ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有する５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤
【課題】細菌によって引き起こされる感染症に対する薬剤として臨床できることが期待される、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して阻害活性を示す新規物質及びその製造方法を提供する。
【解決手段】（１）下記式（Ｉ）
（式中Ｒはｎ−Ｃ１６Ｈ３３，ｉ−Ｃ１６Ｈ３３，ｎ−Ｃ１７Ｈ３５，ＭはＨまたはＮａ等を表わす）で示される化合物、（２）その化合物等からなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、（３）ストレプトミセス属に属し式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中に前記化合物を蓄積せしめ、培養物から前記化合物を採取する式（Ｉ）で示される化合物の製造方法、及び（４）ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物。
【解決手段】（１）下記式（Ｉ）
（式中Ｒはｎ−Ｃ１６Ｈ３３，ｉ−Ｃ１６Ｈ３３，ｎ−Ｃ１７Ｈ３５，ＭはＨまたはＮａ等を表わす）で示される化合物、（２）その化合物等からなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、（３）ストレプトミセス属に属し式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中に前記化合物を蓄積せしめ、培養物から前記化合物を採取する式（Ｉ）で示される化合物の製造方法、及び（４）ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物が生産する脂質代謝阻害活性を有する５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物、その製造方法及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細菌感染症の予防及び治療には各種ベータラクタム抗生物質、アミノ配糖体、マクロライド、グリコペプチド、キノロンなどが使われてきたが、最近これらの抗生物質に耐性を示す感染菌が増加しており、従来のタイプとは異なる抗生物質が渇望されている。
【０００３】
かかる実情において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素はＨＭＧ−ＣｏＡを基質としてメバロン酸を生成する酵素であり、本酵素を阻害する抗菌剤は未だ実用化に至っていない。従って、本酵素を阻害する薬剤の発見は、上記の課題を解決し得ると考えられ、ＭＲＳＡやＶＲＥなどの多剤耐性菌による難治性の感染症の新しい治療剤として臨床できることが期待される。
【０００４】
本発明に関連する先行技術には、ストレプトミセス属に属する微生物培養液から単離した５−アルキルベンゼンスルフェート類（ただし、５−アルキルは炭素原子数１５〜１６である。）をパノシアリン（panosialin）と命名し、パノシアリン類（panosialins）がシアリダーゼ（sialidase）、酸性ホスファターゼ（acid phosphatase）及びポリガラクツロナーゼ（polygalacturonase）阻害作用を有することを報告している（The Jounal of Antibiotics, 24, 860-875(1971)；非特許文献１）、また、同様にストレプトミセス属に属する微生物培養液から５−アルキル部分の炭素原子数が１５〜１６のパノシアリン類似体がグリコシダーゼ阻害活性を有する旨の報告が有るが（The Jounal of Antibiotics, 48, 205-210(1995)；非特許文献２）、５−アルキルベンゼンスルフェート類がＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有することについては全く記載がない。
【０００５】
【非特許文献１】The Jounal of Antibiotics, 24, 860-875(1971)
【非特許文献２】The Jounal of Antibiotics, 48, 205-210(1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、微生物のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して阻害作用を有することにより、抗細菌剤として臨床できる新規物質及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、土壌より新たに分離されたストレプトミセス属（Streptomyces sp.）に属する菌株の培養物中に、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有する物質が産生されることを見出した。次いで、該培養物中から本ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する活性物質を分離、精製したところ、公知のパノシアリンに比べて５位のアルキル基の構造が異なり、炭素原子数が１６〜１７個の類似体である後記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）で示される化学構造を有する新規物質を見出した。
【０００８】
これらの物質は従来全く知られていないことから、各々本物質を０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質と称し、その総称を０１−７６Ｄ３物質と称することにした。また、公知のパノシアリン類についてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を測定したところ、上記０１−７６Ｄ３−１、０１−７６Ｄ３−２、及び０１−７６Ｄ３―３物質と同等の活性を有することを初めて見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は下記１〜４の新規化合物、５〜１２のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、１３〜１４の新規化合物の製造方法、及び１５〜１６の新規微生物に関する。
１．下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）16ＣＨ3、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）。）
で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物。
２．Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記１に記載の化合物。
３．Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記１に記載の化合物。
４．Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記１に記載の化合物。
５．下記式（ＩＡ）
【化２】
（式中、ＲaはＣ１０〜２０の分岐していてもよいアルキル基を表わし、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物からなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
６．Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ3、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）、−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、及び−（ＣＨ2）16ＣＨ3から選択される基を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
７．Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
８．Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
９．Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１０．Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１１．Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１２．Ｒが−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１３．Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１４．ストレプトミセス属に属し、下記式（Ｉ）
【化３】
（式中の記号は前記１の記載と同じ意味を表わす。）
で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中に前記化合物を蓄積せしめ、培養物から前記化合物を採取することを特徴とする式（Ｉ）で示される化合物の製造方法。
１５．ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である前記１０記載の製造方法。
１６．ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物。
１７．微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である前記５記載の微生物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明にかかる新規化合物を示す一般式（Ｉ）において、Ｒが表わすアルキル基の具体例としては、−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）16ＣＨ3が挙げられる。
【００１１】
本発明にかかるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である一般式（ＩＡ）で示される化合物において、Ｒaが表わすアルキル基の具体例としては、上記一般式（Ｉ）のＲで挙げた例のほかに−（ＣＨ2）12ＣＨ3、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＢ）、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＡ）、−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＣ）、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＤ）等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、一般式（Ｉ）及び（ＩＡ）中のＭは水素原子を表わすか、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。塩としては特に限定されないが、公知のアルカリ金属（Ｎａ，Ｋ等）、アルカリ土類金属（Ｃａ，Ｍｇ等）、アンモニウム塩、有機アミン塩等が挙げられる。
【００１３】
本発明の式（１）で示される新規５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物（０１−７６Ｄ３物質）を生産する能力を有する微生物（以下、「０１−７６Ｄ３物質生産菌」と称する）は、ストレプトミセス属に属するが、例えば本発明者らが分離したストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３菌株が、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。
【００１４】
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はイースト・麦芽エキス寒天やオートミール寒天で豊富に着生し、白色から薄い茶褐色の色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に２０個以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は螺旋状で、胞子の大きさは約0.7×0.9μｍの円筒状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のう及び遊走子は見出されない。
【００１５】
（II）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（E.B.Shirling）とデー・ゴットリーブ（D.Gottlieb）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー，１６巻，３１３頁，１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。
【００１６】
【表１】
【００１７】
（III）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天 陰 性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天 陰 性
（ハ）トリプトン・イースト液 陰 性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃） 陰 性
（２）硝酸塩の還元 陰 性
（３）ゼラチンの液化（２１〜２３℃） 陰 性
（単純ゼラチン培地）
（４）スターチの加水分解 陽 性
（５）脱脂乳の凝固（３７℃） 陰 性
（６）脱脂乳のペプトン化（３７℃） 陽 性
（７）生育温度範囲 １１〜４５℃
（８）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、
ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、
Ｄ−フラクトース、シュークロース
やや利用する：メリビオース
利用しない：ラフィノース
（９）セルロースの分解 陰 性
【００１８】
（IV）細胞壁組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ6）とＭＫ−９（Ｈ8）である。
【００１９】
（Ｖ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次の通りである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ6）とＭＫ−９（Ｈ8）である。胞子連鎖の形態は螺旋状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は黄色の色調を呈し、気菌糸は白色から茶褐色の色調を呈する。メラニン色素は産生しない。
【００２０】
これらの結果及び１６Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子の解析結果から、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、４巻、１９８９年に基づくストレプトミセス属に属する菌種であると考えられる。
【００２１】
なお、本菌株はストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３）として、平成１７年２月１５日に茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受領番号はＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６である。
【００２２】
また、本発明の好ましい菌株として０１−７６Ｄ３物質生産菌を挙げたが、菌の一般的性状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行なわれる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ストレプトミセス属に属し、０１−７６Ｄ３物質を生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株も０１−７６Ｄ３物質生産菌として包含される。
【００２３】
本発明の０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質は、ストレプトミセス属に属する０１−７６Ｄ３物質生産菌を適当な培地に培養して製造される。本菌株の培養方法は、通常の真菌の培養方法が一般に適用される。
培地は、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩などを含有させた栄養培地が適宜用いられる。
【００２４】
同化し得る炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロース、グリセリン、有機酸などを単独または組み合わせて用いることができ、消化し得る窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、カゼイン、大豆蛋白加水分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物を単独あるいは組み合わせて用いることができ、その他必要に応じてナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩、重金属塩類を添加してもよい。
さらに培地には、必要に応じて本菌の生育や０１−７６Ｄ３物質の生産を促進する微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。
【００２５】
培養方式は特に限定されないが、培養は好気的条件下で行ない、通常は振とうまたは通気撹拌培養を行なう。工業的には深部通気撹拌培養が好ましい。培地の酸性度は、ｐＨ6.8〜7.5の中性付近とする。培養温度は２０〜３７℃とし、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、本発明の０１−７６Ｄ３物質が生成蓄積され、培養物中の蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよく、通常液体培養の場合、３〜６日間培養を行なうと、本発明の０１−７６Ｄ３物質の蓄積量が最大に達する。
【００２６】
これらの培養組成、培地の種類、酸性度、培養温度、撹拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択することができる。液体培養において発泡があるときは、例えばシリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。
【００２７】
このようにして得られた培養物中に蓄積された０１−７６Ｄ３物質は、培養ろ液または培養菌体中に含まれているので、培養ろ液と菌体とに分離し、各々に０１−７６Ｄ３物質が可溶な有機溶媒を加え、０１−７６Ｄ３物質を抽出して採取するのが有利である。
培養ろ液と菌体との分離方法は特に限定されないが、必要に応じてろ過補助剤、例えばセライト、ハイフロースーパーセル等を用いてろ過するか、または遠心分離することができる
【００２８】
培養ろ液から０１−７６Ｄ３物質を採取するには、まず培養ろ液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルムなどの非親水性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して粗製の物質、０１−７６Ｄ３物質が得られる。
【００２９】
該粗製物質は、脂溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマトグラフィーにより分離、精製することができる。
【００３０】
菌体から０１−７６Ｄ３物質を採取するには、菌体を含水アセトン、含水メタノールなどの含水親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物を酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルムなどの非親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液は、前記の培養液から得た抽出液と合わせて分離精製するか、あるいは前記と同じ方法によって０１−７６Ｄ３物質を分離、精製することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
【００３２】
実施例：
５００ｍｌ容三角フラスコに、澱粉2.4％、イーストエキストラクト0.5％、グルコース0.1％、ペプトン0.3％、肉エキス0.3％及びＣａＣＯ30.4％を含む培地（ｐＨ7.0に調整）１００ｍｌを仕込み、綿栓後、１２１℃で２０分の条件で高圧蒸気滅菌した。充分に冷却した後、寒天培地上に生育させたストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Streptomyces echinatus 01-76D3）の胞子を無菌的に植菌し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を得た。
５００ｍｌ容三角フラスコに、グリセロール2.0％、ソイトンペプトン1.0％、炭酸カルシウム0.3％、硫酸ナトリウム0.5％を含む培地（ｐＨ7.4に調整）を１００ｍｌ仕込み、これを２０本作成した。綿栓後、１２１℃で２０分の条件で高圧蒸気滅菌し、充分に冷却した後、三角フラスコあたり上記種培養液２ｍｌを無菌的に移植した。
これを２７℃で５日間しんとう培養後、日立高速遠心分離機を用いて8000回転で上澄みと菌体に分離した。培養液上清1.8Ｌをイオン交換樹脂DAIAION HP-20（１００ｍｌ、三菱化成工業（株）製）のカラムに通し、イオン交換水３００ｍｌで洗浄した後、５０％アセトン水溶液３００ｍｌを流し０１−７６Ｄ３成分を溶出させ、溶出液を減圧濃縮してアセトンを留去した。得られた水溶液を等量のブタノールで３回抽出し、ブタノール層を集め、減圧乾固して褐色の粗物質７０８ｍｇを得た。これをシリカゲル（２０ｇ，シリカゲル６０（230-400メッシュ），メルク社製）のカラムにチャージし、クロロホルム0.1Ｌ、クロロホルム−メタノール（９：１）、（４：１）、（７：３）、（３：２）、（１：１）の溶液各0.15Ｌの順に段階的に溶出させた。
０１−７６Ｄ３成分を含むクロロホルム−メタノール（４：１）及び（７：３）画分を集め、減圧乾固して淡褐色の粗物質１４７ｍｇを得た。これをSephadex LH-20（Amersham社製）のゲルろ過カラム（内径２０ｍｍ、高さ５６５ｍｍ）にチャージし、メタノールで展開した。溶出液を１５ｍｌずつ１００画分に分け、０１−７６Ｄ３成分を含む画分７から画分６０を集め、白色粉末１３１ｍｇを得た。
これを高速液体クロマトグラフィー（装置はセンシュー科学社製のＨＰＬＣシステム、カラムはセンシュー科学社製のSenshu Pak PEGASIL ODS（サイズ２０×２５０ｍｍ）、検出はＵＶ２１０ｎｍ、流速は７ｍｌ／分、カラム温度は４０℃、移動相はアセトニトリル−５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.0）１：１混合液）に１回あたり５ｍｇずつチャージして、溶出時間14.3分、38.4分、51.6分、及び57.4分に出現する画分を集めた。各画分を濃縮してアセトニトリルを留去した後、１０％アセトニトリルで平衡化したＯＤＳ（PEGASIL ODS 粒子径７５〜１５０μｍ、孔径１２０センシュー科学社製）を充填したカラムにチャージし、１０％アセトニトリル１０ｍｌで洗浄した後、７０％アセトニトリルと９０％アセトニトリル各１０ｍｌで溶出した。
これらの溶出液を濃縮乾固することにより溶出時間38.4分の画分から０１−７６Ｄ３−１物質、51.6分の画分から０１−７６Ｄ３−２物質、および57.4分の画分から０１−７６Ｄ３−３物質をそれぞれ3.46ｍｇ、7.17ｍｇおよび2.94ｍｇ得た。
【００３３】
次に、本発明の０１−７６Ｄ３−１物質（式（Ｉ）においてＲ＝−（ＣＨ2）15ＣＨ3、Ｍ＝Ｎａ）、０１−７６Ｄ３−２物質（式（Ｉ）においてＲ＝−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｍ＝Ｎａ）、及び０１−７６Ｄ３−３物質（式（Ｉ）においてＲ＝−（ＣＨ2）16ＣＨ3、Ｍ＝Ｎａ）の理化学的性状について述べる。
【００３４】
［Ｉ］０１−７６Ｄ３−１物質
（１）分子式：Ｃ22Ｈ36Ｏ8Ｓ2Ｎａ2（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ561.1546 (M+Na)が観察された）（計算値561.1545）。
（２）分子量：５３８（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５６１(M+Na)+が観察された）。
（３）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示す通りであり、２０９ｎｍ（ε＝8,500）と２６６ｎｍ（ε＝1,100）に特徴的な吸収極大を示す。
（４）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図２に示す通りであり、λｍａｘKBrｃｍ-1：3468，2917，2848，1589，1469，1261に特徴的な吸収帯を有する。
（５）溶剤に対する溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：無色粉末状物質。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図３に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
0.89(３Ｈ分)，1.28(４Ｈ)，1.28〜1.33(２２Ｈ)，1.62(２Ｈ)，2.58(２Ｈ)，7.00(２Ｈ)，7.04(１Ｈ)。
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノ−ル中で測定、１５０ＭＨｚ）は図４に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
15.2(１Ｃ分)，24.5(１Ｃ)，33.8(１Ｃ)，31.2〜31.6(１１Ｃ)，33.1(１Ｃ)，37.7(１Ｃ)，114.0(１Ｃ)，119.5(２Ｃ)，146.6(１Ｃ)，155.0(２Ｃ)。
【００３５】
以上、０１−７６Ｄ３−１物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、０１−７６Ｄ３−１物質は下記式（Ｉ−１）で表わされる化学構造であることが決定された。
【化４】
【００３６】
［II］０１−７６Ｄ３−２物質
（１）分子式：Ｃ23Ｈ38Ｏ8Ｓ2Ｎａ2（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ575.1697 (M+Na)が観察された）（計算値575.1701）。
（２）分子量：５５２（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５７５(M+Na)+が観察された）。
（３）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図９に示す通りであり、２０９ｎｍ（ε＝7,700）と２６６ｎｍ（ε＝４６０）に特徴的な吸収極大を示す。
（４）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図１０に示す通りであり、λｍａｘKBrｃｍ-1：3465, 2920, 2848, 1589, 1469, 1296に特徴的な吸収帯を有する。
（５）溶剤に対する溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：無色粉末状物質。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図１１に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
0.87(６Ｈ分), 1.28(２Ｈ), 1.28〜1.33(２４Ｈ), 1.53(１Ｈ), 1.62(２Ｈ), 2.58(２Ｈ), 7.00(２Ｈ), 7.04(１Ｈ)。
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノ−ル中で測定、１５０ＭＨｚ）は図１２に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
23.8(２Ｃ分), 29.9(１Ｃ), 31.3〜31.8(１１Ｃ), 33.1(１Ｃ), 37.7(１Ｃ), 41.0(１Ｃ), 114.0(１Ｃ), 119.4(２Ｃ), 146.5(１Ｃ), 155.0(２Ｃ)。
【００３７】
以上、０１−７６Ｄ３−２物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、０１−７６Ｄ３−２物質は下記式（Ｉ−２）で示される化学構造であることが決定された。
【化５】
【００３８】
［III］０１−７６Ｄ３−３物質
（１）分子式：Ｃ23Ｈ38Ｏ8Ｓ2Ｎａ2（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ575.1704 (M+Na)が観察された）（計算値575.1701）。
（２）分子量：５５２（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５７５(M+Na)+が観察された）。
（３）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１３に示す通りであり、２０９ｎｍ（ε＝6,700）と２６６ｎｍ（ε＝５００）に特徴的な吸収極大を示す。
（４）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図１４に示す通りであり、λｍａｘKBrｃｍ-1：3467, 2924, 2852, 1592, 1466, 1266に特徴的な吸収帯を有する。
（５）溶剤に対する溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：無色粉末状物質。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図１５に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
0.89(３Ｈ分), 1.28(４Ｈ), 1.28〜1.33(２４Ｈ), 1.62(２Ｈ), 2.58(２Ｈ), 7.00(２Ｈ), 7.05(１Ｈ）。
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノ−ル中で測定、１５０ＭＨｚ）は図１６に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
15.1(１Ｃ分), 24.4(１Ｃ), 33.8(１Ｃ), 31.2〜31.6(１２Ｃ), 33.1(１Ｃ), 37.2(１Ｃ), 114.0(１Ｃ), 119.4(２Ｃ), 146.5(１Ｃ), 155.0(２Ｃ)。
【００３９】
以上、０１−７６Ｄ３−３物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、０１−７６Ｄ３−３物質は下記式（Ｉ−３）示される化学構造であることが決定された。
【化６】
【００４０】
上記したように、０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまでに全く報告されておらず、０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３−３物質は新規物質である。
【００４１】
試験例：
次に、本発明の５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物である０１−７６Ｄ３物質及び公知の５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物であるパノシアリンＡ〜Ｄの生物学的試験について述べる。
【００４２】
（１）黄色ブドウ球菌由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する阻害作用
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、Ｗｉｌｄｉｎｇらの方法（J. Bacteriol., 182巻, 5147〜5152頁, 2000年）を一部改変して行なった。酵素源としては、黄色ブドウ球菌由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｔ７ファージ由来プロモーターにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてIsopropyl-1-thio-β-Ｄ-galactopyranosideを0.1ｍＭとなるように添加して黄色ブドウ球菌由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を誘導発現させることにより得られた形質転換大腸菌由来の無細胞抽出液を用いた。
上記形質転換大腸菌は氷冷した緩衝液Ａ（２０ｍＭ リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ7.5）、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ7.5）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ショ糖、１ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１０％グリセロール）に懸濁し、フレンチプレスを用いて1,000Ｋｇ／ｃｍ2の圧力で菌体を破砕した。これを18,800×ｇで４℃、１０分間遠心し、得られた上清を100,000×ｇ、４℃、９０分間超遠心した。得られた上清を18.6ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度となるように前記の緩衝液Ａで調製し、無細胞抽出液とした。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の測定は、緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、0.2ｍＭ ＮＡＤＰＨ）中で２５０μＭ ＨＭＧ−ＣｏＡと０１−７６Ｄ３物質を加え全量92.5μｌとして、９６穴マイクロプレートの穴に入れた。酵素溶液（６２μｇ／ｍｌ）7.5μｌを加え全量を１００μｌとして、３４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで２５秒間隔で２０分間測定した。
ＨＭＧ−ＣｏＡ添加、無添加１分間あたりの吸光度の変化を求め、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害率を下記の式から算出した。
【数１】
その算出結果、０１−７６Ｄ３物質のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は、０１−７６Ｄ３−１物質で3.53μＭ、０１−７６Ｄ３−２物質で3.62μＭ、０１−７６Ｄ３−３物質で3.62μＭと測定された。
また、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）の培養物より精製したパノシアリンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤについて同様にして測定したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は各々、3.82μＭ、3.82μＭ、3.35μＭ、及び3.53μＭであった。
【００４３】
（２）抗細菌作用について
次に、本発明の０１−７６Ｄ３物質の抗菌活性について以下に述べる。黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する抗菌活性を日本化学療法学会により規定された微量液体希釈法（Chemotherapy, 41巻, 183頁, 1993年）に従って測定した。その結果、本発明の５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物である０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、０１−７６Ｄ３−３物質とも黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する最小発育阻止濃度は31.3μｇ／ｍｌと測定された。同様にパノシアリンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤについて測定した黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する最小発育阻止濃度は31.3μｇ／ｍｌと測定された。
【００４４】
以上に詳しく述べたように、本発明による新規パノシアリン類（０１−７６Ｄ３物質）及び公知のパノシアリン類はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して阻害活性を示し、黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対して抗菌活性を示すことから、抗細菌剤として有用であると期待される。
【００４５】
以上、本発明を、ストレプトミセス属に属する微生物が生産する一般式（Ｉ）においてＭがＮａであるナトリウム塩化合物について説明したが、当業者であれば、ナトリウム塩化合物から対応するＭが水素原子を表わすフリー体を調製すること、及びフリー体を経由して他の塩類（例えば、カリウム塩、アンモニウム塩等）に容易に誘導できることは明らかであり、またこれらがナトリウム塩化合物と同等の活性有することも予想されるところである。したがって、ナトリウム塩化合物に対応するフリー体及び他の塩類も本発明の範囲に含まれる。
さらに、一般式（Ｉ）で示される化合物は、ストレプトミセス属に属する微生物が生産するものに限定されず、例えば、非特許文献２（The Jounal of Antibiotics, 24, 870-875(1971)）に記載の方法に準じて合成される合成品も当然に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上の通り、ストレプトミセス属に属する０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して、その培養物中から０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３−３物質を採取することにより、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する阻害活性物質が得られた。該物質は多剤耐性菌などによる難治性の細菌感染症に対する抗細菌剤としての効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3ＯＨ中）を示す。
【図２】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図３】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図４】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図５】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3ＯＨ中）を示す。
【図６】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図７】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図８】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図９】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3ＯＨ中）を示す。
【図１０】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図１１】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図１２】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物が生産する脂質代謝阻害活性を有する５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物、その製造方法及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細菌感染症の予防及び治療には各種ベータラクタム抗生物質、アミノ配糖体、マクロライド、グリコペプチド、キノロンなどが使われてきたが、最近これらの抗生物質に耐性を示す感染菌が増加しており、従来のタイプとは異なる抗生物質が渇望されている。
【０００３】
かかる実情において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素はＨＭＧ−ＣｏＡを基質としてメバロン酸を生成する酵素であり、本酵素を阻害する抗菌剤は未だ実用化に至っていない。従って、本酵素を阻害する薬剤の発見は、上記の課題を解決し得ると考えられ、ＭＲＳＡやＶＲＥなどの多剤耐性菌による難治性の感染症の新しい治療剤として臨床できることが期待される。
【０００４】
本発明に関連する先行技術には、ストレプトミセス属に属する微生物培養液から単離した５−アルキルベンゼンスルフェート類（ただし、５−アルキルは炭素原子数１５〜１６である。）をパノシアリン（panosialin）と命名し、パノシアリン類（panosialins）がシアリダーゼ（sialidase）、酸性ホスファターゼ（acid phosphatase）及びポリガラクツロナーゼ（polygalacturonase）阻害作用を有することを報告している（The Jounal of Antibiotics, 24, 860-875(1971)；非特許文献１）、また、同様にストレプトミセス属に属する微生物培養液から５−アルキル部分の炭素原子数が１５〜１６のパノシアリン類似体がグリコシダーゼ阻害活性を有する旨の報告が有るが（The Jounal of Antibiotics, 48, 205-210(1995)；非特許文献２）、５−アルキルベンゼンスルフェート類がＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有することについては全く記載がない。
【０００５】
【非特許文献１】The Jounal of Antibiotics, 24, 860-875(1971)
【非特許文献２】The Jounal of Antibiotics, 48, 205-210(1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、微生物のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して阻害作用を有することにより、抗細菌剤として臨床できる新規物質及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、土壌より新たに分離されたストレプトミセス属（Streptomyces sp.）に属する菌株の培養物中に、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有する物質が産生されることを見出した。次いで、該培養物中から本ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する活性物質を分離、精製したところ、公知のパノシアリンに比べて５位のアルキル基の構造が異なり、炭素原子数が１６〜１７個の類似体である後記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）で示される化学構造を有する新規物質を見出した。
【０００８】
これらの物質は従来全く知られていないことから、各々本物質を０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質と称し、その総称を０１−７６Ｄ３物質と称することにした。また、公知のパノシアリン類についてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を測定したところ、上記０１−７６Ｄ３−１、０１−７６Ｄ３−２、及び０１−７６Ｄ３―３物質と同等の活性を有することを初めて見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は下記１〜４の新規化合物、５〜１２のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、１３〜１４の新規化合物の製造方法、及び１５〜１６の新規微生物に関する。
１．下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）16ＣＨ3、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）。）
で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物。
２．Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記１に記載の化合物。
３．Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記１に記載の化合物。
４．Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記１に記載の化合物。
５．下記式（ＩＡ）
【化２】
（式中、ＲaはＣ１０〜２０の分岐していてもよいアルキル基を表わし、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物からなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
６．Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ3、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）、−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、及び−（ＣＨ2）16ＣＨ3から選択される基を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
７．Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
８．Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
９．Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１０．Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１１．Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１２．Ｒが−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１３．Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす前記５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
１４．ストレプトミセス属に属し、下記式（Ｉ）
【化３】
（式中の記号は前記１の記載と同じ意味を表わす。）
で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中に前記化合物を蓄積せしめ、培養物から前記化合物を採取することを特徴とする式（Ｉ）で示される化合物の製造方法。
１５．ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である前記１０記載の製造方法。
１６．ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物。
１７．微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である前記５記載の微生物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明にかかる新規化合物を示す一般式（Ｉ）において、Ｒが表わすアルキル基の具体例としては、−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）16ＣＨ3が挙げられる。
【００１１】
本発明にかかるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である一般式（ＩＡ）で示される化合物において、Ｒaが表わすアルキル基の具体例としては、上記一般式（Ｉ）のＲで挙げた例のほかに−（ＣＨ2）12ＣＨ3、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＢ）、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＡ）、−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＣ）、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）（ＭがＮａに対応するものがパノシアリンＤ）等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、一般式（Ｉ）及び（ＩＡ）中のＭは水素原子を表わすか、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。塩としては特に限定されないが、公知のアルカリ金属（Ｎａ，Ｋ等）、アルカリ土類金属（Ｃａ，Ｍｇ等）、アンモニウム塩、有機アミン塩等が挙げられる。
【００１３】
本発明の式（１）で示される新規５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物（０１−７６Ｄ３物質）を生産する能力を有する微生物（以下、「０１−７６Ｄ３物質生産菌」と称する）は、ストレプトミセス属に属するが、例えば本発明者らが分離したストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３菌株が、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。
【００１４】
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はイースト・麦芽エキス寒天やオートミール寒天で豊富に着生し、白色から薄い茶褐色の色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に２０個以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は螺旋状で、胞子の大きさは約0.7×0.9μｍの円筒状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のう及び遊走子は見出されない。
【００１５】
（II）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（E.B.Shirling）とデー・ゴットリーブ（D.Gottlieb）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー，１６巻，３１３頁，１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。
【００１６】
【表１】
【００１７】
（III）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天 陰 性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天 陰 性
（ハ）トリプトン・イースト液 陰 性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃） 陰 性
（２）硝酸塩の還元 陰 性
（３）ゼラチンの液化（２１〜２３℃） 陰 性
（単純ゼラチン培地）
（４）スターチの加水分解 陽 性
（５）脱脂乳の凝固（３７℃） 陰 性
（６）脱脂乳のペプトン化（３７℃） 陽 性
（７）生育温度範囲 １１〜４５℃
（８）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、
ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、
Ｄ−フラクトース、シュークロース
やや利用する：メリビオース
利用しない：ラフィノース
（９）セルロースの分解 陰 性
【００１８】
（IV）細胞壁組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ6）とＭＫ−９（Ｈ8）である。
【００１９】
（Ｖ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次の通りである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ6）とＭＫ−９（Ｈ8）である。胞子連鎖の形態は螺旋状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は黄色の色調を呈し、気菌糸は白色から茶褐色の色調を呈する。メラニン色素は産生しない。
【００２０】
これらの結果及び１６Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子の解析結果から、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、４巻、１９８９年に基づくストレプトミセス属に属する菌種であると考えられる。
【００２１】
なお、本菌株はストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３）として、平成１７年２月１５日に茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受領番号はＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６である。
【００２２】
また、本発明の好ましい菌株として０１−７６Ｄ３物質生産菌を挙げたが、菌の一般的性状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行なわれる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ストレプトミセス属に属し、０１−７６Ｄ３物質を生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株も０１−７６Ｄ３物質生産菌として包含される。
【００２３】
本発明の０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質は、ストレプトミセス属に属する０１−７６Ｄ３物質生産菌を適当な培地に培養して製造される。本菌株の培養方法は、通常の真菌の培養方法が一般に適用される。
培地は、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩などを含有させた栄養培地が適宜用いられる。
【００２４】
同化し得る炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロース、グリセリン、有機酸などを単独または組み合わせて用いることができ、消化し得る窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、カゼイン、大豆蛋白加水分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物を単独あるいは組み合わせて用いることができ、その他必要に応じてナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩、重金属塩類を添加してもよい。
さらに培地には、必要に応じて本菌の生育や０１−７６Ｄ３物質の生産を促進する微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。
【００２５】
培養方式は特に限定されないが、培養は好気的条件下で行ない、通常は振とうまたは通気撹拌培養を行なう。工業的には深部通気撹拌培養が好ましい。培地の酸性度は、ｐＨ6.8〜7.5の中性付近とする。培養温度は２０〜３７℃とし、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、本発明の０１−７６Ｄ３物質が生成蓄積され、培養物中の蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよく、通常液体培養の場合、３〜６日間培養を行なうと、本発明の０１−７６Ｄ３物質の蓄積量が最大に達する。
【００２６】
これらの培養組成、培地の種類、酸性度、培養温度、撹拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択することができる。液体培養において発泡があるときは、例えばシリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。
【００２７】
このようにして得られた培養物中に蓄積された０１−７６Ｄ３物質は、培養ろ液または培養菌体中に含まれているので、培養ろ液と菌体とに分離し、各々に０１−７６Ｄ３物質が可溶な有機溶媒を加え、０１−７６Ｄ３物質を抽出して採取するのが有利である。
培養ろ液と菌体との分離方法は特に限定されないが、必要に応じてろ過補助剤、例えばセライト、ハイフロースーパーセル等を用いてろ過するか、または遠心分離することができる
【００２８】
培養ろ液から０１−７６Ｄ３物質を採取するには、まず培養ろ液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルムなどの非親水性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して粗製の物質、０１−７６Ｄ３物質が得られる。
【００２９】
該粗製物質は、脂溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマトグラフィーにより分離、精製することができる。
【００３０】
菌体から０１−７６Ｄ３物質を採取するには、菌体を含水アセトン、含水メタノールなどの含水親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物を酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルムなどの非親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液は、前記の培養液から得た抽出液と合わせて分離精製するか、あるいは前記と同じ方法によって０１−７６Ｄ３物質を分離、精製することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
【００３２】
実施例：
５００ｍｌ容三角フラスコに、澱粉2.4％、イーストエキストラクト0.5％、グルコース0.1％、ペプトン0.3％、肉エキス0.3％及びＣａＣＯ30.4％を含む培地（ｐＨ7.0に調整）１００ｍｌを仕込み、綿栓後、１２１℃で２０分の条件で高圧蒸気滅菌した。充分に冷却した後、寒天培地上に生育させたストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Streptomyces echinatus 01-76D3）の胞子を無菌的に植菌し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を得た。
５００ｍｌ容三角フラスコに、グリセロール2.0％、ソイトンペプトン1.0％、炭酸カルシウム0.3％、硫酸ナトリウム0.5％を含む培地（ｐＨ7.4に調整）を１００ｍｌ仕込み、これを２０本作成した。綿栓後、１２１℃で２０分の条件で高圧蒸気滅菌し、充分に冷却した後、三角フラスコあたり上記種培養液２ｍｌを無菌的に移植した。
これを２７℃で５日間しんとう培養後、日立高速遠心分離機を用いて8000回転で上澄みと菌体に分離した。培養液上清1.8Ｌをイオン交換樹脂DAIAION HP-20（１００ｍｌ、三菱化成工業（株）製）のカラムに通し、イオン交換水３００ｍｌで洗浄した後、５０％アセトン水溶液３００ｍｌを流し０１−７６Ｄ３成分を溶出させ、溶出液を減圧濃縮してアセトンを留去した。得られた水溶液を等量のブタノールで３回抽出し、ブタノール層を集め、減圧乾固して褐色の粗物質７０８ｍｇを得た。これをシリカゲル（２０ｇ，シリカゲル６０（230-400メッシュ），メルク社製）のカラムにチャージし、クロロホルム0.1Ｌ、クロロホルム−メタノール（９：１）、（４：１）、（７：３）、（３：２）、（１：１）の溶液各0.15Ｌの順に段階的に溶出させた。
０１−７６Ｄ３成分を含むクロロホルム−メタノール（４：１）及び（７：３）画分を集め、減圧乾固して淡褐色の粗物質１４７ｍｇを得た。これをSephadex LH-20（Amersham社製）のゲルろ過カラム（内径２０ｍｍ、高さ５６５ｍｍ）にチャージし、メタノールで展開した。溶出液を１５ｍｌずつ１００画分に分け、０１−７６Ｄ３成分を含む画分７から画分６０を集め、白色粉末１３１ｍｇを得た。
これを高速液体クロマトグラフィー（装置はセンシュー科学社製のＨＰＬＣシステム、カラムはセンシュー科学社製のSenshu Pak PEGASIL ODS（サイズ２０×２５０ｍｍ）、検出はＵＶ２１０ｎｍ、流速は７ｍｌ／分、カラム温度は４０℃、移動相はアセトニトリル−５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.0）１：１混合液）に１回あたり５ｍｇずつチャージして、溶出時間14.3分、38.4分、51.6分、及び57.4分に出現する画分を集めた。各画分を濃縮してアセトニトリルを留去した後、１０％アセトニトリルで平衡化したＯＤＳ（PEGASIL ODS 粒子径７５〜１５０μｍ、孔径１２０センシュー科学社製）を充填したカラムにチャージし、１０％アセトニトリル１０ｍｌで洗浄した後、７０％アセトニトリルと９０％アセトニトリル各１０ｍｌで溶出した。
これらの溶出液を濃縮乾固することにより溶出時間38.4分の画分から０１−７６Ｄ３−１物質、51.6分の画分から０１−７６Ｄ３−２物質、および57.4分の画分から０１−７６Ｄ３−３物質をそれぞれ3.46ｍｇ、7.17ｍｇおよび2.94ｍｇ得た。
【００３３】
次に、本発明の０１−７６Ｄ３−１物質（式（Ｉ）においてＲ＝−（ＣＨ2）15ＣＨ3、Ｍ＝Ｎａ）、０１−７６Ｄ３−２物質（式（Ｉ）においてＲ＝−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｍ＝Ｎａ）、及び０１−７６Ｄ３−３物質（式（Ｉ）においてＲ＝−（ＣＨ2）16ＣＨ3、Ｍ＝Ｎａ）の理化学的性状について述べる。
【００３４】
［Ｉ］０１−７６Ｄ３−１物質
（１）分子式：Ｃ22Ｈ36Ｏ8Ｓ2Ｎａ2（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ561.1546 (M+Na)が観察された）（計算値561.1545）。
（２）分子量：５３８（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５６１(M+Na)+が観察された）。
（３）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示す通りであり、２０９ｎｍ（ε＝8,500）と２６６ｎｍ（ε＝1,100）に特徴的な吸収極大を示す。
（４）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図２に示す通りであり、λｍａｘKBrｃｍ-1：3468，2917，2848，1589，1469，1261に特徴的な吸収帯を有する。
（５）溶剤に対する溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：無色粉末状物質。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図３に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
0.89(３Ｈ分)，1.28(４Ｈ)，1.28〜1.33(２２Ｈ)，1.62(２Ｈ)，2.58(２Ｈ)，7.00(２Ｈ)，7.04(１Ｈ)。
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノ−ル中で測定、１５０ＭＨｚ）は図４に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
15.2(１Ｃ分)，24.5(１Ｃ)，33.8(１Ｃ)，31.2〜31.6(１１Ｃ)，33.1(１Ｃ)，37.7(１Ｃ)，114.0(１Ｃ)，119.5(２Ｃ)，146.6(１Ｃ)，155.0(２Ｃ)。
【００３５】
以上、０１−７６Ｄ３−１物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、０１−７６Ｄ３−１物質は下記式（Ｉ−１）で表わされる化学構造であることが決定された。
【化４】
【００３６】
［II］０１−７６Ｄ３−２物質
（１）分子式：Ｃ23Ｈ38Ｏ8Ｓ2Ｎａ2（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ575.1697 (M+Na)が観察された）（計算値575.1701）。
（２）分子量：５５２（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５７５(M+Na)+が観察された）。
（３）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図９に示す通りであり、２０９ｎｍ（ε＝7,700）と２６６ｎｍ（ε＝４６０）に特徴的な吸収極大を示す。
（４）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図１０に示す通りであり、λｍａｘKBrｃｍ-1：3465, 2920, 2848, 1589, 1469, 1296に特徴的な吸収帯を有する。
（５）溶剤に対する溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：無色粉末状物質。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図１１に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
0.87(６Ｈ分), 1.28(２Ｈ), 1.28〜1.33(２４Ｈ), 1.53(１Ｈ), 1.62(２Ｈ), 2.58(２Ｈ), 7.00(２Ｈ), 7.04(１Ｈ)。
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノ−ル中で測定、１５０ＭＨｚ）は図１２に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
23.8(２Ｃ分), 29.9(１Ｃ), 31.3〜31.8(１１Ｃ), 33.1(１Ｃ), 37.7(１Ｃ), 41.0(１Ｃ), 114.0(１Ｃ), 119.4(２Ｃ), 146.5(１Ｃ), 155.0(２Ｃ)。
【００３７】
以上、０１−７６Ｄ３−２物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、０１−７６Ｄ３−２物質は下記式（Ｉ−２）で示される化学構造であることが決定された。
【化５】
【００３８】
［III］０１−７６Ｄ３−３物質
（１）分子式：Ｃ23Ｈ38Ｏ8Ｓ2Ｎａ2（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ575.1704 (M+Na)が観察された）（計算値575.1701）。
（２）分子量：５５２（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５７５(M+Na)+が観察された）。
（３）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１３に示す通りであり、２０９ｎｍ（ε＝6,700）と２６６ｎｍ（ε＝５００）に特徴的な吸収極大を示す。
（４）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図１４に示す通りであり、λｍａｘKBrｃｍ-1：3467, 2924, 2852, 1592, 1466, 1266に特徴的な吸収帯を有する。
（５）溶剤に対する溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：無色粉末状物質。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図１５に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
0.89(３Ｈ分), 1.28(４Ｈ), 1.28〜1.33(２４Ｈ), 1.62(２Ｈ), 2.58(２Ｈ), 7.00(２Ｈ), 7.05(１Ｈ）。
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノ−ル中で測定、１５０ＭＨｚ）は図１６に示す通りであり、水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は、下記に示す通りである。
15.1(１Ｃ分), 24.4(１Ｃ), 33.8(１Ｃ), 31.2〜31.6(１２Ｃ), 33.1(１Ｃ), 37.2(１Ｃ), 114.0(１Ｃ), 119.4(２Ｃ), 146.5(１Ｃ), 155.0(２Ｃ)。
【００３９】
以上、０１−７６Ｄ３−３物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、０１−７６Ｄ３−３物質は下記式（Ｉ−３）示される化学構造であることが決定された。
【化６】
【００４０】
上記したように、０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまでに全く報告されておらず、０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３−３物質は新規物質である。
【００４１】
試験例：
次に、本発明の５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物である０１−７６Ｄ３物質及び公知の５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物であるパノシアリンＡ〜Ｄの生物学的試験について述べる。
【００４２】
（１）黄色ブドウ球菌由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する阻害作用
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、Ｗｉｌｄｉｎｇらの方法（J. Bacteriol., 182巻, 5147〜5152頁, 2000年）を一部改変して行なった。酵素源としては、黄色ブドウ球菌由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｔ７ファージ由来プロモーターにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてIsopropyl-1-thio-β-Ｄ-galactopyranosideを0.1ｍＭとなるように添加して黄色ブドウ球菌由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を誘導発現させることにより得られた形質転換大腸菌由来の無細胞抽出液を用いた。
上記形質転換大腸菌は氷冷した緩衝液Ａ（２０ｍＭ リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ7.5）、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ7.5）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ショ糖、１ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１０％グリセロール）に懸濁し、フレンチプレスを用いて1,000Ｋｇ／ｃｍ2の圧力で菌体を破砕した。これを18,800×ｇで４℃、１０分間遠心し、得られた上清を100,000×ｇ、４℃、９０分間超遠心した。得られた上清を18.6ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度となるように前記の緩衝液Ａで調製し、無細胞抽出液とした。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の測定は、緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、0.2ｍＭ ＮＡＤＰＨ）中で２５０μＭ ＨＭＧ−ＣｏＡと０１−７６Ｄ３物質を加え全量92.5μｌとして、９６穴マイクロプレートの穴に入れた。酵素溶液（６２μｇ／ｍｌ）7.5μｌを加え全量を１００μｌとして、３４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで２５秒間隔で２０分間測定した。
ＨＭＧ−ＣｏＡ添加、無添加１分間あたりの吸光度の変化を求め、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害率を下記の式から算出した。
【数１】
その算出結果、０１−７６Ｄ３物質のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は、０１−７６Ｄ３−１物質で3.53μＭ、０１−７６Ｄ３−２物質で3.62μＭ、０１−７６Ｄ３−３物質で3.62μＭと測定された。
また、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）の培養物より精製したパノシアリンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤについて同様にして測定したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は各々、3.82μＭ、3.82μＭ、3.35μＭ、及び3.53μＭであった。
【００４３】
（２）抗細菌作用について
次に、本発明の０１−７６Ｄ３物質の抗菌活性について以下に述べる。黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する抗菌活性を日本化学療法学会により規定された微量液体希釈法（Chemotherapy, 41巻, 183頁, 1993年）に従って測定した。その結果、本発明の５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物である０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、０１−７６Ｄ３−３物質とも黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する最小発育阻止濃度は31.3μｇ／ｍｌと測定された。同様にパノシアリンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤについて測定した黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対する最小発育阻止濃度は31.3μｇ／ｍｌと測定された。
【００４４】
以上に詳しく述べたように、本発明による新規パノシアリン類（０１−７６Ｄ３物質）及び公知のパノシアリン類はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して阻害活性を示し、黄色ブドウ球菌ＦＤＡ２０９Ｐ株に対して抗菌活性を示すことから、抗細菌剤として有用であると期待される。
【００４５】
以上、本発明を、ストレプトミセス属に属する微生物が生産する一般式（Ｉ）においてＭがＮａであるナトリウム塩化合物について説明したが、当業者であれば、ナトリウム塩化合物から対応するＭが水素原子を表わすフリー体を調製すること、及びフリー体を経由して他の塩類（例えば、カリウム塩、アンモニウム塩等）に容易に誘導できることは明らかであり、またこれらがナトリウム塩化合物と同等の活性有することも予想されるところである。したがって、ナトリウム塩化合物に対応するフリー体及び他の塩類も本発明の範囲に含まれる。
さらに、一般式（Ｉ）で示される化合物は、ストレプトミセス属に属する微生物が生産するものに限定されず、例えば、非特許文献２（The Jounal of Antibiotics, 24, 870-875(1971)）に記載の方法に準じて合成される合成品も当然に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上の通り、ストレプトミセス属に属する０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３―３物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して、その培養物中から０１−７６Ｄ３−１物質、０１−７６Ｄ３−２物質、及び０１−７６Ｄ３−３物質を採取することにより、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する阻害活性物質が得られた。該物質は多剤耐性菌などによる難治性の細菌感染症に対する抗細菌剤としての効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3ＯＨ中）を示す。
【図２】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図３】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図４】本発明による０１−７６Ｄ３−１物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図５】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3ＯＨ中）を示す。
【図６】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図７】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図８】本発明による０１−７６Ｄ３−２物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図９】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3ＯＨ中）を示す。
【図１０】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図１１】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図１２】本発明による０１−７６Ｄ３−３物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）16ＣＨ3、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）
で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物。
【請求項２】
Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
下記式（ＩＡ）
【化２】
（式中、ＲaはＣ１０〜２０の分岐していてもよいアルキル基を表わし、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物からなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項６】
Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ3、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）、−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、及び−（ＣＨ2）16ＣＨ3から選択される基を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項７】
Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項８】
Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項９】
Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１０】
Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１１】
Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１２】
Ｒが−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１３】
Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１４】
ストレプトミセス属に属し、下記式（Ｉ）
【化３】
（式中の記号は請求項１の記載と同じ意味を表わす。）
で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中に前記化合物を蓄積せしめ、培養物から前記化合物を採取することを特徴とする式（Ｉ）で示される化合物の製造方法。
【請求項１５】
ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１６】
ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物。
【請求項１７】
微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である請求項５記載の微生物。
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）16ＣＨ3、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）
で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物。
【請求項２】
Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
下記式（ＩＡ）
【化２】
（式中、ＲaはＣ１０〜２０の分岐していてもよいアルキル基を表わし、Ｍは水素原子を表わすか、またはＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基（ＨＯ3Ｓ−）の塩を表わす。）で示される５−アルキルベンゼン−１，３−ジスルフェート化合物からなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項６】
Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ3、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2、−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）、−（ＣＨ2）15ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2、及び−（ＣＨ2）16ＣＨ3から選択される基を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項７】
Ｒが−（ＣＨ2）15ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項８】
Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項９】
Ｒが−（ＣＨ2）16ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１０】
Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１１】
Ｒが−（ＣＨ2）14ＣＨ3を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１２】
Ｒが−（ＣＨ2）13ＣＨ（ＣＨ3）2を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１３】
Ｒが−（ＣＨ2）12ＣＨ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）を表わし、ＭＯ3Ｓ−基がスルホン酸基のＮａ塩を表わす請求項５に記載のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。
【請求項１４】
ストレプトミセス属に属し、下記式（Ｉ）
【化３】
（式中の記号は請求項１の記載と同じ意味を表わす。）
で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中に前記化合物を蓄積せしめ、培養物から前記化合物を採取することを特徴とする式（Ｉ）で示される化合物の製造方法。
【請求項１５】
ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１６】
ストレプトミセス属に属し、式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物。
【請求項１７】
微生物が、ストレプトミセス エキナタス ０１−７６Ｄ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ ０１−７６Ｄ３，受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２４６）である請求項５記載の微生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００６−２３２７４１（Ｐ２００６−２３２７４１Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６００（Ｐ２００５−５０６００）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【Ｆターム（参考）】
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