ＩＬ−４／ＩＬ−１３特異的ポリペプチドおよびその治療上の使用
インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）に関連する状態または疾患を処置する方法において治療上有用である、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に結合し得るポリペプチドおよび多量体ポリペプチド。本発明は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１３結合融合ポリペプチド（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆをコードする核酸分子に特徴を有する。このポリペプチドにおいて、Ｒ１は、特異的にＩＬ−４活性を阻害し得る改変ＩＬ−４レセプターα（ＩＬ−４Ｒα）構成要素であり、Ｒ２は、特異的にＩＬ−１３活性を阻害し得るＩＬ−１３レセプターα１またはＩＬ−１３レセプターα２（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）であり、Ｆは、融合構成要素であり、そしてｘおよびｙは、各々独立して、１以上の正の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３特異的ポリペプチド、ならびにＩＬ−４活性および／またはＩＬ−１３活性を阻害するための、このようなポリペプチドの治療上の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
特許文献１において、Ｓｔａｈｌらは、サイトカインを結合して、２つのレセプター構成要素および多量体化構成要素から構成される非機能的複合体を形成し得るサイトカイン融合タンパク質融合ポリペプチドを記載する。インターロイキン−４レセプターα（ＩＬ−４Ｒα）およびＩＬ−１３レセプターα構成要素（ＩＬ−１３Ｒα）は、記載されている（例えば、特許文献２および特許文献３ならびに特許文献４）。
【特許文献１】米国特許第６，４７２，１７９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８５６，２９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４０，８６９号明細書
【特許文献４】欧州特許第８７６４８２号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
第一の局面において、本発明は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１３結合融合ポリペプチド（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆをコードする核酸分子に特徴を有する。
このポリペプチドにおいて、
Ｒ１は、この融合ポリペプチドにおける構成要素として存在する場合に、少なくとも１０−１０モル濃度のＩＣ５０で特異的にＩＬ−４活性を阻害し得る改変ＩＬ−４レセプターα（ＩＬ−４Ｒα）構成要素であり、
Ｒ２は、この融合ポリペプチドにおける構成要素として存在する場合に、少なくとも１０−１０モル濃度のＩＣ５０で特異的にＩＬ−１３活性を阻害し得るＩＬ−１３レセプターα１またはＩＬ−１３レセプターα２（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）であり、
Ｆは、融合構成要素であり、そして
ｘおよびｙは、各々独立して、１以上の正の整数である。この融合ポリペプチドの構成要素は、異なる順番（例えば、Ｆ−（Ｒ１）ｘ（Ｒ２）ｙ、（Ｒ１）ｘ−Ｆ−（Ｒ２）ｙまたは（Ｒ２）ｙ−Ｆ−（Ｒ１）ｘ）で配置され得る。より具体的には、Ｒ１は、配列番号２のアミノ酸１〜２３１、２４〜２３１、２８〜２３１または２４〜２２１（配列番号１の核酸配列によりコードされる）を含む親ＩＬ−４Ｒαまたはその対立遺伝子改変体に由来し、改変群Ｉで規定される１〜１０個の改変により改変される。そしてＲ２は、配列番号３のアミノ酸１〜３４３または２７〜３４３を含むＩＬ−１３レセプターα（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）構成要素またはそのフラグメントであり、必要に応じて、改変群ＩＩで規定される１つ以上の改変により改変される。あるいはＲ２は、配列番号４のアミノ酸１〜３４３または２３〜３４３を含むＩＬ−１３レセプターα（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）構成要素であり、必要に応じて、改変群ＩＩＩで規定される１つ以上の改変により改変される。必要に応じて、（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆは、シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む。一実施形態において、この融合ポリペプチドのＲ１構成要素は改変され、改変されていない構成要素と比較して、増加したＩＬ−４阻害活性または低下したＩＬ−４阻害活性および／または増加したＩＬ−１３阻害活性または低下したＩＬ−１３阻害活性を示す。好ましくは、Ｒ１への改変は、ＩＬ−４阻害とＩＬ−１３阻害との両方を増加させる。
【０００４】
Ｒ１：天然に存在する野生型ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、配列番号２に示される細胞外ドメインを有する８００アミノ酸のタンパク質である。配列番号２の公知の対立遺伝子改変体としては、位置７５におけるＰｈｅ、ＶａｌまたはＬｅｕ（Ｉｌｅ７５Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ）および／またはＶａｌ１３１Ｌｅｕが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｒ１は、配列番号２のアミノ酸２４〜２３１またはその対立遺伝子改変体を含み、必要に応じて、改変群Ｉで規定される１つ以上の改変によりさらに改変される。別の実施形態において、Ｒ１は、配列番号２のアミノ酸１〜２３１またはその対立遺伝子改変体であり、改変群Ｉに列挙される改変から選択される少なくとも１つの改変を有する。これらの改変は、特に所望される特性（例えば、改善された溶解性、低減された免疫原性、改善されたＰＫ、改善された生成特徴、および／または改変されたＩＬ−４活性および／またはＩＬ−１３活性をブロックする能力などが挙げられる）を有する新規ポリペプチドを提供する。
【０００５】
改変群Ｉ：配列番号２の位置６７、６８、７１、１５２、１６４、１７１、１７２、１７５、１９８および／または２０７のアミノ酸は、異なるアミノ酸に置換される。好ましい実施形態において、このアミノ酸置換は、以下の通りである：位置６７のＬｅｕは、Ｔｙｒに置換される（Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ）；Ｌｅｕ６８Ａｓｎ（疎水性のパッチを除去し得、そして特定の状況において溶解性ならびに／またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３をブロックする能力を改善するのに、望ましくあり得る）；Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ；Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ（酸性の電位を中和し得、そして疎水性のパッチの大きさを縮小する。それゆえ、改善された溶解性および／またはこの融合ポリペプチドの折りたたみのために望ましくあり得る）；Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ（リガンド結合部位のアミノ酸を変更し、それゆえ、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−４に対する阻害活性を改善するのに望ましくあり得る）；Ａｒｇ１９８Ｓｅｒ（正に荷電したパッチを除去し、それゆえ精製特性を改善するのに望ましくあり得る）；およびＣｙｓ２０７Ｓｅｒ（異常なジスルフィド結合の形成を減少させ、それゆえ共有結合性の凝集および／または不適当なジスルフィド結合を減少するのに望ましくあり得る）。グリコシル化部位の付加をもたらす改変としては、Ａｌａ７１ＡｓｎおよびＴｒｐ１６４Ｓｅｒが挙げられる。いくつかの実施形態において、１箇所以上のグリコシル化部位の付加は、さらなるグリコシル化部位のない同一のタンパク質と比較して免疫原性を低減するか、または溶解性もしくはインビボ安定性を増大するのに望ましい。好ましい実施形態において、Ｒ１は、Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒを有する配列番号２の１〜２３１を含み、位置６７、６８、１５２、１７１および１７２の１つ以上における変化によりさらに改変される。好ましい実施形態において、Ｒ１は、（ｉ）６７、６８および２０７における改変；（ｉｉ）６７、６８、１５２および２０７における改変；（ｉｉｉ）１５２および２０７における改変；（ｉｖ）６７、１７１、１７２および２０７における改変；（ｖ）６８、１７１、１７２および２０７における改変；（ｖｉ）６７、６８、１７１および２０７における改変；（ｖｉｉ）６７、６８、１７２および２０７における改変；（ｖｉｉｉ）１５２、１７１、１７２および２０７における改変；（ｉｘ）６７、６８、１７１、１７２および２０７における改変；（ｘ）６７、６８、１５２、１７１、１７２および２０７における改変；（ｘｉ）１７１、１７２および２０７における改変を含む。さらに好ましい実施形態において、Ｒ１は、Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒと、（ｉ）Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ、（ｉｉ）Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ、（ｉｉｉ）Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ、（ｉｖ）Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ＋Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ、（ｖ）Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ＋Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ、（ｖｉ）Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ＋Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ、（ｖｉｉ）Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ＋Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ＋Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒからなる群から選択される改変とを含む。
【０００６】
Ｒ２：天然に存在するヒト野生型ＩＬ−１３Ｒα１タンパク質は、４２７アミノ酸のタンパク質であり、配列番号３の配列を有し、３４３アミノ酸の細胞外ドメインを含む。一実施形態において、Ｒ２は、配列番号３のアミノ酸１〜３４３または２７〜３４３を含むＩＬ−１３結合ポリペプチド構成要素であり、必要に応じて、改変群ＩＩで規定される１以上の改変により改変される。別の実施形態において、Ｒ２は、配列番号４のアミノ酸１〜３４３または２３〜３４３を含むＩＬ−１３結合ポリペプチド構成要素であり、改変群ＩＩＩで規定される１つ以上の改変により必要に応じて改変される。
【０００７】
改変群ＩＩ：（ａ）配列番号３のアミノ酸１〜１２０は、ヒトｇｐ１３０（配列番号５）のアミノ酸１〜１２３に置換される；（ｂ）配列番号３のアミノ酸３３８〜３４３は欠失させられる；（ｃ）配列番号３のアミノ酸１〜２６は、異なるシグナル配列（例えば、配列番号６）に置換されるか；または（ｄ）配列番号３の位置４６、７３、１４３、２３５、２９３および／または３２９のアミノ酸の１つ以上が、異なるアミノ酸に置換される。より特定の実施形態において、好ましい置換は、以下の通りである：Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｙｒのいずれか一つ（好ましくは、Ａｌａ）による（配列番号３の）位置４６におけるＣｙｓ（Ｃｙｓ４６Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ｔｙｒ）（特定の実施形態において、異常なジスルフィド形成および共有結合性の凝集を減少するのに望ましくあり得る）；Ｌｙｓ７３Ｇｌｎ；Ｌｙｓ７３Ｇｌｎ（強く正に荷電したパッチを除去し、そして特定の実施形態において凝集を減少および／または溶解性を増大するのに望ましくあり得る）。Ｒ２は、完全にはグリコシル化されない部位を除去するために、１箇所以上のグリコシル化部位において、さらに改変され得る。そしてＲ２は、薬物動態および／または生成の一貫性を改善するのに望ましくあり得る：Ａｓｎ２３５Ｓｅｒ／Ｈｉｓ、Ａｓｎ２９３Ｇｌｙ、Ａｓｎ３２９Ａｓｐ。
【０００８】
改変群ＩＩＩ：（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜２２は欠失させられる。特定の実施形態において、これは、欠失したアミノ酸を、例えば配列番号６のようなシグナル配列に置換して、それにより異常なジスルフィド結合形成を除去するために、Ｃｙｓ２２を除去するのに望ましくあり得る、；（ｂ’）配列番号４のＣｙｓ２５２Ｉｌｅ；（ｃ’）配列番号４の位置３１０における変更されるアミノ酸。特定の実施形態において、Ｓｅｒ３１０は、Ｃｙｓに置換される（これは、タンパク質の三次構造を安定化させるのに望ましくあり得る）。
【０００９】
任意の融合構成要素（Ｆ）は、融合ポリペプチドの機能性を亢進させる任意の構成要素である。それゆえ、例えば、融合構成要素は、融合ポリペプチドの生物活性を亢進させ得るか、その生成および／または回収において補助し得るか、または融合ポリペプチドの薬理学的な特性もしくは薬物動態プロフィールを（例えば、その血清半減期、組織浸透性、免疫原性の欠如または安定性を亢進させることにより）亢進させ得る。好ましい実施形態において、この融合構成要素は、多量体化構成要素、血清タンパク質または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群から選択される。
【００１０】
融合構成要素が多量体化構成要素である場合、融合構成要素としては、別の多量体化構成要素と相互作用し、高次構造（例えば、二量体、三量体など）を形成し得る、任意の天然配列または合成配列が挙げられる。特定の実施形態において、多量体化構成要素は、以下からなる群から選択される：（ｉ）免疫グロブリン由来のドメイン、（ｉｉ）切断可能な領域（Ｃ領域）、（ｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）ロイシンジッパー、（ｉｖ）ヘリックスループモチーフ、および（ｖ）コイル−コイルモチーフ。より特定の実施形態において、免疫グロブリン由来のドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖からなる群から選択される。最も特定的な実施形態において、ＩｇＧのＦｃドメインは、ヒトＦｃΔ１（ａ）（軽鎖とのジスルフィド結合の形成に関わる領域の欠失を有するＦｃ分子）である。
【００１１】
融合構成要素が血清タンパク質である場合、血清タンパク質は、任意の血清タンパク質または血清タンパク質のフラグメント（例えば、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、アルブミン、ビタミンＤ結合タンパク質、ヘモペキシン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、ハプトグロビン）であり得る。融合構成要素が血清タンパク質に結合可能な分子である場合、この血清タンパク質に結合可能な分子は、小分子、核酸、ペプチドまたはオリゴ糖であり得る。血清タンパク質に結合可能な分子はまた、ＦｃγＲ１、ＳｃＦｖなどのようなタンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、融合構成要素は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸によりコードされる。しかしながら、いくつかの実施形態においては、例えば融合構成要素がオリゴ糖である場合、この融合構成要素は、発現された融合ポリペプチドへ翻訳後に結合される。
【００１２】
本発明の核酸分子は、必要に応じてさらに、シグナル配列（ＳＳ）構成要素を含み得る。ＳＳがポリペプチドの一部である場合、当該分野において公知の任意のＳＳが使用され得る。このＳＳとしては、任意の供給源（例えば、分泌性タンパク質または膜結合タンパク質）由来の合成配列または天然配列が挙げられる。好ましい一実施形態において、ＲＯＲシグナル配列が使用される（配列番号６）。
【００１３】
関連する第二の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに特徴を有する。さらなる第三の局面および第四の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター（発現制御配列へ作動可能に連結された核酸分子を含む発現ベクターが挙げられる）と適切な宿主細胞中にこの発現ベクターを含む、融合ポリペプチドの生成のための宿主−ベクター系とを包含する。この宿主−ベクター系において、適切な宿主細胞は、限定せずに、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞あるいはタバコのような植物または動物（例えば、ウシ、マウスまたはウサギ）である。適切な細胞の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられる。加えて、アセチル化またはＰＥＧ化により修飾される本発明の融合ポリペプチドが包含される。
【００１４】
関連する第五の局面において、本発明は、本発明の融合ポリペプチドを生成する方法に特徴を有する。この方法は、本発明の核酸分子を含むベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞を、この宿主細胞からのタンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程、およびこのように生成されるポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００１５】
第六の局面、第七の局面および第八の局面において、本発明は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３融合ポリペプチドに特徴を有する。この融合ポリペプチドは、（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆを含み、ここでＲ１、Ｒ２、Ｆ、ｘおよびｙは、上記で規定されるようなものである。好ましい実施形態において、ｘおよびｙは、１〜３であり、より好ましくは、ｘおよびｙは、それぞれ１である。
【００１６】
第九の局面において、本発明は、多量体ポリペプチドに特徴を有する。この多量体ポリペプチドは、２つ以上の本発明の融合ポリペプチドを含む。より特定の実施形態において、この多量体ポリペプチドは、二量体である。本発明の二量体ＩＬ−４／１３特異的融合ポリペプチドは、当該分野において公知のアッセイ方法により決定されるよう、少なくとも１０−１０モル濃度のＩＣ５０でＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方を阻害し得る。ＩＣ５０は、例えば、下記のＴＦ１バイオアッセイにより決定され得る。一般的に、ｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３の生物活性を阻害する（例えば、ブロックする）二量体ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドの能力は、例えば、遊離リガンドおよび／または結合リガンドについてのバイオアッセイまたはＥＬＩＳＡにより測定され得る。バイオアッセイとしては、ＳＴＡＴ６プロモーターエレメントを使用するルシフェラーゼベースのアッセイおよび／または読み出し（例えば、増殖またはｓＣＤ２３分泌）を伴うＴＦ１のような細胞株もしくはヒト末梢血細胞のｈＩＬ−４刺激もしくはｈＩＬ−１３刺激が挙げられ得る。本発明の二量体ＩＬ−４／１３ポリペプチドの異なる実施形態においては、Ｒ１構成要素が改変されて、ｈＩＬ−４活性および／またはｈＩＬ−１３活性をブロックする能力の増加または低下を示し、ならびに／あるいはＲ２構成要素が改変されて、ＩＬ−４活性および／またはＩＬ−１３活性をブロックする能力の増加または低下を示す。
【００１７】
第十の局面において、本発明は、薬学的組成物に特徴を有する。この薬学的組成物は、本発明の融合ポリペプチドと薬学的に受容可能なキャリアとを含む。このような薬学的組成物は、単量体ポリペプチドもしくは多量体ポリペプチド、またはこの融合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【００１８】
本発明のＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の除去、阻害または低減により改善されるか、回復されるか、または阻害される任意の疾患または状態を処置するために治療上有用である。これらのポリペプチドは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の除去、阻害または低減により改善されるか、回復されるか、または阻害される状態（例えば、喘息）の処置のために特に有用である。したがって、さらなる局面において、本発明は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する疾患または状態の処置のための治療方法に特徴を有する。この方法は、本発明の融合ポリペプチドを、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する疾患または状態に罹患する被験体に投与する工程を包含する。あらゆる哺乳動物が、本発明の治療方法により処置され得るが、この被験体は、好ましくは、本発明の融合ポリペプチドにより改善され得るか、回復され得るか、阻害され得るか、または処置され得る状態または疾患に罹患するか、または罹患する危険のあるヒト患者である。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、診断方法および予後診断方法、ならびに本発明の融合ポリペプチドによりＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を検出、定量化、および／またはモニタリングするためのキットにさらに特徴づける。
【００２０】
他の目的および利点が、次の詳細な説明を検討することから明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本方法が説明される前に、本発明が特定の方法および記載される実験条件に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、このような方法および条件は変化し得るからである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のみのためのものであり、限定することを意図されないこともまた理解される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明白に指示しない限り、複数形の言及を含む。それゆえ、例えば、「方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つ以上の方法、ならびに／または本明細書に記載されるおよび／もしくは、本開示を読むことにより当業者に明白となる工程の型などを含む。
【００２３】
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と類似するか、または等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、この刊行物が引用される方法および／または材料と関連する方法および／または材料を記述するために、本明細書において参考として援用される。
【００２４】
（定義）
用語ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３「に対する親和性」は、当該分野において公知のアッセイ方法（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ分析）により決定されるように、本発明の融合ポリペプチドが、少なくとも１０−１０モル濃度（好ましくは、少なくとも１０−１１モル濃度）の親和性で、意図されるサイトカインに結合することを意味する。用語ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を「特異的にブロックし得る」あるいはＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の「活性を阻害し得る」は、例えば、遊離リガンドおよび／または結合リガンドについてのバイオアッセイまたはＥＬＩＳＡにより測定されるように、本発明のＩＬ−４／１３融合ポリペプチドが、標的サイトカインの生物活性を阻害することを意味する。バイオアッセイとしては、ＳＴＡＴ６プロモーターエレメントを使用するルシフェラーゼベースのアッセイおよび／または読み出し（例えば、増殖またはｓＣＤ２３分泌）を伴うＴＦ１のような細胞株もしくはヒト末梢血細胞のＩＬ−４刺激もしくはＩＬ−１３刺激が挙げられ得る。「ＩＣ５０」は、バイオアッセイにより測定されるＩＬ−４またはＩＬ−１３への応答の５０％を阻害するのに必要とされる、融合タンパク質の濃度として定義される。本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１×１０−１０Ｍ（さらにより好ましくは、１０−１１Ｍ（ＩＬ−１３に対して））のＩＣ５０で、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の生物活性を阻害し得る。
【００２５】
用語「処置」および「処置する」などは、本明細書で使用され、望ましい薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味する。効果は、疾患、状態もしくはそれらの症状を完全にか、もしくは部分的に防止することに関して予防的であり得、ならびに／または、疾患、状態もしくはそれらの症状に対する部分的治癒もしくは完全な治癒に関して治療的であり得、ならびに／または、効果は、この疾患または状態に起因する有害な効果であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）の疾患または状態の、任意の処置を網羅する。そして「処置」としては、（ａ）疾患または状態の素因を有し得るが、それを保有しているとはまだ診断されていない被験体におけるこの疾患または状態の発症を防ぐこと；（ｂ）この疾患または状態を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；または（ｃ）この疾患または状態を軽減すること（すなわち、この疾患または状態の退行させること）が挙げられる。本発明の方法により処置される被験体の集団としては、望ましくない状態または疾患に罹患する被験体、ならびに状態または疾患の発症の危険のある被験体が挙げられる。
【００２６】
用語「治療上の有効用量」により、投与されるものに対する望ましい効果を生じる用量が意味される。正確な用量は、処置の目的に依存し、かつ公知の技術を使用して、当業者により確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「状態または疾患」は、一般的に、哺乳動物宿主（特に、ヒト宿主）にとって望ましくない、および／またはその宿主に有害な、その宿主の状態を包含する。それゆえ、ＩＬ−４／１３特異的融合ポリペプチドにより状態または障害を処置することは、哺乳動物（特に、ヒト）の処置を包含する。この哺乳動物は、増大されたＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３または有害なＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３を反映する症状を有するか、あるいは疾患、状態または処置レジメンに応答してこのような低下した活性化を有することが予想される。ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３関連状態または疾患を処置することは、ヒト被験体の処置を包含する。この処置において、本発明の融合ポリペプチドによるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルの低下は、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３関連状態またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３関連疾患から生じる望ましくない症状の改善をもたらす。
【００２８】
（一般的な説明）
ＩＬ−４とＩＬ−１３とを欠損する動物における研究は、これらのサイトカインが、Ｔｈ２様応答（例えば、好酸球の浸潤、免疫グロブリンＥの産生およびＩＬ−５の産生）の誘導において、重複する役割および追加的な役割の両方を担うことを示した（ＭｃＫｅｎｚｉｅら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１０）：１５６５〜７２）。本発明は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３特異的融合ポリペプチドあるいはＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に結合し得、かつこれらの生物学的作用をブロックし得るアンタゴニストとして作用し得る新規ポリペプチド（単量体および多量体の両方）を提供する。
【００２９】
（核酸の構築物および核酸の発現）
本発明は、ＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドをコードする核酸分子の構築を提供する。先に記載されるように、本発明の核酸分子は、野生型（または、天然に存在する）ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質および／またはヒトＩＬ−１３Ｒαタンパク質の改変フラグメントをコードする。したがって、この核酸分子は、それらは天然に見出される核酸分子ではない（例えば、天然に存在する配列ではないが、組換えＤＮＡ技術により構築される配列である）ので、「組み換え型」、「人工」または「合成」と称され得る。
【００３０】
これらの核酸分子は、適切な宿主細胞に導入される場合に、本発明の融合ポリペプチドを発現し得るベクターに挿入される。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のための、当業者にとって公知の任意の方法が、転写制御シグナルおよび／または翻訳制御シグナルの制御下で本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用され得る。
【００３１】
本発明の核酸分子の発現は、この分子が組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主において発現されるように、第二の核酸配列により調節され得る。例えば、発現は、当該分野において公知である、任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得る。キメラポリペプチド分子の発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：長い末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（Ｓｑｕｉｎｔｏら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：１〜２０）；ＳＶ４０早期プロモーター領域、ＣＭＶ、Ｍ−ＭｕＬＶ、チミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子の調節配列；原核生物の発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーター）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４〜９４もまた参照のこと）；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＨ、ＰＧＫ、アルカリホスファターゼ）およびエラスターゼＩのような遺伝子に由来する組織特異的転写制御領域。
【００３２】
本発明の核酸分子を含み、細菌宿主または真核生物宿主において複製され得る発現ベクターは、宿主をトランフェクトし、それにより本発明の融合ポリペプチドを生成するような核酸の発現を導くために使用される。トランフェクトされた細胞は、一過性にか、または、好ましくは、恒常的かつ持続的に、本発明のポリペプチドを発現する。このように発現されるポリペプチドが、融合構成要素（例えば、第二のポリペプチドの多量体化構成要素と会合し得る多量体化構成要素）を含む場合、このように発現される単量体は、多量体化構成要素間の相互作用によって多量体化して、多量体ポリペプチドを形成する（ＷＯ００／１８９３２）。
【００３３】
本発明の融合ポリペプチドは、当該分野において公知の任意の技術により精製され得る。本発明のポリペプチドが、多量体化構成要素（自発的に別のポリペプチドとのマルチマーを形成する）を含む場合、使用される精製技術は、次の、安定的で生物学的に活性な多量体ポリペプチド（「融合ポリペプチド」としても公知である）の形成を可能にする。例えば、限定としてではないが、この因子（ｆａｃｔｏｒ）は、可溶性タンパク質または封入体（そこから８Ｍ塩酸グアニジニウムおよび透析により適量抽出され得る）のいずれかとして、細胞から回収され得る（例えば、米国特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）。さらにこの因子を精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００３４】
（融合構成要素）
本発明の融合ポリペプチドは、特定の実施形態において、多量体化構成要素、血清タンパク質または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群から選択される融合構成要素（Ｆ）を含む。Ｆが多量体化構成要素である場合、Ｆとしては、別の多量体化構成要素と相互作用し、高次構造（例えば、二量体、三量体など）を形成し得る、任意の天然配列または合成配列が挙げられる。多量体化構成要素は、以下からなる群から選択され得る：（ｉ）切断可能な領域を含む多量体化構成要素、（ｉｉ）短縮型多量体化構成要素、（ｉｉｉ）長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、および（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ。Ｆが長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間を含む多量体化構成要素である場合、この配列は、別の融合ポリペプチド（１つ以上のシステイン残基を有するＦを含む）上の対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成し得る、１つ以上のシステイン残基を含み得る。
【００３５】
好ましい実施形態において、この多量体化構成要素は、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＡ由来の１つ以上の免疫グロブリン由来のドメインを含む。特定の実施形態において、この免疫グロブリン由来のドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖からなる群から選択される。ＩｇＧのＦｃドメインは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびに各々のアイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択され得る。特定の一実施形態において、Ｆは、共有結合性の二量体形成を安定化させるためにＰｒｏに変異されたＳｅｒ２２８（Ｃａｂｏｔ番号付け）（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１０５〜１０８）および／または残りのエフェクター機能を除去するＬｅｕ２３５→Ｇｌｕ（Ｒｅｄｄｙら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３）を有するＩｇＧ４のＦｃドメインである。好ましい実施形態において、Ｆは、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、または特異的に所望される特性のために改変され得るＩｇＧ１のＦｃドメインの誘導体である（例えば、Ａｒｍｏｕｒら（２００３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：５８５〜５９３；Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１〜６６０４を参照のこと）。特定の実施形態において、本発明のＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドは、１つまたは２つのＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。
【００３６】
一実施形態において、Ｆは、以下からなる群から選択される血清タンパク質またはそのフラグメントである：α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、トランスフェリン、フェリチン、アファミン、ハプトグロビン、α−フェトプロテイン サイログロブリン、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、β−２−糖タンパク質、ヒアルロン酸結合タンパク質、シンタキシン、Ｃ１Ｒ、Ｃ１ｑ鎖、ガレクチン３−Ｍａｃ２結合タンパク質、フィブリノゲン、重合体Ｉｇレセプター（ＰＩＧＲ）、α−２−マクログロブリン、尿素輸送タンパク質、ハプトグロビン、ＩＧＦＢＰｓ、マクロファージスカベンジャーレセプター、フィブロネクチン、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、Ｆｃ、α−１−抗チロモトリプシン（ａｎｔｉｃｈｙｒｏｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、α−１−抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｂ、β−２−ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体構成要素Ｃ３またはＣ４、ＣＩエラスターゼインヒビター、Ｃ反応性タンパク質、シスタチンＣおよびプロテインＣ。より特定の実施形態において、Ｆは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、アファミン、ハプトグロビンからなる群から選択される。Ｆ構成要素の含有は、所望される場合、本発明のＩＬ−４／１３特異的ポリペプチド血清半減期を延長し得る。例えば、血清アルブミン融合タンパク質の例について米国特許第６，４２３，５１２号、同第５，８７６，９６９号、同第６，５９３，２９５号および同第６，５４８，６５３号を参照のこと。
【００３７】
Ｆが、血清タンパク質に結合可能な分子である場合、この分子は、合成小分子、脂質もしくはリポソーム、核酸（アプタマーのような合成核酸を含む）、ペプチドまたはオリゴ糖であり得る。さらに、この分子は、例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、ＦｃγＲ３、重合体Ｉｇレセプター（ＰＩＧＲ）、ＳｃＦｖおよび血清タンパク質に特異的な他の抗体フラグメントのようなタンパク質であり得る。
【００３８】
（任意の構成要素スペーサ）
本発明の融合ポリペプチドの構成要素は、直接的に互いに結合され得るか、またはスペーサを介して結合され得る。一般的に、用語「スペーサ」（またはリンカー）は、１つ以上の構成要素ドメインの間に挿入され得る１つ以上の分子（例えば、核酸もしくはアミノ酸、またはポリエチレングリコールのような非ペプチド部分）を意味する。例えば、スペーサ配列は、操作の容易さのため、構成要素間に望ましい目的の部位を提供するために使用され得る。スペーサはまた、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を亢進させるために提供され得る。スペーサはまた、この構成要素がその最適な三次構造をとり得るように、および／またはこの構成要素が適切にその標的分子と相互作用し得るように、立体障害を減少させるために提供され得る。スペーサおよび望ましいスペーサを同定する方法については、例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１〜８７９を参照のこと。スペーサ配列は、レセプター構成要素に天然的に結合される１つ以上のアミノ酸を含み得るか、または宿主細胞からの融合タンパク質の発現を亢進させるため、特に望まれる目的の部位を提供するため、構成要素ドメインに最適な三次構造を形成させること、および／または構成要素とその標的分子との相互作用を亢進させることを可能にするために使用される付加配列であり得る。一実施形態において、このスペーサは、１つ以上の構成要素間の、１〜１００アミノ酸（好ましくは、１〜２５アミノ酸）の間の１つ以上のペプチド配列を含む。特定の一実施形態において、このスペーサは、３アミノ酸配列であり；より詳細には、Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙの３アミノ酸配列である。
【００３９】
（ＩＬ−４生物活性および／またはＩＬ−１３生物活性の阻害）
本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも１×１０−１０Ｍ（ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方に対して）の；さらにより好ましくは、１０−１１Ｍ（ＩＬ−１３に対して）のＩＣ５０（ＩＬ−４またはＩＬ−１３への応答の５０％を阻害するのに必要とされる融合タンパク質の濃度）で、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の生物活性を阻害し得る。下記の表１〜表７に示されるデータは、下記のようなＩＬ−４またはＩＬ−１３により刺激される増殖についてのＴＦ１バイオアッセイにおいて決定された。ＩＣ５０を決定するのに有用な他のバイオアッセイは当該分野に公知であり、これらとしては、例えば、ＳＴＡＴ６プロモーターエレメントを使用するルシフェラーゼベースのアッセイおよび／または読み出し（例えば、ｓＣＤ２３分泌）を伴うヒト末梢血細胞のｈＩＬ−４刺激もしくはｈＩＬ−１３刺激が挙げられ得る。下記に示される表１〜表７におけるデータは、親分子からの倍分の差（ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（親１１３２分子のＩＣ５０の値で割られた改変融合ポリペプチドのＩＣ５０値）として示される。下記の実験において確証されるように、改変融合ポリペプチドは、その親分子と比較して、１．５倍〜３．０倍の、またはさらに良く改善されたＩＬ−４および／またはＩＬ−１３をブロックする能力を有し得る。特定の実施形態において、本発明の改変融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３をブロックする能力において、少なくとも２．０倍以上の改善、少なくとも２．５倍以上の改善、またはさらには少なくとも３倍以上の改善を有する。
【００４０】
（治療上の使用）
本発明の融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の除去、阻害または低減により改善されるか、回復されるか、阻害されるか、または防止される任意の疾患または状態を処置するために治療上有用である。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方が、独立に、そして連帯して、Ｔｈ２細胞に促進される応答により特徴づけられる種々の臨床状態（例えば、好酸球の浸潤、ＩｇＥの産生およびＩＬ−５の産生）に関係している。したがって、この融合ポリペプチドにより、これらの応答をブロックすることは、ＴＨ２型のヘルパーＴ細胞の発生の増加を有する任意の疾患または状態の処置のために有用である。
【００４１】
一実施形態において、ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドは、喘息を処置するために使用される。動物実験および喘息のヒトの検査より得られるデータは、アトピー性状態の重要な発動因子および喘息性の肺を代表する慢性の炎症性状態の永続因子（ｐｅｒｐｅｔｕａｔｏｒ）として、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を関係付ける。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、喘息の表現型に関連する影響（ＩｇＥ産生へのアイソタイプ転換、好酸球増加症、肥満細胞症、粘液形成、増加した血管透過性、気道の反応亢進、平滑筋過形成および上皮下線維症が挙げられる）を誘導する（Ｈｏｇａｎら（１９９７）Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７４（３）：２５９〜２８３；ＭｃＫｅｎｚｉｅら（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８８（２）：１４３〜１５１；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．１０７（１）：９〜１８）。実際に、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達は、マウスにおいて、アレルゲンに対するＩｇＥ応答の発達のために必要とされ、そしてオボアルブミンに対する喘息応答の発達は、ＩＬ−４Ｒａ欠損マウスにおいて弱められる。さらに、マウスの肺におけるＩＬ−４またはＩＬ−１３のトランスジェニック発現は、マウス肺へのＩＬ−４タンパク質またはＩＬ−１３タンパク質の直接投与で模倣し得る喘息の表現型を導く。それゆえ、ＩＬ−４とＩＬ−１３とをブロックすることは、上記のパラメーターのいくつかまたは全てにおける緩和を導くことが予想される。その上、独立にシグナルカスケードを開始し、そして喘息の表現型を誘導するＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかの能力に起因して、両方の分子を同時に阻害することは、より強力な抗喘息の有効性を生じ得る。
【００４２】
ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の阻害または低減により改善される特定の状態の非網羅的なリストは、以下を含む：アトピー性皮膚炎、免疫複合体疾患（例えば、狼瘡、腎炎およびグレーヴズ病）、アレルギー状態、高ＩｇＥ症候群、免疫欠損、特発性肺線維症、肝線維症、ＨＩＶ、肺の「再構築」、ＣＯＰＤ、潰瘍性大腸炎、癌、ホジキンリンパ腫、水疱性類天疱瘡、対宿主移植組織および移植片病（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｎｄ ｇｒａｆｔ ｖｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウイルス疾患、寄生虫性疾患、細菌性疾患ならびに真菌の感染（１２／１１／０１に発行された米国特許第６，３２８，９５４号、Ｉｄｚｅｒｄａ，Ｒ．Ｊ．ら １９９０ Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１〜８７３）。
【００４３】
代替的な実施形態において、融合ポリペプチドは、しばしばＩｇアイソタイプにおける変化ならびにＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を伴う細胞媒介性免疫の一つへの免疫応答を促進するワクチンと共にアジュバントとして使用される。ＣＴＬは本来、ウイルスに感染した細胞または細胞内細菌に感染した細胞および腫瘍細胞の破壊を補助するＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
【００４４】
（処置のために適切な被験体）
処置のために適切な被験体は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の阻害または低減により改善される特定の状態に罹患すると診断されるヒトである。この特定の状態としては、アトピー性皮膚炎、免疫複合体疾患（例えば、狼瘡、腎炎およびグレーヴズ病）、アレルギー状態、高ＩｇＥ症候群、免疫欠損、特発性肺線維症、肝線維症、ＨＩＶ、肺の「再構築」、ＣＯＰＤ、潰瘍性大腸炎、癌、ホジキンリンパ腫、水疱性類天疱瘡、対宿主移植組織および移植片病、ウイルス疾患、寄生虫性疾患、細菌性疾患ならびに真菌の感染が挙げられる。
【００４５】
（併用治療）
多数の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、１つ以上のさらなる化合物または治療と組み合わせて投与され得る。組み合わせとしては、短時間作用性の吸入β２アゴニスト、経口β２アゴニスト、吸入抗コリン作用剤、経口コルチコステロイド、吸入コルチコステロイド、クロモリンナトリウム（ＧａｓｔｒｏｃｒｏｍＴＭ／Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ネドクロミル、長時間作用性β２アゴニスト、ロイコトリエン修飾因子、テオフィリン、カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｒｉｎ）インヒビター、ピクロリムス（ｐｉｃｒｏｌｉｍｕｓ）、シロリムス、抗ＩｇＥ（ＺｏｌａｉｒＴＭ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮＦＫＢインヒビター、ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター（ＶＸ−７０２）、ＩＣＥインヒビター（ＶＸ−７６５）、ＩＬ−１インヒビター（ＩＬ−１特異的融合ポリペプチド、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；アナキンラ、Ａｍｇｅｎ）、ＴＮＦａインヒビター（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ；ＥｎｂｒｅｌＴＭ、Ａｍｇｅｎ；ＨｕｍｉｒａＴＭ、Ａｂｂｏｔｔ）、ＩＬ−５インヒビター、ＩＬ−１８インヒビター、ＩＦＮγインヒビター、ＩＦＮαブロッカーが挙げられる。例えば、複数の融合ポリペプチドが、共に投与され得るか、または１つ以上のポリペプチドが、１つ以上の治療化合物と共に投与され得る。本発明のポリペプチドがＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を除去する場合、１つ以上のその他の治療剤は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の存在に関連する状態を防止するか、または処置するために使用される治療剤である。本発明の融合ポリペプチドと第二の治療剤との併用の利益は、いずれかの治療剤の効能の改善および／または毒性の減少を提供することである。
【００４６】
（投与方法）
本発明は、有効量の本発明の融合ポリペプチドを被験体に投与する工程を包含する処置方法を提供する。好ましい局面において、この融合ポリペプチドは、実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するか、または望まれない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。この被験体は、好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００４７】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の薬剤を投与するために使用され得る（例えば、リポソーム中における封入、微小粒子、マイクロカプセル、この化合物を発現し得る組換え体、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法は、経腸的か、または非経口的であり得、そして導入方法としては、皮内経路、筋内経路、関節内経路、注入ポリペプチドエリトニール（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｅｒｉｔｏｎｅａｌ）経路、静脈内経路、皮下経路、鼻内経路、眼内経路および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。この化合物は、任意の簡便な経路（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口内粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）により投与され得、そして他の生物学的に活性な因子と共に投与され得る。投与は、全身性か、または局所性であり得る。投与は、急性的か、または慢性的（例えば、毎日、毎週、毎月など）であり得るか、あるいは他の因子と組み合され得る。肺の投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む処方物の使用により利用され得る。
【００４８】
別の実施形態において、この活性薬剤は、制御放出系内またはポンプ内のベシクル（特に、リポソーム）中において送達され得る。本発明の活性薬剤がタンパク質をコードする核酸である別の実施形態において、この核酸は、以下により、そのコードされるタンパク質の発現を促進するためにインビボ投与され得る：適切な核酸発現ベクターの一部としてこの核酸を構築し、そしてこの核酸が、例えば、レトロウイルスベクターの使用（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）によってか、直接注射によってか、もしくは微粒子砲撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）の使用によって細胞内になるように、この核酸を投与するか、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることによって、あるいは核内に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドへ連結した状態でこの核酸を投与することによってなど（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６１〜１８６８を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、発現のために、相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡに取り込まれ得る。全身性発現もまた、プラスミド注射（皮内にか、または筋内に）および細胞へのエレクトロポレーションにより達成され得る。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物を処置の必要のある領域に局所的に投与することが望ましい；このことは、例えば（限定の目的ではなく）、手術中の局所注入、（局所（ｔｏｐｉｃａｌ）適用（例えば、注射によってか、カテーテルによってか、または移植物によって））により達成され得る。この移植物は、多孔性材料、非多孔性材料またはゼラチン状材料（シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜、ファイバーまたは市販の皮膚代用物が挙げられる）で作られる。
【００５０】
本発明の方法を実施することにおいて有用な組成物は、本発明の薬剤を、溶液中、懸濁物中、またはその両方の中に含む液体であり得る。用語「溶液／懸濁物」は、活性薬剤の第一の部分は溶液中に存在し、活性薬剤の第二の部分は粒子状の形態（液体マトリックス中の懸濁物）で存在する液体の組成物をいう。液体の組成物としてはまた、ゲルが挙げられる。液体の組成物は、水性であり得るか、または軟膏の形態であり得る。
【００５１】
一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、徐放性組成物である。生物学的に活性なペプチドの送達のための徐放性処方物は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第６，７４０，６３４号は、生物学的に活性な物質のヒドロキシナフトエ酸（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｏｉｃ ａｃｉｄ）塩と生分解性ポリマーとを含む徐放性処方物を記載する。米国特許第６，６９９，５００号は、少なくとも５ヶ月の期間にわたって生理学的に活性な物質を放出し得る徐放性処方物を開示する。
【００５２】
（診断方法およびスクリーニング方法）
本発明の融合ポリペプチドは、診断的に、および／またはスクリーニング方法において使用され得る。例えば、融合ポリペプチドは、処置効能を評価する臨床研究の間、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のレベルをモニタリングするために使用され得る。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、例えば、非常に高いＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルあるいは非常に低いＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルを有する個体を同定する臨床研究への参加のため、個体をスクリーニングするために使用される。本発明の融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の局在化および活性に関する、当該分野において公知の方法（例えば、診断方法におけるイメージング、適切な生理学的サンプルにおけるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のレベルを測定することなど）において使用され得る。
【００５３】
本発明の融合ポリペプチドは、例えば、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の発現を低下させ得る試験薬剤を同定するスクリーニング方法において、存在する未結合ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の量を定量化するインビボスクリーニングアッセイおよびインビトロスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。より一般的には、本発明の融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の定量および／または単離が所望される任意のアッセイまたはプロセスにおいて使用され得る。
【００５４】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療上の有効量の１つ以上の融合ポリペプチドと薬学的に受容可能なキャリアとを含む。用語「薬学的に受容可能な」は、動物（より詳細には、ヒト）における使用についての連邦政府もしくは州政府の監督官庁により認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般的に承認される薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、水および油（石油由来の油、動物由来の油、植物由来の油または合成由来の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油およびゴマ油など）が挙げられる）のような無菌の液体であり得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールなどが挙げられる。所望される場合、この組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤あるいはｐＨ緩衝剤も含む。これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末剤および徐放性処方物などの形態を取り得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【００５５】
本発明の融合ポリペプチドは、中性の形態または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離アミノ基と共に形成される塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩）および遊離カルボキシル基と共に形成される塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩）が挙げられる。
【００５６】
意図される治療上の使用のために有効な融合ポリペプチドの量は、本記載に基づく標準的な臨床技術により決定され得る。加えて、インビトロアッセイが、必要に応じて、最適な投薬量の範囲を同定するのを補助するために利用され得る。一般的に、静脈内投与のための適切な投薬量の範囲は、大体、１キログラム体重あたり約０．０２ミリグラム〜約１０ミリグラムの活性化合物である。鼻内投与のための適切な投薬量の範囲は、大体、１ｋｇ体重あたり約０．０１ｐｇ〜１ｋｇ体重あたり約１０ｍｇである。有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から得られる用量−応答曲線から推定され得る。投与される化合物の量は、もちろん、処置されている被験体に依存し、被験体の体重、苦痛の重症度、投与様式および処方する医師の判断に依存する。治療は、症状が検出可能である間または症状が検出不能である場合でさえも、断続的に繰り返され得る。
【００５７】
（細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビボおよびインビトロでの細胞のトランスフェクションのための、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸の使用を包含する。これらの核酸は、標的細胞および標的生物のトランスフェクションのために、任意の多くの周知のベクターに挿入され得る。核酸は、エキソビボおよびインビボで、脂質の混合またはエレクトロポレーションにより促進されるベクターと標的細胞との相互作用を介して細胞にトランスフェクトされる。組成物は、治療応答を誘発するのに十分な量で（例えば、筋肉への注射により）被験体に投与される。このことを達成するのに適当な量は、「治療上の有効用量または治療上の有効量」として定義される。
【００５８】
別の局面において、本発明は、ヒトまたは他の動物におけるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルを減少させる方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドをコードする核酸により細胞をトランスフェクトする工程を包含する。ここで、この核酸は、このポリペプチドをコードする核酸へ作動可能に連結された誘導可能なプロモーターを含む。ヒトの疾患の処置または防止における遺伝子治療の手順については、例えば、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１４９〜１１５４を参照のこと。
【００５９】
（キット）
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、薬学的製品もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定される書式での通知が、このような容器に付随し得る。この通知は、（ａ）ヒトへの投与に関する、上記機関による製造、使用または販売の認可（ｂ）使用についての指示、またはその両方を示す。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法のある完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、かつ本発明者らが、本発明者らの発明とみなす範囲を限定することを意図されない。使用された数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するために努力がなされたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が説明されるべきである。他に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は、大気圧または大気圧の近傍である。
【００６１】
（実施例１．ＩＬ−４／１３改変融合ポリペプチドの構築）
親ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドを作製するために、１１３２（配列番号８）（ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン（配列番号１〜２）とヒトＩＬ−１３Ｒα１細胞外ドメイン（配列番号３の２７〜３４３）とをコードする核酸）を、標準的なＰＣＲ技術を使用して増幅し、ヒトＦｃ配列を含む発現ベクターに連結させた。それにより、ＩＬ−４Ｒαおよび／またはＩＬ−１３Ｒα１から構成される融合タンパク質とそのヒンジ（Ｎ末端からＣ末端までの、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域およびＣＨ３領域）とを作製した。配列番号８の置換：Ｃｙｓ２０７→Ｓｅｒおよび配列番号８の置換：Ｃｙｓ２５１→Ａｌａ（Ｃｙｓ２５１は、配列番号３のＣｙｓ４６に対応する）を、当該分野において公知の標準的な技術を使用する部位特異的突然変異誘発により導入した。全ての配列を、標準的な技術により確認した。適切なコード配列を、標準的な分子生物学技術を使用して真核生物発現ベクターにサブクローニングした。当該分野において公知の技術を使用して、親１１３２融合ポリペプチドの部位特異的突然変異誘発により、ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド改変体を作製し、そして配列決定により確認した。
【００６２】
改変ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＬＩＰＯ ＰｌｕｓＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、改変タンパク質をコードするＤＮＡ構築物により一過的にＣＨＯ細胞をトランスフェクトすることによって、小規模な上清として生成した。上清を７２時間後に収集した。そしてタンパク質発現を、抗ヒトＦｃ ＨＲＰ結合抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるウエスタンブロッティングにより測定し、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化した。改変ＩＬ／４／１３融合ポリペプチドの大規模な精製のために、この融合タンパク質をコードするＤＮＡを、ＦＡＳＴＲ技術（米国特許出願公開２００２０１６８７０２）を使用して、一過性発現のためまたは安定株を作製するためのいずれかのためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。１Ｌ〜２Ｌのこの融合タンパク質を発現する細胞の培地を収集し、そしてＦｃを含む融合タンパク質を捕捉するために、プロテインＡカラムに通過させた。プロテインＡ精製を、製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプロトコールにしたがって実行した。濃縮後、この融合タンパク質を、混入している凝集体のパーセンテージについて特徴づけ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）または類似のカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してさらに精製した。
【００６３】
改変ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドの安定性を、標準的な方法（２０回の凍結／融解のサイクル後のＳＥＣによる分析およびウェスタンブロットによる分析、３７℃で７日間、低塩の緩衝液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液）および中程度の塩の緩衝液（ＰＢＳ）中で、このタンパク質をインキュベートすることによる分析、または種々のｐＨで緩衝化されたＰＢＳ溶液中でこのタンパク質を２時間インキュベートすることによる分析が挙げられる）を使用して、評価した。
【００６４】
この分子の薬物動態を、１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−４／１３融合ポリペプチド改変体を用いて、マウスまたはラットに静脈内にかまたは皮下に注射することにより決定した。血液を種々の時点において収集し、そして血清を単離した。この融合タンパク質を捕捉する抗ＩＬ−１３Ｒａモノクローナル抗体と、複合体を形成するビオチン化抗ＩＬ−４Ｒａモノクローナル抗体と、この複合体を検出するストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体とを用いるＥＬＩＳＡを使用して、改変融合ポリペプチドの量について血清サンプルを分析した。融合ポリペプチドの濃度を、血清サンプルからのＯＤと精製融合タンパク質を使用して生成される検量線から得られるＯＤとの比較により決定した。融合ポリペプチドの量をまた、３種の抗体（抗ＩＬ−１３Ｒａ抗体、抗ＩＬ−４Ｒａ抗体または抗ヒトＦｃ抗体）のうちの１つと検出のためのＨＲＰ結合体化二次抗体とを使用する１μｌの血清のウェスタンブロット分析によりモニタリングした。
【００６５】
（実施例２．改変融合ポリペプチドによるｈＩＬ−４生物活性およびｈＩＬ−１３生物活性の阻害）
（ＴＦ１バイオアッセイ）ｈＩＬ−１３Ｒα１により安定的にトランスフェクトしたＴＦ１細胞を、増殖培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン）中で維持した。バイオアッセイのために、細胞をアッセイ培地（上記と同じだが、ＧＭ−ＣＳＦを含まない）で３回洗浄し、次に５０μｌのアッセイ培地中に２×１０４の細胞でプレートした。精製融合ポリペプチドを、アッセイ培地中に段階希釈した。２５μｌの各々の改変ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドを、この細胞に添加した。次に、２５μｌのＩＬ−１３（１５ｐＭ）または２５μｌのＩＬ−４（２０ｐＭまたは４０ｐＭ）のいずれかを、この細胞とこの融合ポリペプチドとを含むウェルに添加した。それから、細胞を約７０時間、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。ＴＦ１細胞の増殖の程度を、製造者（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のプロトコールにしたがったＣＣＫ−８アッセイにより測定した。
【００６６】
表１〜表７についての全てのバイオアッセイは、親ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド、１１３２（シグナル配列（成熟ポリペプチドから切断される）と共に示される配列番号８）（配列番号７によりコードされる）を含んだ。この融合ポリペプチドは、以下からなる：シグナル配列（アミノ酸１〜２３）＋１つのＩＬ−４Ｒα構成要素（Ｃｙｓ２０７→Ｓｅｒを有する配列番号８のアミノ酸２４〜２３１）（配列番号２の２４〜２３１に対応する）＋１つのＩＬ−１３Ｒα１構成要素（Ｃｙｓ２５１→Ａｌａを有する配列番号８のアミノ酸２３２〜５４８）（Ｃｙｓ２５１は、配列番号３のＣｙｓ４６に対応する）（配列番号３の２７〜３４３に対応する）＋１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ）（配列番号８の５４９〜７７６）。全ての改変融合ポリペプチド（別に特定されるもの（表１）を除く）は、親のＣｙｓ２０７→Ｓｅｒ変異を含み、そして全ての改変融合ポリペプチドは、ＩＬ−１３Ｒａ１構成要素中のＣｙｓ２５１→Ａｌａ（配列番号３のＣｙｓ４６）変異を含む。例えば、配列番号１０（構築物２６７４；配列番号９によりコードされる）、配列番号１２（構築物２６８１；配列番号１１によりコードされる）、配列番号１４（構築物２７９５；配列番号１３によりコードされる）、および配列番号１６（構築物２７９６；配列番号１５によりコードされる）（これらは、最終的に成熟融合ポリペプチドから切断されるシグナル配列を含む）を参照のこと。表１は、親のトラップ（ｔｒａｐ）１１３２および２例の改変融合ポリペプチドについてのＩＣ５０のデータ（細胞の増殖の５０％が阻害される濃度）ならびに親ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド１１３２についてのＩＣ５０値からの倍分の差（改変融合ポリペプチドＩＣ５０で割った親融合ポリペプチドＩＣ５０）を示す。
【００６７】
（表１．融合ポリペプチド２６７４および２６８１のＩＣ５０のデータおよび倍分の差のデータ）
【００６８】
【表１】
表２〜表６は、ＣＨＯの一過性の上清を使用してアッセイされた、改変融合ポリペプチドのＩＣ５０バイオアッセイ値の倍分の差を示す。この上清の濃度を、ウェスタンブロット分析により決定した。表２は、システイン変異を有する改変体の、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする能力についてのＩＣ５０における倍分の差を示す；表３は、コアを安定化する変異と活性部位変異とを有する融合ポリペプチド改変体の、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする能力を示す；表４は、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする電荷変更改変体および組み合わせを示す；表５は、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする疎水性パッチ改変体および組み合わせを示す；表６は、ＩＬ−４ＲαのＮ末端欠失およびＣ末端欠失を有する改変融合ポリペプチドの活性を示す（これらの全ては、親融合ポリペプチド１１３２と比較して表現される）。
（表２．システイン改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００６９】
【表２】
（表３．コアを安定化する改変体および活性部位改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性をブロックする能力）
【００７０】
【表３】
（表４．ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性を阻害する電荷改変体および組み合わせ改変体）
【００７１】
【表４】
（表５．疎水性パッチ改変体および組み合わせ改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００７２】
【表５】
（表６．Ｎ末端改変体およびＣ末端改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００７３】
【表６】
（実施例３．生物活性についての精製融合ポリペプチド改変体の特徴づけ）
表７は、改変融合ポリペプチドの、ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性をブロックする能力を示す。その結果を、親融合ポリペプチド、ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド１１３２（配列番号８）についてのＩＣ５０値からの倍分の差（改変融合ポリペプチドＩＣ５０で割った親融合ポリペプチドＩＣ５０）として示す。この親分子は、以下からなる：シグナル配列（アミノ酸１〜２３）＋１つのＩＬ−４Ｒα構成要素（Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒを有するアミノ酸２４〜２３１）（配列番号２の２４〜２３１に対応する）＋１つのＩＬ−１３Ｒα１構成要素（Ｃｙｓ２５１Ａｌａを有するアミノ酸２３２〜５４８）（配列番号３の２７〜３４３に対応する）＋１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ）（５４９〜７７６）。標準偏差は、３回以上アッセイされたものについて示される。全ての改変融合ポリペプチド（他の特定のＣｙｓ２０７の置換を有するものを除く）は、Ｃｙｓ２０７→Ｓｅｒ変異を含み、全ての改変融合ポリペプチドは、ＩＬ−１３Ｒａ１構成要素中のＣｙｓ２５１→Ａｌａ変異を含む。
（表７．改変体分子の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００７４】
【表７】
（実施例４．ＢＩＡｃｏｒｅを使用しての、改変体のＩＬ−４／１３結合親和性の決定）
ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対するＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドの親和性を、ＷＯ００／７５３１９に記載されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ ３０００を使用して測定した。このＢＩＡｃｏｒｅアッセイは、Ｒ１−Ｒ２−Ｆｃ改変体（全てのこれらの改変体は、１つのシグナル配列、１つのＩＬ−４Ｒα構成要素、続いて、１つのＩＬ−１３Ｒα１構成要素および１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ）から構成された）と比較して、親の１１３２（配列番号８）構築物を試験した。ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド改変体を、抗ヒトＦｃ抗体を使用してチップ表面に捕捉した。種々の濃度のヒトＩＬ−４および／またはヒトＩＬ−１３を、この表面の全面に注入し、そして会合および解離の時間経過をモニタリングした。会合速度定数および解離速度定数を得るために、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用する反応速度分析を実行した。結果を表８に示す。
（表８．ＢＩＡｃｏｒｅを介して測定されたＩＬ−４／ＩＬ−１３結合親和性）
【００７５】
【表８】
（実施例５．構成要素改変体の、ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性を阻害する能力）
表９は、上記のＣＨＯの一過性の上清を使用してアッセイされた、融合ポリペプチドのＩＣ５０バイオアッセイ値の倍分の差を示す。これらの融合ポリペプチドは、代替的な構成要素配置（例えば、Ｒ２−Ｒ１−Ｆ（配列番号３および配列番号２））を含む。そして、これらの融合ポリペプチドを１１３２親分子と比較する。試験した改変体は、以下から構成される：ＲＯＲシグナル配列（アミノ酸１〜２９）＋ＩＬ−１３Ｒα１構成要素（Ｃｙｓ４６Ｓｅｒを有するアミノ酸３０〜３４６（配列番号３の２７〜３４３に対応する））＋１つのＩＬ−４Ｒα構成要素（Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒを有するアミノ酸３４７〜５５４（配列番号２の２４〜２３１に対応する））＋１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ、アミノ酸５５５〜７８４）。
（表９．構成要素配置改変体）
【００７６】
【表９】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３特異的ポリペプチド、ならびにＩＬ−４活性および／またはＩＬ−１３活性を阻害するための、このようなポリペプチドの治療上の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
特許文献１において、Ｓｔａｈｌらは、サイトカインを結合して、２つのレセプター構成要素および多量体化構成要素から構成される非機能的複合体を形成し得るサイトカイン融合タンパク質融合ポリペプチドを記載する。インターロイキン−４レセプターα（ＩＬ−４Ｒα）およびＩＬ−１３レセプターα構成要素（ＩＬ−１３Ｒα）は、記載されている（例えば、特許文献２および特許文献３ならびに特許文献４）。
【特許文献１】米国特許第６，４７２，１７９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８５６，２９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４０，８６９号明細書
【特許文献４】欧州特許第８７６４８２号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
第一の局面において、本発明は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１３結合融合ポリペプチド（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆをコードする核酸分子に特徴を有する。
このポリペプチドにおいて、
Ｒ１は、この融合ポリペプチドにおける構成要素として存在する場合に、少なくとも１０−１０モル濃度のＩＣ５０で特異的にＩＬ−４活性を阻害し得る改変ＩＬ−４レセプターα（ＩＬ−４Ｒα）構成要素であり、
Ｒ２は、この融合ポリペプチドにおける構成要素として存在する場合に、少なくとも１０−１０モル濃度のＩＣ５０で特異的にＩＬ−１３活性を阻害し得るＩＬ−１３レセプターα１またはＩＬ−１３レセプターα２（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）であり、
Ｆは、融合構成要素であり、そして
ｘおよびｙは、各々独立して、１以上の正の整数である。この融合ポリペプチドの構成要素は、異なる順番（例えば、Ｆ−（Ｒ１）ｘ（Ｒ２）ｙ、（Ｒ１）ｘ−Ｆ−（Ｒ２）ｙまたは（Ｒ２）ｙ−Ｆ−（Ｒ１）ｘ）で配置され得る。より具体的には、Ｒ１は、配列番号２のアミノ酸１〜２３１、２４〜２３１、２８〜２３１または２４〜２２１（配列番号１の核酸配列によりコードされる）を含む親ＩＬ−４Ｒαまたはその対立遺伝子改変体に由来し、改変群Ｉで規定される１〜１０個の改変により改変される。そしてＲ２は、配列番号３のアミノ酸１〜３４３または２７〜３４３を含むＩＬ−１３レセプターα（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）構成要素またはそのフラグメントであり、必要に応じて、改変群ＩＩで規定される１つ以上の改変により改変される。あるいはＲ２は、配列番号４のアミノ酸１〜３４３または２３〜３４３を含むＩＬ−１３レセプターα（ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−１３Ｒα２）構成要素であり、必要に応じて、改変群ＩＩＩで規定される１つ以上の改変により改変される。必要に応じて、（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆは、シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む。一実施形態において、この融合ポリペプチドのＲ１構成要素は改変され、改変されていない構成要素と比較して、増加したＩＬ−４阻害活性または低下したＩＬ−４阻害活性および／または増加したＩＬ−１３阻害活性または低下したＩＬ−１３阻害活性を示す。好ましくは、Ｒ１への改変は、ＩＬ−４阻害とＩＬ−１３阻害との両方を増加させる。
【０００４】
Ｒ１：天然に存在する野生型ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、配列番号２に示される細胞外ドメインを有する８００アミノ酸のタンパク質である。配列番号２の公知の対立遺伝子改変体としては、位置７５におけるＰｈｅ、ＶａｌまたはＬｅｕ（Ｉｌｅ７５Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ）および／またはＶａｌ１３１Ｌｅｕが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｒ１は、配列番号２のアミノ酸２４〜２３１またはその対立遺伝子改変体を含み、必要に応じて、改変群Ｉで規定される１つ以上の改変によりさらに改変される。別の実施形態において、Ｒ１は、配列番号２のアミノ酸１〜２３１またはその対立遺伝子改変体であり、改変群Ｉに列挙される改変から選択される少なくとも１つの改変を有する。これらの改変は、特に所望される特性（例えば、改善された溶解性、低減された免疫原性、改善されたＰＫ、改善された生成特徴、および／または改変されたＩＬ−４活性および／またはＩＬ−１３活性をブロックする能力などが挙げられる）を有する新規ポリペプチドを提供する。
【０００５】
改変群Ｉ：配列番号２の位置６７、６８、７１、１５２、１６４、１７１、１７２、１７５、１９８および／または２０７のアミノ酸は、異なるアミノ酸に置換される。好ましい実施形態において、このアミノ酸置換は、以下の通りである：位置６７のＬｅｕは、Ｔｙｒに置換される（Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ）；Ｌｅｕ６８Ａｓｎ（疎水性のパッチを除去し得、そして特定の状況において溶解性ならびに／またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３をブロックする能力を改善するのに、望ましくあり得る）；Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ；Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ（酸性の電位を中和し得、そして疎水性のパッチの大きさを縮小する。それゆえ、改善された溶解性および／またはこの融合ポリペプチドの折りたたみのために望ましくあり得る）；Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ（リガンド結合部位のアミノ酸を変更し、それゆえ、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−４に対する阻害活性を改善するのに望ましくあり得る）；Ａｒｇ１９８Ｓｅｒ（正に荷電したパッチを除去し、それゆえ精製特性を改善するのに望ましくあり得る）；およびＣｙｓ２０７Ｓｅｒ（異常なジスルフィド結合の形成を減少させ、それゆえ共有結合性の凝集および／または不適当なジスルフィド結合を減少するのに望ましくあり得る）。グリコシル化部位の付加をもたらす改変としては、Ａｌａ７１ＡｓｎおよびＴｒｐ１６４Ｓｅｒが挙げられる。いくつかの実施形態において、１箇所以上のグリコシル化部位の付加は、さらなるグリコシル化部位のない同一のタンパク質と比較して免疫原性を低減するか、または溶解性もしくはインビボ安定性を増大するのに望ましい。好ましい実施形態において、Ｒ１は、Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒを有する配列番号２の１〜２３１を含み、位置６７、６８、１５２、１７１および１７２の１つ以上における変化によりさらに改変される。好ましい実施形態において、Ｒ１は、（ｉ）６７、６８および２０７における改変；（ｉｉ）６７、６８、１５２および２０７における改変；（ｉｉｉ）１５２および２０７における改変；（ｉｖ）６７、１７１、１７２および２０７における改変；（ｖ）６８、１７１、１７２および２０７における改変；（ｖｉ）６７、６８、１７１および２０７における改変；（ｖｉｉ）６７、６８、１７２および２０７における改変；（ｖｉｉｉ）１５２、１７１、１７２および２０７における改変；（ｉｘ）６７、６８、１７１、１７２および２０７における改変；（ｘ）６７、６８、１５２、１７１、１７２および２０７における改変；（ｘｉ）１７１、１７２および２０７における改変を含む。さらに好ましい実施形態において、Ｒ１は、Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒと、（ｉ）Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ、（ｉｉ）Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ、（ｉｉｉ）Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ、（ｉｖ）Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ＋Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ、（ｖ）Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ＋Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ、（ｖｉ）Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ＋Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒ、（ｖｉｉ）Ｔｙｒ１５２Ｐｈｅ＋Ｌｅｕ６７Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ６８Ａｓｎ＋Ａｓｐ１７１Ｔｙｒ／Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ１７２Ｓｅｒからなる群から選択される改変とを含む。
【０００６】
Ｒ２：天然に存在するヒト野生型ＩＬ−１３Ｒα１タンパク質は、４２７アミノ酸のタンパク質であり、配列番号３の配列を有し、３４３アミノ酸の細胞外ドメインを含む。一実施形態において、Ｒ２は、配列番号３のアミノ酸１〜３４３または２７〜３４３を含むＩＬ−１３結合ポリペプチド構成要素であり、必要に応じて、改変群ＩＩで規定される１以上の改変により改変される。別の実施形態において、Ｒ２は、配列番号４のアミノ酸１〜３４３または２３〜３４３を含むＩＬ−１３結合ポリペプチド構成要素であり、改変群ＩＩＩで規定される１つ以上の改変により必要に応じて改変される。
【０００７】
改変群ＩＩ：（ａ）配列番号３のアミノ酸１〜１２０は、ヒトｇｐ１３０（配列番号５）のアミノ酸１〜１２３に置換される；（ｂ）配列番号３のアミノ酸３３８〜３４３は欠失させられる；（ｃ）配列番号３のアミノ酸１〜２６は、異なるシグナル配列（例えば、配列番号６）に置換されるか；または（ｄ）配列番号３の位置４６、７３、１４３、２３５、２９３および／または３２９のアミノ酸の１つ以上が、異なるアミノ酸に置換される。より特定の実施形態において、好ましい置換は、以下の通りである：Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｙｒのいずれか一つ（好ましくは、Ａｌａ）による（配列番号３の）位置４６におけるＣｙｓ（Ｃｙｓ４６Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ｔｙｒ）（特定の実施形態において、異常なジスルフィド形成および共有結合性の凝集を減少するのに望ましくあり得る）；Ｌｙｓ７３Ｇｌｎ；Ｌｙｓ７３Ｇｌｎ（強く正に荷電したパッチを除去し、そして特定の実施形態において凝集を減少および／または溶解性を増大するのに望ましくあり得る）。Ｒ２は、完全にはグリコシル化されない部位を除去するために、１箇所以上のグリコシル化部位において、さらに改変され得る。そしてＲ２は、薬物動態および／または生成の一貫性を改善するのに望ましくあり得る：Ａｓｎ２３５Ｓｅｒ／Ｈｉｓ、Ａｓｎ２９３Ｇｌｙ、Ａｓｎ３２９Ａｓｐ。
【０００８】
改変群ＩＩＩ：（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜２２は欠失させられる。特定の実施形態において、これは、欠失したアミノ酸を、例えば配列番号６のようなシグナル配列に置換して、それにより異常なジスルフィド結合形成を除去するために、Ｃｙｓ２２を除去するのに望ましくあり得る、；（ｂ’）配列番号４のＣｙｓ２５２Ｉｌｅ；（ｃ’）配列番号４の位置３１０における変更されるアミノ酸。特定の実施形態において、Ｓｅｒ３１０は、Ｃｙｓに置換される（これは、タンパク質の三次構造を安定化させるのに望ましくあり得る）。
【０００９】
任意の融合構成要素（Ｆ）は、融合ポリペプチドの機能性を亢進させる任意の構成要素である。それゆえ、例えば、融合構成要素は、融合ポリペプチドの生物活性を亢進させ得るか、その生成および／または回収において補助し得るか、または融合ポリペプチドの薬理学的な特性もしくは薬物動態プロフィールを（例えば、その血清半減期、組織浸透性、免疫原性の欠如または安定性を亢進させることにより）亢進させ得る。好ましい実施形態において、この融合構成要素は、多量体化構成要素、血清タンパク質または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群から選択される。
【００１０】
融合構成要素が多量体化構成要素である場合、融合構成要素としては、別の多量体化構成要素と相互作用し、高次構造（例えば、二量体、三量体など）を形成し得る、任意の天然配列または合成配列が挙げられる。特定の実施形態において、多量体化構成要素は、以下からなる群から選択される：（ｉ）免疫グロブリン由来のドメイン、（ｉｉ）切断可能な領域（Ｃ領域）、（ｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）ロイシンジッパー、（ｉｖ）ヘリックスループモチーフ、および（ｖ）コイル−コイルモチーフ。より特定の実施形態において、免疫グロブリン由来のドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖からなる群から選択される。最も特定的な実施形態において、ＩｇＧのＦｃドメインは、ヒトＦｃΔ１（ａ）（軽鎖とのジスルフィド結合の形成に関わる領域の欠失を有するＦｃ分子）である。
【００１１】
融合構成要素が血清タンパク質である場合、血清タンパク質は、任意の血清タンパク質または血清タンパク質のフラグメント（例えば、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、アルブミン、ビタミンＤ結合タンパク質、ヘモペキシン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、ハプトグロビン）であり得る。融合構成要素が血清タンパク質に結合可能な分子である場合、この血清タンパク質に結合可能な分子は、小分子、核酸、ペプチドまたはオリゴ糖であり得る。血清タンパク質に結合可能な分子はまた、ＦｃγＲ１、ＳｃＦｖなどのようなタンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、融合構成要素は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸によりコードされる。しかしながら、いくつかの実施形態においては、例えば融合構成要素がオリゴ糖である場合、この融合構成要素は、発現された融合ポリペプチドへ翻訳後に結合される。
【００１２】
本発明の核酸分子は、必要に応じてさらに、シグナル配列（ＳＳ）構成要素を含み得る。ＳＳがポリペプチドの一部である場合、当該分野において公知の任意のＳＳが使用され得る。このＳＳとしては、任意の供給源（例えば、分泌性タンパク質または膜結合タンパク質）由来の合成配列または天然配列が挙げられる。好ましい一実施形態において、ＲＯＲシグナル配列が使用される（配列番号６）。
【００１３】
関連する第二の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに特徴を有する。さらなる第三の局面および第四の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター（発現制御配列へ作動可能に連結された核酸分子を含む発現ベクターが挙げられる）と適切な宿主細胞中にこの発現ベクターを含む、融合ポリペプチドの生成のための宿主−ベクター系とを包含する。この宿主−ベクター系において、適切な宿主細胞は、限定せずに、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞あるいはタバコのような植物または動物（例えば、ウシ、マウスまたはウサギ）である。適切な細胞の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられる。加えて、アセチル化またはＰＥＧ化により修飾される本発明の融合ポリペプチドが包含される。
【００１４】
関連する第五の局面において、本発明は、本発明の融合ポリペプチドを生成する方法に特徴を有する。この方法は、本発明の核酸分子を含むベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞を、この宿主細胞からのタンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程、およびこのように生成されるポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００１５】
第六の局面、第七の局面および第八の局面において、本発明は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３融合ポリペプチドに特徴を有する。この融合ポリペプチドは、（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆを含み、ここでＲ１、Ｒ２、Ｆ、ｘおよびｙは、上記で規定されるようなものである。好ましい実施形態において、ｘおよびｙは、１〜３であり、より好ましくは、ｘおよびｙは、それぞれ１である。
【００１６】
第九の局面において、本発明は、多量体ポリペプチドに特徴を有する。この多量体ポリペプチドは、２つ以上の本発明の融合ポリペプチドを含む。より特定の実施形態において、この多量体ポリペプチドは、二量体である。本発明の二量体ＩＬ−４／１３特異的融合ポリペプチドは、当該分野において公知のアッセイ方法により決定されるよう、少なくとも１０−１０モル濃度のＩＣ５０でＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方を阻害し得る。ＩＣ５０は、例えば、下記のＴＦ１バイオアッセイにより決定され得る。一般的に、ｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３の生物活性を阻害する（例えば、ブロックする）二量体ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドの能力は、例えば、遊離リガンドおよび／または結合リガンドについてのバイオアッセイまたはＥＬＩＳＡにより測定され得る。バイオアッセイとしては、ＳＴＡＴ６プロモーターエレメントを使用するルシフェラーゼベースのアッセイおよび／または読み出し（例えば、増殖またはｓＣＤ２３分泌）を伴うＴＦ１のような細胞株もしくはヒト末梢血細胞のｈＩＬ−４刺激もしくはｈＩＬ−１３刺激が挙げられ得る。本発明の二量体ＩＬ−４／１３ポリペプチドの異なる実施形態においては、Ｒ１構成要素が改変されて、ｈＩＬ−４活性および／またはｈＩＬ−１３活性をブロックする能力の増加または低下を示し、ならびに／あるいはＲ２構成要素が改変されて、ＩＬ−４活性および／またはＩＬ−１３活性をブロックする能力の増加または低下を示す。
【００１７】
第十の局面において、本発明は、薬学的組成物に特徴を有する。この薬学的組成物は、本発明の融合ポリペプチドと薬学的に受容可能なキャリアとを含む。このような薬学的組成物は、単量体ポリペプチドもしくは多量体ポリペプチド、またはこの融合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【００１８】
本発明のＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の除去、阻害または低減により改善されるか、回復されるか、または阻害される任意の疾患または状態を処置するために治療上有用である。これらのポリペプチドは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の除去、阻害または低減により改善されるか、回復されるか、または阻害される状態（例えば、喘息）の処置のために特に有用である。したがって、さらなる局面において、本発明は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する疾患または状態の処置のための治療方法に特徴を有する。この方法は、本発明の融合ポリペプチドを、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する疾患または状態に罹患する被験体に投与する工程を包含する。あらゆる哺乳動物が、本発明の治療方法により処置され得るが、この被験体は、好ましくは、本発明の融合ポリペプチドにより改善され得るか、回復され得るか、阻害され得るか、または処置され得る状態または疾患に罹患するか、または罹患する危険のあるヒト患者である。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、診断方法および予後診断方法、ならびに本発明の融合ポリペプチドによりＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を検出、定量化、および／またはモニタリングするためのキットにさらに特徴づける。
【００２０】
他の目的および利点が、次の詳細な説明を検討することから明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本方法が説明される前に、本発明が特定の方法および記載される実験条件に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、このような方法および条件は変化し得るからである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のみのためのものであり、限定することを意図されないこともまた理解される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明白に指示しない限り、複数形の言及を含む。それゆえ、例えば、「方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つ以上の方法、ならびに／または本明細書に記載されるおよび／もしくは、本開示を読むことにより当業者に明白となる工程の型などを含む。
【００２３】
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と類似するか、または等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、この刊行物が引用される方法および／または材料と関連する方法および／または材料を記述するために、本明細書において参考として援用される。
【００２４】
（定義）
用語ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３「に対する親和性」は、当該分野において公知のアッセイ方法（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ分析）により決定されるように、本発明の融合ポリペプチドが、少なくとも１０−１０モル濃度（好ましくは、少なくとも１０−１１モル濃度）の親和性で、意図されるサイトカインに結合することを意味する。用語ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を「特異的にブロックし得る」あるいはＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の「活性を阻害し得る」は、例えば、遊離リガンドおよび／または結合リガンドについてのバイオアッセイまたはＥＬＩＳＡにより測定されるように、本発明のＩＬ−４／１３融合ポリペプチドが、標的サイトカインの生物活性を阻害することを意味する。バイオアッセイとしては、ＳＴＡＴ６プロモーターエレメントを使用するルシフェラーゼベースのアッセイおよび／または読み出し（例えば、増殖またはｓＣＤ２３分泌）を伴うＴＦ１のような細胞株もしくはヒト末梢血細胞のＩＬ−４刺激もしくはＩＬ−１３刺激が挙げられ得る。「ＩＣ５０」は、バイオアッセイにより測定されるＩＬ−４またはＩＬ−１３への応答の５０％を阻害するのに必要とされる、融合タンパク質の濃度として定義される。本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１×１０−１０Ｍ（さらにより好ましくは、１０−１１Ｍ（ＩＬ−１３に対して））のＩＣ５０で、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の生物活性を阻害し得る。
【００２５】
用語「処置」および「処置する」などは、本明細書で使用され、望ましい薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味する。効果は、疾患、状態もしくはそれらの症状を完全にか、もしくは部分的に防止することに関して予防的であり得、ならびに／または、疾患、状態もしくはそれらの症状に対する部分的治癒もしくは完全な治癒に関して治療的であり得、ならびに／または、効果は、この疾患または状態に起因する有害な効果であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）の疾患または状態の、任意の処置を網羅する。そして「処置」としては、（ａ）疾患または状態の素因を有し得るが、それを保有しているとはまだ診断されていない被験体におけるこの疾患または状態の発症を防ぐこと；（ｂ）この疾患または状態を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；または（ｃ）この疾患または状態を軽減すること（すなわち、この疾患または状態の退行させること）が挙げられる。本発明の方法により処置される被験体の集団としては、望ましくない状態または疾患に罹患する被験体、ならびに状態または疾患の発症の危険のある被験体が挙げられる。
【００２６】
用語「治療上の有効用量」により、投与されるものに対する望ましい効果を生じる用量が意味される。正確な用量は、処置の目的に依存し、かつ公知の技術を使用して、当業者により確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「状態または疾患」は、一般的に、哺乳動物宿主（特に、ヒト宿主）にとって望ましくない、および／またはその宿主に有害な、その宿主の状態を包含する。それゆえ、ＩＬ−４／１３特異的融合ポリペプチドにより状態または障害を処置することは、哺乳動物（特に、ヒト）の処置を包含する。この哺乳動物は、増大されたＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３または有害なＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３を反映する症状を有するか、あるいは疾患、状態または処置レジメンに応答してこのような低下した活性化を有することが予想される。ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３関連状態または疾患を処置することは、ヒト被験体の処置を包含する。この処置において、本発明の融合ポリペプチドによるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルの低下は、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３関連状態またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３関連疾患から生じる望ましくない症状の改善をもたらす。
【００２８】
（一般的な説明）
ＩＬ−４とＩＬ−１３とを欠損する動物における研究は、これらのサイトカインが、Ｔｈ２様応答（例えば、好酸球の浸潤、免疫グロブリンＥの産生およびＩＬ−５の産生）の誘導において、重複する役割および追加的な役割の両方を担うことを示した（ＭｃＫｅｎｚｉｅら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１０）：１５６５〜７２）。本発明は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３特異的融合ポリペプチドあるいはＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に結合し得、かつこれらの生物学的作用をブロックし得るアンタゴニストとして作用し得る新規ポリペプチド（単量体および多量体の両方）を提供する。
【００２９】
（核酸の構築物および核酸の発現）
本発明は、ＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドをコードする核酸分子の構築を提供する。先に記載されるように、本発明の核酸分子は、野生型（または、天然に存在する）ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質および／またはヒトＩＬ−１３Ｒαタンパク質の改変フラグメントをコードする。したがって、この核酸分子は、それらは天然に見出される核酸分子ではない（例えば、天然に存在する配列ではないが、組換えＤＮＡ技術により構築される配列である）ので、「組み換え型」、「人工」または「合成」と称され得る。
【００３０】
これらの核酸分子は、適切な宿主細胞に導入される場合に、本発明の融合ポリペプチドを発現し得るベクターに挿入される。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のための、当業者にとって公知の任意の方法が、転写制御シグナルおよび／または翻訳制御シグナルの制御下で本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用され得る。
【００３１】
本発明の核酸分子の発現は、この分子が組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主において発現されるように、第二の核酸配列により調節され得る。例えば、発現は、当該分野において公知である、任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得る。キメラポリペプチド分子の発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：長い末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（Ｓｑｕｉｎｔｏら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：１〜２０）；ＳＶ４０早期プロモーター領域、ＣＭＶ、Ｍ−ＭｕＬＶ、チミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子の調節配列；原核生物の発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーター）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４〜９４もまた参照のこと）；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＨ、ＰＧＫ、アルカリホスファターゼ）およびエラスターゼＩのような遺伝子に由来する組織特異的転写制御領域。
【００３２】
本発明の核酸分子を含み、細菌宿主または真核生物宿主において複製され得る発現ベクターは、宿主をトランフェクトし、それにより本発明の融合ポリペプチドを生成するような核酸の発現を導くために使用される。トランフェクトされた細胞は、一過性にか、または、好ましくは、恒常的かつ持続的に、本発明のポリペプチドを発現する。このように発現されるポリペプチドが、融合構成要素（例えば、第二のポリペプチドの多量体化構成要素と会合し得る多量体化構成要素）を含む場合、このように発現される単量体は、多量体化構成要素間の相互作用によって多量体化して、多量体ポリペプチドを形成する（ＷＯ００／１８９３２）。
【００３３】
本発明の融合ポリペプチドは、当該分野において公知の任意の技術により精製され得る。本発明のポリペプチドが、多量体化構成要素（自発的に別のポリペプチドとのマルチマーを形成する）を含む場合、使用される精製技術は、次の、安定的で生物学的に活性な多量体ポリペプチド（「融合ポリペプチド」としても公知である）の形成を可能にする。例えば、限定としてではないが、この因子（ｆａｃｔｏｒ）は、可溶性タンパク質または封入体（そこから８Ｍ塩酸グアニジニウムおよび透析により適量抽出され得る）のいずれかとして、細胞から回収され得る（例えば、米国特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）。さらにこの因子を精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００３４】
（融合構成要素）
本発明の融合ポリペプチドは、特定の実施形態において、多量体化構成要素、血清タンパク質または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群から選択される融合構成要素（Ｆ）を含む。Ｆが多量体化構成要素である場合、Ｆとしては、別の多量体化構成要素と相互作用し、高次構造（例えば、二量体、三量体など）を形成し得る、任意の天然配列または合成配列が挙げられる。多量体化構成要素は、以下からなる群から選択され得る：（ｉ）切断可能な領域を含む多量体化構成要素、（ｉｉ）短縮型多量体化構成要素、（ｉｉｉ）長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、および（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ。Ｆが長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間を含む多量体化構成要素である場合、この配列は、別の融合ポリペプチド（１つ以上のシステイン残基を有するＦを含む）上の対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成し得る、１つ以上のシステイン残基を含み得る。
【００３５】
好ましい実施形態において、この多量体化構成要素は、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＡ由来の１つ以上の免疫グロブリン由来のドメインを含む。特定の実施形態において、この免疫グロブリン由来のドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖からなる群から選択される。ＩｇＧのＦｃドメインは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびに各々のアイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択され得る。特定の一実施形態において、Ｆは、共有結合性の二量体形成を安定化させるためにＰｒｏに変異されたＳｅｒ２２８（Ｃａｂｏｔ番号付け）（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１０５〜１０８）および／または残りのエフェクター機能を除去するＬｅｕ２３５→Ｇｌｕ（Ｒｅｄｄｙら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３）を有するＩｇＧ４のＦｃドメインである。好ましい実施形態において、Ｆは、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、または特異的に所望される特性のために改変され得るＩｇＧ１のＦｃドメインの誘導体である（例えば、Ａｒｍｏｕｒら（２００３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：５８５〜５９３；Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１〜６６０４を参照のこと）。特定の実施形態において、本発明のＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドは、１つまたは２つのＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。
【００３６】
一実施形態において、Ｆは、以下からなる群から選択される血清タンパク質またはそのフラグメントである：α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、トランスフェリン、フェリチン、アファミン、ハプトグロビン、α−フェトプロテイン サイログロブリン、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、β−２−糖タンパク質、ヒアルロン酸結合タンパク質、シンタキシン、Ｃ１Ｒ、Ｃ１ｑ鎖、ガレクチン３−Ｍａｃ２結合タンパク質、フィブリノゲン、重合体Ｉｇレセプター（ＰＩＧＲ）、α−２−マクログロブリン、尿素輸送タンパク質、ハプトグロビン、ＩＧＦＢＰｓ、マクロファージスカベンジャーレセプター、フィブロネクチン、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、Ｆｃ、α−１−抗チロモトリプシン（ａｎｔｉｃｈｙｒｏｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、α−１−抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｂ、β−２−ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体構成要素Ｃ３またはＣ４、ＣＩエラスターゼインヒビター、Ｃ反応性タンパク質、シスタチンＣおよびプロテインＣ。より特定の実施形態において、Ｆは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、アファミン、ハプトグロビンからなる群から選択される。Ｆ構成要素の含有は、所望される場合、本発明のＩＬ−４／１３特異的ポリペプチド血清半減期を延長し得る。例えば、血清アルブミン融合タンパク質の例について米国特許第６，４２３，５１２号、同第５，８７６，９６９号、同第６，５９３，２９５号および同第６，５４８，６５３号を参照のこと。
【００３７】
Ｆが、血清タンパク質に結合可能な分子である場合、この分子は、合成小分子、脂質もしくはリポソーム、核酸（アプタマーのような合成核酸を含む）、ペプチドまたはオリゴ糖であり得る。さらに、この分子は、例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、ＦｃγＲ３、重合体Ｉｇレセプター（ＰＩＧＲ）、ＳｃＦｖおよび血清タンパク質に特異的な他の抗体フラグメントのようなタンパク質であり得る。
【００３８】
（任意の構成要素スペーサ）
本発明の融合ポリペプチドの構成要素は、直接的に互いに結合され得るか、またはスペーサを介して結合され得る。一般的に、用語「スペーサ」（またはリンカー）は、１つ以上の構成要素ドメインの間に挿入され得る１つ以上の分子（例えば、核酸もしくはアミノ酸、またはポリエチレングリコールのような非ペプチド部分）を意味する。例えば、スペーサ配列は、操作の容易さのため、構成要素間に望ましい目的の部位を提供するために使用され得る。スペーサはまた、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を亢進させるために提供され得る。スペーサはまた、この構成要素がその最適な三次構造をとり得るように、および／またはこの構成要素が適切にその標的分子と相互作用し得るように、立体障害を減少させるために提供され得る。スペーサおよび望ましいスペーサを同定する方法については、例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１〜８７９を参照のこと。スペーサ配列は、レセプター構成要素に天然的に結合される１つ以上のアミノ酸を含み得るか、または宿主細胞からの融合タンパク質の発現を亢進させるため、特に望まれる目的の部位を提供するため、構成要素ドメインに最適な三次構造を形成させること、および／または構成要素とその標的分子との相互作用を亢進させることを可能にするために使用される付加配列であり得る。一実施形態において、このスペーサは、１つ以上の構成要素間の、１〜１００アミノ酸（好ましくは、１〜２５アミノ酸）の間の１つ以上のペプチド配列を含む。特定の一実施形態において、このスペーサは、３アミノ酸配列であり；より詳細には、Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙの３アミノ酸配列である。
【００３９】
（ＩＬ−４生物活性および／またはＩＬ−１３生物活性の阻害）
本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも１×１０−１０Ｍ（ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方に対して）の；さらにより好ましくは、１０−１１Ｍ（ＩＬ−１３に対して）のＩＣ５０（ＩＬ−４またはＩＬ−１３への応答の５０％を阻害するのに必要とされる融合タンパク質の濃度）で、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の生物活性を阻害し得る。下記の表１〜表７に示されるデータは、下記のようなＩＬ−４またはＩＬ−１３により刺激される増殖についてのＴＦ１バイオアッセイにおいて決定された。ＩＣ５０を決定するのに有用な他のバイオアッセイは当該分野に公知であり、これらとしては、例えば、ＳＴＡＴ６プロモーターエレメントを使用するルシフェラーゼベースのアッセイおよび／または読み出し（例えば、ｓＣＤ２３分泌）を伴うヒト末梢血細胞のｈＩＬ−４刺激もしくはｈＩＬ−１３刺激が挙げられ得る。下記に示される表１〜表７におけるデータは、親分子からの倍分の差（ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（親１１３２分子のＩＣ５０の値で割られた改変融合ポリペプチドのＩＣ５０値）として示される。下記の実験において確証されるように、改変融合ポリペプチドは、その親分子と比較して、１．５倍〜３．０倍の、またはさらに良く改善されたＩＬ−４および／またはＩＬ−１３をブロックする能力を有し得る。特定の実施形態において、本発明の改変融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３をブロックする能力において、少なくとも２．０倍以上の改善、少なくとも２．５倍以上の改善、またはさらには少なくとも３倍以上の改善を有する。
【００４０】
（治療上の使用）
本発明の融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の除去、阻害または低減により改善されるか、回復されるか、阻害されるか、または防止される任意の疾患または状態を処置するために治療上有用である。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方が、独立に、そして連帯して、Ｔｈ２細胞に促進される応答により特徴づけられる種々の臨床状態（例えば、好酸球の浸潤、ＩｇＥの産生およびＩＬ−５の産生）に関係している。したがって、この融合ポリペプチドにより、これらの応答をブロックすることは、ＴＨ２型のヘルパーＴ細胞の発生の増加を有する任意の疾患または状態の処置のために有用である。
【００４１】
一実施形態において、ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドは、喘息を処置するために使用される。動物実験および喘息のヒトの検査より得られるデータは、アトピー性状態の重要な発動因子および喘息性の肺を代表する慢性の炎症性状態の永続因子（ｐｅｒｐｅｔｕａｔｏｒ）として、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を関係付ける。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、喘息の表現型に関連する影響（ＩｇＥ産生へのアイソタイプ転換、好酸球増加症、肥満細胞症、粘液形成、増加した血管透過性、気道の反応亢進、平滑筋過形成および上皮下線維症が挙げられる）を誘導する（Ｈｏｇａｎら（１９９７）Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７４（３）：２５９〜２８３；ＭｃＫｅｎｚｉｅら（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８８（２）：１４３〜１５１；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．１０７（１）：９〜１８）。実際に、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達は、マウスにおいて、アレルゲンに対するＩｇＥ応答の発達のために必要とされ、そしてオボアルブミンに対する喘息応答の発達は、ＩＬ−４Ｒａ欠損マウスにおいて弱められる。さらに、マウスの肺におけるＩＬ−４またはＩＬ−１３のトランスジェニック発現は、マウス肺へのＩＬ−４タンパク質またはＩＬ−１３タンパク質の直接投与で模倣し得る喘息の表現型を導く。それゆえ、ＩＬ−４とＩＬ−１３とをブロックすることは、上記のパラメーターのいくつかまたは全てにおける緩和を導くことが予想される。その上、独立にシグナルカスケードを開始し、そして喘息の表現型を誘導するＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかの能力に起因して、両方の分子を同時に阻害することは、より強力な抗喘息の有効性を生じ得る。
【００４２】
ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の阻害または低減により改善される特定の状態の非網羅的なリストは、以下を含む：アトピー性皮膚炎、免疫複合体疾患（例えば、狼瘡、腎炎およびグレーヴズ病）、アレルギー状態、高ＩｇＥ症候群、免疫欠損、特発性肺線維症、肝線維症、ＨＩＶ、肺の「再構築」、ＣＯＰＤ、潰瘍性大腸炎、癌、ホジキンリンパ腫、水疱性類天疱瘡、対宿主移植組織および移植片病（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｎｄ ｇｒａｆｔ ｖｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウイルス疾患、寄生虫性疾患、細菌性疾患ならびに真菌の感染（１２／１１／０１に発行された米国特許第６，３２８，９５４号、Ｉｄｚｅｒｄａ，Ｒ．Ｊ．ら １９９０ Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１〜８７３）。
【００４３】
代替的な実施形態において、融合ポリペプチドは、しばしばＩｇアイソタイプにおける変化ならびにＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を伴う細胞媒介性免疫の一つへの免疫応答を促進するワクチンと共にアジュバントとして使用される。ＣＴＬは本来、ウイルスに感染した細胞または細胞内細菌に感染した細胞および腫瘍細胞の破壊を補助するＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
【００４４】
（処置のために適切な被験体）
処置のために適切な被験体は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の阻害または低減により改善される特定の状態に罹患すると診断されるヒトである。この特定の状態としては、アトピー性皮膚炎、免疫複合体疾患（例えば、狼瘡、腎炎およびグレーヴズ病）、アレルギー状態、高ＩｇＥ症候群、免疫欠損、特発性肺線維症、肝線維症、ＨＩＶ、肺の「再構築」、ＣＯＰＤ、潰瘍性大腸炎、癌、ホジキンリンパ腫、水疱性類天疱瘡、対宿主移植組織および移植片病、ウイルス疾患、寄生虫性疾患、細菌性疾患ならびに真菌の感染が挙げられる。
【００４５】
（併用治療）
多数の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、１つ以上のさらなる化合物または治療と組み合わせて投与され得る。組み合わせとしては、短時間作用性の吸入β２アゴニスト、経口β２アゴニスト、吸入抗コリン作用剤、経口コルチコステロイド、吸入コルチコステロイド、クロモリンナトリウム（ＧａｓｔｒｏｃｒｏｍＴＭ／Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ネドクロミル、長時間作用性β２アゴニスト、ロイコトリエン修飾因子、テオフィリン、カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｒｉｎ）インヒビター、ピクロリムス（ｐｉｃｒｏｌｉｍｕｓ）、シロリムス、抗ＩｇＥ（ＺｏｌａｉｒＴＭ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮＦＫＢインヒビター、ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター（ＶＸ−７０２）、ＩＣＥインヒビター（ＶＸ−７６５）、ＩＬ−１インヒビター（ＩＬ−１特異的融合ポリペプチド、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；アナキンラ、Ａｍｇｅｎ）、ＴＮＦａインヒビター（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ；ＥｎｂｒｅｌＴＭ、Ａｍｇｅｎ；ＨｕｍｉｒａＴＭ、Ａｂｂｏｔｔ）、ＩＬ−５インヒビター、ＩＬ−１８インヒビター、ＩＦＮγインヒビター、ＩＦＮαブロッカーが挙げられる。例えば、複数の融合ポリペプチドが、共に投与され得るか、または１つ以上のポリペプチドが、１つ以上の治療化合物と共に投与され得る。本発明のポリペプチドがＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を除去する場合、１つ以上のその他の治療剤は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の存在に関連する状態を防止するか、または処置するために使用される治療剤である。本発明の融合ポリペプチドと第二の治療剤との併用の利益は、いずれかの治療剤の効能の改善および／または毒性の減少を提供することである。
【００４６】
（投与方法）
本発明は、有効量の本発明の融合ポリペプチドを被験体に投与する工程を包含する処置方法を提供する。好ましい局面において、この融合ポリペプチドは、実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するか、または望まれない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。この被験体は、好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００４７】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の薬剤を投与するために使用され得る（例えば、リポソーム中における封入、微小粒子、マイクロカプセル、この化合物を発現し得る組換え体、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法は、経腸的か、または非経口的であり得、そして導入方法としては、皮内経路、筋内経路、関節内経路、注入ポリペプチドエリトニール（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｅｒｉｔｏｎｅａｌ）経路、静脈内経路、皮下経路、鼻内経路、眼内経路および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。この化合物は、任意の簡便な経路（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口内粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）により投与され得、そして他の生物学的に活性な因子と共に投与され得る。投与は、全身性か、または局所性であり得る。投与は、急性的か、または慢性的（例えば、毎日、毎週、毎月など）であり得るか、あるいは他の因子と組み合され得る。肺の投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む処方物の使用により利用され得る。
【００４８】
別の実施形態において、この活性薬剤は、制御放出系内またはポンプ内のベシクル（特に、リポソーム）中において送達され得る。本発明の活性薬剤がタンパク質をコードする核酸である別の実施形態において、この核酸は、以下により、そのコードされるタンパク質の発現を促進するためにインビボ投与され得る：適切な核酸発現ベクターの一部としてこの核酸を構築し、そしてこの核酸が、例えば、レトロウイルスベクターの使用（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）によってか、直接注射によってか、もしくは微粒子砲撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）の使用によって細胞内になるように、この核酸を投与するか、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることによって、あるいは核内に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドへ連結した状態でこの核酸を投与することによってなど（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６１〜１８６８を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、発現のために、相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡに取り込まれ得る。全身性発現もまた、プラスミド注射（皮内にか、または筋内に）および細胞へのエレクトロポレーションにより達成され得る。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物を処置の必要のある領域に局所的に投与することが望ましい；このことは、例えば（限定の目的ではなく）、手術中の局所注入、（局所（ｔｏｐｉｃａｌ）適用（例えば、注射によってか、カテーテルによってか、または移植物によって））により達成され得る。この移植物は、多孔性材料、非多孔性材料またはゼラチン状材料（シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜、ファイバーまたは市販の皮膚代用物が挙げられる）で作られる。
【００５０】
本発明の方法を実施することにおいて有用な組成物は、本発明の薬剤を、溶液中、懸濁物中、またはその両方の中に含む液体であり得る。用語「溶液／懸濁物」は、活性薬剤の第一の部分は溶液中に存在し、活性薬剤の第二の部分は粒子状の形態（液体マトリックス中の懸濁物）で存在する液体の組成物をいう。液体の組成物としてはまた、ゲルが挙げられる。液体の組成物は、水性であり得るか、または軟膏の形態であり得る。
【００５１】
一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、徐放性組成物である。生物学的に活性なペプチドの送達のための徐放性処方物は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第６，７４０，６３４号は、生物学的に活性な物質のヒドロキシナフトエ酸（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｏｉｃ ａｃｉｄ）塩と生分解性ポリマーとを含む徐放性処方物を記載する。米国特許第６，６９９，５００号は、少なくとも５ヶ月の期間にわたって生理学的に活性な物質を放出し得る徐放性処方物を開示する。
【００５２】
（診断方法およびスクリーニング方法）
本発明の融合ポリペプチドは、診断的に、および／またはスクリーニング方法において使用され得る。例えば、融合ポリペプチドは、処置効能を評価する臨床研究の間、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のレベルをモニタリングするために使用され得る。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、例えば、非常に高いＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルあるいは非常に低いＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルを有する個体を同定する臨床研究への参加のため、個体をスクリーニングするために使用される。本発明の融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の局在化および活性に関する、当該分野において公知の方法（例えば、診断方法におけるイメージング、適切な生理学的サンプルにおけるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のレベルを測定することなど）において使用され得る。
【００５３】
本発明の融合ポリペプチドは、例えば、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の発現を低下させ得る試験薬剤を同定するスクリーニング方法において、存在する未結合ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の量を定量化するインビボスクリーニングアッセイおよびインビトロスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。より一般的には、本発明の融合ポリペプチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の定量および／または単離が所望される任意のアッセイまたはプロセスにおいて使用され得る。
【００５４】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療上の有効量の１つ以上の融合ポリペプチドと薬学的に受容可能なキャリアとを含む。用語「薬学的に受容可能な」は、動物（より詳細には、ヒト）における使用についての連邦政府もしくは州政府の監督官庁により認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般的に承認される薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、水および油（石油由来の油、動物由来の油、植物由来の油または合成由来の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油およびゴマ油など）が挙げられる）のような無菌の液体であり得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールなどが挙げられる。所望される場合、この組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤あるいはｐＨ緩衝剤も含む。これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末剤および徐放性処方物などの形態を取り得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【００５５】
本発明の融合ポリペプチドは、中性の形態または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離アミノ基と共に形成される塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩）および遊離カルボキシル基と共に形成される塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩）が挙げられる。
【００５６】
意図される治療上の使用のために有効な融合ポリペプチドの量は、本記載に基づく標準的な臨床技術により決定され得る。加えて、インビトロアッセイが、必要に応じて、最適な投薬量の範囲を同定するのを補助するために利用され得る。一般的に、静脈内投与のための適切な投薬量の範囲は、大体、１キログラム体重あたり約０．０２ミリグラム〜約１０ミリグラムの活性化合物である。鼻内投与のための適切な投薬量の範囲は、大体、１ｋｇ体重あたり約０．０１ｐｇ〜１ｋｇ体重あたり約１０ｍｇである。有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から得られる用量−応答曲線から推定され得る。投与される化合物の量は、もちろん、処置されている被験体に依存し、被験体の体重、苦痛の重症度、投与様式および処方する医師の判断に依存する。治療は、症状が検出可能である間または症状が検出不能である場合でさえも、断続的に繰り返され得る。
【００５７】
（細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビボおよびインビトロでの細胞のトランスフェクションのための、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸の使用を包含する。これらの核酸は、標的細胞および標的生物のトランスフェクションのために、任意の多くの周知のベクターに挿入され得る。核酸は、エキソビボおよびインビボで、脂質の混合またはエレクトロポレーションにより促進されるベクターと標的細胞との相互作用を介して細胞にトランスフェクトされる。組成物は、治療応答を誘発するのに十分な量で（例えば、筋肉への注射により）被験体に投与される。このことを達成するのに適当な量は、「治療上の有効用量または治療上の有効量」として定義される。
【００５８】
別の局面において、本発明は、ヒトまたは他の動物におけるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３レベルを減少させる方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドをコードする核酸により細胞をトランスフェクトする工程を包含する。ここで、この核酸は、このポリペプチドをコードする核酸へ作動可能に連結された誘導可能なプロモーターを含む。ヒトの疾患の処置または防止における遺伝子治療の手順については、例えば、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１４９〜１１５４を参照のこと。
【００５９】
（キット）
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、薬学的製品もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定される書式での通知が、このような容器に付随し得る。この通知は、（ａ）ヒトへの投与に関する、上記機関による製造、使用または販売の認可（ｂ）使用についての指示、またはその両方を示す。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法のある完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、かつ本発明者らが、本発明者らの発明とみなす範囲を限定することを意図されない。使用された数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するために努力がなされたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が説明されるべきである。他に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は、大気圧または大気圧の近傍である。
【００６１】
（実施例１．ＩＬ−４／１３改変融合ポリペプチドの構築）
親ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドを作製するために、１１３２（配列番号８）（ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン（配列番号１〜２）とヒトＩＬ−１３Ｒα１細胞外ドメイン（配列番号３の２７〜３４３）とをコードする核酸）を、標準的なＰＣＲ技術を使用して増幅し、ヒトＦｃ配列を含む発現ベクターに連結させた。それにより、ＩＬ−４Ｒαおよび／またはＩＬ−１３Ｒα１から構成される融合タンパク質とそのヒンジ（Ｎ末端からＣ末端までの、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域およびＣＨ３領域）とを作製した。配列番号８の置換：Ｃｙｓ２０７→Ｓｅｒおよび配列番号８の置換：Ｃｙｓ２５１→Ａｌａ（Ｃｙｓ２５１は、配列番号３のＣｙｓ４６に対応する）を、当該分野において公知の標準的な技術を使用する部位特異的突然変異誘発により導入した。全ての配列を、標準的な技術により確認した。適切なコード配列を、標準的な分子生物学技術を使用して真核生物発現ベクターにサブクローニングした。当該分野において公知の技術を使用して、親１１３２融合ポリペプチドの部位特異的突然変異誘発により、ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド改変体を作製し、そして配列決定により確認した。
【００６２】
改変ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＬＩＰＯ ＰｌｕｓＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、改変タンパク質をコードするＤＮＡ構築物により一過的にＣＨＯ細胞をトランスフェクトすることによって、小規模な上清として生成した。上清を７２時間後に収集した。そしてタンパク質発現を、抗ヒトＦｃ ＨＲＰ結合抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるウエスタンブロッティングにより測定し、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化した。改変ＩＬ／４／１３融合ポリペプチドの大規模な精製のために、この融合タンパク質をコードするＤＮＡを、ＦＡＳＴＲ技術（米国特許出願公開２００２０１６８７０２）を使用して、一過性発現のためまたは安定株を作製するためのいずれかのためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。１Ｌ〜２Ｌのこの融合タンパク質を発現する細胞の培地を収集し、そしてＦｃを含む融合タンパク質を捕捉するために、プロテインＡカラムに通過させた。プロテインＡ精製を、製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプロトコールにしたがって実行した。濃縮後、この融合タンパク質を、混入している凝集体のパーセンテージについて特徴づけ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）または類似のカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してさらに精製した。
【００６３】
改変ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドの安定性を、標準的な方法（２０回の凍結／融解のサイクル後のＳＥＣによる分析およびウェスタンブロットによる分析、３７℃で７日間、低塩の緩衝液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液）および中程度の塩の緩衝液（ＰＢＳ）中で、このタンパク質をインキュベートすることによる分析、または種々のｐＨで緩衝化されたＰＢＳ溶液中でこのタンパク質を２時間インキュベートすることによる分析が挙げられる）を使用して、評価した。
【００６４】
この分子の薬物動態を、１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−４／１３融合ポリペプチド改変体を用いて、マウスまたはラットに静脈内にかまたは皮下に注射することにより決定した。血液を種々の時点において収集し、そして血清を単離した。この融合タンパク質を捕捉する抗ＩＬ−１３Ｒａモノクローナル抗体と、複合体を形成するビオチン化抗ＩＬ−４Ｒａモノクローナル抗体と、この複合体を検出するストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体とを用いるＥＬＩＳＡを使用して、改変融合ポリペプチドの量について血清サンプルを分析した。融合ポリペプチドの濃度を、血清サンプルからのＯＤと精製融合タンパク質を使用して生成される検量線から得られるＯＤとの比較により決定した。融合ポリペプチドの量をまた、３種の抗体（抗ＩＬ−１３Ｒａ抗体、抗ＩＬ−４Ｒａ抗体または抗ヒトＦｃ抗体）のうちの１つと検出のためのＨＲＰ結合体化二次抗体とを使用する１μｌの血清のウェスタンブロット分析によりモニタリングした。
【００６５】
（実施例２．改変融合ポリペプチドによるｈＩＬ−４生物活性およびｈＩＬ−１３生物活性の阻害）
（ＴＦ１バイオアッセイ）ｈＩＬ−１３Ｒα１により安定的にトランスフェクトしたＴＦ１細胞を、増殖培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン）中で維持した。バイオアッセイのために、細胞をアッセイ培地（上記と同じだが、ＧＭ−ＣＳＦを含まない）で３回洗浄し、次に５０μｌのアッセイ培地中に２×１０４の細胞でプレートした。精製融合ポリペプチドを、アッセイ培地中に段階希釈した。２５μｌの各々の改変ＩＬ−４／１３融合ポリペプチドを、この細胞に添加した。次に、２５μｌのＩＬ−１３（１５ｐＭ）または２５μｌのＩＬ−４（２０ｐＭまたは４０ｐＭ）のいずれかを、この細胞とこの融合ポリペプチドとを含むウェルに添加した。それから、細胞を約７０時間、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。ＴＦ１細胞の増殖の程度を、製造者（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のプロトコールにしたがったＣＣＫ−８アッセイにより測定した。
【００６６】
表１〜表７についての全てのバイオアッセイは、親ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド、１１３２（シグナル配列（成熟ポリペプチドから切断される）と共に示される配列番号８）（配列番号７によりコードされる）を含んだ。この融合ポリペプチドは、以下からなる：シグナル配列（アミノ酸１〜２３）＋１つのＩＬ−４Ｒα構成要素（Ｃｙｓ２０７→Ｓｅｒを有する配列番号８のアミノ酸２４〜２３１）（配列番号２の２４〜２３１に対応する）＋１つのＩＬ−１３Ｒα１構成要素（Ｃｙｓ２５１→Ａｌａを有する配列番号８のアミノ酸２３２〜５４８）（Ｃｙｓ２５１は、配列番号３のＣｙｓ４６に対応する）（配列番号３の２７〜３４３に対応する）＋１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ）（配列番号８の５４９〜７７６）。全ての改変融合ポリペプチド（別に特定されるもの（表１）を除く）は、親のＣｙｓ２０７→Ｓｅｒ変異を含み、そして全ての改変融合ポリペプチドは、ＩＬ−１３Ｒａ１構成要素中のＣｙｓ２５１→Ａｌａ（配列番号３のＣｙｓ４６）変異を含む。例えば、配列番号１０（構築物２６７４；配列番号９によりコードされる）、配列番号１２（構築物２６８１；配列番号１１によりコードされる）、配列番号１４（構築物２７９５；配列番号１３によりコードされる）、および配列番号１６（構築物２７９６；配列番号１５によりコードされる）（これらは、最終的に成熟融合ポリペプチドから切断されるシグナル配列を含む）を参照のこと。表１は、親のトラップ（ｔｒａｐ）１１３２および２例の改変融合ポリペプチドについてのＩＣ５０のデータ（細胞の増殖の５０％が阻害される濃度）ならびに親ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド１１３２についてのＩＣ５０値からの倍分の差（改変融合ポリペプチドＩＣ５０で割った親融合ポリペプチドＩＣ５０）を示す。
【００６７】
（表１．融合ポリペプチド２６７４および２６８１のＩＣ５０のデータおよび倍分の差のデータ）
【００６８】
【表１】
表２〜表６は、ＣＨＯの一過性の上清を使用してアッセイされた、改変融合ポリペプチドのＩＣ５０バイオアッセイ値の倍分の差を示す。この上清の濃度を、ウェスタンブロット分析により決定した。表２は、システイン変異を有する改変体の、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする能力についてのＩＣ５０における倍分の差を示す；表３は、コアを安定化する変異と活性部位変異とを有する融合ポリペプチド改変体の、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする能力を示す；表４は、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする電荷変更改変体および組み合わせを示す；表５は、ｈＩＬ−１３活性またはｈＩＬ−４活性をブロックする疎水性パッチ改変体および組み合わせを示す；表６は、ＩＬ−４ＲαのＮ末端欠失およびＣ末端欠失を有する改変融合ポリペプチドの活性を示す（これらの全ては、親融合ポリペプチド１１３２と比較して表現される）。
（表２．システイン改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００６９】
【表２】
（表３．コアを安定化する改変体および活性部位改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性をブロックする能力）
【００７０】
【表３】
（表４．ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性を阻害する電荷改変体および組み合わせ改変体）
【００７１】
【表４】
（表５．疎水性パッチ改変体および組み合わせ改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００７２】
【表５】
（表６．Ｎ末端改変体およびＣ末端改変体の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００７３】
【表６】
（実施例３．生物活性についての精製融合ポリペプチド改変体の特徴づけ）
表７は、改変融合ポリペプチドの、ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性をブロックする能力を示す。その結果を、親融合ポリペプチド、ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド１１３２（配列番号８）についてのＩＣ５０値からの倍分の差（改変融合ポリペプチドＩＣ５０で割った親融合ポリペプチドＩＣ５０）として示す。この親分子は、以下からなる：シグナル配列（アミノ酸１〜２３）＋１つのＩＬ−４Ｒα構成要素（Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒを有するアミノ酸２４〜２３１）（配列番号２の２４〜２３１に対応する）＋１つのＩＬ−１３Ｒα１構成要素（Ｃｙｓ２５１Ａｌａを有するアミノ酸２３２〜５４８）（配列番号３の２７〜３４３に対応する）＋１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ）（５４９〜７７６）。標準偏差は、３回以上アッセイされたものについて示される。全ての改変融合ポリペプチド（他の特定のＣｙｓ２０７の置換を有するものを除く）は、Ｃｙｓ２０７→Ｓｅｒ変異を含み、全ての改変融合ポリペプチドは、ＩＬ−１３Ｒａ１構成要素中のＣｙｓ２５１→Ａｌａ変異を含む。
（表７．改変体分子の、ＩＬ−１３活性およびＩＬ−４活性を阻害する能力）
【００７４】
【表７】
（実施例４．ＢＩＡｃｏｒｅを使用しての、改変体のＩＬ−４／１３結合親和性の決定）
ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対するＩＬ−４／１３特異的ポリペプチドの親和性を、ＷＯ００／７５３１９に記載されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ ３０００を使用して測定した。このＢＩＡｃｏｒｅアッセイは、Ｒ１−Ｒ２−Ｆｃ改変体（全てのこれらの改変体は、１つのシグナル配列、１つのＩＬ−４Ｒα構成要素、続いて、１つのＩＬ−１３Ｒα１構成要素および１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ）から構成された）と比較して、親の１１３２（配列番号８）構築物を試験した。ＩＬ−４／１３融合ポリペプチド改変体を、抗ヒトＦｃ抗体を使用してチップ表面に捕捉した。種々の濃度のヒトＩＬ−４および／またはヒトＩＬ−１３を、この表面の全面に注入し、そして会合および解離の時間経過をモニタリングした。会合速度定数および解離速度定数を得るために、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用する反応速度分析を実行した。結果を表８に示す。
（表８．ＢＩＡｃｏｒｅを介して測定されたＩＬ−４／ＩＬ−１３結合親和性）
【００７５】
【表８】
（実施例５．構成要素改変体の、ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性を阻害する能力）
表９は、上記のＣＨＯの一過性の上清を使用してアッセイされた、融合ポリペプチドのＩＣ５０バイオアッセイ値の倍分の差を示す。これらの融合ポリペプチドは、代替的な構成要素配置（例えば、Ｒ２−Ｒ１−Ｆ（配列番号３および配列番号２））を含む。そして、これらの融合ポリペプチドを１１３２親分子と比較する。試験した改変体は、以下から構成される：ＲＯＲシグナル配列（アミノ酸１〜２９）＋ＩＬ−１３Ｒα１構成要素（Ｃｙｓ４６Ｓｅｒを有するアミノ酸３０〜３４６（配列番号３の２７〜３４３に対応する））＋１つのＩＬ−４Ｒα構成要素（Ｃｙｓ２０７Ｓｅｒを有するアミノ酸３４７〜５５４（配列番号２の２４〜２３１に対応する））＋１つの多量体化構成要素（ＩｇＧ１ Ｆｃ、アミノ酸５５５〜７８４）。
（表９．構成要素配置改変体）
【００７６】
【表９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチド（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆであって、該融合ポリペプチドにおいて、
Ｒ１は、以下の配列：配列番号２の１〜２３１および２４〜２３１から選択され、該配列は１〜１０個の改変を含み得；
Ｒ２は、配列番号３および配列番号４から選択され、該配列は１〜３個の改変を含み得；
Ｆは、融合構成要素であり、そしてｘおよびｙは、各々独立して、１以上の正の整数である、融合ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の融合ポリペプチドであって、前記Ｒ１が、位置６７、６８、７１、１５２、１６４、１７１、１７２、１７５、１９８および／または２０７における１以上のアミノ酸の、異なるアミノ酸による置換によって改変される、融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記位置６７におけるアミノ酸がＴｙｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記位置６８におけるアミノ酸がＡｓｎに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記位置１７１におけるアミノ酸がＴｙｒまたはＰｈｅに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記位置１７２におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記位置１５２におけるアミノ酸がＰｈｅに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記位置１９８におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記位置２０７におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｒ１が、位置６７、６８および２０７における置換により改変される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記位置６７におけるアミノ酸がＴｙｒに置換される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記位置６８におけるアミノ酸がＡｓｎに置換される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記位置６８におけるアミノ酸がＡｓｎに置換される、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｒ１が位置１７１および１７２における置換によりさらに改変される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記位置１７１におけるアミノ酸がＴｙｒまたはＰｈｅに置換される、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記位置１７２におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｒ１が位置１５２における置換によりさらに改変される、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記位置１５２におけるアミノ酸がＰｈｅに置換される、請求項１７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の融合ポリペプチドであって、Ｒ２が、（ｉ）配列番号３の１〜３４３または２７〜３４３、および（ｉｉ）配列番号４の１〜３４３または２３〜３４３からなる群から選択される、融合ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載の融合ポリペプチドであって、前記（ｉ）が、以下：
（ａ）配列番号３のアミノ酸１〜１２０を配列番号５のアミノ酸１〜１２３に置換する工程；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸３３８〜３４３を欠失させる工程；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸１〜２６を配列番号６に置換する工程；または
（ｄ）位置４６、７３、１４３、２３５、２９３および／または３２９における１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換する工程、
により改変される、融合ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１９に記載の融合ポリペプチドであって、前記（ｉｉ）が、（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜２２の欠失；（ｂ’）Ｃｙｓ２５１Ｉｌｅ；または（ｃ’）配列番号４の位置３１０のアミノ酸の置換、により改変される、融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｆが、多量体化構成要素、血清タンパク質または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載の融合ポリペプチドであって、前記Ｆが、（ｉ）免疫グロブリン由来のドメイン、（ｉｉ）切断可能な領域（Ｃ領域）、（ｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）ロイシンジッパー、（ｉｖ）ヘリックスループモチーフ、および（ｖ）コイル−コイルモチーフ、からなる群から選択される多量体化構成要素である、融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記Ｆが、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖からなる群から選択される免疫グロブリン由来のドメインである、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
２つ以上の請求項１〜２４のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む、多量体タンパク質。
【請求項２６】
２つの融合ポリペプチドを含む二量体である、請求項２５に記載の多量体タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
適切な宿主細胞中に、請求項２８に記載のベクターを含む宿主−ベクター系。
【請求項３０】
融合ポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、前記宿主細胞からのタンパク質の発現に適切な条件下で、請求項２９に記載の宿主−ベクター系を培養する工程、およびこのように生成される該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項１】
融合ポリペプチド（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｆであって、該融合ポリペプチドにおいて、
Ｒ１は、以下の配列：配列番号２の１〜２３１および２４〜２３１から選択され、該配列は１〜１０個の改変を含み得；
Ｒ２は、配列番号３および配列番号４から選択され、該配列は１〜３個の改変を含み得；
Ｆは、融合構成要素であり、そしてｘおよびｙは、各々独立して、１以上の正の整数である、融合ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の融合ポリペプチドであって、前記Ｒ１が、位置６７、６８、７１、１５２、１６４、１７１、１７２、１７５、１９８および／または２０７における１以上のアミノ酸の、異なるアミノ酸による置換によって改変される、融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記位置６７におけるアミノ酸がＴｙｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記位置６８におけるアミノ酸がＡｓｎに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記位置１７１におけるアミノ酸がＴｙｒまたはＰｈｅに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記位置１７２におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記位置１５２におけるアミノ酸がＰｈｅに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記位置１９８におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記位置２０７におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｒ１が、位置６７、６８および２０７における置換により改変される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記位置６７におけるアミノ酸がＴｙｒに置換される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記位置６８におけるアミノ酸がＡｓｎに置換される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記位置６８におけるアミノ酸がＡｓｎに置換される、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｒ１が位置１７１および１７２における置換によりさらに改変される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記位置１７１におけるアミノ酸がＴｙｒまたはＰｈｅに置換される、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記位置１７２におけるアミノ酸がＳｅｒに置換される、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｒ１が位置１５２における置換によりさらに改変される、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記位置１５２におけるアミノ酸がＰｈｅに置換される、請求項１７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の融合ポリペプチドであって、Ｒ２が、（ｉ）配列番号３の１〜３４３または２７〜３４３、および（ｉｉ）配列番号４の１〜３４３または２３〜３４３からなる群から選択される、融合ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載の融合ポリペプチドであって、前記（ｉ）が、以下：
（ａ）配列番号３のアミノ酸１〜１２０を配列番号５のアミノ酸１〜１２３に置換する工程；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸３３８〜３４３を欠失させる工程；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸１〜２６を配列番号６に置換する工程；または
（ｄ）位置４６、７３、１４３、２３５、２９３および／または３２９における１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換する工程、
により改変される、融合ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１９に記載の融合ポリペプチドであって、前記（ｉｉ）が、（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜２２の欠失；（ｂ’）Ｃｙｓ２５１Ｉｌｅ；または（ｃ’）配列番号４の位置３１０のアミノ酸の置換、により改変される、融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｆが、多量体化構成要素、血清タンパク質または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載の融合ポリペプチドであって、前記Ｆが、（ｉ）免疫グロブリン由来のドメイン、（ｉｉ）切断可能な領域（Ｃ領域）、（ｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さ１アミノ酸〜約５００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）ロイシンジッパー、（ｉｖ）ヘリックスループモチーフ、および（ｖ）コイル−コイルモチーフ、からなる群から選択される多量体化構成要素である、融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記Ｆが、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖からなる群から選択される免疫グロブリン由来のドメインである、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
２つ以上の請求項１〜２４のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む、多量体タンパク質。
【請求項２６】
２つの融合ポリペプチドを含む二量体である、請求項２５に記載の多量体タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
適切な宿主細胞中に、請求項２８に記載のベクターを含む宿主−ベクター系。
【請求項３０】
融合ポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、前記宿主細胞からのタンパク質の発現に適切な条件下で、請求項２９に記載の宿主−ベクター系を培養する工程、およびこのように生成される該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【公表番号】特表２００８−５０４８０６（Ｐ２００８−５０４８０６Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００７７３（Ｐ２００７−５００７７３）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５２８４
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５２８４
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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