Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）を選択的に阻害するための方法
リンパ系または骨髄系起源の細胞におけるＪａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）依存性の機能を阻害または破壊するための、特にリンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞）の増殖および機能をブロックするための方法が開示される。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基化合物、または誘導体もしくは修飾された化合物が用いられ、これは、Ｊａｋ３活性を選択的に阻害する一方で、その他のタンパク質チロシンキナーゼ活性をより少ない程度に影響するか、または全く影響しないで、従来の免疫抑制剤を用いるよりも少ない副作用で、移植片拒絶の軽減およびアレルギー応答の緩和のような有益な効果を与える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
［発明の分野］
本発明は概して、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）を含むリンパ球およびその他のリンパ系起源の細胞の増殖および機能の阻害に関する。より詳細には、本発明は、リンパ球機能、特に免疫活性の調節をブロックする化学薬剤を使用する治療および試験の方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）媒介性の細胞活性および細胞増殖を選択的に破壊することに関する。
【０００２】
［関連技術の説明］
臓器の同種移植片拒絶に対処するために今日使用される治療的ストラテジーの効果は、強い副作用を生じる免疫抑制薬物への依存によって厳しく制限される。現在の臨床的な免疫抑制療法は、セリン−スレオニンホスファターゼカルシニューリン（ＣａＮ）インヒビターシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびタクロリムス（ＦＫ５０６）１によって占められ、これらは細胞周期の初期のＧ１期を通してＴ細胞増殖をブロックすることによってＴ細胞修飾因子として作用する１、２。これらの薬物に関連する望ましくない副作用としては、腎臓毒性、神経毒性、真性糖尿病、高脂血症、高血圧、多毛症、および歯肉増殖症が挙げられる３。より新しい薬物、ラパマイシン（ＲＡＰＡ）は、ＲＡＰＡのセリン−スレオニンキナーゼ哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）を標的とし、これはまた、粘膜潰瘍、リンパ増殖異常、低カリウム血症を表し得、そして低密度のリポタンパク質、コレステロール、およびトリグリセリドを増加する４。臨床的に承認された薬物の深刻な欠点は、これらが同種移植片の永続的な受容を生じないことであり、それゆえこれらは患者に継続的に送達される必要がある。
【０００３】
臓器の同種移植片拒絶に対処するための現在の治療的ストラテジーは、Ｔ細胞シグナル伝達経路およびそれを含む分子に集中している。Ｔ細胞シグナル伝達カスケード、ならびに免疫抑制におけるおよび潜在的に移植寛容を誘導するための、その潜在的な役割は、ＫｉｒｋｅｎおよびＳｔｅｐｋｏｗｓｋｉによって記載されている５。Ｔ細胞の完全な活性化は、３つの閾値制限された連続的なシグナルを必要とする６。
【０００４】
シグナル１が、特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合する抗原によって送達されて、続いて、シグナル２が、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用によって送達される。ＴＣＲとの結合後、数秒〜数分以内に、Ｚａｐ７０、Ｌｃｋ、およびＦｙｎのタンパク質Ｔｙｒキナーゼの自己活性化の間にＣＤ３ζ鎖はチロシン（Ｔｙｒ）リン酸化される７〜９。同時に、カルシウム（Ｃａ２＋）移動が、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）脱リン酸化核因子に対するＣａＮホスファターゼの触媒活性化−ＮＦＡＴが核移行してインターロイキン（ＩＬ）−２遺伝子のプロモーター内の不連続のＤＮＡ結合エレメントを結合するために必要な工程−を引き起こす１０。シグナル１および２はＩＬ−２の合成および分泌にとって重要であり、ＩＬ−２は、ＩＬ−４、−７、−９、−１３、−１５、および−２１のような他のＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）と協調して、サイトカイン受容体を介してシグナル３を送達する。これは、Ｔ細胞のクローン増殖を駆動するために要求される必要な工程である１１。これらのサイトカイン受容体は共通のγ鎖（γｃ）を共有し、この共通のγ鎖（γｃ）は、各サイトカインについて固有のα鎖と結合される際にＪａｎｕｓチロシン（Ｔｙｒ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ３を介して細胞内シグナルを送達し、ならびに転写のシグナル伝達因子および活性化因子（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （Ｓｔａｔ））１、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５ａ／ｂ、およびＳｔａｔ６を活性化する１１〜１８。
【０００５】
（Ｔ細胞におけるシグナル１経路に関与する）ＣａＮ酵素および（Ｔ細胞におけるシグナル３経路に関与する）ｍＴＯＲ酵素は、身体中の種々の組織において遍在的に発現される。このことは、Ｔ細胞特異的標的化に対するＣｓＡ、ＦＫ５０６、およびＲＡＰＡのような阻害薬物の効果を厳しく制限する。ＲＡＰＡは、今日臨床的に承認されている唯一の効果的なシグナル３インヒビターである２４。治療的介入のための候補標的として作用する他のシグナル伝達経路分子とは異なり、Ｊａｋ３発現は、組織発現の制限されたパターンを示し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および単球に、または一般的用語では免疫起源の細胞に細分化される。
【０００６】
Ｊａｋ３は、リンパ系細胞へのその主要な局在性ゆえに、多くの免疫由来疾患を取り除くための固有の分子的なおよび治療的な標的として期待できる１９〜２１。この酵素は、γｃを介してほぼ排他的に会合および活性化されるため、Ｊａｋ３またはγｃの遺伝子破壊は、重篤な複合免疫不全疾患として表れる２２。この深刻な免疫抑制の理由は、上述のようなＴＣＧＦのファミリーによるＴ細胞の発達および補充においてのＪａｋ３の重要な役割に起因する。Ｊａｋ３は受容体成分および近位膜と会合するので、これらの受容体から発せられる、Ｓｔａｔおよび分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （Ｍａｐｋ））カスケードを含む、全ての下流のシグナルが活性化される。すなわち、Ｊａｋ３の破壊は、ＴＣＧＦによって媒介される全てのシグナルを引き続きブロックし、それゆえに、これらの細胞内の遺伝子転写を調節するそれらの能力をブロックする。しかし、この固有のおよび余剰なシグナル伝達経路の阻害を制御することができれば、免疫活性化の好ましい調節が、これらの遺伝子を欠損する患者およびマウスにおいて観察されるように達成可能となるはずである。さらに、この経路を標的化することは、理論上は、ＣｓＡに応答しない拒絶を担う、活性化されかつ増殖するＴ細胞の集団も阻害する２１。
【０００７】
リンパ球においてＪａｋ３を特異的に標的化するインヒビターを同定するための努力は、僅かに報告されているＪａｋ３を阻害する薬物もまた多くの身体組織における日常的な細胞機能に必要とされる多くの他のチロシンキナーゼを阻害するという事実によって阻まれる。実際、これらのタンパク質チロシンキナーゼは、細胞表面受容体から核へ細胞外シグナルを伝達し、続いてリンパ球以外の細胞型の増殖、分化、および機能を調節するためには、基本的に重要である。
【０００８】
米国特許出願公開第２００２／００４２５１３号明細書（Ｕｃｋｕｎら）は所定のキナゾリン化合物を記載しており、その化合物は、インスリン受容体チロシンキナーゼに対する構造相同性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）に基づくＪａｋ３相同性モデルを使用して、その推定されたドッキング親和性に基づいて選択される。移植片合併症、自己免疫誘導性糖尿病を処置もしくは防止する、または同種移植片生存を延長する、いくつかのキナゾリン化合物の能力が評価された。
【０００９】
米国特許出願公開第２００２／００３２２０４号明細書（Ｍｏｏｎら）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）、およびセチン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＳＴＫ）の触媒活性を調節する、所定の３−（ピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体の所定のＭａｎｎｉｃｈ塩基プロドラッグを記載する。これらのプロドラッグが、異常なタンパク質キナーゼ活性によって媒介される多くの疾患を処置するために有用であることが述べられている。開示された化合物が、多くの種類の固形腫瘍を治癒するための治療的アプローチとして、ＲＴＫ，ＣＴＫ、および／またはＳＴＫ媒介性のシグナル伝達経路を調節すると述べられている。その他のＭａｎｎｉｃｈ塩基化合物が記載され、そして細胞傷害性および抗ガン特性について記載および評価されている３４、３５。抗真菌および抗新生物特性を有する共役スチリルケトンの所定のＭａｎｎｉｃｈ塩基は、米国特許第６，０１７，９３３号明細書の主題である。
【００１０】
近年、Ｊａｋ３に対して選択性を示す２つの薬剤が同定された２１、２４、２５。ＡＧ−４９０と示される一方の薬剤は、チルホスチンファミリーメンバーであり、ベンジリデンマロノニトリルの誘導体であり、これは以下の構造式を有する：
【００１１】
他方は、ＰＮＵ１５６８０４であり、これは毒性の親化合物ウンデシルプロジギオシンの同族体であり、以下の構造式を有する：
【００１２】
ＡＧ−４９０およびＰＮＵ１５６８０４の両方は、ＴＣＧＦおよびＪａｋ３自己キナーゼ活性によって媒介されるＴ細胞増殖を阻害するために有能である一方で、Ｊａｋ３を発現しない非活性化Ｔ細胞に対しては制限された効果を有する。これらの２つの薬剤のいずれも、ｐ５６ＬｃｋまたはＺａｐ７０チロシンキナーゼを含むＴ細胞受容体活性化カスケードの中間体に影響しないことが見出された２３、２５。
【００１３】
１つの研究において、ＡＧ４９０処置は、単核細胞（ＧＩＣ）の移植片浸潤と、エクスビボでＩＬ−２刺激されたＧＩＣのＳｔａｔ５ａ／ｂＤＮＡ結合とを減少したが、リボヌクレアーゼ保護アッセイによって判断されたようにＩＬ２Ｒ□の発現には影響しなかった。すなわち、Ｊａｋ３の阻害は、同種移植片生存を延長し、また、ＣｓＡの免疫抑制効果は増強するが、ＲＡＰＡの免疫抑制効果は増強しないと結論された。ＡＧ４９０は、その他のチロシンキナーゼファミリーメンバーのＬｃｋ、Ｌｙｍ、Ｂｔｋ、Ｓｙｋ、Ｓｒｃ、Ｊａｋ１、またはＴｙｋ２キナーゼを阻害しない一方で、その密接に関連するファミリーメンバーＪａｋ２に対しては類似の効果を及ぼすこともまた見出された２４。ＡＧ−４９０の有害な副作用は、免疫抑制治療のための日常的な臨床的使用を妨げる。
【００１４】
他方、ＰＮＵ１５６８０４は、ＩＬ−２によるＪａｋ３媒介性のＴ細胞増殖を阻害することによって、Ｊａｋ２を使用するその他の増殖因子（プロラクチン）に比較して、より優れた特異性を示した。キナーゼアッセイによって、ＰＮＵ１５６８０４が、Ｊａｋ３自己リン酸化を、Ｊａｋ２と比較して優先的に阻害したこと、ならびにＳｔａｔ５経路のような中間体エフェクター分子を共有したことが示された２５。その研究においては、ＰＮＵ１５６８０４は同種移植片生存を延長し、そしてＣｓＡとは相乗的に作用するが、ＲＡＰＡとは相加的に作用することが示された。ＰＮＵ１５６８０４は、（Ｊａｋ２自己キナーゼ活性と比較して）優先的にＪａｋ３を破壊し、それによって、γｃにより駆動されるＴ細胞クローン増殖を選択的に阻害することもまた証明された。現在のモデルは、Ｊａｋ３がｍＴＯＲの上流活性化因子であることを保持する。Ｊａｋ３は免疫細胞において発現されるので、Ｊａｋ３の阻害はＲＡＰＡと現在関連される有害な影響を伴わずにｍＴＯＲ活性化をブロックする。さらに、ＣｓＡ（Ｇ０〜Ｇ１移行をブロックする）と、ＰＮＵ１５６８０４（Ｇ１〜Ｓ増殖をブロックする）との相乗効果は、連続的な活性化シグナルをブロックすることにより、それによって、必要とされる各薬物の投薬量をより低くしながら有益な治療的効果を維持することにより、免疫抑制を行う新規なストラテジーを提供する２５。しかし、ＰＮＵ１５６８０４はその後、ヒトにおける治療的使用に対しては毒性が強すぎることが証明されている。
【００１５】
いくつかの現在利用可能な薬物は、急性の拒絶をブロックする見込みがあることが示されているが、連続的な免疫抑制の不在下では、慢性的な移植片破壊および永続的な同種移植片受容（例えば、移植寛容）の問題は衰えていない。これらの問題に十分に取り組む治療的方法、および有害な副作用を回避する医薬品が必要とされている。これらの目的に向かって、Ｔ細胞シグナル伝達を理解することにおいて、およびシグナル伝達経路における所定の分子を標的化するためのストラテジーを考案することにおいて、大幅な進歩があった。ＴＣＧＦによって活性化されるＴおよびＢリンパ球のシグナル３経路に固有の分子を、選択的にまたは特異的に阻害する薬剤が緊急に必要とされている。かかる薬剤は、その他の細胞に影響することなくＴ細胞のクローン増殖をブロックする大きな潜在性を有する。上述されたように、宿主対移植片疾患および移植片対宿主疾患のような望ましくない免疫応答を調節するために、Ｊａｋ３はシグナル３経路において固有の分子標的を表す。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００４２５１３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００３２２０４号明細書
【非特許文献１】Ｄａｔａｂａｓｅ ＭＢＡＳＥ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．２００３３６６６１４，ＫＡＨＮ ｅｔ ａｌ．’Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，’ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，２００３，３５／５，ｐｐ．１６２１−１６２３
【非特許文献２】Ｄａｔａｂａｓｅ ＭＢＡＳＥ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．２００３３９１４５１，ＭＡＮＥＺ，Ｒ．’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，’ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，２００３，１６／５，ｐｐ．３３２−３３６
【非特許文献３】Ｄａｔａｂａｓｅ ＣＡＰＬＵＳ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．１９９３：６０３０３２，ＤＩＭＭＯＣＫ ｅｔ ａｌ．’Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｍａｎｎｉｃｈ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｏａｌｋａｎｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，’ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２８（４），ｐｐ．３１３−２２
【非特許文献４】Ｄａｔａｂａｓｅ ＣＡＰＬＵＳ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．１９９５：９６２２８１，ＤＩＭＭＯＣＫ ｅｔ ａｌ．’Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｍａｎｎｉｃｈ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ａｌｉｃｙｃｌｉｃ Ｋｅｔｏｎｅｓ，’，ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，１９９５，５０（１），ｐｐ．６６８−７１
【発明の開示】
【００１６】
好ましい実施態様の概要
本発明は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）を発現する任意の細胞型、好ましくは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞を含むリンパ系または骨髄系起源の細胞型（「リンパ系または骨髄系の細胞」）の機能および／または増殖を破壊または阻害する新規な方法を提供することによって、先行技術に存在する所定の欠点を克服することを目指している。したがって、本発明の所定の実施態様においては、リンパ球の機能および／または増殖の破壊または阻害は、所定の化合物、好ましくはＭａｎｎｉｃｈ塩基で細胞を処置して治療的な免疫抑制を獲得することによって達成される。本発明の所定の実施態様においては、Ｊａｋ３を優先的に破壊する一方でその他の広く散在するタンパク質チロシンキナーゼには実質的に影響しない免疫抑制剤として作用し得ることが以前は未知のもしくは認識されていなかった、所定のＭａｎｎｉｃｈ塩基化合物またはその他の化合物を用いるインビボおよびインビトロでの治療方法および試験方法が提供される。治療的に用いられる際、これらの薬剤はまた、今日使用されている従来の免疫抑制剤に付随する深刻な副作用を完全にまたは少なくともある程度回避する。かかる方法は、臓器移植拒絶を軽減する上で、自己免疫疾患、気道過敏症（例えば喘息）、アレルギーの寛解を促進する上で、ならびにＪａｋ３依存性の白血病およびリンパ腫の腫瘍の増殖、およびＪａｋ３を発現するリンパ系または骨髄系起源の細胞におけるその他のＪａｋ３依存性の異常を阻害する上で、臨床的に有用であると期待される。
【００１７】
したがって、本発明のいくつかの実施態様においては、Ｔリンパ球、単球、または樹状細胞のようなリンパ系または骨髄系の細胞がＪａｋ３を有するかまたは発現する、リンパ系または骨髄系の細胞の増殖および／または活性を阻害するインビトロの方法が提供される。方法は、Ｊａｋ３を選択的に阻害し得る化合物の存在下で細胞を培養する工程を有する。いくつかの実施態様においては、下記の式（Ｉ）を有する化合物が用いられる。
【００１８】
ここでＲ１は、Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＨ２ＳＣ６Ｈ５、ＣＨ２ＳＣＨ２−（４−Ｃ６Ｈ４ＯＣＨ３）、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２であり；Ｒ２は、Ｏであり；およびＲ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、およびＣＨ２−（Ｎ−モルフィル）である。好ましい実施態様においては、化合物は式（Ｉ）を有する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）であり、Ｒ１およびＲ３はそれぞれＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である。別の好ましい実施態様においては、化合物は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のメソの立体異性体の形態であり、ＷＰ９３８として示される。
【００１９】
所定の実施態様においては、Ｊａｋ３を発現するリンパ系または骨髄系の細胞を、前記Ｊａｋ３の活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物または前記化合物の塩に接触させる工程を有する、リンパ系または骨髄系の細胞の機能および／または増殖を阻害する方法が提供される。
【００２０】
ここでｎは１、２、３、４、または６であり；Ｒ１は、Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；Ｒ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００２１】
所定の実施態様においては、Ｊａｋ３を発現するリンパ系または骨髄系の細胞を、前記Ｊａｋ３の活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式（ＩＩＩ）の少なくとも１つの化合物または前記化合物の塩に接触する工程を有する、リンパ系または骨髄系の細胞の機能および／または増殖を阻害する方法が提供される。
【００２２】
ここでｎは１または２であり；Ｒ１は、Ｈ、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；Ｒ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００２３】
上述のような、リンパ系の細胞の機能および／または増殖を阻害する方法のいくつかの実施態様において、リンパ系の細胞は活性化Ｔ細胞であり、方法は細胞分裂がブロックされるようにシグナル３経路を干渉する工程を有する。いくつかの実施態様においては、リンパ系の細胞は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を選択的に阻害するのに有効、かつその他のタンパク質チロシンキナーゼの活性を阻害するのに実質的に無効な濃度において、化合物に接触される。いくつかの実施態様においては、Ｊａｋ３活性は、キナーゼアッセイにおいて、Ｔ細胞のようなリンパ球の集団のＪａｋ２活性よりも少なくとも５０倍多く阻害される。いくつかの実施態様においては、方法は、ＩＬ２により活性化されたＪａｋ３およびＳｔａｔ５ａ／ｂを阻害するのに十分な濃度において、プロラクチン（ＰＲＬ）によってＪａｋ２およびＳｔａｔ５ａ／ｂ活性化が阻害される可能性がないかまたは小さい１つ以上の化合物を選択する工程を有する。
【００２４】
本発明のさらに他の実施態様においては、治療的な免疫抑制剤として有用な物質を同定することを補助するインビトロの試験方法が提供される。かかる方法は以下の工程を有する。（ａ）細胞培養培地中に静止状態のＪａｋ３依存性Ｔリンパ球の集団を獲得する工程；（ｂ）随意に、静止状態のＴリンパ球を、リンパ球が増殖することを刺激するために、サイトカインで前処理する工程；（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）からの静止状態のまたは刺激されたリンパ球を、前述のような、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を有する化合物またはそれらの塩で処置する工程；（ｄ）工程（ｃ）からのリンパ球を、細胞増殖を促進する条件下で培養する工程；（ｅ）工程（ｄ）後の細胞増殖の程度を評価する工程；（ｆ）随意に、Ｊａｋ２依存性Ｔリンパ球増殖に対する前記化合物の阻害効果を評価する工程；（ｇ）随意に、前記化合物の細胞傷害性を評価する工程；（ｈ）工程（ｅ）からの、ならびに、存在する場合は、工程（ｆ）および（ｇ）からの評価によって、化合物の細胞傷害性に起因しないＪａｋ３依存性リンパ球、またはその他のＪａｋ３を発現する細胞型の増殖の有意な阻害が、インビボの治療的使用のための候補薬物としての、Ｔ細胞媒介性の免疫抑制剤としての、および／またはＴ細胞増殖のインヒビターとしての潜在性をその化合物が有することを示唆すると判断する工程；および（ｉ）随意に、工程（ｅ）および（ｆ）からの評価を比較し、工程（ｆ）において評価される阻害効果が工程（ｅ）において評価される阻害効果よりも小さい場合は、前記化合物がＪａｋ２活性、または別のキナーゼを阻害することに比較して、Ｊａｋ３活性を阻害することに少なくともある程度選択的であることを前記比較から判断する工程。
【００２５】
本発明の別の実施態様によれば、哺乳動物被験体において細胞の望ましくない機能を抑制するインビボの方法が提供され、細胞はＪａｋ３を有する。方法は、細胞を、上述の式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を有する化合物のうちの少なくとも１つ、またはその代謝物もしくは誘導体に、細胞におけるシグナル３経路を干渉し、それによって細胞機能を阻害するのに有効な量において、接触させる工程を有する。接触させる工程は、かかる化合物の少なくとも１つ、または活性な代謝物のような化合物の成熟型、または被験体の身体内において前記化合物に転換され得る前記化合物の前駆体、またはそれらのうちのいずれかの薬学的に受容可能な塩を、薬学的に受容可能なキャリア中に含む、治療的に有効な量の薬学的組成物を被験体に投与して、Ｊａｋ３依存性の細胞機能を阻害する工程を有する。投与する工程は継続的または周期的に行われる。いくつかの実施態様においては、Ｊａｋ３を有する細胞はＴ細胞であり、投与される薬学的組成物の量はＴ細胞における細胞分裂をブロックするのに有効である。所定の好ましい実施態様においては、化合物、代謝物、誘導体、または前駆体の腎臓毒性はシクロスポリンＡの腎臓毒性よりも小さい。
【００２６】
本発明の所定の実施態様によれば、望ましくない免疫応答を抑制するために哺乳動物被験体を治療的に処置する方法が提供される。ここで被験体は望ましくない免疫応答を経験しているかまたは経験する危険性がある。この方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制する上述の方法を行う工程を有する。ここで治療的に有効な量の薬学的組成物は前記望ましくない免疫応答を軽減または防止する。所定の実施態様においては、方法はさらに、Ｊａｋ３インヒビターの他の免疫抑制剤；例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６、の治療的に有効な量を被験体に投与する工程を有する。このことは、シグナル１経路を介してＴ細胞をブロックすることにより、およびまたシグナル３経路を干渉することを介して活性化Ｔ細胞の細胞分裂をブロックすることにより、Ｔ細胞機能を阻害する利点を提供する。
【００２７】
本発明の所定の実施態様によれば、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、移植される臓器に対するＴ細胞媒介性の免疫応答を抑制するのに有効な上述の方法を行い、それによって臓器の拒絶が軽減または停止される工程を有する、哺乳動物移植片レシピエントにおける臓器移植拒絶を軽減する方法が提供される。
【００２８】
本発明の所定の実施態様によれば、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性の抗同種移植片免疫応答を抑制するのに有効な上述の方法を行い、それによって同種移植片の急性の拒絶が軽減または防止される工程を有する、哺乳動物同種移植片レシピエントにおける急性の同種移植片拒絶を軽減する方法が提供される。いくつかの実施態様においては、Ｊａｋ３インヒビター組成物の継続的なまたは周期的な投与を有する、慢性の同種移植片拒絶予防のための方法が提供される。
【００２９】
本発明の所定の実施態様によれば、哺乳動物移植片レシピエントにおいて移植寛容を誘導するための方法が提供される。方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性の移植片拒絶応答を抑制するのに有効な、上記の方法を行う工程を有する。
【００３０】
本発明の所定の実施態様によれば、自己免疫疾患の寛解を、前記疾患を被る哺乳動物被験体において促進する方法が提供される。方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、前記被験体におけるＴ細胞媒介性の自己免疫応答を抑制するのに有効な、上述の方法を行う工程を有し、それによって内因性のＪａｋ３依存性Ｔ細胞によって媒介される被験体のネイティブな組織に対する自己免疫攻撃が減少または停止される。
【００３１】
本発明の所定の実施態様によれば、気道過敏症を、前記過敏症を被る哺乳動物被験体において軽減する方法が提供される。方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性の過敏症応答を抑制するのに有効な、上述の方法を行う工程を有し、それによって被験体における気道組織の過敏症が減少または停止される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施態様は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性のアレルギー応答を抑制するのに有効な、上述の方法を行う工程を有し、アレルギーを、前記アレルギーを被る哺乳動物被験体において軽減する方法が提供される。それによって被験体におけるアレルギー反応が減少または停止される。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様は、白血病またはリンパ腫を被る哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制する上述の方法を行う工程を有し、Ｊａｋ３依存性の白血病またはリンパ腫の増殖を阻害する方法を提供する。好ましい実施態様においては、化合物またはその代謝物もしくは誘導体は、その他のキナーゼ（例えば、Ｊａｋ２）の活性の阻害に比較して、Ｊａｋ３活性を選択的にまたは特異的に阻害し得る。薬学的組成物の量は、白血病またはリンパ腫の細胞の増殖を阻害またはブロックするのに有効である。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様においては、Ｔ細胞媒介性の免疫応答に関連する生物学的なプロセスを解明するために、および新規な免疫抑制薬物を同定するために有用なインビトロの方法が提供される。いくつかの実施態様においては、以下の工程を有する、新規な免疫抑制薬物を同定することを補助するインビトロの方法が提供される。（ａ）Ｊａｋ３を有するＴ細胞を目的の化合物にある濃度の範囲にわたって接触させて、化合物が範囲内の１つ以上の濃度においてＪａｋ３活性を阻害するか否かを判断することによって、Ｔ細胞機能を破壊するための活性について目的の化合物を試験する工程；（ｂ）目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、既知のＪａｋ３阻害活性を有する式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の化合物、好ましくは６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のＪａｋ３阻害活性とを比較する工程；ならびに（ｃ）かかる試験および比較の結果を使用して、目的の化合物が治療的な免疫抑制剤としてインビボで使用するための候補薬物であるか否かを判断する工程。いくつかの実施態様においては、方法はまた、（ｄ）目的の化合物を１つ以上のその他のキナーゼ（たとえば、Ｊａｋ２）の阻害活性について試験する工程；（ｅ）目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、もしあれば１つ以上のその他のキナーゼのその阻害活性とを比較する工程；および（ｆ）比較を使用して、目的の化合物を選択的なＪａｋ３インヒビターとして同定する工程も有する。
【００３５】
本発明の別の実施態様においては、所定のＪａｋ３選択的または特異的なインヒビターを用いるインビボの試験方法が提供される。かかる方法は、動物モデルにおいてＴ細胞媒介性の免疫応答を研究するために有用であり、ならびに６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）、ＷＰ９３８、および図１４Ｂ〜３９Ｂにおいて同定されるその他の化合物のような化合物は、候補Ｊａｋ３特異的インヒビターの活性を比較するための標準として作用する。候補免疫抑制薬物を同種移植片生存に対するこの効果について試験するためのかかる方法の１つは、以下の工程を有する：（ａ）適切なドナー動物から採取された同種移植片を、適切なレシピエント動物に移植する工程；（ｂ）動物についての基本栄養素および健康促進条件を維持する工程；（ｃ）候補薬物を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、処置されたレシピエントまたは群を提供する工程；（ｄ）請求項１において規定されるような化合物を少なくとも１つの動物に投与してポジティブコントロール群として作用させる工程であって、Ｒ１およびＲ３はそれぞれＣＮ（ＣＨ３）２であり、ならびにＲ２はＯである工程；（ｅ）随意に、少なくとも１つのレシピエント動物を未処置のままにして未処置のコントロールレシピエントまたは群として作用させる工程；（ｆ）各レシピエントにおける各同種移植片の同種移植片生存時間を判断する工程；（ｇ）各同種移植片の組織学的検査を行い、必要に応じて、各同種移植片に対する候補薬物関連性の構造的損傷を評価する工程；（ｈ）各同種移植片において、同種移植片生存時間および候補薬物誘導性の組織学的構造変化を比較する工程；ならびに（ｉ）（ｈ）からの比較を使用することで、未処置のコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、またはポジティブコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、エンハンスされた移植片生存時間および薬物処置された同種移植片に対する薬物誘導性の構造的損傷の欠如が、候補薬物が免疫抑制剤としてインビボで治療的に使用される場合に有効である可能性が高いことを標示していると判断する工程。いくつかの実施態様においては、方法はまた、候補薬物が、Ｊａｋ３依存性のＴ細胞増殖をインビトロで選択的に阻害し得ると判断する工程も有する。
【００３６】
所定の他の実施態様においては、インビボの免疫抑制の潜在性について候補薬物を評価するインビボの方法が提供される。候補薬物は好ましくは、先ずＪａｋ３依存性Ｔ細胞増殖をインビトロで選択的に阻害し得るとして同定される。方法は、以下の工程を有する。（ａ）適切なドナー哺乳動物から採取された同種移植片を、適切なレシピエント動物に移植する工程；（ｂ）動物についての基本栄養素および健康促進条件を維持する工程；（ｃ）候補薬物を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、処置されたレシピエントまたは群を提供する工程；（ｄ）６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、標準レシピエントまたは群として作用させる工程；（ｅ）好ましくは、少なくとも１つのレシピエント動物を未処置のままにして未処置のコントロールレシピエントまたは群として作用させる工程；（ｆ）各レシピエントにおける各同種移植片の同種移植片生存時間を判断する工程；（ｇ）各同種移植片の組織学的検査を行い、必要に応じて、各同種移植片に対する薬物関連性の構造的損傷を評価する工程；ならびに（ｈ）各同種移植片において、同種移植片生存時間および薬物誘導性の組織学的構造変化を比較する工程；ならびに（ｉ）（ｈ）からの比較を使用することで、未処置のコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、またはポジティブコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、エンハンスされた移植片生存時間および薬物処置された同種移植片に対する薬物誘導性の構造的損傷の欠如が、候補薬物が免疫抑制剤としてインビボで治療的に使用される場合に有効である可能性が高いことを標示していると判断する工程。本発明のこれらのおよびその他の実施態様、特徴、および利点は、以下の記載および図面を参照して明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書中に記載される研究において、生化学的中間体−酵素Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）が成熟Ｔ細胞の活性化、機能、および同種移植片拒絶にとって重要であることが確認される。本明細書中で同定される所定の化合物、特にＭａｎｎｉｃｈ塩基として分類される化合物は、選択的にＪａｋ３を阻害し、ＣｓＡ、ＦＫ５０６、およびＲＡＰＡのような従来の免疫抑制薬物を越える治療的利点を提供し得る。上述の背景のセクションに記載されたように、ＲＡＰＡはｍＴＯＲを阻害する一方、ＣｓＡおよびＦＫ５０６はＣａＮをブロックし、これらの標的分子の両方とも、遍在的な発現プロフィールを示し、強力な毒性副作用を引き起こす。それとは対照的に、Ｊａｋ３発現は、ＴおよびＢリンパ球を含むリンパ系区分に排他的に制限される。
【００３８】
最初に、Ｊａｋ３のアンタゴニストを同定および特徴づけを目指して一連の試験が行われた。それによって、Ｊａｋ３のアンタゴニストはＴＣＧＦ依存性経路のファミリー全体を阻害する。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基およびその他の化合物の群が、ある濃度の範囲にわたって、選択的なＪａｋ３阻害活性についてスクリーニングされた。プロラクチン（ＰＲＬ）刺激された（すなわち、Ｊａｋ２依存性の）Ｔ細胞増殖に比較して、ＩＬ−２刺激された（すなわち、Ｊａｋ３依存性の）Ｔ細胞増殖の選択的な阻害のいくつかの基準を示した化合物は、構造的に類似するいくつかの化合物とともに、図１４Ｂ〜３９Ｂに、それらの構造式により示される。各化合物の対応する阻害活性は、図１４Ａ〜３９Ａに示される。図２２Ａは、図２１Ａのアッセイに類似するアッセイの結果を示すが、図２１Ｂと同じ化合物の僅かに異なる純度の調製物を伴う。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基に加えて、構造的に類似の化合物（図２５Ｂおよび２６Ｂ）が、試験された化合物の中に含まれる。以下の材料および一般的な方法が、実施例においてそうではないと記載された場合を除いて使用された。代表的な化合物、６４９６４１Ｐはまた、ＮＣＩ薬物データベース番号ＮＣ１１５３によって本明細書中で参照され、および図１８Ｂに示されるメソの立体異性体（ＷＰ９３８と称される）は、同一の選択的なＪａｋ３阻害をインビトロで示し、単独でまたはＣｓＡと組合わせて同種移植片生存を延長する能力について、ならびに薬物誘導性の毒性についてさらに試験された。
【００３９】
［一般的な方法および材料］
［細胞培養および処置］
ラットＴ細胞株Ｎｂ２−１１ｃは、元来Ｐｅｔｅｒ Ｇｏｕｔ博士（Ｖａｎｖｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）によって開発され、１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、カタログ番号１０２０−９０）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、およびペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、５０ＩＵ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）を伴うＲＰＭＩ−１６４０中で、３７℃／５％ ＣＯ２にて増殖された。等遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）；ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）によって精製された、新鮮に外殖された正常なヒトＴリンパ球は、以前に記載されるように２３、７２時間、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）活性化された。Ｔリンパ球は、洗浄し、サイトカインへの曝露の前に、１％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間インキュベートすることによって、静止状態にされた。次に、細胞は図面の説明において以下に記載されるように、種々の濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置された。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ＪｏｎａｔｈａｎＤｉｍｍｏｃｋ 博士 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ、Ｃａｎａｄａにより快く提供された。次いで、全ての細胞は１ｎＭ組換えヒトＩＬ−２（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｂａｓａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＩＬ−４もしくはＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎ ａｎｄ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ、ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅｓａｓｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって供給されたヒツジプロラクチン（ＰＲＬ）で、３７℃にて刺激された。細胞ペレットは−７０℃にて凍結された。
【００４０】
［増殖アッセイ］
静止状態ヒト１次Ｔ細胞、ＹＴ、またはラットＮｂ２−１１ｃ Ｔ細胞（５．０×１０４／ウェル）が、１ｎＭ ＩＬ−２、−４、−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）またはＰＲＬの不在下または存在下、２００μｌの静止状態の培地中、平底の、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて播種された。次に、細胞は、Ｍａｎｎｉｃｈ塩基薬物で１６時間処置され、次いで４時間、［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／２００μｌ）でパルスされ、そして線維ガラスフィルター上に採集された。［３Ｈ］−チミジン取り込みは、以前に記載されるように２３、液体シンチレーション計測によって、または当該分野において周知である標準的な技術を使用して、分析された。
【００４１】
［膜タンパク質の可溶化、免疫沈降、およびウェスタンブロット分析］
凍結された細胞ペレットは、以前に記載されるように１６、氷上で解凍され、そして１％ ＴＸ−１００溶解緩衝液（１０８細胞／ｍｌ）中で可溶化され、そして遠心分離によって分類された。ヒトＴ細胞に対しては、上清は、Ｊａｋ３の固有ＣＯＯＨ末端（アミノ酸［ａ．ａ］１１０４〜１１２４）、ヒトＳｔａｔ５ａ（ａ．ａ７７５〜７９４）のカルボキシル末端、またはＳｔａｔ５ｂ（ａ．ａ７７７〜７８７）のカルボキシル末端２６のいずれかに由来するペプチドに対して産生された５μｌ／ｍｌポリクローナルウサギ抗血清とともに、２時間、４℃にて、上下回転してインキュベートされた。Ａｂおよび免疫沈降されたタンパク質が、プロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）との３０分間のインキュベーションにより捕獲され、精製のために沈降され、そして２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８中の２０％ グリセロール、１０％ ２−メルカプトエタノール、４．６％ ＳＤＳ、０．００４％ ブロモフェノールブルー）中で４分間煮沸することによって溶出された。ホスホＭａｐｋアッセイに対しては、約２５μｇの全細胞可溶化物がＳＤＳサンプル緩衝液中に解離され、そして還元条件下、１０％（ほかの全ては７．５％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された。タンパク質は、以前に記載されるように２７、二フッ化ポリビニリデン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）；カタログ番号１ＰＶＨ０００１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）にトランスファーされた。ウェスタンブロット分析が、ｐＡｂ、マウス抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ｍＡｂ；ＵＢＩ；４Ｇ１０；カタログ番号０５〜３２１、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）または、ホスホ ｐ４４／４２ Ｍａｐｋ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、カタログ番号９１０１）を用いて行われた。上述の抗体、ウサギ抗ホスホ−Ｅｒｋ１／２、およびモノクローナルｐａｎ−Ｅｒｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号Ｅ１７１２０）でウェスタンされたブロットは、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈され、そして以前に記載されるように２７、または当該分野において周知である標準的な技術を用いて使用された。ウサギ抗ホスホ−チロシン（□ＰＹ）、およびモノクローナルマウス抗−Ｆｙｎ、または抗−Ｌｃｋ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号６１０１６３［Ｆｙｎ］および６１００９７［Ｌｃｋ］）でウェスタンされたブロットは、以前に記載されるように２７、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈された。
【００４２】
［ラット腎臓移植］
Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得られた成体雄性ＡＣＩ（ＲＴ１ａ）およびＬｅｗｉｓ（ＬＥＷ；ＲＴ１１）ラット（１６０〜２００ｇ）は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って飼育された。ラットは、光および温度制御された部屋で飼育され、そして食事および水が適宜与えられた。腎臓は、ＯｎｏおよびＬｉｎｄｓｅｙ２８の標準的な超微細手術を使用して、ＬＥＷドナーからＡＣＩレシピエントに異種局所的に移植された。免疫抑制薬物の評価に対しては、移植片レシピエントは、毎日の静脈内（ｉ．ｖ．）注射または経口強制飼養（ｐ．ｏ．）によって、Ｍａｎｎｉｃｈ塩基化合物を、単独で、または経口強制飼養により毎日投与されるＣｓＡもしくはＲＡＰＡと組合わせて与えて処置された。レシピエントのコントロール群は未処置のままであった。いくつかのレシピエントは、ＣｓＡまたはＲＡＰＡ単独で処置された。移植片生存時間は、腎臓移植片を支持する動物の生命の生存として規定された。結果は、平均生存時間（ＭＳＴ）±標準偏差（ＳＤ）として表され、Ｇｅｈａｎ生存検定により統計学的有意性について評価された。さらに、Ｍａｎｎｉｃｈ塩基と、ＣｓＡまたはＲＡＰＡとの間の相互作用が、５０％有効分析２９、３０によって評価された。コンピューターソフトウェアが、組合わせ指標（ＣＩ）値を算定するために使用され：ＣＩ＜１は相乗的な相互作用、ＣＩ＞１は拮抗的な相互作用、またはＣＩ＝１は相加的な相互作用を示した３０。
【００４３】
［組織病理学的評価］
ＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＩ（ＲＴ１ａ）レシピエントは、以下に続く実施例において記載されるように処置された。移植後７日目に、腎臓同種移植片がＢｏｕｉｎ´ｓ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｐｏｌｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒ＆Ｄ Ｃｏｒｐ．、Ｂａｙ Ｓｈｏｒｅ、ＮＹ）に置かれた。各腎臓は、単回の水平切開、続く３つの連続的な切開からなる同一の方法で切り取られて、スライドを作成するために使用された。次に、別の切開が行われ、続いてさらに３つの連続的な切片およびスライドが作成された。腎臓当たり合計１２個のスライドが、以前に記載されるように３１、または当該分野において周知である標準的な技術を使用して、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。拒絶の程度は、Ｈｅｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎによって確立された基準３２に従って分類された。特に、腎臓は、緩衝化１０％ホルマリン中に固定化されて一晩処理され；３−□組織学的切片は、漸進性のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）試薬で染色された。２つの独立した病理学者が、複数の腎臓切片における血管障害、糸球体の変化、および尿細管間質障害の程度を評価するために、光学顕微鏡基準の半定量スケールを使用した。尿細管および糸球体の変化は、別々に、０＝変化なし；１＋＝＜５％；２＋＝５〜２５％；３＋＝２６〜５０％；および４＋＝＞５０％関与として分類された。類似の血管スケールは、０＝なし；１＋＝最小；２＋＝軽度；３＋＝中程度；および４＋＝重篤を含んだ。
【００４４】
［ＥＭＳＡ］電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。
薬物またはベヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で処置された細胞は、遠心分離（２０，０００×ｇ、１分間、４℃にて）によりペレット化され、そして続いて５容量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＰＭＳＦ、５□ｇ／ｍｌアプロチニン、１□ｇ／ｍｌペプスタチンＡ、および２□ｇ／ｍｌロイペプチン中で洗浄され、遠心分離され、次いで１％ ＮＰ−４０が補充された同じ緩衝液中に溶解され、そして２０分間氷上でインキュベートされた。核を含むペレットは、等容量の低塩緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼインヒビター）および高塩緩衝液（８００ｍＭ ＫＣｌを含む低塩緩衝液）中に再懸濁された。次いで、この画分は４℃にて１０分間の遠心分離によって単離され、そして上清は核タンパク質抽出物として保存され、そして−７０℃で貯蔵された。ゲル移動度シフトアッセイが、Ｓｔａｔ５ａ／ｂ ＤＮＡ結合活性を検出するために、□−カゼイン遺伝子のプロモーター（５´−ＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣ−３´）またはＮＦ−ｋＢ結合エレメント（５´−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣ−３´）に対応するＳｔａｔ５ＤＮＡ結合配列を使用して行われた。両方のプローブは、［３２Ｐ］ｄＡＴＰで末端標識化された。次いで、標識化オリゴヌクレオチドは、１５□ｌの結合カクテル（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、５０％ グリセロール）中、４℃にて２時間、５□ｇの核抽出されたタンパク質とともにインキュベートされた。スーパーシフトアッセイについて、核抽出物は、１□ｇの正常なウサギ血清またはＳｔａｔ５ａ、Ｓｔａｔ５ｂ、もしくはｐ５０／ｐ６５ ＮＦ□Ｂに特異的な抗血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ；それぞれ、カタログ番号ｓｃ−１１９０Ｘおよびｓｃ−３７２Ｘ）のいずれかとともに、４℃にて１時間、説明書において示されるように、予めインキュベートされ、次いで［３２Ｐ］−標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチドとともに、１５分間室温でインキュベートされた。ＤＮＡ−タンパク質複合体は、０．２５×ＴＢＥ緩衝液中で、１時間、１００Ｖにて予め泳動された、０．２５×ＴＢＥを含む５％ポリアクリルアミドゲル上で分解された。サンプルはロードされ、そしてゲルは室温で約２時間、１５０Ｖにて泳動され、次いで減圧下で過熱することによって乾燥され、そしてＸ線フィルム（Ｘ−Ｏｍａｔ、Ｋｏｄａｋ）に、−７０℃にて露光された。
【００４５】
［Ｍａｎｎｉｃｈ塩基およびその他の化合物］
最初の研究において使用された化合物６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｒｃｈｅｗａｎ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、ＣａｎａｄａのＪｏｎａｔｈａｎ Ｒ．Ｄｉｍｍｏｃｋ博士から提供された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）および図１４Ｂ〜３９Ｂにおいて同定される化合物を含むその他の化合物は、ｔｈｅ Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴｅｘａｓのＷａｌｄｅｍａｒ Ｐｒｉｅｂｅ博士によって調製された。本明細書中に記載される化合物は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のようなサプライヤーから入手可能な市販の出発物質および試薬によって調製され得る。Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ´ｓ ＲＥＡＧＥＮＴ ＦＯＲ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＥＳＩＳ、第１〜１７巻（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９１）；Ｒｏｄｄ´ｓ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＣＡＲＢＯＮ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ、第１〜５巻およびその増刊（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８９）；ＯＲＧＡＮＩＣ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ、第１〜４０巻（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９１）、Ｍａｒｃｈ´ｓ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第４版）、およびＬａｒｏｃｋ´ｓ ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．、１９８９）のような参考文献において記載されるように、標準的な化学合成技術および手順が用いられ得る。化合物を合成するためのさらなる手引きは、定期刊行物、例えば、Ｄｉｍｍｏｃｋ３４、３５の出版物において、および以下に記載されるように、見出され得る。
【００４６】
以下の制限されない例は、代表的なＪａｋ３選択的インヒビター化合物の特徴および使用の説明であり、および本発明をいかようにも制限することを意味するものではない。
【００４７】
［実施例１．Ｍａｎｎｉｃｈ塩基６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のインビトロでの効果］
６４９６４１Ｐ（Ｃ１８Ｈ３８Ｃ１２Ｎ２Ｏ；分子量３６９．４１）と示されるＭａｎｎｉｃｈ塩基はまたＮＣ１１５３として、その立体異性体の混合物として参照され、以下の一般式を有するが、
Ｊａｋ３対Ｊａｋ２依存性の増殖を受けるＴ細胞に添加されて、上述のように、Ｊａｋ３を選択的に阻害するその能力が試験された。図１Ａは、γｃ／Ｊａｋ３−依存性のＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示すグラフである。静止状態のＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞（５．０×１０４細胞／ウェル）は、１ｎＭヒトＩＬ−２（■）、ＩＬ−４（●）、またはＩＬ−７（▲）の存在下または不在下で、漸増濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（縦座標）とともに、１６時間３７℃にて培養された。次いで細胞は、［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／２００μｌ）で４時間パルスされ、そして取り込まれた放射標識化プローブが横座標上にプロットされ、ＤＭＳＯ処置されたサンプルセット（ｎ＝６）からの全ｃｐｍの阻害％として表された。
【００４８】
図１Ｂは、Ｊａｋ２活性化因子（プロラクチン；ＰＲＬ［○］）またはＪａｋ３活性化因子〈インターロイキン−２；ＩＬ−２［■］〉の存在下で培養されたＴ細胞の増殖に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示す。ラットＴ細胞株（Ｎｂ２−１１ｃ）が選択されたのは、それがＰＲＬ／Ｊａｋ２またはＩＬ−２／Ｊａｋ３刺激のいずれかに応答するからである。静止状態ラットＴ細胞（５．０×１０４細胞／ウェル）は、Ｊａｋ２活性化因子（１ｎＭ ＰＲＬ（［○］）またはＪａｋ３活性化因子（１ｎＭ ＩＬ−２［■］）の存在下、漸増濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（縦軸；０〜１００μＭ）とともに、１６時間３７℃にて培養された。細胞は、アッセイの最後の４時間、［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／２００μｌ）でパルスされ、次いでＤＮＡが取り込まれた放射標識化プローブが横軸上にプロットされ、ＤＭＳＯ処置されたサンプルセット（ｎ＝４）からの全ｃｐｍの阻害％として表された。図１Ａ〜Ｂに示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、γｃ／Ｊａｋ３依存性の細胞増殖を選択的に阻害するが、ＰＲＬ／Ｊａｋ２依存性の細胞増殖は阻害しない。特に、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−７に応答してＮｂ２−１１ｃ細胞増殖を等しく有効に阻害することを証明したが、同化合物は、Ｊａｋ２依存性の増殖よりもＪａｋ３依存性の増殖を３倍有効に阻害した。
【００４９】
図２Ａ〜Ｃにおいては、Ｊａｋ３／Ｓｔａｔ５シグナル経路に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果が示される。ヒトＹＴ細胞は、上昇する濃度（１〜１００μＭ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を伴わないで（ａ〜ｂ）、または伴って（ｃ〜ｉ）、２時間培養され、そして１００ｎＭ ＩＬ−２を伴って（＋）または伴わないで（−）、１０分間再抗原投与された。細胞は、抗Ｊａｋ３ ｐＡｂで免疫沈降され、そして図２Ａ、上部パネルに示されるように、抗ホスホチロシンｍＡｂでウェスタンブロットされ、次いで剥離されて抗Ｊａｋ３で再ブロットされた（図２Ａ、下部パネル）。これらのウェスタンブロットの実験結果は、Ｊａｋ３のチロシンリン酸化が、ヒトＹＴ細胞（１〜１００μＭ）においては６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）によって用量依存的に阻害されており、図１Ａに示される結果と相関する。ここで図２Ｂを参照すると、ヒトＹＴ Ｔ細胞はまた、上昇する濃度（１〜１００μＭ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を伴わないで（ａ〜ｂ）、または伴って（ｃ〜ｉ）、２時間培養され、そして１００ｎＭ ＩＬ−２を伴って（＋）または伴わないで（−）、１０分間再抗原投与された。細胞は、抗Ｓｔａｔ５ａ ｐＡｂで免疫沈降され、そして抗ホスホチロシンｍＡｂでウェスタンブロットされ（図２Ｂ、上部パネル）、次いで剥離されてＳｔａｔ５ａで再ブロットされた（図２Ｂ、下部パネル）。第３の試験において、この結果は図２Ｃに示され、ヒトＹＴ細胞は、上昇する濃度（１〜１００μＭ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を伴わないで（ａ〜ｂ）、または伴って（ｃ〜ｉ）、１６時間培養され、そして１００ｎＭ ＩＬ−２を伴って（＋）または伴わないで（−）、１０分間再抗原投与された。細胞は、抗Ｓｔａｔ５ｂ ｐＡｂで免疫沈降され、そして抗ホスホチロシンｍＡｂでウェスタンブロットされ（図２Ｃ、上部パネル）、次いで剥離されて抗Ｓｔａｔ５ａで再ブロットされた（図２Ｃ、下部パネル）。
【００５０】
ＩＬ−２はまた、アダプタータンパク質、Ｓｈｃを介して、Ｓｈｃ／Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｅｒｋ経路を強力に活性化する。ＳｈｃはＩＬ−２Ｒβ鎖のＴｙｒ３３８に結合して、最終的にＴ細胞増殖を駆動する。図３は、上述の実験に類似する実験の結果を示し、ここではＩＬ−２媒介性のｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２リン酸化に対する上昇する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）濃度の効果が研究された。静止状態のＰＨＡ−活性化Ｔ細胞は、ＤＭＳＯ（コントロール；レーンａ〜ｂ）または漸増濃度（ｃ〜ｉ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で２時間処置され、次いで１μｇの存在下、３７℃にて１０分間刺激された。細胞は溶解され、そして全細胞可溶化物は、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ＰＶＤＦ膜上にトランスファーされ、抗−ホスホ−ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２でウェスタンブロットされ（上部パネル）、次いで剥離されてｐａｎ Ｅｒｋ抗体で再プローブされた（下部パネル）。矢印は、ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２の位置を示す。これらの結果は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が、ヒトＴ細胞においてＩＬ２媒介性のＥｒｋ１／２活性化をブロックすることを明らかにする。
【００５１】
ＹＴ細胞は、活性化ＦｙｎおよびＬｃｋキナーゼを恒常的に発現し、その活性化ＦｙｎおよびＬｃｋキナーゼは、ＹＴ細胞のチロシンリン酸化状態について試験することによって示され得る。ＹＴ細胞は、様々な濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（１〜１００□Ｍ）とともに２時間培養された。細胞抽出物は、抗Ｆｙｎまたは抗Ｌｃｋ抗体で免疫沈降され、そして抗ホスホチロシン抗体（□ＰＹ）でウェスタンブロットされ、次いで剥離されて抗Ｆｙｎまたは抗Ｌｃｋ抗体で再ブロットされた。図４は、上述の実験の結果を示す：ＹＴ細胞抽出物は、抗Ｆｙｎで免疫沈降され、そして抗ホスホチロシン抗体（□ＰＹ）でウェスタンブロットされ（第１列）、次いで剥離されて抗Ｆｙｎで再ブロットされ（第２列）；ＹＴ細胞は抗Ｌｃｋ抗体で免疫沈降（ＩＰ）されて抗ホスホチロシン抗体（□ＰＹ）でウェスタンブロットされ（第３列）、次いで剥離されて抗Ｌｃｋ抗体で再ブロットされた（第４列）。ＹＴ細胞はベヒクルのみとともに（レーンａおよびｂ）、または上昇する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）濃度（１〜１００□Ｍ）（レーンｃ〜ｉ）とともに培養された。これらの結果は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＦｙｎまたはＬｃｋキナーゼの活性をブロックしないことを示す。
【００５２】
上述の結果は、その他のインヒビターはＪａｋ３およびＪａｋ２の応答性細胞増殖を阻害する（約１０〜２５μＭのＩＣ５０）一方で、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は約２．５μＭのＩＣ５０を伴って細胞増殖を破壊することによってより有効であったことを示す。さらに、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＩＬ４またはＩＬ７駆動の細胞増殖を同じ濃度において有効に阻害した（約２．５□□のＩＣ５０）。この薬剤は、ホスホウェスタンブロットによって測定されたように、Ｊａｋ３およびその基質、すなわちＳｔａｔ５ａ／ｂ、アダプタータンパク質Ｓｈｃ、およびＥｒｋ１／２のチロシンリン酸化を阻害した。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、以前に記載された約１０□□のＩＣ５０を示すＰＮＵ１５６８０４ Ｊａｋ３インヒビターよりも有効であった。さらに、オリゴヌクレオチドプローブへのＳｔａｔ５ａ／ｂ ＤＮＡ結合は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）によって大きく損なわれるが、この化合物は、ＴＮＦ−□誘導性のＮＦ−ｋＢ ＤＮＡ結合に対してなんら効果がないので、この転写因子に特異的であった。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物は非Ｊａｋ３発現ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＤＮＡ合成も、ＴＣＲシグナル伝達中間体ＬｃｋおよびＦｙｎチロシンキナーゼの活性化も阻害しなかった。
【００５３】
［実施例２．同種移植片生存に対するＭａｎｎｉｃｈ塩基６４９４６１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果］
インビボでの効果を試験するために、腎臓同種移植片のレシピエントは、移植後即座に開始して７日間、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置された。ＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＩ（ＲＴ１ａ）レシピエントは、２．５、５．０、１０．０、または２０．０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を７日間毎日のｉ．ｖ．注射単独で、または２．５、５．０、１０．０、もしくは２０．０ｍｇ／ｋｇのＣｓＡの経口強制飼養と組合わせることによって、処置された。ｉ．ｖ．または経口強制飼養によって送達されて単独で与えられた６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、表１に示されるように、投薬量依存的にラット腎臓同種移植片生存を延長した。８０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）ｐ．ｏ．は、ｉ．ｖ．注射された１０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）と類似の生存を生じたので、経口の生物学的利用能は、約１２．５％であると見積もられる。平均生存時間（ＭＳＴ）およびＳＤは、５〜６の実験から各群について算出された。組合わせ指標（ＣＩ）値は、５０％有効分析によって算出された（ＣＩ＜１は相乗的な相互作用、ＣＩ＞１は拮抗的な相互作用、およびＣＩ＝１は相加的な相互作用を示す）２９、３０。
【００５４】
経口強制飼養によって投与された、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の単独の、またはＣｓＡと組合わせた腎臓同種移植片生存に対する効果は、表２に示される。ＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＴ（ＲＴ１ａ）レシピエントは、４０、８０、または１６０ｍｇ／ｋｇ／ｄの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の７日間の経口強制飼養によって、単独で、または２．５、５．０、１０．０、または２０．０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＣｓＡの経口強制飼養と組合わせて、１日１回処置された。ＭＳＴおよびＳＤは、５〜６実験から各群について算出された。組合わせ指標（ＣＩ）値が算出された。
【００５５】
ＭＳＴ±ＳＤに係る表２に示される結果は、Ｇｅｈａｎ生存検定によって統計学的有意性について評価された。
【００５６】
結果に対して算出された組合わせ指標（ＣＩ）値対ＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）比は表１に示され、そしてこれらのデータは図５に示されるようにグラフ化された。ＣｓＡの経口の生物学的利用能が９０％であることを考慮して、４：１、３：１、２：１、および１．５：１のＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）比（ＣＩ＝０．１〜０．２７）は、１：１、１：２、または１：４のＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）比（ＣＩ＝０．３８〜０．６０）に比較して、より良好な相乗作用を示した。５０％有効分析および組合わせ指標（ＣＩ）値が、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）とＣｓＡとの間の相互作用の質を算出するために使用された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）およびＣｓＡの組合わせは、ＣＩ値（０．６〜０．１；図５）によって確認されるように、相乗的であり；１：２〜１：４の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）／ＣｓＡ比は最も有効であった（ＣＩ＝０．１〜０．２７；表１）。
【００５７】
結果をまとめると、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は腎臓同種移植片生存の用量依存性の延長を示し：７日間ｉ．ｖ．送達された２０ｍｇ／ｋｇ／日の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の投薬量は、２４．８±６．６日の（ｐ＝０．００００３：未処置コントロール；ＭＳＴ＝８．８±０．５日）、７または１４日間経口送達された２４０ｍｇ／ｋｇ／日の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、４７．８±１９．５９日または＞６０日（両方ともｐ＜０．００００１）のＭＳＴを生じた。ＣｓＡ単独（２．５、５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、３日間）での処置は、用量依存性の効果を生じ、最も高い用量にて、２４．５０±４．５８日のＭＳＴを達成する（ｐ＜０．０００１）。組合わせの処置は、各試薬での単剤治療と比較して、移植片生存における強力な相乗的相互作用を明らかにした。例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ／日の７日間の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独のｉ．ｖ．投与は、９．５±１．４日のＭＳＴを生じ、３日間の１０ｍｇ／ｋｇ／日のＣｓＡ単独の静脈内投与は、２１．２±５．３日のＭＳＴを生じるが、２つの薬物の組合わせは生存を４１．４±９．８日に延長した（ｐ＝０．００００２）。最も良好な結果は、４：１および２：１の６４９６４１Ｐ：ＣｓＡ投薬量比で観察され、それぞれ０．１１および０．２７のＣＩ値を生じた。新規なおよび選択的なＪａｋ３インヒビター、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、腎臓同種移植モデルにおいてインビボで免疫抑制的であり、そしてＣｓＡと組合わせて顕著な相乗的効果を発揮することが同定された。
【００５８】
［実施例３．腎臓毒性についての６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の評価］
組織学的検査のために、組織がＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＩ（ＲＴ１ａ）レシピエントから得られ、これは以下のように処置された；７日間低塩食餌におかれたレシピエントは１４日間：ｉ．ｖ．送達された１０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）；ｉ．ｖ．送達された０．１６ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡ；ｐ．ｏ．送達された１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡ；１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡｐ．ｏ．と０．１６ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡｉ．ｖ．との組み合わせ；または１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡ ｐ．ｏ．と１０ｍｇ／ｋｇ ６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）ｉ．ｖ．との組み合わせ、で処置された。１４日目にラットは屠殺され、そして組織学が、標準的な方法に従うＨ＆Ｅ染色を使用して腎臓に対して行われた。図６Ａ〜Ｅにおける顕微鏡写真は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独の、またはＣｓＡと組合わせた、腎臓構造に対する効果を示す。全ての写真は、同じ２００×倍率にて示される。類似の結果が１群あたり５匹のラットにおいて観察された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（図６Ａ）もＲＡＰＡ単独（図６Ｂ）も、腎臓において有意な変化をなんら示さなかった。それとは対照的に、ＣｓＡ単独（図６Ｃ）は、空胞形成および萎縮によって可視化されるように、３０％の細管において障害を引き起こした。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ（ＳＲＬ）群は、萎縮および濃縮した核を伴って、９０％の細管において大規模な空胞形成を示した（図６Ｄ）。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ群と対照的に、ＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の組合わせで処置されたラットからの腎臓は、ＣｓＡ単独の群において観察された変化に類似する変化を示した（図６Ｅ）。簡潔には、６４９６４１もＲＡＰＡ単独のいずれも、腎臓毒性を引き起こさなかった。しかし、ＣｓＡ単独は腎臓毒性であり、そしてこの効果は、ＲＡＰＡとともに増強され、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）では増強されなかった。
【００５９】
上述の組織学的研究に加えて、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）処置された動物はまた、ＳＲＬと典型的に関連する毒性のタイプについても評価された。この研究においては、動物の処置は６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独またはＣｓＡとの組合わせを含んだ。Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットは、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ ｉ．ｖ．または強制飼養あたり４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）もしくはＳＲＬ（強制飼養あたり１．６ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を単独で、またはＣｓＡ（強制飼養あたり１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）と組合わせて受けた。慢性的な腎臓毒性を評価するための塩類の欠乏（０．０５％ ＮａＣｌ）、または脂質補充（１７．７％トリグリセリド、５．０２％コレステロール）のいずれかによる７日間の食餌前処理後、ラットの群は、７、１４、または２８日間の処置過程（ｎ＝６／薬物／持続時間）を受けた。クレアチニンクリアランス（ＣｒＣＬ）における差異；総密度、低密度、および高密度（ＨＤＬ）コレステロール（ＣＨＯＬ）画分；トリグリセリド（ＴＧ）；骨髄細胞密度；抹消血計数（ＰＢＣ）；および血液の化学的性質が、Ｆｉｓｈｅｒのｔ検定によって評価された。
【００６０】
この研究の結果は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が体重増加（ｐ＝０．０００２）を引き起こし、そしてＣｓＡまたはＳＲＬによって生じる体重減少をエンハンスしないことを示した。ＣｒＣＬ値は、未処置（２．０ ０．１ｍＬ／分）および６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独（１．９ ０．１ｍＬ／分）について類似であったが、ＳＲＬ単独（１．７ ０．１ｍＬ／分；ｐ＜０．０２）、およびＣｓＡ単独（１．３ ０．１ｍＬ／分；ｐ＜０．００１）について減少した。ＣｓＡ単独に比較して、６４８６４１Ｐの付加は、ＣｒＣＬ値をさらに減少させることはなかった（１．３８ ０．２ｍＬ／分；ｐ＝０．６８）；一方、ＳＲＬは顕著にこれを減少させた（０．９ ０．２ｍＬ／分；ｐ＝０．０３）。低塩食餌における未処置のラットに比較して、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ＴＧまたはＬＤＬレベルを変化させずに、血清ＣＨＯＬ（８２．０ ５．０対６５．５ ９．４ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０３）を減少させ、ＨＤＬを増加させた（ｐ＝０．００４）。６４８６４１Ｐは、ＳＲＬ＋ＣｓＡ（１０７．８ ８．４ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０００５）と対照的に、ＣｓＡの高コレステロール症効果を増加させなかった（７７．５ ７．０単独対６４．１ １２．７ｍｇ／ｄＬ組合わせ）。高脂食餌において、ＳＲＬはＣＨＯＬ（６８９．５ ６７．４；ｐ＝０．００００１）およびその他の脂質画分に対して顕著な効果を生じ；ＣｓＡはより少ない効果（５４５．７ ９５．７ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０００２）であり、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、未処置の動物において中程度の変化のみを生じた（３２３．８ ５１．１ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０１対２３７．５ ３１．４ｍｇ／ｄＬ）。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＨＤＬ、ＬＤＬ、またはＴＧレベルに対する効果をなんら有しなかった。６４８６４１ＰもＣｓＡも、ＳＲＬとは対照的に（Ｐ＜０．０４）、未処置のラットと比較して、ＰＢＣを減少させなかった。ＳＲＬ／ＣｓＡ宿主は低細胞性の骨髄を示し（３０〜４０％が脂肪組織に置き換えられる）、６４９６４１Ｐ／ＣｓＡコホートは、未処置のラットからなんら有意な変化を示さなかった。これらの結果を考慮すると、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、腎臓毒性および骨髄毒性の効果がなく、高脂投与に対して軽度の脂質毒性を伴うと結論づけられる。ＳＲＬを混乱させるようなＣｓＡの有害な効果を悪化させないので、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はリンパ系要素に対して選択的な作用を発揮するようである。
【００６１】
上述の研究から、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＪａｋ３活性をブロックし、単独で同種移植片生存を延長し、そしてＣｓＡと相乗的であることが結論づけられ得る。好ましい化合物、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＪａｋ２依存性Ｔ細胞増殖に比較してＪａｋ３依存性Ｔ細胞増殖のインビトロでの選択的な阻害を示し、そしてインビボでなんら腎臓毒性の副作用を引き起こすことなく臓器の同種移植片の生存を延長させた。有利には、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はシクロスポリンと強力な相乗的相互作用を示し、シクロスポリン誘導性の腎臓毒性を増加することなく臓器の同種移植片の生存を延長させた。さらに、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、以前に記載された化合物ＡＧ４９０およびＰＮＵ１５６８０４と比べて、Ｊａｋ３媒介性の細胞活性をブロックすることに対しては大きな特異性を示したが、Ｊａｋ２媒介性の細胞活性をブロックすることに対しては示さなかった。しかし、現時点では、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の投与と関連する上述の望ましい薬理学的特性が、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物とＪａｋ３との直接的な相互作用に完全に起因するのか否か、または、例えばＪａｋ３阻害が６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）からの代謝物または誘導体よってなんらかの程度インビボで媒介されるのか否かは、明らかではない。後者の場合、医学的に示すとすれば、かかる活性な代謝物または誘導体の種のいずれの直接的な投与が、治療的に６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の代わりをし得ると考えられる。同様に、本明細書中に記載される選択的なＪａｋ３インヒビター化合物の１つを生じるようにインビボで作用する前駆体化合物もまた、個体の特別の必要性がそのように示す場合には、治療的に投与され得る。
【００６２】
［実施例４．治療的適用］
６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物は、免疫抑制治療のため、およびＪａｋ３を含むかまたは発現するリンパ系、骨髄系、またはその他の細胞の病理を処置するため、本明細書中に記載される医学的有用性のある化合物の群の代表であると考えられる。化合物は、ヒトのＴ細胞関連疾患において特に有用であると考えられ、および獣医学的診察における使用に対して、Ｊａｋ３依存性のリンパ系もしくは骨髄系の細胞機能をその他のタンパク質キナーゼの活性に影響を与えずに抑制することが望ましいなんらかの適用に対して、またはかかるキナーゼにほとんど影響を与えないもしくは治療的に受容可能な程度の影響を与えるなんらかの適用に対して、特に有用であると考えられる。処置は、リンパ球、またはＪａｋ３を発現するリンパ系もしくは骨髄系起源の他の細胞においてシグナル３経路を干渉するのに有効な化合物の量を投与する工程を有し、それによってその作用を阻害する。例えば、細胞分裂をブロックする。かかる投与は、化合物の酸の形態または薬学的に受容可能なその塩を利用するか、またはこれは化合物の生物学的に活性な代謝物の形態をとる。あるいは、被験体の身体において化合物の１つ以上の活性な形態に代謝され得る前駆体化合物が投与され、それによってＪａｋ３依存性のリンパ球作用が破壊され、好ましくは細胞分裂をブロックする。投与は連続的または周期的である。
【００６３】
いくつかの医学的状況において、個体は望ましくない免疫応答の抑制を必要とし、その場合、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）、または前駆体もしくは活性な代謝物を含む薬学的組成物の有効な量の投与は、望ましくない免疫応答を軽減または防止する。シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６のような、Ｊａｋ３阻害を介して作用しない、別の免疫抑制剤の治療的に有効な量を同時投与することによって、さらにより良好な結果が、個体に対する毒性をほとんど伴わずに達成され得る。かかる使用の例は、哺乳動物移植片もしくは同種移植片レシピエントにおける臓器移植拒絶もしくは同種移植片拒絶を軽減すること、または移植寛容を誘導することを含む。その他の例においては、治療目的は、内因性Ｊａｋ３依存性Ｔ細胞によって媒介される自己免疫疾患の寛解を促進することであり、それによって被験体のネイティブな組織に対する自己免疫攻撃が減少または停止される。さらにその他の使用の手段は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の薬学的調製物を投与して、Ｔ細胞媒介性の過敏性応答を抑制することによって哺乳動物被験体における気道過敏症を軽減することを含む。同様に、アレルギー患者は、Ｔ細胞媒介性のアレルギー応答を抑制するために処置され、それによってアレルギー反応が減少または停止される。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を含む薬学的組成物の投与はまた、Ｊａｋ３依存性の白血病またはリンパ腫の増殖を阻害することが期待される。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）での治療的処置の顕著な潜在的利点は、Ｊａｋ３活性を選択的に阻害し、リンパ系画分の細胞（およびＪａｋ３を発現する骨髄系の細胞）に制限されることによる、ならびにＪａｋ２、および身体にわたる多くの組織において見出される他のタンパク質キナーゼ活性に対してほとんどまたは全く影響を有しないことによる利点であり、ずっと少ない副作用が期待される。
【００６４】
［薬学的組成物］
治療的使用に適切な薬学的組成物は、その酸形態をとる６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物、または適切なキャリアと組み合わせられてその薬学的に受容可能な塩もしくは水和物を含む。薬学的に受容可能な塩および水和物とは、製薬化学者に明白な化合物の、このような塩および水和物の形態、すなわち、溶解性、嗜好性、吸収、分散、代謝、および排泄のような化合物の物理学的なまたは薬物動態学的な特性に好ましい影響を与える形態をいう。事実上より実用的で、化合物の形態の選択においてもまた重要なその他の因子は、得られるバルク薬物の、原材料費用、結晶化の容易性、収量、安定性、溶解性、吸湿性、および流動性を含む。化合物が負に荷電されると、これは対イオン、例えば、ナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属カチオンによって平衡化される。他の適切な対イオンとしては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アンモニウム、またはテトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、コリン、トリエチルヒドロアンモニウム、メグルミン、トリエタノールヒドロアンモニウムなどのような、アルキルアンモニウムカチオンが挙げられる。対イオンの適切な数は、全体の電荷の中立性を維持するための分子に関連する。同様に、化合物が正に荷電される、例えばプロトン化されると、適切な数の負に荷電された対イオンが存在して全体の電荷の中立性を維持する。
【００６５】
薬学的に受容可能な塩はまた、酸付加塩を含む。すなわち、化合物は、無機または有機の酸または塩基に由来する塩の形態において使用可能である。例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳塩、樟脳硫酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン塩、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチネート、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基を伴う塩、ならびにアルギニン、リジンなどのようなアミノ酸を伴う塩が挙げられる。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物、ヨウ化物のような低級アルキルハライド；ジメチル、ジエチル、ジブチルのようなジアルキル硫酸塩；およびジアミル硫酸塩、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル塩化物、臭化物、ヨウ化物のような長鎖ハライド、ベンジルおよびフェネチル臭化物のようなアラルキルハライドなどの薬剤で四元化される。他の薬学的に受容可能な塩としては、硫酸塩エタノレートおよび硫酸塩が挙げられる。
【００６６】
本明細書中に記載されるＪａｋ３インヒビター化合物は、当該分野において周知であるように、薬学的に受容可能なキャリアと、化合物とを組合わせることによって薬学的組成物中に処方される。化合物は、粉末または結晶の形態で、溶液中でまたは懸濁液中で用いられる。これらは、経口的に、非経口的に（静脈内または筋肉内）、局所的に、経皮的に、または吸入によって投与される。用いられるキャリアは、必要に応じて、固体または液体である。固体キャリアの例としては、ラクトース、石膏、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。液体キャリアの例としては、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、水などが挙げられる。経口の使用のためのキャリアとしては、単独で、またはワックスと組合わせて、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような当該分野において周知な時間遅延材料が挙げられる。局所的な適用は、軟膏、クリーム、ローションを形成するために疎水性または親水性の基剤のようなキャリアで、塗布剤を形成するために水性、油性、またはアルコール性の液体で、または粉末剤を形成するために乾燥希釈剤で処方される。経口固体投薬形態の例としては、錠剤、カプセル、トローチ、薬用キャンデーなどが挙げられる。投薬形態の大きさは、広範に変化するが、好ましくは約２５ｍｇ〜約５００ｍｇである。経口液体投薬形態の例としては、溶液、懸濁液、シロップ、乳濁液、軟質ゼラチンカプセルなどが挙げられる。注射可能な投薬形態の例としては、無菌の注射可能な液体、例えば、溶液、乳濁液、および懸濁液が挙げられる。注射可能な固体の例としては、注射の前に液体中に再構成、溶解、または懸濁される粉末が挙げられる。注射可能な組成物において、キャリアは典型的には、無菌水、生理食塩水、または別の注射可能な液体、例えば、筋肉内注射のためのピーナツ油、からなる。また、種々の薬学的に受容可能な緩衝剤、保存剤なども含まれる。
【００６７】
［投薬］
本明細書中に記載されるＪａｋ３選択的インヒビター化合物の治療的使用を行うための薬学的組成物としては、意図される目的、すなわち、Ｊａｋ３活性の選択的な破壊もしくは、阻害、またはＪａｋ３関連性の異常の処置もしくは防止を達成するのに十分な量において有効成分を含む組成物が挙げられる。治療的に有効な量すなわち投薬量は、本明細書中に示されるようにして、先ず細胞増殖アッセイから見積もられる。次いで、投薬量は、また本明細書中で示されることだが、動物モデルにおける使用のために処方され、細胞培養で判断されるＩＣ５０（すなわち、ＩＬ２依存性の増殖の最大阻害の半分を達成し、ＰＲＬ依存性の増殖をほとんどまたは全く阻害しない化合物の濃度）を含む循環濃度範囲が達成される。次いで、かかる情報は、標準的な薬理学的な実施に従って、ヒトおよびその他の哺乳動物において有用な投薬量の範囲をより正確に判断するために使用される。投薬量は、用いられる投薬形態および利用投与経路に依存して変化する。例えば、投薬の量および間隔は、所望されるＪａｋ３阻害効果を開始および／または維持するのに十分である活性な種の血漿レベルを提供するように個々に調節される。これらの血漿レベルは、習慣的には最小有効濃度（ＭＥＣ）として参照される。ＭＥＣは、化合物によって異なるが、上記のようにインビトロデータから見積もられる。例えば、Ｔ細胞の集団においてＪａｋ３自己キナーゼ活性の５０〜９０％阻害達成するのに必要な濃度は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して確認される。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイが、血漿濃度を判断するために用いられ得る。投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して判断される。好ましくは、化合物は所望される期間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持する投与計画を使用して投与される。局所的な投与または選択的な取り込みを含む処置において、化合物、またはその活性な代謝物もしくは誘導体の有効な局所濃度は、血漿濃度によって十分に反映されない可能性がある。この場合においては、当該分野において周知の、その他の手順が適切な投薬の量および間隔を判断するために用いられる。成体ヒトに対する適切な経口投薬量の範囲の例は、単回または分割される投薬量において、１日あたり約０．１〜約８０ｍｇ／ｋｇである。適切な非経口投薬量の範囲の例は、単回または分割される用量において、１日当たり約０．１〜約８０ｍｇ／ｋｇであり、静脈内または筋肉内注射によって投与される。局所的な投薬量の範囲は、約０．１ｍｇ〜約１５０ｍｇであり、１日約１〜４回、外部から適用される。吸入の投薬量の例は、一日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の状態、処置される疾患の性質、およびその他の因子を考慮して個々の医師によって選択され得る。
【００６８】
［実施例５．さらなるＪａｋ３選択的インヒビター化合物］
前述の実施例において、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、Ｊａｋ３を含むＴ細胞の増殖および機能を選択的にまたは特異的に阻害し、同種移植片の生存を延長し、そして低い毒性を示すことが実証された。これらの評価を考慮すると、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が免疫関連の異常を有する個体を処置するための潜在的治療的価値を有することは明らかである。この化合物はまた、インビトロのアッセイおよびインビボの研究におけるＪａｋ３の阻害または破壊についての選択性に関して、その他の候補薬物化合物を評価する上での比較基準として使用するための試薬として価値がある。
【００６９】
上記のように、本研究の過程において、ＮＣＩ薬物発見データベース（ＮＣＩ Ｄｒｕｇ Ｄｉｃｏｖｅｒｙ Ｄａｔａｂａｓｅ）が、Ｊａｎｕｓキナーゼ３（Ｊａｋ３）の選択的なインヒビターとして作用し得るさらなる候補化合物についてスキャンされた。「種」化合物ＡＧ４９０、Ｊａｋ３阻害の潜在性を伴うチルホスチンに類似の相関係数を示す化合物が評価された。
【００７０】
［ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズム］
ＮＣＩ薬物データベースは、世界の種々の部門から集められた数十万の化合物からなるデータベースである。これらとしては、大きな製薬会社から小さな私有の研究所までにおよぶ薬物の寄託が挙げられる。多くの例において、これらの化合物が付加されて、ライブラリーが試験および促進された。しかし、これらの化合物の多くは、その元来提案された機能についての効果のなさに起因して、製造業者により製造中止にされており、およびいくつかの例においては、提出した企業がもはや稼動していない。薬物の状態にかかわらず、その構造および得られる活性は、毎週更新されるライブラリーデータベースに付加される。
【００７１】
データベースは、６０個の異なるヒト細胞株（例えば、上皮、肺、結腸、単球／マクロファージ、Ｔ−Ｂ細胞、乳房−前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）など）に対して、特定の薬物についての投薬量応答性を試験することによって作成された。測定されるこれらのパラメーターとしては、細胞増殖の阻害（ＩＣ５０）、細胞傷害性（ＬＣ５０）、および細胞増殖抑制効果（ＴＧＩ）が挙げられる。同時に、これらは、各化合物についての平均グラフ「符号定数」を含む。ポジティブな値を示す（右側に突出する）薬物は、平均を超える反射的な細胞感受性である。ネガティブな値（左側に突出する）は、細胞株が、試験薬剤に対して平均よりも少ない感受性であることを示す。ＣＯＭＰＡＲＥは、各化合物を、本明細書の場合のＡＧ４９０におけるように、所定の「種」に対するインビトロでのその活性に基づいて序列するアルゴリズムである。平均グラフは、各薬物に対してピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ （ＰＣＣ））を使用してスカラー指標順位（ｓｃａｌａｒ ｉｎｄｅｘ ｒａｔｉｎｇ）に変換される。最終的には、最も類似の効果を伴う薬物は高位の相関（アプローチ１）を示し、種化合物の作用メカニズムに類似する作用メカニズムを有する可能性が高い。
【００７２】
ＣＯＭＰＡＲＥは、類似の作用メカニズムを伴う化合物を同定することにおいて成功してきた。これは、例えば細胞増殖をブロックする類似した薬物は、類似した細胞型の同じ重要な標的経路を標的する、という前提に基づく仮説的なモデルである。特定の経路に大きく依存する細胞は、その経路を阻害する感受性があるが（例えば、ＪＡＫ３／Ｓｔａｔ５を発現する細胞）、かかる分子を発現しないか、またはほとんどこの経路に依存しない細胞は、同じ薬物はほとんどまたは全く効果を有しない。このことは、ＣＯＭＰＡＲＥが、細胞のパネルにわたって類似の作用メカニズムを伴う薬物をまとめて分類することを可能にする。
【００７３】
今日までに完了された多くの様々な研究は、このアプローチが、同じ分子標的に選択的に影響する、すなわち特徴的な平均グラフパターンを生じる新規な薬剤を同定するために成功してきたことを示した。ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムは、別個の構造の化合物であるが、種と比べて同じ作用メカニズムを伴う化合物に対する類似の平均パターンを同定し得る。実験室研究では、特定の読取り内での適合（ＪＡＫ３ Ｓｔａｔ５リン酸化）を確認する必要がある。ＣＯＭＰＡＲＥは、薬物作用の類似メカニズムに依存するので、化学構造に必ずしも依存しない。このことは、以前は所定の標的に対する特定のインヒビターとして決して認識されていなかった、構造的に新規なクラスの化合物の同定を可能にする。このアプローチの有効性は、ｐ５３、Ｒａｆ、トポイソメラーゼ、およびチューブリン結合タンパク質のインヒビターを同定することによって実証されてきた。既知の作用メカニズムの構造的クラスが一旦発見されると、次いで新しい作用メカニズムの利用可能な類似体および合成体のさらなるスクリーニングが使用されて、目的の薬物が規定および最適化され得る。
【００７４】
上記のＮＣＩ薬物データベーススクリーニングにおいて同定された化合物の中に、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）、および６４９６４１Ｐのいくつかの同族体または構造類似があった。Ｔ細胞増殖に対する化合物６３７７１２、６４０６７４、６４３４２３、６５５９０６、６７３１３７、６８３３３２、および６９３８１２（それらのＮＣＩデータベース番号によって示される）の効果が評価され、ＡＧ４９０、ＰＮＵ１５６８０４、および６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果と比較された。これらの比較アッセイの結果は、図７Ａにおいて棒グラフの形態において示される。ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞の増殖は、ＩＬ−２での刺激後にこれらのＮＣＩ薬剤によってブロックされることがわかる。ＮＣ１１５３の構造式は、差込図において示されている。ＮＣ１１５３は、ＩＬ２受容体の発現に影響しなかった。
【００７５】
また示されるのは（図７Ｂ）、５０μＭ ＮＣ１１５３を伴わないで（太線）、または伴って（細線）、一晩処置されてＩＬ２Ｒ−α、−β、およびγ鎖について染色されたＰＨＡ活性化Ｔ細胞ブラストのＦＡＣＳ分析を示すグラフである。破線は、ＮＣ１１５３で前処理された細胞を示す。これらの結果は、ＩＬ−２受容体の存在がＮＣ１１５３によって影響を受けないことを示す。これらの知見は、ＩＬ２シグナルの喪失は、受容体発現における変化に起因せず、すなわちＩＬ２受容体、従ってＪａｋ３の遠位で生じることを実証する。図７Ｃに示されるように、ＮＣ１１５３化合物は、非Ｊａｋ３発現細胞の細胞増殖をブロックしない。Ｊａｋ３を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞（黒菱形）は、Ｊａｋ３を含むＰＨＡ活性化Ｔ細胞（白四角）とは対照的に、ＮＣ１１５３での処置後の細胞増殖には有意な変化を示さなかった。データは、ベヒクルコントロールのパーセントとして正規化される。ＮＣ１１５３は、Ｊａｋ３および共通のガンマ鎖を利用するサイトカインによる細胞の増殖を阻害する（図７Ｄ）。図１Ａにおいてまた示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置されたＴ細胞のＴ細胞増殖は、未処置コントロールに対して正規化されたＩＬ２、ＩＬ４、またはＩＬ７駆動性の増殖を投薬量依存的に阻害する。すなわち、ＮＣ１１５３の阻害効果は、ＩＬ−２によってのみ刺激された細胞に制限されるわけではない。その代わりに、Ｊａｋ３を使用するサイトカインのファミリー全体は、ＮＣ１１５３によってブロックされる。
【００７６】
ここで図８を参照すると、６４９６４２１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３シグナル伝達経路を阻害するという直接的な証拠が提供される。Ｊａｋ３自己キナーゼ活性は、インビトロの分析に基づいて、ＮＣ１１５３によって直接的にブロックされる。「ＰＹ−Ｊａｋ３」として同定されるバンドは、ＮＣ１１５３の示された投薬量にて、ＩＬ−２およびＡＴＰを伴ってまたは伴わないで、活性なＪａｋ３のみを明らかにする。「Ｊａｋ３」として同定されるバンドは、全ての（活性プラス不活性な）Ｊａｋ３タンパク質の存在を明らかにする。Ｊａｋ３を阻害することが下流の経路をブロックするということを示すために、免疫精製されたＪａｋ３は、Ｊａｋ３自己キナーゼ活性についてアッセイされ、１００μＭのＡＴＰおよび／または薬物の存在下または不在下での、ホスホチロシンウェスタンブロットによって試験され、そして図２Ａ〜Ｃに示されるようにコントロールと比較された。６４９６４１（ＮＣ１１５３）は、図７Ａおよび７Ｄに示されるように、増殖データに類似する約２．５μＭのＩＣ５０を示したことがまた観察された。
【００７７】
図９Ａ〜Ｃは、ＮＣ１１５３が非Ｊａｋ３シグナル伝達経路を阻害しないことを示す。図９Ａにおいて、ＮＣ１１５３が、漸増濃度のＮＣ１１５３で処置されたＰＨＡ活性化Ｔ細胞において、ＥＭＳＡ分析を介して測定されるように（上部パネル）、Ｊａｋ３駆動性の転写因子−Ｓｔａｔ５ａ／ｂを投薬量依存的に阻害することがわかる。「コールド匹敵物」として同定されるレーンは、未標識のプローブを含む。しかし、ＴＮＦ−□による非Ｊａｋ３媒介性Ｎｆ□Ｂ活性化（下部パネル）は、同じ処置セット内では影響を受けなかった。図９Ｂに示される結果は、ＮＣ１１５３は、密接関連Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５ａシグナル伝達経路を阻害しないことを確立する。ラットＮｂ２細胞は、漸増濃度のＮＣ１１５３で処置され、次いでプロラクチンで刺激された。ホスホチロシンウェスタンブロットは、活性化を検出したが、ＮＣ１１５３による阻害は検出しなかった。Ｓｔａｔ５ａ／ｂ活性化において、Ｊａｋ３媒介性のＪａｋ３自己キナーゼ活性化は、インビトロの分析に基づいて、ＮＣ１１５３によって直接的にブロックされる。ＮＣ１１５３は、複数のキナーゼの活性に影響を与えない。キナーゼアッセイにおけるＪａｋ２よりも少なくとも５０倍多いＪａｋ３の阻害が、図９Ｂおよび図８に示される。図９Ｃに示されるように、ＮＣ１１５３は、１０または５０μＭにて、増殖因子チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ３およびＰＤＧＦＲ□）、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、Ｚａｐ７０）、またはセリンスレオニンキナーゼ（ＰＫＣおよびＰＫＡ）の基質のリン酸化をブロックすることが試験された。コントロールの活性は、破線としてプロットされる。
【００７８】
図１０Ａ〜Ｄは、（表１に示された）同種移植片生存に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のインビボの効果をまとめる。Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ）腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントは、７日間、毎日の静脈内注射または経口強制飼養により送達されるＮＣ１１５３で処置された。種々の薬物投薬量での同種移植片生存時間（日）は図１０Ａに示され、個体の生存は表１に示される。ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントは、１４日間、毎日の経口強制飼養によって送達されるＮＣ１１５３で処置された。移植片生存比率（日）は、図１０ＢにおいてＮＣ１１５３の種々の投薬量にて示される。ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントは７日間、そしてその後、３×／１週間、９０日まで、毎日の経口強制飼養によって送達される１６０ｍｇ／ｋｇのＮＣ１１５３で処置された。図１０Ｃに示されるように、処置されたレシピエントの７５％が、９０日間の処置を超えて生存し、生存時間は２００日間を越えた。移植寛容の誘導は、ＬＥＷドナー（＞１００日間；ｎ＝３）の受容によって確認されたが、長期間生存するレシピエントによる第三者のＢＵＦ（７．０±１．０日；ｎ＝３）心臓同種移植片によっては確認されなかった。寛容のメカニズムは、ＬＥＷ心臓同種移植片の照射（４００ｒａｄ）ＡＣＩレシピエントが寛容レシピエントから３０×１０６個の精製Ｔ細胞を養子的にトランスファーされた際に試験された。寛容Ｔ細胞をトランスファーされたレシピエントは、ＬＥＷ心臓同種移植片の有意に遅延された拒絶を示し（４０．０±１５．０日；Ｎ＝６対１５±１．０日；照射されたコントロールにおいてｎ＝５）、２つの心臓は１００日間を越えて良好に心拍したが、第三者の心臓同種移植片は拒絶された（１２±１．０日；ｎ＝２）。これらの結果は、移植寛容が、Ｔ細胞調節細胞によって少なくとも一部媒介されたことを示す（示されず）。図１０Ｄは、表２において上述で示される結果のまとめを示す。これは、７日間、毎日の経口強制飼養により送達された、ＮＣ１１５３単独で、ＣｓＡ単独で、および組み合わせの薬物で処置されたＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントに関する。各投薬量レベルでの各処置群のＭＳＴが示され、そして図の下方では、ＮＣ１１５３−ＣｓＡの組合わせが相乗的であることを示す低いＣＩ値が示されている。
【００７９】
図１１Ａ〜Ｆに示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は腎臓毒性でなく、脂質代謝に影響を与えない。低塩食餌を与えられたラット（治療前の７日間および治療の間の１４日間）は、１６０ｍｇ／ｋｇのＮＣ１１５３を単独で、または５ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡと組合わせて経口強制飼養によって処置され；いくつかの動物は０．８ｍｇ／ｋｇラパマイシン（ＲＡＰＡ）単独でまたは５ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡと組合わせて処置された。腎臓機能は、血清クレアチニンレベルおよび血清クレアチニンクリアランスによって評価され、そして結果は、それぞれ、図１１Ａおよび１１Ｂに示される。脂質代謝は、血清コレステロール（図１１Ｃ）、トリグリセリド（図１１Ｄ）、ＬＤＬ−コレステロール（図１１Ｅ）、およびＨＤＬ−コレステロール（図１１Ｆ）を測定することによって評価された。ＮＣ１１５３単独またはＣｓＡとの組合わせの、腎臓構造に対する効果が判断された。７日間低塩食餌にあったラットは、１４日間、１０ｍｇ／ｋｇ ＮＣ１１５３のｉ．ｖ．送達；０．１６ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡのｉ．ｖ．送達；１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡの経口強制飼養による送達；１０ｍｇ／ＣｓＡのｐ．ｏ．と０．１６ｍｇ／ｋｇＲＡＰＡのｉ．ｖ．との組合わせ；または１０ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡのｐ．ｏ．と１０ｍｇ／ｋｇ ６４１Ｐのｉ．ｖ．との組合わせ、で処置された。１４日目に、ラットは屠殺され、そして組織学が、Ｈ＆Ｅ染色を使用して腎臓に対して行われた。類似の結果が、１群当たり５匹のラットにおいて観察された。図６Ａ〜Ｅに示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独もＲＡＰＡ単独も、腎臓において有意な変化を示さなかった。対照的に、ＣｓＡ単独は、３０％の細管において障害を引き起こし、空胞形成および萎縮を伴った。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ群は、９０％の細管において大規模な空胞形成を示し、萎縮および濃縮した核を伴った。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ群とは対照的に、ＣｓＡ／ＮＣ１１５３の組合わせで処置されたラットからの腎臓は、ＣｓＡ単独の群において観察された変化に類似した変化を示した。
【００８０】
６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のメソの立体異性体は、（図１８Ｂに示される）ＷＰ９３８と称され、以下の工程を有する手順を使用して合成された。４００ｍＬのアセトニトリル中に溶解された０．１ｍｍｏｌのシクロアルカノネオンおよび０．２１ＭのＮ，Ｎ，Ｎ´、Ｎ´−テトラメチルジアミノメタンに、１６．５ｇ（０．２１ｍｏｌ）の塩化アセチルが４０分間、滴下して添加された。反応が完了した後に粗生成物が沈殿され、濾過され、エーテルで洗浄され、そして乾燥された。その後の結晶化によって、純粋な生成物が得られた。
【００８１】
得られたＷＰ９３８化合物は、単独でまたはＣｓＡと組合わせて投与された際の、同種移植片生存に対するその効果についておよび毒性について試験された。結果は、図１２Ａ、Ｂから図１３Ａ〜Ｆに示される。経口強制飼養により７日間、投薬量２０〜１６０ｍｇ／ｋｇにて送達されるＷＰ９３８単独は、ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩレシピエントの生存を、投薬量依存的に延長したことが見出された（図１２Ａ）。ｐ．ｏ．で７日間送達された１．２５ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡと１６０ｍｇ／ｋｇ ＷＰ９３８との組合わせは、０．４４のＣＩ値によって示されるように（図１２Ｂ）、腎臓同種移植片生存に対して相乗的な相互作用を生じた。図１３Ａ〜Ｆに示されるように、１６０ｍｇ／ｋｇ ＷＰ９３８の１４日間の経口治療は、化学的性質および血液要素計数における変化を生じず、毒性がないことを実証した。血清クレアチニンおよびクレアチニンクリアランスは、ＷＰ９３８による腎臓毒性がないこと、およびＣｓＡ誘導性の腎臓毒性に対して効果がないことを示した（図１３Ａ、Ｂ）。図１３Ｃは、コレステロールレベルを示す。図１３Ｄはトリグリセリドを示す。図１３ＥはＨＤＬレベルを示す。図１３ＦはＬＤＬレベルを示す。
【００８２】
図１４Ｂ〜図３９Ｂは、プロラクチンまたはＩＬ２刺激されたＴ細胞において増殖を阻害する能力についてスクリーニングされた種々のＭａｎｎｉｃｈ塩基化合物およびその他の化合物（塩として示される）の化学式を示す。図１４Ａ〜図３９Ａは、示された濃度範囲にわたるこれらのアッセイの結果を示す。スクリーニングアッセイが、実質的に上述の一般的な方法で記載されたように行われた。ＩＬ２（白四角）により活性化されるＪａｋ３およびＳｔａｔ５ａ／ｂを阻害するのに十分な濃度にて、プロラクチン（ＰＲＬ）（黒四角）によるＪａｋ２およびＳｔａｔ５ａ／ｂ活性をブロックしない明白な特徴を有する化合物が、さらなる評価のために同定された。好ましい６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物およびその選択的な阻害活性は、実施例１および図１Ａ、Ｂに示される。さらなる候補薬物、すなわちＰＲＬまたはＩＬ２刺激されたＴ細胞に関する所定の濃度での少なくともある程度の量の選択的な阻害活性を示した図１４Ｂ〜１７Ｂおよび１９Ｂ〜３９Ｂに示される化合物は、代表的な化合物６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を用いる上述の実施例において記載されるのと同様に現在研究中の主題である。適用可能な場合は、これらの化合物は非対称中心を有し、そしてラセミ体、ラセミ混合物として、および本明細書中に開示される目的のための全ての異性体形態が含まれる個々のジアステレオマーまたは鏡像異性体として存在する。例えば、式（Ｉ）に関して、Ｃ−２およびＣ−１２での立体配置は（Ｒ）または（Ｓ）である。これらの化合物は、全ての立体異性体を含み、これらは十分に非毒性と判断され、そしてこれらは６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）に対して本明細書中で示されたように同種移植片生存を有意に延長し得、ヒトにおいて、および免疫抑制治療における獣医の使用のための、潜在的な治療的価値も有する。これらはまた、リンパ系または骨髄系起源のＪａｋ３を発現する細胞に関連するその他の病理を処置するための治療的価値があると期待される。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）およびＷＰ９３８において示されたように、これらの候補薬物化合物のいくつかはまた、Ｊａｋ３関連経路以外の経路によりその免疫抑制効果を発揮するＣｓＡまたはその他の免疫抑制剤とともに投与されると、相乗的な活性を示すと考えられる。
【００８３】
［定義］
その習慣的および通常の意味を有することに加えて、以下の定義が、明細書および請求の範囲において文脈が認める場合に適用する。
【００８４】
「選択的阻害」とは、１つのタンパク質の機能を優先的に、または１つ以上の既知のタンパク質をより少ない程度に、ブロックする化合物をいう。
【００８５】
「特異的な阻害」とは、所定のタンパク質の機能を、その他のタンパク質を影響することなく専らブロックする化合物をいう。
【００８６】
「免疫抑制の潜在性」とは、免疫応答を減少または除去するべき化合物（例えば、移植された臓器同種移植片の拒絶をブロックする薬物）をいう。
【００８７】
「薬学的組成物」とは、医薬品としての哺乳動物への投与のための、１つ以上の化学物質、または薬学的に受容可能なその塩と、適切なキャリアとの混合物をいう。
【００８８】
「リンパ細胞」とは、免疫起源の細胞、または、より詳細には、リンパ系統の幹細胞に由来する細胞をいい、大リンパ球、称リンパ球、血漿細胞を包含する。リンパ系の細胞の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００８９】
「骨髄細胞」とは、骨髄起源の、すなわち、骨髄系統の幹細胞に由来する細胞をいい、単球、マクロファージ、および樹状細胞を包含する。
【００９０】
「薬物」とは、医薬の使用に適切な化合物をいう。
【００９１】
「同族体」またはコージェナーとは、組成物（例えば、構造類似体）内で他方と密接関連し、て類似のまたは拮抗的な効果を発揮する化合物をいう。
【００９２】
「治療的に有効な量」とは、処置される異常の１つ以上の症状を、少なくともある程度軽減する、投与される化合物の量をいう。例えば、疾患の症状を防止、緩和、もしくは寛解する、または処置される被験体の生存を延長するのに有効な化合物の量。
【００９３】
疾患または異常に関して、用語「処置」とは、疾患もしくは異常の出現を防止、抑制すること、疾患もしくは異常の症状もしくは副作用を停止、退行、もしくはそれらからの救済を提供すること、ならびに／または処置される被験体の生存を延長することをいう。
【００９４】
【００９５】
本発明の好ましい実施態様が示され、そして記載されたが、その改変は、本発明の精神および教示から逸脱することなく当業者によってなされ得る。本明細書中に記載される実施態様は例示および典型であり、ならびに制限することは意図されない。本明細書中に開示される本発明の多くの変形および改変が可能であり、そして本発明の範囲内である。上述の記載は、Ｔ細胞駆動性の移植片対宿主疾患に対して集中されたが、本明細書中に記載される方法、化合物、および組成物はまた、他のＴ細胞依存性の疾患または異常における適用を有するようであることが容易に理解される。例えば、これらは狼瘡、関節炎、および多発性硬化症のような自己免疫疾患を処置するために、またはアレルギー、喘息、乾癬、潰瘍性大腸炎、リンパ腫、および白血病を処置するために有用である。選択的なＪａｋ３標的化阻害はまた、機能亢進のまたは望ましくない樹状細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞由来の状態に由来する機能亢進性免疫系応答状態を含む、多くのその他の免疫由来の病理においての、またはＪａｋ３を発現する骨髄系細胞由来の病理においての適用もまた有することが期待される。したがって、保護の範囲は、上述の記載によって制限されず、以下の請求の範囲によってのみ制限され、その範囲は請求の範囲の主題の全ての等価物を含む。本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に記載された材料、方法、および例示的な詳細に補充的な、材料、方法、および例示的な詳細をそれらが提供する程度に、本明細書中に参考として援用される。上述の関連分野の記載におけるある参考文献の考察は、それらが本発明に対する先行技術であるとの承認ではない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１Ａは、未処置コントロールに対して正規化された、１ｎＭヒトＩＬ−２（■）、ＩＬ−４（●）、またはＩＬ−７（▲）の不在下または存在下で培養されたγｃ／Ｊａｋ３−依存性ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞増殖に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の投薬量依存性の効果を示すグラフである。図１Ｂは、Ｊａｋ２活性化因子（ＰＲＬ［○］）またはＪａｋ３活性化因子（ＩＬ−２［■］）の存在下で培養された際の、Ｊａｋ２対Ｊａｋ３依存性のラットＴ細胞増殖に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の阻害効果を示すグラフである。
【図２】リン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）による阻害または阻害なしを示すウェスタンブロットである。図２ＡはヒトＹＴ細胞におけるＩＬ−２活性化Ｊａｋ３チロシンリン酸化を示す。図２ＢはヒトＹＴ細胞におけるＩＬ−２活性化Ｓｔａｔ５ａチロシンリン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示す。図２ＣはＹＴ細胞におけるＩＬ−２活性化Ｓｔａｔ５ｂチロシンリン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示す。
【図３】ＰＨＡ活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２活性化ｐ４４／４２ ＥＲＫ１／２リン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示すウェスタンブロットである。
【図４】ＹＴ細胞における活性化ＦｙｎおよびＬｃｋに対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示すウェスタンブロットである。
【図５】ＡＣＩレシピエントラット心臓同種移植片に対するＬｗｅｉｓの生存についての、ＣｓＡ対６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の比率の範囲についての組合わせ指標を示すグラフである。
【図６】ラット腎臓構造に対する６４９４６１Ｐ（ＮＣ１１５３）、ＲＡＰＡ、およびＣｓＡの効果を示す顕微鏡写真（２００×の倍率）である。図６Ａは６４９４６１Ｐ（ＮＣ１１５３）である。図６ＢはＲＡＰＡである。図６ＣはＣｓＡである。図６ＤはＣｓＡおよびＲＡＰＡ（シロリムスまたはＳＲＬ）の組合わせの効果を示す。図６ＥはＣｓＡおよび６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の組合わせの効果を示す。
【図７】６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３を含むＴ細胞の増殖を特異的に阻害することを示すグラフである。図７Ａは、ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞の増殖が、ＩＬ−２での刺激後に示されるＮＣＩ薬剤によってブロックされたことを示す棒グラフである。図７Ｂは、５０μＭ ＮＣ１１５３を伴わないで（太線）または伴って（細線）一晩処置され、そしてＩＬ２Ｒ−α、−β、および−γ鎖について染色された、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞ブラストのＦＡＣＳ分析である。図７Ｃは、Ｊａｋ３非発現細胞（黒菱形）における、およびＪａｋ３を含むＰＨＡ活性化Ｔ細胞（白四角）における、ＮＣ１１５３の濃度範囲にわたる細胞増殖阻害のグラフである。図７Ｄは、Ｊａｋ３および共通のγ鎖を利用してサイトカインにより刺激されるＴ細胞における、細胞増殖阻害対ＮＣ１１５３濃度のグラフである。
【図８】インビトロの分析に基づいた、Ｊａｋ３自己キナーゼ活性が６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）により直接的に阻害されることを示す棒グラフである。免疫精製されたＪａｋ３は、Ｊａｋ３自己キナーゼ活性についてアッセイされ、１００□Ｍ ＡＴＰおよび／または薬物の不在下または存在下で、ホスホチロシンウェスタンブロットによって試験されてコントロールと比較された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、約２．５□ＭのＩＣ５０を示し、これは図１ＡおよびＢの増殖データに類似する。
【図９】６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）選択性を示す。図９Ａは、用量依存性の様式において漸増濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置されたＰＨＡ活性化Ｔ細胞において、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３駆動性の転写因子−Ｓｔａｔ５ａ／ｂを阻害することを示す電気泳動移動度アッセイ（ＥＭＳＡ）のオートラジオグラフである（上部パネル）。ＴＮＦ−□による非Ｊａｋ３媒介性のＮｆ□Ｂ活性化は、同じ処置セット内で影響されなかった（下部パネル）。図９Ｂは、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が、密接関連Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５ａシグナル伝達経路を阻害できないことを示すウェスタンブロットオートラジオグラフである。プロラクチン［ＰＲＬ］（＋）または（−）は、細胞がＪａｋ２活性化を伴うプロラクチンで刺激されたか否かを示す。ホスホチロシンウェスタンブロットは、Ｊａｋ２−Ｓｔａｔ５活性化を検出するが、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）による阻害は検出しない。図９Ｃは、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３以外の複数のキナーゼの活性に影響を与えないことを示す棒グラフである。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、１０（白棒）または５０μＭ（黒棒）にて、基質の増殖因子チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ３およびＰＤＧＦＲ□）、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、Ｚａｐ７０）、またはセリンスレオニンキナーゼ（ＰＫＣおよびＰＫＡ）リン酸化をブロックすることを試験された。コントロールの活性は、破線としてプロットされている。
【図１０】同種移植片生存に対するＮＣ１１５３のインビボの効果を説明する。図１０Ａは、毎日の静脈内注射により（左側パネル）または経口強制飼養により（右側パネル）送達される、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で７日間処置された、ルイス（ＬＥＷ）腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントにおける移植片生存を示す。図１０Ｂは、毎日の経口強制飼養により送達される、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で１４日間処置された類似のレシピエントにおける移植片生存を示す。図１０Ｃは、毎日の経口強制飼養により送達される、１６０ｍｇ／ｋｇ ＮＣ１１５３で７日間、そしてその後３×／１週間で９０日間まで処置された類似のレシピエントにおける移植片生存を示す。図１０Ｄは、７日間処置されたＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントにおいて、毎日の経口強制飼養により送達されるＮＣ１１５３の、ＣｓＡとの相乗的効果を示す。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独（黒棒）。ＣｓＡ単独（白棒）、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）およびＣｓＡ（淡色棒）。
【図１１】６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が腎臓毒性でなく、および脂質代謝を影響しないことを示すアッセイ結果のグラフであり、血清クレアチニンレベル（図１１Ａ）、血清クレアチニンクリアランス（図１１Ｂ）、血清コレステロール（図１１Ｃ）、トリグリセリド（図１１Ｄ）、ＬＤＬ−コレステロール（図１１Ｅ）、およびＨＤＬ−コレステロール（図１１Ｆ）によって評価される。結果は、ｍｇ／ｄＬにおいて表されている。組織学的外見は図６Ａ〜Ｅに示されるようであった。
【図１２】（図１８Ｂに示される）ＷＰ９３８と称される６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のメソの立体異性体での結果を示す以外は、図１０Ａ〜Ｄに類似し、ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩレシピエントにおける同種移植片生存について試験された。図１２Ａは、未処置の、ＣｓＡ単独で処置された、およびＷＰ９３８単独で処置されたラットの平均生存を示す。図１２Ｂは、同じ投薬量のＣｓＡ／ＷＰ９３８の組合わせと比較した、１投薬量のＣｓＡ単独、１投薬量のＷＰ９３８単独の比較を示し；０．４４のＣＩ値は、相乗的な相互作用を示す。
【図１３】ＷＰ９３８単独についての、またはＣｓＡと組合わせての毒性アッセイの結果を示す。図１３Ａは血清クレアチニンレベルを示す。図１３Ｂはクレアチニンクリアランスを示す。図１３Ｃはコレステロールレベルを示す。図１３Ｄはトリグリセリドを示す。図１３ＥはＨＤＬレベルを示す。図１３ＦはＬＤＬレベルを示す。
【図１４−１７】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図１８−２１】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図２２−２５】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図２６−２９】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図３０−３３】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図３４−３７】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図３８−３９】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
［発明の分野］
本発明は概して、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）を含むリンパ球およびその他のリンパ系起源の細胞の増殖および機能の阻害に関する。より詳細には、本発明は、リンパ球機能、特に免疫活性の調節をブロックする化学薬剤を使用する治療および試験の方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）媒介性の細胞活性および細胞増殖を選択的に破壊することに関する。
【０００２】
［関連技術の説明］
臓器の同種移植片拒絶に対処するために今日使用される治療的ストラテジーの効果は、強い副作用を生じる免疫抑制薬物への依存によって厳しく制限される。現在の臨床的な免疫抑制療法は、セリン−スレオニンホスファターゼカルシニューリン（ＣａＮ）インヒビターシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびタクロリムス（ＦＫ５０６）１によって占められ、これらは細胞周期の初期のＧ１期を通してＴ細胞増殖をブロックすることによってＴ細胞修飾因子として作用する１、２。これらの薬物に関連する望ましくない副作用としては、腎臓毒性、神経毒性、真性糖尿病、高脂血症、高血圧、多毛症、および歯肉増殖症が挙げられる３。より新しい薬物、ラパマイシン（ＲＡＰＡ）は、ＲＡＰＡのセリン−スレオニンキナーゼ哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）を標的とし、これはまた、粘膜潰瘍、リンパ増殖異常、低カリウム血症を表し得、そして低密度のリポタンパク質、コレステロール、およびトリグリセリドを増加する４。臨床的に承認された薬物の深刻な欠点は、これらが同種移植片の永続的な受容を生じないことであり、それゆえこれらは患者に継続的に送達される必要がある。
【０００３】
臓器の同種移植片拒絶に対処するための現在の治療的ストラテジーは、Ｔ細胞シグナル伝達経路およびそれを含む分子に集中している。Ｔ細胞シグナル伝達カスケード、ならびに免疫抑制におけるおよび潜在的に移植寛容を誘導するための、その潜在的な役割は、ＫｉｒｋｅｎおよびＳｔｅｐｋｏｗｓｋｉによって記載されている５。Ｔ細胞の完全な活性化は、３つの閾値制限された連続的なシグナルを必要とする６。
【０００４】
シグナル１が、特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合する抗原によって送達されて、続いて、シグナル２が、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用によって送達される。ＴＣＲとの結合後、数秒〜数分以内に、Ｚａｐ７０、Ｌｃｋ、およびＦｙｎのタンパク質Ｔｙｒキナーゼの自己活性化の間にＣＤ３ζ鎖はチロシン（Ｔｙｒ）リン酸化される７〜９。同時に、カルシウム（Ｃａ２＋）移動が、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）脱リン酸化核因子に対するＣａＮホスファターゼの触媒活性化−ＮＦＡＴが核移行してインターロイキン（ＩＬ）−２遺伝子のプロモーター内の不連続のＤＮＡ結合エレメントを結合するために必要な工程−を引き起こす１０。シグナル１および２はＩＬ−２の合成および分泌にとって重要であり、ＩＬ−２は、ＩＬ−４、−７、−９、−１３、−１５、および−２１のような他のＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）と協調して、サイトカイン受容体を介してシグナル３を送達する。これは、Ｔ細胞のクローン増殖を駆動するために要求される必要な工程である１１。これらのサイトカイン受容体は共通のγ鎖（γｃ）を共有し、この共通のγ鎖（γｃ）は、各サイトカインについて固有のα鎖と結合される際にＪａｎｕｓチロシン（Ｔｙｒ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ３を介して細胞内シグナルを送達し、ならびに転写のシグナル伝達因子および活性化因子（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （Ｓｔａｔ））１、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５ａ／ｂ、およびＳｔａｔ６を活性化する１１〜１８。
【０００５】
（Ｔ細胞におけるシグナル１経路に関与する）ＣａＮ酵素および（Ｔ細胞におけるシグナル３経路に関与する）ｍＴＯＲ酵素は、身体中の種々の組織において遍在的に発現される。このことは、Ｔ細胞特異的標的化に対するＣｓＡ、ＦＫ５０６、およびＲＡＰＡのような阻害薬物の効果を厳しく制限する。ＲＡＰＡは、今日臨床的に承認されている唯一の効果的なシグナル３インヒビターである２４。治療的介入のための候補標的として作用する他のシグナル伝達経路分子とは異なり、Ｊａｋ３発現は、組織発現の制限されたパターンを示し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および単球に、または一般的用語では免疫起源の細胞に細分化される。
【０００６】
Ｊａｋ３は、リンパ系細胞へのその主要な局在性ゆえに、多くの免疫由来疾患を取り除くための固有の分子的なおよび治療的な標的として期待できる１９〜２１。この酵素は、γｃを介してほぼ排他的に会合および活性化されるため、Ｊａｋ３またはγｃの遺伝子破壊は、重篤な複合免疫不全疾患として表れる２２。この深刻な免疫抑制の理由は、上述のようなＴＣＧＦのファミリーによるＴ細胞の発達および補充においてのＪａｋ３の重要な役割に起因する。Ｊａｋ３は受容体成分および近位膜と会合するので、これらの受容体から発せられる、Ｓｔａｔおよび分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （Ｍａｐｋ））カスケードを含む、全ての下流のシグナルが活性化される。すなわち、Ｊａｋ３の破壊は、ＴＣＧＦによって媒介される全てのシグナルを引き続きブロックし、それゆえに、これらの細胞内の遺伝子転写を調節するそれらの能力をブロックする。しかし、この固有のおよび余剰なシグナル伝達経路の阻害を制御することができれば、免疫活性化の好ましい調節が、これらの遺伝子を欠損する患者およびマウスにおいて観察されるように達成可能となるはずである。さらに、この経路を標的化することは、理論上は、ＣｓＡに応答しない拒絶を担う、活性化されかつ増殖するＴ細胞の集団も阻害する２１。
【０００７】
リンパ球においてＪａｋ３を特異的に標的化するインヒビターを同定するための努力は、僅かに報告されているＪａｋ３を阻害する薬物もまた多くの身体組織における日常的な細胞機能に必要とされる多くの他のチロシンキナーゼを阻害するという事実によって阻まれる。実際、これらのタンパク質チロシンキナーゼは、細胞表面受容体から核へ細胞外シグナルを伝達し、続いてリンパ球以外の細胞型の増殖、分化、および機能を調節するためには、基本的に重要である。
【０００８】
米国特許出願公開第２００２／００４２５１３号明細書（Ｕｃｋｕｎら）は所定のキナゾリン化合物を記載しており、その化合物は、インスリン受容体チロシンキナーゼに対する構造相同性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）に基づくＪａｋ３相同性モデルを使用して、その推定されたドッキング親和性に基づいて選択される。移植片合併症、自己免疫誘導性糖尿病を処置もしくは防止する、または同種移植片生存を延長する、いくつかのキナゾリン化合物の能力が評価された。
【０００９】
米国特許出願公開第２００２／００３２２０４号明細書（Ｍｏｏｎら）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）、およびセチン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＳＴＫ）の触媒活性を調節する、所定の３−（ピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体の所定のＭａｎｎｉｃｈ塩基プロドラッグを記載する。これらのプロドラッグが、異常なタンパク質キナーゼ活性によって媒介される多くの疾患を処置するために有用であることが述べられている。開示された化合物が、多くの種類の固形腫瘍を治癒するための治療的アプローチとして、ＲＴＫ，ＣＴＫ、および／またはＳＴＫ媒介性のシグナル伝達経路を調節すると述べられている。その他のＭａｎｎｉｃｈ塩基化合物が記載され、そして細胞傷害性および抗ガン特性について記載および評価されている３４、３５。抗真菌および抗新生物特性を有する共役スチリルケトンの所定のＭａｎｎｉｃｈ塩基は、米国特許第６，０１７，９３３号明細書の主題である。
【００１０】
近年、Ｊａｋ３に対して選択性を示す２つの薬剤が同定された２１、２４、２５。ＡＧ−４９０と示される一方の薬剤は、チルホスチンファミリーメンバーであり、ベンジリデンマロノニトリルの誘導体であり、これは以下の構造式を有する：
【００１１】
他方は、ＰＮＵ１５６８０４であり、これは毒性の親化合物ウンデシルプロジギオシンの同族体であり、以下の構造式を有する：
【００１２】
ＡＧ−４９０およびＰＮＵ１５６８０４の両方は、ＴＣＧＦおよびＪａｋ３自己キナーゼ活性によって媒介されるＴ細胞増殖を阻害するために有能である一方で、Ｊａｋ３を発現しない非活性化Ｔ細胞に対しては制限された効果を有する。これらの２つの薬剤のいずれも、ｐ５６ＬｃｋまたはＺａｐ７０チロシンキナーゼを含むＴ細胞受容体活性化カスケードの中間体に影響しないことが見出された２３、２５。
【００１３】
１つの研究において、ＡＧ４９０処置は、単核細胞（ＧＩＣ）の移植片浸潤と、エクスビボでＩＬ−２刺激されたＧＩＣのＳｔａｔ５ａ／ｂＤＮＡ結合とを減少したが、リボヌクレアーゼ保護アッセイによって判断されたようにＩＬ２Ｒ□の発現には影響しなかった。すなわち、Ｊａｋ３の阻害は、同種移植片生存を延長し、また、ＣｓＡの免疫抑制効果は増強するが、ＲＡＰＡの免疫抑制効果は増強しないと結論された。ＡＧ４９０は、その他のチロシンキナーゼファミリーメンバーのＬｃｋ、Ｌｙｍ、Ｂｔｋ、Ｓｙｋ、Ｓｒｃ、Ｊａｋ１、またはＴｙｋ２キナーゼを阻害しない一方で、その密接に関連するファミリーメンバーＪａｋ２に対しては類似の効果を及ぼすこともまた見出された２４。ＡＧ−４９０の有害な副作用は、免疫抑制治療のための日常的な臨床的使用を妨げる。
【００１４】
他方、ＰＮＵ１５６８０４は、ＩＬ−２によるＪａｋ３媒介性のＴ細胞増殖を阻害することによって、Ｊａｋ２を使用するその他の増殖因子（プロラクチン）に比較して、より優れた特異性を示した。キナーゼアッセイによって、ＰＮＵ１５６８０４が、Ｊａｋ３自己リン酸化を、Ｊａｋ２と比較して優先的に阻害したこと、ならびにＳｔａｔ５経路のような中間体エフェクター分子を共有したことが示された２５。その研究においては、ＰＮＵ１５６８０４は同種移植片生存を延長し、そしてＣｓＡとは相乗的に作用するが、ＲＡＰＡとは相加的に作用することが示された。ＰＮＵ１５６８０４は、（Ｊａｋ２自己キナーゼ活性と比較して）優先的にＪａｋ３を破壊し、それによって、γｃにより駆動されるＴ細胞クローン増殖を選択的に阻害することもまた証明された。現在のモデルは、Ｊａｋ３がｍＴＯＲの上流活性化因子であることを保持する。Ｊａｋ３は免疫細胞において発現されるので、Ｊａｋ３の阻害はＲＡＰＡと現在関連される有害な影響を伴わずにｍＴＯＲ活性化をブロックする。さらに、ＣｓＡ（Ｇ０〜Ｇ１移行をブロックする）と、ＰＮＵ１５６８０４（Ｇ１〜Ｓ増殖をブロックする）との相乗効果は、連続的な活性化シグナルをブロックすることにより、それによって、必要とされる各薬物の投薬量をより低くしながら有益な治療的効果を維持することにより、免疫抑制を行う新規なストラテジーを提供する２５。しかし、ＰＮＵ１５６８０４はその後、ヒトにおける治療的使用に対しては毒性が強すぎることが証明されている。
【００１５】
いくつかの現在利用可能な薬物は、急性の拒絶をブロックする見込みがあることが示されているが、連続的な免疫抑制の不在下では、慢性的な移植片破壊および永続的な同種移植片受容（例えば、移植寛容）の問題は衰えていない。これらの問題に十分に取り組む治療的方法、および有害な副作用を回避する医薬品が必要とされている。これらの目的に向かって、Ｔ細胞シグナル伝達を理解することにおいて、およびシグナル伝達経路における所定の分子を標的化するためのストラテジーを考案することにおいて、大幅な進歩があった。ＴＣＧＦによって活性化されるＴおよびＢリンパ球のシグナル３経路に固有の分子を、選択的にまたは特異的に阻害する薬剤が緊急に必要とされている。かかる薬剤は、その他の細胞に影響することなくＴ細胞のクローン増殖をブロックする大きな潜在性を有する。上述されたように、宿主対移植片疾患および移植片対宿主疾患のような望ましくない免疫応答を調節するために、Ｊａｋ３はシグナル３経路において固有の分子標的を表す。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００４２５１３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００３２２０４号明細書
【非特許文献１】Ｄａｔａｂａｓｅ ＭＢＡＳＥ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．２００３３６６６１４，ＫＡＨＮ ｅｔ ａｌ．’Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，’ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，２００３，３５／５，ｐｐ．１６２１−１６２３
【非特許文献２】Ｄａｔａｂａｓｅ ＭＢＡＳＥ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．２００３３９１４５１，ＭＡＮＥＺ，Ｒ．’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，’ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，２００３，１６／５，ｐｐ．３３２−３３６
【非特許文献３】Ｄａｔａｂａｓｅ ＣＡＰＬＵＳ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．１９９３：６０３０３２，ＤＩＭＭＯＣＫ ｅｔ ａｌ．’Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｍａｎｎｉｃｈ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｏａｌｋａｎｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，’ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２８（４），ｐｐ．３１３−２２
【非特許文献４】Ｄａｔａｂａｓｅ ＣＡＰＬＵＳ ｏｎ ＳＴＮ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｎｏ．１９９５：９６２２８１，ＤＩＭＭＯＣＫ ｅｔ ａｌ．’Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｍａｎｎｉｃｈ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ａｌｉｃｙｃｌｉｃ Ｋｅｔｏｎｅｓ，’，ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，１９９５，５０（１），ｐｐ．６６８−７１
【発明の開示】
【００１６】
好ましい実施態様の概要
本発明は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）を発現する任意の細胞型、好ましくは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞を含むリンパ系または骨髄系起源の細胞型（「リンパ系または骨髄系の細胞」）の機能および／または増殖を破壊または阻害する新規な方法を提供することによって、先行技術に存在する所定の欠点を克服することを目指している。したがって、本発明の所定の実施態様においては、リンパ球の機能および／または増殖の破壊または阻害は、所定の化合物、好ましくはＭａｎｎｉｃｈ塩基で細胞を処置して治療的な免疫抑制を獲得することによって達成される。本発明の所定の実施態様においては、Ｊａｋ３を優先的に破壊する一方でその他の広く散在するタンパク質チロシンキナーゼには実質的に影響しない免疫抑制剤として作用し得ることが以前は未知のもしくは認識されていなかった、所定のＭａｎｎｉｃｈ塩基化合物またはその他の化合物を用いるインビボおよびインビトロでの治療方法および試験方法が提供される。治療的に用いられる際、これらの薬剤はまた、今日使用されている従来の免疫抑制剤に付随する深刻な副作用を完全にまたは少なくともある程度回避する。かかる方法は、臓器移植拒絶を軽減する上で、自己免疫疾患、気道過敏症（例えば喘息）、アレルギーの寛解を促進する上で、ならびにＪａｋ３依存性の白血病およびリンパ腫の腫瘍の増殖、およびＪａｋ３を発現するリンパ系または骨髄系起源の細胞におけるその他のＪａｋ３依存性の異常を阻害する上で、臨床的に有用であると期待される。
【００１７】
したがって、本発明のいくつかの実施態様においては、Ｔリンパ球、単球、または樹状細胞のようなリンパ系または骨髄系の細胞がＪａｋ３を有するかまたは発現する、リンパ系または骨髄系の細胞の増殖および／または活性を阻害するインビトロの方法が提供される。方法は、Ｊａｋ３を選択的に阻害し得る化合物の存在下で細胞を培養する工程を有する。いくつかの実施態様においては、下記の式（Ｉ）を有する化合物が用いられる。
【００１８】
ここでＲ１は、Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＨ２ＳＣ６Ｈ５、ＣＨ２ＳＣＨ２−（４−Ｃ６Ｈ４ＯＣＨ３）、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２であり；Ｒ２は、Ｏであり；およびＲ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、およびＣＨ２−（Ｎ−モルフィル）である。好ましい実施態様においては、化合物は式（Ｉ）を有する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）であり、Ｒ１およびＲ３はそれぞれＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である。別の好ましい実施態様においては、化合物は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のメソの立体異性体の形態であり、ＷＰ９３８として示される。
【００１９】
所定の実施態様においては、Ｊａｋ３を発現するリンパ系または骨髄系の細胞を、前記Ｊａｋ３の活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物または前記化合物の塩に接触させる工程を有する、リンパ系または骨髄系の細胞の機能および／または増殖を阻害する方法が提供される。
【００２０】
ここでｎは１、２、３、４、または６であり；Ｒ１は、Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；Ｒ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００２１】
所定の実施態様においては、Ｊａｋ３を発現するリンパ系または骨髄系の細胞を、前記Ｊａｋ３の活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式（ＩＩＩ）の少なくとも１つの化合物または前記化合物の塩に接触する工程を有する、リンパ系または骨髄系の細胞の機能および／または増殖を阻害する方法が提供される。
【００２２】
ここでｎは１または２であり；Ｒ１は、Ｈ、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；Ｒ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００２３】
上述のような、リンパ系の細胞の機能および／または増殖を阻害する方法のいくつかの実施態様において、リンパ系の細胞は活性化Ｔ細胞であり、方法は細胞分裂がブロックされるようにシグナル３経路を干渉する工程を有する。いくつかの実施態様においては、リンパ系の細胞は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を選択的に阻害するのに有効、かつその他のタンパク質チロシンキナーゼの活性を阻害するのに実質的に無効な濃度において、化合物に接触される。いくつかの実施態様においては、Ｊａｋ３活性は、キナーゼアッセイにおいて、Ｔ細胞のようなリンパ球の集団のＪａｋ２活性よりも少なくとも５０倍多く阻害される。いくつかの実施態様においては、方法は、ＩＬ２により活性化されたＪａｋ３およびＳｔａｔ５ａ／ｂを阻害するのに十分な濃度において、プロラクチン（ＰＲＬ）によってＪａｋ２およびＳｔａｔ５ａ／ｂ活性化が阻害される可能性がないかまたは小さい１つ以上の化合物を選択する工程を有する。
【００２４】
本発明のさらに他の実施態様においては、治療的な免疫抑制剤として有用な物質を同定することを補助するインビトロの試験方法が提供される。かかる方法は以下の工程を有する。（ａ）細胞培養培地中に静止状態のＪａｋ３依存性Ｔリンパ球の集団を獲得する工程；（ｂ）随意に、静止状態のＴリンパ球を、リンパ球が増殖することを刺激するために、サイトカインで前処理する工程；（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）からの静止状態のまたは刺激されたリンパ球を、前述のような、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を有する化合物またはそれらの塩で処置する工程；（ｄ）工程（ｃ）からのリンパ球を、細胞増殖を促進する条件下で培養する工程；（ｅ）工程（ｄ）後の細胞増殖の程度を評価する工程；（ｆ）随意に、Ｊａｋ２依存性Ｔリンパ球増殖に対する前記化合物の阻害効果を評価する工程；（ｇ）随意に、前記化合物の細胞傷害性を評価する工程；（ｈ）工程（ｅ）からの、ならびに、存在する場合は、工程（ｆ）および（ｇ）からの評価によって、化合物の細胞傷害性に起因しないＪａｋ３依存性リンパ球、またはその他のＪａｋ３を発現する細胞型の増殖の有意な阻害が、インビボの治療的使用のための候補薬物としての、Ｔ細胞媒介性の免疫抑制剤としての、および／またはＴ細胞増殖のインヒビターとしての潜在性をその化合物が有することを示唆すると判断する工程；および（ｉ）随意に、工程（ｅ）および（ｆ）からの評価を比較し、工程（ｆ）において評価される阻害効果が工程（ｅ）において評価される阻害効果よりも小さい場合は、前記化合物がＪａｋ２活性、または別のキナーゼを阻害することに比較して、Ｊａｋ３活性を阻害することに少なくともある程度選択的であることを前記比較から判断する工程。
【００２５】
本発明の別の実施態様によれば、哺乳動物被験体において細胞の望ましくない機能を抑制するインビボの方法が提供され、細胞はＪａｋ３を有する。方法は、細胞を、上述の式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を有する化合物のうちの少なくとも１つ、またはその代謝物もしくは誘導体に、細胞におけるシグナル３経路を干渉し、それによって細胞機能を阻害するのに有効な量において、接触させる工程を有する。接触させる工程は、かかる化合物の少なくとも１つ、または活性な代謝物のような化合物の成熟型、または被験体の身体内において前記化合物に転換され得る前記化合物の前駆体、またはそれらのうちのいずれかの薬学的に受容可能な塩を、薬学的に受容可能なキャリア中に含む、治療的に有効な量の薬学的組成物を被験体に投与して、Ｊａｋ３依存性の細胞機能を阻害する工程を有する。投与する工程は継続的または周期的に行われる。いくつかの実施態様においては、Ｊａｋ３を有する細胞はＴ細胞であり、投与される薬学的組成物の量はＴ細胞における細胞分裂をブロックするのに有効である。所定の好ましい実施態様においては、化合物、代謝物、誘導体、または前駆体の腎臓毒性はシクロスポリンＡの腎臓毒性よりも小さい。
【００２６】
本発明の所定の実施態様によれば、望ましくない免疫応答を抑制するために哺乳動物被験体を治療的に処置する方法が提供される。ここで被験体は望ましくない免疫応答を経験しているかまたは経験する危険性がある。この方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制する上述の方法を行う工程を有する。ここで治療的に有効な量の薬学的組成物は前記望ましくない免疫応答を軽減または防止する。所定の実施態様においては、方法はさらに、Ｊａｋ３インヒビターの他の免疫抑制剤；例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６、の治療的に有効な量を被験体に投与する工程を有する。このことは、シグナル１経路を介してＴ細胞をブロックすることにより、およびまたシグナル３経路を干渉することを介して活性化Ｔ細胞の細胞分裂をブロックすることにより、Ｔ細胞機能を阻害する利点を提供する。
【００２７】
本発明の所定の実施態様によれば、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、移植される臓器に対するＴ細胞媒介性の免疫応答を抑制するのに有効な上述の方法を行い、それによって臓器の拒絶が軽減または停止される工程を有する、哺乳動物移植片レシピエントにおける臓器移植拒絶を軽減する方法が提供される。
【００２８】
本発明の所定の実施態様によれば、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性の抗同種移植片免疫応答を抑制するのに有効な上述の方法を行い、それによって同種移植片の急性の拒絶が軽減または防止される工程を有する、哺乳動物同種移植片レシピエントにおける急性の同種移植片拒絶を軽減する方法が提供される。いくつかの実施態様においては、Ｊａｋ３インヒビター組成物の継続的なまたは周期的な投与を有する、慢性の同種移植片拒絶予防のための方法が提供される。
【００２９】
本発明の所定の実施態様によれば、哺乳動物移植片レシピエントにおいて移植寛容を誘導するための方法が提供される。方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性の移植片拒絶応答を抑制するのに有効な、上記の方法を行う工程を有する。
【００３０】
本発明の所定の実施態様によれば、自己免疫疾患の寛解を、前記疾患を被る哺乳動物被験体において促進する方法が提供される。方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、前記被験体におけるＴ細胞媒介性の自己免疫応答を抑制するのに有効な、上述の方法を行う工程を有し、それによって内因性のＪａｋ３依存性Ｔ細胞によって媒介される被験体のネイティブな組織に対する自己免疫攻撃が減少または停止される。
【００３１】
本発明の所定の実施態様によれば、気道過敏症を、前記過敏症を被る哺乳動物被験体において軽減する方法が提供される。方法は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性の過敏症応答を抑制するのに有効な、上述の方法を行う工程を有し、それによって被験体における気道組織の過敏症が減少または停止される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施態様は、哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制して、Ｔ細胞媒介性のアレルギー応答を抑制するのに有効な、上述の方法を行う工程を有し、アレルギーを、前記アレルギーを被る哺乳動物被験体において軽減する方法が提供される。それによって被験体におけるアレルギー反応が減少または停止される。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様は、白血病またはリンパ腫を被る哺乳動物被験体において望ましくないリンパ球機能を抑制する上述の方法を行う工程を有し、Ｊａｋ３依存性の白血病またはリンパ腫の増殖を阻害する方法を提供する。好ましい実施態様においては、化合物またはその代謝物もしくは誘導体は、その他のキナーゼ（例えば、Ｊａｋ２）の活性の阻害に比較して、Ｊａｋ３活性を選択的にまたは特異的に阻害し得る。薬学的組成物の量は、白血病またはリンパ腫の細胞の増殖を阻害またはブロックするのに有効である。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様においては、Ｔ細胞媒介性の免疫応答に関連する生物学的なプロセスを解明するために、および新規な免疫抑制薬物を同定するために有用なインビトロの方法が提供される。いくつかの実施態様においては、以下の工程を有する、新規な免疫抑制薬物を同定することを補助するインビトロの方法が提供される。（ａ）Ｊａｋ３を有するＴ細胞を目的の化合物にある濃度の範囲にわたって接触させて、化合物が範囲内の１つ以上の濃度においてＪａｋ３活性を阻害するか否かを判断することによって、Ｔ細胞機能を破壊するための活性について目的の化合物を試験する工程；（ｂ）目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、既知のＪａｋ３阻害活性を有する式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の化合物、好ましくは６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のＪａｋ３阻害活性とを比較する工程；ならびに（ｃ）かかる試験および比較の結果を使用して、目的の化合物が治療的な免疫抑制剤としてインビボで使用するための候補薬物であるか否かを判断する工程。いくつかの実施態様においては、方法はまた、（ｄ）目的の化合物を１つ以上のその他のキナーゼ（たとえば、Ｊａｋ２）の阻害活性について試験する工程；（ｅ）目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、もしあれば１つ以上のその他のキナーゼのその阻害活性とを比較する工程；および（ｆ）比較を使用して、目的の化合物を選択的なＪａｋ３インヒビターとして同定する工程も有する。
【００３５】
本発明の別の実施態様においては、所定のＪａｋ３選択的または特異的なインヒビターを用いるインビボの試験方法が提供される。かかる方法は、動物モデルにおいてＴ細胞媒介性の免疫応答を研究するために有用であり、ならびに６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）、ＷＰ９３８、および図１４Ｂ〜３９Ｂにおいて同定されるその他の化合物のような化合物は、候補Ｊａｋ３特異的インヒビターの活性を比較するための標準として作用する。候補免疫抑制薬物を同種移植片生存に対するこの効果について試験するためのかかる方法の１つは、以下の工程を有する：（ａ）適切なドナー動物から採取された同種移植片を、適切なレシピエント動物に移植する工程；（ｂ）動物についての基本栄養素および健康促進条件を維持する工程；（ｃ）候補薬物を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、処置されたレシピエントまたは群を提供する工程；（ｄ）請求項１において規定されるような化合物を少なくとも１つの動物に投与してポジティブコントロール群として作用させる工程であって、Ｒ１およびＲ３はそれぞれＣＮ（ＣＨ３）２であり、ならびにＲ２はＯである工程；（ｅ）随意に、少なくとも１つのレシピエント動物を未処置のままにして未処置のコントロールレシピエントまたは群として作用させる工程；（ｆ）各レシピエントにおける各同種移植片の同種移植片生存時間を判断する工程；（ｇ）各同種移植片の組織学的検査を行い、必要に応じて、各同種移植片に対する候補薬物関連性の構造的損傷を評価する工程；（ｈ）各同種移植片において、同種移植片生存時間および候補薬物誘導性の組織学的構造変化を比較する工程；ならびに（ｉ）（ｈ）からの比較を使用することで、未処置のコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、またはポジティブコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、エンハンスされた移植片生存時間および薬物処置された同種移植片に対する薬物誘導性の構造的損傷の欠如が、候補薬物が免疫抑制剤としてインビボで治療的に使用される場合に有効である可能性が高いことを標示していると判断する工程。いくつかの実施態様においては、方法はまた、候補薬物が、Ｊａｋ３依存性のＴ細胞増殖をインビトロで選択的に阻害し得ると判断する工程も有する。
【００３６】
所定の他の実施態様においては、インビボの免疫抑制の潜在性について候補薬物を評価するインビボの方法が提供される。候補薬物は好ましくは、先ずＪａｋ３依存性Ｔ細胞増殖をインビトロで選択的に阻害し得るとして同定される。方法は、以下の工程を有する。（ａ）適切なドナー哺乳動物から採取された同種移植片を、適切なレシピエント動物に移植する工程；（ｂ）動物についての基本栄養素および健康促進条件を維持する工程；（ｃ）候補薬物を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、処置されたレシピエントまたは群を提供する工程；（ｄ）６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、標準レシピエントまたは群として作用させる工程；（ｅ）好ましくは、少なくとも１つのレシピエント動物を未処置のままにして未処置のコントロールレシピエントまたは群として作用させる工程；（ｆ）各レシピエントにおける各同種移植片の同種移植片生存時間を判断する工程；（ｇ）各同種移植片の組織学的検査を行い、必要に応じて、各同種移植片に対する薬物関連性の構造的損傷を評価する工程；ならびに（ｈ）各同種移植片において、同種移植片生存時間および薬物誘導性の組織学的構造変化を比較する工程；ならびに（ｉ）（ｈ）からの比較を使用することで、未処置のコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、またはポジティブコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、エンハンスされた移植片生存時間および薬物処置された同種移植片に対する薬物誘導性の構造的損傷の欠如が、候補薬物が免疫抑制剤としてインビボで治療的に使用される場合に有効である可能性が高いことを標示していると判断する工程。本発明のこれらのおよびその他の実施態様、特徴、および利点は、以下の記載および図面を参照して明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書中に記載される研究において、生化学的中間体−酵素Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）が成熟Ｔ細胞の活性化、機能、および同種移植片拒絶にとって重要であることが確認される。本明細書中で同定される所定の化合物、特にＭａｎｎｉｃｈ塩基として分類される化合物は、選択的にＪａｋ３を阻害し、ＣｓＡ、ＦＫ５０６、およびＲＡＰＡのような従来の免疫抑制薬物を越える治療的利点を提供し得る。上述の背景のセクションに記載されたように、ＲＡＰＡはｍＴＯＲを阻害する一方、ＣｓＡおよびＦＫ５０６はＣａＮをブロックし、これらの標的分子の両方とも、遍在的な発現プロフィールを示し、強力な毒性副作用を引き起こす。それとは対照的に、Ｊａｋ３発現は、ＴおよびＢリンパ球を含むリンパ系区分に排他的に制限される。
【００３８】
最初に、Ｊａｋ３のアンタゴニストを同定および特徴づけを目指して一連の試験が行われた。それによって、Ｊａｋ３のアンタゴニストはＴＣＧＦ依存性経路のファミリー全体を阻害する。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基およびその他の化合物の群が、ある濃度の範囲にわたって、選択的なＪａｋ３阻害活性についてスクリーニングされた。プロラクチン（ＰＲＬ）刺激された（すなわち、Ｊａｋ２依存性の）Ｔ細胞増殖に比較して、ＩＬ−２刺激された（すなわち、Ｊａｋ３依存性の）Ｔ細胞増殖の選択的な阻害のいくつかの基準を示した化合物は、構造的に類似するいくつかの化合物とともに、図１４Ｂ〜３９Ｂに、それらの構造式により示される。各化合物の対応する阻害活性は、図１４Ａ〜３９Ａに示される。図２２Ａは、図２１Ａのアッセイに類似するアッセイの結果を示すが、図２１Ｂと同じ化合物の僅かに異なる純度の調製物を伴う。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基に加えて、構造的に類似の化合物（図２５Ｂおよび２６Ｂ）が、試験された化合物の中に含まれる。以下の材料および一般的な方法が、実施例においてそうではないと記載された場合を除いて使用された。代表的な化合物、６４９６４１Ｐはまた、ＮＣＩ薬物データベース番号ＮＣ１１５３によって本明細書中で参照され、および図１８Ｂに示されるメソの立体異性体（ＷＰ９３８と称される）は、同一の選択的なＪａｋ３阻害をインビトロで示し、単独でまたはＣｓＡと組合わせて同種移植片生存を延長する能力について、ならびに薬物誘導性の毒性についてさらに試験された。
【００３９】
［一般的な方法および材料］
［細胞培養および処置］
ラットＴ細胞株Ｎｂ２−１１ｃは、元来Ｐｅｔｅｒ Ｇｏｕｔ博士（Ｖａｎｖｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）によって開発され、１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、カタログ番号１０２０−９０）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、およびペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、５０ＩＵ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）を伴うＲＰＭＩ−１６４０中で、３７℃／５％ ＣＯ２にて増殖された。等遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）；ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）によって精製された、新鮮に外殖された正常なヒトＴリンパ球は、以前に記載されるように２３、７２時間、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）活性化された。Ｔリンパ球は、洗浄し、サイトカインへの曝露の前に、１％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間インキュベートすることによって、静止状態にされた。次に、細胞は図面の説明において以下に記載されるように、種々の濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置された。Ｍａｎｎｉｃｈ塩基６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ＪｏｎａｔｈａｎＤｉｍｍｏｃｋ 博士 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ、Ｃａｎａｄａにより快く提供された。次いで、全ての細胞は１ｎＭ組換えヒトＩＬ−２（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｂａｓａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＩＬ−４もしくはＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎ ａｎｄ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ、ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅｓａｓｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって供給されたヒツジプロラクチン（ＰＲＬ）で、３７℃にて刺激された。細胞ペレットは−７０℃にて凍結された。
【００４０】
［増殖アッセイ］
静止状態ヒト１次Ｔ細胞、ＹＴ、またはラットＮｂ２−１１ｃ Ｔ細胞（５．０×１０４／ウェル）が、１ｎＭ ＩＬ−２、−４、−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）またはＰＲＬの不在下または存在下、２００μｌの静止状態の培地中、平底の、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて播種された。次に、細胞は、Ｍａｎｎｉｃｈ塩基薬物で１６時間処置され、次いで４時間、［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／２００μｌ）でパルスされ、そして線維ガラスフィルター上に採集された。［３Ｈ］−チミジン取り込みは、以前に記載されるように２３、液体シンチレーション計測によって、または当該分野において周知である標準的な技術を使用して、分析された。
【００４１】
［膜タンパク質の可溶化、免疫沈降、およびウェスタンブロット分析］
凍結された細胞ペレットは、以前に記載されるように１６、氷上で解凍され、そして１％ ＴＸ−１００溶解緩衝液（１０８細胞／ｍｌ）中で可溶化され、そして遠心分離によって分類された。ヒトＴ細胞に対しては、上清は、Ｊａｋ３の固有ＣＯＯＨ末端（アミノ酸［ａ．ａ］１１０４〜１１２４）、ヒトＳｔａｔ５ａ（ａ．ａ７７５〜７９４）のカルボキシル末端、またはＳｔａｔ５ｂ（ａ．ａ７７７〜７８７）のカルボキシル末端２６のいずれかに由来するペプチドに対して産生された５μｌ／ｍｌポリクローナルウサギ抗血清とともに、２時間、４℃にて、上下回転してインキュベートされた。Ａｂおよび免疫沈降されたタンパク質が、プロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）との３０分間のインキュベーションにより捕獲され、精製のために沈降され、そして２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８中の２０％ グリセロール、１０％ ２−メルカプトエタノール、４．６％ ＳＤＳ、０．００４％ ブロモフェノールブルー）中で４分間煮沸することによって溶出された。ホスホＭａｐｋアッセイに対しては、約２５μｇの全細胞可溶化物がＳＤＳサンプル緩衝液中に解離され、そして還元条件下、１０％（ほかの全ては７．５％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された。タンパク質は、以前に記載されるように２７、二フッ化ポリビニリデン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）；カタログ番号１ＰＶＨ０００１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）にトランスファーされた。ウェスタンブロット分析が、ｐＡｂ、マウス抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ｍＡｂ；ＵＢＩ；４Ｇ１０；カタログ番号０５〜３２１、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）または、ホスホ ｐ４４／４２ Ｍａｐｋ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、カタログ番号９１０１）を用いて行われた。上述の抗体、ウサギ抗ホスホ−Ｅｒｋ１／２、およびモノクローナルｐａｎ−Ｅｒｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号Ｅ１７１２０）でウェスタンされたブロットは、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈され、そして以前に記載されるように２７、または当該分野において周知である標準的な技術を用いて使用された。ウサギ抗ホスホ−チロシン（□ＰＹ）、およびモノクローナルマウス抗−Ｆｙｎ、または抗−Ｌｃｋ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号６１０１６３［Ｆｙｎ］および６１００９７［Ｌｃｋ］）でウェスタンされたブロットは、以前に記載されるように２７、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈された。
【００４２】
［ラット腎臓移植］
Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得られた成体雄性ＡＣＩ（ＲＴ１ａ）およびＬｅｗｉｓ（ＬＥＷ；ＲＴ１１）ラット（１６０〜２００ｇ）は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って飼育された。ラットは、光および温度制御された部屋で飼育され、そして食事および水が適宜与えられた。腎臓は、ＯｎｏおよびＬｉｎｄｓｅｙ２８の標準的な超微細手術を使用して、ＬＥＷドナーからＡＣＩレシピエントに異種局所的に移植された。免疫抑制薬物の評価に対しては、移植片レシピエントは、毎日の静脈内（ｉ．ｖ．）注射または経口強制飼養（ｐ．ｏ．）によって、Ｍａｎｎｉｃｈ塩基化合物を、単独で、または経口強制飼養により毎日投与されるＣｓＡもしくはＲＡＰＡと組合わせて与えて処置された。レシピエントのコントロール群は未処置のままであった。いくつかのレシピエントは、ＣｓＡまたはＲＡＰＡ単独で処置された。移植片生存時間は、腎臓移植片を支持する動物の生命の生存として規定された。結果は、平均生存時間（ＭＳＴ）±標準偏差（ＳＤ）として表され、Ｇｅｈａｎ生存検定により統計学的有意性について評価された。さらに、Ｍａｎｎｉｃｈ塩基と、ＣｓＡまたはＲＡＰＡとの間の相互作用が、５０％有効分析２９、３０によって評価された。コンピューターソフトウェアが、組合わせ指標（ＣＩ）値を算定するために使用され：ＣＩ＜１は相乗的な相互作用、ＣＩ＞１は拮抗的な相互作用、またはＣＩ＝１は相加的な相互作用を示した３０。
【００４３】
［組織病理学的評価］
ＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＩ（ＲＴ１ａ）レシピエントは、以下に続く実施例において記載されるように処置された。移植後７日目に、腎臓同種移植片がＢｏｕｉｎ´ｓ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｐｏｌｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒ＆Ｄ Ｃｏｒｐ．、Ｂａｙ Ｓｈｏｒｅ、ＮＹ）に置かれた。各腎臓は、単回の水平切開、続く３つの連続的な切開からなる同一の方法で切り取られて、スライドを作成するために使用された。次に、別の切開が行われ、続いてさらに３つの連続的な切片およびスライドが作成された。腎臓当たり合計１２個のスライドが、以前に記載されるように３１、または当該分野において周知である標準的な技術を使用して、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。拒絶の程度は、Ｈｅｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎによって確立された基準３２に従って分類された。特に、腎臓は、緩衝化１０％ホルマリン中に固定化されて一晩処理され；３−□組織学的切片は、漸進性のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）試薬で染色された。２つの独立した病理学者が、複数の腎臓切片における血管障害、糸球体の変化、および尿細管間質障害の程度を評価するために、光学顕微鏡基準の半定量スケールを使用した。尿細管および糸球体の変化は、別々に、０＝変化なし；１＋＝＜５％；２＋＝５〜２５％；３＋＝２６〜５０％；および４＋＝＞５０％関与として分類された。類似の血管スケールは、０＝なし；１＋＝最小；２＋＝軽度；３＋＝中程度；および４＋＝重篤を含んだ。
【００４４】
［ＥＭＳＡ］電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。
薬物またはベヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で処置された細胞は、遠心分離（２０，０００×ｇ、１分間、４℃にて）によりペレット化され、そして続いて５容量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＰＭＳＦ、５□ｇ／ｍｌアプロチニン、１□ｇ／ｍｌペプスタチンＡ、および２□ｇ／ｍｌロイペプチン中で洗浄され、遠心分離され、次いで１％ ＮＰ−４０が補充された同じ緩衝液中に溶解され、そして２０分間氷上でインキュベートされた。核を含むペレットは、等容量の低塩緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼインヒビター）および高塩緩衝液（８００ｍＭ ＫＣｌを含む低塩緩衝液）中に再懸濁された。次いで、この画分は４℃にて１０分間の遠心分離によって単離され、そして上清は核タンパク質抽出物として保存され、そして−７０℃で貯蔵された。ゲル移動度シフトアッセイが、Ｓｔａｔ５ａ／ｂ ＤＮＡ結合活性を検出するために、□−カゼイン遺伝子のプロモーター（５´−ＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣ−３´）またはＮＦ−ｋＢ結合エレメント（５´−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣ−３´）に対応するＳｔａｔ５ＤＮＡ結合配列を使用して行われた。両方のプローブは、［３２Ｐ］ｄＡＴＰで末端標識化された。次いで、標識化オリゴヌクレオチドは、１５□ｌの結合カクテル（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、５０％ グリセロール）中、４℃にて２時間、５□ｇの核抽出されたタンパク質とともにインキュベートされた。スーパーシフトアッセイについて、核抽出物は、１□ｇの正常なウサギ血清またはＳｔａｔ５ａ、Ｓｔａｔ５ｂ、もしくはｐ５０／ｐ６５ ＮＦ□Ｂに特異的な抗血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ；それぞれ、カタログ番号ｓｃ−１１９０Ｘおよびｓｃ−３７２Ｘ）のいずれかとともに、４℃にて１時間、説明書において示されるように、予めインキュベートされ、次いで［３２Ｐ］−標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチドとともに、１５分間室温でインキュベートされた。ＤＮＡ−タンパク質複合体は、０．２５×ＴＢＥ緩衝液中で、１時間、１００Ｖにて予め泳動された、０．２５×ＴＢＥを含む５％ポリアクリルアミドゲル上で分解された。サンプルはロードされ、そしてゲルは室温で約２時間、１５０Ｖにて泳動され、次いで減圧下で過熱することによって乾燥され、そしてＸ線フィルム（Ｘ−Ｏｍａｔ、Ｋｏｄａｋ）に、−７０℃にて露光された。
【００４５】
［Ｍａｎｎｉｃｈ塩基およびその他の化合物］
最初の研究において使用された化合物６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｒｃｈｅｗａｎ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、ＣａｎａｄａのＪｏｎａｔｈａｎ Ｒ．Ｄｉｍｍｏｃｋ博士から提供された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）および図１４Ｂ〜３９Ｂにおいて同定される化合物を含むその他の化合物は、ｔｈｅ Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴｅｘａｓのＷａｌｄｅｍａｒ Ｐｒｉｅｂｅ博士によって調製された。本明細書中に記載される化合物は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のようなサプライヤーから入手可能な市販の出発物質および試薬によって調製され得る。Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ´ｓ ＲＥＡＧＥＮＴ ＦＯＲ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＥＳＩＳ、第１〜１７巻（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９１）；Ｒｏｄｄ´ｓ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＣＡＲＢＯＮ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ、第１〜５巻およびその増刊（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８９）；ＯＲＧＡＮＩＣ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ、第１〜４０巻（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９１）、Ｍａｒｃｈ´ｓ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第４版）、およびＬａｒｏｃｋ´ｓ ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．、１９８９）のような参考文献において記載されるように、標準的な化学合成技術および手順が用いられ得る。化合物を合成するためのさらなる手引きは、定期刊行物、例えば、Ｄｉｍｍｏｃｋ３４、３５の出版物において、および以下に記載されるように、見出され得る。
【００４６】
以下の制限されない例は、代表的なＪａｋ３選択的インヒビター化合物の特徴および使用の説明であり、および本発明をいかようにも制限することを意味するものではない。
【００４７】
［実施例１．Ｍａｎｎｉｃｈ塩基６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のインビトロでの効果］
６４９６４１Ｐ（Ｃ１８Ｈ３８Ｃ１２Ｎ２Ｏ；分子量３６９．４１）と示されるＭａｎｎｉｃｈ塩基はまたＮＣ１１５３として、その立体異性体の混合物として参照され、以下の一般式を有するが、
Ｊａｋ３対Ｊａｋ２依存性の増殖を受けるＴ細胞に添加されて、上述のように、Ｊａｋ３を選択的に阻害するその能力が試験された。図１Ａは、γｃ／Ｊａｋ３−依存性のＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示すグラフである。静止状態のＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞（５．０×１０４細胞／ウェル）は、１ｎＭヒトＩＬ−２（■）、ＩＬ−４（●）、またはＩＬ−７（▲）の存在下または不在下で、漸増濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（縦座標）とともに、１６時間３７℃にて培養された。次いで細胞は、［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／２００μｌ）で４時間パルスされ、そして取り込まれた放射標識化プローブが横座標上にプロットされ、ＤＭＳＯ処置されたサンプルセット（ｎ＝６）からの全ｃｐｍの阻害％として表された。
【００４８】
図１Ｂは、Ｊａｋ２活性化因子（プロラクチン；ＰＲＬ［○］）またはＪａｋ３活性化因子〈インターロイキン−２；ＩＬ−２［■］〉の存在下で培養されたＴ細胞の増殖に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示す。ラットＴ細胞株（Ｎｂ２−１１ｃ）が選択されたのは、それがＰＲＬ／Ｊａｋ２またはＩＬ−２／Ｊａｋ３刺激のいずれかに応答するからである。静止状態ラットＴ細胞（５．０×１０４細胞／ウェル）は、Ｊａｋ２活性化因子（１ｎＭ ＰＲＬ（［○］）またはＪａｋ３活性化因子（１ｎＭ ＩＬ−２［■］）の存在下、漸増濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（縦軸；０〜１００μＭ）とともに、１６時間３７℃にて培養された。細胞は、アッセイの最後の４時間、［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／２００μｌ）でパルスされ、次いでＤＮＡが取り込まれた放射標識化プローブが横軸上にプロットされ、ＤＭＳＯ処置されたサンプルセット（ｎ＝４）からの全ｃｐｍの阻害％として表された。図１Ａ〜Ｂに示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、γｃ／Ｊａｋ３依存性の細胞増殖を選択的に阻害するが、ＰＲＬ／Ｊａｋ２依存性の細胞増殖は阻害しない。特に、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−７に応答してＮｂ２−１１ｃ細胞増殖を等しく有効に阻害することを証明したが、同化合物は、Ｊａｋ２依存性の増殖よりもＪａｋ３依存性の増殖を３倍有効に阻害した。
【００４９】
図２Ａ〜Ｃにおいては、Ｊａｋ３／Ｓｔａｔ５シグナル経路に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果が示される。ヒトＹＴ細胞は、上昇する濃度（１〜１００μＭ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を伴わないで（ａ〜ｂ）、または伴って（ｃ〜ｉ）、２時間培養され、そして１００ｎＭ ＩＬ−２を伴って（＋）または伴わないで（−）、１０分間再抗原投与された。細胞は、抗Ｊａｋ３ ｐＡｂで免疫沈降され、そして図２Ａ、上部パネルに示されるように、抗ホスホチロシンｍＡｂでウェスタンブロットされ、次いで剥離されて抗Ｊａｋ３で再ブロットされた（図２Ａ、下部パネル）。これらのウェスタンブロットの実験結果は、Ｊａｋ３のチロシンリン酸化が、ヒトＹＴ細胞（１〜１００μＭ）においては６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）によって用量依存的に阻害されており、図１Ａに示される結果と相関する。ここで図２Ｂを参照すると、ヒトＹＴ Ｔ細胞はまた、上昇する濃度（１〜１００μＭ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を伴わないで（ａ〜ｂ）、または伴って（ｃ〜ｉ）、２時間培養され、そして１００ｎＭ ＩＬ−２を伴って（＋）または伴わないで（−）、１０分間再抗原投与された。細胞は、抗Ｓｔａｔ５ａ ｐＡｂで免疫沈降され、そして抗ホスホチロシンｍＡｂでウェスタンブロットされ（図２Ｂ、上部パネル）、次いで剥離されてＳｔａｔ５ａで再ブロットされた（図２Ｂ、下部パネル）。第３の試験において、この結果は図２Ｃに示され、ヒトＹＴ細胞は、上昇する濃度（１〜１００μＭ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を伴わないで（ａ〜ｂ）、または伴って（ｃ〜ｉ）、１６時間培養され、そして１００ｎＭ ＩＬ−２を伴って（＋）または伴わないで（−）、１０分間再抗原投与された。細胞は、抗Ｓｔａｔ５ｂ ｐＡｂで免疫沈降され、そして抗ホスホチロシンｍＡｂでウェスタンブロットされ（図２Ｃ、上部パネル）、次いで剥離されて抗Ｓｔａｔ５ａで再ブロットされた（図２Ｃ、下部パネル）。
【００５０】
ＩＬ−２はまた、アダプタータンパク質、Ｓｈｃを介して、Ｓｈｃ／Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｅｒｋ経路を強力に活性化する。ＳｈｃはＩＬ−２Ｒβ鎖のＴｙｒ３３８に結合して、最終的にＴ細胞増殖を駆動する。図３は、上述の実験に類似する実験の結果を示し、ここではＩＬ−２媒介性のｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２リン酸化に対する上昇する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）濃度の効果が研究された。静止状態のＰＨＡ−活性化Ｔ細胞は、ＤＭＳＯ（コントロール；レーンａ〜ｂ）または漸増濃度（ｃ〜ｉ）の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で２時間処置され、次いで１μｇの存在下、３７℃にて１０分間刺激された。細胞は溶解され、そして全細胞可溶化物は、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ＰＶＤＦ膜上にトランスファーされ、抗−ホスホ−ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２でウェスタンブロットされ（上部パネル）、次いで剥離されてｐａｎ Ｅｒｋ抗体で再プローブされた（下部パネル）。矢印は、ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２の位置を示す。これらの結果は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が、ヒトＴ細胞においてＩＬ２媒介性のＥｒｋ１／２活性化をブロックすることを明らかにする。
【００５１】
ＹＴ細胞は、活性化ＦｙｎおよびＬｃｋキナーゼを恒常的に発現し、その活性化ＦｙｎおよびＬｃｋキナーゼは、ＹＴ細胞のチロシンリン酸化状態について試験することによって示され得る。ＹＴ細胞は、様々な濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（１〜１００□Ｍ）とともに２時間培養された。細胞抽出物は、抗Ｆｙｎまたは抗Ｌｃｋ抗体で免疫沈降され、そして抗ホスホチロシン抗体（□ＰＹ）でウェスタンブロットされ、次いで剥離されて抗Ｆｙｎまたは抗Ｌｃｋ抗体で再ブロットされた。図４は、上述の実験の結果を示す：ＹＴ細胞抽出物は、抗Ｆｙｎで免疫沈降され、そして抗ホスホチロシン抗体（□ＰＹ）でウェスタンブロットされ（第１列）、次いで剥離されて抗Ｆｙｎで再ブロットされ（第２列）；ＹＴ細胞は抗Ｌｃｋ抗体で免疫沈降（ＩＰ）されて抗ホスホチロシン抗体（□ＰＹ）でウェスタンブロットされ（第３列）、次いで剥離されて抗Ｌｃｋ抗体で再ブロットされた（第４列）。ＹＴ細胞はベヒクルのみとともに（レーンａおよびｂ）、または上昇する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）濃度（１〜１００□Ｍ）（レーンｃ〜ｉ）とともに培養された。これらの結果は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＦｙｎまたはＬｃｋキナーゼの活性をブロックしないことを示す。
【００５２】
上述の結果は、その他のインヒビターはＪａｋ３およびＪａｋ２の応答性細胞増殖を阻害する（約１０〜２５μＭのＩＣ５０）一方で、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は約２．５μＭのＩＣ５０を伴って細胞増殖を破壊することによってより有効であったことを示す。さらに、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＩＬ４またはＩＬ７駆動の細胞増殖を同じ濃度において有効に阻害した（約２．５□□のＩＣ５０）。この薬剤は、ホスホウェスタンブロットによって測定されたように、Ｊａｋ３およびその基質、すなわちＳｔａｔ５ａ／ｂ、アダプタータンパク質Ｓｈｃ、およびＥｒｋ１／２のチロシンリン酸化を阻害した。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、以前に記載された約１０□□のＩＣ５０を示すＰＮＵ１５６８０４ Ｊａｋ３インヒビターよりも有効であった。さらに、オリゴヌクレオチドプローブへのＳｔａｔ５ａ／ｂ ＤＮＡ結合は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）によって大きく損なわれるが、この化合物は、ＴＮＦ−□誘導性のＮＦ−ｋＢ ＤＮＡ結合に対してなんら効果がないので、この転写因子に特異的であった。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物は非Ｊａｋ３発現ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＤＮＡ合成も、ＴＣＲシグナル伝達中間体ＬｃｋおよびＦｙｎチロシンキナーゼの活性化も阻害しなかった。
【００５３】
［実施例２．同種移植片生存に対するＭａｎｎｉｃｈ塩基６４９４６１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果］
インビボでの効果を試験するために、腎臓同種移植片のレシピエントは、移植後即座に開始して７日間、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置された。ＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＩ（ＲＴ１ａ）レシピエントは、２．５、５．０、１０．０、または２０．０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を７日間毎日のｉ．ｖ．注射単独で、または２．５、５．０、１０．０、もしくは２０．０ｍｇ／ｋｇのＣｓＡの経口強制飼養と組合わせることによって、処置された。ｉ．ｖ．または経口強制飼養によって送達されて単独で与えられた６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、表１に示されるように、投薬量依存的にラット腎臓同種移植片生存を延長した。８０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）ｐ．ｏ．は、ｉ．ｖ．注射された１０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）と類似の生存を生じたので、経口の生物学的利用能は、約１２．５％であると見積もられる。平均生存時間（ＭＳＴ）およびＳＤは、５〜６の実験から各群について算出された。組合わせ指標（ＣＩ）値は、５０％有効分析によって算出された（ＣＩ＜１は相乗的な相互作用、ＣＩ＞１は拮抗的な相互作用、およびＣＩ＝１は相加的な相互作用を示す）２９、３０。
【００５４】
経口強制飼養によって投与された、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の単独の、またはＣｓＡと組合わせた腎臓同種移植片生存に対する効果は、表２に示される。ＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＴ（ＲＴ１ａ）レシピエントは、４０、８０、または１６０ｍｇ／ｋｇ／ｄの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の７日間の経口強制飼養によって、単独で、または２．５、５．０、１０．０、または２０．０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＣｓＡの経口強制飼養と組合わせて、１日１回処置された。ＭＳＴおよびＳＤは、５〜６実験から各群について算出された。組合わせ指標（ＣＩ）値が算出された。
【００５５】
ＭＳＴ±ＳＤに係る表２に示される結果は、Ｇｅｈａｎ生存検定によって統計学的有意性について評価された。
【００５６】
結果に対して算出された組合わせ指標（ＣＩ）値対ＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）比は表１に示され、そしてこれらのデータは図５に示されるようにグラフ化された。ＣｓＡの経口の生物学的利用能が９０％であることを考慮して、４：１、３：１、２：１、および１．５：１のＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）比（ＣＩ＝０．１〜０．２７）は、１：１、１：２、または１：４のＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）比（ＣＩ＝０．３８〜０．６０）に比較して、より良好な相乗作用を示した。５０％有効分析および組合わせ指標（ＣＩ）値が、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）とＣｓＡとの間の相互作用の質を算出するために使用された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）およびＣｓＡの組合わせは、ＣＩ値（０．６〜０．１；図５）によって確認されるように、相乗的であり；１：２〜１：４の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）／ＣｓＡ比は最も有効であった（ＣＩ＝０．１〜０．２７；表１）。
【００５７】
結果をまとめると、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は腎臓同種移植片生存の用量依存性の延長を示し：７日間ｉ．ｖ．送達された２０ｍｇ／ｋｇ／日の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の投薬量は、２４．８±６．６日の（ｐ＝０．００００３：未処置コントロール；ＭＳＴ＝８．８±０．５日）、７または１４日間経口送達された２４０ｍｇ／ｋｇ／日の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、４７．８±１９．５９日または＞６０日（両方ともｐ＜０．００００１）のＭＳＴを生じた。ＣｓＡ単独（２．５、５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、３日間）での処置は、用量依存性の効果を生じ、最も高い用量にて、２４．５０±４．５８日のＭＳＴを達成する（ｐ＜０．０００１）。組合わせの処置は、各試薬での単剤治療と比較して、移植片生存における強力な相乗的相互作用を明らかにした。例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ／日の７日間の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独のｉ．ｖ．投与は、９．５±１．４日のＭＳＴを生じ、３日間の１０ｍｇ／ｋｇ／日のＣｓＡ単独の静脈内投与は、２１．２±５．３日のＭＳＴを生じるが、２つの薬物の組合わせは生存を４１．４±９．８日に延長した（ｐ＝０．００００２）。最も良好な結果は、４：１および２：１の６４９６４１Ｐ：ＣｓＡ投薬量比で観察され、それぞれ０．１１および０．２７のＣＩ値を生じた。新規なおよび選択的なＪａｋ３インヒビター、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、腎臓同種移植モデルにおいてインビボで免疫抑制的であり、そしてＣｓＡと組合わせて顕著な相乗的効果を発揮することが同定された。
【００５８】
［実施例３．腎臓毒性についての６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の評価］
組織学的検査のために、組織がＬＥＷ（ＲＴ１１）腎臓同種移植片のＡＣＩ（ＲＴ１ａ）レシピエントから得られ、これは以下のように処置された；７日間低塩食餌におかれたレシピエントは１４日間：ｉ．ｖ．送達された１０ｍｇ／ｋｇの６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）；ｉ．ｖ．送達された０．１６ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡ；ｐ．ｏ．送達された１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡ；１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡｐ．ｏ．と０．１６ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡｉ．ｖ．との組み合わせ；または１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡ ｐ．ｏ．と１０ｍｇ／ｋｇ ６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）ｉ．ｖ．との組み合わせ、で処置された。１４日目にラットは屠殺され、そして組織学が、標準的な方法に従うＨ＆Ｅ染色を使用して腎臓に対して行われた。図６Ａ〜Ｅにおける顕微鏡写真は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独の、またはＣｓＡと組合わせた、腎臓構造に対する効果を示す。全ての写真は、同じ２００×倍率にて示される。類似の結果が１群あたり５匹のラットにおいて観察された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（図６Ａ）もＲＡＰＡ単独（図６Ｂ）も、腎臓において有意な変化をなんら示さなかった。それとは対照的に、ＣｓＡ単独（図６Ｃ）は、空胞形成および萎縮によって可視化されるように、３０％の細管において障害を引き起こした。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ（ＳＲＬ）群は、萎縮および濃縮した核を伴って、９０％の細管において大規模な空胞形成を示した（図６Ｄ）。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ群と対照的に、ＣｓＡ／６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の組合わせで処置されたラットからの腎臓は、ＣｓＡ単独の群において観察された変化に類似する変化を示した（図６Ｅ）。簡潔には、６４９６４１もＲＡＰＡ単独のいずれも、腎臓毒性を引き起こさなかった。しかし、ＣｓＡ単独は腎臓毒性であり、そしてこの効果は、ＲＡＰＡとともに増強され、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）では増強されなかった。
【００５９】
上述の組織学的研究に加えて、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）処置された動物はまた、ＳＲＬと典型的に関連する毒性のタイプについても評価された。この研究においては、動物の処置は６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独またはＣｓＡとの組合わせを含んだ。Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットは、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ ｉ．ｖ．または強制飼養あたり４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）もしくはＳＲＬ（強制飼養あたり１．６ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を単独で、またはＣｓＡ（強制飼養あたり１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）と組合わせて受けた。慢性的な腎臓毒性を評価するための塩類の欠乏（０．０５％ ＮａＣｌ）、または脂質補充（１７．７％トリグリセリド、５．０２％コレステロール）のいずれかによる７日間の食餌前処理後、ラットの群は、７、１４、または２８日間の処置過程（ｎ＝６／薬物／持続時間）を受けた。クレアチニンクリアランス（ＣｒＣＬ）における差異；総密度、低密度、および高密度（ＨＤＬ）コレステロール（ＣＨＯＬ）画分；トリグリセリド（ＴＧ）；骨髄細胞密度；抹消血計数（ＰＢＣ）；および血液の化学的性質が、Ｆｉｓｈｅｒのｔ検定によって評価された。
【００６０】
この研究の結果は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が体重増加（ｐ＝０．０００２）を引き起こし、そしてＣｓＡまたはＳＲＬによって生じる体重減少をエンハンスしないことを示した。ＣｒＣＬ値は、未処置（２．０ ０．１ｍＬ／分）および６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独（１．９ ０．１ｍＬ／分）について類似であったが、ＳＲＬ単独（１．７ ０．１ｍＬ／分；ｐ＜０．０２）、およびＣｓＡ単独（１．３ ０．１ｍＬ／分；ｐ＜０．００１）について減少した。ＣｓＡ単独に比較して、６４８６４１Ｐの付加は、ＣｒＣＬ値をさらに減少させることはなかった（１．３８ ０．２ｍＬ／分；ｐ＝０．６８）；一方、ＳＲＬは顕著にこれを減少させた（０．９ ０．２ｍＬ／分；ｐ＝０．０３）。低塩食餌における未処置のラットに比較して、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、ＴＧまたはＬＤＬレベルを変化させずに、血清ＣＨＯＬ（８２．０ ５．０対６５．５ ９．４ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０３）を減少させ、ＨＤＬを増加させた（ｐ＝０．００４）。６４８６４１Ｐは、ＳＲＬ＋ＣｓＡ（１０７．８ ８．４ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０００５）と対照的に、ＣｓＡの高コレステロール症効果を増加させなかった（７７．５ ７．０単独対６４．１ １２．７ｍｇ／ｄＬ組合わせ）。高脂食餌において、ＳＲＬはＣＨＯＬ（６８９．５ ６７．４；ｐ＝０．００００１）およびその他の脂質画分に対して顕著な効果を生じ；ＣｓＡはより少ない効果（５４５．７ ９５．７ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０００２）であり、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、未処置の動物において中程度の変化のみを生じた（３２３．８ ５１．１ｍｇ／ｄＬ；ｐ＝０．０１対２３７．５ ３１．４ｍｇ／ｄＬ）。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＨＤＬ、ＬＤＬ、またはＴＧレベルに対する効果をなんら有しなかった。６４８６４１ＰもＣｓＡも、ＳＲＬとは対照的に（Ｐ＜０．０４）、未処置のラットと比較して、ＰＢＣを減少させなかった。ＳＲＬ／ＣｓＡ宿主は低細胞性の骨髄を示し（３０〜４０％が脂肪組織に置き換えられる）、６４９６４１Ｐ／ＣｓＡコホートは、未処置のラットからなんら有意な変化を示さなかった。これらの結果を考慮すると、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、腎臓毒性および骨髄毒性の効果がなく、高脂投与に対して軽度の脂質毒性を伴うと結論づけられる。ＳＲＬを混乱させるようなＣｓＡの有害な効果を悪化させないので、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はリンパ系要素に対して選択的な作用を発揮するようである。
【００６１】
上述の研究から、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＪａｋ３活性をブロックし、単独で同種移植片生存を延長し、そしてＣｓＡと相乗的であることが結論づけられ得る。好ましい化合物、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はＪａｋ２依存性Ｔ細胞増殖に比較してＪａｋ３依存性Ｔ細胞増殖のインビトロでの選択的な阻害を示し、そしてインビボでなんら腎臓毒性の副作用を引き起こすことなく臓器の同種移植片の生存を延長させた。有利には、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）はシクロスポリンと強力な相乗的相互作用を示し、シクロスポリン誘導性の腎臓毒性を増加することなく臓器の同種移植片の生存を延長させた。さらに、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、以前に記載された化合物ＡＧ４９０およびＰＮＵ１５６８０４と比べて、Ｊａｋ３媒介性の細胞活性をブロックすることに対しては大きな特異性を示したが、Ｊａｋ２媒介性の細胞活性をブロックすることに対しては示さなかった。しかし、現時点では、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の投与と関連する上述の望ましい薬理学的特性が、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物とＪａｋ３との直接的な相互作用に完全に起因するのか否か、または、例えばＪａｋ３阻害が６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）からの代謝物または誘導体よってなんらかの程度インビボで媒介されるのか否かは、明らかではない。後者の場合、医学的に示すとすれば、かかる活性な代謝物または誘導体の種のいずれの直接的な投与が、治療的に６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の代わりをし得ると考えられる。同様に、本明細書中に記載される選択的なＪａｋ３インヒビター化合物の１つを生じるようにインビボで作用する前駆体化合物もまた、個体の特別の必要性がそのように示す場合には、治療的に投与され得る。
【００６２】
［実施例４．治療的適用］
６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物は、免疫抑制治療のため、およびＪａｋ３を含むかまたは発現するリンパ系、骨髄系、またはその他の細胞の病理を処置するため、本明細書中に記載される医学的有用性のある化合物の群の代表であると考えられる。化合物は、ヒトのＴ細胞関連疾患において特に有用であると考えられ、および獣医学的診察における使用に対して、Ｊａｋ３依存性のリンパ系もしくは骨髄系の細胞機能をその他のタンパク質キナーゼの活性に影響を与えずに抑制することが望ましいなんらかの適用に対して、またはかかるキナーゼにほとんど影響を与えないもしくは治療的に受容可能な程度の影響を与えるなんらかの適用に対して、特に有用であると考えられる。処置は、リンパ球、またはＪａｋ３を発現するリンパ系もしくは骨髄系起源の他の細胞においてシグナル３経路を干渉するのに有効な化合物の量を投与する工程を有し、それによってその作用を阻害する。例えば、細胞分裂をブロックする。かかる投与は、化合物の酸の形態または薬学的に受容可能なその塩を利用するか、またはこれは化合物の生物学的に活性な代謝物の形態をとる。あるいは、被験体の身体において化合物の１つ以上の活性な形態に代謝され得る前駆体化合物が投与され、それによってＪａｋ３依存性のリンパ球作用が破壊され、好ましくは細胞分裂をブロックする。投与は連続的または周期的である。
【００６３】
いくつかの医学的状況において、個体は望ましくない免疫応答の抑制を必要とし、その場合、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）、または前駆体もしくは活性な代謝物を含む薬学的組成物の有効な量の投与は、望ましくない免疫応答を軽減または防止する。シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６のような、Ｊａｋ３阻害を介して作用しない、別の免疫抑制剤の治療的に有効な量を同時投与することによって、さらにより良好な結果が、個体に対する毒性をほとんど伴わずに達成され得る。かかる使用の例は、哺乳動物移植片もしくは同種移植片レシピエントにおける臓器移植拒絶もしくは同種移植片拒絶を軽減すること、または移植寛容を誘導することを含む。その他の例においては、治療目的は、内因性Ｊａｋ３依存性Ｔ細胞によって媒介される自己免疫疾患の寛解を促進することであり、それによって被験体のネイティブな組織に対する自己免疫攻撃が減少または停止される。さらにその他の使用の手段は、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の薬学的調製物を投与して、Ｔ細胞媒介性の過敏性応答を抑制することによって哺乳動物被験体における気道過敏症を軽減することを含む。同様に、アレルギー患者は、Ｔ細胞媒介性のアレルギー応答を抑制するために処置され、それによってアレルギー反応が減少または停止される。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を含む薬学的組成物の投与はまた、Ｊａｋ３依存性の白血病またはリンパ腫の増殖を阻害することが期待される。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）での治療的処置の顕著な潜在的利点は、Ｊａｋ３活性を選択的に阻害し、リンパ系画分の細胞（およびＪａｋ３を発現する骨髄系の細胞）に制限されることによる、ならびにＪａｋ２、および身体にわたる多くの組織において見出される他のタンパク質キナーゼ活性に対してほとんどまたは全く影響を有しないことによる利点であり、ずっと少ない副作用が期待される。
【００６４】
［薬学的組成物］
治療的使用に適切な薬学的組成物は、その酸形態をとる６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物、または適切なキャリアと組み合わせられてその薬学的に受容可能な塩もしくは水和物を含む。薬学的に受容可能な塩および水和物とは、製薬化学者に明白な化合物の、このような塩および水和物の形態、すなわち、溶解性、嗜好性、吸収、分散、代謝、および排泄のような化合物の物理学的なまたは薬物動態学的な特性に好ましい影響を与える形態をいう。事実上より実用的で、化合物の形態の選択においてもまた重要なその他の因子は、得られるバルク薬物の、原材料費用、結晶化の容易性、収量、安定性、溶解性、吸湿性、および流動性を含む。化合物が負に荷電されると、これは対イオン、例えば、ナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属カチオンによって平衡化される。他の適切な対イオンとしては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アンモニウム、またはテトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、コリン、トリエチルヒドロアンモニウム、メグルミン、トリエタノールヒドロアンモニウムなどのような、アルキルアンモニウムカチオンが挙げられる。対イオンの適切な数は、全体の電荷の中立性を維持するための分子に関連する。同様に、化合物が正に荷電される、例えばプロトン化されると、適切な数の負に荷電された対イオンが存在して全体の電荷の中立性を維持する。
【００６５】
薬学的に受容可能な塩はまた、酸付加塩を含む。すなわち、化合物は、無機または有機の酸または塩基に由来する塩の形態において使用可能である。例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳塩、樟脳硫酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン塩、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチネート、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基を伴う塩、ならびにアルギニン、リジンなどのようなアミノ酸を伴う塩が挙げられる。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物、ヨウ化物のような低級アルキルハライド；ジメチル、ジエチル、ジブチルのようなジアルキル硫酸塩；およびジアミル硫酸塩、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル塩化物、臭化物、ヨウ化物のような長鎖ハライド、ベンジルおよびフェネチル臭化物のようなアラルキルハライドなどの薬剤で四元化される。他の薬学的に受容可能な塩としては、硫酸塩エタノレートおよび硫酸塩が挙げられる。
【００６６】
本明細書中に記載されるＪａｋ３インヒビター化合物は、当該分野において周知であるように、薬学的に受容可能なキャリアと、化合物とを組合わせることによって薬学的組成物中に処方される。化合物は、粉末または結晶の形態で、溶液中でまたは懸濁液中で用いられる。これらは、経口的に、非経口的に（静脈内または筋肉内）、局所的に、経皮的に、または吸入によって投与される。用いられるキャリアは、必要に応じて、固体または液体である。固体キャリアの例としては、ラクトース、石膏、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。液体キャリアの例としては、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、水などが挙げられる。経口の使用のためのキャリアとしては、単独で、またはワックスと組合わせて、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような当該分野において周知な時間遅延材料が挙げられる。局所的な適用は、軟膏、クリーム、ローションを形成するために疎水性または親水性の基剤のようなキャリアで、塗布剤を形成するために水性、油性、またはアルコール性の液体で、または粉末剤を形成するために乾燥希釈剤で処方される。経口固体投薬形態の例としては、錠剤、カプセル、トローチ、薬用キャンデーなどが挙げられる。投薬形態の大きさは、広範に変化するが、好ましくは約２５ｍｇ〜約５００ｍｇである。経口液体投薬形態の例としては、溶液、懸濁液、シロップ、乳濁液、軟質ゼラチンカプセルなどが挙げられる。注射可能な投薬形態の例としては、無菌の注射可能な液体、例えば、溶液、乳濁液、および懸濁液が挙げられる。注射可能な固体の例としては、注射の前に液体中に再構成、溶解、または懸濁される粉末が挙げられる。注射可能な組成物において、キャリアは典型的には、無菌水、生理食塩水、または別の注射可能な液体、例えば、筋肉内注射のためのピーナツ油、からなる。また、種々の薬学的に受容可能な緩衝剤、保存剤なども含まれる。
【００６７】
［投薬］
本明細書中に記載されるＪａｋ３選択的インヒビター化合物の治療的使用を行うための薬学的組成物としては、意図される目的、すなわち、Ｊａｋ３活性の選択的な破壊もしくは、阻害、またはＪａｋ３関連性の異常の処置もしくは防止を達成するのに十分な量において有効成分を含む組成物が挙げられる。治療的に有効な量すなわち投薬量は、本明細書中に示されるようにして、先ず細胞増殖アッセイから見積もられる。次いで、投薬量は、また本明細書中で示されることだが、動物モデルにおける使用のために処方され、細胞培養で判断されるＩＣ５０（すなわち、ＩＬ２依存性の増殖の最大阻害の半分を達成し、ＰＲＬ依存性の増殖をほとんどまたは全く阻害しない化合物の濃度）を含む循環濃度範囲が達成される。次いで、かかる情報は、標準的な薬理学的な実施に従って、ヒトおよびその他の哺乳動物において有用な投薬量の範囲をより正確に判断するために使用される。投薬量は、用いられる投薬形態および利用投与経路に依存して変化する。例えば、投薬の量および間隔は、所望されるＪａｋ３阻害効果を開始および／または維持するのに十分である活性な種の血漿レベルを提供するように個々に調節される。これらの血漿レベルは、習慣的には最小有効濃度（ＭＥＣ）として参照される。ＭＥＣは、化合物によって異なるが、上記のようにインビトロデータから見積もられる。例えば、Ｔ細胞の集団においてＪａｋ３自己キナーゼ活性の５０〜９０％阻害達成するのに必要な濃度は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して確認される。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイが、血漿濃度を判断するために用いられ得る。投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して判断される。好ましくは、化合物は所望される期間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持する投与計画を使用して投与される。局所的な投与または選択的な取り込みを含む処置において、化合物、またはその活性な代謝物もしくは誘導体の有効な局所濃度は、血漿濃度によって十分に反映されない可能性がある。この場合においては、当該分野において周知の、その他の手順が適切な投薬の量および間隔を判断するために用いられる。成体ヒトに対する適切な経口投薬量の範囲の例は、単回または分割される投薬量において、１日あたり約０．１〜約８０ｍｇ／ｋｇである。適切な非経口投薬量の範囲の例は、単回または分割される用量において、１日当たり約０．１〜約８０ｍｇ／ｋｇであり、静脈内または筋肉内注射によって投与される。局所的な投薬量の範囲は、約０．１ｍｇ〜約１５０ｍｇであり、１日約１〜４回、外部から適用される。吸入の投薬量の例は、一日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の状態、処置される疾患の性質、およびその他の因子を考慮して個々の医師によって選択され得る。
【００６８】
［実施例５．さらなるＪａｋ３選択的インヒビター化合物］
前述の実施例において、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、Ｊａｋ３を含むＴ細胞の増殖および機能を選択的にまたは特異的に阻害し、同種移植片の生存を延長し、そして低い毒性を示すことが実証された。これらの評価を考慮すると、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が免疫関連の異常を有する個体を処置するための潜在的治療的価値を有することは明らかである。この化合物はまた、インビトロのアッセイおよびインビボの研究におけるＪａｋ３の阻害または破壊についての選択性に関して、その他の候補薬物化合物を評価する上での比較基準として使用するための試薬として価値がある。
【００６９】
上記のように、本研究の過程において、ＮＣＩ薬物発見データベース（ＮＣＩ Ｄｒｕｇ Ｄｉｃｏｖｅｒｙ Ｄａｔａｂａｓｅ）が、Ｊａｎｕｓキナーゼ３（Ｊａｋ３）の選択的なインヒビターとして作用し得るさらなる候補化合物についてスキャンされた。「種」化合物ＡＧ４９０、Ｊａｋ３阻害の潜在性を伴うチルホスチンに類似の相関係数を示す化合物が評価された。
【００７０】
［ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズム］
ＮＣＩ薬物データベースは、世界の種々の部門から集められた数十万の化合物からなるデータベースである。これらとしては、大きな製薬会社から小さな私有の研究所までにおよぶ薬物の寄託が挙げられる。多くの例において、これらの化合物が付加されて、ライブラリーが試験および促進された。しかし、これらの化合物の多くは、その元来提案された機能についての効果のなさに起因して、製造業者により製造中止にされており、およびいくつかの例においては、提出した企業がもはや稼動していない。薬物の状態にかかわらず、その構造および得られる活性は、毎週更新されるライブラリーデータベースに付加される。
【００７１】
データベースは、６０個の異なるヒト細胞株（例えば、上皮、肺、結腸、単球／マクロファージ、Ｔ−Ｂ細胞、乳房−前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）など）に対して、特定の薬物についての投薬量応答性を試験することによって作成された。測定されるこれらのパラメーターとしては、細胞増殖の阻害（ＩＣ５０）、細胞傷害性（ＬＣ５０）、および細胞増殖抑制効果（ＴＧＩ）が挙げられる。同時に、これらは、各化合物についての平均グラフ「符号定数」を含む。ポジティブな値を示す（右側に突出する）薬物は、平均を超える反射的な細胞感受性である。ネガティブな値（左側に突出する）は、細胞株が、試験薬剤に対して平均よりも少ない感受性であることを示す。ＣＯＭＰＡＲＥは、各化合物を、本明細書の場合のＡＧ４９０におけるように、所定の「種」に対するインビトロでのその活性に基づいて序列するアルゴリズムである。平均グラフは、各薬物に対してピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ （ＰＣＣ））を使用してスカラー指標順位（ｓｃａｌａｒ ｉｎｄｅｘ ｒａｔｉｎｇ）に変換される。最終的には、最も類似の効果を伴う薬物は高位の相関（アプローチ１）を示し、種化合物の作用メカニズムに類似する作用メカニズムを有する可能性が高い。
【００７２】
ＣＯＭＰＡＲＥは、類似の作用メカニズムを伴う化合物を同定することにおいて成功してきた。これは、例えば細胞増殖をブロックする類似した薬物は、類似した細胞型の同じ重要な標的経路を標的する、という前提に基づく仮説的なモデルである。特定の経路に大きく依存する細胞は、その経路を阻害する感受性があるが（例えば、ＪＡＫ３／Ｓｔａｔ５を発現する細胞）、かかる分子を発現しないか、またはほとんどこの経路に依存しない細胞は、同じ薬物はほとんどまたは全く効果を有しない。このことは、ＣＯＭＰＡＲＥが、細胞のパネルにわたって類似の作用メカニズムを伴う薬物をまとめて分類することを可能にする。
【００７３】
今日までに完了された多くの様々な研究は、このアプローチが、同じ分子標的に選択的に影響する、すなわち特徴的な平均グラフパターンを生じる新規な薬剤を同定するために成功してきたことを示した。ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムは、別個の構造の化合物であるが、種と比べて同じ作用メカニズムを伴う化合物に対する類似の平均パターンを同定し得る。実験室研究では、特定の読取り内での適合（ＪＡＫ３ Ｓｔａｔ５リン酸化）を確認する必要がある。ＣＯＭＰＡＲＥは、薬物作用の類似メカニズムに依存するので、化学構造に必ずしも依存しない。このことは、以前は所定の標的に対する特定のインヒビターとして決して認識されていなかった、構造的に新規なクラスの化合物の同定を可能にする。このアプローチの有効性は、ｐ５３、Ｒａｆ、トポイソメラーゼ、およびチューブリン結合タンパク質のインヒビターを同定することによって実証されてきた。既知の作用メカニズムの構造的クラスが一旦発見されると、次いで新しい作用メカニズムの利用可能な類似体および合成体のさらなるスクリーニングが使用されて、目的の薬物が規定および最適化され得る。
【００７４】
上記のＮＣＩ薬物データベーススクリーニングにおいて同定された化合物の中に、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）、および６４９６４１Ｐのいくつかの同族体または構造類似があった。Ｔ細胞増殖に対する化合物６３７７１２、６４０６７４、６４３４２３、６５５９０６、６７３１３７、６８３３３２、および６９３８１２（それらのＮＣＩデータベース番号によって示される）の効果が評価され、ＡＧ４９０、ＰＮＵ１５６８０４、および６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果と比較された。これらの比較アッセイの結果は、図７Ａにおいて棒グラフの形態において示される。ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞の増殖は、ＩＬ−２での刺激後にこれらのＮＣＩ薬剤によってブロックされることがわかる。ＮＣ１１５３の構造式は、差込図において示されている。ＮＣ１１５３は、ＩＬ２受容体の発現に影響しなかった。
【００７５】
また示されるのは（図７Ｂ）、５０μＭ ＮＣ１１５３を伴わないで（太線）、または伴って（細線）、一晩処置されてＩＬ２Ｒ−α、−β、およびγ鎖について染色されたＰＨＡ活性化Ｔ細胞ブラストのＦＡＣＳ分析を示すグラフである。破線は、ＮＣ１１５３で前処理された細胞を示す。これらの結果は、ＩＬ−２受容体の存在がＮＣ１１５３によって影響を受けないことを示す。これらの知見は、ＩＬ２シグナルの喪失は、受容体発現における変化に起因せず、すなわちＩＬ２受容体、従ってＪａｋ３の遠位で生じることを実証する。図７Ｃに示されるように、ＮＣ１１５３化合物は、非Ｊａｋ３発現細胞の細胞増殖をブロックしない。Ｊａｋ３を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞（黒菱形）は、Ｊａｋ３を含むＰＨＡ活性化Ｔ細胞（白四角）とは対照的に、ＮＣ１１５３での処置後の細胞増殖には有意な変化を示さなかった。データは、ベヒクルコントロールのパーセントとして正規化される。ＮＣ１１５３は、Ｊａｋ３および共通のガンマ鎖を利用するサイトカインによる細胞の増殖を阻害する（図７Ｄ）。図１Ａにおいてまた示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置されたＴ細胞のＴ細胞増殖は、未処置コントロールに対して正規化されたＩＬ２、ＩＬ４、またはＩＬ７駆動性の増殖を投薬量依存的に阻害する。すなわち、ＮＣ１１５３の阻害効果は、ＩＬ−２によってのみ刺激された細胞に制限されるわけではない。その代わりに、Ｊａｋ３を使用するサイトカインのファミリー全体は、ＮＣ１１５３によってブロックされる。
【００７６】
ここで図８を参照すると、６４９６４２１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３シグナル伝達経路を阻害するという直接的な証拠が提供される。Ｊａｋ３自己キナーゼ活性は、インビトロの分析に基づいて、ＮＣ１１５３によって直接的にブロックされる。「ＰＹ−Ｊａｋ３」として同定されるバンドは、ＮＣ１１５３の示された投薬量にて、ＩＬ−２およびＡＴＰを伴ってまたは伴わないで、活性なＪａｋ３のみを明らかにする。「Ｊａｋ３」として同定されるバンドは、全ての（活性プラス不活性な）Ｊａｋ３タンパク質の存在を明らかにする。Ｊａｋ３を阻害することが下流の経路をブロックするということを示すために、免疫精製されたＪａｋ３は、Ｊａｋ３自己キナーゼ活性についてアッセイされ、１００μＭのＡＴＰおよび／または薬物の存在下または不在下での、ホスホチロシンウェスタンブロットによって試験され、そして図２Ａ〜Ｃに示されるようにコントロールと比較された。６４９６４１（ＮＣ１１５３）は、図７Ａおよび７Ｄに示されるように、増殖データに類似する約２．５μＭのＩＣ５０を示したことがまた観察された。
【００７７】
図９Ａ〜Ｃは、ＮＣ１１５３が非Ｊａｋ３シグナル伝達経路を阻害しないことを示す。図９Ａにおいて、ＮＣ１１５３が、漸増濃度のＮＣ１１５３で処置されたＰＨＡ活性化Ｔ細胞において、ＥＭＳＡ分析を介して測定されるように（上部パネル）、Ｊａｋ３駆動性の転写因子−Ｓｔａｔ５ａ／ｂを投薬量依存的に阻害することがわかる。「コールド匹敵物」として同定されるレーンは、未標識のプローブを含む。しかし、ＴＮＦ−□による非Ｊａｋ３媒介性Ｎｆ□Ｂ活性化（下部パネル）は、同じ処置セット内では影響を受けなかった。図９Ｂに示される結果は、ＮＣ１１５３は、密接関連Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５ａシグナル伝達経路を阻害しないことを確立する。ラットＮｂ２細胞は、漸増濃度のＮＣ１１５３で処置され、次いでプロラクチンで刺激された。ホスホチロシンウェスタンブロットは、活性化を検出したが、ＮＣ１１５３による阻害は検出しなかった。Ｓｔａｔ５ａ／ｂ活性化において、Ｊａｋ３媒介性のＪａｋ３自己キナーゼ活性化は、インビトロの分析に基づいて、ＮＣ１１５３によって直接的にブロックされる。ＮＣ１１５３は、複数のキナーゼの活性に影響を与えない。キナーゼアッセイにおけるＪａｋ２よりも少なくとも５０倍多いＪａｋ３の阻害が、図９Ｂおよび図８に示される。図９Ｃに示されるように、ＮＣ１１５３は、１０または５０μＭにて、増殖因子チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ３およびＰＤＧＦＲ□）、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、Ｚａｐ７０）、またはセリンスレオニンキナーゼ（ＰＫＣおよびＰＫＡ）の基質のリン酸化をブロックすることが試験された。コントロールの活性は、破線としてプロットされる。
【００７８】
図１０Ａ〜Ｄは、（表１に示された）同種移植片生存に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のインビボの効果をまとめる。Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ）腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントは、７日間、毎日の静脈内注射または経口強制飼養により送達されるＮＣ１１５３で処置された。種々の薬物投薬量での同種移植片生存時間（日）は図１０Ａに示され、個体の生存は表１に示される。ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントは、１４日間、毎日の経口強制飼養によって送達されるＮＣ１１５３で処置された。移植片生存比率（日）は、図１０ＢにおいてＮＣ１１５３の種々の投薬量にて示される。ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントは７日間、そしてその後、３×／１週間、９０日まで、毎日の経口強制飼養によって送達される１６０ｍｇ／ｋｇのＮＣ１１５３で処置された。図１０Ｃに示されるように、処置されたレシピエントの７５％が、９０日間の処置を超えて生存し、生存時間は２００日間を越えた。移植寛容の誘導は、ＬＥＷドナー（＞１００日間；ｎ＝３）の受容によって確認されたが、長期間生存するレシピエントによる第三者のＢＵＦ（７．０±１．０日；ｎ＝３）心臓同種移植片によっては確認されなかった。寛容のメカニズムは、ＬＥＷ心臓同種移植片の照射（４００ｒａｄ）ＡＣＩレシピエントが寛容レシピエントから３０×１０６個の精製Ｔ細胞を養子的にトランスファーされた際に試験された。寛容Ｔ細胞をトランスファーされたレシピエントは、ＬＥＷ心臓同種移植片の有意に遅延された拒絶を示し（４０．０±１５．０日；Ｎ＝６対１５±１．０日；照射されたコントロールにおいてｎ＝５）、２つの心臓は１００日間を越えて良好に心拍したが、第三者の心臓同種移植片は拒絶された（１２±１．０日；ｎ＝２）。これらの結果は、移植寛容が、Ｔ細胞調節細胞によって少なくとも一部媒介されたことを示す（示されず）。図１０Ｄは、表２において上述で示される結果のまとめを示す。これは、７日間、毎日の経口強制飼養により送達された、ＮＣ１１５３単独で、ＣｓＡ単独で、および組み合わせの薬物で処置されたＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントに関する。各投薬量レベルでの各処置群のＭＳＴが示され、そして図の下方では、ＮＣ１１５３−ＣｓＡの組合わせが相乗的であることを示す低いＣＩ値が示されている。
【００７９】
図１１Ａ〜Ｆに示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は腎臓毒性でなく、脂質代謝に影響を与えない。低塩食餌を与えられたラット（治療前の７日間および治療の間の１４日間）は、１６０ｍｇ／ｋｇのＮＣ１１５３を単独で、または５ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡと組合わせて経口強制飼養によって処置され；いくつかの動物は０．８ｍｇ／ｋｇラパマイシン（ＲＡＰＡ）単独でまたは５ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡと組合わせて処置された。腎臓機能は、血清クレアチニンレベルおよび血清クレアチニンクリアランスによって評価され、そして結果は、それぞれ、図１１Ａおよび１１Ｂに示される。脂質代謝は、血清コレステロール（図１１Ｃ）、トリグリセリド（図１１Ｄ）、ＬＤＬ−コレステロール（図１１Ｅ）、およびＨＤＬ−コレステロール（図１１Ｆ）を測定することによって評価された。ＮＣ１１５３単独またはＣｓＡとの組合わせの、腎臓構造に対する効果が判断された。７日間低塩食餌にあったラットは、１４日間、１０ｍｇ／ｋｇ ＮＣ１１５３のｉ．ｖ．送達；０．１６ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡのｉ．ｖ．送達；１０ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡの経口強制飼養による送達；１０ｍｇ／ＣｓＡのｐ．ｏ．と０．１６ｍｇ／ｋｇＲＡＰＡのｉ．ｖ．との組合わせ；または１０ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰＡのｐ．ｏ．と１０ｍｇ／ｋｇ ６４１Ｐのｉ．ｖ．との組合わせ、で処置された。１４日目に、ラットは屠殺され、そして組織学が、Ｈ＆Ｅ染色を使用して腎臓に対して行われた。類似の結果が、１群当たり５匹のラットにおいて観察された。図６Ａ〜Ｅに示されるように、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独もＲＡＰＡ単独も、腎臓において有意な変化を示さなかった。対照的に、ＣｓＡ単独は、３０％の細管において障害を引き起こし、空胞形成および萎縮を伴った。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ群は、９０％の細管において大規模な空胞形成を示し、萎縮および濃縮した核を伴った。ＣｓＡ／ＲＡＰＡ群とは対照的に、ＣｓＡ／ＮＣ１１５３の組合わせで処置されたラットからの腎臓は、ＣｓＡ単独の群において観察された変化に類似した変化を示した。
【００８０】
６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のメソの立体異性体は、（図１８Ｂに示される）ＷＰ９３８と称され、以下の工程を有する手順を使用して合成された。４００ｍＬのアセトニトリル中に溶解された０．１ｍｍｏｌのシクロアルカノネオンおよび０．２１ＭのＮ，Ｎ，Ｎ´、Ｎ´−テトラメチルジアミノメタンに、１６．５ｇ（０．２１ｍｏｌ）の塩化アセチルが４０分間、滴下して添加された。反応が完了した後に粗生成物が沈殿され、濾過され、エーテルで洗浄され、そして乾燥された。その後の結晶化によって、純粋な生成物が得られた。
【００８１】
得られたＷＰ９３８化合物は、単独でまたはＣｓＡと組合わせて投与された際の、同種移植片生存に対するその効果についておよび毒性について試験された。結果は、図１２Ａ、Ｂから図１３Ａ〜Ｆに示される。経口強制飼養により７日間、投薬量２０〜１６０ｍｇ／ｋｇにて送達されるＷＰ９３８単独は、ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩレシピエントの生存を、投薬量依存的に延長したことが見出された（図１２Ａ）。ｐ．ｏ．で７日間送達された１．２５ｍｇ／ｋｇ ＣｓＡと１６０ｍｇ／ｋｇ ＷＰ９３８との組合わせは、０．４４のＣＩ値によって示されるように（図１２Ｂ）、腎臓同種移植片生存に対して相乗的な相互作用を生じた。図１３Ａ〜Ｆに示されるように、１６０ｍｇ／ｋｇ ＷＰ９３８の１４日間の経口治療は、化学的性質および血液要素計数における変化を生じず、毒性がないことを実証した。血清クレアチニンおよびクレアチニンクリアランスは、ＷＰ９３８による腎臓毒性がないこと、およびＣｓＡ誘導性の腎臓毒性に対して効果がないことを示した（図１３Ａ、Ｂ）。図１３Ｃは、コレステロールレベルを示す。図１３Ｄはトリグリセリドを示す。図１３ＥはＨＤＬレベルを示す。図１３ＦはＬＤＬレベルを示す。
【００８２】
図１４Ｂ〜図３９Ｂは、プロラクチンまたはＩＬ２刺激されたＴ細胞において増殖を阻害する能力についてスクリーニングされた種々のＭａｎｎｉｃｈ塩基化合物およびその他の化合物（塩として示される）の化学式を示す。図１４Ａ〜図３９Ａは、示された濃度範囲にわたるこれらのアッセイの結果を示す。スクリーニングアッセイが、実質的に上述の一般的な方法で記載されたように行われた。ＩＬ２（白四角）により活性化されるＪａｋ３およびＳｔａｔ５ａ／ｂを阻害するのに十分な濃度にて、プロラクチン（ＰＲＬ）（黒四角）によるＪａｋ２およびＳｔａｔ５ａ／ｂ活性をブロックしない明白な特徴を有する化合物が、さらなる評価のために同定された。好ましい６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）化合物およびその選択的な阻害活性は、実施例１および図１Ａ、Ｂに示される。さらなる候補薬物、すなわちＰＲＬまたはＩＬ２刺激されたＴ細胞に関する所定の濃度での少なくともある程度の量の選択的な阻害活性を示した図１４Ｂ〜１７Ｂおよび１９Ｂ〜３９Ｂに示される化合物は、代表的な化合物６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）を用いる上述の実施例において記載されるのと同様に現在研究中の主題である。適用可能な場合は、これらの化合物は非対称中心を有し、そしてラセミ体、ラセミ混合物として、および本明細書中に開示される目的のための全ての異性体形態が含まれる個々のジアステレオマーまたは鏡像異性体として存在する。例えば、式（Ｉ）に関して、Ｃ−２およびＣ−１２での立体配置は（Ｒ）または（Ｓ）である。これらの化合物は、全ての立体異性体を含み、これらは十分に非毒性と判断され、そしてこれらは６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）に対して本明細書中で示されたように同種移植片生存を有意に延長し得、ヒトにおいて、および免疫抑制治療における獣医の使用のための、潜在的な治療的価値も有する。これらはまた、リンパ系または骨髄系起源のＪａｋ３を発現する細胞に関連するその他の病理を処置するための治療的価値があると期待される。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）およびＷＰ９３８において示されたように、これらの候補薬物化合物のいくつかはまた、Ｊａｋ３関連経路以外の経路によりその免疫抑制効果を発揮するＣｓＡまたはその他の免疫抑制剤とともに投与されると、相乗的な活性を示すと考えられる。
【００８３】
［定義］
その習慣的および通常の意味を有することに加えて、以下の定義が、明細書および請求の範囲において文脈が認める場合に適用する。
【００８４】
「選択的阻害」とは、１つのタンパク質の機能を優先的に、または１つ以上の既知のタンパク質をより少ない程度に、ブロックする化合物をいう。
【００８５】
「特異的な阻害」とは、所定のタンパク質の機能を、その他のタンパク質を影響することなく専らブロックする化合物をいう。
【００８６】
「免疫抑制の潜在性」とは、免疫応答を減少または除去するべき化合物（例えば、移植された臓器同種移植片の拒絶をブロックする薬物）をいう。
【００８７】
「薬学的組成物」とは、医薬品としての哺乳動物への投与のための、１つ以上の化学物質、または薬学的に受容可能なその塩と、適切なキャリアとの混合物をいう。
【００８８】
「リンパ細胞」とは、免疫起源の細胞、または、より詳細には、リンパ系統の幹細胞に由来する細胞をいい、大リンパ球、称リンパ球、血漿細胞を包含する。リンパ系の細胞の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００８９】
「骨髄細胞」とは、骨髄起源の、すなわち、骨髄系統の幹細胞に由来する細胞をいい、単球、マクロファージ、および樹状細胞を包含する。
【００９０】
「薬物」とは、医薬の使用に適切な化合物をいう。
【００９１】
「同族体」またはコージェナーとは、組成物（例えば、構造類似体）内で他方と密接関連し、て類似のまたは拮抗的な効果を発揮する化合物をいう。
【００９２】
「治療的に有効な量」とは、処置される異常の１つ以上の症状を、少なくともある程度軽減する、投与される化合物の量をいう。例えば、疾患の症状を防止、緩和、もしくは寛解する、または処置される被験体の生存を延長するのに有効な化合物の量。
【００９３】
疾患または異常に関して、用語「処置」とは、疾患もしくは異常の出現を防止、抑制すること、疾患もしくは異常の症状もしくは副作用を停止、退行、もしくはそれらからの救済を提供すること、ならびに／または処置される被験体の生存を延長することをいう。
【００９４】
【００９５】
本発明の好ましい実施態様が示され、そして記載されたが、その改変は、本発明の精神および教示から逸脱することなく当業者によってなされ得る。本明細書中に記載される実施態様は例示および典型であり、ならびに制限することは意図されない。本明細書中に開示される本発明の多くの変形および改変が可能であり、そして本発明の範囲内である。上述の記載は、Ｔ細胞駆動性の移植片対宿主疾患に対して集中されたが、本明細書中に記載される方法、化合物、および組成物はまた、他のＴ細胞依存性の疾患または異常における適用を有するようであることが容易に理解される。例えば、これらは狼瘡、関節炎、および多発性硬化症のような自己免疫疾患を処置するために、またはアレルギー、喘息、乾癬、潰瘍性大腸炎、リンパ腫、および白血病を処置するために有用である。選択的なＪａｋ３標的化阻害はまた、機能亢進のまたは望ましくない樹状細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞由来の状態に由来する機能亢進性免疫系応答状態を含む、多くのその他の免疫由来の病理においての、またはＪａｋ３を発現する骨髄系細胞由来の病理においての適用もまた有することが期待される。したがって、保護の範囲は、上述の記載によって制限されず、以下の請求の範囲によってのみ制限され、その範囲は請求の範囲の主題の全ての等価物を含む。本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に記載された材料、方法、および例示的な詳細に補充的な、材料、方法、および例示的な詳細をそれらが提供する程度に、本明細書中に参考として援用される。上述の関連分野の記載におけるある参考文献の考察は、それらが本発明に対する先行技術であるとの承認ではない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１Ａは、未処置コントロールに対して正規化された、１ｎＭヒトＩＬ−２（■）、ＩＬ−４（●）、またはＩＬ−７（▲）の不在下または存在下で培養されたγｃ／Ｊａｋ３−依存性ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞増殖に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の投薬量依存性の効果を示すグラフである。図１Ｂは、Ｊａｋ２活性化因子（ＰＲＬ［○］）またはＪａｋ３活性化因子（ＩＬ−２［■］）の存在下で培養された際の、Ｊａｋ２対Ｊａｋ３依存性のラットＴ細胞増殖に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の阻害効果を示すグラフである。
【図２】リン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）による阻害または阻害なしを示すウェスタンブロットである。図２ＡはヒトＹＴ細胞におけるＩＬ−２活性化Ｊａｋ３チロシンリン酸化を示す。図２ＢはヒトＹＴ細胞におけるＩＬ−２活性化Ｓｔａｔ５ａチロシンリン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示す。図２ＣはＹＴ細胞におけるＩＬ−２活性化Ｓｔａｔ５ｂチロシンリン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示す。
【図３】ＰＨＡ活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２活性化ｐ４４／４２ ＥＲＫ１／２リン酸化に対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示すウェスタンブロットである。
【図４】ＹＴ細胞における活性化ＦｙｎおよびＬｃｋに対する６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の効果を示すウェスタンブロットである。
【図５】ＡＣＩレシピエントラット心臓同種移植片に対するＬｗｅｉｓの生存についての、ＣｓＡ対６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の比率の範囲についての組合わせ指標を示すグラフである。
【図６】ラット腎臓構造に対する６４９４６１Ｐ（ＮＣ１１５３）、ＲＡＰＡ、およびＣｓＡの効果を示す顕微鏡写真（２００×の倍率）である。図６Ａは６４９４６１Ｐ（ＮＣ１１５３）である。図６ＢはＲＡＰＡである。図６ＣはＣｓＡである。図６ＤはＣｓＡおよびＲＡＰＡ（シロリムスまたはＳＲＬ）の組合わせの効果を示す。図６ＥはＣｓＡおよび６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）の組合わせの効果を示す。
【図７】６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３を含むＴ細胞の増殖を特異的に阻害することを示すグラフである。図７Ａは、ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞の増殖が、ＩＬ−２での刺激後に示されるＮＣＩ薬剤によってブロックされたことを示す棒グラフである。図７Ｂは、５０μＭ ＮＣ１１５３を伴わないで（太線）または伴って（細線）一晩処置され、そしてＩＬ２Ｒ−α、−β、および−γ鎖について染色された、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞ブラストのＦＡＣＳ分析である。図７Ｃは、Ｊａｋ３非発現細胞（黒菱形）における、およびＪａｋ３を含むＰＨＡ活性化Ｔ細胞（白四角）における、ＮＣ１１５３の濃度範囲にわたる細胞増殖阻害のグラフである。図７Ｄは、Ｊａｋ３および共通のγ鎖を利用してサイトカインにより刺激されるＴ細胞における、細胞増殖阻害対ＮＣ１１５３濃度のグラフである。
【図８】インビトロの分析に基づいた、Ｊａｋ３自己キナーゼ活性が６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）により直接的に阻害されることを示す棒グラフである。免疫精製されたＪａｋ３は、Ｊａｋ３自己キナーゼ活性についてアッセイされ、１００□Ｍ ＡＴＰおよび／または薬物の不在下または存在下で、ホスホチロシンウェスタンブロットによって試験されてコントロールと比較された。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、約２．５□ＭのＩＣ５０を示し、これは図１ＡおよびＢの増殖データに類似する。
【図９】６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）選択性を示す。図９Ａは、用量依存性の様式において漸増濃度の６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で処置されたＰＨＡ活性化Ｔ細胞において、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３駆動性の転写因子−Ｓｔａｔ５ａ／ｂを阻害することを示す電気泳動移動度アッセイ（ＥＭＳＡ）のオートラジオグラフである（上部パネル）。ＴＮＦ−□による非Ｊａｋ３媒介性のＮｆ□Ｂ活性化は、同じ処置セット内で影響されなかった（下部パネル）。図９Ｂは、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が、密接関連Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５ａシグナル伝達経路を阻害できないことを示すウェスタンブロットオートラジオグラフである。プロラクチン［ＰＲＬ］（＋）または（−）は、細胞がＪａｋ２活性化を伴うプロラクチンで刺激されたか否かを示す。ホスホチロシンウェスタンブロットは、Ｊａｋ２−Ｓｔａｔ５活性化を検出するが、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）による阻害は検出しない。図９Ｃは、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）がＪａｋ３以外の複数のキナーゼの活性に影響を与えないことを示す棒グラフである。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）は、１０（白棒）または５０μＭ（黒棒）にて、基質の増殖因子チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ３およびＰＤＧＦＲ□）、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、Ｚａｐ７０）、またはセリンスレオニンキナーゼ（ＰＫＣおよびＰＫＡ）リン酸化をブロックすることを試験された。コントロールの活性は、破線としてプロットされている。
【図１０】同種移植片生存に対するＮＣ１１５３のインビボの効果を説明する。図１０Ａは、毎日の静脈内注射により（左側パネル）または経口強制飼養により（右側パネル）送達される、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で７日間処置された、ルイス（ＬＥＷ）腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントにおける移植片生存を示す。図１０Ｂは、毎日の経口強制飼養により送達される、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）で１４日間処置された類似のレシピエントにおける移植片生存を示す。図１０Ｃは、毎日の経口強制飼養により送達される、１６０ｍｇ／ｋｇ ＮＣ１１５３で７日間、そしてその後３×／１週間で９０日間まで処置された類似のレシピエントにおける移植片生存を示す。図１０Ｄは、７日間処置されたＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩラットレシピエントにおいて、毎日の経口強制飼養により送達されるＮＣ１１５３の、ＣｓＡとの相乗的効果を示す。６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）単独（黒棒）。ＣｓＡ単独（白棒）、６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）およびＣｓＡ（淡色棒）。
【図１１】６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）が腎臓毒性でなく、および脂質代謝を影響しないことを示すアッセイ結果のグラフであり、血清クレアチニンレベル（図１１Ａ）、血清クレアチニンクリアランス（図１１Ｂ）、血清コレステロール（図１１Ｃ）、トリグリセリド（図１１Ｄ）、ＬＤＬ−コレステロール（図１１Ｅ）、およびＨＤＬ−コレステロール（図１１Ｆ）によって評価される。結果は、ｍｇ／ｄＬにおいて表されている。組織学的外見は図６Ａ〜Ｅに示されるようであった。
【図１２】（図１８Ｂに示される）ＷＰ９３８と称される６４９６４１Ｐ（ＮＣ１１５３）のメソの立体異性体での結果を示す以外は、図１０Ａ〜Ｄに類似し、ＬＥＷ腎臓同種移植片のＡＣＩレシピエントにおける同種移植片生存について試験された。図１２Ａは、未処置の、ＣｓＡ単独で処置された、およびＷＰ９３８単独で処置されたラットの平均生存を示す。図１２Ｂは、同じ投薬量のＣｓＡ／ＷＰ９３８の組合わせと比較した、１投薬量のＣｓＡ単独、１投薬量のＷＰ９３８単独の比較を示し；０．４４のＣＩ値は、相乗的な相互作用を示す。
【図１３】ＷＰ９３８単独についての、またはＣｓＡと組合わせての毒性アッセイの結果を示す。図１３Ａは血清クレアチニンレベルを示す。図１３Ｂはクレアチニンクリアランスを示す。図１３Ｃはコレステロールレベルを示す。図１３Ｄはトリグリセリドを示す。図１３ＥはＨＤＬレベルを示す。図１３ＦはＬＤＬレベルを示す。
【図１４−１７】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図１８−２１】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図２２−２５】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図２６−２９】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図３０−３３】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図３４−３７】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【図３８−３９】多くの化合物の化学式、およびインビトロアッセイにおけるＪａｋ３依存性またはＪａｋ３非依存性のＴ細胞の増殖を阻害するそれらの活性を示す。（Ａ）ＩＬ−２刺激（淡色丸）；ＰＲＬ刺激（黒丸）。（Ｂ）それに対応する各化合物の構造式（塩として示される）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、
細胞を、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有し、
Ｒ１は、Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＨ２ＳＣ６Ｈ５、ＣＨ２ＳＣＨ２−（４−Ｃ６Ｈ４ＯＣＨ３）、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２であり；
Ｒ２は、Ｏであり；
Ｒ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、またはＣＨ２−（Ｎ−モルフィル）である方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
Ｒ１はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ３はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記化合物はメソの立体異性体である方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
細胞はリンパ系または骨髄系起源である方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
細胞分裂がブロックされるように、前記細胞におけるシグナル３経路を干渉する工程を有する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を選択的に阻害するのに有効な前記濃度において、前記少なくとも１つの化合物は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３活性以外のタンパク質チロシンキナーゼ活性に実質的に非阻害性である方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞においてＪａｋ２活性を阻害するよりも少なくとも３倍多くＪａｋ３活性を阻害する工程を有する方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
ＩＬ２により活性化されるＪａｋ３およびＳｔａｔ５ａ／ｂを阻害するのに十分な濃度におけるプロラクチン（ＰＲＬ）によって、Ｊａｋ２およびＳｔａｔ５ａ／ｂ活性を阻害する可能性の小さな少なくとも１つの前記化合物を選択する工程を有する方法。
【請求項９】
治療的な免疫抑制剤として有用である物質を同定することを補助するためのインビトロの試験方法であって、
（ａ）細胞培養培地中に静止状態のＪａｋ３依存性Ｔリンパ球の集団を獲得する工程；
（ｂ）随意に、静止状態のＴリンパ球を、前記リンパ球が増殖することを刺激するために、サイトカインで前処理する工程；
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）からの前記静止状態のまたは刺激されたリンパ球を、請求項１において規定されるように、化合物またはその塩で処置する工程；
（ｄ）工程（ｃ）からのリンパ球を、細胞増殖を促進する条件下で培養する工程；
（ｅ）工程（ｄ）後の細胞増殖の程度を評価する工程；
（ｆ）随意に、Ｊａｋ２依存性Ｔリンパ球増殖に対する前記化合物の阻害効果を評価する工程；
（ｇ）随意に、前記化合物の細胞傷害性を評価する工程；
（ｈ）工程（ｅ）からの、ならびに、存在する場合は、工程（ｆ）および（ｇ）からの評価によって、化合物の細胞傷害性に起因しないＪａｋ３依存性リンパ球増殖の有意な阻害が、インビボで治療的に使用されるための候補薬物としての、Ｔ細胞媒介性の免疫抑制剤としての、および／またはＴ細胞増殖のインヒビタ−としての潜在性をその化合物が有することを示唆すると判断する工程；および
（ｉ）随意に、工程（ｅ）および（ｆ）からの評価を比較し、ならびに、工程（ｆ） において評価された阻害効果が工程（ｅ）において評価された阻害効果よりも有意に小さい場合は、前記化合物が、Ｊａｋ２活性を阻害することに比較して、Ｊａｋ３活性を阻害することに少なくともある程度選択的であることを前記比較から判断する工程、を有する方法。
【請求項１０】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の望ましくない機能を抑制する、その必要がある哺乳動物被験体におけるインビボの方法であって、
前記細胞を、請求項１において規定される少なくとも１つの化合物、またはその代謝物もしくは誘導体に、細胞におけるシグナル３経路を干渉するのに有効な量において接触させて、それによって細胞機能を阻害する工程を有し、
前記接触させる工程は、請求項１において規定される少なくとも１つの前記化合物、または薬学的に受容可能なその塩、または前記化合物の代謝物、または被験体の身体において前記化合物に変換可能な前記化合物の前駆体を、薬学的に受容可能なキャリア中に含む、治療的に有効な量の薬学的組成物を前記被験体に投与して、Ｊａｋ３依存性の細胞機能を阻害する工程を有する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記細胞はＴ細胞であり、前記薬学的組成物の前記量が前記Ｔ細胞における細胞分裂をブロックするのに有効である方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
前記薬学的組成物が継続的にまたは周期的に被験体に投与される工程を有する方法。
【請求項１３】
哺乳動物被験体を治療的に処置して望ましくない免疫応答を抑制する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行う工程を有し、前記被験体は望ましくない免疫応答を経験しているかまたは経験する危険性があり、前記薬学的組成物の前記治療的に有効な量は、前記望ましくない免疫応答を軽減するかまたは防止する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
Ｊａｋ３インヒビターの他の免疫抑制剤の治療的に有効な量を前記被験体に投与する工程をさらに有する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記他の免疫抑制剤はシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６である方法。
【請求項１６】
哺乳動物移植片レシピエントにおいて臓器移植片拒絶を軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って、移植される臓器に対するＴ細胞媒介性の免疫応答を抑制する工程を有し、それによって臓器の拒絶が軽減または停止される方法。
【請求項１７】
哺乳動物の同種移植片レシピエントにおいて急性の同種移植片拒絶を軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記同種移植片に対するＴ細胞媒介性の抗同種移植片免疫応答を抑制する工程を有し、それによって同種移植片の急性の拒絶が軽減または防止される方法。
【請求項１８】
哺乳動物移植片レシピエントにおいて移植寛容を誘導する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行ってＴ細胞媒介性の移植片拒絶応答を抑制する工程を有する方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患を被る哺乳動物被験体において前記疾患の寛解を促進する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記被験体におけるＴ細胞媒介性の自己免疫応答を抑制する工程を有し、それによって内因性のＪａｋ３依存性Ｔ細胞によって媒介される被験体のネイティブな組織に対する自己免疫攻撃が減少または停止される方法。
【請求項２０】
気道過敏性を被る哺乳動物被験体において前記気道過敏性を軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記被験体においてＴ細胞媒介性の過敏性応答を抑制する工程を有し、それによって前記被験体における気道組織の過敏性が減少または停止される方法。
【請求項２１】
アレルギーを被る哺乳動物被験体において前記アレルギーを軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記被験体においてＴ細胞媒介性のアレルギー応答を抑制する工程を有し、それによって前記被験体におけるアレルギー反応が減少または停止される方法。
【請求項２２】
Ｊａｋ３依存性白血病またはリンパ腫の増殖を阻害する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って白血病またはリンパ腫細胞の増殖を阻害またはブロックする工程を有し、前記被験体は白血病またはリンパ腫を被っており、前記化合物または前記代謝物は他のキナーゼ活性に比較してＪａｋ３活性を選択的に阻害し得る方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載の方法であって、
前記化合物の腎臓毒性がシクロスポリンＡの腎臓毒性よりも少ない方法。
【請求項２４】
請求項１０に記載の方法であって、
別の免疫抑制剤を投与する工程をさらに有する方法。
【請求項２５】
新規な免疫抑制薬物を同定することを補助するためのインビトロの方法であって、
Ｊａｋ３を有するＴ細胞を前記目的の化合物に濃度範囲にわたって接触させて前記化合物が前記範囲内の１つ以上の濃度においてＪａｋ３活性を阻害するか否かを判断することによって、Ｔ細胞機能を破壊するための活性について目的の化合物を試験する工程；
前記目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、既知のＪａｋ３阻害活性を有する請求項２において規定される化合物のＪａｋ３阻害活性とを比較する工程；ならびに
前記試験および比較の結果を使用して、前記目的の化合物が治療的な免疫抑制剤としてインビボで使用するための候補薬物であるか否かを判断する工程を有する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
前記目的の化合物をＪａｋ２阻害活性について試験する工程；
前記目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、もしあればそのＪａｋ２阻害活性とを比較する工程；および
前記比較を使用して、前記目的の化合物を選択的なＪａｋ３インヒビターとして同定する工程をさらに有する方法。
【請求項２７】
候補の免疫抑制薬物を同種移植片生存に対するその効果について試験するインビボの方法であって、
（ａ）適切なドナー動物から採取された同種移植片を、適切なレシピエント動物に移植する工程；
（ｂ）動物についての基本栄養素および健康促進条件を維持する工程；
（ｃ）候補薬物を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、処置されたレシピエントまたは群を提供する工程；
（ｄ）請求項１において規定される化合物を少なくとも１つの動物に投与してポジティブコントロール群として作用させる工程であって、Ｒ１およびＲ３はそれぞれＣＮ（ＣＨ３）２であり、ならびにＲ２はＯである工程；
（ｅ）随意に、少なくとも１つのレシピエント動物を未処置のままにして未処置のコントロールレシピエントまたは群として作用させる工程；
（ｆ）各レシピエントにおける各同種移植片の同種移植片生存時間を判断する工程；
（ｇ）各同種移植片の組織学的検査を行い、必要に応じて、各同種移植片に対する候補薬物関連性の構造的損傷を評価する工程；
（ｈ）各同種移植片において、同種移植片生存時間および候補薬物誘導性の組織学的構造変化を比較する工程；ならびに
（ｉ）（ｈ）からの比較を使用することで、未処置のコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、またはポジティブコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、エンハンスされた移植片生存時間および薬物処置された同種移植片に対する薬物誘導性の構造的損傷の欠如が、候補薬物が免疫抑制剤としてインビボで治療的に使用される場合に有効である可能性が高いことを標示していると判断する工程を有する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記候補薬物がＪａｋ３依存性Ｔ細胞増殖をインビトロで選択的に阻害し得ると判断する工程を有する方法。
【請求項２９】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、
細胞を、前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３の活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有し、
ｎは１、２、３、４、または６であり；
Ｒ１はＨ、ＣＨ２、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ３はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である方法。
【請求項３０】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、細胞を、前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３の活性を選択的に阻害するのに有効な濃度において、下記の式（ＩＩＩ）の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有し、
ｎは１または２であり；
Ｒ１はＨまたはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ３はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である方法。
【請求項３１】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、
細胞を、前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼの３活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有する方法。
【請求項３２】
下記の式を有する単離されたもしくは精製された化合物またはその塩。
【請求項３３】
請求項３２に記載の化合物または薬学的に受容可能なその塩をキャリア中に有する薬学的組成物。
【請求項１】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、
細胞を、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有し、
Ｒ１は、Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＨ２ＳＣ６Ｈ５、ＣＨ２ＳＣＨ２−（４−Ｃ６Ｈ４ＯＣＨ３）、ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２であり；
Ｒ２は、Ｏであり；
Ｒ３は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、またはＣＨ２−（Ｎ−モルフィル）である方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
Ｒ１はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ３はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記化合物はメソの立体異性体である方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
細胞はリンパ系または骨髄系起源である方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
細胞分裂がブロックされるように、前記細胞におけるシグナル３経路を干渉する工程を有する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を選択的に阻害するのに有効な前記濃度において、前記少なくとも１つの化合物は、Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３活性以外のタンパク質チロシンキナーゼ活性に実質的に非阻害性である方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞においてＪａｋ２活性を阻害するよりも少なくとも３倍多くＪａｋ３活性を阻害する工程を有する方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
ＩＬ２により活性化されるＪａｋ３およびＳｔａｔ５ａ／ｂを阻害するのに十分な濃度におけるプロラクチン（ＰＲＬ）によって、Ｊａｋ２およびＳｔａｔ５ａ／ｂ活性を阻害する可能性の小さな少なくとも１つの前記化合物を選択する工程を有する方法。
【請求項９】
治療的な免疫抑制剤として有用である物質を同定することを補助するためのインビトロの試験方法であって、
（ａ）細胞培養培地中に静止状態のＪａｋ３依存性Ｔリンパ球の集団を獲得する工程；
（ｂ）随意に、静止状態のＴリンパ球を、前記リンパ球が増殖することを刺激するために、サイトカインで前処理する工程；
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）からの前記静止状態のまたは刺激されたリンパ球を、請求項１において規定されるように、化合物またはその塩で処置する工程；
（ｄ）工程（ｃ）からのリンパ球を、細胞増殖を促進する条件下で培養する工程；
（ｅ）工程（ｄ）後の細胞増殖の程度を評価する工程；
（ｆ）随意に、Ｊａｋ２依存性Ｔリンパ球増殖に対する前記化合物の阻害効果を評価する工程；
（ｇ）随意に、前記化合物の細胞傷害性を評価する工程；
（ｈ）工程（ｅ）からの、ならびに、存在する場合は、工程（ｆ）および（ｇ）からの評価によって、化合物の細胞傷害性に起因しないＪａｋ３依存性リンパ球増殖の有意な阻害が、インビボで治療的に使用されるための候補薬物としての、Ｔ細胞媒介性の免疫抑制剤としての、および／またはＴ細胞増殖のインヒビタ−としての潜在性をその化合物が有することを示唆すると判断する工程；および
（ｉ）随意に、工程（ｅ）および（ｆ）からの評価を比較し、ならびに、工程（ｆ） において評価された阻害効果が工程（ｅ）において評価された阻害効果よりも有意に小さい場合は、前記化合物が、Ｊａｋ２活性を阻害することに比較して、Ｊａｋ３活性を阻害することに少なくともある程度選択的であることを前記比較から判断する工程、を有する方法。
【請求項１０】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の望ましくない機能を抑制する、その必要がある哺乳動物被験体におけるインビボの方法であって、
前記細胞を、請求項１において規定される少なくとも１つの化合物、またはその代謝物もしくは誘導体に、細胞におけるシグナル３経路を干渉するのに有効な量において接触させて、それによって細胞機能を阻害する工程を有し、
前記接触させる工程は、請求項１において規定される少なくとも１つの前記化合物、または薬学的に受容可能なその塩、または前記化合物の代謝物、または被験体の身体において前記化合物に変換可能な前記化合物の前駆体を、薬学的に受容可能なキャリア中に含む、治療的に有効な量の薬学的組成物を前記被験体に投与して、Ｊａｋ３依存性の細胞機能を阻害する工程を有する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記細胞はＴ細胞であり、前記薬学的組成物の前記量が前記Ｔ細胞における細胞分裂をブロックするのに有効である方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
前記薬学的組成物が継続的にまたは周期的に被験体に投与される工程を有する方法。
【請求項１３】
哺乳動物被験体を治療的に処置して望ましくない免疫応答を抑制する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行う工程を有し、前記被験体は望ましくない免疫応答を経験しているかまたは経験する危険性があり、前記薬学的組成物の前記治療的に有効な量は、前記望ましくない免疫応答を軽減するかまたは防止する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
Ｊａｋ３インヒビターの他の免疫抑制剤の治療的に有効な量を前記被験体に投与する工程をさらに有する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記他の免疫抑制剤はシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６である方法。
【請求項１６】
哺乳動物移植片レシピエントにおいて臓器移植片拒絶を軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って、移植される臓器に対するＴ細胞媒介性の免疫応答を抑制する工程を有し、それによって臓器の拒絶が軽減または停止される方法。
【請求項１７】
哺乳動物の同種移植片レシピエントにおいて急性の同種移植片拒絶を軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記同種移植片に対するＴ細胞媒介性の抗同種移植片免疫応答を抑制する工程を有し、それによって同種移植片の急性の拒絶が軽減または防止される方法。
【請求項１８】
哺乳動物移植片レシピエントにおいて移植寛容を誘導する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行ってＴ細胞媒介性の移植片拒絶応答を抑制する工程を有する方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患を被る哺乳動物被験体において前記疾患の寛解を促進する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記被験体におけるＴ細胞媒介性の自己免疫応答を抑制する工程を有し、それによって内因性のＪａｋ３依存性Ｔ細胞によって媒介される被験体のネイティブな組織に対する自己免疫攻撃が減少または停止される方法。
【請求項２０】
気道過敏性を被る哺乳動物被験体において前記気道過敏性を軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記被験体においてＴ細胞媒介性の過敏性応答を抑制する工程を有し、それによって前記被験体における気道組織の過敏性が減少または停止される方法。
【請求項２１】
アレルギーを被る哺乳動物被験体において前記アレルギーを軽減する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って前記被験体においてＴ細胞媒介性のアレルギー応答を抑制する工程を有し、それによって前記被験体におけるアレルギー反応が減少または停止される方法。
【請求項２２】
Ｊａｋ３依存性白血病またはリンパ腫の増殖を阻害する方法であって、
請求項１０に記載の方法を行って白血病またはリンパ腫細胞の増殖を阻害またはブロックする工程を有し、前記被験体は白血病またはリンパ腫を被っており、前記化合物または前記代謝物は他のキナーゼ活性に比較してＪａｋ３活性を選択的に阻害し得る方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載の方法であって、
前記化合物の腎臓毒性がシクロスポリンＡの腎臓毒性よりも少ない方法。
【請求項２４】
請求項１０に記載の方法であって、
別の免疫抑制剤を投与する工程をさらに有する方法。
【請求項２５】
新規な免疫抑制薬物を同定することを補助するためのインビトロの方法であって、
Ｊａｋ３を有するＴ細胞を前記目的の化合物に濃度範囲にわたって接触させて前記化合物が前記範囲内の１つ以上の濃度においてＪａｋ３活性を阻害するか否かを判断することによって、Ｔ細胞機能を破壊するための活性について目的の化合物を試験する工程；
前記目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、既知のＪａｋ３阻害活性を有する請求項２において規定される化合物のＪａｋ３阻害活性とを比較する工程；ならびに
前記試験および比較の結果を使用して、前記目的の化合物が治療的な免疫抑制剤としてインビボで使用するための候補薬物であるか否かを判断する工程を有する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
前記目的の化合物をＪａｋ２阻害活性について試験する工程；
前記目的の化合物のＪａｋ３阻害活性と、もしあればそのＪａｋ２阻害活性とを比較する工程；および
前記比較を使用して、前記目的の化合物を選択的なＪａｋ３インヒビターとして同定する工程をさらに有する方法。
【請求項２７】
候補の免疫抑制薬物を同種移植片生存に対するその効果について試験するインビボの方法であって、
（ａ）適切なドナー動物から採取された同種移植片を、適切なレシピエント動物に移植する工程；
（ｂ）動物についての基本栄養素および健康促進条件を維持する工程；
（ｃ）候補薬物を少なくとも１つの動物のそれぞれに投与して、処置されたレシピエントまたは群を提供する工程；
（ｄ）請求項１において規定される化合物を少なくとも１つの動物に投与してポジティブコントロール群として作用させる工程であって、Ｒ１およびＲ３はそれぞれＣＮ（ＣＨ３）２であり、ならびにＲ２はＯである工程；
（ｅ）随意に、少なくとも１つのレシピエント動物を未処置のままにして未処置のコントロールレシピエントまたは群として作用させる工程；
（ｆ）各レシピエントにおける各同種移植片の同種移植片生存時間を判断する工程；
（ｇ）各同種移植片の組織学的検査を行い、必要に応じて、各同種移植片に対する候補薬物関連性の構造的損傷を評価する工程；
（ｈ）各同種移植片において、同種移植片生存時間および候補薬物誘導性の組織学的構造変化を比較する工程；ならびに
（ｉ）（ｈ）からの比較を使用することで、未処置のコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、またはポジティブコントロールレシピエントからの同種移植片に比較して、エンハンスされた移植片生存時間および薬物処置された同種移植片に対する薬物誘導性の構造的損傷の欠如が、候補薬物が免疫抑制剤としてインビボで治療的に使用される場合に有効である可能性が高いことを標示していると判断する工程を有する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記候補薬物がＪａｋ３依存性Ｔ細胞増殖をインビトロで選択的に阻害し得ると判断する工程を有する方法。
【請求項２９】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、
細胞を、前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３の活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有し、
ｎは１、２、３、４、または６であり；
Ｒ１はＨ、ＣＨ２、またはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ３はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である方法。
【請求項３０】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、細胞を、前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３の活性を選択的に阻害するのに有効な濃度において、下記の式（ＩＩＩ）の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有し、
ｎは１または２であり；
Ｒ１はＨまたはＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ３はＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である方法。
【請求項３１】
Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼ３を発現する細胞の機能および／または増殖を阻害する方法であって、
細胞を、前記Ｊａｎｕｓチロシンキナーゼの３活性を選択的に阻害するに有効な濃度において、下記の式の少なくとも１つの化合物またはそれらの塩に接触させる工程を有する方法。
【請求項３２】
下記の式を有する単離されたもしくは精製された化合物またはその塩。
【請求項３３】
請求項３２に記載の化合物または薬学的に受容可能なその塩をキャリア中に有する薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１７】
【図１８−２１】
【図２２−２５】
【図２６−２９】
【図３０−３３】
【図３４−３７】
【図３８−３９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１７】
【図１８−２１】
【図２２−２５】
【図２６−２９】
【図３０−３３】
【図３４−３７】
【図３８−３９】
【公表番号】特表２００６−５１４０２１（Ｐ２００６−５１４０２１Ａ）
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５９４４２（Ｐ２００４−５５９４４２）
【出願日】平成１５年１２月９日（２００３．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３８９９３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５２３５９
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【出願人】（５０１４４９５４０）ザ・ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム (4)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月９日（２００３．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３８９９３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５２３５９
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【出願人】（５０１４４９５４０）ザ・ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム (4)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【Ｆターム（参考）】
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