ＪＡＫ２遺伝子の変異解析方法
【課題】骨髄増殖性疾患に関連するＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法を提供する。
【解決手段】ＪＡＫ２遺伝子の変異解析方法、特に、個体由来サンプル中の特定の変異を有するＪＡＫ２遺伝子の割合を定量する方法。また、該方法に有用な核酸プローブの提供。
【解決手段】ＪＡＫ２遺伝子の変異解析方法、特に、個体由来サンプル中の特定の変異を有するＪＡＫ２遺伝子の割合を定量する方法。また、該方法に有用な核酸プローブの提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＪＡＫ２遺伝子の変異解析方法、特に、個体由来サンプル中の特定の変異を有するＪＡＫ２遺伝子の割合を解析する方法に関する。本発明はまた、該方法に有用な核酸プローブにも関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄増殖性疾患（ｃＭＰＤ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、造血幹細胞レベルでの異常が認められるクローナルな疾患である。該疾患には、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、及び原発性骨髄線維症が含まれる。
【０００３】
これら３種類の疾患の発症メカニズムは長らく不明であったが、２００５年に、これらの３種類の疾患において、ヤーヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ；ＪＡＫ２）遺伝子のエキソン１４の７３番目のグアニン塩基がチミン塩基に置換される遺伝子変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）が高頻度に観察されることが報告された（非特許文献１）。このことから、当該ＪＡＫ２遺伝子変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）の検出は、ｃＭＰＤの診断及び治療計画において重要な役割を果たすと考えられる。
【０００４】
実際には、一個体由来の血液試料であっても、変異型ＪＡＫ２遺伝子を有する血液細胞と正常型ＪＡＫ２遺伝子を有する血液細胞の両方が含まれる。このことが、ＪＡＫ２遺伝子変異の検出を利用したｃＭＰＤの診断を複雑にしている。一方で、トランスジェニックマウスを用いた実験により、変異型ＪＡＫ２遺伝子の含有割合（アレルバーデン；ａｌｌｅｌｅ ｂｕｒｄｅｎ）とｃＭＰＤの病態との間に関連性が存在することが示唆されており、変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析はｃＭＰＤの診断において極めて重要である（非特許文献２）。
【０００５】
これまでに開発されているＪＡＫ２遺伝子変異の検出及びアレルバーデン解析に関する手法としては、直接シーケンス法、アリル特異的ＰＣＲ法、及び解離曲線解析法が挙げられる。
【０００６】
直接シーケンス法では、変異部位を含む領域をＰＣＲで増幅し、その増幅産物についてサンガー法を利用したＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を解析する（非特許文献３）。この方法では、変異部位のシグナルの状態から、変異型遺伝子の検出及びアレルバーデン解析を行うことができる。この方法は操作が煩雑な上、臨床検体を対象とする場合にはバックグラウンドノイズの影響などにより正確なアレルバーデンの判定が困難であるという問題がある。
【０００７】
アリル特異的ＰＣＲ法では、ＰＣＲプライマーの３’末端付近に鋳型の塩基配列とのミスマッチが存在すると伸長反応が進まないことを利用して変異を検出する（非特許文献４）。この方法の特徴は感度が高いことであり、１％程度のアレルバーデンであっても検出することが可能である。しかしながら、この方法は、１つの検体に対して２回の反応（変異型遺伝子検出のための反応及び正常型遺伝子検出のための反応）を行なう必要があり、時間と労力を要する。また、臨床検体を対象とする場合、擬陽性を生じ易いという問題がある。
【０００８】
解離曲線解析法では、まず遺伝子の変異部位を含む領域をＰＣＲなどで増幅し、次に変異部位を含む領域に相補的なプローブを用いて、試料中の核酸由来の増幅産物とプローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。続いて、得られたハイブリッド核酸を加熱し、温度上昇に伴うハイブリッドから一本鎖核酸への解離を、蛍光シグナル測定などにより検出する。このときの温度変化による蛍光値のシグナルの形状により、試料中の核酸が変異型遺伝子であるか正常型遺伝子であるかを判別する。解離曲線解析は、簡便ではあるが、変異型遺伝子の存在の有無を検出することができるのみであり、定量性が低いためアレルバーデン解析に用いることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ Ｃ．，Ｕｇｏ Ｖ．，Ｌｅ Ｃｏｕｅｄｉｃ，Ｊ−Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００５；４３４：１１４４−１１４８
【非特許文献２】Ｔｉｅｄｔ Ｒ．，Ｈａｏ−ｓｈｅｎ Ｈ．，Ｓｏｂａｓ Ｍ．Ａ．，ら，Ｂｌｏｏｄ，２００８；１１１：３９３１−３９４０
【非特許文献３】Ｌｅｖｉｎｅ Ｒ．Ｌ．，Ｗｅｒｎｉｇ Ｇ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ，２００６；２３３−２３９
【非特許文献４】Ｌａｒｓｅｎ Ｔ．Ｓ．，ら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００７；１３６：７４５−７５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の通り、変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析はｃＭＰＤの診断において極めて重要であるが、そのための十分な感度及び定量性を有する簡便な方法は未だ開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、簡便で定量性の高い変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析のための方法を開発することを目標として、塩基による蛍光色素の消光現象に着目し、本発明を完成させた。
【００１２】
具体的には、本発明は、以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブを準備するステップ、
（ｂ）サンプル由来の核酸のＪＡＫ２遺伝子エキソン１４中の、ステップ（ａ）のプローブと相補的な配列を含む領域を増幅するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物にステップ（ａ）のプローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｄ）第１の標識物質からのシグナルを検出するステップ
を含み、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法。
【００１３】
〔２〕前記プローブが、配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔１〕に記載の方法。
【００１４】
〔４〕第１の標識物質が、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、又はパシフィック・ブルーである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５〕前記プローブが、第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されており、ステップ（ｄ）で第２の標識物質からのシグナルを第１の標識物質からのシグナルの検出と逐次的又は同時に検出し、その後、第１と第２の標識物質からのシグナルの比を算出する、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１５】
〔６〕ステップ（ｂ）での増幅を、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、又はＨＤＡ法により行なう、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔７〕サンプルが血液、骨髄液又はそれらの処理物である、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
〔８〕配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されており、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブ。
〔９〕配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔８〕に記載のプローブ。
【００１７】
〔１０〕前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔８〕に記載のプローブ。
〔１１〕第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されている、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載のプローブ。
〔１２〕上記〔８〕〜〔１１〕のいずれか１つに記載のプローブを少なくとも含む、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、簡便で定量性の高い変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析のための方法が提供され、これにより、骨髄増殖性疾患の正確な遺伝子診断を低コストで簡便に行なうことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態の測定原理を表す模式図である。
【図２】標準サンプルを用いた本発明の方法によるアレルバーデン解析の標準曲線を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブを準備するステップ、
（ｂ）サンプル由来の核酸のＪＡＫ２遺伝子エキソン１４中の、ステップ（ａ）のプローブと相補的な配列を含む領域を増幅するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物にステップ（ａ）のプローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｄ）第１の標識物質からのシグナルを検出するステップ
を含み、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法に関する。
【００２１】
本発明は、ヌクレオチド塩基との近接による蛍光色素の消光現象に基づく。この現象の詳細については、Ｔｏｒｉｍｕｒａら，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２００１，１７，１５５−１６０を参照されたい。一部の蛍光色素は、酸化能の高い塩基（例えば、グアニン）との光誘導性電子移動により消光し得ることが示されている。本発明の方法では、グアニンとチミンとの間のこの消光現象を誘導する能力の差を利用して、ＪＡＫ２遺伝子中のエキソン１４の７３番目の塩基のＧ→Ｔの点突然変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異）の解析を行う。
【００２２】
本発明の一実施形態の測定原理を、図１に示す。第１ステップでは、サンプル中の野生型ＪＡＫ２遺伝子及び変異型ＪＡＫ２遺伝子を、両者に共通のプライマーセットを用いて競合的に増幅させる。増幅手法は特に限定されないが、ＰＣＲ法が好ましい。この過程で、サンプル中の野生型遺伝子及び変異型遺伝子は、アレルバーデンを保ったまま増幅される。第２ステップでは、増幅反応前、反応中又は反応後の反応液に、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素で標識した蛍光プローブを添加し、増幅核酸中のＪＡＫ２遺伝子の変異部分近傍にハイブリダイズさせる。蛍光プローブは変異部位の塩基を含まないため、野生型及び変異型遺伝子核酸の双方に等しい親和力で結合する。蛍光プローブは増幅反応に影響を与えないので、反応前に予め反応液に添加することができる。第３ステップでは、蛍光プローブの非結合時と結合時のそれぞれの蛍光強度を測定し、蛍光変化率（例えば、蛍光消光率）を算出する。このとき、蛍光プローブが野生型ＪＡＫ２遺伝子核酸に結合した場合には、プローブに標識された蛍光色素からのシグナルが、近傍に存在するグアニン塩基の影響で変化（例えば、消光）する。一方、蛍光プローブが変異型ＪＡＫ２遺伝子核酸に結合した場合は、ＪＡＫ２変異の点突然変異部位がグアニン塩基からチミン塩基に変換されているため、蛍光色素近傍にグアニン塩基が存在せず、蛍光色素からのシグナルは変化（例えば、消光）しない。この蛍光変化率（例えば、蛍光消光率）の差から、サンプル中のアレルバーデンを定量することができる。
【００２３】
ＪＡＫ２遺伝子中のエキソン１４の７３番目の塩基は、登録番号ＡＬ１６１４５０としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトゲノム配列の５５０６１番目の塩基に相当し、本願の配列番号１の７３番目の塩基、相補配列である配列番号２では５０番目の塩基に相当する。
【００２４】
本発明の方法で用いるプローブは、配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ（以下、「５’側プローブ」と称することもある。）、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ（以下、「３’側プローブ」と称することもある。）であって、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である。
【００２５】
プローブの塩基長は、ハイブリダイゼーションを利用した解析が可能であれば特に制限されないが、特異性の観点から、好ましくは１５塩基長以上であり、より好ましくは１６塩基長以上であり、最も好ましくは１９塩基長以上である。また、融解温度又はＴｍ値が一定の値を超えると、解析の条件設定が困難になる、増幅反応において共存させることができないなどの問題を生じるため、塩基長は好ましくは、５０塩基長以下であり、より好ましくは、Ｔｍ値が７５℃程度である４４塩基長（５’側プローブ）又は４６塩基長（３’側プローブ）以下である。最も好ましくは、プローブは、配列番号３に示す配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている。
【００２６】
第１の標識物質は、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素であり、好ましくは、上記の消光現象を呈する蛍光色素である。そのようなものとしては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、及びパシフィック・ブルーが挙げられる。上記で具体的に挙げたもの以外でも、上記の消光現象を呈することが示されている蛍光色素であれば、本発明において用いることができる。
【００２７】
例えば、第１の標識物質からのシグナルを、ハイブリダイゼーションの前後で測定するか、又はハイブリダイゼーション反応の間、リアルタイムで検出することにより、ハイブリダイゼーションによる標識物質のシグナルの変化を検出して、ハイブリダイゼーションしたプローブのうち、第１の標識物質のグアニンへの近接によりシグナルが変化したプローブの割合、すなわち、サンプル中に存在する核酸中の変異遺伝子の割合（アレルバーデン）を定量する。
【００２８】
プローブは、第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質で標識されていてもよい。この場合、ステップ（ｄ）で、第２の標識物質からのシグナルを第１の標識物質からのシグナルの検出と逐次的又は同時に検出し、その後、第１と第２の標識物質からのシグナルの比を算出する。これにより、アレルバーデン定量の精度を上げることができる。
【００２９】
好ましくは、第２の標識物質もまた、第１の標識物質と同様にグアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素であり、ハイブリダイゼーションによって第２の標識物質がグアニンの近傍に位置するようにプローブの配列を設定する。そして、ハイブリダイゼーション後のシグナルについて、次式：
（Ｆｓａｍｐｌｅ−Ｆｃｏｎｔｒｏｌ）／（Ｓｃｏｎｔｒｏｌ−Ｓｓａｍｐｌｅ）
（式中、Ｆｓａｍｐｌｅ＝サンプルの第１の標識物質からのシグナル、Ｆｃｏｎｔｒｏｌ＝陰性対照の第１の標識物質からのシグナル、Ｓｃｏｎｔｒｏｌ＝陰性対照の第２の標識物質からのシグナル、Ｓｓａｍｐｌｅ＝サンプルの第１の標識物質からのシグナル）
を用いて相対蛍光強度を算出する。標準サンプルについて上記の式により得られた相対蛍光強度から標準曲線を作成し、被験サンプルについての相対蛍光強度から、被験サンプルのアレルバーデンを求めることができる。
【００３０】
ステップ（ｂ）で増幅する核酸としては、細胞から抽出したトータルＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、又はトータルＲＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡが挙げられる。本発明の方法の対象となるサンプルとしては、上記のような核酸を含むものであれば特に制限されないが、血液、骨髄液、バフィーコートなどの核酸を含む血液処理物等が挙げられる。そのようなサンプルからの核酸の調製方法は、当該技術分野で周知である。
【００３１】
本発明の方法におけるステップ（ｂ）での対象核酸領域の増幅は、好ましくは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、又はＨＤＡ法により行ない、最も好ましくは、ＰＣＲ法により行なう。上記の各手法は、当該技術分野において周知である。
【００３２】
核酸の増幅の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物に、上記プローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜設定することができる。好ましくは、増幅反応の前にサンプル由来の核酸を含む反応溶液にプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを、増幅反応後、増幅反応溶液中で、プローブのＴｍ値−１０℃〜−５℃の温度で行なう。ハイブリダイゼーションは、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃で行なう。プローブのＴｍ値は、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）等により算出することができる。
【００３３】
本発明は、配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されており、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブにも関する。当該プローブの特徴は、上記で説明した通りである。
【００３４】
また、本発明は、上記プローブを少なくとも含むＪＡＫ２遺伝子変異解析用キットにも関する。当該キットの追加の構成要素としては、被験核酸領域増幅用のプライマー、核酸増幅用の酵素及び反応バッファー等の試薬などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明の上記ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブは、全自動ＪＡＫ２遺伝子変異解析装置での解析にも利用することができる。したがって、本発明は、全自動ＪＡＫ２遺伝子変異解析装置にも関する。当該解析装置は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ及びパシフィック・ブルーなどのグアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素の蛍光強度を測定することができる蛍光測定デバイス、自動分注デバイス、遺伝子増幅デバイス等により構成される。
【００３６】
さらに、本発明を利用して、ＪＡＫ２遺伝子をバイオマーカーとするｃＭＰＤ創薬のためのスクリーニングを行なうことも可能である。すなわち、本発明を用いて被験体のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆのアレルバーデンを正確に判定することにより被験体をスクリーニングし、種々の重症度を有するｃＭＰＤ被験体による候補薬物への反応を調べることにより、ｃＭＰＤに有効な薬物を取得することができる。
【００３７】
以下で、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：新規蛍光プローブを用いた標準曲線の作成
新規蛍光プローブを用いて、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異のアレルバーデンについての標準曲線を作成した。
【００３９】
プローブ（ＡＢＱＰ−ＪＡＫｄ−１）の配列を、以下に示す。
ＴＡＭＲＡ−ｃｃｔｇｔａｇｔｔｔｔａｃｔｔａｃｔｃｔｃｇｔｃｔｃｃａｃａｇａ−ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（配列番号３）
方法は以下の通りである。野生型ＪＡＫ２遺伝子及び変異型ＪＡＫ２遺伝子に由来する、常法に従い調製した濃度既知のゲノム配列ＰＣＲ産物を、アレルバーデン（変異型の割合）が０％、２０％、４０％、６０％、８０％又は１００％となるように混合し、鋳型として用いた。初期鋳型量は、１０５コピーとした。増幅反応に用いたプライマーの配列を、以下に示す：
フォワードプライマー（Ｆ−ＪＡＫｄ−１）：５’−ａｔｃｔａｔａｇｔｃａｔｇｃｔｇａａａｇｔａｇｇａｇａａａｇ−３’（配列番号４）
リバースプライマー（Ｒ−ＪＡＫｄ−１）：５’−ｃｔｇａａｔａｇｔｃｃｔａｃａｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｃａ−３’（配列番号５）
（共に、Ｂａｘｔｅｒ Ｅ．Ｊ．ら，Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５：１０５４−１０６１を参照されたい。）
【００４０】
反応液の組成は以下の通りである：１０５コピー／反応 鋳型ＤＮＡ、１２０ｎＭ プローブ（ＡＢＱＰ−ＪＡＫｄ−１）、５００ｎＭ フォワードプライマー（Ｆ−ＪＡＫｄ−１）、１５０ｎＭ リバースプライマー（Ｒ−ＪＡＫｄ−１）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＰＣＲバッファー（タカラバイオ株式会社）、１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）。反応温度条件は、９４℃、３分（解離反応）の後、９４℃、３０秒→６２℃、３０秒→７２℃、３０秒を５０サイクル、７２℃、２分（伸長反応）とした。ＰＣＲ反応後、９５℃、２分、及び５５℃、２分の２点においてＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＴＡＭＲＡからの蛍光強度を測定し、それぞれの温度における蛍光強度から以下の式により表される相対蛍光強度を算出した。蛍光強度の測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行なった。相対蛍光強度は、各サンプルのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの蛍光強度をＢｓ、ＴＡＭＲＡの蛍光強度をＴｓ、陰性対照（鋳型なし）のＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの蛍光強度をＢｐ、ＴＡＭＲＡの蛍光強度をＴｐとしたとき、（Ｂｓ−Ｂｐ）／（Ｔｐ−Ｔｓ）から算出される。
【００４１】
算出した相対蛍光強度をサンプルのアレルバーデンに対してグラフ化したものを、図２に示す。図２から明らかなように、測定結果からは直線性が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９９６であった。測定を３連で３回実施し、いずれの場合にも同様の結果を得た。
【００４２】
実施例２：新規蛍光プローブを用いたＪＡＫ２アレルバーデン定量の正確性確認試験
細胞から抽出したＤＮＡのＪＡＫ２アレルバーデンを上記の新規蛍光プローブを用いて定量し、アッセイの正確性を試験した。
【００４３】
ＪＡＫ２野生型株（ＵＴ−７／Ｅｐｏ株）及びＪＡＫ２変異型株（ＨＥＬ株）からトータルＤＮＡを抽出し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比から、各ＤＮＡサンプルの濃度を決定した。得られた濃度に基づき、野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとを、アレルバーデンが５０％、１０％、５％又は１％となるように混合し、正確性試験のための定量用サンプルとした。反応液組成、反応温度条件、及び蛍光強度の測定条件は実施例１に記載の通りとした。試験を３連で３回実施し、３回の定量結果からＲＳＤ（残差標準偏差）値を算出し、アッセイの正確性を評価した。
【００４４】
結果を表１に示す。結果から、アレルバーデンが５％以上の場合、ＲＳＤ値は２５％を下回り、極めて正確に、サンプル中のＪＡＫ２アレルバーデン定量が可能であることが示された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
実施例３：新規蛍光プローブを用いた臨床サンプルのＪＡＫ２アレルバーデン定量試験
上記の新規蛍光プローブを用いて、臨床サンプル中のＪＡＫ２アレルバーデンの定量を行なった。
【００４７】
山梨大学医学部附属病院血液腫瘍内科を受診中のｃＭＰＤ患者の末梢血から抽出したＤＮＡサンプルのうち、直接シーケンス法を用いて変異の有無が判明しているものをサンプルとして用いた。反応液組成、反応温度条件、及び蛍光強度の測定条件は実施例１に記載の通りとした。測定は３連で３回実施した。
【００４８】
結果を表２に示す。表中、ＰＶは真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ）、ＥＴは本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ＰＭＦは原発性骨髄線維症（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）を意味する。
【００４９】
【表２】
【００５０】
結果から、本発明の方法を用いたＪＡＫ２アレルバーデンの定量結果と、直接シーケンス法を用いた判定結果とが、良好な相関を有していることが明らかとなった。直接シーケンス法の判定結果でそれぞれヘテロ型又はホモ型と判定されたサンプルが、本発明の方法のアレルバーデン定量では同程度の値となっているケースも存在した（表２、サンプルＮｏ．３及び５）。このことから、本発明の方法によるアレルバーデン定量の重要性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、医学的診断、特に骨髄増殖性疾患の診断及び治療設計において有用性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＪＡＫ２遺伝子の変異解析方法、特に、個体由来サンプル中の特定の変異を有するＪＡＫ２遺伝子の割合を解析する方法に関する。本発明はまた、該方法に有用な核酸プローブにも関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄増殖性疾患（ｃＭＰＤ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、造血幹細胞レベルでの異常が認められるクローナルな疾患である。該疾患には、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、及び原発性骨髄線維症が含まれる。
【０００３】
これら３種類の疾患の発症メカニズムは長らく不明であったが、２００５年に、これらの３種類の疾患において、ヤーヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ；ＪＡＫ２）遺伝子のエキソン１４の７３番目のグアニン塩基がチミン塩基に置換される遺伝子変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）が高頻度に観察されることが報告された（非特許文献１）。このことから、当該ＪＡＫ２遺伝子変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）の検出は、ｃＭＰＤの診断及び治療計画において重要な役割を果たすと考えられる。
【０００４】
実際には、一個体由来の血液試料であっても、変異型ＪＡＫ２遺伝子を有する血液細胞と正常型ＪＡＫ２遺伝子を有する血液細胞の両方が含まれる。このことが、ＪＡＫ２遺伝子変異の検出を利用したｃＭＰＤの診断を複雑にしている。一方で、トランスジェニックマウスを用いた実験により、変異型ＪＡＫ２遺伝子の含有割合（アレルバーデン；ａｌｌｅｌｅ ｂｕｒｄｅｎ）とｃＭＰＤの病態との間に関連性が存在することが示唆されており、変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析はｃＭＰＤの診断において極めて重要である（非特許文献２）。
【０００５】
これまでに開発されているＪＡＫ２遺伝子変異の検出及びアレルバーデン解析に関する手法としては、直接シーケンス法、アリル特異的ＰＣＲ法、及び解離曲線解析法が挙げられる。
【０００６】
直接シーケンス法では、変異部位を含む領域をＰＣＲで増幅し、その増幅産物についてサンガー法を利用したＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を解析する（非特許文献３）。この方法では、変異部位のシグナルの状態から、変異型遺伝子の検出及びアレルバーデン解析を行うことができる。この方法は操作が煩雑な上、臨床検体を対象とする場合にはバックグラウンドノイズの影響などにより正確なアレルバーデンの判定が困難であるという問題がある。
【０００７】
アリル特異的ＰＣＲ法では、ＰＣＲプライマーの３’末端付近に鋳型の塩基配列とのミスマッチが存在すると伸長反応が進まないことを利用して変異を検出する（非特許文献４）。この方法の特徴は感度が高いことであり、１％程度のアレルバーデンであっても検出することが可能である。しかしながら、この方法は、１つの検体に対して２回の反応（変異型遺伝子検出のための反応及び正常型遺伝子検出のための反応）を行なう必要があり、時間と労力を要する。また、臨床検体を対象とする場合、擬陽性を生じ易いという問題がある。
【０００８】
解離曲線解析法では、まず遺伝子の変異部位を含む領域をＰＣＲなどで増幅し、次に変異部位を含む領域に相補的なプローブを用いて、試料中の核酸由来の増幅産物とプローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。続いて、得られたハイブリッド核酸を加熱し、温度上昇に伴うハイブリッドから一本鎖核酸への解離を、蛍光シグナル測定などにより検出する。このときの温度変化による蛍光値のシグナルの形状により、試料中の核酸が変異型遺伝子であるか正常型遺伝子であるかを判別する。解離曲線解析は、簡便ではあるが、変異型遺伝子の存在の有無を検出することができるのみであり、定量性が低いためアレルバーデン解析に用いることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ Ｃ．，Ｕｇｏ Ｖ．，Ｌｅ Ｃｏｕｅｄｉｃ，Ｊ−Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００５；４３４：１１４４−１１４８
【非特許文献２】Ｔｉｅｄｔ Ｒ．，Ｈａｏ−ｓｈｅｎ Ｈ．，Ｓｏｂａｓ Ｍ．Ａ．，ら，Ｂｌｏｏｄ，２００８；１１１：３９３１−３９４０
【非特許文献３】Ｌｅｖｉｎｅ Ｒ．Ｌ．，Ｗｅｒｎｉｇ Ｇ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ，２００６；２３３−２３９
【非特許文献４】Ｌａｒｓｅｎ Ｔ．Ｓ．，ら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００７；１３６：７４５−７５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の通り、変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析はｃＭＰＤの診断において極めて重要であるが、そのための十分な感度及び定量性を有する簡便な方法は未だ開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、簡便で定量性の高い変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析のための方法を開発することを目標として、塩基による蛍光色素の消光現象に着目し、本発明を完成させた。
【００１２】
具体的には、本発明は、以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブを準備するステップ、
（ｂ）サンプル由来の核酸のＪＡＫ２遺伝子エキソン１４中の、ステップ（ａ）のプローブと相補的な配列を含む領域を増幅するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物にステップ（ａ）のプローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｄ）第１の標識物質からのシグナルを検出するステップ
を含み、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法。
【００１３】
〔２〕前記プローブが、配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔１〕に記載の方法。
【００１４】
〔４〕第１の標識物質が、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、又はパシフィック・ブルーである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５〕前記プローブが、第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されており、ステップ（ｄ）で第２の標識物質からのシグナルを第１の標識物質からのシグナルの検出と逐次的又は同時に検出し、その後、第１と第２の標識物質からのシグナルの比を算出する、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１５】
〔６〕ステップ（ｂ）での増幅を、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、又はＨＤＡ法により行なう、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔７〕サンプルが血液、骨髄液又はそれらの処理物である、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
〔８〕配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されており、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブ。
〔９〕配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔８〕に記載のプローブ。
【００１７】
〔１０〕前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、上記〔８〕に記載のプローブ。
〔１１〕第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されている、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載のプローブ。
〔１２〕上記〔８〕〜〔１１〕のいずれか１つに記載のプローブを少なくとも含む、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、簡便で定量性の高い変異型ＪＡＫ２遺伝子のアレルバーデン解析のための方法が提供され、これにより、骨髄増殖性疾患の正確な遺伝子診断を低コストで簡便に行なうことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態の測定原理を表す模式図である。
【図２】標準サンプルを用いた本発明の方法によるアレルバーデン解析の標準曲線を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブを準備するステップ、
（ｂ）サンプル由来の核酸のＪＡＫ２遺伝子エキソン１４中の、ステップ（ａ）のプローブと相補的な配列を含む領域を増幅するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物にステップ（ａ）のプローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｄ）第１の標識物質からのシグナルを検出するステップ
を含み、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法に関する。
【００２１】
本発明は、ヌクレオチド塩基との近接による蛍光色素の消光現象に基づく。この現象の詳細については、Ｔｏｒｉｍｕｒａら，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２００１，１７，１５５−１６０を参照されたい。一部の蛍光色素は、酸化能の高い塩基（例えば、グアニン）との光誘導性電子移動により消光し得ることが示されている。本発明の方法では、グアニンとチミンとの間のこの消光現象を誘導する能力の差を利用して、ＪＡＫ２遺伝子中のエキソン１４の７３番目の塩基のＧ→Ｔの点突然変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異）の解析を行う。
【００２２】
本発明の一実施形態の測定原理を、図１に示す。第１ステップでは、サンプル中の野生型ＪＡＫ２遺伝子及び変異型ＪＡＫ２遺伝子を、両者に共通のプライマーセットを用いて競合的に増幅させる。増幅手法は特に限定されないが、ＰＣＲ法が好ましい。この過程で、サンプル中の野生型遺伝子及び変異型遺伝子は、アレルバーデンを保ったまま増幅される。第２ステップでは、増幅反応前、反応中又は反応後の反応液に、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素で標識した蛍光プローブを添加し、増幅核酸中のＪＡＫ２遺伝子の変異部分近傍にハイブリダイズさせる。蛍光プローブは変異部位の塩基を含まないため、野生型及び変異型遺伝子核酸の双方に等しい親和力で結合する。蛍光プローブは増幅反応に影響を与えないので、反応前に予め反応液に添加することができる。第３ステップでは、蛍光プローブの非結合時と結合時のそれぞれの蛍光強度を測定し、蛍光変化率（例えば、蛍光消光率）を算出する。このとき、蛍光プローブが野生型ＪＡＫ２遺伝子核酸に結合した場合には、プローブに標識された蛍光色素からのシグナルが、近傍に存在するグアニン塩基の影響で変化（例えば、消光）する。一方、蛍光プローブが変異型ＪＡＫ２遺伝子核酸に結合した場合は、ＪＡＫ２変異の点突然変異部位がグアニン塩基からチミン塩基に変換されているため、蛍光色素近傍にグアニン塩基が存在せず、蛍光色素からのシグナルは変化（例えば、消光）しない。この蛍光変化率（例えば、蛍光消光率）の差から、サンプル中のアレルバーデンを定量することができる。
【００２３】
ＪＡＫ２遺伝子中のエキソン１４の７３番目の塩基は、登録番号ＡＬ１６１４５０としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトゲノム配列の５５０６１番目の塩基に相当し、本願の配列番号１の７３番目の塩基、相補配列である配列番号２では５０番目の塩基に相当する。
【００２４】
本発明の方法で用いるプローブは、配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ（以下、「５’側プローブ」と称することもある。）、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ（以下、「３’側プローブ」と称することもある。）であって、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である。
【００２５】
プローブの塩基長は、ハイブリダイゼーションを利用した解析が可能であれば特に制限されないが、特異性の観点から、好ましくは１５塩基長以上であり、より好ましくは１６塩基長以上であり、最も好ましくは１９塩基長以上である。また、融解温度又はＴｍ値が一定の値を超えると、解析の条件設定が困難になる、増幅反応において共存させることができないなどの問題を生じるため、塩基長は好ましくは、５０塩基長以下であり、より好ましくは、Ｔｍ値が７５℃程度である４４塩基長（５’側プローブ）又は４６塩基長（３’側プローブ）以下である。最も好ましくは、プローブは、配列番号３に示す配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている。
【００２６】
第１の標識物質は、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素であり、好ましくは、上記の消光現象を呈する蛍光色素である。そのようなものとしては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、及びパシフィック・ブルーが挙げられる。上記で具体的に挙げたもの以外でも、上記の消光現象を呈することが示されている蛍光色素であれば、本発明において用いることができる。
【００２７】
例えば、第１の標識物質からのシグナルを、ハイブリダイゼーションの前後で測定するか、又はハイブリダイゼーション反応の間、リアルタイムで検出することにより、ハイブリダイゼーションによる標識物質のシグナルの変化を検出して、ハイブリダイゼーションしたプローブのうち、第１の標識物質のグアニンへの近接によりシグナルが変化したプローブの割合、すなわち、サンプル中に存在する核酸中の変異遺伝子の割合（アレルバーデン）を定量する。
【００２８】
プローブは、第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質で標識されていてもよい。この場合、ステップ（ｄ）で、第２の標識物質からのシグナルを第１の標識物質からのシグナルの検出と逐次的又は同時に検出し、その後、第１と第２の標識物質からのシグナルの比を算出する。これにより、アレルバーデン定量の精度を上げることができる。
【００２９】
好ましくは、第２の標識物質もまた、第１の標識物質と同様にグアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素であり、ハイブリダイゼーションによって第２の標識物質がグアニンの近傍に位置するようにプローブの配列を設定する。そして、ハイブリダイゼーション後のシグナルについて、次式：
（Ｆｓａｍｐｌｅ−Ｆｃｏｎｔｒｏｌ）／（Ｓｃｏｎｔｒｏｌ−Ｓｓａｍｐｌｅ）
（式中、Ｆｓａｍｐｌｅ＝サンプルの第１の標識物質からのシグナル、Ｆｃｏｎｔｒｏｌ＝陰性対照の第１の標識物質からのシグナル、Ｓｃｏｎｔｒｏｌ＝陰性対照の第２の標識物質からのシグナル、Ｓｓａｍｐｌｅ＝サンプルの第１の標識物質からのシグナル）
を用いて相対蛍光強度を算出する。標準サンプルについて上記の式により得られた相対蛍光強度から標準曲線を作成し、被験サンプルについての相対蛍光強度から、被験サンプルのアレルバーデンを求めることができる。
【００３０】
ステップ（ｂ）で増幅する核酸としては、細胞から抽出したトータルＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、又はトータルＲＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡが挙げられる。本発明の方法の対象となるサンプルとしては、上記のような核酸を含むものであれば特に制限されないが、血液、骨髄液、バフィーコートなどの核酸を含む血液処理物等が挙げられる。そのようなサンプルからの核酸の調製方法は、当該技術分野で周知である。
【００３１】
本発明の方法におけるステップ（ｂ）での対象核酸領域の増幅は、好ましくは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、又はＨＤＡ法により行ない、最も好ましくは、ＰＣＲ法により行なう。上記の各手法は、当該技術分野において周知である。
【００３２】
核酸の増幅の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物に、上記プローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜設定することができる。好ましくは、増幅反応の前にサンプル由来の核酸を含む反応溶液にプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを、増幅反応後、増幅反応溶液中で、プローブのＴｍ値−１０℃〜−５℃の温度で行なう。ハイブリダイゼーションは、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃で行なう。プローブのＴｍ値は、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）等により算出することができる。
【００３３】
本発明は、配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されており、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブにも関する。当該プローブの特徴は、上記で説明した通りである。
【００３４】
また、本発明は、上記プローブを少なくとも含むＪＡＫ２遺伝子変異解析用キットにも関する。当該キットの追加の構成要素としては、被験核酸領域増幅用のプライマー、核酸増幅用の酵素及び反応バッファー等の試薬などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明の上記ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブは、全自動ＪＡＫ２遺伝子変異解析装置での解析にも利用することができる。したがって、本発明は、全自動ＪＡＫ２遺伝子変異解析装置にも関する。当該解析装置は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ及びパシフィック・ブルーなどのグアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素の蛍光強度を測定することができる蛍光測定デバイス、自動分注デバイス、遺伝子増幅デバイス等により構成される。
【００３６】
さらに、本発明を利用して、ＪＡＫ２遺伝子をバイオマーカーとするｃＭＰＤ創薬のためのスクリーニングを行なうことも可能である。すなわち、本発明を用いて被験体のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆのアレルバーデンを正確に判定することにより被験体をスクリーニングし、種々の重症度を有するｃＭＰＤ被験体による候補薬物への反応を調べることにより、ｃＭＰＤに有効な薬物を取得することができる。
【００３７】
以下で、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：新規蛍光プローブを用いた標準曲線の作成
新規蛍光プローブを用いて、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異のアレルバーデンについての標準曲線を作成した。
【００３９】
プローブ（ＡＢＱＰ−ＪＡＫｄ−１）の配列を、以下に示す。
ＴＡＭＲＡ−ｃｃｔｇｔａｇｔｔｔｔａｃｔｔａｃｔｃｔｃｇｔｃｔｃｃａｃａｇａ−ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（配列番号３）
方法は以下の通りである。野生型ＪＡＫ２遺伝子及び変異型ＪＡＫ２遺伝子に由来する、常法に従い調製した濃度既知のゲノム配列ＰＣＲ産物を、アレルバーデン（変異型の割合）が０％、２０％、４０％、６０％、８０％又は１００％となるように混合し、鋳型として用いた。初期鋳型量は、１０５コピーとした。増幅反応に用いたプライマーの配列を、以下に示す：
フォワードプライマー（Ｆ−ＪＡＫｄ−１）：５’−ａｔｃｔａｔａｇｔｃａｔｇｃｔｇａａａｇｔａｇｇａｇａａａｇ−３’（配列番号４）
リバースプライマー（Ｒ−ＪＡＫｄ−１）：５’−ｃｔｇａａｔａｇｔｃｃｔａｃａｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｃａ−３’（配列番号５）
（共に、Ｂａｘｔｅｒ Ｅ．Ｊ．ら，Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５：１０５４−１０６１を参照されたい。）
【００４０】
反応液の組成は以下の通りである：１０５コピー／反応 鋳型ＤＮＡ、１２０ｎＭ プローブ（ＡＢＱＰ−ＪＡＫｄ−１）、５００ｎＭ フォワードプライマー（Ｆ−ＪＡＫｄ−１）、１５０ｎＭ リバースプライマー（Ｒ−ＪＡＫｄ−１）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＰＣＲバッファー（タカラバイオ株式会社）、１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）。反応温度条件は、９４℃、３分（解離反応）の後、９４℃、３０秒→６２℃、３０秒→７２℃、３０秒を５０サイクル、７２℃、２分（伸長反応）とした。ＰＣＲ反応後、９５℃、２分、及び５５℃、２分の２点においてＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＴＡＭＲＡからの蛍光強度を測定し、それぞれの温度における蛍光強度から以下の式により表される相対蛍光強度を算出した。蛍光強度の測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行なった。相対蛍光強度は、各サンプルのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの蛍光強度をＢｓ、ＴＡＭＲＡの蛍光強度をＴｓ、陰性対照（鋳型なし）のＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの蛍光強度をＢｐ、ＴＡＭＲＡの蛍光強度をＴｐとしたとき、（Ｂｓ−Ｂｐ）／（Ｔｐ−Ｔｓ）から算出される。
【００４１】
算出した相対蛍光強度をサンプルのアレルバーデンに対してグラフ化したものを、図２に示す。図２から明らかなように、測定結果からは直線性が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９９６であった。測定を３連で３回実施し、いずれの場合にも同様の結果を得た。
【００４２】
実施例２：新規蛍光プローブを用いたＪＡＫ２アレルバーデン定量の正確性確認試験
細胞から抽出したＤＮＡのＪＡＫ２アレルバーデンを上記の新規蛍光プローブを用いて定量し、アッセイの正確性を試験した。
【００４３】
ＪＡＫ２野生型株（ＵＴ−７／Ｅｐｏ株）及びＪＡＫ２変異型株（ＨＥＬ株）からトータルＤＮＡを抽出し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比から、各ＤＮＡサンプルの濃度を決定した。得られた濃度に基づき、野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとを、アレルバーデンが５０％、１０％、５％又は１％となるように混合し、正確性試験のための定量用サンプルとした。反応液組成、反応温度条件、及び蛍光強度の測定条件は実施例１に記載の通りとした。試験を３連で３回実施し、３回の定量結果からＲＳＤ（残差標準偏差）値を算出し、アッセイの正確性を評価した。
【００４４】
結果を表１に示す。結果から、アレルバーデンが５％以上の場合、ＲＳＤ値は２５％を下回り、極めて正確に、サンプル中のＪＡＫ２アレルバーデン定量が可能であることが示された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
実施例３：新規蛍光プローブを用いた臨床サンプルのＪＡＫ２アレルバーデン定量試験
上記の新規蛍光プローブを用いて、臨床サンプル中のＪＡＫ２アレルバーデンの定量を行なった。
【００４７】
山梨大学医学部附属病院血液腫瘍内科を受診中のｃＭＰＤ患者の末梢血から抽出したＤＮＡサンプルのうち、直接シーケンス法を用いて変異の有無が判明しているものをサンプルとして用いた。反応液組成、反応温度条件、及び蛍光強度の測定条件は実施例１に記載の通りとした。測定は３連で３回実施した。
【００４８】
結果を表２に示す。表中、ＰＶは真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ）、ＥＴは本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ＰＭＦは原発性骨髄線維症（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）を意味する。
【００４９】
【表２】
【００５０】
結果から、本発明の方法を用いたＪＡＫ２アレルバーデンの定量結果と、直接シーケンス法を用いた判定結果とが、良好な相関を有していることが明らかとなった。直接シーケンス法の判定結果でそれぞれヘテロ型又はホモ型と判定されたサンプルが、本発明の方法のアレルバーデン定量では同程度の値となっているケースも存在した（表２、サンプルＮｏ．３及び５）。このことから、本発明の方法によるアレルバーデン定量の重要性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、医学的診断、特に骨髄増殖性疾患の診断及び治療設計において有用性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブを準備するステップ、
（ｂ）サンプル由来の核酸のＪＡＫ２遺伝子エキソン１４中の、ステップ（ａ）のプローブと相補的な配列を含む領域を増幅するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物にステップ（ａ）のプローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｄ）第１の標識物質からのシグナルを検出するステップ
を含み、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法。
【請求項２】
前記プローブが、配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の標識物質が、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、又はパシフィック・ブルーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが、第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されており、ステップ（ｄ）で第２の標識物質からのシグナルを第１の標識物質からのシグナルの検出と逐次的又は同時に検出し、その後、第１と第２の標識物質からのシグナルの比を算出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）での増幅を、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、又はＨＤＡ法により行なう、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが血液、骨髄液又はそれらの処理物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されており、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブ。
【請求項９】
配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１１】
第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも含む、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用キット。
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているプローブ、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されているプローブを準備するステップ、
（ｂ）サンプル由来の核酸のＪＡＫ２遺伝子エキソン１４中の、ステップ（ａ）のプローブと相補的な配列を含む領域を増幅するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、その途中、又は後に、サンプル由来の核酸又はその増幅産物にステップ（ａ）のプローブを添加して、増幅配列にプローブをハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｄ）第１の標識物質からのシグナルを検出するステップ
を含み、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異の解析方法。
【請求項２】
前記プローブが、配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の標識物質が、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、又はパシフィック・ブルーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが、第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されており、ステップ（ｄ）で第２の標識物質からのシグナルを第１の標識物質からのシグナルの検出と逐次的又は同時に検出し、その後、第１と第２の標識物質からのシグナルの比を算出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）での増幅を、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、又はＨＤＡ法により行なう、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが血液、骨髄液又はそれらの処理物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号２の４９位から５’側の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されており、第１の標識物質が、グアニンへの近接によりシグナルが変化する蛍光色素である、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用プローブ。
【請求項９】
配列番号２の４９位から５’側の１６〜４４塩基長の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されているか、又は配列番号２の５１位から３’側の１６〜４６塩基長の配列を有し、５’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記プローブが、配列番号３の配列を有し、３’末端が第１の標識物質により標識されている、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１１】
第１の標識物質と反対側の末端で、第１の標識物質とは異なるシグナルを生成する第２の標識物質により標識されている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも含む、ＪＡＫ２遺伝子変異解析用キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−３４５８０（Ｐ２０１２−３４５８０Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７４５７１（Ｐ２０１０−１７４５７１）
【出願日】平成２２年８月３日（２０１０．８．３）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【出願人】（５０２２８５４５７）学校法人順天堂 (64)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３日（２０１０．８．３）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【出願人】（５０２２８５４５７）学校法人順天堂 (64)
【Ｆターム（参考）】
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