競合アッセイによって、ＨＭ74を調節する他の分子を同定するために使用することができる。
【００１４】
本発明の別の態様には、治療組成物が含まれ、ここで、このような組成物には、核酸、抗体、ポリペプチド、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。またさらに、本発明の方法は、治療の必要な患者にこのような治療組成物を投与することによって疾患状態を治療し、そしてＨＭ74シグナル伝達活性を調節する方法を含む。
【００１５】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。さらに、種々の文献を以下に記載し、特定の方法または組成物をより詳細に記述する。これにより、それぞれの文献は、それぞれが個々に組み込まれて記述されている場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ＨＭ74を活性化する分子の発見に基づく。
【００１７】
ＨＭ74コード配列は、知られている(前出のNomura et al.)。ＨＭ74を得、製造し、そして使用する方法が本明細書に記載されている。ＨＭ74コード配列およびアミノ酸への変化は、ＨＭ74の知られている機能活性が悪影響を受けない限り、許容される。
【００１８】
本化合物は、ＨＭ74を調節し、ＨＭ74のアゴニストであり、従って炎症、例えば喘息を特徴とする障害の候補薬である。
【００１９】
また、本化合物は、ＨＭ74アンタゴニストのスクリーニングに使用することができる。例えば、ＨＭ74を発現する細胞を試験化合物、次いで本発明のアゴニストに暴露する。次いで、例えばカルシウム動員における試験化合物の効果を測定して、試験化合物が本発明のアゴニストによって誘発されるカルシウム動員を減らすかどうかを確かめることができる。
【００２０】
例えばアゴニストおよびインバースアゴニストを同定するための他のこのようなアッセイは、本発明の範囲内に帰属することが意図される。
【００２１】
興味のオキシデカリンは、以下の構造を有する：
【化２】
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルケニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルキニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ3−Ｃ18アリール、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基であるか；またはＲ2は、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである、であることができ；または、ＸおよびＲ2
は、環を形成することができ；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【００２２】
興味の化合物は、一般にアゴニストである。従って、興味の化合物は、候補薬として開発することができる。興味の化合物は、例えば競合アッセイによって、ＨＭ74を調節する他の分子を同定するために使用することができる。
【００２３】
用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、sec−ブチル、ペンチルおよびヘキシルである。炭化水素は、１つまたはそれ以上の不飽和三重結合を含むことができる。
【００２４】
用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシである。
【００２５】
「アリール」は、芳香族炭化水素の環である。例としては、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００２６】
「ヘテロ原子」は、一般に、分子の典型的な原子とは異なる原子である。従って、炭化水素において炭素または水素ではないすべての原子はヘテロ原子である。一般に生物学的に許容しうるヘテロ原子には、酸素、硫黄および窒素が含まれる。
【００２７】
用語「ヘテロアリール」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアリール基のことである。例としては、ピリジル、イミダゾリル、ピロリル、チエニル、フリル、ピラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、ナフチリジニルおよびイソオキサゾリルである。
【００２８】
「分枝」は、構造が１つまたはそれ以上の部位で１つまたはそれ以上の枝分れを含むことを意味する。枝分れは、上記定義されたＲ基または他の側基であることができる。
【００２９】
用語「シクロアルキル」は、環式炭化水素のことである。いくつかの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。長さが変化した橋かけを含むことができる。
【００３０】
「複素環」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたシクロアルキルである。例としては、ピロリジニル、ピペリジニルおよびピペラジニルである。
【００３１】
用語「ヘテロアルキル」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアルキルである。エーテルは、ヘテロアルキルである。
【００３２】
「置換された」は、基部となる有機基が１つまたはそれ以上の置換基を有することを意味する。従って、原子または基は、分子中で別の原子または基に置き換えられる。代表的な置換基としては、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ8アルキル、−ＣＮ、アルコキシル、ヒドロキシル、スルフィド、スルフェート、スルホンアミド、アミン、アミド、アルコール、ケト基、Ｃ6−Ｃ18アリール、ハロゲン化Ｃ1−Ｃ18アルキル、亜硝酸基または硝酸基が含まれる。
【００３３】
「ハロゲン」は、例えば塩素、フッ素または臭素である。
【００３４】
「アルケニル」は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む炭化水素である。炭化水素は分枝していてもよい。
【００３５】
用語「環」は、１つの、複数の環構造の１つの、または複数の、環構造を意味し、その際、複数の環の２つまたはそれ以上は縮合していてもよく、複数の環または複数の環の１つまたはそれ以上は、芳香族であってもよく、ヘテロ原子を含み、置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせであることができる。環は、二環式または多環式であってもよい。環は、長さが変化した橋かけを含むことができる。
【００３６】
用語「側基」は、別の構造に結合した原子または分子を意味する。従って、側基は、上記定義されたＲ基、アルキル、アリール、シクロアルキル、等であることができる。
【００３７】
用語「橋かけ」は、２つの構造間のリンカーのことである。例えば、ヘテロ原子を含むことができ、置換されていてもよく、分枝していてもよく、またはそれらの組み合わせであることができる非環式炭化水素、例えばアルキル、アルケニル等は、２つの環式炭化水素、例えばアリールまたはシクロアルキル基を結合することができる。また、橋かけは、環式構造の少なくとも２個の原子を結合する環式構造中に含んでいてもよい。分子内架橋は、０、１、２、３、４またはそれ以上の原子を含むことができる。分子内架橋は、直鎖、分枝であってもよく、そして置換を含むことができる。
【００３８】
興味の化合物は、誘導体化して生物学的利用能を高めるプロドラッグを形成することができる官能基を含む。従って、本発明は、投与した後、代謝されて生物活性形態になるものは興味の活性化合物の変形を意図する。このような生物活性薬物の前駆体は、生体変換可能なキャリア(bioreversible carriers)、潜在的な薬物、ドラッグデリバリーシステムまたはプロドラッグとしても知られている(“Bioreversible Carriers in Drug Design" E.B. Roche, ed., Pergamon, NY, 1987;“Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems", Higuchi & Stella, eds., American Chemical Society, DC, 1975)。
【００３９】
薬物の化学修飾は、脂質バリアを越えなければならない極性化合物の利用能をいかにして高めるか、通常、生体内で分解等に敏感である化合物をいかにして安定化させるかといったような薬力学の特定の態様に対処することを目的とする。
【００４０】
プロドラッグを製造する別の理由としては、生物活性薬物の毒性、特異性の欠如、不安定性、吸収部位で代謝される、あまりに急速に吸収される、患者のコンプライアンス、例えば味覚に乏しいもしくは注射部位の疼痛、医師の承認が低いまたは製剤の問題が同様に含まれる。
【００４１】
一般的な修飾は、エステル化であり、これはカルボキシル基の誘導体化に限らない。同様に、例えばアミン、イミン、硫黄を含む置換基およびアミドについてこのような誘導体を製造するための化学がある。
【００４２】
エステルの場合、種々の置換基を、それに加えることができ、置換基は非分枝、環式または分枝炭化水素を含み、これは置換されていてもよく、１つまたはそれ以上の二重または三重結合を含むことができ、環構造を含むことができ、炭化水素骨格鎖は、１つまたはそれ以上のヘテロ原子、例えば窒素、硫黄または酸素、等を含むことができる。
【００４３】
エステルを構成するためにＲ基を検討する場合、考慮すべき別の因子は、酵素切断への感受性である。従って、生物学的利用能にとって立体的電荷および立体配座的因子は、決定因子であるといえる。例えば、分枝アルキル基は、エステラーゼ活性部位への接近容易さにとって立体障害となり、それによって加水分解の速度を遅くすることができる。あまり望ましくなければ、生物学的利用能を遅らせるか、望ましければ生物学的利用能を持続させるかのいずれかである。
【００４４】
別の状況では、薬物の水溶解度を高めることが望ましい。その目標を達成する置換基の例としては、スクシネート、スルフェート、ヘミスクシネート、ホスフェート、アミノ酸、アセテート、アミン等が含まれる。
【００４５】
アミド、イミド、カルボネート、ヒダントイン等の窒素は、誘導体化することができる。窒素への反応に適切な基は、ヒドロキシメチル基または一般にヒドロキシアルキル基、アシルオキシアルキル基およびアシル基が含まれる。
【００４６】
また、カルボニル基も誘導体化の部位である。誘導体の例は、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンおよびエノールエステルである。
【００４７】
上記議論した誘導体は、薬物への置換基の共有結合を含むが、置換基は、別の形で、例えば水素結合、ファンデルワールス力、静電力、疎水的相互作用、等で薬物に結合することができる。
【００４８】
誘導体化のさらに別の手段は、非酵素的機構によってプロドラッグから除去される置換基を用いることである。例としては、(２−オキソ−１,３−ジオキソール−４−イル)メチルエステル、マンニッヒ塩基、オキサゾリジン、分子内加水分解に触媒作用を及ぼす塩基性側鎖を有するエステルおよび分子内求核環化脱離反応を受けるエステルまたはアミドを含むプロドラッグが含まれる。環化機構は、フェノール、アルコールおよびアミンを含む薬物で利用可能である(“Prodrug Design" Testa & Mayer in “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology," 2nd ed. V.3, Swarbrick & Boylan, eds., Marcel Dekker, 2002.)。
【００４９】
従って、本発明は、知られている合成方法を実施して、一旦投与したら反応し、または生体内で作用してＨＭ74活性を調節する化合物を生じる化合物を得るための興味の化合物のなんらかのさらなる修飾を企図する。
【００５０】
本明細書における用語「同等のアミノ酸残基」は、２つまたはそれ以上の配列を分析でアラインメントした時にタンパク質配列において実質的に同じ位置を占めるアミノ酸を意味する。本発明の好ましいＨＭ74ポリペプチドは、野生型ＨＭ74のものと十分に同一のアミノ酸配列を有する。「野生型」は、局所的またはより広い範囲にかかわらず定義された個体群中に存在する最も一般的な形態または対立遺伝子を意味する。本明細書で使用する用語「十分に同一」は、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列が第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分なまたは最小数の同一もしくは同等の(例えば、類似の側鎖を有する)アミノ酸残基またはヌクレオチドを含み、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することである。例えば、ＨＭ74活性と少なくとも９６％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチド配列は、十分に同一であるものとして本明細書に定義される。
【００５１】
本明細書において同義的に使用するように、「ＨＭ74活性」、「ＨＭ74の生物活性」または「ＨＭ74の機能活性は、標準技術に従ってインビボまたはインビトロで測定してＨＭ74発現細胞においてＨＭ74タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によってもたらされた活性を意味する。ＨＭ74活性は、直接的な活性、例えば第２のタンパク質との結合もしくは第２のタンパク質上の酵素活性、または間接的な活性、例えばＨＭ74と第２のタンパク質との相互作用が介在する細胞のシグナル伝達活性であってもよい。好ましい実施態様において、ＨＭ74活性には、少なくとも以下の活性の１つまたはそれ以上が含まれる：(ｉ) ＨＭ74シグナル伝達経路においてタンパク質と相互作用する能力；(ii) ＨＭ74リガンドと相互作用する能力；(iii)活性化された時に宿主細胞を変化させる能力；(iv)本発明の分子を結合することにおける活性化；および(ｖ)細胞内標的タンパク質と相互作用する能力。
【００５２】
本発明の一態様において、ＨＭ74が活性化された時に反応を示す細胞中でＨＭ74を発現することに関する。本明細書で使用するように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子(例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)およびＲＮＡ分子(例えばｍＲＮＡ)ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００５３】
「単離された」核酸分子は、核酸の自然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が誘導された生物のゲノムＤＮＡ中で本来ＨＭ74をコードしている核酸の側面に位置する配列(すなわち、核酸の５'および３'末端に位置する配列)を含まない。単離されたＨＭ74核酸分子は、核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡ中で本来オープンリーディングフレーム核酸分子の側面に位置する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂまたは０.１ｋｂより少ないヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって作成した場合、他の細胞物質または培養基を実質的に含まず、または化学合成した場合、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００５４】
本発明の核酸分子、例えばＨＭ74をコードする核酸分子は、標準分子生物学技術および配列を用いて単離することができる(前出のNomura et al.)。ＨＭ74配列の全てまたは一部を用い、標準ハイブリッド形成およびクローン技術を用いてＨＭ74核酸分子を単離することができる(例えば、Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載された通り)。
【００５５】
本発明の核酸分子は、標準ＰＣＲ増幅技術に従ってテンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマを用いて増幅することができる。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特性評価することができる。さらにまた、標準合成技術、例えば自動化されたＤＮＡ合成装置を用いてＨＭ74ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを製造することができる。
【００５６】
さらに、本発明の核酸分子は、ＨＭ74をコードする核酸配列の部分のみ、例えばリガンドがそれに結合した時に検出可能な細胞内事象が生じる細胞外ドメインおよび／または細胞内ドメインをコードするフラグメントを含むことができる。検出可能な細胞内事象は、ＨＭ74が正常なホスト細胞中で活性化された時に観察されるものであることが好ましい。
【００５７】
「ＨＭ74の生物活性部分」をコードする核酸フラグメントは、ＨＭ74生物活性を有するポリペプチドをコードするＨＭ74の部分を単離し、ＨＭ74タンパク質のコード部分を発現し(例えばインビトロの組換え型発現によって)そしてＨＭ74のコード部分の活性を評価することによって作成することができる。
【００５８】
本発明は、さらに遺伝コードの縮重のため開示されたＨＭ74のヌクレオチド配列と異なるが、以前に開示されたものと実質的に同じＨＭ74タンパク質をコードする核酸分子を包含する。
【００５９】
ＨＭ74のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列多形が個体群(例えばヒト個体群)に存在しうることが当業者ならば理解するであろう。ＨＭ74コード配列におけるこのような遺伝的多形は、対立遺伝子の自然変異(natural allelic variation)のため、個体群の中で個々に存在する可能性がある。対立遺伝子は、所定の遺伝子座で代替的に生じる一群の遺伝子の１つである。本明細書で使用するように、用語「遺伝子」および「組換遺伝子」は、ＨＭ74タンパク質、好ましくは哺乳動物のＨＭ74タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子のことである。本明細書で使用するように、語句「対立遺伝子の変異型」は、ＨＭ74遺伝子座で生じたヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドのことである。代替の対立遺伝子は、多くの異なる個体において興味の遺伝子を塩基配列決定することによって同定することができる。それは、ハイブリッド形成プローブを用いて種々の個体において同じ遺伝子座を同定することによって容易に実施することができる。いずれかおよびすべてのこのようなヌクレオチド変異および対立遺伝子の自然変異の結果でありＨＭ74の機能活性と変わらないＨＭ74中に生成したアミノ酸性多形または変異は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００６０】
さらに、ヒトＨＭ74の核酸分子と異なるヌクレオチド配列を有するが、実質的に同じ活性を有する他の種類(ＨＭ74同族体)からのＨＭ74タンパク質をコードする核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。対立遺伝子の自然変異型(natural allelic variants)および本発明のＨＭ74 ｃＤＮＡの同族体に対応する核酸分子は、標準ハイブリッド形成技術に従ってストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成プローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその部分を用いて本明細書に開示されたヒトＨＭ74核酸との同一性に基づいて単離することができる。
【００６１】
本明細書で使用するように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」は、ヌクレオチド配列がハイブリッド形成し、および典型的にハイブリッド形成されたまま残る洗浄するための条件を表わすものとする。このようなストリンジェントな条件は、当業者に知られており、そして“Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6.に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃で６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)中でハイブリッド形成、続いて５０〜６５℃で、０.２ＸＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ中で１回またはそれ以上洗浄する。ストリンジェントな条件下で配列ＨＭ74またはその相補体にハイブリッド形成された本発明の単離された核酸分子は、自然発生の(naturally occurring)核酸分子に対応することが好ましい。本明細書で使用するように、「自然発生の(naturally occurring)」核酸分子は、自然発生のヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことである(例えば、天然タンパク質をコードする)。
【００６２】
個体群中に存在しうるＨＭ74配列の対立遺伝子の自然発生変異型に加えて、熟練技術者は、さらに、突然変異によってヌクレオチド配列に変化をもたらし、それによってＨＭ74タンパク質の生物活性を実質的に変えることなく、コードされたＨＭ74のアミノ酸配列に変化させることができることを理解するであろう。従って、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換体をもたらすヌクレオチド置換体を作成することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を実質的に変化させることなくＨＭ74の野生型配列から変化させることができる残基である。「必須」アミノ酸残基は、実質的な生物活性に必要なものである。例えば、様々な種のＨＭ74の中で保存されてないまたは半保存しかされてないアミノ酸残基は、活性にとって必須ではなく、従って改変のターゲットとなることが多い。二者択一的に、様々な種のＨＭ74タンパク質の中で保存されたアミノ酸残基は、活性にとって必須であり、従って改変のターゲットとなることはあまりない。
【００６３】
従って、本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含むＨＭ74タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＨＭ74タンパク質は知られているアミノ酸配列と異なるが、生物活性を保持する。一実施態様において、単離された核酸分子は、知られているＨＭ74アミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
知られているＨＭ74の配列と異なる配列を有するＨＭ74タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コードされたタンパク質中に１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を導入するように知られているＨＭ74のヌクレオチド配列に１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を導入することによって作成することができる。
【００６５】
突然変異は、標準技術、例えば部位特異的突然変異生成法およびＰＣＲ仲介による突然変異生成によって導入することができる。１つまたはそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基で、同類アミノ酸置換を行うことが好ましい。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義される。そのファミリーには、塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニンおよびヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸)、非荷電の極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンおよびシステイン)、無極性の側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えばトレオニン、バリンおよびイソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。従って、ＨＭ74において予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることが好ましい。別法として、突然変異は、例えば飽和突然変異生成によってＨＭ74コード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、そして生成した突然変異体は、活性を保持している突然変異体を同定するため、ＨＭ74生物活性についてスクリーニングすることができる。突然変異生成後、コードされたタンパク質を、組換え発現することができ、そしてタンパク質の活性を測定することができる。
【００６６】
関心のある核酸を産生するために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシルおよび２,６−ジアミノプリンが含まれる。
【００６７】
ＨＭ74の機能に影響を与える１つの方法は、ＨＭ74の発現に影響を及ぼすことである。従って、転写レベルは、より小さいまたはより大きいレベルのＨＭ74ｍＲＮＡについて操作することができ、これが順に細胞表面でより小さいまたはより大きいレベルのＨＭ74発現に至る。このような操作を実施する１つの方法は、例えば相同組換えによってＨＭ74コード配列の付近でゲノム中の適当な部位に導入することができる調節可能なプロモーターを用いることである。
【００６８】
従って、本発明の別の態様は、抗ＨＭ74抗体に関する。本明細書に使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性部分、すなわち特異的に抗原、例えばＨＭ74を結合する抗原結合部位を含む分子のことである。ＨＭ74に特異的に結合する分子は、試料、例えば本来ＨＭ74を含有する生体試料においてＨＭ74を結合するが、他の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性部分の例としては、抗体をペプシンのような酵素で処理することによって生成することができるＦ(ａｂ)およびＦ(ａｂ')2フラグメントが含まれる。本発明は、ＨＭ74を結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書に使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＨＭ74の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のイディオタイプまたはクローンを１種類しか含まない抗体分子の集団のことである。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的に特定のＨＭ74タンパク質エピトープについて単一結合親和性を示す。
【００６９】
抗体の様々な他の抗原結合形態は、フラグメント、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、等を含めて当分野で知られているように製造することができる。
【００７０】
本発明の別の態様は、ベクター、好ましくはＨＭ74(またはその部分)をコードしている核酸を含む発現ベクターに関する。本明細書で使用するように、用語「ベクター」は、それに結合した別の核酸を運ぶことができる核酸分子のことである。ベクターの１つのタイプは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。ベクターの別のタイプは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結することができるウイルスベクターである。ある種のベクターは、宿主細胞中で自律複製できる(例えば細菌性の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば非エピソームの哺乳類のベクター)は、宿主細胞へ導入する際、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、操作可能な状態でそれに結合された(operably linked)遺伝子の発現を導くことができる。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド(ベクター)の形態である。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすこのような他の型の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば複製欠損のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むものとする。
【００７１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中で核酸を発現するのに適した形態の本発明の核酸を含む。つまり、組換え発現ベクターには、発現しようとする核酸に操作可能な状態で結合しており、発現に用いる宿主細胞に基づいて選ばれる１つまたはそれ以上の調節配列が含まれる。組換え発現ベクターの中で、「操作可能な状態で結合した(operably linked)」は、ヌクレオチド配列の発現可能な形で興味のヌクレオチド配列が調節配列(複数可)に結合していることを意味するものとする(例えば、ベクターが宿主細胞に導入された時にインビトロ転写／翻訳系においてまたは宿主細胞において)。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節因子(例えばポリアデニル化シグナル)を含むものとする。このような調節配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの(例えば組織特異性調節配列)が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、等のような因子に左右されうることは当業者ならば理解するであろう。本発明の発現ベクターは、本明細書に記載された核酸をコードするタンパク質またはペプチド(例えばＨＭ74、ＨＭ74の変異形、融合タンパク質、等)を生産するため、宿主細胞に導入することができる。
【００７２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いる)、イースト細胞または哺乳動物細胞中でＨＭ74の発現用に設計することができる。適切な宿主細胞は、前出のGoeddel中でさらに議論されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えばＴ7プロモーター調節配列およびＴ7ポリメラーゼを用いてインビトロで転写し、そして翻訳することができる。
【００７３】
別の実施態様において、ＨＭ74発現ベクターは、イースト発現ベクターである。S. cerevisiaeのようなイースト中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234)、ｐＭＦａ (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943)、ｐＪＲＹ88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123)、ｐＹＥＳ2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)およびｐＰｉｃＺ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)が含まれる。
【００７４】
別法として、ＨＭ74は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させることができる。培養された昆虫細胞(例えばＳｆ９細胞)中でタンパク質を発現させるために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列(Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165)およびｐＶＬ系列(Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39)が含まれる。
【００７５】
さらに別の実施態様において、本発明の核酸は、哺乳類の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ8(Seed, Nature (1987) 329:840)およびｐＭＴ2ＰＣ(Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195)が含まれる。哺乳動物細胞に用いる場合、発現ベクターの調節機能は、しばしばウイルス調節因子によってもたらされる。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウィルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞についての他の適切な発現系については、前出のSambrook等の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００７６】
哺乳動物細胞の安定な形質転換については、使用する発現ベクターおよび形質転換技術に応じて、小画分の細胞のみがゲノム中に外来性ＤＮＡを組み込むことができることが知られている。成分の同定および選択には、一般に、選択可能なマーカーをコードする遺伝子(例えば、抗生物質耐性についての)を関心のある遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーとしては、薬物抵抗性を与えるもの、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートが含まれる。選択可能なマーカーをコードしている核酸を、ＨＭ74をコードしているものと同じベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別々のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定してトランスフェクションされた細胞は、薬物選択によって同定することができる(例えば選択可能な標識遺伝子を組み込まれた細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する)。
【００７７】
ＨＭ74と関与し、これを活性化する興味の化合物は、縮合環ジヒドロピランであり、これにはオキシデカリン様化合物が含まれる。オキシデカリンは、オキシデカヒドロナフタレンの別の名称である。このようなジヒドロピランは、一般構造を有する：
興味のジヒドロピランおよびオキシデカリンは、米国特許第６,３９９,６５３号、ＷＯ ９７／４８６９１中およびvon Roedern, Mol. Div. (1998) 3:253-256中に教示されたように製造することができる。
【００７８】
興味のオキシデカリンは、以下の構造を有する：
【化３】
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルケニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルキニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ3−Ｃ18アリール、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基であるか；またはＲ2は、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである、であることができ；またはＸおよびＲ2は、環を形成することができ；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【００７９】
関心のある化合物は、一般にアゴニストである。従って、興味の化合物は、候補薬として開発することができる。また、興味の化合物は、例えば競合アッセイによってＨＭ74を調節する他の分子を同定するために使用することができる。
【００８０】
好ましい化合物は、Ｒ2がメチル、エチルまたはシクロヘキシルである場合、Ｒ1はｎ−アルキルまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルではない；またはＲ1がアセチル基で置換されうるＣ1−Ｃ4アルコールまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルである場合、Ｒ1はｎ(−Ｃ1−Ｃ8)アルキル、(Ｃ1−Ｃ4)分枝アルキルまたはチオ置換されたフェニルではないものである。
【００８１】
用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、sec−ブチル、ペンチルおよびヘキシルである。炭化水素は、１つまたはそれ以上の不飽和三重結合を含むことができる。
【００８２】
用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシである。
【００８３】
「アリール」は、芳香族炭化水素である。例としては、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００８４】
「ヘテロ原子」は、一般に、分子の典型的な原子とは異なる原子である。従って、炭化水素において炭素または水素ではないすべての原子はヘテロ原子である。一般に生物学的に許容しうるヘテロ原子には、酸素、硫黄および窒素が含まれる。
【００８５】
用語「ヘテロアリール」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアリール基のことである。例としては、ピリジル、イミダゾリル、ピロリル、チエニル、フリル、ピラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、ナフチリジニルおよびイソオキサゾリルである。
【００８６】
用語「シクロアルキル」は、環式炭化水素のことである。いくつかの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。
【００８７】
「複素環」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたシクロアルキルである。例は、ピロリジニル、ピペリジニルおよびピペラジニルである。
【００８８】
用語「ヘテロアルキル」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアルキルである。エーテルは、ヘテロアルキルである。
【００８９】
「置換された」は、ベースとなる有機基が１つまたはそれ以上の置換基を有することを意味する。従って、原子または基は、分子中で別の原子または基と置き換わる。代表的な置換基としては、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ8アルキル、−ＣＮ、アルコキシル、ヒドロキシル、スルフィド、スルフェート、スルホンアミド、アミン、アミド、アルコール、ケト基、Ｃ6−Ｃ18アリール、ハロゲン化Ｃ1−Ｃ18アルキル、亜硝酸基または硝酸基が含まれる。
【００９０】
「ハロゲン」は、例えば塩素、フッ素または臭素である。
【００９１】
「アルケニル」は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む炭化水素である。炭化水素は分枝していてもよい。
【００９２】
用語「環」は、１つの環構造または複数の環構造の１つを意味し、その際、複数の環の２つまたはそれ以上が縮合していてもよく、複数の環、複数の環の１つまたはそれ以上は、芳香族であってもよく、ヘテロ原子を含むことができ、置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである。環は二環式または多環式であってもよく、そして橋かけを含んでいてもよい。
【００９３】
関心のある化合物はＨＭ74と結合し、ＨＭ74を活性化するが、ＨＭ74Ａには結合しない。
【００９４】
関心のあるオキシデカリンは、当分野で知られているように合成することができる(米国特許第６,３９９,６５３号)。
【００９５】
本発明のオキシデカリン様化合物は、投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。このような組成物は、典型的に活性成分および医薬上許容しうる担体を含んでなる。本明細書で使用するように、用語「医薬上許容しうる担体」は、医薬投与に適合しうる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性のおよび吸収を遅らせる物質、等のいずれかおよびすべてを含むものとする。医薬活性物質のためのこのような媒体および物質の使用は、当分野でよく知られている。いずれか慣用の媒体または物質が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用を意図する。また、補助活性化合物を組成物に組み込むことができる。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合しうるように処方する。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮的(局所)、経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下用途に用いる液剤または懸濁剤は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸または塩基(例えばＨＣｌまたはＮａＯＨ)で調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックから製造されたアンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアル中に封入することができる。
【００９７】
注射用途に適した医薬組成物は、滅菌水性液剤(水溶性の場合)または分散剤および滅菌注射液剤または分散剤を即座に調製するための滅菌散剤が含まれる。静脈内投与では、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ(R)(BASF; Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)が含まれる。すべての場合において、組成物を滅菌しなければならず、そして容易にシリンジ化可能な程度にまで流動性でなければなれらない。組成物は、製造および貯蔵条件において安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に備えて保存しければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコール等)およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等によって行うことができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば砂糖、多価アルコール(例えばマンニトール)、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００９８】
滅菌注射液剤は、必要な量の活性化合物を上記列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適当な溶媒中に組み込み、必要に応じて、その後、滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を基本的な分散媒体および上記列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製する。滅菌注射液剤を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより予め滅菌濾過された溶液から活性成分＋任意の添加所望成分の粉末が得られる。
【００９９】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または可食性担体を含む。組成物はゼラチンカプセル中に封入するかまたは圧縮して錠剤にすることができる。経口治療の投与では、活性化合物を賦形剤と共に組み込むことができ、そして錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用する。また、経口組成物は、シロップまたは液体製剤を得るための液体担体を用いて調製することができ、またはうがい薬としての使用のために調製され、ここで液体担体中の化合物を経口的に適用し、うがいして吐き出すまたは飲み込む。
【０１００】
医薬上適合しうる結合剤、および／または補助物質は、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、等は、以下の成分：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelまたはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または着香剤、例えばハッカ、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のいずれかまたは類似の性質の化合物を含むことができる。
【０１０１】
吸入による投与では、適切な噴射剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で化合物を送達する。
【０１０２】
また、全身投与は、経粘膜または経皮的な手段によることができる。経粘膜または経皮投与では、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に用いる。このような浸透剤は、一般に当分野で知られており、そして例えば、経粘膜投与では、デタージェント、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内噴霧器または坐剤を使用して実施することができる。経皮投与では、活性化合物を一般に当分野で知られているように軟膏、サルヴ剤（salves）、ゲル剤またはクリームに処方する。
【０１０３】
また、化合物は、直腸送達のための坐剤(例えば、慣用の坐剤基剤、例えばカカオ脂および他のグリセリドを用いて)または停留浣腸剤の形態で調製することができる。
【０１０４】
一実施態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達システムを含む放出制御製剤のように、身体から化合物が急速に排泄させるのを防ぐ担体を用いて調製される。生分解性の、生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。
【０１０５】
このような製剤の調製方法は、当業者に明らかである。また、材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することができる。また、リポソームの懸濁剤(モノクローナル抗体で感染細胞に標的設定されたリポソーム剤を含む)は、医薬上許容しうる担体として使用することができる。それは、当業者に知られている方法に従って、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載されたように調製することができる。
【０１０６】
投与を容易にし、用量を均一にするため単位投薬形態で経口または非経口の組成物を処方することは特に好都合である。本明細書で使用する単位投薬形態は、治療しようとする対象者のための単回の投薬に適した物理的に分離された単位のことであり；それぞれの単位は所望の治療効果を得るために算出された活性化合物の所定の量を必要な医薬担体と共に含んでなる。例えば１回またはそれ以上の分割投与によるかまたは持続注入によるかどうかにかかわらず、患者に投与するための初期の候補用量は、疾患のタイプおよび重症度に応じて、活性成分約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ)である。典型的な日用量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲となりうる。数日またはそれより長い反復投与では、状態に応じて、疾患の症状が望ましく抑制されるまで治療を持続させる。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。治療の進行は、慣用の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。典型的な用法・用量は、ＷＯ ９４／０４１８８に開示されている。本発明の単位投薬形態について詳細は、活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果および個体の治療のためこのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって定まり、これらに直接左右される。
【０１０７】
医薬組成物は、投薬説明書と共に容器、パックまたはディスペンサー中に梱包することができる。
【０１０８】
興味のＨＭ74モジュレーターは、スクリーニングアッセイおよび治療方法(例えば、治療および予防)に使用することができる。興味のＨＭ74モジュレーターは、ＨＭ74活性または発現を調節する他の薬物または化合物をスクリーニングするために、そして炎症を特徴とする障害を治療するために使用することができる。また、興味のモジュレーターは、ＨＭ74タンパク質の不十分なもしくは過剰の産生から生じる、またはＨＭ74野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有するＨＭ74タンパク質形態の産生によって生じる病気における使用を見いだすことができる。さらに、本発明は、スクリーニングアッセイによって同定された新規なＨＭ74モジュレーターおよび本明細書に記載された治療のためのその使用に関する。
【０１０９】
本発明は、モジュレーター、すなわち、ＨＭ74に結合し、そして例えばＨＭ74発現またはＨＭ74活性における刺激または抑制効果を有する候補物質または試験化合物または薬剤(例えばペプチド、ペプチドミメティック、小分子、抗体または他の薬物)を同定するための方法(また、本明細書では「スクリーニングアッセイ」と称する)を提供する。
【０１１０】
一実施態様において、本発明は、ＨＭ74を結合しまたはＨＭ74の活性を調節する候補物質または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。従って、スクリーニングアッセイを用いてＨＭ74を調節する他のフロセミド様およびオキシデカリン様化合物を同定することができる。また、このようなモジュレーターを競合アッセイ中に使用してＨＭ74アンタゴニストのような他のモジュレーターを同定することができる。
【０１１１】
一実施態様において、アッセイは、細胞に基づくアッセイであり、細胞表面でＨＭ74の膜結合形態を発現する細胞を試験化合物と接触させてＨＭ74を活性化する試験化合物の能力を測定する。細胞は、例えば、イースト細胞または哺乳動物起源の細胞であることができる。ＨＭ74を活性化する試験化合物の能力の測定は、例えば試験化合物を放射性同位元素または酵素標識と結合させることによって実施することができ、その結果試験化合物のＨＭ74への結合は、ＨＭ74との複合体中で、またはＨＭ74が位置する場所で標識化合物を検出することによって測定することができる。例えば、試験化合物は、直接または間接的に125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで標識化することができ、そして放射性同位元素は放射線放出を直接カウントするか、またはシンチレーションカウントによって検出される。別法として、試験化合物は、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼによって標識化することができ、そして酵素標識は、適切な基質が生成物に変換するのを測定することによって検出される。好ましい実施態様において、アッセイは、細胞表面のＨＭ74の膜結合形態を発現する細胞を試験化合物と共にＨＭ74を結合する知られている化合物と接触させ、知られている化合物と競合してＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含む。
【０１１２】
別の実施態様において、アッセイは、細胞表面上でＨＭ74の膜結合形態を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そしてＨＭ74の活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)試験化合物の能力を測定することを含む、細胞に基づくアッセイである。ＨＭ74の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えばＨＭ74を活性化または阻害する試験化合物の能力を測定することによって実施することができる。それは活性化されたＨＭ74が、シグナル伝達経路に関連する細胞内のまたは膜の標的分子と相互作用するときに顕在化する可能性がある。本明細書で使用するように、「標的分子」は、事実上ＨＭ74が結合するまたは相互作用する分子、例えばＨＭ74を発現する細胞表面上の分子、第２の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜または細胞質の分子の内側面と関連する分子である。ＨＭ74標的分子は、非ＨＭ74分子であることができる。一実施態様において、ＨＭ74標的分子は、細胞膜を通しておよび細胞中に細胞外シグナル(例えば化合物がＨＭ74へ結合することによって生じるシグナル)の伝達を促進するシグナル伝達経路の成分である。標的は、例えば触媒活性を有する第２の細胞間タンパク質または下流のシグナル伝達分子とＨＭ74との結合を促進するタンパク質であることができる。
【０１１３】
ＨＭ74標的分子と結合するまたは相互作用するＨＭ74の能力の測定は、直接結合を測定するための上記方法の１つによって実施することができる。好ましい実施態様において、ＨＭ74標的分子と結合するまたは相互作用するＨＭ74の能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって実施することができる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞の第二メッセンジャーの誘発を検出する(例えば細胞内Ｃａ2+、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、等)、適切な基質上で標的の触媒／酵素活性を検出する、レポーター遺伝子の誘発を検出する(例えば、検出可能なマーカーをコードしている核酸に操作可能な状態で結合したＨＭ74反応性の調節要素、例えばルシフェラーゼ)または細胞の反応、例えば細胞の分化または細胞増殖を検出することによって測定することができる。
【０１１４】
さらに別の実施態様において、本発明のアッセイは、ＨＭ74を試験化合物と接触させ、そしてＨＭ74に結合する試験化合物の能力を測定することを含む細胞を含まないアッセイである。試験化合物のＨＭ74への結合は、先に述べたように、直接または間接的に測定することができる。好ましい実施態様において、アッセイは、ＨＭ74を試験化合物と共に本発明の知られている化合物と接触させ、そして本明細書に記載された知られている化合物のＨＭ74活性に影響を与える試験化合物の能力を測定することを含む。ＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力の測定は、本明細書に記載された知られている化合物の結合と比べて優先的にＨＭ74と結合する試験化合物の能力を測定することを含む。
【０１１５】
別の実施態様において、アッセイは、ＨＭ74を試験化合物と接触させ、そしてＨＭ74の活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)試験化合物の能力を測定することを含む細胞を含まないアッセイである。ＨＭ74の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば直接結合を測定するための上記方法の１つによって、ＨＭ74標的分子に結合する活性化ＨＭ74の能力を測定することによって実施することができる。別の実施態様において、ＨＭ74の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、ＨＭ74標的分子をさらに調節するＨＭ74の能力を測定することによって実施することができる。例えば、適切な基質の標的分子の触媒／酵素活性は、先に記載したように測定することができる。
【０１１６】
さらに別の実施態様において、細胞を含まないアッセイは、ＨＭ74を、試験化合物とＨＭ74を結合させる知られている化合物と接触させ、そしてＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、その際、ＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力の測定は、ＨＭ74標的分子に優先的に結合するまたはＨＭ74標的分子の活性を調節するＨＭ74の能力を測定することを含む。
【０１１７】
受容体は、必ずしもリガンド結合を阻害しないが、受容体中で構造変換を生じてＧタンパク質結合またはおそらく活性化を生じることができる受容体凝集、二量化またはクラスター形成を可能にする非リガンド分子によって活性化することができる。
【０１１８】
本発明の細胞を含まないアッセイは、ＨＭ74の可溶形態および膜結合形態の両方の使用に適する。ＨＭ74の膜結合形態を含む、細胞を含まないアッセイの場合、ＨＭ74の膜結合形態が溶液中で維持されるように可溶化剤を用いることが望ましいといえる。このような可溶化剤の例としては、非イオン性デタージェント、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Triton-X-100、Triton-X-114、Thesit(R)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンミノ]−１−プロパンスルホネート(CHAPS)、３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(CHAPSO)またはＮ−ドデシル＝Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが含まれる。
【０１１９】
別の実施態様において、宿主細胞上で発現する場合、一定の活性状態にあるようＨＭ74を変化させる。ＨＭ74を変化させると、リガンドを結合させる必要なく受容体を活性にすることができる。活性化された受容体を得る１つのやり方は、リガンド結合することなくＨＭ74を変化させてＧタンパク質と相互作用させることである。変化は、受容体と細胞内Ｇタンパク質との結合を可能にするリガンド結合における受容体の立体配座の変化に似ている。そのような一つのアプローチは、ＷＯ ００／２２１２９に記載されている。
【０１２０】
ＷＯ ００／２２１２９は、構成的活性が得られるＴＭ6およびＩＣ3の領域における特定のアミノ酸を教示している。部位特異的突然変異誘発、サブクローニング、等のような特定のアミノ酸をＨＭ74に組み込む方法は、当分野で知られている。次いで、変化したＨＭ74分子を宿主細胞中で発現させて構成的に活性なＨＭ74を得る。
【０１２１】
次いで、活性化された細胞を、ＨＭ74アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、等、ＨＭ74活性を変化させる分子であることが推測される分子に暴露する。Ｇタンパク質活性を変化させるそれらの分子は、医薬開発において知られている方法を用いてＨＭ74代謝の変化と関連する障害を治療するための目標とされる。
【０１２２】
本発明の上記のアッセイ方法の複数の実施態様において、ＨＭ74またはその標的分子のいずれかを固定してタンパク質の一方または両方の複合体形成してない形態から複合形態の分離を促進するだけでなく、アッセイの自動化に適応させることが望ましいといえる。試験化合物のＨＭ74への結合または候補化合物の存在下および欠如下での標的分子とＨＭ74との相互作用は、反応体を含むのに適したいずれかの容器中で実施することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心分離管が含まれる。一実施態様において、タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させるドメインを加えた融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＨＭ74融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロース(R)ビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができる。次いで、その複合体を試験化合物および非吸着の標的タンパク質またはＨＭ74タンパク質と合わせ、そして混合物を複合体形成に適した条件下で(例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件で)インキューベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄してすべての非結合成分を除去し、そして複合体形成を、例えば先に述べたように直接または間接的に測定する。別法として、複合体をマトリックスから分離して、標準技術を用いてＨＭ74結合または活性のレベルを測定することができる。
【０１２３】
また、マトリックス上でタンパク質を固定する別の技術を本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、ＨＭ74またはその標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を用いて固定することができる。ビオチン化されたＨＭ74または標的分子は、当分野でよく知られた技術(例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチンＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド)から製造し、そしてストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレート(Pierce Chemicals)のウェル中に固定することができる。別法として、ＨＭ74または標的分子と反応性であるが、ＨＭ74タンパク質の標的分子への結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、結合していない標的またはＨＭ74を、抗体結合によってウェル中に捕捉することができる。このような複合体の検出方法としては、ＧＳＴ固定された複合体について上記されたもの加えて、ＨＭ74または標的分子と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出の他にＨＭ74または標的分子に伴う酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１２４】
別の実施態様において、ＨＭ74発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中でのＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下でのＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを候補化合物がない場合のＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、その比較に基づいて候補化合物をＨＭ74発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、候補化合物の欠如下よりも、候補化合物の存在下でＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がより大きい(統計学的に有意に大きい)場合、候補化合物は、ＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質またはアゴニストとして同定される。あるいは、ＨＭ74ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の欠如下よりも候補物質の存在下でより少ない(統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物は、ＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤またはアンタゴニストとして同定される。ＨＭ74活性が、リガンドまたはアゴニストの存在下で、または構成的ＨＭ74中でベースラインより下に減少する場合、候補化合物は、インバースアゴニストとして同定される。細胞中のＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載された方法によって測定することができる。
【０１２５】
大量の純粋なＨＭ74を製造することができるので、合理的なドラッグデザインをする際、有望な機能領域の高次構造の物理的な特性評価を確かめることができる。例えば、分子のＩＣ3領域およびＥＣドメインは、特に興味深い領域である。領域の形状およびイオン配置がわかったら、その領域と相互作用する候補薬物を構成し、次いでインタクトの細胞、動物および患者で試験することができる。このような構造情報を導くことができる方法としては、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、分子モデリング等が含まれる。また、３Ｄ構造により、特定の部位で作用する知られている薬物が存在する場合、他の知られているタンパク質において類似の立体配座部位を同定することができる。それらの薬物またはその誘導体は、ＨＭ74に関する用途を見いだすことができる。
【０１２６】
さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤および本明細書に記載された治療のためのその使用に関する。
【０１２７】
本発明は、異常なＨＭ74発現または活性と関連する障害の危険性がある(すなわち、かかりやすい)またはその障害を有する対象者を治療する予防的および治療的な両方法を提供する。このような障害としては、例えば炎症性障害、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患および関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
一態様において、本発明は、対象者にＨＭ74発現または少なくとも１つのＨＭ74活性を調節する薬剤を投与することによって、対象者において異常なＨＭ74発現または活性に関連する疾患または状態を予防する方法を提供する。異常なＨＭ74発現または活性によって生じるまたはそれが原因となる疾患の危険性のある対象者は、例えば、本明細書に記載した診断法または予測アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。疾患または障害を予防するまたは代わりに進行を遅らせるように、ＨＭ74異常の症状の特徴が発現する前に予防的な薬剤の投与を行うことができる。ＨＭ74異常のタイプに応じて、例えばＨＭ74アゴニストまたはＨＭ74アンタゴニストの薬剤を、対象者の治療に使用することができる。本明細書に記載されたスクリーニングアッセイに基づいて適切な薬剤を決定することができる。
【０１２９】
本発明の別の態様は、治療目的でＨＭ74発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、細胞と関連するＨＭ74の活性の１つまたはそれ以上を調節する薬剤と接触させることを含む。ＨＭ74活性を調節する薬剤は、本明細書に記載された薬剤、例えばフロセミドまたはオキシデカリン、核酸またはタンパク質、ＨＭ74タンパク質の自然発生の同種のリガンド、ペプチド、ＨＭ74ペプチドミメティックまたは他の小分子であることができる。一実施態様において、薬剤は、ＨＭ74の生物活性の１つまたはそれ以上を刺激する。別の実施態様において、薬剤は、ＨＭ74タンパク質の生物活性の１つまたはそれ以上を阻害する。このような阻害剤の例としては、抗ＨＭ74抗体が含まれる。調節的な方法は、インビトロで(例えば、薬剤と共に細胞を培養することによって)または、代わりに、インビボで(例えば、対象者に薬剤を投与することによって)実施することができる。このように、本発明は、ＨＭ74の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害で苦しむ人の治療方法を提供する。一実施態様において、方法は、薬剤(例えば本明細書に記載されたスクリーニングアッセイによって同定された薬剤)またはＨＭ74発現または活性を調節する薬剤の組み合わせ(例えば、上方制御または下方制御する)を投与することを含む。
【０１３０】
ＨＭ74活性の刺激は、ＨＭ74が異常に下方制御されたおよび／または高められたＨＭ74活性が有益な効果をもたらす見込みがある状況において望ましい。これに対して、ＨＭ74活性の阻害は、ＨＭ74が異常に上方制御されたおよび／または低下したＨＭ74活性が有益な効果をもたらす見込みがある状況において望ましい。
【０１３１】
〔実施例〕
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それは制限するものとして解釈すべきではない。本願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
実施例１ ＨＭ74を発現する哺乳動物細胞の産生
ｈＨＭ74をコードするｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニングし、そして哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞または２９３細胞中にトランスフェクションした。
【０１３３】
ＨＭ74を過剰発現する哺乳動物細胞を産生させるため、６ウェルの３５ｍｍ組織培養プレート(ウェル当たり３×１０５の哺乳動物細胞(ATCC Catalog No. CRL-1573))において、ＤＭＥＭ培地(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)２ｍｌ中、１０％ウシ胎児血清(Gibco/BRL Catalog No. 1600-044)の存在下で哺乳動物細胞を培養した。
【０１３４】
次いで、細胞が５０〜８０％集密になるまでＣＯ2インキュベータ中３７℃で細胞をインキューベートした。ＨＭ74のクローニングされたｃＤＮＡ核酸配列をｐｃＤＮＡ３.１クローニングベクター(Invitrogen, Catalog No. V790-20)中に挿入した。ＤＮＡ２μｇを無血清Ｆ１２ハム培地１００μｌ中に希釈した。それとは別に、リポフェクトアミン試薬(Life Technologies, Catalog No. 18324-020)２５μｌを無血清Ｆ１２ハム培地１００μｌ中に希釈した。次いで、ＤＮＡ溶液およびリポフェクトアミン溶液を穏やかに混合し、室温で４５分インキューベートし、ＤＮＡ脂質複合体を形成させた。
【０１３５】
細胞を、無血清Ｆ１２ハム培地２ｍｌで１回すすいだ。それぞれのトランスフェクションについて(６ウェルプレート中で６トランスフェクション)、無血清Ｆ１２ハム培地０.８ｍｌを、ＤＮＡ脂質複合体を含む溶液(０.２ｍｌの総体積)に加え、穏やかに混合した。次いで、得られた混合物(以下、「トランスフェクション混合物」)をすすいだ細胞上にかぶせた(０.８ｍｌ＋０.２ｍｌ)。抗細菌試薬は加えなかった。次いで、細胞を脂質ＤＮＡ複合体と共にＣＯ2インキュベータ中３７℃で１６時間インキューベートしてトランスフェクションさせた。
【０１３６】
培養期間が完了した後、最初にトランスフェクション混合物を除去することなく、１０％ウシ胎児血清を含むＦ１２ハム培地１ｍｌを細胞上にかぶせた。トランスフェクションの１８時間後、細胞にかぶせた媒体を吸い出した。次いで、細胞をＰＢＳ，ｐＨ２〜４ (Gibco/BRL Catalog No. 10010-023)で洗浄し、そしてＰＢＳを、５％血清を含むＦ１２ハム培地(「選択培地」)で置き換えた。トランスフェクションの７２時間後、抗菌剤ジェネティシン(Life Technologies, Catalog No. 11811)を４００μｇ／ｍｌで含む選択培地中に細胞を１０倍希釈した。
【０１３７】
実施例２ アゴニストアッセイ
ヒトＨＭ74のアゴニストをスクリーニングするため、ＨＭ74をＧq機構に人工的に共役させることができる。Ｇq機構の活性化は、細胞内の筋小胞体からのＣａ2+の放出を刺激する。Ｃａ2+が細胞質中に放出され、これはＣａ2+キレート化色素を用いて検出することができる。蛍光測定イメージングプレートリーダーまたはＦＬＩＰＲ(R)装置(Molecular Devices)を用いて蛍光において生じたなんらかの変化をモニターする。アゴニストの活性は、蛍光におけるなんらかの増加によって反映される。
【０１３８】
ＨＭ74を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を予め操作してＧｑタンパク質(Ｇα１６)の無差別形態(indiscriminate form)を発現させた。このような細胞を製造するため、Ｇα１６共役型ＣＨＯ細胞を商業的に入手し(Molecular Devices LIVEWARETM cells, Catalog No. RD-HGAl6)、実施例１のプロトコールに続いてそれらの細胞中のＨＭ74の発現を促進した。
【０１３９】
１０％ウシ胎児血清、１００ｌＵ／ｍｌペニシリン(Gibco/BRL, Catalog No. 15140-148)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(Catalog No. 15140-148, Gibco/BRL)、４００μｇ／ｍｌジェネティシン(Ｇ４１８)(Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035)および２００μｇ／ｍｌゼオシン(Invitrogen, Catalog No. R250-05)を含むＦ１２ハム媒体(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)中、３７℃および５％ＣＯ２で細胞を増殖対数期に維持した。アッセイの１日前に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞１２，５００細胞／ウェルを96/384 Multidropデバイス(Labsystems, Type 832)を用いてウェル体積５０μｌを有する３８４ウェルの透明な底部のアッセイプレート(Greiner/Marsh, Catalog No. N58102)上で培養した。加湿された５％ＣＯ2インキュベータ(Forma Scientific CO2 water jacketed incubator Model 3110)中、３７℃で細胞をインキューベートした。
【０１４０】
以下の保存溶液を調製した：Hepes(Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080)の１Ｍ保存溶液(ｐＨ７.５)；１Ｎ ＮａＯＨ中に作成したプロベニシド(Sigma, Catalog No. P8761)の２５０ｍＭ保存溶液；およびＤＭＳＯ (Sigma D2650)中に作成したFluo 4-AM Dye (Molecular Probes, Catalog No. Fl 4202)の１ｍＭ保存溶液。ハンクス平衡塩類溶液(Fisher/Mediatech, Catalog No. MT21023)１０００ｍｌ、１Ｍ Hepes保存溶液２０ｍｌおよび２５０ｍＭプロベニシド保存溶液１０ｍｌを用いて反応緩衝液を調製した。ローディング緩衝液を調製するため、１ｍＭ Fluo 4-AM Dye保存溶液１.６ｍｌをプルロニック酸(Molecular Probes, Catalog No. P6866)０.３２ｍｌと混合し、次いで上記の反応緩衝液４００ｍｌおよびウシ胎児血清４ｍｌと混合した。
【０１４１】
アッセイの１時間前に、96/384 Multidropデバイスを用いて新たに調製したローディング緩衝液５０μｌを３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。加湿されたインキュベータ中３７℃で細胞をインキューベートして色素取込みを最大にした。アッセイの直前に、プレート底面より少なくとも１０ｍｍ上に設定された吸引ヘッドを有する384 EMBLA Cell Washer (Skatron; Model No. 12386)を用いて細胞を反応緩衝液９０μｌで２回洗浄し、ウェル当たり４５μｌの緩衝液を残した。
【０１４２】
FLIPR(R) II (Molecular Devices)機器のＣＣＤカメラ(Princeton Instruments)をｆ−ストップ２.０および露出０.４秒に設定した。カメラを用いて色素ローディングの精度について細胞プレートをモニターした。
【０１４３】
候補となるオキシデカリン様化合物を含む化合物ライブラリーをそれぞれウェル当たり生理学的塩類緩衝液中約１０μＭの濃度で試験した。蛍光における変化を化合物添加前に１０秒間測定した。化合物を添加した後、最初の１分間は毎秒、蛍光を測定し、続いて全実験分析時間３分間の間に６秒毎に露光した。第１０スキャン後、１００μＭ保存化合物の５μｌアリコートを加え、１０μＭの細胞における最終化合物濃度を得た。最初の８０スキャンについての最大蛍光変化をアゴニスト活性の基準として記録し、そして１０μＭ ＡＴＰ (Sigma A9062)により誘発された最大蛍光変化と比較した。
【０１４４】
多くのオキシデカリン化合物は、ＨＭ74を活性化することがわかった。
【０１４５】
実施例３ アンタゴニストアッセイ
ヒトＨＭ74のアンタゴニストについてスクリーニングするため、ＨＭ74を、Ｇq機構に人工的に共役させることができる。実施例２のようにして、FLIPR(R)装置を用いて蛍光において生じたすべての変化をモニターする。アンタゴニストの活性は、蛍光におけるなんらかの減少によって反映される。
【０１４６】
ＨＭ74を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を予め操作し、実施例２に記載したようにＧｑタンパク質(Ｇα１６)の無差別形態(indiscriminate form)を発現させた。１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン(Gibco/BRL, Catalog No. 15140-148)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(Catalog No. 15140-148, Gibco/BRL)、４００μｇ／ｍｌジェネティシン(Ｇ４１８)(Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035)および２００μｇ／ｍｌゼオシン(Invitrogen, Catalog No. R250-05)を含むＦ１２ハム培地(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)中３７℃および５％ＣＯ２で細胞を増殖対数期に維持した。アッセイの１日前、96/384 Multidropデバイスを用いてウェル体積５０μｌを有する３８４ウェルの黒い／透明な底部のアッセイプレート(Greiner/Marsh, Catalog No. N58102)上でＣＨＯ−Ｋ１細胞１２,５００細胞／ウェルを培養した。加湿された５％ＣＯ2中３７℃で細胞をインキューベートした。
【０１４７】
以下の保存溶液を調製した：Hepes(Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080)の１Ｍ保存溶液(ｐＨ７.５)；１Ｎ ＮａＯＨ中に作成されたプロベニシド(Sigma, Catalog No. P8761)の２５０ｍＭ保存溶液；ＤＭＳＯ (Sigma D2650)中に作成されたFluo 4-AM Dye(Molecular Probes, Catalog No. F 14202)の１ｍＭ保存溶液；およびリガンドまたはアンタゴニストの保存溶液。ハンクス平衡塩類溶液(Fisher/Mediatech, Catalog No. MT21023)１０００ｍｌ、１Ｍ Hepes保存溶液２０ｍｌ、２５０ｍＭプロベニシド保存溶液１０ｍｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ2を用いて反応緩衝剤を調製した。ローディング緩衝液を調製するため、１ｍＭ Fluo 4-AM Dye保存溶液８０μｌをプルロニック酸(Molecular Probes, Catalog No. P6866)１６μｌと混合し、次いで、上記の反応緩衝液２０ｍｌおよびウシ胎児血清０.２ｍｌと混合した。
【０１４８】
アッセイの３０分前、96/384 Multidropデバイスを用いて、新たに調製したローディング緩衝液３０μｌを３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。加湿されたＣＯ２インキュベータ中３７℃で細胞をインキューベートして色素取込みを最大にした。アッセイ直前に、プレート底面より少なくとも４０ｍｍ上に設定された吸引ヘッドを有する384 EMBLA Cell Washerを用いて細胞を反応緩衝液１００μｌで３回洗浄し、ウェル当たり緩衝液４５μｌを残した。
【０１４９】
Platemate 384 pipetor(Matrix)を用いて１００μＭ保存アンタゴニスト化合物５μｌを細胞に加えた。インキュベーション工程中の化合物濃度は、約１０μＭであった。細胞をFLIPR(R) IIに置き、プレートの蛍光は、最初の１分間は毎秒測定し、続いて全実験分析時間３分間の間に６秒ごとに露光させた。第１０スキャンの後、アンタゴニストまたはリガンド(１０μＭ)を加えた。それぞれ添加した後、３８４のチップを、水中０.０１％ＤＭＳＯ２０μｌで１０回洗浄した。
【０１５０】
ＨＭ74細胞は、同定されたアゴニストに暴露することができまたは候補アンタゴニストで試験した後に暴露することができる。
【０１５１】
実施例４ 受容体結合アッセイ
ＨＭ74を含む膜画分を調製するため、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水(１０ｍｌ)中でインキュベーションすることによってＨＭ74を発現するＣＨＯ細胞系を集めた。細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡ(１０ｍｌ)を含むリン酸緩衝生理食塩水中でさらに３回洗浄した後、緩衝液Ａ(５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ７.８)(Sigma T6791)５ｍｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 (Sigma M8266)および１ｍＭ ＥＧＴＡ (Sigma 0396)中で再懸濁した。
【０１５２】
次いで、組織ホモジナイザー(Polytron, Kinemetica, Model PT 10/35)で１分間、細胞を粉砕した。生成したホモジネートをSorvall Instruments RC3B冷却遠心機中、４℃で２０分間４９,０００Ｘｇで遠心分離した。得られたペレットを緩衝液Ａ２５ｍｌ中で再懸濁し、そして遠心分離工程を３回繰り返した。最後に遠心分離した後、再びペレットを緩衝液Ａ５ｍｌ中に再懸濁し、等分し、そして−７０℃で保存した。
【０１５３】
膜画分およびトレーサーとして放射性同位元素標識化された興味のアゴニストを用いた受容体結合実験を実施した。アッセイは、９６ウェルプレート(Beckman Instruments)で実施した。結合反応物は、０.１％ウシ血清アルブミン(Sigma, Catalog No. 34287) (Im et al., J. Biol. Chem. (2000) 275(19): 14281-14286参照)を含む緩衝液Ａの最終体積０.２ｍｌ中、放射性アゴニスト(０.０１ｎＭ〜２５ｎＭ)の存在下でＣＨＯ細胞調製物１８μｇからなる。反応物を室温で１時間インキューベートした。０.３％ポリエチレンイミン(Sigma, Catalog No. P3143)および０.１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)で１時間、前処理したマルチチャネル収穫器(Brandell)上でWhatman GF/Cフィルタを通して濾過することによって反応を終了した。混合物をフィルタに適用し、１時間インキューベートした。フィルタを氷冷５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ７.６)１ｍｌで６回洗浄した。特異的結合は、放射活性の測定による各トレーサー濃度について全結合と非特異的結合(バックグラウンド)との間の差分に基づいて算出した。８〜１６の濃度データポイントを得、アゴニストと受容体との間の平衡状態で達成された受容体へのアゴニストの結合を測定した(平衡結合パラメーター)。競合アッセイにおいて、試験化合物を混合物に加え、受容体上で放射性アゴニストの結合について競合させた(競合結合値)。阻害曲線を作成し、結合の５０％阻害を達成するのに必要な濃度(ＩＣ50)を決定した。
【０１５４】
実施例５ 小分子アゴニスト
一連のオキシデカリン様分子を先に述べたようなＨＭ74を発現する細胞に暴露した。標的分子を標識化してＨＭ74への結合が生じたかどうかを測定した。洗浄後で細胞の標識化の程度を測定することによって結合を検出した。また、２Ｄゲル電気泳動によってＨＭ74を単離し、そのタンパク質と関連する標識化の程度を測定することによって結合を確かめた。その結合評価に続いて、またはその結合評価とは別に、ＨＭ74を活性化する候補アゴニストの能力を測定した。FLIPRアッセイを用いてＨＭ74への標的分子の結合における細胞内カルシウム動員を評価した。これによってカルシウム動員を生じたオキシデカリン分子を同定した。
【０１５５】
本発明を説明してきたが、技術者は、本明細書に教示された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書の教示に対して種々の変更および改良を行うことができることを知っている。
【０１５６】
本明細書に引用されたすべての文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００１】
Ｇタンパク質共役型受容体(ＧＰＣＲ)は、細胞のシグナル伝達に含まれる必須膜タンパク質である。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光を含む種々の細胞外シグナルに反応して、細胞中で第二メッセンジャー反応を開始するようにシグナルを変換することができる。多くの治療薬物は、ＧＰＣＲを標的にしており、その理由は、それらの受容体が炎症、血管拡張、心拍、気管支拡張、内分泌および蠕動を含む様々な生理反応に介在するからである。
【０００２】
喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、乾癬および関節リウマチ(ＲＡ)といったような疾患は、一般にＴヘルパー細胞、単球マクロファージおよび好酸球を含む炎症性の病因を有すると考えられる。コルチコステロイドを用いた現在の抗炎症治療は、喘息に有効であるが、代謝性のおよび内分泌の副作用を伴う。肺または鼻粘膜を通して吸収することができる吸入製剤についても、おそらく同じことが言える。ＲＡまたはＣＯＰＤについて満足な経口治療は、今のところない。
【０００３】
ヒト単球からのＨＭ74の分子クローニングでは、ＨＭ74はケモカイン受容体であることが予測される(Nomura et al., Int. Immunol. (1993) 5(10): 1239 1249)。ＨＭ74は、主として骨髄、脾臓、扁桃および気管で発現する。
【０００４】
また、ヒト細胞には、関連があるが異なる受容体ＨＭ74Ａが含まれる。ＨＭ74とＨＭ74Ａのアミノ酸配列は、約９５％が同一である。しかしながら、ＨＭ74Ａのリガンドは知られているが、ＨＭ74のリガンドが知られていない。ナイアシンまたはニコチン酸は、ＨＭ74Ａリガンドである(Wise et al., J. Biol. Chem. 278:9869-9874, 2003)。しかし、ナイアシンは、ＨＭ74の活性化因子としては劣る。
【０００５】
マウスゲノムはＨＭ74遺伝子でなくＨＭ74Ａ遺伝子を含む。
【０００６】
ある状況下では、ＨＭ74およびＨＭ74Ａは、同時制御を示す。出願人らは、Taqman ＰＣＲを用いて、ＨＭ74およびＨＭ74Ａの発現が、顆粒球ではＴＮＦαによって５０倍、そして単球ではＬＰＳまたはＴＮＦαによって１０〜２０倍誘発されることを見出した。また、ＨＭ74およびＨＭ74の発現は、喘息の病因に重要であることが知られているＴＨ２サイトカイン、ＩＬ４またはＩＬ１３によって正常なヒト気管支上皮細胞において４〜５倍誘発される。ＨＭ74およびＨＭ74Ａの発現は、ヒト一次好酸球(human primary eosinophil)においてＩＬ５によって上方制御される。最終的に、肺のＨＭ74Ａ発現は、ネズミの実験的な喘息モデルにおいて上方制御される。
【０００７】
ＨＭ74およびＨＭ74Ａの限定された組織分布およびそれらの制御は、喘息、ＣＯＰＤおよびＲＡのような炎症性プロセスにおけるＨＭ74およびＨＭ74Ａの役割を示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＧＰＣＲが疾患において役割があり、ＧＰＣＲの活性を調節することによって疾患を治療する能力があるとすれば、ＧＰＣＲの活性を含む疾患状態を治療する新しい組成物および方法を開発するためのＧＰＣＲリガンドの同定および特性評価を提供することができる。本発明は、ＨＭ74に関与する分子を同定および特性評価し、そして関連する疾患の同定および治療にその発見を適用するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＨＭ74ＡでなくＨＭ74を活性化する分子に関する。
【００１０】
本発明の別の態様において、ＨＭ74のモジュレーターの同定方法が開示されている。例えば、興味の方法は、化学的部分を設け、ＨＭ74を発現する細胞を供給し、そして化学的部分がＨＭ74のシグナル伝達活性を調節するかどうかを、このような調節が本発明のアゴニストの存在下でまたは欠如下で生じるかどうかを含めて測定する工程からなる。関連した態様において、化学的部分には、ペプチド、抗体、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストが含まれうるが、これらに制限されない。別の態様として、知られているモジュレーターは、競合アッセイにおいて他のモジュレーターを同定するために使用することができる。
【００１１】
縮合環ジヒドロピラン(別名オキシデカヒドロナフタレンおよびオキシデカリン)は、ＨＭ74を活性化する。その化合物は、ＨＭ74を発現する細胞、例えばＣＨＯ細胞、２９３細胞およびＬ１.２細胞において選択的用量−反応性のカルシウム動員を生じる。
【００１２】
興味のオキシデカリンは、以下の構造を有する：
【化１】
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルケニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルキニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ3−Ｃ18アリール、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはその組み合わせである；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基であるか；またはＲ2は、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである、であることができ；またはＸおよびＲ2は、環を形成することができ；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【００１３】
興味の化合物は、一般にアゴニストである。従って、興味の化合物は、候補薬として開発することができる。また、興味の化合物は、例えば競合アッセイによって、ＨＭ74を調節する他の分子を同定するために使用することができる。
【００１４】
本発明の別の態様には、治療組成物が含まれ、ここで、このような組成物には、核酸、抗体、ポリペプチド、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。またさらに、本発明の方法は、治療の必要な患者にこのような治療組成物を投与することによって疾患状態を治療し、そしてＨＭ74シグナル伝達活性を調節する方法を含む。
【００１５】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。さらに、種々の文献を以下に記載し、特定の方法または組成物をより詳細に記述する。これにより、それぞれの文献は、それぞれが個々に組み込まれて記述されている場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ＨＭ74を活性化する分子の発見に基づく。
【００１７】
ＨＭ74コード配列は、知られている(前出のNomura et al.)。ＨＭ74を得、製造し、そして使用する方法が本明細書に記載されている。ＨＭ74コード配列およびアミノ酸への変化は、ＨＭ74の知られている機能活性が悪影響を受けない限り、許容される。
【００１８】
本化合物は、ＨＭ74を調節し、ＨＭ74のアゴニストであり、従って炎症、例えば喘息を特徴とする障害の候補薬である。
【００１９】
また、本化合物は、ＨＭ74アンタゴニストのスクリーニングに使用することができる。例えば、ＨＭ74を発現する細胞を試験化合物、次いで本発明のアゴニストに暴露する。次いで、例えばカルシウム動員における試験化合物の効果を測定して、試験化合物が本発明のアゴニストによって誘発されるカルシウム動員を減らすかどうかを確かめることができる。
【００２０】
例えばアゴニストおよびインバースアゴニストを同定するための他のこのようなアッセイは、本発明の範囲内に帰属することが意図される。
【００２１】
興味のオキシデカリンは、以下の構造を有する：
【化２】
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルケニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルキニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ3−Ｃ18アリール、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基であるか；またはＲ2は、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである、であることができ；または、ＸおよびＲ2
は、環を形成することができ；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【００２２】
興味の化合物は、一般にアゴニストである。従って、興味の化合物は、候補薬として開発することができる。興味の化合物は、例えば競合アッセイによって、ＨＭ74を調節する他の分子を同定するために使用することができる。
【００２３】
用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、sec−ブチル、ペンチルおよびヘキシルである。炭化水素は、１つまたはそれ以上の不飽和三重結合を含むことができる。
【００２４】
用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシである。
【００２５】
「アリール」は、芳香族炭化水素の環である。例としては、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００２６】
「ヘテロ原子」は、一般に、分子の典型的な原子とは異なる原子である。従って、炭化水素において炭素または水素ではないすべての原子はヘテロ原子である。一般に生物学的に許容しうるヘテロ原子には、酸素、硫黄および窒素が含まれる。
【００２７】
用語「ヘテロアリール」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアリール基のことである。例としては、ピリジル、イミダゾリル、ピロリル、チエニル、フリル、ピラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、ナフチリジニルおよびイソオキサゾリルである。
【００２８】
「分枝」は、構造が１つまたはそれ以上の部位で１つまたはそれ以上の枝分れを含むことを意味する。枝分れは、上記定義されたＲ基または他の側基であることができる。
【００２９】
用語「シクロアルキル」は、環式炭化水素のことである。いくつかの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。長さが変化した橋かけを含むことができる。
【００３０】
「複素環」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたシクロアルキルである。例としては、ピロリジニル、ピペリジニルおよびピペラジニルである。
【００３１】
用語「ヘテロアルキル」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアルキルである。エーテルは、ヘテロアルキルである。
【００３２】
「置換された」は、基部となる有機基が１つまたはそれ以上の置換基を有することを意味する。従って、原子または基は、分子中で別の原子または基に置き換えられる。代表的な置換基としては、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ8アルキル、−ＣＮ、アルコキシル、ヒドロキシル、スルフィド、スルフェート、スルホンアミド、アミン、アミド、アルコール、ケト基、Ｃ6−Ｃ18アリール、ハロゲン化Ｃ1−Ｃ18アルキル、亜硝酸基または硝酸基が含まれる。
【００３３】
「ハロゲン」は、例えば塩素、フッ素または臭素である。
【００３４】
「アルケニル」は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む炭化水素である。炭化水素は分枝していてもよい。
【００３５】
用語「環」は、１つの、複数の環構造の１つの、または複数の、環構造を意味し、その際、複数の環の２つまたはそれ以上は縮合していてもよく、複数の環または複数の環の１つまたはそれ以上は、芳香族であってもよく、ヘテロ原子を含み、置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせであることができる。環は、二環式または多環式であってもよい。環は、長さが変化した橋かけを含むことができる。
【００３６】
用語「側基」は、別の構造に結合した原子または分子を意味する。従って、側基は、上記定義されたＲ基、アルキル、アリール、シクロアルキル、等であることができる。
【００３７】
用語「橋かけ」は、２つの構造間のリンカーのことである。例えば、ヘテロ原子を含むことができ、置換されていてもよく、分枝していてもよく、またはそれらの組み合わせであることができる非環式炭化水素、例えばアルキル、アルケニル等は、２つの環式炭化水素、例えばアリールまたはシクロアルキル基を結合することができる。また、橋かけは、環式構造の少なくとも２個の原子を結合する環式構造中に含んでいてもよい。分子内架橋は、０、１、２、３、４またはそれ以上の原子を含むことができる。分子内架橋は、直鎖、分枝であってもよく、そして置換を含むことができる。
【００３８】
興味の化合物は、誘導体化して生物学的利用能を高めるプロドラッグを形成することができる官能基を含む。従って、本発明は、投与した後、代謝されて生物活性形態になるものは興味の活性化合物の変形を意図する。このような生物活性薬物の前駆体は、生体変換可能なキャリア(bioreversible carriers)、潜在的な薬物、ドラッグデリバリーシステムまたはプロドラッグとしても知られている(“Bioreversible Carriers in Drug Design" E.B. Roche, ed., Pergamon, NY, 1987;“Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems", Higuchi & Stella, eds., American Chemical Society, DC, 1975)。
【００３９】
薬物の化学修飾は、脂質バリアを越えなければならない極性化合物の利用能をいかにして高めるか、通常、生体内で分解等に敏感である化合物をいかにして安定化させるかといったような薬力学の特定の態様に対処することを目的とする。
【００４０】
プロドラッグを製造する別の理由としては、生物活性薬物の毒性、特異性の欠如、不安定性、吸収部位で代謝される、あまりに急速に吸収される、患者のコンプライアンス、例えば味覚に乏しいもしくは注射部位の疼痛、医師の承認が低いまたは製剤の問題が同様に含まれる。
【００４１】
一般的な修飾は、エステル化であり、これはカルボキシル基の誘導体化に限らない。同様に、例えばアミン、イミン、硫黄を含む置換基およびアミドについてこのような誘導体を製造するための化学がある。
【００４２】
エステルの場合、種々の置換基を、それに加えることができ、置換基は非分枝、環式または分枝炭化水素を含み、これは置換されていてもよく、１つまたはそれ以上の二重または三重結合を含むことができ、環構造を含むことができ、炭化水素骨格鎖は、１つまたはそれ以上のヘテロ原子、例えば窒素、硫黄または酸素、等を含むことができる。
【００４３】
エステルを構成するためにＲ基を検討する場合、考慮すべき別の因子は、酵素切断への感受性である。従って、生物学的利用能にとって立体的電荷および立体配座的因子は、決定因子であるといえる。例えば、分枝アルキル基は、エステラーゼ活性部位への接近容易さにとって立体障害となり、それによって加水分解の速度を遅くすることができる。あまり望ましくなければ、生物学的利用能を遅らせるか、望ましければ生物学的利用能を持続させるかのいずれかである。
【００４４】
別の状況では、薬物の水溶解度を高めることが望ましい。その目標を達成する置換基の例としては、スクシネート、スルフェート、ヘミスクシネート、ホスフェート、アミノ酸、アセテート、アミン等が含まれる。
【００４５】
アミド、イミド、カルボネート、ヒダントイン等の窒素は、誘導体化することができる。窒素への反応に適切な基は、ヒドロキシメチル基または一般にヒドロキシアルキル基、アシルオキシアルキル基およびアシル基が含まれる。
【００４６】
また、カルボニル基も誘導体化の部位である。誘導体の例は、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンおよびエノールエステルである。
【００４７】
上記議論した誘導体は、薬物への置換基の共有結合を含むが、置換基は、別の形で、例えば水素結合、ファンデルワールス力、静電力、疎水的相互作用、等で薬物に結合することができる。
【００４８】
誘導体化のさらに別の手段は、非酵素的機構によってプロドラッグから除去される置換基を用いることである。例としては、(２−オキソ−１,３−ジオキソール−４−イル)メチルエステル、マンニッヒ塩基、オキサゾリジン、分子内加水分解に触媒作用を及ぼす塩基性側鎖を有するエステルおよび分子内求核環化脱離反応を受けるエステルまたはアミドを含むプロドラッグが含まれる。環化機構は、フェノール、アルコールおよびアミンを含む薬物で利用可能である(“Prodrug Design" Testa & Mayer in “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology," 2nd ed. V.3, Swarbrick & Boylan, eds., Marcel Dekker, 2002.)。
【００４９】
従って、本発明は、知られている合成方法を実施して、一旦投与したら反応し、または生体内で作用してＨＭ74活性を調節する化合物を生じる化合物を得るための興味の化合物のなんらかのさらなる修飾を企図する。
【００５０】
本明細書における用語「同等のアミノ酸残基」は、２つまたはそれ以上の配列を分析でアラインメントした時にタンパク質配列において実質的に同じ位置を占めるアミノ酸を意味する。本発明の好ましいＨＭ74ポリペプチドは、野生型ＨＭ74のものと十分に同一のアミノ酸配列を有する。「野生型」は、局所的またはより広い範囲にかかわらず定義された個体群中に存在する最も一般的な形態または対立遺伝子を意味する。本明細書で使用する用語「十分に同一」は、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列が第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分なまたは最小数の同一もしくは同等の(例えば、類似の側鎖を有する)アミノ酸残基またはヌクレオチドを含み、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することである。例えば、ＨＭ74活性と少なくとも９６％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチド配列は、十分に同一であるものとして本明細書に定義される。
【００５１】
本明細書において同義的に使用するように、「ＨＭ74活性」、「ＨＭ74の生物活性」または「ＨＭ74の機能活性は、標準技術に従ってインビボまたはインビトロで測定してＨＭ74発現細胞においてＨＭ74タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によってもたらされた活性を意味する。ＨＭ74活性は、直接的な活性、例えば第２のタンパク質との結合もしくは第２のタンパク質上の酵素活性、または間接的な活性、例えばＨＭ74と第２のタンパク質との相互作用が介在する細胞のシグナル伝達活性であってもよい。好ましい実施態様において、ＨＭ74活性には、少なくとも以下の活性の１つまたはそれ以上が含まれる：(ｉ) ＨＭ74シグナル伝達経路においてタンパク質と相互作用する能力；(ii) ＨＭ74リガンドと相互作用する能力；(iii)活性化された時に宿主細胞を変化させる能力；(iv)本発明の分子を結合することにおける活性化；および(ｖ)細胞内標的タンパク質と相互作用する能力。
【００５２】
本発明の一態様において、ＨＭ74が活性化された時に反応を示す細胞中でＨＭ74を発現することに関する。本明細書で使用するように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子(例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)およびＲＮＡ分子(例えばｍＲＮＡ)ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００５３】
「単離された」核酸分子は、核酸の自然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が誘導された生物のゲノムＤＮＡ中で本来ＨＭ74をコードしている核酸の側面に位置する配列(すなわち、核酸の５'および３'末端に位置する配列)を含まない。単離されたＨＭ74核酸分子は、核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡ中で本来オープンリーディングフレーム核酸分子の側面に位置する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂまたは０.１ｋｂより少ないヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって作成した場合、他の細胞物質または培養基を実質的に含まず、または化学合成した場合、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００５４】
本発明の核酸分子、例えばＨＭ74をコードする核酸分子は、標準分子生物学技術および配列を用いて単離することができる(前出のNomura et al.)。ＨＭ74配列の全てまたは一部を用い、標準ハイブリッド形成およびクローン技術を用いてＨＭ74核酸分子を単離することができる(例えば、Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載された通り)。
【００５５】
本発明の核酸分子は、標準ＰＣＲ増幅技術に従ってテンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマを用いて増幅することができる。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特性評価することができる。さらにまた、標準合成技術、例えば自動化されたＤＮＡ合成装置を用いてＨＭ74ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを製造することができる。
【００５６】
さらに、本発明の核酸分子は、ＨＭ74をコードする核酸配列の部分のみ、例えばリガンドがそれに結合した時に検出可能な細胞内事象が生じる細胞外ドメインおよび／または細胞内ドメインをコードするフラグメントを含むことができる。検出可能な細胞内事象は、ＨＭ74が正常なホスト細胞中で活性化された時に観察されるものであることが好ましい。
【００５７】
「ＨＭ74の生物活性部分」をコードする核酸フラグメントは、ＨＭ74生物活性を有するポリペプチドをコードするＨＭ74の部分を単離し、ＨＭ74タンパク質のコード部分を発現し(例えばインビトロの組換え型発現によって)そしてＨＭ74のコード部分の活性を評価することによって作成することができる。
【００５８】
本発明は、さらに遺伝コードの縮重のため開示されたＨＭ74のヌクレオチド配列と異なるが、以前に開示されたものと実質的に同じＨＭ74タンパク質をコードする核酸分子を包含する。
【００５９】
ＨＭ74のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列多形が個体群(例えばヒト個体群)に存在しうることが当業者ならば理解するであろう。ＨＭ74コード配列におけるこのような遺伝的多形は、対立遺伝子の自然変異(natural allelic variation)のため、個体群の中で個々に存在する可能性がある。対立遺伝子は、所定の遺伝子座で代替的に生じる一群の遺伝子の１つである。本明細書で使用するように、用語「遺伝子」および「組換遺伝子」は、ＨＭ74タンパク質、好ましくは哺乳動物のＨＭ74タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子のことである。本明細書で使用するように、語句「対立遺伝子の変異型」は、ＨＭ74遺伝子座で生じたヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドのことである。代替の対立遺伝子は、多くの異なる個体において興味の遺伝子を塩基配列決定することによって同定することができる。それは、ハイブリッド形成プローブを用いて種々の個体において同じ遺伝子座を同定することによって容易に実施することができる。いずれかおよびすべてのこのようなヌクレオチド変異および対立遺伝子の自然変異の結果でありＨＭ74の機能活性と変わらないＨＭ74中に生成したアミノ酸性多形または変異は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００６０】
さらに、ヒトＨＭ74の核酸分子と異なるヌクレオチド配列を有するが、実質的に同じ活性を有する他の種類(ＨＭ74同族体)からのＨＭ74タンパク質をコードする核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。対立遺伝子の自然変異型(natural allelic variants)および本発明のＨＭ74 ｃＤＮＡの同族体に対応する核酸分子は、標準ハイブリッド形成技術に従ってストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成プローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその部分を用いて本明細書に開示されたヒトＨＭ74核酸との同一性に基づいて単離することができる。
【００６１】
本明細書で使用するように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」は、ヌクレオチド配列がハイブリッド形成し、および典型的にハイブリッド形成されたまま残る洗浄するための条件を表わすものとする。このようなストリンジェントな条件は、当業者に知られており、そして“Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6.に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃で６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)中でハイブリッド形成、続いて５０〜６５℃で、０.２ＸＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ中で１回またはそれ以上洗浄する。ストリンジェントな条件下で配列ＨＭ74またはその相補体にハイブリッド形成された本発明の単離された核酸分子は、自然発生の(naturally occurring)核酸分子に対応することが好ましい。本明細書で使用するように、「自然発生の(naturally occurring)」核酸分子は、自然発生のヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことである(例えば、天然タンパク質をコードする)。
【００６２】
個体群中に存在しうるＨＭ74配列の対立遺伝子の自然発生変異型に加えて、熟練技術者は、さらに、突然変異によってヌクレオチド配列に変化をもたらし、それによってＨＭ74タンパク質の生物活性を実質的に変えることなく、コードされたＨＭ74のアミノ酸配列に変化させることができることを理解するであろう。従って、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換体をもたらすヌクレオチド置換体を作成することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を実質的に変化させることなくＨＭ74の野生型配列から変化させることができる残基である。「必須」アミノ酸残基は、実質的な生物活性に必要なものである。例えば、様々な種のＨＭ74の中で保存されてないまたは半保存しかされてないアミノ酸残基は、活性にとって必須ではなく、従って改変のターゲットとなることが多い。二者択一的に、様々な種のＨＭ74タンパク質の中で保存されたアミノ酸残基は、活性にとって必須であり、従って改変のターゲットとなることはあまりない。
【００６３】
従って、本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含むＨＭ74タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＨＭ74タンパク質は知られているアミノ酸配列と異なるが、生物活性を保持する。一実施態様において、単離された核酸分子は、知られているＨＭ74アミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
知られているＨＭ74の配列と異なる配列を有するＨＭ74タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コードされたタンパク質中に１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を導入するように知られているＨＭ74のヌクレオチド配列に１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を導入することによって作成することができる。
【００６５】
突然変異は、標準技術、例えば部位特異的突然変異生成法およびＰＣＲ仲介による突然変異生成によって導入することができる。１つまたはそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基で、同類アミノ酸置換を行うことが好ましい。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義される。そのファミリーには、塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニンおよびヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸)、非荷電の極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンおよびシステイン)、無極性の側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えばトレオニン、バリンおよびイソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。従って、ＨＭ74において予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることが好ましい。別法として、突然変異は、例えば飽和突然変異生成によってＨＭ74コード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、そして生成した突然変異体は、活性を保持している突然変異体を同定するため、ＨＭ74生物活性についてスクリーニングすることができる。突然変異生成後、コードされたタンパク質を、組換え発現することができ、そしてタンパク質の活性を測定することができる。
【００６６】
関心のある核酸を産生するために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシルおよび２,６−ジアミノプリンが含まれる。
【００６７】
ＨＭ74の機能に影響を与える１つの方法は、ＨＭ74の発現に影響を及ぼすことである。従って、転写レベルは、より小さいまたはより大きいレベルのＨＭ74ｍＲＮＡについて操作することができ、これが順に細胞表面でより小さいまたはより大きいレベルのＨＭ74発現に至る。このような操作を実施する１つの方法は、例えば相同組換えによってＨＭ74コード配列の付近でゲノム中の適当な部位に導入することができる調節可能なプロモーターを用いることである。
【００６８】
従って、本発明の別の態様は、抗ＨＭ74抗体に関する。本明細書に使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性部分、すなわち特異的に抗原、例えばＨＭ74を結合する抗原結合部位を含む分子のことである。ＨＭ74に特異的に結合する分子は、試料、例えば本来ＨＭ74を含有する生体試料においてＨＭ74を結合するが、他の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性部分の例としては、抗体をペプシンのような酵素で処理することによって生成することができるＦ(ａｂ)およびＦ(ａｂ')2フラグメントが含まれる。本発明は、ＨＭ74を結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書に使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＨＭ74の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のイディオタイプまたはクローンを１種類しか含まない抗体分子の集団のことである。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的に特定のＨＭ74タンパク質エピトープについて単一結合親和性を示す。
【００６９】
抗体の様々な他の抗原結合形態は、フラグメント、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、等を含めて当分野で知られているように製造することができる。
【００７０】
本発明の別の態様は、ベクター、好ましくはＨＭ74(またはその部分)をコードしている核酸を含む発現ベクターに関する。本明細書で使用するように、用語「ベクター」は、それに結合した別の核酸を運ぶことができる核酸分子のことである。ベクターの１つのタイプは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。ベクターの別のタイプは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結することができるウイルスベクターである。ある種のベクターは、宿主細胞中で自律複製できる(例えば細菌性の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば非エピソームの哺乳類のベクター)は、宿主細胞へ導入する際、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、操作可能な状態でそれに結合された(operably linked)遺伝子の発現を導くことができる。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド(ベクター)の形態である。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすこのような他の型の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば複製欠損のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むものとする。
【００７１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中で核酸を発現するのに適した形態の本発明の核酸を含む。つまり、組換え発現ベクターには、発現しようとする核酸に操作可能な状態で結合しており、発現に用いる宿主細胞に基づいて選ばれる１つまたはそれ以上の調節配列が含まれる。組換え発現ベクターの中で、「操作可能な状態で結合した(operably linked)」は、ヌクレオチド配列の発現可能な形で興味のヌクレオチド配列が調節配列(複数可)に結合していることを意味するものとする(例えば、ベクターが宿主細胞に導入された時にインビトロ転写／翻訳系においてまたは宿主細胞において)。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節因子(例えばポリアデニル化シグナル)を含むものとする。このような調節配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの(例えば組織特異性調節配列)が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、等のような因子に左右されうることは当業者ならば理解するであろう。本発明の発現ベクターは、本明細書に記載された核酸をコードするタンパク質またはペプチド(例えばＨＭ74、ＨＭ74の変異形、融合タンパク質、等)を生産するため、宿主細胞に導入することができる。
【００７２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いる)、イースト細胞または哺乳動物細胞中でＨＭ74の発現用に設計することができる。適切な宿主細胞は、前出のGoeddel中でさらに議論されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えばＴ7プロモーター調節配列およびＴ7ポリメラーゼを用いてインビトロで転写し、そして翻訳することができる。
【００７３】
別の実施態様において、ＨＭ74発現ベクターは、イースト発現ベクターである。S. cerevisiaeのようなイースト中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234)、ｐＭＦａ (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943)、ｐＪＲＹ88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123)、ｐＹＥＳ2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)およびｐＰｉｃＺ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)が含まれる。
【００７４】
別法として、ＨＭ74は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させることができる。培養された昆虫細胞(例えばＳｆ９細胞)中でタンパク質を発現させるために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列(Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165)およびｐＶＬ系列(Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39)が含まれる。
【００７５】
さらに別の実施態様において、本発明の核酸は、哺乳類の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ8(Seed, Nature (1987) 329:840)およびｐＭＴ2ＰＣ(Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195)が含まれる。哺乳動物細胞に用いる場合、発現ベクターの調節機能は、しばしばウイルス調節因子によってもたらされる。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウィルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞についての他の適切な発現系については、前出のSambrook等の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００７６】
哺乳動物細胞の安定な形質転換については、使用する発現ベクターおよび形質転換技術に応じて、小画分の細胞のみがゲノム中に外来性ＤＮＡを組み込むことができることが知られている。成分の同定および選択には、一般に、選択可能なマーカーをコードする遺伝子(例えば、抗生物質耐性についての)を関心のある遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーとしては、薬物抵抗性を与えるもの、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートが含まれる。選択可能なマーカーをコードしている核酸を、ＨＭ74をコードしているものと同じベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別々のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定してトランスフェクションされた細胞は、薬物選択によって同定することができる(例えば選択可能な標識遺伝子を組み込まれた細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する)。
【００７７】
ＨＭ74と関与し、これを活性化する興味の化合物は、縮合環ジヒドロピランであり、これにはオキシデカリン様化合物が含まれる。オキシデカリンは、オキシデカヒドロナフタレンの別の名称である。このようなジヒドロピランは、一般構造を有する：
興味のジヒドロピランおよびオキシデカリンは、米国特許第６,３９９,６５３号、ＷＯ ９７／４８６９１中およびvon Roedern, Mol. Div. (1998) 3:253-256中に教示されたように製造することができる。
【００７８】
興味のオキシデカリンは、以下の構造を有する：
【化３】
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルケニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ1−Ｃ18アルキニル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；Ｃ3−Ｃ18アリール、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル、これは側基を含むことができ、橋かけを含むことができ、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基であるか；またはＲ2は、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル、これは分枝していてもよく、ヘテロ原子を含むことができ、もしくは置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである、であることができ；またはＸおよびＲ2は、環を形成することができ；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【００７９】
関心のある化合物は、一般にアゴニストである。従って、興味の化合物は、候補薬として開発することができる。また、興味の化合物は、例えば競合アッセイによってＨＭ74を調節する他の分子を同定するために使用することができる。
【００８０】
好ましい化合物は、Ｒ2がメチル、エチルまたはシクロヘキシルである場合、Ｒ1はｎ−アルキルまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルではない；またはＲ1がアセチル基で置換されうるＣ1−Ｃ4アルコールまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルである場合、Ｒ1はｎ(−Ｃ1−Ｃ8)アルキル、(Ｃ1−Ｃ4)分枝アルキルまたはチオ置換されたフェニルではないものである。
【００８１】
用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、sec−ブチル、ペンチルおよびヘキシルである。炭化水素は、１つまたはそれ以上の不飽和三重結合を含むことができる。
【００８２】
用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシである。
【００８３】
「アリール」は、芳香族炭化水素である。例としては、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００８４】
「ヘテロ原子」は、一般に、分子の典型的な原子とは異なる原子である。従って、炭化水素において炭素または水素ではないすべての原子はヘテロ原子である。一般に生物学的に許容しうるヘテロ原子には、酸素、硫黄および窒素が含まれる。
【００８５】
用語「ヘテロアリール」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアリール基のことである。例としては、ピリジル、イミダゾリル、ピロリル、チエニル、フリル、ピラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、ナフチリジニルおよびイソオキサゾリルである。
【００８６】
用語「シクロアルキル」は、環式炭化水素のことである。いくつかの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。
【００８７】
「複素環」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたシクロアルキルである。例は、ピロリジニル、ピペリジニルおよびピペラジニルである。
【００８８】
用語「ヘテロアルキル」は、１つまたはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアルキルである。エーテルは、ヘテロアルキルである。
【００８９】
「置換された」は、ベースとなる有機基が１つまたはそれ以上の置換基を有することを意味する。従って、原子または基は、分子中で別の原子または基と置き換わる。代表的な置換基としては、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ8アルキル、−ＣＮ、アルコキシル、ヒドロキシル、スルフィド、スルフェート、スルホンアミド、アミン、アミド、アルコール、ケト基、Ｃ6−Ｃ18アリール、ハロゲン化Ｃ1−Ｃ18アルキル、亜硝酸基または硝酸基が含まれる。
【００９０】
「ハロゲン」は、例えば塩素、フッ素または臭素である。
【００９１】
「アルケニル」は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む炭化水素である。炭化水素は分枝していてもよい。
【００９２】
用語「環」は、１つの環構造または複数の環構造の１つを意味し、その際、複数の環の２つまたはそれ以上が縮合していてもよく、複数の環、複数の環の１つまたはそれ以上は、芳香族であってもよく、ヘテロ原子を含むことができ、置換されていてもよく、またはそれらの組み合わせである。環は二環式または多環式であってもよく、そして橋かけを含んでいてもよい。
【００９３】
関心のある化合物はＨＭ74と結合し、ＨＭ74を活性化するが、ＨＭ74Ａには結合しない。
【００９４】
関心のあるオキシデカリンは、当分野で知られているように合成することができる(米国特許第６,３９９,６５３号)。
【００９５】
本発明のオキシデカリン様化合物は、投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。このような組成物は、典型的に活性成分および医薬上許容しうる担体を含んでなる。本明細書で使用するように、用語「医薬上許容しうる担体」は、医薬投与に適合しうる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性のおよび吸収を遅らせる物質、等のいずれかおよびすべてを含むものとする。医薬活性物質のためのこのような媒体および物質の使用は、当分野でよく知られている。いずれか慣用の媒体または物質が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用を意図する。また、補助活性化合物を組成物に組み込むことができる。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合しうるように処方する。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮的(局所)、経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下用途に用いる液剤または懸濁剤は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸または塩基(例えばＨＣｌまたはＮａＯＨ)で調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックから製造されたアンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアル中に封入することができる。
【００９７】
注射用途に適した医薬組成物は、滅菌水性液剤(水溶性の場合)または分散剤および滅菌注射液剤または分散剤を即座に調製するための滅菌散剤が含まれる。静脈内投与では、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ(R)(BASF; Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)が含まれる。すべての場合において、組成物を滅菌しなければならず、そして容易にシリンジ化可能な程度にまで流動性でなければなれらない。組成物は、製造および貯蔵条件において安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に備えて保存しければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコール等)およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等によって行うことができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば砂糖、多価アルコール(例えばマンニトール)、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００９８】
滅菌注射液剤は、必要な量の活性化合物を上記列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適当な溶媒中に組み込み、必要に応じて、その後、滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を基本的な分散媒体および上記列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製する。滅菌注射液剤を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより予め滅菌濾過された溶液から活性成分＋任意の添加所望成分の粉末が得られる。
【００９９】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または可食性担体を含む。組成物はゼラチンカプセル中に封入するかまたは圧縮して錠剤にすることができる。経口治療の投与では、活性化合物を賦形剤と共に組み込むことができ、そして錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用する。また、経口組成物は、シロップまたは液体製剤を得るための液体担体を用いて調製することができ、またはうがい薬としての使用のために調製され、ここで液体担体中の化合物を経口的に適用し、うがいして吐き出すまたは飲み込む。
【０１００】
医薬上適合しうる結合剤、および／または補助物質は、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、等は、以下の成分：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelまたはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または着香剤、例えばハッカ、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のいずれかまたは類似の性質の化合物を含むことができる。
【０１０１】
吸入による投与では、適切な噴射剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で化合物を送達する。
【０１０２】
また、全身投与は、経粘膜または経皮的な手段によることができる。経粘膜または経皮投与では、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に用いる。このような浸透剤は、一般に当分野で知られており、そして例えば、経粘膜投与では、デタージェント、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内噴霧器または坐剤を使用して実施することができる。経皮投与では、活性化合物を一般に当分野で知られているように軟膏、サルヴ剤（salves）、ゲル剤またはクリームに処方する。
【０１０３】
また、化合物は、直腸送達のための坐剤(例えば、慣用の坐剤基剤、例えばカカオ脂および他のグリセリドを用いて)または停留浣腸剤の形態で調製することができる。
【０１０４】
一実施態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達システムを含む放出制御製剤のように、身体から化合物が急速に排泄させるのを防ぐ担体を用いて調製される。生分解性の、生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。
【０１０５】
このような製剤の調製方法は、当業者に明らかである。また、材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することができる。また、リポソームの懸濁剤(モノクローナル抗体で感染細胞に標的設定されたリポソーム剤を含む)は、医薬上許容しうる担体として使用することができる。それは、当業者に知られている方法に従って、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載されたように調製することができる。
【０１０６】
投与を容易にし、用量を均一にするため単位投薬形態で経口または非経口の組成物を処方することは特に好都合である。本明細書で使用する単位投薬形態は、治療しようとする対象者のための単回の投薬に適した物理的に分離された単位のことであり；それぞれの単位は所望の治療効果を得るために算出された活性化合物の所定の量を必要な医薬担体と共に含んでなる。例えば１回またはそれ以上の分割投与によるかまたは持続注入によるかどうかにかかわらず、患者に投与するための初期の候補用量は、疾患のタイプおよび重症度に応じて、活性成分約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ)である。典型的な日用量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲となりうる。数日またはそれより長い反復投与では、状態に応じて、疾患の症状が望ましく抑制されるまで治療を持続させる。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。治療の進行は、慣用の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。典型的な用法・用量は、ＷＯ ９４／０４１８８に開示されている。本発明の単位投薬形態について詳細は、活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果および個体の治療のためこのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって定まり、これらに直接左右される。
【０１０７】
医薬組成物は、投薬説明書と共に容器、パックまたはディスペンサー中に梱包することができる。
【０１０８】
興味のＨＭ74モジュレーターは、スクリーニングアッセイおよび治療方法(例えば、治療および予防)に使用することができる。興味のＨＭ74モジュレーターは、ＨＭ74活性または発現を調節する他の薬物または化合物をスクリーニングするために、そして炎症を特徴とする障害を治療するために使用することができる。また、興味のモジュレーターは、ＨＭ74タンパク質の不十分なもしくは過剰の産生から生じる、またはＨＭ74野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有するＨＭ74タンパク質形態の産生によって生じる病気における使用を見いだすことができる。さらに、本発明は、スクリーニングアッセイによって同定された新規なＨＭ74モジュレーターおよび本明細書に記載された治療のためのその使用に関する。
【０１０９】
本発明は、モジュレーター、すなわち、ＨＭ74に結合し、そして例えばＨＭ74発現またはＨＭ74活性における刺激または抑制効果を有する候補物質または試験化合物または薬剤(例えばペプチド、ペプチドミメティック、小分子、抗体または他の薬物)を同定するための方法(また、本明細書では「スクリーニングアッセイ」と称する)を提供する。
【０１１０】
一実施態様において、本発明は、ＨＭ74を結合しまたはＨＭ74の活性を調節する候補物質または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。従って、スクリーニングアッセイを用いてＨＭ74を調節する他のフロセミド様およびオキシデカリン様化合物を同定することができる。また、このようなモジュレーターを競合アッセイ中に使用してＨＭ74アンタゴニストのような他のモジュレーターを同定することができる。
【０１１１】
一実施態様において、アッセイは、細胞に基づくアッセイであり、細胞表面でＨＭ74の膜結合形態を発現する細胞を試験化合物と接触させてＨＭ74を活性化する試験化合物の能力を測定する。細胞は、例えば、イースト細胞または哺乳動物起源の細胞であることができる。ＨＭ74を活性化する試験化合物の能力の測定は、例えば試験化合物を放射性同位元素または酵素標識と結合させることによって実施することができ、その結果試験化合物のＨＭ74への結合は、ＨＭ74との複合体中で、またはＨＭ74が位置する場所で標識化合物を検出することによって測定することができる。例えば、試験化合物は、直接または間接的に125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで標識化することができ、そして放射性同位元素は放射線放出を直接カウントするか、またはシンチレーションカウントによって検出される。別法として、試験化合物は、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼによって標識化することができ、そして酵素標識は、適切な基質が生成物に変換するのを測定することによって検出される。好ましい実施態様において、アッセイは、細胞表面のＨＭ74の膜結合形態を発現する細胞を試験化合物と共にＨＭ74を結合する知られている化合物と接触させ、知られている化合物と競合してＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含む。
【０１１２】
別の実施態様において、アッセイは、細胞表面上でＨＭ74の膜結合形態を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そしてＨＭ74の活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)試験化合物の能力を測定することを含む、細胞に基づくアッセイである。ＨＭ74の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えばＨＭ74を活性化または阻害する試験化合物の能力を測定することによって実施することができる。それは活性化されたＨＭ74が、シグナル伝達経路に関連する細胞内のまたは膜の標的分子と相互作用するときに顕在化する可能性がある。本明細書で使用するように、「標的分子」は、事実上ＨＭ74が結合するまたは相互作用する分子、例えばＨＭ74を発現する細胞表面上の分子、第２の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜または細胞質の分子の内側面と関連する分子である。ＨＭ74標的分子は、非ＨＭ74分子であることができる。一実施態様において、ＨＭ74標的分子は、細胞膜を通しておよび細胞中に細胞外シグナル(例えば化合物がＨＭ74へ結合することによって生じるシグナル)の伝達を促進するシグナル伝達経路の成分である。標的は、例えば触媒活性を有する第２の細胞間タンパク質または下流のシグナル伝達分子とＨＭ74との結合を促進するタンパク質であることができる。
【０１１３】
ＨＭ74標的分子と結合するまたは相互作用するＨＭ74の能力の測定は、直接結合を測定するための上記方法の１つによって実施することができる。好ましい実施態様において、ＨＭ74標的分子と結合するまたは相互作用するＨＭ74の能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって実施することができる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞の第二メッセンジャーの誘発を検出する(例えば細胞内Ｃａ2+、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、等)、適切な基質上で標的の触媒／酵素活性を検出する、レポーター遺伝子の誘発を検出する(例えば、検出可能なマーカーをコードしている核酸に操作可能な状態で結合したＨＭ74反応性の調節要素、例えばルシフェラーゼ)または細胞の反応、例えば細胞の分化または細胞増殖を検出することによって測定することができる。
【０１１４】
さらに別の実施態様において、本発明のアッセイは、ＨＭ74を試験化合物と接触させ、そしてＨＭ74に結合する試験化合物の能力を測定することを含む細胞を含まないアッセイである。試験化合物のＨＭ74への結合は、先に述べたように、直接または間接的に測定することができる。好ましい実施態様において、アッセイは、ＨＭ74を試験化合物と共に本発明の知られている化合物と接触させ、そして本明細書に記載された知られている化合物のＨＭ74活性に影響を与える試験化合物の能力を測定することを含む。ＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力の測定は、本明細書に記載された知られている化合物の結合と比べて優先的にＨＭ74と結合する試験化合物の能力を測定することを含む。
【０１１５】
別の実施態様において、アッセイは、ＨＭ74を試験化合物と接触させ、そしてＨＭ74の活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)試験化合物の能力を測定することを含む細胞を含まないアッセイである。ＨＭ74の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば直接結合を測定するための上記方法の１つによって、ＨＭ74標的分子に結合する活性化ＨＭ74の能力を測定することによって実施することができる。別の実施態様において、ＨＭ74の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、ＨＭ74標的分子をさらに調節するＨＭ74の能力を測定することによって実施することができる。例えば、適切な基質の標的分子の触媒／酵素活性は、先に記載したように測定することができる。
【０１１６】
さらに別の実施態様において、細胞を含まないアッセイは、ＨＭ74を、試験化合物とＨＭ74を結合させる知られている化合物と接触させ、そしてＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、その際、ＨＭ74と相互作用する試験化合物の能力の測定は、ＨＭ74標的分子に優先的に結合するまたはＨＭ74標的分子の活性を調節するＨＭ74の能力を測定することを含む。
【０１１７】
受容体は、必ずしもリガンド結合を阻害しないが、受容体中で構造変換を生じてＧタンパク質結合またはおそらく活性化を生じることができる受容体凝集、二量化またはクラスター形成を可能にする非リガンド分子によって活性化することができる。
【０１１８】
本発明の細胞を含まないアッセイは、ＨＭ74の可溶形態および膜結合形態の両方の使用に適する。ＨＭ74の膜結合形態を含む、細胞を含まないアッセイの場合、ＨＭ74の膜結合形態が溶液中で維持されるように可溶化剤を用いることが望ましいといえる。このような可溶化剤の例としては、非イオン性デタージェント、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Triton-X-100、Triton-X-114、Thesit(R)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンミノ]−１−プロパンスルホネート(CHAPS)、３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(CHAPSO)またはＮ−ドデシル＝Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが含まれる。
【０１１９】
別の実施態様において、宿主細胞上で発現する場合、一定の活性状態にあるようＨＭ74を変化させる。ＨＭ74を変化させると、リガンドを結合させる必要なく受容体を活性にすることができる。活性化された受容体を得る１つのやり方は、リガンド結合することなくＨＭ74を変化させてＧタンパク質と相互作用させることである。変化は、受容体と細胞内Ｇタンパク質との結合を可能にするリガンド結合における受容体の立体配座の変化に似ている。そのような一つのアプローチは、ＷＯ ００／２２１２９に記載されている。
【０１２０】
ＷＯ ００／２２１２９は、構成的活性が得られるＴＭ6およびＩＣ3の領域における特定のアミノ酸を教示している。部位特異的突然変異誘発、サブクローニング、等のような特定のアミノ酸をＨＭ74に組み込む方法は、当分野で知られている。次いで、変化したＨＭ74分子を宿主細胞中で発現させて構成的に活性なＨＭ74を得る。
【０１２１】
次いで、活性化された細胞を、ＨＭ74アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、等、ＨＭ74活性を変化させる分子であることが推測される分子に暴露する。Ｇタンパク質活性を変化させるそれらの分子は、医薬開発において知られている方法を用いてＨＭ74代謝の変化と関連する障害を治療するための目標とされる。
【０１２２】
本発明の上記のアッセイ方法の複数の実施態様において、ＨＭ74またはその標的分子のいずれかを固定してタンパク質の一方または両方の複合体形成してない形態から複合形態の分離を促進するだけでなく、アッセイの自動化に適応させることが望ましいといえる。試験化合物のＨＭ74への結合または候補化合物の存在下および欠如下での標的分子とＨＭ74との相互作用は、反応体を含むのに適したいずれかの容器中で実施することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心分離管が含まれる。一実施態様において、タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させるドメインを加えた融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＨＭ74融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロース(R)ビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができる。次いで、その複合体を試験化合物および非吸着の標的タンパク質またはＨＭ74タンパク質と合わせ、そして混合物を複合体形成に適した条件下で(例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件で)インキューベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄してすべての非結合成分を除去し、そして複合体形成を、例えば先に述べたように直接または間接的に測定する。別法として、複合体をマトリックスから分離して、標準技術を用いてＨＭ74結合または活性のレベルを測定することができる。
【０１２３】
また、マトリックス上でタンパク質を固定する別の技術を本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、ＨＭ74またはその標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を用いて固定することができる。ビオチン化されたＨＭ74または標的分子は、当分野でよく知られた技術(例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチンＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド)から製造し、そしてストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレート(Pierce Chemicals)のウェル中に固定することができる。別法として、ＨＭ74または標的分子と反応性であるが、ＨＭ74タンパク質の標的分子への結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、結合していない標的またはＨＭ74を、抗体結合によってウェル中に捕捉することができる。このような複合体の検出方法としては、ＧＳＴ固定された複合体について上記されたもの加えて、ＨＭ74または標的分子と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出の他にＨＭ74または標的分子に伴う酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１２４】
別の実施態様において、ＨＭ74発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中でのＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下でのＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを候補化合物がない場合のＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、その比較に基づいて候補化合物をＨＭ74発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、候補化合物の欠如下よりも、候補化合物の存在下でＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がより大きい(統計学的に有意に大きい)場合、候補化合物は、ＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質またはアゴニストとして同定される。あるいは、ＨＭ74ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の欠如下よりも候補物質の存在下でより少ない(統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物は、ＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤またはアンタゴニストとして同定される。ＨＭ74活性が、リガンドまたはアゴニストの存在下で、または構成的ＨＭ74中でベースラインより下に減少する場合、候補化合物は、インバースアゴニストとして同定される。細胞中のＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＨＭ74 ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載された方法によって測定することができる。
【０１２５】
大量の純粋なＨＭ74を製造することができるので、合理的なドラッグデザインをする際、有望な機能領域の高次構造の物理的な特性評価を確かめることができる。例えば、分子のＩＣ3領域およびＥＣドメインは、特に興味深い領域である。領域の形状およびイオン配置がわかったら、その領域と相互作用する候補薬物を構成し、次いでインタクトの細胞、動物および患者で試験することができる。このような構造情報を導くことができる方法としては、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、分子モデリング等が含まれる。また、３Ｄ構造により、特定の部位で作用する知られている薬物が存在する場合、他の知られているタンパク質において類似の立体配座部位を同定することができる。それらの薬物またはその誘導体は、ＨＭ74に関する用途を見いだすことができる。
【０１２６】
さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤および本明細書に記載された治療のためのその使用に関する。
【０１２７】
本発明は、異常なＨＭ74発現または活性と関連する障害の危険性がある(すなわち、かかりやすい)またはその障害を有する対象者を治療する予防的および治療的な両方法を提供する。このような障害としては、例えば炎症性障害、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患および関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
一態様において、本発明は、対象者にＨＭ74発現または少なくとも１つのＨＭ74活性を調節する薬剤を投与することによって、対象者において異常なＨＭ74発現または活性に関連する疾患または状態を予防する方法を提供する。異常なＨＭ74発現または活性によって生じるまたはそれが原因となる疾患の危険性のある対象者は、例えば、本明細書に記載した診断法または予測アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。疾患または障害を予防するまたは代わりに進行を遅らせるように、ＨＭ74異常の症状の特徴が発現する前に予防的な薬剤の投与を行うことができる。ＨＭ74異常のタイプに応じて、例えばＨＭ74アゴニストまたはＨＭ74アンタゴニストの薬剤を、対象者の治療に使用することができる。本明細書に記載されたスクリーニングアッセイに基づいて適切な薬剤を決定することができる。
【０１２９】
本発明の別の態様は、治療目的でＨＭ74発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、細胞と関連するＨＭ74の活性の１つまたはそれ以上を調節する薬剤と接触させることを含む。ＨＭ74活性を調節する薬剤は、本明細書に記載された薬剤、例えばフロセミドまたはオキシデカリン、核酸またはタンパク質、ＨＭ74タンパク質の自然発生の同種のリガンド、ペプチド、ＨＭ74ペプチドミメティックまたは他の小分子であることができる。一実施態様において、薬剤は、ＨＭ74の生物活性の１つまたはそれ以上を刺激する。別の実施態様において、薬剤は、ＨＭ74タンパク質の生物活性の１つまたはそれ以上を阻害する。このような阻害剤の例としては、抗ＨＭ74抗体が含まれる。調節的な方法は、インビトロで(例えば、薬剤と共に細胞を培養することによって)または、代わりに、インビボで(例えば、対象者に薬剤を投与することによって)実施することができる。このように、本発明は、ＨＭ74の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害で苦しむ人の治療方法を提供する。一実施態様において、方法は、薬剤(例えば本明細書に記載されたスクリーニングアッセイによって同定された薬剤)またはＨＭ74発現または活性を調節する薬剤の組み合わせ(例えば、上方制御または下方制御する)を投与することを含む。
【０１３０】
ＨＭ74活性の刺激は、ＨＭ74が異常に下方制御されたおよび／または高められたＨＭ74活性が有益な効果をもたらす見込みがある状況において望ましい。これに対して、ＨＭ74活性の阻害は、ＨＭ74が異常に上方制御されたおよび／または低下したＨＭ74活性が有益な効果をもたらす見込みがある状況において望ましい。
【０１３１】
〔実施例〕
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それは制限するものとして解釈すべきではない。本願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
実施例１ ＨＭ74を発現する哺乳動物細胞の産生
ｈＨＭ74をコードするｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニングし、そして哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞または２９３細胞中にトランスフェクションした。
【０１３３】
ＨＭ74を過剰発現する哺乳動物細胞を産生させるため、６ウェルの３５ｍｍ組織培養プレート(ウェル当たり３×１０５の哺乳動物細胞(ATCC Catalog No. CRL-1573))において、ＤＭＥＭ培地(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)２ｍｌ中、１０％ウシ胎児血清(Gibco/BRL Catalog No. 1600-044)の存在下で哺乳動物細胞を培養した。
【０１３４】
次いで、細胞が５０〜８０％集密になるまでＣＯ2インキュベータ中３７℃で細胞をインキューベートした。ＨＭ74のクローニングされたｃＤＮＡ核酸配列をｐｃＤＮＡ３.１クローニングベクター(Invitrogen, Catalog No. V790-20)中に挿入した。ＤＮＡ２μｇを無血清Ｆ１２ハム培地１００μｌ中に希釈した。それとは別に、リポフェクトアミン試薬(Life Technologies, Catalog No. 18324-020)２５μｌを無血清Ｆ１２ハム培地１００μｌ中に希釈した。次いで、ＤＮＡ溶液およびリポフェクトアミン溶液を穏やかに混合し、室温で４５分インキューベートし、ＤＮＡ脂質複合体を形成させた。
【０１３５】
細胞を、無血清Ｆ１２ハム培地２ｍｌで１回すすいだ。それぞれのトランスフェクションについて(６ウェルプレート中で６トランスフェクション)、無血清Ｆ１２ハム培地０.８ｍｌを、ＤＮＡ脂質複合体を含む溶液(０.２ｍｌの総体積)に加え、穏やかに混合した。次いで、得られた混合物(以下、「トランスフェクション混合物」)をすすいだ細胞上にかぶせた(０.８ｍｌ＋０.２ｍｌ)。抗細菌試薬は加えなかった。次いで、細胞を脂質ＤＮＡ複合体と共にＣＯ2インキュベータ中３７℃で１６時間インキューベートしてトランスフェクションさせた。
【０１３６】
培養期間が完了した後、最初にトランスフェクション混合物を除去することなく、１０％ウシ胎児血清を含むＦ１２ハム培地１ｍｌを細胞上にかぶせた。トランスフェクションの１８時間後、細胞にかぶせた媒体を吸い出した。次いで、細胞をＰＢＳ，ｐＨ２〜４ (Gibco/BRL Catalog No. 10010-023)で洗浄し、そしてＰＢＳを、５％血清を含むＦ１２ハム培地(「選択培地」)で置き換えた。トランスフェクションの７２時間後、抗菌剤ジェネティシン(Life Technologies, Catalog No. 11811)を４００μｇ／ｍｌで含む選択培地中に細胞を１０倍希釈した。
【０１３７】
実施例２ アゴニストアッセイ
ヒトＨＭ74のアゴニストをスクリーニングするため、ＨＭ74をＧq機構に人工的に共役させることができる。Ｇq機構の活性化は、細胞内の筋小胞体からのＣａ2+の放出を刺激する。Ｃａ2+が細胞質中に放出され、これはＣａ2+キレート化色素を用いて検出することができる。蛍光測定イメージングプレートリーダーまたはＦＬＩＰＲ(R)装置(Molecular Devices)を用いて蛍光において生じたなんらかの変化をモニターする。アゴニストの活性は、蛍光におけるなんらかの増加によって反映される。
【０１３８】
ＨＭ74を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を予め操作してＧｑタンパク質(Ｇα１６)の無差別形態(indiscriminate form)を発現させた。このような細胞を製造するため、Ｇα１６共役型ＣＨＯ細胞を商業的に入手し(Molecular Devices LIVEWARETM cells, Catalog No. RD-HGAl6)、実施例１のプロトコールに続いてそれらの細胞中のＨＭ74の発現を促進した。
【０１３９】
１０％ウシ胎児血清、１００ｌＵ／ｍｌペニシリン(Gibco/BRL, Catalog No. 15140-148)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(Catalog No. 15140-148, Gibco/BRL)、４００μｇ／ｍｌジェネティシン(Ｇ４１８)(Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035)および２００μｇ／ｍｌゼオシン(Invitrogen, Catalog No. R250-05)を含むＦ１２ハム媒体(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)中、３７℃および５％ＣＯ２で細胞を増殖対数期に維持した。アッセイの１日前に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞１２，５００細胞／ウェルを96/384 Multidropデバイス(Labsystems, Type 832)を用いてウェル体積５０μｌを有する３８４ウェルの透明な底部のアッセイプレート(Greiner/Marsh, Catalog No. N58102)上で培養した。加湿された５％ＣＯ2インキュベータ(Forma Scientific CO2 water jacketed incubator Model 3110)中、３７℃で細胞をインキューベートした。
【０１４０】
以下の保存溶液を調製した：Hepes(Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080)の１Ｍ保存溶液(ｐＨ７.５)；１Ｎ ＮａＯＨ中に作成したプロベニシド(Sigma, Catalog No. P8761)の２５０ｍＭ保存溶液；およびＤＭＳＯ (Sigma D2650)中に作成したFluo 4-AM Dye (Molecular Probes, Catalog No. Fl 4202)の１ｍＭ保存溶液。ハンクス平衡塩類溶液(Fisher/Mediatech, Catalog No. MT21023)１０００ｍｌ、１Ｍ Hepes保存溶液２０ｍｌおよび２５０ｍＭプロベニシド保存溶液１０ｍｌを用いて反応緩衝液を調製した。ローディング緩衝液を調製するため、１ｍＭ Fluo 4-AM Dye保存溶液１.６ｍｌをプルロニック酸(Molecular Probes, Catalog No. P6866)０.３２ｍｌと混合し、次いで上記の反応緩衝液４００ｍｌおよびウシ胎児血清４ｍｌと混合した。
【０１４１】
アッセイの１時間前に、96/384 Multidropデバイスを用いて新たに調製したローディング緩衝液５０μｌを３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。加湿されたインキュベータ中３７℃で細胞をインキューベートして色素取込みを最大にした。アッセイの直前に、プレート底面より少なくとも１０ｍｍ上に設定された吸引ヘッドを有する384 EMBLA Cell Washer (Skatron; Model No. 12386)を用いて細胞を反応緩衝液９０μｌで２回洗浄し、ウェル当たり４５μｌの緩衝液を残した。
【０１４２】
FLIPR(R) II (Molecular Devices)機器のＣＣＤカメラ(Princeton Instruments)をｆ−ストップ２.０および露出０.４秒に設定した。カメラを用いて色素ローディングの精度について細胞プレートをモニターした。
【０１４３】
候補となるオキシデカリン様化合物を含む化合物ライブラリーをそれぞれウェル当たり生理学的塩類緩衝液中約１０μＭの濃度で試験した。蛍光における変化を化合物添加前に１０秒間測定した。化合物を添加した後、最初の１分間は毎秒、蛍光を測定し、続いて全実験分析時間３分間の間に６秒毎に露光した。第１０スキャン後、１００μＭ保存化合物の５μｌアリコートを加え、１０μＭの細胞における最終化合物濃度を得た。最初の８０スキャンについての最大蛍光変化をアゴニスト活性の基準として記録し、そして１０μＭ ＡＴＰ (Sigma A9062)により誘発された最大蛍光変化と比較した。
【０１４４】
多くのオキシデカリン化合物は、ＨＭ74を活性化することがわかった。
【０１４５】
実施例３ アンタゴニストアッセイ
ヒトＨＭ74のアンタゴニストについてスクリーニングするため、ＨＭ74を、Ｇq機構に人工的に共役させることができる。実施例２のようにして、FLIPR(R)装置を用いて蛍光において生じたすべての変化をモニターする。アンタゴニストの活性は、蛍光におけるなんらかの減少によって反映される。
【０１４６】
ＨＭ74を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を予め操作し、実施例２に記載したようにＧｑタンパク質(Ｇα１６)の無差別形態(indiscriminate form)を発現させた。１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン(Gibco/BRL, Catalog No. 15140-148)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(Catalog No. 15140-148, Gibco/BRL)、４００μｇ／ｍｌジェネティシン(Ｇ４１８)(Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035)および２００μｇ／ｍｌゼオシン(Invitrogen, Catalog No. R250-05)を含むＦ１２ハム培地(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)中３７℃および５％ＣＯ２で細胞を増殖対数期に維持した。アッセイの１日前、96/384 Multidropデバイスを用いてウェル体積５０μｌを有する３８４ウェルの黒い／透明な底部のアッセイプレート(Greiner/Marsh, Catalog No. N58102)上でＣＨＯ−Ｋ１細胞１２,５００細胞／ウェルを培養した。加湿された５％ＣＯ2中３７℃で細胞をインキューベートした。
【０１４７】
以下の保存溶液を調製した：Hepes(Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080)の１Ｍ保存溶液(ｐＨ７.５)；１Ｎ ＮａＯＨ中に作成されたプロベニシド(Sigma, Catalog No. P8761)の２５０ｍＭ保存溶液；ＤＭＳＯ (Sigma D2650)中に作成されたFluo 4-AM Dye(Molecular Probes, Catalog No. F 14202)の１ｍＭ保存溶液；およびリガンドまたはアンタゴニストの保存溶液。ハンクス平衡塩類溶液(Fisher/Mediatech, Catalog No. MT21023)１０００ｍｌ、１Ｍ Hepes保存溶液２０ｍｌ、２５０ｍＭプロベニシド保存溶液１０ｍｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ2を用いて反応緩衝剤を調製した。ローディング緩衝液を調製するため、１ｍＭ Fluo 4-AM Dye保存溶液８０μｌをプルロニック酸(Molecular Probes, Catalog No. P6866)１６μｌと混合し、次いで、上記の反応緩衝液２０ｍｌおよびウシ胎児血清０.２ｍｌと混合した。
【０１４８】
アッセイの３０分前、96/384 Multidropデバイスを用いて、新たに調製したローディング緩衝液３０μｌを３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。加湿されたＣＯ２インキュベータ中３７℃で細胞をインキューベートして色素取込みを最大にした。アッセイ直前に、プレート底面より少なくとも４０ｍｍ上に設定された吸引ヘッドを有する384 EMBLA Cell Washerを用いて細胞を反応緩衝液１００μｌで３回洗浄し、ウェル当たり緩衝液４５μｌを残した。
【０１４９】
Platemate 384 pipetor(Matrix)を用いて１００μＭ保存アンタゴニスト化合物５μｌを細胞に加えた。インキュベーション工程中の化合物濃度は、約１０μＭであった。細胞をFLIPR(R) IIに置き、プレートの蛍光は、最初の１分間は毎秒測定し、続いて全実験分析時間３分間の間に６秒ごとに露光させた。第１０スキャンの後、アンタゴニストまたはリガンド(１０μＭ)を加えた。それぞれ添加した後、３８４のチップを、水中０.０１％ＤＭＳＯ２０μｌで１０回洗浄した。
【０１５０】
ＨＭ74細胞は、同定されたアゴニストに暴露することができまたは候補アンタゴニストで試験した後に暴露することができる。
【０１５１】
実施例４ 受容体結合アッセイ
ＨＭ74を含む膜画分を調製するため、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水(１０ｍｌ)中でインキュベーションすることによってＨＭ74を発現するＣＨＯ細胞系を集めた。細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡ(１０ｍｌ)を含むリン酸緩衝生理食塩水中でさらに３回洗浄した後、緩衝液Ａ(５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ７.８)(Sigma T6791)５ｍｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 (Sigma M8266)および１ｍＭ ＥＧＴＡ (Sigma 0396)中で再懸濁した。
【０１５２】
次いで、組織ホモジナイザー(Polytron, Kinemetica, Model PT 10/35)で１分間、細胞を粉砕した。生成したホモジネートをSorvall Instruments RC3B冷却遠心機中、４℃で２０分間４９,０００Ｘｇで遠心分離した。得られたペレットを緩衝液Ａ２５ｍｌ中で再懸濁し、そして遠心分離工程を３回繰り返した。最後に遠心分離した後、再びペレットを緩衝液Ａ５ｍｌ中に再懸濁し、等分し、そして−７０℃で保存した。
【０１５３】
膜画分およびトレーサーとして放射性同位元素標識化された興味のアゴニストを用いた受容体結合実験を実施した。アッセイは、９６ウェルプレート(Beckman Instruments)で実施した。結合反応物は、０.１％ウシ血清アルブミン(Sigma, Catalog No. 34287) (Im et al., J. Biol. Chem. (2000) 275(19): 14281-14286参照)を含む緩衝液Ａの最終体積０.２ｍｌ中、放射性アゴニスト(０.０１ｎＭ〜２５ｎＭ)の存在下でＣＨＯ細胞調製物１８μｇからなる。反応物を室温で１時間インキューベートした。０.３％ポリエチレンイミン(Sigma, Catalog No. P3143)および０.１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)で１時間、前処理したマルチチャネル収穫器(Brandell)上でWhatman GF/Cフィルタを通して濾過することによって反応を終了した。混合物をフィルタに適用し、１時間インキューベートした。フィルタを氷冷５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ７.６)１ｍｌで６回洗浄した。特異的結合は、放射活性の測定による各トレーサー濃度について全結合と非特異的結合(バックグラウンド)との間の差分に基づいて算出した。８〜１６の濃度データポイントを得、アゴニストと受容体との間の平衡状態で達成された受容体へのアゴニストの結合を測定した(平衡結合パラメーター)。競合アッセイにおいて、試験化合物を混合物に加え、受容体上で放射性アゴニストの結合について競合させた(競合結合値)。阻害曲線を作成し、結合の５０％阻害を達成するのに必要な濃度(ＩＣ50)を決定した。
【０１５４】
実施例５ 小分子アゴニスト
一連のオキシデカリン様分子を先に述べたようなＨＭ74を発現する細胞に暴露した。標的分子を標識化してＨＭ74への結合が生じたかどうかを測定した。洗浄後で細胞の標識化の程度を測定することによって結合を検出した。また、２Ｄゲル電気泳動によってＨＭ74を単離し、そのタンパク質と関連する標識化の程度を測定することによって結合を確かめた。その結合評価に続いて、またはその結合評価とは別に、ＨＭ74を活性化する候補アゴニストの能力を測定した。FLIPRアッセイを用いてＨＭ74への標的分子の結合における細胞内カルシウム動員を評価した。これによってカルシウム動員を生じたオキシデカリン分子を同定した。
【０１５５】
本発明を説明してきたが、技術者は、本明細書に教示された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書の教示に対して種々の変更および改良を行うことができることを知っている。
【０１５６】
本明細書に引用されたすべての文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造：
【化１】
を有する分子を治療を必要とする患者に投与することを含む、該患者においてＨＭ74シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節するための治療方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項２】
アゴニスト候補を、ＨＭ74を発現する細胞と接触させ、該アゴニスト候補の存在下でのＨＭ74のシグナル伝達活性が、該アゴニスト候補がない場合のＨＭ74の活性と比較して高められたかどうかを測定することを含むＨＭ74のアゴニストの同定方法であって、該アゴニスト候補は、下記構造：
【化２】
を有する上記方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項３】
インバースアゴニスト候補を、ＨＭ74を発現する細胞と接触させ、該インバースアゴニスト候補の存在下でのＨＭ74の活性が、該インバースアゴニスト候補がない場合のＨＭ74の活性と比較して減少したかどうかを測定することを含むＨＭ74のインバースアゴニストの同定方法であって、該インバースアゴニスト候補は、下記構造：
【化３】
を有する上記方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、シッフ塩基に結合したカルボニルもしくは酸素、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項４】
アンタゴニスト候補を、ＨＭ74を発現する細胞と接触させ、該アンタゴニスト候補の存在下でのＨＭ74のシグナル伝達活性が、アゴニストの存在下でのＨＭ74の活性と比較して減少したかどうかを測定することを含むＨＭ74のアンタゴニストの同定方法であって、該アンタゴニスト候補は、下記構造：
【化４】
を有する上記方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項５】
式：
【化５】
の化合物を含む医薬組成物の炎症調節量を治療の必要な患者に暴露することからなる炎症の調節方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項６】
式：
【化６】
の化合物。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルであり、
但し、Ｒ2がメチル、エチルまたはシクロヘキシルである場合、Ｒ1はｎ−アルキルまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルではなく；またはＲ2がアセチル基で置換されてもよいＣ1−Ｃ4アルコールまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルである場合、Ｒ1はｎ−(Ｃ1−Ｃ8)アルキル、(Ｃ1−Ｃ4)分枝アルキルまたはチオ置換されたフェニルではない。
【請求項１】
下記構造：
【化１】
を有する分子を治療を必要とする患者に投与することを含む、該患者においてＨＭ74シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節するための治療方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項２】
アゴニスト候補を、ＨＭ74を発現する細胞と接触させ、該アゴニスト候補の存在下でのＨＭ74のシグナル伝達活性が、該アゴニスト候補がない場合のＨＭ74の活性と比較して高められたかどうかを測定することを含むＨＭ74のアゴニストの同定方法であって、該アゴニスト候補は、下記構造：
【化２】
を有する上記方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項３】
インバースアゴニスト候補を、ＨＭ74を発現する細胞と接触させ、該インバースアゴニスト候補の存在下でのＨＭ74の活性が、該インバースアゴニスト候補がない場合のＨＭ74の活性と比較して減少したかどうかを測定することを含むＨＭ74のインバースアゴニストの同定方法であって、該インバースアゴニスト候補は、下記構造：
【化３】
を有する上記方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、シッフ塩基に結合したカルボニルもしくは酸素、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項４】
アンタゴニスト候補を、ＨＭ74を発現する細胞と接触させ、該アンタゴニスト候補の存在下でのＨＭ74のシグナル伝達活性が、アゴニストの存在下でのＨＭ74の活性と比較して減少したかどうかを測定することを含むＨＭ74のアンタゴニストの同定方法であって、該アンタゴニスト候補は、下記構造：
【化４】
を有する上記方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項５】
式：
【化５】
の化合物を含む医薬組成物の炎症調節量を治療の必要な患者に暴露することからなる炎症の調節方法。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルである。
【請求項６】
式：
【化６】
の化合物。
式中、ＸはＯ、ＮＲ2またはＳであり；
Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ18アルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルケニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ1−Ｃ18アルキニル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；Ｃ3−Ｃ18アリール（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはその組み合わせであってもよい）；またはＣ5−Ｃ18シクロアルキル（これは側基を含んでいても、橋かけを含んでいても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）；またはそれらの組み合わせであり；
Ｒ2は、Ｒ1基、(Ｃ1−Ｃ10)アルキル−(Ｃ3−Ｃ10)シクロアルキル（これは分枝していても、ヘテロ原子を含んでいても、もしくは置換されていても、またはそれらの組み合わせであってもよい）であり；またはＸおよびＲ2は、環を形成してもよく；
Ｒ3は、ＨまたはＲ1であり；そして
Ｙは、カルボニル、シッフ塩基、オキシン、ケタール、アセタール、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはエノールエステルであり、
但し、Ｒ2がメチル、エチルまたはシクロヘキシルである場合、Ｒ1はｎ−アルキルまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルではなく；またはＲ2がアセチル基で置換されてもよいＣ1−Ｃ4アルコールまたはＣ1−Ｃ4分枝アルキルである場合、Ｒ1はｎ−(Ｃ1−Ｃ8)アルキル、(Ｃ1−Ｃ4)分枝アルキルまたはチオ置換されたフェニルではない。
【公表番号】特表２００７−５２６９１７（Ｐ２００７−５２６９１７Ａ）
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５４１２７（Ｐ２００６−５５４１２７）
【出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４０９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８２３５２
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５００１３７９７６）アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド (76)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４０９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８２３５２
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５００１３７９７６）アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド (76)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]