Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びＬ−アミノ酸の製造法
【課題】Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内生菌科に属する菌株、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。例えば、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜８に記載された方法を挙げることができる。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えＤＮＡ技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。
【０００３】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ [EC:2.4.2.102.10]は、ピリミジン生合成系の酵素であり、pyrE遺伝子によってコードされている。pyrEはその上流にあるrph（RNase PHをコードする）とオペロンを成すが、エシェリヒア・コリMG1655やW3110では、rphのコード領域の３’末端領域に−１のフレームシフトがあり、その影響でpyrEの発現量が不十分となり、ピリミジン飢餓になると考えられている。(非特許文献１)
【０００４】
しかし、rph-pyrE オペロンの発現量、pyrE遺伝子産物の発現量、及びオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性と、腸内細菌による物質生産との関連については知られていなかった。
【特許文献１】欧州特許第0643135号公報
【特許文献２】欧州特許第0733712号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第1477565号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第0796912号公報
【特許文献５】欧州特許出願公開第0837134号公報
【特許文献６】国際公開第WO01/53459号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開第1170376号公報
【特許文献８】国際公開第WO2005/010175号パンフレット
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強させた微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
（２）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大させることによりオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物
（３）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された、前記微生物。
（４）ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有し、ｒｐｈ遺伝子のコード領域に−１のフレームシフト変異を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシフト変異を解消する変異が導入されたことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
（５）ｐｙｒＥ遺伝子の上流のアテニュエーターを欠損したことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
（６）前記オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（Ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（７）前記ｐｙｒＥ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記微生物：
（ａ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である前記微生物。
（９）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記微生物。
（１０）前記微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１１）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンなどの塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンなどの脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンなどのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンなどの環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンなどの含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物であって、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体から回収できる程度にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１０】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。中でもＬ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−グルタミン酸が好ましく、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−スレオニンが特に好ましい。
【００１１】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。
【００１２】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America）。
【００１３】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであ
れば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体などを用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１４】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの親株にのＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００１５】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００１６】
遺伝子組換えとしては、目的Ｌ−アミノ酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する方法や、目的Ｌ−アミノ酸の分解に関する酵素をコードする遺伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。
【００１７】
以下、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使用することができる微生物は以下のものには限定されない。
【００１８】
（Ｌ−スレオニン生産菌）
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、
オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００２０】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００２１】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
【００２２】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００２３】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている（ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990）。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている（ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990）。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する（WO2005/049808, WO2003/097839）。
【００２４】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００２５】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性）。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している（ABSTRACTS of the
17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation
with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A）。
【００２６】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており（ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307）、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる（White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照）。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００２７】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており（ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895）、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００２８】
（Ｌ−リジン生産菌）
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442（FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００２９】
WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。
【００３０】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００３１】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の
化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００３２】
（Ｌ−システイン生産菌）
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
（Ｌ−ロイシン生産菌）
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００３５】
（Ｌ−ヒスチジン生産菌）
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM
B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116
- B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM
BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E.
coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００３７】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより
阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００３８】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００３９】
（Ｌ−グルタミン酸生産菌）
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００４０】
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。このような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
【００４１】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００４２】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００４３】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００４４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したAJ12624(FFRM P-12379)(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００４５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。Pantoea ananatis AJ13356は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。Pantoea ananatis
AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomerans AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。
【００４６】
（Ｌ−フェニルアラニン生産菌）
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００４７】
（Ｌ−トリプトファン生産菌）
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,37
3号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００４８】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００４９】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００５０】
（Ｌ−チロシン生産菌）
本発明のＬ−チロシン生産菌を誘導するための親株の例としては、芳香族アミノ酸の生合成系酵素、例えばデオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)を増強した菌株が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を増強してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。これらの酵素活性増強は、Ｌ−トリプトファン生産菌、Ｌ−フェニルアラニン生産菌の誘導にも適用できる。
【００５１】
（Ｌ−プロリン生産菌）
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH
遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００５３】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００５４】
（Ｌ−アルギニン生産菌）
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００５６】
（Ｌ−バリン生産菌）
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００５７】
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００５８】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００５９】
（Ｌ−イソロイシン生産菌）
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 03567
39, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００６０】
＜１−２＞活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下「OPRTase」と略す）活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、OPRTase活性が増強するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。
【００６１】
なお、OPRTase活性の増強は、後述するように、OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成でき、これらの発現量の増強はプロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性遺伝子の発現増強であってもよいし、遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現増強であってもよい。またOPRTaseの活性上昇は、アテニュエーター領域を欠損すること、またOPRTaseの上流領域にフレームシフト変異を導入することによっても、達成することができる。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００６２】
本発明のOPRTase活性とは、オロチジン5’-リン酸と二リン酸からオロト酸と5-ホスホ−α−D−リボース一リン酸を生成する活性を意味し（下記式参照）、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとも呼ばれる（EC 2.4.2.10 ）。
【００６３】
オロチジン5’-リン酸 + 二リン酸 → オロト酸 + 5-ホスホ−α−D−リボース一リン酸
【００６４】
OPRTase活性の増強は、Poulsenらの方法によって確認できる。（Eur.J.Biochem.135:223-229 1983）
【００６５】
「OPRTase活性が増強するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのOPRTaseの分子の数が増大した場合や、OPRTaseの１分子当たりの活性が向上した場合が該当する。OPRTaseの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００６６】
OPRTase活性の増強は、OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成できる。発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、OPRTase活性の増強は、OPRTaseのタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００６７】
OPRTase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（pyrE遺伝子）としては、例えば、エシェリヒア・コリのpyrE遺伝子、具体的には、配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を有するpyrE遺伝子(GenBank Accession No.NC_00913 VERSION NC_000913
.2 GI:49175990の塩基番号3813150〜3813791の相補鎖)が挙げられる。
【００６８】
他の微生物由来pyrE遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_004088の577565..579529の相補鎖に示されるエルシニア・ペスティスのpyrE遺伝子、GenBank Accession No. AL627282の120832..122790の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィのPYRE遺伝子、GenBank Accession No. NC_002505の305121..307121の相補鎖に示されるビブリオ・コレラエのpyrE遺伝子、NC_003197の4513714..4515672の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィムリウムのOPRTase遺伝子などが挙げられる。
【００６９】
さらに、pyrE遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えば配列番号９、１０に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(Methods Enzymol., 183, 63
(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００７０】
pyrE遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺伝子で、上記のpyrE遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅した際にOPRTase活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。pyrE遺伝子のホモログは、配列番号１２のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、OPRTase活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、OPRTase活性を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、OPRTase活性を調べることによって確認することができる。
【００７１】
また、本発明に用いるpyrE遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質のOPRTase活性が損なわれない限り、配列番号１２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。
【００７２】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の
置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、OPRTase遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７３】
またpyrE遺伝子は、配列番号１２の塩基配列の相補配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、OPRTase活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７４】
上記pyrE遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のこれらの遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００７５】
pyrE遺伝子としてエシェリヒア・コリのpyrE遺伝子を用いる場合、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号９、１０に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、pyrE遺伝子を取得することができる。他の微生物のpyrE遺伝子も、それぞれその微生物において公知のOPRTase遺伝子もしくは他種の微生物のpyrE遺伝子又はpyrEタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００７６】
次に、PCR法により増幅されたpyrE遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
【００７７】
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）、 RSF1010（Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）、pBR322、pMW219、pMW119（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV28、pSTV29（宝バイオ社製）等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００７８】
これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、pyrE遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor La
boratory Press, (1989)等に記載されている。
【００７９】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal
of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153
(1977)）を使用することもできる。
【００８０】
一方、pyrE遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にこれらの遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、OPRTase遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００８１】
宿主としてエシェリヒア・コリK12株系統の菌株、例えばMG1655株やW3110株を用いる場合、以下の方法によってもORPTase活性を上昇させることができる。エシェリヒア・コリでは、pyrE遺伝子はその上流にあるrphとオペロンを形成している。エシェリヒア・コリK12株のrph-pyrEオペロンの塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号１１において、pyrEのコード領域は塩基番号782〜1423である。K12株では、rphのコード領域の3'末端側（配列番号１１の667位と671位の間）に-1のフレームシフト変異があり、その影響でORPTaseの翻訳量が低減し、OPRTaseの活性が低く抑えられている（Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407）。従って、OPRTaseの活性を上昇させるには、rph遺伝子の3'端領域より下流、かつ、pyrE遺伝子の上流の領域に前記-1のフレームシフト変異を相補する変異、例えば+1変異又は-2変異、または、-1変異もしくは+2変異を導入するすることにより、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができる。具体的には、例えば、配列番号１１の670位と671位の間に１塩基挿入し、フレームシフトを相補する変異を導入することにより、rphのコード領域が長くなり、rphの翻訳終了位置とリボソームとの親和性の高いアテニュエータ領域が近くなることによりリボソームがｍRNAから遊離しにくなり、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができると考えられる。このようなフレームシフトが解消されたpyrE遺伝子上流域を含むrph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号１３に例示する。配列番号１３において、rphのコード領域は、塩基番号１〜７１４である。
【００８２】
また、例えば，アテニュエーター上流の領域を欠損し前記-1のフレームシフトを相補するような変異を導入することにより、rphのコード領域が長くなり、rphの翻訳終了位置がpyrEの翻訳開始位置に近くなることにより、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができる。具体的には、配列番号１１の６１０−６９１位の塩基配列を欠失させることにより達成できる。このような領域を欠損したrph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号１４に例示する。
【００８３】
さらにpyrE遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、これらの遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又はこれらの遺伝子の発
現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
【００８４】
プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりOPRTase遺伝子の発現が強化される。
【００８５】
さらに、pyrE遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、OPRTase活性が上昇するような変異をこれらの遺伝子に導入してもよい。OPRTase活性が上昇するような変異としてはpyrE遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、OPRTaseタンパク質の比活性が高くなるようなこれらの遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００８６】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする。
【００８７】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８８】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００８９】
なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカ
チオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照、米国特許出願公開第2002025564号）。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００９１】
〔実施例１〕 pyrE遺伝子の上流部分を欠失したグルタミン酸生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の欠損
エシェリヒア・コリMG1655よりsucA遺伝子欠損株を作製した。報告されているsucA遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、sucA遺伝子のN末およびC末断片をPCR法により増幅した。
【００９２】
N末端断片増幅用PCR用プライマーにはプライマー１、２（配列番号１、２）を、C末端断片増幅用PCR用プライマーにはプライマー３、４（配列番号３、４）を用いた。プライマー１にはHindIIIサイトが、プライマー４にはXbaIサイトがそれぞれデザインされている。
【００９３】
PCR後の増幅DNA断片は、それぞれ、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）にて精製し、精製したN末端DNA断片およびC末端DNA断片、及びプライマー１、４を用いて、クロスオーバーPCR法（A. J. Link, D. Phillips, G. M. Church, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)）により、欠損型sucA断片を得た。精製したDNA断片を、HindIII及びXbaI（宝酒造社製）にて切断した後、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿を行った。同様にHindIII及びXbaIで切断した温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03988号国際公開パンフレット）と前記DNA断片とをDNA ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて連結した。この連結反応液にて、JM109コンピテント細胞（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン（シグマ社製）を25μg/mL含むLB寒天プレート（LB＋アンピシリンプレート）に塗布した。30℃で１日培養後、生育したコロニーを25μg/mLのアンピシリンを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、自動プラスミド抽出機PI-50（クラボウ社製）を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをHindIII及びXbaIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、目的断片が挿入されているプラスミドをsucA欠失用プラスミドpMAN_ΔsucAとした。尚、前記pMAN997は、pMAN031(S．Matsuyama and S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたものである。
【００９４】
プラスミドpMAN_ΔsucAでエシェリヒア・コリMG1655株をC. T. Chungらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)）により形質転換し、LB＋アンピシリンプレートで30℃でコロニーを選択した。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10-3希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養した。10-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択した。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、sucA遺伝子の欠失を確認した。こうしてE. coli MG1655由来のsucA欠損株MG1655ΔsucAを得た。
【００９５】
（２）エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の欠損株MG1655ΔsucA株からのpyrE上流部分が欠失した株MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株の構築
MG1655ΔsucA株の染色体上で、pyrE遺伝子の上流（5’側）にあるrph遺伝子内の82bp (E. coli MG1655 genomeの塩基配列(GenBank ACCESSION：NC_000913, VERSION：NC_000913.2 GI:49175990の座標3813882〜3813963、配列番号１１の塩基番号610〜691)は、以下の
ようにして欠失させることができる。まず、MG1655染色体DNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド５、６（配列番号５、６）をプライマーとしてPCRを行いDNA断片１を得る。同様にして合成オリゴヌクレオチド７、８（配列番号７、８）をプライマーとしてPCRを行いDNA断片２を得る。次に、DNA断片１、DNA断片２の混合物を鋳型とし、オリゴヌクレオチド５、８をプライマーとしてPCRを行うことにより、欠失型rph-pyrE DNA断片を得、これを温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03988号国際公開パンフレット）のマルチプルクローニングサイトに挿入することにより、欠失用プラスミド pMAN-rph-pyrE (m) を得る。このプラスミドでMG1655ΔsucA株をC. T. Chungらの方法により形質転換し、LB＋アンピシリンプレートで30℃でコロニーを選択する。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10-3希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択する。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養する。10-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択する。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、pyrE遺伝子上流部分の目的の欠失を確認する。こうしてE. coli MG1655由来のsucA欠失株MG1655ΔsucAよりpyrE上流部分が欠失した株MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株を得ることができる。
【００９６】
（３）MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株のグルタミン酸生成能の評価
pyrE遺伝子上流の欠失によるＬ−グルタミン酸発酵への効果を検討するため、MG1655ΔsucAΔsucA rph-pyrE(m)株を、sucA遺伝子欠損株MG1655ΔsucAを対照として培養し、Ｌ−グルタミン酸生産量を測定した。そのための培地および培養方法ならびに分析方法を以下に示す。26.6時間培養後のＬ−グルタミン酸収率を表１に示した。独立に取得した２クローンについてシングルコロニーアイソレーションして得た株各２株づつ、計４株を培養し、グルタミン酸収率の平均値を示した。
【００９７】
〔MS培地〕
（最終濃度）
グルコース 40 g/L（別殺菌）
MgSO4・7H2O 1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4 16 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
CaCO3 30 g/L（別殺菌）
【００９８】
〔培養方法〕
リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌をLB寒天培地に接種し、37℃、24時間培養した。
種（seed）試験管培養；リフレッシュ培養した菌をLB液体培地（必要に応じて薬剤添加）に接種し、37℃、16時間培養した。
主(main)培養；種培養液体培地から10％MS液体培地（必要に応じて薬剤添加）に接種し、37℃、 20ml/500ml容坂口フラスコで培養した。
【００９９】
〔分析方法〕
グルコース濃度、及びＬ−グルタミン酸濃度は、培養液を15,000rpmで5分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈してバイオバイオテックアナライザーAS-210（サクラ精器）により測定した。尚、培養26.6時間後の培地中のグルコース濃度は11g/lであった。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
〔実施例２〕pyrE遺伝子を増幅したスレオニン生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B-3996、B-5318からのpyrE増幅株の構築
pyrE増幅用のプラスミドを以下のようにして構築した。MG1655染色体DNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド９、１０（配列番号９、１０）をプライマーとしてPCRを行い、pyrE遺伝子断片を得た。これをプラスミドベクターpMW219（ニッポンジーン）またはpSTV28（TaKaRa）のSmaIサイトにクローニングし、それぞれ pMW219-pyrE、pSTV28-pyrEを得た。
【０１０２】
スレオニン生産菌B-3996株、B-5318株からのpyrE遺伝子増幅株は、B-3996株、B-5318株にpMW219-pyrE、pSTV28-pyrEをエレクトロポレーションにより導入することによって得ることができる。
【０１０３】
（２）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B3996、B3996のpyrE増幅株のＬ−スレオニン生産能の評価
B3996、B3996由来pyrE増幅株を、下記のようにして培養した後、培養液のＬ−スレオニンを定量し、対照の非増幅株と比べてスレオニン収率が高いことを示すことができる。
【０１０４】
（培地）
グルコース 40.0 g/l (A), K2HPO4 0.7 g/l (B), Thiamine HCl 0.2mg/l (C), MgSO4・7aq1.0g/l (D), (NH4)2SO4 16.0 g/l (D), FeSO4・7aq0.01g/l (D), MnSO4・5aq0.01g/l,
イーストエキストラクト2.0 g/l (D), L-イソロイシン0.05 g/l (D)。A, B, Dは、それぞれKOHでpH7.0にあわせ、別々に殺菌 (115℃，10分オートクレーブ) した後混合し、フィルター滅菌した(C) を添加する。
【０１０５】
（培養方法）
LB培地で一晩培養した培養液1 mlを、20 mlの上記培地に植菌し、500 ml坂口フラスコにて37℃で振とう培養する。
【０１０６】
（分析方法）
培養液を15,000rpmで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈し、アミノ酸アナライザーL-8500で測定する。
【０１０７】
〔実施例３〕pyrE遺伝子を増幅したＬ−グルタミン酸生産株の評価
また、OPRTase活性が上昇したＬ−グルタミン酸生産菌の親株として パントエア・アナナティスAJ13601株を用いることが出来る。なお、パントエア・アナナティスAJ13601株は経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号FERM P-17516として1999年8月18日に寄託され、2000年7月6日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。Ｌ−グルタミン酸生産菌からのpyrE遺伝子増幅株の構築は、実施例２と同様の方法でpMW219-pyrE，pSTV28-pyrEを導入することにより得ることが出来る。
【０１０８】
pyrE遺伝子増幅株は、Ｌ−グルタミン酸生産培地で培養し、往復振とう培養装置で培養
する。培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量を公知の方法により測定し、Ｌ−グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したpyrE遺伝子増幅株を取得することが出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。例えば、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜８に記載された方法を挙げることができる。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えＤＮＡ技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。
【０００３】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ [EC:2.4.2.102.10]は、ピリミジン生合成系の酵素であり、pyrE遺伝子によってコードされている。pyrEはその上流にあるrph（RNase PHをコードする）とオペロンを成すが、エシェリヒア・コリMG1655やW3110では、rphのコード領域の３’末端領域に−１のフレームシフトがあり、その影響でpyrEの発現量が不十分となり、ピリミジン飢餓になると考えられている。(非特許文献１)
【０００４】
しかし、rph-pyrE オペロンの発現量、pyrE遺伝子産物の発現量、及びオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性と、腸内細菌による物質生産との関連については知られていなかった。
【特許文献１】欧州特許第0643135号公報
【特許文献２】欧州特許第0733712号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第1477565号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第0796912号公報
【特許文献５】欧州特許出願公開第0837134号公報
【特許文献６】国際公開第WO01/53459号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開第1170376号公報
【特許文献８】国際公開第WO2005/010175号パンフレット
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強させた微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
（２）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大させることによりオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物
（３）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された、前記微生物。
（４）ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有し、ｒｐｈ遺伝子のコード領域に−１のフレームシフト変異を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシフト変異を解消する変異が導入されたことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
（５）ｐｙｒＥ遺伝子の上流のアテニュエーターを欠損したことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
（６）前記オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（Ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（７）前記ｐｙｒＥ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記微生物：
（ａ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である前記微生物。
（９）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記微生物。
（１０）前記微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１１）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンなどの塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンなどの脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンなどのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンなどの環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンなどの含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物であって、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体から回収できる程度にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１０】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。中でもＬ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−グルタミン酸が好ましく、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−スレオニンが特に好ましい。
【００１１】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。
【００１２】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America）。
【００１３】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであ
れば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体などを用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１４】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの親株にのＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００１５】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００１６】
遺伝子組換えとしては、目的Ｌ−アミノ酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する方法や、目的Ｌ−アミノ酸の分解に関する酵素をコードする遺伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。
【００１７】
以下、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使用することができる微生物は以下のものには限定されない。
【００１８】
（Ｌ−スレオニン生産菌）
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、
オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００２０】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００２１】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
【００２２】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００２３】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている（ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990）。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている（ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990）。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する（WO2005/049808, WO2003/097839）。
【００２４】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００２５】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性）。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している（ABSTRACTS of the
17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation
with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A）。
【００２６】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており（ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307）、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる（White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照）。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００２７】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており（ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895）、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００２８】
（Ｌ−リジン生産菌）
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442（FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００２９】
WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。
【００３０】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００３１】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の
化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００３２】
（Ｌ−システイン生産菌）
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
（Ｌ−ロイシン生産菌）
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００３５】
（Ｌ−ヒスチジン生産菌）
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM
B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116
- B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM
BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E.
coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００３７】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより
阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００３８】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００３９】
（Ｌ−グルタミン酸生産菌）
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００４０】
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。このような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
【００４１】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００４２】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００４３】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００４４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したAJ12624(FFRM P-12379)(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００４５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。Pantoea ananatis AJ13356は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。Pantoea ananatis
AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomerans AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。
【００４６】
（Ｌ−フェニルアラニン生産菌）
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００４７】
（Ｌ−トリプトファン生産菌）
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,37
3号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００４８】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００４９】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００５０】
（Ｌ−チロシン生産菌）
本発明のＬ−チロシン生産菌を誘導するための親株の例としては、芳香族アミノ酸の生合成系酵素、例えばデオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)を増強した菌株が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を増強してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。これらの酵素活性増強は、Ｌ−トリプトファン生産菌、Ｌ−フェニルアラニン生産菌の誘導にも適用できる。
【００５１】
（Ｌ−プロリン生産菌）
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH
遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００５３】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００５４】
（Ｌ−アルギニン生産菌）
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００５６】
（Ｌ−バリン生産菌）
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００５７】
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００５８】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００５９】
（Ｌ−イソロイシン生産菌）
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 03567
39, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００６０】
＜１−２＞活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下「OPRTase」と略す）活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、OPRTase活性が増強するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。
【００６１】
なお、OPRTase活性の増強は、後述するように、OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成でき、これらの発現量の増強はプロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性遺伝子の発現増強であってもよいし、遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現増強であってもよい。またOPRTaseの活性上昇は、アテニュエーター領域を欠損すること、またOPRTaseの上流領域にフレームシフト変異を導入することによっても、達成することができる。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００６２】
本発明のOPRTase活性とは、オロチジン5’-リン酸と二リン酸からオロト酸と5-ホスホ−α−D−リボース一リン酸を生成する活性を意味し（下記式参照）、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとも呼ばれる（EC 2.4.2.10 ）。
【００６３】
オロチジン5’-リン酸 + 二リン酸 → オロト酸 + 5-ホスホ−α−D−リボース一リン酸
【００６４】
OPRTase活性の増強は、Poulsenらの方法によって確認できる。（Eur.J.Biochem.135:223-229 1983）
【００６５】
「OPRTase活性が増強するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのOPRTaseの分子の数が増大した場合や、OPRTaseの１分子当たりの活性が向上した場合が該当する。OPRTaseの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００６６】
OPRTase活性の増強は、OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成できる。発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、OPRTase活性の増強は、OPRTaseのタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００６７】
OPRTase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（pyrE遺伝子）としては、例えば、エシェリヒア・コリのpyrE遺伝子、具体的には、配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を有するpyrE遺伝子(GenBank Accession No.NC_00913 VERSION NC_000913
.2 GI:49175990の塩基番号3813150〜3813791の相補鎖)が挙げられる。
【００６８】
他の微生物由来pyrE遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_004088の577565..579529の相補鎖に示されるエルシニア・ペスティスのpyrE遺伝子、GenBank Accession No. AL627282の120832..122790の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィのPYRE遺伝子、GenBank Accession No. NC_002505の305121..307121の相補鎖に示されるビブリオ・コレラエのpyrE遺伝子、NC_003197の4513714..4515672の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィムリウムのOPRTase遺伝子などが挙げられる。
【００６９】
さらに、pyrE遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えば配列番号９、１０に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(Methods Enzymol., 183, 63
(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００７０】
pyrE遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺伝子で、上記のpyrE遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅した際にOPRTase活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。pyrE遺伝子のホモログは、配列番号１２のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、OPRTase活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、OPRTase活性を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、OPRTase活性を調べることによって確認することができる。
【００７１】
また、本発明に用いるpyrE遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質のOPRTase活性が損なわれない限り、配列番号１２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。
【００７２】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の
置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、OPRTase遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７３】
またpyrE遺伝子は、配列番号１２の塩基配列の相補配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、OPRTase活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７４】
上記pyrE遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のこれらの遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００７５】
pyrE遺伝子としてエシェリヒア・コリのpyrE遺伝子を用いる場合、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号９、１０に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、pyrE遺伝子を取得することができる。他の微生物のpyrE遺伝子も、それぞれその微生物において公知のOPRTase遺伝子もしくは他種の微生物のpyrE遺伝子又はpyrEタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００７６】
次に、PCR法により増幅されたpyrE遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
【００７７】
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）、 RSF1010（Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）、pBR322、pMW219、pMW119（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV28、pSTV29（宝バイオ社製）等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００７８】
これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、pyrE遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor La
boratory Press, (1989)等に記載されている。
【００７９】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal
of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153
(1977)）を使用することもできる。
【００８０】
一方、pyrE遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にこれらの遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、OPRTase遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００８１】
宿主としてエシェリヒア・コリK12株系統の菌株、例えばMG1655株やW3110株を用いる場合、以下の方法によってもORPTase活性を上昇させることができる。エシェリヒア・コリでは、pyrE遺伝子はその上流にあるrphとオペロンを形成している。エシェリヒア・コリK12株のrph-pyrEオペロンの塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号１１において、pyrEのコード領域は塩基番号782〜1423である。K12株では、rphのコード領域の3'末端側（配列番号１１の667位と671位の間）に-1のフレームシフト変異があり、その影響でORPTaseの翻訳量が低減し、OPRTaseの活性が低く抑えられている（Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407）。従って、OPRTaseの活性を上昇させるには、rph遺伝子の3'端領域より下流、かつ、pyrE遺伝子の上流の領域に前記-1のフレームシフト変異を相補する変異、例えば+1変異又は-2変異、または、-1変異もしくは+2変異を導入するすることにより、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができる。具体的には、例えば、配列番号１１の670位と671位の間に１塩基挿入し、フレームシフトを相補する変異を導入することにより、rphのコード領域が長くなり、rphの翻訳終了位置とリボソームとの親和性の高いアテニュエータ領域が近くなることによりリボソームがｍRNAから遊離しにくなり、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができると考えられる。このようなフレームシフトが解消されたpyrE遺伝子上流域を含むrph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号１３に例示する。配列番号１３において、rphのコード領域は、塩基番号１〜７１４である。
【００８２】
また、例えば，アテニュエーター上流の領域を欠損し前記-1のフレームシフトを相補するような変異を導入することにより、rphのコード領域が長くなり、rphの翻訳終了位置がpyrEの翻訳開始位置に近くなることにより、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができる。具体的には、配列番号１１の６１０−６９１位の塩基配列を欠失させることにより達成できる。このような領域を欠損したrph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号１４に例示する。
【００８３】
さらにpyrE遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、これらの遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又はこれらの遺伝子の発
現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
【００８４】
プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりOPRTase遺伝子の発現が強化される。
【００８５】
さらに、pyrE遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、OPRTase活性が上昇するような変異をこれらの遺伝子に導入してもよい。OPRTase活性が上昇するような変異としてはpyrE遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、OPRTaseタンパク質の比活性が高くなるようなこれらの遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００８６】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする。
【００８７】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８８】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００８９】
なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカ
チオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照、米国特許出願公開第2002025564号）。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００９１】
〔実施例１〕 pyrE遺伝子の上流部分を欠失したグルタミン酸生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の欠損
エシェリヒア・コリMG1655よりsucA遺伝子欠損株を作製した。報告されているsucA遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、sucA遺伝子のN末およびC末断片をPCR法により増幅した。
【００９２】
N末端断片増幅用PCR用プライマーにはプライマー１、２（配列番号１、２）を、C末端断片増幅用PCR用プライマーにはプライマー３、４（配列番号３、４）を用いた。プライマー１にはHindIIIサイトが、プライマー４にはXbaIサイトがそれぞれデザインされている。
【００９３】
PCR後の増幅DNA断片は、それぞれ、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）にて精製し、精製したN末端DNA断片およびC末端DNA断片、及びプライマー１、４を用いて、クロスオーバーPCR法（A. J. Link, D. Phillips, G. M. Church, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)）により、欠損型sucA断片を得た。精製したDNA断片を、HindIII及びXbaI（宝酒造社製）にて切断した後、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿を行った。同様にHindIII及びXbaIで切断した温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03988号国際公開パンフレット）と前記DNA断片とをDNA ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて連結した。この連結反応液にて、JM109コンピテント細胞（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン（シグマ社製）を25μg/mL含むLB寒天プレート（LB＋アンピシリンプレート）に塗布した。30℃で１日培養後、生育したコロニーを25μg/mLのアンピシリンを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、自動プラスミド抽出機PI-50（クラボウ社製）を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをHindIII及びXbaIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、目的断片が挿入されているプラスミドをsucA欠失用プラスミドpMAN_ΔsucAとした。尚、前記pMAN997は、pMAN031(S．Matsuyama and S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたものである。
【００９４】
プラスミドpMAN_ΔsucAでエシェリヒア・コリMG1655株をC. T. Chungらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)）により形質転換し、LB＋アンピシリンプレートで30℃でコロニーを選択した。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10-3希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養した。10-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択した。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、sucA遺伝子の欠失を確認した。こうしてE. coli MG1655由来のsucA欠損株MG1655ΔsucAを得た。
【００９５】
（２）エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の欠損株MG1655ΔsucA株からのpyrE上流部分が欠失した株MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株の構築
MG1655ΔsucA株の染色体上で、pyrE遺伝子の上流（5’側）にあるrph遺伝子内の82bp (E. coli MG1655 genomeの塩基配列(GenBank ACCESSION：NC_000913, VERSION：NC_000913.2 GI:49175990の座標3813882〜3813963、配列番号１１の塩基番号610〜691)は、以下の
ようにして欠失させることができる。まず、MG1655染色体DNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド５、６（配列番号５、６）をプライマーとしてPCRを行いDNA断片１を得る。同様にして合成オリゴヌクレオチド７、８（配列番号７、８）をプライマーとしてPCRを行いDNA断片２を得る。次に、DNA断片１、DNA断片２の混合物を鋳型とし、オリゴヌクレオチド５、８をプライマーとしてPCRを行うことにより、欠失型rph-pyrE DNA断片を得、これを温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03988号国際公開パンフレット）のマルチプルクローニングサイトに挿入することにより、欠失用プラスミド pMAN-rph-pyrE (m) を得る。このプラスミドでMG1655ΔsucA株をC. T. Chungらの方法により形質転換し、LB＋アンピシリンプレートで30℃でコロニーを選択する。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10-3希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択する。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養する。10-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択する。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、pyrE遺伝子上流部分の目的の欠失を確認する。こうしてE. coli MG1655由来のsucA欠失株MG1655ΔsucAよりpyrE上流部分が欠失した株MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株を得ることができる。
【００９６】
（３）MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株のグルタミン酸生成能の評価
pyrE遺伝子上流の欠失によるＬ−グルタミン酸発酵への効果を検討するため、MG1655ΔsucAΔsucA rph-pyrE(m)株を、sucA遺伝子欠損株MG1655ΔsucAを対照として培養し、Ｌ−グルタミン酸生産量を測定した。そのための培地および培養方法ならびに分析方法を以下に示す。26.6時間培養後のＬ−グルタミン酸収率を表１に示した。独立に取得した２クローンについてシングルコロニーアイソレーションして得た株各２株づつ、計４株を培養し、グルタミン酸収率の平均値を示した。
【００９７】
〔MS培地〕
（最終濃度）
グルコース 40 g/L（別殺菌）
MgSO4・7H2O 1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4 16 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
CaCO3 30 g/L（別殺菌）
【００９８】
〔培養方法〕
リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌をLB寒天培地に接種し、37℃、24時間培養した。
種（seed）試験管培養；リフレッシュ培養した菌をLB液体培地（必要に応じて薬剤添加）に接種し、37℃、16時間培養した。
主(main)培養；種培養液体培地から10％MS液体培地（必要に応じて薬剤添加）に接種し、37℃、 20ml/500ml容坂口フラスコで培養した。
【００９９】
〔分析方法〕
グルコース濃度、及びＬ−グルタミン酸濃度は、培養液を15,000rpmで5分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈してバイオバイオテックアナライザーAS-210（サクラ精器）により測定した。尚、培養26.6時間後の培地中のグルコース濃度は11g/lであった。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
〔実施例２〕pyrE遺伝子を増幅したスレオニン生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B-3996、B-5318からのpyrE増幅株の構築
pyrE増幅用のプラスミドを以下のようにして構築した。MG1655染色体DNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド９、１０（配列番号９、１０）をプライマーとしてPCRを行い、pyrE遺伝子断片を得た。これをプラスミドベクターpMW219（ニッポンジーン）またはpSTV28（TaKaRa）のSmaIサイトにクローニングし、それぞれ pMW219-pyrE、pSTV28-pyrEを得た。
【０１０２】
スレオニン生産菌B-3996株、B-5318株からのpyrE遺伝子増幅株は、B-3996株、B-5318株にpMW219-pyrE、pSTV28-pyrEをエレクトロポレーションにより導入することによって得ることができる。
【０１０３】
（２）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B3996、B3996のpyrE増幅株のＬ−スレオニン生産能の評価
B3996、B3996由来pyrE増幅株を、下記のようにして培養した後、培養液のＬ−スレオニンを定量し、対照の非増幅株と比べてスレオニン収率が高いことを示すことができる。
【０１０４】
（培地）
グルコース 40.0 g/l (A), K2HPO4 0.7 g/l (B), Thiamine HCl 0.2mg/l (C), MgSO4・7aq1.0g/l (D), (NH4)2SO4 16.0 g/l (D), FeSO4・7aq0.01g/l (D), MnSO4・5aq0.01g/l,
イーストエキストラクト2.0 g/l (D), L-イソロイシン0.05 g/l (D)。A, B, Dは、それぞれKOHでpH7.0にあわせ、別々に殺菌 (115℃，10分オートクレーブ) した後混合し、フィルター滅菌した(C) を添加する。
【０１０５】
（培養方法）
LB培地で一晩培養した培養液1 mlを、20 mlの上記培地に植菌し、500 ml坂口フラスコにて37℃で振とう培養する。
【０１０６】
（分析方法）
培養液を15,000rpmで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈し、アミノ酸アナライザーL-8500で測定する。
【０１０７】
〔実施例３〕pyrE遺伝子を増幅したＬ−グルタミン酸生産株の評価
また、OPRTase活性が上昇したＬ−グルタミン酸生産菌の親株として パントエア・アナナティスAJ13601株を用いることが出来る。なお、パントエア・アナナティスAJ13601株は経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号FERM P-17516として1999年8月18日に寄託され、2000年7月6日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。Ｌ−グルタミン酸生産菌からのpyrE遺伝子増幅株の構築は、実施例２と同様の方法でpMW219-pyrE，pSTV28-pyrEを導入することにより得ることが出来る。
【０１０８】
pyrE遺伝子増幅株は、Ｌ−グルタミン酸生産培地で培養し、往復振とう培養装置で培養
する。培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量を公知の方法により測定し、Ｌ−グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したpyrE遺伝子増幅株を取得することが出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
【請求項２】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大させることによりオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有し、ｒｐｈ遺伝子のコード領域に−１のフレームシフト変異を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシフト変異を相補する変異が導入されたことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項５】
ｐｙｒＥ遺伝子の上流のアテニュエーターを欠損したことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項６】
前記オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の微生物：
（Ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記ｐｙｒＥ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項２〜６のいずれか一項に記載に記載の微生物：
（ａ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１１】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
【請求項２】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大させることによりオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有し、ｒｐｈ遺伝子のコード領域に−１のフレームシフト変異を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシフト変異を相補する変異が導入されたことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項５】
ｐｙｒＥ遺伝子の上流のアテニュエーターを欠損したことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項６】
前記オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の微生物：
（Ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記ｐｙｒＥ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項２〜６のいずれか一項に記載に記載の微生物：
（ａ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１１】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１０に記載の方法。
【公開番号】特開２００９−１６５３５５（Ｐ２００９−１６５３５５Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２４６９２（Ｐ２００６−１２４６９２）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]